Ensayos de inmunización en pequeños rumiantes con proteinasas tipo cisteína de vermes adultos de Haemonchus contortus: implicaciones en la variabilidad genética del parásito

UNIVERSIDAD DE LAS PALMAS DE GRAN CANARIA UNIVERSIDAD DE LAS PALMAS DE GRAN CANARIAUNIVERSIDAD DE LAS PALMAS DE GRAN CANARIA UNIVERSIDAD DE LAS PALMAS DE GRAN CANARIA FACULTAD DE VETERINARIA FACULTAD DE VETERINARIAFACULTAD DE VETERINARIA FACULTAD DE VETERINARIA Departamento de Patología Animal, Producción Animal, Bromatología y Tecnología de los Alimentos “ ““ “ENSAYOS DE INMUNIZACIÓN EN PEQUEÑOS RUMIANTES ENSAYOS DE INMUNIZACIÓN EN PEQUEÑOS RUMIANTES ENSAYOS DE INMUNIZACIÓN EN PEQUEÑOS RUMIANTES ENSAYOS DE INMUNIZACIÓN EN PEQUEÑOS RUMIANTES CON CON CON CON PROTEINASAS PROTEINASAS PROTEINASAS PROTEINASAS TIPO CISTEÍNA DE VER TIPO CISTEÍNA DE VERTIPO CISTEÍNA DE VER TIPO CISTEÍNA DE VERMES ADULTOS DE MES ADULTOS DE MES ADULTOS DE MES ADULTOS DE HAEMONCHUS CONTORTUS HAEMONCHUS CONTORTUSHAEMONCHUS CONTORTUS HAEMONCHUS CONTORTUS : : : : IMPLICACIONES EN LA VARIABILIDAD GENÉTICA DEL PARÁSITO IMPLICACIONES EN LA VARIABILIDAD GENÉTICA DEL PARÁSITOIMPLICACIONES EN LA VARIABILIDAD GENÉTICA DEL PARÁSITO IMPLICACIONES EN LA VARIABILIDAD GENÉTICA DEL PARÁSITO” ”” ” TESIS DOCTORAL TESIS DOCTORALTESIS DOCTORAL TESIS DOCTORAL Presentada por: Sergio Martín Martel Sergio Martín MartelSergio Martín Martel Sergio Martín Martel Dirigida por: Dr. Antonio Ruiz Reyes Antonio Ruiz Reyes Antonio Ruiz Reyes Antonio Ruiz Reyes y Dr. José Manuel Molina Caballero José Manuel Molina Caballero José Manuel Molina Caballero José Manuel Molina Caballero Dr. Antonio Ruiz Reyes Dr. Antonio Ruiz Reyes Dr. Antonio Ruiz Reyes Dr. Antonio Ruiz Reyes Dr. José Manuel Molina Caballero Dr. José Manuel Molina Caballero Dr. José Manuel Molina Caballero Dr. José Manuel Molina Caballero D. Sergio Martín Martel D. Sergio Martín Martel D. Sergio Martín Martel D. Sergio Martín Martel Arucas, Arucas, Arucas, Arucas, mayo 2010 mayo 2010mayo 2010 mayo 2010 D. Antonio Ruiz Reyes Antonio Ruiz ReyesAntonio Ruiz Reyes Antonio Ruiz Reyes y D. José Manuel Molina Caballero José Manuel Molina CaballeroJosé Manuel Molina Caballero José Manuel Molina Caballero , Profesores Titulares del Área de Parasitología del Departamento de Patología Animal, Producción Animal, Bromatología y Tecnología de los Alimentos de la Universidad de Las Palmas de Gran Canaria. INFORMAN INFORMANINFORMAN INFORMAN: Que D. Sergio Martín Martel, Licenciado en Veterinaria, ha realizado bajo nuestra dirección y asesoramiento el presente trabajo titulado: “ “ “ “ENSAYOS DE INMUNIZACIÓN EN PEQUEÑOS RUMIANTES CON ENSAYOS DE INMUNIZACIÓN EN PEQUEÑOS RUMIANTES CON ENSAYOS DE INMUNIZACIÓN EN PEQUEÑOS RUMIANTES CON ENSAYOS DE INMUNIZACIÓN EN PEQUEÑOS RUMIANTES CON PROTEINASAS TIPO CISTEÍNA DE VERMES ADULTOS DE PROTEINASAS TIPO CISTEÍNA DE VERMES ADULTOS DE PROTEINASAS TIPO CISTEÍNA DE VERMES ADULTOS DE PROTEINASAS TIPO CISTEÍNA DE VERMES ADULTOS DE HAE HAEHAE HAEMONCHUS MONCHUS MONCHUS MONCHUS CONTORTUS CONTORTUSCONTORTUS CONTORTUS : IMPLICACIONES EN LA VARIABILIDAD GENÉTICA DEL : IMPLICACIONES EN LA VARIABILIDAD GENÉTICA DEL : IMPLICACIONES EN LA VARIABILIDAD GENÉTICA DEL : IMPLICACIONES EN LA VARIABILIDAD GENÉTICA DEL PARÁSITO PARÁSITOPARÁSITO PARÁSITO” ”” ” El cual consideramos cumple la normativa vigente para optar al Grado de Doctor en Veterinaria. Arucas, 17 de marzo de 2010 Los Directores Dr. Antonio Ruiz Reyes Antonio Ruiz ReyesAntonio Ruiz Reyes Antonio Ruiz Reyes Dr. José Manuel Molina Caballero José Manuel Molina CaballeroJosé Manuel Molina Caballero José Manuel Molina Caballero “ Daría todo lo que sé por la mitad de lo que ignoro ”. René Descartes A mis padres y hermanos . ÍNDICE ÍNDICE ÍNDICE ÍNDICE Índice I Página PáginaPágina Página 1. INTRODUCCIÓN 1. INTRODUCCIÓN1. INTRODUCCIÓN 1. INTRODUCCIÓN 1 11 1 2. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA 2. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA2. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA 2. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA 5 55 5 2.1. HAEMONCHOSIS 5 2.1.1. ETIOLOGÍA 5 2.1.1.1. TAXONOMÍA 5 2.1.1.2. MORFOLOGÍA 7 2.1.1.3. CICLO BIOLÓGICO 11 2.1.1.3.1. Fase exógena 11 2.1.1.3.2. Fase endógena 13 2.1.2. EPIDEMIOLOGÍA 14 2.1.3. PATOGÉNESIS 17 2.1.4. SIGNOS CLÍNICOS 20 2.1.5. LESIONES 23 2.1.6. DIAGNÓSTICO 23 2.1.6.1. DATOS CLÍNICOS Y EPIDEMIOLÓGICOS 23 2.1.6.2. ANÁLISIS DE LABORATORIO 24 2.1.6.3. ESTUDIO ANATOMOPATOLÓGICO 25 2.1.6.4. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO 25 2.1.6.5. OTROS MÉTODOS 26 2.1.7. TRATAMIENTO 26 2.1.7.1. ANTIHELMÍNTICOS SINTÉTICOS 27 2.1.7.1.1. Benzimidazoles y probenzimidazoles 27 2.1.7.1.2. Imidazotiazoles 27 2.1.7.1.3. Lactonas macrocíclicas 28 2.1.7.1.4. Organofosforados 29 2.1.7.1.5. Derivados del amino-acetonitrilo (AADs) 29 2.1.7.2. RESISTENCIA A LOS ANTIHELMÍNTICOS 29 2.1.7.3. PLANTAS CON ACTIVIDAD ANTIHELMÍNTICA 31 2.1.8. PROFILAXIS Y CONTROL 33 2.1.8.1. MANEJO DEL PASTO 33 2.1.8.2. CONTROL BIOLÓGICO 34 2.1.8.3. SUPLEMENTOS NUTRICIONALES 35 2.1.8.4. INMUNOPROFILAXIS 36 2.1.8.4.1. Vacunas atenuadas 36 Índice II 2.1.8.4.2. Vacunas frente a antígenos naturales 36 2.1.8.4.2.1. Antígeno E/S 37 2.1.8.4.2.2. Hc-sL3 38 2.1.8.4.2.3. Hc40 39 2.1.8.4.3. Vacunas frente a antígenos ocultos 39 2.1.8.4.3.1. H11 40 2.1.8.4.3.2. H-gal-GP 40 2.1.8.4.3.3. Proteinasas tipo cisteína 41 2.1.8.4.3.4. Otros antígenos ocultos 42 2.1.8.5. ENFOQUE GENÉTICO 43 2.1.8.6. CONTROL INTEGRADO 44 2.2. PROTEINASAS 45 2.2.1. ESTRUCTURA, TIPOS Y FUNCIÓN 45 2.2.1.1. Serina proteinasas 47 2.2.1.2. Aspártico proteinasas 47 2.2.1.3. Metaloproteinasas 48 2.2.1.4. Glutámico proteinasas 49 2.2.1.5. Treonina proteinasas 49 2.2.1.6. Proteinasas tipo cisteína 49 2.2.1.7. Proteinasas de mecanismo catalítico desconocido 51 2.2.2. PROTEINASAS EN HAEMONCHUS CONTORTUS 51 2.2.3. UTILIDAD DIAGNÓSTICA DE LAS PROTEINASAS 53 2.2.4. UTILIDAD INMUNOPROFILÁCTICA DE LAS PROTEINASAS 54 2.2.4.1. Utilidad inmunógena de las aspártico proteinasas 55 2.2.4.2. Utilidad inmunógena de las metaloproteinasas 56 2.2.4.3. Utilidad inmunógena de las proteinasas tipo cisteína 57 2.2.4.3.1. Utilidad inmunógena de las proteinasas tipo cisteína en Haemonchus contortus 58 2.3. POLIMORFISMO GENÉTICO 60 2.3.1. POLIMORFISMO GENÉTICO EN NEMATODOS 62 2.3.1.1. Implicaciones epidemiológicas y patológicas 63 Índice III 2.3.1.2. Implicaciones en el diagnóstico 64 2.3.1.3. Implicaciones en el control 65 2.3.1.4. Polimorfismo en proteinasas tipo cisteína 66 3. MATERIAL Y MÉTODOS 3. MATERIAL Y MÉTODOS3. MATERIAL Y MÉTODOS 3. MATERIAL Y MÉTODOS 69 6969 69 3.1. ANIMALES 69 3.1.1. ANIMALES DONANTES 69 3.1.2. ANIMALES DE EXPERIMENTACIÓN 69 3.2. PARÁSITOS 70 3.2.1. OBTENCIÓN, CONCENTRACIÓN Y PURIFICACIÓN DE LARVAS 3 70 3.2.2. RECOGIDA Y PURIFICACIÓN DE VERMES ADULTOS 71 3.3. DISEÑO EXPERIMENTAL 73 3.3.1. GRUPOS EXPERIMENTALES 73 3.3.2. PROTOCOLO EXPERIMENTAL 74 3.3.3. INMUNIZACIONES 74 3.3.3.1. Obtención y preparación del antígeno 74 3.3.3.1.1. Preparación de homogeneizados 74 3.3.3.1.2. Determinación de la concentración de proteínas 75 3.3.3.1.3. Purificación del antígeno mediante cromatografía de afinidad 75 3.3.3.1.3.1. Preparación de la muestra 75 3.3.3.1.3.2. Preparación de la columna cromatográfica 76 a) Hidratación y estabilización de la matriz 76 b) Montaje de la columna 76 3.3.3.1.3.3. Prueba “binding” 77 3.3.3.1.3.4. Elución 77 3.3.3.1.3.5. Separación de las fracciones proteicas enriquecidas para proteinasas tipo cisteína 78 3.3.3.1.3.6. Determinación de la concentración de proteínas 78 Índice IV 3.3.3.2. Preparación del inmunógeno y protocolo de inmunización 79 3.3.4. INFECCIONES EXPERIMENTALES 79 3.3.5. TOMA DE MUESTRAS Y SACRIFICIO 79 3.4. ESTUDIO DEL NIVEL DE PROTECCIÓN 81 3.4.1. ANÁLISIS PARASITOLÓGICOS 81 3.4.1.1. Recuentos fecales 81 3.4.1.2. Recuentos de vermes adultos 81 3.4.2. DETERMINACIÓN DE LOS NIVELES DE IgGs ESPECÍFICAS EN SUERO 81 3.5. ESTUDIO DEL POLIMORFISMO GENÉTICO 83 3.5.1. RECOGIDA Y CONSERVACIÓN DE VERMES 83 3.5.2. SELECCIÓN DE LOS GENES 83 3.5.3. EXTRACCIÓN DE ADN 84 3.5.4. AMPLIFICACIONES MEDIANTE PCR 85 3.5.5. SSCP ( SINGLE STRAND CONFORMATION POLYMORPHISM ) 86 3.5.5.1. Preparación del soporte de la electroforesis 86 3.5.5.2. Preparación del gel de acrilamida 87 3.5.5.3. Preparación de las muestras 88 3.5.5.4. Condiciones de la electroforesis 88 3.5.5.5. Tinción de plata 88 3.5.6. SECUENCIACIÓN 89 3.6. ANÁLISIS ESTADÍSTICO 91 3.6.1. ESTUDIO DEL NIVEL DE PROTECCIÓN 91 3.6.2. ANÁLISIS DEL POLIMORFISMO GENÉTICO 92 3.6.3. ANÁLISIS DE VARIABILIDAD GENÉTICA 92 4. RESULTADOS 4. RESULTADOS4. RESULTADOS 4. RESULTADOS 95 9595 95 4.1. ESTUDIO DEL NIVEL DE PROTECCIÓN 95 4.1.1. RECUENTO DE HUEVOS POR GRAMO DE HECES 95 4.1.1.1. Inmunizaciones en ovinos frente a infecciones con la cepa NA 95 4.1.1.2. Inmunizaciones en ovinos frente a infecciones con la cepa SP 96 4.1.1.3. Inmunizaciones en caprinos frente a infecciones con la cepa NA 97 1. Introducción 4 alelos que codificarían proteinasas tipo cisteína con valor inmunoprofiláctico frente a la haemonchosis. 4. Identificar a partir de los resultados obtenidos en los análisis de selección genética aquellos alelos que, usados en el diseño de vacunas recombinantes, podrían conferir un mayor nivel de protección en ambas cepas y ambas especies hospedadoras. 2. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA 2. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA2. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA 2. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA 2. Revisión Bibliográfica 5 2. 2.2. 2.1. 1. 1. 1. HA HAHA HAE EE EMONCHOSIS MONCHOSISMONCHOSIS MONCHOSIS 2.1. 2.1.2.1. 2.1.1. 1.1. 1. ETIOLOGÍA ETIOLOGÍA ETIOLOGÍA ETIOLOGÍA 2.1.1. 2.1.1.2.1.1. 2.1.1.1. 1.1. 1. TAXONOMÍA TAXONOMÍATAXONOMÍA TAXONOMÍA La haemonchosis producida por H. contortus en los pequeños rumiantes se incluye en un conjunto de enfermedades parasitarias que se conocen comúnmente como nematodosis gastrointestinales. Suelen ser infecciones mixtas, es decir, suelen estar producidas por diversas familias y géneros, destacando las siguientes: Trichostrongylidae ( Haemonchus, Ostertagia, Teladorsagia, Trichostrongylus, Marshallagia, Cooperia ); Molineidae ( Nematodirus ); Ancylostomatidae ( Bunostomun ) y Strongylidae ( Chabertia y Oesophagostomun ) (Cordero del (Cordero del (Cordero del (Cordero del Campillo, 2000) Campillo, 2000)Campillo, 2000) Campillo, 2000). Dependiendo de la especie, estos vermes se localizan a distintos niveles en el aparato digestivo: cuajar (Tricostrongílidos), intestino delgado (Tricostrongílidos, Molineidos, Ancilostomátidos), e intestino grueso (Estrongílidos). La carga parasitaria, es decir, el número de vermes que albergan los hospedadores, variará en función del sistema de explotación (intensivo-extensivo), el acceso a zonas de pastoreo (mayor intensidad en regadíos) o la edad de los animales (mayor en jóvenes), pudiendo fluctuar entre varios cientos (pastoreo en secano) y decenas de miles (regadío). De este factor dependerá en gran medida las presentaciones subclínicas o clínicas del proceso. Todas estas especies son parásitos vermiformes de sección redondeada, de color blanquecino o rojizo (si desarrollan hematofagia), con unas medidas que oscilan entre un par de milímetros y tres o cuatro centímetros. La cutícula puede ser lisa o estriada, más o menos ornamentada, y a veces puede presentar expansiones en el extremo anterior. A nivel del extremo posterior de los machos estas expansiones de la cutícula forman una estructura conocida como bolsa copuladora, donde se localizan diversas estructuras quitinosas que intervienen en la cópula. Las hembras producen huevos que son ovoides, de cáscara fina, y que salen al medio con las heces en fase de blástula, con un número variable de blastómeros según especie. Continúan su desarrollo en el medio bajo condiciones ambientales apropiadas hasta que eclosiona la larva (L1) de su interior, la cual, bajo las mismas condiciones, experimentará dos mudas para alcanzar finalmente el estado de L3, que será infectante. 2. Revisión Bibliográfica 6 Dentro del amplio conjunto de especies responsables de “gastroenteritis parasitarias” en pequeños rumiantes, uno de los encuadres taxonómicos reconocidos actualmente para Haemonchus contortus ( H. contortus ) sería el siguiente: Phylum Nematoda Orden Strongylida Suborden Strongylina (Wilford Olsen/ Cordero del Campillo, 1977) Superfamilia Trichostrongyloidea (Cram, 1927) Familia Trichostrongylidae (Leiper, 1912) Subfamilia Haemonchinae (Anderson, 1992). Género Haemonchus (Cobb, 1898) Especie Haemonchus contortus (Rudolphi, 1803) Además de Haemonchus contortus (Rudolphi, 1803), descrito como parásito del cuajar de ovejas, cabras, y en menor medida de bovinos y otros numerosos rumiantes en casi todas las zonas del mundo, se han identificado otras especies diferentes dentro del género. Gibbsons (1979), uno de los autores que quizás ha revisado el género Haemonchus con más profundidad, reconoce la existencia de un total de nueve especies. Autores como Das y Whitlock (1960), en base a diferencias morfológicas de diversos aislados geográficos del parásito, han propuesto incluso la existencia de dos nuevas subespecies y una nueva variedad de H. contortus , denominadas Haemonchus contortus contortus (Australia), H. contortus cayugensis (Estado de New York, EEUU) y H. contortus var. utkalensis (Orissa, India). Posteriormente se han identificado otras subespecies, entre ellas H. contortus bangalorensis (India), H. contortus hispanicus (España) y H. contortus kentuckiensis (Kentucky, EEUU). Según Daskalov (1972) el hospedador sería el principal responsable de la aparición de las diferentes subespecies de H. contortus , sin dejar al margen la influencia de los factores geográficos y ecológicos. Otra especie actualmente reconocida del género Haemonchus es Haemonchus placei (Place, 1893; Ransom, 1911). La propuesta inicial de estos autores fue contrastada por Roberts et al . (1954) tras diversos estudios realizados en Australia en rumiantes parasitados por Haemonchus sp.. Concluyen que bovinos y ovinos están parasitados por dos especies diferentes del género Haemonchus, H. placei y H. contortus , respectivamente. Los estudios de Bremner (1955) sobre el cromosoma X apoyan las diferencias entre las dos especies; mientras que la longitud del cromosoma X era de 8 μm en bovino, en el ovino era semejante a los autosomas y medía 3 μm. Posteriormente, Herlich et al . (1958) encontraron diferencias entre las dos especies en la longitud de las espículas, la distancia entre las lengüetas y la punta de las espículas, así como en la actividad de las larvas infectantes. A pesar de estas 2. Revisión Bibliográfica 7 evidencias, Gibbons (1979) siguió considerando cierta identidad entre H. placei y H. contortus . Más recientemente se han realizado estudios basados en métodos moleculares que demuestran claras diferencias en el ADN ribosomal de ambas especies (Stevenson (Stevenson (Stevenson (Stevenson et al et alet al et al ., .,., ., 1995) 1995)1995) 1995). Se han propuesto incluso 3 subespecies: H. placei placei en aislados de Australia, H. placei africanus en el oeste de África y H. placei argentinensis en el Nuevo Mundo ( (( (Giudic GiudicGiudic Giudici i i i et al et alet al et al ., 1999 ., 1999., 1999 ., 1999) )) ). Dentro de este mismo género se encuentra también Haemonchus similis (Travassos, 1914). Esta especie se ha encontrado en bóvidos y cérvidos en Florida, Lousiana y Texas, y también en rumiantes de Europa y Brasil. Difiere de H. contortus en que el proceso terminal del radio dorsal es más largo y las espículas más cortas. En ciertas regiones de África (Costa de Marfil), donde los rumiantes comparten los mismos pastos durante todo el año, es común encontrar infecciones mixtas por H. placei , H. contortus y H. similis. En este caso, esta útima especie ( H. similis ) parece ser la especie predominante en bovinos de razas autóctonas y en cebúes ( (( (Achi Achi Achi Achi et al et alet al et al ., 2003 ., 2003., 2003 ., 2003) )) ). En camellos y dromedarios del Norte de África e India, también se ha descrito H. longistipes (Pailliet y Henry, 1909), una especie cuyas espículas son mucho más largas que en las demás especies del género (unos 625 μm). Algunas otras especies se han descrito en rumiantes silvestres; H. bedfordi H. bedfordiH. bedfordi H. bedfordi (Le Roux, 1929), cuajar de búfalo africano y diversas gacelas; H. dinniki H. dinnikiH. dinniki H. dinniki (Sachs, Gibbons y Leveno, 1973), cuajar de diversas gacelas; H. krugeri H. krugeriH. krugeri H. krugeri (Ortlepp, 1964), cuajar de impala; H. lawrenci H. lawrenciH. lawrenci H. lawrenci (Sandground, 1933), intestino delgado de antílope Cephalophus ; H. mitchelli H. mitchelliH. mitchelli H. mitchelli ( (( (Lichtenfels LichtenfelsLichtenfels Lichtenfels et al et alet al et al ., 2002) ., 2002)., 2002) ., 2002), cuajar de gacelas, eland, orix; H. vegliai H. vegliaiH. vegliai H. vegliai (Le Roux, 1929), cuajar de orix y antílopes; H H H H. .. . okapiae okapiae okapiae okapiae ( (( (Lichtenfels LichtenfelsLichtenfels Lichtenfels et al et alet al et al ., 2002 ., 2002., 2002 ., 2002) )) ), okapis ( Okapia johnstoni ), H. horaki H. horakiH. horaki H. horaki (Lichtenfels (Lichtenfels (Lichtenfels (Lichtenfels et al et alet al et al ., 2001) ., 2001)., 2001) ., 2001) antílopes ( Pelea capreolus ) de ciertas regiones del África austral. 2.1. 2.1.2.1. 2.1.1. 1.1. 1.2. 2. 2. 2. MORFOLOGÍA MORFOLOGÍAMORFOLOGÍA MORFOLOGÍA H. contortus se encuentra englobado en la superfamilia Trichostrongyloidea, considerándose la especie de mayor longitud entre los nematodos con bursa (Anderson, 1992) (Anderson, 1992)(Anderson, 1992) (Anderson, 1992). Esta superfamilia se encuentra dividida a su vez en 14 familias y 24 subfamilias (Durette (Durette (Durette (Durette- -- -Desset y Chabaud, 1977; 1981; Durette Desset y Chabaud, 1977; 1981; DuretteDesset y Chabaud, 1977; 1981; Durette Desset y Chabaud, 1977; 1981; Durette- -- -Desset, 1983) Desset, 1983)Desset, 1983) Desset, 1983). Se trata de un grupo de nematodos por lo general pequeños, frecuentes patógenos de los rumiantes en pastoreo, que tienen la apariencia de un pelo, y que suelen alojarse (salvo Dyctiocaulus que se localiza en vías respiratorias) en el tracto digestivo de mamíferos y aves (Anderson, 1992; Urquhart (Anderson, 1992; Urquhart (Anderson, 1992; Urquhart (Anderson, 1992; Urquhart et al et alet al et al . .. ., 2001) , 2001), 2001) , 2001). Existen, sin embargo, otros géneros que podemos encontrar en cavidad nasal (género Nasistrongylus ), 2. Revisión Bibliográfica 8 conductos biliares (género Hepatojarakus ) y glándula mamaria (género Mammanidula ) de sus hospedadores (Anderson, 1992) (Anderson, 1992)(Anderson, 1992) (Anderson, 1992). Los miembros de esta superfamilia no presentan estructuras muy llamativas y su cápsula bucal es muy reducida. Sin embargo, en los machos destaca la presencia de bolsas copuladotas desarrolladas, con dos espículas cuyas características morfológicas se utilizan para su diferenciación (Urquhart (Urquhart (Urquhart (Urquhart et al et alet al et al ., 2001) ., 2001)., 2001) ., 2001). Haemonchus sp. (Cobb, 1898), uno de los géneros parásitos del cuajar de diversos rumiantes con mayor potencial patógeno, tiene una longitud que oscila entre los 10-30 mm. Poseen una pequeña cápsula bucal con un fino diente o lanceta, así como papilas cervicales prominentes. La bolsa copuladora del macho es grande, en especial los lóbulos laterales, siendo el lóbulo dorsal pequeño y asimétrico. La vulva se sitúa en el tercio posterior y puede contar con una protuberancia, solapa o proceso lingüiforme. Estas características morfológicas generales pueden mostrar ciertas variaciones entre distintos aislados, por lo que el género puede considerarse en una situación de cambio evolutivo. Fig. 1. Fig. 1. Fig. 1. Fig. 1. Crestas cuticulares de un adulto de H. contortus (Gibbons, 1986) (Gibbons, 1986)(Gibbons, 1986) (Gibbons, 1986). Haemonchus contortus (Rudolphi, 1803) se presenta en el cuajar de ovejas, cabras, vacas y otros numerosos rumiantes, en casi todas las zonas del mundo. Se conoce vulgarmente como gusano rojo del cuajar de los rumiantes y es una de las especies más patógenas. Los machos miden de 10 a 22 mm de longitud, y las hembras de 18 a 34 mm (Soulsby, 1988; Cordero del Campillo, 2000) (Soulsby, 1988; Cordero del Campillo, 2000)(Soulsby, 1988; Cordero del Campillo, 2000) (Soulsby, 1988; Cordero del Campillo, 2000). El macho de esta especie presenta un color rojizo uniforme, mientras que en la hembra, los ovarios blancos enrollados en espiral alrededor del intestino rojo le dan un aspecto rayado. Presenta unas crestas cuticulares en la superficie (Fig. 1 y 2) (Fig. 1 y 2)(Fig. 1 y 2) (Fig. 1 y 2) que van desde el extremo anterior 2. Revisión Bibliográfica 9 hasta más allá de la mitad del cuerpo ( (( (Lichtenfels y Pilitt, Lichtenfels y Pilitt, Lichtenfels y Pilitt, Lichtenfels y Pilitt, 2000 20002000 2000) )) ), si bien se han observado ciertas diferencias según el grado de adaptación al hospedador (ovino o caprino) ( (( (Wahab y Suhalia, 2007 Wahab y Suhalia, 2007Wahab y Suhalia, 2007 Wahab y Suhalia, 2007) )) ). Fig. 2. Fig. 2. Fig. 2. Fig. 2. Sección transversal de un adulto de H. contortus (Wahab y Suhalia (Wahab y Suhalia(Wahab y Suhalia (Wahab y Suhalia, 2007) , 2007), 2007) , 2007). Tal y como se refirió previamente en el género, la bolsa copuladora de los machos de H. contortus es muy desarrollada y tiene lóbulos laterales alargados sustentados por radios largos y finos. El pequeño lóbulo dorsal es asimétrico y está desviado hacia uno de los lóbulos laterales, estando sustentado por un radio dorsal en forma de Y. Las espículas miden de 0,46 a 0,506 mm de longitud, y cada una de ellas cuenta con una pequeña lengüeta cerca del extremo distal, terminando en forma de espolón ( (( (Urquhart Urquhart Urquhart Urquhart et al et alet al et al ., 2001; Cordero del Campi ., 2001; Cordero del Campi., 2001; Cordero del Campi ., 2001; Cordero del Campillo, 2000 llo, 2000llo, 2000 llo, 2000) )) ). Estas espículas tienen una parte esclerotizada que está formada por tres estratos compuestos por queratina y colágeno. El eje de cada espícula posee unas alas ventrales y dorsales que se curvan hacia las correspondientes alas de la otra espícula. Tanto las espículas como el gubernáculo, una estructura en forma de cuña que se localiza entre las espículas, son de naturaleza proteica en su mayoría. La vulva de la hembra de H. contortus está cubierta normalmente por un proceso lingüiforme (solapa vulvar) que suele ser grande y muy prominente, pero que puede aparecer reducido a una pequeña prominencia en forma de botón en algunos ejemplares, o incluso presentar una superficie lisa ( (( (Wahab y Suhalia, 2007 Wahab y Suhalia, 2007Wahab y Suhalia, 2007 Wahab y Suhalia, 2007) )) ). La solapa vulvar tiene interés morfológico y presenta asociada una glándula hipodermal denominada poro perivulvar ( (( (Lichtenfels Lichtenfels Lichtenfels Lichtenfels et al et alet al et al ., 1995 ., 1995., 1995 ., 1995) )) ). Los huevos liberados por las hembras tienen forma ovoide, son de cáscara fina y presentan un tamaño que oscila entre 67-85 x 41-48 µm. Salen al exterior con las 2. Revisión Bibliográfica 10 heces en forma de blástula con 16-32 blastómeros (Fig. 3) (Fig. 3)(Fig. 3) (Fig. 3) (Soulsby, 1988; (Soulsby, 1988; (Soulsby, 1988; (Soulsby, 1988; Anderson, Anderson, Anderson, Anderson, 1992) 1992)1992) 1992). Fig. 3. Fig. 3. Fig. 3. Fig. 3. Huevo de H. contortus . La primera fase larvaria (L1) mide 340-350 µm de longitud y presenta un bulbo esofágico, cola puntiaguda prominente y cavidad bucal tubular. El poro genital consta de 2 células. El segundo estadio larvario (L2) es algo mayor, con una longitud de 400-450 µm, y también está provisto de bulbo esofágico. Tras la segunda muda la L2 se transforma en L3, que mide en torno a 754-756 µm de longitud y presenta una vaina, que no es sino la cutícula de la L2. La cola de la larva de tercer estado es de tamaño medio y puntiaguda, y el extremo anterior estrecho y redondeado. Todas ellas características que se utilizan para diferenciar el género de otros de la superfamilia (MAFF, 1989) (MAFF, 1989)(MAFF, 1989) (MAFF, 1989). El poro genital de la L3 tiene 16 núcleos, la cavidad bucal está elongada pero cerrada anteriormente (Anderson, 1992) (Anderson, 1992)(Anderson, 1992) (Anderson, 1992), y el número de células intestinales es de 16 (MAFF, 1989) (MAFF, 1989)(MAFF, 1989) (MAFF, 1989). El cuarto estado larvario (L4) tiene una longitud de 750-850 µm y presenta una cápsula bucal provisional que le permite ingerir sangre. Esta cápsula es globular y relativamente profunda, con unas paredes gruesas (MAFF, 1989) (MAFF, 1989)(MAFF, 1989) (MAFF, 1989). Por último, antes de evolucionar a estado adulto, el parásito pasa por una fase denominada L5 o preadulto, que dispone de una cápsula bucal más globular y desarrollada que la L4 y caracteres sexuales diferenciados. 2. Revisión Bibliográfica 11 2. 2.2. 2.1. 1.1. 1.1. 1.1. 1.3. 3.3. 3. CICLO CICLO CICLO CICLO BIOLÓGICO BIOLÓGICOBIOLÓGICO BIOLÓGICO 2.1 2.12.1 2.1.1 .1.1 .1. .. .3.1. 3.1.3.1. 3.1. F F F Fase exógena ase exógenaase exógena ase exógena H. contortus tiene un ciclo biológico directo típicamente tricostrongiloide (Soulsby, 1988; Urquhart (Soulsby, 1988; Urquhart (Soulsby, 1988; Urquhart (Soulsby, 1988; Urquhart et al et alet al et al ., 2001) ., 2001)., 2001) ., 2001). Los animales parasitados eliminan huevos que salen al medio junto con las heces del hospedador y allí evolucionan hasta el estado de L3 (envainada), que es la forma infectante. La infección se produce por ingestión de larvas de tercer estado o L3, cuyo posterior desarrollo hasta el estado adulto se produce en la localización final, el abomaso, sin llegar a producir ningún tipo de migración orgánica (Fig. 4 (Fig. 4(Fig. 4 (Fig. 4) )) ) ( (( (Urquhart Urquhart Urquhart Urquhart et al et alet al et al ., 2001 ., 2001., 2001 ., 2001) )) ). Los adultos se localizan en abomaso y depositan los huevos en la luz gástrica Los huevos son eliminados al medio en forma de mórula Los huevos eclosionan y las larvas evolucionan hasta alcanzar el estado L3 o forma infectante El ganado se infecta al ingerir las L3 del pasto contaminado Los adultos se localizan en abomaso y depositan los huevos en la luz gástrica Los huevos son eliminados al medio en forma de mórula Los huevos eclosionan y las larvas evolucionan hasta alcanzar el estado L3 o forma infectante El ganado se infecta al ingerir las L3 del pasto contaminado Fi FiFi Fig. 4 g. 4g. 4 g. 4. .. . Ciclo biológico de H. contortus . Veglia (1915 Veglia (1915Veglia (1915 Veglia (1915) )) ) llevó a cabo un estudio detallado de este ciclo vital, con especial atención al desarrollo de las fases larvarias libres. Las hembras son ovíparas y depositan los huevos normalmente en la cuarta fase celular, siendo capaces de eliminar entre 5.000 y 10.000 huevos/día (Cordero del Campillo, 2000) (Cordero del Campillo, 2000)(Cordero del Campillo, 2000) (Cordero del Campillo, 2000). Los huevos se desarrollan a medida que discurren por el intestino del hospedador y posteriormente en el medio, siendo aquellos que alcanzan el estado de pre-eclosión más resistentes a condiciones adversas como la congelación o la desecación (Soulsby, (Soulsby, (Soulsby, (Soulsby, 1988) 1988)1988) 1988). Según algunos autores la masa fecal serviría de protección frente a las condiciones ambientales (Zajac, 2006) (Zajac, 2006) (Zajac, 2006) (Zajac, 2006) y la humedad favorecería la eclosión de los huevos (O’Connor (O’Connor (O’Connor (O’Connor et al et alet al et al ., 2007) ., 2007)., 2007) ., 2007). Es importante tener en cuenta que, incluso dentro de 2. Revisión Bibliográfica 12 condiciones medioambientales aceptables, para cada especie existen evidencias de adaptaciones locales; así pues, los huevos de H. contortus de una cepa de Inglaterra, habituada a unas temperaturas en verano más frías, se ha demostrado que eclosionan a temperaturas más bajas que cepas procedentes de regiones más templadas (Zajac, (Zajac, (Zajac, (Zajac, 2006) 2006)2006) 2006). La temperatura óptima para el desarrollo oscila entre 20 y 30°C. En este rango de temperatura la primera fase larvaria (L1) eclosiona del huevo a las 14-17 horas. Una hora más tarde aproximadamente la larva comienza a alimentarse y en 10-12 horas, cuando alcanza una longitud 400-450 µm, sufre la primera muda. El segundo estado larvario (L2) queda desarrollado a partir de las 60-65 horas después de la eclosión del huevo. Tanto las L1 como las L2 se alimentan de bacterias antes de mudar a L3 (Zajac, 2006) (Zajac, 2006)(Zajac, 2006) (Zajac, 2006). El tiempo que tardan en alcanzar el estado de L3 varía con la temperatura; así, en veranos calurosos, el desarrollo de las larvas puede tardar 3 ó 4 días, mientras que si los huevos son depositados en primaveras frías, el desarrollo puede verse retrasado varios meses (Zajac, 2006) (Zajac, 2006)(Zajac, 2006) (Zajac, 2006). Esta fase larvaria se caracteriza por contar con una vaina que le proporciona gran resistencia frente a distintos factores ambientales, pero evita que las larvas se alimenten, por lo que una vez que las L3 consumen sus reservas metabólicas, mueren. Por este motivo, las larvas que eclosionan en periodos con temperaturas más bajas cuentan con menos movilidad y tienden a sobrevivir durante más tiempo (Zajac, 2006) (Zajac, 2006)(Zajac, 2006) (Zajac, 2006). Los huevos no se desarrollan si la temperatura es inferior a 4°C, y pueden no continuar su desarrollo cuando se elevan las temperaturas. Las larvas 3 sí sobreviven a 4°C pero pueden morir a temperaturas altas (75-85°C), así como en heces en descomposición. Las larvas maduras abandonan el contenido fecal y son más resistentes a la desecación, en parte por la presencia de lípidos en las células intestinales y porque tienden a agruparse. La humedad fecal normal es adecuada para el desarrollo de la L1 y la L2, pero no para la L3, que necesita de mayor humedad (O’Connor (O’Connor (O’Connor (O’Connor et al et alet al et al ., 2007) ., 2007)., 2007) ., 2007). Este factor (humedad), y especialmente la lluvia, son muy importantes para que la L3 abandone la materia fecal para migrar hacia el pasto, por lo que en tiempos secos un mayor porcentaje de larvas quedará retenida en el estiércol (Zajac, 2006) (Zajac, 2006)(Zajac, 2006) (Zajac, 2006). Su migración hacia la hierba no sólo se encuentra afectada por la humedad, sino también por la intensidad de luz, lo que explica que el número máximo de larvas infectantes se encuentre en el pasto en las primeras horas de la mañana y al final de la tarde, cuando la temperatura, humedad e intensidad lumínica son más favorables. Además de la lluvia, otro factor que favorece la desintegración fecal y por tanto la traslación de las larvas a la hierba es el viento. También existe la posibilidad de que algunos invertebrados jueguen cierto papel en la dispersión del material fecal por el simple movimiento mecánico del mismo. Sin embargo, estos mismos elementos pueden jugar un papel negativo sobre la supervivencia del parásito en el medio. La actividad de escarabajos del estiércol y gusanos de tierra, al 2. Revisión Bibliográfica 19 La separación entre células da lugar a un aumento de la permeabilidad, que explica parte de la patogenia de estos procesos. Así, la alteración de la integridad de la capa mucosa del abomaso conduce a la modificación de la Diferencia del Potencial Transmural (DPT) – potencial eléctrico a través de la pared gástrica – y de la concentración intraluminal de iones. Se ha observado que a los 30 minutos que siguen a la infección se produce un fuerte aumento de la DPT con variaciones en la concentración de los iones (incremento en la concentración de iones HCO3 que contribuye al aumento del pH gástrico), lo que da lugar a la disminución de la secreción de HCl y, como consecuencia, a un aumento del pH gástrico. En un principio se pensó que este aumento de pH se debía a la destrucción de células parietales de la mucosa por los parásitos, pero se ha visto que existe una rápida recuperación de los valores normales tras una desparasitación, mucho antes de que se pueda alcanzar la normalidad celular. Algunos autores proponen que existe una activación de la secreción ácida en los lugares donde los vermes no tienen una acción directa, posiblemente inducido por la acción de la gastrina. También se considera que la inhibición de la secreción de HCl podría estar producida por un factor gástrico de origen desconocido que se ha relacionado con la presencia del verme adulto (Cordero del Campillo, (Cordero del Campillo,(Cordero del Campillo, (Cordero del Campillo, 2000) 2000) 2000) 2000). De cualquier manera, el aumento del pH repercute negativamente en la digestión proteica porque el pepsinógeno no se transforma en pepsina (Ambrosi, (Ambrosi, (Ambrosi, (Ambrosi, 1995) 1995)1995) 1995). Lo mismo que ocurre en otras trichostrongylidosis, el resultado final de estas alteraciones es la disfunción del proceso digestivo, que suele acompañarse de una pérdida del efecto bacteriostático del pH gástrico y, por tanto, un aumento del número de bacterias, lo que favorece la aparición de diarreas. También se ha observado un aumento de la síntesis de gastrina, que lleva asociado a su vez un aumento de la contractilidad del cuajar y del peristaltismo intestinal (Cordero del (Cordero del (Cordero del (Cordero del Campillo, 2000) Campillo, 2000)Campillo, 2000) Campillo, 2000). La hipergastrinemia y el aumento del pH abomasal ocurren al mismo tiempo, si bien la gastrina sérica sigue aumentando tras la restauración de los valores normales de pH (Simpson (Simpson (Simpson (Simpson et al et alet al et al ., 1997) ., 1997)., 1997) ., 1997). La génesis del aumento del pepsinógeno plasmático en H. contortus no está muy clara aún. Se acepta la teoría según la cual las lesiones y alteraciones funcionales de la mucosa del cuajar, principalmente a nivel glandular, limitarían la secreción del HCl, reduciéndose la transformación del pepsinógeno en pepsina, y facilitando el paso de macromoléculas -como el pepsinógenoal torrente circulatorio a través de los complejos de unión entre las células endoteliales y epiteliales dañadas. Por otro lado, estudios más recientes afirman que no es necesaria la invasión de la mucosa para que se eleve el pepsinógeno plasmático, pues los valores se elevan ya a las 24-48 horas de la infección. Parece que los parásitos inducen un incremento en el número de células zimógenas y en consecuencia un aumento de la secreción de pepsinógeno, el cual se 2. Revisión Bibliográfica 20 vertería directamente en la circulación sanguínea (Scott (Scott (Scott (Scott et al et alet al et al ., 1998) ., 1998)., 1998) ., 1998). La hiperplasia de células mucosas podría mantener la secreción de pepsinógeno en animales infectados, incluso si las células principales tienen reducida su viabilidad (Scott (Scott (Scott (Scott et al et alet al et al ., ., ., ., 1998) 1998)1998) 1998). Sin embargo, otros autores han señalado que no en todas las parasitaciones por H. contortus se eleva el nivel del pepsinógeno plasmático, aunque sí el pH abomasal y la gastrina sérica. Además, en los animales en los que sí ocurre un aumento del pepsinógeno en sangre, éste no precede a las variaciones de otros parámetros como ocurre en la hiperpepsinogenemia de las infecciones por Ostertagia spp. (Simpson (Simpson (Simpson (Simpson et et et et al alal al ., 1997) ., 1997)., 1997) ., 1997). También se ha considerado que algunos productos de excreción/secreción de H. contortus pudieran estar implicados en la inhibición del ácido gástrico, en la vacuolización de células epiteliales y en la pérdida de células parietales (Przemeck (Przemeck (Przemeck (Przemeck et et et et al alal al ., 2005) ., 2005)., 2005) ., 2005). Estos productos sólo serían producidos por los adultos y no por las fases larvarias (Simpson (Simpson (Simpson (Simpson et al et alet al et al ., ., ., ., 1997) 1997)1997) 1997). También actuarían indirectamente sobre las células denominadas ECL (enterochromaffin-like), bien induciendo la aparición de procesos inflamatorios, o perturbando el sistema de defensa de la mucosa gástrica. La inflamación contribuiría al aumento de la concentración del pepsinógeno plasmático y también podría incrementar la secreción de gastrina (Simpson, 2000) (Simpson, 2000)(Simpson, 2000) (Simpson, 2000). Los animales infectados pierden gran cantidad de proteínas séricas a través del tracto gastrointestinal, habiéndose citado pérdidas fecales medias de plasma de 210 a 340 ml/día, estimadas mediante la pérdida de polivinilpirrolidona marcada con I131 (Dargie (Dargie(Dargie (Dargie, , , , 1975) 1975)1975) 1975). No obstante, la concentración de albúmina sérica puede permanecer en su nivel normal durante varias semanas, lo que puede estar asociado con un notable incremento de la síntesis albuminoidea que se produce hasta que las reservas metabólicas del animal se agotan (Soulsby, 1988) (Soulsby, 1988)(Soulsby, 1988) (Soulsby, 1988). A partir del día 35 post-infección (p.i.), hay un retorno a la normalidad estructural y funcional de la mucosa gástrica, que empieza a hacerse evidente hacia el día 63-70 p.i. Las células de las glándulas adyacentes a las parasitadas van recuperando su estructura típica, mientras que las glándulas parasitadas continúan revestidas por el epitelio cilíndrico de células mucosas (Cordero del Campillo, 2000) (Cordero del Campillo, 2000)(Cordero del Campillo, 2000) (Cordero del Campillo, 2000). 