Estudio del núcleo Ectomamilar durante el desarrollo embrionario de las aves

Elena Félix Domínguez 2015 Estudio del núcleo Ectomamilar durante el desarrollo embrionario de aves Elena Félix Domínguez Universidad de Las Palmas de Gran Canaria Ciencias de la Salud, Patología animal, producción animal y ciencia y tecnología de los alimentos Las Palmas de Gran Canaria, España 2015 Contenido III Estudio del núcleo Ectomamilar durante el desarrollo embrionario de aves Doña Elena Félix Domínguez Tesis presentada como requisito para optar al grado de: Doctora en Biología Directora: Doctora Dña. Lilián Rosa Pérez Santana Universidad de Las Palmas de Gran Canaria Ciencias de la Salud, Patología animal, producción animal y ciencia y tecnología de los alimentos Las Palmas de Gran Canaria, España 2015 Dime y lo olvido, enséñame y lo recuerdo, involúcrame y lo aprendo. Benjamin Franklin (1706-1790). No hay que temer a nada en la vida, solo hay que comprender sus secretos. Marie Curie (1895-1969). Agradecimientos Quiero agradecer a mi directora, Lilián Pérez Santana, su confianza en mí y por haberme abierto esta ventana hacia el fascinante mundo de la ciencia. A los miembros del departamento de Morfología de la Universidad de Las Palmas de Gran Canaria, en especial a la Doctora Dña Blanca Mompeó, por su apoyo incondicional. A Fabiola, Juanfra, Susana y Eduardo, amigos y compañeros del departamento A Paqui, que me enseñó el verdadero amor a la ciencia. Sin ti nada hubiera sido igual. A los miembros del Departamento de Anatomía Humana de la Universidad de Murcia, en especial a Luis Puelles y Margaret por su apoyo científico y personal. A Chelo, Juanu, Luisa y Sylvia, compañeros de andanzas de Murcia. Antonia y Ana Delgado, compañeras y amigas de la Universidad de La Laguna. A Carlos, por tu infinita paciencia A todas aquellas personas que de un modo u otro me han apoyado y ayudado para que este trabajo llegue a su fin. A mi familia que siempre ha confiado en mí. A Juan Andrés, tu amor y apoyo incondicional me han dado el empujón necesario para llegar hasta aquí. Contenido VII A mis padres A Paqui Contenido Pág. II 1.INTRODUCCIÓN ................................................................................................................ 12 Desarrollo del SNC de los vertebrados ........................................................................................ 16 1. Morfogénesis Temprana: Neurulación ..................................................................................... 17 2. Vesiculación y segmentación.................................................................................................... 21 3. Morfogénesis secundaria .......................................................................................................... 29 Diencéfalo ................................................................................................................................... 31 1. Diencéfalo: organización nuclear ............................................................................................. 33 a) Pretectum (P1) ...................................................................................................................... 33 b) Tálamo: Complejos nucleares del Tálamo .......................................................................... 34 c) Epitálamo ............................................................................................................................... 35 d) Pretálamo ............................................................................................................................... 36 e) Eminencia pretalámica, actualmente se denomina habénula pretalámica (Atlas, 2007) 36 El sistema visual ......................................................................................................................... 38 1. Vías visuomotoras ..................................................................................................................... 40 2. El sistema óptico accesorio (AOS) ........................................................................................... 41 Núcleo Ectomamilar .................................................................................................................... 44 Justificación y Objetivo ................................................................................................................ 49 2.MATERIAL Y MÉTODOS .................................................................................................. 51 Obtención y procesamiento del material ...................................................................................... 53 1. Obtención. .................................................................................................................................. 53 Procesamiento ............................................................................................................................ 54 1. Histología. .................................................................................................................................. 54 Cortes ............................................................................................................................................. 54 Fijacion ........................................................................................................................................... 54 Parafina .......................................................................................................................................... 55 Contenido IX Inclusión y corte en parafina ............................................................................................ 55 Tinción ............................................................................................................................ 56 Inmunohistoquímica......................................................................................................... 56 Agarosa y gelatina ......................................................................................................................... 58 Inclusión y corte en vibratomo.......................................................................................... 58 Tinción ............................................................................................................................ 59 Protocolo de AChE (Acetilcolinesterasa) (Modificado de Karnovsky y Rotts´64) ..................... 59 Timidina Tritiada............................................................................................................................. 60 3.RESULTADOS ..................................................................................................................... 64 1. Estudio de la citoarquitectura y localización del núcleo Ectomamilar (Em) durante el desarrollo embrionario mediante la tinción con Cresil Violeta ....................................................... 65 2. Expresión de la proteína Engrailed-2 durante el desarrollo del Núcleo Ectomamilar ............. 71 3. Seguimiento temporal del nacimiento de las neuronas que van a formar el núcleo con Timidina Tritiada ......................................................................................................................... 