Estudio microbiológico de infertilidad en yeguas

Anexo II UNIVERSIDAD DE LAS PALMAS DE GRAN CANARIA Departamento: Instituto Universitario de Sanidad Animal y Seguridad Alimentaria Programa de Doctorado: “SANIDAD ANIMAL” Título de la Tesis ESTUDIO MICROBIOLOGICO DE INFERTILIDAD EN YEGUAS Tesis Doctoral presentada por D. María Luisa Díaz-Bertrana Sánchez Dirigida por el Dr. José Bismarck Poveda Guerrero, el Dr. Christian de la Fe Rodríguez y la Dra. María Montserrat Rivera del Álamo El Director, El Director, La Directora, El Doctorando, José Bismarck. Poveda Christian De la Fe María Montserrat Rivera María Luisa Díaz-Bertrana Guerrero Rodríguez del Álamo Sánchez Las Palmas de Gran Canaria, a 1 de diciembre de 2012 JOSÉ B. POVEDA GUERRERO, CATEDRÁTICO DEL ÁREA DE CONOCIMIENTO DE SANIDAD ANIMAL Y COORDINADOR DEL GRUPO DE INVESTIGACIÓN DE EPIDEMIOLOGÍA Y MEDICINA PREVENTIVA VETERINARIA DE LA UNIVERSIDAD DE LAS PALMAS DE GRAN CANARIA. INFORMA: Que Doña María Luisa Díaz-Bertrana Sánchez Licenciada en Veterinaria por la Universidad de Las Palmas de Gran Canaria, ha realizado bajo mi dirección y asesoramiento el presente trabajo titulado “Estudio microbiológico de infertilidad en yeguas”, el cual considero reúne las condiciones y calidad científica para optar al grado de Doctor en Veterinaria. Y para que así conste a los efectos oportunos, firmo el presente informe en Las Palmas de Gran Canaria a 12 de Noviembre de 2012. Fdo: José B. Poveda Guerrero D. CHRISTIAN DE LA FE RODRÍGUEZ, Profesor Titular de Universidad del Departamento de Sanidad Animal de la Facultad de Veterinaria de la Universidad de Murcia, INFORMA que: El presente trabajo titulado “Estudio microbiológico de infertilidad en yeguas” que recoge la siguiente memoria, ha sido realizado por Dª. María Luisa Díaz-Bertrana Sánchez, Licenciada en Veterinaria por la Universidad de Las Palmas de Gran Canaria, bajo mi dirección y asesoramiento y que reúne las condiciones de originalidad y calidad científica requerida para que opte al Grado de Doctor en Veterinaria. Para que conste a los efectos oportunos, firmamos el presente informe en Murcia, a 12 de noviembre de 2012. Fdo.: Christian de la Fe Rodríguez Da. MARIA MONTSERRAT RIVERA DEL ALAMO, investigadora post-doctoral del Departamento de Medicina y Cirugía Animales de la Facultad de Veterinaria de la Universidad Autónoma de Barcelona, INFORMA que: Da MARÍA LUISA DÍAZ-BERTRANA SÁNCHEZ, licenciada en veterinaria por la Universidad de las Palmas de Gran Canaria, ha realizado el presente trabajo de tesis titulado “Estudio microbiológico de infertilidad en yeguas” bajo mi dirección y supervisión, reuniendo éste las condiciones científicas requeridas para optar el Grado de Doctor en Veterinaria. Y para que así conste a los efectos oportunos, firmo el presente documento en Bellaterra, a 13 de Noviembre de 2012. Maria Montserrat Rivera del Alamo DVM, PhD, Diplomada ECAR A Manolo y Menchu, mis padres. A mis seis hermanos. Índice VII ÍNDICE - INTRODUCCIÓN ..................................................................................................................... 1 - REVISIÓN BILIOGRÁFICA .................................................................................................. 4 INTRODUCCIÓN .................................................................................................................... 4 AGENTES INFECCIOSOS ASOCIADOS A INFERTILIDAD EQUINA ............................. 5 -CLASIFICACIÓN DE LAS BACTERIAS ........................................................................ 5 -MICROORGANISMOS GRAM POSITIVOS .................................................................. 6 -MICROORGANISMOS GRAM NEGATIVOS ................................................................ 8 MECANISMOS DE PATOGENICIDAD .............................................................................. 14 PATOGÉNESIS: PATOFISIOLOGÍA: .................................................................................. 15 - 1 Endometritis crónica ..................................................................................................... 16 - 2 Transmisión sexual ....................................................................................................... 16 - 3 Endometritis inducida post-servicio (EPIS) ................................................................. 16 - 4 Infección uterina crónica .............................................................................................. 16 DIAGNÓSTICO ..................................................................................................................... 20 TRATAMIENTO .................................................................................................................... 25 -EXPERIENCIA 1 E.1: ETIOLOGÍA DE LOS PROCESOS DE ENDOMETRITIS EN YEGUAS ................... 36 E.1.1 - INTRODUCCIÓN ................................................................................................. 36 E.1.2MATERIAL Y METODOS .................................................................................... 37 E.1.2.1Diseño del estudio ........................................................................................... 37 E.1.2.2Animales ......................................................................................................... 37 E.1.2.3Recogida y procesado de las muestras ............................................................ 38 E.1.2.4Identificación de los aislamientos ................................................................... 41 E.1.2.4.1Pruebas preliminares ............................................................................... 41 E.1.2.4.1.1Tinción de Gram ............................................................................. 41 E.1.2.4.1.2Prueba de la catalasa ....................................................................... 42 E.1.2.4.1.3Prueba de la coagulasa .................................................................... 43 E.1.2.4.1.4Prueba de la oxidasa ....................................................................... 43 E.1.2.4.2Identificación mediante galerías API ...................................................... 44 E.1.2.4.2.1Galería API Staph ........................................................................... 44 VIII E.1.2.4.2.2Galería API 20E .............................................................................. 46 E.1.3-RESULTADOS Y DISCUSIÓN.............................................................................. 49 E.1.4ANEXOS ................................................................................................................ 79 ANEXO E.1.4.1: Composición de los medios de cultivo ........................................... 79 ANEXO E.1.4.2: Composición de los reactivos de la tinción Gram .......................... 84 ANEXO E.1.4.3: Componentes del sistema de identificación mediante galerías API ................................................................................................................ 85 -EXPERIENCIA 2 E.2: ESTUDIO DE LA SENSIBILIDAD ANTIBIÓTICA DE LAS CEPAS BACTERIANAS AISLADAS DE CASOS DE INFERTILIAD EQUINA ............................................................. 90 E.2.1INTRODUCCIÓN ....................................................................................................... 90 E.2.2MATERIAL Y MÉTODOS ......................................................................................... 93 E.2.2.1Diseño del estudio ................................................................................................ 93 E.2.2.2Cepas analizadas .................................................................................................. 94 E.2.2.3Antibióticos .......................................................................................................... 94 E.2.3RESULTADOS Y DISCUSIÓN............................................................................. 95 -EXPERIENCIA 3 E.3: EFICACIA DEL TRATAMIENTO DE LOS PROCESOS DE ENDOMETRITIS EN YEGUAS: SEGUIMIENTO DE 48 CASOS ................................................................. 119 E.3.1INTRODUCCIÓN ..................................................................................................... 119 E.3.2MATERIAL Y MÉTODOS ....................................................................................... 120 E.3.2.1Diseño del estudio .............................................................................................. 120 E.3.2.2Yeguas analizadas .............................................................................................. 120 E.3.2.3Tratamiento de la endometritis y evaluación de su eficacia ............................... 120 E.3.3RESULTADOS Y DISCUSIÓN ................................................................................ 126 -CONCLUSIONES .................................................................................................................. 148 -RESUMEN-SUMMARY RESUMEN ........................................................................................................................... 150 SUMMARY .......................................................................................................................... 152 -AGRADECIMIENTOS .......................................................................................................... 155 -BIBLIOGRAFÍA .................................................................................................................... 158 Revisión bibliográfica 6 microorganismos oportunistas (Shin y col., 1979; Ricketts y col., 1993). Los estudios publicados hasta la fecha coinciden en el hecho de que los principales microorganismos aislados en los procesos de metritis son Escherichia coli y Estreptococos β-hemolíticos. Sin embargo, difieren en la prevalencia de uno o del otro. Así, Albihn y col. (2003) establecieron que el microorganismo aislado con más frecuencia en las endometritis equinas era Escherichia coli, seguido de los estreptococos β -hemolíticos, mientras que en otros estudios ha sido este grupo el aislado con mayor frecuencia (Shin y col., 1979; Ricketts y col., 1993; Langoni y col. 1997). Además de los patógenos oportunistas, cabe destacar la participación de otros microorganismos como Taylorella equigenitalis, Klebsiella pneumoniae (cápsula tipo 1, 2 y 5) y algunas cepas de Pseudomonas aeruginosa como microorganismos que pueden transmitirse por vía venérea (Paccamonti y Picock, 2009). También se ha descrito la presencia de Pasteurella spp. y Citrobacter spp. en algunas yeguas con cuadro clínico de endometritis (Sertich, 2004). A continuación, describiremos brevemente algunos de los microorganismos que se asocian más frecuentemente a esta patología. Microorganismos Gram positivos Como ya hemos comentado anteriormente, los estreptococos del tipo β-hemolíticos se aíslan frecuentemente como agentes causales de metritis equinas. En algunos casos, los trabajos realizados parecen determinar que estos microorganismos son los más prevalentes en una determinada zona o país asociados a este tipo de patologías (Urosevic y col., 2010). Entre las especies más prevalentes, destacan Streptococcus equi subsp. zooepidemicus, Streptococcus dysgalactiae subsp. equisimilis o Revisión bibliográfica 7 Streptococus equi subsp. equi (Casagrande y col., 2011; Overbeck y col., 2011; Urosevic y col., 2010). Entre ellos, Streptococcus equi subsp. zooepidemicus es uno de los microorganismos bacterianos que se aísla con mayor frecuencia en las endometritis equinas. De acuerdo con la literatura publicada hasta la fecha, se aísla en el 22-54% de todos los casos de endometritis equina (Bain, 1966; Wingfield Digby y Ricketts, 1982; Welsh, 1984; Silva y col., 1999; Watson, 2000; Blanchard y col., 2003) y es el responsable del 15-20% de los abortos observados en la yegua (Roberts, 1971; Welsh, 1984). Es un patógeno oportunista extracelular que se encuentra normalmente en los genitales externos tanto de yeguas como de sementales clínicamente normales. La primera línea de defensa de la yegua contra las infecciones por estreptococos se basa en mecanismos no específicos que estimulan la eliminación física de las bacterias, así como de anticuerpos específicos y células fagocitarias que se encargan de eliminar las bacterias (Mims, 1987), En las yeguas normales, este agente es eliminado rápidamente por los neutrófilos uterinos (Cheung y col., 1985; Watson y col. 1987), si bien tiene la capacidad de adherirse a las superficies epiteliales mediante proteínas que se unen a la fibronectina (Lindmar y col., 1996) y una cápsula de ácido hialurónico (Wibawan y col., 1999), haciendo que su eliminación del lumen uterino sea más difícil. El resto de especies de estreptocos se detectan esporádicamente en las endometritis del caballo (Casagrande y col., 2011). Streptococus equi subsp. equi es un descendiente o biovariedad de un microorganismo ancestral precursor de Streptococcus equi subsp. zooepidemicus (Timoney, 2004), que en el caballo se asocia principalmente a la etiología de la papera equina, una enfermedad que afecta principalmente al aparato respiratorio Revisión bibliográfica 8 (Waller y col., 2011) Por su parte, Streptococcus dysgalactiae subsp. equisimilis se considera un patógeno oportunista e infrecuente en el caballo, donde se ha relacionado en algunas ocasiones con procesos similares a la papera equina, determinándose su presencia en un porcentaje importante de los hisopos nasales chequeados en algunos estudios (Preziuso y col., 2010). Es importante mencionar que a nivel diagnóstico, estudios recientes, han demostrado la validez tanto de las técnicas convencionales de diagnóstico como del uso de la PCR para la identificación de los estreptococos en muestras recogidas en yeguas con problemas de fertilidad (Casagrande y col., 2011). Los estafilococos también se encuentran entre los agentes etiológicos que se aíslan comúnmente en los casos de infertilidad en yeguas. En este sentido, diversos trabajos sitúan a Staphylococcus aureus entre los microorganismos más prevalentes asociados a este tipo de problemas (Szeredi y col., 2003; Frontoso y col., 2008). Es interesante mencionar que entre los estafilococos aislados de casos de metritis equinas, las cepas de Staphylococcus aureus que son resistentes a la meticilina (MRSA) suelen tener un perfil genético similar (Shimizu y col., 1997). Otras especies de estafilococos coagulasa negativos, como Staphylococcus epidermidis también suelen aislarse de este tipo de procesos aunque con menor frecuencia (Frontoso y col., 2008; Urosevic y col., 2011). Microorganismos Gram negativos Escherichia coli y otras especies de enterobacterias que poseen una serie de características muy similares a esta especie, englobadas en Revisión bibliográfica 9 conjunto en las enterobacterias coliformes, se aíslan frecuentemente en los casos de metritis e infertilidad equina (Overbeck y col., 2011; Urosevic y col., 2010). En algunas ocasiones, es incluso el microorganismo más prevalente en algunos de los estudios realizados, asociados en muchos casos a yeguas repetidoras más que a yeguas con sintomatología clínica de endometritis (Albihn y col., 2003). Escherichia coli es capaz de fabricar biocapas que los antibióticos difícilmente pueden atravesar (Costerton y col., 1995; Leblanc y Causey, 2009), por lo que son necesarias concentraciones muy elevadas de dichos fármacos para conseguir la eficacia necesaria para eliminar la infección. Pseudomonas aeruginosa es otro microorganismo oportunista que, esporádicamente, ha sido asociado como agente causal de endometritis en las yeguas (Allen y col., 2011) y, según algunos autores, se contempla como un patógeno de transmisión venérea (Atherton y Pitt, 1982; Blanchard y col., 1992). Algunos trabajos indican que la utilización de agua contaminada podría ser la fuente de infección para yeguas y sementales, más que la propia transmisión venérea del agente (Allen y col., 2011). No obstante, estudios recientes muestran que la utilización de sementales infectados durante la monta natural puede producir la trasmisión venérea del microorganismo y una disminución de la calidad embrionaria, si bien tanto la monta natural como la inseminación artificial con semen de estos animales infectados parece no conducir a una reducción de la fertilidad (Guimarães y col., 2012). Klebsiella pneumoniae es otra bacteria Gram-negativa que también se ha descrito como agente etiológico en casos de metritis equina, jugando el semental