Descubrimiento de fármacos basado en fragmentos

1 DESCUBRIMIENTO DE FÁRMACOS BASADO EN FRAGMENTOS ALUMNA: AMANDA ZAMORA ROLDÁN TUTOR: FERNANDO IGLESIAS GUERRA DEPARTAMENTO DE QUÍMICA ORGÁNICA Y FARMACÉUTICA TFG DE CARÁCTER BIBLIOGRÁFICO UNIVERSIDAD DE SEVILLA FACULTAD DE FARMACIA GRADO EN FARMACIA TRABAJO FIN DE GRADO 2 RESUMEN El descubrimiento de fármacos basado en fragmentos, conocido como FBDD (Fragment Based Drug Desing), es una estrategia para la búsqueda de nuevos fármacos, incluido en las técnicas de cribados sistemáticos. El proceso comienza seleccionando una biblioteca de fragmentos para encontrar los hits iniciales que pueden llegar a ser leads. Esta biblioteca es sometida a un cribado a altas concentraciones y sensibilidad, para detectar los fragmentos que son capaces de unirse de forma débil a la diana terapéutica. En este método, el cribado utilizado es el cribado basado en fragmentos (FBS), ya que presenta numerosas ventajas con respecto al cribado de alto rendimiento (HTS). El primer método biofísico empleado para detectar los enlaces débiles formados entre el fragmento y target fue la espectroscopía de resonancia magnética nuclear (NMR). Una vez detectados los hits, el objetivo es obtener el compuesto líder (lead), para ello se lleva a cabo la optimización de los fragmentos, es decir, sometemos a los hits a procesos de expansión o combinación. En los últimos años, se han utilizado otras técnicas para mejorar la detección de los fragmentos y así obtener leads con mayor probabilidad de convertirse en fármaco. Entre estas técnicas destacamos la electroforesis capilar de afinidad (ACE), mediante este método se está investigando la proteína HSP90 como objetivo terapéutico en oncología, y los métodos computaciones, en el que destaca el cribado virtual que permite reducir de forma significativa el número de ensayos llevados a cabo y con ello reducir el tiempo del proceso. Existen números fármacos que se encuentran actualmente en ensayos clínicos obtenidos mediante FBDD como Venetoclax y Zelboraf. Palabras claves: hit, lead, optimización, método computacional, NMR. 3 ÍNDICE: 1. INTRODUCCIÓN……………………………………………………………………………………………Pág.4. 2. OBJETIVOS……………………………………………….………………………………………………….Pág.4. 3. MATERIAL Y MÉTODOS………………………………………………………………………………..Pág.5. 4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN………………………….……………………………………………….Pág.5. 4.1. DEFINICIÓN Y DESARROLLO DEL FBDD………………………………………..…………….Pág.5. 4.2. APLICACIÓN DE NUEVAS TÉCNICAS EN FBDD…………………………………………….Pág.13. 4.2.1. Electroforesis capilar………………………………………………………………………………Pág.13. 4.2.2. Métodos computacionales…………………………………..…………………………………Pág.16. 5. EJEMPLOS REPRESENTATIVOS………………………………………………………………………Pág.18. 5.1. Descubrimiento a partir de fragmentos de un potente inhibidor de NAMPT.Pág.18. 5.2. Obtención mediante FBDD de potentes moduladores alostéricos positivos dirigidos a los receptores mGluR2…………………………………………………………………………………..Pág.21. 6. CONCLUSIÓN………………………………………………………………………………..………………Pág.30. 7. BIBLIOGRAFÍA……………………………………………………………………………………………….Pág.31. 4 1. INTRODUCCIÓN El descubrimiento de fármacos basados en fragmentos, conocido como FBDD por sus siglas en inglés (Fragment Based Drug Desing), es un campo interdisciplinario, que se sirve de numerosas ciencias como la biología, química, física y la química farmacéutica entre otras. La primera demostración relacionada con este campo fue en el año 1996, realizada por Laboratorios Abbott, de la mano de Suker et al. El documento fue publicado en 1996, el cual estaba enfocado como “relación estructura-actividad por resonancia magnética nuclear” (SAR por NMR). La industria ha tenido un papel importante en el desarrollo de FBDD mediante la mejora de tecnologías emergentes y enfoque para su aplicación en el descubrimiento de fármacos. También tiene gran importancia la Universidad en este campo, aportando la mayor parte del fundamento teórico. En la década de los 2000, industria y universidad empezaron a formar una red de colaboración, demostrando que FBDD es un campo de investigación multidisciplinar de alta tecnología en el que especialistas de distintas áreas colaboran en el desarrollo de nuevos productos farmacéuticos (Romasanta et al., 2018). 