73 4. Marcaje de las neuronas que forman la población del Núcleo Ectomamilar .......................... 75 a) Patrón de marcaje de la proteína Calretinina .......................................................................... 75 b) Patrón de marcaje de la proteína Calbindina .......................................................................... 78 c) Patrón de expresión de las células Acetilcolinesterasa .......................................................... 79 4.FIGURAS .............................................................................................................................. 82 FIGURA 1 ................................................................................................................................... 83 FIGURA 2 ................................................................................................................................... 85 FIGURA 3 ................................................................................................................................... 87 FIGURA 4 ................................................................................................................................... 89 FIGURA 5 ................................................................................................................................... 91 FIGURA 6 ................................................................................................................................... 93 FIGURA 7 ................................................................................................................................... 95 FIGURA 8 ................................................................................................................................... 97 FIGURA 9 ................................................................................................................................... 99 FIGURA 10 ............................................................................................................................... 101 FIGURA 11 ............................................................................................................................... 103 Desarrollo del SNC de los vertebrados El encéfalo humano comparte un patrón morfológico básico y fundamental con todos los demás vertebrados. La siguiente sinopsis de las principales características de este patrón se basa, principalmente, en los estudios embriológicos clásicos de los investigadores suecos Bergquist y Kallén y sus colaboradores, 1954; Kallen, 1965; Vaage, 1969; Keyser, 1972, y en el trabajo reciente de Puelles y Rubenstein y de sus colaboradores (Rubenstein & Puelles, 1993).  Las paredes laterales del encéfalo pueden ser divididas en una serie de unidades o campos básicos formados por la intersección de neurómeros de orientación transversal con zonas de disposición longitudinal.  Dos dominios longitudinales, la placa basal y alar, se extienden a lo largo del neuroeje. La zona limitante longitudinal o límite alar-basal, finaliza rostralmente justo detrás del quiasma óptico. Este límite se aproxima al concepto de surco limitante de His (His, 1983), el cual básicamente separaba las neuronas de diferenciación precoz de la placa basal de las células más tardías de la placa alar. Este límite se puede rastrear en todos los vertebrados mediante marcadores moleculares.  Las unidades morfológicas básicas representan complejos radiales tridimensionales, que se extienden desde la superficie ventricular hasta la superficie pial (meníngea). Cada una de estas unidades forma un centro de Introducción 17 proliferación, que produce células postmitóticas que migran en sentido radial y que, después de alcanzar su posición final, participan en la formación de diferentes clases de estructuras. 1. Morfogénesis Temprana: Neurulación Para comprender el cerebro debemos entender cómo surge y los cambios que sufre a lo largo de la vida. Los primeros procesos del desarrollo animal siguen un patrón fijo. Tras la fecundación una serie de rápidas divisiones celulares subdividen al cigoto y lo transforman en una mórula que pasa a denominarse blástula cuando sus grandes células se disponen como una pelota hueca con una cavidad interna llamada blastocisto. A continuación se desencadena un proceso de movilización masiva de células que se conoce como gastrulación, en las que se forman las tres capas germinales del embrión: ectodermo, mesodermo y endodermo. Paralelamente al proceso de gastrulación comienza otro igualmente importante, conocido como inducción primaria. Básicamente consiste en que las células del mesodermo intraembrionario axial (la placa precordal y prolongación cefálica) ejercen un potente efecto sobre las tres hojas embrionarias induciendo y organizando su ulterior desarrollo. Esta inducción primaria puede ser descompuesta, según la hoja embrionaria sobre la que actúa, en inducción neural, inducción mesodérmica e inducción endodérmica. La primera manifestación visible del efecto de la inducción neural es el cambio de morfología celular, la cual lleva consigo una reorganización del Introducción 18 citoesqueleto en una serie de pasos dinámicos que hacen inestable la forma plana inicial de la placa neural y la llevan a replegarse sobre sí misma. Vemos así la elevación progresiva de las crestas neurales, formando primero un canal neural y luego llegando a cerrarse por adhesión y fusión de los dos bordes que se encuentran mutuamente en la línea media dorsal. Este proceso de “canalización”, lo denominamos neurulación. Es importante que la neurulación culmine con la transformación del canal neural en un tubo neural completamente cerrado. Quedan zonas abiertas transitoriamente al exteriorrostral y caudal, que llamamos neuroporos anterior y posterior. El cierre del tubo neural progresa en ambas direcciones hasta completarse, primero rostralmente y algo más tarde caudalmente. Conforme progresa la neurulación, el canal neural se va alargando y plegando sobre su línea media ventral para producir el tubo neural. Tras la neurulación, se instaura una fase de proliferación intensa del neuroepitelio, generándose el aumento de superficie característico de los procesos de vesiculación y segmentación. Todas las células neuroepiteliales se dividen, aunque a diferente ritmo (ciclos mitóticos de diferente duración) lo que da lugar a las expansiones y contracciones (vesículas, neurómeros) de la forma cerebral incipiente. Tras la fase de proliferación y crecimiento rápido inicial, se sucede un largo periodo en el que esta proliferación neuronal continúa, pero acompañada de producción de células cuyos cuerpos abandonan la capa ventricular y se acumulan en la capa marginal generando la capa del manto. Este proceso, así como los movimientos que realizan dentro de esta capa hasta llegar a su lugar de diferenciación definitiva, se denomina migración neuronal. La migración neuronal se ha definido en dos tipos de acuerdo con la orientación y dirección del movimiento celular, aunque hay clases de neuronas que Introducción 19 realizan ambos tipos de migración en diferentes fases de su diferenciación inicial:  Migración radial: es el movimiento desde la capa ventricular a la capa del manto, siguiendo básicamente la dirección radial del neuroepitelio circundante. Es el tipo de migración más importante en el encéfalo de los mamíferos.  