un papel importante en la transmisión de dicho microorganismo (Dimock y Edwards, 1926; Crouch y col., 1972). Sin embargo, igual que Revisión bibliográfica 10 sucede con otros microorganismos, no todos aquellos sementales portadores de esta bacteria que presentan sintomatología, formando ésta parte de la flora normal del prepucio. A este respecto, un estudio realizado por Platt y Atherton (1976) puso de manifiesto que muchos sementales son portadores de Klebsiella pneumoniae cápsula tipo 7, considerando dicho microorganismo como parte de la flora bacteriana normal de la piel del prepucio. Dada la localización anatómica de la bacteria, su inoculación en el tracto genital de la hembra durante la monta es más que probable, aunque, aparentemente, es de poca o ninguna patogenicidad en situaciones normales. Los casos de metritis asociados a Klebsiella pneumoniae cápsula tipo 7 parecen ser infecciones esporádicas y oportunistas, presumiblemente asociadas con deficiencias en las defensas normales del tracto genital. Sin embargo, otros tipos de cápsulas, como los tipos 1, 2 y 5; sí han demostrado estar asociadas con brotes de metritis (Dimock y Edwars, 1926; Edwards, 1928; Platt y Atherton, 1976). Otros microorganismos que se han aislado en el tracto reproductivo de las yeguas son diversas especies de micoplasma, concretamente Mycoplasma equigenitalium y Mycoplasma subdolum. Estos dos microorganismos se han asociado frecuentemente con problemas de infertilidad, endometritis, vulvitis y aborto en yeguas, y con fertilidad reducida y balanopostitis en sementales (Kirchhoff y col., 1973, 1980; Moorthy y col., 1977; Heitmann y col., 1979). Sin embargo, su presencia en el tracto genital no siempre origina problemas reproductivos (Kirchhoff y col., 1973, 1980; Moorthy y col., 1977; Heitmann y col., 1979; Bermúdez y col., 1988) y estudios recientes han demostrado una relación de tipo comensal del micoplasma con el tracto genital de los sementales (Spergser y col., 2002). Revisión bibliográfica 11 Metritis contagiosa equina (Taylorella equigenitalis) Taylorella (T.) equigenitalis es un cocobacilo Gram-negativo de crecimiento lento, perteneciente a la familia Alcaligenaceae. Para aislar T. equigenitalis es necesario utilizar medios de cultivo enriquecidos que contengan, además, antibióticos para controlar el crecimiento de la mayoría de bacterias, tanto Gram-negativo como Gram-positivo, contaminantes (Heath y Timoney, 2008). Asimismo, es necesario incubar las placas inoculadas en condiciones microaerofílicas durante al menos 7 días dado que dicho microorganismo es de crecimiento lento y las colonias pueden no ser visibles con tiempos de incubación más cortos (Ward y col. 1984). Respecto a sus características bioquímicas, es un microorganismo que no produce fermentación ni tampoco es proteolítico. Sí que es, en cambio, positivo a la citocromo oxidasa, catalasa y fosfatasa alcalina (Platt y Taylor, 1982; Heath y Timoney, 2008). Por otro lado, es muy lábil en el medio ambiente (Timoney y col., 1978a) y se elimina rápidamente con una gran variedad de desinfectantes, exposición a rayos UV, temperaturas elevadas y baja humedad. Sin embargo, en condiciones ambientales óptimas, puede sobrevivir durante algún tiempo en diferentes fómites utilizados en la cubrición de la yegua o en la extracción de semen del semental (Powell, 1981; Timoney, 1996). T. equigenitalis es un microorganismo sensible a una gran variedad de antibióticos (Taylor y col., 1978; Platt y Taylor, 1982). Su implicación como agente causal de endometritis equina contagiosa se describió por primera vez en 1977 (Crowhurst, 1977; Timoney y col., 1977). Es una patología venérea que se puede diseminar por contacto directo o indirecto entre yegua y semental (Crowhurst, 1977; Platt y col. 1977b; Ricketts y col., 1977; Powell, 1981; Platt y Taylor, Revisión bibliográfica 12 1982). Obviamente, la transmisión es más eficaz cuando se utiliza la monta natural, ya que permite un contacto más directo entre los puntos de persistencia del microorganismo, ya sea el portador el macho o la hembra. Sin embargo, aunque el riesgo es considerablemente menor en comparación con la monta natural, también puede transmitirse cuando se realiza una inseminación artificial (IA) a través del semen. Por otro lado, el uso de materiales contaminados como espéculos vaginales, fórceps, bandas para colas, mangas obstétricas, etc., también puede ser una vía de transmisión del microorganismo cuando se realiza una IA. La endometritis causada por T. equigenitalis se caracteriza por la presencia de secreción vaginal mucopurulenta abundante y un grado variable de vaginitis, endometritis y cervicitis que acaban provocando infertilidad temporal y, raramente, abortos precoces (Nakashiro y col. 1981). En un estudio experimental, las yeguas infectadas con T. equigenitalis también desarrollaron salpingitis (Acland y Kenney, 1983). En ocasiones, sin embargo, la yegua puede ser asintomática (Matsuda y Moore, 2003). Se ha descrito que, independientemente de si la endometritis cursa de manera sintomática o asintomática, un 20-25% de las yeguas quedan portadoras después de la infección (Wood y col., 2007). La mayoría de las yeguas portadoras se consideran portadoras clitorianas, ya que el microorganismo queda almacenado en el seno y la fosa clitoriana (Simpson y Eaton-Evans, 1978). Sin embargo, una pequeña minoría de yeguas son portadoras uterinas (Timoney y Powell, 1988). El principal vector de esta patología es el propio semental (Duquesne, 2007) que, además, no presenta sintomatología de ningún tipo. Para ser más exactos, en el caso de los sementales, la bacteria coloniza zonas específicas de su tracto reproductor y actúa como un mero comensal Revisión bibliográfica 13 (Platt y col. 1978; Powell, 1981; Platt y Taylor, 1982) sin que el animal se infecte. En la literatura sólo se ha descrito un caso de un semental que presentaba una infección real por T. equigenitalis a nivel testicular, epididimario, de vesículas seminales y uretra diagnosticada post-mortem (Schluter y col. 1991). Las principales zonas de detección de T. equigenitalis son la fosa uretral, el seno uretral, la uretra distal y la superficie externa del pene y el prepucio (Powell 1982; Heath y Timoney, 2008). Por el contrario, las hembras, como se ha dicho antes, sí presentan sintomatología clínica. Inicialmente, la infección se limita al tracto reproductivo (Powell 1981; Platt y Taylor, 1982). A diferencia del semental, las yeguas infectadas con el microorganismo desarrollan una respuesta inmunitaria humoral que, normalmente, es de corta duración (Benson y col., 1978; Croxton-Smith y col. 1978; Bryans y col., 1979). El periodo de incubación del microorganismo es de 2 a 13 días, al cabo de los cuales la yegua presenta secreción vaginal mucopurulenta que puede persistir durante dos semanas o más si no se trata convenientemente. La secreción vaginal se acompaña, como se ha comentado previamente, de endometritis, cervicitis y vaginitis de gravedad variable (Crowhurst, 1977; Platt y col., 1977b, 1978; Ricketts y col., 1977; Timoney y col. 1977, 1978b; Powell, 1981). Cuando T. equigenitalis infecta a una yegua preñada, ésta puede presentar o no síntomas. Pueden presentar secreción vaginal intermitente a lo largo de la gestación. Algunas pueden desarrollar cierto grado de placentitis (Ricketts y col., 1977; Powell y Whitwell, 1979). Sin embargo, raramente se observan abortos después del séptimo u octavo mes de gestación (Nakashiro y col., 1981). Por otro lado, T. equigenitalis parece no comprometer el bienestar del feto (Powell y Whitwell, 1979). Revisión bibliográfica 14 Mecanismos de patogenicidad Las bacterias disponen de factores de virulencia diferentes y tienen distintos métodos de evadir la respuesta inmunitaria, lo que puede originar un amplio abanico de síntomas clínicos, así como hallazgos ecográficos y laboratoriales. Algunos microorganismos, como Escherichia coli, se adhieren con fuerza a las superficies epiteliales, evitando así la eliminación física. Otros, como Streptococcus spp.., estimulan la producción de un exudado inflamatorio que interfiere en el proceso fagocitario de los neutrófilos. Por otro lado, Pseudomonas aeruginosa y algunas levaduras y hongos secretan una matriz adhesiva o biocapa que sirve de base para el crecimiento y el mantenimiento de las micro-colonias bacterianas. Estas biocapas, además, proporcionan una resistencia inherente hacia los antibióticos y las defensas inmunitarias, tanto celulares como humorales, dando lugar a infecciones crónicas persistentes incluso después de tratamientos prolongados con antibióticos (Costerton y col., 1995; Donlan y Costerton, 2002; Otto, 2006). Algunas bacterias y hongos forman placas que no se identifican mediante citología uterina, mientras que otras no producen fluido intrauterino. La respuesta uterina al patógeno también contribuye a que la infección se establezca y cronifique. Durante la fase aguda y subaguda de la endometritis, la producción de moco por parte de las células epiteliales del endometrio está aumentada (Causey y col., 2000; Causey, 2007), mientras que cuando nos enfrentamos a un endometrio con inflamación crónica, hay pérdida del epitelio y de la capa de moco, lo que facilita la adhesión bacteriana (Causey y col., 2008). Revisión bibliográfica 15 Patogénesis La endometritis se asocia habitualmente con infecciones por bacterias aeróbicas. Sin embargo, también puede deberse a infecciones por bacterias anaeróbicas, pneumovagina, acumulación de orina en la vagina, exposición al semen e infusión intrauterina con sustancias irritantes (Riddle y col., 2007). Las bacterias aisladas más habitualmente en los cultivos uterinos son Streptococcus equi subp. zooepidemicus y Escherichia coli (Shin y col., 1979; Ricketts y col., 1993; Albihn y col., 2003), ambas comensales de las mucosas y consideradas como patógenos oportunistas (Shin y col., 1979; Ricketts y col., 1993; Riddle y col., 2007). De acuerdo con Albihn y col. (2003), las infecciones por Escherichia coli están más asociadas a yeguas repetidoras que a yeguas con sintomatología clínica de endometritis, mientras que las infecciones por estreptococos están más relacionadas con la presencia de sintomatología clínica. Estos resultados están en concordancia con los obtenidos por Causey (2006) en los que se pone de manifiesto que, en función del agente bacteriano, los factores implicados en el desarrollo de la endometritis, como la inducción de inflamación, la adherencia epitelial, la resistencia a la fagocitosis y la viscosidad de las secreciones varían ampliamente. Así, podemos afirmar que la endometritis es una patología de naturaleza multifactorial. A pesar de esto, se puede clasificar, basándose en la etiología y la patofisiología en cuatro categorías diferentes: (1) endometriosis (endometritis degenerativa crónica), (2) patologías de transmisión sexual, (3) endometritis persistente inducida por la monta y (4) endometritis infecciosa crónica (Troedsson y col., 1995; Troedsson, 1997). Revisión bibliográfica 22 La biopsia uterina, y más concretamente la puntuación desarrollada por Kenney y Doig (1986), también se utiliza para diagnosticar el grado de endometritis en las yeguas en combinación con otras pruebas diagnósticas, proporcionando información sobre la capacidad del útero de llevar a término una gestación. Esta técnica diagnóstica está indicada en yeguas que quedaron vacías en la estación anterior, yeguas repetidoras durante la estación reproductiva, yeguas con historia de muertes embrionarias precoces y yeguas con endometritis o piometra clínicas. La obtención de la muestra endometrial puede realizarse en cualquier momento del ciclo reproductivo, pero es necesario conocerlo porque, en función de la actividad ovárica, la arquitectura endometrial puede variar. Son varios los parámetros que se avalúan en una biopsia uterina: repuesta inflamatoria, fibrosis endometrial, lagunas linfáticas, quistes endometriales y glándulas quísticas. En lo referente a la respuesta inflamatoria endometrial, ésta puede ser de tipo agudo o crónico. En las reacciones agudas, predomina la infiltración de polimorfonucleares neutrófilos, sobretodo en el estrato compacto o el epitelio luminar, así como en las vénulas y capilares del estrato compacto. La inflamación crónica, sin embargo, se caracteriza por la presencia de infiltrados de linfocitos y, menos frecuentemente, células plasmáticas, siderófagos, eosinófilos y mastocitos. Las inflamaciones crónicas afectan, habitualmente, al estrato compacto, pero pueden afectar también al estrato esponjoso en forma de focos discretos con una distribución dispersa. Cuando se observa la presencia de reacciones crónicas de moderadas a graves, sobre todo si hay presencia de células plasmáticas, es indicativo de una estimulación antigénica continuada, lo que debería poner al clínico en alerta sobre la posible existencia de una Revisión bibliográfica 23 causa infecciosa de la endometritis. También es importante valorar la extensión/dispersión de la inflamación en la muestra. Cuanto mayor sea la dispersión, menor será la capacidad del endometrio de llevar a término una gestación. El grado de fibrosis endometrial es un factor muy importante en la evaluación de las biopsias uterinas. A diferencia de los cambios inflamatorios, los cambios fibróticos son permanentes y no van a reducir en grado, convirtiéndose en un importante factor limitante de la capacidad reproductiva de la yegua. Las fibras de colágeno se depositan alrededor de las glándulas endometriales, de manera individual o formando nidos, y la membrana basal del epitelio luminar (Kenney, 1978). La gravedad de la fibrosis se clasifica en función del número de capas de colágeno periglandular y el número de focos fibróticos por campo lineal. En cuanto a las lagunas linfáticas, se desconoce su papel exacto en la capacidad de llevar a término una gestación, pero se ha observado que cuando tienen una distribución extensa y se detectan por palpación, parecen reducir marcadamente dicha capacidad. Si aparecen en combinación con quistes linfáticos, el efecto negativo es acumulativo. Por último, los quistes endometriales parecen estar asociados con muertes embrionarias, mientras que los quistes glandulares parecen estar asociados con las repeticiones. En función de los cambios histológicos observados, podemos clasificar las muestras en diferentes categorías: I, IIA, IIB y III, tratándose del tipo I de un endometrio normal y el III un endometrio gravemente alterado. Revisión bibliográfica 24 Categoría I: el endometrio no presenta ni hipoplasia ni atrofia. No hay cambios patológicos o, si los hay, éstos son leves y escasos. Categoría IIA: el endometrio presenta infiltraciones inflamatorias difusas de leves a moderadas del estrato compacto o focos frecuentes, aunque dispersos, tanto en el estrato compacto como en el esponjoso. Se ven cambios fibróticos, de una a tres capas de colágeno, alrededor de glándulas individuales o nidos en una proporción inferior a 2 por 5.5 mm de campo lineal. Las lagunas linfáticas son lo bastante extensas como para notarlas por palpación. Categoría IIB: se observan focos inflamatorios difusos y diseminados moderadamente graves. Se observan cambios fibróticos extensos y difusos, mostrando cuatro o más capas de colágeno alrededor de las glándulas endometriales, o una media superior a 2 nidos por 5.5 mm de campo lineal en una media de cuatro o más campos. Categoría III: existen cuatro criterios que determinan la clasificación de una muestra endometrial dentro de esta categoría. (1) cambios inflamatorios graves, difusos y extensos, (2) fibrosis extensa de manera uniforme de las ramas glandulares de cinco o más nidos por 5.5 mm de campo lineal, (3) presencia elevada de lagunas linfáticas que dan una sensación gelatinosa a los pliegues endometriales y (4) atrofia profunda. Por último, la endoscopia uterina es el único método que nos permite evaluar la extensión real de las lesiones intrauterinas, así como su gravedad, y establecer con más precisión el potencial reproductivo de esa hembra (Bracher y Allen, 1991; Bracher y col., 1992). La endoscopia uterina es útil sobretodo en yeguas que presentan endometritis subclínica debido a infecciones focales, adherencias uterinas, retención de copas Revisión bibliográfica 25 endometriales, cuerpos extraños, cicatrices endometriales y pérdida de pliegues endometriales (LeBlanc y Causey, 2009). Dado que el edema uterino puede dar resultados erróneos, esta técnica