2. OBJETIVOS - Revisión bibliográfica con el fin de ofrecer una visión actual sobre el descubrimiento de fármacos basado en fragmentos (FBDD) - Explicar el fundamento de la técnica del diseño de fármacos basado en fragmentos, enfocado como estrategia para la búsqueda de nuevos fármacos - Comparar la técnica usada desde el comienzo con nuevas técnicas aplicadas al descubrimiento de fármacos basado en fragmentos - Mostrar ejemplos de fármacos obtenidos a partir de fragmentos y desarrollar su procedimiento 5 3. MATERIALES Y MÉTODOS Se llevó a cabo una búsqueda bibliográfica, seleccionando artículos científicos relacionados con el descubrimiento de fármacos basados en fragmentos, la técnica de resonancia magnética nuclear para la detección de fragmentos, la aplicación de nuevas técnicas para el diseño de fármacos basados en fragmentos y fármacos obtenidos a partir de fragmentos. Esta búsqueda se hizo en las bases de datos Pubmed y Scifinder, a partir de palabras claves como FBDD (descubrimiento de fármacos basados en fragmentos), NMR (resonancia magnética nuclear), ACE (electroforesis capilar de afinidad y computational approaches (métodos computacionales). Además, se recabó información de libros de Química Farmacéutica, los cuales hacía referencia a temas relacionados con el descubrimiento de fármacos basado en fragmentos y las técnicas utilizadas en el mismo. 4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 4.1. DEFINICIÓN Y DESARROLLO DEL FBDD El descubrimiento de fármacos basado en fragmento ocupa un lugar importante en el ámbito de la química farmacéutica. Ésta tiene como objetivo principal el estudio de los fármacos desde el punto de vista químico y su metodología consiste en establecer la relación entre la estructura química del fármaco y su actividad biológica. El FBDD es una estrategia para la búsqueda de nuevos fármacos, definiéndose fármaco como “sustancia pura, químicamente definida, extraídas de fuentes naturales o sintetizada en laboratorio, dotada de acción biológica, que puede o no ser aprovechada por sus efectos terapéuticos” (Avendaño, 2001). Está incluido en las técnicas de cribados sistemáticos. Las técnicas de cribados sistemáticos permiten explorar de modo preliminar el perfil farmacológico de una molécula, sirviéndose de amplias bibliotecas de compuestos que se someten a ensayos bioquímicos frente a una batería de dianas terapéuticas, es decir, macromoléculas biológicas donde el fármaco va a ejercer su acción (Cirilo et al., 2003). 6 El primer paso para llevar a cabo la estrategia del FBDD consiste en seleccionar una biblioteca de fragmentos, definiéndose fragmentos como moléculas orgánicas de peso molecular comprendido entre 100 y 300 Dalton (Da), para encontrar los hits iniciales que pueden convertirse en leads. Entendiendo por hit, compuesto que muestra selectividad biológica y cuya actividad excede de un determinado nivel y definiendo lead como un compuesto representativo de una serie con suficiente potencial como para ser considerado en un programa que desarrolla la búsqueda de un nuevo fármaco (Cirilo et al., 2003). En el proceso de selección de la biblioteca se analizan fragmentos y bibliotecas de fragmentos que están disponibles comercialmente. Es importante seleccionar una biblioteca que cumpla algunos criterios primarios dependiendo del perfil de la diana terapéutica de interés, basándose en una diversidad tanto química como de tamaño. Entre estos criterios, está la elección de una biblioteca con compuestos de pequeño tamaño y que cumplan la regla del 3. Además, se descartan moléculas con grupos funcionales que puedan contribuir a una reacción química adicional, toxicidad o a la aparición de falsos positivos (Heidrich et al., 2019). Una vez seleccionada la biblioteca, se hace un cribado a