Migración tangencial: es el movimiento paralelo a la superficie del tubo neural, dentro de la capa del manto. Este mecanismo de migración va a producir fundamentalmente un desplazamiento a otro entorno histogenético vecino o lejano. Introducción 20 Figura 1.El esquema ilustra las etapas del cierre del tubo neural. A. 18 días; B.20 días; C. 22 días; E. corte transversal del embrión de 18 días; F. corte transversal del embrión de 20 días; G. corte transversal del embrión de 22 días de incubación.( Tomado de Sanes D, 2002). a) Génesis temprana en aves: El estudio de estas dos fases, gastrulación y neurulación, en embriones de aves es más rápida debido a que su desarrollo sigue una serie de 46 estadios que cronológicamente comienza con la fecundación del huevo Introducción 21 y finaliza con su rotura y el nacimiento del polluelo. Esta serie de estadíos (HH) debe su nombre a sus creadores (Hamburger & Hamilton, 1951). Este desarrollo embrionario es considerablemente rápido ya que los 46 estadíos se completan en 21 días. (Tabla 1) En aves, la neurulación comienza a las veintidós horas desde la fecundación, cuando el embrión se encuentra en el estadío HH7. A las veintisiete horas comienza el cierre del tubo neural (HH9) quedando el neuroporo abierto hasta el estadío HH11. La flexura cefálica se inicia en el estadío HH10 y la flexura pontina es visible desde HH27 y se incrementa considerablemente en HH31. El cerebelo se reconoce desde el décimo día (HH36) y la primera fisura aparece el décimo primer día (HH37). En el embrión de ave los rasgos esenciales del cerebro están presentes el décimo segundo día (HH38). (Dubbeldam JL, 1998). 2. Vesiculación y segmentación La regionalización del cerebro es un proceso progresivo que empieza muy temprano, durante la neurulación y vesiculación (Marín y Rubenstein, 2002). El modelo prosomérico del desarrollo del prosencéfalo (Bulfone y col., 1993; Figdor y Stern, 1993; Puelles y Rubenstein, 1993; Rubenstein ycol., 1994), postula que antes del cierre completo del neuroporo anterior aparecen ya las vesículas ópticas, que se forman por evaginación de sendos territorios circulares a cada lado del extremo anterior del tubo neuronal. Poco después de la primera aparición de las vesículas ópticas distinguimos a grandes rasgos tres regiones abombadas del tubo neural: Introducción 22 1. El prosencéfalo primario, que comprende toda la porción anterior dilatada del tubo, incluyendo a las vesículas ópticas como divertículos laterales. 2. El mesencéfalo o vesícula intermedia. 3. El rombencéfalo o región trasera, que en realidad consta desde un principio de al menos tres vesiculaciones independientes. Desde su propuesta inicial (Puelles y Rubenstein, 1993), el modelo prosomérico ha sufrido pequeñas variaciones para encajar nuevos datos e interpretaciones sobre el desarrollo del prosencéfalo (Martínez y Puelles, 2001; Puelles, 2001; Puelles y Rubenstein, 2003). En todas sus versiones (Fig.2), el prosencéfalo primario queda dividido en dos dominios transversales anteroposteriores como consecuencia de una subdivisión secundaría, formándose dos protovesículas: el diencéfalo caudalmente y el prosencéfalo secundario rostralmente. El prosencéfalo secundario va a estar constituido por el hipotálamo ventralmente, el telencéfalo dorsalmente y las vesículas ópticas a cada lado, mientras que el diencéfalo dará lugar al tálamo y pretecho dorsalmente, y varios territorios tegmentales ventralmente (Puelles y col., 1987; Puelles y Rubenstein, 2003) (Fig. 2). Mientras que el prosencéfalo secundario es precordal, y queda bajo la influencia de señales inductoras precordales, el diencéfalo es principalmente epicordal (Shimamura y col., 1995; Echevarría y col., 2003). La existencia de estas dos subdivisiones en el prosencéfalo - prosencéfalo secundario y diencéfalo y la extensión de cada una queda también apoyada por datos de mutaciones de genes reguladores del desarrollo, que afectan a una u otra subdivisión de forma distinta. Por ejemplo, los mutantes de Six3 (que se expresa específicamente en el prosencéfalo secundario) presentan una ausencia de formación del prosencéfalo Introducción 23 secundario, pero la formación del diencéfalo no está afectada (Lagutin y col., 2003). La subdivisión segmentaria del diencéfalo ha quedado también apoyada por estudios de transplantes (López-García y col., 2004). La concepción del diencéfalo y del prosencéfalo secundario propuesta por el modelo (que está apoyada por los estudios de genes reguladores del desarrollo y mapas de destino) contradice los estudios neuroanatómicos clásicos, que incluyen en el diencéfalo tanto el tálamo como el hipotálamo. Una de las principales aportaciones del modelo prosomérico es que ofrece un eje de coordenadas que permite entender mejor los patrones de expresión génica, los efectos o resultados de mutaciones, inducciones, trasplantes y otras manipulaciones experimentales, así como la disposición de las subdivisiones del prosencéfalo con respecto a los ejes. Por ejemplo, el modelo implica que el tálamo ventral (p3) es rostral al tálamo dorsal (p2), mientras que las vesículas telencefálicas, evaginadas desde la región más dorsal de la placa alar del prosencéfalo secundario, están constituidas solo por territorio alar (Fig. 2). Además, el modelo se puede aplicar a las distintas especies de vertebrados y predice la existencia de prosómeros y subdivisiones intraprosoméricas homólogas entre los distintos grupos (Puelles, 1995; Puelles y col., 1996). La regionalización del cerebro es un proceso progresivo que empieza muy temprano, durante la neurulación y vesiculación (Marín y Rubenstein, 2002). El modelo prosomérico del desarrollo del prosencéfalo (Bulfone y col., 1993; Figdor y Stern, 1993; Puelles y Rubenstein, 1993; Rubenstein ycol., 1994), postula que antes del cierre completo del neuroporo anterior aparecen ya las vesículas ópticas, que se forman por evaginación de sendos territorios circulares a cada lado del extremo anterior del tubo neuronal. Poco después de la primera aparición de las vesículas ópticas distinguimos a grandes rasgos tres regiones abombadas del tubo neural: Introducción 24 1. El prosencéfalo primario, que comprende toda la porción anterior dilatada del tubo, incluyendo a las vesículas ópticas como divertículos laterales. 2. El mesencéfalo o vesícula intermedia. 