Metodología para la identificación de especies animales con características bioacústicas de sonidos simples

Tesis doctoral P. Verborgh. 2015 - 2 Tesis doctoral P. Verborgh. 2015 - 3 Tesis doctoral P. Verborgh. 2015 - 4 Tesis doctoral P. Verborgh. 2015 - 5 Tesis doctoral P. Verborgh. 2015 - 6 Tesis doctoral P. Verborgh. 2015 - 7 Tesis doctoral P. Verborgh. 2015 - 8 Tesis doctoral P. Verborgh. 2015 - 9 Dr. RENAUD DE STEPHANIS, DIRECTOR DEL DEPARTAMENTO DE INVESTIGACIÓN Y PRESIDENTE DE CIRCE (CONSERVACIÓN, INFORMACIÓN Y ESTUDIO SOBRE CETÁCEOS) INFORMA: Que la presente tesis doctoral titulada “Demografía y estructura de las poblaciones de calderones comunes (Globicephala melas) en el Mediterráneo español” realizada por D. Philippe Verborgh, con número de identificación X7308815J, Licenciado en Biología Marina para optar al título de Doctor por la Universidad de Las Palmas de Gran Canaria ha sido realizada bajo mi dirección y, considerando que reúne las condiciones y calidad científica para optar al grado de Doctor, autorizo su presentación para que pueda ser juzgada por el tribunal correspondiente. Y para que conste a los efectos oportunos, firmo la presente en Tarifa, a treinta de octubre de dos mil quince. Renaud de Stephanis Tesis doctoral P. Verborgh. 2015 - 16 Agradecimientos V. Este trabajo es en parte el reflejo de lo que es CIRCE (Conservación, Información y Estudio sobre Cetáceos) es decir, una entidad que promueve proyectos de investigación que tienen una aplicación en la conservación de los cetáceos. Esta tesis es el resultado de un trabajo que ha contado con la colaboración de varias entidades a nivel internacional durante muchos años. La lista es muy larga, con más de 20 años de datos recopilados, pero sin ellos nada hubiera sido posible. Primero, quiero agradecer a CIRCE por haberme acogido en 2001 y darme la posibilidad de estudiar una especie tan fascinante como los calderones comunes. Desde la creación del catálogo de fotoidentificación en 2003, he pasado más tiempo con los calderones y otros cetáceos que con mi propia familia. Después de varios miles de avistamientos, seguimos aprendiendo sobre ellos y, aunque ya tenemos respuestas a muchas preguntas, todavía quedan muchas más por responder. A special thanks to all the entities who have collaborated in the genetic study of longfinned pilot whales by either providing the samples and showing how important it is to create historical tissue banks or by carrying out surveys to collect biopsy samples: Irish Cetacean Genetic Tissue Bank, Irish Whale and Dolphin Group, National Museum of Ireland, Centre de Recherche sur les Mammifères Marins, Euskal Izurde eta Balezaleen Elkartea (EIBE), Coordinadora para o Estudo dos Mamíferos Mariños (CEMMA), Sociedade Portuguesa de Vida Selvagem (SPVS), Alnitak, Asociación de Naturalistas del Sureste (ANSE), Centre de Recherche pour la Conservation du Marineland (CRC Marineland) and University of Sienna. Merci à Lionel Minvielle-Sebastia et son équipe pour m’avoir accueilli dans son laboratoire, financer les résultats de génétique et de m’avoir enseigné depuis zéro comment extraire de l’ADN, réaliser des PCR, faire migrer sur gel, aligner des séquences et savoir prendre une absence de résultats à la fin d’une longue journée avec bonne humeur. Une partie des analyses (PCR des microsatélites et ADN mitochondrial et migration sur séquenceur automatique ABI 3130 XL) présentées dans ce travail ont été réalisé par Christophe Hubert et ses collaborateurs à la Plateforme Tesis doctoral P. Verborgh. 2015 - 17 Génome Transcriptome du Centre de Génomique Fonctionnelle de Bordeaux, Université Bordeaux Segalen, France (subventionné par le Conseil Régional d’Aquitaine n°20030304002FA et 20040305003FA et de l’Union Européene, FEDER n°2003227 et de l’Investissements d'avenir, Convention attributive d’aide N°ANR-10-EQPX-16-01)." Merci à Mathilde Saboureau et Amélie Boué pour m’avoir hébergé durant mes séjours à Bordeaux et surtout m’avoir remonté le moral après des journées entières perdues sans obtenir de résultats de ces ADN malicieux. La recogida de datos en el mar es un trabajo que requiere la participación de muchas personas, la mayoría del tiempo de manera voluntaria, durante muchas horas y no siempre en condiciones ideales. Han pasado más de 200 personas por el barco desde que empecé en 2001 y sería imposible nombrarlos a todos sin dejar a alguien de lado. Sin embargo, quiero agradecer a la gente que ha pasado un tiempo importante en el barco, dejando su huella, o que siguen en CIRCE: Renaud, Neus, Patricia, Manolo, Juanma, Evix, Eva, Zaida, Marta, Bea, Ruth, Vicki, Lydia, Susana, Noelia, Pablo, Nico, David, Alicia, Sergi, María C., Yohan, Alice, Pauline, Joan, Carolina, João, Bruno, Tuca, Aixa, Marina, Charlotte, Ruth Q, Eva, Ambra y María V. Un agradecimiento especial a todos los asistentes de investigación que permitieron seguir con la monitorización anual de los calderones del Estrecho. Muchas gracias por todas estas preguntas y motivación que me dieron una razón para seguir con este trabajo tan importante. Un merci spécial à Clémentine, Morgane et Élodie qui ont analysé plusieurs dizaines de milliers de photos de dorsales de globis en quelques mois et ont réalisé une partie des analyses. Muchas gracias a Jose Luis, Rossa, Kaja, Leila, Marina, Aixa y Maria por haber creado y comparado los catálogos de calderones del mar de Alborán y golfo de Vera. Tesis doctoral P. Verborgh. 2015 - 18 Gracias a Alnitak, Alnilam y ANSE por haber compartido sus bases de datos y fotografías de aletas de calderones comunes. Gracias a mis directores de tesis Toño y Renaud que han permitido concretizar este trabajo, después de muchos años. Gracias a Tuca, Rosa, Ruth, Joan y Pauline por revisar la calidad del castellano en esta tesis. Merci à mes parents et ma sœur pour m’avoir soutenu autant moralement que financièrement depuis le début de cette aventure. La conservation de ces globis est parfois passée avant la conservation de nos relations mais j’espère que si dans 20 ans la population est toujours vivante grâce à ce travail alors cela aura valu la peine. Finalement un merci infini à Pauline pour m’avoir épaulé depuis le début de ce projet, pour les révisions de cette thèse et bien sûr pour ton soutien moral infini surtout dans les moments durs où je me suis retrouvé à bout sans énergie pour continuer. Tesis doctoral P. Verborgh. 2015 - 19 Índice Resumen ........................................................................................................................................ 13 I. Abstract ......................................................................................................................................... 14 II. Financiadores ............................................................................................................................ 15 III. Presentaciones de resultados ................................................................................................... 15 IV. Agradecimientos ........................................................................................................................... 16 V. CAPÍTULO 1 – INTRODUCCIÓN GENERAL ................................................................................................... 23 Justificación ................................................................................................................................... 25 I. Conocimientos sobre el calderón común (Globicephala melas) ................................................... 28 II. 2.1 Morfología ..................................................................................................................... 28 2.2 Dieta ........................................................................................................................ 30 2.3 Distribución espacial y abundancia ......................................................................... 32 2.4 Taxonomía ............................................................................................................... 37 2.5 Estructura poblacional de calderones comunes ..................................................... 38 2.6 Parámetros demográficos de los calderones comunes .......................................... 39 2.7 Estructura social ...................................................................................................... 40 2.8 Amenazas ................................................................................................................ 41 2.9 Estado de conservación ........................................................................................... 43 Información necesaria para evaluar el estado de conservación del calderón común en el III. Mediterráneo español ............................................................................................................................ 46 Objetivos generales .................................................................................................................. 49 IV. Referencias .................................................................................................................................... 52 V. CAPÍTULO 2 - ESTRUCTURA POBLACIONAL DEL CALDERÓN COMÚN EN EUROPA..................................... 61 Introducción .................................................................................................................................. 63 I. Metodología .................................................................................................................................. 66 II. 2.1 Muestreos de los calderones comunes ................................................................... 66 2.2 Determinación de sexos .......................................................................................... 67 2.3 Análisis de microsatélites ........................................................................................ 68 2.4 Análisis de ADN mitocondrial (ADNmt) ................................................................... 71 Resultados ................................................................................................................................. 72 III. 3.1 Muestras obtenidas ................................................................................................. 72 3.2 Determinación de sexos .......................................................................................... 73 3.3 Estructura de población .......................................................................................... 74 Discusión ................................................................................................................................... 84 IV. 4.1 Estructura de población .......................................................................................... 84 4.2 Diversidad genética ................................................................................................. 87 Conclusiones.................................................................................................................................. 89 V. Tesis doctoral P. Verborgh. 2015 - 20 Referencias ............................................................................................................................... 89 VI. CAPÍTULO 3 - IDENTIFICACIÓN DE UNIDADES DE GESTIÓN DE CALDERONES COMUNES EN EL MEDITERRÁNEO ESPAÑOL.......................................................................................................................... 95 Introducción .................................................................................................................................. 97 I. Metodología .................................................................................................................................. 99 II. 2.1 Foto-identificación ........................................................................................................ 99 2.2 Marcas satélite ...................................................................................................... 100 2.3 Tasa de migración reciente ................................................................................... 103 Resultados ............................................................................................................................... 104 III. 3.1 Foto-identificación ................................................................................................ 104 3.2 Marcas satélite ...................................................................................................... 107 Discusión ................................................................................................................................. 115 IV. Conclusión ................................................................................................................................... 119 V. Referencias ............................................................................................................................. 119 VI. CAPÍTULO 4 - PARÁMETROS DEMOGRÁFICOS DE LOS CALDERONES COMUNES DEL ESTRECHO DE GIBRALTAR ................................................................................................................................................ 123 Introducción ................................................................................................................................ 125 I. Material y métodos ..................................................................................................................... 126 II. 2.1 Obtención de datos ............................................................................................... 126 2.2 Foto-identificación de los individuos marcados de forma natural ....................... 127 2.3 Catálogo de los individuos “no marcados” o con marcas secundarias ................. 131 2.4 Determinación de clases de edad a partir de las fotografías ................................ 133 2.5 Abundancia y tasas de supervivencia de la población .......................................... 134 2.6 El modelo de diseño robusto cerrado ................................................................... 134 2.7 Modelo multiestado .............................................................................................. 135 2.8 El modelo multiestado de diseño robusto cerrado (MEDRC) ............................... 136 2.9 Intervalo de nacimientos y estacionalidad de reproducción ................................ 139 2.10 Tiempo de generación ........................................................................................... 140 Resultados ............................................................................................................................... 140 III. 3.1 Obtención de datos ............................................................................................... 140 3.2 Foto-identificación de todos los individuos de la población ................................. 141 3.3 Tasa de supervivencia y abundancia de la población ........................................... 143 3.4 Intervalo de nacimiento y estacionalidad de reproducción .................................. 145 3.5 Tiempo de generación ........................................................................................... 147 Discusión ................................................................................................................................. 147 IV. 4.1 Determinación de las clases de edad .................................................................... 147 4.2 Asunciones del modelo de diseño robusto cerrado .............................................. 148 Tesis doctoral P. Verborgh. 2015 - 21 4.3 Estimas de la tasa de supervivencia ...................................................................... 149 4.4 Estimas de abundancia .......................................................................................... 151 4.5 Porcentaje de individuos maduros ........................................................................ 152 4.6 Intervalo de nacimientos y estacionalidad de reproducción ................................ 152 4.7 Tiempo de generación ........................................................................................... 153 4.8 Seguimiento del estado de la población ............................................................... 154 Conclusión ................................................................................................................................... 154 V. Referencias ............................................................................................................................. 155 VI. CAPÍTULO 5 - EFECTOS DE LA EPIZOOTIA DE MORBILLIVIRUS SOBRE LOS PARÁMETROS DEMOGRÁFICOS DE LOS CALDERONES COMUNES DEL ESTRECHO DE GIBRALTAR ............................................................. 159 Introducción ................................................................................................................................ 161 I. Metodología ................................................................................................................................ 164 II. 2.1 Foto-identificación ................................................................................................ 164 2.2 Estimas de parámetros demográficos ................................................................... 164 2.3 Hipótesis y selección de modelos.......................................................................... 165 2.4 Estimas de abundancia .......................................................................................... 166 Resultados ............................................................................................................................... 167 III. 3.1 Foto-identificación ................................................................................................ 167 3.2 Selección de modelos ............................................................................................ 169 3.3 Estimas de abundancia .......................................................................................... 170 3.4 Tasa de supervivencia ........................................................................................... 172 3.5 Tasa de crecimiento poblacional ........................................................................... 173 Discusión ................................................................................................................................. 175 IV. Conclusión ................................................................................................................................... 183 V. Referencias ............................................................................................................................. 183 VI. CAPÍTULO 6 - DISCUSIÓN GENERAL .......................................................................................................... 187 Estado de conservación de calderones comunes del Atlántico Europeo .................................... 190 I. Estado de conservación de calderones comunes del estrecho de Gibraltar ............................... 191 II. Estado de conservación de calderones comunes del Mediterráneo ...................................... 194 III. Propuesta de plan de conservación para los calderones comunes del Mediterráneo ........... 195 IV. Referencias .................................................................................................................................. 202 V. CAPÍTULO 7 - CONCLUSIONES FINALES .................................................................................................... 205 ANEXO1: MEDIDAS DE CONSERVACIÓN ................................................................................................... 