altas concentraciones y en condiciones de gran sensibilidad para detectar los fragmentos que se han unido débilmente al target o diana terapéutica de interés. Este cribado se conoce como cribado basado en fragmentos (FBS) y presenta numerosas ventajas frente al cribado de alto rendimiento (HTS) usado tradicionalmente. HTS es un cribado farmacológico de alto rendimiento, que consiste en probar grandes colecciones de compuestos químicos o productos naturales para identificar moléculas biológicamente activas. El FBS en comparación con HTS presenta ventajas como son: el número de compuestos cribados es menor debido a que tienen una mayor probabilidad de enlazarse al target por su pequeño tamaño; la optimización química es más fácil de llevar a cabo debido a que la interacción ha sido validada y conocida estructuralmente; al partir de moléculas de pequeño tamaño, la optimización conduce a leads o líderes cuyas masas moleculares están en el rango apropiado; el fragmento seleccionado presenta una gran proporción 7 de átomos implicados en la interacción con el target, con lo que los fragmentos se pueden describir como enlazantes eficientes, es decir, con altas energía de enlace por unidad de masa molecular (Singh et al., 2018). En HTS los compuestos identificados son más potentes pero son enlazantes con menor eficiencia. En la figura 1 se representa un hit obtenido por HTS. En el primer dibujo, podemos observar que, aunque el hit sea de un tamaño grande y presente numerosos puntos de contacto con la diana, no forma interacciones de calidad en los bolsillos claves de unión. Los bolsillos de unión representan la región específica del target al que se une el fragmento o hit. En el dibujo número 2, podemos observar un fragmento de menor tamaño y capaz de establecer interacción con el sitio de unión de una mayor calidad, aunque posea menor afinidad global, ya que esa afinidad la puede adoptar en la etapa de optimización, añadiendo al fragmento otro fragmento adicional que establezca una interacción eficiente con otro bolsillo (dibujo 3), pudiéndose obtener el líder. En general, FBS ofrece un mayor número de aciertos y eficiencias de enlace en comparación con HTS, aunque ambas técnicas han sido usadas en combinación por la industria farmacéutica y biotecnológica para acortar la fase inicial en el proceso de FBDD, llegándose a obtener series de compuestos líderes (Singh et al, 2018). La eficiencia del enlace del ligando (Bembenek et al., 2009) se puede cuantificar como balance de energía libre por átomo pesado (no hidrógeno). La eficiencia del ligando (LE) se define como: Dibujo 1 Dibujo 2 Dibujo 3 Figura 1. Comparación de fragmentos obtenido por HTS y por FBS 8 LE= ΔG/Nº átomos pesados ΔG se obtiene de la constante de disociación del complejo: ΔG= –RT lnKd También se puede expresar la eficiencia del enlace relacionándola con el peso molecular (PM): PEI = % inhibición /PM donde PEI es el índice de eficiencia porcentual BEI= pKi , pKd o pIC50 /PM donde BEI es el índice de eficiencia del enlace. Esta última, tiene como ventaja la inclusión de los hidrógenos. Los fragmentos de la biblioteca de FBS deben cumplir la regla del 3 (Kirsch et al., 2019), ésta es una regla empírica para las propiedades lead/fragment-like, cuyas consideraciones son: peso molecular debe ser menor o igual a 300Da; el número de átomos donadores de puentes de hidrógeno debe ser menor o igual a tres; el número de átomos aceptores de puentes de hidrógeno debe ser menor o igual a tres; el logaritmo calculado (Hansch) del coeficiente de reparto n-octanol/agua debe ser menor o igual a tres. Además se incluye que la superficie del área polar sea igual a 60 A2 y que el número de enlaces rotables debe tener una media igual o menor a tres. Cumplir esta regla proporciona que en la etapa de optimización se siga dentro del rango farmacocinético favorable, es decir, nos facilita cumplir con la regla de Lipinski, que le confiere al fármaco una buena biodisponibilidad oral. Existen diferentes métodos