3. El rombencéfalo o región trasera, que en realidad consta desde un principio de al menos tres vesiculaciones independientes. El avance de los procesos de crecimiento y especificación genética de las partes del tubo neuronal (ahora controlado por genes de segmentación e interacciones morfogenéticas entre las diferentes vesículas) conduce a la subdivisión transversal de las vesículas primarias en segmentos o neurómeros, particularmente en el prosencéfalo (cuyos segmentos se denominarán prosómeros) y en el rombencéfalo (segmentos llamados rombómeros y pseudorombómeros). Así el prosencéfalo primario se desdobla en prosencéfalo secundario y diencéfalo. El prosencéfalo secundario es, como su nombre indica, la porción más rostral, e incluye las vesículas ópticas a cada lado. Su parte basal formará el territorio hipotalámico del cerebro adulto. Su parte dorsal es inicialmente simple, pero presentan más tarde el abombamiento bilateral de las vesículas telencefálicas, a partir de las cuales deriva el telencéfalo adulto. El extremo rostral del tubo neuronal queda a nivel de la lámina terminal, en el extremo anterior de la región preóptica, la prospectiva región quiasmática y la región anterobasal del hipotálamo. El borde del neuroporo anterior cerrado coincide con la futura comisura anterior. La protovesícula diencefálica se subdivide a su vez en tres segmentos o prosómeros 1-3 (P1-P3). De atrás a delante, estos contienen Introducción 25 respectivamente en sus partes dorsales los territorios prospectivos del pretectum o región pretectal (P1 alar), Tálamo mas epitálamo y glándula pineal (P2 alar), y pretálamo (P3 alar). Las respectivas partes ventrales de los neurómeros diencefálicos se encuentran por detrás de la región mamilar la concepción embriológica moderna que acabamos de resumir choca con el concepto clásico de “diencéfalo”, ya que en este se interpreta el territorio hipotalámico como la base del diencéfalo en vez de como la base del prospectivo telencéfalo, donde se hace terminar erróneamente el eje longitudinal. Al igual que existe la división transversal, se distingue una subdivisión longitudinal primaria, que es pronto traducida en histogénesis diferencial. Esto quiere decir que la especificación, proliferación y diferenciación de neuronas se regula de forma independiente y cronológicamente diferente en distintas áreas dorsoventrales de la pared de cada segmento. Se distinguen 4 columnas longitudinales que atraviesan a cada lado tanto el diencéfalo como el prosencéfalo secundario, continuándose las de la derecha con las de la izquierda en el extremo más rostral (Fig. 2). Se trata de las placas alar, basal, del suelo y del techo.  La placa basal, incluye sucesivas áreas histogenéticas segmentarias en serie, caracterizadas por presentar diferenciación precoz y terminar rápidamente su producción neuronal. Ello da lugar a poblaciones neuronales de tamaño más bien reducido. Como características generales de su conectividad tienden a establecer conexiones con otras áreas basales del neuroeje, pudiendo alcanzar sus axones la médula espinal. Se ha estudiado poco la región basal diencefálica, ocupada también por las partes más rostrales de la sustancia negra. Se puede Introducción 32 unas a partir de las otras. Un mapa detallado de estos prosómeros de destino en la etapa del tubo neural se produjo recientemente trazando los principales derivados alares y basales (García-López et al 2004). La principal diferencia de este trabajo con lo después publicado en el atlas (Puelles et al 2007) es que esos autores colocan el núcleo retromamilar en el diencéfalo en P3 y en el atlas se cree que la colocación correcta es en el hipotálamo. Esto afecta a la clasificación de otros núcleos que se originan en la zona. Por tanto, el diencéfalo propiamente dicho consta de tres segmentos epicordales o neurómeros (sinencéfalo , parencéfalo posterior y parencéfalo anterior). Sus respectivas porciones alares desarrollan las agrupaciones nucleares del pretecho (P1), del tálamo(P2) y del pretálamo (P3) respectivamente. Sus porciones más ventrales (placa del suelo) aparecen comprimidas en la parte rostral de la fosa interpeduncular, entre los cuerpos mamilares y la raíz del III par craneal. El sinencéfalo (P1) genera la región pretectal o pretectum y una zona tegmental dentro de la que se diferencian el núcleo intersticial de Cajal y la parte parvocelular del núcleo rojo. El parencéfalo posterior (P2) da origen al epitálamo (núcleos habenulares mas epífisis) y al tálamo (tálamo dorsal), mientras que el pretálamo (tálamo ventral)(P3) se desarrolla dentro del parencéfalo anterior. Según Puelles (Puelles L, 2001) el tercer neurómero diencefálico, P3, incluye la eminencia pretalámica en su parte más dorsal. Introducción 33 Figura 3. Esquema donde se representan los tres prosómeros o neurómeros en los que se divide el Diencéfalo. La línea continua indica el límite alar/basal.p1-p3, prosómeros 1-3. (Puelles L, 2003) 1. Diencéfalo: organización nuclear a) Pretectum (P1) El pretectum es una región exclusivamente alar perteneciente al prosómero 1 y que se encuentra encajado entre el tálamo del diencéfalo y el mesencéfalo. (Fig. 4). Se distinguen tres territorios en el pretectum. Caudalmente está el pretectum comisural, caracterizado por ser la zona ocupada por las fibras de la comisura posterior y las neuronas que nacen en esta zona y se incorporan al manto atravesando el plano de estas fibras, una zona intermedia relativamente estrecha, llamada pretectum yuxtacomisural, donde nacen núcleos específicos. Finalmente, por delante de este se encuentra el territorio pretectal mas rostral, el pretectum precomisural, el cual ya limita por delante con el tálamo. Este territorio es el que produce la población pretectal más voluminosa, Introducción 34 el núcleo pretectal anterior. En su parte superficial recibe proyecciones de la vía óptica. Una formación que parece derivar del pretectum yuxtacomisural superficial, es el complejo terminal de la vía óptica basal, descompuesto en un pequeño núcleo terminal dorsolateral y un núcleo terminal medial de la vía óptica basal. Este último se encuentra desplazado en posición muy ventral, abrazado por la sustancia negra compacta. Dorsalmente a estos dos grupos yuxtacomisurales aparece el núcleo olivar pretectal, el centro pretectal para el reflejo pupilar. Estos tres núcleos reciben proyecciones ópticas a través de un contingente particular de axones retinianos, el tracto óptico basal, que circula primero basal a la cintilla óptica, separado de la misma desde detrás del quiasma óptico hasta llegar al núcleo terminal medial, (núcleo ectomamilar) al que cede terminales. Luego sigue por el tracto peduncular transverso, un delgado filamento que se ve cruzar superficialmente el pie del pedúnculo en dirección dorsal, hasta encontrar al núcleo terminal dorsolateral y el núcleo olivar pretectal. b) Tálamo: Complejos nucleares del Tálamo La voluminosa masa nuclear del tálamo (Fig.4) se desarrolla en la placa alar del prosómero 2, complementada directamente por el epitálamo o complejo habenular. Su gran tamaño se correlaciona con el desarrollo de la corteza cerebral y otras formaciones telencefálicas con las que sus neuronas se relacionan estrechamente. Se considera el tálamo como la principal puerta de entrada de señales al telencéfalo. Esta masa nuclear se encuentra atravesada por las numerosas fibras aferentes y eferentes que aseguran su conectividad. Tales fibras Introducción 35 tienden a acumularse en determinadas zonas, llamadas láminas medulares. Se distingue así la lámina medular externa y la lámina medular interna del tálamo. La lámina medular externa es una extensa cáscara