211 Estrategia de Conservación ......................................................................................................... 211 I. Plan de Conservación .................................................................................................................. 214 II. Referencias ............................................................................................................................. 235 III. Tesis doctoral P. Verborgh. 2015 - 22 CAPÍTULO 1 – INTRODUCCIÓN GENERAL Capítulo 1Introducción general Tesis doctoral P. Verborgh. 2015 - 24 Capítulo 1Introducción general Tesis doctoral P. Verborgh. 2015 - 25 Justificación I. El reconocimiento de la importancia de la conservación de la biodiversidad a nivel mundial es reciente, con la firma del Convenio sobre la Diversidad Biológica por 168 países durante la Conferencia de las Naciones Unidas sobre el Medio Ambiente y el Desarrollo celebrado en Rio de Janeiro en 1992. La diversidad biológica o biodiversidad es "la variabilidad de organismos vivos de todas las clases, incluida la diversidad intraespecífica, interespecífica y de los ecosistemas" (Naciones Unidas, 1992). Esta biodiversidad está demostrando cada vez más su importancia para el desarrollo económico, sociológico y médico (Gascon et al., 2015). A nivel mundial, la Unión Internacional para la Conservación de la Naturaleza (UICN) está encargada de evaluar el riesgo de extinción de las especies tanto animales como vegetales. Las plantas, hongos y animales evaluados en la Lista Roja de la UICN son los portadores de la diversidad genética y los componentes básicos de los ecosistemas. La información sobre su estado de conservación y distribución proporciona una base sólida para la toma de decisiones sobre la conservación de la biodiversidad tanto a nivel local como mundial. La evaluación de los datos disponibles de una especie permite clasificarla en una categoría de riesgo de extinción que va desde “Preocupación Menor” hasta “Extinto” (figura 1.1). Figura 1.1. Esquema de los diferentes estados de conservación de la UICN. Se evalúan los datos disponibles de todas las especies, subespecies o poblaciones para atribuirles una categoría de conservación: EX=Extinto, EW=Extinto en estado Silvestre, CR=en Peligro Crítico de Extinción, EN=en Peligro de Extinción, VU=Vulnerable, NT=Casi Amenazado, LC=Preocupación Menor, DD=Datos insuficientes, NE=Sin Evaluar. Capítulo 1Introducción general Tesis doctoral P. Verborgh. 2015 - 32 Tipo Especie Área* Referencia** Gadiculus argenteus Is Fer 1 Gadidae spp Med 6 Glyptocephalus cynoglossus Is Fer 1 Hippoglossus hippoglossus Is Fer 1 Lycodes sp. Is Fer 1 Melanogrammus aeglefinus Is Fer 1 Merlangius merlangus Is Fer 1 Merluccius bilinearis Atl NO 2 Merluccius merluccius GdV 8, 9 Micromesistius poutassou Is Fer, GdV, Med 1, 6, 8, 9 Reinhardtius hippoglossoides Is Fer 1 Rhinonemus cimbrius Is Fer 1 Sardina pilchardus GdV 8 Scomber scombrus Atl NO, GdV 2, 8 Squalus acanthias Atl NO 2 Trachurus trachurus GdV 8, 9 Trichiuridae Is Fer 1 Trisopterus sp. Is Fer, GdV 1, 8 Crustáceos Pandalus montagui Is Fer 1 Polybius henslowii Gal 9 Invertebrados Salpidae GdV 8 * Atl N: Atlántico norte, Atl NO: Atlántico Noroeste, Is Fer: Islas Feroe, Esc: Escocia, GdV: Golfo de Vizcaya, Gal: Galicia, Por: Portugal, Med: Mediterráneo, Bra: Brasil, Nv Zel: Nueva Zelanda, Arc: Árctico. ** 1: Desportes y Mouritsen, 1993; 2: Gannon et al., 1997a,b; 3: Bjørke, 2001; 4: dos Santos y Haimovici, 2001; 5: González y Sánchez, 2002; 6: Astruc, 2005; 7: Beatson y O'Shea, 2009; 8: Spitz et al., 2011; 9: Santos et al., 2014 2.3 Distribución espacial y abundancia Según Taylor et al. (2008), a nivel mundial, el calderón común habita en aguas templadas y subpolares de cierta profundidad, algunas veces en aguas pelágicas y otras cerca de la costa. Además, es frecuente observarlo a lo largo del talud continental donde se encuentran la mayoría de las presas descritas anteriormente, aunque en ocasiones puede acercarse mucho a la costa e incluso penetrar en las rías en busca de alimento. Algunos grupos, durante la búsqueda de alimento, realizan movimientos desde la costa hacia mar adentro. Como se puede apreciar en la figura 1.3, existen dos subespecies no conectadas, una circumpolar antártica en el hemisferio sur, y otra en el Atlántico norte (Davies, 1960; Oremus et al., 2009). La subespecie G.m. edwardii del hemisferio sur tiene alrededor de 200.000 individuos (CV: 0,35; Kasamatsu y Joyce, 1995). La subespecie G.m. melas del Atlántico norte cuenta con Capítulo 1Introducción general Tesis doctoral P. Verborgh. 2015 - 33 unos 778.000 animales en la cuenca noreste (IC 95%: 440.000-1.370.000; CV=0,30, Buckland et al. 1993) mientras que la del noroeste está estimada en unos 13.000 en las aguas de Terranova (Hay, 1982) y entre 10 y 12.000 en las costas de Estados Unidos (Payne y Heinemann, 1993). Figura 1.3. Mapa del rango de distribución mundial del calderón común común con la presencia en el Atlántico norte y el mar Mediterráneo de Globicephala melas melas y en el hemisferio sur de G. m. edwardii (Taylor et al., 2008). En el Atlántico peninsular, el calderón común es un cetáceo habitual, presente sobre todo en áreas oceánicas y de gran productividad biológica cerca del talud continental y de cañones submarinos (Hammond et al., 2009; Marcos-Ipiña et al., 2014; Pettex et al., 2014). Los avistamientos de esta especie en las costas peninsulares del golfo de Vizcaya se concentran principalmente en el País Vasco y noroeste de Galicia en aguas profundas (Marcos-Ipiña et al., 2014; Goetz et al., 2015). La figura 1.4 muestra la predicción de los modelos espaciales en toda la zona de estudio del proyecto CODA (Cetacean Offshore Distribution and Abundance in the European Atlantic) con una diferencia de densidad importante entre el golfo de Vizcaya (mínima) y el Rockall Capítulo 1Introducción general Tesis doctoral P. Verborgh. 2015 - 34 Trough (máxima) al noroeste de Irlanda (Hammond et al., 2009). Se estimó en estas zonas una población de 25.338 individuos (IC 95%: 12.912-49.725; CV: 0,35; Hammond et al., 2009). Un estudio reciente basado en transectos lineales ha estimado que la población de calderones comunes en la zona económica exclusiva (ZEE) francesa del golfo de Vizcaya (y una extensión hacia aguas inglesas de la Mancha y parte de las aguas españolas costeras del sur del golfo) consta de unos 2.886 individuos (IC 95%: 1.276-6.951) en invierno y 3.864 individuos (IC 95%: 2.064-7.611) en verano (Pettex et al., 2014). Se observa una preferencia por la zona profunda con mayor pendiente en el norte del golfo, entrando a veces en el canal de la Mancha (Kiszka et al., 2004; Kiszka et al., 2007; Hammond et al., 2009; Pettex et al., 2014). No existen estimas de abundancia de calderones comunes en las costas Portuguesas o el golfo de Cádiz pero es una especie común en aguas profundas (Goetz et al., 2015). Figura 1.4. Mapa de predicción de las abundancias estimadas de calderones (Hammond et al., 2009). Capítulo 1Introducción general Tesis doctoral P. Verborgh. 2015 - 35 No existen estimas de abundancia para todo el Mediterráneo, pero su presencia es habitual en el Mediterráneo occidental, aunque no muy frecuente, excepto en el estrecho de Gibraltar, mar de Alborán y golfo de Vera (figura 1.5). Figura 1.5. Distribución supuesta de calderones comunes en la zona de ACCOBAMS, Azul oscuro: habitual, Azul claro presente, Blanco: escaso o ausente, Granate: sin datos (Notarbartolo di Sciara y Birkun, 2010). La población del estrecho de Gibraltar se estimó con una media de 213 individuos todo el año entre 1999 y 2005 (de Stephanis, 2008; Verborgh et al., 2009), estando presentes en la parte central y más profunda del estrecho (de Stephanis et al., 2008a). En el mar de Alborán, se encuentra también en todas las estaciones del año con las mayores tasas de encuentro en Granada, Almería y el estrecho de Gibraltar, seguido por el golfo de Vera (Cañadas et al., 2005). Los modelos de predicción de Cañadas et al. (2005) indican una preferencia por aguas con profundidades superiores a los 500 metros (figura 1.6). Capítulo 1Introducción general Tesis doctoral P. Verborgh. 2015 - 36 Figura 1.6. Mapa de predicción de probabilidad de encontrar calderones comunes en la cuenca norte desde el estrecho de Gibraltar hasta el golfo de Vera (Cañadas et al., 2005) En la Comunidad Valenciana y norte de la Región de Murcia, esta especie parece estar presente por toda el área, aunque con una baja densidad (Gómez de Segura et al., 2006; Gozalbes et al., 2010). Es poco abundante en Cataluña e Islas Baleares, donde está presente más allá de la plataforma continental, por lo que tanto los varamientos como los avistamientos de esta especie son escasos (Raga y Pantoja, 2004). En el Mediterráneo noroccidental, el calderón común es una especie predominantemente de aguas abiertas, con preferencia por aguas de gran profundidad, cerca de las pendientes de los taludes continentales (Gannier, 1995; Pettex et al., 2014). Pettex et al. (2014) estimaron que en las aguas francesas del Mediterráneo hay 369 calderones comunes (IC 95%: 128-1.108) en invierno y 391 (IC 95%: 270-565) en verano del 2012. No se suele encontrar en el mar Tirreno (Campana et al., 2015; Santoro et al., 2015) con sólo un grupo social observado en las Islas Ventotene (Mussi et al., 2000). No hay evidencia de presencia de calderones comunes en la cuenca este del Mediterráneo (Marchessaux y Duguy, 1978; Frantzis et al., 2003; Boisseau et al., 2010), aunque algunos avistamientos oportunistas han sido registrados en McBrearty et al., (1986) y Reeves y Notarbartolo di Sciara (2006). La especie es por tanto considerada como presente tan sólo en la cuenca oeste del Mediterráneo. Aunque la mayoría de Capítulo 1Introducción general Tesis doctoral P. Verborgh. 2015 - 37 información procede del norte de la cuenca, se ha descrito también su presencia en aguas de Marruecos (Bayed, 1996), Argelia (Boutiba, 1994) y Túnez (Lotfi et al., 1997). 2.4 Taxonomía El calderón común (Globicephala melas) es un mamífero del orden de los cetáceos con dientes u odontocetos. Forma parte de la familia de los Delphinidae, que incluye a los delfines oceánicos, y de la subfamilia de los Globicephalinae que está compuesta por 9 especies como se puede ver en la figura 1.7, según Vilstrup et al. (2011). La especie más cercana es el calderón tropical (Globicephala macrorhynchus). Figura 1.7. Reconstrucción filogenética bayesiana de la subfamilia de los Globicephalinae (adaptado de Vilstrup et al., 2011). Los calderones comunes habitan aguas frías templadas del Atlántico norte y del hemisferio sur separadas por la zona tropical en la que son ausentes (figura 1.3). Rayner (1939) describió a los animales viviendo en cada hemisferio como especies diferentes debido a la presencia de la pigmentación blanca en la silla de montar en calderones del hemisferio sur (entonces nombrados Globicephala leucosagmaphora), pero Davies (1960) rectificó con descripciones similares observadas en calderones del Atlántico norte. Sin embargo, se guardó una distinción de subespecie con Globicephala Capítulo 1Introducción general Tesis doctoral P. Verborgh. 2015 - 38 melas melas en el Atlántico norte y G. m. edwardii en el hemisferio sur. Esta separación podría haber sucedido hace 10 a 15.000 años durante la última glaciación del Pleistoceno cuando las aguas ecuatoriales eran más frías (Davies, 1960). Después de un estudio de la filogeografía de los calderones a nivel mundial a partir del ADN mitocondrial (ADNmt), Oremus et al. (2009) confirmaron su nivel de diferenciación como subespecies aunque hayan encontrado haplotipos similares entre los dos hemisferios. Los calderones comunes están ausentes en el Pacífico norte, pero existen pruebas de una antigua población, con fósiles encontrados en Alaska, Estados Unidos, con una datación estimada de hace 3.500 a 2.500 años (Crockford y Frederick, 2007) y en Japón en varios sitios arqueológicos de los siglos VIII a XII (Kasuya, 1975). Estos descubrimientos sugieren la extinción de las poblaciones del Pacífico norte, hace relativamente poco tiempo. 2.5 Estructura poblacional de calderones comunes Oremus et al. (2009) investigaron la distribución mundial del ADNmt y la filogeografía de los calderones comunes del Atlántico norte (G. m. melas) y el hemisferio sur (G. m. edwardii). Los resultados indicaron varias restricciones en el flujo de genes entre las dos subespecies, aunque ambas comparten varios haplotipos que sugieren algunos contactos recientes. Las cortas distancias genéticas entre haplotipos y el comienzo contemporáneo de la filogenia sugieren una expansión mundial reciente de la población de las subespecies de G. melas spp. Sobre todo, los resultados del estudio confirman que la diversidad a nivel mundial del ADNmt es baja, debido probablemente a la reciente expansión mundial y potencialmente, a una estructura matrilineal. El primer estudio de estructura poblacional en calderones comunes en el Atlántico norte fue llevado a cabo por Siemann (1994) a partir de muestras de varamientos en Cabo Cod (Estados Unidos), Terranova y Nueva Escocia en Canadá así como Escocia e Inglaterra en Reino Unido. Los resultados obtenidos a partir del análisis del ADNmt sugieren que no hay aislamiento entre individuos muestreados en el este y oeste del Atlántico norte. El segundo y último estudio es el de Fullard et al. (2000) quienes utilizaron ocho loci de microsatélites altamente polimórficos para analizar las muestras de cuatro lugares diferentes: la costa este de Estados Unidos (Cabo Cod), el oeste de Capítulo 1Introducción general Tesis doctoral P. Verborgh. 2015 - 39 Groenlandia, las Islas Feroe y Reino Unido. Sus resultados indican que existe una subestructura, y ésta es particularmente pronunciada entre el oeste de Groenlandia y el resto de zonas. En el Atlántico noreste, todavía no existe ninguna información sobre la estructura de las poblaciones de calderones al sur del Reino Unido y en el Mediterráneo. 2.6 Parámetros demográficos de los calderones comunes La mayoría de los datos existentes sobre los parámetros demográficos provienen de datos obtenidos mediante la caza ballenera en las Islas Feroe en Dinamarca (e.g. Bloch et al., 1993b; Desportes et al., 1993; Martin y Rothery, 1993; Desportes et al., 1994; Olson y Reilly, 2002) y Terranova en Canadá (e.g. Sergeant, 1962b). Durante esta actividad, grupos enteros de calderones comunes son dirigidos hacia la costa y agrupados dentro de una bahía donde se matan para el consumo humano. A diferencia de los varamientos de animales enfermos o heridos, este tipo de caza permite obtener datos de agrupaciones naturales de individuos y donde todas las clases de edades y sexos están representadas porque no se deja escapar a ningún individuo. Las hembras de calderones comunes se pueden reproducir a partir de los 6-8 años (Sergeant, 1962b; Martin y Rothery, 1993) mientras los machos no se reproducen antes de los 12-14 años (Sergeant, 1962b; Desportes et al., 1993). Al contrario que las orcas (Orcinus orca) y los calderones tropicales donde las hembras tienen un periodo largo de vida post-reproductiva (Kasuya y Marsh, 1984; Olesiuk et al., 1990; Foote, 2008), las hembras de calderones comunes pueden procrear hasta el final de su vida, que puede alcanzar los 59 años (Bloch et al., 1993b). Sin embargo, la fertilidad disminuye probablemente a partir de los 40 años (Martin y Rothery, 1993). Los machos pueden vivir hasta los 46 años (Bloch et al., 1993b). Los calderones comunes son polígamos y no tienen más de una cría a la vez (Olson y Reilly, 2002) con un intervalo medio estimado entre las crías de 5,1 años, con un periodo de gestación de 12 meses (Martin y Rothery, 1993). Una hembra puede tener hasta 9 crías durante su vida (Sergeant, 1962b). La proporción entre machos y hembras varía en función de la edad, con más hembras entre los animales de 0 a 3 años pero llega a la paridad entre 3 y 10 Capítulo 1Introducción general Tesis doctoral P. Verborgh. 2015 - 40 años (Desportes et al., 1994). Además, las hembras de más de 25 años de edad suelen tener más crías hembras que machos (Desportes et al., 1994). Sergeant (1962b) estimó una tasa de mortalidad de 0,350 en el primer año de vida, siendo de 0,058 para los machos y de 0,045 para las hembras de entre 1 y 8 años en Terranova. En las Islas Feroe, la mortalidad juvenil es más alta, estimada en 0,072 en los machos entre 0 y 15 años y en 0,092 para las hembras entre 0 y 10 años (Bloch et al., 1993b), probablemente inflada porque tiene en cuenta el primer año de vida. En la misma zona, la mortalidad es baja durante la fase adulta, especialmente para las hembras (0,055 en machos y 0,010 en hembras), pero sube drásticamente después de los 31 años a 0,127 en las hembras (Bloch et al., 1993b). A nivel mundial, solo existe un único estudio sobre parámetros demográficos de una población viva de calderones comunes. Se trata de la población residente del estrecho de Gibraltar donde se estimó una tasa de supervivencia alta de 0,982 (IC 95%: 0,9550,993) para adultos y una tasa de crecimiento poblacional anual de 5,5% (IC 95%: 2,18,9%) entre 1999 y 2005 (Verborgh et al., 2009). Estos resultados corresponden con la fase adulta descrita en las Islas Feroe (Bloch et al., 1993b). 2.7 Estructura social La estructura social de los calderones comunes ha sido estudiada en pocos sitios del planeta por la ausencia de poblaciones residentes. De manera general, los grupos de calderones tienen entre 10 y 50 individuos (Cañadas y Sagarminaga 2000; Ottensmeyer y Whitehead, 2003; Raga y Pantoja, 2004; Cañadas et al., 2005; Kiszka et al., 2007; de Stephanis et al., 2008b; Greco, 2011) pero se han observado agrupaciones de cientos de individuos, probablemente con fines reproductivos (Cañadas et al., 2005; de Stephanis, 2008). Los grupos sociales están formados por individuos relacionados matrilinealmente y parece que no se dispersan del grupo natal (Amos et al., 1993; Mussi et al., 2000; Ottensmeyer y Whitehead, 2003; de Stephanis et al., 2008b; Greco, 2011). En el estrecho de Gibraltar, se ha propuesto que las comunidades de calderones tienen un sistema social jerárquico donde la población estaría compuesta por clanes, cada uno compuesto por varios grupos sociales o pods (de Stephanis, 2008). Cada Capítulo 1Introducción general Tesis doctoral P. Verborgh. 2015 - 41 grupo social estaría finalmente formado por unidades matrilineales, tal y como se ha descrito en las Islas Feroe (Amos et al., 1993; Fullard, 2000) y en los varamientos masivos observados en Nueva Zelanda y Australia (Oremus et al., 2013). Asimismo, ninguno de los dos sexos se dispersa del grupo social en el que ha nacido y los padres no se encuentran dentro de estos grupos, de manera que la reproducción tiene lugar entre diferentes grupos sin relación de parentesco entre ellos (Amos et al., 1993). 2.8 Amenazas Los calderones comunes, tienen una serie de amenazas tanto naturales como antropogénicas, directas e indirectas que pueden influir sobre las tendencias poblacionales. Primero, las capturas incidentales de calderones comunes que han tenido lugar en los últimos decenios se han producido principalmente en la pesca de arrastre de caballa y calamar en la costa este de Estados Unidos y en las redes de deriva usadas en la pesca de pez espada, tanto en aguas estadounidenses como del mar Mediterráneo (Duguy y Hussenot, 1982; Di Natale, 1990; Northridge, 1991; Di Natale, 1995; University of Barcelona, 1995; Couperus, 1997; Mussi et al., 1998; Johnson et al., 1999; Yeung, 1999; Tudela, 2004; Tudela et al., 2005; David et al., 2006; Fairfield y Garrison, 2008; NOAA, 2010; Rossman, 2010). La mortalidad encontrada en las pesquerías de Estados Unidos estarían por encima del nivel máximo de extracción biológica potencial es decir, el número límite de muertes anuales provocadas por actividades humanas, más allá del cual la población estaría en peligro (NOAA, 2010). Las pesquerías podrían tener un impacto indirecto en caso de sobrepesca de las presas de los calderones comunes como podría ser el caso en el noroeste de la península Ibérica (Monteiro et al., 2015). Por otro lado, los calderones suelen vivir lejos de costa donde el tráfico marítimo suele ser menos intenso y el riesgo de colisión con embarcaciones es menor. Sin embargo, en el estrecho de Gibraltar y mar de Alborán se han registrado casos de colisiones donde la distribución de los calderones se solapa tanto con el paso de los cargueros que entran y salen del Mediterráneo como con las rutas de los ferris que cruzan en un eje norte‐sur (de Stephanis et al., 2005; de Stephanis y Urquiola, 2006). Solo se ha Capítulo 1Introducción general Tesis doctoral P. Verborgh. 