Citotoxicidad de la eupatorina en células leucémicas humanas

D JUAN FRANCISCO LORO FERRER, COORDINADOR DEL PROGRAMA DE DOCTORADO INVESTIGACIÓN APLICADA A LAS CIENCIAS SANITARIAS, DE LA ESCUELA DE DOCTORADO DE LA UNIVERSIDAD DE LAS PALMAS DE GRAN CANARIA, EN CALIDAD DE PRESIDENTE DE LA COMISIÓN DE DOCTORADO CERTIFICA, Que la citada Comisión en su sesión de uno de Junio tomó el acuerdo de dar el consentimiento para su tramitación, a la tesis doctoral titulada "Citotoxicidad de la Eupatorina en células leucémicas humanas" presentada por la doctoranda Dª Sara Estévez Sarmiento y dirigida por los Doctores Francisco Estévez Rosas y José Quintana Aguiar. Y para que así conste, y a efectos de lo previsto en el Artº 8 del Reglamento de Estudios de Doctorado de la Universidad de Las Palmas de Gran Canaria, firmo la presente en Las Palmas de Gran Canaria, a 1 de Junio de dos mil dieciséis UNIVERSIDAD DE LAS PALMAS DE GRAN CANARIA Programa de Doctorado Investigación aplicada a las Ciencias Sanitarias Departamento de Bioquímica y Biología Molecular, Fisiología, Genética e Inmunología TÍTULO CITOTOXICIDAD DE LA EUPATORINA EN CÉLULAS LEUCÉMICAS HUMANAS Memoria para optar al grado de Doctor por la Universidad de Las Palmas de Gran Canaria presentada por la Licenciada en Medicina Dª. Sara Estévez Sarmiento La Doctoranda El Director El Director Dª Sara Dr. Francisco Dr. José Estévez Sarmiento Estévez Rosas Quintana Aguiar Las Palmas de Gran Canaria, a 8 de Abril de 2016 ÍNDICE Abreviaturas 17 ABREVIATURAS ADN Ácido desoxirribonucleico AIF Factor inductor de apoptosis Apaf-1 Factor activador de proteasas apoptóticas ATP Adenosín trifosfato Bad Proteína pro-apoptótica de la familia Bcl-2 Bak Proteína pro-apoptótica de la familia Bcl-2 Bax Proteína pro-apoptótica de la familia Bcl-2 Bcl-2 Proteína anti-apoptótica de la familia Bcl-2 Bcl-xL Proteína anti-apoptótica de la familia Bcl-2 Bid Proteína pro-apoptótica de la familia Bcl-2 BIR Dominio de interacción proteína-proteína en las IAPs CAK Proteína quinasa activadora de CDK CDK Proteína quinasa dependiente de ciclina CKI Inhibidores de CDK DD Dominio de muerte DED Dominio efector de muerte DISC Complejo de señalización inductor de muerte DMSO Dimetilsulfóxido DTT Ditiotreitol EDTA Ácido etilen-diamin-tetraacético EGTA Ácido etilenglicol-bis-N,N’-tetraacético ERK Proteína quinasa regulada por señales extracelulares FADD Dominio de muerte asociado a Fas Fas Receptor de muerte, también llamado Apo1 o CD95R FasL Ligando de receptor de muerte Fas FBS Suero bovino fetal GPCR Receptor acoplado a proteína G IAP Proteína inhibidora de apoptosis IC50 Concentración de producto que inhibe el crecimiento celular a la mitad JNK Proteína quinasa N-terminal de jun jun Factor de transcripción de la familia AP-1 MAPK Proteína quinasa activada por mitógenos MEK Proteína quinasa de MAPK MK Proteínas quinasa activadas por MAPKs MKP Fosfatasas de MAPK MTT Bromuro de 3-[4,5-dimetiltiazol-2-il]-2,5-difeniltetrazolio Abreviaturas 18 NAC N-acetil-L-cisteína NF-κB Factor nuclear κB p21 Inhibidor de quinasa dependiente de ciclinas p38 Proteína quinasa activada por mitógenos p38 p53 Proteína supresora de tumores PARP Poli(ADP-ribosa) polimerasa PBS Tampón fosfato salino PD98059 Inhibidor de MEK1 PMSF Fluoruro de metilsulfonilfenilo Raf MAP3K Ras Proteína G pequeña RING Dominio interacción proteína-proteína RIP Proteína de interacción con el receptor ROS Especies reactivas del oxígeno SB203580 Inhibidor de p38 SDS Dodecil sulfato sódico Ser Serina Smac/DIABLO Segundo activador de caspasas derivado de mitocondria SOD Superóxido dismutasa SP600125 Inhibidor de JNK TEMED N,N,N,N-tetrametil-etilendiamina Thr Treonina TNF Factor de necrosis tumoral TNFR1 Receptor 1 de TNF TRADD Dominio de muerte asociado a TNFR TRAF2 Factor asociado al receptor de TNF TRAIL Ligando inductor de apoptosis relacionado con TNF U0126 Inhibidor de MEK1 y MEK2 XIAP Proteína inhibidora de la apoptosis z-VAD-fmk Inhibidor general de caspasas INTRODUCCIÓN Introducción 21 1.1. Importancia Biomédica de los Flavonoides Dentro del gran grupo de los compuestos polifenólicos, los flavonoides constituyen una clase de metabolitos secundarios de las plantas que poseen un amplio espectro de actividades farmacológicas incluyendo actividades anti-cancerígenas. Se ha descrito que estos compuestos interfieren en la iniciación, en la promoción y en la progresión del cáncer a través de la modulación de diferentes enzimas y receptores en rutas de señalización implicadas en la proliferación celular, la diferenciación, la apoptosis, la inflamación, la angiogénesis, la metástasis y en la reversión de la multirresistencia a fármacos. Debido a sus múltiples mecanismos de acción se está llevando a cabo un importante esfuerzo en la investigación de las potenciales aplicaciones en la terapia anti-cancerígena de los flavonoides tanto naturales como sintéticos. 1.2. Estructura Química de los Flavonoides. El término ‘flavonoide’ se usa generalmente para describir un amplio grupo de productos naturales que poseen un esqueleto carbonado C6–C3–C6, o más específicamente un esqueleto fenilbenzopirano [el sistema cíclico benzopirano también se denomina cromano, (1)] (Figura 1). Químicamente los flavonoides son polifenoles que poseen una estructura básica que consta de dos anillos bencénicos (A y B) unidos a través de un anillo C heterocíclico de pirano o pirona (con un doble enlace) central. De acuerdo a la nomenclatura IUPAC [1], estos grupos se dividen en flavonoides (2), isoflavonoides (3) y los neoflavonoides (4), basado en la posición del enlace del anillo fenilo al núcleo benzopirano. El núcleo básico fenilbenzo-γ-pirona (C6-C3-C6) de los flavonoides puede existir tanto como aglicona libre o conjugado con azúcares formando glucósidos. Los flavonoides se subdividen además en Introducción 22 flavanonas (5), flavonas (6), dihidroflavonoles (7), flavonoles (8), flavanoles (9, 10 y 11, incluyendo las catequinas) y antocianidinas (12) (Figura 1). Esta clasificación se basa en la presencia (o ausencia) de un doble enlace en la posición 4 del anillo C central, la presencia (o ausencia) de un doble enlace entre los átomos de carbono 2 y 3 del anillo C, el patrón de sustitución del anillo C y la apertura del anillo de pirano central [2] (Figura 1). En la estructura flavonoide, un grupo fenilo ocupa normalmente la posición 2 del anillo de pirona. Los flavonoides y los tocoferoles (vitamina E) comparten una estructura común, el anillo de cromano. En los isoflavonoides, la sustitución del grupo fenilo tiene lugar en la posición 3. Constituyen una subclase distinta de la familia flavonoides que contiene el esqueleto 3-fenilbenzopirano, biosintéticamente derivada por la migración 1,2-arilo de un precursor 2-fenilbenzopirano. Los neoflavonoides son estructuralmente y biogenéticamente relacionados con los flavonoides y los isoflavonoides. Las neoflavonas son conocidas en la literatura como 4-arilcumarinas. Los productos naturales como las chalconas (13) y las auronas (14) se consideran flavonoides minoritarios y también contienen el esqueleto C6–C3–C6. Todas las plantas son capaces de sintetizar flavonoides. La biosíntesis comienza invariablemente a partir del aminoácido fenilalanina y toma diferentes rutas, pero relacionadas, dependiendo del tipo de flavonoides. Los flavonoides son abundantes en la dieta humana y presentan una toxicidad relativamente baja comparada con otros principios activos de plantas, por ejemplo los alcaloides, un grupo compuestos nitrogenados derivados de aminoácidos, que poseen potente acción fisiológica en los animales incluso a bajas dosis. Introducción 23 O O O O OH O OH Flavan-3-ol (9) Flavona (6) O O Flavanona (5) Dihidroflavonol (7) O + Antocianidina (12) O Chalcona (13) 1’ 2’ 3’ 4’ 1 O Benzopirano (Cromano) (1) O 12 3 4 5 6 7 82’ 3’ 4’ 5’ 6’ AC B Flavonoides (2) O Isoflavonoides (3) O Neoflavonoides (4) O O OH Flavonol (8) O OH O OH OH Flavan-4-ol (10) Flavan-3,4-diol (11) O O HO HO OH Aurona (14) 5’ 6’ 234 5 6 Figura 1. Estructuras de tipos de flavonoides. 