anterior, lateral y ventral, que separa al tálamo del pretálamo y recibe también el nombre zona limitans intertalámica. Coincide con el límite interneuromérico alar entre P2 y P3. c) Epitálamo Esta región nuclear, también llamada habénula, es un pequeño añadido dorsal al tálamo. El epitálamo posee dos subdivisiones principales: núcleos habenulares lateral y medial. Ambos proyectan a través del tracto retroflejo, que recorre longitudinalmente el suelo de P1, del mesencéfalo y del istmo y finalmente alcanza el núcleo interpeduncular el cual se extiende en la línea media, a caballo del rafe medio, a través de los rombómeros 1 y 2. Al llegar al núcleo interpeduncular, el tracto retroflejo se comporta de un modo único en el cerebro tal y como fue descrito por Santiago Ramón y Cajal: los axones zigzaguean repetidas veces a través de la línea media superficial, dentro del núcleo entrecruzándose con los del lado contrario, aparentemente sinaptando con neuronas a todo lo largo del complejo. Algunas fibras terminales, sobre todo del núcleo habenular lateral, proyectan también sobre los núcleos del rafe cercanos, así como sobre la sustancia negra y el área tegmental ventral del mesencéfalo y diencéfalo caudal. Asociada al epitálamo, en su techo, está la glándula pineal o epífisis. Esta especialización del techo no contiene neuronas, estando compuesta por células gliales y células especiales llamadas pinealocitos. La glándula está densamente inervada por terminales serotoninérgicos procedentes de los núcleos del rafe, cuyo transmisor, Introducción 36 la serotonina, aparentemente es usado por los pinealocitos para producir melatonina, su secreción principal. d) Pretálamo Es una región alar derivada del prosómero p3 diencefálico, se subdivide en tres grandes dominios histogenéticos: La eminencia pretalámica y las regiones pretalámica rostral y caudal. Esta región se aplana progresivamente durante su desarrollo en la cercanía del ovoide talámico, quedando sus poblaciones neuronales desfiguradas por el paso a través de su territorio de todas las fibras que interconectan el tálamo con el telencéfalo. Las poblaciones neuronales del pretálamo no presentan proyecciones ascendentes al telencéfalo, limitándose a mantener conexiones longitudinales ipsiy contralaterales con otras partes alares del prosencéfalo extratelencefálico y del mesencéfalo y conexiones dorsoventrales sobre la placa basal subyacente. e) Eminencia pretalámica, actualmente se denomina habénula pretalámica (Atlas, 2007) Esta pequeña región nuclear dorsal se comporta topológicamente con relación al pretálamo exactamente como lo hace el epitálamo con relación al tálamo (epi-pretálamo). La eminencia pretalámica (en P3 dorsal) y el epitálamo (en P2 dorsal) se encuentran unos a continuación Introducción 37 del otro y ambos contactan dorsalmente con la tela coroidea del III ventrículo, por detrás del techo del orificio interventricular. Figura 4. Esquema que representa la estructura general del pretecho, tálamo y pretálamo (alar y basal). Tomado de Puelles y col., 2008, Neuroanatomía. El sistema visual El sistema visual consiste en algunas vías paralelas, y cada una de ellas cumple una función específica. El procesamiento de la información visual ya está presente a nivel de la retina, en donde se distinguen diferentes capas, siendo una de ellas la capa de células ganglionares y la capa de fibras del nervio óptico (Fig. 5). Los axones de las células ganglionares pasan sobre la superficie interna de la retina y convergen hacia el polo posterior del ojo, donde atraviesan agujeros en la esclerótica y forman entonces el nervio óptico. Los nervios ópticos se dirigen hacia el quiasma óptico, que está situado en la base del encéfalo en la porción más rostral del hipotálamo. Dentro del quiasma óptico, ocurre una decusación parcial: las fibras provenientes de las mitades nasales de las retinas, que incluyen la proyección del campo visual monocular, cruzan hacia el lado opuesto; las que provienen de las mitades temporales de las retinas no cruzan. Después de esta decusación parcial, los axones de las células ganglionares de la retina continúan sin interrupción por detrás del quiasma como dos tractos ópticos divergentes. Éstos se arquean alrededor de las caras laterales del diencéfalo hasta que alcanzan los cuerpos geniculados laterales, donde terminan la mayoría de sus fibras. Sin embargo, algunas fibras continúan en dirección mediocaudal y se dirigen a través del tubérculo cuadrigémino superior al colículo superior, a la región pretectal y a los núcleos terminales del sistema óptico accesorio. Introducción 39 Figura 5. Vía visual central. Tomado de Puelles, 2008, neuroanatomía. Introducción 40 1. Vías visuomotoras Las vías visuomotoras incluyen las vías reflejas para acomodación, vergencia y estabilización del ojo, y las vías involucradas en los sacádicos voluntarios y el seguimiento suave de objetos en movimiento. Existen dos sistemas principales que impulsan los movimientos oculares conjugados. Uno es el arco reflejo de tres neuronas del reflejo oculovestibular, que conecta cada conducto semicircular, a través de los núcleos vestibulares, con los pares de músculos que mueven el ojo en el plano de este plano semicircular. Este sistema fue desarrollado en invertebrados para estabilizar la posición del ojo en el espacio y se mantuvo presente, escasamente alterado, en el encéfalo de mamíferos. Las vías utilizadas por el reflejo oculovestibular son compartidas por el reflejo optocinético, reflejo que estabiliza el ojo por los movimientos de seguimiento suave y genera movimientos sacádicos. Este reflejo junto con el oculovestibular reciben su información acerca del “desplazamiento retiniano” del sistema óptico accesorio y del núcleo del tracto óptico. El seguimiento suave comprende el procesamiento de información sobre dirección y velocidad de un objeto que es rastreado por las áreas corticales visuales y la supresión simultánea del reflejo oculovestibular. Los sacádicos son movimientos oculares rápidos que redirigen la línea de la vista hacia un área de interés y aseguran que el punto diana caiga sobre la fóvea muy pequeña. Introducción 41 2. El sistema óptico accesorio (AOS) A partir del quiasma óptico, ciertas fibras retinianas se separan en bloque de la cintilla óptica (también conocida como tracto óptico lateral o principal) y circulan paralelamente a ella por el diencéfalo en una posición algo más ventral, formando el tracto óptico accesorio o basal. Este paquete de fibras procede de un subtipo especial de neuronas ganglionares y va dirigido específicamente a unos núcleos de la región pretectal. Al llegar a esta región sus fibras la recorren superficialmente de ventral a dorsal, pasando por el tracto peduncular transverso, para sinaptar sobre sus dianas. Su posición nos indica dónde se encuentra lateralmente el límite entre el pretectum y el mesencéfalo (Van der Want y col., 1992). Los núcleos terminales de la vía óptica basal: dorsal, lateral y medial, (Fig. 6) proceden de un esbozo embrionario único y reciben por la vía óptica basal un subconjunto particular de axones retinianos procedentes de células ganglionares que detectan