2015 - 48 consiste en fragmentos de ADN en los que una secuencia de dos hasta seis pares de bases se repite de manera consecutiva. La variación en el número de repeticiones crea diferentes alelos. Los mamíferos, al ser organismos diploides, presentan dos alelos heredados uno de la madre y otro del padre. Estos alelos pueden ser iguales y entonces se llamarán homocigotos o diferentes y serán heterocigotos. El ADNmt tiene una secuencia genómica mitocondrial no codificante llamada “lazo D” (o D-loop en inglés). La región de control del lazo D suele presentar mutaciones. Cada secuencia es un haplotipo, ya que las mitocondrias solamente se heredan maternalmente. También se pueden usar otras partes del ADNmt como el citocromo b o c que son codificante pero que pueden aportar información sobre mutaciones a más largo plazo. Las mutaciones suelen ocurrir después de varias generaciones (Sun et al., 2012) de manera que si la separación entre poblaciones es reciente, la probabilidad de detectar una diferencia genética disminuye. Sin embargo, existen otras maneras de medir intercambios entre zonas. A corto plazo, se pueden investigar los movimientos individuales y ver como se solapan o se separan los rangos de uso espacio-temporal de diferentes individuos en las diferentes zonas de estudio. El marcaje y seguimiento por satélite permite obtener varias posiciones de un individuo cada día durante varios días o semanas. Es una técnica reciente pero la información obtenida en pequeños cetáceos ha aumentado estos últimos años, principalmente gracias a la miniaturización de las marcas y la mejora de los sistemas de fijación en el animal (Balmer et al., 2014; McIntyre, 2014). Una de las ventajas de este tipo de seguimiento es que permite obtener información sobre áreas poco estudiadas, entender mejor el uso del hábitat u observar movimientos a largas distancias. A partir de la información genética, se eligen las zonas apropiadas donde marcar diferentes individuos para comprobar si existe solapamiento geográfico entre los individuos de las diferentes poblaciones. Otra manera de realizar un seguimiento a largo plazo de los individuos es a través de la foto-identificación. Esta técnica consiste en identificar a un individuo gracias a las fotografías de las marcas naturales que aparecen en una zona específica del cuerpo. Esta técnica se ha desarrollado para los cetáceos desde los años 1970s (e.g. Katona et Capítulo 1Introducción general Tesis doctoral P. Verborgh. 2015 - 49 al., 1979), para los cuales se usan generalmente las marcas situadas en la aleta dorsal o caudal. A partir de las fotografías, se crean catálogos de individuos de cada área estudiada y se comparan entre zonas para estudiar movimientos individuales. Esta técnica tiene la ventaja de ser totalmente no invasiva para los animales. Otra ventaja es que se pueden comparar catálogos de diferentes zonas del planeta, y desvelar migraciones a gran escala (por ejemplo Carpinelli et al., 2014). Asimismo, la foto-identificación permite también estudiar los parámetros demográficos de un grupo de individuos que usan un área en particular (Hammond, 1986). Gracias a modelos de marca-recaptura, se puede estimar el tamaño de población, la tasa de supervivencia aparente anual para diferentes clases de edad, intervalos de nacimientos y el crecimiento poblacional. A su vez, estos parámetros podrán ser comparados en situaciones “normales” y en el caso de una epizootia de morbillivirus, con el fin de evaluar las consecuencias demográficas de la misma. Objetivos generales IV. Los objetivos de esta tesis doctoral son primero investigar la estructura de las diferentes poblaciones de calderones comunes en Europa, con un énfasis en España (figura 1.8, rectángulo con línea punteada). Después, se pretende definir unidades de gestión en el Mediterráneo español, donde existen datos a largo plazo sobre esta especie (figura 1.8, rectángulo con línea discontinuada). Luego, se estimaran parámetros demográficos y se investigarán los efectos de una epizootia de morbillivirus sobre la población del estrecho de Gibraltar (figura 1.8, rectángulo con línea continua). Finalmente, gracias a los resultados obtenidos, se pretende proponer un estatus de conservación para la especie en el Mediterráneo Español y redactar una propuesta de plan de conservación. Capítulo 1Introducción general Tesis doctoral P. Verborgh. 2015 - 50 Figura 1.8. Zonas de estudio representado por el rectángulo con línea punteada para el Capítulo 2, el rectángulo con línea discontinuada para el Capítulo 3 y el rectángulo con línea continua para los Capítulos 4 y 5. Mapa realizado con el software libre QGIS 2.8 (QGIS Development Team, 2015). Estos objetivos se llevarán a cabo de la forma siguiente: 1. Definir la estructura de población a nivel molecular de los calderones comunes en Europa. Gracias a la colaboración de varias instituciones, se realizarán análisis de genética poblacional en muestras de piel procedentes de Irlanda, el Atlántico francés, Galicia, Portugal, el estrecho de Gibraltar, el mar de Alborán, golfo de Vera, el Mediterráneo francés e Italia. De estas muestras, se extraerá el ADN y se analizarán las secuencias de los haplotipos de la región de control del “lazo D” del ADN mitocondrial así como 14 microsatélites o marcadores de ADN nuclear. Estos análisis permitirán evaluar el número de poblaciones presentes en las aguas del oeste de Europa y del Mediterráneo así como posible aislamiento o flujos migratorios entre ellas. Asimismo, se realizará un análisis detallado del Mediterráneo español. Capítulo 1Introducción general Tesis doctoral P. Verborgh. 2015 - 51 2. Definir las unidades de gestión del Mediterráneo español. Se estudiarán los movimientos individuales de calderones comunes en el Mediterráneo español mediante dos métodos de estudio. Primero, se compararán los catálogos de fotoidentificación existentes en el sur de la Península Ibérica para tener una resolución temporal más reciente que la que proporcionan los análisis genéticos. Gracias a la colaboración entre varias entidades, se dispone de datos de foto-identificación en el mar de Alborán y golfo de Vera desde 1992 hasta 2014 y en el estrecho de Gibraltar desde 1999 hasta 2011. Además, se analizarán los movimientos espacio-temporales de calderones equipados con marcas satélites desplegadas en las tres zonas para investigar posibles límites de distribución entre diferentes unidades de gestión y así entender si existen intercambios entre zonas a corto-medio plazo. 3. Estimar los parámetros demográficos de los calderones del estrecho de Gibraltar. El estrecho de Gibraltar tiene una población residente de calderones comunes. Gracias a la foto-identificación, se conoce cada individuo de la población entre 1999 y 2006. Con estos datos se construirán modelos de captura-recaptura para estimar parámetros demográficos, incluyendo las tasas de supervivencia y abundancias de diferentes clases de edad (cría, juvenil y adulta), así como el intervalo entre nacimientos. En el resto del mundo, estos parámetros sólo se han podido estimar a partir de animales muertos y por primera vez se calcularán para una población in-situ. 4. Estimar los efectos de la epizootia de morbillivirus sobre los parámetros demográficos de los calderones del estrecho de Gibraltar. Gracias a la fotoidentificación, también se estudiarán los efectos de la epizootia de morbillivirus del 2006-07 sobre diferentes parámetros demográficos del estrecho de Gibraltar. Gracias a un monitoreo que incluye el periodo pre-(1999-2006) y post-morbillivirus (20072011), se construirán modelos de marca-recaptura para estudiar el efecto de la epizootia sobre la tasa de supervivencia, la abundancia y el crecimiento poblacional. Estos datos todavía no se han estimado para ninguna especie de cetáceo a nivel mundial y son de crucial importancia para evaluar la viabilidad de la población. Capítulo 1Introducción general Tesis doctoral P. Verborgh. 2015 - 52 5. Proponer una revisión del estatus de conservación para los calderones comunes del Mediterráneo español. Con este trabajo, se pretende realizar un diagnóstico de la situación de los calderones comunes del Mediterráneo español y evaluar si su estado de conservación es favorable o desfavorable. Esta evaluación permitirá justificar cambios en el Catálogo Español de Especies Amenazadas, en caso que sea necesario. Para ello, se enfrentará la nueva información conseguida y la existente con los «criterios orientadores para la inclusión de taxones y poblaciones en catálogos de especies amenazadas» aprobados por la Comisión Nacional para la Protección de la Naturaleza, el 17 de marzo de 2004 y detallados anteriormente. Teniendo en cuenta estos criterios, se elaborará una memoria técnica justificativa aconsejando que se conserve o que se cambie de categoría de amenaza. 6. Redactar una propuesta de plan de conservación para los calderones comunes del Mediterráneo español. El R.D. 139/2011 de 4 de febrero especifica que “En el caso concreto de las especies incluidas en el Catálogo [Español de Especies Amenazadas], debe realizarse una gestión activa de sus poblaciones mediante la puesta en marcha de medidas específicas por parte de las administraciones públicas. Estas medidas se concretarán en la adopción de estrategias de conservación y de planes de acción”. Una vez actualizada la categoría de amenaza de los calderones comunes del Mediterráneo español, se procederá a la redacción de una propuesta de plan de conservación. Este documento constará de una evaluación del grado de las diferentes amenazas a la conservación así como un plan de acción para aumentar el conocimiento y limitar las amenazas identificadas. Referencias V. Airoldi, S., Azzellino, A., Nani, B., Ballardini, M., Bastoni, C., Notarbartolo di Sciara, G., Sturlese, A., 1999. Whale-watching in Italy: results of the first three years of activity, in: Evans, P.G.H., Cruz, J., Raga, J.A. (Eds.), European Research on Cetacenas 13: Thirteenth Annual Conference of the European Cetacean Society. Valencia, Spain, pp. 153–156. Alves, A., Antunes, R., Bird, A., Tyack, P.L., Miller, P.J.O., Lam, F.-P. a., Kvadsheim, P.H., 2014. Vocal matching of naval sonar signals by long-finned pilot whales (Globicephala melas). Mar. Mammal Sci. 30, 1248–1257. doi:10.1111/mms.12099 Amos, B., Schlötterer, C., Tautz, D., 1993. Social structure of pilot whales revealed by analytical DNA profiling. 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Capítulo 2 - Estructura de las poblaciones de calderón común en Europa Tesis doctoral P. Verborgh. 2015 - 64 listados (Stenella coeruleoalba), calderones grises (Grampus griseus) y cachalotes (Physeter macrocephalus) (Engelhaupt et al., 2009; Gaspari et al., 2007a,b). Sin embargo, estos estudios realizados no tenían muestras de las áreas próximas al estrecho de Gibraltar para poder confirmar la falta de existencia de intercambios de genes. Los calderones comunes, al tener un hábitat principalmente pelágico, han sido poco estudiado hasta la fecha y los estudios de estructura poblacional están basados únicamente en muestras de varamientos y de caza ballenera. Hasta la fecha, se han identificado dos subespecies de calderones comunes, Globicephala melas melas en el hemisferio norte y G. m. edwardii en el sur, con una separación hace 10 a 15.000 años durante la última glaciación del Pleistoceno (Davies, 1960). Oremus et al. (2009) investigaron la distribución en el mundo del ADN mitocondrial (ADNmt) y la filogeografía de los calderones comunes del Atlántico norte y el hemisferio sur. Los resultados indicaron varias restricciones en el flujo de genes entre las dos subespecies, aunque ambos hemisferios comparten varios haplotipos que sugieren contactos recientes. Las cortas distancias genéticas entre haplotipos y el comienzo contemporáneo de la filogenia sugieren una expansión de la población mundial de las subespecies de Globicephala melas spp. En particular, los resultados confirman que la diversidad del ADNmt mundial es baja para la especie, debido probablemente a la reciente expansión mundial y potencialmente, a una estructura matrilineal. El primer estudio de estructura de población en calderones comunes en el Atlántico norte fue llevado a cabo por Siemann (1994) a partir de muestras de varamientos y capturas incidentales en Cabo Cod en Estados Unidos, Terranova y Nueva Escocia en Canadá, Escocia e Inglaterra en Reino Unido. Los resultados obtenidos a partir del análisis del ADNmt sugieren la ausencia de aislamiento entre individuos muestreados en el este y oeste del Atlántico norte (figura 2.1). Sin embargo, solo encontró 3 haplotipos diferentes lo que representa una variabilidad muy pequeña para llegar a conclusiones definitivas. El segundo y último estudio es el de Fullard et al. (2000), quienes utilizaron ocho loci de microsatélites altamente polimórficos para analizar las muestras de cuatro lugares diferentes: costa este de Estados Unidos (Cabo Cod), oeste Capítulo 2 - Estructura de las poblaciones de calderón común en Europa Tesis doctoral P. Verborgh. 2015 - 65 de Groenlandia, las Islas Feroe y Gran Bretaña. Sus resultados indican que existe una subestructura, y ésta es particularmente pronunciada entre el oeste de Groenlandia y el resto de lugares (figura 2.1), lo que no respalda el modelo de un simple aislamiento por distancia. En cambio, los patrones de diferenciación genética sugieren que el aislamiento de la población se produce entre áreas del océano que difieren en la temperatura superficial del agua. Dicho mecanismo se confirma con la observación de la temperatura como un factor primario determinante de las distribuciones relativas de dos poblaciones de calderones tropicales (G. macrorhynchus) en las costas de Pacífico de Japón (Kasuya et al., 1988). Asimismo, es probable que la temperatura no determine directamente la distribución de los calderones en sí, sino la de sus presas, que están más influenciadas por factores oceanográficos. Sin embargo, estos estudios se basaron en muestras de calderones que habitan en aguas del norte del Reino Unido y todavía no existe ninguna información de la estructura de la población de calderones del Atlántico noreste al sur del Reino Unido y en el Mediterráneo (figura 2.1). Figura 2.1. Estructura de población de calderones comunes donde se ven las zonas muestreadas en el Atlántico norte por Siemann (1994) y Fullard et al. (2000): las zonas rojas pertenecen a una población y la blanca otra. El rectángulo negro con una línea discontinua señala la zona de estudio del presente capítulo. Mapa realizado con el software libre QGIS 2.8 (QGIS Development Team, 2015). Capítulo 2 - Estructura de las poblaciones de calderón común en Europa Tesis doctoral P. Verborgh. 2015 - 66 El objetivo de este capítulo es investigar la estructura poblacional de calderón común en Europa, incluyendo los posibles niveles de aislamiento o tasas de migración entre ellas, así como la diversidad genética de cada población. Metodología II. 2.1 Muestreos de los calderones comunes Las muestras de piel usadas en este capítulo procedieron de animales varados en la costa o de biopsias remotas de animales en libertad. En el caso de las biopsias obtenidas en España, las muestras de piel se obtuvieron con una ballesta de 67 kg (Barnett Wildcat XL), disparando la flecha hacia la región media lateral, debajo de la aleta dorsal, a un rango de distancias de entre 5 y 15 metros del animal. La flecha tiene una punta de 1,5 centímetros de largo y 0,6 cm de diámetro interno, lo que permite obtener muestras de piel incluyendo tanto la epidermis como la dermis. Un flotador que hace de tope se encuentra a continuación de la punta para evitar la penetración excesiva y provocar el rebote después del impacto con el individuo. Además, el flotador también permite recoger la flecha después del disparo, usando una red. Tanto las flechas como las puntas fueron diseñadas por Finn Larsen del Instituto Danés de Investigación Pesquera en Charlottenlund, Dinamarca. Antes de la toma de muestras, se identificaron los individuos gracias a las marcas naturales de su aleta dorsal (AugerMéthé y Whitehead, 2007; Verborgh et al., 2009) para evitar el muestreo doble y conseguir datos sobre la identidad del individuo y la unidad social a la que pertenece. Antes de disparar la ballesta, la tripulación se aseguraba de que no había ninguna cría presente en el área, por lo tanto, no se biopsió a ninguna cría. La curación de la herida creada en los calderones ha sido estudiada, y ha demostrado que esta técnica no provoca heridas o infecciones a largo plazo (Giménez et al., 2011). Se muestrearon individuos independientemente de su tamaño (excluyendo las crías). Las muestras fueron tomadas entre el invierno de 2005 y el verano de 2008 en el estrecho de Gibraltar, en el caso del mar de Alborán entre noviembre de 2007 y junio 2008, en el golfo de Vera durante el mes de mayo de 2008 y en febrero de 2008 en las aguas del país vasco español en el golfo de Vizcaya (más adelante se nombrará Euskadi). Todas estas muestras se recolectaron gracias a un permiso de investigación Capítulo 2 - Estructura de las poblaciones de calderón común en Europa Tesis doctoral P. Verborgh. 2015 - 67 del Ministerio de Medio Ambiente. Inmediatamente después de su toma, las muestras de piel se preservaron de dos maneras diferentes. Una parte fue inmediatamente puesta en un tubo de 2 ml que contenía una solución al 20% de dimetilsulfóxido (DMSO) saturada en sal (NaCl) (Amos y Hoelzel, 1991) y congelada a -20°C. Esta parte de la muestra fue utilizada para realizar los análisis genéticos. La segunda parte de la muestra de piel se congeló a -20°C sin ningún tratamiento, y fue utilizada para investigar los valores de isótopos estables de carbono y nitrógeno. Además se incluyeron muestras recolectadas en calderones varados en Irlanda, el Atlántico francés, Galicia, Portugal, y el Mediterráneo francés. Algunas muestras proceden de animales biopsiados en el mar de Liguria en Italia (ver tabla 2.3). Todas estas muestras se guardaron en Alcohol a 70% a 4°C en la mayoría de los casos, y en algunos casos a temperatura ambiente. 2.2 Determinación de sexos Para determinar el sexo de cada individuo, se siguieron las metodologías de Bérubé y Palsbøll (1996) y Rosel (2003). Primero, se extrajo el ADN con el DNeasy kit (Quickagen) y se midió su concentración gracias a un espectrómetro. Se añadió una cantidad de agua variable dependiendo de la concentración en ADN de cada muestra, con el fin de tener una cantidad de ADN de 30 ng. A ésta se le agregó una mezcla de 25 μl compuesta de 2,5 μl de 10X Buffer, 0,75 μl de 50 mM MgCl2, 0,5 μl de 10 μM cebador Fwd (LGL 331 (ZFX/ZFY)), 0,5 μl de 10 μM cebador Rev (LGL 335 (ZFX/ZFY)), 2 μl de 2,5 mM dNTP, 0,25 μl de 10 mg/ml BSA, 0,2 μl de 5 U/μl Taq polimerasa y 18,3 μl de H2O mQ. Los cebadores ZFX y ZFY permiten la diferenciación entre machos (2 bandas X y Y) y hembras (1 banda XX). Para confirmar los resultados se usó un cebador específico para el gen SRY, el cual es positivo para machos (1 banda) y negativo para hembras (sin banda). Las secuencias utilizadas en los cebadores vienen descritas en la tabla 2.1. Capítulo 2 - Estructura de las poblaciones de calderón común en Europa Tesis doctoral P. Verborgh. 