1.3. Actividades Biológicas de los Flavonoides. Determinados flavonoides inducen parada del ciclo celular y muerte celular, que son características clave de la acción de los compuestos utilizados en la quimioterapia en células leucémicas [3]. Dentro del grupo de los flavonoides, las flavonas aisladas de fuentes vegetales se caracterizan por poseer múltiples patrones de sustitución en el esqueleto fenilbenzo--pirona. Esta diversidad estructural es la que les confiere su amplio espectro de actividades biológicas. Además de proteger a las plantas de enfermedades microbianas, se ha demostrado que las flavonas exhiben Introducción 24 una serie de actividades biológicas útiles, incluyendo actividades frente a enfermedades metabólicas e infecciosas. Específicamente presentan actividades antiinflamatorias, antiestrogénicas, antimicrobianas, antialérgicas, antioxidantes, antitumorales y citotóxicas. Las primeras revisiones de Middleton y colaboradores y de Harborne y Williams describieron la interacción de flavonoides y flavonas con células de mamíferos [2,4]. Desde entonces, ha habido un gran progreso en el conocimiento del efecto de las flavonas sobre determinadas enfermedades metabólicas como la arterioesclerosis, la diabetes, el cáncer y la enfermedad de Alzheimer, y también sobre las enfermedades infecciosas como la malaria. Muchos de estos efectos de las flavonas son el resultado de sus actividades como (i) inhibidores de proteínas tirosina quinasas, (ii) inhibidores de Ser/Thr (serina/treonina) quinasas, (iii) inhibidores de topoisomerasas, (iv) agentes antiangiogénicos, (v) agentes antioxidantes y (vi) moduladores de la multirresistencia a fármacos. Las tirosina quinasas son enzimas que catalizan la fosforilación de residuos de tirosina en las proteínas y median la transducción de muchas señales extrae intracelulares. Estas proteínas quinasas están implicadas en la regulación de la proliferación y la diferenciación celular así como en la oncogénesis. La comparación del efecto inhibidor sobre la proteína tirosina quinasa p40 de las diferentes clases de flavonoides ha puesto de manifiesto que las flavonas y los flavonoles son mejores inhibidores de esta tirosina quinasa que sus correspondientes flavanonas o isoflavonas, así como el requerimiento de un doble enlace C-2 y C-3 y la posición del anillo B en el C-2 para la actividad inhibidora proteína tirosina quinasa [5]. Introducción 25 Las flavonas crisina y baicaleína (Figura 2) poseen actividad inhibidora de la DNA topoisomerasa II [6,7]. Mientras que la acacetina, la apigenina y la luteolina inhiben la re-ligación del ADN catalizada por la topoisomerasa I [8]. Se ha descrito que la flavona luteolina (Figura 2) se une a la proteína quinasa C (PKC) inhibiéndola [9]. PKC es una Ser/Thr quinasa que cataliza la fosforilación de los grupos hidroxilos de los residuos de serina y treonina en las proteínas celulares. Este enzima juega un importante papel en varias cascadas de transducción de la señal. Cuando se activa por un promotor de tumores (por ejemplo, un éster de forbol), puede fosforilar a potentes activadores de la transcripción, lo que conduce de esta manera a una expresión de oncogenes que promueven la progresión del cáncer [10]. Determinadas flavonas inhiben a las quinasas dependientes de ciclina (CDKs) que son serina/treonina quinasas implicadas en la regulación del ciclo celular. De los estudios estructura-actividad se pone de manifiesto que el C4-oxo y el doble enlace C2–C3 son cruciales para la actividad inhibidora. La presencia de un grupo 3´-OH en el anillo B como en luteolina está correlacionada con un bloqueo en la fase G1 del ciclo celular, mientras que su ausencia como en la apigenina (Figura 2) está asociada con una detención en la fase G2 [11]. La tangeretina (5,6,7,8,4´-pentametoxiflavona, Figura 2) inhibe la proliferación de las células de carcinoma de colon COLO 205 a través de la modulación de las actividades de varias proteínas reguladoras clave de G1, tales como Cdk2 y Cdk4, e induce la expresión de los inhibidores de Cdk p21 y p27 [12]. La flavona eupatorina reduce la migración de las células endoteliales HUVEC y su capacidad para formar tubos [13] y la wogonina presenta propiedades antiangiogénicas [14,15]. Introducción 32 multicelulares y su desarrollo. La desregulación de este proceso puede causar enfermedades neurodegenerativas y autoinmunes y muchos tipos de cáncer. Durante la apoptosis, las células sufren una serie de cambios morfológicos: disminuyen de tamaño, se condensan y luego se fragmentan, liberando pequeños cuerpos apoptóticos rodeados por membranas que son fagocitados por macrófagos, células parenquimales o células neoplásicas y son degradados en los fagolisosomas [24]. El núcleo de las células apoptóticas se condensa y el DNA se fragmenta, pero los constituyentes celulares no se liberan al medio extracelular. La membrana plasmática permanece intacta. El mecanismo de apoptosis es complejo y sofisticado e incluye una cascada de eventos moleculares dependientes de energía. Existen al menos dos vías principales de la apoptosis: la vía extrínseca o de los receptores de muerte y la vía intrínseca o mitocondrial. Sin embargo, estas dos vías están conectadas y las moléculas de señalización de una vía pueden influir en la otra. Además, estas dos rutas convergen para iniciar la vía de ejecución. Las modificaciones bioquímicas que presentan las células apoptóticas incluyen: (i) la hidrólisis y la reticulación de las proteínas, (ii) la fragmentación del ADN y (iii) la expresión de los marcadores de reconocimiento fagocítico en la membrana celular. La reticulación de las proteínas se induce por la expresión y la activación de la transglutaminasa tisular dependiente de Ca2+. Esta enzima cataliza uniones específicas entre las cadenas laterales de glutamato y de lisina de las proteínas intray extracelulares, siendo responsable de la estabilización estructural observada en el proceso de la muerte celular apoptótica [25]. El ADN se fragmenta por las endonucleasas dependientes de Ca2+ y Mg2+, generando fragmentos de 180 a Introducción 33 200 pares de bases [26]. Esta “escalera de ADN” característica se puede visualizar en un gel de agarosa teñido con bromuro de etidio e iluminado con luz ultravioleta. La expresión de los marcadores fagocíticos en la superfície celular constituye otra característica bioquímica de la apoptosis que permite a las células vecinas reconocer y fagocitar rápidamente a las células apoptóticas. La fosfatidilserina es un fosfolípido que normalmente se localiza en la cara interna de la membrana plasmática y se transloca a la cara externa en los estadíos tempranos del proceso de apoptosis. La proteína anexina V se une a fosfatidilserina en presencia de Ca2+ permitiendo detectar las células apoptóticas por citometría de flujo, previa incubación de las células con anexina V unida al fluorocromo isotiocianato de fluoresceína (FITC) [27,28]. Aunque la externalización de la fosfatidilserina es un marcador bien establecido de la fagocitosis, estudios recientes indican que existen otras proteínas que se exponen a la superficie celular durante el proceso apoptótico. 1.5.1. Caspasas. La mayoría de los cambios morfológicos detectados durante la muerte celular por apoptosis están causados por la activación de un grupo enzimas proteolíticas o proteasas denominadas caspasas, llamadas así porque contienen un residuo de cisteína clave en el centro activo y cortan o hidrolizan selectivamente proteínas en los sitios inmediatos en dirección C-terminal de residuos de aspartato. Se han identificado al menos catorce caspasas siendo diez las más comunes, que se clasifican en iniciadoras (caspasas-2,-8,-9,-10), ejecutoras (caspasas-3,-6,-7) e inflamatorias Introducción 34 (caspasas-1,-4,-5) [29,30]. La especificidad de las caspasas viene determinada por los cuatro residuos de aminoácidos N-terminales del sitio de corte [31]. Como la mayoría de los enzimas proteolíticos, las caspasas se sintetizan como zimógenos o proenzimas inactivas denominadas procaspasas. Estas proenzimas contienen tres dominios: un prodominio N-terminal y dominios p20 y p10, que se encuentran en la enzima madura. En todos los casos examinados las enzimas activas son heterotetrámeros que contienen dos heterodímeros p20/p10 y dos centros activos. La mayoría de las caspasas se activan por escisión de la proenzima entre los dominios p20 y p10 y normalmente también entre el prodominio y el dominio p20. Todas estas escisiones tienen lugar después de residuos de aspartato, lo que sugiere que existe una autocatálisis o una activación por otras caspasas. Por ejemplo, las caspasas ejecutoras se activan por las caspasas iniciadoras, mientras que la caspasa-8 se autoactiva por proximidad (ver vía extrínseca). La caspasa-9 se activa por un mecanismo más complejo. A diferencia de las otras caspasas el procesamiento proteolítico de la caspasa-9 tiene un efecto menor sobre su actividad