el movimiento del fondo de la escena visual con relación a los objetos en primer plano. Esto se produce cuando estamos en movimiento; por ejemplo, al avanzar por una carretera, los árboles y las casas se desplazan aparentemente a los lados respecto al fondo y a nosotros. Una parte de esta población neuronal pretectal computa los desplazamientos horizontales y otra parte los desplazamientos verticales. Sus proyecciones hacia el cerebelo, puente oliva bulbar y formación reticular median las respuestas ocumolotoras reflejas que conocemos como reflejo de nistagmus u optocinético en estos dos planos espaciales. Este reflejo, desencadenado automáticamente al movernos en el medio que nos rodea, consiste en dos fases: primero ocurre un seguimiento lento con ambos ojos de algún objeto cercano que parece desplazarse y, luego se salta rápidamente (movimiento sacádico) a un segundo objeto cuando se pierde de vista al primero, para seguirlo lentamente. Se piensa que es una actividad exploratoria automática del Introducción 48 McKenna y Wallman (1981) encontraron que el nBOR lateralis es continuo con el LM y representa la parte caudomedial del LM. Además mostraron que con respecto a la preferencia de dirección del estímulo visual el lateralis se asemeja al LM más que al nBOR. En docenas de especies de aves, Iwaniuk y Wylie (2007) observaron en secciones coronarias teñidas con Nissl que el lateralis es continuo con LM y que las conexiones del nBOR, con el nBOR contralateral y el núcleo oculomotor no envuelven al lateralis. Por estas razones Wylie et al (2007) consideran que el nBOR lateralis forma parte del LM más que del complejo nBOR. Aunque existen diferencias entre las especies (Giolli y col., 2006), el núcleo ectomamilar de especies no mamíferas y los núcleos del AOS de mamíferos podrían ser vistos como estructuras homólogas, anatómicamente, funcionalmente y en términos de mayoría, aunque posiblemente de no todas, las conexiones nerviosas básicas. La especificidad de proyecciones retinofugales a los núcleos del AOS parece estar determinado durante los estadios embrionarios por la presencia, tanto en células retinales, en las neuronas y neuropilos de estos núcleos, de un subconjunto específico de Cadherinas (moléculas de adhesión) llamadas cadherina6B y cadherina 7 (Wohrn y col., 1998). Justificación y Objetivo El cerebro de pollo es un modelo ideal para los estudios en el desarrollo embrionario, ya que tiene un fácil control de incubación y por tanto es relativamente sencillo conseguir embriones en los periodos necesarios para el estudio. Son de fácil manejo y además la proximidad filogenética de las aves con los mamíferos y reptiles ayuda a reconocer homologías en las estructuras. Existe una gran cantidad de estudios dedicados a las proyecciones y función del nBOR, pero muy pocos sobre su aparición y cómo sus neuronas migran desde su origen hasta su localización final. Teniendo en cuenta esto, con este trabajo hemos querido abordar aspectos desconocidos del núcleo Ectomamilar a lo largo del desarrollo embrionario del pollo. Partiendo de la base de que el núcleo ectomamilar o nBOR no es homogéneo (Brecha et al., 1980; Zayats et al., 2002) nos hemos centrado en la identificación y distribución de sus poblaciones neuronales. Para ello, hemos recurrido al estudio de identificación del tipo de neuronas mediante la expresión de cuatro tipos de proteinas: Engrailed-2, acetilcolinesterasa, calbindina y calretinina.  Objetivos generales: Estudiar la estructura, el origen y la diferenciación del núcleo ectomamilar o nBOR durante la embriogénesis en aves y de esta forma ampliar conocimientos sobre el sistema óptico accesorio al que pertenece. Justificación y Objetivos 50  Objetivos específicos: A) Estudiar cuándo nacen y migran las diversas poblaciones neuronales del nBOR. Estos datos son importantes para su correlación con información en la literatura sobre cuándo y dónde aparecen determinadas expresiones génicas, así como con la cronología de maduración del perfil químico y de las conexiones de las diversas poblaciones neuronales del nBOR. B) Cómo maduran en el nBOR sus diferentes subpoblaciones neuronales. Localizar y seguir paso a paso la maduración en el seno del neuropilo de las neuronas químicamente caracterizables que forman esta población. 2.Material y métodos Material y métodos 52 Material y métodos En nuestro trabajo hemos utilizado embriones de pollo ya que el estudio de la morfogénesis del cerebro en aves ha contribuido ampliamente a un mejor entendimiento de su organización y al reconocimiento de homologías entre los cerebros de diferentes vertebrados. Todos los animales utilizados a lo largo de la tesis fueron tratados de acuerdo con la normativa Española (Ley 32/2007, de 7 de Noviembre, para el cuidado de los animales en su explotación, transporte, experimentación y sacrificio) y de la Unión Europea para el cuidado y manejo de animales de experimentación (2007/526/CE). Tabla1. Estadio de desarrollo según Hamilton y Hamburger en el embrión de pollo. Material y métodos 53 Obtención y procesamiento del material 1. Obtención. Para la realización del presente trabajo se utilizaron 150 embriones de pollo (Gallus gallus) provenientes de huevos de gallinas fertilizados obtenidos, 24 horas después de la puesta, de una granja local. Posteriormente, los huevos fueron incubados en una incubadora automática (Masalles, Barcelona) en atmósfera húmeda a 37º C durante las horas necesarias para la obtención de los embriones en los estadios de interés siguiendo las tablas de Hamilton y Hamburger (1951) (Tabla 1). El número de embriones puede ser dividido en dos grupos, un grupo de 70 embriones incluidos y cortados en parafina y otro grupo de 80 embriones, de los cuales unos 30 fueron incluidos en agarosa y el resto en gelatina. Cada uno de estos grupos se puede subdividir en 15 estadios, desde el estadio HH26 (5 días de incubación) hasta HH45 (20 días de incubación). Usando en cada estadio aproximadamente 5 embriones. Procesamiento 1. Histología. Cortes Horizontal corregido: paralelo al plano que pasa desde el centro del ojo al centro del tectum (paralelo al tracto óptico). Este tipo de corte te utiliza debido a que el tubo neural no es recto. Fijacion Para proceder a la fijación abrimos la cáscara del huevo y extraemos el embrión, que rápidamente sumergimos en PBS (tampón fosfato salino 0.1M, ph 7´3) frío. A continuación, se siguió dos procedimientos dependiendo de la edad de los embriones: Hasta 9 días de incubación (HH 35) fueron decapitados, pelados y fijadas sus cabezas mediante inmersión aproximadamente 24 horas en fijador Clarke ( 3:1, etanol 100%, ácido acético). Los embriones de más de 9 días de incubación (HH35-HH42) fueron sometidos a una perfusión transcardiaca de paraformaldehído al 4% (PFA 4%), seguida de una noche de postfijación en la misma solución fijadora. Material y métodos 55 Parafina Inclusión y corte en parafina Para su inclusión en parafina, la deshidratación se realizó de manera progresiva, mediante lavados en etanol 70%, etanol 96% y etanol 100%. El tiempo que debe permanecer el tejido en cada uno de los alcoholes depende del volumen de éste, así