2015 - 68 Tabla 2.1. Secuencia de los cebadores usados en el sexado genético de los calderones (Bérubé y Palsbøll, 1996; Rosel, 2003). Cebadores Secuencias 5’-3’ LGL331-forward CAAATCATGCAAGGATAGAC LGL335-reverse AGACCTGATTCCAGACAGTACCA SRY-forward ACCGGCTTTCCATTCGTGAACG SRY-reverse CATTGTGTGGTCTCGTGATC A continuación la muestra se colocó en el termociclador para realizar una reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para amplificar el fragmento de ADN correspondiendo a ZFX/ZFY o SRY. Se realizaron varios ciclos con el termociclador; en el primer ciclo, que sólo se hizo una vez, se empleó una temperatura de 94°C durante 3 minutos para desnaturalizar el ADN. El segundo ciclo estaba compuesto por una primera fase a 94°C durante 30 s, una segunda a 52°C durante 30 s y una tercera a 72°C durante 45 s y esta operación se repitió 35 veces. Una vez acabada la PCR, se añadió una solución de 4 μl de Buffer 6X ADN a los productos de la PCR para colorearlos. Para realizar la electroforesis, se preparó un gel de 1% de agarosa, con 100 ml de 5x TBE, 40 μl de 10 mg/ml BET y el resto de agua mQ hasta llegar a los 1000 ml. Por último, se colocaron los productos de la PCR dentro del gel para realizar la electroforesis. 2.3 Análisis de microsatélites Los microsatélites son fragmentos de ADN nuclear en los que una secuencia de dos a seis pares de bases se repite de manera consecutiva (por ejemplo, 2 pares: TATATATA). La variación en el número de repeticiones crea diferentes alelos según su longitud, de los cuales uno es heredado de la madre y otro del padre. El análisis de microsatélites se ha llevado a cabo con 14 parejas de cebadores descritos en la literatura (ver la tabla 2.2). Cada PCR se realizó con 30 ng de ADN purificado en 25 μl de volumen de reactivo compuesto por 2.5 μl de buffer reactivo de Taq polimerasa (InVitrogen), 1,5 mM MgCl2 (InVitrogen), 0,2 mM dNTPs, 0,4 U de Taq polimerasa (InVitrogen), 10 pmoles del cebador forward (6FAM) y 10 pmoles del cebador reverse. Las reacciones de la PCR se Capítulo 2 - Estructura de las poblaciones de calderón común en Europa Tesis doctoral P. Verborgh. 2015 - 69 realizaron de la siguiente manera: 1 ciclo a 95°C de 5 min, después 35 ciclos de desnaturalización en 30 s a 95°C, hibridación en 30 s a temperatura de hibridación de cada cebador (ver tabla 2.2), y amplificación a 72°C en 45 s y un ciclo final a 72°C en 10 min. Posteriormente, la longitud del fragmento de ADN fue medida en un secuenciador automático ABI 3130 XL en la Plateforme Génome Transcriptome del Centre de Génomique Fonctionnelle de Bordeaux en la Université Bordeaux Segalen, Francia. Para determinar el tamaño de los alelos se utilizó un marcador estándar interno (GS 350; Applied Biosystems). Tabla 2.2. Secuencias de los cebadores de microsatélite y sus temperaturas de hibridación Pareja de cebador de microsatélite Secuencia del cebador T° (°C) de hibridación Referencia 464/465 GGGGTTTCTCCTCTA 41 Amos et al. (1993) TGATCTGCCAATAAGA 468/469 ACCCCAGAGAAAACA 40 Amos et al. (1993) CAGGTATTTCAGAA EV37Mn AGCTTGATTTGGAAGTCATGA 45 Valsecchi y Amos (1996) TAGTAGAGCCGTGATAAAGTGC EV94Mn ATCGTATTGGTCCTTTTCTCG 48 Valsecchi y Amos (1996) AATAGATAGTGATGATGATTCACACC 199/200 TGAAATTCTTCATCAGT 42 Amos et al. (1993) GTTAATGTAGGCAGACT 409/470 GTTTTGGTTGCTTGA 43 Amos et al. (1993) TAAAAGACAGTGGCA 415/416 GTTCCTTTCCTTACA 42 Amos et al. (1993) ATCAATGTTTGTCAA 417/418 GTGATATCATACAGTA 43 Amos et al. (1993) ATCTGTTTGTCACATA DlrFCB1 TGCATCTCCATGGTATGTCTTATCC 57 Buchanan (1996) AGCCTCTGCTATGCCTGGAACGC DlrFCB6 GTACCCTTGGACTTGTCACCCTC 58 Buchanan (1996) ACTGCCTATATTAGTCAGGGTTCTC EV1Pm CCCTGCTCCCCATTCTC 52 Valsecchi y Amos (1996) ATAAACTCTAATACACTTCCTCCAAC GATA53 ATTGGCAGTGGCAGGAGACCC 60 Palsbøll et al. (1997) GACACAGAGATGTAGAAGGAG GT575 TATAAGTGAATACAAAGACCC 52 Bérubé et al. (2000) ACCATCAACTGGAAGTCTTTC Ppho131 GTTAGGTACCAGCCTCC 54 Rosel et al. (1999) CTAGTTATCATGCAGGGAGT Para estimar una tasa de error de genotipado se han utilizado 8 individuos que fueron biopsiados 2 veces (determinado a partir de foto-identificación) y 20 individuos Capítulo 2 - Estructura de las poblaciones de calderón común en Europa Tesis doctoral P. Verborgh. 2015 - 70 elegidos al azar que fueron amplificados y genotipados dos veces. Solo se usaron individuos que tenían por lo menos una amplificación de buena calidad en 7 loci diferentes. Se verificó cada locus para alelos nulos y errores de calificación con Microchecker (Van Oosterhout et al., 2004). Las posibles desviaciones del equilibrio de Hardy-Weinberg (desviación total, deficiencia heterocigótica y exceso heterocigótico) y de desequilibrio de ligamento (asociaciones entre loci) se han comprobado para cada población usando la prueba exacta de Fisher y el método en cadena de Markov (10.000 iteraciones) con la versión en línea de GENEPOP 4.2 (Raymond y Rousset, 1995). Se corrigieron los niveles de significatividad para comparaciones múltiples con la técnica secuenciada de Bonferroni (Holm, 1979). El número más probable de poblaciones (K), que mejor expliquen los patrones de variabilidad genética, se estimó usando el programa STRUCTURE v. 2.1 (Pritchard et al., 2000). Este análisis indica cuantas poblaciones ancestrales diferentes habría creado la variabilidad observada en los datos, minimizando la desviación del equilibrio de HardyWeinberg y del desequilibrio de ligamento (Pritchard et al., 2000). El nivel de diferenciación entre poblaciones se estimó con el índice de fijación FST (Weir y Cockerham, 1984) usando el programa ARLEQUIN v. 2.0 (Schneider y Excoffier, 1999). Para comprobar la correlación entre las distancias genéticas y geográficas, se realizó un test de Mantel gracias al Isolation By Distance Web Service, versión 3.23 (Jensen et al., 2005), para todas las zonas muestreadas. El sesgo de sexos en las tasas de dispersión se comprobó usando el programa FSTAT v. 2.9.3 para comparar los índices de asignación específicos de cada sexo y los valores FST (Goudet, 2001). Las tasas de migración recientes (entre 1 y 3 generaciones) entre poblaciones fueron calculadas con BAYESASS (Wilson y Rannala, 2003). Siguiendo las recomendaciones de Rannala (2013), primero se hicieron pruebas preliminares para ajustar los parámetros de mezcla de las tasas de migración, frecuencia alélica y coeficientes de endogamia en la cadena de Markov de Monte Carlo (MCMC) para asegurar unas tasas alrededor del 30%. Luego, se hicieron 10 pruebas con una fase inicial de 1x106 iteraciones, que se descartan, para asegurar que los parámetros estén suficientemente mezclados, Capítulo 2 - Estructura de las poblaciones de calderón común en Europa Tesis doctoral P. Verborgh. 2015 - 71 seguidos por 2x107 iteraciones de MCMC y una frecuencia de muestreo de 1000. Los archivos trazas creados fueron dibujados con TRACER (Rambaut et al., 2014) para comprobar la convergencia y mezcla en los resultados. Finalmente, se definió un nivel de aislamiento entre poblaciones, cuando se encontró menos de 10% de tasa de migración entre ellas (Hastings, 1993). El tamaño de cada alelo se usó para estimar el nivel de diversidad genética con la heterocigosidad observada (Ho), la heterocigosidad esperada (He), la riqueza alélica y el coeficiente de endogamia (FIS) usando el programa FSTAT v. 2.9.3 (Goudet, 2001). La riqueza alélica controla la variación en el tamaño de muestra por un método de rarefacción. 2.4 Análisis de ADN mitocondrial (ADNmt) Como se encuentra descrito en Oremus et al. (2009), las muestras se secuenciaron para 800 pares de bases (pb) del extremo 5’ de la región de control del lazo D del ADNmt. Se amplificó con los cebadores lightstrand, tPro-whale M13-Dlp-1.5 (5'- TCACCCAAAGCTGRATTCTA-3', Dalebout et al., 1998), y heavy strand, Dlp-8G (5'- GGAGTACTATGTCCTGTAACCA-3', diseñados por G. Lento como reportado en Dalebout et al., 2005). Los productos de la PCR se purificaron con columnas de purificación QIAgen PCR y se secuenciaron directamente usando el método ABI dye-terminator. Las secuencias se alinearon usando SEQUENCHER v. 3.0 (Gene Code Corporation). El grado de diferenciación (FST), la diversidad nucleotídica y diversidad genética se estimaron usando ARLEQUIN v. 2.0 (Schneider y Excoffier, 1999). Para deducir las relaciones filogenéticas entre los haplotipos del ADNmt, se generó una red de haplotipos usando el programa NETWORK v. 2.0 (Bandelt et al., 1999; www.fluxusengineering.com). Todo el trabajo de laboratorio se realizó en el Institut de Biochimie et Génétique de Burdeos en Francia, que pertenece al Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS) y luego en el Instituto Europeo de Química y Biología – INSERM, Unidad 869/Universidad de Burdeos, Francia. Capítulo 2 - Estructura de las poblaciones de calderón común en Europa Tesis doctoral P. Verborgh. 2015 - 72 Resultados III. 3.1 Muestras obtenidas Para este estudio se recolectaron un total de 251 muestras entre Irlanda e Italia. La mayoría de las muestras (73%) se cogieron a través de biopsias en las zonas del golfo de Vizcaya, estrecho de Gibraltar, mar de Alborán y golfo de Vera. Gracias a la colaboración de varias entidades internacionales (ver figura 2.2 y tabla 2.3), se ha podido ampliar la zona de estudio al resto de Europa. Figura 2.2. Mapa del origen geográfico de las muestras que se han usado en el estudio junto con la organización que las proporcionan. Fuente: (V): varamientos, (B): biopsias. Mapa realizado con el software libre QGIS 2.8 (QGIS Development Team, 2015). Capítulo 2 - Estructura de las poblaciones de calderón común en Europa Tesis doctoral P. Verborgh. 2015 - 73 Tabla 2.3. Área de origen, organización propietaria de las muestras, número de muestras (N) y fuente. Área de origen Organización N Fuente Irlanda Irish Cetacean Genetic Tissue Bank. Irish Whale and Dolphin Group. National Museum of Ireland 15 Varamientos FranciaAtlántico CRMM 13 Varamientos Euskadi EIBE-CIRCE 27 Biopsias Galicia CEMMA 17 Varamientos Portugal SPVS 6 Varamientos Estrecho de Gibraltar CIRCE 92 Biopsias/Varamientos Mar de Alborán Alnitak-CIRCE 45 Biopsias Golfo de Vera ANSE-CIRCE 21 Biopsias FranciaMediterráneo CRC Marineland 5 Biopsias/Varamientos Italia University of Sienna 10 Biopsias TOTAL 251 3.2 Determinación de sexos De las 192 muestras que dieron resultados, 91 fueron hembras y 101 machos, lo que representa una proporción H:M de 0,9:1 (ver tabla 2.4 y figura 2.3). Esta proporción es importante ya que muestra que los datos tienen un sesgo de sexos mínimo. Para 59 muestras, no se pudo determinar el sexo, debido a la poca concentración de ADN. Esto pudo ser debido a una muestra de piel de tamaño insuficiente, que generalmente ocurre cuando la biopsia no fue totalmente exitosa, o a problemas con la extracción del ADN. Capítulo 2 - Estructura de las poblaciones de calderón común en Europa Tesis doctoral P. Verborgh. 2015 - 80 Tabla 2.7. Matriz de tasas de migración reciente (desviación estándar entre paréntesis) obtenida con el programa BAYESASS. La tasa de migración es la proporción de individuos en una población que ha emigrado por generación desde otra población fuente. Los valores en diagonal (negrita) representan la proporción de los no-inmigrantes dentro de cada población. * indica un valor superior a 0,10 que no permite diferenciar dos unidades de gestión. Destino de los migrantes Origen de los migrantes Atlántico Euskadi Gibraltar Mediterráneo Atlántico 0,799 (0,027) 0,167 (0,031)* 0,025 (0,019) 0,009 (0,008) Euskadi 0,050 (0,023) 0,920 (0,028) 0,017 (0,016) 0,013 (0,013) Gibraltar 0,008 (0,006) 0,005 (0,005) 0,939 (0,032) 0,048 (0,032) Mediterráneo 0,009 (0,006) 0,005 (0,005) 0,016 (0,013) 0,970 (0,015) No se encontraron diferencias significativas de dispersión entre hembras y machos entre las diferentes poblaciones (p=0,42). 3.3.2 Análisis del ADNmt Se usaron fragmentos de secuencias de 358pb de la región de control del ADNmt para poder comparar los resultados de este estudio con los de Siemann (1994). Un total de 4 sitios polimórficos fueron detectados, lo que permitió identificar un total de 4 haplotipos diferentes. Dos transiciones y dos “indels” (inserción en el haplotipo 2 de Irlanda, ver tabla 2.8) fueron observados. Los 3 haplotipos encontrados por Siemann (1994) provienen de Escocia, norte de Inglaterra, Cabo Cod en Estados Unidos (haplotipo igual a haplotipo 3 de este estudio, número de acceso Genbank: U20926), de Terranova y de Nueva Escocia en Canadá (números de acceso Genbank: U20927 y U20928) que son diferentes de los encontrados en este estudio (tabla 2.8). Capítulo 2 - Estructura de las poblaciones de calderón común en Europa Tesis doctoral P. Verborgh. 2015 - 81 Tabla 2.8. Posiciones de los nucleótidos variables en la región de control (358pb) de los haplotipos de ADNmt. El punto (.) indica la similitud con el primer haplotipo (i.e. no ha habido mutación), el guión (-) indica la supresión del nucleótido. El asterisco (*) indica los haplotipos descritos por Siemann (1994). Haplotipos Posición del nucleótido modificado 107 108 160 225 230 232 Haplotipo 1 - - C C C A Haplotipo 2 T A T . . . Haplotipo 3* - - T . . . Haplotipo 4 - - T T . . Terranova* - - T . T . Nueva Escocia* - - T . T G En la figura 2.8, se representa la frecuencia de los haplotipos en las diferentes poblaciones identificadas anteriormente gracias a los microsatélites. Los haplotipos H1 y H3 se comparten entre todas las poblaciones, pero con frecuencias diferentes según las zonas. En cambio, el haplotipo 2 es único, ya que solamente fue encontrado en la población atlántica, en un individuo varado al norte de Irlanda. A su vez, el haplotipo 4 solamente se encuentra en el estrecho de Gibraltar y Mediterráneo. La frecuencia de los haplotipos H1 y H3 es similar en Euskadi y Atlántico. Aunque el estrecho de Gibraltar y el Mediterráneo comparten los 3 mismos haplotipos, H3 es muy mayoritario en el Estrecho, mientras H4 domina la población mediterránea. Capítulo 2 - Estructura de las poblaciones de calderón común en Europa Tesis doctoral P. Verborgh. 2015 - 82 Figura 2.8. Frecuencia de los 4 haplotipos de ADNmt en cada población. El número de muestras se indica entre paréntesis. En la red de cobertura mínima (figura 2.9) se puede observar la relación entre los diferentes haplotipos de ADNmt. Se incluyen los haplotipos de Nueva Escocia y Terranova descritos por Siemann (1994) para su comparación pero no se representan con un tamaño proporcional debido a que se descargaron de Genbank. Estos dos haplotipos del Atlántico noroeste son diferentes de todos los que se han encontrado en la zona muestreada en este estudio. El haplotipo central en la red y más representado es el haplotipo 3 (descrito también por Siemann (1994) en Gran Bretaña y Estados Unidos), que se encuentra en individuos de todas las zonas muestreadas, menos el mar de Alborán. 0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% 100% Atlántico (14) Euskadi (7) Gibraltar (64) Mediterráneo (32) Frecuencia H4 H3 H2 H1 Capítulo 2 - Estructura de las poblaciones de calderón común en Europa Tesis doctoral P. Verborgh. 2015 - 83 Figura 2.9. Red de cobertura mínima entre los haplotipos de ADNmt y proporción en cada población. El tamaño de los círculos es proporcional al número total de muestras de cada haplotipo observado, salvo Terranova (TN) y Nueva Escocia (NE) que se extrajeron de Siemann (1994). En la tabla 2.9, se pueden ver distancias genéticas significativamente diferentes entre todas las poblaciones, menos entre Euskadi y el resto de Atlántico. Estos resultados se basan en tan solo 4 haplotipos así que se deberían considerar con precaución. Sin embargo, las frecuencias de distribución de los haplotipos en cada población son diferentes (figura 2.8), lo que también se toma en cuenta en el FST. Tabla 2.9. Valores de diferenciación por pares de poblaciones expresado como FST basado en datos de ADNmt. Significación estadística: *p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001. Atlántico Euskadi Gibraltar Euskadi -0,092 --- Gibraltar 0,169** 0,139* --- Mediterráneo 0,349*** 0,319** 0,185*** Capítulo 2 - Estructura de las poblaciones de calderón común en Europa Tesis doctoral P. Verborgh. 2015 - 84 3.3.3 Diversidad genética Los resultados de diversidad genética indican un nivel mayor de endogamia (FIS) en las poblaciones de Gibraltar y del Mediterráneo con niveles de heterocigosidad reducidos en estas dos poblaciones comparados con la Atlántica y Euskadi (tabla 2.10). Los números de alelos y la riqueza alélica son altos y equivalentes entre las poblaciones de Gibraltar y Euskadi pero muy reducidos en la población Mediterránea. La presencia de alelos únicos en cada población respalda los resultados de estructura de población. Tabla 2.10. Diversidad genética obtenida a partir de datos de microsatélites. N: número de muestras, FIS: coeficiente de endogamia, Ho: heterocigosidad observada, He: heterocigosidad esperada, NA: número medio de alelos en cada loci, RA: Riqueza alélica, AU: Alelos únicos a una población. La desviación estándar está indicada entre paréntesis. N FIS Ho He NA RA AU Atlántico 51 0,042 (0,029) 0,728 (0,220) 0,807 (0,084) 6,0 4,8 6 Euskadi 27 0,057 (0,029) 0,693 (0,199) 0,733 (0,123) 7,0 6,8 5 Gibraltar 84 0,166 (0,030) 0,575 (0,152) 0,658 (0,131) 7,3 6,9 9 Mediterráneo 80 0,073 (0,024) 0,479 (0,231) 0,549 (0,205) 4,4 3,5 6 La media de la diversidad nucleotídica total en el ADNmt fue de 0,002 (SD = 0,002). Debido a los pocos haplotipos encontrados no se puede comparar poblaciones a nivel de la diversidad nucleotídica. Discusión IV. 4.1 Estructura de población A partir de las 6 poblaciones ancestrales y de las distancias genéticas entre las zonas muestreadas, se agruparon los datos en 4 poblaciones. Esta potencial sobreestimación de poblaciones ancestrales puede ser debido parcialmente al aislamiento por distancia encontrado en los datos (Frantz et al., 2009). Ninguno de los individuos muestreados en el océano Atlántico proviene de las poblaciones ancestrales roja y azul que solamente se encontraron en el Mediterráneo y estrecho de Gibraltar. Eso llevó a un primer nivel de separación. Asimismo, los individuos de Euskadi no proceden de la población verde oscura. Por esa razón, los individuos de Irlanda, el Atlántico francés, Capítulo 2 - Estructura de las poblaciones de calderón común en Europa Tesis doctoral P. Verborgh. 2015 - 85 Galicia y Portugal se unificaron en una población “Atlántica”, mientras los de Euskadi se atribuyeron a una población distinta. A su vez, el alto porcentaje de individuos “amarillos” en el estrecho de Gibraltar, sugirió una separación con el resto del Mediterráneo, incluyendo las zonas del mar de Alborán, golfo de Vera, el Mediterráneo francés e Italia. Estas separaciones se ven respaldadas por los resultados de distancias genéticas significativamente diferentes y las tasas de migraciones bajas entre estas cuatro poblaciones. La población de Euskadi es significativamente diferente de la del Atlántico según los resultados de microsatélites. Sin embargo, se han detectado individuos migrantes desde la población de Euskadi a la del resto del Atlántico, con una tasa de migración reciente de más del 16% de manera que estas dos poblaciones forman una unidad de gestión según los criterios de Hastings (1993). Además, los resultados de distancia genética con ADNmt no muestran diferencias significativas entre estas dos poblaciones, aunque haya pocos datos para respaldar este resultado. Debido a esta situación, la monitorización de los calderones comunes del golfo de Vizcaya debería incluir a ambas poblaciones porque es imposible distinguirlas in-situ. Asimismo, su presencia en Euskadi, Galicia y Portugal es estacional, indicando movimientos a otras zonas (Marcos Ipiña et al., 2014; Santos et al., 2014). Sin embargo, un estudio de toda la zona económica exclusiva francesa del golfo de Vizcaya e incluyendo el País Vasco español y Cantabria estima una abundancia de unos 3000 individuos en invierno y casi 4000 en verano, ocupando las mismas zonas del talud continental en ambas estaciones (Pettex et al., 2014). Por otro lado, el haplotipo único encontrado en un individuo varado en el norte de Irlanda podría indicar la presencia de otras poblaciones de calderones comunes en la parte norte de las Islas Británicas donde tienen una densidad mucho mayor que en el golfo de Vizcaya (Hammond et al., 2009; Pettex et al., 2014). Varios estudios han sugerido que los calderones comunes del Atlántico siguen a sus presas (Fullard et al., 2000; Bloch et al., 2003). Algunos viajan varios miles de kilómetros, como los individuos marcados en las Islas Feroe (aproximadamente 62°N 7°W) que han llegado hasta la dorsal mesoatlántica (aproximadamente 48°N 26°W), a más de 2.200 km (http://savn.fo/00534/00554/00201/). Es posible que la diferencia entre Euskadi y el resto del Atlántico sea el resultado de una separación Capítulo 2 - Estructura de las poblaciones de calderón común en Europa Tesis doctoral P. Verborgh. 