se aplica preferiblemente durante la fase de diestro. Para poder visualizar correctamente el endometrio, es necesario llenar el lumen uterino con aire o con solución salina estéril. La imagen es siempre más clara cuando se insufla aire, pero éste es irritante para el endometrio. Una vez que se ha realizado la exploración, es necesario vaciar el contenido uterino. Tratamiento Los objetivos del tratamiento de la endometritis son, fundamentalmente, tres: corregir los defectos de las defensas uterinas, neutralizar los agentes patógenos y controlar la inflamación post-cubrición (LeBlanc y Causey, 2009). El tratamiento utilizado actualmente se basa en la irrigación del útero, seguida por la administración de un fármaco ecbólico, oxitocina (1025 UI i.v. o i.m.) o cloprostenol (250 µg i.m.), entre 4 y 8 horas después de la cubrición (Brinsko y col, 1990; LeBlanc y col., 1994a; Troedsson y col., 1995; Combs y col., 1996; Pycock y Newcombe 1996; Rasch y col., 1996; Knutti y col., 2000; Pycock, 2009). Estudios anteriores basados en la respuesta inflamatoria post-cubrición, la contractibilidad uterina y el efecto de la irrigación uterina (Williamson y col., 1987; Brinsko y col., 1990; Katila 1995) han establecido el período de tratamiento en esas 4-8 horas post-cubrición como el más eficaz para la obtención de buenos resultados reproductivos. Revisión bibliográfica 26 - Lavado uterino. El lavado uterino con, preferiblemente, solución salina fisiológica o solución de Ringer lactato estériles, es un tratamiento importante en los procesos de endometritis. Este tratamiento (1) ayuda a la eliminación de microorganismos, neutrófilos no funcionales y otras sustancias que interfieren en la función de neutrófilos activos y antibióticos, (2) estimula la contractibilidad uterina para ayudar a la eliminación mecánica del contenido del útero y (3) ayuda en el reclutamiento de neutrófilos nuevos y opsoninas, probablemente debido a la irritación mecánica del endometrio, para combatir los agentes infecciosos (Blanchard y col., 2003). Las soluciones estériles se introducen mediante un catéter que dispone de un globo hinchable en el extremo que permitirá que el líquido se mantenga en el interior del útero. Para asegurarnos que la solución estéril se distribuye homogéneamente por todo el lumen, se puede realizar un masaje uterino por vía transrectal. A continuación, se vaciará el contenido uterino por gravedad. Es importante evaluar el aspecto macroscópico del contenido recogido y continuar haciendo lavados hasta que éste sea claro. Por último, es importante evaluar la eliminación total del líquido del lumen uterino mediante examen ecográfico. - Fármacos ecbólicos. Existen diversos fármacos ecbólicos entre los que los más utilizados son la oxitocina y la prostaglandinas. De estos dos fármacos, la oxitocina es la que más se utiliza en el tratamiento de la endometritis. Esta hormona provoca contracciones uterinas tanto en yeguas cíclicas, como en preñadas y de post-parto, por lo que estimula Revisión bibliográfica 27 el drenaje uterino en aquellas hembras en las que la eliminación está disminuida (Allen, 1991). Estudios anteriores (LeBlanc y col., 1994; Paccamonti y col., 1999) han demostrado, por otro lado que la oxitocina estimula la liberación de prostaglandina F 2α (PGF 2α ), por lo que las contracciones miometriales pueden ser debidas, en parte al efecto de la propia oxitocina y, en parte, a la liberación de PGF 2α (Cadario y col., 1995; Paccamonti y col, 1997). Además del lavado uterino y la aplicación de agentes ecbólicos existen otros tratamientos coadyuvantes como la administración de antibióticos intrauterinos, infusión intrauterina de plasma, infusión intrauterina de desinfectantes, curetage uterino, infusiones de calostro, terapia hormonal y prostaglandina E local (Riddle y col., 2003; Pycock, 2007). - Antibióticos intrauterinos. El uso de antibióticos intrauterinos es, cuanto menos, controvertido. En un estudio desarrollado por Troedsson (1995) se observó que la eficacia de la administración intrauterina de antibiótico era igual de efectiva que la combinación de lavado uterino y PGF 2α . Sin embargo, en este estudio se inoculó un único tipo de agente microbiológico. En condiciones normales, la población bacteriana causante de la endometritis es mixta y, además, en muchas ocasiones, el lavado uterino no puede realizarse durante las primeras 12 horas, por lo que los resultados de este estudio podrían no representar la realidad clínica de la endometritis. En la práctica clínica, los veterinarios combinan la aplicación de lavados uterinos con la infusión de antibióticos de amplio espectro para evitar el crecimiento bacteriano. Los antibióticos más utilizados para el tratamiento de la endometritis se especifican en la Tabla 1. Revisión bibliográfica 28 Según estudios realizados con anterioridad, el diagnóstico microbiológico, así como el estudio de la sensibilidad antibiótica, debe realizarse con la mayor brevedad posible para poder instaurar la terapia antimicrobiológica adecuada cuando la yegua todavía está en estro (Ricketts y Mackintosh, 1987; Ricketts, 1989). Como ya se ha mencionado, el uso de antibióticos intrauterinos es una práctica muy extendida como tratamiento (Hurtgen, 2006; Liu y Troedsson, 2008) y prevención (Picock y Newcombe, 1996; LeBlanc, 2009) de las infecciones uterinas. El razonamiento para utilizar la administración intrauterina de antibióticos se basa en la hipótesis de que las reservas de bacterias están localizadas en el interior del lumen uterino y, por lo tanto, los antibióticos administrados por esta vía alcanzan concentraciones más elevadas en comparación con los antibióticos administrados por vía sistémica (Picock y Newcombe, 1996). Sin embargo, este tratamiento tiene detractores debido al efecto irritante de dichos fármacos sobre el endometrio, así como la inhibición de los mecanismos de defensa del útero (Causey, 2006), el riesgo de la aparición de resistencias (Hinrichs y col., 1992; McDonnell y Watson, 1992) y el incremento de la incidencia de las endometritis fúngicas (Liu y Troedsson, 2008). A pesar de estos posibles efectos secundarios de los antibióticos intrauterinos, su utilización es una práctica muy extendida en la clínica reproductiva equina (Albihn y col., 2003). Trabajos recientes muestran que muchas de las cepas aisladas de casos de metritis son sensibles a la penicilina (Urosevic y col., 2010). Otros estudios recomiendan la utilización de la enrofloxacina, una fluoroquinolona de segunda generación, como terapia preventiva frente a las bacterias más comúnmente asociadas a las endometritis equinas (González y col., 2010) dado su amplio espectro de actividad tanto con Revisión bibliográfica 29 bacterias Gram-negativas como Gram-positivas. La enrofloxacina es un antibiótico altamente liposoluble y una capacidad de unión a proteínas baja, lo que permite que tenga un elevado volumen de distribución. Este elevado volumen de distribución permite alcanzar concentraciones elevadas en muchos tejidos y fluidos corporales (McKellar y col., 2004), presentando concentraciones más elevadas en dichos tejidos que a nivel sérico (Prescott y Baggot, 1994). Otro antibiótico que se ha estudiado recientemente es el ceftiofur, una cefalosporina de tercera generación con un amplio espectro de acción. Es un fármaco muy eficaz en el tratamiento de infecciones tanto por bacterias Gram positivas como Gram negativas (Salmon y col., 1996; Haggett y Wilson, 2008). También la cefquinoma, una cefalosporina de cuarta generación, ha demostrado un amplio espectro de actividad contra un elevado número de agentes bacterianos evaluados in vitro como Streptococcus spp., Staphylococcus spp., Pseudomonas spp., Moraxella spp., Haemophilus spp., corinebacterias, enterococos, Escherichia coli y otros microorganismos anaerobios Gram-positivos (Limbert y col., 1991; Murphy y col., 1994; Shpigel y col., 1997; Guérin-Faublée y col., 2003). Este antibiótico parece ser resistente a las β-lactamasas de Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Citrobacter spp. y Enterobacter spp. (Limbert y col., 1991). Un estudio reciente desarrollado por Parlevliet y col., 200) ha demostrado la eficacia de este antibiótico como tratamiento intrauterino de la endometritis en yeguas. Los resultados muestran que el antibiótico alcanza fácilmente la concentración mínima inhibitoria (CMI) necesaria para las especies bacterianas aisladas con más frecuencia en los casos de endometritis, Streptococcus equi subsp. zooepidemicus y Escherichia coli. Por otro lado, el estudio también ha Revisión bibliográfica 30 demostrado que es un antibiótico seguro dada la falta de reacción inflamatoria intrauterina significativa después de su administración. Tabla 1.Gráfico adaptado del Manual de Reproducción Equina. Mckinnon y col., 1992. Pautas para la administración de algunas drogas intrauterinas de uso general Droga Dosificación Comentarios Penicilina (Na + o K + sal) 5 millones de U Muy eficaz frente a los estreptococos; económico y de uso general. Sulfato de Gentamicina 500-1000 magnesio Altamente eficaz; generalmente no irrita cuando está mezclado con un volumen igual de NaHCO 3 (bicarbonato sódico) y diluido en solución salina. Ampicilina 1-3 g Uso en las altas diluciones porque puede ser irritante;( Na + ) la sal deja un precipitado en endometrio que permanece en el útero por un período prolongado. Carbenicilina 2-6 g Su utilización es reservada para microorganismos persistentes como Pseudomonas spp. (eficacia sinérgica con los aminoglicosidos); generalmente dado en días alternos con los aminoglicosidos; levemente irritante. Ticarcilina 1-3 g Eficaz frente a Pseudomonas spp..; no utilizar frente a Klebsiella spp. Timentin 3-6 g Actividad de amplio espectro frente a diversas bacterias tanto Grampositivas como Gram negativas; contiene ticarcilina y ácido clavulánico para proteger ticarcilina contra la degradación cerca βlactamasa enzima productora de bacterias. Sulfato de Amikacina 1-2 g Eficaz frente a Pseudomonas spp.., Klebsiella spp.., y otros organismos Gram-negativos persistentes; mezclado con el igual volumen de NaHCO3 y diluido en solución salina. Sodio de Ceftiofur (Naxcel) 1 g Cefalosporina de la tercera generación; se ha utilizado de forma empírica una vez al día bien por via intramuscular o por infusión intrauterina; Eficaz para el tratamiento de amplio espectro frente a bacterias Grampositivas y Gram negativas. Sodio de Cefazolin 1 g Cefalosporina de primera generación; Se ha utilizado de forma empírica aplicada una vez al día por vía intramuscular durante 2-3 semanas; Eficacia en tratamientos de amplio-espectro frente a bacterias Grampositivas y gran negativas. Revisión bibliográfica 31 Pautas para la administración de algunas drogas intrauterinas de uso general Droga Dosificación Comentarios Sulfato del Kanamicina 1 g No utilizar en periodos cercanos a la reproducción, porque es tóxica para los espermatozoides. Polimixina B 1 millón de U Uso frente a las bacterias Gram-negativas, particularmente Pseudomonas spp. Sulfato de neomicina 3-4 g Uso frente a cepas sensibles de Escherichia coli; puede ser irritante; Cloranfenicol 2-3 g Puede ser muy irritante, especialmente en la aplicación por vía oral. Nitrofurazona 50-60 ml La eficacia es altamente cuestionable. Povidona-yodo (5ml de la solución común de Betadine, diluido en 1 L) 1 litro (lavado solución) Si las soluciones se concentran también, la endometritis severa puede resultar y/o deteriorar la función de los neutrófilos. La actividad bactericida in vitro se mantiene en las concentraciones tan bajas como 0.01%-0.005%; indicado para el lavado de úteros con inflamación no específica o infecciones fúngicas o causadas por levaduras. Nistatina 500.000 U Utilizado sobre todo frente a infecciones causadas por levaduras (e.g., Candida Albicans l) ; diluir en 100 a 250 ml agua estéril, lo cual produce una suspensión insoluble que debe mezclarse de forma vigorosa inmediatamente antes de la infusión. Anfotericina B magnesio 200 Utilizado para las infecciones con Aspergillus spp.., Candida spp.., Histoplasma spp., o Mucor spp..; diluir en 100 a 250 ml agua estéril; se produce una suspensión relativamente insoluble. Clotrimazol magnesio 700 Utilizado para el tratamiento de las infecciones ocasionadas por la levadura (Candida spp.); disponible como la crema, las tabletas, o supositorios; preferible realizar el tratamiento diluyendo las tabletas en 40 ml. de agua estéril. Generalmente infundido después de lavado uterino. Miconazol magnesio 200 Es el más eficaz para las infecciones de la levadura (Candida spp.) pero ha sido utilizados por algunos médicos para las infecciones fúngicas resistentes en yeguas infundiendo una vez diariamente hasta 10 días; Diluir en salino estéril de 40-60 ml antes de la infusión. Fluconazol magnesio 100 Agente antifúngico del triazole sintético; propuesto como infusión para el tratamiento fungicida o frente a Candida spp. , administrado una vez diariamente durante 5-10 días; Ajustar el pH a 7 en caso de necesidad como el pH varía a partir de la 4-8. Vinagre el 2% (v/v) 20 ml/l de salino Utilizado empíricamente como adjunto para tratar endometritis causadas por levaduras; lavado uterino de 1 litro; eficacia no probada científicamente. Experiencia 1 38 Las muestras fueron recogidas en yeguas de Alicante, procedentes del Hospital Clínico Veterinario San Vicente del Raspeig (n=225), de la isla de Gran Canaria (n= 111), en Sevilla de la Clínica Aznalcollar (n= 36), en Barcelona de la Clínica Eguisof (n=9) y en Pontevedra de la Clínica O`Cabalo (n= 6). Dicha información también se detalla en la tabla E1.1. La edad de las yeguas analizadas oscilaba entre 2 y 21 años, con una media de 11.5 años. Los animales sometidos a dicho estudio venían con historiales de infertilidad repetida, bien por monta natural o mediante el uso de la inseminación artificial. La mayor parte de las muestras que llegaban a nuestro laboratorio procedían de yeguas con citología endometrial positiva, observándose más de dos polimorfonucleares neutrófilos por campo a 400 aumentos (Riddle y col., 2007). E1.2.3. Recogida y procesado de las muestras Todas las muestras se obtuvieron siguiendo un mismo protocolo de actuación en el campo, basado en la esterilización y la asepsia de la zona del periné de la yegua con povidona yodada diluida al 1%, utilizando para ello papel de un solo uso, limpiando siempre desde el centro hacia la periferia de la vulva. Posteriormente, se colocó el guante de exploración rectal estéril, lubrificándolo con solución salina estéril. Para la toma de muestras se empleó una torunda estéril de 3 vías (Equinvet, Equivet, Madrid, España). Dicha torunda se protegió con la mano y se introdujo en la vulva atravesando con ella la vagina, superando la barrera anatómica del cérvix uterino, el cual en el momento de la toma de muestras se encontraba abierto ya que las yeguas estaban en celo en el momento del muestreo. Una vez en el cuerpo del útero, se retiró el precinto Experiencia 1 39 de seguridad situado en la parte distal de la torunda, y se presionó para extraer la torunda que quedaba cubierta por la guía. Acto seguido la cabeza de la torunda se frotó contra la pared uterina y se volvió a introducir en la guía. Se retiró de la yegua y, una vez en el exterior, dicho hisopo se cortó y se sumergió en un medio de cultivo SP4 II sin ampicilina para su transporte. Una vez recogidas e identificadas, las muestras se enviaron al laboratorio a temperatura ambiente adjuntando todo el historial reproductivo. Todas las muestras se procesaron en el Laboratorio de Epidemiología y Medicina Preventiva de la Facultad de Veterinaria de la Universidad de Las Palmas de Gran Canaria de la siguiente manera: 1) Aquéllas que llegaron con una variación de color en el medio, indicando crecimiento bacteriano, se inocularon directamente en los distintos medios de cultivo. El volumen del inoculo fue de 10 µl. 2) Las que no mostraron variación de color en el medio de cultivo se incubaron a 37ºC durante un periodo de tiempo variable, pero nunca inferior a 24 horas, para ser inoculadas posteriormente cuando se produjera el cambio de color. Los medios de cultivo utilizados fueron Columbia Agar,MacConkey Agar, Glucosa Sabouraud Agar y Baird-Parker Agar (Ver Anexo E.1.4.1). - Columbia Agar. Medio de cultivo general en el que crece un gran número de especies bacterianas y que es utilizado para el aislamiento de Streptococcus spp. con un pH ligeramente ácido, donde se favorecen las