por ejemplo, una cabeza de un embrión de 9 días (HH35) requiere dos lavados de dos horas cada uno en alcohol. A continuación el tejido se sumerge en butanol, un alcohol miscible con la parafina, donde permanece una noche para proceder seguidamente a su inclusión. La inclusión en parafina se realiza en una estufa de vacío a una temperatura de 60ºC, el tiempo preciso de inclusión y la utilización de vacío dependen asimismo del volumen del tejido. Así una cabeza de un embrión de 9 días requiere tres baños con parafina nueva de dos horas cada uno, en un medio donde se ha hecho vacío de –60 atmósferas. A continuación hacemos los bloques de parafina en un molde metálico a temperatura ambiente, orientando de forma adecuada la cabeza del embrión para posteriormente cortarlo en el plano elegido. Una vez solidificado el bloque procedemos a su corte en un microtomo de parafina, ajustando el grosor de las secciones a 10 micras. Posteriormente los cortes son montados en portas sobre una plancha a 48ºC. Las secciones se adhieren a los portas con una solución de albúmina de huevo preparada y filtrada previamente (clara de huevo, glicerina y timol). Los cortes fueron ordenados en los portas en dos series paralelas, siendo utilizada una de ellas para la tinción de cresil violeta, destinada al estudio citoarquitectónico. Sobre la otra serie realizamos una inmunohistoquímica usando como primario el Material y métodos 56 anticuerpo monoclonal 4D9 que detecta la proteína que codifica para el gen Engrailed-2, de origen mesencefálico. Tinción Una de las series obtenidas del corte en microtomo de parafina se destina al estudio citoarquitectónico de los embriones. Este estudio se realizó con la tinción de cresil violeta aunque algunas series realizadas en Murcia fueron teñidas con Tionina-rojo neutro. Para ambas tinciones, se procede en primer lugar a desparafinar los cortes mediante inmersión en xilol (dos baños de media hora cada uno). A continuación hidratamos progresivamente el tejido en baños de etanol de gradación decreciente (dos baños de etanol 100%, dos en etanol 96%, uno en etanol 70%) y agua destilada. Sumergimos los cortes en el colorante de cresil durante 3-5 minutos, en el caso de tioninarojo neutro, se sumerge primero durante un minuto en la tionina, se hace un lavado y a continuación un baño de un minuto en el rojo neutro. Seguidamente lavamos en agua destilada y deshidratamos progresivamente el tejido en la bateria de los alcoholes. Finalmente, sumergimos los portas en xilol y se cubren con cubreobjetos en el medio Eukitt®. Inmunohistoquímica La otra serie obtenida del corte de microtomo de parafina es procesada para la detección inmunohistoquímica del tejido de pollo con el anticuerpo 4D9 (IgG, Developmental Hybridoma Bank, Iowa). Para la realización de la inmunohistoquímica las secciones son desparafinadas como relatamos anteriormente. Posteriormente Material y métodos 57 lavamos los portas en PBS + T (PBS 0´1 M pH 7´3, tritón al 0´75%) dos veces diez minutos cada vez y a continuación mantenemos los portas durante 30 minutos en 0´3% H2O2 en PBS-T protegidos de la luz, para la eliminación en el tejido de peroxidasa endógena. Después lavamos de nuevo con PBS-T y dejamos los portas en una disolución prebloqueante de PBS-Gelatina-Tritón-Lisina (PBS 0´1M pH 7´3, gelatina al 2%, tritón al 25%) durante sesenta minutos. Lavamos durante diez minutos en PBS-Gelatina-Tritón-Azida (azida 0´1%) y procedemos a incubar las secciones en una disolución del anticuerpo 4D9D4 anti-engrailed/invected (DSHB, The University of Iowa) en PBS-G-T-A, concentración 1:2, durante 48 horas en la nevera. Pasado este tiempo lavamos las secciones en PBS-G-T y a continuación tres veces en PBS-T. Incubamos las secciones en el anticuerpo secundario GAM-Biot disuelto en PBS-G-T a una concentración 1/200 durante dos horas. Volvemos a lavar en PBS-T e incubamos durante una hora en el complejo anti-avidina-biotina (vector), concentración 1:300 disuelto en PBS-T. Lavamos de nuevo con PBS-T y tampón Tris (Tris-HCl 0´05M pH 7´4) y procedemos al revelado de la peroxidasa, utilizando como sustrato de la reacción enzimática H2O2 0´03% y Diaminobencidina (DAB) diluida al 0´05% en tampón Tris. Finalmente se para la reacción en tampón Tris cuando la observación bajo la lupa muestra el estado óptimo del marcaje. Se deshidratan las secciones y se cubren los portas en el medio Eukitt. 3.Resultados Resultados 65 Resultados Figura. 3.1 Esquema de cerebro de paloma en una visión ventral donde se indica el corte horizontal corregido, paralelo al tracto óptico. Tomado de J.L Dubbeldam., 1998. 1. Estudio de la citoarquitectura y localización del núcleo Ectomamilar (Em) durante el desarrollo embrionario mediante la tinción con Cresil Violeta El núcleo Ectomamilar es un núcleo superficial fácil de detectar en cerebros ya maduros gracias a que se localiza en el característico abultamiento que presenta la zona ventral del diencéfalo (Figura 3.2). Los primeros indicios de aparición del núcleo se observan en un embrión en el estadio HH34 (8 días de incubación). Resultados 66 Figura 3.2. Visión Ventral de un cerebro de paloma, mostrando la localización del nBOR. Tomado de J.L Dubbeldam., 1998. El tamaño del núcleo es diferente desde su nacimiento en el estadio HH30/33 (68 días de incubación) hasta que consigue su posición final en el estadio HH38 (12 días de incubación). A partir de aquí el tamaño y la forma del núcleo permanecen estables y no difieren a lo largo del desarrollo embrionario. En el estadio HH34 (8 días de incubación) (figura 1 A, B, C) se observa tres secciones horizontales, las secciones se realizan paralelas al tracto óptico, a nivel del diencéfalo teñidas con violeta de Cresilo y organizadas de más superficiales hasta más profundas, entendiéndose por superficiales aquellas que están más cerca de la superficie pial de la zona ventral del Resultados 67 diencéfalo. En las secciones más superficiales comienza a apreciarse una banda de células teñidas en lo que es el inicio de la formación del abultamiento de la superficie pial del prosómero 1 del diencéfalo y que caracteriza y distingue al núcleo Ectomamilar ya maduro. En la zona caudal del diencéfalo, zona más próxima al techo óptico (TO), existen agrupaciones de células teñidas formando bandas a lo largo de toda la sección que se corresponden con agrupaciones celulares pertenecientes a las diferentes vesículas que se observan en la imagen: mesencéfalo (parte inferior de la imagen), diencéfalo (toda la zona central, y telencéfalo (parte superior de la imagen). A medida que vamos hacia secciones más profundas (Fig.1 C), observamos la aparición de una gran masa redondeada moderadamente teñida que ocupa prácticamente toda la zona rostral del diencéfalo, el Tálamo (T). Hacia la zona caudal del diencéfalo, entre el techo óptico y el Tálamo se distingue un grupo de células ligeramente teñidas (señalado como GT) que se corresponden con el núcleo Griseum tectal En el estadio HH35 (9 días de incubación) se observa una sección superficial (Figura 2 A, B, C, D). la parte derecha de la imagen se corresponde con la zona caudal y la zona rostral se encuentra en la