2015 - 86 ecológica con animales que se alimentan de presas diferentes pero en la misma zona. En este sentido, los análisis de contenidos estomacales e isótopos estables desarrollados en Portugal, Galicia y Escocia sugieren que los calderones consumen presas similares pero en cantidades diferentes según la zona, con una dieta más variada basada en octópodos en la Península Ibérica (Santos et al., 2014; Monteiro et al., 2015). Los individuos de la población del estrecho de Gibraltar comparten ancestros comunes principalmente con la población del Mediterráneo. Por un lado, comparten un haplotipo de ADNmt que está ausente en los individuos del océano Atlántico. Por otro lado, comparten dos poblaciones ancestrales roja y azul definidas por microsatélites, que tampoco están representadas en individuos del Atlántico. Sin embargo, las tasas de migración reciente y los resultados de distancias genéticas, tanto con microsatélites como por ADNmt, indican que son dos poblaciones independientes. Estos resultados se corresponden con a las observaciones hechas en el Estrecho donde la mayoría de los individuos están presentes todo el año en la zona (de Stephanis, 2008). Uno de los resultados más interesantes de este estudio es probablemente la presencia de una población ancestral única en el Estrecho que prácticamente no se encuentra en otras zonas. Solo se encontró un individuo varado en Portugal que corresponde a esta población ancestral. La ausencia de diferencias significativas entre los individuos del mar de Alborán y golfo de Vera, zonas de muestreo relativamente cercanas, está respaldada por las recapturas fotográficas de individuos entre las zonas de Almería y el golfo de Vera (Morata et al., 2013; Capítulo 3). Por otro lado, la similitud con los calderones del Mediterráneo francés e Italia es interesante porque indica que la población Mediterránea sería una única población, por lo menos con respecto a los individuos muestreados en la parte norte. Sin embargo, las distancias genéticas entre las zonas muestreadas aumentan significativamente con el alejamiento geográfico, sugiriendo un grado de aislamiento por distancia. Capítulo 2 - Estructura de las poblaciones de calderón común en Europa Tesis doctoral P. Verborgh. 2015 - 87 Oremus et al. (2009) encontró una diversidad genética mundial muy baja para los calderones comunes, con tan solo 13 haplotipos descritos, de los cuales 3 eran del Atlántico norte (Siemann, 1994). Gracias a este estudio, se han identificado 3 nuevos haplotipos que no se habían descrito hasta ahora. Las únicas otras especies de cetáceos con niveles tan bajos de diversidad genética a nivel mundial son las orcas (Hoelzel et al., 2002) y los cachalotes (Lyrholm et al., 1996) que tienen una organización social matrilineal. Los haplotipos encontrados para los individuos biopsiados que pertenecen a las diferentes unidades sociales en de Stephanis et al. (2008b) fueron idénticos para los animales dentro de cada unidad (CIRCE, datos no publicados), como se ha descrito en las Islas Feroe (Amos et al., 1993). Este resultado parece confirmar que los grupos sociales del estrecho de Gibraltar serían unidades matrilineales. Sin embargo, la variedad de haplotipos encontrada en el Estrecho sugiere que un clan estaría compuesto por varias unidades matrilineales (de Stephanis et al., 2008b), que no necesariamente comparten un ancestro directo común, como se ha descrito también en varamientos masivos en el hemisferio sur (Oremus et al., 2013). Esto podría reflejar una colonización inicial del Mediterráneo por varias matrilíneas que se han quedado en el Estrecho al encontrar buenas condiciones de alimentación (de Stephanis et al., 2008c). Aunque las diferencias genéticas no fueron significativas entre las diferentes áreas del Mediterráneo, se pudo detectar un grado de alejamiento por distancia. El tamaño de muestra es pequeño en la parte francesa (n=5) e italiana (n=10). Sin embargo, ha sido suficiente para observar tres de los cuatro haplotipos descritos y una variabilidad dentro de esta área geográfica. 4.2 Diversidad genética Los valores de diversidad genética de la población de Euskadi (Ho=0,693) y la población Atlántica (Ho=0,716) son altos con respecto a otras poblaciones de calderones en el Atlántico norte. En efecto, Fullard (2000) encontró una diversidad genética de 0,650 para los calderones de las Islas Feroe usando los mismos cebadores. Esta diversidad genética podría ser debida a los niveles elevados de abundancia de calderones comunes de estas poblaciones que cuentan con varios miles de individuos (Buckland et al., 1993; Hammond et al., 2009; Pettex et al., 2014). Capítulo 2 - Estructura de las poblaciones de calderón común en Europa Tesis doctoral P. Verborgh. 2015 - 88 En cambio, la diversidad genética es baja en el Mediterráneo (Ho=0,479). Este resultado sugiere un aislamiento genético de esta población con respecto a los calderones del Atlántico y del estrecho de Gibraltar. Este aislamiento parece respaldado por los niveles bajos de número medio de alelos y riqueza alélica y la tasa muy alta de no-inmigrantes en la población mediterránea. Asimismo, los flujos migratorios en las últimas tres generaciones desde o hacia otras poblaciones fueron casi inexistentes con respecto a las del océano Atlántico y muy limitados con el Estrecho. Se encontraron resultados similares en la población aislada de delfines mulares del mar Negro (Ho=0,46 en Natoli et al., 2005). A su vez, los individuos del Estrecho tienen un diversidad intermedia (Ho=0,575) pero una riqueza alélica superior. Esto les confiere una importancia especial porque podrían ser una fuente de diversidad genética para el Mediterráneo. Durante la epizootia de morbillivirus (Fernández et al., 2008), es probable que se haya perdido una parte de la diversidad genética en el Estrecho y el Mediterráneo, aunque no parece haber afectado a todos los clanes de calderones de igual manera (Wierucka et al., 2014). Todas las muestras del Mediterráneo fueron recolectadas después de la epizootia, en consecuencia los resultados bajos podrían reflejar en parte esta pérdida de diversidad. Sin embargo, lo más probable es que la diversidad ya fuera baja y que haya bajado aún más después de la epizootia. En todo caso, la situación es preocupante para los calderones comunes del Mediterráneo; una diversidad genética baja podría resultar en una debilidad frente a nuevas epizootias u otras catástrofes de origen natural o antropogénico, reduciendo críticamente la viabilidad de la población a medio o largo plazo. Por esa razón, parece especialmente necesario mantener una monitorización continua de los calderones del Mediterráneo para poder detectar cambios en sus tasas de mortalidad y su abundancia. Además, se requiere un esfuerzo importante para la conservación de la población del estrecho de Gibraltar, por su particularidad a nivel genético y la intensidad de las actividades humanas en la zona. Capítulo 2 - Estructura de las poblaciones de calderón común en Europa Tesis doctoral P. Verborgh. 2015 - 89 Conclusiones V. Se han identificado 4 poblaciones en Europa, una Atlántica que engloba Irlanda, el Atlántico francés, Galicia y Portugal, una en Euskadi, una en el estrecho de Gibraltar y una Mediterránea. Sin embargo, a partir de estos resultados recomendamos separar las zonas muestreadas en 3 unidades de gestión porque la población de Euskadi revela migraciones recientes con la población Atlántica y no muestran diferencias significativas de distancia genética según los resultados de ADNmt. Cada unidad de gestión se enfrenta a diferentes amenazas. En el Atlántico se han identificado problemas probables con pesquerías, tanto a nivel de impacto sobre sus presas como de capturas incidentales (Monteiro et al., 2015). En las unidades de gestión del estrecho de Gibraltar y del Mediterráneo se encontró una baja diversidad genética y en el Estrecho un nivel de endogamia más alto de lo esperado. Una epizootia de morbillivirus en 2006-2007 ha tenido un impacto importante con tasas de varamientos superiores a un año normal (Fernández et al., 2008; Keck et al., 2010) lo que podría haber afectado de manera importante a la pequeña población del estrecho de Gibraltar y parcialmente la del Mediterráneo (Verborgh et al., 2009; Wierucka et al., 2014). Todavía no se ha definido los límites geográficos de cada unidad de gestión. Es un dato importante para poder aplicar una buena gestión y monitorización de cada una de ellas. Referencias VI. Alves, F., Quérouil, S., Dinis, A., Nicolau, C., Ribeiro, C., Freitas, L., Kaufmann, M., Fortuna, C., 2013. Population structure of short-finned pilot whales in the oceanic archipelago of Madeira based on photo-identification and genetic analyses: implications for conservation. Aquat. Conserv. Mar. Freshw. Ecosyst. 23, 758–776. doi:10.1002/aqc.2332 Amos, B., Bloch, D., Desportes, G., Majerus, T.M.O., Bancroft, D.R., Barrett, J.A., Dover, J.A., 1993a. A review of molecular evidence relating to social organisation and breeding system in the longfinned pilot whale, in: Biology of Northern Hemisphere Pilot Whales. Report of the International Whaling Commission. International Whaling Commission, Cambridge, pp. 209–218. Amos, B., Hoelzel, A.R., 1991. Long-term preservation of whale skin for DNA analysis, in: Genetic Ecology of Whales and Dolphins. Report of the International Whaling Commission. International Whaling Commission, Cambridge, pp. 99–103. Amos, B., Schlötterer, C., Tautz, D., 1993b. Social structure of pilot whales revealed by analytical DNA profiling. Science 260, 670–672. doi:10.1126/science.8480176 Auger-Méthé, M., Whitehead, H., 2007. The use of natural markings in studies of long-finned pilot whales (Globicephala melas). Mar. Mammal Sci. 23, 77–93. doi:10.1111/j.1748-7692.2006.00090.x Bandelt, H.J., Forster, P., Röhl, a, 1999. Median-joining networks for inferring intraspecific phylogenies. Capítulo 3 - Identificación de unidades de gestión de calderones comunes en el Mediterráneo español Tesis doctoral P. Verborgh. 2015 - 96 Capítulo 3 - Identificación de unidades de gestión de calderones comunes en el Mediterráneo español Tesis doctoral P. Verborgh. 2015 - 97 Introducción I. La identificación de unidades de gestión (UGs) es crucial para las entidades responsables de la conservación de las especies silvestres y de la monitorización de las actividades humanas que les afectan (Palsbøll et al., 2007). La definición de una UG ha evolucionado con el tiempo y, aunque todavía no se ha llegado a un acuerdo universal, se han determinado las diferentes herramientas que se deberían usar para su caracterización (Crandall et al., 2000; Waples y Gaggioti, 2006). Uno de los primeros intereses para las especies de cetáceos fue la identificación de los stocks para la caza ballenera, con el objetivo de saber cuántos animales se podrían extraer sin afectar a la población. Para obtener esa información se usaron diferentes técnicas, como por ejemplo diferencias morfológicas, o de trayectoria en las capturas por unidad de esfuerzo o bien por los valores de yodo en la grasa de rorcuales comunes (Jonsgård, 1966). Crandall et al. (2000) hacen un resumen de la evolución de esta definición, empezando con Ryder (1986) “poblaciones que representan variaciones de adaptación significativas, basado en la concordancia entre diferentes conjuntos de datos obtenidos a partir de diferentes técnicas”. Las definiciones posteriores de Waples (1991) y Moritz (1994) descartan la parte más ecológica de la definición de Ryder (1986) y se centraron únicamente en las diferencias genéticas entre poblaciones. Sin embargo, Crandall et al. (2000) proponen volver a la primera definición, introduciendo a su vez el concepto de “intercambios ecológicos y genéticos” para recomendar acciones de gestión en función de los niveles de intercambio recientes e históricos entre diferentes poblaciones. Palsbøll et al. (2007) propusieron una definición de unidad de gestión que permite cuantificar la distinción entre UGs: “población de individuos congéneres entre los cuales el grado de conectividad es suficientemente bajo, para que cada población se pueda monitorear y gestionar de manera separada”. Como las unidades de gestión representan unidades aisladas demográficamente, para su identificación se necesita estimar la tasa de dispersión entre las poblaciones. Esta tasa se puede estimar a diferentes niveles. A nivel molecular, la tasa representaría una dispersión multigeneracional para observar una diferencia (Waples y Gaggiotti, 2006), mientras a nivel Capítulo 3 - Identificación de unidades de gestión de calderones comunes en el Mediterráneo español Tesis doctoral P. Verborgh. 2015 - 98 individual, por ejemplo a través de métodos de marca-recaptura, se basaría en movimientos recientes entre poblaciones (Evans y Teilmann, 2009). Hastings (1993) propuso una tasa de dispersión de menos del 10% para diferenciar poblaciones genéticamente. Sin embargo, todavía no se ha determinado qué cantidad de divergencia genética poblacional corresponde con diferentes tasas de dispersión en cada técnica. La tasa de dispersión que se calcula con métodos de marca-recaptura no tiene por qué corresponder con la calculada con datos genéticos, porque un individuo se puede mover a otras áreas sin reproducirse con otra población (Lowe y Allendorf, 2010). Sin embargo, estos movimientos pueden jugar un papel en las estimas de abundancia de una zona, si ésta cuenta con una tasa de inmigración importante que viene a desaparecer. Las causas de la dispersión pueden ser muy variadas: por ejemplo, puede ser debido a una densidad demasiado grande en un hábitat limitado (capacidad de carga), o para aumentar la dispersión de algunas adaptaciones genéticas (Bowler y Benton, 2005). Para diferenciar unidades de gestión en cetáceos se han usado varias técnicas de estudio. En la mayoría de los estudios, las conclusiones se han basado en resultados de estructura de población a nivel genético (Palsbøll et al., 2007). Sin embargo, cada técnica puede informar sobre niveles de separación entre UGs a diferentes escalas tanto espaciales como temporales (Evans y Teilmann, 2009). La información genética puede dar indicaciones sobre la separación entre poblaciones a nivel contemporáneo (por ejemplo los microsatélites) y/o histórico (por ejemplo el ADN mitocondrial) en función de los marcadores utilizados (e.g. Evans y Teilmann, 2009; Wiszniewski et al., 2010). Asimismo, las diferencias morfométricas suelen resultar de una separación genética histórica (e.g. Bloch y Lastein, 1993; Evans y Teilmann, 2009). En cambio, el uso de marcadores ecológicos como los contaminantes antropogénicos, los isótopos estables y los ácidos grasos, o el seguimiento individual con foto-identificación, telemetría o acústica estática pasiva dan información desde los últimos días hasta el tiempo de vida del individuo muestreado (e.g. Baird et al., 2009; Evans y Teilmann, 2009; Alves et al., 2013; Oremus et al., 2013; Sveegaard et al., 2015). Capítulo 3 - Identificación de unidades de gestión de calderones comunes en el Mediterráneo español Tesis doctoral P. Verborgh. 2015 - 99 La región occidental del Mediterráneo español comprendida por el golfo de Vera, mar de Alborán y estrecho de Gibraltar, es una de las zonas con mayor abundancia de calderón común de todo el Mediterráneo (Cañadas y Sagarminaga, 2000; Cañadas et al., 2005; Notarbartolo di Sciara y Birkun, 2010). Nuevos análisis genéticos sugieren que la población del estrecho de Gibraltar es diferente del resto del Mediterráneo que incluye el mar de Alborán, el golfo de Vera, el Mediterráneo francés e Italia (ver Capítulo 2). Las tasas de migración reciente entre estas dos poblaciones indican que los intercambios serían muy restringidos con solamente 4,8% de dispersión desde el Mediterráneo hacia el Estrecho y 1,6% al revés (Capítulo 2). En consecuencia, se tendrían que considerar como 2 unidades de gestión diferentes según la definición de Hastings (1993). No obstante, la evolución espacio-temporal de la epizootia de morbillivirus que afectó a los calderones comunes en 2006-2007 sugiere que podría existir una conexión entre estas poblaciones. En efecto, la epizootia empezó en el estrecho de Gibraltar en noviembre 2006, se extendió hacia las costas de Almería en enero 2007, llegó hasta Baleares en abril 2007 y finalizó en las costas mediterráneas francesas a finales de 2007 (Fernández et al., 2008; Keck et al., 2010). Si la transmisión del virus fue intra-específica, algún contacto “físico” habrá ocurrido entre individuos del estrecho de Gibraltar y del resto del Mediterráneo. El objetivo de este estudio es definir los límites geográficos recientes de las unidades de gestión para el calderón común en las diferentes zonas estudiadas del Mediterráneo occidental español a través de dos técnicas de seguimiento individual, por un lado la foto-identificación y por otro la telemetría. Además, se estimarán las tasas de migración reciente entre las zonas muestreadas para definir el nivel de aislamiento entre las mismas. Metodología II. 2.1 Foto-identificación Se han utilizado datos de avistamientos entre 1992 y 2014 de calderones comunes que forman parte de cuatro catálogos de foto-identificación en el Mediterráneo occidental español: el catálogo de CIRCE del estrecho de Gibraltar, el catálogo de ALNITAKALNILAM del mar de Alborán y golfo de Vera, el catálogo de ANSE del golfo de Vera y Capítulo 3 - Identificación de unidades de gestión de calderones comunes en el Mediterráneo español Tesis doctoral P. Verborgh. 2015 - 100 Almería y el catálogo de CIRCE-ANSE-INRH del sur del mar de Alborán, todos disponibles en www.cetidmed.com. Se han comparado estos catálogos entre sí para detectar movimientos de individuos entre las áreas de estudio y crear un catálogo único para el Mediterráneo occidental español. Durante cada avistamiento, se han analizado fotografías de las aletas dorsales que tienen muescas y permiten distinguir a cada individuo (Verborgh et al., 2009; Capítulo 4). Aquí no se trata de estudiar la estructura social en sí, pero se aprovechan las herramientas disponibles para representar gráficamente las relaciones que existen entre los individuos de las diferentes zonas estudiadas. La estructura social fue analizada utilizando el software SOCPROG 2.4 (Whitehead, 2009). Se definió un grupo como todos los individuos identificados en un avistamiento (Ottensmeyer y Whitehead, 2003). Solo se han considerados individuos que se habían visto por lo menos 2 veces. Para cada díada (pareja de individuos) se calculó la fuerza de la asociación mediante el índice de peso medio (half-weight association index) (Ottensmeyer y Whitehead, 2003; de Stephanis et al., 2008b; Whitehead, 2009) y se generó una matriz de asociaciones. El software NetDraw 2.135 (Borgatti, 2002) ha sido utilizado para representar la red social de todos los calderones comunes del Mediterráneo occidental español. 