reacciones hemolíticas precisas. Experiencia 1 40 - McConkey.Agar Éste es un medio diferencial para la selección y recuperación de bacilos Gram-negativos. Contiene sales biliares y cristal violeta que inhiben el crecimiento de bacterias Grampositivas. Los organismos fermentadores de lactosa crecen formando colonias rojas-rosas mientras que los no fermentadores de lactosa forman colonias incoloras o blancas (Frost, 1984). - Glucosa Sabouraud Agar. Se utiliza para el cultivo de hongos y levaduras, así como para la cuantificación de estos microorganismos en alimentos, muestras clínicas y otros materiales. Están especialmente indicados para dermatofitos, mientras que los que contienen maltosa favorecen el crecimiento de hongos filamentosos. - Baird Parker.Agar Se utiliza para el aislamiento de Staphyloccoccus spp. Contiene litio y telurito potásico para suprimir el crecimiento de organismos no deseados, en tanto que permite el crecimiento de Staphylococcus aureus. Además, contiene piruvato y glicina para potenciar el crecimiento de este género. El telurito y los componentes de la yema de huevo son los responsables de la diferenciación de estafilococos positivos a la coagulasa. Aquéllos se caracterizan por la formación de colonias convexas, de color negro, brillantes, rodeadas por una zona transparente. (Frost, 1984) Finalmente, se procedió a la identificación de los aislamientos mediante pruebas específicas detalladas posteriormente. Experiencia 1 41 E1.2.4. Identificación de los aislamientos E1.2.4.1. Pruebas preliminares Una vez aislados los agentes etiológicos, éstos se sometieron a pruebas preliminares de identificación básicas como la tinción de Gram, la prueba de la catalasa, la oxidasa y la coagulasa. Por último, se utilizaron galerías API para la identificación final de los mismos. E1.2.4.1.1. Tinción de Gram y bacterioscopia directa Para la bacterioscopia directa se realizó la tinción de Gram. Esta tinción permite clasificar las bacterias en Gram-positivas y en Gram-negativas. Las primeras se caracterizan porque retienen en su interior el colorante cristal violeta tras su aclarado con alcohol, mientras que en las Gram-negativas se observan únicamente mediante la adición de safranina, ya que éstas pierden el color violeta tras su decoloración, observándose, así de color rosado (Tortora y col., 2007). Para la observación de las bacterias, se llevó a cabo la tinción de Gram, según el método de Hucker modificado (Doestch, 1981) a partir de un frotis de cada muestra. Para ello, se utilizaron los siguientes reactivos (Ver Anexo E.1.4.2): ∂ Solución de cristal violeta. ∂ Solución de lugol. ∂ Decolorante (alcohol). ∂ Solución de safranina Experiencia 1 42 Una vez realizado el frotis, se aplicó la solución de cristal violeta durante 1 minuto y se aclaró con agua destilada. Posteriormente, se realizó la misma operación con la solución de lugol y se lavó con agua destilada. Seguidamente, se cubrió la muestra con alcohol para eliminar el colorante durante 15 segundos. Tras lavar nuevamente con agua destilada, por último, se aplicó la solución de safranina alrededor de 30 segundos y se aclaró con agua destilada. Una vez seco, el frotis se observó al microscopio con aceite de inmersión a 1000X, pudiendo determinarse la morfología de las bacterias presentes (cocos, bacilos, cocobacilos, etc...) así como la presencia de bacterias Gram-negativas o Gram-positivas. E1.2.4.1.2. Prueba de la catalasa Se utilizó para comprobar la presencia del enzima catalasa que se encuentra en la mayoría de las bacterias aerobias y anaerobias facultativas que contienen citocromo. Se realiza de la siguiente manera: • Con el asa de siembra, se recoge el centro de una colonia pura de 18-24 horas y se coloca sobre un portaobjetos limpio de vidrio. • Agregar con gotero o pipeta Pasteur una gota de H 2 O 2 al 30% sobre el microorganismo sin mezclarlo con el cultivo. • Observar la formación inmediata de burbujas (resultado positivo). • Desechar el portaobjetos. • Si se invierte el orden del método (extender la colonia sobre el agua oxigenada) pueden producirse falsos positivos. Experiencia 1 43 Reacción positiva: Formación de burbujas inmediatamente. El gas originado transcurridos 20-30 segundos no se considera un resultado positivo. Reacción negativa: Ausencia de formación de gas. E1.2.4.1.3. Prueba de la coagulasa: Se realizó la prueba de la coagulasa utilizando el test “Staphytest Plus” (Oxoid, Reino Unido) (bio Mériux. S.A., Francia) siguiendo las instrucciones del fabricante. Todo ello para diferenciar Staphylococcus aureus del resto de Staphylococcus spp., agrupadas genéricamente con estafilococos coagulasa negativos. E1.2.4.1.4. Prueba de la oxidasa: Este procedimiento se llevó a cabo con el fin de identificar las bacterias que producen citocromo oxidasa. Esta prueba puede realizarse mediante dos métodos: 1. Método sobre papel de filtro. Se coloca un trozo de papel de filtro de 3x3 cm aproximadamente en una placa de Petri. A continuación se añaden 2-3 gotas del reactivo de Kovacs en el centro del papel. Se extiende, con el asa de siembra, una colonia sobre el papel impregnado. La reacción de color positiva se produce a los 5-10 segundos. Experiencia 1 44 2. Método en placa directa. En este método, se agregan directamente 2 ó 3 gotas de de reactivo de Kovacs a algunas colonias. Se observan los cambios de color que, con el reactivo que se utilizó, se produce a los 10-15 minutos. Para este estudio, se utilizó el segundo método, obteniendo, por lo tanto, mayor información de las bacterias aisladas. E1.2.4.2. Identificación mediante galerías API E1.2.4.2.1. Galería API Staph El API Staph (bioMérieux. S.A., Francia) es un sistema para la identificación de Staphylococcus spp., Micrococcus spp.y Kocuria spp.y fue utilizado para la identificación de los primeros (Anexo E.1.4.3). Incluye 20 microtubos que contienen substratos deshidratados, donde se inocula la suspensión bacteriana elaborada a partir de una ampolla de dicha galería consiguiendo una turbidez de 0.5 de McFarland, con el fin de que se produzcan reacciones durante la incubación, traduciéndose en cambios de color bien de forma espontánea o mediante la adición de reactivos, como son el aceite de parafina, VP 1 y 2, NIT 1 y 2, ZYM A y B. La inoculación en la galería se efectuó mediante pipetas para rellenar los microtubos sin sobrepasar el nivel de éstos y evitando la formación de burbujas. En determinados tests se requerían condiciones de anaerobiosis, la cual se consiguió mediante el aceite de parafina. Tras completar la inoculación, se incubó a 37ºC durante 24 horas. Experiencia 1 45 Una vez completada la incubación, se añadieron los reactivos en los tests necesarios para la observación de los resultados mediante el cambio de color tras su adición. Por último, para conocer la bacteria estudiada se realizó la determinación del perfil numérico, sumando los diferentes números de cada grupo en las reacciones positivas y por medio de la identificación a través de la página web www.apiweb.biomerieux.com, donde introduciendo dicho perfil nos informa de qué bacteria se trata, así como del nivel de precisión de la identificación y de los tests complementarios en caso de una baja discriminación. Preparación de la galería: • Unir el fondo y la tapa de una cámara de incubación y repartir en los alveolos aproximadamente 5ml de agua destilada o desmineralizada con el fin de crear una atmósfera húmeda. • Inscribir la referencia de la cepa en la lengüeta lateral de la cámara. • Sacar la galería de su bolsa hermética y depositarla en la cámara. Preparación del inóculo • Realizar un precultivo en Agar sangre a 35-37ºC • Verificar que la cepa pertenece a la familia de los Micrococcacea, (morfología, Gram, Catalasa), así como de su pureza. • Abrir una ampolla de API STAPH Medium. • Preparar una suspensión bacteriana homogénea de turbidez equivalente al 0.5 de McFarland. Experiencia 1 46 Inoculación de la Galería: • Rellenar los tubos de la galería con la suspensión preparada con API STAPH Medium utilizando una pipeta, siguiendo las indicaciones del fabricante. Posteriormente, se incubaron a 35-37ºC durante 18-24 horas. E1.2.4.2.2. Galería Api 20E En este caso, para la identificación de estos microorganismos se utilizó la galería API 20E. Este sistema permite identificar microoganismos Gramnegativos no exigentes que utilizan 23 test bioquímicos estandarizados y miniaturizados, y una base de datos. La lista completa de las bacterias que pueden identificarse usando este sistema aparece en la tabla de identificación, al final de la ficha técnica. El sistema API 20E consta de 20 microtubos que contienen substratos deshidratados. Estos test se inoculan con una suspensión bacteriana la cual hidrata el medio. Durante la incubación, se producen cambios de color espontáneos o revelados por adición de reactivos. La lectura de las reacciones se hace de acuerdo con la tabla de lectura y la identificación mediante el API 20 E Index o el programa informático para identificación, tal y como se ha descrito en el apartado E.1.2.4.2.2. El API 20E no debe ser utilizado directamente a partir de muestras de origen clínico u otro. Los microorganismos a identificar deben, en primer lugar, ser aislados sobre un medio de cultivo adaptado al cultivo de Experiencia 1 47 microorganismos Gram-negativos no exigentes (ej. MacConkey) según las técnicas usuales de bacteriología. Preparación de la galería: • Reunir el fondo y la tapa de una cámara de incubación y repartir aproximadamente 5 ml de agua destilada o desmineralizada en los alvéolos del fondo con el fin de crear una atmósfera húmeda. • Inscribir la referencia de la cepa en la lengüeta lateral de la cámara. • Sacar la galería de su envase. • Colocar la galería en la cámara de incubación. Preparación del inóculo • Abrir una ampolla de NaCl 0,85% Medium (5ml) ó una ampolla de Suspensión Medium (5ml) o utilizar un tubo que contenga 5ml de agua fisiológica estéril ó de agua destilada estéril, sin aditivos. Con la ayuda de una pipeta o PSIpette, tomar una sola colonia Experiencia 1 54 muchos casos en cultivo puro, a partir de esta localización. En este sentido, un estudio llevado a cabo por Madsen y Christensen (1995) puso de manifiesto que la flora bacteriana predominante en el tracto reproductor del caballo eran estafilococos coagulasa-negativos. En este estudio, en el 76% de la muestras obtenidas, hubo crecimiento de estafilococos (Staphylococcus lentus, Staphylococcus capitis, Staphylococcus haemolyticus y Staphylococcus xylosus), en el 52% de las muestras crecieron corineformes y en el 33% de las muestras crecieron estreptococos y lactobacilos. De modo que una posible explicación para esta elevada prevalencia, sería una posible trasmisión por contacto sexual entre el macho y la hembra. Así mismo, del mismo modo que los estafilococos son la flora bacteriana predominante en el tracto reproductor del caballo, también podría serlo en el tracto reproductor de la hembra, existiendo, por lo tanto, la posibilidad de que la contaminación del útero tenga un origen ascendente desde la vagina. También debemos considerar que a pesar de las precauciones tomadas, pueda haberse contaminado alguna de las muestras, por lo que el porcentaje de aislamientos de estafilococos obtenidos podría estar sobrevalorado. No obstante, los resultados obtenidos en este trabajo de Tesis, con un 22% de casos positivos parecen indicarnos el interés potencial de estos microorganismos como agentes asociados a las metritis equinas, lo cual, , ya ha sido observado por algunos autores (Szeredi y col., 2003; Frontoso y col., 2008). Ante la ausencia de información de estudios relacionados con el aislamiento de micrococos en úteros de yeguas, es de reseñar que estos microorganismos sí que han sido aislados en leche de esta especie en diferentes momentos de la lactancia (Rios y col.,1987). Así, de un total de 204 muestras de leche provenientes de igual número de glándulas, se Experiencia 1 55 Estafilocos identificados en el estudio 45624 1 54 11 Staphylococcus capitis Staphylococcus haemolyticus Staphylococcus epidermidis Staphylococcus intermedius Staphylococcus lentus Staphylococcus lugdunensis Staphylococcus sp. Staphylococcus xylosus aislaron 9 especies de microorganismos en 32 muestras de leche correspondiendo la mayor frecuencia de aislamiento a Micrococcus luteus aislado en 15 muestras de leche, que corresponde al (7,35%). Figura E1.3: Estafilococos aislados durante el estudio microbiológico También resulta muy interesante la presencia de Pseudomonas spp. como agente causal del 10% de los casos estudiados (Figura E1.4), pues este microorganismo está clasificado habitualmente como un patógeno oportunista en este tipo de procesos (Allen y col., 2011). Si bien, diversos autores también lo contemplan como un patógeno de transmisión venérea (Atherton y Pitt, 1982; Blanchard y col., 1992), lo que podría explicar su alta frecuencia de aislamiento en este estudio. Algunos trabajos indican que la utilización de agua contaminada podría ser la fuente de infección para yeguas y sementales, más que la propia transmisión venérea del agente (Allen y col., 2011). Sin Experiencia 1 56 embargo, en este caso, las yeguas donde se realizó el aislamiento de estos microorganismos procedían indistintamente de todos los lugares geográficos utilizados en el presente trabajo, lo que no permite obtener conclusiones válidas al respecto. No obstante, en este sentido, estudios recientes muestran que la utilización de sementales infectados durante la monta natural puede producir la trasmisión venérea del microorganismo (Guimarães y col., 2012). Figura E1.4: Porcentaje de cepas de Pseudomonas aeruginosa aisladas en relación a otras pseudomonas durante el estudio microbiológico Presencia de P. aeruginosa 55% 45% Pseudomonas aeruginosa Pseudomonas spp En este trabajo, se determinó la presencia de Bordetella spp. en un total de dos yeguas analizadas. A pesar de la ausencia de información en referencia a la participación de esta bacteria en procesos de endometritis infecciosa, en algunas ocasiones, algunos autores han constatado su participación en casos aislados de infertilidad en esta especie (Mather y col., 1973; Mohan y Obwolo, 1991). No obstante, la presencia de este microorganismo en el Experiencia 1 57 caballo está documentada en el caso de problemas respiratorios (Koenhe y col., 1981). El aislamiento esporádico de algunos hongos en este trabajo, parece coincidir con trabajos previos donde estos microorganismos se detectan en un número limitado de casos. Su presencia asociada a estos casos de infertilidad podría asociarse con el tratamiento prolongado con antibióticos en los animales con infertilidad con antibióticos, además del manejo intensivo o asociado a la reproducción de las yeguas, que podría favorecer su presencia (Blue, 1987; Frondoso y col., 2008). Del mismo modo, otras bacterias como Vibrio spp. o Aeromonas spp. se aíslan esporádicamente en casos de problemas de fertilidad equina, si bien su significación general es muy limitada (Frontoso y col., 2008). También se ha producido el aislamiento esporádico de otras especies bacterianas cuya posible participación en estos procesos debe ser estudiada con más detenimiento. Tabla E.1.3: Resultados microbiológicos individuales en función de la edad, origen y raza de los animales chequeados. NOMBRE EDAD ORIGEN RAZA IDENTIFICACION FINAL P.coagulasa JARCA 18 1 4 Negativa CAMI 5 1 1 Enterococcus faecalis NINA 5 1 1 Escherichia coli ESCULTORA 5 1 1 Proteus mirabalis VENTOSA 21 1 1 Staphylococcus spp. CN EDILA 18 1 1 Klebsiella pneumoniae EMOTIVA 18 1 1 Enterococcus faecalis Experiencia 1 58 NOMBRE EDAD ORIGEN RAZA IDENTIFICACION FINAL P.coagulasa AIROSA 5 1 1 Klebsiella pneumoniae AIROSA 5 1 1 Enterococcus faecalis DONCELLA 6 1 1 Negativa BOGOTA 11 1 1 Pseudomonas spp. ALGABITA 14 3 3 Escherichia coli NINA 5 1 1 Escherichia coli NINA 5 1 1 Staphylococcus spp. CN CAMI 5 1 1 Escherichia coli CARRILLO ESPINOSA 10 1 3 Proteus spp. DOLORES 5 1 3 Negativa NIÑA 7 1 3 Negativa ENVIDIADA 5 1 1 Pseudomonas spp. FABULOSA 5 1 1 Streptococcus spp. ALGABITA 14 3 3 Escherichia coli ALGABITA 14 3 3 Staphylococcus capitis ROCIERA V 20 3 3 Escherichia coli LIBERTADORA 9 1 1 Klebsiella spp. LIBERTADORA 9 1 1 Staphylococcus spp. ESTRELLA 5 1 1 Proteus spp. DADIVOSA 12 1 1 Pseudomonas spp. AMAPOLA 20 1 1 Klebsiella spp. SIDERITA 11 2 2 Escherichia coli SIDERITA 11 2 2 Staphylococcus spp. CN CARA BELLA 15 2 2 Pseudomonas spp. ARANWEN 18 1 3 Klebsiella spp. Experiencia 