2. 2.2. 2.1.4 1.41.4 1.4. SIGNOS CLÍNICOS . SIGNOS CLÍNICOS . SIGNOS CLÍNICOS . SIGNOS CLÍNICOS La aparición de signos clínicos está asociada con la influencia de factores relacionados con el propio parásito (ciclo endógeno, hábitos alimentarios y dosis infectante) así como del hospedador (edad, receptividad, estado nutritivo, estado 2. Revisión Bibliográfica 21 inmunológico), siendo, en general, la anemia el signo clínico más importante (Fig. (Fig. (Fig. (Fig. 5 55 5) )) ) ( (( (Dargie Dargie Dargie Dargie y y y y A AA Allonby llonbyllonby llonby, ,, , 1975 1975 1975 1975; ; ; ; Scala ScalaScala Scala, 2006 , 2006, 2006 , 2006) )) ). Fig. 5 Fig. 5Fig. 5 Fig. 5. .. . Mucosa pálida en ovino debido a la anemia provocada por H. contortus . Otra de las alteraciones más características, tanto en infecciones por H. contortus como en las producidas por otros tricostrongiloideos, es la hipoproteinemia (Abbott (Abbott (Abbott (Abbott et al et alet al et al ., 1988) ., 1988)., 1988) ., 1988), con un marcado descenso de la albúmina sérica (Abbott (Abbott (Abbott (Abbott et al et alet al et al ., 1986 ., 1986., 1986 ., 1986; ; ; ; Scala, 2006) Scala, 2006)Scala, 2006) Scala, 2006). En general, se describe un incremento en la fracción gamma-globulina, relacionada con la respuesta inmunitaria, lo que unido a la hipoalbuminemia origina una disminución en el cociente albúmina/globulinas (Cordero del Campillo, 2000) (Cordero del Campillo, 2000)(Cordero del Campillo, 2000) (Cordero del Campillo, 2000). Son frecuentes también la anorexia y consiguiente reducción del consumo de alimento, posiblemente debido al dolor gástrico que origina la parasitación, sin que se descarte una reducción del apetito a nivel del sistema nervioso central producida por productos excretados-secretados por el parásito ( (( (Abbott Abbott Abbott Abbott et al et alet al et al ., 1988 ., 1988., 1988 ., 1988; ; ; ; Miller y Miller y Miller y Miller y Hor HorHor Horohov, 2006 ohov, 2006ohov, 2006 ohov, 2006) )) ). Comúnmente, se considera que la haemonchosis puede manifestarse siguiendo tres tipos de cursos clínicos: hiperagudo, agudo y crónico (Soulsby, 1988 (Soulsby, 1988(Soulsby, 1988 (Soulsby, 1988; ; ; ; Urquhart Urquhart Urquhart Urquhart et al et alet al et al ., 2001) ., 2001)., 2001) ., 2001). 2. Revisión Bibliográfica 22 Haemonc HaemoncHaemonc Haemonch hh hosis hiperaguda o sobreaguda osis hiperaguda o sobreagudaosis hiperaguda o sobreaguda osis hiperaguda o sobreaguda: es poco común, pero puede ocurrir en animales susceptibles y expuestos a una infección masiva de hasta 30.000 vermes; por ejemplo en animales muy jóvenes durante su primer año de pastoreo. El enorme número de parásitos provoca un rápido desarrollo de la anemia, eliminación de heces de color oscuro y una muerte súbita (Miller y Horohov, 2006) (Miller y Horohov, 2006)(Miller y Horohov, 2006) (Miller y Horohov, 2006) debido a la pérdida de sangre. El cuadro suele estar acompañado de una gastritis hemorrágica intensa y puede producir la muerte del animal incluso durante el periodo prepatente. Haemonchosis aguda Haemonchosis agudaHaemonchosis aguda Haemonchosis aguda: se observa principalmente en animales jóvenes susceptibles con infecciones menos intensas que en la haemonchosis sobreaguda. La anemia puede aparecer muy rápidamente, pero permite que se desarrolle una respuesta eritropoyética. La anemia producida en este caso es menos intensa y va acompañada de hipoproteinemia y edema (submandibular o ascitis), letargia, heces oscuras, y también puede desencadenar la muerte de los animales afectados. Los recuentos de huevos fecales observados en estos casos suelen ser elevados (más de 100.000 por gramo de heces). Los animales afectados muestran en la necropsia edema generalizado y anemia, pudiéndose obtener recuentos de 1.000 a 20.000 parásitos en el cuajar, que causan numerosas y pequeñas lesiones hemorrágicas. El contenido del abomaso es fluido y de color pardo oscuro debido a la presencia de sangre digerida. Haemonc HaemoncHaemonc Haemonch hh hosis crónica osis crónicaosis crónica osis crónica: es muy común y de considerable importancia económica, llegado a ser tan relevante como la haemonchosis aguda en áreas tropicales. Suele ser frencuente en estaciones secas prolongadas donde la reinfección no tiene especial importancia, pero en las que el pasto es muy deficiente en nutrientes. La enfermedad se produce por la infección crónica con un número bajo de parásitos (100-1.000) y suele asociarse a una morbilidad del 100% y a una mortalidad baja. Los animales afectados están débiles, puede haber caída de la lana en ovejas, síntomas de agotamiento y emaciación (Scala, 2006) (Scala, 2006)(Scala, 2006) (Scala, 2006). La anemia y la hipoproteinemia podrían llegar a ser graves, dependiendo de la capacidad de regeneración eritropoyética del animal, sus reservas de hierro y las reservas metabólicas nutricionales del hospedador, pero por lo general no suele haber anemia grave ni edemas manifiestos. Los recuentos fecales pueden ser en ocasiones menores de 2.000 huevos por gramo de heces. En el examen post-mortem se observan gastritis hiperplásica y alteraciones crónicas de la médula ósea. Como en otras nematodosis gastrointestinales la haemonchosis tiene un efecto importante sobre los parámetros productivos. Se reduce la ganancia diaria de peso, el crecimiento ( (( (Abbott Abbott Abbott Abbott et al et alet al et al ., 1988 ., 1988., 1988 ., 1988; ; ; ; Bricarello Bricarello Bricarello Bricarello et al et alet al et al ., 2005) ., 2005)., 2005) ., 2005) y la producción láctea o de lana (Cordero del Campillo, 2000) (Cordero del Campillo, 2000)(Cordero del Campillo, 2000) (Cordero del Campillo, 2000). Además, como ocurre en otras enfermedades parasitarias, estas infecciones favorecerían el desarrollo de una serie de 2. Revisión Bibliográfica 23 reacciones en el hospedador que pueden traducirse en enfermedades secundarias o incluso la muerte (Biffa (Biffa (Biffa (Biffa et al et alet al et al ., 2007) ., 2007)., 2007) ., 2007). 2. 2.2. 2.1.5 1.51.5 1.5. LESIONES . LESIONES. LESIONES . LESIONES Los signos post-mortem observados en los animales parasitados por H. contortus varían dependiendo del tipo de cuadro clínico desarrollado. En general, las membranas mucosas y la piel están pálidas, la sangre tiene un aspecto acuoso y los órganos internos están intensamente pálidos (Nettles (Nettles (Nettles (Nettles et al et alet al et al ., 2002) ., 2002)., 2002) ., 2002). Con frecuencia hay hidrotórax, fluido en el pericardio y ascitis, así como una gran caquexia y sustitución de la grasa tisular por un tejido gelatinoso de color marrón brillante; este tejido es frágil y muestra degeneración grasa. El cuajar contiene ingesta pardo-rojiza, y un gran número de gusanos que se mueven activamente si el cadáver está todavía caliente. La mucosa aparece hinchada y cubierta de pequeñas marcas rojizas (petequias), producto de las erosiones producidas por los parásitos. A los 35 días de la infección ya se observan pequeñas úlceras con hemorragias capilares. En ocasiones se observan úlceras superficiales de bordes irregulares en las que se encuentran fijados por su extremo anterior gran número de gusanos, y no es infrecuente que se pueda llegar a producir una fuerte gastritis hemorrágica (Urquhart (Urquhart (Urquhart (Urquhart et al et alet al et al ., 2001) ., 2001)., 2001) ., 2001). Las lesiones microscópicas han sido tratadas con detalle en el capítulo 2. 2.2. 2.1.3. 1.3. 1.3. 1.3. Patogénesis PatogénesisPatogénesis Patogénesis. Lo más destacado son las alteraciones en las glándulas circundantes a aquellas afectadas por los nematodos gástricos; en ellas se produce una rápida división celular que origina una marcada hiperplasia, con engrosamiento de la mucosa, edema submucoso, así como un aumento del número de células plasmáticas. Los espacios intercelulares epiteliales se encuentran dilatados y los complejos de unión entre las células desaparecen (Cordero del Campillo, 2000) (Cordero del Campillo, 2000)(Cordero del Campillo, 2000) (Cordero del Campillo, 2000). 2. 2.2. 2.1.6 1.61.6 1.6. DIAGNOSTICO . DIAGNOSTICO. DIAGNOSTICO . DIAGNOSTICO Debe realizarse en base a los datos clínicos, al historial epidemiológico, así como a distintos análisis de laboratorio. 2. 2.2. 2.1.6. 1.6.1.6. 1.6.1. 1. 1. 1. DATOS DATOSDATOS DATOS CLÍNICOS Y EPIDEMIOLÓGICOS CLÍNICOS Y EPIDEMIOLÓGICOS CLÍNICOS Y EPIDEMIOLÓGICOS CLÍNICOS Y EPIDEMIOLÓGICOS Es difícil debido a que las manifestaciones más frecuentes (diarrea, adelgazamiento, anemia) pueden aparecer en otros procesos, parasitarios o no. Aún 2. Revisión Bibliográfica 24 así, estos signos pueden orientar y aportan información valiosa si los relacionamos con los datos epidemiológicos. Se puede sospechar de infecciones intensas por nematodos cuando en una explotación ganadera se aprecian signos relacionados con trastornos gastrointestinales, animales en mal estado, anoréxicos e incluso muertes esporádicas. La anemia que provoca Haemonchus , sobre todo en animales jóvenes, puede estar asociada en ocasiones con altos índices de mortalidad y puede ser de utilidad para el diagnóstico de esta parasitosis, aunque siempre requiere de confirmación laboratorial ( (( (Soulsby, 1988; Soulsby, 1988; Soulsby, 1988; Soulsby, 1988; Cordero del Campillo, 2000) Cordero del Campillo, 2000)Cordero del Campillo, 2000) Cordero del Campillo, 2000). Durante los últimos años se está poniendo en práctica en zonas endémicas la utilización de métodos basados en el grado de palidez de las mucosas (FAMACHA) para estimar el grado de infección por H. contortus . La utilización de este método podría contribuir a identificar aquellos animales con cargas parasitarias más elevadas, con lo que se podría racionalizar el uso de antihelmínticos en términos económicos, a la vez que dificultar la aparición de resistencias debido al excesivo uso de estos productos (van Wyk y Bath, 2002) (van Wyk y Bath, 2002)(van Wyk y Bath, 2002) (van Wyk y Bath, 2002). 2. 2.2. 2.1.6. 1.6.1.6. 1.6.2 22 2. . . . ANÁLISIS DE LABORATORIO ANÁLISIS DE LABORATORIOANÁLISIS DE LABORATORIO ANÁLISIS DE LABORATORIO Es imprescindible para establecer un diagnóstico asertivo. Sin embargo, este diagnóstico debe ir acompañado de datos clínicos y epidemiológicos, puesto que ninguna prueba laboratorial disponible tiene por sí sola un valor determinante. Tradicionalmente, la confirmación de la infección por H. contortus se ha realizado mediante estudios coprológicos, estimándose que sería necesario analizar un 10% del número total de cabezas de la explotación para obtener una adecuada estimación del grado de infección (Ballweber, 2006) (Ballweber, 2006)(Ballweber, 2006) (Ballweber, 2006). El procedimiento más comúnmente usado para detectar huevos fecales de H. contortus es la técnica de concentración por flotación, que se basa en la capacidad de los huevos del parásito para flotar en soluciones concentradas de azúcar, cloruro sódico, sulfato de zinc, sulfato magnésico o nitrito de sodio. La morfología de los huevos de H. contortus es similar a la de otros géneros de la misma familia Trichostrongylidae ( Ostertagia sp., Trichostrongylus sp., etc.) por lo que un diagnóstico certero debe ir precedido de cultivos fecales y observación de las características morfológicas de las L3 (Cordero del Campillo, 2000) (Cordero del Campillo, 2000)(Cordero del Campillo, 2000) (Cordero del Campillo, 2000). 2. Revisión Bibliográfica 25 En ocasiones es necesario realizar un análisis cuantitativo de las muestras fecales, como indicador de la carga parasitaria. Para ello se han descrito varios procedimientos como la técnica de la doble centrifugación, el método de Stoll modificado y la técnica de McMaster, siendo esta última la más usada (MAFF, 1989; (MAFF, 1989;(MAFF, 1989; (MAFF, 1989; Ballweber, 2006) Ballweber, 2006)Ballweber, 2006) Ballweber, 2006). Algunos autores proponen como método diagnóstico la determinación del valor del pepsinógeno sanguíneo (Cordero del Campillo, 2000) (Cordero del Campillo, 2000)(Cordero del Campillo, 2000) (Cordero del Campillo, 2000), aunque ciertos estudios demuestran que no siempre existe un aumento en el pepsinógeno plasmático en los animales parasitados por H. contortus (Simpson (Simpson (Simpson (Simpson et al et alet al et al ., 1997) ., 1997)., 1997) ., 1997). 2. 2.2. 2.1.6. 1.6.1.6. 1.6.3. 3. 3. 3. ESTUDIO ANATOMOPATOLÓGICO ESTUDIO ANATOMOPATOLÓGICOESTUDIO ANATOMOPATOLÓGICO ESTUDIO ANATOMOPATOLÓGICO Este método de diagnóstico incluye el estudio tanto de las lesiones generales (anemia, ascitis, adelgazamiento, caquexia) como de las locales (gastritis), corroborado con la visualización de los vermes adultos en el cuajar. Es una forma de diagnóstico sencilla, pero también tiene sus inconvenientes. Por ejemplo, en ovejas que acaban de experimentar el fenómeno de la autocura, o están en fase terminal de la enfermedad, la mayor parte de los parásitos pueden haber desaparecido del abomaso (Cordero del Campillo, 2000; (Cordero del Campillo, 2000; (Cordero del Campillo, 2000; (Cordero del Campillo, 2000; Urquhart Urquhart Urquhart Urquhart et al et alet al et al ., 2001 ., 2001., 2001 ., 2001) )) ). En otros casos, la muerte puede sobrevenir en ausencia de un número abundante de vermes en la luz del abomaso, a consecuencia de la acción patógena ejercida por las formas inmaduras (Miller y Horohov, 2006) (Miller y Horohov, 2006)(Miller y Horohov, 2006) (Miller y Horohov, 2006). 2. 2.2. 2.1.6. 1.6.1.6. 1.6.4. 4. 4. 4. DIAGNÓSTICO DIAGNÓSTICO DIAGNÓSTICO DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO SEROLÓGICOSEROLÓGICO SEROLÓGICO Otros métodos que se han considerado en el diagnóstico de la haemonchosis y otras parasitosis gastrointestinales han sido distintos métodos serológicos, entre los que cabría destacar algunos test inmunoenzimáticos (ELISA), tanto para detectar reacciones serológicas frente a antígenos somáticos como frente a productos de excreción/secreción de H. contortus (Schallig (Schallig (Schallig (Schallig et al et alet al et al ., 1995 ., 1995., 1995 ., 1995b bb b; Li ; Li ; Li ; Li et al et alet al et al ., 2007 ., 2007., 2007 ., 2007; ; ; ; Prasad PrasadPrasad Prasad et et et et al alal al ., 2008 ., 2008., 2008 ., 2008) )) ), bien en forma de antígenos circulantes (en muestras de suero, orina o leche) (Petit (Petit (Petit (Petit et al et alet al et al ., 1981) ., 1981) ., 1981) ., 1981) o, incluso, como coproantígenos (Derbala y el (Derbala y el (Derbala y el (Derbala y el- -- -Rahman, Rahman, Rahman, Rahman, 2001) 2001)2001) 2001). Entre los inconvenientes observados en su utilización destacan la dificultad para detectar infecciones primarias (Gill, 1991) (Gill, 1991)(Gill, 1991) (Gill, 1991), o la aparición de reacciones cruzadas con otros tricostrongílidos (Anderson (Anderson (Anderson (Anderson et al et alet al et al ., 1989; Cuquerella ., 1989; Cuquerella ., 1989; Cuquerella ., 1989; Cuquerella et al et alet al et al ., 1994) ., 1994)., 1994) ., 1994). Para evitar las reacciones cruzadas (especialmente frente a Teladorsagia circumcincta ), se han llevado a cabo distintos estudios en los que se ha analizado la respuesta serológica frente antígenos específicos de vermes adultos o larvas 4 de H. contortus , 2. Revisión Bibliográfica 26 tanto en ganado ovino (Schallig (Schallig (Schallig (Schallig et al et alet al et al ., .,., ., 1994; Gómez 1994; Gómez 1994; Gómez 1994; Gómez- -- -Muñoz Muñoz Muñoz Muñoz et al et alet al et al ., 1996; Gómez ., 1996; Gómez., 1996; Gómez ., 1996; Gómez- -- - Muñoz Muñoz Muñoz Muñoz et al et alet al et al ., 2000) ., 2000) ., 2000) ., 2000) como en caprino (Molina (Molina (Molina (Molina et al et alet al et al ., 1999) ., 1999)., 1999) ., 1999). 2. 2.2. 2.1.6. 1.6.1.6. 1.6.5 55 5. . . . OTROS MÉTODOS OTROS MÉTODOSOTROS MÉTODOS OTROS MÉTODOS Algunos autores han conseguido diferenciar la presencia de huevos fecales de H. contortus de diversos trichostrongílidos mediante la utilización de algunas lectinas como marcadores. Así, la aglutinina de cacahuete se ha observado que se une de forma específica a la superficie de los huevos de H. contortus . (Palmer y (Palmer y (Palmer y (Palmer y McCombe McCombeMcCombe McCombe, ,, , 1996) 1996) 1996) 1996). La determinación de sangre oculta en las heces ha sido utilizada también como método para determinar la severidad de la infección por H. contortus , a partir de un test denominada FBO (faecal occult blood). Sin embargo, este test podría dar muchos falsos positivos debido a que la presencia de sangre en las heces es compatible con otras infecciones parasitarias como la fascioliosis, coccidiosis o enfermedades de origen bacteriano (Colditz y Le Jambre, 2008) (Colditz y Le Jambre, 2008)(Colditz y Le Jambre, 2008) (Colditz y Le Jambre, 2008). También mediante PCR en tiempo real, utilizando sondas específicas del tipo TaqMan MGB (TaqMan minor groove binder probes) para el ITS2 (second internal transcriber spacer) de la unidad de transcripción de ADN ribosómico, se han conseguido diferenciar entre las larvas de los principales nematodos gastrointestinales de rumiantes. Mediante este método, se ha llegado a observar una alta correlación (84%) entre los resultados obtenidos y las características morfológicas de las larvas observadas tras coprocultivos, por lo que se ha propuesto como una herramienta de diagnóstico fiable, rápida y adecuada para el diagnóstico de infecciones mixtas por nematodos gastrointestinales en rumiantes (von Samson (von Samson(von Samson (von Samson- -- - Himmelstjerna Himmelstjerna Himmelstjerna Himmelstjerna et al et alet al et al ., 2002; Siedek ., 2002; Siedek ., 2002; Siedek ., 2002; Siedek et al et alet al et al ., 2006) ., 2006)., 2006) ., 2006). También se ha considerado la combinación de técnicas microscópicas y moleculares (PCR a partir de ADN aislado de los huevos del parásito) para la diferenciación de géneros de la familia Trichostrongylidae ( H. contortus , Teladorsagia circumcincta , Trichostrongylus sp., Cooperia oncophora , Oesophagostomum columbianum , Oesophagostomum venulosum y Chabertia ovina ) a partir de muestras fecales (Bott (Bott (Bott (Bott et al et alet al et al ., 2009) ., 2009)., 2009) ., 2009). 2. 2.2. 2.1.7. 1.7.1.7. 1.7. TRATAMIENTO TRATAMIENTOTRATAMIENTO TRATAMIENTO Actualmente, el control y la profilaxis de las trichostrongylidosis pasa por contemplar un conjunto de acciones que combinan los tratamientos antihelmínticos estratégicos con prácticas de pastoreo que limiten los riesgos de infección. Estas 2. Revisión Bibliográfica 27 medidas deberían diseñarse de forma específica de acuerdo con los sistemas de explotación y las condiciones climáticas (Cordero del Campillo, 2000) (Cordero del Campillo, 2000)(Cordero del Campillo, 2000) (Cordero del Campillo, 2000). 2. 2.2. 2.1.7. 1.7.1.7. 1.7.1. 1. 1. 1. ANTIHELMÍNTICOS ANTIHELMÍNTICOSANTIHELMÍNTICOS ANTIHELMÍNTICOS SINTÉTICOS SINTÉTICOSSINTÉTICOS SINTÉTICOS Los fármacos que se utilizan actualmente pertenecen a los siguientes grupos farmacológicos: benzimidazoles y probenzimidazoles, imidazotiazoles, lactonas macrocíclicas y organofosforados. 2. 2.2. 2.1.7. 1.7.1.7. 1.7.1.1. 1.1. 1.1. 1.1. Benzimidazoles y probenzimidazoles Benzimidazoles y probenzimidazolesBenzimidazoles y probenzimidazoles Benzimidazoles y probenzimidazoles Todos se administran por vía oral. Se absorben rápidamente, alcanzando en 23 horas los niveles plasmáticos más altos. Los que más se utilizan en los rumiantes son el albendazol y el oxfendazol (Ostlind (Ostlind (Ostlind (Ostlind et al et alet al et al ., 2006) ., 2006)., 2006) ., 2006), además de otros como el oxibendazol, parbendazol, mebendazol, fenbendazol, cambendazol y thiabendazol (Lyons (Lyons (Lyons (Lyons et al et alet al et al ., 1993) ., 1993)., 1993) ., 1993). Este grupo de fármacos químicamente relacionados comparte los siguientes mecanismos de acción ( (( (Álvarez ÁlvarezÁlvarez Álvarez- -- -Sánchez Sánchez Sánchez Sánchez et al et alet al et al ., 2006 ., 2006., 2006 ., 2006) )) ): • Inhibición de la polimerización microtubular del parásito (unión a la βtubulina). • Alteración en el aparato reproductor de los helmintos. • Otros: inhibición de la rodoquinol fumarato reductasa, con el consiguiente desacoplamiento de la fosforilación oxidativa. Dentro de los probencimidazoles se encuentra el netobimin, muy soluble en agua, por lo que se puede administrar vía oral o subcutánea. Se utiliza en ovinos por vía oral frente a vermes adultos, estadíos larvarios y larvas inhibidas de los nematodos gastrointestinales; incluso presenta actividad ovicida (Cordero del (Cordero del (Cordero del (Cordero del Camp CampCamp Campillo, 2000) illo, 2000)illo, 2000) illo, 2000). 2. 2.2. 2.1.7.1. 1.7.1.1.7.1. 1.7.1.2 22 2. . . . Imidazotiazoles ImidazotiazolesImidazotiazoles Imidazotiazoles Dentro de este grupo farmacológico se encuadra el tetramisol y el levamisol, conocidos por su eficacia frente a las formas adultas de distintas especies de nematodos gastrointestinales de los rumiantes (Ostlind (Ostlind (Ostlind (Ostlind et et et et al alal al ., 2006) ., 2006)., 2006) ., 2006), pero no frente a los estados larvarios (menos del 80% de efecividad). 2. Revisión Bibliográfica 28 El mecanismo de acción que ejerce en los nematodos se manifiesta sobre los canales iónicos de los receptores nicotínicos de acetilcolina, permitiendo la entrada de calcio y favoreciendo la aparición de una contracción y parálisis espástica que impide su permanencia en el tracto gastrointestinal (Martin y (Martin y(Martin y (Martin y Robertson RobertsonRobertson Robertson, 2007) , 2007), 2007) , 2007). 2. 2.2. 2.1.7. 1.7.1.7. 1.7.1. 1.1. 1.3 33 3. . . . Lactonas macrocíclicas Lactonas macrocíclicasLactonas macrocíclicas Lactonas macrocíclicas Dentro de este grupo se encuentra la ivermectina, fármaco que a dosis muy bajas (0,2 mg/k.p.v.) suele presentar una efectividad del 100% (Ostlind (Ostlind (Ostlind (Ostlind et al et alet al et al ., 2006) ., 2006)., 2006) ., 2006). También se clasifica en este grupo la doramectina que, administrada a la misma dosis en cabras, es efectiva frente a la haemonchosis, y su efecto persiste entre los 14-25 días post-tratamiento (Molina (Molina (Molina (Molina et al et alet al et al ., 2005) ., 2005)., 2005) ., 2005). Este mismo compuesto en ovino también se ha mostrado eficaz frente a otros nematodos gastrointestinales como Teladorsagia circumcincta , Nematodirus battus , Nematodirus filicollis , Oesophagostomun venulosum , y Trichuris spp. (Dorchies (Dorchies (Dorchies (Dorchies et al et alet al et al ., 2001) ., 2001)., 2001) ., 2001). Ambos fármacos se administran por vía oral o parenteral, con una eficacia elevada frente a adultos y estados larvarios, incluso en hipobiosis. Además, son eficaces frente a ectoparásitos. Sin embargo, el periodo de supresión es muy alto ya que se mantiene circulando al menos durante 2 semanas. Para carne, el periodo de supresión alcanza los 21 días, y no se pueden administrar en ganado lechero (Cordero del Campillo, 2000) (Cordero del Campillo, 2000)(Cordero del Campillo, 2000) (Cordero del Campillo, 2000). Otro fármaco perteneciente a este grupo es la eprinomectina, cuya eficacia se ha demostrado frente a nematodos gastrointestinales tanto en cabras como en ovejas. En cabras, mediante aplicaciones “pour-on” a dosis de 500 µg/k.p.v., resulta eficaz frente a Teladorsagia circumcincta , Haemonchus. contortus y Trichostrongylus colubriformis ( (( (Hoste HosteHoste Hoste et al et alet al et al . .. ., 2004) , 2004), 2004) , 2004), si bien su persitencia se ve aumentada a una dosis de 1000 µg/k.p.v, prolongándose su efecto entre 10 y 17 días tras el tratamiento (Molina (Molina (Molina (Molina et al et alet al et al ., 2008) ., 2008)., 2008) ., 2008). La eficacia de este fármaco también ha sido constatada por otros autores ( (( (Cringoli Cringoli Cringoli Cringoli et al et alet al et al . .. ., 2003) , 2003), 2003) , 2003) en ovinos frente a Haemonchus contortus y otros nematodos gastrointestinales como Teladorsagia circumcincta , Trichostrongylus vitrinus , Trichostrongylus capricola , Nematodirus sp., y Chabertia ovina . Una ventaja de este fármaco es que puede utilizarse en animales en fase de producción láctea. En este apartado cabe considerar también a la moxidectina, una milbemicina que ha demostrado ser altamente eficaz frente a H. contortus , llegando a reducir los recuentos fecales de huevos en un 90% a las 24 horas, y en un 100% a las 48 horas del tratamiento (Tyrre (Tyrre(Tyrre (Tyrrel ll ll l l l et al et alet al et al ., 2002) ., 2002)., 2002) ., 2002). El efecto también se evaluó en cabras, donde se obtuvieron resultados óptimos a dosis de 0,2 mg/kg, con una protección de al menos 29 días tras su aplicación (Torres (Torres(Torres (Torres- -- -Acosta Acosta Acosta Acosta y Jacobs, y Jacobs,y Jacobs, y Jacobs, 1999) 1999)1999) 1999). 2. Revisión Bibliográfica 35 Por último, se han realizado estudios que demuestran que ovejas que pastan en campos con algunas especies de plantas como la achicoria ( Cichorium intybus ) o un tipo de forrajera llamada “cuernecillo” o “loto de los prados” ( Lotus corniculatus ), presentan una menor eliminación de huevos que ovejas que pastan en otro tipo de campos (Waller y Thamsborg, 2005) (Waller y Thamsborg, 2005)(Waller y Thamsborg, 2005) (Waller y Thamsborg, 2005). Así mismo, se ha demostrado, al comparar varios tipos de forraje, que en los de la forrajera Andropogon gayanus había una menor cantidad de L3 de H. contortus (Oliveira (Oliveira (Oliveira (Oliveira et al et alet al et al ., 2009) ., 2009)., 2009) ., 2009). Entre las posibles circunstancias que podrían explicar el efecto de esta planta estarían: 1) el aumento de proteínas y/o oligoelementos en la dieta del hospedador que pudiesen incrementar su inmunidad y reducir la patología por aumento de la reparación de tejidos; 2) la disminución del desarrollo o supervivencia de las fases larvarias debido a la toxicidad directa de las plantas (Marley (Marley (Marley (Marley et al et alet al et al ., 2003) ., 2003)., 2003) ., 2003). 2. 2.2. 2.1.8. 1.8.1.8. 1.8.3. 3. 3. 3. SUPLEMENTOS NUTRICIONALES SUPLEMENTOS NUTRICIONALESSUPLEMENTOS NUTRICIONALES SUPLEMENTOS NUTRICIONALES La alimentación suplementaria es un método de control frente a nematodos. Sin embargo, el principal inconveniente para la adopción más generalizada de esta solución es en gran parte financiero, tanto por el costo de los suplementos como por el trabajo adicional que se requiere (Stear (Stear (Stear (Stear et al et alet al et al ., 2007) ., 2007)., 2007) ., 2007). Una de las manifestaciones clínicas que se presentan en la haemonchosis, al igual que en otras trichostrongylidosis, es la hipoproteinemia (Abbott (Abbott (Abbott (Abbott et al et alet al et al ., 1988) ., 1988)., 1988) ., 1988) y, por tanto, los signos clínicos pueden prevenirse o reducirse mediante el suplemento de proteínas en la dieta antes y durante la infección (Coop (Coop (Coop (Coop et al et alet al et al ., 1995; Nnadi ., 1995; Nnadi ., 1995; Nnadi ., 1995; Nnadi et al et alet al et al ., ., ., ., 2007) 2007)2007) 2007); además, el aporte proteico alivia algunos cambios fisiopatológicos asociados a esta parasitosis ( (( (Nnadi Nnadi Nnadi Nnadi et al et alet al et al ., 2007) ., 2007)., 2007) ., 2007). La utilidad del suplemento de proteínas en la dieta para prevenir o reducir los signos clínicos en infecciones por H. contortus también ha sido demostrada por diversos autores (Abb (Abb(Abb (Abbott ott ott ott et al et alet al et al ., 1986, 1988; Wallace ., 1986, 1988; Wallace ., 1986, 1988; Wallace ., 1986, 1988; Wallace et al et alet al et al ., ., ., ., 1999) 1999)1999) 1999), algunos de los cuales ha señalado que este tipo de dieta podría favorecer el desarrollo de una la respuesta inmune efectiva frente al parásito (Strain (Strain (Strain (Strain y yy y Stear, Stear, Stear, Stear, 2001) 2001)2001) 2001), y probablemente ayudar a reparar la mucosa dañada. Un suplemento proteico en la dieta podría ser beneficioso durante el periodo del periparto, donde aumenta el recuento de huevos en heces debido a una disminución de la inmunidad, o bien durante las etapas tempranas de la gestación (Valderrábano (Valderrábano (Valderrábano (Valderrábano et etet et al al al al ., 2006) ., 2006)., 2006) ., 2006). Algunos estudios han demostrado que la dieta suplementada con urea en corderos infectados con H. contortus es capaz de elevar los niveles de albúmina plasmáticos y el hematocrito, así como de producir un aumento en la ganancia media diaria de peso y del apetito de los animales (Wallace (Wallace (Wallace (Wallace et al et alet al et al ., 1998) ., 1998)., 1998) ., 1998). 2. Revisión Bibliográfica 36 Además del efecto positivo de las dietas con suplementos proteicos, se ha observado que ciertos oligoelementos como el hierro, el zinc, el cobre o el molibdeno podrían actuar reforzando la resistencia del hospedador a las infecciones por nematodos, por lo que su empleo podría incluirse también entre las estrategias de control de las nematodosis gastrointestinales (Koski (Koski (Koski (Koski y yy y Scott, 2003) Scott, 2003) Scott, 2003) Scott, 2003). 2. 2.2. 2.1.8. 1.8.1.8. 1.8.4. 4. 4. 4. INMUNOPROFILAXIS INMUNOPROFILAXISINMUNOPROFILAXIS INMUNOPROFILAXIS Para el control inmunoprofiláctico de las enfermedades parasitarias producidas por nematodos se han seguido estrategias distintas, en base a las cuales se reconocen actualmente tres tipos principales de vacunas: vacunas atenuadas (Bain, (Bain, (Bain, (Bain, 1999) 1999)1999) 1999), vacunas frente a antígenos naturales (Meeuse (Meeuse (Meeuse (Meeusen n n n y yy y Piedrafita, 2003) Piedrafita, 2003) Piedrafita, 2003) Piedrafita, 2003) y vacunas frente a antígenos ocultos (Knox (Knox (Knox (Knox et al et alet al et al ., 2003) ., 2003)., 2003) ., 2003). 2. 2.2. 2.1.8.4. 1.8.4.1.8.4. 1.8.4.1. 1. 1. 1. Vacunas atenuadas Vacunas atenuadasVacunas atenuadas Vacunas atenuadas Las principales vacunas atenuadas ensayadas frente a Haemonchus contortus han sido las obtenidas mediante irradicación de L3 infectantes. Este tipo de vacunas no tienen efecto en corderos (Smith y Christie, 1979) (Smith y Christie, 1979)(Smith y Christie, 1979) (Smith y Christie, 1979), pero sí en ovejas adultas, que son ya de por sí menos susceptibles a la enfermedad por medio de otros mecanismos naturales. Probablemente la vacuna sólo funcionaría si se encuentran desarrollados los mecanismos naturales de inmunidad del hospedador (Stear (Stear (Stear (Stear et al et alet al et al ., 2007) ., 2007)., 2007) ., 2007). Frente a otros nematodos gastrointestinales de rumiantes, también se han realizado algunos ensayos de vacunación con larvas irradiadas, como las llevadas a cabo por Smith Smith Smith Smith e ee et t t t al alal al . .. . ( (( (1982 19821982 1982) ) ) ) frente a Teladorsagia circumcincta en ovinos adultos. Vacunas que han empleado este tipo de antígenos han sido utilizadas desde hace más de 40 años en ganado vacuno contra el nematodo pulmonar Dictyocaulus viviparus (Jarret y Sharp, (Jarret y Sharp, (Jarret y Sharp, (Jarret y Sharp, 1963; John 1963; John1963; John 1963; Johnson son son son et al et alet al et al ., 2003) ., 2003)., 2003) ., 2003). 2. 2.2. 2.1.8. 1.8.1.8. 1.8.4.2. 4.2. 4.2. 4.2. Vacunas frente a a Vacunas frente a aVacunas frente a a Vacunas frente a antígenos naturales ntígenos naturalesntígenos naturales ntígenos naturales Durante muchos años se ha intentado inducir la inmunidad frente a nematodos gastrointestinales con antígenos naturales, así como con sus formas recombinantes. Frente a H. contortus se han utilizado diferentes tipos, entre ellos antígenos cuticulares, antígenos de excreción/secreción (ES) larvarios y de vermes adultos (totales y fraccionados), etc., con los que se han conseguido reducciones en los recuentos fecales y en el número de vermes en abomaso de hasta el 75% (Emery, (Emery, (Emery, (Emery, 1996) 1996)1996) 1996). Pero muchos de los datos siguen siendo inéditos por razones comerciales, y ninguno de estos antígenos ha dado lugar a un producto registrado (Newton y (Newton y (Newton y (Newton y Meeusen, 2003) Meeusen, 2003)Meeusen, 2003) Meeusen, 2003). 2. Revisión Bibliográfica 37 2.1.8.4.2.1. Antígenos de E/S Los productos de excreción/secreción (ES) de los nematodos gastrointestinales pueden realizar diversas funciones, como por ejemplo permitir la penetración de las formas larvarias en el tejido, facilitar la degradación de proteínas del hospedador para alimentarse (Cox (Cox (Cox (Cox et et et et al alal al ., 1990; Karanu ., 1990; Karanu ., 1990; Karanu ., 1990; Karanu et al et alet al et al ., 1993) ., 1993)., 1993) ., 1993), regular la respuesta inmune del hospedador y evitar la coagulación de la sangre, entre otros, lo que los han convertido en candidatos para el desarrrollo de vacunas efectivas frente a estos parásitos (Joshi y Singh, 2000; S (Joshi y Singh, 2000; S(Joshi y Singh, 2000; S (Joshi y Singh, 2000; Suchitra y Joshi, 2005) uchitra y Joshi, 2005)uchitra y Joshi, 2005) uchitra y Joshi, 2005). Se han estudiado ciertos antígenos de E/S de bajo peso molecular (denominados ES15 y ES24 ), los cuales son expresados tanto por las L4 como por los adultos del parásito. Estos antígenos fueron identificados utilizando anticuerpos séricos obtenidos de ovejas parcialmente inmunes durante una infección secundaria (Schallig (Schallig (Schallig (Schallig et al et alet al et al ., 1994) ., 1994)., 1994) ., 1994). En inmunizaciones con preparaciones enriquecidas con este tipo de antígenos se redujeron los recuentos fecales entre un 32 y un 77%, y la media de vermes adultos en el abomaso se redujo entre un 64 y un 85% (Schallig (Schallig(Schallig (Schallig y y y y van vanvan van Leeuwen LeeuwenLeeuwen Leeuwen, , , , 1997; V 1997; V1997; V 1997; Vervelde ervelde ervelde ervelde et al et alet al et al ., 2002 ., 2002., 2002 ., 2002) )) ). El mecanismo de inmunidad conferida por este tipo de antígenos no ha sido definido aún, pero se ha correlacionado con una respuesta de proliferación de células T (Schallig (Schallig(Schallig (Schallig y y y y van vanvan van Leeuwen Leeuwen Leeuwen Leeuwen, , , , 1997 19971997 1997) )) ), niveles de anticuerpos específicos en suero IgG1, IgA o IgE ( (( (V VV Vervelde ervelde ervelde ervelde et al et alet al et al ., 2002 ., 2002., 2002 ., 2002) )) ), y la presencia de mastocitos en abomaso (Schallig (Schallig(Schallig (Schallig et al et alet al et al ., ., ., ., 1997) 1997)1997) 1997). Se han realizado ensayos con antígenos ES15 recombinantes con buenos resultados, aunque la eficacia no siempre fue evidente ( (( (V VV Vervelde ervelde ervelde ervelde et al et alet al et al ., 2002 ., 2002., 2002 ., 2002) )) ). La escasa inmunoprotección de las vacunas recombinantes, en este caso, estuvo correlacionada con bajos niveles de IgG1 e IgA específicos. Por otro lado, a diferencia de lo observado con los antígenos naturales ES15 y ES24 , los productos recombinantes no indujeron una respuesta importante de IgE específicas en ovejas adultas. A pesar de todo, ni los antígenos naturales ni los recombinantes ES15 y E24 fueron capaces de inducir anticuerpos IgE o protección en corderos jóvenes ( (( (V VV Vervelde ervelde ervelde ervelde et al et alet al et al ., 2002 ., 2002., 2002 ., 2002) )) ), un requisito para cualquier uso comercial de una vacuna frente a H. contortus (Newton y Meeusen, 2003) (Newton y Meeusen, 2003)(Newton y Meeusen, 2003) (Newton y Meeusen, 2003). En un estudio más reciente se ha identificado mediante Western blot la existencia de un producto de E/S de vermes adultos de H. contortus de 66k Da ( p66 ). La proteína es capaz de inhibir la función de los monocitos in vitro y estimular la proliferación en células mononucleares periféricas. Además, se observó una correlación entre los niveles de anticuerpos antip66 y la carga parasitaria, así como una reducción in vitro de la motilidad de los parásitos adultos tratados con anticuerpos específicos frente a la proteína (Rathore (Rathore (Rathore (Rathore et al et alet al et al ., 2006) ., 2006)., 2006) ., 2006). 