2.2 Marcas satélite Para desplegar las marcas, se siguió la metodología sugerida por Andrews et al. (2008), consistente en transmisores LIMPET SPOT5 y MK10 Argos (Wildlife Computer, Redmond, WA, figura 3.1). Estos transmisores están sumergidos en epoxi (Scotchcast 5, 3 M, Austin, TX), y se fijaron a los animales por medio de enganches sub-dérmicos de titanio. Las balizas SPOT5 solamente registran la posición geográfica mientras las balizas MK10 también graban información sobre profundidad y perfil de buceo. Para ahorrar energía, las transmisiones de las marcas fueron limitadas por un sensor de inmersión, de manera que solo envía mensajes cuando la marca esta fuera del agua durante más de 1,5 segundos pero solo uno cada 30 s. Las marcas fueron programadas para enviar un máximo de 450 y 600 mensajes diarios para los SPOT5 y MK10 Capítulo 3 - Identificación de unidades de gestión de calderones comunes en el Mediterráneo español Tesis doctoral P. Verborgh. 2015 - 101 respectivamente entre las horas siguientes: 01:00-05:00, 07:00-10:00 y 12:00-22:00 GMT para coincidir con los pasos de los satélites ARGOS sobre el área. Figura 3.1. Tamaño de una marca satélite LIMPET SPOT 5 y de sus enganches de titanio. Para desplegar las marcas, se aprovecharon las campañas de navegación en aguas del estrecho de Gibraltar, mar de Alborán (con la colaboración de ANSE, Alnilam y el Woods Hole Oceanographic Institute) y golfo de Vera (ANSE) entre diciembre 2010 y septiembre 2011. Para estudiar posibles relaciones entre calderones comunes entre el Estrecho, el mar de Alborán y el golfo de Vera, se intentó desplegar marcas simultáneamente en cada zona y en diferentes estaciones. Además, en el Estrecho, se conoce una población residente todo el año (de Stephanis, 2008; Verborgh et al., 2009). Sin embargo, a partir del año 2007, se empezaron a observar nuevos grupos sociales, que no habían sido identificados en de Stephanis et al. (2008b), que se quedaban unas semanas en verano antes de desaparecer durante uno o varios años, llamados “inmigrantes” (CIRCE, datos no publicados). En esta zona, se desplegaron marcas tanto en individuos residentes como en individuos inmigrantes para saber dónde van cuando no se encuentran en el Estrecho. Una vez seleccionado un grupo social de interés, se identificaron los individuos presentes en el grupo a partir de los catálogos de foto-identificación, directamente en el mar. Luego, la embarcación se acercó suavemente al costado del animal seleccionado, y se disparó la flecha con la marca mediante un rifle hipodérmico a una distancia de entre 3 y 5 metros (figura 3.2). Capítulo 3 - Identificación de unidades de gestión de calderones comunes en el Mediterráneo español Tesis doctoral P. Verborgh. 2015 - 102 Figura 3.2. Calderón común GM_GIB_345 marcado con un marca tipo MK10 (PTT 104210). Todas las posiciones de las marcas fueron recibidas a través del sistema de telemetría ARGOS que usa el efecto Doppler para calcular la posición de la marca que envía su mensaje a una cierta frecuencia recibida por el satélite. Hace falta un mínimo de 4 mensajes para poder calcular una posición. En función de la cantidad y calidad de los mensajes, ARGOS calcula una calidad de posición que tiene un radio de error que se puede ver en la tabla 3.1. Tabla 3.1. Calidad de posiciones obtenidas por las marcas satélites con el radio de error asociado según ARGOS (www.argos-system.org). Calidad de posición Radio de error 3 <250m 2 <500m 1 <1500m 0 >1500m A, B y Z Desconocido Debido a la gran cantidad de posiciones 0, A, B y Z, de mala calidad, o con un error desconocido, se procedió a realizar los siguientes pasos para analizar los datos: a) Validación de cada posición a partir del filtro Douglas Argos basado en el programa SAS (Douglas et al., 2012). Este filtro elimina posiciones aberrantes, Capítulo 3 - Identificación de unidades de gestión de calderones comunes en el Mediterráneo español Tesis doctoral P. Verborgh. 2015 - 103 basándose en velocidades máximas teóricas (fijado en 4 m/s) y cambios de rumbo. b) Análisis visual de los trayectos desarrollados por los animales. c) Mapas de uso de hábitat, con ayuda de un sistema de Información Geográfico (ArcView), y su extensión Animal Movement (Hooge y Eichenlaub, 2000). Los datos de seguimiento remoto se han representado mediante kernels. Estos representan de manera continua en el espacio el conjunto de localizaciones, y las categoriza en función de su densidad espacial. De esta forma aparecen destacadas gráficamente aquellas áreas en las que los cetáceos marcados han pasado mayor tiempo. Así un kernel del 50% representa en área que, por sí sola, concentra la mitad de las localizaciones de una determinada campaña de marcaje. El valor 50% se ha tomado como indicativo de las mejores zonas potenciales (Worton, 1995; Seaman y Powell, 1996; Seaman et al., 1999; Powell, 2000), que posteriormente se han corroborado con datos de comportamiento obtenidos de las campañas en el mar y de la bibliografía existente (Cañadas et al., 2005; de Stephanis, 2008; de Stephanis et al., 2008a). 2.3 Tasa de migración reciente Para estimar las tasas de migración reciente, se usaron los datos de 11 loci de microsatélites de 84 individuos del estrecho de Gibraltar, 45 individuos de la zona de Almería y 21 individuos de la zona del golfo de Vera, según la metodología detallada en el Capítulo 2. Las tasas de migración reciente (entre 1 y 3 generaciones) entre poblaciones fueron calculadas con BAYESASS (Wilson y Rannala, 2003). Siguiendo las recomendaciones de Rannala (2013), primero se hicieron pruebas preliminares para ajustar los parámetros de mezcla de las tasas de migración, frecuencia alélica y coeficientes de endogamia en la cadena de Markov de Monte Carlo (MCMC) para asegurar unas tasas alrededor del 30%. Luego, se hicieron 10 pruebas con una fase inicial de 1x106 iteraciones, que se descartan, para asegurar que los parámetros estén suficientemente mezclados, seguidos por 2x107 iteraciones de MCMC y una frecuencia de muestreo de 1000. Los archivos trazas creados fueron dibujados con TRACER (Rambaut et al., 2014) para comprobar la convergencia y mezcla en los resultados. Capítulo 3 - Identificación de unidades de gestión de calderones comunes en el Mediterráneo español Tesis doctoral P. Verborgh. 2015 - 104 Finalmente, se definió un nivel de aislamiento entre poblaciones, cuando se encontró menos de 10% de tasa de migración entre ellas (Hastings, 1993). Resultados III. 3.1 Foto-identificación Un total de 374 individuos fueron identificados en el estrecho de Gibraltar por CIRCE, 387 en el golfo de Vera por ANSE, 777 en la zona oriental del mar de Alborán y el golfo de Vera por ALNITAK-ALNILAM y 72 en el sur de la Isla de Alborán por CIRCE-ANSEINRH (tabla 3.2). Tabla 3.2. Total de individuos en los catálogos de cada organización. Gibraltar Alborán Vera Periodo Recapturas CIRCE 374 - - 1999-2011 ANSE - - 387 1999-2013 19 ALNITAK-ALNILAM - 611 85 1992-2009 - 81 22 CIRCE-ANSE-INRH 72 2014 TOTAL 374 764 553 1992-2014 No se han obtenido recapturas entre el catálogo de CIRCE del Estrecho y los otros tres catálogos. En la figura 3.3, se observa que existen muy pocos avistamientos en las aguas de la provincia de Málaga, entre el Estrecho y el resto de zonas. En cambio, se han detectado 19 recapturas entre el catálogo de ANSE y ALNITAK-ALNILAM. Cuatro de estos animales se han visto sólo en el golfo de Vera mientras quince se han observado en ambas zonas: Alborán oriental y Vera. Además, se han recapturado 22 individuos del catálogo de CIRCE-ANSE-INRH con el de Alnitak-Alnilam (figura 3.5). El catálogo del Mediterráneo occidental español contiene 1519 individuos únicos, a los que se suman 50 individuos del sur del mar de Alborán. Capítulo 3 - Identificación de unidades de gestión de calderones comunes en el Mediterráneo español Tesis doctoral P. Verborgh. 2015 - 105 Figura 3.3. Avistamientos de calderones comunes de cada organización. Mapa realizado con el software libre QGIS 2.8 (QGIS Development Team, 2015). Para el análisis de estructura social, se usaron un total de 584 grupos, incluyendo 648 individuos que se han visto más de dos veces. La red social muestra asociaciones fuertes entre todos los individuos del estrecho de Gibraltar, cuya población no está relacionada con ninguno de los individuos de las demás áreas de estudio. Los individuos de Alborán oriental y golfo de Vera mantienen asociaciones entre sí, el 24% de estos calderones identificados frecuentan las dos áreas estudiadas (ver figura 3.4). Capítulo 3 - Identificación de unidades de gestión de calderones comunes en el Mediterráneo español Tesis doctoral P. Verborgh. 2015 - 112 Figura 3.7 (página anterior). Seguimiento (izquierda) y kernel (derecha) de cuatro individuos marcados en el mar de Alborán y golfo de Vera: a) PTT 101195 del 03/08/2011 hasta el 25/08/2011 en Almería, b) PTT 104207 del 18/08/2011 hasta el 26/09/2011 en Almería, c) PTT 104204 del 31/03/2011 hasta el 13/05/2011 en Murcia, d) PTT 101196 del 05/08/2011 hasta el 23/09/2011 en Murcia. El conjunto de los individuos marcados muestra que la mayoría de los individuos utilizan una zona de distribución restringida; sin embargo cubren la casi totalidad de las zonas profundas del mar de Alborán, durante movimientos de pocos días a zonas más alejadas (figura 3.8). Los movimientos del individuo “inmigrante” del Estrecho no llegaron a solapar la distribución de los individuos marcados en Almería, quedándose en aguas de la provincia de Málaga al oeste del banco de Yibuti. Los kernels indican que las zonas más utilizadas se encuentran en el estrecho de Gibraltar, al norte del mar de Alborán en aguas de 600 a 1000 m de profundidad, y en los cañones del golfo de Vera en aguas de 600 a 2000 m de profundidad. Se vuelve a notar la zona de poca presencia alrededor de los montes Yibuti. Aunque hubo movimientos hacia la zona sur, éstos fueron a corto plazo. Capítulo 3 - Identificación de unidades de gestión de calderones comunes en el Mediterráneo español Tesis doctoral P. Verborgh. 2015 - 113 Figura 3.8. Seguimiento (arriba) y kernel (abajo) de los 8 calderones comunes marcados en el Mediterráneo occidental español entre diciembre 2010 y septiembre 2011. #S #S #S #S #S #S #S #S #S#S #S#S#S #S #S #S#S #S #S #S#S #S#S#S #S #S #S #S #S#S #S#S #S #S #S #S #S#S#S #S #S #S #S#S #S #S #S #S#S #S #S #S#S#S #S #S #S #S #S #S#S #S #S#S#S #S #S#S #S#S #S#S #S #S #S#S#S #S#S#S#S#S #S#S#S#S #S#S #S #S #S #S#S #S #S #S #S #S#S #S #S #S #S #S#S #S#S #S#S #S#S #S #S #S #S#S#S#S #S #S#S#S #S#S #S #S#S #S#S #S #S #S#S #S #S #S#S #S #S#S #S#S #S #S #S#S#S #S #S#S #S #S#S#S #S #S #S #S #S #S #S#S #S #S#S #S #S #S #S#S#S #S #S #S#S #S #S#S#S#S #S #S#S #S#S #S #S #S #S #S #S#S#S#S #S #S#S #S #S#S #S #S #S #S #S #S #S#S #S #S #S #S #S #S #S #S #S #S #S#S #S #S#S#S #S#S 0 200 400 Kilometers N EW S 35°00' 35°00' 36°00' 36°00' 37°00' 37°00' 38°00' 38°00' 5°00' 5°00' 4°00' 4°00' 3°00' 3°00' 2°00' 2°00' 1°00' 1°00' Batimetría 200 m 400 m 600 m 1000 m 1500 m 2000 m 3000 m Capítulo 3 - Identificación de unidades de gestión de calderones comunes en el Mediterráneo español Tesis doctoral P. Verborgh. 2015 - 114 Las tasas de migración reciente indican que los individuos del estrecho de Gibraltar forman una unidad de gestión separada de los individuos muestreados en el mar de Alborán oriental y golfo de Vera según el criterio de Hastings (1993), con tasas de migración de menos de 10% (tabla 3.4). Sin embargo, la tasa de migración reciente de 27,5% desde Almería hacia el golfo de Vera indica que estas dos áreas forman una única unidad de gestión. Los límites geográficos de cada unidad de gestión definida a partir de los resultados de foto-identificación, seguimientos por satélites y genética se pueden ver en la figura 3.9. Tabla 3.4. Matriz de tasas de migración reciente (desviación estándar entre paréntesis) obtenida con el programa BAYESASS. La tasa de migración es la proporción de individuos en una población que ha emigrado por generación desde otra población fuente. Los valores en diagonal (negrita) representan la proporción de los no-inmigrantes dentro de cada población. * indica un valor superior a 0,10 que no permite diferenciar dos unidades de gestión según Hastings (1993). Destino de los migrantes Origen de los migrantes Gibraltar Almería Golfo de Vera Gibraltar 0.9107 (0.0330) 0.0816 (0.0337) 0.0077 (0.0069) Almería 0.0277 (0.0189) 0.9590 (0.0209) 0.0133 (0.0100) Golfo de Vera 0.0341 (0.0257) 0.2754 (0.0297)* 0.6905 (0.0195) Capítulo 3 - Identificación de unidades de gestión de calderones comunes en el Mediterráneo español Tesis doctoral P. Verborgh. 2015 - 115 Figura 3.9. Delimitación geográficas de las unidades de gestión del estrecho de Gibraltar (en amarillo) y Alborán oriental-Vera (en rojo). Mapa realizado con el software libre QGIS 2.8 (QGIS Development Team, 2015). Discusión IV. Según los criterios de Hastings (1993) y Palsbøll et al. (2007), los resultados de tasas de migración recientes indican que la población de calderón común del Mediterráneo occidental español consta de dos unidades de gestión diferentes, el estrecho de Gibraltar y el resto del Mediterráneo occidental (ver Capítulo 2). En efecto, los análisis genéticos han mostrado que el 37% de los individuos biopsiados en el Estrecho comparten un origen ancestral con los individuos del Mediterráneo, pero las tasas de migraciones recientes son muy reducidas entre las dos poblaciones (Capítulo 2). Esto sugiere que posiblemente existió cierta conexión entre ellas, pero actualmente no se observan intercambios individuales entre las diferentes áreas como se ha mostrado tanto con la foto-identificación como con los seguimientos por marcas satélites. En consecuencia, los resultados de seguimiento individual vía foto-identificación y de marcaje satélite de los individuos de las diferentes zonas confirman los análisis moleculares y permiten definir mejor los límites de distribución de cada UG: la UG del estrecho de Gibraltar se extendería hasta el mar de Alborán occidental y la segunda UG se extendería del mar de Alborán oriental al golfo de Vera. Estos resultados Capítulo 3 - Identificación de unidades de gestión de calderones comunes en el Mediterráneo español Tesis doctoral P. Verborgh. 2015 - 116 sugieren que se necesita actualizar la catalogación de los calderones comunes en el CEEA en 2 unidades de gestión en vez de una como está actualmente (Real Decreto 139/2011, de 4 de febrero, para el desarrollo del Listado de Especies Silvestres en Régimen de Protección Especial y del Catálogo Español de Especies Amenazadas). Las tasas de migración recientes entre Almería y el golfo de Vera (27,5%) son parecidas a las encontradas por foto-identificación (24%) sugiriendo que los movimientos observados entre las dos áreas podrían tener fines reproductivos. En este estudio se han identificado un total de 1.569 individuos, con 374 individuos en la UG del Estrecho y 1.195 individuos en la UG de Alborán oriental y golfo de Vera. Sin embargo, este número representa identificaciones sobre un periodo largo (1992-2014), por lo tanto es muy probable que una cierta proporción haya muerto durante el estudio de manera que no se pueden considerar como estimas mínimas de la abundancia de la población. Según de Stephanis et al. (2008b), la estructura social de los grupos del estrecho de Gibraltar es perdurable en el tiempo con individuos quedándose por lo menos hasta 8 años juntos. Esto sugiere que cuando se marca a un individuo dentro de un grupo social, la información recibida representa los movimientos del grupo social y no solamente del individuo. Además, en el Estrecho, se han observado movimientos coordinados de varios grupos sociales al mismo tiempo como la desaparición de toda la población durante periodos de 2 a 3 semanas a finales de primavera (de Stephanis, 2008). El individuo “inmigrante” marcado en el Estrecho llegó hasta zonas muy cercanas de los animales marcados en Almería. Sin embargo, se quedó en el giro anticiclónico occidental del mar de Alborán, siguiendo las corrientes superficiales que existen de manera cíclica todo el año en sentido horario en esta zona (e.g. Renault et al., 2012). Esto sugiere que el banco de Yibuti y la dorsal de Alborán podrían actuar como una barrera oceanográfica que reduce la comunicación entre las UGs. De la misma forma, no se encontró ninguna recaptura entre los catálogos del estrecho de Gibraltar y del resto de zonas durante más de 15 años de estudio, lo que confirma la separación identificada previamente por la genética (Capítulo 2). Sin embargo, aunque no se haya Capítulo 3 - Identificación de unidades de gestión de calderones comunes en el Mediterráneo español Tesis doctoral P. Verborgh. 2015 - 117 observado en el estudio, individuos de las dos UGs podrían asociarse durante periodos cortos en zonas colindantes y no haber sido detectados por las diferentes metodologías. Esto podría explicar la transmisión de la epizootia de morbillivirus desde el Estrecho hasta las Baleares, a través del mar de Alborán (Fernández et al., 2008). En este caso, estos individuos serían claves para una posible dispersión de la diversidad genética mayor del estrecho de Gibraltar (Capítulo 2) hacia el Mediterráneo en el futuro. Sin embargo, no se puede descartar una transmisión inter-específica, por ejemplo vía Stenella coeruleoalba que fue afectado por un virus similar durante el mismo periodo (Fernández et al., 2008; Raga et al., 2008), o un solapamiento de corta duración entre zonas de alimentación pero sin reproducción. El seguimiento por telemetría del individuo “residente” del estrecho de Gibraltar marcado en verano (PTT 104210) desveló una zona de distribución de calderones al este del Estrecho (entre 5°00 y 5°20 de longitud Oeste) que hasta ahora era desconocida. Durante el verano 2012, en una ocasión se avistaron los calderones residentes del Estrecho en esta zona, donde se observaron socializar y reproducirse con otros grupos de calderones desconocidos, que no se encontraron en el catálogo de foto-identificación del Estrecho (Verborgh, obs. pers.). Después de este avistamiento, no se volvieron a observar calderones dentro del Estrecho durante una semana y media. Esto podría sugerir que el resto de grupos sociales se desplazó hacia la misma zona o incluso más al este, para reproducirse con otros grupos desconocidos del mar de Alborán occidental. La desaparición de todo el clan del Estrecho durante 2 o 3 semanas ya había sido descrita anteriormente por de Stephanis (2008), quien propuso que podría ser con fines reproductivos. Los otros movimientos a larga distancia (más de 200 km) y corta duración, como los efectuados por el individuo PTT 101196, también podrían tener fines reproductivos. En cambio, las zonas de presencia habituales están probablemente relacionadas con la alimentación. Los individuos residentes del estrecho de Gibraltar utilizan una zona mucho más restringidas geográficamente, en general unos 40 km de oeste a este, que los individuos de las otras zonas, con áreas habituales de más de 120 km. Esto puede reflejar una alta densidad de presas disponibles en el estrecho de Gibraltar que Capítulo 3 - Identificación de unidades de gestión de calderones comunes en el Mediterráneo español Tesis doctoral P. Verborgh. 