biofísicos para el cribado basado en fragmentos, es decir, para detectar los enlaces débiles entre el fragmento y target. Destaca la espectroscopía de resonancia magnética nuclear (NMR), ya que fue el primer método que se utilizó para tal fin y sigue en uso en la actualidad. En 1996, Shuker et al. publicó un estudio en el que convierte a la NMR en la técnica más popular para el cribado basado en fragmento, ya que puede detectar esa unión débil (Singh et al., 2018). La espectroscopía de NMR se basa en una interacción entre los momentos magnéticos de los núcleos (µn) con un campo magnético externo (B0), produciéndose una separación de los niveles de energía, estando cada nivel asociado a una orientación diferente del momento magnético nuclear respecto al campo magnético externo. La diferencia de energía entre niveles sucesivos viene dada por: 9 ∆𝐸 = ϒ× ђ × 𝐵 Donde: 𝜇= 𝛾× ђ × 𝐼 y: - ђ es la constante de Planck normalizada - ϒn es la constante giromagnética - In es el momento cinético del núcleo En esta espectrometría la muestra es irradiada con radiación electromagnética en el rango de radiofrecuencias, produciendo la transición entre niveles de energía consecutivos (Carey y Giuliano, 2014). Dentro de esta técnica los ensayos pueden dividirse en métodos que observan la proteína y métodos que observan el ligando (Jimenez, 2015). Los métodos basados en la proteína tienen una alta fiabilidad y sensibilidad, nos permiten detectar la unión de moléculas y estimar la energía enlazante. Como inconveniente requieren que la proteína sea marcada (15N y/o 13C) además de tener un peso molecular menor a 50kDa. Los métodos basados en ligando requieren una menor cantidad de proteínas, ya que son muy sensibles, no requieren marcaje de la proteína ni limitan el peso molecular de la proteína. Nos permiten la identificación de los fragmentos que interaccionan directamente con la proteína, pero no nos dan información sobre el sitio de unión del ligando. Los métodos basados en la proteína son útiles para detectar la unión de moléculas y estimar la energía de la interacción enlazante. Se lleva a cabo mediante la técnica SAR by NMR (Relación estructura-actividad), requiriendo el marcaje 15N y un peso molecular menos a 40 KDa. El espectro de una proteína por NMR es complejo y requiere otras técnicas además de 1H-NMR. La primera técnica que se desarrolló después de la de protones fue la NMR de 13C, esta técnica se convirtió en una herramienta imprescindible para resolver los problemas estructurales biológicos. Posteriormente, se desarrollaron las técnicas bidimensionales, las cuales consisten en registrar espectros de dos núcleos diferentes, correlacionándolos. Para ello, se utilizan técnicas como el HSQC (correlación 16 La concentración de trombina seleccionada para el ensayo fue de 10mM, manteniendo así un bajo consumo de proteínas y un impacto significativo en la migración de PL. La concentración del ligando de estudio no modifica la migración del PL, con lo que se utilizó una concentración baja para eliminar problemas de solubilidad entre otros. El voltaje utilizado fue de 8Kv (corriente de 36mA), ya que es el que mejor respetaba el tiempo de análisis. Se determinó el valor IC50 de dos fragmentos conocidos inhibidores de la trombina (benzamidina y p-aminobenzamidina) y de un inhibidor débil, como es el nafamostat [(6- carbamimidoilnaftalen-2-il) 4-(diaminometilidenamino) benzoato], para así demostrar la precisión y fiabilidad del método (Farças et al., 2017). También se construyó una biblioteca química que permite evaluar el rendimiento y ventajas del ensayo en comparación con el método directo. Podemos concluir que el método indirecto se caracteriza por su universalidad, ya que pueden seleccionarse todo tipo de moléculas, independientemente de su carga y de la absorbancia en UV-VIS. Nos permite señalar los fragmentos más interesantes y calcular la IC50, de forma directa, de los fragmentos seleccionados, ofreciendo información en las primeras fases del descubrimiento de fármacos (Farças et al., 2018). 