2. Revisión Bibliográfica 38 También se han empleado con éxito proteínas de productos de E/S con afinidad por grupos thiol para inmunizar al ganado ovino. El antígeno, obtenido a partir de eluciones de una columna de Thiol Sepharose mediante el uso de cisteína y Dl-dithiothreitol (DTT), fue capaz de reducir el número de huevos en las heces y la carga parasitaria en torno al 50% en ovejas inmunizadas y posteriormente inoculadas experimentalmente con 5.000 L3 de H. contortus (Bakker (Bakker (Bakker (Bakker et al et alet al et al ., 2004) ., 2004)., 2004) ., 2004). Así mismo, , , , Ruiz Ruiz Ruiz Ruiz et al et alet al et al . .. . (2004 (2004 (2004 (2004a aa a) )) ), utilizando fracciones solubles en PBS y enriquecidas para proteinasas tipo cisteína mediante columnas de Thiol-Sepharosa similares a las anteriores, consiguieron una importante protección en caprinos, que se tradujo en una disminución de la eliminación de huevos en heces del 89% y en una reducción del número de vermes en el abomaso del 68%. La solubilidad de las proteinasas en PBS indicaría que se trata de antígenos no necesariamente ocultos (Ruiz (Ruiz (Ruiz (Ruiz et al et alet al et al ., ., ., ., 2004 20042004 2004a aa a) )) ). Estos resultados contrastan con los de Knox Knox Knox Knox et al et alet al et al . .. . (1999) (1999) (1999) (1999), quienes no consiguieron inmunoprotección en ovinos inmunizados con fracciones de similares características. Estudios más recientes han revelado la capacidad inmunoprotectora en ovinos frente a H. contortus de una vacuna a partir de la proteinasa tipo cisteína AC-5 identificada en los productos de excreción/secreción del parásito (De Vries (De Vries (De Vries (De Vries et et et et al alal al ., 2009) ., 2009)., 2009) ., 2009). Concretamente, se consiguió una reducción de la carga parasitaria del 36% y de los recuentos fecales de huevos del 32%. La posibilidades inmunoprotectoras de los productos de E/S de H. contortus fueron estudiadas en detalle por Yatsuda Yatsuda Yatsuda Yatsuda et al et alet al et al . .. . (2003) (2003) (2003) (2003) mediante electroforesis bidimensional. Encontraron más de 100 proteínas, algunas no identificadas, muchas de las cuales serían susceptibles de ser utilizadas como antígenos en futuros ensayos de vacunación. 2.1.8.4.2.2. Hc-sL3 En un enfoque distinto en la identificación de antígenos mediante el uso de anticuerpos séricos, se investigaron células secretoras de anticuerpos aisladas de linfonódulos de ovejas con inmunidad inducida hacia H. contortus. Mediante esta metodología se logró identificar un antígeno de superficie en las L3 con aproximadamente 70-80 kDa, que se denominó Hc-sL3 (Bowles (Bowles (Bowles (Bowles et al et alet al et al ., 1995; Raleigh ., 1995; Raleigh ., 1995; Raleigh ., 1995; Raleigh y Meeusen y Meeuseny Meeusen y Meeusen, ,, , 1996; Raleigh 1996; Raleigh 1996; Raleigh 1996; Raleigh et al et alet al et al ., 1996) ., 1996)., 1996) ., 1996) (Fig. (Fig. (Fig. (Fig. 6 66 6) )) ). Las inmunizaciones con Hc-sL3 han mostrado reducciones en el recuento fecal de huevos entre el 64 y el 69%, y entre el 45 y el 55% de la carga de vermes del abomaso (Jacobs (Jacobs (Jacobs (Jacobs et al et alet al et al ., 1999) ., 1999)., 1999) ., 1999). La protección parece ser dependiente de la respuesta Th2 (Jacobs (Jacobs (Jacobs (Jacobs et al et alet al et al ., 1999) ., 1999)., 1999) ., 1999), similar al mecanismo inmune desarrollado frente a nematodos en ratones (Grencis, 1996) (Grencis, 1996)(Grencis, 1996) (Grencis, 1996). Finalmente, también se ha observado que los eosinófilos son capaces de destruir las larvas 3 desenvainadas in vitro en presencia anticuerpos mono y policlonales específicos para 2. Revisión Bibliográfica 39 Hc-sL3 (Rainbird (Rainbird (Rainbird (Rainbird et al et alet al et al ., 1998) ., 1998)., 1998) ., 1998), en consonancia con las observaciones en las que se correlaciona la eosinofilia adquirida con la inmunidad natural frente a nematodos gastrointestinales en ovejas (Jarrett (Jarrett (Jarrett (Jarrett et al et alet al et al ., 1959) ., 1959)., 1959) ., 1959). Fig. Fig. Fig. Fig. 6 66 6. .. . Localización del antígeno Hc-sL3 en la superficie de L3 de H. contortus (Newton y Munn, (Newton y Munn, (Newton y Munn, (Newton y Munn, 1999) 1999)1999) 1999). 2.1.8.4.2.3. Hc40 Es un antígeno extraído de L3 activas capaz de reducir un 65% la carga de H. contortus en cobayas (Sharp y Wagland, 1996) (Sharp y Wagland, 1996)(Sharp y Wagland, 1996) (Sharp y Wagland, 1996). Yatsuda Yatsuda Yatsuda Yatsuda et al et alet al et al . .. . ( (( (2 22 2003 003003 003) ) ) ) encontraron también dicho antígeno junto con un amplio panel de proteínas en productos de E/S de vermes adultos del parásito, entre las que se encontraban diversas proteinasas de distinta actividad (metalo, serina y aspártico proteinasas) y otras proteínas. 2. 2.2. 2.1.8. 1.8.1.8. 1.8.4.3. 4.3. 4.3. 4.3. Vacunas frente a antígenos Vacunas frente a antígenos Vacunas frente a antígenos Vacunas frente a antígenos ocultos ocultosocultos ocultos Se designan de esta forma a un grupo de antígenos que no son capaces de inducir una respuesta inmunitaria en el hospedador durante el curso de la infección natural (Munn, 1997) (Munn, 1997)(Munn, 1997) (Munn, 1997), posiblemente porque no son accesibles a los anticuerpos ni a otros componentes del sistema inmune. La especial importancia de estos antígenos ocultos en las estrategias de inmunoprotección se debe a que no ha habido una presión selectiva mediada por la evolución de los parásitos con mecanismos que evadan la respuesta inmune. Entre este tipo de antígenos se encuentran los que se refieren a continuación. 2. Revisión Bibliográfica 40 2.1.8.4.3.1. H11 El antígeno oculto mejor caracterizado de H. contortus es una glicoproteína de la membrana del intestino denominada H11 (Smith (Smith (Smith (Smith et al et alet al et al ., 1993 ., 1993., 1993 ., 1993b bb b) )) ). El antígeno H11 originario, procedente de vermes adultos, ha sido testado en un gran número de ensayos de vacunación en distintas razas, incluyendo corderos jóvenes, en los que induce niveles altos de anticuerpos específicos y una importante reducción de los recuentos fecales de huevos y de la carga de vermes en el abomaso (Newton y Munn, (Newton y Munn, (Newton y Munn, (Newton y Munn, 1999) 1999)1999) 1999). Mediante clonación de cDNA se demostró que el antígeno H11 es una aminopeptidasa microsomal (Graham (Graham (Graham (Graham et al et alet al et al ., 1993; Smith ., 1993; Smith ., 1993; Smith ., 1993; Smith et al et alet al et al . .. ., 1997) , 1997) , 1997) , 1997) que posiblemente está implicada en el desglose final de pequeños péptidos que son producidos por la digestión de las proteínas de la dieta (Munn y Munn, 2002) (Munn y Munn, 2002)(Munn y Munn, 2002) (Munn y Munn, 2002), de ahí la hipótesis de que el mecanismo de protección sea inducido por anticuerpos que alteran la absorción de nutrientes. Han sido descritas tres isoformas del H11, que son idénticas en aproximadamente un 65% a nivel de su secuencia de aminoácidos (Graham (Graham (Graham (Graham et al et alet al et al. .. . , 1993) , 1993), 1993) , 1993). También ha sido clonado un cDNA que codifica una cuarta isoforma y una secuencia marcada extraída para una quinta isoforma está ya presente en las bases de datos. La eliminación de la terminal-N de la secuencia de anclaje produce una forma soluble natural del antígeno H11 (denominado H11S) que induce igual protección que la proteína en toda su longitud en los ensayos de vacunación (Graham (Graham (Graham (Graham et al et alet al et al. .. . , 1993) , 1993), 1993) , 1993). Aunque el éxito con la vacuna de antígenos solubles naturales H11 fue el primero que se notificó en la literatura, y unos clones de cDNA fueron patentados en 1993 (Graham (Graham (Graham (Graham et al et alet al et al. .. . , 1993; Smith , 1993; Smith , 1993; Smith , 1993; Smith et al et alet al et al ., 1993 ., 1993., 1993 ., 1993b bb b) )) ), esta vacuna aún no ha sido comercializada, principalmente debido a problemas con la forma recombinante de los antígenos. De este modo, a pesar de que la inmunización de ovinos con moléculas recombinantes del H11S inducían niveles altos de anticuerpos que reaccionaban de manera cruzada con el antígeno natural H11S y que inhibía la actividad aminopetidasa de ambos (natural y recombinante) en ensayos in vitro (Newton y Meeusen, 2003) (Newton y Meeusen, 2003)(Newton y Meeusen, 2003) (Newton y Meeusen, 2003), las ovejas no mostraron protección frente a H. contortus (Newton (Newton (Newton (Newton et al. et al.et al. et al. , no publicado) , no publicado), no publicado) , no publicado). Si se consiguieron resultados satisfactorios de inmunoprotección con una nueva forma recombinante de H11 diseñada con posterioridad ( (( (Reszka ReszkaReszka Reszka et al et alet al et al ., ., ., ., 2007) 2007)2007) 2007). 2.1.8.4.3.2. H-gal-GP Una segundo tipo de antígeno oculto procedente de la membrana del intestino de H. contortus , denominado H-gal-GP, también se ha mostrado capaz de inducir altos niveles de protección, con reducciones en los recuentos de huevos en 2. Revisión Bibliográfica 41 heces próximos al 90% y del 60% en las cargas parasitarias (N (N(N (Newton y Munn, 1999; ewton y Munn, 1999; ewton y Munn, 1999; ewton y Munn, 1999; Smith, 2007) Smith, 2007)Smith, 2007) Smith, 2007). El antígeno H-gal-GP es un complejo de proteínas cuyo tamaño oscila entre 31 y 230 kDa cuando se analiza mediante SDS-PAGE ( (( (Smith y Smith, 1996; Smith y Smith, 1996; Smith y Smith, 1996; Smith y Smith, 1996; Smith Smith Smith Smith et al et alet al et al ., 1999) ., 1999)., 1999) ., 1999), y está provisto de actividad aspartil proteinasa, metaloproteinasa neutra y proteinasa tipo cisteína (Smith (Smith (Smith (Smith et al et alet al et al ., 1999) ., 1999)., 1999) ., 1999). La presencia de esta actividad proteinasa sugiere que, como ocurría con el antígeno H11, el mecanismo de inmunidad proporcionado por H-gal-GP pudiera estar relacionado con la interrupción de la digestión. Aunque se ha conseguido inmunoprotección parcial con algunas fracciones de H-gal-GP separadas a partir de geles en condiciones no desnaturalizantes (Smith (Smith (Smith (Smith et al et alet al et al ., 1999) ., 1999)., 1999) ., 1999), el fraccionamiento completo y, por tanto, la identificación de los componentes realmente activos no ha sido posible (Knox y (Knox y (Knox y (Knox y Smith, 2001) Smith, 2001)Smith, 2001) Smith, 2001). Existen pruebas de que al menos 3 de las 4 metaloproteinasasas neutras que integran el complejo no contribuyen a la protección (Smith (Smith (Smith (Smith et al et alet al et al ., 2000a) ., 2000a)., 2000a) ., 2000a), como tampoco contribuyen las formas recombinantes de este tipo de metaloproteinasas y de proteinasas tipo aspartil, también integrantes de H-gal-GP (Redmond (Redmond (Redmond (Redmond et al et alet al et al ., 2004 ., 2004., 2004 ., 2004) )) ). Mediante clonación de ADN complementario se han identificado también un homólogo de la trombospondina (Skuce (Skuce (Skuce (Skuce et al et alet al et al ., 2001) ., 2001)., 2001) ., 2001), una galectina (Newlands (Newlands (Newlands (Newlands et al et alet al et al ., ., ., ., 1999) 1999)1999) 1999) y una cistantina (Newlands (Newlands (Newlands (Newlands et al et alet al et al ., 2001) ., 2001)., 2001) ., 2001) como componentes del antígeno Hgal-GP, pero las versiones recombinantes de estas proteínas no han demostrado tener actividad protectora en ovinos (Skuce (Skuce (Skuce (Skuce et al et alet al et al ., 2001 ., 2001., 2001 ., 2001) )) ). En contraste, otros autores han obtenido porcentajes de reducción en los recuentos fecales de huevos y la carga parasitaria entre el 40-50% en caprino infectado con H. contortus utilizando como antígeno galectinas recombinantes (rHco-gal-m y rHco-gal-f) (Yanming (Yanming(Yanming (Yanming et al et alet al et al ., 2007) ., 2007)., 2007) ., 2007). Más recientemente, algunos autores han probado la eficacia de una vacuna combinada entre el antígeno H11 y el H-gal-GP con resultados satisfactorios en ovinos infectados de forma natural por H. contortus a partir de pastos contaminados. Los animales inmunizados presentaron altos niveles de IgG1 e IgG2 específicos frente al antígeno empleado en la vacuna, y los valores de IgA e IgE aumentaron al final de la experiencia, probablemente debido a la exposición natural al parásito (LeJambre (LeJambre (LeJambre (LeJambre et al et alet al et al ., 2008) ., 2008)., 2008) ., 2008). Por último, también se ha intentado sin éxito inducir un sinergismo mediante la inmunización con H-gal-GP y el uso de antihelmínticos como la ivermectina o el fenbendazol en ovejas inoculadas con una cepa del parásito resistente a ambos fármacos (Smith, 2007) (Smith, 2007)(Smith, 2007) (Smith, 2007). 2.1.8.4.3.3. Proteinasas tipo cisteína La vacunación con productos extraídos con detergentes (Triton X-100) procedentes de vermes adultos enriquecidos para proteinasas tipo cisteína de membrana de intestino (TBSP), han mostrado una reducción media del recuento 2. Revisión Bibliográfica 42 fecal de huevos y de la carga parasitaria del 77% y 47%, respectivamente (Knox y (Knox y (Knox y (Knox y Smith, 2001) Smith, 2001)Smith, 2001) Smith, 2001). Las proteinasas tipo cisteína presentes en TBSP han sido clonadas mediante cDNA y han resultado tener secuencias similares a la catepsina B (Skuce (Skuce (Skuce (Skuce et et et et al alal al . .. ., 1999a) , 1999a), 1999a) , 1999a), y gran semejanza con proteinasas tipo cisteína previamente obtenidas por extracción acuosa de adultos de H. contortus (Pratt (Pratt (Pratt (Pratt et al. et al.et al. et al. , 1992) , 1992), 1992) , 1992). Un importante componente de 60 kDa de TSBP ha demostrado ser una glutamato deshidrogenasa ( (( (Skuce Skuce Skuce Skuce et al et alet al et al. .. . , 1999b) , 1999b), 1999b) , 1999b), sin embargo, esta proteína se expresa en el citoplasma de las células intestinales y parece no contribuir a la protección (Skuce (Skuce (Skuce (Skuce et al. et al.et al. et al. , 1999b; Knox , 1999b; Knox , 1999b; Knox , 1999b; Knox et al et alet al et al . .. ., 1995 , 1995, 1995 , 1995a aa a) )) ). Los anticuerpos de ovejas inmunizadas con TBSP son capaces de inhibir la actividad proteinasa tipo cisteína de TBSP in vitro (Knox (Knox (Knox (Knox et al et alet al et al ., 2005) ., 2005)., 2005) ., 2005) por lo que el mecanismo de inmunidad podría estar mediado por anticuerpos que inhibirían la digestión de proteínas. También los productos recombinantes de proteinasas tipo cisteína parecen ser capaces de reducir la carga parasitaria (27%) y el recuento fecal de huevos (29%) en ovejas (Redmond y Knox, 2006) (Redmond y Knox, 2006)(Redmond y Knox, 2006) (Redmond y Knox, 2006). A partir de estos resultados, se ha propuesto incluso la posibilidad de obtener una vacuna recombinante a partir de la extracción y purificación de proteinasas tipo cisteína (del tipo de la catepsina L) de Caenorhabditis elegans . Aunque se ha demostrado que las proteinasas extraídas son enzimáticamente activas y están glicosiladas (Murray (Murray (Murray (Murray et al et alet al et al ., 2007) ., 2007)., 2007) ., 2007), hasta el momento no hay datos de efectividad in vivo . Todo lo referente a las proteinasas tipo cisteína, incluyendo su potencial como antígenos inmunoprotectores será abordado con mayor profundidad en capítulos posteriores. 2.1.8.4.3.4. Otros antígenos ocultos Se han ensayado igualmente otros antígenos ocultos que confieren inmunoprotección frente a H. contortus . Un ejemplo es el polímero denominado contortina obtenido a partir de adultos del parásito, que es capaz de reducir la carga parasitaria en un 78% en ovinos vacunados (Munn (Munn (Munn (Munn et al et alet al et al ., 1987) ., 1987)., 1987) ., 1987). Por su parte, los antígenos denominados p52 y p46 indujeron protección en cabras y ovejas inmunizadas reduciendo la carga de vermes adultos en el abomaso (33% en ovino y 60% en caprino) y el recuento de huevos en heces (78% en ovino y 50% en caprino) (Jasmer (Jasmer (Jasmer (Jasmer et al et alet al et al ., 1993; Smith ., 1993; Smith ., 1993; Smith ., 1993; Smith et al et alet al et al ., 2000b) ., 2000b)., 2000b) ., 2000b). Los antígenos p52 y p46 formarían parte de una poliproteína denominada GA1 ( (( (Jasmer Jasmer Jasmer Jasmer et al et alet al et al ., 1993; Jasmer ., 1993; Jasmer ., 1993; Jasmer ., 1993; Jasmer et al et alet al et al ., 1996) ., 1996)., 1996) ., 1996). Smith Smith Smith Smith et et et et al alal al . .. . (1993 (1993 (1993 (1993b bb b) ) ) ) detectaron también un grupo de tres proteínas que fueron separadas de la denominada H11 por cromatografía de intercambio iónico, logrando reducir en aproximadamente un 70% los recuentos fecales, y en torno al 30% los recuentos de 2. Revisión Bibliográfica 43 vermes de H. contortus . Se identificaron tres péptidos de 45, 49 y 53 kDa (p45, p49 y p53, respectivamente) y se incluyeron dentro del denominado complejo p150, que presentaba cierta similitud con la proteína GA1. También se han obtenido resultados positivos a partir de fracciones somáticas purificadas de bajo peso molecular, las denominadas p26/23 , que fueron capaces de estimular la respuesta inmune tanto a nivel local como general, con reducciones en torno al 60% tanto en los recuentos fecales como en la carga parasitaria. Además, los animales inmunizados que desarrollaron un mayor grado de protección pudieron reconocer algunos péptidos de alto peso molecular (34 a 65 kDa) en extractos del parásito adulto ( (( (Domínguez DomínguezDomínguez Domínguez- -- - Toraño Toraño Toraño Toraño et al et alet al et al ., 2000; Domínguez ., 2000; Domínguez., 2000; Domínguez ., 2000; Domínguez- -- -Toraño Toraño Toraño Toraño et al et alet al et al ., 2003) ., 2003)., 2003) ., 2003). Recientemente, en estudios de aislamiento e inmunocalización, se ha observado que dichos antígenos se encuentran en los cordones hipodermales del parásito (García (García(García (García- -- -Coiradas Coiradas Coiradas Coiradas et al et alet al et al . .. ., 2009) , 2009), 2009) , 2009). 2. 2.2. 2.1. 1.1. 1.8. 8.8. 8.5 55 5. .. . ENFOQUE GENÉTICO ENFOQUE GENÉTICOENFOQUE GENÉTICO ENFOQUE GENÉTICO Existen razas genéticamente resistentes a las gastroenteritis parasitarias de los pequeños rumiantes. Suelen ser razas locales, muy adaptadas al hábitat en el que viven, y que pueden proporcionar per se una alternativa para el control de la haemonchosis. Estos animales poseen la habilidad de evitar el establecimiento y/o el consiguiente desarrollo de la infección parasitaria, pudiendo llegar a mantener la producción a pesar de presentar una parasitación por nematodos gastrointestinales. Es por este motivo por lo que la FAO enfatiza sobre en la importancia de conservar y potenciar este tipo de razas (FAO, 2004) (FAO, 2004)(FAO, 2004) (FAO, 2004). Se han realizado numerosos estudios que demuestran la mayor resistencia de ciertas razas de ovino frente a otras más susceptibles a la enfermedad. Así, en Kenya, la raza local Red Massai es más resistente que razas importadas como la Dorper (Nguti (Nguti (Nguti (Nguti et al et alet al et al ., .,., ., 2003; Mugambi 2003; Mugambi 2003; Mugambi 2003; Mugambi et al et alet al et al ., 2005) ., 2005)., 2005) ., 2005). Razas como la Gulf Coast Native han mostrado también ser más resistentes que otras como la Suffolk (Bahirathan (Bahirathan (Bahirathan (Bahirathan et al et alet al et al ., ., ., ., 2000 20002000 2000; ; ; ; Shakya ShakyaShakya Shakya et al et alet al et al ., 2009 ., 2009., 2009 ., 2009) )) ). Así mismo, se han documentado razas con un gran grado de resistencia frente a la haemonchosis, como la St Croix (Gamble y Zajac, 1992) (Gamble y Zajac, 1992)(Gamble y Zajac, 1992) (Gamble y Zajac, 1992), la Garole india (Nimbkar (Nimbkar (Nimbkar (Nimbkar et al et alet al et al ., 2003) ., 2003)., 2003) ., 2003) y la Barbados Blackbelly (Aumont (Aumont (Aumont (Aumont et al et alet al et al . .. ., ,, , 2003) 2003) 2003) 2003). La oveja de pelo Caribeña y la Katahdin también han demostraron ser más resistentes a la enfermedad que razas más seleccionadas como la Dorper y la Dorset ( (( (Vanimisetti Vanimisetti Vanimisetti Vanimisetti et al et alet al et al ., 2004 ., 2004., 2004 ., 2004; ; ; ; MacKinnon MacKinnonMacKinnon MacKinnon et al et alet al et al . .. ., 2009 , 2009, 2009 , 2009) )) ). Por último, la oveja canaria de pelo conocida como pelibuey ha mostrado ser más resistentes a la infección por H. contortus que otras razas ovinas (Gonz (Gonz(Gonz (Gonzá áá ález lez lez lez et a et aet a et al ll l ., 2008 ., 2008., 2008 ., 2008a aa a) )) ). Aunque es menos evidente que en ovino, también existen razas de ganado caprino resistentes de manera natural, o capaces de tolerar mejor una infección por 2. Revisión Bibliográfica 44 H. contortus , como por ejemplo la cabra enana de África Occidental (Chiejina (Chiejina (Chiejina (Chiejina et al et alet al et al ., ., ., ., 20 2020 2002; Behnke 02; Behnke 02; Behnke 02; Behnke et al et alet al et al ., 2006) ., 2006)., 2006) ., 2006). Otras razas caprinas, como la natural de Thai ha mostrado una mayor resistencia a la infección por H. contortus que el cruce con la AngloNubian (50% natural de Thai-50% Anglo-Nubian) ( (( (Pralomkarn Pralomkarn Pralomkarn Pralomkarn et al et alet al et al ., 1997) ., 1997)., 1997) ., 1997). También la cabra pequeña del este de África (Baker (Baker (Baker (Baker et al et alet al et al ., 1998) ., 1998)., 1998) ., 1998) y la raza caprina Creole se han descrito como razas con cierta resistencia frente a las nematodosis gastrointestinales (Mandonnet (Mandonnet(Mandonnet (Mandonnet et al et alet al et al ., 2001; ., 2001; ., 2001; ., 2001; Bambou Bambou Bambou Bambou et al et alet al et al ., .,., ., 2009) 2009)2009) 2009). Hay también estudios que señalan una mayor resistencia frente a las nematodosis gastrointestinales en los cruces entre razas. En este sentido se ha demostrado que el cruce entre las razas Border Leicester y Merino es más resistente que la raza merina pura (Donald (Donald (Donald (Donald et al et alet al et al ., 1982) ., 1982)., 1982) ., 1982), del mismo modo que el cruce de Merino con Rhoen (Hielscher (Hielscher (Hielscher (Hielscher et al et alet al et al ., 2006) ., 2006)., 2006) ., 2006). Un fenómeno similar se ha observado en Nueva Zelanda al cruzar ovejas Texel y Romney (Niezen (Niezen (Niezen (Niezen et al et alet al et al . .. ., ,, , 1996) 1996) 1996) 1996). Habitualmente, las razas locales resistentes, o sus cruces, son más pequeñas en tamaño que las razas susceptibles, probablemente debido a la necesidad de emplear los recursos en combatir la enfermedad y reparar los daños (Stear (Stear (Stear (Stear et al et alet al et al ., 2007) ., 2007)., 2007) ., 2007). Por este motivo, en algunos casos es muy difícil sustituir una raza por otra de menor productividad. Es lo que ocurre en Australia en la industria de la lana y en la industria lechera en el mundo occidental. En estos casos, se está tratando de aprovechar la variación genética dentro del colectivo, seleccionando aquellos individuos dentro de la misma raza con características ventajosas en términos productivos y de resistencia natural a las infecciones por nematodos gastrointestinales (Kloosterman (Kloosterman (Kloosterman (Kloosterman et al et alet al et al ., 1978; Gray ., 1978; Gray ., 1978; Gray ., 1978; Gray et al et alet al et al ., 1987 ., 1987., 1987 ., 1987; ;; ; Gonz GonzGonz Gonzá áá ález lezlez lez et al et alet al et al ., ., ., ., 2008 20082008 2008b bb b) )) ). 2. 2.2. 2.1.8.6. 1.8.6.1.8.6. 1.8.6. CO COCO CONTROL INTEGRADO NTROL INTEGRADONTROL INTEGRADO NTROL INTEGRADO Como se ha revisado en los apartados anteriores, el control de las nematodosis gástricas puede enfocarse de distinta manera, y son muchas las posibilidades de elección, pero no existe un método que recomiende excluir a los otros. Lo apropiado sería más bien tratar de combinar distintos métodos de control. El control integrado implica un uso racional de una combinación de controles biológicos, biotecnológicos y químicos, con medidas de manejo o estrategias genéticas para así reducir el uso de agentes químicos al mínimo. Como ejemplo, una de las combinaciones que ha sido investigada es la actuación sobre dieta y resistencia genética. En este sentido, Abbott Abbott Abbott Abbott et al et alet al et al . .. . (2000) (2000) (2000) (2000) investigaron el efecto de un suplemento de proteínas en la dieta en animales 2. Revisión Bibliográfica 51 • Degradación de la matriz Degradación de la matrizDegradación de la matriz Degradación de la matriz tisular tisular tisular tisular : :: : Entre otras funciones atribuibles a este tipo de proteinasas se encuentra la degradación de la matriz tisular. Esta posibilidad se ha descrito en helmintos como Fasciola hepatica (Berasain (Berasain (Berasain (Berasain et al et alet al et al ., 1997) ., 1997)., 1997) ., 1997), Taenia saginata (oncosfera) (White (White (White (White et al et alet al et al ., 1996) ., 1996)., 1996) ., 1996), H. contortus (L4 y adulto) (Rhoads y (Rhoads y (Rhoads y (Rhoads y Fetterer, 1996 Fetterer, 1996Fetterer, 1996 Fetterer, 1996) )) ), así como en el protozoo Entamoeba histolytica durante las primeras fases de invasión del intestino (Que (Que(Que (Que et al et alet al et al ., 2002) ., 2002)., 2002) ., 2002). • Hidrólisis de inmunoglobulinas Hidrólisis de inmunoglobulinasHidrólisis de inmunoglobulinas Hidrólisis de inmunoglobulinas : :: : También en este grupo de proteinasas existen algunas capaces de hidrolizar inmunoglobulinas para evadir la respuesta inmune del hospedador. Esta capacidad se ha observado en Fasciola hepatica (Chapman y Mitc (Chapman y Mitc(Chapman y Mitc (Chapman y Mitchell, 1982; Wilson hell, 1982; Wilson hell, 1982; Wilson hell, 1982; Wilson et al et alet al et al ., 1998) ., 1998)., 1998) ., 1998), en Taenia crassiceps (metacestodo) ( (( (White White White White et al et alet al et al ., 1997; ., 1997; ., 1997; ., 1997; Khalil Khalil Khalil Khalil et al et alet al et al ., 1998) ., 1998)., 1998) ., 1998) y Taenia solium (metacestodo) (White (White (White (White et al et alet al et al ., ., ., ., 1992) 1992)1992) 1992). • Otras funciones Otras funcionesOtras funciones Otras funciones : :: : En nematodos filáridos se ha demostrado que las proteinasas tipo cisteína están implicadas en los procesos de muda (Gregory y (Gregory y (Gregory y (Gregory y Maizels, 2007) Maizels, 2007)Maizels, 2007) Maizels, 2007). En Paragonimus westermani se ha observado que cumple funciones relacionadas con la reproducción y la escisión de la metacercaria de este trematodo (Park (Park (Park (Park et al et alet al et al ., 2002; Yang ., 2002; Yang ., 2002; Yang ., 2002; Yang et al et alet al et al ., 2004) ., 2004) ., 2004) ., 2004) y también parecen poder perturbar los mecanismos de defensa del hospedador inactivando el complemento o los mediadores citotóxicos expresados por los linfocitos (Leid, 1987) (Leid, 1987)(Leid, 1987) (Leid, 1987). 2. 2.2. 2.2 22 2.1. .1..1. .1.7 77 7. .. . Proteinasa ProteinasaProteinasa Proteinasas de mecanismo catalítico desconocido s de mecanismo catalítico desconocidos de mecanismo catalítico desconocido s de mecanismo catalítico desconocido Existe además un grupo de proteinasas cuyo mecanismo catalítico es desconocido, o no se encuentran dentro de las descritas en los demás grupos. En este grupo se encuentra un clan con 9 familias (Rawlings (Rawlings (Rawlings (Rawlings et al et alet al et al ., 2008) ., 2008)., 2008) ., 2008), entre los que destaca el proteosoma, un complejo proteico encargado de la mayor parte de la degradación no lisosomal de proteínas. El mecanismo catalítico de estas proteinasas es diferente al de la mayoría de proteinasas conocidas, y se expresa en función del entorno proteico en cinco actividades proteásicas diferentes. Gracias a esto, el proteosoma puede hidrolizar prácticamente cualquier enlace peptídico de las proteínas sustrato. Hasta el momento no se han descrito en parásitos. 2. 2.2. 2.2. 2.2. 2.2. 2. 2. 2. PROTEINASA PROTEINASAPROTEINASA PROTEINASAS EN S EN S EN S EN HAEMONCHUS CONTORTUS HAEMONCHUS CONTORTUSHAEMONCHUS CONTORTUS HAEMONCHUS CONTORTUS La penetración de H. contortus en los tejidos huéspedes y la utilización de la sangre del hospedador como fuente nutricional están mediados por procesos mecánicos y por la liberación de productos histolíticos (Trap y Boireau, 2000) (Trap y Boireau, 2000)(Trap y Boireau, 2000) (Trap y Boireau, 2000). 2. Revisión Bibliográfica 52 Un análisis de los productos de excreción-secreción potencialmente histolíticos en adultos utilizando geles de poliacrilamida ha permitido la identificación de cuatro fracciones (Karanu (Karanu (Karanu (Karanu et al et alet al et al ., 1993) ., 1993)., 1993) ., 1993) de 32, 35, 38 y 40 kDa con actividad proteinasa tipo cisteína. También fueron identificadas aspartil proteinasas y metaloproteinasas en estos productos de excreción/secreción. Hasta el momento se han descrito las secuencias génicas de los siguientes grupos de proteinasas tipo cisteína en H. contortus : familia AC (Pratt (Pratt (Pratt (Pratt et al et alet al et al ., 1990; Pratt ., 1990; Pratt ., 1990; Pratt ., 1990; Pratt et al et alet al et al ., 1992) ., 1992)., 1992) ., 1992), GCP-7 (Rehman y (Rehman y (Rehman y (Rehman y Jasmer, 1998) Jasmer, 1998)Jasmer, 1998) Jasmer, 1998), hmcp 1, hmcp 4 y hmcp 6 (Skuce (Skuce (Skuce (Skuce et al et alet al et al ., 1999 ., 1999., 1999 ., 1999a aa a) )) ), HC58 (Muleke (Muleke (Muleke (Muleke et al et alet al et al ., 2006) ., 2006)., 2006) ., 2006) y cistatina (Newlands (Newlands (Newlands (Newlands et al et alet al et al ., 2001) ., 2001)., 2001) ., 2001). En general, las proteinasas de H. contortus son más similares entre sí de lo que lo son con respecto a la catepsina B humana (38-44% identidad de aminoácidos), o a la proteinasa tipo cisteína de Sm31 de Schistosoma mansoni (36-40% de identidad) (Pratt (Pratt (Pratt (Pratt et al et alet al et al ., 1992) ., 1992)., 1992) ., 1992). Esta gran diversidad de familias de proteinasas permitiría al adulto de H. contortus desarrollar funciones muy diversas, como por ejemplo la degradación de los tejidos conjuntivos. En este sentido, las larvas L4 y los adultos de H. contortus son capaces de degradar el 42% y el 100%, respectivamente, de una matriz extracelular compuesta de glicoproteínas, de elastina y de colágeno. También se ha observado que los productos de excreción/secreción de los adultos pueden degradar el 64% de la matriz, incrementándose este porcentaje en presencia de dithiothreitol (activador de proteinasas tipo cisteína). A la inversa, la degradación de las matrices es inhibida cuando estos mismos productos de excreción/secreción son coincubados con un inhibidor específico de proteinasas tipo cisteína (Rhoads y Fetterer, 1996) (Rhoads y Fetterer, 1996)(Rhoads y Fetterer, 1996) (Rhoads y Fetterer, 1996). Por tanto, una o varias proteinasas tipo cisteína de H. contortus tendrían la capacidad de degradar componentes mayores de la matriz extracelular (elastina y colágeno) en condiciones fisiológicas y participarían en la lisis de los tejidos favoreciendo la penetración en el cuajar y/o en los capilares sanguíneos del hospedador (Trap y Boireau, 2000) (Trap y Boireau, 2000)(Trap y Boireau, 2000) (Trap y Boireau, 2000). Existen también diferentes trabajos que demuestran la capacidad de las proteinasas tipo cisteína de H. contortus para digerir la hemoglobina del huésped. Así, una proteinasa con actividad cisteína del tipo catepsina L identificada en el estadío de larva L4 y en adultos se ha demostrado que inhibe la coagulación de la sangre en ovino mediante hidrólisis del fibrinógeno, presentando por tanto una función hemoglobinolítica (Rhoads y Fetterer, 1995) (Rhoads y Fetterer, 1995)(Rhoads y Fetterer, 1995) (Rhoads y Fetterer, 1995). En este sentido se ha demostrado que en presencia de inhibidores de proteinasas tipo cisteína, la incorporación de hemoglobina radiomarcada se reduce en un 78%, y la viabilidad parasitaria disminuye, mientras que utilizando un inhibidor de serina proteinasas sólo se consigue una disminución de la incorporación de un 40% (Fetterer y Rhoads, (Fetterer y Rhoads, (Fetterer y Rhoads, (Fetterer y Rhoads, 2. Revisión Bibliográfica 53 1997) 1997)1997) 1997). Más tarde Muleke Muleke Muleke Muleke et al et alet al et al . .. . (2006) (2006) (2006) (2006) describieron una proteína que a pH ácido no sólo tenía capacidad para degradar la hemoglobina, sino también la cadena mayor de la IgG caprina y la azocaseína. Dicha proteína se conoce como HC58 y también ha mostrado capacidad para degradar el fibrinógeno a pH básico. En H. contortus se pueden encontrar también otro tipo de proteinasas, como aspartil proteinasas (Longbottom (Longbottom (Longbottom (Longbottom et al et alet al et al ., 1997 ., 1997., 1997 ., 1997; ; ; ; Smith Smith Smith Smith et al et alet al et al ., 2003) ., 2003)., 2003) ., 2003) o metaloproteinasas ( (( (Redmond Redmond Redmond Redmond et al et alet al et al ., 1997; Smith ., 1997; Smith ., 1997; Smith ., 1997; Smith et al et alet al et al ., 1999; ., 1999; ., 1999; ., 1999; Newlands Newlands Newlands Newlands et al et alet al et al ., 2006) ., 2006)., 2006) ., 2006), pero sus funciones no se han investigado con tanta profundidad como las proteinasas tipo cisteína. 2. 2.2. 2.2 22 2.3. .3..3. .3. UTILIDAD DIAGNÓSTICA DE LAS UTILIDAD DIAGNÓSTICA DE LAS UTILIDAD DIAGNÓSTICA DE LAS UTILIDAD DIAGNÓSTICA DE LAS PROTEINASA PROTEINASAPROTEINASA PROTEINASAS SS S Las proteinasas tipo cisteína no sólo están involucradas en procesos fisiopatológicos sino que pueden resultar también útiles como marcadores de diagnóstico y pronóstico de determinadas enfermedades en el hombre y en los animales (Berdowska, 2004) (Berdowska, 2004)(Berdowska, 2004) (Berdowska, 2004). En este sentido, extractos de una proteinasa tipo cisteína de 28 kDa del trematodo Fasciola gigantica han sido utilizados como antígeno para el inmunodiagnóstico mediante ELISA de la fasciolosis en vacuno, ovino y caprino (Fagbemi y Guobadia, 1995) (Fagbemi y Guobadia, 1995)(Fagbemi y Guobadia, 1995) (Fagbemi y Guobadia, 1995). La misma catepsina L de 28 kDa ha sido empleada por otros autores para el diagnóstico de la fasciolosis en ganado ovino utilizando otras técnicas diferentes al ELISA, como el Western blotting y/o el Dipstick ELISA (Dixit (Dixit (Dixit (Dixit et al et alet al et al ., 2002; Yadav ., 2002; Yadav ., 2002; Yadav ., 2002; Yadav et al et alet al et al ., 2005) ., 2005)., 2005) ., 2005). Más recientemente, se ha valorado la sensibilidad y eficacia del inmunodiagnóstico mediante ELISA de esta parasitosis en búfalos de agua usando en la detección dos tipos de antígenos, proteinasas tipo cisteína del tipo catepsina L (Dixit (Dixit (Dixit (Dixit et al et alet al et al ., 2008) ., 2008)., 2008) ., 2008) y proteinasas recombinantes tipo catepsina L1-D. La sensibilidad de la técnica fue superior al 97% y se obtuvo una especificidad del 100%. Además, no se observaron reacciones cruzadas con otros parásitos como, por ejemplo, Schistosoma indicum, S. spindale, Paramphistomum epiclitum, Gastrothylax spp. , Gigantocotyle explanatum y Strongyloides papilossus (Raina (Raina (Raina (Raina et al et alet al et al . .. ., 2006) , 2006), 2006) , 2006). También se han obtenido resultados satisfactorios a partir de la construcción de 3 péptidos sobre la base de la región amino terminal del sitio enzimático de la catepsina L de F. gigantica (aminoácidos 110-123) (Jezek (Jezek (Jezek (Jezek et al et alet al et al ., 2007) ., 2007)., 2007) ., 2007). El valor diagnóstico de las proteinasas tipo cisteína de Fasciola gigantica no sólo se ha evaluado en animales sino también en medicina humana, donde se ha llegado a poner a punto un test ELISA de alta sensibilidad y precisión que detecta IgG (subclase 4, IgG4) frente a una catepsina L1 del parásito (Wongkham (Wongkham (Wongkham (Wongkham et al et alet al et al ., ., ., ., 2005) 2005)2005) 2005). Otros estudios obtuvieron resultados similares empleando el antígeno recombinante de la misma proteinasa tipo cisteína (Tantraw (Tantraw(Tantraw (Tantrawatpan atpan atpan atpan et al et alet al et al ., 2005) ., 2005)., 2005) ., 2005). 