enzimática. Para la activación de esta proteasa es necesaria su asociación con un cofactor proteico Apaf-1 [32]. La holoenzima formada por la caspasa-9, Apaf-1 y la proteína mitocondrial citocromo c se denomina apoptosoma. En condiciones normales de supervivencia celular, el citocromo c se localiza en el espacio intermembrana mitocondrial, mientras que Apaf-1 y la caspasa-9 en estado inactivo se encuentra en el citosol. Muchos estímulos que inducen la muerte celular inducen la liberación del citocromo c mitocondrial al citosol, formandocon Apaf-1 y caspasa-9 el apoptosoma y activando la caspasa-9. Introducción 35 Se han descrito hasta el momento más de 400 sustratos potenciales de caspasas. Estos sustratos incluyen proteínas-componentes del citoesqueleto (actina, gelsolina, β-catenina) y del núcleo (lamina A y B, receptor de lamina B, proteínas del aparato mitótico), proteínas implicadas en la reparación y el metabolismo del ADN [poli(ADP-ribosa)polimerasa (PARP), subunidad catalítica de la proteína quinasa dependiente de ADN (DNA-PKcs), ADN-topoisomerasa II], proteínas quinasas [proteína quinasa C (PKC), proteína quinasa N (PKN), proteína quinasa 2 activa por p21 (PAK2), MEKK1, Raf1), proteínas involucradas en las vías de señalización (prointerleuquinas, el factor de transcripción NF-κB y su regulador IκB), proteínas reguladoras del ciclo celular y la proliferación (p21, p27, pRb, CDC27), así como las proteínas cuya hidrólisis desempeña un papel crítico en la apoptosis (procaspasas, proteínas de la familia Bcl-2, ICAD (inhibidor de la DNasa activada por caspasa-3, endonucleasa responsable de la aparición de la “escalera de ADN”) [33]. La actividad de las caspasas está regulada por una familia de proteínas llamada IAPs (Proteínas Inhibidoras de Apoptosis) [34]. Se han identificado ocho IAPs humanas. Entre ellas, cIAP1, cIAP2, XIAP (IAP ligada al cromosoma X), MLIAP (melanoma-IAP) y survivina son las más caracterizadas. XIAP es considerada como el miembro de la familia IAP con la actividad antiapoptótica más potente y bloquea la apoptosis al unirse e inhibir la activación de caspasa-3, -7, y -9. Todos los miembros de la familia IAP contienen de 1 a 3 dominios N-terminales BIR (repetición IAP de baculovirus, dominio de coordinación con Zn2+) y un dominio Cterminal RING. Los dominios BIR son necesarios para la unión y la inhibición de las caspasas. Introducción 36 1.5.2. Vía intrínseca. Proteínas de la familia Bcl-2. La vía de señalización intrínseca implica varios estímulos de apoptosis no relacionados con los receptores de muerte y se inicia en la mitocondria. Se puede estimular tanto por ausencia de factores de crecimiento, de hormonas y de citoquinas como por factores como la radiación, las toxinas, la hipoxia y la presencia de radicales libres [24]. Todos estos cambios pueden inducir la liberación de varias proteínas pro-apoptóticas de la mitocondria al citosol como el citocromo c (Figura 4). En las células sanas normales el citocromo c, localizado entre la membrana mitocondrial interna y la externa, funciona como un transportador electrónico móvil que transfiere los electrones desde el complejo III (Q-citocromo c reductasa) de la cadena de transporte electrónico al complejo IV (citocromo c oxidasa). . En las células que sufren apoptosis, el citocromo c se libera al citosol y se asocia con Apaf-1 favoreciendo su oligomerización dependiente de ATP y permitiendo el reclutamiento de la pro-caspasa-9 para formar una holoenzima denominada apoptosoma que activa a la caspasa-9. Por lo tanto, la activación de la caspasa-9 está mediada por los cambios conformacionales y no por proteólisis [35]. Otras proteínas liberadas de la mitocondria, Smac/DIABLO y HtrA2/Omi, también estimulan la apoptosis ya que inhiben la actividad anti-apoptótica de las proteínas IAPs (Proteínas Inhibidores de Apoptosis). Introducción 37 Citocromo c Caspasa-3/7 Smac/Diablo Bid tBid Daño al DNA p53 Bcl-2 Bcl-xL AIF Endonucleasa G Caspasa-8 IAPs Pro-caspasa-9 Apaf-1 Apoptosoma Pro-caspasa-8 Bax Pro-caspasa-3/7 Fragmentación del ADN Condensación de cromatina Núcleo Apoptosis Membrana celular Señal de muerte Extrínseca Señal de muerte Intrínseca Figura 4. La vía intrínseca de la apoptosis. Esta vía se inicia por una señal de muerte intracelular. Esta señal provoca la oligomerización y la translocación de Bax y Bak a la membrana externa mitocondrial, desencadenando un aumento de la permeabilidad de la membrana y la liberación de citocromo c y de proteínas de unión a IAP. El citocromo c forma el apoptosoma con Apaf-1 y la pro-caspasa-9, provocando la muerte celular. Las proteínas de unión a IAP, como Smac, se unen a XIAP y antagonizan su función. El segundo grupo de proteínas pro-apoptóticas liberadas de la mitocondria incluyen a la AIF (factor inductor de apoptosis), la endonucleasa G y CAD (endonucleasa activada por caspasas, proteína responsable de la formación de la “escalera de ADN”). Sin embargo, es un evento tardío de la apoptosis y una vez Introducción 38 liberadas estas proteínas inducen la fragmentación de ADN y la condensación de la cromatina [36]. La liberación de estas proteínas de la mitocondria está controlada por proteínas de la familia Bcl-2. La proteína que da el nombre a esta familia, Bcl-2 (B cell lymphoma-2) es un protoncogén responsable de un linfoma folicular de células B [37]. La familia Bcl-2 comprende al menos tres grupos de acuerdo a su estructura y su papel en la apoptosis [38]: - proteínas anti-apoptóticas como Bcl-2, Bcl-xL, Bcl-w y Mcl-1. Estas proteínas se caracterizan por la presencia de los 4 dominios Bcl-2 (BH: BH1, BH2, BH3 y BH4) y poseen una cola hidrofóbica C-terminal que localiza a estas proteínas en la superficie exterior de la membrana mitocondrial y el resto de la proteína está orientada al citosol. - proteínas pro-apoptóticas como Bax, Bak, Bok/Mtd y Bcl-Xs, que contienen tres dominios BH1, BH2 y BH3 y la cola hidrofóbica C-terminal. - proteínas que solo contienen un dominio BH3, que incluyen Bid, Bad y Noxa. Estas proteínas inducen apoptosis activando las proteínas pro-apoptóticas como Bax o inhibiendo las proteínas anti-apoptóticas como Bcl-2. Las proteínas de estas tres clases son capaces de formar homodímeros y heterodímeros y desempeñan distintos papeles en el control del potencial de la membrana mitocondrial. Bax y Bak son esenciales para la liberación de citocromo c [39]. En las células sanas Bax está localizado en el citosol como un monómero. Durante la apoptosis Bax se transloca a la mitocondria [40], donde sufre homooligomerización. Por el contrario, Bak reside en la mitocondria constantemente y durante la apoptosis se oligomeriza [41]. Los miembros anti-apoptóticos de la Introducción 39 familia Bcl-2 previenen la liberación de citocromo c formando heterodímeros con Bax/Bak y desactivándolos. Las proteínas de la familia Bcl-2 no poseen homología en secuencia de aminoácidos significativa con ninguna otra proteína, aunque la estructura tridimensional de Bcl-xL se asemeja a la estructura de los dominios formadores de poros de ciertas toxinas bacterianas que actúan como canales iónicos o de proteínas. Si la función está relacionada con la estructura, la predicción sería que las proteínas de la familia Bcl-2 pueden funcionar como canales [42]. Sin embargo, no se sabe si estos canales pueden ser los suficientemente grandes para que puedan pasar las proteínas. Otra posibilidad es que las proteínas de la familia Bcl-2 recluten otras proteínas de la membrana externa mitocondrial, por ejemplo VDAC (Canal Aniónico Dependiente de Voltaje) para formar poros grandes [43]. Este modelo asume que VDAC sufre cambios conformacionales significativos al unirse con los miembros de la familia Bcl-2. Es posible que las proteínas de la familia Bcl-2 controlen la homeostasis de la mitocondria (por ejemplo gracias a su actividad como canal de iones mencionada más arriba) o indirectamente, a través de la modulación de otras proteínas mitocondriales, como por ejemplo VDAC, ya que puede formar un poro de transición permeable mitocondrial (PTP). PTP es un canal grande, su apertura determina la pérdida rápida del potencial mitocondrial, el hinchamiento del orgánulo y la liberación de citocromo c [38]. 