4.2.2. Métodos computacionales En los últimos años, los métodos computacionales han formado parte del proceso del FBDD, contribuyendo al análisis eficiente de datos, al cribado de bibliotecas, a aportar hipótesis que ayuden al estudio del mecanismo de acción de los fármacos y al diseño de nuevas estructuras químicas entre otras. Además, han servido para el desarrollo de fármacos que se encuentran en ensayos clínicos. Los métodos computacionales forman parte del diseño de fármacos asistido por computadora (DIFAC). Éste pretende estudiar las relaciones estructura-actividad de moléculas y tiene como objetivo diseñar nuevas estructuras con actividad biológica frente a dianas de interés terapéutico, filtrar las moléculas de mayor interés para llevarlas a estudio y mejorar las propiedades de los fragmentos, así como disminuir sus efectos adversos (Prieto-Martínez y Medina-Franco, 2018). 17 El DIFAC es un proceso que requiere una gran preparación, análisis para realizar una buena interpretación de los resultados obtenidos del ordenador. Dentro de los métodos computacionales se pueden destacar tres métodos empleados en la identificación de fragmentos y su optimización. El primero es el acoplamiento molecular automatizado, cuyo objetivo es buscar la conformación y orientación óptima del ligando dentro de la diana de interés. La primera etapa de este método es el docking o búsqueda de la conformación y orientación de moléculas, y la segunda etapa es el scoring, proceso en el que se asigna un valor que va a medir la interacción entre fragmento y proteína. Esta última etapa es la más difícil de calcular de manera rápida, con lo que actualmente el acoplamiento molecular es útil para describir un modelo de unión, pero no para calcular con precisión la energía de interacción. Glide, Gold y Sur- Flock-Dock son programas de acoplamiento usados en la actualidad. El segundo método dentro de los métodos computacionales es el modelo farmacóforo (Prieto-Martínez y Medina-Franco, 2018). Éste consiste en diseñar un fragmento de forma tridimensional con las características mínimas necesarias tanto estéricas como electrónicas, para así asegurar las interacciones óptimas con la diana de interés, desencadenando una respuesta biológica. Este farmacóforo no va a representar una molecula real, pero puede ser considerado como partida para el posterior desarrollo de un conjunto de moléculas activas. Como último método, describimos el cribado virtual (Bian y Xie, 2018), el cual es un filtrado computacional de fragmentos para así seleccionar a los candidatos, llamados hits computacionales, para su posterior estudio y evaluación experimental. Esto nos ayuda a reducir de forma significativa el número de ensayos que se tendría que llevar a cabo sin esta filtración. El cribado virtual consta de cinco fases principales. En la primera, se establece una biblioteca de fragmentos diversa. Esto nos va a permitir analizar una gran cantidad de fragmentos, en un tiempo reducido, garantizando una gran diversidad de fragmentos, aumentando así la probabilidad estadística para encontrar el fragmento óptimo para la diana de interés. La segunda fase consiste en cribar de forma virtual la biblioteca de fragmentos para así obtener los hits, es decir, aquellos que puedan tener interacción 18 con el target. Esto se puede conseguir evaluando las interacciones de enlace de hidrógeno o hidrófobas. En la tercera fase, se procede a diseñar los leads a partir de los hits. En esta fase se lleva a cabo la optimización de los fragmentos explicada anteriormente. La cuarta fase consiste en verificar los nuevos leads mediante ensayos biológicos, que nos va a proporcionar la información de la efectividad que poseen los nuevos compuestos. En la última fase, se va a confirmar la unión, es decir, se revela las interacciones lead-target y se obtiene información del mecanismo de activación o inhibición de la diana. Un ejemplo del éxito de este método se puede comprobar en el diseño de moduladores alostéricos en mGluR5, en el trabajo publicado por Xie et al. En este trabajo se informa de la aplicación del FBDD mediante métodos computacionales para la búsqueda de nuevos moduladores alostéricos en el receptor metabotrópico del glutamato 5. Este receptor es un objetivo de interés para el desarrollo de fármacos, debido a su relación con múltiples enfermedades del sistema nervioso central. 