2. Revisión Bibliográfica 54 Finalmente, algunos autores han demostrado que el serodiagnóstico mediante ELISA usando proteinasas tipo cisteína purificadas de Fasciola gigantica era más concluyente y permitía discriminar mejor entre poblaciones de individuos seropositivos y seronegativos que cuando se utilizaban extractos somáticos (Rokni (Rokni (Rokni (Rokni et et et et al alal al ., 2003) ., 2003)., 2003) ., 2003). Fasciola hepatica , otro trematodo del mismo género, ha sido estudiado en numerosas ocasiones para evaluar la capacidad diagnóstica de sus proteinasas. Cornelissen Cornelissen Cornelissen Cornelissen et al et alet al et al . .. . ( ( ( (1999) 1999)1999) 1999) pusieron de manifiesto el valor inmunodiagnóstico de las proteinasas tipo cisteína del tipo catepsina L mediante ELISA en vacuno. . . . Además, se observó que la forma recombinante de dicho antígeno poseía un valor inmodiagnóstico de alta sensibilidad y fiabilidad en fases tempranas de la infección, tanto en ovino como en vacuno (Cornelissen (Cornelissen (Cornelissen (Cornelissen et al et alet al et al ., 2001) ., 2001)., 2001) ., 2001). Otros estudios ha evaluado la eficacia de estos métodos diagnósticos en medicina humana. De esta manera, al igual que en rumiantes, existen métodos de detección de anticuerpos mediante ELISA frente a una forma recombinante de proteinasas tipo cisteína del tipo procatepsina L (Carnevale (Carnevale (Carnevale (Carnevale et al et alet al et al ., 2001) ., 2001)., 2001) ., 2001). El diagnóstico de la fasciolosis también se ha abordado mediante ELISA utilizando proteinasas tipo cisteína de 26 kDa (Fas1) (Timoteo (Timoteo (Timoteo (Timoteo et al et alet al et al ., 2005) ., 2005)., 2005) ., 2005) y de 25 kDa (Fas2), tanto en animales (alpacas) (Neyra (Neyra (Neyra (Neyra et al et alet al et al ., ., ., ., 2002; Timoteo 2002; Timoteo 2002; Timoteo 2002; Timoteo et al et alet al et al ., 2005) ., 2005)., 2005) ., 2005) como en humana (Espinoza (Espinoza (Espinoza (Espinoza et al et alet al et al ., 2005; Espinoza ., 2005; Espinoza ., 2005; Espinoza ., 2005; Espinoza et al et alet al et al ., ., ., ., 2007) 2007)2007) 2007). Por último, fracciones proteolíticas de 28 y 34 kDa (P28 y P34 respectivamente) con actividad cisteína proteinasa fueron identificadas y empleadas con éxito para diagnosticar mediante ELISA indirecto la fasciolosis producida por F. hepatica en ganado caprino (Ruiz (Ruiz (Ruiz (Ruiz et al et alet al et al ., 2003) ., 2003)., 2003) ., 2003). Más recientemente, se ha demostrado que en los productos de excreciónsecreción de Schistosoma mansoni figuran dos sustancias altamente inmunogénicas y específicas con actividad cisteína proteinasa, con pesos moleculares de 31/32 kDa y 38/40 kDa (Planchart (Planchart (Planchart (Planchart et al et alet al et al ., 2007) ., 2007)., 2007) ., 2007). Los autores de este trabajo propusieron la utilización de estos antígenos como una buena estrategia de diagnóstico de la schistosomosis, capaz de determinar el grado de intensidad de la infección, la eficacia de la quimioterapia y la presencia de infecciones activas. 2. 2.2. 2.2. 2.2. 2.4. 4. 4. 4. UTILIDAD INMUNOPROFILÁCTICA DE LAS PROTEINASAS UTILIDAD INMUNOPROFILÁCTICA DE LAS PROTEINASASUTILIDAD INMUNOPROFILÁCTICA DE LAS PROTEINASAS UTILIDAD INMUNOPROFILÁCTICA DE LAS PROTEINASAS La actividad proteinasa ha sido identificada en extractos y secreciones de un gran número de nematodos y trematodos, tanto en el hombre como en los animales. Dada la importancia de estas enzimas proteolíticas en la supervivencia de los parásitos por su intervención en procesos fisiológicos fundamentales como la invasión de los tejidos, la alimentación, la embriogénesis y la evasión de la respuesta 2. Revisión Bibliográfica 55 inmune, se han propuesto como candidatas para el desarrollo de vacunas. Han sido numerosas las publicaciones que han descrito niveles variables de protección frente a diversos helmintos usando un gran número de antígenos, entre los cuales las proteinasas representan un grupo de moléculas de poder inmunógeno ampliamente reconocido. Como breve reseña bibliográfica se puede mencionar que tanto el ganado ovino como el vacuno han resultado protegidos frente a Fasciola hepatica tras la inmunización con cisteína y metaloproteinasas (Dalton y Mulcahy, 2001) (Dalton y Mulcahy, 2001)(Dalton y Mulcahy, 2001) (Dalton y Mulcahy, 2001). Además, tal como se ha indicado en el apartado de Inmunoprofilaxis InmunoprofilaxisInmunoprofilaxis Inmunoprofilaxis, se ha conseguido inmunoprotección en ovejas frente a H. contortus empleando extractos de membrana de intestino ricos en proteinasas (H-gal-GP) (Knox y Smith, 2001) (Knox y Smith, 2001) (Knox y Smith, 2001) (Knox y Smith, 2001) con actividad aspartil proteinasa, metaloproteinasa neutra y proteinasa tipo cisteína (Smith (Smith (Smith (Smith et al et alet al et al ., 1999) ., 1999)., 1999) ., 1999). Por otro lado, también se ha observado que perros inmunizados con una vacuna recombinante a partir de una aspártico proteinasa presentaron una reducción de la carga parasitaria de Ancylostoma caninum (Hotez (Hotez (Hotez (Hotez et al et alet al et al ., 2002) ., 2002)., 2002) ., 2002) y que una proteinasa tipo catepsina F secretada por las larvas L4 de Teladorsagia circumcincta fue capaz de inducir una respuesta de IgA local en ovino asociada a un retraso en el crecimiento de los vermes adultos y retención de las L4 (Redmond (Redmond (Redmond (Redmond et et et et al alal al ., 2006) ., 2006)., 2006) ., 2006). 2. 2.2. 2.2.4.1. 2.4.1.2.4.1. 2.4.1. Utilidad inmunógena de las aspártico Utilidad inmunógena de las aspártico Utilidad inmunógena de las aspártico Utilidad inmunógena de las aspártico proteinasa proteinasaproteinasa proteinasas ss s Este tipo de proteinasas se expresa en el intestino de nematodos y trematodos hematófagos, e interviene en los primeros eventos que tienen lugar en el hospedador en la digestión de la hemoglobina (Brindley (Brindley (Brindley (Brindley et al et alet al et al ., 1997; Brindley ., 1997; Brindley ., 1997; Brindley ., 1997; Brindley et al et alet al et al ., 2001; ., 2001; ., 2001; ., 2001; Williamson Williamson Williamson Williamson et al et alet al et al ., 2002) ., 2002)., 2002) ., 2002). Se han realizado estudios con vacunas recombinantes del tipo catepsina D en Schistosoma japonicum , donde se generó una leve protección (21-38%) frente a una posterior infección, pero no se observó efecto frente a la fecundidad del parásito; además, la protección no se correlacionó con niveles de anticuerpos ( (( (Verity Verity Verity Verity et al et alet al et al ., 2001) ., 2001)., 2001) ., 2001). También se han realizado ensayos con una catepsina D (Ac-APR-1) en perros frente a Ancylostoma caninum , sin llegarse a generar un gran nivel de protección (18%) (Hotez (Hotez (Hotez (Hotez et al et alet al et al ., 2002) ., 2002)., 2002) ., 2002). Un grado de protección mayor frente a Ancylostoma caninum ha sido obtenido recientemente por Pearson PearsonPearson Pearson et al et alet al et al . .. . (2009) (2009) (2009) (2009) al inmunizar a perros con una aspártico proteinasa similar a la Ac-APR-1, concretamente con la Na-APR-1 extraída de Necator americanus . Los perros vacunados presentaron menores recuentos de huevos, menor carga parasitaria, menor pérdida de peso, así como una menor sintomatología que los no vacunados. 2. Revisión Bibliográfica 56 Otro tipo de aspártico proteinasas relacionadas con la pepsina se ha encontrado en el intestino de H. contortus (Longbottom (Longbottom (Longbottom (Longbottom et al et alet al et al ., 1997) ., 1997)., 1997) ., 1997) y en Necator americanus (Na-APR-2) (Williamson (Williamson (Williamson (Williamson et al et alet al et al ., 2003) ., 2003)., 2003) ., 2003). En los estudios de inmunoprotección realizados con este tipo de antígenos se ha observado que NaAPR-2 es capaz de inhibir in vitro el 50% de la infección percutánea por larvas y los antisueros, tanto frente a APR-2 como frente a APR-1, son capaces de inhibir la capacidad de las respectivas proteinasas de digerir substratos peptídicos in vitro (Williamson (Williamson (Williamson (Williamson et al et alet al et al ., 2002) ., 2002)., 2002) ., 2002). Otros autores identificaron proteinasas tipo aspártico en el complejo H-gal-GP, las denominadas HcPEP1 y HcPEP2, que fueron empleadas con éxito como antígenos inmunógenos en ovino, también frente a H. contortus , obteniéndose reducciones en la eliminación de huevos en las heces y de la carga parasitaria entre el 30-50% (Smith (Smith (Smith (Smith et al et alet al et al ., 2003) ., 2003)., 2003) ., 2003). 2. 2.2. 2.2. 2.2. 2.4.2. 4.2.4.2. 4.2. Utilidad inmunógena de Utilidad inmunógena deUtilidad inmunógena de Utilidad inmunógena de las metalo las metalolas metalo las metaloproteinasa proteinasaproteinasa proteinasas ss s Las metaloproteinasas de los helmintos parásitos están involucradas en procesos como la invasión de los tejidos por las larvas y la alimentación de los vermes adultos. Dentro de este tipo de proteinasas se encuentran las metaloproteinasas dependientes de Zinc que son secretadas por el adulto (Hotez (Hotez (Hotez (Hotez et al et alet al et al ., 1985; Jones y ., 1985; Jones y ., 1985; Jones y ., 1985; Jones y Hotez, 2002) Hotez, 2002)Hotez, 2002) Hotez, 2002) y las larvas (Zhan (Zhan (Zhan (Zhan et al et alet al et al ., 2002) ., 2002)., 2002) ., 2002) de gusanos ganchudos y Strongyloides stercoralis (Brindley (Brindley (Brindley (Brindley et al et alet al et al ., 1995) ., 1995)., 1995) ., 1995). La forma recombinante de una de estas enzimas, obtenidas a partir de larvas de A. caninum (Ac-MTP-1), no indujo sin embargo protección frente a una infección posterior con larvas. Coincidiendo con esta falta de protección, esta proteína recombinante no desarrolló actividad enzimática (Dalton (Dalton (Dalton (Dalton et et et et al alal al ., 2003) ., 2003)., 2003) ., 2003). Otras metaloendopeptidasas expresadas por los adultos de Ancylostoma en su luz intestinal, y que muestran un alto grado de semejanza en su secuencia de aminoácidos con la metaloendopeptidasas de H. contortus (Jones y Hotez, 2002) (Jones y Hotez, 2002) (Jones y Hotez, 2002) (Jones y Hotez, 2002) y la neprilisina humana, como las denominadas Ac-MEP-1, se han propuesto como antígenos ocultos susceptibles de ser utilizados en ensayos de vacunación. Éstos tendrían propiedades similares a los antígenos ocultos que han demostrado gran eficacia en vacunas frente a las ixodidosis del ganado bovino (Wong y Opdebeeck (Wong y Opdebeeck(Wong y Opdebeeck (Wong y Opdebeeck, , , , 1993) 1993)1993) 1993). También se han realizado estudios de vacunación en ovejas con leucina aminopeptidasa, una metaloproteinasa de F. hepatica que fue capaz de inducir la producción de anticuerpos neutralizantes y una protección del 89% frente a la fasciolosis (Pia (Pia(Pia (Piacenza cenza cenza cenza et al et alet al et al ., 1999) ., 1999)., 1999) ., 1999). Finalmente, como ya se ha mencionado en el capítulo de Profilaxis y Profilaxis y Profilaxis y Profilaxis y C CC Control ontrolontrol ontrol, la inmunización de ovejas con aminopeptidasa M, denominada H11, es también altamente eficaz frente a H. contortus , siendo posibles 2. Revisión Bibliográfica 57 reducciones del número de vermes adultos que pueden llegar hasta un 90% (Smith (Smith (Smith (Smith et et et et al alal al ., 1993 ., 1993., 1993 ., 1993b bb b) )) ). 2. 2.2. 2.2 22 2.4.3. .4.3..4.3. .4.3. Utilidad inmunógena de las Utilidad inmunógena de las Utilidad inmunógena de las Utilidad inmunógena de las proteinasas tipo cisteína proteinasas tipo cisteínaproteinasas tipo cisteína proteinasas tipo cisteína Ciertos estudios revelan que la actividad enzimática de las proteinasas tipo catepsina L destaca entre los productos de excreción/secreción de las fases juveniles de Fasciola hepatica , y han sido asociadas a la proteolisis de IgG (Chapman y (Chapman y (Chapman y (Chapman y Mitchell, 1982; Smith Mitchell, 1982; Smith Mitchell, 1982; Smith Mitchell, 1982; Smith et al et alet al et al ., 1993 ., 1993., 1993 ., 1993a aa a) )) ). También se ha observado que impiden la adherencia de eosinófilos (Carmona (Carmona (Carmona (Carmona et al et alet al et al ., 1993) ., 1993)., 1993) ., 1993) y son capaces de suprimir la respuesta de las células T (O'Neill (O'Neill (O'Neill (O'Neill et al et alet al et al ., 2001; Prowse ., 2001; Prowse ., 2001; Prowse ., 2001; Prowse et al et alet al et al ., 2002) ., 2002)., 2002) ., 2002). Todas estas actividades podrían explicar el hecho de que la inmunización de ganado vacuno con catepsinas L1 y L2 purificadas de F. hepatica sean capaces de inducir más de un 60% de protección frente al establecimiento de vermes adultos, además de una inhibición de la embriogénesis de los huevos (Dalton (Dalton (Dalton (Dalton et al et alet al et al ., 1996a; Mulcahy ., 1996a; Mulcahy ., 1996a; Mulcahy ., 1996a; Mulcahy et al et alet al et al ., 1998) ., 1998)., 1998) ., 1998). La inmunización en ratas frente a este trematodo también ha resultado eficaz utilizando vacunas recombinantes de proteinasas tipo cisteína que fueron clonadas a partir de vermes adultos del parásito. Este mismo antígeno se ha mostrado eficaz tanto en bovinos ( (( (Dabrowska Dabrowska Dabrowska Dabrowska et al et alet al et al ., 2006) ., 2006)., 2006) ., 2006) como en ovinos (Wedrychowicz (Wedrychowicz (Wedrychowicz (Wedrychowicz et al et alet al et al ., 2007) ., 2007)., 2007) ., 2007). Recientemente, Jayaraj JayarajJayaraj Jayaraj et al et alet al et al . .. . (2009) (2009) (2009) (2009) han realizado ensayos de inmunización en ratas utilizando como antígeno la forma recombinante de otros 3 tipos de proteinasas tipo cisteína de F. hepatica (catepsina L5, catepsina L1g y catepsina B). La utilización tanto de cada antígeno por separado como de las combinaciones de todos ellos se tradujo en una reducción significativa de la carga parasitaria, siendo la combinación de catepsina B y catepsina L5 la que ofreció mejores resultados. En extractos de otros trematodos como Schistosoma spp. también se encuentran proteinasas del tipo catepsina B y L que parecen participar en la cascada proteolítica de la hemoglobina en el intestino (Dalton (Dalton (Dalton (Dalton et al et alet al et al ., 1996b; Brindley ., 1996b; Brindley ., 1996b; Brindley ., 1996b; Brindley et al et alet al et al ., ., ., ., 1997; Tort 1997; Tort 1997; Tort 1997; Tort et al et alet al et al ., 1999) ., 1999)., 1999) ., 1999). Algunos ensayos in vitro e in vivo han demostrado el efecto frente a la fecundidad del parásito de estas proteinasas (Brindley (Brindley (Brindley (Brindley et al et alet al et al ., 1997) ., 1997)., 1997) ., 1997) y otras como la calpaína (Ohta (Ohta (Ohta (Ohta et al et alet al et al ., 2004) ., 2004)., 2004) ., 2004). Más recientemente, se ha observado que la administración de IL-4 puede mejorar el efecto protector de la vacuna de ADN de catepsina B contra la infección por S. japonicum en ratones (Chen (Chen (Chen (Chen et al et alet al et al ., 2005) ., 2005)., 2005) ., 2005). En otras especies de este género, concretamente S. mansoni , se han realizado también ensayos de vacunación utilizando una asparaginil endopeptidasa ( Sm32 ) que desde el punto de vista funcional se trata de una proteinasa tipo cisteína, que sin embargo no está relacionada con la secuencia de las catepsinas L o B. También en este caso la vacunación provocó una alteración en la fecundidad de Schistosoma sp. en roedores (Chlichlia (Chlichlia (Chlichlia (Chlichlia et al et alet al et al ., 2001) ., 2001)., 2001) ., 2001). 2. Revisión Bibliográfica 58 En los nematodos gastrointestinales de los rumiantes se han realizado estudios de inmunoprotección frente a Ostertagia ostertagi en ganado vacuno utilizando como antígeno fracciones enriquecidas de proteinasas tipo cisteína. Las purificaciones se realizaron mediante cromatografía en thiol-sepharose a partir de extractos de vermes adultos obtenidos con Triton X-100 (S3-thiol) y de productos de ES también de adultos (ES-thiol). De los dos tipos de antígeno, solamente el ES-thiol fue capaz de inducir inmunoprotección en bovinos frente a Ostertagia ostertagi . La protección se tradujo en una disminución significativa de los recuentos fecales (60%), un alto porcentaje de larvas L4 inhibidas (9,8%) y un menor número de vermes adultos (18% menos). Además, tanto las hembras como los machos adultos fueron significativamente más pequeños, y las hembras presentaron un menor número de huevos intrauterinos. Los niveles de anticuerpos locales específicos de Ostertagia mostraron una correlación negativa con el tamaño de los vermes adultos del parásito, el número de huevos por hembra y el recuento acumulado de huevos en heces. Sin embargo, estas correlaciones fueron bastante débiles (Geldhof (Geldhof (Geldhof (Geldhof et al et alet al et al ., 2002) ., 2002)., 2002) ., 2002). Posteriormente, el antígeno ES-thiol fue fraccionado mediante cromatografía de intercambio de iones (Sepharose-Q) para separar las proteínas secretadas asociadas por activación (ASPs), las proteinasas tipo cisteína y el resto de fracciones. Los tres tipos de fracciones fueron empleadas como inmunógenos y se obtuvieron reducciones en el recuento fecal de huevos del 74, 80 y 70% respectivamente. Aunque no hubo disminución de la carga parasitaria en ninguno de estos grupos, sí se observó que todos los vermes eran de menor tamaño que los del grupo control ( (( (Geldhof Geldhof Geldhof Geldhof et al et alet al et al ., 200 ., 200., 200 ., 2008 88 8) )) ). Los animales inmunizados con ASPs no presentaron reacciones cruzadas mediante Western blot con los otros dos grupos y sólo reconocieron las ASPs por lo que se propuso que era precisamente esta fracción la principal responsable de la protección (Meyvis (Meyvis (Meyvis (Meyvis et al et alet al et al ., 2007) ., 2007)., 2007) ., 2007). No obstante, la vacunación mediante la forma recombinante de este antígeno (Oo-ASP1) no mostró ningún efecto inmunoprotector (Geldhof (Geldhof (Geldhof (Geldhof et al et alet al et al ., 2008) ., 2008)., 2008) ., 2008). 2. 2.2. 2.2 22 2.4.3 .4.3.4.3 .4.3.1. .1..1. .1. Utilidad inmunógena de las proteinasas Utilidad inmunógena de las proteinasas Utilidad inmunógena de las proteinasas Utilidad inmunógena de las proteinasas tip tiptip tipo o o o cisteína cisteína cisteína cisteína en enen en Haemonchus Haemonchus Haemonchus Haemonchus contortus contortuscontortus contortus Como ya se ha indicado, las cisteína proteinasas desempeñan funciones vitales en H. contortus . La importancia de todas estas funciones justifica el hecho de que cualquier alteración de su actividad a través de la respuesta inmune del hospedador pueda dificultar la penetración, asentamiento y pervivencia del parásito en el mismo. 2. Revisión Bibliográfica 59 En la actualidad se han evaluado con fines inmunoprotectores, con distinta efectividad, diversas fracciones de H. contortus con actividad proteinasa tipo cisteína. Una de ellas contiene un complejo formado por dos proteínas de 35 y 55 kDa con capacidad de degradar el fibrinógeno, la primera de las cuales mostraría una homología con la catepsina B (Cox (Cox (Cox (Cox et al et alet al et al ., 1990; Boisvenue ., 1990; Boisvenue ., 1990; Boisvenue ., 1990; Boisvenue et al et alet al et al ., 1992) ., 1992)., 1992) ., 1992), no llegando a mostrar dicho complejo gran efectividad como inmunógeno frente a la haemonchosis ovina (Boisvenue (Boisvenue (Boisvenue (Boisvenue et al et alet al et al ., 1992) ., 1992)., 1992) ., 1992). Otra fracción con actividad proteinasa tipo cisteína, peso molecular de 70 kDa, y cierta homología con la anterior, fue aislada por Knox KnoxKnox Knox et al et alet al et al . (1995b) . (1995b). (1995b) . (1995b). Posteriormente, estos mismos autores ( (( (Knox Knox Knox Knox et al et alet al et al ., .,., ., 1999) 1999)1999) 1999) aislaron 3 tipos de extractos en función del solvente empleado: PBS (S1) (phosphate-buffered saline soluble), Tween 20 (S2) y Tritón X-100 (S3). Todos los extractos se pasaron a través de columnas Thiol-Sepharosa, confirmando la presencia de proteinasas tipo cisteína. Las proteinasas tipo cisteína halladas en las fracciones S1 y S2 se encontraron en un rango de 50-55 kDa, coincidentes con las descritas por Karanu Karanu Karanu Karanu et al et alet al et al . .. . ( (( (1993) 1993)1993) 1993), mientras que en el extracto S3 se encontraron fracciones de 35 y 70 kDa similares a las descritas por Boisvenue Boisvenue Boisvenue Boisvenue et al et alet al et al . .. . ( (( (1992) 1992)1992) 1992). Al evaluar la capacidad inmunoprotectora de estas fracciones se observó que las fracciones S1 y S2 no inducían un considerable nivel de protección, únicamente una ligera disminución en los recuentos fecales de huevos y en la cantidad de vermes en los animales vacunados. Sin embargo, la fracción S3 sí mostró mayor potencial inmunógeno, detectándose descensos en los recuentos fecales de huevos de hasta el 95% (Knox (Knox (Knox (Knox et al et alet al et al ., 1999) ., 1999)., 1999) ., 1999). En otros estudios realizados en ovino, la vacunación con extractos de detergente procedentes de vermes adultos enriquecidos para proteinasas tipo cisteína de membrana de intestino (TBSP) han dado lugar a una reducción media del recuento fecal de huevos y de la carga parasitaria del 77% y 47%, respectivamente (Knox y Smith, 2001) (Knox y Smith, 2001)(Knox y Smith, 2001) (Knox y Smith, 2001). La presencia de anticuerpos de ovejas vacunadas con TBSP natural con capacidad para inhibir la actividad proteinasa tipo cisteína de TBSP in vitro (Knox (Knox (Knox (Knox et al et alet al et al ., 2005) ., 2005)., 2005) ., 2005) pone de manifiesto la posibilidad de que el mecanismo de inmunidad pudiese estar mediado por anticuerpos capaces de inhibir la digestión de proteínas. Posteriormente, Ruiz Ruiz Ruiz Ruiz et al et alet al et al . (2004a) . (2004a). (2004a) . (2004a) aislaron fracciones proteicas solubles en PBS enriquecidas para proteinasas tipo cisteína con columnas de Thiol-Sepharosa, cuyo principal componente era una proteinasa tipo cisteína de 35 kDa, similar a la encontrada por Cox Cox Cox Cox et al et alet al et al . (1991) . (1991). (1991) . (1991). Dicha fracción se mostró capaz de inmunizar eficazmente a caprinos frente a la haemonchosis, registrándose una reducción significativa tanto en el HPG como en la carga parasitaria. Recientemente, De Vries De Vries De Vries De Vries 2. Revisión Bibliográfica 60 et al et alet al et al . (2009) . (2009). (2009) . (2009) utilizando la proteinasa tipo cisteína AC-5 identificada en productos de excreción/secreción del parásito, han conseguido una reducción de la carga parasitaria del 36% y de los recuentos fecales del 32% en ovinos inmunizados. Se ha demostrado también que vacunas recombinantes a partir de proteinasas tipo cisteína son capaces de reducir la carga parasitaria (27%) y el recuento fecal de huevos (29%) en ovejas (Redmond y Knox, 2006) (Redmond y Knox, 2006) (Redmond y Knox, 2006) (Redmond y Knox, 2006). Aunque sin éxito, también se ha propuesto la posibilidad de obtener una vacuna recombinante eficaz a partir de la extracción y purificación de proteinasas tipo cisteína del tipo de la catepsina L a partir de Caenorhabditis elegans (Murray (Murray (Murray (Murray et al et alet al et al ., 2007) ., 2007)., 2007) ., 2007). 2. 2.2. 2.3 33 3. . . . POLIMORFISMO GENÉ POLIMORFISMO GENÉPOLIMORFISMO GENÉ POLIMORFISMO GENÉTICO TICOTICO TICO El genoma representa el material genético presente en una sola célula de un organismo. Está constituido por moléculas de ácido desoxirribonucleico (ADN) que están repartidas en un número determinado de cromosomas según la especie. A su vez, cada gen es una secuencia de bases de ADN que codifica o contiene la información para sintetizar una proteína determinada. Una cadena de ADN es un largo polímero ramificado compuesto únicamente de cuatro subunidades distintas. Estas subunidades son los desoxirribonucleótidos que contienen las bases adenina (A), citosina (C), guanina (G) y timina (T). Los nucleótidos están unidos por enlaces covalentes fosfodiéster entre el carbono 5’ de un grupo desoxirribosa y el carbono 3’ del siguiente. Las cuatro bases están fijadas a esta cadena azúcar-fosfato repetitiva, casi como cuatro tipos diferentes de cuentas ensartadas en un collar ( (( (Alberts Alberts Alberts Alberts et al et alet al et al ., 1994 ., 1994., 1994 ., 1994) )) ). La secuencia de los genes generalmente es estable, pero a veces puede sufrir cambios que reciben el nombre de mutaciones. Las consecuencias de estos errores son dobles. Por un lado, el error será copiado en todas las generaciones futuras, ya que las secuencias de ADN “malas” se copian con igual fidelidad que las “buenas”. Por otro lado, el error puede tener efectos importantes sobre la célula, según el lugar donde se haya producido la mutación ( (( (Alberts Alberts Alberts Alberts et al et alet al et al ., 1994 ., 1994., 1994 ., 1994) )) ). Las mutaciones pueden provocar la modificación de la síntesis de la proteína que codifica el gen mutado y por tanto pueden afectar a la función de dicha proteína en el organismo al que pertenecen. Las mutaciones constituyen la base principal de variabilidad en las poblaciones y sirven además como herramienta para diferenciar individuos ( (( (Alberts Alberts Alberts Alberts et al et alet al et al ., 1994 ., 1994., 1994 ., 1994) )) ). 2. Revisión Bibliográfica 67 enzimas podrían variar entre diferentes aislados geográficos (Karanu (Karanu (Karanu (Karanu et al et alet al et al ., 1993; ., 1993; ., 1993; ., 1993; Knox Knox Knox Knox et al et alet al et al ., 1993) ., 1993)., 1993) ., 1993). La existencia de esta variabilidad ha sido también sugerida por Karanu Karanu Karanu Karanu et al et alet al et al . .. . (1997) (1997)(1997) (1997) al estudiar mediante zimoensayos las proteinasas de productos de excreciónsecreción de H. contortus en aislados geográficos procedentes de Kenia y Estados Unidos. Las proteinasas de ambos aislados no sólo difieren de forma significativa en relación a su peso molecular sino también en cuanto a su actividad: mientras que las estadounidenses mostraron actividad tipo cisteína, la actividad observada en las de origen africano fue mayoritariamente del tipo de las metaloproteinasas y proteinasas tipo serina. Es importante destacar de este trabajo que, además de las variaciones intergeográficas, también se observaron este tipo de variaciones entre los dos aislados de Kenia estudiados (KI y KII). Diferentes estudios a nivel molecular han demostrado igualmente gran variabilidad entre las proteinasas presentes en H. contortus . A partir de tales proteinasas, catalogadas como catepsinas tipo B (CTB), se identificaron inicialmente cinco genes diferentes pertenecientes a una misma familia (Pratt (Pratt (Pratt (Pratt et al et alet al et al ., 1990; Pratt ., 1990; Pratt ., 1990; Pratt ., 1990; Pratt et et et et al alal al ., 1992) ., 1992)., 1992) ., 1992) y con posterioridad un gen que codificaba un polipéptido CTB (GCP) distinto de los cinco genes CTB anteriores (Rehman y Jasmer, 1998) (Rehman y Jasmer, 1998)(Rehman y Jasmer, 1998) (Rehman y Jasmer, 1998). Skuce Skuce Skuce Skuce et al et alet al et al . .. . (1999 (1999 (1999 (1999a aa a) )) ), tras realizar un panel de cDNAs codificadores de cisteína proteinasas tipo catepsina B, observaron mediante Southern blot genómico que algunas de esas enzimas estaban codificadas por una única copia de genes, mientras que otras lo estaban por múltiples copias. Un posterior análisis secuencial de estas proteinasas demostró que existían claras diferencias a nivel molecular entre las procedentes de dos aislados geográficos distintos, uno del Reino Unido (UK) y otro de los Estados Unidos de América (USA). Estos autores lograron identificar 3 proteinasas tipo cisteínas en la cepa de UK (hcmp1, 4 y 6) y localizarlas específicamente mediante inmunofluorescencia en el intestino de H. contortus. Estas proteinasas eran distintas de las de la familia AC y al GCP-7, llegando sólo al 60% de similitud en la secuencia de aminoácidos. Skuce Skuce Skuce Skuce et al et alet al et al . (1999a . (1999a. (1999a . (1999a) )) ) intentaron sin éxito amplificar mediante una PCR genérica algún gen de la familia AC o el GCP-7, en su lugar, se amplificó un panel de 4 homólogos de cisteína proteinasas (hcmp14). Además, el esfuerzo por clonar el gen AC-1 (Cox (Cox (Cox (Cox et al et alet al et al ., 1990) ., 1990) ., 1990) ., 1990) sólo tuvo como consecuencia la amplificación de un nuevo homólogo de la catepsina B, que denominaron hmcp5. Este compartía mayor homología con hmcp3 y 4 (68% aprox.), si bien su secuencia de nucleótidos fue más similar al grupo AC (1-5) (58% aprox.) que a hmcp1 y 2. Es poco probable que los genes codificados de proteinasas tipo cisteína de ambas cepas se hayan distanciado tanto como para que sus productos sean 2. Revisión Bibliográfica 68 proteinasas de familias distintas. Más bien representan distintos grupos de proteinasas tipo cisteína relacionados. De hecho, los análisis filogenéticos indican que el grupo de genes AC y hmcp están suficientemente relacionados como para ocupar un único clan (Tort (Tort (Tort (Tort et al et alet al et al ., 1998) ., 1998)., 1998) ., 1998). Por su parte, Ruiz Ruiz Ruiz Ruiz et al et alet al et al . .. . (2004b) (2004b) (2004b) (2004b) evaluaron la variabilidad genética en las proteinasas tipo cisteína procedentes de dos cepas de H. contortus , una aislada en ganado caprino de Gran Canaria y otra de ovinos de Norteamérica, en un total de 5 loci amplificados previamente por PCR a partir de las secuencias de los genes AC-1 (Pratt (Pratt (Pratt (Pratt et al et alet al et al ., 1990) ., 1990)., 1990) ., 1990), AC-3, AC-4 y AC-5 (Pratt (Pratt (Pratt (Pratt et al et alet al et al ., 1992) ., 1992)., 1992) ., 1992) y GCP-7 (Rehman y (Rehman y (Rehman y (Rehman y Jasmer, 1998) Jasmer, 1998)Jasmer, 1998) Jasmer, 1998). Con excepción del locus AC-5, el resto de loci fueron polimórficos, con valores de variabilidad genética total (Ht) que oscilaron entre 0,353 y 0,669. Se observaron un total de 20 alelos diferentes mediante la técnica SSCP, cuyas frecuencias génicas difirieron significativamente entre las dos cepas analizadas. El análisis de la secuencia de nucleótidos de los diferentes alelos reveló igualmente la existencia de un importante grado de diversidad nucleotídica (π) con valores que oscilaron entre 0,0334 y 0,1037 (Ruiz (Ruiz (Ruiz (Ruiz et al et alet al et al ., 2004b) ., 2004b)., 2004b) ., 2004b). Tal como se ha comentado previamente, numerosos han sido los estudios que describen la importancia de la variación genética en los nematodos desde distintos puntos de vista. Rehman y Jasmer (1999) Rehman y Jasmer (1999)Rehman y Jasmer (1999) Rehman y Jasmer (1999) realizaron un estudio donde valoraron la variabilidad funcional de las catepsinas tipo B en distintos nematodos, entre ellos H. contortus , e identificaron los principales lugares de variación: las subregiones S2 y S2’ del “occluding loop” y los aminoácidos que constituyen la subregión S2. Los análisis secuenciales descritos en este estudio apoyan los trabajos de otros autores en los que se subraya las implicaciones funcionales de las variaciones en las catepsinas tipo B (Larminie y (Larminie y (Larminie y (Larminie y Johnstone, Johnstone,Johnstone, Johnstone, 1996) 1996) 1996) 1996); de ahí la importancia de definir los alelos con mayor potencial inmunoprotector a la hora de instaurar un control inmunológico de la haemonchosis mediante este tipo de enzimas. Por el contrario, Redmon RedmonRedmon Redmond y Windham (2005) d y Windham (2005) d y Windham (2005) d y Windham (2005) observaron que las proteinasas asociadas con fracciones de proteínas integrales de membranas de adultos de H. contortus mostraban una limitada variación geográfica entre las diferentes cepas del parásito en función de su pH óptimo, tamaño molecular y especificidad del sustrato, tal vez debido a una menor presión selectiva que aquellas enzimas que son capaces de generar una respuesta inmune en el hospedador. Por este motivo sugieren que este tipo de proteinasas podrían resultar eficaces como inmmunógenos frente a en un amplio rango de aislados, tal vez a nivel de especie. 3. MATERIAL Y MÉTODOS 3. MATERIAL Y MÉTODOS3. MATERIAL Y MÉTODOS 3. MATERIAL Y MÉTODOS 3. Material y Métodos 69 3.1. ANIMALES 3.1. ANIMALES3.1. ANIMALES 3.1. ANIMALES 3.1.1. ANIMALES DONANTES 3.1.1. ANIMALES DONANTES3.1.1. ANIMALES DONANTES 3.1.1. ANIMALES DONANTES Se utilizaron animales de unos 4 meses de edad como donantes de vermes adultos y larvas infectantes de tercer estado que posteriormente se destinarían a la preparación del antígeno necesario en las inmunizaciones y al desafío de los animales que se emplearon en las inoculaciones experimentales. Por su parte, se emplearon 5 ovejas de lana de raza Canaria para el mantenimiento de la cepa ovina de Haemonchus contortus ( H. contortus) procedente de Norteamérica (cepa NA) y 5 cabras de la ACC (Agrupación Caprina Canaria, variedad Majorera) para el mantenimiento de la cepa caprina del parásito aislada originalmente en Gran Canaria (cepa SP). Ambos grupos de animales se mantuvieron en un ambiente libre de nematodos en cubículos independientes del área de inoculación de la Facultad de Veterinaria de la Universidad de Las Palmas de Gran Canaria, y se alimentaron con maíz, alfalfa deshidratada, paja y agua ad libitum . Para el manejo se utilizó vestimenta y calzado exclusivo para cada cepa con el fin de evitar contaminaciones. Todos los animales se inocularon vía intraruminal con 10.000 L3 infectantes de la correspondiente cepa de H. contortus . A partir de la segunda semana de infección se realizó un chequeo coprológico diario a todos los animales para determinar el comienzo de la eliminación de los huevos, para lo cual se utilizó el método de concentración por flotación en solución saturada de cloruro sódico. Una vez constatada la presencia de huevos se colocó un arnés de cuero a los animales para la recogida de las heces con el fin de obtener la mayor cantidad de heces posible y minimizar las contaminaciones con nematodos de vida libre. La obtención de larvas 3 infectantes y la recogida de adultos se realizaron mediante procedimientos estándar (ver apartados 3.2.1. y 3.2.2 de Material y Métodos Material y MétodosMaterial y Métodos Material y Métodos). 3.1.2. ANIMALES DE EXPERIMENTACIÓN 3.1.2. ANIMALES DE EXPERIMENTACIÓN3.1.2. ANIMALES DE EXPERIMENTACIÓN 3.1.2. ANIMALES DE EXPERIMENTACIÓN Los animales utilizados en los experimentos fueron cabras de la Agrupación Caprina Canaria (ACC) (variedad Majorera) y ovejas canarias de lana procedentes del sureste de la isla de Gran Canaria. Se utilizaron un total de 35 cabras y 35 ovejas. 