1.5.3. Vía extrínseca. Receptores de muerte. La ruta extrínseca implica interacciones mediadas por los receptores transmembranales de muerte de la superfamilia del receptor de TNF (Factor de Necrosis Tumoral), como los receptores a TNF, a Fas y a TRAIL, y depende de las Introducción 40 caspasa-8 que corta y activa a las caspasas efectoras (caspasa-3, -6 y -7), induciendo una cascada de caspasas. Los miembros de la superfamilia del receptor de TNF comparten un dominio extracelular rico en cisteína y poseen un dominio citoplasmático de 80 residuos de aminoácidos denominado dominio de muerte (DD) [44]. Este último desempeña un papel importante en la transmisión de la señal de la muerte en la superficie celular de las vías de señalización intracelulares. Los ligandos y receptores de muerte mejor caracterizados incluyen FasL/FasR (CD95), TNFα/TNFR1, Apo3L/DR3, Apo2L (TRAIL)/DR4 y Apo2L (TRAIL)/DR5. En la Figura 5 se presenta la secuencia de eventos de la vía extrínseca de la apoptosis referidos a FasL/FasR y TNF-α/TNFR1. Tras la unión del ligando Fas a los receptores Fas (asociados en trímeros), los receptores de muerte activados reclutan una proteína adaptadora FADD (Dominio de Muerte Asociada con Fas) que contiene dos dominios: un dominio de muerte (DD) y un dominio efector de muerte (DED). FADD se une al receptor de Fas, al mismo tiempo el DED se une a DED de la procaspasa-8, de esta manera se forma el complejo de señalización inductor de la muerte (DISC). La formación de DISC induce una alta concentración local de pro-caspasa-8 [44,45]. En estas condiciones la baja actividad intrínseca de la pro-caspasa-8 es suficiente para que varias moléculas de proenzima se activen recíprocamente. Una vez activada la caspasa-8 se inicia la fase de ejecución de la apoptosis activando la caspasa-3. La caspasa-8 también corta una proteína de la familia Bcl-2 llamada Bid. La proteína Bid procesada se transloca a la mitocondria para activar la vía intrínseca, activándose así las dos rutas y amplificando la señal apoptótica inducida por los receptores de muerte [46]. Introducción 41 DD DD DD DD DD DED DED DED DED CD95 Fas Apo1 FADD FADD Pro-caspasa-8 DD DD DD DD DD DED DED TNFR1 FADD RIP Pro-caspasa-8 DD DD TRADD TRADD TRAF2 NIK IKK I-B / NF-B NF-B MEKK1 MKK4/7 JNK c-Jun Caspasa-8 c-FLIP Caspasas ejecutoras APOPTOSIS t-Bid Vía intrínseca CD95L TNF Figura 5. La vía extrínseca de la apoptosis. Está vía implica la unión de señales de muerte, como el ligando Fas o el factor de necrosis tumoral, a sus correspondientes receptores y está asociada a la formación de un complejo de señalización inductor de muerte (DISC). En ciertas células, el complejo DISC activa directamente a las caspasas, conduciendo a muerte celular. Sin embargo, en la mayoría de las células, el DISC, a través de su componente caspasa-8, corta Bid para formar tBid, conduciendo a la oligomerización de Bax/Bak, a un aumento de la permeabilidad de la membrana externa mitocondrial, formación del apoptosoma, y muerte celular. La unión del ligando TNF a su receptor determina la unión de una proteína adaptadora TRADD y el reclutamiento de RIP y TRAF2 o FADD. RIP y TRAF2 estimulan las rutas de activación de los factores de transcripción NF-κB y JNK/AP-1, mientras FADD induce la ruta de apoptosis. A diferencia de Fas la unión de TNF a su Introducción 48 familia RAS, que a su vez también recluta y fosforila RAC1, que actúa entonces a través de la familia de proteínas quinasas activadas por la proteína p21 (PAK) para fosforilar miembros de la familia MAP3K. Se han asociado al menos 14 miembros de la familia MAP3K con la activación de la cascada de señalización de JNK, por ejemplo, MAP3K4 y MAP3K12. MAP3K fosforila de manera dual a MAP2K4 (MKK4) en Ser257 y Thr265, o a MAP2K7 (MKK7) en Ser271 y Thr275, que a su vez activan MAPK8 (JNK), MAPK9 (JNK2), y MAPK10 (JNK3). Las proteínas quinasas JNK1 y JNK2 se expresan de forma ubicua en los seres humanos, mientras que JNK3 se expresa principalmente en el cerebro, el corazón y los testículos. Una amplia variedad de procesos celulares se activan por la vía de JNK, incluyendo la apoptosis [66], moléculas de señalización [67] y factores de transcripción tales como JUN [68], JUND [69], y p53 [70]. Las JNKs de mamíferos están codificadas por tres genes distintos (JNK1, JNK2 y JNK3) y la maduración alternativa de estos genes genera diez productos génicos diferentes de 46-55 kDa. Como en el caso de ERK la activación de JNK requiere la fosforilación en el motivo conservado de Thr-Pro-Tyr. Se han identificado múltiples sustratos de JNKs, principalmente factores de transcripción y receptores hormonales nucleares. Muchas proteínas mitocondriales, como por ejemplo las proteínas de la familia Bcl-2 (Bcl-2, Bcl-xL, Bad, Bim y Bax), también son sustratos de JNK, así como las proteínas del citoesqueleto paxilina, MAP-2, -1B y Tau. Se ha demostrado que JNK está involucrada en la degradación del inhibidor de caspasa-8 cFLIPL. Aunque el papel de JNK en la apoptosis está bien establecido, esta quinasa también contribuye a la supervivencia. Estos efectos opuestos están determinados por la duración o la magnitud de la activación y en parte por la activación de otras rutas. Introducción 49 La activación prolongada de JNK induce la apoptosis, mientras que la activación transitoria está implicada en la supervivencia celular [71]. Las p38MAPKs son fuertemente activadas por estrés y por citoquinas inflamatorias; sin embargo, los factores de crecimiento son capaces de activar débilmente esta ruta. Las p38MAPKs desempeñan un papel importante en puntos de control del ciclo celular. Las p38MAPKs requieren la fosforilación dual del motivo ThrGly-Tyr en el lazo de activación por MAP2K3 (MEK3) o MAP2K6 (MEK6) para ser completamente activas. Existen al menos cuatro isoformas de p38MAPK: MAPK11 (p38-α), MAPK12 (p38-β), MAPK13 (p38-δ), y MAPK14 (p38-γ), siendo la p38-α la más estudiada. La proteína quinasa p38MAPK activa fosforila varias dianas celulares, tanto factores de transcripción (p53, STAT1, MEF y NF-B) como proteínas del citoesqueleto y otras quinasas. También se ha demostrado que p38MAPK fosforila y reduce los niveles de la proteína anti-apoptótica Bcl-xL y aumenta los niveles del factor de transcripción p53 [72], favoreciendo de esta manera la apoptosis. . 1.7. Fuentes de eupatorina, ensayos biológicos previos en células de cáncer y planteamiento de investigación. Las flavonas son miembros importantes de la familia de los flavonoides que se encuentran en frutas y verduras, y que han recibido un amplio interés por su potencial antioxidante y su capacidad para modular varios sistemas enzimáticos implicados en una serie de enfermedades [73]. Las flavonas son lipofílicas (debido a su esqueleto hidrocarbonado que contiene dos anillos aromáticos) así como Introducción 50 hidrofílicas (debido a la presencia del grupo carbonilo en C-4), presentando grupos polares en diferentes posiciones, y el esqueleto en sí es susceptible de generar grupos funcionales implicados en la modulación selectiva de diferentes enzimas. La eupatorina (3´,5-dihidroxi-4´,6,7-trimetoxiflavona) es una flavona que ha sido previamente aislada de varias plantas medicinales, entre ellas Tanacetum vulgare [74], Lantana montevidensis [75] y Orthosiphon stamineus [76], y se ha descrito la inhibición de la proliferación en líneas celulares de cáncer humano y murino [75]. El efecto anti-proliferativo de la eupatorina frente a las células de cáncer de mama humano MDA-MB-468 se ha atribuido al metabolismo mediado por los enzimas citocromos P450 CYP1 [77]. Sin embargo, la importancia potencial de la eupatorina en la terapia antitumoral en células de leucemia no se ha explorado aún. En el presente estudio hemos investigado los efectos de la eupatorina en tres líneas de leucemia humana, sus efectos sobre el ciclo celular y la apoptosis y el papel de las caspasas y la vía de las proteínas quinasas activadas por mitógenos (MAPK). Además, se investigó la formación de especies reactivas del oxígeno (ROS) para dilucidar si éstas juegan un papel fundamental en el efecto apoptótico de la eupatorina en células de leucemia. En este trabajo demostramos que la eupatorina induce parada del ciclo celular en la fase G2-M y muerte celular por apoptosis en células leucémicas humanas, implicando la activación de múltiples caspasas, la liberación de citocromo c mitocondrial y el procesamiento del enzima de reparación del ADN poli(ADP-ribosa) polimerasa. Esta flavona indujo la fosforilación de las proteínas quinasas activadas por mitógenos y la muerte celular fue atenuada por la inhibición de las proteínas Introducción 51 quinasas N-terminal de c-jun/proteínas quinasas activadas por estrés. En la presente Tesis Doctoral se describen las rutas de muerte celular desencadenadas por la eupatorina que implican tanto las vías intrínseca y extrínseca de activación de caspasas y la generación de las especies reactivas del oxígeno. OBJETIVOS Objetivos 55 OBJETIVOS 1. Analizar la citotoxicidad de la flavona natural eupatorina utilizando como modelo de estudio líneas celulares de leucemia humana. 