1 59 NOMBRE EDAD ORIGEN RAZA IDENTIFICACION FINAL P.coagulasa LADY 5 1 3 Klebsiella spp. CORDOBESA 17 3 3 Serratia spp. INDIANA 10 1 3 Streptococcus spp. CAMI 5 1 1 Pseudomonas spp. DONCELLA 4 1 1 Proteus spp. NINA 4 1 1 Escherichia coli PIA 4 2 3 Pseudomonas spp. PIA 4 2 3 Staphylococcus spp. CN SEVILLA 36 21 3 3 Aerococcus viridans SEVILLA 37 21 3 3 Pseudomonas aeruginosa RASKY 8 2 2 Proteus mirabalis RASKY 8 2 2 Staphylococcus capitis GANDULA 12 1 1 Streptococcus spp. Nº 16 8 3 1 Proteus mirabalis RIGA 23 3 1 Ochrobactrum anthropi ELEGIDA 5 3 1 Pseudomonas aeruginosa COPA 5 3 1 Enterobacter sakazakii HISPANICA 9 3 3 Pseudomonas spp. ELUDIDA 9 3 3 Escherichia coli KARA 8 1 3 Pseudomonas spp. KARA 8 1 3 Staphylococcus spp. CN ADORADA V. 20 3 1 Proteus spp. ADORADA 20 3 1 Myroides spp. ADORADA 20 3 1 Staphylococcus capitis ABORA 7 2 3 Bordetella spp. Experiencia 1 60 NOMBRE EDAD ORIGEN RAZA IDENTIFICACION FINAL P.coagulasa GRECIA 5 2 3 Klebsiella ornithinolytica ROBERTA BAYA 9 2 2 Bordetella spp. RUMBERA 13 1 3 Pseudomonas spp. RUMBERA 13 1 3 Staphylococcus spp. CN VALSEQUILLA 8 2 2 Streptococcus spp. ELUDIDA 6 1 3 Streptococcus spp. ELUDIDA 6 1 3 Staphylococcus capitis ADORADA VI 20 3 1 Pseudomonas spp. ADORADA VI 20 3 1 Staphylococcus spp. CN QUISKA 9 3 1 Escherichia coli VOLUNTARIA 13 3 3 Myroides spp. ISABOR 5 2 3 Escherichia coli ISABOR 5 2 3 Staphylococcus spp. CN DESCONOCIDO 6 3 3 Pseudomonas aeruginosa DESCONOCIDO 6 3 3 Staphylococcus spp. CN ISIDRO 8 3 1 Escherichia coli DIEGO CHECHE 7 3 1 Serratia spp. DIEGO CHECHE 7 3 1 Staphylococcus spp. CN RIGA 23 3 1 Klebsiella pneumoniae RIGA 23 3 1 Staphylococcus intermedius ANIMOSA 10 3 1 Escherichia coli ANIMOSA 10 3 1 Staphylococcus intermedius R.P.L 6 3 1 Proteus panneri R.P.L 6 3 1 Micrococcus spp. R.P.L 6 3 1 Negativa Experiencia 1 61 NOMBRE EDAD ORIGEN RAZA IDENTIFICACION FINAL P.coagulasa BODIA 9 2 2 Staphylococcus spp. CN CHARNELA 11 3 1 Negativa ALVAR 12 3 3 Escherichia coli ALVAR 12 3 3 Staphylococcus spp. CN GARA 10 2 3 Negativa FAUSTA 6 2 3 Escherichia coli MISS ALTINA 5 2 2 Escherichia coli MISS ALTINA 5 2 2 Staphylococcus haemolyticus MONTESDEOCA 7 2 2 Aeromonas hydrophila MONTESDEOCA 7 2 2 Staphylococcus spp. CN EDILA 18 1 1 Klebsiella pneumoniae EMOTIVA 18 1 1 Klebsiella ornithinolytica CARBONITA 12 1 1 Klebsiella pneumoniae GITANA 12 2 3 Pseudomonas aeruginosa CORREAS 15 1 1 Candida spp. NICOLASA 12 2 2 Escherichia coli NICOLASA 12 2 2 Staphylococcus epidermidis EMOTIVA 18 1 1 Negativa EDILA 18 1 1 Negativa EDEL 10 2 2 Escherichia coli GAVIA 5 2 3 Pseudomonas spp. AZUZENA 11 1 1 Pseudomonas aeruginosa ANIMOSA 7 1 1 Staphylococcus spp. CN DOMINGA 6 2 2 Streptococcus spp. TINA 8 2 2 Pseudomonas aeruginosa Experiencia 1 62 NOMBRE EDAD ORIGEN RAZA IDENTIFICACION FINAL P.coagulasa PINEDA 3 2 2 Negativa AZUZENA 12 1 1 Escherichia coli AZAHARA 9 1 1 Streptococcus spp. BANDURRIA 8 1 1 Streptococcus spp. CAMELA 5 1 1 Streptococcus spp. MARTILLERA 7 1 1 Negativa LUMINOSA 7 1 1 Escherichia coli KIRICA 6 1 1 Pseudomonas aeruginosa NOCEDA 8 1 1 Pseudomonas spp. BOLERA 13 1 1 Enterobacter spp. AVENTAJADA 12 1 1 Pseudomonas aeruginosa HORMIGUERA 8 1 1 Serratia spp. MARTILLERA 7 1 1 Escherichia coli LAVADA 11 2 3 Streptococcus spp. ESCRIBO 10 2 3 Staphylococcus spp. CN CONDESA 5 1 1 Pseudomonas spp. LUMINOSA 7 1 1 Serratia spp. KATABA 8 1 1 Staphylococcus xylosus CONDESA 5 1 1 Escherichia coli KIRICA 8 1 1 Enterobacter spp. MISS ALTINA 5 2 2 Staphylococcus haemolyticus GISELLE 11 1 3 Escherichia coli BAMBINA 9 5 3 Negativa BARQUERA 4 1 1 Staphylococcus haemolyticus ALBORADA XII 5 1 1 Staphylococcus xylosus Experiencia 1 63 NOMBRE EDAD ORIGEN RAZA IDENTIFICACION FINAL P.coagulasa GALOPADORA 12 1 1 Negativa CANTORA V 4 1 1 Streptococcus spp. FILIPINAS 7 1 1 Staphylococcus xylosus JUICIOSA 9 1 1 Staphylococcus xylosus MISS ALTINA 5 2 2 Pseudomonas aeruginosa YESSIE 10 2 3 Enterobacter aerogenes DECIDIDA 14 1 1 Negativa COPLA 13 1 1 Klebsiella spp. COPLA 13 1 1 Staphylococcus xylosus DOÑA ROCIERA 9 1 1 Staphylococcus spp. CN DOÑA ZORAIDA 7 1 1 Staphylococcus spp. CN DOÑA MANUELA 7 1 1 Staphylococcus spp. CN GREISLAND 11 2 2 Escherichia coli BAYONA 9 2 3 Staphylococcus spp. CN CARACOLA 15 1 1 Streptococcus spp. MAXIMINA 7 2 3 Escherichia coli ROBERTA BAYA 8 2 2 Escherichia coli RED POLY 9 2 2 Enterobacter spp. BELLA DE SAN MARTIN 8 2 2 Escherichia coli BURBUJITA 9 2 3 Enterobacter spp. TAMARA 7 2 3 Staphylococcus spp. CN FURIA 11 4 3 Streptococcus spp. TABAQUERA 9 1 1 Escherichia coli MIVI 7 2 2 Staphylococcus haemolyticus MANOLITO MORALES 12 2 2 Aerococcus viridans Experiencia 1 70 NOMBRE EDAD ORIGEN RAZA IDENTIFICACION FINAL P.coagulasa SABANA 6 2 3 Streptococcus spp. BILLETERA 12 2 2 Staphylococcus spp. CN DESCARADA 8 2 1 Enterococcus faecalis RABINA 6 2 3 Pseudomonas aeruginosa LUCITANO 7 2 1 Staphylococcus spp. CN J.V 7 1 1 Streptococcus spp. BODIA 10 2 2 Escherichia coli PRIETA 9 2 2 Staphylococcus spp. CN MIRABALA 7 2 2 Streptococcus spp. URSULINA 6 1 1 Streptococcus spp. MARQUESA 10 1 1 Aerococcus viridans CASTAÑUELA 15 4 3 Enterococcus faecalis MIRACONCHA 8 2 2 Citrobacter spp. OLIVERA 6 1 1 Enterococcus faecalis CHENDA 10 2 3 Pseudomonas aeruginosa MAYOR 7 2 3 Streptococcus spp. FLAMENCA 8 1 1 Staphylococcus spp. CN VERDEGAS 11 1 3 Streptococcus spp. PALMERA 6 1 3 Escherichia coli SENCILLA 8 1 1 Escherichia coli BIENVENIIDA 18 1 1 Escherichia coli ALAZANA 6 1 1 Negativa CANARIA 5 2 3 Kluveria spp. CUBANA 7 1 3 Proteus spp. MIMOSA 7 1 1 Serratia spp. Experiencia 1 71 NOMBRE EDAD ORIGEN RAZA IDENTIFICACION FINAL P.coagulasa RISUEÑA 8 1 1 Negativa GIRALDINA 5 1 1 Staphylococcus spp. CN FARANDULA 9 1 1 Negativa ENEIDA 7 1 1 Escherichia coli MIMOSA 8 1 1 Proteus spp. CUBANA 7 1 3 Citrobacter spp. IMPALA 8 1 1 Pseudomonas aeruginosa LORENTE ESCARELA 10 1 1 Escherichia coli LUNERA 6 1 1 Klebsiella pneumoniae JARA 8 1 1 Klebsiella pneumoniae ESTRELLA 7 1 1 Proteus spp. JARA 7 2 3 Negativa LENITA 7 1 1 Staphylococcus spp. CN ADA 11 1 1 Staphylococcus spp. CN BAÑERA 6 1 1 Klebsiella pneumoniae FULERA 10 1 1 Pseudomonas aeruginosa FURIOSA 12 2 1 Klebsiella pneumoniae MAYOR 5 2 3 Staphylococcus spp. CN ALBA 6 1 3 Negativa CHIVATA 15 1 1 Klebsiella pneumoniae ALBA 6 1 3 Staphylococcus spp. CN ALGAIDA 7 1 1 Enterobacter aerogenes ABRILEÑA 7 1 1 Negativa ALBA 5 1 3 Staphylococcus spp. CN DIVINA 7 1 1 Staphylococcus spp. CN Experiencia 1 72 NOMBRE EDAD ORIGEN RAZA IDENTIFICACION FINAL P.coagulasa RECOLETA 5 1 1 Staphylococcus spp. CN BAYO GRANADO 8 1 1 Kluveria spp. AGRADECIDA 7 1 1 Negativa NICARAGUA 14 1 1 Escherichia coli FAVORITA 8 1 1 Enterobacter aerogenes ESCRITORA 8 1 3 Pseudomonas spp. JAMAIKA 6 1 1 Negativa DUQUESA 16 1 1 Proteus spp. HUNGARA 15 1 1 Staphylococcus spp. CN CAPRICHOSA 10 1 3 Staphylococcus spp. CN UTANA 10 1 1 Negativa CERVATINA 6 1 1 Serratia spp. CARIBEÑA 8 1 1 Pseudomonas spp. DESTACADA 7 1 1 Staphylococcus spp. CN FENISIA 7 1 1 Staphylococcus spp. CN ATRUCHADA 9 1 1 Pseudomonas spp. ESCOGIDA 6 1 1 Staphylococcus spp. CN OLIVERA II 7 1 1 Negativa VENTOLERA 6 1 1 Staphylococcus spp. CN CACAHUETE 8 1 1 Staphylococcus spp. CN PIA 7 1 1 Staphylococcus spp. CN INFANTA 10 1 3 Staphylococcus spp. CN MORAIMA 10 1 1 Streptococcus spp. BATALLA 12 1 1 Negativa VALENCIA 8 1 1 Pseudomonas spp. Experiencia 1 73 NOMBRE EDAD ORIGEN RAZA IDENTIFICACION FINAL P.coagulasa ELEGIDA 7 4 1 Enterobacter spp. PERLA 6 1 1 Kluveria spp. RISUEÑA 16 1 1 Escherichia coli DANA 9 2 3 Negativa ESCANDALOSA 7 1 1 Enterobacter spp. MANUELA 6 2 2 Pseudomonas spp. CLIO 7 1 1 Pseudomonas spp. Para facilitar la exposición de los resultados obtenidos, sólo se ha incluido en la tabla la identificación final a nivel de género o especie de cada uno de los aislamientos. No se han incluido datos referentes a las pruebas preliminares de identificación realizadas (Gram, catalasa, oxidasa) que no añaden más información extra, y que en su caso, han orientado la realización de las galerías APIs idóneas. 2 Sólo se ha incluido la información de los resultados obtenidos con la prueba de la coagulasa (CN, coagulasa negativo) para los estafilococos aislados en los que no se pudo determinar la especie, por su interés clínico-epidemiológico a la hora de diferenciar la presencia de S. aureus (coagulasa positivo) del resto de especies identificadas. Claves de la tabla Origen: 1= Hospital Clínico Veterinario Sant Vicente del Raspeig (n= 225); 2= isla de Gran Canaria (n= 111); 3= Clínical Aznalcollar (n= 36), 4= Clínica Eguisof (n= 9); 5= Clínica O’Cabalo (n= 6). Experiencia 1 74 Raza: 1= PRE (n= 226); 2= PSI (n=47); 3= cruzado (n=109); 4= PRA (n=1); 5= Holstein (n= 1); 6= KWP (n= 1); 7= Silla francês (n=2). Por otra parte, una vez analizados los resultados desde el punto de vista general, hemos evaluado las diferencias existentes en función de diferentes factores como la edad de los animales, el origen de las muestras o la raza. Para ello, hemos establecido diversos grupos de bacterias a comparar (sin seguir un criterio taxonómico, sino agrupadas en función de la prevalencia obtenida en el presente estudio), al objeto de poder establecer la comparación de los resultados. Para evaluar diferencias entre los aislamientos en función del origen de las muestras, hemos considerado tan sólo los orígenes de los que se analizo un número importante de muestras (Alicante y Gran Canaria). Experiencia 1 75 Figura E1.5: Aislamientos en las muestras procedentes de Alicante 4% 14% 10% 11% 4% 12% 28% 17% Enterobacter spp Escherichia coli Klebsiella spp Otros Proteus spp Pseudomonas spp Staphylococcus spp Streptococcus spp Los resultados se muestran en las figuras E.1.5 y E.1.6 respectivamente. En líneas generales, parecen indicarnos que los aislamientos son similares en ambos casos independientemente del origen de las mismas. Tanto en Gran Canaria como en Alicante, los estafilococos son el grupo más prevalente. No obstante, en Alicante el segundo grupo en importancia son los estreptocos seguidos de E. coli, mientras que en Gran Canaria son las pseudomonas junto a E. coli los grupos posteriores. Como ya se ha comentado anteriormente, los datos existentes varían en función del origen de los estudios (Shin y col., 1979; Ricketts y col., 1993; Langoni y col. 1997; Albihn y col. 2003), si bien a nivel porcentual, y a pesar de estas pequeñas diferencias, los grupos aislados con más prevalencia en nuestro estudio parecen bastante similares en ambos casos. Experiencia 1 76 Figura E1.6: Aislamientos en las muestras procedentes de Gran Canaria 9% 21% 8% 12% 1% 13% 24% 12% Enterobacter spp Escherichia coli Klebsiella spp Otros Proteus spp Pseudomonas spp Staphylococcus spp Streptococcus spp Al objeto de evaluar posibles diferencias en los grupos bacterianos aislados en función de la edad de las yeguas muestreadas, hemos dividido los casos analizados en tres grupos (1-5 años, 6-10 años y 11 o más años). Los resultados se muestran en la tabla E.1.4 y en líneas generales, porcentualmente, los datos parecen indicarnos que no hay diferencias importantes en función de la edad de las yeguas, coincidiendo con lo observado por otros autores (Urosevic y col., 2010). Experiencia 1 77 Tabla E1.4: Resultados obtenidos en función de la edad de las yeguas Aislamiento Edad de las yeguas muestreadas 1-5 años 6-10 años 11 o más años Enterobacter spp. 3 13 5 Escherichia coli 7 34 19 Klebsiella spp. 5 13 11 Serratia spp. 0 7 2 Proteus spp. 3 7 2 Pseudomonas spp. 7 20 15 Staphylococcus spp. 14 48 25 Streptococcus spp. 6 29 14 Bordetella spp. 0 2 0 Candida spp.. 0 2 1 Otros 2 20 11 Finalmente, los resultados obtenidos en las muestras recogidas en las dos razas más muestreadas se observan en las figuras E.1.7 y E.1.8 respectivamente. Sería necesario analizar más animales para obtener resultados comparables, por la diferencia en el número de animales de ambas razas muestreados. No obstante, a modo preliminar y como ejemplo, el análisis de los resultados obtenidos parece sugerir que entre las enterobacterias aisladas, algunas especies como Klebsiella spp. o Proteus spp. podrían aislarse esporádicamente en las yeguas de PRI en comparación con las de PRE, mientras que Escherichia coli parece tener un papel más importante, al menos porcentualmente. Más datos son necesarios al objeto de obtener conclusiones claras al respecto, si bien hemos de considerar que las Experiencia 1 78 diferencias existentes entre las bacterias aisladas en ambos casos podrían relacionarse con el manejo diferente de la reproducción y de los sementales (Albihn y col., 2003), más que con el propio efecto de la raza equina. Figura E1.7: Aislamientos en pura sangre inglés (PSI) 7% 28% 2% 11% 2% 15% 26% 9% Enterobacter spp Escherichia coli Klebsiella spp Otros Proteus spp Pseudomonas spp Staphylococcus spp Streptococcus spp Figura E1.8: Aislamientos en pura raza español (PRE) 5% 14% 10% 15% 5%11% 27% 13% Enterobacter spp Escherichia coli Klebsiella spp Otros Proteus spp Pseudomonas spp Staphylococcus spp Streptococcus spp Experiencia 1 79 E1.4. ANEXOS Anexo E1.4.1. Composición de los medios de cultivo Composición del medio de transporte SP4 II 1.1. Parte esterilizable en autoclave - Bacto PPLO broth ( DIFCO) ...................................... 4,20 gr - Bacto peptona (DIFCO ............................................... 6,40 gr - Bacto triptona (DIFCO) ............................................ 12,00gr - Agua bidestilada ...................................................... 535,00 ml Ajustar a pH = 7,8 con NaOH 1.2. Componentes filtrados por membrana de 0,22 µm de poro - C.M.R.L. (10X) con glutamina (SIGMA) ................ 60,00 ml - Extracto fresco de levadura (25% p/v) ..................... 42,00 ml - Yeast Extract (DIFCO) (5 gr/250 ml) ..................... 120,00 ml - Rojo fenol (solución 0,1%) ....................................... 24,00 ml - Agua bidestilada ...................................................... 212,00 ml - Suero de caballo inactivado a 56ºC 30min. ............ 251,00 ml Ajustar a pH= 7,2 Preparación Mezclar asépticamente las dos fases, a partes iguales v/v y distribuirlo a razón de 5ml, en tubos de tapón de rosca estéril y refrigerar a 4ºC hasta su utilización. Composición del medio de cultivo Columbia Columbia, Base Agar (Ph. Eur.) (Medio Deshidratado) CULTIMED Experiencia 1 86 Composición de medios y reactivos: API STAPH ........................ Extracto de levadura ... 0,5g MEDIUM ........................... Bactopepona ............. 10,0g 6ML .................................... NaCl ............................ 5,0g Oligoelementos .................. .................................. 10,0ml Agua desmineralizada ........ qsp......................... 1000,0ml Ph: 7,0-7.4 Reactivo VP1 5ml Hidróxido potásico....................................................................................40ml H 2 O..........................................................................................................100ml Reactivo VP2 5ml -naftol…………………………………………………………………..…6g Etanol…………………………………………………………….……..100ml Reactivo NIT1 5ml Acido sulfanílico.........................................................................................0.4g Acido Acético..............................................................................................30g H2O………………………………………………………………………70ml Reactivo NIT2 5ml N,N-dimetil.1-naftilamina...........................................................................0.6g Acido Acético..............................................................................................30g H2O............................................................................................................70ml Reactivo ZYM A 8ml Tris-hidroximetil-aminometano..................................................................25g Acido Clorhídrico al 37%..........................................................................11ml Laurilsulfato Na...........................................................................................10g H2O............................................................................................................10ml Reativo ZYM B 8ml Fast Blue BB.............................................................................................0.35g 2-metoxi-etanol........................................................................................100ml Experiencia 1 87 Enterobacterias y otros bacilos Gram-negativo Reactivos: -composición del envase ref. 20 100 (25 test) *25 galerías 20 API 20 E *25 cámaras de incubación *25 hojas de resultados *1 sistema de cierre *1 ficha técnica -composición del envase ref. 20 160 (100 test) *100 galerías API 20 E *100 cámaras de incubación *100 hojas de resultados *1 sistema de cierre *1 ficha técnica Composición de los medios y reactivos NaCl 0,85% Medium 5ml Ó Suspensión Medium 5 ml Cloruro sódico……………………8,5 gr Agua desmineralizada….