3. Material y Métodos 70 Todos los animales se alojaron en las instalaciones de la Granja Agrícola Experimental del Cabildo de Gran Canaria, situada en el municipio de Arucas en las proximidades de la Facultad de Veterinaria de la Universidad de Las Palmas de Gran Canaria. Dichas instalaciones fueron previamente limpiadas y desinfectadas. Antes de comenzar la experiencia se analizó el estado de parasitación de los animales. Para ello se tomaron las heces directamente de recto y se analizaron mediante técnicas de concentración (flotación en solución sobresaturada de cloruro sódico y sedimentación formol-éter). Se observaron ooquistes de Eimeria spp., pero las heces estuvieron libres de nematodos en todos los análisis efectuados. Aún así, los animales fueron desparasitados simultáneamente con Diclazuril (Vecoxan ®, Esteve veterinaria) a una dosis de 2 ml/5 k.p.v. y Levamisol (Cyver ®) a una dosis de 1ml/10 k.p.v. Adicionalmente se les administró vitaminas vía IM (Amino-Tiersan ®, Boehringer Ingelheim España, S.A.). Todos los animales se mantuvieron en un ambiente libre de nematodos y se alimentaron con maíz, alfalfa deshidratada, remolacha, paja y agua ad libitum . A fin de evitar infecciones cruzadas entre las cepas utilizadas, los animales infectados con cepas distintas, así como los grupos controles, se mantuvieron en instalaciones independientes y aisladas entre sí. 3.2. 3.2.3.2. 3.2. PARÁSITOS PARÁSITOSPARÁSITOS PARÁSITOS Se utilizaron dos cepas de H. contortus , una de ellas procedente de Norteamérica (cepa NA) y cedida por el Dr. Prichard del Instituto de Parasitología de la Universidad McGill (Montreal-Canadá) y la otra aislada de caprinos de Gran Canaria (cepa SP) mediante el cultivo in vitro de macerados de hembras del parásito de animales infectados de forma natural. Ambas cepas se mantuvieron en animales donantes según se ha descrito previamente en el apartado anterior 3.1.2. de Material Material Material Material y Métodos y Métodosy Métodos y Métodos. 3.2.1. OBTENCIÓN, CONCENTRACIÓN Y PURIFICACIÓN DE 3.2.1. OBTENCIÓN, CONCENTRACIÓN Y PURIFICACIÓN DE 3.2.1. OBTENCIÓN, CONCENTRACIÓN Y PURIFICACIÓN DE 3.2.1. OBTENCIÓN, CONCENTRACIÓN Y PURIFICACIÓN DE LARVAS 3 LARVAS 3LARVAS 3 LARVAS 3 Con el objeto crear condiciones favorables para el desarrollo larvario, las heces recogidas de los correspondientes animales donantes se mezclaron en un recipiente con turba estéril en relación 1/3 aproximadamente (una parte de turba y tres de heces) y se humedecieron con agua destilada hasta conseguir una mezcla 3. Material y Métodos 71 homogénea con un grado de humedad alto, aunque procurando que no hubiese exceso de líquido. Para evitar la contaminación vehiculada por artrópodos y facilitar al mismo tiempo la aireación, los cultivos se cubrieron con una tela tipo tul sellada con elástico. Las incubaciones se realizaron a 22–23°C en una estufa o a temperatura ambiente, según la época del año, durante 12 días. Durante este tiempo, y con una frecuencia de 48 horas, el material fecal se volteó para facilitar la aireación de las capas más profundas del cultivo y minimizar el crecimiento de hongos, añadiendo agua, en caso necesario, para mantener un grado de humedad óptimo. Las larvas infectantes (L3) se obtuvieron mediante el método de Baerman. El material cultivado se colocó sobre una rejilla en un embudo en el que se añadió agua destilada hasta cubrir la parte inferior del material fecal. Transcurridas 24 horas a temperatura ambiente, el líquido del embudo se recogió en una copa de decantación para proceder a la concentración y purificación de las larvas. Con esta finalidad, el líquido recogido del embudo se mantuvo a 4°C durante aproximadamente 24 horas para que las larvas sedimentaran en el fondo. Transcurrido este tiempo, se eliminó el sobrenadante y el sedimento se transfirió y se dejó secar en un papel de filtro durante 24 horas a temperatura ambiente. Una vez seco el papel de filtro se depositó sobre otra copa de decantación con agua limpia y se mantuvo en esta posición durante 24 horas a la misma temperatura; de esta forma se conseguía que las larvas migraran hacia el agua desprendiéndose del papel y que el detritus quedase adherido al filtro. Una vez limpias, las larvas se concentraron mediante decantación y frío de la forma descrita anteriormente y el sedimento con larvas limpias y concentradas se conservó a 4°C hasta su uso en frascos de cultivo de fondo plano. Para favorecer la viabilidad y vitalidad de las larvas el agua se renovó cada 2-3 días (Fleck y Moody, (Fleck y Moody, (Fleck y Moody, (Fleck y Moody, 1988; MAFF, 1989; 1988; MAFF, 1989; 1988; MAFF, 1989; 1988; MAFF, 1989; Colville, 1991) Colville, 1991)Colville, 1991) Colville, 1991). La determinación de la concentración de las larvas se realizó en base a la media obtenida en los recuentos de 10 alícuotas de 20 µl extraídas del volumen total de líquido, previamente mantenido a temperatura ambiente durante 24 horas para favorecer la activación larvaria. En el recuento solamente se consideraron las larvas que mostraban movilidad (MAFF, 1989) (MAFF, 1989)(MAFF, 1989) (MAFF, 1989). 3.2.2. RECOGIDA Y PURIFICACIÓN DE VERMES ADULTOS 3.2.2. RECOGIDA Y PURIFICACIÓN DE VERMES ADULTOS3.2.2. RECOGIDA Y PURIFICACIÓN DE VERMES ADULTOS 3.2.2. RECOGIDA Y PURIFICACIÓN DE VERMES ADULTOS La técnica utilizada para la recogida de adultos de H. contortus se basa en la capacidad de los vermes para migrar activamente desde una película semisólida de agar hacia un medio de cultivo mantenido a 37°C. El material empleado en la técnica y la metodología seguida se describen a continuación. 3. Material y Métodos 72 Se cortaron paños de teflón de manera que su tamaño se ajustase al fondo de bandejas de plástico de aproximadamente 40 X 20 cm (un total de 10-12 bandejas por abomaso). Se dejó más largo el extremo que ha de conectar con la barra soporte para que se pudiese fijar bien a ella mediante pinzas. La longitud real del paño tenía que ser inferior a la del tanque de incubación para que los vermes pudieran migrar al fondo. Una vez fijados los paños a los soportes de madera con pinzas, el conjunto se dispuso en las bandejas ajustando el paño completamente al fondo para evitar que se formasen pliegues; para ello se sumergió previamente el paño en agua tibia, se escurrió y se amoldó luego al fondo de la bandeja. Se preparó suficiente medio de cultivo RPMI 1640 (Sigma) para llenar el tanque y se mantuvo a 38°C (unos 5 litros por tanque y dos tanques por abomaso). Aunque la viabilidad de los vermes disminuye más rápidamente, se han observado resultados aceptables utilizando PBS 0,01 M como medio de incubación. En cualquier caso, la temperatura de la estufa donde se colocaron las urnas se mantuvo a 42°C para que al abrir y cerrar no disminuyese la temperatura por debajo de los 38°C. Además de estos materiales, para cada abomaso se prepararon 14 g de agar (Sigma-Aldrich), 700 ml de agua destilada próximos a ebullición y 700 ml de agua a 38°C. Antes del sacrificio de los animales fue necesario mantenerlos en ayuno entre 24-36 horas con el fin de limitar la cantidad de contenido gástrico. Tras el sacrificio se ligó el abomaso por ambos extremos fuertemente con una cuerda, se identificó convenientemente, se introdujo en una bolsa de plástico y a continuación se pasó a una nevera-termo que contenía agua a unos 40°C para que se mantuviese en lo posible a temperatura corporal hasta su llegada al laboratorio, que se realizó de la manera más rápida posible. Una vez que los abomasos llegaron al laboratorio, se añadieron los 14 g de agar a los 700 ml de agua destilada próximos a ebullición y se siguió calentando y agitando hasta que la mezcla hirvió al menos tres veces consecutivas. Se enfrió entonces la mezcla en hielo, agitando con frecuencia y comprobando la temperatura hasta que alcanzaron los 43°C. Cuando la temperatura del agar líquido estuvo próxima a los 43°C, se colocó el abomaso en una bandeja y se abrió por la curvatura mayor. A continuación se lavó la mucosa del abomaso con agua a 38°C (hasta 700 ml) tratando de recoger el mayor número de vermes posible. El lavado se mezcló con el agar líquido, dispensando rápidamente la mezcla resultante en las bandejas de manera que se formase una fina capa que cubriese todo el paño. 3. Material y Métodos 73 Una vez que el agar solidificó, los paños se colocaron rápidamente en el tanque con medio RPMI a 38°C, manteniendo el conjunto en la estufa una hora y media como mínimo con el objeto de que los vermes se desprendiesen del agar y pasasen al RPMI. Durante este tiempo se prepararon tubos eppendorf, placas de petri, así como lancetas y se mantuvo una placa caliente a 38°C. Transcurrida una hora y media, se retiraron los paños de la estufa comprobando que estuviesen libres de vermes. Tras desechar el RPMI sobrenadante del tanque, el sedimento con vermes se recogió en un vaso de precipitado, desde donde se fueron transfiriendo pequeñas cantidades de RPMI y vermes a placas de petri de plástico que se mantenían a 38°C sobre la placa caliente. Después de realizar tres lavados consecutivos en medio RPMI, los vermes limpios se conservaron a -20°C en tubos de 10 ml hasta la realización de los homogenizados, o bien a -80°C en tubos eppendorf para el estudio de polimorfismo genético. 3.3. DISEÑO EXPERIMENTAL 3.3. DISEÑO EXPERIMENTAL3.3. DISEÑO EXPERIMENTAL 3.3. DISEÑO EXPERIMENTAL 3.3.1. GRUPOS EXPERIMENTALES 3.3.1. GRUPOS EXPERIMENTALES3.3.1. GRUPOS EXPERIMENTALES 3.3.1. GRUPOS EXPERIMENTALES Se realizaron un total de 14 grupos experimentales que se distribuyeron de la siguiente forma (Tabla (Tabla(Tabla (Tablas s s s 2A y 2 2A y 2 2A y 2 2A y 2B) B)B) B): Tabla 2 Tabla 2Tabla 2 Tabla 2A. A.A. A. Ensayos de inmunización con la cepa NA o SP, y posterior infección con la cepa NA de H. contortus . INMUNIZADOS INMUNIZADOS INMUNIZADOS INMUNIZADOS FRENTE A NA FRENTE A NAFRENTE A NA FRENTE A NA NO INMUNIZADOS NO INMUNIZADOSNO INMUNIZADOS NO INMUNIZADOS CONTROL CONTROLCONTROL CONTROL OVINO OVINOOVINO OVINO NA/NA SP/NA Ø/NA Ø/Ø (*) CAPRINO CAPRINOCAPRINO CAPRINO NA/NA SP/NA Ø/NA Ø/Ø (*) Tabla 2 Tabla 2Tabla 2 Tabla 2B BB B. .. . Ensayos de inmunización con la cepa NA o SP, y posterior infección con la cepa SP de H. contortus . INMUNIZADOS FRENTE A SP INMUNIZADOS FRENTE A SPINMUNIZADOS FRENTE A SP INMUNIZADOS FRENTE A SP NO INMUNIZADOS NO INMUNIZADOSNO INMUNIZADOS NO INMUNIZADOS CONTROL CONTROLCONTROL CONTROL OVINO OVINOOVINO OVINO SP/SP NA/SP Ø/SP Ø/Ø (*) CAPRINO CAPRINOCAPRINO CAPRINO SP/SP NA/SP Ø/SP Ø/Ø (*) (*) Los grupos controles de infección fueron los mismos para las dos cepas 3. Material y Métodos 74 3.3.2. PROTOCOLO EXPERIMENTAL 3.3.2. PROTOCOLO EXPERIMENTAL3.3.2. PROTOCOLO EXPERIMENTAL 3.3.2. PROTOCOLO EXPERIMENTAL En la siguiente tabla se recogen de forma gráfica todas las actuaciones llevadas a cabo en cada semana a lo largo de la experiencia en los diferentes grupos de animales: inmunización (V), infección (I), toma de muestras de heces (H), toma de muestras de sangre (S) y sacrificio (SC) (Tabla 3 (Tabla 3(Tabla 3 (Tabla 3) )) ). Tabla Tabla Tabla Tabla 3 33 3. .. . Esquema del protocolo experimental. Semana SemanaSemana Semana 1 11 1 2 22 2 3 33 3 4 44 4 5 55 5 6 66 6 7 77 7 8 88 8 9 99 9 10 1010 10 11 1111 11 12 1212 12 13 1313 13 14 1414 14 15 1515 15 Inmuniza InmunizaInmuniza Inmunización ciónción ción V V V V V Infección InfecciónInfección Infección I Heces HecesHeces Heces H H H H H H H Sangre SangreSangre Sangre S S S S S S S S S S S S S S S Sa SaSa Sacrificio crificiocrificio crificio SC 3.3.3. INMUNIZACIONES 3.3.3. INMUNIZACIONES3.3.3. INMUNIZACIONES 3.3.3. INMUNIZACIONES 3.3.3.1. 3.3.3.1. 3.3.3.1. 3.3.3.1. Obtención y preparación del antígeno Obtención y preparación del antígenoObtención y preparación del antígeno Obtención y preparación del antígeno Los antígenos que se utilizaron en los diferentes ensayos fueron fracciones proteicas enriquecidas para proteinasas tipo cisteína mediante cromatografía de afinidad a partir de homogenizados de vermes adultos de H. contortus . La metodología para la obtención de dichos antígenos se describe a continuación. 3.3.3.1.1. 3.3.3.1.1. 3.3.3.1.1. 3.3.3.1.1. Preparación de homogenizados Preparación de homogenizadosPreparación de homogenizados Preparación de homogenizados La preparación de los homogenizados de vermes adultos de H. contortus se realizó , de forma independiente para las dos cepas del parásito, siguiendo el protocolo descrito previamente por Ruiz Ruiz Ruiz Ruiz et al et alet al et al . .. . (2004a) (2004a) (2004a) (2004a). Los vermes conservados a -20°C se descongelaron y se transfirieron a una placa de petri de plástico que se mantuvo en frío en una bandeja de corcho con hielo durante el proceso de homogenización. Los homogenizados se prepararon en frío con PBS 0,01 M a una concentración de 100 adultos/ml usando un homogenizador 3. Material y Métodos 75 automático Ultra-Turrak T8 Ika®-Werke. La solución resultante se dejó reposar en hielo durante 60 minutos agitando periódicamente los tubos donde se había realizado el homogenizado, para a continuación centrifugar a 10.000 x g durante 30 minutos a 4°C. Tras pasar el sobrenadante a través de filtros Acrodisc ® Syringe (Pall) de 0,2 µm de diámetro de poro, se realizaron alícuotas de 9 ml que se conservaron a -20°C. 3.3.3.1.2 3.3.3.1.23.3.3.1.2 3.3.3.1.2. . . . Determinación de la concentración de proteínas Determinación de la concentración de proteínasDeterminación de la concentración de proteínas Determinación de la concentración de proteínas La concentración de proteínas se determinó mediante el método Bradford (Bradford, 197 (Bradford, 197(Bradford, 197 (Bradford, 1976) 6)6) 6) utilizando el kit Bio-Rad Protein Assay (Biorad) siguiendo las instrucciones del fabricante. . . . 3.3.3.1. 3.3.3.1.3.3.3.1. 3.3.3.1.3 33 3. .. . Purificación del antígeno mediante cromatografía de afinidad Purificación del antígeno mediante cromatografía de afinidadPurificación del antígeno mediante cromatografía de afinidad Purificación del antígeno mediante cromatografía de afinidad Una vez obtenidos los homogenizados de los vermes adultos de ambas cepas, el antígeno se purificó mediante cromatografía de afinidad con el fin de obtener fracciones proteicas enriquecidas para proteinasas tipo cisteína. Para ello se siguió un protocolo similar al propuesto por Knox Knox Knox Knox et al et alet al et al . .. . (1999) (1999) (1999) (1999) con ligeras modificaciones. 3.3.3.1.3.1. Preparación de la muestra La preparación de la muestra tiene como objetivo eliminar las sales y pequeños grupos “tiol” que puedan interferir con la cromatografía. Para ello se utilizaron columnas Hitrap-Desalting de 5 ml (Pharmacia Biotech) y un sistema cromatográfico FPLC. Todo el proceso se realizó a 4°C para evitar que se alterasen las proteinasas purificadas. Como tampón se empleó una solución 10 mM de Trizma base (Sigma) y 0,5 M de ClNa (Panreac) a pH 7,4. A esta solución se le denominó buffer A. Para incrementar el volumen de muestra susceptible de desalación, se trabajó con 5 columnas Hitrap-desalting en serie (25 ml en total) sujetas mediante soportes a un cromatógrafo Biorad Biologic LP provisto de bomba peristáltica, sistema de lectura espectrofotométrica y colector de fracciones. Inicialmente se hicieron pasar dos volúmenes de buffer A a un flujo de 5 ml/min con el fin de equilibrar el sistema. Tras el equilibrado se hicieron circular a este mismo flujo 9 ml de muestra y cuatro volúmenes de buffer A, de forma que la absorbancia volviese a niveles basales. Con esto se conseguía que toda la muestra circulase por el sistema y que éste quedase equilibrado para una nueva cromatografía. 3. Material y Métodos 82 Tiol-Sheparose, según se describió en apartados anteriores (PBS-TSBP), utilizando una concentración final de 1 µg/ml en buffer carbonato pH 9,6 (NaHCO3 al 0,36% p/v; NaCO3 al 0,19% p/v en agua destilada). Para la antigenación se añadieron 100 µl del antígeno diluido a cada pocillo y la placa se mantuvo 12 h a 4°C, transcurrido este tiempo se realizaron 3 lavados de 5 minutos c/u con 200 µl de PBS-TWEEN 20 al 0,05% v/v. A continuación se procedió neutralizar las reacciones inespecíficas, para lo cual se incubó la placa a 37°C durante 45 minutos tras añadir a cada pocillo 200 µl de PBS-BSA al 3% p/v (Sigma). Tras nuevos lavados con PBS-TWEEN 20 al 0,05% v/v se añadieron 100 µl de los sueros seleccionados para el análisis, previamente diluidos (1/100) con PBS y 0,02% p/v de azida de sodio (Sigma). Los sueros se incubaron a 37°C durante 1 hora y a continuación se realizaron nuevos lavados con PBS-TWEEN 20 al 0,05% en las mismas condiciones descritas anteriormente. Las incubaciones con el conjugado (anti-goat IgG peroxidase) (Sigma) se llevaron a cabo a 37°C durante 45 minutos sobre un volumen total de 100 µl a una dilución de 1/3.000 v/v en PBS ( (( (Tabla TablaTabla Tabla 4 4 4 4) )) ). Tras la incubación con el conjugado se realizó un último lavado (x 3) y la reacción inmunoenzimática se reveló añadiendo 100 µl de sustrato/pocillo durante aproximadamente 10 minutos a temperatura ambiente y en ausencia de luz. El sustrato consistió en una mezcla de tampón cítrico-fosfato (ácido cítrico al 1,02% v/v; fosfato sódico al 1,44% v/v) con OPD (Ophenylenediamine dihydrochloride) (Sigma) al 0,04% p/v, a la que se añadió H2O2 33% v/v a una concentración final del 0,1% v/v. Finalmente, la reacción se frenó con 50 µl/pocillo de una solución 2 M de ácido sulfúrico (H2SO4) (Panreac) y la reacción colorimétrica resultante se midió en un espectrofotómetro (Multiskan Ascent, Termo Labsystem) a una longitud de onda de 492 nm. Tabla Tabla Tabla Tabla 4 44 4. .. . ELISA IgG para la determinación de anticuerpos específicos. Tipo de ELISA Tipo de ELISATipo de ELISA Tipo de ELISA INDIRECTO Conjugado ConjugadoConjugado Conjugado Anti-goat IgG peroxidase (Sigma) Especie Especie Especie Especie de obtención de obtenciónde obtención de obtención del conjugado del conjugado del conjugado del conjugado Conejo Control positivo Control positivoControl positivo Control positivo Pool de animales inmunizados correspondiente a la semana 14 Dilución utilizada (suero) Dilución utilizada (suero)Dilución utilizada (suero) Dilución utilizada (suero) 1:100 Dilución utilizada (conjugado) Dilución utilizada (conjugado)Dilución utilizada (conjugado) Dilución utilizada (conjugado) 1:3.000 3. Material y Métodos 83 Los datos se expresaron en base al porcentaje relativo de los niveles de IgG específica del suero con mayor respuesta. Como control positivo se usó el pool de animales inmunizados correspondiente a la semana 14. 3.5 3.53.5 3.5. ESTUDIO DEL POLIMORFISMO GENÉTICO . ESTUDIO DEL POLIMORFISMO GENÉTICO. ESTUDIO DEL POLIMORFISMO GENÉTICO . ESTUDIO DEL POLIMORFISMO GENÉTICO 3.5.1. RECOGIDA Y CONSERVACIÓN DE VERMES 3.5.1. RECOGIDA Y CONSERVACIÓN DE VERMES3.5.1. RECOGIDA Y CONSERVACIÓN DE VERMES 3.5.1. RECOGIDA Y CONSERVACIÓN DE VERMES A partir de los abomasos de los animales sacrificados en el día último de la experiencia se recogieron un total de 100 vermes adultos machos de cada grupo experimental para el estudio del polimorfismo genético. En dicho análisis se incluyeron sólo los vermes machos ya que las hembras podrían contener esperma procedente de machos o huevos fecundados, con los que los resultados de variabilidad genética no corresponderían a un solo individuo. Cada verme macho se lavó tres veces en PBS a 4°C durante 5 min sobre una base de hielo, transfiriéndose posteriormente a un vial “eppendorf” que fue congelado rápidamente a -80°C para minimizar la degradación de su ADN. Cada vial se identificó individualmente indicando el experimento del que procedía y la fecha de recogida. 3.5.2. 3.5.2.3.5.2. 3.5.2. SELECCIÓN DE LOS GENES SELECCIÓN DE LOS GENES SELECCIÓN DE LOS GENES SELECCIÓN DE LOS GENES El análisis de polimorfismo genético se realizó sobre cuatro genes codificadores de proteinasas tipo cisteína que han demostrado tener variabilidad genética según trabajos previos (Ruiz (Ruiz (Ruiz (Ruiz et al et alet al et al ., 2004 ., 2004., 2004 ., 2004b bb b) )) ). En la siguiente tabla se recogen la fuente bibliográfica donde se publicaron por primera vez estos genes y los “primers” utilizados en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para su amplificación y posterior análisis de polimorfismo (Tabla (Tabla (Tabla (Tabla 5 55 5) )) ). Tabla 5 Tabla 5Tabla 5 Tabla 5. .. . Genes seleccionados para la realización de los estudios de polimorfismo genético. Gen GenGen Gen Fuente bibliográfica Fuente bibliográficaFuente bibliográfica Fuente bibliográfica Primer forward (F) Primer forward (F)Primer forward (F) Primer forward (F) Primer reverse (R) Primer reverse (R)Primer reverse (R) Primer reverse (R) GCP-7 (Rehman y Jasmer, 1998) (Rehman y Jasmer, 1998)(Rehman y Jasmer, 1998) (Rehman y Jasmer, 1998) 5’GCATGCTGTGGAAAGTTC3’ 5’CGGAGTGGCATAGGGATG3’ AC1 (Pratt (Pratt (Pratt (Pratt et al et alet al et al ., 1990) ., 1990)., 1990) ., 1990) 5’TTTCTGCCACTGACATCA3’ 5’ACGGTGGGGTTGGCGCTG 3’ AC-3 (Pratt (Pratt (Pratt (Pratt et al et alet al et al ., 1992) ., 1992)., 1992) ., 1992) 5’GACATCCTGTACGCCAAC3’ 5’GTTGACGCCTCTTCAGGA 3’ AC-4 (Pratt (Pratt (Pratt (Pratt et al et alet al et al ., 1992) ., 1992)., 1992) ., 1992) 5’ATTTTGACATGCTGCAAT3’ 5’TGGAGTTGCCGCCTCTCG3’ 3. Material y Métodos 84 3.5.3. EXTRACCIÓN DE ADN 3.5.3. EXTRACCIÓN DE ADN3.5.3. EXTRACCIÓN DE ADN 3.5.3. EXTRACCIÓN DE ADN La extracción del ADN se realizó por separado para cada uno de los vermes machos de H. contortus utilizando la técnica de doble extracción fenólica propuesta por Sambrook Sambrook Sambrook Sambrook et al et alet al et al . ( . (. ( . (1989 19891989 1989) )) ). A cada muestra se le añadieron 100 µl de una solución de digestión compuesta por 9,410 µl de TE1X (Tris-EDTA) (Sigma), 50 µl de Proteinasa K (Roche) (20 mg/ml), 40 µl de RNAsa (Roche) (10 µg/µl) y 500 µl de SDS (Sigma) 20% p/v en agua MilliQ. La mezcla se mantuvo a 52°C en agitación durante 24 horas. Tras la digestión enzimática se añadieron 100 µl de fenol con hidroxiquinoleína y las muestras se mantuvieron en agitación durante 10 minutos. Posteriormente se centrifugaron a 5.000 x g durante 15 minutos a 4°C y se recogieron los sobrenadantes (unos 75 µl aproximadamente por cada muestra). Sobre el sedimento obtenido en el paso anterior se añadieron 75 µl de TE1X y se realizó el mismo proceso (agitación y centrifugación) con el objeto de recuperar la mayor cantidad de ADN posible. Los nuevos sobrenadantes se mezclaron con los anteriores en el mismo vial. A los productos obtenidos se añadieron 150 µl de la solución de fenol y, tras la agitación de las muestras (10 min.), se realizó un nuevo proceso de centrifugación en las mismas condiciones que en el paso anterior. El sobrenadante obtenido se transfirió a otro vial, al que se añadieron 300 µl de etanol absoluto y 15 µl de acetato sódico 3M (pH 6) mantenidos previamente a 4°C. La mezcla resultante se dejó en reposo 30 minutos y posteriormente se centrifugó a 12.000 x g durante 30 minutos a la misma temperatura. Tras dicha centrifugación, se eliminó todo el sobrenadante con la precaución necesaria para no aspirar el “pellet” de ADN que había quedado en el fondo del vial. La muestra se lavó una vez más, en esta ocasión con 300 µl de etanol al 70% mediante centrifugación (12.000 x g durante/ 10 min.), y se volvió a retirar el líquido sobrenadante. Para finalizar, las muestras se deshidrataron mediante un evaporador centrífugo (Eppendorf concentrador 5301) a 30°C durante 15 minutos y posteriormente se resuspendieron en 50 µl de TE 1X. Todas las muestras extraídas según este procedimiento se mantuvieron almacenadas a 4°C. 3. Material y Métodos 85 3.5.4. 3.5.4. 3.5.4. 3.5.4. AMPLIFICACIONES MEDIANTE PCR AMPLIFICACIONES MEDIANTE PCRAMPLIFICACIONES MEDIANTE PCR AMPLIFICACIONES MEDIANTE PCR Una vez extraído el ADN de los vermes se procedió a la amplificación de los genes AC-1, AC-3, AC-4, y GCP-7 utilizando los primers descritos previamente. Las amplificaciones se realizaron en viales “eppendorf” de 200 µl sobre un volumen final de 25 µl. Para cada gen se estandarizó cada componente de la reacción de PCR hasta optimizar el proceso de amplificación, tal y como se detalla en la Tabla Tabla Tabla Tabla 6 66 6. Tabla Tabla Tabla Tabla 6 66 6. .. . Condiciones de PCR para cada uno de los genes analizados. GCP GCPGCP GCP- -- -7 77 7 AC ACAC AC- -- -1 11 1 AC ACAC AC- -- -3 33 3 AC ACAC AC- -- -4 44 4 Primer F Primer FPrimer F Primer F 0,8 µM 0,8 µM 0,4 µM 0,4 µM Primer R Primer RPrimer R Primer R 0,8 µM 0,8 µM 0,4 µM 0,4 µM MgCl MgClMgCl MgCl2 22 2 1 mM 2 mM 1 mM 1 mM dNTPs dNTPsdNTPs dNTPs 0,2 mM/nucl. 0,4 mM/nucl. 0,2 mM/nucl. 0,2 mM/nucl. 10x TaqBuffer 10x TaqBuffer10x TaqBuffer 10x TaqBuffer 10% v/v 10% v/v 10% v/v 10% v/v Taq Polim. Taq Polim.Taq Polim. Taq Polim. 0,2 U 0,2 U 0,2 U 0,2 U DNA DNADNA DNA/TE1X /TE1X/TE1X /TE1X 1 µl 1 µl 1 µl 1 µl Para todos los genes se usaron cebadores (“primers”) comercializados por Invitrogen y una solución de nucleótidos (A, T, U y G) producidos por Roche. El resto de reactivos (Taq polimerasa, 10x TaqBuffer y MgCl2) fueron suministrados por la casa comercial Bioline. La preparación de la mezcla para la reacción de PCR se realizó siempre a 4°C y en condiciones de esterilidad. Las amplificaciones se llevaron a cabo en un termociclador (Biorad, Cycler TM Termal Cycler) utilizando programas específicos para cada gen (Tabla (Tabla (Tabla (Tabla 7 77 7) )) ). Tabla Tabla Tabla Tabla 7 77 7. .. . Programas de amplificación utilizados para los diferentes genes. Temperatura TemperaturaTemperatura Temperatura ( ( ( (°C °C°C °C) )) ) Tiempo TiempoTiempo Tiempo Nº de ciclos Nº de ciclosNº de ciclos Nº de ciclos 94 2:00 2:00 2:00 2:00 min minmin min 1 94 52,2 (*) 70 0:15 seg 0:15 seg0:15 seg 0:15 seg 0:30 seg 0:30 seg0:30 seg 0:30 seg 1:00 min 1:00 min1:00 min 1:00 min 34 ciclos 70 5:00 min 5:00 min5:00 min 5:00 min 1 15 2:00 min 2:00 min2:00 min 2:00 min 1 4 hasta recoger la muestra hasta recoger la muestrahasta recoger la muestra hasta recoger la muestra 3. Material y Métodos 86 (*) La temperatura de "annealing" fue la única que varió según el fragmento de gen amplificado, siendo de 52,2°C para los genes AC-1, AC-4, de 53°C para el gen AC-3 y de 54°C para el gen GCP-7. Entre las muestras se incluyó siempre un control positivo (ADN de un verme amplificado con resultados positivos previamente), así como un control negativo (TE1X). El chequeo de la amplificación de las muestras se llevó a cabo en geles de agarosa al 1,2% (ROCHE) en TBE 1X utilizando una cubeta de Biorad (Sub-Cell ®, Model 96). Tras la polimerización de la agarosa, el gel se estabilizó en buffer de electroforesis TBE 1X durante unos 15 minutos, y a continuación se cargaron las muestras amplificadas previamente mezcladas con tampón de carga (6 µl de producto de PCR y 2 µl de tampón de carga 6X). Además de los productos de PCR, se incluyó un marcador para verificar el tamaño de los fragmentos amplificados (λ 125, Amersham Biosciences). La electroforesis se realizó a un voltaje constante (100 V) durante 30 minutos utilizando una fuente de alimentación PowerPac Basic (Biorad). Para visualización de las bandas amplificadas, los geles se tiñeron durante 30 minutos en bromuro de etidio (Sigma) y se lavaron en agitación durante 10 minutos en agua destilada. La visualización se llevó a cabo en un transiluminador Gel DocTM XR (Biorad) con un equipo de fotografía ChemiDocTM XRS (Biorad) que permitía registrar las imágenes en formato *.JPG. En los fragmentos amplificados de los genes AC-1, AC-3 y AC-4 se observó una única banda de 350 bps aproximadamente, mientras que para el gen GCP-7 dicha banda presentó un tamaño próximo a los 625 bps. 3.5.5. SSCP ( 3.5.5. SSCP (3.5.5. SSCP ( 3.5.5. SSCP ( SINGLE STRAND SINGLE STRAND SINGLE STRAND SINGLE STRAND CONFORMATION CONFORMATIONCONFORMATION CONFORMATION POLIMORPHISM POLIMORPHISM POLIMORPHISM POLIMORPHISM ) )) ) Una vez obtenidos los distintos productos de PCR, se procedió a evaluar el polimorfismo genético para cada uno de los genes indicados. Para ello las muestras se sometieron a una electroforesis en gel de acrilamida en condiciones no desnaturalizantes siguiendo la metodología que se describe a continuación. 3.5.5.1. 3.5.5.1. 3.5.5.1. 3.5.5.1. Preparación del soporte de electroforesis Preparación del soporte de electroforesisPreparación del soporte de electroforesis Preparación del soporte de electroforesis El gel de acrilamida sobre el que se llevó a cabo la electroforesis de los distintos productos amplificados se realizó sobre cristales de 42 cm de largo x 20 cm de ancho, que fueron previamente limpiados con alcohol 70% v/v. Al cristal que sirvió de soporte al gel de electroforesis se le añadieron 500 µl de una solución de adherencia que contenía 6,25 µl de alcohol del 70%, 25 µl de ácido acético glacial (Panreac) y 2,5 µl de Bind Silane (Amersham Biosciences). La superficie del cristal se lavó con alcohol del 70% y, finalmente, con agua Milli-Q. 3. Material y Métodos 87 Por último, se unieron las dos caras de los cristales colocando dos separadores de teflón de 0,4 mm de grosor en los márgenes, y el conjunto se fijó con pinzas. 3.5.5. 3.5.5.3.5.5. 3.5.5.2 22 2. . . . Preparación del gel de acrilamida Preparación del gel de acrilamidaPreparación del gel de acrilamida Preparación del gel de acrilamida Todos los análisis electroforéticos de las muestras amplificadas se realizaron sobre geles de acrilamida en los que se utilizó una solución “madre” 49:1 que contenía acrilamida al 49% p/v (Sigma) y N-N’ Methilenebisacrilamide al 1% p/v (Sigma) en Agua Milli-Q. Dado el tamaño de los cristales, así como el grosor de los separadores utilizados, se prepararon rutinariamente volúmenes de 40 ml que contenían la mezcla necesaria para formar el gel (Tabla (Tabla (Tabla (Tabla 8 88 8) )) ). Este volumen incluía un 40% v/v de la solución “madre” de acrilamida en buffer, un 20% v/v de buffer TBE 5X (1,11 M Tris, 1,11 M Ácido bórico, 0,003 M EDTA, pH 8,0), un 0,13% v/v de N,N,N,N’–tetra– methyl-ethylenediamine (Temed) (Sigma) y un 0,07% p/v de amonio persulfato (APS) (Sigma) en Agua Milli-Q. Los dos últimos compuestos (Temed y APS) se añadieron en último lugar y a continuación la mezcla se introdujo entre los dos cristales con la ayuda de una jeringa. Tabla Tabla Tabla Tabla 8 88 8. .. . Condiciones de los análisis mediante SSCP para los distintos genes. La dilución de la muestra corresponde a la proporción producto de PCR/tampón de carga (con formamida). GCP GCPGCP GCP- -- -7 77 7 AC ACAC AC- -- -1 11 1 AC ACAC AC- -- -3 33 3 AC ACAC AC- -- -4 44 4 A AA Acrilamida 49:1 crilamida 49:1crilamida 49:1 crilamida 49:1 40% 40% 40% 40% TBE TBETBE TBE 5X 5X5X 5X 20% 20% 20% 20% Temed TemedTemed Temed 0,13 % v/v 0,13 % v/v 0,13 % v/v 0,13 % v/v APS APSAPS APS 0,07% p/v 0,07% p/v 0,07% p/v 0,07% p/v Agua Milli Agua MilliAgua Milli Agua Milli- -- -Q QQ Q Hasta 40 ml Hasta 40 ml Hasta 40 ml Hasta 40 ml Dilución muestra Dilución muestra Dilución muestra Dilución muestra 1:20 1:50 1:50 1:50 Voltios VoltiosVoltios Voltios 500 600 600 600 Tiempo (horas) Tiempo (horas)Tiempo (horas) Tiempo (horas) 22 22 22 22 Tras acoplar el peine al ensamblaje se esperó a la polimerización del gel durante aproximadamente 60 minutos. Tras la polimerización se retiró el peine y se equilibró el sistema en una cubeta de electroforesis (Scientific CO, Model # SG-40020) sometida a 60 V constantes durante 15 minutos utilizando TBE 1X como buffer. 3. Material y Métodos 88 3.5.5.3. Preparación de las muestras 3.5.5.3. Preparación de las muestras3.5.5.3. Preparación de las muestras 3.5.5.3. Preparación de las muestras Solamente se analizaron aquellos productos de PCR que, tras ser analizados en geles de agarosa, mostraron una única banda con un tamaño correspondiente al producto amplificado (350 bps para los genes AC-1, AC-3 y AC-4 y 625 bps para el gen GCP-7, aproximadamente). Cada muestra se colocó en el gel a una dilución en tampón de carga que contenía formamida al 95% (Sigma), NaOH 10mM, Bromophenol Blue 0,25% (Sigma) y Xylene Cyanol 0,25% (Sigma). Las diluciones empleadas para cada gen se recogen en la Tabla Tabla Tabla Tabla 8 88 8. Las muestras diluidas se calentaron a 94°C durante 2 minutos para facilitar la deshibridación de las cadenas de ADN y se matuvieron a 4°C antes de someterlas a electroforesis. Se cargaron 2 µl por pocillo de cada una de las muestras. 3.5.5.4 3.5.5.43.5.5.4 3.5.5.4. Condiciones de la electroforesis . Condiciones de la electroforesis. Condiciones de la electroforesis . Condiciones de la electroforesis Las condiciones de electroforesis fueron similares para todos los genes. Por lo general, se utilizó un voltaje constante de 600 V durante 22 horas a temperatura ambiente, a excepción de en los análisis realizados sobre los productos de amplificación del gen GCP-7 (500 V) (Tabla (Tabla (Tabla (Tabla 8 88 8) )) ). Como buffer de electroforesis se empleó el mismo buffer utilizado para equilibrar el gel (TBE 1X). 3.5.5.5 3.5.5.53.5.5.5 3.5.5.5. Tinción de plata . Tinción de plata. Tinción de plata . Tinción de plata Tras la electroforesis, los fragmentos amplificados y desnaturalizados de cada una de las muestras se visualizaron mediante una tinción de plata. Con este objetivo, el gel adherido al cristal se colocó en una bandeja de tinción y se fijó mediante un lavado durante 20 minutos con una solución de acido acético glacial al 10% v/v en agua Milli-Q a 4°C. A continuación se realizaron dos lavados lavadoslavados lavados de dos minutos cada uno con 500 ml de Agua Milli-Q a 4°C, y posteriormente se procedió a la tinción tincióntinción tinción propiamente dicha con plata utilizando para ello una solución con 0,1% p/v de nitrato de plata (Merck) en agua Milli-Q con 0,2% v/v de formaldehído al 37% (Fluka). El proceso de tinción se realizó a temperatura ambiente durante 25 minutos. Una vez finalizada la tinción, el gel se lavó durante 5 segundos en agua Milli-Q a 4°C. Para el revelado reveladorevelado revelado de la tinción, el gel se incubó con una solución 0,24 M de carbonato sódico (Fluka) hasta que se visualizaron las bandas. Una vez que se consiguió un grado de definición óptimo, la reacción se detuvo añadiendo la misma solución utilizada en el proceso de fijación. Para finalizar, se realizó un último lavado con agua Milli-Q a 4°C durante 2 minutos. 3. Material y Métodos 89 3.5.6. 3.5.6. 3.5.6. 