2015 - 118 permite a una población residente de más de 200 individuos (Verborgh et al., 2009) alimentarse todo el año en la zona (de Stephanis, 2008; de Stephanis et al., 2008c). Sin embargo, la fuerte corriente atlántica superficial obliga a los animales a nadar a contra corriente durante gran parte del día para mantenerse en la zona central (de Stephanis, 2008; de Stephanis et al., 2008a). En cambio, los individuos de la UG de Alborán usan habitualmente hábitats de más de 100 km de largo e incluso han realizado algunos movimientos de más de 200 km desde Murcia hasta Málaga y hasta el sur de la Isla de Alborán. Estos movimientos podrían estar relacionados con una densidad menor de presas y más dispersas que en el Estrecho. No se han observado movimientos más al norte que cabo de Palos en Murcia lo que sugiere que las zonas más productivas para los calderones comunes se encuentran en los cañones del golfo de Vera y en el mar de Alborán. Los movimientos realizados por todos los individuos seguidos en este estudio son mucho menores en comparación con los observados para los calderones marcados en el Atlántico donde se han registrado movimientos de hasta 234 km en un día y una media de 80 km/día (Bloch et al., 2003; Nawojchik et al., 2003; Mate et al., 2005). Además, individuos marcados en las Islas Feroe (aproximadamente 62°N 7°W) llegaron hasta la dorsal mesoatlántica (aproximadamente 48°N 26°W), situado a más de 2.200 km (http://savn.fo/00534/00554/00201/). El individuo PTT 101196 es el único que se ha desplazado más de 100 km en un día, volviendo al norte después de haber bajado al sur de la cuenca. Todos los otros individuos han mostrado movimientos diarios de distancias menores y en un área bien definida. Las zonas más importantes tienen las mismas características que se han identificado previamente en el Mediterráneo y océano Atlántico, áreas oceánicas y de gran productividad biológica cerca del talud continental y de cañones submarinos, generalmente de más de 600 m de profundidad (Cañadas et al., 2005, de Stephanis et al., 2008a, Hammond et al., 2009; Marcos-Ipiña et al., 2014; Pettex et al., 2014, Goetz et al., 2015). Estos resultados refuerzan la importancia tanto del estrecho de Gibraltar como del mar de Alborán como zonas de alta concentración de alimento para las poblaciones de calderones que les permiten Capítulo 3 - Identificación de unidades de gestión de calderones comunes en el Mediterráneo español Tesis doctoral P. Verborgh. 2015 - 119 quedarse en la misma área durante largos periodos de tiempo (Cañadas y Sagarminaga, 2000, Cañadas et al., 2005, de Stephanis et al., 2008a). Conclusión V. La catalogación actual de los calderones comunes del Mediterráneo español como vulnerable en el Catálogo Español de Especies Amenazadas considera una sola población que se extiende desde el estrecho de Gibraltar hasta la frontera francesa (RD 139/2011). Sin embargo, los resultados de este estudio sugieren que por lo menos la parte occidental debería separarse en dos unidades de gestión: una desde el estrecho de Gibraltar hasta el oeste del banco de Yibuti y la dorsal de Alborán, y otra desde el este del banco de Yibuti hasta cabo de Palos en Murcia. En consecuencia, cada unidad de gestión debería tener su propio plan de conservación y monitorización, para poder detectar cambios en cada UG. Además, sería recomendable reevaluar el estatus de conservación de cada unidad de gestión, especialmente para la del estrecho de Gibraltar que cuenta con una población residente de poco más de 200 individuos (Verborgh et al., 2009). La delimitación geográfica de cada UG ayudará a definir una zona de monitoreo que abarque las áreas más utilizadas por los individuos de cada UG, reduciendo el esfuerzo y el coste de los planes de monitorización. Referencias VI. Alves, F., Quérouil, S., Dinis, A., Nicolau, C., Ribeiro, C., Freitas, L., Kaufmann, M., Fortuna, C., 2013. Population structure of short-finned pilot whales in the oceanic archipelago of Madeira based on photo-identification and genetic analyses: implications for conservation. Aquat. Conserv. Mar. Freshw. Ecosyst. 23, 758–776. doi:10.1002/aqc.2332 Andrews, R.D., Pitman, R., Ballance, L., 2008. Satellite tracking reveals distinct movement patterns for Type Band Type C killer whales in the southern Ross Sea, Antarctica. 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Estos datos consistían en: el número de avistamiento, nombre de grupo, número de carrete, número de foto, número total de individuos en la fotografía, número de individuo analizado en la foto (comenzando desde el individuo más próximo al más lejano y de izquierda a derecha, cuando dos animales estaban a la misma distancia), exposición de la aleta (fuera o no del agua), ángulo y calidad de la misma, código del individuo en el catálogo y comportamiento. El ángulo comienza desde 0°, cuando el animal es visto de frente, y aumenta cada 30° alrededor del animal (figura 4.1). Esto permite seleccionar sólo los animales vistos del lado izquierdo (desde 240° a 300°) para el análisis. Figura 4.1. Descripción de los ángulos alrededor de la aleta dorsal. El ángulo es la posición del fotógrafo (Verborgh, 2005). Un rango de calidades (Q) en una escala de 0 a 2 (de mala a excelente) fue asignado a cada imagen de aleta dorsal basándose en cinco características: enfoque, tamaño, orientación, exposición y el porcentaje de aleta visible en cada diapositiva. Q0: aleta dorsal inútil. Está desenfocada, demasiado lejos, con un ángulo entre 330° y 30° o 150° y 210°. Q1: calidad media. Se puede ver parcialmente o completamente la aleta dorsal, con ángulo entre 240° y 300°. Capítulo 4 - Parámetros demográficos de los calderones comunes del estrecho de Gibraltar Tesis doctoral P. Verborgh. 2015 - 129 Q2: calidad alta. Se puede ver la aleta dorsal completa, con un enfoque perfecto, en un ángulo de 270°. Se asignó un código a cada individuo identificado en el catálogo siguiendo la siguiente fórmula: GM_GIB_XXX, donde GM representa Globicephala melas, GIB para estrecho de Gibraltar y XXX para el número asignado a cada individuo identificado en el catálogo. Se contrastaron con individuos previamente identificados comparando cada fotografía nueva, del lado izquierdo, con todos los individuos identificados del catálogo. A los animales a los cuales no se les pudo reconocer se les dio una identificación nueva. Cada individuo del catálogo recibió un nivel de marcaje (M) de 1 a 3: M1: individuos con pequeñas muescas en la aleta dorsal que sólo pueden ser detectadas con fotografías de alta calidad. M2: individuos con muescas en la aleta dorsal de tamaño medio o muchas de pequeño tamaño. M3: individuos con muescas en la aleta dorsal muy características. Por ejemplo amputaciones de una parte o la totalidad de la aleta dorsal. Éstas pueden ser reconocidas incluso con imágenes de muy baja calidad. Los individuos no incluidos en el catálogo fueron nombrados como no marcados, mientras que los individuos del catálogo (de M1 a M3) fueron llamados animales marcados (figura 4.2). Capítulo 4 - Parámetros demográficos de los calderones comunes del estrecho de Gibraltar Tesis doctoral P. Verborgh. 2015 - 130 a) b) c) d) Figura 4.2. a) Individuo “no marcado”, b) Individuo con nivel de marcaje M1: 2 muescas pequeñas indicadas por las flechas negras, c) Individuo M2: dos muescas de tamaño medio indicadas con las flechas negras; d) Individuo M3: muescas profundas y fácilmente reconocibles. Capítulo 4 - Parámetros demográficos de los calderones comunes del estrecho de Gibraltar Tesis doctoral P. Verborgh. 2015 - 131 2.3 Catálogo de los individuos “no marcados” o con marcas secundarias Se realizó un catálogo de los individuos “no marcados” en el que se incluye principalmente a las crías y juveniles siguiendo el protocolo descrito anteriormente, pero nombrándolos GM_GIB_UM_XXX. Los individuos “no marcados” no presentan muescas en su aleta dorsal, así que se usaron métodos adicionales para identificarlos en las fotografías, que se consideran marcas secundarias:  Forma general de la aleta dorsal.  Silla de montar: está caracterizada por bandas de pigmentación más clara que se extiende detrás de la aleta dorsal (ver figura 4.3). Aunque el contraste de la silla de montar cambia con la edad, su forma no cambia una vez que aparece (Bigg (1982) en orcas, Auger-Méthé y Whitehead (2007) en calderones comunes). Figura 4.3. Silla de montar de GM_GIB_UM_118 (arriba en 2000 y abajo en 2006).  Presencia de arañazos y cicatrices: Aunque los arañazos pueden desaparecer bastante rápido con el tiempo, algunos pueden permanecer presentes durante unos meses y a veces quedarse visible para el resto de su vida. Cuando las sesiones de foto-identificación se distribuyen regularmente a lo largo del año, Capítulo 4 - Parámetros demográficos de los calderones comunes del estrecho de Gibraltar Tesis doctoral P. Verborgh. 2015 - 132 los cambios en los arañazos se pueden detectar y hacer un seguimiento a largo plazo (ver figura 4.4). Figura 4.4. Seguimiento del individuo GM_GIB_UM_117 desde Junio de 2005 a Julio de 2006 gracias a los arañazos (las flechas rojas indican nuevos arañazos y las flechas azules muestran arañazos antiguos, las punteadas indican las más recientes).  Presencia de parásitos: las aletas dorsales de los calderones comunes frecuentemente están cubiertas con balanos sin caparazón Xenobalanus globicipitis (Steenstrup, 1851). Pueden ser vistos colgando en los bordes de aletas pectorales, dorsales y caudales de sus hospedadores, firmemente anclados con un pie en forma de estrella (figura 4.3 arriba). X. globicipitis no se alimenta de su hospedador, sino que se alimenta del plancton gracias a sus cirrípedos, por lo tanto su asociación con cetáceos se caracteriza como una foresis, es decir que tienen una interacción de comensalismo donde un organismo es transportado por otro (Berland et al., 2003). Su emplazamiento fijo en la aleta dorsal y la cicatriz que dejan al destacarse pueden ser utilizados para el reconocimiento de los individuos a corto-medio plazo.  Estructura social: de acuerdo con de Stephanis et al. (2008b), los calderones del estrecho de Gibraltar tienen unos vínculos sociales muy fuertes con unidades matrilineales constantes a lo largo del tiempo. Por lo tanto, la presencia de un individuo no marcado en un subgrupo de individuos marcados puede ayudar a su identificación. Capítulo 4 - Parámetros demográficos de los calderones comunes del estrecho de Gibraltar Tesis doctoral P. Verborgh. 2015 - 133 Para las crías (y juveniles), además hay otros parámetros que pueden ayudar a su identificación:  Marcas fetales: también conocidas como pliegues verticales, bandas transversales de nacimiento o bandas fetales (figura 4.5). Las marcas fetales desaparecen a lo largo del primer año de vida del animal y no pueden ser usadas como marcas a largo plazo para foto-identificación. Sin embargo, ayudan a distinguir a las clases de edad crías y juvenil (Auger-Méthé y Whitehead, 2007) y los espacios entre cada marca funciona como un código de barra que permite identificar a cada cría dentro de un año.  Presencia de su madre: Amos et al. (1991a,b; 1993), usando análisis de microsatélites en calderones comunes en las Islas Feroe, demostraron que los machos adultos no se dispersan de sus grupos sociales maternos y que el 95% de las crías de 0-5 años estaban acompañadas por sus madres dentro del grupo social. Por lo tanto, la presencia de la posible madre en el subgrupo puede ayudarnos a identificar a su descendencia. Todas estas marcas secundarias nos permiten identificar a todos los individuos previamente “no marcados”, que son llamados “individuos con marcas secundarias”. Por lo tanto, todos los individuos fotografiados en la población de calderones en el Estrecho han sido identificados. 2.4 Determinación de clases de edad a partir de las fotografías La clase de edad se determinó para todos los individuos fotografiados desde 1999 a 2006. Tres clases de edad diferentes se atribuyeron a cada fotografía durante el análisis: cría, juvenil y adulto (figura 4.5), definidos de la siguiente manera:  Cría: menor de un año con marcas fetales todavía visibles en el costado. Esta categoría corresponde a la categoría “neonato” en los datos recopilados en el mar.  Juvenil: sin marcas fetales, pero el animal todavía presenta un color grisáceo y con una aleta dorsal pequeña y/o un tamaño menor comparado con los adultos. Esta categoría se corresponde con las de “cría” y “juvenil” en los datos recopilados en el mar. Capítulo 4 - Parámetros demográficos de los calderones comunes del estrecho de Gibraltar Tesis doctoral P. Verborgh. 2015 - 134  Adulto: Color oscuro y tamaño del animal mayor. Figura 4.5. De izquierda a derecha, calderón común adulto con cría, cría y juvenil. 2.5 Abundancia y tasas de supervivencia de la población La abundancia de la población y la tasa de supervivencia en cada clase de edad se estimaron mediante un modelo multiestado de diseño robusto cerrado (de aquí en adelante, MEDRC), inicialmente presentado por Nichols y Coffman (1999). Este modelo fue creado en el programa MARK usando los datos de captura-recaptura fotográfica de verano durante ocho años (1999-2006). Para describir la estructura de MEDRC se describirá primero la estructura del modelo de diseño robusto, y luego la estructura del multiestado. 2.6 El modelo de diseño robusto cerrado El modelo de diseño robusto cerrado de Pollock (Pollock, 1982) permite calcular las tasas de supervivencia y estimas de abundancia usando datos de captura-recaptura. En el contexto típico de marcaje-recaptura, la probabilidad de encontrar un individuo en la muestra, también llamado tasa de retorno, se define por la probabilidad de que esté vivo y en el área de muestreo (Φ), y la probabilidad de encuentro, condicionada por estar vivo y en el área de muestro (p). El modelo de diseño robusto cerrado es una combinación del modelo de marcarecaptura Cormack-Jolly-Seber (CJS, Cormack, 1964; Jolly, 1965; Seber, 1965) y los modelos de estima de población cerradas (Otis et al., 1978). El modelo se presenta esquematizado en la figura 4.6. Capítulo 4 - Parámetros demográficos de los calderones comunes del estrecho de Gibraltar Tesis doctoral P. Verborgh. 2015 - 135 Figura 4.6. Estructura básica del modelo de diseño robusto cerrado de Pollock con las sesiones secundarias cerradas y primarias abiertas (adaptado de Pollock, 1982). En el diseño robusto cerrado, las sesiones secundarias están cerradas, lo que significa que no se permiten nacimientos, muertes, inmigración o emigración dentro de una sesión secundaria (verano). Sin embargo, estos eventos están permitidos entre las sesiones primarias, que son por lo tanto consideradas abiertas. 2.7 Modelo multiestado Los modelos multiestado permiten estimar las tasas de supervivencia para cada clase de edad, llamadas “estados”, y las transiciones entre estados. En el contexto típico de modelos de marcaje-recaptura, con un solo estado, los parámetros Φ y p son los que se han descrito anteriormente. El modelo multiestado añade un parámetro que es la “probabilidad de transición”, es decir, la probabilidad de pasar de un estado al otro. Se define de la siguiente forma: la probabilidad de que se produzca una determinada transición entre las sesiones (i) e (i+1) depende sólo del estado en el tiempo (i). Bajo esta premisa, los parámetros que definen juntos la probabilidad de encuentro de un individuo en un estado concreto en una sesión determinada son: rs i  = la probabilidad de que un animal vivo en el estado r en el tiempo i esté vivo y su estado sea s en el tiempo i+1. p s i = la probabilidad de que un animal vivo en el estado s al tiempo i sea reencontrado en el tiempo i+1. Capítulo 4 - Parámetros demográficos de los calderones comunes del estrecho de Gibraltar Tesis doctoral P. Verborgh. 2015 - 136 En este caso, el parámetro  refleja la probabilidad de sobrevivir y de hacer la transición hacia otro o el mismo estado. Como la supervivencia (S) del tiempo i al i+1 no depende del estado en el tiempo i+1, entonces: rs i r i rs iS  . donde rs i  es la probabilidad condicional de que un animal en el estado r en el tiempo i esté en el estado s al tiempo i+1, sabiendo que el animal está vivo a i+1. Como los animales pueden permanecer en el mismo estado o pasar a otro estado, mientras se mantienen vivos, entonces están entre dos estados r y s: rrrs  1 , por lo tanto la suma de las probabilidades de transición/supervivencia ϕ es igual a la tasa de supervivencia. En otras palabras, r i s rs iS   2.8 El modelo multiestado de diseño robusto cerrado (MEDRC) En este estudio, cada periodo primario (de junio a septiembre de cada año) fue dividido entre múltiples periodos secundarios, cada uno consistente en 15 días consecutivos de muestreo. Todos los avistamientos de un individuo dentro de un periodo secundario fueron considerados como un avistamiento. El número de sesiones secundarias varía a lo largo de los años. Para los intervalos entre periodos primarios se estimaron los siguientes parámetros, siguiendo el modelo multiestado: r t S , la probabilidad de que un individuo del estado r en el periodo t sobreviva hasta el estado r en el periodo t+1; rs t  (también nombrado como psirst), la probabilidad condicional de que un animal en el estado r en el periodo t esté en el estado s en el periodo t+1, dado que está vivo en el periodo t+1. p s t , la probabilidad de que un animal vivo en el estado s en el periodo t sea visto en el periodo t. En este estudio, el estado representa la clase de edad del individuo en el momento t. Se consideraron tres estados: C como crías, J como juveniles y A de adultos. Por lo Capítulo 4 - Parámetros demográficos de los calderones comunes del estrecho de Gibraltar Tesis doctoral P. Verborgh. 2015 - 137 tanto, algunas transiciones no pueden ocurrir, por ejemplo, un adulto no se puede convertir en cría, así que se fijaron algunas probabilidades de transición como 0: 0 JCAJAC  En otras palabras, cuando un individuo es adulto, se mantiene adulto: 11  AJACAA  Dado que la transición entre cría y juvenil es constante, es decir, una cría se convierte en juvenil después de un año, este parámetro se fijó como 1. 1 CJ  La figura 4.7 resume las probabilidades de supervivencia, recaptura y transición estimada para las clases de edad C, J, A. Figura 4.7. Tasa de supervivencia S, probabilidad de captura p y probabilidad de transición para los tres estados: C (cría), J (juvenil) y A (adulto). Durante las sesiones secundarias se usó un modelo de población cerrada para estimar las probabilidades de captura. Dado que se esperaba una heterogeneidad de las capturas entre individuos, se utilizaron modelos con heterogeneidad. Se modelizó la heterogeneidad usando un modelo finito mezclado (Pledger, 2000) con dos grupos de individuos, uno con alta probabilidad de captura (phigh) y el otro con baja probabilidad de captura (plow). El parámetro de mezcla π (pi) indica la proporción de los datos en uno u otro grupo de individuos. Esto implica tener dos probabilidades de captura en cada sesión. La selección del modelo comienza con un modelo general de supervivencia S constante notado (.) y transiciones psi, heterogeneidad pi y probabilidad de captura p variando Capítulo 4 - Parámetros demográficos de los calderones comunes del estrecho de Gibraltar Tesis doctoral P. Verborgh. 