2. Evaluar si la eupatorina induce muerte celular por apoptosis. 3. Investigar su mecanismo de acción. Específicamente la contribución de las cascadas de las caspasas, la ruta de señalización de las proteínas quinasas activadas por mitógenos y la generación e implicación de las especies reactivas del oxígeno. MATERIAL Y MÉTODOS Material y Métodos 64 3.4.2. Tinción con el fluorocromo trihidrocloruro de bisbencimida. El primer método utilizado para la evaluación de inducción de apoptosis utilizado fue la tinción con la sonda fluorescente Hoescht 33258. Se basa en la capacidad del fluorocromo para unirse al ADN, permitiendo visualizar la aparición de cambios morfológicos del núcleo, como son la segmentación nuclear y la condensación de la cromatina y su compactación a lo largo de la periferia nuclear. Este método permite cuantificar el porcentaje de células apoptóticas a través del contaje de un total de 500 células y aplicando el criterio de célula apoptótica (núcleo fragmentado y/o condensado). Para ello, una vez finalizados los tratamientos, las células (~5x105) se lavaron con PBS (10 mM fosfato sódico, 150 mM NaCl, pH 7,4) y se fijaron con 70 µl de paraformaldehído (3% en PBS) durante 10 minutos a temperatura ambiente. A continuación se centrifugaron (12.000 g, 1 minuto), se eliminó el paraformaldehído, se lavaron con PBS y las células se tiñeron con 20 µl de una disolución que contenía 20 µg/ml de bisbencimida (Hoechst 33258) en PBS durante 15 minutos a temperatura ambiente y en la oscuridad. Una alícuota (10 µl) se fijó en un porta y se analizó la morfología nuclear de 500 células con un microscopio de fluorescencia (Zeiss-Axiovert). Se consideraron células apoptóticas aquellas cuyos núcleos presentaron condensación de la cromatina, su compactación a lo largo de la periferia y/o la fragmentación nuclear en tres o más cuerpos apoptóticos [78]. 3.4.3. Fragmentación del ADN. La fragmentación del ADN es un método cualitativo basado en la detección de la fragmentación internucleosómica del ADN y visualización como una escalera discontinua de bandas multiméricas de 185-200 pares de bases, características del proceso apoptótico. Después de los tratamientos, las células (5 x 105 células/ml) se Material y Métodos 65 recolectaron por centrifugación (12.000 g, 1 minuto) y se lavaron dos veces con PBS frío. Las células se resuspendieron con 30 µl de tampón de lisis [50 mM Tris-HCl (pH 8,0), 10 mM EDTA, 0,5% SDS] y se incubaron sucesivamente con 1 µg/µl de RNasa A (1 hora a 37 ºC) y con 1 µg/ µl de Proteinasa K (1 h a 50 ºC). Se añadió a cada muestra 2 µl de azul bromofenol (0,25%) y el ADN se extrajo con 100 µl de una mezcla fenol:cloroformo:alcohol isoamílico (24:24:1). Las muestras se centrifugaron (12.000 g, 1 min.) a temperatura ambiente y la fase acuosa se lavó nuevamente con 100 µl de cloroformo. A las muestras se les añadió 5 µl de tampón de carga (10 mM EDTA, pH 8,0, conteniendo 1% (p/v) de agarosa de bajo punto de fusión y 40% de sacarosa) y se incubaron a 70 ºC durante 5-10 minutos. Finalmente 30 µl de cada muestra se sometieron a electroforesis (5 V/cm) durante 3-4 h en geles de agarosa al 1,8%. Los geles se tiñeron con bromuro de etidio (1 µg/ml durante 20 min), los fragmentos de ADN se visualizaron a 260 nm en un transiluminador y la imagen se capturó con una cámara digital (DC290, Kodak) y se analizó con el software Quantity One (Bio-Rad, Hercules, EE.UU.). 3.4.4. Cuantificación de células hipodiploides por citometría de flujo. Cuantificación de la fracción SubG1, G1, S y G2/M mediante el análisis del contenido en ADN. Esta técnica permite distinguir las células en las diferentes etapas del ciclo celular en función de la cantidad de ADN. Se trata de un método cuantitativo basado en la fluorescencia emitida por diferentes fluorocromos capaces de unirse al ADN (Ej. yoduro de propidio). Se puede detectar el porcentaje de células en cada fase del ciclo celular en función de su contenido en ADN. Las células en fase G1 forman el Material y Métodos 66 primer pico, en la fase S las células están sintetizando ADN y en fase G2/M las células presentan el doble de contenido en ADN que una célula normal y aparecerán como un segundo pico. Las células que contienen ADN hipodiploide (menor contenido de ADN que el contenido diploide de las células normales) son consideradas apoptóticas, y se localizan a la izquierda del pico G1 constituyendo la fracción SubG1 [78]. Después de los tratamientos, las células se lavaron con PBS frío y se fijaron durante al menos una hora en etanol al 70 %, a −20 ºC. A continuación se lavaron dos veces con PBS, se centrifugaron a 500 g durante 10 minutos y se incubaron (1 h a 37 ºC en oscuridad) con 1 ml de PBS conteniendo 100 µg/ml de RNasa A y 50 µg/ml de yoduro de propidio. La sonda fue excitada a 488 nm y la fluorescencia emitida por el complejo propidio-ADN (617 nm) se determinó en un citómetro FACS Verse (BD) usando el detector FL3 (620±15 nm). Se analizaron 10.000 células en cada muestra y los resultados se analizaron con el software Flowing (Turku Centre of Biotechnology, Universidad de Turku, Finlandia) [81]. 3.4.5. Determinación de las células apoptóticas mediante el análisis de la externalización de fosfatidilserina. La doble tinción con anexina V-FITC (isotiocianato de fluoresceína) y yoduro de propidio permite la cuantificación de células apoptóticas y necróticas. La fosfatidilserina es un fosfolípido que normalmente se encuentra en la cara interna de la membrana plasmática y se transloca a la cara externa de dicha membrana en los estadíos tempranos del proceso de apoptosis. La proteína anexina V se une a fosfatidilserina en presencia de Ca2+ y permite detectar las células apoptóticas por Material y Métodos 67 citometría de flujo, previa incubación de las células con anexina V unida a un fluorocromo (FITC, isotiocianato de fluoresceína) [28]. A partir de los histogramas obtenidos por citometría de flujo se pueden cuantificar los porcentajes de: (i) células viables, no unen anexina V y excluyen yoduro de propidio, (ii) células en apoptosis temprana, unen anexina V y excluyen yoduro de propidio, (iii) células en apoptosis tardía, unen anexina V e incorporan yoduro de propidio y (iv) células necróticas, unen anexina V e incorporan yoduro de propidio, o sólo incorporan yoduro de propidio. Las células (1x106 por muestra) una vez tratadas se lavaron con PBS frío, y se resuspendieron en 10 mM HEPES/NaOH, pH 7,4, 140 mM NaCl, 2,5 mM CaCl2. Se transfirieron 100 µl de la suspensión (1 x 105 células) a un tubo de cultivo de 5 ml, y se le añadió 5 µl de anexina V-FITC y 5 µl de yoduro de propidio. Se mezcló suavemente y las células se incubaron durante 15 minutos a temperatura ambiente (25 °C) en la oscuridad. Se añadió 400 µl del anterior tampón a cada tubo y se analizó cada muestra por citometría de flujo. Cuando las células en cultivo sufren apoptosis, al no poder ser fagocitadas, sufren necrosis secundaria al proceso apoptótico, por lo que puede aumentar el número de células que dan positivo a yoduro de propidio. 3.4.7. Determinación de la actividad caspasa. La actividad caspasa se evaluó midiendo la rotura proteolítica de los sustratos cromogénicos específicos Los sustratos colorimétricos específicos utilizados en el ensayo para la actividad caspasa-3/-7, la actividad caspasa-6, la actividad caspasa-8 y la actividad caspasa-9 fueron respectivamente Ac-DEVD-pNA (N-acetil-Asp-GluVal-Asp-p-nitroanilina), Ac-VEID-pNA (N-acetil-Val-Glu-Ile-Asp-p-nitroanilina), Material y Métodos 68 Ac-IETD-pNA (N-acetil-Ile-Glu-Thr-Asp-p-nitroanilina) y Ac-LEHD-pNA (Nacetil-Leu-Glu-His-Asp-p-nitroanilina). Para ello, las células tratadas se centrifugaron a 1.000 g durante 5 min a 4 °C, se lavaron con PBS y se incubaron en hielo. Las células se resuspendieron en tampón de lisis (50 mM HEPES, pH 7,4, 1 mM ditiotreitol, 0,1 mM EDTA, 0,1% Chaps) y se incubaron 5 min en hielo. Las células se lisaron usando una aguja 21G, se centrifugaron durante 10 min at 16.000 g a 4 °C, se determinó la concentración de proteínas en los sobrenadantes mediante el método de Bradford [82] y se almacenaron a −20 °C hasta que se usaron para el estudio de la actividad enzimática de las caspasas. Se utilizó una cantidad equivalente de proteínas de los diferentes tratamientos (~20 µg). El incremento de la absorbancia a 405 nm después de la incubación a 37 °C durante 1 hora fue indicativo de la actividad enzimática de las caspasas. 