3.5.6. SECUENCIACIÓN SECUENCIACIÓNSECUENCIACIÓN SECUENCIACIÓN La secuenciación de los diferentes alelos encontrados en cada gen se realizó en el Servicio de Genética Forense de la Universidad de Las Palmas de Gran Canaria. Para ello se utilizaron productos de PCR que habían mostrado bandas nítidas tras el chequeo en geles de agarosa, preferentemente de homocigotos. Sin embargo, no todos los alelos pudieron encontrarse en homocigosis sino que algunos sólo aparecieron en forma de heterocigotos. Para aislar el ADN de este tipo de alelos, se utilizó un kit de extracción de ADN de geles de poliacrilamida QIAEX II (Qiagen). Una vez realizada la electroforesis de la SSCP y antes de que solidificara del todo el gel de poliacrilamida, se cortó con bisturí únicamente la banda correspondiente al alelo que se pretendía aislar. Tras pesar el gel cortado, se añadieron 2 volúmenes de buffer de difusión pH 8,0 (0,5 M Acetato amónico (Sigma); 10mM Acetato magnésico (Sigma); 1mM EDTA (Sigma); 0,1 SDS (Sigma)) por cada volumen de gel, y la mezcla se incubó a 50°C durante 30 minutos. Posteriormente, tras centrifugar la muestra durante 1 minuto a 10.000 x g, se recolectó el sobrenadante y se pasó a través de un filtro Whatman GF/C (Whatman®) para eliminar restos de acrilamida. A continuación se añadieron aproximadamente 3 volúmenes de Buffer QX1 (Qiagen) y el conjunto se resuspendió mediante vórtex durante 30 segundos. A esta mezcla se le añadió 10 µl de QIAEX II (Qiagen) y posteriormente se realizó una incubación a temperatura ambiente durante 10 minutos. Tras una nueva centrifugación a 10.000 x g durante 30 segundos, se eliminó el sobrenadante, se realizaron 2 lavados con 500 µl de Buffer PE (Qiagen) y se dejó secar la muestra de 10 a 15 minutos. Por último se resuspendió el ADN obtenido en 20 µl de TE1X. El ADN del alelo aislado fue amplificado nuevamente mediante PCR y posteriormente se comprobó su patrón SSCP para verificar el proceso de aislamiento y purificación. Como paso previo a la reacción de secuenciación, los productos de PCR se purificaron utilizando columnas MicroSpin con resina SephacrylTM S-400 HR (Amersham Biosciences). El proceso de purificación incluyó un primer paso de homogenización de la resina mediante agitación en vórtex. Posteriormente, y tras romper la parte distal de la columna, se colocó en un tubo de centrífuga de 1,5 ml y se centrifugó a 800 x g durante 1 minuto, observándose que la resina formaba una rampa en el interior. Seguidamente se colocó la columna en un tubo nuevo de 1,5 ml y se aplicó la muestra en el centro de la rampa formada previamente. El proceso finalizó con una nueva centrifugación de 2 minutos a 800 x g. 3. Material y Métodos 90 El método de secuenciación utilizado en este trabajo se basa en la reacción enzimática desarrollada por Sanger Sanger Sanger Sanger et al et alet al et al . .. . (1977) (1977) (1977) (1977), que consiste en la extensión por Taq polimerasa de una cadena de ADN a partir de un primer específico y siguiendo una cadena molde, con la particularidad de que la síntesis se efectúa en presencia de didesoxinucleótidos (ddNTPs), aparte de los habituales desoxinucleótidos (dNTPs). En la adaptación del método Sanger utilizado (BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit; Applied Biosystems) se emplearon ddNTPs marcados con fluorocromos dicloro [R6G] para ddATP, dicloro [TAMRA] para ddTTP, dicloro [R110] para ddGTP y dicloro [ROX] para ddCTP. La reacción generó de esta forma numerosas cadenas de ADN marcadas en los extremos 3’ por la incorporación de un ddNTP. El producto de la reacción se analizó mediante el secuenciador automático ABI Prism 3100 Genetic Analyzer (Applied Biosystems). En este equipo los fragmentos simplificados se separan por peso molecular a través de un polímero especial (POP 6; Performance Optimizad Polymer 6) en medio desnaturalizante sometido a un campo eléctrico. La lectura final se realizó mediante un láser que, al incidir sobre los fluorocromos situados al final de las diferentes cadenas ya ordenadas, emite un espectro de fluorescencia que es interpretado por un software específico y traducido en forma de secuencia de nucleótidos. La secuenciación se expresa en forma de un electroferograma en el que cada una de las cuatro bases está representada por un color diferente. El protocolo seguido fue el recomendado por el fabricante, que consistió en añadir en un tubo de centrífuga de 0,2 ml, 8 μl de terminador Ready Reaction Mix (que contiene las cantidades necesarias de dNTPs, ddNTPs, tampón, Taq polimerasa y MgCl2), 3,2 pmoles de primer, 50 ng de ADN molde y agua Milli-Q hasta un volumen de 20 μl. Esta mezcla se introdujo en un termociclador con un programa que constaba de 25 ciclos de 10 segundos a 96°C, 5 segundos a 50°C y 4 minutos a 4°C. Posteriormente, se precipitó el producto de extensión de cada reacción de secuenciación en un tubo de centrífuga de 1,5 ml que contenía 2 μl de acetato sódico 3M a pH 4,6 y 50 μl de etanol al 95%. Al volumen anterior se le añadieron los 20 μl de muestra y la mezcla se agitó en vórtex. Tras mantener las muestras durante 10 minutos a temperatura ambiente, el tubo se centrifugó a una velocidad de 12.000 x g durante 30 minutos. Se descartó el sobrenadante y se añadieron 250 μl de etanol al 70% para volver a centrifugarlo en las mismas condiciones anteriores durante 5 minutos. Finalmente se retiró el sobrenadante y se dejó evaporar el resto de alcohol a temperatura ambiente durante aproximadamente 15 minutos. Las muestras se resuspendieron en 20 μl de formamida y se transfirieron a una placa de secuenciación. Tras realizar una desnaturalización a 95°C durante 3 minutos y posterior incubación en hielo durante otros 3 minutos, las muestras se inyectaron en 3. Material y Métodos 91 el secuenciador automático aplicando un voltaje de 1,5 kilovoltios (Kv) durante 30 segundos. La electroforesis propiamente dicha se realizó a un voltaje constante de 12,2 Kv durante 6.500 segundos. Una vez obtenidos los archivos informáticos que facilitó el Servicio de Genética Forense, se procedió a su análisis con el programa MEGA 4.0.1 (Tamura (Tamura (Tamura (Tamura et et et et al alal al ., 2007) ., 2007)., 2007) ., 2007), gracias al cual se obtuvieron los alineamientos y la secuencia completa de cada alelo. Las secuencias de nucleótidos completas de los diferentes alelos de cada gen se encuentran en las Figuras FigurasFiguras Figuras 58 5858 58, 59 5959 59, 60 6060 60 y 61 6161 61 (ver Anexos “Figuras”). Ese mismo programa, junto con el programa informático DnaSP 4.50.3 (Giaglis (Giaglis (Giaglis (Giaglis et al et alet al et al ., 2007) ., 2007)., 2007) ., 2007), se utilizó para realizar los análisis de variabilidad genética, de polimorfismo y los estudios filogenéticos. A partir de las secuencias nucleotídicas de cada alelo, se dedujo la secuencia de aminoácidos utilizando el programa BLASTX, así como la estructura (secuencia de intrones y exones) de los diferentes alelos (Ruiz (Ruiz (Ruiz (Ruiz et al et alet al et al ., ., ., ., 2004b) 2004b)2004b) 2004b). Las secuencias inferidas de aminoácidos de los diferentes alelos de cada gen se encuentran en las Figuras FigurasFiguras Figuras 62 6262 62, 63 6363 63, 6 66 64 44 4 y 6 66 65 55 5 (ver Anexos “Figuras”). 3.6. ANÁLISIS ESTADÍSTICO 3.6. ANÁLISIS ESTADÍSTICO3.6. ANÁLISIS ESTADÍSTICO 3.6. ANÁLISIS ESTADÍSTICO 3.6.1. 3.6.1. 3.6.1. 3.6.1. ESTUDIO DEL NIVEL D ESTUDIO DEL NIVEL DESTUDIO DEL NIVEL D ESTUDIO DEL NIVEL DE PROTECCIÓN E PROTECCIÓNE PROTECCIÓN E PROTECCIÓN Una vez obtenidos los resultados de recuentos fecales de huevos, de la carga parasitaria y de los niveles séricos de IgG, se procedió a su análisis estadístico utilizando el programa estadístico SPSS 13.0 (SPSS Inc., 2000) (González (González (González (González et al et alet al et al ., ., ., ., 2008a) 2008a)2008a) 2008a) para Windows XP. En el caso de distintas tomas de muestras que se repiten a lo largo del tiempo, como por ejemplo HPG o niveles séricos de IgG, en primer lugar se comprobó que los datos seguían una distribución normal, utilizando para ello las pruebas de normalidad Kolmogorov-Smirnov(a) y Shapiro-Wilk según cada caso. Los datos no normalizados se transformaron mediante distintas funciones (log10+1, raíz cuadrada), para posteriormente, una vez comprobada su normalidad, aplicar el Modelo General Lineal de Muestras Repetidas. Los datos correspondientes a los recuentos fecales de huevos, se normalizaron utilizando la función log10+1 de los recuentos acumulados a lo largo de toda la experiencia, mientras que los valores de IgG ya se encontraban normalizados. Los valores P < 0,05 fueron considerados significativos. 4. Resultados 98 Los resultados obtenidos con este protocolo de inmunización mostraron una reducción no significativa del número de HPG en los animales inmunizados del ensayo homólogo (NA/NA) cuando se comparó con los datos observados en el grupo control (Ø/NA) (Tabla (Tabla (Tabla (Tabla 10 1010 10) )) ). En la inmunización heteróloga (SP/NA) los recuentos fecales fueron incluso mayores que los del grupo control. Por último, los recuentos de huevos en heces del grupo control (Ø/NA) fueron similares a los obtenidos en los animales inmunizados que sí resultaron protegidos frente a inoculaciones con la cepa SP (Fig. (Fig. (Fig. (Fig. 13 1313 13B BB B) )) ). 4.1.1.4. 4.1.1.4. 4.1.1.4. 4.1.1.4. Inmunización en caprino Inmunización en caprino Inmunización en caprino Inmunización en caprino frente a infecciones frente a infeccionesfrente a infecciones frente a infecciones con con con con la cepa la cepa la cepa la cepa SP SPSP SP La observación de huevos fecales en el grupo control fue aumentando progresivamente desde la 4ª semana p.i. hasta alcanzar valores máximos a la 6ª semana post-infección y estos valores se mantuvieron elevados hasta el momento del sacrificio. El grupo de caprinos inmunizados con la cepa homóloga (SP/SP) alcanzó el pico de eliminación de huevos a la 5ª semana post-infección y a partir de ese momento los recuentos fueron decreciendo ligeramente hasta el final de la experiencia. En el grupo inmunizado con la cepa heteróloga (NA/SP) se encontraron los valores máximos de HPG entre la 6ª y 7ª semana p.i. y a partir de ahí fueron decreciendo progresivamente. Los resultados obtenidos en este ensayo demostraron una clara disminución en la eliminación de HPG en todos los animales que fueron previamente inmunizados (SP/SP y NA/SP) frente a los animales del grupo control (Ø/SP), desde la 5ª semana p.i. hasta la 8ª semana p.i, siendo más evidente la diferencia a medida que avanzó la experiencia (Fig. (Fig. (Fig. (Fig. 13 1313 13B BB B) )) ). Estos datos fueron estadísticamente significativos para ambos grupos de animales inmunizados al compararlos con el grupo control (Ø/SP), tanto para el ensayo homólogo (SP/SP) como para el ensayo heterólogo (NA/SP). En el ensayo homólogo (SP/SP) la significación se registró a partir de la 4ª semana p.i., mientras que en el ensayo heterólogo (NA/SP) comenzó a partir de la 5ª semana p.i., y en ambos casos dicha significación continuó hasta el final del estudio, habiéndose obtenido, en cualquier caso, un valor de P < 0,05 tanto para el homólogo como para el heterólogo. 4. Resultados 99 Fig. Fig. Fig. Fig. 13 1313 13. . . . Evolución semanal comparativa del número de HPG. A la izquierda (Fig. 13A) se representan todos los caprinos inmunizados e infectados posteriormente con NA y su grupo control (Ø/NA). A la derecha (Fig. 13B) los caprinos inmunizados e infectados con la cepa SP y su grupo control (Ø/SP). Se representan las medias de los dos muestreos semanales de cada grupo ± SEM. 4.1.1.5. 4.1.1.5. 4.1.1.5. 4.1.1.5. Animales no inmunizados Animales no inmunizadosAnimales no inmunizados Animales no inmunizados En aquellos animales controles no inmunizados e infectados con una cepa procedente de una especie hospedadora distinta, se observaron recuentos menores de HPG que en los controles infectados con la correspondiente cepa homóloga. Es decir, los ovinos (Ø/SP) y los caprinos (Ø/NA) presentaron recuentos de HPG sensiblemente más bajos que los ovinos (Ø/NA) y los caprinos (Ø/SP) (Fig. (Fig. (Fig. (Fig. 14 1414 14) )) ). Dentro de los grupos control, los recuentos encontrados en ovino (Ø/NA) fueron significativamente mayores que los del caprino (Ø/SP) ( P < 0,001 y < 0,05). 0 00 0 5000 50005000 5000 10000 1000010000 10000 15000 1500015000 15000 20000 2000020000 20000 25000 2500025000 25000 30000 3000030000 30000 35000 3500035000 35000 10 1010 10 11 1111 11 12 1212 12 13 1313 13 14 1414 14 15 1515 15 Semanas SemanasSemanas Semanas HPG HPG HPG HPG Ovino OvinoOvino Ovino ( (( (Ø ØØ Ø/NA) /NA)/NA) /NA) Ovino OvinoOvino Ovino ( (( (Ø ØØ Ø/SP) /SP)/SP) /SP) Caprino CaprinoCaprino Caprino ( (( (Ø ØØ Ø/NA) /NA)/NA) /NA) Caprino CaprinoCaprino Caprino ( (( (Ø ØØ Ø/SP) /SP)/SP) /SP) 0 00 0 5000 50005000 5000 10000 1000010000 10000 15000 1500015000 15000 20000 2000020000 20000 25000 2500025000 25000 30000 3000030000 30000 35000 3500035000 35000 10 1010 10 11 1111 11 12 1212 12 13 1313 13 14 1414 14 15 1515 15 Semanas SemanasSemanas Semanas HPG HPG HPG HPG Ovino OvinoOvino Ovino ( (( (Ø ØØ Ø/NA) /NA)/NA) /NA) Ovino OvinoOvino Ovino ( (( (Ø ØØ Ø/SP) /SP)/SP) /SP) Caprino CaprinoCaprino Caprino ( (( (Ø ØØ Ø/NA) /NA)/NA) /NA) Caprino CaprinoCaprino Caprino ( (( (Ø ØØ Ø/SP) /SP)/SP) /SP) Fig. Fig. Fig. Fig. 14 1414 14. . . . Evolución semanal comparativa de HPG de los animales controles no inmunizados. Se representan las medias de los dos muestreos semanales de cada grupo ± SEM. 0 2000 4000 6000 8000 10000 12000 10 11 12 13 14 15 Semana HPG Caprino (NA/NA) Caprino (SP/NA) Caprino (Ø/NA) 10 11 12 13 14 15 Semana Caprino (SP/SP) Caprino (NA/SP) Caprino (Ø/SP) 0 2000 4000 6000 8000 10000 12000 10 11 12 13 14 15 Semana HPG Caprino (NA/NA) Caprino (SP/NA) Caprino (Ø/NA) 10 11 12 13 14 15 Semana Caprino (SP/SP) Caprino (NA/SP) Caprino (Ø/SP) A AA A B BB B 4. Resultados 100 Tabla Tabla Tabla Tabla 10 1010 10. . . . Evolución semanal de la eliminación de huevos por gramo de heces (HPG) en los diferentes grupos experimentales de caprinos. Se representa la media de los datos acumulados de cada muestreo semanal junto al error estándar. 4.1.2 4.1.24.1.2 4.1.2. . . . RECUENTO DE VERM RECUENTO DE VERMRECUENTO DE VERM RECUENTO DE VERMES ADULTOS RECOGIDOS EN ES ADULTOS RECOGIDOS EN ES ADULTOS RECOGIDOS EN ES ADULTOS RECOGIDOS EN ABOMASO ABOMASOABOMASO ABOMASO 4. 4.4. 4.1.2.1 1.2.11.2.1 1.2.1. .. . Inmunización en ovinos Inmunización en ovinos Inmunización en ovinos Inmunización en ovinos frente a frente afrente a frente a infecciones infeccionesinfecciones infecciones con con con con la lala las ss s cepa cepa cepa cepas ss s NA NA NA NA y SP y SP y SP y SP Los ovinos inmunizados e infectados con L3 de la cepa NA, tanto los del grupo homólogo (NA/NA) como los del grupo heterólogo (SP/NA), presentaron una reducción en el número de vermes adultos presentes en abomaso con respecto al grupo control (Ø/NA) (Fig. (Fig. (Fig. (Fig. 15 1515 15) )) ). Dicha reducción sólo resultó estadísticamente significativa ( P < 0,05) cuando se comparó el grupo perteneciente al ensayo homólogo (NA/NA) con el grupo no inmunizado (Ø/NA). Grupo Grupo Grupo Grupo S SS S. .. .p pp p. .. .i ii i. .. .. .. . CA CA CA CA (NA/NA) (NA/NA)(NA/NA) (NA/NA) CA CA CA CA (SP/NA) (SP/NA)(SP/NA) (SP/NA) CA CACA CA (Ø/NA) (Ø/NA)(Ø/NA) (Ø/NA) CA CA CA CA (SP/SP) (SP/SP)(SP/SP) (SP/SP) CA CA CA CA (NA/SP) (NA/SP)(NA/SP) (NA/SP) CA CACA CA (Ø/SP) (Ø/SP)(Ø/SP) (Ø/SP) 3ª A 3ª A3ª A 3ª A 0 ± 0 0 ± 0 0 ± 0 0 ± 0 0 ± 0 0 ± 0 3ª B 3ª B3ª B 3ª B 0 ± 0 0 ± 0 0 ± 0 0 ± 0 0 ± 0 0 ± 0 4ª A 4ª A4ª A 4ª A 5 ± 5,00 6,25 ± 6,25 40 ± 40,00 0 ± 0 16,66 ± 16,66 0 ± 0 4ª B 4ª B4ª B 4ª B 116 ± 98,33 145 ± 121,29 207 ± 192,12 275 ± 246,22 50 ± 28,87 508,33 ± 149,12 5ª A 5ª A5ª A 5ª A 626 ± 436,38 688,75 ± 557,50 922 ± 511,05 987,5 ± 768,65 233,33 ± 158,99 2.183,3 ± 601,76 5ª B 5ª B5ª B 5ª B 1.391 ± 882,54 1.482,5 ± 1.133,23 2.721,6 ± 1.642,99 2.288,33 ± 1.634,74 483,33 ± 358,62 6.041,66 ± 1.851,55 6ª A 6ª A6ª A 6ª A 2.456 ± 1.337,55 2.813,75 ± 1.663,86 4.096,6 ± 2.409,28 4.961,67 ± 3.211,35 2.196,66 ± 960,91 10.300 ± 2.778,49 6ª B 6ª B6ª B 6ª B 3.376 ± 1.739,30 3.876,25 ± 2.150,55 5.834 ± 3.317,17 6.901,66 ± 4.427,65 3.713,33 ± 1.356,47 16.208,3 ± 4.370,13 7ª A 7ª A7ª A 7ª A 4.386 ± 2.139,39 5.063,75 ± 2.619,68 7.604 ± 4.300,28 7.976,66 ± 4.696,48 6.244 ± 2.072,53 23.833,3 ± 7.706,92 7ª B 7ª B7ª B 7ª B 5.176,8 ± 2.555,40 6.039,75 ± 3.105,21 8.949 ± 5.126,16 9.235 ± 4.744,26 7.127,33 ± 2.102,26 31.533,33 ± 7.168,32 8ª A 8ª A8ª A 8ª A 6.326,8 ± 3.135,95 7.446 ± 3.781,88 10.689 ± 5.962,76 10.126,66 ± 4.758,14 8.085,66 ± 1.930,35 35.798,33 ± 7.581,55 8ª B 8ª B8ª B 8ª B 7.096,8 ± 3.467,04 8.383,5 ± 4.156,28 12.114 ± 6.628,81 11.281,6 ± 4.945,80 8.769 ± 2.110,71 42.266,6 ± 8.432,96 4. Resultados 101 Los ovinos inmunizados que fueron infectados con la cepa SP (SP/SP y NA/SP) no mostraron una reducción significativa con respecto al grupo no inmunizado (Ø/SP). Por otro lado, en los tres grupos de ovinos infectados con la cepa SP, inmunizados o no, los recuentos de vermes fueron inferiores a los observados en los ovinos controles no inmunizados e infectados con la cepa NA (Ø/NA), aunque sin llegar a ser estadísticamente significativos (Fig. (Fig. (Fig. (Fig. 15 1515 15) )) ). Fig. Fig. Fig. Fig. 15 1515 15. . . . Número de vermes en abomaso en los grupos de ovinos. Se representa la media de cada grupo junto con el error estándar. 4.1.2. 4.1.2.4.1.2. 4.1.2.2 22 2. Inmunización en caprinos . Inmunización en caprinos . Inmunización en caprinos . Inmunización en caprinos frente a frente afrente a frente a infecciones infeccionesinfecciones infecciones con con con con la lala las ss s cepa cepa cepa cepas s s s NA NANA NA y SP y SP y SP y SP Los caprinos inmunizados e infectados con la cepa NA (grupos NA/NA y SP/NA) mostraron una carga parasitaria similar que la observada en el correspondiente grupo control (Ø/NA) (Fig. (Fig. (Fig. (Fig. 16 1616 16) )) ). En los grupos inmunizados e infectados con SP (grupos SP/SP y NA/SP) se observó una reducción en el número de vermes con respecto al grupo control (Ø/SP), siendo esta reducción estadísticamente significativa ( P < 0,05) en el ensayo homólogo (SP/SP) (Fig. 16) (Fig. 16)(Fig. 16) (Fig. 16). 4. Resultados 102 Fig. Fig. Fig. Fig. 16 1616 16. . . . Número de vermes en abomaso al finalizar el ensayo en todos los grupos de caprinos. Se representa la media de cada grupo junto con el error estándar. 4.1.3. 4.1.3. 4.1.3. 4.1.3. SEGUIMIENTO DEL NIV SEGUIMIENTO DEL NIVSEGUIMIENTO DEL NIV SEGUIMIENTO DEL NIVEL DE PROTECCIÓN MEDIANTE EL DE PROTECCIÓN MEDIANTE EL DE PROTECCIÓN MEDIANTE EL DE PROTECCIÓN MEDIANTE ELISA ELISAELISA ELISA Se tomaron muestras de sangre semanalmente a todos los animales para realizar un seguimiento de la respuesta desarrollada durante la inmunización y subsiguiente infección con el parásito. Para ello, se analizó la evolución de los niveles de anticuerpos (IgG) específicos mediante un test ELISA indirecto, utilizando como antígeno las proteinasas utilizadas en las inmunizaciones. Los resultados obtenidos se analizaron de forma individual en cada animal, y a partir de ellos se calculó la media y el error estándar de cada grupo experimental durante todas las semanas del estudio. Los valores que se obtuvieron se expresaron en porcentaje relativo, como ya se indicó en el apartado de Material y M Material y MMaterial y M Material y Métodos étodosétodos étodos. Esta transformación se realizó a fin de eliminar posibles variaciones entre placas. 4.1.3.1. 4.1.3.1. 4.1.3.1. 4.1.3.1. Inmunización en ovinos Inmunización en ovinos Inmunización en ovinos Inmunización en ovinos frente a infecciones frente a infeccionesfrente a infecciones frente a infecciones con con con con la cepa NA la cepa NAla cepa NA la cepa NA En los ovinos inmunizados e infectados experimentalmente con la cepa NA (NA/NA) se observaron valores significativamente más elevados de IgG que en el 4. Resultados 103 grupo control (Ø/NA) en los muestreos llevados a cabo entre la semana 4 ( P < 0,05) y el final del estudio ( P < 0,05). Excepcionalmente, también se apreciaron diferencias significativas a las dos semanas del estudio ( P < 0,01), coincidiendo con el periodo de inmunización. Como se observa en la Fig. Fig. Fig. Fig. 1 11 17 77 7, los niveles de IgG específicos fueron aumentando progresivamente a lo largo del estudio en los animales inmunizados (NA/NA), sufrieron una ligera disminución a partir de la 7ª semana, coincidiendo con el infección experimental, y volvieron a incrementarse a partir de la 8ª semana, alcanzándose los mayores valores en la semana 12 de la experiencia. Los niveles de IgG del grupo control (Ø/NA) permanecieron prácticamente inalterables desde el comienzo del estudio y fueron similares a los de los animales no inmunizados ni infectados (Ø/Ø). 0,00 20,00 40,00 60,00 80,00 100,00 120,00 140,00 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 Semanas SemanasSemanas Semanas Porcentaje relativo de Porcentaje relativo de Porcentaje relativo de Porcentaje relativo de IgG IgG IgG IgG OVINO (NA/ OVINO (NA/OVINO (NA/ OVINO (NA/NA NANA NA) ) ) ) OVINO OVINO OVINO OVINO ( (( (Ø ØØ Ø/ // /NA NANA NA) ) ) ) OVINO OVINO OVINO OVINO ( (( (Ø ØØ Ø/ // /Ø ØØ Ø) )) ) 0,00 20,00 40,00 60,00 80,00 100,00 120,00 140,00 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 Semanas SemanasSemanas Semanas Porcentaje relativo de Porcentaje relativo de Porcentaje relativo de Porcentaje relativo de IgG IgG IgG IgG OVINO (NA/ OVINO (NA/OVINO (NA/ OVINO (NA/NA NANA NA) ) ) ) OVINO OVINO OVINO OVINO ( (( (Ø ØØ Ø/ // /NA NANA NA) ) ) ) OVINO OVINO OVINO OVINO ( (( (Ø ØØ Ø/ // /Ø ØØ Ø) )) ) 0,00 20,00 40,00 60,00 80,00 100,00 120,00 140,00 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 Semanas SemanasSemanas Semanas Porcentaje relativo de Porcentaje relativo de Porcentaje relativo de Porcentaje relativo de IgG IgG IgG IgG OVINO (NA/ OVINO (NA/OVINO (NA/ OVINO (NA/NA NANA NA) ) ) ) OVINO OVINO OVINO OVINO ( (( (Ø ØØ Ø/ // /NA NANA NA) ) ) ) OVINO OVINO OVINO OVINO ( (( (Ø ØØ Ø/ // /Ø ØØ Ø) )) ) 0,00 20,00 40,00 60,00 80,00 100,00 120,00 140,00 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 Semanas SemanasSemanas Semanas Porcentaje relativo de Porcentaje relativo de Porcentaje relativo de Porcentaje relativo de IgG IgG IgG IgG OVINO (NA/ OVINO (NA/OVINO (NA/ OVINO (NA/NA NANA NA) ) ) ) OVINO OVINO OVINO OVINO ( (( (Ø ØØ Ø/ // /NA NANA NA) ) ) ) OVINO OVINO OVINO OVINO ( (( (Ø ØØ Ø/ // /Ø ØØ Ø) )) ) Fig. Fig. Fig. Fig. 1 11 17. 7. 7. 7. Representación comparativa semanal de la evolución de los niveles de IgG específicas entre el grupo de ovinos inmunizados e infectados con NA (NA/NA), el grupo control ovino no inmunizado e infectado (Ø/NA) y el grupo control ovino no inmunizado y no infectado (Ø/Ø). Se representa la media semanal de cada grupo con su error estándar. Están marcadas con flechas las cinco semanas donde se llevaron a cabo las inmunizaciones, así como la semana donde se inocularon las larvas infectantes (semana 7). 4.1.3.2. 4.1.3.2. 4.1.3.2. 4.1.3.2. Inmunización en caprino Inmunización en caprino Inmunización en caprino Inmunización en caprino frente a infecciones frente a infeccionesfrente a infecciones frente a infecciones con con con con la cepa SP la cepa SP la cepa SP la cepa SP Los caprinos inmunizados e infectados con L3 de la cepa SP (SP/SP) presentaron niveles de IgG específicos más elevados que los observados en el grupo 4. Resultados 104 control (Ø/SP) (valores de P entre < 0,001 y < 0,05) durante todas las semanas de la experiencia. Como puede observarse en la Fig. Fig. Fig. Fig. 1 11 18 88 8, los niveles de IgG específicos aumentaron progresivamente a lo largo del estudio en los animales inmunizados (SP/SP), alcanzándose valores máximos al finalizar la experiencia. Los valores de IgG disminuyeron desde la 6ª semana, coincidiendo con la semana posterior a la última dosis del antígeno, hasta la semana 10, pero aún así se mantuvieron las diferencias significativas entre animales inmunizados (SP/SP) y no inmunizados (Ø/SP). A la 11ª semana de comenzado el estudio se produjo un nuevo incremento de los niveles de IgG, que se mantuvieron elevados hasta el final de la experiencia. 0,00 20,00 40,00 60,00 80,00 100,00 120,00 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 Semanas SemanasSemanas Semanas Porcentaje relativo de Porcentaje relativo de Porcentaje relativo de Porcentaje relativo de IgG IgG IgG IgG CAPRINO (SP/ CAPRINO (SP/CAPRINO (SP/ CAPRINO (SP/SP SPSP SP) )) ) CAPRINO CAPRINO CAPRINO CAPRINO ( (( (Ø ØØ Ø/ // /SP SPSP SP) )) ) CA CA CA CA ( (( (Ø ØØ Ø/ // /Ø ØØ Ø) )) ) 0,00 20,00 40,00 60,00 80,00 100,00 120,00 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 Semanas SemanasSemanas Semanas Porcentaje relativo de Porcentaje relativo de Porcentaje relativo de Porcentaje relativo de IgG IgG IgG IgG CAPRINO (SP/ CAPRINO (SP/CAPRINO (SP/ CAPRINO (SP/SP SPSP SP) )) ) CAPRINO CAPRINO CAPRINO CAPRINO ( (( (Ø ØØ Ø/ // /SP SPSP SP) )) ) CA CA CA CA ( (( (Ø ØØ Ø/ // /Ø ØØ Ø) )) ) 0,00 20,00 40,00 60,00 80,00 100,00 120,00 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 Semanas SemanasSemanas Semanas Porcentaje relativo de Porcentaje relativo de Porcentaje relativo de Porcentaje relativo de IgG IgG IgG IgG CAPRINO (SP/ CAPRINO (SP/CAPRINO (SP/ CAPRINO (SP/SP SPSP SP) )) ) CAPRINO CAPRINO CAPRINO CAPRINO ( (( (Ø ØØ Ø/ // /SP SPSP SP) )) ) CA CA CA CA ( (( (Ø ØØ Ø/ // /Ø ØØ Ø) )) ) 0,00 20,00 40,00 60,00 80,00 100,00 120,00 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 Semanas SemanasSemanas Semanas Porcentaje relativo de Porcentaje relativo de Porcentaje relativo de Porcentaje relativo de IgG IgG IgG IgG CAPRINO (SP/ CAPRINO (SP/CAPRINO (SP/ CAPRINO (SP/SP SPSP SP) )) ) CAPRINO CAPRINO CAPRINO CAPRINO ( (( (Ø ØØ Ø/ // /SP SPSP SP) )) ) CA CA CA CA ( (( (Ø ØØ Ø/ // /Ø ØØ Ø) )) ) Fig. Fig. Fig. Fig. 1 11 18. 8.8. 8. Representación comparativa semanal de la evolución de los niveles de IgG entre el grupo de caprinos inmunizados e infectados con SP (SP/SP), el grupo control caprino no inmunizado e infectado (Ø/SP) y el grupo control caprino no inmunizado y no infectado (Ø/Ø). Se representa la media semanal de cada grupo con su error estándar. Están marcadas con flechas las cinco semanas donde se llevaron a cabo las inmunizaciones y la semana donde se inocularon las larvas infectantes (semana 7). 4. Resultados 105 4.2. ANÁLISIS DE POLIMORFISMO GENÉTICO MEDIANTE 4.2. ANÁLISIS DE POLIMORFISMO GENÉTICO MEDIANTE 4.2. ANÁLISIS DE POLIMORFISMO GENÉTICO MEDIANTE 4.2. ANÁLISIS DE POLIMORFISMO GENÉTICO MEDIANTE SSCP. SSCP. SSCP. SSCP. 4. 4.4. 4.2.1. GEN GCP 2.1. GEN GCP2.1. GEN GCP 2.1. GEN GCP- -- -7 77 7 El producto de PCR amplificado para este gen mostró un tamaño de 620 bp aproximadamente. Al evaluar todas las muestras en los diferentes grupos experimentales se obtuvo un total de 7 alelos ( M-A7, M-B7, M-C7, M-D7, M-E7, M-F7 y M-G7 ), 4 de ellos presentes sólo en la cepa de Gran Canaria (SP) ( M-D7, M-E7, M-F7 y M-G7 ), y los otros 3 en ambas cepas. En la Fig. 19 Fig. 19Fig. 19 Fig. 19 se representan los productos amplificados de estos 7 alelos en un gel de agarosa al 1,2%. Como puede apreciarse en la imagen, únicamente el alelo M-E7 presentó diferencias de peso molecular con respecto al resto de alelos. En la Fig. 20 Fig. 20 Fig. 20 Fig. 20 se representan los patrones SSCP para cada alelo. Fig.19. Fig.19.Fig.19. Fig.19. Productos de PCR en gel de agarosa al 1,2% para el locus GCP-7 De izquierda a derecha: DNA Molecular Weight Marker II (0.12-23.1 kbp), homocigotos para los alelos M-A 7 al M-G 7 y DNA Molecular Weight Marker XIV (100-1.500 bp). 4. Resultados 106 Fig. 20. Fig. 20.Fig. 20. Fig. 20. Patrones de SSCP encontrados en el gen codificador de proteasas tipo cisteína GCP-7. Se representan los homocigotos encontrados para los 7 alelos. Las frecuencias de los diferentes patrones de SSCP para el gen GCP-7 en los diferentes grupos experimentales estudiados están recogidas en las T TT Tablas ablas ablas ablas 1 11 16 66 6 y 1 11 18 88 8 (ver Anexo “Tablas”), al igual que las correspondientes frecuencias alélicas (Tablas (Tablas (Tablas (Tablas Anexo Anexo Anexo Anexo 1 11 17 77 7 y 1 1 1 19 99 9) )) ). Los resultados obtenidos para las frecuencias alélicas de todos los grupos fueron evaluados comparativamente con el fin de valorar los distintos factores objeto de estudio, tal y como se recoge en la Tabla Tabla Tabla Tabla 31 3131 31 (ver Anexo “Tablas”). A continuación se describen los resultados de las comparaciones en las que se observaron diferencias significativas o, en su defecto, las que fueron relevantes para la valoración global del estudio de polimorfismo genético planteado. 4. 4.4. 4.2.1.1. 2.1.1.2.1.1. 2.1.1. Factor Factor Factor Factor inmunización inmunizacióninmunización inmunización Se observaron diferencias estadísticamente significativas ( P < 0,05) entre las frecuencias alélicas de vermes aislados de los ovinos inmunizados e infectados con la cepa NA (NA/NA) y su correspondiente grupo control (Ø/NA). Tales diferencias fueron probablemente debidas a una menor presencia del alelo M-C7 en el grupo inmunizado, como puede apreciarse en la Fig. 21 Fig. 21Fig. 21 Fig. 21. El menor número de alelos M-C7 también se observó en ovinos inmunizados con la cepa SP e infectados con la cepa NA (SP/NA), si bien las diferencias no fueron estadísticamente significativas. No hubo diferencias entre los dos grupos de ovinos inmunizados (Fig. (Fig. (Fig. (Fig. 21 2121 21) )) ). Coincidiendo 4. Resultados 107 con la disminución del alelo M-C7 , se observó un aumento del alelo M-A7 en los grupos en los que se observó inmunoprotección (ovino NA/NA y ovino SP/NA). Fig. 2 Fig. 2Fig. 2 Fig. 21. 1. 1. 1. Distribución comparada de alelos para el gen GCP-7 en la población de machos obtenidos de ovinos infectados con la cepa NA. Se representan los grupos inmunizados, tanto con la cepa homóloga (NA) como con la heteróloga (SP), y el grupo control no inmunizado. También se observaron diferencias significativas ( P < 0,05) cuando se compararon las frecuencias alélicas de los caprinos inmunizados e infectados con la cepa SP (SP/SP) con las del correspondiente grupo control (Ø/SP). En esta ocasión, el grado de significación se atribuyó a la menor presencia del alelo M-D7 en el grupo inmunizado (Fig. 22) (Fig. 22)(Fig. 22) (Fig. 22). Estas diferencias, sin llegar a ser significativas, también se observaron en vermes obtenidos en caprinos inmunizados con enzimas aisladas de la cepa NA e infectados con larvas de la cepa SP (NA/SP). No hubo diferencias entre los grupos de caprinos inmunizados, si bien el alelo M-D7 se observó con menor frecuencia en el grupo de caprinos inmunizados con la cepa homóloga (SP/SP) (Fig. (Fig. (Fig. (Fig. 22 2222 22) )) ). Al igual que en los ovinos, en los grupos en los que se observó inmunoprotección (caprinos SP/SP y caprinos NA/SP), la frecuencia del alelo M-A7 se encontró aumentada con respecto a los controles. Al igual que en el ensayo homólogo con NA en ovino (NA/NA), en el grupo de ovinos inmunizados con proteinasas de la cepa SP y posteriormente infectados con esta misma cepa de H. contortus (SP/SP) se observó una disminución del alelo M-C7 y un aumento del M-A7 . En este mismo grupo de animales (SP/SP) y en los 0 00 0 0,1 0,10,1 0,1 0,2 0,20,2 0,2 0,3 0,30,3 0,3 0,4 0,40,4 0,4 0,5 0,50,5 0,5 0,6 0,60,6 0,6 0,7 0,70,7 0,7 0,8 0,80,8 0,8 0,9 0,90,9 0,9 1 11 1 OV (NA/NA) OV (NA/NA) OV (NA/NA) OV (NA/NA) N=164 OV (SP/NA) OV (SP/NA)OV (SP/NA) OV (SP/NA) N=136 OV ( OV (OV ( OV (Ø ØØ Ø/NA) /NA)/NA) /NA) N=170 M MM M- -- -A AA A7 77 7 M MM M- -- -B BB B7 77 7 M MM M - -- - C CC C 7 77 7 Frecuenc Frecuenc Frecuenc Frecuenc ia ia ia ia 4. Resultados 114 Fig. 31. Fig. 31.Fig. 31. Fig. 31. Patrones de SSCP encontrados en el gen codificador de proteasas tipo cisteína AC-1. Se representan los homocigotos encontrados para los 7 alelos. 4. 4.4. 4.2.2.1. 2.2.1.2.2.1. 2.2.1. Factor Factor Factor Factor inmunización inmunizacióninmunización inmunización Al comparar los vermes procedentes de ovinos inmunizados (ya sea con NA o con SP) y posteriormente infectados con la cepa NA, y aquellos correspondientes al grupo control (Ø/NA), se observó una menor frecuencia del alelo M-A1 y mayor frecuencia del alelo M-B1 (Fig. 32) (Fig. 32)(Fig. 32) (Fig. 32), diferencias que resultaron estadísticamente significativas con valores de P < 0,05 y < 0,01 para los inmunizados con la cepa NA y con la cepa SP, respectivamente. Comparando los dos grupos de ovinos inmunizados entre sí, se observó que las diferencias en las frecuencias alélicas eran más acusadas en los inmunizados con inmunógenos procedentes de la cepa SP. En los caprinos infectados con L3 de la cepa SP, los grupos inmunizados tanto con productos purificados de la cepa SP (SP/SP) como de la cepa NA (NA/SP) presentaron frecuencias del alelo M-A1 más elevadas que las del correspondiente grupo control (Ø/SP), y frecuencias inferiores de los alelos M-E1 y M-F1 (Fig. 33) (Fig. 33)(Fig. 33) (Fig. 33). Estas diferencias resultaron en un valor P próximo a la significación al comparar las frecuencias observadas en vermes procedentes de caprino inmunizado con proteinasas tipo cisteína de la cepa NA respecto a su correspondiente grupo control (Ø/SP) ( P = 0,084). 4. Resultados 115 Fig. Fig. Fig. Fig. 32 3232 32. .. . Distribución comparada de alelos para el gen AC-1 en la población de machos obtenidos de ovinos infectados con la cepa NA. Se representan los grupos inmunizados, tanto con la cepa homóloga (NA) como con la heteróloga (SP), y el grupo control no inmunizado. Fig. Fig. Fig. Fig. 33 3333 33. .. . Distribución comparada de alelos para el gen AC-1 en la población de machos obtenidos de caprinos infectados con la cepa SP. Se representan los grupos inmunizados, tanto con la cepa homóloga (SP) como con la heteróloga (NA), y el grupo control no inmunizado. 0 00 0 0,1 0,10,1 0,1 0,2 0,20,2 0,2 0,3 0,30,3 0,3 0,4 0,40,4 0,4 0,5 0,50,5 0,5 0,6 0,60,6 0,6 0,7 0,70,7 0,7 0,8 0,80,8 0,8 0,9 0,90,9 0,9 1 11 1 OV (NA/NA) OV (NA/NA)OV (NA/NA) OV (NA/NA) N=150 OV (SP/NA) OV (SP/NA)OV (SP/NA) OV (SP/NA) N=144 OV (Ø/NA) OV (Ø/NA)OV (Ø/NA) OV (Ø/NA) N=190 M MM M - -- - A AA A 1 11 1 M MM M- -- -B BB B1 11 1 M MM M- -- -C CC C1 11 1 M MM M- -- -D DD D1 11 1 M MM M- -- -E EE E1 11 1 M MM M- -- -F FF F1 11 1 Frecuencia Frecuencia Frecuencia Frecuencia 0 00 0 0,1 0,10,1 0,1 0,2 0,20,2 0,2 0,3 0,30,3 0,3 0,4 0,40,4 0,4 0,5 0,50,5 0,5 0,6 0,60,6 0,6 0,7 0,70,7 0,7 0,8 0,80,8 0,8 0,9 0,90,9 0,9 1 11 1 CA (SP/SP) CA (SP/SP)CA (SP/SP) CA (SP/SP) N=150 CA (NA/SP) CA (NA/SP)CA (NA/SP) CA (NA/SP) N=144 CA (Ø/SP) CA (Ø/SP)CA (Ø/SP) CA (Ø/SP) N=150 Frecuencia Frecuencia Frecuencia Frecuencia M MM M - -- - A AA A 1 11 1 M MM M - -- - B BB B 1 11 1 M MM M - -- - C CC C 1 11 1 M MM M - -- - D DD D 1 11 1 M MM M - -- - E EE E 1 11 1 M MM M - -- - F FF F 1 11 1 4. Resultados 116 En los ovinos inmunizados e infectados con la cepa SP (SP/SP), las frecuencias de los alelos comunes a la cepa NA ( M-A1 , M-B1 y M-C1 ) permanecieron prácticamente iguales. Este mismo grupo de animales y el grupo de ovinos inmunizados con la cepa NA (NA/SP) presentaron además una disminución del alelo M-E1 y un aumento del M-D1 , al compararlos con el grupo control (Ø/SP). Las diferencias encontradas estuvieron próximas a la significación, con valores de P = 0,064 y P = 0,059, respectivamente. En los vermes obtenidos de caprinos infectados con L3 de la cepa NA no hubo significación estadística en ninguna de las comparaciones realizadas entre las frecuencias alélicas de los vermes de los grupos inmunizados y los no inmunizados. Al agrupar las frecuencias alélicas obtenidas en muestras procedentes de todos los ovinos inmunizados con la cepa NA y los ovinos inmunizados con SP, y compararlos con todos los ovinos no inmunizados, los grupos que recibieron inmunización presentaron una disminución del alelo M-A1 y un aumento de los alelos M-B1 y M-F1 . Esta diferencia fue más acusada en los inmunizados con SP, cuya comparación resultó ser estadísticamente significativa ( P < 0,05) (Fig. 34) (Fig. 34) (Fig. 34) (Fig. 34). Al realizar la misma comparación pero en caprino, en los animales inmunizados se observó un aumento del alelo M-A1 y una disminución de los alelos M-E1 y M-F1 , siendo estas diferencias estadísticamente significativas en los caprinos inmunizados con la cepa NA ( P < 0,05). Fig. Fig. Fig. Fig. 3 33 34 44 4. .. . Distribución comparada de alelos para el gen AC-1 en la población de vermes machos obtenidos de ovinos inmunizados con SP. Se representan los grupos inmunizados, tanto con la cepa homóloga (NA) como con la heteróloga (SP), y el grupo control no inmunizado. 0 00 0 0,1 0,10,1 0,1 0,2 0,20,2 0,2 0,3 0,30,3 0,3 0,4 0,40,4 0,4 0,5 0,50,5 0,5 0,6 0,60,6 0,6 0,7 0,70,7 0,7 0,8 0,80,8 0,8 0,9 0,90,9 0,9 1 11 1 OVINOS INM. SP OVINOS INM. SPOVINOS INM. SP OVINOS INM. SP N=304 OVINOS NO INM. OVINOS NO INM.OVINOS NO INM. OVINOS NO INM. N=316 Frecuencia Frecuencia Frecuencia Frecuencia M MM M - -- - A AA A 1 11 1 M MM M- -- -B BB B1 11 1 M MM M - -- - C CC C 1 11 1 M MM M- -- -D DD D1 11 1 M MM M - -- - E EE E 1 11 1 M MM M- -- -F FF F1 11 1 M MM M - -- - G GG G 1 11 1 4. Resultados 117 4. 4.4. 4.2.2.2. 2.2.2.2.2.2. 2.2.2. Factor cepa Factor cepaFactor cepa Factor cepa Al realizar las comparaciones teniendo en cuenta la cepa inoculada se observó que la cepa SP presentaba de forma constante un mayor número de alelos que la cepa de origen norteamericano (NA), lo que propició diferencias significativas en todas las comparaciones (Fig. 3 (Fig. 3(Fig. 3 (Fig. 35 55 5 y 3 y 3 y 3 y 36 66 6) )) ). El alelo M-A1 fue el predominante en ambas cepas. En cambio, en todas las comparaciones se observó que la frecuencia alélica del alelo M-B1 fue inferior en la cepa SP. De esta forma, que en la cepa NA dicho alelo era el segundo mayoritario, mientras que en la cepa SP esta categoría recayó en el alelo M-F1 (Fig. 3 (Fig. 3(Fig. 3 (Fig. 35 55 5 y 3 y 3 y 3 y 36 66 6) )) ). El alelo predominante M-A1 presentó una frecuencia relativa inferior en la cepa SP, sólo en vermes procedentes de grupos experimentales no inmunizados (tanto en ovino como en caprino). Fig. Fig. Fig. Fig. 3 33 35 55 5. .. . Distribución comparada de alelos para el gen AC-1 en la población de vermes machos obtenidos de ovinos no inmunizados tras la infección con L3 de las cepas NA y SP. 4.2.2.3. 4.2.2.3.4.2.2.3. 4.2.2.3. Factor hospedador Factor hospedadorFactor hospedador Factor hospedador Cuando se compararon todos los grupos inmunizados entre sí, los ovinos presentaron una menor frecuencia del alelo M-A1 que los respectivos caprinos, y justo lo contrario se observó cuando las comparaciones se realizaron entre los grupos no inmunizados. 