5. EJEMPLOS REPRESENTATIVOS 5.1. Descubrimiento a partir de fragmentos de un potente inhibidor de NAMPT (nicotinamida fosforribosil transferasa) (Korepanova et al., 2018). La NAMPT es una enzima que aparece sobreexpresada en numerosos tipos de cáncer, convirtiéndola en una diana para su estudio. Esta enzima es un factor limitante para la recuperación del cofactor NAD+ (nicotamida adenina dinucleótido), el cual actúa como intercambiador de electrones en reacciones redox que van a generar ATP, que es la fuente principal de energía para un gran número de procesos celulares. 19 Figura 6. Reacción catalizada por NAMPT Se utilizó NMR para la detección de fragmentos y ensayos de unión bioquímicos. Se obtuvo estructuras cristalinas para dos de los fragmentos unidos a NAMPT. Además, se aplicó la técnica de acoplamiento molecular para obtener la conformación y orientación próxima de los fragmentos. El nuevo inhibidor del NAMPT se consiguió por la unión de estos fragmentos a NAMPT ligada a FK866, el cual es un inhibidor conocido de la misma. Se llevó a cabo un cribado basado en fragmentos mediante NMR. Se utilizó nicotinamida (NAM) como elemento informativo, ya que se une a NAMPT y da lugar a un buen espectro de MNR. El FK866 fue usado como control positivo y su adición provocó que las señales en el espectro desaparecieran. Estas señales se deben a la union de NAM a NAMPT. Figura 7. Espectro de NMR del FK866. Posteriormente, se realizó un cribado de una biblioteca de 6000 fragmentos, de los cuales, 4 fragmentos provocaron una disminución de al menos un 80% en la intensidad de la señal del espectro de NMR. A continuación, se determinó la afinidad de estos fragmentos mediantes ensayos de unión. 20 Figura 8. Fragmentos seleccionados de la biblioteca. Para mejorar la eficiencia, se elaboró una hipótesis estructural. Se busca una estructura cristalina, solo dos fragmentos (2 y 5) dieron cristales de calidad óptima para que se pudiese obtener la estructura. Los otros fragmentos de interés (1, 3, 4 y 6), se sometieron a acoplamiento molecular para así obtener la disposición espacial correcta para su interacción con la proteína, mediante el programa Glide. Figura 9. Estructuras cristalinas de fragmentos superpuestas con FK866. Como se puede observar en la figura 9, los seis fragmentos se unen a la parte posterior del bolsillo de unión llenando el espacio que estaría ocupado por la nicotinamida. Esto implica que haya solo una dirección para el diseño de los fragmentos, debido a la 21 superposición de cada fragmento con FK866. Los fragmentos A y E son los que poseen mayor eficiencia para NAMPT, el fragmento F es el que posee la mejor opción para la elaboración sintética. La superposición del fragmento F, unido al bolsillo de unión de NAMPT, con FK866 muestra que el metileno del fragmento se superpone al nitrógeno amida de FK866. Esta amida de nitrógeno va a formar dos puentes de hidrógeno con la proteína, en presencia de agua. Uno se une al hidroxilo de la cadena lateral de S241 y el otro se une al carbonilo principal de V242 (figura9). Esto ofreció un nuevo punto de vista, y se demostró que la sustitución de metilenamida del fragmento por un resto de urea proporcionaría un aumento de la potencia. Además, debido a la superposición del fragmento 6 con FK866, se produciría un espacio hidrofóbico adicional, ocupado por un grupo fenilo terminal de FK866. Todo esto dirigió el estudio en el diseño del compuesto 7, que presenta una mayor afinidad y potencia. Figura 10. Compuesto 7 5.2. Obtención mediante FBDD de potentes moduladores alostéricos positivos