3.4.8. Inmunodetección de proteínas. Transferencia Western. Las células (1-10 x 106) se incubaron en medio de cultivo con los productos de interés durante distintos tiempos a 37 ºC. A continuación se recolectaron por centrifugación (500 g, 10 minutos, 4 ºC) y se lavaron dos veces con PBS. Obtención del lisado celular total: El precipitado celular se resuspendió en 100 µl de tampón de lisis [Tris-HCl (pH 7,4), 2 mM EDTA, 137 mM NaCl, 10% glicerol, 1% Triton X-100, 2 mM de pirofosfato de sodio, 20 mM glicerofosfato de sodio, 10 mM NaF, 2 mM ortovanadato sódico, 1 mM PMSF, leupeptina (5 µg/ml), aprotinina (5 µg/ml) y pepstatina A (5 µg/ml)] y se incubó durante 15 min a 4 ºC. Los lisados se sonicaron (cuatro ciclos de cinco segundos) y se centrifugaron a 11,000 x g Material y Métodos 69 durante 10 min a 4 ºC. El precipitado resultante (membranas y demás restos celulares) se descartó, mientras el sobrenadante se analizó [78,79]. Fraccionamiento subcelular: El precipitado celular ( 107 células) se resuspendió en 100 µl de tampón de homogeneización [20 mM HEPES-KOH (pH 7,5), 10 mM KCl, 1,5 mM MgCl2, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1 mM DTT, 250 mM sacarosa] con inhibidores de proteasas (0,1 mM PMSF, 10 µg/ml de leupeptina, 10 µg/ml aprotinina y 10 µg/ml pepstatina A), y se incubó durante 15 min a 4 ºC. Las células se lisaron usando una aguja de 21G y el extracto resultante se centrifugó a 1.000 x g durante 5 min a 4 ºC. El precipitado (fracción nuclear) se resuspendió en 100 µl de tampón de homogeneización y se sonicó 3 veces durante 10 segundos a 4 ºC. El sobrenadante resultante se centrifugó a 22.000 x g durante 20 minutos a 4 ºC. El precipitado (fracción mitocondrial) se resuspendió en 50 µl de tampón de homogeneización mientras que el sobrenadante fue utilizado como fracción citosólica. Las diferentes fracciones se congelaron a −20 ºC hasta su utilización [78]. La pureza de las fracciones mitocondriales y citosólicas se determinaron utilizando anticuerpos contra citocromo c oxidasa y -actina, respectivamente. La concentración de proteínas se determinó por el método de Bradford, y todas las muestras se ajustaron a la misma concentración utilizando el tampón anterior. Los lisados celulares se hirvieron en tampón de electroforesis [50 mM TrisHCl (pH 6,8), 15% sacarosa, 2 mM EDTA, 3% SDS, 5 mM β-mercaptoetanol y 0,01% azul de bromofenol] a 100 ºC durante 5 min [78]. Las muestras se sometieron a electroforesis en un gel de poliacrilamida (del 7,5% al 15%, dependiendo del peso molecular de la proteína a estudiar) conteniendo 0,1% SDS y se transfirieron a membranas de PVDF. Las membranas se bloquearon Material y Métodos 70 con 10% de leche desnatada en tampón TBST [20 mM Tris-HCl (pH 7,5), 137 mM NaCl, 0,1 % Tween-20] durante 1 h a temperatura ambiente (o toda la noche a 4 ºC), seguido de una incubación con el anticuerpo específico. Los anticuerpos utilizados en este estudio se diluyeron en TBST conteniendo 3% de leche desnatada y las membranas se incubaron en presencia del anticuerpo de interés, durante 24 h con agitación suave y a 4 ºC. Las membranas se lavaron con TBST tres veces durante 15 min cada vez y se incubaron con el anticuerpo secundario apropiado durante 1 h a temperatura ambiente. Finalmente las membranas se lavaron nuevamente con TBST en las mismas condiciones anteriores y la detección de las proteínas específicas se determinó por emisión de quimioluminiscencia, utilizando un kit comercial y posterior exposición de las membranas sobre películas de autorradiografía. Las imágenes fueron capturadas con un escáner y analizadas con el programa Adobe Photoshop 7.0. Como control de que se ha cargado y transferido la misma cantidad de proteínas, las distintas muestras se analizaron con un anticuerpo específico anti-βactina. 3.4.9. Determinación de la generación de especies reactivas de oxígeno intracelular. La generación de peróxidos y de anión superóxido intracelular se determinó por citometría de flujo usando las sondas diacetato 2´,7´-diclorodihidrofluoresceína (H2-DCFDA) y dihidroetidio (DHE), respectivamente. La sonda H2-DCF-DA se incorpora a las células y se desacetila por esterasas intracelulares generando el compuesto no fluorescente 2´,7´-diclorodihidrofluoresceína (H2-DCF). Las sondas H2-DCF y DHE se oxidan por el H2O2 (y por otros peróxidos) y por los aniones superóxido, respectivamente, para generar los compuetos altamente fluorescentes Material y Métodos 71 2´,7´-diclorofluoresceína (DCF) y etidio. La intensidad de la fluorescencia de DCF y del etidio es proporcional a la cantidad de peróxidos y superóxido, respectivamente, producidas por las células. Las células se trataron con o sin eupatorina y posteriormente se añadió H2-DCF-DA (2 M) o DHE (2 M) al medio de cultivo 30 min antes de la finalización de la incubación con eupatorina. Las células se lavaron con PBS y la fluorescencia emitida por DCF (525 nm) y DHE (568 nm) se determinó por citometría de flujo. 3.5. Métodos estadísticos. En todos los casos las determinaciones para cada grupo experimental se realizaron por triplicado o cuadruplicado, y los valores representados se corresponden a datos de tres experimentos como mínimo (Media ± S.E.M). La comparación entre los distintos tratamientos se realizó por el método de la t de Student o análisis de la varianza, considerando significativos los valores de P < 0,05. RESULTADOS Evaluación de la actividad antiproliferativa de la eupatorina Resultados 80 4.3. La muerte celular inducida por eupatorina es dependiente de caspasas Para explorar el papel de las caspasas, las células se trataron con concentraciones crecientes de eupatorina durante 24 h y las caspasas se determinaron por transferencia Western. Los resultados indican que este compuesto estimula el procesamiento de las pro-caspasas-9 y -8 iniciadoras y el procesamiento proteolítico de las procaspasas ejecutoras -3, -6 y -7 (Figura 11). La proteína poli(ADP-ribosa) polimerasa (PARP), uno de los sustratos de la caspasa-3, fue procesada generando un fragmento de 85 kDa en células expuestas a eupatorina. También se observa una disminución de la pro-caspasa-4, sugiriendo que la eupatorina induce el procesamiento de este zimógeno que está implicado en el estrés del retículo endoplasmático [83]. Para conocer si la apoptosis inducida por la eupatorina implica la liberación del citocromo c mitocondrial, se analizaron las preparaciones citosólicas y se observó un aumento significativo en los niveles de citocromo c en el citosol después del tratamiento con 1 M (MOLT-3) o 3 M (HL-60 y U-937) de eupatorina. Además, la eupatorina también indujo la liberación de otras proteínas mitocondriales al citosol, tales como el factor inductor de apoptosis (AIF) y Smac/DIABLO. Puesto que las mitocondrias son importantes en las rutas de señalización que conducen a la apoptosis y puesto que esta ruta de muerte celular está regulada por la familia de proteínas Bcl-2, seguidamente se investigaron si los cambios en la expresión o en la localización de estas proteínas estaban asociados con la muerte celular. El tratamiento de las células HL-60 y MOLT-3 con eupatorina a concentraciones suficientes para inducir apoptosis disminuyó la expresión de la Resultados 81 proteína Bcl-2, mientras que en células U-937 el tratamiento con 3 M de eupatorina indujo el procesamiento de la proteína Bcl-2. Sin embargo, en células no tratadas la proteína Bax se localizó predominantemente en la fracción citosólica y la incubación con eupatorina indujo una redistribución de este factor pro-apoptótico desde el compartimento citosólico al mitocondrial. Curiosamente, un fragmento de 18 kDa generado a partir de la proteína completa Bax de 22 kDa se detectó solamente en las células HL-60 tratadas con el flavonoide. Para explorar si la eupatorina conduce a la activación de Bid, se analizó los niveles y/o el procesamiento de esta proteína solo BH3 que media la liberación de citocromo c de la mitocondria inducida por caspasa-8 en respuesta a la activación de receptores de muerte de la superficie celular. Los experimentos demostraron una disminución de los niveles de la proteína Bid en las células HL-60 y MOLT-3, presumiblemente reflejando procesamiento o activación. Aunque