0 00 0 0,1 0,10,1 0,1 0,2 0,20,2 0,2 0,3 0,30,3 0,3 0,4 0,40,4 0,4 0,5 0,50,5 0,5 0,6 0,60,6 0,6 0,7 0,70,7 0,7 0,8 0,80,8 0,8 0,9 0,90,9 0,9 1 11 1 OV (Ø/NA) OV (Ø/NA)OV (Ø/NA) OV (Ø/NA) N=190 OV (Ø/SP) OV (Ø/SP)OV (Ø/SP) OV (Ø/SP) N=126 Frecuencia Frecuencia Frecuencia Frecuencia M MM M- -- -A AA A1 11 1 M MM M - -- - B BB B 1 11 1 M MM M - -- - C CC C 1 11 1 M MM M - -- - D DD D 1 11 1 M MM M- -- -E EE E1 11 1 M MM M - -- - F FF F 1 11 1 M MM M - -- - G GG G 1 11 1 4. Resultados 118 En las muestras obtenidas de los ovinos inmunizados con la cepa NA, además de la disminución del alelo M-A1 ya indicada, se observó un aumento del alelo M-B1 , ligera disminución del alelo M-C1 y un aumento del alelo M-F1 en comparación con los resultados obtenidos en caprino. Fig. Fig. Fig. Fig. 3 33 36 66 6. .. . Distribución comparada de alelos para el gen AC-1 en la población de vermes machos obtenidos de caprinos no inmunizados tras la infección con L3 las cepas NA y SP. Fig. 37. Fig. 37.Fig. 37. Fig. 37. Distribución comparada de alelos para el gen AC-1 en la población de vermes machos obtenidos de ovinos y caprinos inmunizados con la cepa SP [(SP/SP) + (SP/NA)] 0 00 0 0,1 0,10,1 0,1 0,2 0,20,2 0,2 0,3 0,30,3 0,3 0,4 0,40,4 0,4 0,5 0,50,5 0,5 0,6 0,60,6 0,6 0,7 0,70,7 0,7 0,8 0,80,8 0,8 0,9 0,90,9 0,9 1 11 1 OV (SP/SP) + OV (SP/NA) OV (SP/SP) + OV (SP/NA)OV (SP/SP) + OV (SP/NA) OV (SP/SP) + OV (SP/NA) N=304 CAP (SP/SP) CAP (SP/SP) CAP (SP/SP) CAP (SP/SP) + + + + CAP (SP/NA) CAP (SP/NA)CAP (SP/NA) CAP (SP/NA) N=272 Frecuencia Frecuencia Frecuencia Frecuencia M MM M - -- - A AA A 1 11 1 M MM M - -- - B BB B 1 11 1 M MM M - -- - C CC C 1 11 1 M MM M - -- - D DD D 1 11 1 M MM M - -- - E EE E 1 11 1 M MM M - -- - F FF F 1 11 1 0 00 0 0,1 0,10,1 0,1 0,2 0,20,2 0,2 0,3 0,30,3 0,3 0,4 0,40,4 0,4 0,5 0,50,5 0,5 0,6 0,60,6 0,6 0,7 0,70,7 0,7 0,8 0,80,8 0,8 0,9 0,90,9 0,9 1 11 1 CA (Ø/NA) CA (Ø/NA)CA (Ø/NA) CA (Ø/NA) N=116 CA (Ø/SP) CA (Ø/SP)CA (Ø/SP) CA (Ø/SP) N=150 Frecuencia Frecuencia Frecuencia Frecuencia M MM M - -- - A AA A 1 11 1 M MM M- -- -B BB B1 11 1 M MM M - -- - C CC C 1 11 1 M MM M - -- - D DD D 1 11 1 M MM M - -- - E EE E 1 11 1 M MM M- -- -F FF F1 11 1 4. Resultados 119 Cuando se compararon los grupos inmunizados con SP entre sí se observó una mayor frecuencia alélica del alelo M-F1 en los ovinos, circunstancia que se invirtió al comparar entre hospedadores no inmunizados. Además de esto, al agrupar todos los ovinos inmunizados con la cepa SP (SP/SP y SP/NA) y compararlos con la correspondiente agrupación en hospedadores caprinos, no sólo se observó una disminución de la frecuencia del alelo M-A1 (como ya se ha indicado) sino también del M-E1 ; los alelos M-B1 , M-C1 y M-D1 estuvieron por el contrario aumentados. En este caso las diferencias significativas estuvieron cercanas a la significación ( P = 0,064) (Fig. 37) (Fig. 37)(Fig. 37) (Fig. 37). El alelo M-G1 sólo estuvo presente en el ovino, si bien su frecuencia (0,1% del total de la población) fue poco representativa. 4.2.3. GEN AC 4.2.3. GEN AC4.2.3. GEN AC 4.2.3. GEN AC- -- -3 33 3 El producto de PCR amplificado para este gen tenía un tamaño de 345 bp aproximadamente. Al evaluar las muestras de todos los grupos experimentales se obtuvo un total de 8 alelos ( M-A3 , M-B3 , M-C3 , M-D3 , M-E3 , M-F3 , M-G3 y M-H3 ), 3 de ellos presentes sólo en la cepa de Gran Canaria (SP) ( M-F3 , M-G3 y M-H3 ) y 2 sólo en la cepa de Norteamérica (NA) ( M-B3 y M-D3 ), mientras que los restantes 3 alelos ( M-A3 , M-C3 y M-E3 ) se observaron en ambas cepas. En la Fi FiFi Fig. 3 g. 3g. 3 g. 38 88 8 se representan los productos amplificados de estos 8 alelos en un gel de agarosa al 1,2% y en la Fig. 3 Fig. 3 Fig. 3 Fig. 39 99 9 los diferentes patrones obtenidos mediante SSCP para cada alelo. Fig. 3 Fig. 3Fig. 3 Fig. 38 88 8. .. . Productos de PCR en gel de agarosa al 1,2% para el locus AC-3. De izquierda a derecha: DNA Molecular Weight Marker II (0.12-23.1 kbp), homocigotos para los alelos M-A 3 al M-H 3 y DNA Molecular Weight Marker XIV (100-1.500 bp). 4. Resultados 120 Fig. 3 Fig. 3Fig. 3 Fig. 39 99 9. .. . Patrones de SSCP encontrados en el gen codificador de proteasas tipo cisteína AC-3. Se representan los homocigotos encontrados para los 8 alelos. Las frecuencias de los diferentes patrones de SSCP para el gen AC-3 en los diferentes grupos experimentales estudiados están recogidas en las Tablas Tablas Tablas Tablas 2 22 24 44 4 y 2 2 2 26 66 6 (ver Anexo “Tablas”), al igual que las correspondientes frecuencias alélicas (Tablas 2 (Tablas 2(Tablas 2 (Tablas 25 55 5 y 2 2 2 27 77 7) )) ). Los resultados obtenidos para las frecuencias alélicas de todos los grupos fueron evaluados comparativamente con el fin de valorar los distintos factores objeto de estudio, tal y como se describe a continuación. 4.2.3.1. 4.2.3.1.4.2.3.1. 4.2.3.1. Factor Factor Factor Factor inmunización inmunizacióninmunización inmunización Independientemente de la cepa utilizada en la inmunización, las muestras obtenidas en los ovinos inmunizados e infectados con la cepa de NA presentaron diferencias estadísticas significativas ( P < 0,001) al compararlas con su correspondiente grupo control no inmunizado (Ø/NA) (Fig. (Fig. (Fig. (Fig. 40 4040 40A AA A) )) ). En ambos grupos (NA/NA y SP/NA) se observó una mayor frecuencia del alelo M-A3 , y menor frecuencia de los alelos M-C3 , M-D3 y M-E3 . Además, al comparar los dos grupos de ovinos inmunizados entre sí se observó que los valores de las frecuencias alélicas eran similares, salvo la de los alelos M-B3 y M-E3 , el primero de ellos sólo presente en los inmunizados con NA y el segundo en menor proporción en el mismo grupo. Estas 4. Resultados 121 dos circunstancias motivaron que las frecuencias alélicas de ambos grupos fueran estadísticamente significativas ( P < 0,05) (Fig. (Fig. (Fig. (Fig. 40 4040 40A AA A) )) ). Fig. Fig. Fig. Fig. 40 4040 40A AA A. . . . Distribución comparada de alelos para el gen AC-3 en la población de vermes machos obtenidos de ovinos infectados con la cepa NA. Se representan los grupos inmunizados, tanto con la cepa homóloga (NA) como con la heteróloga (SP), y el grupo control no inmunizado. Fig. 40B. Fig. 40B. Fig. 40B. Fig. 40B. Distribución comparada de alelos para el gen AC-3 en la población de vermes machos obtenidos de ovinos infectados con la cepa SP. Se representan los grupos inmunizados, tanto con la cepa homóloga (SP) como con la heteróloga (NA), y el grupo control no inmunizado. Todos los grupos de caprinos infectados con L3 de la cepa SP, previamente inmunizados con cualquiera de las dos cepas (SP/SP y NA/SP), presentaron un aumento del alelo M-E3 , mientras que los alelos M-C3 y M-H3 presentaron frecuencias relativas menores cuando se compararon con el grupo control. Estas 0 00 0 0,1 0,10,1 0,1 0,2 0,20,2 0,2 0,3 0,30,3 0,3 0,4 0,40,4 0,4 0,5 0,50,5 0,5 0,6 0,60,6 0,6 0,7 0,70,7 0,7 0,8 0,80,8 0,8 0,9 0,90,9 0,9 1 11 1 CA (SP/SP) CA (SP/SP)CA (SP/SP) CA (SP/SP) N=116 CA (NA/SP) CA (NA/SP)CA (NA/SP) CA (NA/SP) N=122 CA (Ø/SP) CA (Ø/SP)CA (Ø/SP) CA (Ø/SP) N=138 Frecuencia Frecuencia Frecuencia Frecuencia M MM M- -- -A AA A3 33 3 M MM M- -- -B BB B3 33 3 M MM M - -- - C CC C 3 33 3 M MM M- -- -D DD D3 33 3 M MM M- -- -E EE E3 33 3 M MM M- -- -F FF F3 33 3 M MM M- -- -G GG G3 33 3 M MM M- -- -H HH H3 33 3 0 00 0 0,1 0,10,1 0,1 0,2 0,20,2 0,2 0,3 0,30,3 0,3 0,4 0,40,4 0,4 0,5 0,50,5 0,5 0,6 0,60,6 0,6 0,7 0,70,7 0,7 0,8 0,80,8 0,8 0,9 0,90,9 0,9 1 11 1 OV (NA/NA) OV (NA/NA)OV (NA/NA) OV (NA/NA) N=116 OV (SP/NA) OV (SP/NA)OV (SP/NA) OV (SP/NA) N=116 OV (Ø/NA) OV (Ø/NA)OV (Ø/NA) OV (Ø/NA) N=132 Frecuencia Frecuencia Frecuencia Frecuencia M MM M- -- -A AA A3 33 3 M MM M- -- -B BB B3 33 3 M MM M - -- - C CC C 3 33 3 M MM M - -- - D DD D 3 33 3 M MM M - -- - E EE E 3 33 3 4. Resultados 122 variaciones en las frecuencias alélicas se tradujo en diferencias significativas ( P < 0,001) (Fig. 40B) (Fig. 40B) (Fig. 40B) (Fig. 40B). En las infecciones de ovinos con la cepa SP de origen caprino hay que destacar varios aspectos. Por un lado, al analizar los dos grupos de ovinos inmunizados e infectados con esta cepa (SP/SP y NA/SP) se observó una frecuencia similar para el alelo M-A3 , mientras que los alelos M-E3 y M-F3 estuvieron aumentados en el grupo homólogo SP/SP. Aparte, en este último grupo no se encontraron los alelos M-C3 , M-G3 y M-H3 , todo lo cual motivó que hubieran diferencias significativas ( P < 0,001), tanto al comparar los dos grupos inmunizados entre sí, como al comparar los resultados del grupo inmunizado con NA (NA/SP) con el control (Ø/SP) (Fig. (Fig. (Fig. (Fig. 41A 41A41A 41A) )) ). Fig. 4 Fig. 4Fig. 4 Fig. 41A 1A1A 1A. . . . Distribución comparada de alelos para el gen AC-3 en la población de vermes machos obtenidos de ovinos infectados con la cepa SP. Se representan los grupos inmunizados, tanto con la cepa homóloga (SP) como con la heteróloga (NA), y el grupo control no inmunizado. Por su parte, en las muestras procedentes de caprinos infectados con la cepa de origen ovino (NA), al comparar los grupos inmunizados e infectados (SP/NA y NA/NA) con el grupo control correspondiente (Ø/NA), sólo se observaron diferencias estadísticamente significativas cuando la inmunización se realizó con la cepa SP, si bien en todos los inmunizados la proporción de alelos M-A3 y M-E3 fue menor, y mayor la del alelo M-D3 (Fig. (Fig. (Fig. (Fig. 4 44 41 11 1B BB B) )) ). La única pero importante diferencia fue la ausencia de alelo M-C3 en los vermes de animales inmunizados de forma homóloga (NA/NA) en comparación con los inmunizados de forma heteróloga (SP/NA), en los que este alelo se encontró con una frecuencia del 16%. Esta 0 00 0 0,1 0,10,1 0,1 0,2 0,20,2 0,2 0,3 0,30,3 0,3 0,4 0,40,4 0,4 0,5 0,50,5 0,5 0,6 0,60,6 0,6 0,7 0,70,7 0,7 0,8 0,80,8 0,8 0,9 0,90,9 0,9 1 11 1 OV OV OV OV (SP/SP) (SP/SP)(SP/SP) (SP/SP) N=100 OV OV OV OV (NA/SP) (NA/SP)(NA/SP) (NA/SP) N=149 OV (Ø/SP) OV (Ø/SP)OV (Ø/SP) OV (Ø/SP) N=88 Frecuencia Frecuencia Frecuencia Frecuencia M MM M - -- - A AA A 3 33 3 M MM M- -- -B BB B3 33 3 M MM M - -- - C CC C 3 33 3 M MM M - -- - D DD D 3 33 3 M MM M - -- - E EE E 3 33 3 M MM M- -- -F FF F3 33 3 M MM M - -- - G GG G 3 33 3 M MM M - -- - H HH H 3 33 3 4. Resultados 123 característica, unida a una menor frecuencia del alelo M-E3 en este mismo grupo motivó que hubiese diferencias estadísticamente significativas ( P < 0,001) entre los dos lotes de caprinos inmunizados. Fig. 4 Fig. 4Fig. 4 Fig. 41 11 1B BB B. . . . Distribución comparada de alelos para el gen AC-3 en la población de vermes machos obtenidos de caprinos infectados con la cepa NA. Se representan los grupos inmunizados, tanto con la cepa homóloga (NA) como con la heteróloga (SP), y el grupo control no inmunizado. Al agrupar y comparar los resultados procedentes de todos los infectados con L3 de la cepa NA que previamente habían sido inmunizados, se observó una menor proporción del alelo M-E3 con respecto a los no inmunizados (Ø/NA). Estas diferencias fueron más acusadas cuando las inmunizaciones se realizaron con su hospedador originario, es decir, grupos NA/NA en el ovino. 4.2.3.2. 4.2.3.2.4.2.3.2. 4.2.3.2. Factor cepa Factor cepaFactor cepa Factor cepa Como ya se ha indicado, el gen AC-3 presentó 8 alelos distintos. Tres de ellos fueron alelos comunes de ambas cepas ( M-A3 , M-C3 y M-E3 ), otros tres sólo se observaron en la cepa SP ( M-F3 , M-G3 y M-H3 ) y dos sólo aparecieron en la cepa NA ( M-B3 y M-D3 ) (Fig. 4 (Fig. 4(Fig. 4 (Fig. 42 22 2) )) ). La presencia o ausencia de alelos junto con las variaciones de frecuencia alélica entre ambas cepas provocaron que en todas las comparaciones analizadas hubiese diferencias estadísticamente significativas con el mayor grado de significación ( P < 0,001). 0 00 0 0,1 0,10,1 0,1 0,2 0,20,2 0,2 0,3 0,30,3 0,3 0, 0,0, 0, 4 44 4 0,5 0,50,5 0,5 0,6 0,60,6 0,6 0,7 0,70,7 0,7 0,8 0,80,8 0,8 0,9 0,90,9 0,9 1 11 1 CA (NA/NA) CA (NA/NA)CA (NA/NA) CA (NA/NA) N=94 CA (SP/NA) CA (SP/NA)CA (SP/NA) CA (SP/NA) N=116 CA (Ø/NA) CA (Ø/NA)CA (Ø/NA) CA (Ø/NA) N=86 Frecuencia Frecuencia Frecuencia Frecuencia M MM M - -- - A AA A 3 33 3 M MM M - -- - B BB B 3 33 3 M MM M - -- - C CC C 3 33 3 M MM M - -- - D DD D 3 33 3 M MM M - -- - E EE E 3 33 3 4. Resultados 130 Finalmente, en las muestras procedentes de ganado caprino infectado con la cepa de origen ovino NA, no se observó ningún tipo de tendencia en las frecuencias alélicas a destacar, salvo que los vermes de caprinos inmunizados con proteinasas de la cepa SP y posteriormente infectados con larvas NA (SP/NA) presentaron unos niveles de alelos M-A4 similares a los observados en las muestras de los ovinos del grupo control para la cepa NA (Ø/NA). Fig. 4 Fig. 4Fig. 4 Fig. 49 99 9. . . . Distribución comparada de alelos para el gen AC-4 en la población de machos obtenidos de caprinos infectados con la cepa SP. Se representan los grupos inmunizados, tanto con la cepa homóloga (SP) como con la heteróloga (NA), y el grupo control no inmunizado. Independientemente de las diferencias en las frecuencias alélicas, sólo se observaron alelos M-E4 en los grupos control de la cepa SP (Ø/SP) en ambos hospedadores, y alelos M-F4 sólo en los caprinos del grupo control de dicha cepa (Ø/SP). El alelo M-F4 fue el tercer-cuarto alelo predominante, de hecho, su ausencia en el grupo control unido a la menor presencia del alelo M-A4 en los vermes aislados en los caprinos inmunizados (SP/SP y NA/SP) propició que existiesen diferencias estadísticamente significativas entre las frecuencias alélicas obtenidas en los caprinos inmunizados y los no inmunizados tras la infección experimental con la cepa SP, con valores de significación más altos en el ensayo homólogo (SP/SP). Al agrupar los datos procedentes de todos los animales inmunizados y compararlos con los correspondientes a los no inmunizados, se observaron diferencias estadísticamente significativas (P<0,001), acentuándose los patrones de frecuencias ya descritas anteriormente, es decir, frecuencias alélicas M-A4 disminuidas y aumento de la frecuencia de los alelos M-B4 y M-C4 . 0 00 0 0,1 0,10,1 0,1 0,2 0,20,2 0,2 0,3 0,30,3 0,3 0,4 0,40,4 0,4 0,5 0,50,5 0,5 0,6 0,60,6 0,6 0,7 0,70,7 0,7 0,8 0,80,8 0,8 0,9 0,90,9 0,9 1 11 1 CA (SP/SP) CA (SP/SP)CA (SP/SP) CA (SP/SP) N=154 CA (NA/SP) CA (NA/SP)CA (NA/SP) CA (NA/SP) N=140 CA (Ø/SP) CA (Ø/SP)CA (Ø/SP) CA (Ø/SP) N=162 Frecuencia Frecuencia Frecuencia Frecuencia M MM M - -- - A AA A 4 44 4 M MM M - -- - B BB B 4 44 4 M MM M - -- - C CC C 4 44 4 M MM M- -- -D DD D4 44 4 M MM M - -- - E EE E 4 44 4 M MM M - -- - F FF F 4 44 4 4. Resultados 131 4.2.4.2. 4.2.4.2.4.2.4.2. 4.2.4.2. Factor cepa Factor cepaFactor cepa Factor cepa Tras analizar todos los patrones de SSCP, se encontró que la cepa SP presentaba 3 alelos más que la cepa de Norteamérica, concretamente los alelos M-D4 , M-E4 y M-F4 (Fig. (Fig. (Fig. (Fig. 50 5050 50 y y y y 51 5151 51) )) ). Esto motivó que al hacer las comparaciones las diferencias asociadas al factor cepa fueran estadísticamente significativas en todos los casos. La cepa SP, tanto en muestras obtenidas en ovino como en caprino, presentó una mayor proporción del alelo M-B4 y menor proporción del alelo M-C4 en todas las comparaciones con respecto a la cepa NA. En ambas cepas los alelos predominantes fueron el M-A4 y el M-B4 , siendo el M-C4 el tercer alelo más frecuente. A pesar de que la cepa SP presentó mayor variedad de alelos, estos tres alelos se mantuvieron en frecuencias similares a los de la cepa NA. Los alelos M-D4 y M-E4 se encontraron como alelos minoritarios en las dos cepas, y el alelo M-F4 , que sólo se presentó en muestras de caprino no inmunizado e infectado experimentalmente con la cepa SP, mostró una frecuencia alélica similar a la del alelo M-C4 (Fig. (Fig. (Fig. (Fig. 50 5050 50 y y y y 51 5151 51) )) ). Fig. Fig. Fig. Fig. 50 5050 50. .. . Distribución comparada de alelos para el gen AC-4 en la población de vermes machos obtenidos de ovinos infectados experimentalmente con las cepas NA y SP. 0 00 0 0,1 0,10,1 0,1 0,2 0,20,2 0,2 0,3 0,30,3 0,3 0,4 0,40,4 0,4 0,5 0,50,5 0,5 0,6 0,60,6 0,6 0,7 0,70,7 0,7 0,8 0,80,8 0,8 0,9 0,90,9 0,9 1 11 1 OV (Ø/NA) OV (Ø/NA)OV (Ø/NA) OV (Ø/NA) N=190 OV (Ø/SP) OV (Ø/SP)OV (Ø/SP) OV (Ø/SP) N=128 Frecuencia Frecuencia Frecuencia Frecuencia M MM M- -- -A AA A4 44 4 M MM M - -- - B BB B 4 44 4 M MM M - -- - C CC C 4 44 4 M MM M- -- -D DD D4 44 4 M MM M - -- - E EE E 4 44 4 M MM M - -- - F FF F 4 44 4 4. Resultados 132 Fig. 51 Fig. 51Fig. 51 Fig. 51. .. . Distribución comparada de alelos para el gen AC-4 en la población de vermes machos obtenidos de caprinos infectados experimentalmente con las cepas NA y SP. 4.2.4.3. 4.2.4.3.4.2.4.3. 4.2.4.3. Factor hospedador Factor hospedadorFactor hospedador Factor hospedador Las muestras de vermes machos procedentes de ovinos no inmunizados (Ø/NA) presentaron una mayor frecuencia del alelo M-A4 al compararlo con los resultados del correspondiente grupo caprino (Ø/NA), aunque las diferencias no llegaron a ser significativas. Esta tendencia se invirtió cuando se compararon los ovinos inmunizados (independientemente de la cepa utilizada en las inmunizaciones) con los respectivos grupos caprinos. En relación a la cepa SP, también los vermes machos de ovinos inmunizados (SP/SP y NA/SP) presentaron una menor frecuencia del alelo M-A4 , sin tampoco llegar a ser significativas las diferencias con respecto a sus homólogos caprinos. No se observaron diferencias entre ambos hospedadores en los grupos no inmunizados e infectados con esta cepa (Ø/SP). En general, las frecuencias de los alelos M-B4 y M-C4 se mantuvieron con valores ligeramente más elevados en las muestras procedentes de ovinos. Las únicas excepciones se encontraron en el grupo control de la cepa NA (Ø/NA), donde el alelo M-B4 se presentó ligeramente en menor proporción en los grupos ovinos, y en el grupo control de la cepa SP (Ø/SP), donde el alelo M-C4 presentó también valores menores en dicho hospedador. 0 00 0 0,1 0,10,1 0,1 0,2 0,20,2 0,2 0 00 0 ,3 ,3,3 ,3 0,4 0,40,4 0,4 0,5 0,50,5 0,5 0,6 0,60,6 0,6 0,7 0,70,7 0,7 0,8 0,80,8 0,8 0,9 0,90,9 0,9 1 11 1 CA (Ø/NA) CA (Ø/NA)CA (Ø/NA) CA (Ø/NA) N=128 CA (Ø/SP) CA (Ø/SP)CA (Ø/SP) CA (Ø/SP) N=162 Frecuencia Frecuencia Frecuencia Frecuencia M MM M - -- - A AA A 4 44 4 M MM M - -- - B BB B 4 44 4 M MM M - -- - C CC C 4 44 4 M MM M - -- - D DD D 4 44 4 M MM M - -- - E EE E 4 44 4 M MM M - -- - F FF F 4 44 4 4. Resultados 133 Fig. 5 Fig. 5Fig. 5 Fig. 52 22 2. .. . Distribución comparada de alelos para el gen AC-4 en la población de vermes machos obtenidos en todos los animales infectados experimentalmente con la cepa NA. Se representan los ovinos infectados con dicha cepa frente a sus homólogos caprinos, independientemente de la inmunización y tipo de antígeno utilizado en las inmunizaciones. Fig. 5 Fig. 5Fig. 5 Fig. 53 33 3. .. . Distribución comparada de alelos para el gen AC-4 en la población de vermes machos obtenidos en todos los animales infectados experimentalmente con la cepa SP. Se representan los ovinos infectados con dicha cepa frente a sus homólogos caprinos, independientemente de la inmunización y tipo de antígeno utilizado en las inmunizaciones. 0 00 0 0,1 0,10,1 0,1 0,2 0,20,2 0,2 0,3 0,30,3 0,3 0,4 0,40,4 0,4 0,5 0,50,5 0,5 0,6 0,60,6 0,6 0,7 0,70,7 0,7 0,8 0,80,8 0,8 0,9 0,90,9 0,9 1 11 1 OV INOC. NA OV INOC. NAOV INOC. NA OV INOC. NA N=502 CA INOC. NA CA INOC. NACA INOC. NA CA INOC. NA N=468 Frecuencia Frecuencia Frecuencia Frecuencia M MM M - -- - A AA A 4 44 4 M MM M - -- - B BB B 4 44 4 M MM M - -- - C CC C 4 44 4 0 00 0 0,1 0,10,1 0,1 0,2 0,20,2 0,2 0,3 0,30,3 0,3 0, 0,0, 0, 4 44 4 0,5 0,50,5 0,5 0,6 0,60,6 0,6 0,7 0,70,7 0,7 0,8 0,80,8 0,8 0,9 0,90,9 0,9 1 11 1 OV INOC. SP OV INOC. SPOV INOC. SP OV INOC. SP N=443 CA INOC. SP CA INOC. SPCA INOC. SP CA INOC. SP N=456 Frecuencia Frecuencia Frecuencia Frecuencia M MM M - -- - A AA A 4 44 4 M MM M- -- -B BB B4 44 4 M MM M - -- - C CC C 4 44 4 M MM M - -- - D DD D 4 44 4 M MM M- -- -E EE E4 44 4 M MM M - -- - F FF F 4 44 4 4. Resultados 134 Al agrupar los resultados de los grupos ovinos infectados experimentalmente con la cepa NA y compararlos con los grupos caprinos infectados con L3 de la misma cepa, se confirmó que todos los vermes aislados de ovinos infectados con la cepa NA presentaron menor frecuencia del alelo M-A4 y mayor frecuencia de los alelos M-B4 y M-C4 (Fig. 52) (Fig. 52)(Fig. 52) (Fig. 52); no obstante, estas diferencias no fueron lo suficientemente importantes como para alcanzar una significación estadística. Al igual que en la cepa NA, cuando se agruparon todos los resultados obtenidos en los animales infectados con la cepa SP, se observó menor frecuencia del alelo M-A4 y mayor presencia del alelo M-B4 en los ovinos, mientras que tanto el alelo M-C4 como el M-D4 permanecieron aproximadamente iguales en ambos hospedadores (Fig. 53) (Fig. 53)(Fig. 53) (Fig. 53). Agrupando todos los resultados obtenidos en ovinos y comparándolos con todos los obtenidos en caprinos, se confirmó lo descrito con anterioridad en las comparaciones sectoriales, es decir, menor frecuencia del alelo M-A4 y mayor frecuencia de los alelos M-B4 , M-C4 y M-D4 en los ovinos. 4.3. ESTUDIO DE LA VARIABILIDAD GENÉT 4.3. ESTUDIO DE LA VARIABILIDAD GENÉT4.3. ESTUDIO DE LA VARIABILIDAD GENÉT 4.3. ESTUDIO DE LA VARIABILIDAD GENÉTICA ICAICA ICA 4.3.1. 4.3.1. 4.3.1. 4.3.1. GEN GEN GEN GEN GCP GCPGCP GCP- -- -7 77 7 Tabla 11 Tabla 11Tabla 11 Tabla 11. . . . Estimación de la variabilidad nucleotídica dentro y entre las distintas cepas (NA y SP) en el gen GCP-7 de Haemonchus contortus . Se representa el número de sitios polimórficos ( S ), la diversidad nucleotídica (π) y la heterocigosidad por sitio nucleotídico ( θ ). Los errores estándar se muestran entre paréntesis. CEPA NA CEPA NACEPA NA CEPA NA CEPA SP CEPA SPCEPA SP CEPA SP S SS S 82 109 π ππ π 0,1024 (0,0283) 0,0954 (0,0130) θ θθ θ 0,1018 (0,0615) 0,0969 (0,0440) Distancia media dentro de g Distancia media dentro de gDistancia media dentro de g Distancia media dentro de grupos ruposrupos rupos 0,0890 (0,0120) 0,1030 (0,0100) Distancia media entre grupos Distancia media entre gruposDistancia media entre grupos Distancia media entre grupos 0,0830 (0,0090) Distancia mínima del total de la población Distancia mínima del total de la poblaciónDistancia mínima del total de la población Distancia mínima del total de la población 0,0240 (0,0070) Distancia máxima del total de la población Distancia máxima del total de la poblaciónDistancia máxima del total de la población Distancia máxima del total de la población 0,1570 (0,0200) Diversidad media del total de la población Diversidad media del total de la poblaciónDiversidad media del total de la población Diversidad media del total de la población 0,0930 (0,0090) 4. Resultados 135 M - B 7 M-F 7 M-D 7 M-E 7 M-A 7 M-C 7 M-G 7 100 98 84 90 0.000.010.020,030.040.050.060.07 M - B 7 M-F 7 M-D 7 M-E 7 M-A 7 M-C 7 M-G 7 100 98 84 90 0.000.010.020,030.040.050.060.07 Fig. 5 Fig. 5Fig. 5 Fig. 54 44 4. .. . Dendrograma de las secuencias del gen GCP-7 de proteinasas tipo cisteína de Haemonchus contortus de España y Norte América. El árbol se obtuvo mediante 500 réplicas usando los métodos Jukes Cantor y Neighbour-Joining en MEGA versión 4.0. Los números junto a las ramas son los porcentajes de probabilidad en base a los 500 muestreos aleatorios. La escala representa las distancias Jukes Cantor entre los alelos de los diferentes loci analizados. El gen GCP-7 mostró mayor número de sitios polimórficos (S) en la cepa SP, con un total de 109, frente a los 82 que se encontraron en la cepa NA. Por otro lado, también en la cepa SP fue donde la distancia media dentro de grupos fue mayor, con un valor de 0,103 frente al valor de 0,089 encontrado en la cepa NA. 4.3.2. 4.3.2. 4.3.2. 4.3.2. GEN GEN GEN GEN AC ACAC AC- -- -1 11 1 En el gen AC-1 también se encontró un mayor número de sitios polimórficos (S) en la cepa SP, con un total de 30, frente a los 27 de la cepa NA. Sin embargo, fue la cepa NA la que mostró una mayor distancia media dentro de grupos, con un valor de 0,049. En el gen AC-1 se diferenciaron 2 grandes grupos que partieron de un tronco común para conformar dos ramas filogenéticas bien diferenciadas. Una de ellas englobó a los alelos M-A1 y M-G1 (éstos más relacionados entre sí) y al alelo M-B1 . La otra rama incluyó al resto de alelos, de los cuales el M-F1 se encontró más distanciado filogenéticamente (Fig. 55) (Fig. 55)(Fig. 55) (Fig. 55). 4. Resultados 136 Tabla 12 Tabla 12Tabla 12 Tabla 12. . . . Estimación de la variabilidad nucleotídica dentro y entre las distintas cepas (NA y SP) en el gen AC-1 de Haemonchus contortus . Se representa el número de sitios polimórficos ( S ), la diversidad nucleotídica (π) y la heterocigosidad por sitio nucleotídico ( θ ). Los errores estándar se muestran entre paréntesis. CEPA NA CEPA NACEPA NA CEPA NA CEPA SP CEPA SPCEPA SP CEPA SP S SS S 27 30 π ππ π 0,0477 (0,0099) 0,0389 (0,0066) θ θθ θ 0,0453 (0,0254) 0,0376 (0,0179) Distancia media dentro Distancia media dentro Distancia media dentro Distancia media dentro de grupos de gruposde grupos de grupos 0,0490 (0,0090) 0,0400 (0,0070) Distancia media entre grupos Distancia media entre gruposDistancia media entre grupos Distancia media entre grupos 0,0370 (0,0070) Distancia mínima del total de la población Distancia mínima del total de la poblaciónDistancia mínima del total de la población Distancia mínima del total de la población 0,0030 (0,0030) Distancia máxima del total de la población Distancia máxima del total de la poblaciónDistancia máxima del total de la población Distancia máxima del total de la población 0,0640 (0,0140) Diversidad media del total de la población Diversidad media del total de la poblaciónDiversidad media del total de la población Diversidad media del total de la población 0,0400 (0,0070) M-D 1 M-E 1 M-C 1 M-F 1 M-B 1 M-A 1 M-G 1 97 93 76 97 0.0000.0050.0100.0150.0200.025 M-D 1 M-E 1 M-C 1 M-F 1 M-B 1 M-A 1 M-G 1 97 93 76 97 0.0000.0050.0100.0150.0200.025 Fig. 5 Fig. 5Fig. 5 Fig. 55 55 5. .. . Dendrograma de las secuencias del gen AC-1 de proteinasas tipo cisteína de Haemonchus contortus de España y Norte América. El árbol se obtuvo mediante 500 réplicas usando los métodos Jukes Cantor y Neighbour-Joining en MEGA versión 4.0. Los números junto a las ramas son los porcentajes de probabilidad en base a los 500 muestreos aleatorios. La escala representa las distancias Jukes Cantor entre los alelos de los diferentes loci analizados. 4.3.3. 4.3.3. 4.3.3. 4.3.3. GEN GEN GEN GEN AC ACAC AC- -- -3 33 3 El gen AC-3 mostró mayor número de sitios polimórficos (S) en la cepa SP, con un total de 47, frente a los 37 de la cepa NA. Así mismo, la cepa SP fue la que 4. Resultados 137 mostró mayor distancia media dentro grupos, con un valor de 0,067 tal y como puede apreciarse en la Tabl TablTabl Tabla aa a 1 1 1 13 33 3. Tabla 1 Tabla 1Tabla 1 Tabla 13 33 3. . . . Estimación de la variabilidad nucleotídica dentro y entre las distintas cepas (NA y SP) en el gen AC-3 de Haemonchus contortus . Se representa el número de sitios polimórficos ( S ), la diversidad nucleotídica (π) y la heterocigosidad por sitio nucleotídico ( θ ). Los errores estándar se muestran entre paréntesis. CEPA NA CEPA NACEPA NA CEPA NA CEPA SP CEPA SPCEPA SP CEPA SP S SS S 37 47 π ππ π 0,0552 (0,0161) 0,0636 (0,0074) θ θθ θ 0,0584 (0,0302) 0,0719 (0,0349) Distancia media dentro de grupos Distancia media dentro de gruposDistancia media dentro de grupos Distancia media dentro de grupos 0,0560 (0,0090) 0,0670 (0,0090) Distancia media entre grupos Distancia media entre gruposDistancia media entre grupos Distancia media entre grupos 0,0560 (00080) Distancia mínima del total de la población Distancia mínima del total de la poblaciónDistancia mínima del total de la población Distancia mínima del total de la población 0,0040 (0,0030) Distancia máxima del total de la población Distancia máxima del total de la poblaciónDistancia máxima del total de la población Distancia máxima del total de la población 0,0890 (0,0180) Diversidad media del total de la población Diversidad media del total de la poblaciónDiversidad media del total de la población Diversidad media del total de la población 0,0580 (0,0090) M - D 3 M-E 3 M-B 3 M-F 3 M-H 3 M-C 3 M-A 3 M-G 3 99 87 84 60 0.0000.0050.0100.0150.0200.0250.0300.035 M - D 3 M-E 3 M-B 3 M-F 3 M-H 3 M-C 3 M-A 3 M-G 3 99 87 84 60 0.0000.0050.0100.0150.0200.0250.0300.035 Fig, 56 Fig, 56Fig, 56 Fig, 56. .. . Dendrograma de las secuencias del gen AC-3 de proteasas tipo cisteína de Haemonchus contortus de España y Norte América. El árbol se obtuvo mediante 500 réplicas usando los métodos Jukes Cantor y Neighbour-Joining en MEGA versión 4.0. Los números junto a las ramas son los porcentajes de probabilidad en base a los 500 muestreos aleatorios. La escala representa las distancias Jukes Cantor entre los alelos de los diferentes loci analizados. El gen AC-3 presentó 2 ramas filogenéticas bien distintas, en una de ellas se agruparon los alelos M-A3 , M-C3 y M-G3 y en la otra el resto. En esta última rama, el alelo M-H3 estuvo claramente separado del resto (Fig. 56) (Fig. 56)(Fig. 56) (Fig. 56). 4. Resultados 138 4.3.4. 4.3.4. 4.3.4. 4.3.4. GEN GEN GEN GEN AC ACAC AC- -- -4 44 4 El gen AC-4 mostró mayor número de sitios polimórficos (S) en la cepa SP, con un total de 17 sitios polimórficos, frente a los 14 de la cepa NA. Por el contrario, en la cepa SP fue donde la distancia media dentro de grupos fue menor (Tabla 14) (Tabla 14)(Tabla 14) (Tabla 14). Tabla 14 Tabla 14Tabla 14 Tabla 14. . . . Estimación de la variabilidad nucleotídica dentro y entre las distintas cepas (NA y SP) en el gen AC-4 de Haemonchus contortus . Se representa el número de sitios polimórficos ( S ), la diversidad nucleotídica (π) y la heterocigosidad por sitio nucleotídico ( θ ). Los errores estándar se muestran entre paréntesis. CEPA NA CEPA NACEPA NA CEPA NA CEPA SP CEPA SPCEPA SP CEPA SP S SS S 14 17 π ππ π 0,0318 (0,0104) 0,0273 (0,0049) θ θθ θ 0,0318 (0,0202) 0,0254 (0,0130) Distancia media dentro de grupos Distancia media dentro de gruposDistancia media dentro de grupos Distancia media dentro de grupos 0,0330 (0,0090) 0,0280 (0,0070) Distancia media entre grupos Distancia media entre gruposDistancia media entre grupos Distancia media entre grupos 0,0240 (0,0060) Distancia mínima del total de la población Distancia mínima del total de la poblaciónDistancia mínima del total de la población Distancia mínima del total de la población 0,0030 (0,0030) Distancia máxima del total de la población Distancia máxima del total de la poblaciónDistancia máxima del total de la población Distancia máxima del total de la población 0,0490 (0,0140) Diversidad media del total de la población Diversidad media del total de la poblaciónDiversidad media del total de la población Diversidad media del total de la población 0,0270 (0,0060) Fig. 57 Fig. 57Fig. 57 Fig. 57. .. . Dendrograma de las secuencias del gen AC-4 de proteasas tipo cisteína de Haemonchus contortus de España y Norte América. El árbol se obtuvo mediante 500 réplicas usando los métodos Jukes Cantor y Neighbour-Joining en MEGA versión 4.0. Los números junto a las ramas son los porcentajes de probabilidad en base a los 500 muestreos aleatorios. La escala representa las distancias Jukes Cantor entre los alelos de los diferentes loci analizados. 0.002 0.0020.002 0.002 0.001 0.0010.001 0.001 0.000 0.0000.000 0.000 0.003 0.0030.003 0.003 0.004 0.0040.004 0.004 0.006 0.0060.006 0.006 0.005 0.0050.005 0.005 M M M M - -- - A AA A 4 44 4 M M M M - -- - C CC C 4 44 4 M M M M - -- - E EE E 4 44 4 M M M M - -- - B BB B 4 44 4 M M M M - -- - D DD D 4 44 4 M M M M - -- - F FF F 4 44 4 96 9696 96 100 100100 100 73 7373 73 4. Resultados 139 El árbol filogenético del gen AC-4 agrupó los seis alelos encontrados en dos ramas. En una de ellas se englobaron los alelos M-A4 , M-C4 y M-E4 , los dos primeros con un origen común. En la segunda rama se incluyeron a los alelos M-B4 , M-D4 y M-F4 , de los cuales el M-B4 presentó un origen distinto (Fig. 57) (Fig. 57)(Fig. 57) (Fig. 57). 10. Bibliografía 239 WOO WOOWOO WOOTTON, J. C., FENG, X., FERDIG, M. T., COOPER, R. A., MU, J., BARUCH, D. TTON, J. C., FENG, X., FERDIG, M. T., COOPER, R. A., MU, J., BARUCH, D. TTON, J. C., FENG, X., FERDIG, M. T., COOPER, R. A., MU, J., BARUCH, D. TTON, J. C., FENG, X., FERDIG, M. T., COOPER, R. A., MU, J., BARUCH, D. I., MAGILL, A. J. y SU, X. Z. (2002): I., MAGILL, A. J. y SU, X. Z. (2002):I., MAGILL, A. J. y SU, X. Z. (2002): I., MAGILL, A. J. y SU, X. Z. (2002): Genetic diversity and chloroquine selective sweeps in Plasmodium falciparum . Nature, London 418: 320-323. 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W., KIM, Y. M.E, K. W., KIM, Y. M. E, K. W., KIM, Y. M., LEE, M. H. , LEE, M. H. , LEE, M. H. , LEE, M. H. y yy y PARK, H. (2004): PARK, H. (2004): PARK, H. (2004): PARK, H. (2004): Cloning and characterization of a new cysteine proteinase secreted by Paragonimus westermani adult worms. Am. J. Trop. Med. Hyg. 71: 87-92. YANG, Y., WEI, H., QIN, W. y ZHENG, J. (2009): YANG, Y., WEI, H., QIN, W. y ZHENG, J. (2009):YANG, Y., WEI, H., QIN, W. y ZHENG, J. (2009): YANG, Y., WEI, H., QIN, W. y ZHENG, J. (2009): Expression and characterization of aspartic protease gene in eggs and larvae stage of Ancylostoma caninum . Parasitol. Res . 104: 1327-1333. YANMING, S., RUOFENG, Y., MULEKE, C. YANMING, S., RUOFENG, Y., MULEKE, C.YANMING, S., RUOFENG, Y., MULEKE, C. YANMING, S., RUOFENG, Y., MULEKE, C. I., GUANGWEI, Z., L I., GUANGWEI, Z., LI., GUANGWEI, Z., L I., GUANGWEI, Z., LIXIN, X. IXIN, X.IXIN, X. IXIN, X. y y y y XIANGRUI, L. (2007): XIANGRUI, L. (2007):XIANGRUI, L. (2007): XIANGRUI, L. 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M., DUFFY, T., SCHIJMAN, A. G. y IJMAN, A. G. y IJMAN, A. G. y IJMAN, A. G. y BASOMBRÍO, M. A. (2008): BASOMBRÍO, M. A. (2008):BASOMBRÍO, M. A. (2008): BASOMBRÍO, M. A. (2008): Impairment of infectivity and immunoprotective effect of a LYT1 null mutant of Trypanosoma cruzi . Infect. Immun . 76: 443-451. ZAJAC ZAJACZAJAC ZAJAC, ,, , A. M. (2006 A. M. (2006 A. M. (2006 A. M. (2006): ):): ): Gastrointestinal nematodes of small ruminants: life cycle, anthelmintics, and diagnosis . Vet. Clin. North. Am. Food. Anim. Pract . 22: 529-541. ZHAN, B., HOTEZ, P. ZHAN, B., HOTEZ, P. ZHAN, B., HOTEZ, P. ZHAN, B., HOTEZ, P. J., WANG, Y. J., WANG, Y. J., WANG, Y. J., WANG, Y. y yy y HAWDON, J. M. (2002 HAWDON, J. M. (2002 HAWDON, J. M. (2002 HAWDON, J. M. (2002): ):): ): A developmentally regulated metalloprotease secreted by host-stimulated Ancylostoma caninum thirdstage infective larvae is a member of the astacin family of proteases. Mol. Biochem. Parasitol. 120: 291-296. ZHOU, D. M., YI, X. 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FIGURAS 11.1. FIGURAS11.1. FIGURAS 11.1. FIGURAS Fig. 58. Fig. 58.Fig. 58. Fig. 58. Secuencias alineadas de los diferentes alelos encontrados en el gen GCP-7. Número de secuencias=7; número de posiciones alineadas=670; posiciones homólogas= (.); posiciones ausentes= (-) M-A7 TGC GGA TAT GGG TAT GTT TCA TCT TGA ATA TGT GTT TAG ACG CTT GCC [ 48] M-B7 ... ... ..C ... ..G ... ... ... A.G C.. ..C T.. C.. G.. .C. ... [ 48] M-C7 ... ... ..C ... ... ... ... ... C.G ... ... ... ... ... ... ... [ 48] M-D7 ... ... ..C ... ..G ... ... ... C.G C.. ..C T.. C.. G.. .C. ... [ 48] M-E7 ... ... ..C ... ..G ... ... ... ..G C.. ..C T.. C.. G.. .G. A.. [ 48] M-F7 ... ... ... ... ..G ... ... ... A.G C.. ..C T.C C.. G.. .C. ... [ 48] M-G7 ... ... ..C ... ..G ... .GC ... A.. .-. A.. T.. ... ..C .C. ..T [ 48] M-A7 AAT TTA CCT --- CCT TTA CGG TAG -TC TAG AAA GCC TCA TGA GCA TAG [ 96] M-B7 ... ... ... --- .G. ... T.. ... GC. ... ... .TT .A. ... .T. ... [ 96] M-C7 ... ... ... TTA ... ... ... ... -.. ... ... ..T ... ... ... ... [ 96] M-D7 ... ... ... --- .G. ... T.. ... GC. ... ... .TT ... ... .T. ... [ 96] M-E7 ... ... ... --- .G. ... T.. ... GC. ... ... .TT .T. ... .T. ... [ 96] M-F7 ... ... ... --- .G. ... T.. ... GC. ... ... .TT .A. ... .T. ... [ 96] M-G7 ..A ... ... --- .T. ... T.. ... -.T ... ... TTA A.. ... .T. ... [ 96] M-A7 CAG TAG CTG TCA CAA GGA AAA AAT GGG TTA GGA TTT CTG CTA -AT --- [144] M-B7 ... ... ... ... T.. A.G ... .