dirigidos a los receptores mGluR2 (Szabó et al., 2018). El receptor metobotrópico de glutamato 2 (mGluR2) es un receptor acoplado a proteína G. Estos receptores están localizados ampliamente en el sistema nervioso central, interviniendo en numerosos procesos neuropsiquiátricos. El glutamato es un aminoácido no esencial y el principal neurotransmisor excitatorio del sistema nervioso central. Interviene en la plasticidad sináptica en personas adultas, en la neurogénesis y neurodegeneración. Al ser un aminoácido no esencial, no atraviesa la barrera hematoencefálica. Es sintetizado en la mitocondria neuronal, partiendo de glucosa entre otros precursores. Una vez sintetizado, el glutamato es liberado al citoplasma, donde se acumula en vesículas sinápticas. Este proceso es dependiente de Mg2+ y ATP. Posteriormente, el glutamato es liberado al espacio sináptico, promovido por la propagación del impulso nervioso hacia la terminal axónica. Este mecanismo es dependiente de la concentración de Ca2+ intracelular y se da por exocitosis. Una vez que 22 el glutamato está en el espacio sináptico es capaz de interactuar con sus receptos específicos. El receptor metabotrópico es un tipo de receptor del glutamato, llamados mGluR. Estos receptores están acoplados a proteínas G, por lo que la unión del glutamato al receptor no provoca la apertura de un canal intrínseco, sino que se produce una regulación en la transmisión sináptica y excitabilidad neuronal mediante la activación o inhibición de diversos sistemas efectores que están acoplados a proteínas G. Debido a esto, dichos receptores al inicio son más lentos mientras que su tiempo de acción es de mayor durabilidad, con lo que son capaces de modular la actividad neuronal un mayor tiempo (Flores-Soto et al., 2012). Con respecto a su estructura, consta de siete dominios transmembrana, que se encuentran separados por pequeñas asas intracelulares y extracelulares. Figura 11. Estructura de los receptores metabotrópicos del glutamato (Alcibíades et al., 2012) Dentro de los mGluR existen ocho subtipos, los cuales están divididos en tres grupos. Con respecto al grupo dos, su activación conlleva la inhibición de la adenilciclasa, la cual es la encargada de convertir el ATP en AMPc, provocando una disminución de este último, liberándose menor cantidad de glutamato, actuando como neuroprotectivo, es decir, manteniendo la transmisión del glutamato dentro del rango fisiológico, evitando que se dé una hiperexcitabilidad y que el cerebro se vea afectado. En relación con la patología de la esquizofrenia, según hipótesis, la hiperactividad de la transmisión del glutamato en regiones límbicas es el mecanismo que subyace en dicha patología. Se ha postulado que las moléculas agonistas de mGluR2 podrían llevar a cabo 23 una disminución de los síntomas esquizofrénicos, debido a su acción farmacológica, es decir, al ser capaces de reducir la transmisión del glutamato en la sinapsis, obteniéndose una nueva línea de investigación para el tratamiento de la esquizofrenia. Los agonistas de mGluR2 de acción directa han sido utilizados en ensayos clínicos, demostrándose que mejora la sintomatología positiva en los pacientes, siendo comparable con la olanzapina, fármaco utilizado en el tratamiento de la esquizofrenia, pero no se ha sido capaz de demostrar que aumente la prolactina o los síntomas extrapiramidales. Por esto, las líneas de investigación centraron nuevos objetivos, como son los moduladores alostéricos positivos (PAM) selectivos de subtipo. Los moduladores alostéricos positivos del mGluR2 se han incluido como farmacología potencial para el tratamiento de enfermedades psiquiátricas. El mecanismo de acción de estos ligandos consiste en activar el mGluR2 en el sitio de union alostérico potenciando la activación inducida por el glutamato. Existen dos moléculas de mGluR2 PAM que han formado parte de la clínica (Szabó et al., 2018). Son AZD8529 y ADX71149, la primera llegó hasta la fase dos del ensayo clínico en AstraZeneca, ensayada