no hubo un claro procesamiento de Bid en las células U-937, la pro-caspasa8 disminuyó significativamente evidenciado por la disminución en la cantidad de la pro-enzima de 55-57 kDa. Para confirmar que la muerte celular desencadenada por la eupatorina requiere la activación de las caspasas, las células HL-60 y MOLT-3 se trataron con eupatorina en presencia o ausencia del inhibidor general de caspasas zVAD-fmk, y posteriormente se determinó la extensión de apoptosis. Los resultados (Figura 12) muestran una reducción significativa en el porcentaje de células hipodiploides en presencia del inhibidor general de caspasas, lo que sugiere que la eupatorina induce apoptosis por un mecanismo dependiente de caspasa. Resultados 82 MOLT-3 46 35-37 55-57 35 32 36 18-20 116 85 34 15 HL-60 U-937 42-44 22 22 42 22 22 PARP Pro-caspasa 8 Pro-caspasa 7 Pro-caspasa 6 Pro-caspasa 3 Citocromo c Pro-caspasa 9 Fragmento AIF Bax (citosol) Bid Bcl-2 Bax (mitocondria) Smac Pro-caspasa 4 -Actina 67 26 43 Eupatorina (M) (kDa) 0 1 3 10 0 1 3 10 0 1 3 10 17 Cox IV (mitocondria) Figura 11. Implicación de las caspasas en la apoptosis inducida por la eupatorina en células leucémicas humanas. Las células se incubaron en presencia de las indicadas concentraciones de eupatorina y los lisados celulares (o los extractos citosólicos en el caso de citocromo c, AIF y Smac) se ensayaron por transferencia Western. La - actina y la Cox IV (citocromo c oxidasa) se usaron como controles de carga en el citosol y en la mitocondria, respectivamente. Resultados 83 Figura 12. Efecto del inhibidor permeable general de caspasas z-VAD-fmk sobre la apoptosis inducida por la eupatorina. Las células HL-60 y MOLT-3 se incubaron con 10 M de eupatorina durante 24 h, en ausencia o presencia de z-VAD-fmk (100 M) y las células apoptóticas (es decir, con ADN hipodiploide) se cuantificaron por citometría de flujo después de la tindión con yoduro de propidio. * indica P < 0,05 por comparación con el control no tratado, # indica P < 0,05 por comparación con el tratamiento con la eupatorina sola. Dado que el procesamiento de las caspasas no siempre se correlaciona con la actividad, también se investigaron las actividades enzimáticas. Tal como se muestra (Figura 13A), la estimulación de las actividades caspasa-3/7, caspasa-8 y caspasa-9 aumentó en presencia de eupatorina después de 24 h de tratamiento y este efecto fue dependiente de la concentración. Para estudiar la cinética de activación de las caspasas, las células se trataron con esta flavona y después se recogieron en varios intervalos. El aumento de las actividades de las caspasas iniciadoras, caspasa-8 y -9, fue significativamente detectable a las 6 h (MOLT-3) o a las 12 h (HL-60 y U-937) de tratamiento (Figura 13B). Estos hallazgos indican que la eupatorina activa Resultados 84 simultáneamente a las caspasas-8 y -9 y también promueve una marcada activación de las caspasas-3/7, mientras que la caspasa-6 ejecutora mostró un menor grado de activación. 0 3 HL-60 1 Caspasa-8 Caspasa-9 Caspasa-6 Caspasa-3/7 B 2 0 Actividad Caspasa (u.a.) 1 2 3 4 5U937 Tiempo (h) 0 6 12 24 0 MOLT-3 1 2 3 4 6 4 * **** * * ** * * * * * * * * * * * * * * * * 0 1 2 3 HL-60 ** *** * Caspasa-8 Caspasa-9 Caspasa-6 Caspasa-3/7 A Actividad Caspasa (u.a.) 0 1 2 3 4 5U937 * * * * * * * * * Eupatorina (M) 0 1 3 10 0 MOLT-3 2 4 6 * * * * * ** * ** 1 3 5 7 6 4 * * * Figura 13. Dependencia de la concentración y cinéticas de la activación de caspasas en respuesta a eupatorina en células leucémicas humanas. (A) Activación de las caspasas en respuesta a eupatorina. Las células se trataron con la concentración indicada de eupatorina y se recolectaron a las 24 h. Los lisados celulares se ensayaron para determinar las actividades caspasa-9, caspasa-8, caspasa-6 y caspasa-3/7 usando los sustratos colorimétricos Ac-LEHD-pNA, Ac-IETD-pNA, Ac-VEID-pNA y AcDEVD-pNA, respectivamente. Los valores representan el aumento de la actividad caspasa respecto al control no tratado. (B) Cinéticas de activación de las caspasas en Resultados 85 respuesta a eupatorina. Las células se trataron con 3 M de eupatorina, se recolectaron a los tiempos indicados, y los lisados celulares se ensayaron y los resultados se expresan como el aumento de la actividad caspasa respecto al control no tratado. * indica P<0,05 por comparación con el control no tratado. 4.4. La eupatorina activa a las proteínas quinasas activadas por mitógenos (MAPKs) Dado que las MAPKs desempeñan un papel esencial en la proliferación celular y la apoptosis, los efectos de la eupatorina en la activación de estas proteínas quinasas se investigaron en células HL-60. Los resultados muestran una fosforilación rápida (1-2 h) de ERK 1/2 y de JNK / SAPK que permanecieron aumentadas durante al menos 8 h, mientras que no se detectó la activación de p38MAPK (Figura 14). 3 M Eupatorina 42-44 57 46 57 46 42-44 42 38 38 1 40 2 86 Tiempo (h) 1 40 2 86 10 M Eupatorina kDa P-ERK 1/2 P-JNK JNK ERK 1/2 p38 P-p38 -Actina Figura 14. La eupatorina induce la fosforilación de las proteínas quinasas activadas por mitógenos (MAPKs). Las células HL-60se trataron con la concentración indicada Resultados 86 de eupatorina durante los tiempos especificados y los lisados celulares se ensayaron para determinar la fosforilación de las MAPKs por transferencias Western. Para determinar la posible implicación de las MAPKs en la apoptosis inducida por eupatorina, se investigó el efecto de inhibidores específicos de las proteínas quinasas activadas por mitógenos extracelulares 1/2 (MEK1 / 2) (PD98059 y U0126), p38MAPK (SB203580) y JNK / SAPK (SP600125). Ni la inhibición de las quinasas activadas por mitógenos extracelulares 1/2 (MEK1/2), ni la inhibición de p38MAPK afectó a la muerte celular inducida por eupatorina. Sin embargo, el tratamiento de las células con el inhibidor de JNK / SAPK redujo significativamente la apoptosis mediada por eupatorina (Figura 15). 0 10 20 Células hipodiploides (%) * # 25 15 5 Inhibidor Eupatorina - - + + + + + U0 PD SB SP Figura 15. Efecto de los inhibidores de la vía de MAPKs sobre la apoptosis inducida por la eupatorina. Las células se pretrataron con U0126 (U0, 10 M), PD98059 (PD, 10 M), SB203580 (SB, 2 M) y SP600125 (SP, 10 M) durante 1 h y después se incubaron con eupatorina durante 24 h y las células hipodiploides se cuantificaron por citometría de flujo. * indica P<0,05 por comparación con el control no tratado, # indica P < 0,05 por comparación con el tratamiento con eupatorina sola. Resultados 87 4.5. Las especies reactivas del oxígeno están implicadas en la muerte celular inducida por eupatorina Las especies reactivas del oxígeno (ROS) se consideran los principales mediadores de la señalización de apoptosis y el aumento de las concentraciones intracelulares pueden dar lugar a la activación de proteínas quinasas activadas por mitógenos y la muerte celular. Para verificar si las ROS están involucrados en la apoptosis inducida por eupatorina, las células se tiñeron con las sondas de 2´,7´- diacetato diclorodihidrofluoresceína (H2-DCFDA) y dihidroetidio (DHE) y después se analizaron por citometría de flujo. DCF DHE Número de células HL-60 Control Eupatorina Control Eupatorina MOLT-3 Control Eupatorina Control Eupatorina Fluorescencia Figura 16. La eupatorina induce la generación de las especies reactivas del oxígeno. (A) Las células HL-60 y MOLT-3 se incubaron con 10 M eupatorina durante 24 h y 6 h, respectivamente, y la fluorescencia de las sondas oxidadas H2DCF o DHE se determinó por citometría de flujo. Como se muestra en la Figura 16 y 17A, el tratamiento con la eupatorina aumenta la fluorescencia derivada de DCF en las células HL-60 y en MOLT-3 lo que sugiere que la generación de H2O2 y otros peróxidos se vió afectada por eupatorina Resultados 88 en ambas líneas celulares. Se observó un incremento de 2,4 veces y de 1,8 veces en la fluorescencia derivada de DCF en las células HL-60 y en MOLT-3, respectivamente. Para valorar la producción de anión superóxido, las células se incubaron con DHE, una sonda fluorescente que es relativamente específica para el anión superóxido y que reacciona sólo mínimamente con peróxido de hidrógeno. La eupatorina aumentó la fluorescencia derivada de DHE (aproximadamente 2 veces) en células HL-60. Por el contrario, no se observaron cambios en la fluorescencia derivada de DHE en células MOLT-3 tratadas con eupatorina. Figura 17. La eupatorina induce la generación de las especies reactivas del oxígeno y los antioxidantes bloquean la muerte