………1000 ml Agua desmineralizada Reactivo TDA 5 ml Percloruro de hierro……………….3,4 g H₂O……………………...…..csp 100ml Reactivo JAMES 5 ml Componente J 2183..........................0,5 g HCL 1N.................................qsp 100 ml Reactivo VP1 5ml Hidróxido potásico…………………40 g H₂O……………………………...100 ml Experiencia 1 88 Reactivo VP2 5ml α-naftol................................................6 g Etanol............................................100 ml Reactivo NIT 1 5ml Ácido sulfanílico..............................0,4 g Ácido acético.....................................30 g H₂O……………………………….70 ml Reactivo NIT 2 5 ml N,N-dimetil-1-naftilamina...............0,6 g Ácido acético....................................30 g H₂O……………………………….70 ml Reactivo Zn 10 g Zinc en polvo Experiencia 2 Experiencia 2 90 E2. ESTUDIO DE LA SENSIBILIDAD ANTIBIÓTICA DE CEPAS BACTERIANAS AISLADAS DE CASOS DE INFERTILIDAD EQUINA. E2.1. INTRODUCCIÓN Las resistencias antibióticas en las bacterias están muy extendidas. Algunos microorganismos son resistentes a uno o más agentes antibacterianos de manera innata. En estos casos, todas las cadenas de esa especie bacteriana son probablemente resistentes a todos los miembros de esa clase antibacteriana. Sin embargo, otros microorganismos tienen resistencia adquirida. En este caso, poblaciones bacterianas inicialmente sensibles a determinada familia de antibióticos se vuelven resistentes gracias a diversos mecanismos. En primer lugar, los microorganismos pueden adquirir genes que codifican enzimas, como las β-lactamasas, que destruyen el agente antibacteriano antes de que éste pueda actuar. En segundo lugar, la bacteria puede adquirir bombas de eflujo que expulsan al agente bacteriano de la célula antes de que pueda alcanzar el punto de acción y ejercer su efecto. En tercer lugar, la bacteria puede adquirir varios genes para una vía metabólica que sintetice paredes celulares alteradas que ya no contienen el punto de unión para el agente antimicrobiano, o la bacteria puede adquirir mutaciones que limitan el acceso de los antibióticos al punto de acción intracelular (Tenover, 2006). Así, poblaciones bacterianas sensibles pueden adquirir la resistencia mediante mutación y selección o adquiriendo de otras bacterias la información genética que codifica la capacidad de resistencia. La información genética proveniente de otras bacterias puede obtenerse a través de varios mecanismos como la transformación, la conjugación o la transducción. Mediante los mecanismos de intercambio genético, muchas Experiencia 2 91 bacterias se vuelven resistentes a un elevado número de agentes antibacterianos. Por lo que respecta a las mutaciones espontáneas, éstas pueden causar resistencia (1) alterando la proteína diana a la que se une el agente antimicrobiano mediante la modificación o la eliminación del punto de unión, (2) regulando la producción de enzimas que inactivan el agente antibacteriano, (3) regulando o alterando un canal proteico de la membrana externa que utiliza el agente antimicrobiano para entrar y (4) regulando las bombas que expulsan el fármaco de la célula (Mamanas, 1997). El uso de antibióticos en estas cadenas bacterianas que presentan mutaciones acelera su selección, ya que mata las cadenas susceptibles y permite que las cadenas nuevas resistentes sobrevivan y crezcan. La resistencia adquirida que se desarrolla mediante una mutación cromosómica se denomina evolución vertical. En cuanto a la resistencia adquirida mediante la obtención de material genético nuevo a partir de otros organismos resistentes, ésta se denomina evolución horizontal. Puede tener lugar entre cadenas de la misma especie o de diferentes especies o géneros bacterianos mediante, como se ha dicho anteriormente, mecanismos de conjugación, transducción y transformación (McManus, 1997). Mediante el mecanismo de conjugación, una bacteria Gram-negativa transfiere un plásmido que contiene genes de resistencia a una bacteria adyacente. Durante la transducción, los genes resistentes se transfieren de una bacteria a otra mediante un bacteriófago. Por último, la transformación consiste en la adquisición e incorporación de segmentos de ADN a partir de otra bacteria que ha liberado su complemento de ADN en el ambiente después de la lisis celular. Experiencia 2 92 Escherichia coli es un microorganismo habitual en múltiples infecciones y, con frecuencia, es resistente a las aminopenicilinas, como la amoxicilina o la ampicilina, y a las cefalosporinas de espectro estrecho (Allen y col., 1999; Karlowsky y col., 2002; Landgren y col., 2005). La resistencia a los agentes antimicrobianos está mediada gracias a la adquisición de β-lactamasas que hidrolizan e inactivan dichos fármacos (Rupp y Fey, 2003). Uno de los principales agentes de infecciones nosocomiales en personas es el Staphylococcus aureus resistente a meticilina (MRSA) (Shimizu y col., 1997). Este microorganismo tiene una gran importancia clínica porque tiene resistencia cruzada con otros antibióticos β-lactámicos, incluyendo las cefalosporinas. Además, el MRSA es resistente a muchos otros agentes antimicrobianos. La primera vez que se documentó el aislamiento de MRSA en animales fue en la leche proveniente de vacas con mastitis (Devriese y Hommez, 1975). En el caso de Pseudomonas aeruginosa, su capacidad para resistir a la acción de los antibióticos se basa en la producción de una biocapa (Costerton y col., 1995; Parking y col., 2001). Estas biocapas, además de proporcionar resistencia a los antibióticos, también proporcionan resistencia a las defensas inmunitarias tanto celulares como humorales (Costerton y col., 1999; Olson y col., 2002). En esencia, estas biocapas son una matriz extracelular de carbohidratos o exopolisacáridos que envuelven a las colonias bacterianas y las protegen de los ambientes nocivos (Costerton y col., 1999; Costerton y col., 1995; Rosser y col., 1987; Mah y O’Toole, 2001). Experiencia 2 93 Otro mecanismo de resistencia a los antibióticos es la presencia del gen resistente al carbapen, también denominado bla NDM-1 . Este gen ha sido detectado en la familia de las enterobacterias y proporciona una alta resistencia a numerosos tipos de antibióticos, incluyendo los β-lactámicos, las fluoroquinolonas y los aminoglucósidos (Kumarasamy y col., 2010). La mera presencia de agentes bacterianos en el lumen uterino disminuye la fertilidad de la yegua (Asbury y col., 1986), por lo que el tratamiento de estas infecciones con un antibiótico ineficaz prolongará el problema de infertilidad en esa reproductora. Así, pues, es necesario comprobar la sensibilidad de los aislamientos microbiológicos en el útero de las yeguas al objeto de recomendar los tratamientos antibióticos más eficaces a utilizar en el lavado uterino. Ello, nos dará más garantías de éxito del tratamiento y por tanto, debe repercutir en las tasas de fertilidad obtenidas tras efectuar los tratamientos de lavado. E2.2. MATERIAL Y MÉTODOS E2.2.1. Diseño del estudio Partiendo de los aislamientos microbiológicos obtenidos en la experiencia 1 (E.1.3) de la presente Tesis Doctoral, se han realizado las pruebas necesarias para estimar la resistencia de los microorganismos aislados frente a una serie de antibióticos seleccionados en base a los datos previos existentes respecto a su utilización para el tratamiento de infecciones en el útero de las yeguas sin provocar reacciones adversas tras el mismo. Para ello, hemos utilizado una prueba de difusión con discos convencional, donde se correlaciona el uso de discos de papel de filtro Experiencia 2 94 impregnados con antibióticos con las CMI para muchas cepas bacterianas (Forbes y col., 2002). Posteriormente, se ha realizado la comparación de los datos obtenidos en función de las especies microbianas testadas, así como las características epidemiológicas de dichos aislamientos. Todo ello, al objeto de poder evaluar el uso efectivo de determinados antibióticos para el tratamiento de problemas de infertilidad ocasionados por bacterias del mismo género o especie. E2.2.2. Cepas analizadas Se han analizado un total de 344 cepas aisladas de yeguas con problemas de infertilidad que resultaron positivas a los análisis microbiológicos. La identificación y procedencia de dichos aislamientos, incluyendo los datos epidemiológicos de los mismos se muestran en la Experiencia 1 de la presente Tesis Doctoral. E2.2.3. Antibióticos Los antibióticos utilizados en este estudio han sido los siguientes: gentamicina (GM10), Amikacina (AK), Ampicilina (AMP10), Penicilina (P10), Doxiciclina (D30), Kanamicina (K30), Neomicina (N30), Apramicina (APR15), Ticarcilina (TIC175), Ampicilina (AMC30), Claritromicina (CR30), Trimetropínsulfametoxalazol (SXT), Cefoxitina (FOX30) y Oxitetraciclina (OT) Se testó la resistencia antimicrobiana de todos los aislamientos frente a estos antibióticos. Además, con posterioridad, y a partir de la yegua de nombre Maximina (nº160) se añadieron dos antibióticos más a los antibiogramas tales como Trimetropínsulfametozalazol (SXT) y Experiencia 2 95 Cefolixitina (FOX3). A partir de la yegua de nombre Copla (nº186), se añadió además la Oxitetraciclina (OT), que incluimos en las pruebas de sensibilidad, incorporados al estudio. Los discos de antibióticos utilizados para realizar los antibiogramas procedieron en todos los casos de la casa comercial Oxoid. S.A. (Madrid). E2.3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN E2.3.1 Tablas con el resumen general de los resultados de la sensibilidad a los distintos antibióticos A continuación, las tablas E.2.1 muestran los resultados de sensibilidad antibiótica por grupo de microorganismos obtenidos para cada uno de los antibióticos analizados en el presente trabajo. En la tabla E.2.1.1 se muestran los resultados de sensibilidad antibiótica para la gentamicina. En dicha tabla se observa que el 53.3% de los casos de endometritis por Escherichia coli era sensible a este antibiótico, mientras que el 26.7% era resistente. En el caso de las endometritis por Staphylococcus spp., el 43.7% era sensible a la gentamicina y el 35.6% era resistente. En las endometritis causadas por infección por Streptococcus spp., el 46.0% de las cepas aisladas era sensible a la acción de la gentamicina y el 44.5% era resistente. Para los casos positivos a Pseudomonas spp., el 52.4% mostraron ser sensibles a la acción de la gentamicina, mientras que el 28.5% fue resistente. En cuanto a las endometritis por Klebsiella spp., el 31.0% era sensible a este antibiótico y el 58.6% era resistente. Respecto a las endometritis en las que se aislaron cepas de Enterobacter spp., el 60.0% era sensible a la gentamicina, Experiencia 2 102 En cuanto a la sensibilidad de la gentamicina, estudios anteriores (Frontoso y col., 2008) observaron que era un antibiótico eficaz en los casos de endometritis equina causados por Escherichia coli y Klebsiella spp., Sin embargo, en nuestro estudio, Klebsiella spp.,fue resistente a la acción de la gentamicina y Escherichia coli fue sensible en el 53.3% de los cultivos. Por otro lado, mientras que en el estudio de Frontoso y col. (2008) Pseudomonas spp.,y estreptococos eran resistentes a la gentamicina, en nuestro estudio la sensibilidad de estos microorganismos fue del 52.4% y el 46.0% respectivamente. Por último, la ampicilina, según los resultados de Metzidie y col (2006), es un antibiótico sensible en el caso de las endometritis causadas por enterococos. Sin embargo, de acuerdo a nuestros resultados, dichos microorganismos eran resistentes a la acción de la ampicilina. Las diferencias existentes entre nuestros resultados y los obtenidos en estudios anteriores pueden deberse a cambios sufridos en las cepas de los distintos microorganismos, de manera que se han vuelto más resistentes a la acción de los diferentes antibióticos utilizados en este estudio. Experiencia 2 103 Tabla E2.1.1 Resumen general de los resultados de sensibilidad obtenidos para la gentamicina. Bacteria Gentamicina (GM10) Total Sensible N (%) Intermedio N (%) Resistente N (%) Escherichia coli 32 (53.3) 12 (20.0) 16 (26.7) 60 Staphylococcus spp. 38 (43.7) 18 (20.7) 31 (35.6) 87 Streptoccocus spp., 29 (46.0) 6 (9.5) 28 (44.5) 63 Pseudomonas spp. 22 (52.4) 8 (19.1) 12 (28.5) 42 Klebsiella spp. 9 (31.0) 3 (10.4) 17 (58.6) 29 Enterobacter spp. 12 (60.0) 4 (20.0) 4 (20.0) 20 Proteus spp. 3 (25.0) 3 (25.0) 6 (50.0) 12 Serratia spp. 7 (77.8) 2 (22.2) 0 (0.0) 9 Ochrobactrum anthropi 0 (0.0) 1 (50.0) 1 (50.0) 2 Myroides spp. 2 (100.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 2 Bordetella spp. 2 (100.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 2 Micrococcus spp. 2 (66.7) 1 (3.3) 0 (0.0) 3 Aeromonas hydrophila 3 (100.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 3 Citrobacter spp. 1 (25.0) 1 (25.0) 2 (50.0) 4 Kluveria spp. 1 (33.3) 1 (33.3) 1 (33.3) 3 Vibrio parahaemolyticus 1 (100.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 1 Agrobacterium radiobacter 2 (100.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 2 Total 166 (48.3) 60 (17.4) 118 (34.3) 344 Experiencia 2 104 Tabla E2.1.2 Resumen general de los resultados de sensibilidad obtenidos para la amikacina. Bacteria Amikacina (AK30) Total Sensible N (%) Intermedio N (%) Resistente N (%) Escherichia coli 38 (63.3) 17 (28.3) 5 (8.4) 60 Staphylococcus spp. 45 (51.7) 21 (24.1) 21 (24.2) 87 Streptoccocus spp. 25 (39.7) 15 (23.8) 23 (36.5) 63 Pseudomonas spp. 31 (73.8) 6 (14.3) 5 (11.9) 42 Klebsiella spp. 17 (58.6) 7 (24.1) 5 (17.3) 29 Enterobacter spp. 11 (55.0) 7 (35.0) 2 (10.0) 20 Proteus spp. 8 (66.7) 2 (16.7) 2 (16.6) 12 Serratia spp. 7 (77.8) 0 (0.0) 2 (22.2) 9 Ochrobactrum anthropi 1 (50.0) 0 (0.0) 1 (50.0) 2 Myroides spp. 2 (100.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 2 Bordetella spp. 2 (100.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 2 Micrococcus spp. 2 (66.6) 0 (0.0) 1 (33.3) 3 Aeromonas hydrophila 2 (66.6) 1 (33.3) 0 0.0) 3 Citrobacter spp. 2 (50.0) 1 (25.0) 1 (25.0) 4 Kluveria spp. 1 (33.3) 1 (33.3) 1 (33.3) 3 Vibrio parahaemolyticus 1 (100.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 1 Agrobacterium radiobacter 2 (100.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 2 Total 197 (57.3) 78 (22.7) 69 (20.0) 344 Experiencia 2 105 Tabla E2.1.3 Resumen general de los resultados de sensibilidad obtenidos para la Ampicilina. . Bacteria Ampicilina (AMP10) Total Sensible N (%) Intermedio N (%) Resistente N (%) Escherichia coli 10 (16.7) 12 (20.0) 38 (63.3) 60 Staphylococcus spp. 33 (37.9) 11 (12.6) 43 (49.5) 87 Streptoccocus spp. 13 (20.6) 13 (20.6) 37 (58.8) 63 Pseudomonas spp. 7 (16.7) 5 (11.9) 30 (71.4) 42 Klebsiella spp. 2 (6.9) 2 (6.9) 25 (83.2) 29 Enterobacter spp. 1 (5.0) 5 (25.0) 14 (70.0) 20 Proteus spp. 2 (16.7) 0 (0.0) 10 (83.3) 12 Serratia spp. 4 (44.4) 0 (0.0) 5 (55.6) 9 Ochrobactrum anthropi 0 (0.0) 0 (0.0) 2 (100.0) 2 Myroides spp. 0 (0.0) 0 (0.0) 2 (100.0) 2 Bordetella spp. 2 (100.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 2 Micrococcus spp. 0 (0.0) 1 (33.3) 2 (66.7) 3 Aeromonas hydrophila 1 (33.3) 0 (100.0) 2 (66.7) 3 Citrobacter spp. 1 (25.0) 1 (25.0) 2 (50.0) 4 Kluveria spp. 1 (33.3) 1 (33.3) 1 (33.3) 3 Vibrio parahaemolyticus 0 (0.0) 1 (100.0) 0 (0.0) 1 Agrobacterium radiobacter 0 (0.0) 2 (100.0) 0 (0.0) 2 Total 77 (22.4) 54 (15.7) 213 (61.9) 344 Experiencia 2 106 Tabla E2.1.4 Resumen general de los resultados de sensibilidad obtenidos para la Penicilina. Bacteria Penicilina (P10) Total Sensible N (%) Intermedio N (%) Resistente N (%) Escherichia coli 8 (13.3) 5 (8.3) 47 (78.3) 60 Staphylococcus spp. 20 (23.0) 10 (11.5) 57 (65.5) 87 Streptoccocus spp. 20 (31.8) 6 (9.5) 37 (58.7) 63 Pseudomonas spp. 5 (11.9) 2 (4.8) 35 (83.3) 42 Klebsiella spp. 3 (10.3) 0 (0.0) 26 (89.7) 29 Enterobacter spp. 2 (10.0) 0 (0.0) 18 (90.0) 20 Proteus spp. 0 (0.0) 0 (0.0) 12 (100.0) 12 Serratia spp. 0 (0.0) 1 (11.1) 8 (88.9) 9 Ochrobactrum anthropi 0 (0.0) 0 (0.0) 2 (100.0) 2 Myroides spp. 0 (0.0) 0 (0.0) 2 (100.0) 2 Bordetella spp. 0 (0.0) 0 (0.0) 2 (100.0) 2 Micrococcus spp. 1 (33.3) 0 (0.0) 2 (66.7) 3 Aeromonas hydrophila 0 (0.0) 0 (0.0) 3 (100.0) 3 Citrobacter spp. 0 (0.0) 0 (0.0) 4 (100.0) 4 Kluveria spp. 0 (0.0) 2 (66.7) 1 (33.3) 3 Vibrio parahaemolyticus 0 (0.0) 0 (0.0) 1 (100.0) 1 Agrobacterium radiobacter 0 (0.0) 0 (0.0) 2 (100.0) 2 Total 59 (17.2) 26 (7.6) 259 (75.2) 344 Experiencia 2 107 Tabla E2.1.5 Resumen general de los resultados de sensibilidad obtenidos para la Doxiciclina. Bacteria Doxiciclina (D30) Total Sensible N (%) Intermedio N (%) Resistente N (%) Escherichia coli 3 (5.0) 20 (33.3) 37 (61.7) 60 Staphylococcus spp. 22 (25.3) 21 (24.1) 44 (50.6) 87 Streptoccocus spp. 9 (14.3) 24 (38.1) 30 (47.6) 63 Pseudomonas spp. 4 (9.5) 14 (33.3) 24 (57.2) 42 Klebsiella spp. 2 (6.9) 11 (37.9) 16 (55.2) 29 Enterobacter spp. 2 (10.0) 7 (35.0) 11 (55.0) 20 Proteus spp. 0 (0.0) 5 (41.7) 7 (58.3) 12 Serratia spp. 1 (11.1) 2 (22.2) 6 (66.7) 9 Ochrobactrum anthropi 0 (0.0) 0 (0.0) 2 (100.0) 2 Myroides spp. 1 (50.0) 0 (0.0) 1 (50.0) 2 Bordetella spp. 2 (100.