-. ... ... ... ... ... ..G T.. --- [144] M-C7 ... ... ... ... ... A.. ... ... --- --- --- --- ... T.G T.. --- [144] M-D7 ... ... ... ... T.. A.G ... C.. ... ... ... ... ... ..G T.. --- [144] M-E7 ... ... --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- [144] M-F7 ... ... ... C.. T.. A.G ... ... ... ... ... ... ... ..G T.. --- [144] M-G7 ... ..A ... A.. ... AA. ..G GG. --- -.G ..G ... G.. T.G T.. TTA [144] M-A7 -AA GTG AGA CTT TCG ACA AAT TGA GAC CTG TAC AAA TAC AAA CTA T-G [192] M-B7 -.. ... .T. ... C.. ..C .-- --- --- --- --. ... ... ... ... .T. [192] M-C7 -G. .G. T.G ..C C.. G.. ... ..C ... ... C.. ..T ... GT. ... .T. [192] M-D7 -.. ... .T. ... C.. ..C ... ... ... ... C.. ... ... ... ... .T. [192] M-E7 --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- [192] M-F7 -.. ... .T. ... C.. ..C .-- --- --- --- --. ... ... ... ... .T. [192] M-G7 G.. .AA G.. ... ... T.. ... A.C ... .C. C.. ..G ... GT. ... CT. [192] M-A7 TAT AAC ATA ATA --- GGT TAG GCG GTC TAC TAC TTA CTG CTT GTC AAT [240] M-B7 .G. ..T ... ... ATA .A. ... ..T ... ... ... ... ... ... ... ... [240] M-C7 ... GCT ... .C. --- .A. .TA T.T ... C.. ... ... ... ... ... ... [240] M-D7 ... G.T ... ... ATA .A. ... ..T ... ... ... ... ... ... ... ... [240] M-E7 --- --- --- --- --- --- --- ..T ... ... ... ... ... ..C ... ... [240] M-F7 .G. ..T ... ... ATA .A. ... ..T ... ... ... ... ... ... ... ... [240] M-G7 ... .-- --- --- --- --. ..A ..T ..A ... ... ... .G. ... C.. ... [240] M-A7 ATA --- --- --- --- --- CAA GTT CT- --- --- --- --- --- --- --- [288] M-B7 ... --- --- --- --- --- ... AC. ..- --- --- --- --- --- --- --- [288] M-C7 ... --- --- --- --- --- ... A.. ..- --- --- --- --- --- --- --- [288] M-D7 ... --- --- --- --- --- ... AC. ..- --- --- --- --- --- --- --- [288] M-E7 ..T --- --- --- --- --- ... AC. ..- --- --- --- --- --- --- --- [288] M-F7 ... --- --- --- --- --- ... AC. ..- --- --- --- --- --- --- --- [288] M-G7 ... ACT CTC TAA CTC TAT .G. AC. ..A TAA CTC TCT ATA ACT CTA ATA [288] M-A7 --- --C TAT CGA AAT CTC TCA CTA AAA TCA TAG GGT TAG GG- --- --- [336] M-B7 --- --. ... ... .T. G.. ... ... ... .A. C.. ... ... ..- --- --- [336] M-C7 --- --. ... ... ... ... ... ... ... ... C.. ... ... ..- --- --- [336] M-D7 --- --. ... ... ... G.. ... ... ... .A. C.. ... A.. ..G TTT TTA [336] M-E7 --- --T ... .A. ... G.. ... ... ... .A. C.. ... A.A ..G TTT TCG [336] M-F7 --- --. C.. ... .T. G.. ... ... ... .A. C.. ... ... ..- --- --- [336] M-G7 ACT CT. ... ... ... A.. ..T T.. ... A.T C.T TA. ... ..- TTT TTG [336] 11. Anexos 242 M-A7 -AA CCT AGA CAG TTT GGG ATA TAT GTA CAT GTA GGT GCA CTG AGC GCA [384] M-B7 -.. ... ... .G. ... ... ... A.- --- ... ... ... ... ... ... ... [384] M-C7 -G. ... ... ... ... ..A ... ..- --- ... ... ... ... ... ... ... [384] M-D7 G.. .T. ... ... ..- ... G.. ..- --- T.. ... ... ... ... ... ... [384] M-E7 G.. .T. ... ... C.. ... G.. ..- --- T.. ... ... ... ... ... ... [384] M-F7 -.G ... ... .G. ... ... ... A.- --- ... ... ... ... ... ... ... [384] M-G7 G.. .A. ... ..A A.. ... ... ..- --- ... ... ... .T. ... ... ... [384] M-A7 TGT AGT CTT GAT TTG CTT TTA GAT GCG ATG GAG GAT ACA ATG CTC GAG [432] M-B7 ..G ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [432] M-C7 ..G ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [432] M-D7 ..A ... ... ... ... G.. ... ... ... ... ... ... ... ... ... .T. [432] M-E7 ..A ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [432] M-F7 ..G ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [432] M-G7 ..G ... .C. .G. ... ... ... ... .T. ... ... ... ... ... ... ... [432] M-A7 CGT GGA AAT GGG CAA CAA TTG CCG GTG TAG TCA CGG GTG GAG CAT ATA [480] M-B7 ... ... ... ... ... .C. ... ... ... .G. ... ... .A. ... ... ... [480] M-C7 .A. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .A. ... ... ... [480] M-D7 .A. ... ... ... ... .G. ... ... ... .G. ... ... .A. ... ..A ... [480] M-E7 .A. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .A. ... ... ... [480] M-F7 ... ... ... ... ... .C. ... ... ... .G. ... ... .A. ... ... ... [480] M-G7 .A. ... ... ... ... ... ... ... ... .G. .T. ... .A. ... .G. ... [480] M-A7 AGG AGA AGG TAA GTA AAA GGA AAG TTA AAC AAC GTT AGA ACC AGA CAA [528] M-B7 ... ... ... ... ... G.. ..G ..A .C. ... .TT ... ... ..T ... ... [528] M-C7 ... ... ... ... T.. G.. ..G ..A .C. .CT ... ... ... ... ... ... [528] M-D7 ... ... ... ... ... G.. ..G ..A .C. .CT ... ..C ... ... ... ... [528] M-E7 ... .A. ... ... ... ... ... ... ... ..T ... ..C ... ... ... T.. [528] M-F7 ... ... ... ... ... ... ..G ..A .C. ... .TT ... ... ..T ... ... [528] M-G7 ... ... ... ... ... G.. ..G ..A .C. .CT ... ... ... ... ... ... [528] M-A7 CC- --- --- --A C-- GGT TTT A-- --- --- --- --- --- --- --- --- [576] M-B7 ..- --- --- --. .TG A.. ..C .GG GCT ATT TTT CTC GTG GAA AGG CCT [576] M-C7 ..- --- --- --. .TA A.. ..C .GG GCT ATT TTT CT- --- --- --- --- [576] M-D7 ..- --- --- --. .TG A.. ..C .GG GCT ATT TTT CTC GTG AAA AGG CCT [576] M-E7 ..T TGT TGA GA. .AC A.. ..G .GG GCT ATT TCT CTC GTA GAA ATG --T [576] M-F7 ..- --- --- --. .TG A.. G.. .GG GCT ATT TTT TTGTG AAA ACG CTT [576] M-G7 ..- --- --- --. .TG A.. ..C .GG GCT ATT TTT CTG GTG GAA AGG CCT [576] M-A7 --T GTA AAA AGG ACT CTT TTA GGG TAA CTG TAA ACC TTA CGT TTT CCC [624] M-B7 TA. ..G G.. -.A .GC ... .C. ... ... ... ... ... ... ... ... ... [624] M-C7 --C ..G ... ... .G. ... AC. ... ... ... ... ... ... ... ... ... [624] M-D7 TA. ..G ... ... .G. ... C.. ... ... ... ... ... ... ... ... ... [624] M-E7 AA. T.G ... ..A .GC ... .C. ... ... ... ... ... ... ... ... ... [624] M-F7 TA. ..G ... ..A .AC T.. .C. ... ... ... ... ... ... ... ... ... [624] M-G7 TA. ..G .G. ..A .GC ... .C. ... ... ... ... ... ... ... ... ... [624] M-A7 TCA ATG TGG AGC CCA CAA AGG GAA GGC ATT CAA CAA TTG TCC GTC A [670] M-B7 A.. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... C.. ... ... . [670] M-C7 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... . [670] M-D7 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... . [670] M-E7 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... C.. ... ... . [670] M-F7 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... C.. ... ... . [670] M-G7 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... C.. ... ... . [670] 11. Anexos 243 Fig. 59 Fig. 59Fig. 59 Fig. 59. .. . Secuencias alineadas de los diferentes alelos encontrados en el gen AC-1. Número de secuencias=7; número de posiciones alineadas=325; posiciones homólogas= (.); posiciones ausentes=(-). M-A1 TGA CGT GCT GCA GGC CAC AGT GCG GTG ACG GGT AAA ATT TCG TAG TA [ 48] M-B1 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..C ... ... .. [ 48] M-C1 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... T.C ... ... .G [ 48] M-D1 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... T.C ... ... .G. [ 48] M-E1 ... ... .T. ... ... ... ... ... ... ... ... ... T.C ... ... .G. [ 48] M-F1 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... T.C ... ... CG. [ 48] M-G1 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [ 48] M-A1 TGA CTC TCA GAG CAC GGA AAT AAG TAT ATA GCC CCA TTT GTC TTA ATA [ 96] M-B1 ..G ... ... ... ... ..G ... ... ... ... ... ... ... AA. .A. ... [ 96] M-C1 ... A.. ... ... ... ..C ... ... ... ..T ... T.. ... AA. .G. ... [ 96] M-D1 ... A.. ... ... ... ..C ... ... ... ..T ... T.. ... AA. .G. ... [ 96] M-E1 ... A.. ... ... ... ..C ... ... ... ..T ... T.. ... AA. .G. ... [ 96] M-F1 ... ... ... ... ... ..C ... ... ... ..C ... T.. A.. AA. ... ... [ 96] M-G1 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [ 96] M-A1 ATT CAT TGT TTC AGG TGT GAA GGA GGA TGG CCT ATC GAA GCT TGG AAA [144] M-B1 ... ..C ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [144] M-C1 ... ..C ... ..A ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [144] M-D1 ... ..C ... ..A ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [144] M-E1 ... ..C ... ..A ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [144] M-F1 G.. T.C ... ..A ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [144] M-G1 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [144] M-A1 TAC TTC ATA TAT GAC GGC GTT GTT TCT GGA GGA GAA TAC CTC ACT AAA [192] M-B1 ... ... ... ... ... ..A ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [192] M-C1 ... ... ... ... ... ..A ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [192] M-D1 ... ... ... ... ... ..A ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [192] M-E1 ... ... ... ... ... ..A ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [192] M-F1 ... ... ... ... ... ..A ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [192] M-G1 ... ... ... ... ... ..A ... ... ..C ... ... ... ... ... ... ... [192] M-A1 GTG AGA TAA CTA TTC CTA ATA TTA TTT GCC GAA ATG TTC TAG CAG TCT [240] M-B1 ... ... ... ... ... ... ... ... A.. ... .T. ... ... ..A T.. A.. [240] M-C1 ... ... ... ... ... ... ... ... A.. ... .T. ... ... ... T.. A.. [240] M-D1 ... ... ... ... ... ... ... ... A.. ... .T. ... ... ... T.. A.. [240] M-E1 ... ... ... ... ... ... ... ... A.. ... .T. ... ... ... T.. A.. [240] M-F1 ... ... ... ..G ... ... ... ... A.. ... ... ... ... ... T.. ... [240] M-G1 ... ... ... ... ... ... ... ... A.. ... .T. ... ... ... T.. A.A [240] M-A1 TGA CAT TAG GAT GTA TGC CGC CCT TAT CCA ATT CAC CCA TGT GGA CAT [288] M-B1 ... ... ... .G. ... ... ... ... ... ... ..C ..T ... ... ... ... [288] M-C1 ... ... ... .G. ... ... ... ... ... ... ... ..T ... ... ... ... [288] M-D1 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..T ... ... ... ... [288] M-E1 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..T ... ... ... ... [288] M-F1 ... ... ... .G. ... ... ... ... ... ... ... ..T ... ... ... ... [288] M-G1 ... ... ... .G. ... ... ... ... ... ... ... ..T ... ... ... ... [288] M-A1 CAC GGA AAC GAC ACC TAC TAC GGG GAA TGC CGT GGA A [325] M-B1 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... . [325] M-C1 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... . [325] M-D1 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... . [325] M-E1 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... . [325] M-F1 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... . [325] M-G1 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... . [325] 11. Anexos 244 Fig. 60. Fig. 60.Fig. 60. Fig. 60. Secuencias alineadas de los diferentes alelos encontrados en el gen AC-3. Número de secuencias=8; número de posiciones alineadas=308; posiciones homólogas= (.); posiciones ausentes=(-). M-A3 ATG CGG TTT TGG GTG AGA TTT CAT GGC TTG ATT TCA CAT AAC ATT AGC [ 48] M-B3 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..A .C. ... ... ... ... ... [ 48] M-C3 ... ... ... ... ... ... ... ... .AA .CA .C. ... ..A ... ... ... [ 48] M-D3 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..A .C. ... ... ... ... ... [ 48] M-E3 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..A .C. ... ... ... ... ... [ 48] M-F3 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..A .C. ... ... ... ... ... [ 48] M-G3 ... ... ... C.. ... ... ... ... ... ... .C. ... ..A ... ... ... [ 48] M-H3 ... ... ... ... ... ... ... ... ..T ..A .C. .T. ..- --- --- --- [ 48] M-A3 AAT GAC GAG ACA CTC TTT ATC TAT AAG CAT CAT TTC TTG GTT TAG ATG [ 96] M-B3 .C. ... ... ... .AT ... ... ..C ... T.. ... ... ... ... ... ... [ 96] M-C3 .C. ... T.T ... ..T C.. ... ... ..A T.. T.C ..G ... ... ... ... [ 96] M-D3 .C. ... ... ... .AT ... ... ..C ... T.. ... ... ... ... ... ... [ 96] M-E3 .C. ... ... ... .AT ... ... ..C ... T.. ... ... ... ... ... ... [ 96] M-F3 .C. ... ... ... .AT ... ... ..C ... T.. ... ... ... ... ... ... [ 96] M-G3 .C. ... T.. ... ..T .C. .C. ... ... T.. ... ... ... ... ... ... [ 96] M-H3 --- --- -.. ... .CT ... ... ... G.- T.. ... ... ... ... ... ... [ 96] M-A3 TGA CGG AGG CTG GTC TAT CAA AGC GTG GGA ATA CTT CAC ATA CGC AGG [144] M-B3 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [144] M-C3 ... ... ... ... ... ... ... ... A.. ... G.. ... ... ... ... ... [144] M-D3 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [144] M-E3 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [144] M-F3 ... ... ... T.. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [144] M-G3 ... ... ... ... ... ... ... ... A.. ... ... ... ... ... ... ... [144] M-H3 ... ... ... ... ... ... ... ... A.. ... ... ... ... ... ... ... [144] M-A3 ACT CGT TTC TGG AGG AGA GTA CCG TAG TAA AGT GAG ATC -TT ACG ACT [192] M-B3 ... T.. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... G.. G.. ..- [192] M-C3 ... T.. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... G.. ... ... [192] M-D3 ... T.. ... ... ... ... ... ... ... ... .A. ... ... G.. G.. ..- [192] M-E3 ... T.. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... G.. G.. ..- [192] M-F3 ... T.. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..G G.. ... ... [192] M-G3 ... T.. ... ... ... ... A.. ... ... ... ... ... ..A G.. ... .A. [192] M-H3 ... T.. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... T.. ... ... [192] M-A3 TCA GTA ATG AAT AAT CGT GTC TTA CTG GTT CAA CAT TTT TGA CAA TAG [240] M-B3 --. A.T ... ... ... ... ... ..G TCA .C. ... ... ... C.. ... ... [240] M-C3 ... ... ... ... ... ..C ..A ... ... .C. ... ... ... ... ... ... [240] M-D3 --. A.T ... ... ... ... ... ..G TCA .C. ... ... ... C.. ... ... [240] M-E3 --. A.T ... ... ... ... ... ..G TCA .C. ... ... ... C.. ... ... [240] M-F3 ... A.. ... ... ... .A. ... ..G ... .C. ... ... ... C.. ... ... [240] M-G3 ... .C. ... ... ... ... ... ... ... .C. ... ... ... ... ... ... [240] M-H3 ... A.. ... ... ... ... ... ..G ..A .C. ... .G. .C. .C. ... ... [240] M-A3 AGG TGT TGC CGT CCT TAT CCG ATC CAT CCT TGT GGA CAT CAC GGA AAT [288] M-B3 ... ..C ... ... ... ..C ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [288] M-C3 ... ..C ... ... ... ..C ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [288] M-D3 ... ..C ... ... ... ..C ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [288] M-E3 ... ..C ... ... ... ..C ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [288] M-F3 ... ..C ... ... ... ..C ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [288] M-G3 ... ..C ... ... ... ..C ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [288] M-H3 ... ..C ... ... ... ..C ... .A. ... ... ... ... ... ... ... ... [288] 11. Anexos 245 M-A3 GAT ACC TAC TAC GGA GAA TG [308] M-B3 ... ... ... ... ... ... .. [308] M-C3 ... ... ... ... ... ... .. [308] M-D3 ... ... ... ... ... ... .. [308] M-E3 ... ... A.. ... ... T.. .. [308] M-F3 ... ... ... ... ... ... .. [308] M-G3 ... ... ... ... ... ... .. [308] M-H3 ... ... ... ... ... ... .. [308] 11. Anexos 246 Fig. 61. Fig. 61.Fig. 61. Fig. 61. Secuencias alineadas de los diferentes alelos encontrados en el gen AC-4. Número de secuencias=6; número de posiciones alineadas=312; posiciones homólogas= (.); posiciones ausentes=(-). M-A4 CCA CAG TGT GGT TTT GGG TAA GAT CTT GAG ATT ACG ACT CCC GAA ACC [ 48] M-B4 ... ... ... ... ... ... ... ..G ... ... ... ... ... ... ... ..T [ 48] M-C4 ... ... ..- ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [ 48] M-D4 ... ... ... ... ... ... ... ..G ... ... ... ... ... ... ... ..T [ 48] M-E4 ... ... ... ... ... ... ... ..G ... ... ... ... ... ... ... ... [ 48] M-F4 ... ... ... ... ... ... A.. ..G ... ... ... ... ... ... ... ..T [ 48] M-A4 ATT CCC AAC TAA ATA GTC TAC TGA TTA AGG TGC GGA GGA GGC TGG TCT [ 96] M-B4 ... ... ... ... ... ... .G. ... ... ... ... ... ... ... ... ... [ 96] M-C4 ... ... ... ... T.. .G. .G. ... ... ... ... ... ... ... ... ... [ 96] M-D4 ... ... ... ... ... ... .G. ... ... ... ... ... ... ... ... ... [ 96] M-E4 ... ... ... ... ... ... .G. ... ... ... ... ... ... ... ... ... [ 96] M-F4 ... ... ... ... ... ... .G. ... ... ... ... ... ... ... ... ... [ 96] M-A4 ATT AGA GCT TGG GAG TAC TTC GTT TAC GAA GGA GTT GTT TCT GGC GGA [144] M-B4 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..A ... [144] M-C4 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [144] M-D4 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..A ... [144] M-E4 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [144] M-F4 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..A ... [144] M-A4 GAA TAT CTC TCG AAA GTA AAT AGT TAC CAG TTC CCA ATA TAA CTG TCT [192] M-B4 ... ... ... A.A ... ... ... ... ... ..A ... ... ... ... ... ... [192] M-C4 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [192] M-D4 ... ... ... A.A ... ... ... ..C ... ..A ... ... ... ... ... ... [192] M-E4 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [192] M-F4 ... ... ... A.A ... ... ... ... ... ..A ... ... ... ... ... ... [192] M-A4 AGA TAT TTA CAC ATG TGG TTT TGA CAC CAG GGT GTC TGC CGT CCC TAT [240] M-B4 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [240] M-C4 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [240] M-D4 ... ... ... ... ... A.. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [240] M-E4 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [240] M-F4 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... [240] M-A4 CCG ATT CAT CCA TGT GGA CGC CAT GAA ATC GAT ACC TAC TAT GGA GAA [288] M-B4 ..A ... ... ... ... ... .A. ... .G. .A. ... ... ... ... ... ... [288] M-C4 ... ... ... ... ... ... ... ... .G. .A. ... ... ... ... ... ... [288] M-D4 ..A ... ... ... ... ... .A. ... .G. .A. ... ... ... ... ... ... [288] M-E4 ... ... ... ... ... ... ... ... .G. .A. ... ... ... ... ... ... [288] M-F4 ..A ... ... ... ... ... .A. ... .G. .A. ... ... ... ... ... ... [288] M-A4 TGC TCT --- --- --- --- --- --- [312] M-B4 ... C.. --- --- --- --- --- --- [312] M-C4 ... ... --- --- --- --- --- --- [312] M-D4 ... C.. --- --- --- --- --- --- [312] M-E4 ... ... --- --- --- --- --- --- [312] M-F4 ... C.. --- --- --- --- --- --- [312] 11. Anexos 247 Fig. 62. Fig. 62. Fig. 62. Fig. 62. Alineamiento de la secuencia de aminoácidos de los alelos del gen GCP-7 deducida a partir de BlastX. 1 10 20 M MM M- -- -A AA A 7 77 7 -- -- C D G G Y N A R A W K W A T I A G V M MM M- -- -B BB B 7 77 7 -- -- C D G G Y N A R A W K W A T I A G V M MM M- -- -C CC C 7 77 7 -- -- C D G G Y N A R A W K W A T I A G V M MM M- -- -D DD D 7 77 7 G -- C D G G Y N A R A W K W A T I A G V M MM M- -- -E EE E 7 77 7 -- -- C D G G Y N A R A W K W A T I A G V M MM M- -- -F FF F 7 77 7 -- -- C D G G Y N A R A W K W A T I A G V M MM M- -- -G GG G 7 77 7 -- -- C D G G Y N A R A W K W A T I A G V 21 30 40 M MM M- -- -A AA A 7 77 7 V G N T G G A Y K E K -- G N C K P Y V F M MM M- -- -B BB B 7 77 7 V -- -- T G G A Y K E K -- G N C K P Y V F M MM M- -- -C CC C 7 77 7 V -- -- T G G A Y K E K -- G N C K P Y V F M MM M- -- -D DD D 7 77 7 V -- -- T G G A N K E K -- G N C K P Y V F M MM M- -- -E EE E 7 77 7 V -- -- T G G A Y K E -- -- G N C K P Y V F M MM M- -- -F FF F 7 77 7 V -- -- T G G A Y K E K V G N C K P Y V F M MM M- -- -G GG G 7 77 7 V -- -- T G G A Y K E K -- G N C K P Y V F 41 50 56 M MM M- -- -A AA A 7 77 7 P Q C G A H K G K A F N N C P S M MM M- -- -B BB B 7 77 7 P Q C G A H K G K A F N N C P S M MM M- -- -C CC C 7 77 7 P Q C G A H K G K A F N N C P S M MM M- -- -D DD D 7 77 7 P Q C G A H K G K A F N N C P S M MM M- -- -E EE E 7 77 7 P Q C G A H K G K A F N N C P S M MM M- -- -F FF F 7 77 7 P Q C G A H K G K A F N N C P S M MM M- -- -G GG G 7 77 7 P Q C G A H K G K A F N N C P S 11. Anexos 254 Tabla 16. Tabla 16. Tabla 16. Tabla 16. Frecuencias de patrones SSCP del gen GCP-7 en los distintos grupos experimentales de ovinos. ( N ): número vermes machos de H. contortus . OV (NA/NA) OV (SP/NA) OV (Ø/NA) OV (SP/SP) OV (NA/SP) OV (Ø/SP) M-A7A7 0,6400 0,5400 0,4200 0,4900 0,2400 0,3700 M-B7B7 0,0100 0,0300 0,0100 0,0600 0,0400 0,0300 M-C7C7 0,0300 0,0700 0,0600 0,0150 0,0500 0,0900 M-D7D7 0,0000 0,0000 0,0000 0,1100 0,0500 0,1100 M-E7E7 0,0000 0,0000 0,0000 0,0150 0,0000 0,0000 M-F7F7 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0100 M-G7G7 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0400 0,0100 M-A7B7 0,1300 0,1200 0,1500 0,0900 0,1200 0,1500 M-A7C7 0,1600 0,2300 0,3300 0,0600 0,1600 0,0100 M-A7D7 0,0000 0,0000 0,0000 0,1100 0,0800 0,1300 M-A7E7 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 M-A7F7 0,0000 0,0000 0,0000 0,0150 0,0000 0,0000 M-A7G7 0,0000 0,0000 0,0000 0,0150 0,1000 0,0100 M-B7C7 0,0100 0,0000 0,0200 0,0150 0,0100 0,0100 M-B7D7 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0200 0,0000 M-B7F7 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0100 M-B7G7 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0500 0,0000 M-C7D7 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0100 0,0000 M-C7F7 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 M-D7E7 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 M-D7G7 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 M-E7G7 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 N = 82 N = 68 N = 85 N = 65 N = 74 N = 54 Tabla 17. Tabla 17. Tabla 17. Tabla 17. Frecuencias alélicas del gen GCP-7 en los distintos grupos experimentales de ovinos. ( N ): número de alelos analizados en cada grupo. OV (NA/NA) OV (SP/NA) OV (Ø/NA) OV (SP/SP) OV (NA/SP) OV (Ø/SP) M-A7 0,7900 0,7200 0,6600 0,6400 0,4700 0,5400 M-B7 0,0800 0,0900 0,1000 0,1100 0,1200 0,1200 M-C7 0,1200 0,1900 0,2300 0,0500 0,1700 0,1000 M-D7 0,0000 0,0000 0,0000 0,1600 0,1300 0,1700 M-E7 0,0000 0,0000 0,0000 0,0150 0,0000 0,0100 M-F7 0,0000 0,0000 0,0000 0,0070 0,0060 0,0300 M-G7 0,0000 0,0000 0,0000 0,0070 0,0800 0,0300 N = 164 N = 136 N = 170 N = 130 N = 148 N = 108 11. Anexos 255 Tabla 18. Tabla 18. Tabla 18. Tabla 18. Frecuencias de patrones SSCP del gen GCP-7 en los distintos grupos experimentales de caprinos. ( N ): número vermes machos de H. contortus . CA (NA/NA) CA (SP/NA) CA (Ø/NA) CA (SP/SP) CA NA/SP) CA (Ø/SP) M-A7A7 0,5300 0,5500 0,6400 0,3800 0,3000 0,2600 M-B7B7 0,0000 0,0000 0,0000 0,0100 0,0400 0,0400 M-C7C7 0,0300 0,0100 0,0700 0,0100 0,0700 0,0500 M-D7D7 0,0000 0,0000 0,0000 0,0300 0,0600 0,0900 M-E7E7 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0100 M-F7F7 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0100 M-G7G7 0,0000 0,0000 0,0000 0,0400 0,0200 0,0100 M-A7B7 0,1300 0,1100 0,0700 0,0800 0,1400 0,1200 M-A7C7 0,3100 0,2900 0,1900 0,0500 0,0700 0,0600 M-A7D7 0,0000 0,0000 0,0000 0,1300 0,1100 0,1600 M-A7E7 0,0000 0,0000 0,0000 0,0100 0,0200 0,0000 M-A7F7 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0300 0,0400 M-A7G7 0,0000 0,0000 0,0000 0,1000 0,0400 0,0100 M-B7C7 0,0000 0,0000 0,0200 0,0400 0,0200 0,0100 M-B7D7 0,0000 0,0000 0,0000 0,0300 0,0200 0,0000 M-B7F7 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 M-B7G7 0,0000 0,0000 0,0000 0,0300 0,0200 0,0000 M-C7D7 0,0000 0,0000 0,0000 0,0300 0,0200 0,0500 M-C7F7 0,0000 0,0000 0,0000 0,0100 0,0000 0,0100 M-D7E7 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0200 0,0000 M-D7G7 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0200 0,0100 M-E7G7 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0100 N = 68 N = 69 N = 42 N = 71 N = 69 N = 75 Tabla 19. Tabla 19. Tabla 19. Tabla 19. Frecuencias alélicas del gen GCP-7 en los distintos grupos experimentales de caprinos. ( N ): número de alelos analizados en cada grupo. CA (NA/NA) CA (SP/NA) CA (Ø/NA) CA (SP/SP) CA (NA/SP) CA (Ø/SP) M-A7 0,7500 0,7500 0,7700 0,5700 0,5100 0,4600 M-B7 0,0600 0,0700 0,0400 0,1000 0,1400 0,1100 M-C7 0,1800 0,1700 0,1600 0,0800 0,1200 0,1000 M-D7 0,0000 0,0000 0,0000 0,1200 0,1400 0,2100 M-E7 0,0000 0,0000 0,0000 0,0070 0,0140 0,0200 M-F7 0,0000 0,0000 0,0000 0,0070 0,0140 0,0400 M-G7 0,0000 0,0000 0,0000 0,1000 0,0500 0,0300 N = 136 N = 138 N = 84 N = 142 N = 138 N = 150 11. Anexos 256 Tabla 20. Tabla 20.Tabla 20. Tabla 20. Frecuencias de patrones SSCP del gen AC-1 en los distintos grupos experimentales de ovinos. ( N ): número vermes machos de H. contortus . OV (NA/NA) OV (SP/NA) OV (Ø/NA) OV (SP/SP) OV (NA/SP) OV (Ø/SP) M-A1A1 0,3300 0,3600 0,5300 0,4300 0,4100 0,4400 M-B1B1 0,1600 0,2800 0,1300 0,0000 0,0100 0,0200 M-C1C1 0,0000 0,0100 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 M-D1D1 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0200 M-E1E1 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0200 0,0000 M-F1F1 0,0000 0,0000 0,0000 0,0100 0,0000 0,0200 M-A1B1 0,4900 0,3000 0,3100 0,0380 0,0600 0,0300 M-A1C1 0,0000 0,0000 0,0300 0,0300 0,0500 0,0500 M-A1D1 0,0000 0,0000 0,0000 0,2400 0,0900 0,0600 M-A1E1 0,0000 0,0000 0,0000 0,0100 0,0400 0,0800 M-A1F1 0,0000 0,0100 0,0000 0,1600 0,2500 0,1600 M-B1C1 0,0130 0,0300 0,0000 0,0100 0,0000 0,0000 M-B1D1 0,0000 0,0000 0,0000 0,0100 0,0100 0,0200 M-B1E1 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0100 0,0300 M-B1F1 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0100 0,0200 M-C1D1 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0200 M-C1F1 0,0000 0,0000 0,0000 0,0380 0,0000 0,0000 M-D1E1 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0100 0,0200 M-D1F1 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0200 M-E1F1 0,0000 0,0000 0,0000 0,0100 0,0000 0,0000 M-E1G1 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0200 N=75 N=72 N=95 N=80 N=76 N=63 Tabla 21. Tabla 21. Tabla 21. Tabla 21. Frecuencias alélicas del gen AC-1 en los distintos grupos experimentales de ovinos. ( N ): número de alelos analizados en cada grupo. OV (NA/NA) OV (SP/NA) OV (Ø/NA) OV (SP/SP) OV (NA/SP) OV (Ø/SP) M-A1 0,5800 0,5200 0,7000 0,6600 0,6500 0,6300 M-B1 0,4100 0,4400 0,2800 0,0400 0,0700 0,0600 M-C1 0,0060 0,0300 0,0160 0,0400 0,0300 0,0300 M-D1 0,0000 0,0000 0,0000 0,1300 0,0600 0,0800 M-E1 0,0000 0,0000 0,0000 0,0100 0,0600 0,0700 M-F1 0,0000 0,0070 0,0000 0,1200 0,1300 0,1100 M-G1 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0080 N=150 N=144 N=190 N=160 N=152 N=126 11. Anexos 257 Tabla 22. Tabla 22. Tabla 22. Tabla 22. Frecuencias de patrones SSCP del gen AC-1 en los distintos grupos experimentales de caprinos. ( N ): número vermes machos de H. contortus . CA (NA/NA) CA (SP/NA) CA (Ø/NA) CA (SP/SP) CA (NA/SP) CA (Ø/SP) M-A1A1 0,4500 0,4100 0,4500 0,3900 0,5000 0,3500 M-B1B1 0,1700 0,1800 0,2200 0,0000 0,0000 0,0000 M-C1C1 0,0000 0,0200 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 M-D1D1 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 M-E1E1 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0100 0,0100 M-F1F1 0,0000 0,0000 0,0000 0,0100 0,0000 0,0500 M-A1B1 0,3300 0,3600 0,2700 0,0900 0,0500 0,0500 M-A1C1 0,0500 0,0000 0,0340 0,0300 0,0700 0,0400 M-A1D1 0,0000 0,0000 0,0000 0,1300 0,1300 0,1200 M-A1E1 0,0000 0,0000 0,0000 0,1300 0,0700 0,1600 M-A1F1 0,0000 0,0000 0,0000 0,1800 0,1000 0,1100 M-B1C1 0,0000 0,0300 0,0170 0,0000 0,0000 0,0000 M-B1D1 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0100 M-B1E1 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0100 M-B1F1 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0100 0,0100 M-C1D1 0,0000 0,0000 0,0000 0,0100 0,0100 0,0000 M-C1F1 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 M-D1E1 0,0000 0,0000 0,0000 0,0100 0,0100 0,0100 M-D1F1 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0100 0,0100 M-E1F1 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0100 0,0400 M-E1G1 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 N=82 N=61 N=58 N=75 N=72 N=74 Tabla 23. Tabla 23. Tabla 23. Tabla 23. Frecuencias alélicas del gen AC-1 en los distintos grupos experimentales de caprinos. ( N ): número de alelos analizados en cada grupo. CA (NA/NA) CA (SP/NA) CA (Ø/NA) CA (SP/SP) CA (NA/SP) CA (Ø/SP) M-A1 0,6400 0,5900 0,6000 0,6700 0,7100 0,5900 M-B1 0,3300 0,3700 0,3700 0,0500 0,0300 0,0400 M-C1 0,0240 0,0300 0,0260 0,0200 0,0400 0,0200 M-D1 0,0000 0,0000 0,0000 0,0800 0,0800 0,0800 M-E1 0,0000 0,0000 0,0000 0,0700 0,0600 0,1200 M-F1 0,0000 0,0000 0,0000 0,1000 0,0700 0,1400 M-G1 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 N=164 N=122 N=116 N=150 N=144 N=150 11. Anexos 258 Tabla 24. Tabla 24.Tabla 24. Tabla 24. Frecuencias de patrones SSCP del gen AC-3 en los distintos grupos experimentales de ovinos. ( N ): número vermes machos de H. contortus . OV (NA/NA) OV (SP/NA) OV (Ø/NA) OV (SP/SP) OV (NA/SP) OV (Ø/SP) M-A3A3 0,7200 0,7700 0,5300 0,0800 0,0900 0,1300 M-B3B3 0,0500 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 M-C3C3 0,0000 0,0300 0,0900 0,0000 0,1100 0,0200 M-D3D3 0,0000 0,0300 0,0700 0,0000 0,0000 0,0000 M-E3E3 0,0500 0,0500 0,1000 0,6200 0,4700 0,5200 M-F3F3 0,0000 0,0000 0,0100 0,2600 0,1500 0,1300 M-G3G3 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 M-A3B3 0,0500 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 M-A3C3 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 M-A3D3 0,0900 0,0000 0,0400 0,0000 0,0000 0,0000 M-A3E3 0,0200 0,0800 0,0600 0,0400 0,0100 0,0400 M-A3F3 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0100 0,0000 M-B3C3 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 M-B3D3 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 M-C3D3 0,0000 0,0000 0,0100 0,0000 0,0000 0,0000 M-C3G3 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0100 0,0000 M-C3H3 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,1500 0,0000 M-D3E3 0,0000 0,0200 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 M-E3F3 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,1300 M-F3G3 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 N = 58 N =58 N =59 N = 50 N = 75 N = 44 Tabla 25. Tabla 25. Tabla 25. Tabla 25. Frecuencias alélicas del gen AC-3 en los distintos grupos experimentales de ovinos. ( N ): número de alelos analizados en cada grupo. OV (NA/NA) OV (SP/NA) OV (Ø/NA) OV (SP/SP) OV (NA/SP) OV (Ø/SP) M-A3 0,8000 0,8200 0,5800 0,1000 0,1000 0,1600 M-B3 0,0800 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 M-C3 0,0010 0,0300 0,1300 0,0000 0,1800 0,0200 M-D3 0,0400 0,0400 0,1100 0,0000 0,0000 0,0000 M-E3 0,0600 0,1000 0,1400 0,6400 0,4800 0,6100 M-F3 0,0010 0,0000 0,0400 0,2600 0,1500 0,2000 M-G3 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0060 0,0000 M-H3 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0700 0,0000 N = 116 N =116 N = 132 N = 100 N = 149 N = 88 11. Anexos 259 Tabla 26. Tabla 26. Tabla 26. Tabla 26. Frecuencias de patrones SSCP del gen AC-3 en los distintos grupos experimentales de caprinos. ( N ): número vermes machos de H. contortus . CA (NA/NA) CA (SP/NA) CA (Ø/NA) CA (SP/SP) CA (NA/SP) CA (Ø/SP) M-A3A3 0,6800 0,6700 0,6700 0,0700 0,0600 0,0600 M-B3B3 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 M-C3C3 0,0000 0,1400 0,0200 0,0500 0,0300 0,2500 M-D3D3 0,0600 0,0300 0,0200 0,0000 0,0000 0,0000 M-E3E3 0,1500 0,0200 0,1600 0,4800 0,6700 0,3600 M-F3F3 0,0000 0,0000 0,0000 0,1700 0,1500 0,1400 M-G3G3 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0400 M-A3B3 0,0200 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 M-A3C3 0,0000 0,0300 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 M-A3D3 0,0200 0,0200 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 M-A3E3 0,0600 0,0500 0,1100 0,0500 0,0200 0,0300 M-A3F3 0,0000 0,0000 0,0000 0,0300 0,0000 0,0000 M-B3C3 0,0000 0,0200 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 M-B3D3 0,0000 0,0200 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 M-C3D3 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 M-C3E3 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0100 M-C3G3 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0300 M-C3H3 0,0000 0,0000 0,0000 0,0200 0,0500 0,0000 M-D3E3 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 M-E3F3 0,0000 0,0000 0,0000 0,1200 0,0200 0,0100 M-F3G3 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0100 N = 47 N = 58 N = 43 N = 58 N = 61 N = 69 Tabla 27. Tabla 27. Tabla 27. Tabla 27. Frecuencias alélicas del gen AC-3 en los distintos grupos experimentales de caprinos. ( N ): número de alelos analizados en cada grupo. CA (NA/NA) CA (SP/NA) CA (Ø/NA) CA (SP/SP) CA (NA/SP) CA (Ø/SP) M-A3 0,7300 0,7200 0,7600 0,1100 0,0700 0,0700 M-B3 0,0100 0,0200 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 M-C3 0,0000 0,1600 0,0200 0,0700 0,0600 0,2800 M-D3 0,0700 0,0500 0,0200 0,0000 0,0000 0,0000 M-E3 0,1800 0,0400 0,2300 0,5700 0,6900 0,3900 M-F3 0,0000 0,0000 0,0000 0,2500 0,1500 0,1500 M-G3 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0100 M-H3 0,0000 0,0000 0,0000 0,0100 0,0200 0,0700 N = 94 N = 116 N = 86 N = 116 N = 122 N = 138 11. Anexos 260 Tabla 28. Tabla 28. Tabla 28. Tabla 28. Frecuencias de patrones SSCP del gen AC-4 en los distintos grupos experimentales de ovinos. ( N ): número vermes machos de H. contortus . OV (NA/NA) OV (SP/NA) OV (Ø/NA) OV (SP/SP) OV (NA/SP) OV (Ø/SP) M-A4A4 0,1875 0,1600 0,2500 0,1800 0,1800 0,3000 M-B4B4 0,1750 0,0660 0,1150 0,2900 0,3400 0,2300 M-C4C4 0,0250 0,0260 0,0200 0,0250 0,0000 0,0000 M-D4D4 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 M-F4F4 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 M-A4B4 0,3000 0,4200 0,4500 0,3900 0,4000 0,3600 M-A4C4 0,1500 0,2000 0,1150 0,0400 0,0800 0,0160 M-A4D4 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0160 M-A4E4 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 M-B4C4 0,1625 0,1300 0,0400 0,0500 0,0800 0,0160 M-B4D4 0,0000 0,0000 0,0000 0,0250 0,0000 0,0470 M-B4E4 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0160 N = 80 N = 76 N = 95 N = 80 N = 79 N = 64 Tabla 29. Tabla 29. Tabla 29. Tabla 29. Frecuencias alélicas del gen AC-4 en los distintos grupos experimentales de ovinos. ( N ): número de alelos analizados en cada grupo. OV (NA/NA) OV (SP/NA) OV (Ø/NA) OV (SP/SP) OV (NA/SP) OV (Ø/SP) M-A4 0,4100 0,4700 0,5400 0,4000 0,4000 0,4900 M-B4 0,4000 0,3400 0,3600 0,5200 0,5600 0,4500 M-C4 0,1800 0,2000 0,1000 0,0700 0,0400 0,0160 M-D4 0,0000 0,0000 0,0000 0,0130 0,0000 0,0080 M-E4 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0080 M-F4 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 N = 160 N = 152 N = 190 N = 160 N = 158 N = 128 11. Anexos 261 Tabla 30. Tabla 30. Tabla 30. Tabla 30. Frecuencias de patrones SSCP del gen AC-4 en los distintos grupos experimentales de caprinos. ( N ): número vermes machos de H. contortus . CA (NA/NA) CA (SP/NA) CA (Ø/NA) CA (SP/SP) CA (NA/SP) CA (Ø/SP) M-A4A4 0,2100 0,3000 0,2500 0,2500 0,2700 0,2500 M-B4B4 0,1300 0,1000 0,1400 0,3100 0,2700 0,1800 M-C4C4 0,0100 0,0120 0,0300 0,0130 0,0000 0,0120 M-D4D4 0,0000 0,0000 0,0000 0,0130 0,0000 0,0000 M-F4F4 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0370 M-A4B4 0,3600 0,3300 0,3600 0,3200 0,4100 0,4400 M-A4C4 0,1900 0,1700 0,1100 0,0260 0,0140 0,0250 M-A4D4 0,0000 0,0000 0,0000 0,0130 0,0000 0,0000 M-A4E4 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0120 M-B4C4 0,1000 0,0800 0,1100 0,0400 0,0280 0,0370 M-B4D4 0,0000 0,0000 0,0000 0,0130 0,0000 0,0000 M-B4E4 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 N = 86 N = 84 N = 64 N = 77 N = 70 N = 81 Tabla 31. Tabla 31. Tabla 31. Tabla 31. Frecuencias alélicas del gen AC-4 en los distintos grupos experimentales de caprinos. ( N ): número de alelos analizados en cada grupo. CA (NA/NA) CA (SP/NA) CA (Ø/NA) CA (SP/SP) CA (NA/SP) CA (Ø/SP) M-A4 0,4800 0,5600 0,4800 0,4300 0,4800 0,4900 M-B4 0,3600 0,3200 0,3700 0,5000 0,4900 0,4200 M-C4 0,1500 0,1400 0,1400 0,0400 0,0200 0,0430 M-D4 0,0000 0,0000 0,0000 0,0300 0,0000 0,0000 M-E4 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0430 M-F4 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0300 N = 172 N = 164 N = 128 N = 154 N = 140 N = 162 UNI VERS ID AD DE lAS P AlMAS DE GRAN CA N AR IA Departam ento de Patologia Anima l, Produ cdó n Animal Br om atol ogía y Tecnol ogia de l os A lim entos Anexo I D. MIGUEL BATISTA ARTEAGA, SECRETARIO DEL DEPARTAMENTO DE PATOLOGíA ANIMAL, PRODUCCiÓN ANIMAL, BROMATOLOGíA Y TECNOLOGíA DE LOS ALIMENTOS DE LA UNIVERSIDAD DE LAS PALMAS DE GRAN CANARIA, CERTIFICA, Que el Consejo de Doctores del Departamento toma el acuerdo de dar el consentimiento para su tramitación a la tesis doctoral titulada "ENSAYOS DE INMUNIZACiÓN EN PEQUEÑOS RUM IANTES CON PROTEINASAS TIPO CISTEíNA DE VERMES ADULTOS DE HAEMONCHUS CONTORTUS: IMPLICACIONES EN LA VARIABILIDAD GENÉTICA DEL PARÁSITO" presentada por el doctorando D. Sergio Martín Martel y dirigida por los Ores. D. Antonio Ruiz Reyes y D. José Manuel Molina Caballero. Y para que as í conste, y a efectos de lo previsto en el artO 73.2 del Reglamento de Estudios de Doctorado de esta Universidad, firmo la presente en Arucas, a dieciocho de marzo de dos mil diez. I t +34 928 451 099 I e-ma il secreta ri a@ dP at. Ul pgc.es I Edi fiC iO de Veterina ri a +34928451 1 37 www. ul pgc.es Ca mpu s U. De Mo nt af'la Ca r do n es f +34 928 45 1 1 42 354 13 Arucas - L as Pa l mas