celular. (A) Las células MOLT-3 se incubaron con eupatorina durante 6 h y la fluorescencia derivada de H2-DCF se determinó por citometría de flujo. (B) Las células MOLT-3 se preincubaron con Nacetil-L-cisteína (NAC, 10 mM), trolox (2 mM) y vitamina E (25 M) durante 1 h y después se incubaron con eupatorina (10 M) durante 24 h y las células apoptóticas Resultados 89 se cuantificaron por citometría de flujo. Los valores representan medias  errores estándar de dos experimentos independientes, cada uno realizado por triplicado. * indica P < 0,05 por comparación con el control no tratado, # indica P < 0,05 por comparación con el tratamiento con eupatorina sola. Para investigar si se requiere la producción de ROS para la muerte celular inducida por eupatorina, las células MOLT-3 se preincubaron con 10 mM de Nacetil-L-cisteína (NAC), 25 M α-tocoferol (vitamina E) y 2 mM trolox, derivado hidrosoluble de la vitamina E. Los resultados demuestran que estos antioxidantes bloquean significativamente la apoptosis, lo que indica que la generación de ROS juega un papel importante en el mecanismo de la muerte celular provocada por eupatorina (Figura 17B). Discusión 96 por presentar una mayor eficacia que la proteína completa en promover el aumento de la permeabilidad de la membrana externa mitocondrial [93]. La caspasa-8 activa induce la escisión de Bid y la translocación de Bid truncado a la mitocondria aumenta la permeabilidad mitocondrial, lo que conduce a la liberación de factores proapoptóticos mitocondriales [94]. En este trabajo hemos encontrado que la eupatorina indujo una disminución (MOLT-3) o una escisión (HL60) de la proteína Bid. Aunque en la mayoría de los casos la proteína Bid truncada parece ser necesaria para inducir un aumento de la permeabilidad de la membrana externa mitocondrial, también se ha sugerido que la proteína completa Bid desempeña un posible papel pro-apoptótico [95,96]. La eupatorina también estimuló el procesamiento proteolítico y la activación de otras caspasas ejecutoras, tales como la caspasa-6 y la caspasa-7, que podrían cooperar con la caspasa-3 para inducir la muerte celular. Por otra parte, la vía de señalización de estrés del retículo endoplasmático podría estar implicada ya que la eupatorina también indujo el procesamiento de la pro-caspasa-4. Las proteínas quinasas activadas por mitógenos (MAPK) regulan la proliferación celular, la diferenciación y la apoptosis. Dos miembros de esta familia, c-Jun N-terminal quinasas / proteínas quinasas activadas por estrés (JNK / SAPK) y p38MAPK juegan un papel esencial en el desencadenamiento de la muerte celular en respuesta a diversos factores de estrés, incluyendo el estrés oxidativo. Discusión 97 En el presente estudio, mostramos que la fosforilación de JNK / SAPK se produjo después de 1-2 h de tratamiento con eupatorina y la fosforilación permaneció elevada durante al menos 8 h y que la inhibición de esta quinasa por SP600125 disminuye significativamente la muerte celular inducida por eupatorina. Estos resultados sugieren que JNK / SAPK se requiere al menos en parte, para la muerte celular. La eupatorina también estimuló la activación de la vía MEK / ERK 1/2 pero la combinación de este flavonoide y los inhibidores específicos de las quinasas activadas por mitógenos extracelulares (MEK) 1/2 PD98059 y U0126 ni atenuaron ni potenciaron la muerte celular. La señalización p38MAPK no parece ser necesaria para la apoptosis inducida por la eupatorina ya que no hay una clara activación / fosforilación de p38MAPK y el inhibidor de p38MAPK SB203580 no atenuó la apoptosis. Se ha descrito que las especies reactivas del oxígeno (ROS) pueden actuar como segundos mensajeros en varias vías de señalización, incluyendo la muerte celular apoptótica y necrótica [97]. El efecto antiproliferativo de la eupatorina está asociado con un aumento en la concentración intracelular de ROS, que parecen jugar un papel crucial en el proceso de apoptosis ya que diferentes antioxidantes bloquearon parcialmente la muerte celular. En resumen, los resultados del presente estudio indican que la eupatorina induce la muerte celular en líneas celulares de leucemia humana a concentraciones Discusión 98 que podrían ser alcanzados in vivo. La eupatorina induce citotoxicidad a través de un mecanismo que implica detención del ciclo celular en la fase G2-M y apoptosis. Esta modalidad de muerte celular es dependiente de caspasa, está asociada con la liberación del citocromo c, y es dependiente de la generación de las especies reactivas del oxígeno. La eupatorina induce la activación de la vía de las proteínas quinasas activadas por mitógenos y la activación de las proteínas c-Jun N-terminal quinasas / proteínas quinasas activadas por estrés (JNK / SAPK) es esencial para la muerte celular. Estos resultados proporcionan una base para evaluar las posibles aplicaciones de la eupatorina y / o compuestos estructuralmente similares en la lucha contra el cáncer. CONCLUSIONES 101 CONCLUSIONES 1. La flavona natural eupatorina induce muerte celular en tres líneas celulares de leucemia humana a concentraciones que podrían ser alcanzadas in vivo. 2. La eupatorina inhibe la viabilidad celular sin diferencias significativas en las tres líneas celulares presentando valores de IC50 de  5 µM. 3. La citotoxicidad inducida por eupatorina fue precedida por la detención del ciclo celular en la fase G2-M. 4. La muerte celular desencadenada por la eupatorina es dependiente de caspasas. La ausencia de un bloqueo total de la muerte celular inducida por el inhibidor general de caspasas z-VAD-fmk sugiere la existencia de otras rutas de inducción de muerte adicionales. 5. La eupatorina induce una activación simultánea de las caspasas iniciadoras caspasas-8 y -9 y también promueve una marcada activación de las caspasas ejecutoras -3 y -7. 6. La muerte celular inducida por la eupatorina está asociada con la liberación de las proteínas mitocondriales citocromo c, Smac/DIABLO y AIF (factor inductor de apoptosis). 7. La eupatorina disminuye la expresión de la proteína anti-apoptótica Bcl-2 en HL-60 y MOLT-3 o induce su procesamiento en U-937. 8. La eupatorina induce la activación de la vía de las proteínas quinasas activadas por mitógenos. 9. La activación de las proteínas c-Jun N-terminal quinasas / proteínas quinasas activadas por estrés (JNK / SAPK) es esencial para la muerte celular. 10. La muerte celular inducida por la eupatorina es dependiente de la generación de las especies reactivas del oxígeno. BIBLIOGRAFÍA Bibliografía 105 BIBLIOGRAFÍA 1. IUPAC Compendium of Chemical Terminology, 1995, p. 1335. 2. Middleton E Jr, Kandaswami C, Theoharides TC. The effects of plant flavonoids on mammalian cells: implications for inflammation, heart disease, and cancer. Pharmacol Rev. 2000; 52:673-751. 3. Newman DJ, Cragg GM. Natural Products as Sources of New Drugs from 1981 to 2014. J Nat Prod. 2016; 79:629-661 4. J. B. Harborne JB, Williams CA. Advances in flavonoid research since 1992. Phytochemistry 2000; 55:481–504. 5. Geahlen RL, Koonchanok NM, Mclaughlin JL, Pratt DE. Inhibition of protein-tyrosine kinase activity by flavonoids and related compounds. J Nat Prod 1989; 52:982–986. 6. Bandele OJ, Osheroff N. Bioflavonoids as poisons of human topoisomerase II alpha and II beta. Biochemistry 2007; 46:6097–7108. 7. Austin CA, Patel S, Ono K, Nakane H, Fisher LM. 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Indicios de calidad: A) Base de datos de indexación: Journal Citation Reports B) Año: 2014 C) Indice de impacto: 3,534 D) Posición que ocupa en la categoría: 8 de 55 E) Categoría: Multidisciplinary Sciences. En la presente Tesis Doctoral se describen los efectos de la flavona natural eupatorina sobre la viabilidad celular de tres líneas de leucemia humana y se aportan evidencias sobre su mecanismo de acción. Este compuesto induce parada del ciclo celular en la fase G2-M y muerte celular por apoptosis implicando la activación de múltiples caspasas, la liberación de citocromo c mitocondrial y el procesamiento del enzima de reparación del ADN poli(ADP-ribosa) polimerasa. Esta flavona activa la cascada de las proteínas quinasas activadas por mitógenos y la muerte celular es atenuada por la inhibición de las proteínas quinasas N-terminal de c-jun/proteínas quinasas activadas por estrés. Las vías de señalización de muerte celular desencadenadas por la eupatorina implican las vías intrínseca y extrínseca de activación de caspasas y la generación de las especies reactivas del oxígeno.