en pacientes esquizofrénicos, pero fue abandonada debido a la falta de eficacia. La segunda, investigada por Addex Therapeutics y Janssen Pharmaceuticals como fármaco para la esquizofrenia y la depresión ansiosa, mostró resultados favorables en pacientes esquizofrénicos pero no en la patología depresiva ansiosa. Figura 12. AZD8529 Figura 13. ADX71149 El estudio para la obtención de fragmentos de mGluR2 PAM comenzó con la búsqueda en una biblioteca de compuestos, identificándose como hit, un fragmento de benzotriazol sustituido con bencilo, el cual posee una mayor eficiencia de ligando (LE=0,49) y un pequeño tamaño (Nhev=16) en comparación con los ya conocidos mGluR2 24 PAM, los cuales tienen una media de Nhev=29 ± 4 y LE=0,25 ± 0,4. Una vez identificado el hit, se procedió a la optimización obteniéndose un derivado de biarilo, consiguiéndose una mejora en la potencia. Pero mostró virtualmente una baja estabilidad metabólica en los microsomas humanos, de ratón y de rata, con lo cual, el objetivo posterior fue mejorar esa estabilidad metabólica, manteniéndose los mismos niveles de potencia y eficiencia. Figura 14. Optimización del hit En relación con la química, se realizó una selección funcional, en la biblioteca elegida, en células que sobreexpresaban mGluR2, dando como resultado un hit, bencilbenzotriazol (compuesto 4), con una potencia aceptable y una alta eficiencia de ligando. La comparación estructural con compuestos de referencia conocidos de mGluR2 PAM, reveló que existen dos líneas de crecimiento potenciales: uno de ellos, está localizado en la posición 4 del núcleo del benzotriazol (vector 2) y el otro se encuentra en la posición para del grupo bencilo (vector 1). Los primeros ensayos se centraron en la posición para del grupo bencilo, intentando mejorar la estabilidad metabólica del biarilbenzotriazol (compuesto 5), a través del ensayo con distintos sustituyentes en el anillo fenil terminal. Los mejores resultados con respecto a la potencia se obtuvieron con la disustitución de 2,4 en el anillo de fenilo. 25 Figura 15. Esquema de la síntesis de benzotriazoles no sustituidos En el esquema se muestra la síntesis general de benzotriazoles no sustituidos. Partimos del benzotriazol disponible comercialmente y lo hacemos reaccionar con los derivados de bromobencilo en THF (tetrahidrofurano) usando NaHMDS (hexametildisilazano de sodio), obteniéndose un intermedio de bromoarilo. A éste se le hizo reaccionar con ácido aril borónico mediante acoplamiento de Suzuki, obteniéndose el hit 5 y derivados. Esta disustitución en las posiciones 2 y 4 permitió conseguir seis compuestos derivados del hit 5 con una mayor potencia y estabilidad metabólica, siendo el mejor perfil el derivado 11: Figura 16. Estructura del compuesto 11 Como inconveniente, estos derivados tienen un alto carácter lipofílico dando lugar a una solubilidad limitada. Por ello, se introdujo átomos de nitrógeno al anillo, obteniéndose cuatro derivados más. Entre estos últimos derivados, el 16 fue el que mostró una estabilidad metabólica y potencia aceptable con la lipofilia mejorada, nombrando este derivado como lead. Figura 17. Estructura del compuesto 16 Este compuesto 16, fue sometido a numerosos ensayos ADME (absorción, distribución, metabolismo y excreción), de farmacocinética y modelos de eficacia in vivo. Los 32 13. Farcaş E, Bouckaert C, Servais AC, Hanson J, Pochet L, Fillet M. Partial filling affinity capillary electrophoresis as a useful tool for fragment-based drug discovery: A proof of concept on thrombin. Anal Chim Acta. 2017; 984:211–22. 14. Chopin M. Principios básicos de electroforesis capilar: Técnica analítica de separación de analitos. Rev Tecnol y Salud. 2012; 1(2): 86-9. 15. Farcaş E, Hanson J, Pochet L, Fillet M. Capillary electrophoretic mobility shift displacement assay for the assessment of weak drug-protein interactions. Anal Chim Acta. 2018;1034:214–22. 16. Wandinger SK, Richter K, Buchner J. 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