2015 - 144 En la figura 4.10 se muestran las tasas de supervivencia para cada clase edad, que aumentan con la edad. La tasa de transición del estado juvenil a adulto obtenida de manera constante en el segundo modelo permite estimar cuánto tiempo un individuo se queda con una coloración de piel más clara que los adultos. Esta tasa de transición fue estimada a 0,28 (SE: 0,05; IC 95%: 0,18-0,40). Al convertirla en años de vida, sabiendo que hay que sumarle el primer año como cría, se estima que un juvenil pasa al estado adulto en las fotografías de media a los 4,6 años (IC 95%: 3,5-6,5 años). Figura 4.10. Valores de la tasa de supervivencia S con valores medios e intervalos de confianza a 95% para cada clase de edad. En la figura 4.11, se puede observar la abundancia de la población estimada por clase de edad en el estrecho de Gibraltar. Se observa un incremento de la población adulta entre 1999 y 2005, que luego queda constante entre 2005 y 2006. El número de juveniles es relativamente constante entre 2001 y 2005, pero se observa un incremento importante entre 2005 y 2006. Para las crías, no hay suficientes datos antes de 2004 para estimar tamaños de población de esa clase de edad, sin embargo, se observa un incremento entre los dos últimos años de estudio. De media, sobre los 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1 01234 Tasa de supervivencia Clase de edad Crías Juveniles Adultos Capítulo 4 - Parámetros demográficos de los calderones comunes del estrecho de Gibraltar Tesis doctoral P. Verborgh. 2015 - 145 tres últimos años de estudio (cuando hay datos de mejor calidad), los adultos representan un 85,4%, los juveniles un 9,0% y las crías un 5,6%. Figura 4.11. Estimas de número de individuos por clase de edad (adultos en gris oscuro, juveniles en gris claro y crías en blanco) con sus intervalos de confianza a 95%. 3.4 Intervalo de nacimiento y estacionalidad de reproducción Un total de 122 potenciales parejas madre-cría fue identificada entre 1999 y 2006. Sólo 26 parejas de madre-cría (13 madres) fueron utilizadas para calcular el intervalo de nacimientos. Sin embargo, solamente 7 intervalos fueron entre crías viables (tabla 4.4, negrita). No se encontró ninguna madre que tuviera más de dos crías durante el periodo de estudio de 8 años. Capítulo 4 - Parámetros demográficos de los calderones comunes del estrecho de Gibraltar Tesis doctoral P. Verborgh. 2015 - 146 Tabla 4.4. Intervalo de nacimientos estimados a partir de las fotografías (en negrita: intervalo de nacimiento de crías viables) MADRE Intervalo (min) Intervalo (max) Media GM_GIB_011 4 4 4 GM_GIB_021 3 5 4 GM_GIB_076 1 2 1,5 GM_GIB_093 2 2 2 GM_GIB_148 1 2 1,5 GM_GIB_204 1 3 2 GM_GIB_004 5 5 5 GM_GIB_023 4 4 4 GM_GIB_031 4 5 4,5 GM_GIB_058 3 6 4,5 GM_GIB_136 5 5 5 GM_GIB_205 5 7 6 GM_GIB_218 2 3 2,5 Intervalo de nacimientos (n=13) 3,1 4,1 3,6 Intervalo de crías viables (n=7) 4,0 5,0 4,5 Los intervalos mínimos y máximos fueron diferentes cuando al menos una de dos crías fue vista por primera vez como juvenil, y, por lo tanto, la fecha de nacimiento fue estimada por el color, forma y tamaño del individuo. La media del intervalo de nacimiento fue de 3,6 años (rango de 1 a 7), mientras que la media del intervalo de crías viables fue de 4,5 años (rango de 2 a 7). El porcentaje de hembras que crían anualmente fue de 27,8% usando el intervalo de nacimientos y 22,2% usando el intervalo de crías viables. La frecuencia de avistamientos con neonatos sube de febrero a abril, donde es máxima con 20% de avistamientos con neonatos, y luego baja hasta diciembre (figura 4.12). No hubo suficiente datos en enero para poder estimar la frecuencia. En cambio, la presencia de neonatos fue nula en octubre y diciembre. Capítulo 4 - Parámetros demográficos de los calderones comunes del estrecho de Gibraltar Tesis doctoral P. Verborgh. 2015 - 147 Figura 4.12. Proporción de presencia mensual de neonatos en los grupos de calderones avistados en el estrecho de Gibraltar entre 1999 y 2011 con los intervalos de confianza a 95%. * No fue estimada en enero por tener menos de 10 avistamientos. 3.5 Tiempo de generación El tiempo de generación usando solamente los datos de las Islas Feroe se calculó como (59-11)/2+11= 35 años. Sin embargo, usando la fórmula de Charnov (1993) para estimar la longevidad a partir de la tasa de supervivencia de adultos en el Estrecho, se estima una longevidad media de 35,7 años (IC 95%: 21,3-58,8 años). En este caso, el tiempo de generación sería de 23,35 años (IC 95%: 16,15-34,9 años). Discusión IV. 4.1 Determinación de las clases de edad Las clases de edades determinadas a partir de la foto-identificación no fueron idénticas a las tomadas en los datos en el mar. De manera general, una cría identificada en una fotografía corresponde a un neonato in-situ (marcas fetales visibles). En cambio, un juvenil en una fotografía puede corresponder a una cría o a un juvenil en el mar (color más claro y tamaño menor que un adulto) mientras que un adulto en una fotografía sería un juvenil o un adulto in-situ (grande tamaño y color oscuro). En las fotografías, se compara fácilmente la diferencia de coloración entre individuos, pero el tamaño 0 5 10 15 20 25 30 35 12345678910 11 12 % de avistamientos con neonatos Mes * Capítulo 4 - Parámetros demográficos de los calderones comunes del estrecho de Gibraltar Tesis doctoral P. Verborgh. 2015 - 148 relativo es más problemático, a no ser que la diferencia sea obvia. Sin embargo, en el mar se pueden comparar tamaños de individuos directamente y asesorar con más precisión a qué clase de edad pertenecen. El mayor solapamiento se encuentra entre los juveniles de tamaño grande in-situ que ya tendrán una coloración oscura y no se podrán diferenciar de los adultos en una fotografía. Por esa razón, los parámetros estimados para adultos a partir de marcaje-recaptura, realmente incluyen individuos adultos y subadultos. 4.2 Asunciones del modelo de diseño robusto cerrado El modelo de diseño robusto cerrado requiere cumplir con un número de asunciones. Primero, se asume una población cerrada dentro de cada periodo primario, es decir sin mortalidad, nacimientos, emigraciones e inmigraciones durante cada verano. Dada la larga esperanza de vida, la tasa de reproducción y la organización social de los calderones comunes, se asume que la población está efectivamente cerrada, porque solo los avistamientos durante los meses de verano fueron utilizados cada año (Verborgh et al., 2009). De acuerdo con de Stephanis et al. (2008a) y los resultados de seguimientos por satélites (Capítulo 3), la distribución de los calderones comunes está principalmente limitada a las aguas centrales y profundas del canal del estrecho de Gibraltar. Por lo tanto, su distribución geográfica es probablemente cerrada también con un nivel de inmigración insignificante durante el periodo de estudio. Segundo, se asume que han sido identificados sin error los individuos marcados naturalmente. Todos los individuos en el avistamiento fueron fotografiados independientemente de su nivel de marcaje. Se realizó también un esfuerzo para asegurarse de que todos los individuos hayan sido fotografiados, de forma que, al menos, haya una imagen de calidad excelente de cada individuo. Sin embargo, el número de fotografías y por lo tanto el número de imágenes de buena calidad fue significativamente menor para los juveniles y las crías que para los adultos (Gauffier et al., 2007) principalmente debido al menor tiempo que pasan respirando en superficie o a que su pequeño tamaño les permite esconderse detrás de los individuos adultos. El porcentaje de las imágenes de buena calidad de los individuos jóvenes tomadas entre 1999-2003 fue muy bajo, por esta razón solo una cría fue registrada de media Capítulo 4 - Parámetros demográficos de los calderones comunes del estrecho de Gibraltar Tesis doctoral P. Verborgh. 2015 - 149 anualmente entre 1999-2003. Además, como son individuos con marcas secundarias que no poseen muescas en la aleta dorsal, se necesitan imágenes de mejor calidad para identificar un individuo sin errores. Al mismo tiempo, se requieren avistamientos seguidos regularmente para poder realizar un seguimiento de los cambios de los arañazos o la aparición de la silla de montar en los individuos juveniles. Las muescas de las aletas dorsales se conservan durante toda la vida del individuo pero pueden evolucionar, por ejemplo cuando aparecen nuevas muescas alrededor de una muesca antigua. Se sabe que las muescas y la silla de montar no se perdieron a lo largo del periodo de estudio porque los individuos identificados en 1999 todavía poseían las mimas marcas en 2006, de acuerdo con Auger-Méthé y Whitehead (2007). Sin embargo, en el caso de los arañazos, varios de ellos fueron permanentes durante el periodo de estudio, otros fueron temporales y fue necesario el estudio de la particularidad de cada silueta de la aleta dorsal, nuevos arañazos o la aparición de la silla de montar para continuar con la identificación del individuo. Otros problemas pueden ocurrir cuando la fotografía está a contraluz y los arañazos se vuelven menos visibles. Por lo tanto, la identificación segura del individuo fue confirmada de acuerdo con la estructura social estable de los calderones comunes (presencia/ausencia de sus compañeros) descrita por de Stephanis et al. (2008b), o la presencia de la supuesta madre si se trataba de animales jóvenes. Los animales fueron identificados con mucha precaución y por lo tanto se considera que la identificación errónea en dos avistamientos de dos individuos como el mismo (un error “falso positivo”, según Stevick et al. (2001)) fue muy improbable. Sin embargo, las marcas secundarias son más sensibles a errores de tipo “falso negativo”, es decir, la identificación del mismo individuo como dos diferentes (Stevick et al., 2001) cuyas consecuencias serán discutidas más adelante. 4.3 Estimas de la tasa de supervivencia La tasa de supervivencia media estimada para los adultos fue de 0,972 (IC 95%: 0,9530,983), ligeramente superior a los valores de 0,945 para machos y 0,969 para hembras encontrado por Bloch et al. (1993a) en las Islas Feroe. Sin embargo la tasa de supervivencia media para los adultos encontrada en este estudio fue menor que el valor 0,982 (IC 95%: 0,955-0,993) encontrado por Verborgh et al. (2009) para los Capítulo 4 - Parámetros demográficos de los calderones comunes del estrecho de Gibraltar Tesis doctoral P. Verborgh. 2015 - 150 individuos muy marcados entre 1999 y 2005. Esto puede explicarse por varias razones. La primera es que el periodo de este estudio es de un año más, durante el cual podría haberse producido una mortalidad mayor que en los años anteriores, lo que se vería reflejado en el valor medio del periodo. La segunda es que al usar todos los individuos de la población, nos acercamos a un valor probablemente más realista y completo. El hecho de usar únicamente los individuos muy marcados, limita los resultados probablemente a individuos más maduros, que tienen una tasa de supervivencia mayor (Bloch et al., 1993), porque las marcas se suelen acumular con el tiempo (Auger-Méthé y Whitehead, 2007). En este estudio, hemos utilizado a todos los individuos “adultos” según criterios de pigmentación de la piel de manera que individuos todavía jóvenes pero mayores de 4,6 años, según la tasa de transición de juveniles a adultos, podrían incluirse en esta clase de edad y así disminuir la estima. Como se ha calculado en este estudio, la tasa de supervivencia es significativamente menor para la clase de edad de juveniles con una media de 0,869 (IC 95%: 0,7580,934). Otra explicación podría ser en este caso, los errores de identificación de tipo “falsos negativos”, de los cuales se explicaron anteriormente sus posibles causas. De hecho, este tipo de identificaciones erróneas podría haber causado una sobreestimación del número de individuos en la población y al mismo tiempo una infra estimación de la tasa de supervivencia como fue descrito en Stevick et al. (2001). Los autores observaron que la identificación del mismo individuo como dos diferentes, provocaba un sesgo en la estimación de la abundancia de la población porque los dos individuos deberían haber sido identificados como uno solo y por lo tanto el segundo avistamiento del mismo individuo es considerado por el modelo como un nuevo individuo que entra en la población. En cambio, en la tasa de supervivencia se produce un sesgo negativo porque el primer individuo identificado no fue nunca vuelto a avistar y por lo tanto se asume como muerto por el modelo. Sin embargo, los resultados no muestran un gran sesgo comparado con otros estudios así que este tipo de error fue probablemente insignificante. La tasa de supervivencia observada en crías de 0,629 (IC 95%: 0,409-0,805) fue baja. Aunque es similar a la tasa de 0,650 estimada en el primer año de vida de los calderones comunes en Canadá (Sergeant, 1962), está muy por debajo de la estimada Capítulo 4 - Parámetros demográficos de los calderones comunes del estrecho de Gibraltar Tesis doctoral P. Verborgh. 2015 - 151 en las Islas Feroe (0,862 en Bloch et al., 1993). Los calderones comunes del estrecho de Gibraltar tienen niveles medios de contaminantes organoclorados DDTs y PCBs cinco veces más altos que en el Mediterráneo (Praca et al., 2011; Lauriano et al., 2014; Pinzone et al., 2015), los cuales a su vez son 5 a 10 veces más altos que en el Atlántico norte (Dam y Bloch, 2000; Praca et al., 2011). Los niveles encontrados en el Estrecho están muy por encima de los umbrales considerados nocivos para el sistema inmune y reproductivo en mamíferos (Kannan et al., 2000; Jepson et al., 2005). Además, se ha demostrado que la mayoría de estos contaminantes se transmitirían a las crías 10 veces más durante la lactancia que en la gestación (Borrell et al., 1995) y que pueden afectar a su supervivencia (Hoydal et al., 2015), lo que explicaría el alto nivel de mortalidad encontrado en los neonatos de este estudio. 4.4 Estimas de abundancia Los modelos sin heterogeneidad fueron evaluados. Pero, ya que las estimas de abundancia fueron menores que para los modelos con heterogeneidad, estos fueron descartados (Chao et al., 1992). Los problemas de identificación errónea fueron más probables entre las sesiones primarias (años) que entre las sesiones secundarias (semanas/meses) porque los arañazos y las marcas fetales pueden durar varios meses (verano), pero muchos no permanecen de un año al siguiente. Por esto, la abundancia fue considerada como bien estimada. Sin embargo, las estimas de 2004 a 2006 son las más fiables, porque el esfuerzo fotográfico y la calidad de las fotografías fueron mayores. Esto fue debido el uso de una nueva cámara fotográfica digital a partir del 2004, permitiendo disparar un mayor número de fotografías y por tanto mejorando la calidad en las imágenes de los individuos jóvenes. De hecho, el uso de las plataformas de avistamiento de cetáceos y la cámara analógica con carretes solo permitió identificar a 5 crías entre 1999 y 2003. Por lo tanto, el verdadero aumento del esfuerzo fotográfico provocado por la adquisición de la nueva cámara digital, comenzó a ser aplicado a los individuos jóvenes en 2004, y ha ido creciendo hasta 2006 para intentar revertir el sesgo negativo del esfuerzo fotográfico enfocado a las crías y los juveniles de acuerdo con Gauffier et al. (2007), permitiendo una identificación adecuada de todos los individuos de la población. Por esto, la estima de 2006 es probablemente la más precisa. Además, para muchas especies de cetáceos, las estimas de captura-recaptura Capítulo 4 - Parámetros demográficos de los calderones comunes del estrecho de Gibraltar Tesis doctoral P. Verborgh. 2015 - 152 de tamaño de población usando las marcas naturales de los individuos son consideradas mucho más precisas que aquellas obtenidas con campañas de transecto lineal (Hiby y Hammond, 1989), el otro método principal disponible. Por lo tanto, la estimación mediante marcaje-recaptura de 349 individuos (IC 95%: 321-407) en la población de 2006 fue considerada una buena estima del número de individuos de la población de calderón común en el estrecho de Gibraltar. 4.5 Porcentaje de individuos maduros El porcentaje alto de individuos adultos (85,4% por foto-identificación y 76,8% en los avistamientos en el mar) encontrado en esta población podría reflejar problemas de reproducción. Según Taylor et al. (2007), la proporción de individuos maduros en calderones comunes estaría alrededor de 46% en una población con un crecimiento poblacional de 4% anual y de 51% en una población estable. Estas predicciones están muy por debajo de lo encontrado en este estudio. Podría ser debido a la baja supervivencia de las crías y los potenciales problemas de reproducción encontrados debido a los altos niveles de contaminantes como se ha discutido anteriormente. 4.6 Intervalo de nacimientos y estacionalidad de reproducción Para el cálculo del intervalo de nacimientos, podría existir un sesgo negativo debido a una mayor mortalidad prenatal y/o neonatal, o al reducido número de parejas disponibles para la reproducción. Se hizo una distinción entre el intervalo de nacimiento, calculado por todas las asociaciones madre-cría y el intervalo de crías viables definido por Olesiuk et al. (1990) calculado solo con las madres cuyas crías sobrevivieron al menos un año. El intervalo de crías de 4,5 años en este estudio fue menor que los 5,1 años de las Islas Feroe por Martin y Rothery (1993), pero similar al intervalo entre embarazos de 4,2 años calculado por los mismos autores. El intervalo de nacimientos de 3,6 años de este estudio fue, por lo tanto, menor que el intervalo entre embarazos de Martin y Rothery (1993), a pesar de que estos autores definieron el intervalo entre embarazos como el intervalo entre dos posibles embarazos, incluso si el feto o recién nacido moría. Las estrictas restricciones impuestas por la selección de parejas válidas madre-cría solo permitieron usar 13 madres para el cálculo del intervalo, sobre los 256 adultos identificados. Esto fue debido probablemente al corto período de tiempo de estudio comparado con la longitud del intervalo (menos de dos Capítulo 4 - Parámetros demográficos de los calderones comunes del estrecho de Gibraltar Tesis doctoral P. Verborgh. 2015 - 153 veces el intervalo) y el bajo número de imágenes de crías y juveniles tomadas entre 1999 y 2003. De hecho, la mayoría de las parejas madre-cría fueron identificadas en 2004-06, un período de solo tres años, i.e. un período menor al intervalo estimado. Por lo tanto, el número de madres seleccionadas para el cálculo fue limitado por el número de potenciales madres identificadas entre 1999-03. Entonces, dos cuestiones surgen de esta pequeña cantidad de datos. Primero, una muestra de 13 individuos podría ser insuficiente para estimar el éxito de reproducción de las hembras en la población, causando una estima sobrevalorada o infravalorada del intervalo de crías. Segundo, el corto período de estudio puede limitar el muestreo a los intervalos de menor duración y, por lo tanto, causar una sobrestimación del éxito de reproducción de las hembras. Los intervalos mínimo y máximo se utilizaron para estimar el intervalo cuando una o las dos crías eran identificadas por primera vez como juveniles, y, por lo tanto, el año de nacimiento solamente podía ser estimado basado en su coloración, forma y tamaño de la dorsal en las imágenes. Las incertidumbres sobre el año de nacimiento de algunos juveniles podrían llevar a sobreestimar o infra-estimar el intervalo. Se encontró una estacionalidad en la presencia de neonato en los grupos de calderones avistados, con un pico durante el mes de abril. Esta observación confirma la hipótesis de que la desaparición temporal de los calderones del estrecho de Gibraltar durante unas semanas en primavera podrían ser con fines reproductivos (de Stephanis, 2008). El tiempo de gestación de 12 meses (Martin y Rothery, 1993) causaría una sincronización de la mayoría de los nacimientos en primavera. Sin embargo, se han observado neonatos todo el año. La estacionalidad observada en la presencia de neonatos podría ser determinante para minimizar el impacto de actividades antropogénicas durante este periodo crítico para la especie. 4.7 Tiempo de generación El tiempo de generación de 35 años calculado a partir de los datos de las Islas Feroe es muy diferente del encontrado por Taylor et al. (2007), que estimaron un tiempo de generación de 24 años para calderones comunes usando otros métodos y los datos de Sergeant (1962) con una edad máxima de reproducción de 40 años en vez de 59 años