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 2 Micrococcus spp. 2 (66.7) 1 (33.3) 0 (0.0) 3 Aeromonas hydrophila 0 (0.0) 1 (33.3) 2 (66.7) 3 Citrobacter spp. 1 (25.0) 2 (50.0) 1 (25.0) 4 Kluveria spp. 1 (33.3) 0 (0.0) 2 (66.7) 3 Vibrio parahaemolyticus 0 (0.0) 1 (100.0) 0 (0.0) 1 Agrobacterium radiobacter 0 (0.0) 1 (50.0) 1 (50.0) 2 Total 50 (14.5) 110 (32.0) 184 (53.5) 344 Experiencia 2 108 Tabla E2.1.6 Resumen general de los resultados de sensibilidad obtenidos para la Kanamicina. Bacteria Kanamicina (K30) Total Sensible N (%) Intermedio N (%) Resistente N (%) Escherichia coli 25 (41.7) 14 (23.3) 21 (35.0) 60 Staphylococcus spp. 20 (23.0) 21 (24.1) 46 (52.9) 87 Streptoccocus spp. 18 (28.6) 14 (22.2) 31 (49.2) 63 Pseudomonas spp. 21 (50.0) 7 (16.7) 14 (33.3) 42 Klebsiella spp. 10 (34.5) 6 (20.7) 13 (44.8) 29 Enterobacter spp. 11 (55.0) 5 (25.0) 4 (20.0) 20 Proteus spp. 6 (50.0) 1 (8.3) 5 (41.7) 12 Serratia spp. 5 (55.6) 3 (33.3) 1 (11.1) 9 Ochrobactrum anthropi 1 (50.0) 0 (0.0) 1 (50.0) 2 Myroides spp. 1 (50.0) 0 (0.0) 1 (50.0) 2 Bordetella spp. 2 (100.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 2 Micrococcus spp. 2 (66.7) 0 (0.0) 1 (33.3) 3 Aeromonas hydrophila 2 (66.7) 1 (33.3) 0 (0.0) 3 Citrobacter spp. 1 (25.0) 1 (25.0) 2 (50.0) 4 Kluveria spp. 2 (66.7) 0 (0.0) 1 (33.3) 3 Vibrio parahaemolyticus 1 (100.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 1 Agrobacterium radiobacter 2 (100.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 2 Total 130 (37.8) 73 (21.2) 141 (41.0) 344 Experiencia 2 109 Tabla E2.1.7 Resumen general de los resultados de sensibilidad obtenidos para la Neomicina. Bacteria Neomicina (N30) Total Sensible N (%) Intermedio N (%) Resistente N (%) Escherichia coli 20 (33.3) 14 (23.3) 26 (43.3) 60 Staphylococcus spp. 33 (37.9) 21 (24.1) 33 (37.9) 87 Streptoccocus spp. 18 (28.6) 22 (34.9) 23 (36.5) 63 Pseudomonas spp. 14 (33.3) 16 (38.1) 12 (28.6) 42 Klebsiella spp. 4 (13.8) 12 (41.4) 13 (44.8) 29 Enterobacter spp. 10 (50.0) 3 (15.0) 7 (35.0) 20 Proteus spp. 4 (33.3) 3 (25.0) 5 (41.7) 12 Serratia spp. 4 (44.4) 2 (22.2) 3 (33.3) 9 Ochrobactrum anthropi 1 (50.0) 0 (0.0) 1 (50.0) 2 Myroides spp. 1 (50.0) 1 (50.0) 0 (0.0) 2 Bordetella spp. 2 (100.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 2 Micrococcus spp. 2 (66.7) 1 (33.3) 0 (0.0) 3 Aeromonas hydrophila 2 (66.7) 0 (0.0) 1 (33.3) 3 Citrobacter spp. 0 (0.0) 2 (50.0) 2 (50.0) 4 Kluveria spp. 0 (0.0) 2 (66.7) 1 (33.3) 3 Vibrio parahaemolyticus 0 (0.0) 1 (100.0) 0 (0.0) 1 Agrobacterium radiobacter 0 (0.0) 0 (0.0) 2 (100.0) 2 Total 115 (33.4) 100 (29.1) 129 (37.5) 344 Experiencia 2 110 Tabla E2.1.8 Resumen general de los resultados de sensibilidad obtenidos para la Apramicina. Bacteria Apramacina (APR15) Total Sensible N (%) Intermedio N (%) Resistente N (%) Escherichia coli 11 (18.3) 12 (20.0) 37 (61.7) 60 Staphylococcus spp. 18 (20.7) 7 (8.1) 62 (71.2) 87 Streptoccocus spp. 8 (12.7) 11 (17.5) 44 (69.8) 63 Pseudomonas spp. 10 (23.8) 4 (9.5) 28 (66.7) 42 Klebsiella spp. 6 (20.7) 8 (27.6) 15 (51.7) 29 Enterobacter spp. 1 (5.0) 9 (45.0) 10 (50.0) 20 Proteus spp. 4 (33.3) 2 (16.7) 6 (50.0) 12 Serratia spp. 2 (22.2) 1 (11.1) 6 (66.7) 9 Ochrobactrum anthropi 0 (0.0) 0 (0.0) 2 (100.0) 2 Myroides spp. 1 (50.0) 0 (0.0) 1 (50.0) 2 Bordetella spp. 0 (0.0) 1 (50.0) 1 (50.0) 2 Micrococcus spp. 0 (0.0) 0 (0.0) 3 (100.0) 3 Aeromonas hydrophila 0 (0.0) 0 (0.0) 3 (100.0) 3 Citrobacter spp. 1 (25.0) 0 (0.0) 3 (75.0) 4 Kluveria spp. 0 (0.0) 1 (33.3) 2 (66.7) 3 Vibrio parahaemolyticus 1 (100.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 1 Agrobacterium radiobacter 0 (0.0) 2 (100.0) 0 (0.0) 2 Total 63 (18.3) 58 (16.9) 223 (64.8) 344 Experiencia 2 111 Tabla E2.1.9 Resumen general de los resultados de sensibilidad obtenidos para la Ticarcilina. Bacteria Ticarcilina (TIC75) Total Sensible N (%) Intermedio N (%) Resistente N (%) Escherichia coli 17 (28.3) 7 (11.7) 36 (60.0) 60 Staphylococcus spp. 29 (33.3) 16 (18.4) 42 (48.3) 87 Streptoccocus spp. 27 (42.9) 11 (17.5) 25 (39.6) 63 Pseudomonas spp. 13 (31.0) 4 (9.5) 25 (59.5) 42 Klebsiella spp. 7 (24.1) 1 (3.5) 21 (72.4) 29 Enterobacter spp. 9 (45.0) 4 (20.0) 7 (35.0) 20 Proteus spp. 1 (8.3) 1 (8.3) 10 (83.3) 12 Serratia spp. 1 (11.1) 4 (44.4) 4 (44.4) 9 Ochrobactrum anthropi 0 (0.0) 0 (0.0) 2 (100.0) 2 Myroides spp. 0 (0.0) 0 (0.0) 2 (100.0) 2 Bordetella spp. 0 (0.0) 0 (0.0) 2 (100.0) 2 Micrococcus spp. 0 (0.0) 0 (0.0) 3 (100.0) 3 Aeromonas hydrophila 0 (0.0) 1 (33.3) 2 (66.7) 3 Citrobacter spp. 3 (75.0) 0 (0.0) 1 (25.0) 4 Kluveria spp. 1 (33.3) 1 (33.3) 1 (33.3) 3 Vibrio parahaemolyticus 1 (100.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 1 Agrobacterium radiobacter 1 (50.0) 1 (50.0) 0 (0.0) 2 Total 110 (32.0) 51 (14.8) 183 (53.2) 344 Experiencia 3 Experiencia 3 119 E3. EFICACIA DEL TRATAMIENTO DE LOS PROCESOS DE ENDOMETRITIS EN YEGUAS. SEGUIMIENTO DE 48 CASOS . E3.1. INTRODUCCIÓN Las yeguas a tratar por problemas de infertilidad suelen ser aquéllas que no logran quedarse preñadas tras varios celos consecutivos por monta natural ó inseminación artificial con el uso de sementales de fertilidad comprobada. Observamos una amplia variedad de yeguas afectadas (diversas razas y edades), además de la existencia de problemas de etiología diversa como problemas anatómicos de la vulva (pneumovagina, urovagina, desgarros rectovaginales…), problemas de úteros péndulos en yeguas de avanzada edad y, principalmente, yeguas con problemas de endometritis de etiología infecciosa. El presente estudio se ha centrado en los problemas de índole infeccioso, realizando, en primer lugar, un estudio etiológico del/los microorganismo/s implicados, tal y como se ha descrito en el apartado E1 y el posterior análisis de la sensibilidad antibiótica de los microorganismos aislados, descrito en el apartado E2. Tras estos procedimientos, la tercera parte de la presente Tesis Doctoral ha consistido en valorar la eficacia de los tratamientos aplicados en algunas de las yeguas afectadas. Para ello, en la mayoría de los casos, se aprovechó el mismo celo ya que éste dura entre 7 y 9 días, aunque en muchas yeguas el celo se prolongaba hasta 15 días. Una vez conocida la sensibilidad antibiótica del microorganismo aislado en cada caso, se elegía el antibiótico más adecuado en función de los resultados del laboratorio y el coste del producto para el propietario. Experiencia 3 120 E3.2. MATERIAL Y MÉTODOS E3.2.1. Diseño del estudio Se seleccionaron un total de 48 yeguas con problemas de infertilidad en las que, posteriormente, se llevó a cabo el diagnóstico etiológico microbiológico de dicha patología. Los animales fueron seleccionados para el seguimiento del caso en base a problemas de fertilidad, sin saber qué era lo que determinaba su patología. El criterio de selección era que la yegua no quedara preñada, por métodos convencionales. Normalmente, las muestras se recogían en yeguas que habían resultado positivas tras realizar una citología endometrial y con un historial reproductivo determinado. En todos los casos, eran claramente candidatas a realizar un estudio microbiológico. E3.2.2. Yeguas analizadas Todas las yeguas incluidas en la Experiencia 3 provenían de la isla de Gran Canaria. De las 48 hembras, 4 eran yeguas PRE, 26 eran PSI y 18 eran cruzadas. La edad de los animales fue de 4 a 16 años, con una media de 9 años. E3.2.3. Tratamiento de la endometritis y evaluación de su eficacia El protocolo inicial de actuación siempre fue el mismo a nivel de campo: 1) limpieza e higiene de la zona vulvar, recto y aledaños, con abundante agua directa, 2) limpieza y desinfección con papel secante impregnado en solución de povidona yodada diluida al 1% de toda la zona descrita anteriormente. A continuación, en todos los casos, se realizaba un lavado uterino con solución salina estéril, administrando posteriormente el antibiótico de elección. Experiencia 3 121 Las herramientas o material utilizados para el lavado uterino fueron: una sonda estéril de un metro de longitud con apertura en forma de ventana para facilitar el retorno del líquido introducido en el útero, un fonil estéril que se conectaba a la porción externa de la sonda para permitir el paso de fluido hacia el interior del útero, así como guantes de exploración estéril, los cuales siempre se lubrificaban antes de introducirlos en el útero. El procedimiento a seguir fue, habitualmente, el descrito a continuación: una vez introducida la mano a través de la vagina y guiando la sonda, se localizaba por palpación el cérvix vaginal, se rebasaba y se introducía la sonda en el útero. Seguidamente, se colocaba el fonil y se introducía medio litro de solución salina estéril, quitándolo rápidamente para permitir el drenaje del líquido. Esta operación se repetía nuevamente con el otro medio litro de solución salina restante y, posteriormente, cuando ya se había eliminado todo o la mayor parte del líquido uterino, se procedía a introducir el antibiótico de elección mediante de una jeringa estéril. El tratamiento completo se repetía todos los días del celo. Además, los animales se monitorizaban a días alternos con un ecógrafo portátil (SIUICTS 200V), (Practice C.V.M., Tudela, Navarra, España) utilizando una sonda SIUI transrectal de 5 Mhz. Cuando se detectaba la presencia de un folículo preovulatorio de 40 mm, se procedía a realizar la inseminación de la yegua y se inducía a la ovulación con Gonadotropina Coriónica Humana (hCG LEPORI 2500 U.I). Cabe destacar que las primeras siete yeguas (hasta L56) se lavaron con un litro de solución salina estéril y se indujo la ovulación con 3500 U.I. de Gonadotropina Coriónica Humana (hCG). A partir de L62 se utilizaron 2 litros de solución salina estéril en cada lavado uterino ya que, de ese modo, el líquido obtenido tras el lavado era más limpio y se obtenían Experiencia 3 122 mejores resultados. Asimismo, se cambió la dosis de hCG empleada a la hora de la inducción a la ovulación empleando 2500 U.I., ya que en el transcurso del estudio se observó que las yeguas sometidas a tratamiento ovulaban a dosis más bajas, abaratando así el coste con iguales resultados y hormonando menos a las pacientes. En aquellas yeguas que, después de varios tratamientos, continuaban quedando vacías, se cubrían mediante inseminación artificial. A las 48 horas, se monitorizaban de nuevo, y en aquellas yeguas que ya habían ovulado se daba por finalizado el tratamiento y las otras que aún no lo habían hecho se volvía a realizar lavado y cubrición hasta que las mismas terminasen su ovulación. Los antibióticos administrados como tratamiento intrauterino fueron amikacina (Amicacina-Braun, Solución para infusión 10mg/ml, B.braun medical, s.a,España), ampicilina (ampicilina laboratorio Antibioticos de México-,), apramicina (Girolan 200,Elanco Valquímica, España, gentamicina, (gentamiciana braun al 6%. España), kanamicina (Kantrex, GrupoBristol-Meyers Squibb,España), penicilina (Duphapen-strep, Fordoge,Pfizer, España) y trimetoprim sulfamida (Trizim,Grappiollo, Italia). A continuación, se describen algunas características de interés en referencia al uso terapéutico de los mismos: AMIKACINA (AMIGLYDE-V, AMICACINA SULFATO) La amikacina sulfato es un antibiótico aminoglucósido semisintético derivado de la kanamicina. Su eficacia en infecciones causadas por Escherichia coli, Pseudomonas spp. y Klebsiella spp. se ha demostrado clínicamente en el caballo. Experiencia 3 123 Según la farmacocinética de este antibiótico, se recomienda la infusión intrauterina de 2 gramos de Amiglyde-V (amicacina sulfato) diariamente durante 3 días consecutivos en yeguas. No obstante, el medicamento no se absorbe apreciablemente de manera sistémica después de la infusión intrauterina. APRAMICINA La apramicina es un antibiótico del grupo de los aminoglicósidos, que se utiliza en veterinaria, pero no en medicina humana. Está formada por dos residuos de azufre y una desoxiestreptamina monosubstituída. Producido por la bacteria Streptomyces tenebrarius. Está indicada para el tratamiento de diversas infeccións por bacterias Gram-negativas en animales, como coliformes o salmonelas GENTAMICINA La gentamicina es un antibiótico aminoglucósido de amplio espectro. Actúa sobre bacterias gramnegativas aerobias, incluyendo enterobacteriáceas, Pseudomonas spp., y Haemophilus spp.., Actúa también sobre estafilococos (Staphylococcus aureus y Staphylococcus epidermidis) incluyendo cepas productoras de penicilinasa, tiene actividad muy limitada sobre estreptococos. Carece de actividad sobre bacterias anaerobias. Indicado para el tratamiento de infecciones en equinos (no Experiencia 3 124 destinados al consumo humano), tanto del tracto genitourinario, como respiratorio. También es eficaz en colibacilosis y salmonelosis en potros. PENICILINA La penicilina procaínica es un antibiótico β-lactámico que actúa impidiendo la síntesis de la pared bacteriana. La dihidroestreptomicina es un antibiótico aminoglucósido, que ejerce su acción antibacteriana mediante la unión irreversible de la subunidad 30S del ribosoma bacteriano. Se ha observado actividad sinérgica o aditiva entre bencilpenicilna y dihidroestreptomicina en enterococos, estafilococos, estreptococos, Pasteurella spp. AMPICILINA La ampicilina es un antibiótico penicilínico semisintético, de amplio espectro y activo por vía oral. Aunque es más activo que las penicilinas naturales no estable frente a las beta-lactamasa producidas por bacterias - postitivas o -negativas. La ampicilina se utiliza para el tratamiento de infecciones debidas a organismos susceptibles como la otitis media, la sinusitis y las cistitis. El espectro de acción de la ampicilina comprende positivos y negativos aerobios incluyendo cepas de Echerichia coli, Klebsiella spp.., y Haemophilus spp.. Experiencia 3 125 KANAMICINA La kanamicina es un antibiótico del grupo de los aminoglucósidos, de amplio espectro, bactericida, activo sobre bacterias Gram positivas, Gram negativas y Mycobacterium spp.., por lo que se indica en una amplia gama de infecciones. Indicado en el tratamiento de infecciones provocadas por gérmenes sensibles a la kanamicina como Staphylococcus aureus, Proteus spp.., Escherichia coli, Shigella spp.., Mycobacterium tuberculosis, etc. Una vez detectada la ovulación mediante ecografía, se realizaba un diagnóstico de gestación a los 21 días, revisándose las positivas a los 45 días post-ovulación por si se había producido reabsorción embrionaria. Sabemos que las yeguas sufren un alto porcentaje de reabsorción embrionaria, principalmente cuando se produce la implantación del embrión en el cuerpo del útero. El retraso en la realización del diagnóstico (a los 21 días) en discrepancia con lo descrito en la literatura a los 14 o 15 días (Mckinnon y col., 1992) no supone una diferencia sustancial. Por otro lado, aquellas yeguas en las que el tratamiento no había sido eficaz, la yegua volvía a estar en celo y podía iniciarse el mismo nuevamente, ahorrándose el propietario la visita anterior de diagnóstico de gestación. Además, en algunas ocasiones, las vesículas embrionarias pueden ser muy pequeñas y pasar desapercibidas a la detección del ecógrafo. A los 21 días de gestación, la vesícula embrionaria tiene un tamaño difícil de no detectar. Experiencia 3 126 Gestación post-tratamiento 38% 62% NEGATIVAS POSITIVAS E3.3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN La figura E3.1 muestra, de modo genérico, el porcentaje de yeguas donde el tratamiento antibiótico resultó positivo, considerando la posterior gestación o no de dichos animales post-tratamiento. Las figuras E3.2 y E3.3 muestran los agentes bacterianos implicados tanto en los casos en los que el tratamiento antibiótico resultó exitoso como en el que resultó infructuoso. Finalmente, en la tabla E3.1 se ofrece una descripción detallada de los resultados individuales post-tratamiento en función del microorganismo identificado en la Experiencia 1 y el antibiótico utilizado en función de la Experiencia 2. Para ello, y al objeto de aportar información epidemiológica relevante, indicamos nuevamente en cada caso la edad, la raza de la yegua, el diagnóstico microbiológico y el procedimiento especifico realizado. Finalmente, en el aparatado de observaciones, describimos la eficacia o no del tratamiento. Figura E3.1: Porcentaje de hembras gestantes post-tratamiento Tal y como podemos observar, el índice de fertilidad aumentó considerablemente en las yeguas tratadas con el antibiótico de elección, hecho por el cual hubo un aumento directo en nuestra casuística. Experiencia 3 127 El tratamiento utilizado habitualmente para solucionar la endometritis en yeguas susceptibles se basa en la irrigación del útero con solución salina fisiológica o Ringer lactato, suplementado o no con antibiótico en función del resultado del cultivo, acompañada de la administración de fármacos ecbólicos para facilitar la expulsión del contenido uterino. Estudios previos (Williamson y col., 1987; Brinsko y col., 1990; Katila, 1995) han establecido que el momento óptimo para tratar las yeguas susceptibles es a las 4-8 horas de la cubrición y es así como se ha venido haciendo en clínica de manera rutinaria. Este período de tratamiento se basa en dos hechos. Por un lado, después de la cubrición, el semen necesita entre media hora y 4 horas para alcanzar los oviductos (Bader, 1982; Scott, 2000) Entre cinco y diez minutos después de la cubrición, el útero se contrae de manera frecuente, permitiendo la redistribución del semen dentro del lumen uterino, tanto craneal como caudalmente. Durante esta distribución transuterina, no todo el eyaculado es transportado hacia los cuernos uterinos, si no que una parte se drena hacia el exterior a través del cérvix (Katila y col., 2000). Así, realizar un lavado uterino antes de las 4 horas, disminuiría las posibilidades de una gestación. Por otro lado, la presencia de espermatozoides dentro del lumen pone en marcha la respuesta inmunitaria del útero. La primera célula en llegar son los polimorfonucleares neutrófilos (PMNs), los cuales migran siguiendo un gradiente quimiotáctico iniciado por el tejido lesionado (Kaplanski y col., 2003). Los primeros PMNs aparecen en el útero media hora después de la cubrición o la inseminación artificial, alcanzando su pico máximo entre las 4 y las 8 horas post-cubrición (Katila, 1995). Experiencia 3 134 Tabla E3.1. Resultados individuales de cada una de las yeguas tratadas, especificando la edad, la raza, el microorganismo aislado y el tratamiento administrado. (PSI= pura sangre ingles; PRE= pura raza española Nº de muestra Edad Raza Aislamiento microbiológico Tratamiento Observaciones L27 15 PSI Pseudomonas spp. Lavados uterinos con 1 litro de solución salina estéril una vez al día durante 15 días, añadiendo 20 ml de gentamicina al 6% por vía intrauterina. Cubrición por monta natural a días alternos. Inducción de la ovulación con folículo preovulatorio de 41 mm de diámetro utilizando 3500 U.I de hCG. Diagnóstico ecográfico de gestación por vía transrectal a los 21 días. Gestación positiva L35 4 PSI Pseudomonas spp. Staphylococcus spp. Lavados uterinos con 1 litro de solución salina estéril una vez al día durante 10 días, añadiendo 20 ml de gentamicina al 6% cada día del lavado. Cubrición por monta natural a días alternos. Inducción de la ovulación con folículo preovulatorio con 41mm utilizando 3500 U.I de hCG. Diagnóstico ecográfico de gestación por vía transrectal los 28 días. Gestación positiva L38 8 PSI Staphylococcus capitis Lavados uterinos con 1 litro de solución salina estéril una vez al día durante 9 días, añadiendo 20 ml de gentamicina al 6% cada día del lavado. Cubrición por monta natural a días alternos. Inducción a la ovulación con folículo preovulatorio con 50 mm. Utilizando 3500 U.I de hCG. Diagnóstico ecográfico de gestación por vía transrectal los 30 días. Gestación negativa Experiencia 3 135 Nº de muestra Edad Raza Aislamiento microbiológico Tratamiento Observaciones L52 7 PSI Bordetella spp. Lavados uterinos con 1 litro de solución salina estéril una vez al día durante 4 días, añadiendo 20ml de gentamicina al 6% cada día del lavado. Cubrición por monta natural a días alternos. Diagnóstico ecográfico de gestación por vía transrectal los 27 días. Gestación positiva L53 5 PSI Klebsiella ornithinolytica Lavados uterinos con 1 litro de solución salina estéril una vez al día durante 9 días, añadiendo 20ml de gentamicina al 6% cada día del lavado. Cubrición por monta natural a días alternos. Diagnóstico ecográfico de gestación por vía transrectal los 52 días. Gestación positiva L54 9 PSI Bordetella spp. Lavados uterinos con 1 litro de solución salina estéril una vez al día durante 9 días, añadiendo 20 ml de gentamicina al 6% cada día del lavado. Cubrición por monta natural a días alternos. Inducción de la ovulación con folículo preovulatorio de 43 mm con 3500 U.I de hCG. Diagnóstico ecográfico de gestación por vía transrectal a los 30 días. Gestación negativa Experiencia 3 136 Nº de muestra Edad Raza Aislamiento microbiológico Tratamiento Observaciones L56 8 PSI Streptococcus spp. Lavados uterinos con 1 litro de solución salina estéril una vez al día durante 9 días, añadiendo 20 ml de gentamicina al 6% cada día del lavado. Cubrición por monta natural a días alternos. Inducción de la ovulación con folículo preovulatorio de 47 mm con 3500 U.I de hCG. Diagnóstico ecográfico de gestación por vía transrectal los 21 días. Gestación positiva L62 5 PSI Echerichia coli Staphylococcus spp. Lavados uterinos con 2 litros de solución salina estéril una vez al día durante 15 días, añadiendo 20 ml de gentamicina al 6% cada día del lavado. Cubrición por monta natural a días alternos. Inducción de la ovulación con folículo preovulatorio de 50 mm con 2500 U.I de hCG. Diagnóstico ecográfico de gestación por vía transrectal los 35 días. Gestación positiva L72 9 PSI Staphylococcus spp. Lavados uterinos con 2 litros de solución salina estéril una vez al día durante 10 días, añadiendo 20 ml de gentamicina al 6% cada día del lavado. Cubrición por monta natural a días alternos. Inducción de la ovulación con folículo preovulatorio de 46 mm con 2500 U.I de hCG. Diagnóstico ecográfico de gestación por vía transrectal los 40 días. Gestación negativa Experiencia 3 137 Nº de muestra Edad Raza Aislamiento microbiológico Tratamiento Observaciones L76 6 PSI Escherichia coli Lavados uterinos con 2 litros de solución salina estéril una vez al día durante 20 días, añadiendo 20 ml de gentamicina al 6% cada día del lavado. Cubrición por monta natural a días alternos. Inducción de la ovulación con folículo preovulatorio de 43 mm con 2500 U.I de hCG. Diagnóstico ecográfico de gestación por vía transrectal los 21 días. Gestación negativa L77 5 PSI Staphylococcus haemoliticus Lavados uterinos con 2 litros de solución salina estéril una vez al día durante 20 días, añadiendo 20 ml de ampicilina cada día del lavado. Cubrición por monta natural a días alternos. Inducción de la ovulación con folículo preovulatorio de 43 mm con 2500 U.I de hCG. Diagnóstico ecográfico de gestación por vía transrectal los 21 días. Gestación negativa L77 Escherichia coli Lavados uterinos con 2 litros de solución salina estéril una vez al día durante 6 días, añadiendo 10 ml de ampicilina cada día del lavado. Cubrición por monta natural a días alternos. Inducción de la ovulación con folículo preovulatorio de 43 mm con 2500 U.I de hCG Diagnóstico ecográfico de gestación por vía transrectal los 21 días. Gestación negativa Experiencia 3 138 Nº de muestra Edad Raza Aislamiento microbiológico Tratamiento Observaciones L82 12 PSI Pseudomonas aeruginosa Lavados uterinos con 2 litros de solución salina estéril una vez al día durante 20 días, añadiendo 20 ml de gentamicina al 6% cada día del lavado. Cubrición por monta natural a días alternos. Inducción de la ovulación con folículo preovulatorio de 43 mm con 2500 U.I de hCG. Diagnóstico ecográfico de gestación por vía transrectal los 21 días. Gestación positiva L84 12 PSI Staphylococcus epidermidis Lavados uterinos con 2 litros de solución salina estéril una vez al día durante 15 días, añadiendo 20 ml de gentamicina al 6% cada día del lavado. Cubrición por monta natural a días alternos. Inducción de la ovulación con folículo preovulatorio de 40 mm con 2500 U.I de hCG. Diagnóstico ecográfico de gestación por vía transrectal los 30 días. Gestación negativa L84 12 PSI Staphylococcus epidermidis Lavados uterinos con 2 litros de solución salina estéril una vez al día durante 15 días, añadiendo 20 ml de gentamicina al 6% cada día del lavado. Cubrición por monta natural a días alternos. Inducción de la ovulación con folículo preovulatorio de 40 mm con 2500 U.I de hCG. Diagnóstico ecográfico de gestación por vía transrectal los 21 días. Gestación negativa Experiencia 3 139 Nº de muestra Edad Raza Aislamiento microbiológico Tratamiento Observaciones L87 10 PSI Escherichia coli Lavados uterinos con 2 litros de solución salina estéril una vez al día durante 10 días, añadiendo 10 ml de apramicina-15 cada día del lavado. Cubrición por monta natural a días alternos. Inducción de la ovulación con folículo preovulatorio de 48 mm con 2500 U.I de hCG. Diagnóstico ecográfico de gestación por vía transrectal a los 25 días. Gestación positiva L88 5 CRUZ ADA Pseudomonas spp. Lavados uterinos con 2 litros de solución salina estéril una vez al día durante 15 días, añadiendo 20 ml de gentamicina al 6% cada día del lavado. Cubrición por monta natural a días alternos. Inducción de la ovulación con folículo preovulatorio de 41 mm con 2500 U.I de hCG. Diagnóstico ecográfico de gestación por vía transrectal los 40 días. Gestación positiva L92 10 PSI Streptococcus spp. Lavados uterinos con 2 litros de solución salina estéril una vez al día durante 7 días, añadiendo 20 ml de amikacina cada día del lavado. Cubrición por monta natural a días alternos. Inducción de la ovulación con folículo preovulatorio de 41 mm con 2500 U.I de hCG. Diagnóstico ecográfico de gestación por vía transrectal los 40 días. Gestación positiva L93 8 PSI Pseudomonas aeruginosa Lavados uterinos con 2 litros de solución salina estéril una vez al día durante 9 días, añadiendo 20 ml de gentamicina cada día del lavado. Inseminación artificial después de la inducción de la ovulación con folículo preovulatorio de 42 mm con 2500 U.I de hCG. Diagnóstico ecográfico de gestación por vía transrectal los 30 días. Gestación positiva Experiencia 3 140 Nº de muestra Edad Raza Aislamiento microbiológico Tratamiento Observaciones 108 10 PSI Staphylococcus spp. Lavados uterinos con 2 litros de solución salina estéril una vez al día durante 8 días, añadiendo 20 ml de gentamicina cada día del lavado. Cubrición por monta natural a días alternos. Inducción de la ovulación con folículo preovulatorio de 45 mm con 2500 U.I de hCG. Diagnóstico ecográfico de gestación por vía transrectal los 28 días. Gestación negativa L114 5 PSI Staphylococcus haemolyticus Lavados uterinos con 2 litros de solución salina estéril una vez al día durante 6 días, añadiendo 10 ml de neomicina cada día del lavado. Cubrición por monta natural a días alternos. Inducción de la ovulación con folículo preovulatorio de 44 mm con 2500 U.I de hCG. Diagnóstico ecográfico de gestación por vía transrectal los 22 días. Gestación negativa L123 5 PSI Pseudomonas aeruginosa Lavados uterinos con 2 litros de solución salina estéril una vez al día durante 9 días, añadiendo 10 ml de amikacina cada día del lavado. Cubrición por monta natural a días alternos. Inducción de la ovulación con folículo preovulatorio de 45 mm con 2500 U.I de hCG. Diagnóstico ecográfico de gestación por vía transrectal los 25 días. Gestación negativa L124 10 PSI Enterobacter aerogenes Lavados uterinos con 2 litros de solución salina estéril una vez al día durante 8 días, añadiendo 20 ml de gentamicina al 6% cada día del lavado. Cubrición por monta natural a días alternos. Inducción de la ovulación con folículo preovulatorio de 45 mm con 2500 U.I de hCG. Diagnóstico ecográfico de gestación por vía transrectal los 32 días. Gestación negativa Experiencia 3 141 Nº de muestra Edad Raza Aislamiento microbiológico Tratamiento Observaciones L130 11 PSI Escherichia coli Lavados uterinos con 2 litros de solución salina estéril una vez al día durante 6 días, añadiendo 20ml de gentamicina cada día del lavado. Inseminación artificial después de la inducción de la ovulación con folículo preovulatorio de 40 mm con 2500 U.I de hCG. Diagnóstico ecográfico de gestación por vía transrectal los 28 días. Gestación positiva L131 9 PSI Staphylococcus spp. Lavados uterinos con 2 litros de solución salina estéril una vez al día durante 7 días, añadiendo 15 ml de ampicilina 10 cada día del lavado. Cubrición por monta natural a días alternos. Inducción de la ovulación con folículo preovulatorio de 41 mm con 2500 U.I de hCG. Diagnóstico ecográfico de gestación por vía transrectal los 33 días. Gestación negativa L133 7 PSI Escherichia coli Lavados uterinos con 2 litros de solución salina estéril una vez al día durante 9 días, añadiendo 20 ml de gentamicina al 6% cada día del lavado. Cubrición por monta natural a días alternos. Inducción a la ovulación con con folículo preovulatorio de 41 mm con 2500 U.I. de hCG. Diagnóstico ecográfico de gestación por vía transrectal los 26 días. Gestación positiva Experiencia 3 142 Nº de muestra Edad Raza Aislamiento microbiológico Tratamiento Observaciones L134 8 PSI Escherichia coli Lavados uterinos con 2 litros de solución salina estéril una vez al día durante 6 días, añadiendo 20 ml de gentamicina al 6% cada día del lavado. Cubrición por monta natural a días alternos. Inducción de la ovulación con folículo preovulatorio de 45 mm con 2500 U.I de hCG. Diagnóstico ecográfico de gestación por vía transrectal los 21 días. Gestación positiva Reabsorción embrionaria a los 48 días. L135 9 PSI Enterobacter spp. Lavados uterinos con 2 litros de solución salina estéril una vez al día durante 8 días, añadiendo 20 ml de amikacina cada día del lavado. Cubrición por monta natural a días alternos. Inducción de la ovulación con folículo preovulatorio de 46 mm con 2500 U.I de hCG. Diagnóstico ecográfico de gestación por vía transrectal los 30 días. Gestación positiva L136 8 PSI Escherichia coli Lavados uterinos con 2 litros de solución salina estéril una vez al día durante 6 días, añadiendo 20 ml de amikacina cada día del lavado. Cubrición por monta natural a días alternos.Inducción de la ovulación con folículo preovulatorio de 41 mm con 2500 U.I de hCG. Diagnóstico ecográfico de gestación por vía transrectal los 36 días. Gestación positiva Experiencia 3 143 Nº de muestra Edad Raza Aislamiento microbiológico Tratamiento Observaciones L137 9 CRUZ ADA Enterobacter spp. Lavados uterinos con 2 litros de solución salina estéril una vez al día durante 8 días, añadiendo 20 ml de gentamicina al 6% cada día del lavado. Cubrición por monta natural a días alternos. Inducción de la ovulación con folículo preovulatorio de 43 mm con 2500 U.I de hCG. Diagnóstico ecográfico de gestación por vía transrectal los 28 días. Gestación negativa L138 7 CRUZ ADA Staphylococcus spp. Lavados uterinos con 2 litros de solución salina estéril una vez al día durante 10 días, añadiendo 20 ml de gentamicina al 6% cada día del lavado. Cubrición por monta natural a días alternos. Inducción de la ovulación con folículo preovulatorio de 41 mm con 2500 U.I de hCG. Diagnóstico ecográfico de gestación por vía transrectal los 28 días. Gestación negativa L141 7 PSI Staphylococcus haemoliticus Lavados uterinos con 2 litros de solución salina estéril una vez al día durante 6 días, añadiendo 10 ml de ampicilina cada día del lavado. Cubrición por monta natural a días alternos. Inducción de la ovulación con folículo preovulatorio de 43 mm con 2500 U.I de hCG. Diagnóstico Ecográfico de gestación por vía transrectal los 30 días. Gestación positiva L142 12 PSI Aerococcus viridans Lavados uterinos con 2 litros de solución salina estéril una vez al día durante 8 días, añadiendo 15 ml de penicilina cada día del lavado. Cubrición por monta natural a días alternos. Inducción de la ovulación con folículo preovulatorio de 40 mm con 2500 U.I de hCG. Diagnóstico ecográfico de gestación por vía transrectal los 28 días. Gestación negativa