parte izquierda. Nos encontramos a nivel del hipotálamo (HT) y a este nivel observamos distintas agrupaciones teñidas que se corresponden con los siguientes núcleos ópticos o núcleos retinorecipientes: a la derecha del núcleo ectomamilar encontramos al ITO, núcleo que se identifica gracias a esa capa laxa de células grandes que abraza al núcleo Rotundus (Rt), a su lado se encuentra el SS (sinencefálico superficial) que se caracteriza porque se observa dos capas, una más profunda compacta con células grandes y otra más superficial laxa compuesta por células de pequeño tamaño y ya en la zona más caudal, el PE (pretectal externo) que está formado por células de gran tamaño, el cual se pone en contacto con el núcleo Ectomamilar. Resultados 68 A su vez, el núcleo Ectomamilar (Em) se localiza debajo de un tracto, el tracto tectotalámico y que en la imagen se observa como una zona con forma redondeada sin teñir. El quiasma óptico se observa en este tipo de cortes por debajo del hipotálamo. En la figura.2B observamos la longitud que alcanza el núcleo desde la zona más caudal (techo óptico) hasta la zona más rostral (hipotálamo). También destaca (en la figura. 2 B-D) que la intensidad de tinción del núcleo es homogénea en este estadio y las células se presentan como una gran masa en la que no se distingue sus diferentes tamaños. En la Figura 2C y D se aprecia que dentro del núcleo la tinción sigue un gradiente desde la zona central hasta el techo óptico, esto quiere decir, que la tinción se vuelve más intensa a medida que nos acercamos al techo óptico. En el embrión de HH36 (10 días de incubación), (Fig.3 A, B, C) se muestran tres imágenes de una misma sección horizontal corregida del diencéfalo. Las figuras.3 Ay B, muestran la misma imagen a distintos aumentos y la figura.3C, muestra el lado derecho de la sección. El núcleo Ectomamilar (Em) se localiza en la zona ventral, debajo del tracto tectotalámico. Este tracto se reconoce porque se encuentra en la zona central del diencéfalo con una forma redondeada sin tinción El crecimiento de este tracto produce una separación entre el núcleo Ectomamilar y el resto de núcleos ópticos. Esta zona se corresponde con el prosómero 2, el cual incluye las agrupaciones nucleares que se observan en la zona superior de la sección por encima del tracto tectotalámico identificadas como SS e ITO. El GV se corresponde con el prosómero 3 y el PE con el prosómero 1. En la figura.3A se aprecia al igual que ocurre en el estadio anterior que el núcleo Ectomamilar tiene su zona caudal más intensamente teñida que la zona rostral, mostrando un gradiente en la intensidad de tinción desde la zona caudal a la zona rostral. En la figura.3B se observa la misma imagen a mayor aumento, y aquí apreciamos con Resultados 69 mayor detalle que el centro del núcleo que se corresponde con la parte más rostral del núcleo, presenta una menor tinción. En la parte inferior de la imagen y muy próximo el núcleo Ectomamilar se observa el mesencéfalo (mes). Observando la imagen de un embrión HH38 (12 días de incubación) llegamos a lo que se denomina estadio intermedio del desarrollo, en esta etapa el diencéfalo muestra un aspecto relativamente maduro y ya es posible distinguir con claridad los diversos núcleos, los cuales ya están completamente formados y por lo tanto, a partir de aquí es cuando su citoarquitectura no varía (Fig.5 A, B, C). En la Figura 5 A se observa la mitad derecha del diencéfalo y se distingue en su zona ventral, parte inferior de la imagen, el núcleo Ectomamilar, que tiene una forma más redondeada debido a lo superficial del corte. Justo por encima de éste encontramos el característico tracto tectotalámico con su forma redondeada y sus fibras sin teñir. Este tracto separa el núcleo Ectomamilar de las otras agrupaciones nucleares que sí se encuentran teñidas. En esta sección superficial no se observa el núcleo Griseum tectal (GT) que separa el prosómero 1 del techo óptico. Se distingue en la zona caudal del diencéfalo, en la parte derecha, al lado del núcleo Ectomamilar las células teñidas del núcleo PE, el cual se expande y se pone en contacto con las células del núcleo Ectomamilar (Fig.5B). A la izquierda del PE (prosómero 1) en una posición ventral y hacia la izquierda de la imagen se observa unas grandes células teñidas que pertencen al núcleo SS. Este núcleo es característico porque se distinguen dos capas de células, una capa inferior laxa y otra superior compacta. En el mismo dominio (Prosómero2) a su izquierda en una posición que en la imagen se ve superior encontramos el ITO característico por sus grandes células y ya en la zona superior izquierda de la figura se observa el GV (prosómero 3), este núcleo se distingue porque está formado por tres capas. En esta Resultados 70 figura se observa con mayor claridad, que en anteriores estadios, las diferentes capas que forman los núcleos ópticos, esto se debe a que ya en este estadio se distinguen los neuropilos teñidos, con lo cual llegamos a distinguir los diferentes tamaños de las células que los forman. En la figura 5, B se observa a un mayor aumento la tinción de las células que forman el núcleo ectomamilar y cómo las células del núcleo PE llegan hasta él. La figura 5,C nos muestra una sección más profunda y ahí ya destaca la aparición de una agrupación celular que no fue observada en la sección más superficial, el Griseum tectal (GT) que separa al núcleo PE del techo óptico (OT). Como se indicó antes, desde HH38 (12 días de incubación) en adelante, la citoarquitectura del núcleo no varía, sin embargo la tinción se intensifica y se distinguen mejor los núcleos que muestran los diferentes tamaños de sus células. Gracias a que la forma de los núcleos se hace más clara observamos en el embrión en estadio HH39 (13 días de incubación) (Fig. 6A), cómo el núcleo cruza los tres prosómeros. Una porción del núcleo se encuentra en el dominio del prosómero 1, como se ha descrito anteriormente, las células del PE (Pretectal externo) tocan al nEM (núcleo ectomamilar), esto corresponde con la zona más caudal del núcleo por lo tanto más cercano al techo óptico. La zona media del núcleo se encuentra en el mismo dominio que los núcleos SS (sinencefálico superficial) e ITO (núcleo intesrticial) que pertenecen al prosómero 2. La zona más rostral del núcleo se corresponde con el prosómero 3 ya que en este dominio encontramos al GV (núcleo geniculado ventral). En un embrión en estadio HH44 (18 días de incubación) (Fig. 10 B) se observa con mayor aumento la mezcla de células de diferentes tamaños que conforman el núcleo Ectomamilar. Resultados 71 2. Expresión de la proteína Engrailed-2 durante el desarrollo del Núcleo Ectomamilar Para observar el desplazamiento de la población neuronal desde el nacimiento del núcleo en el estadio HH30/33 (6-7 días de incubación) hasta su posición final en el estadio HH38 (12 días de incubación), analizamos la expresión de la proteína engrailed-2. En el embrión de pollo de estadio HH34 (8 días de incubación) el diencéfalo está relativamente inmaduro y el núcleo Ectomamilar aún se encuentra en formación (Figura. 12 E, F) por tanto, son muy pocas las células encontradas en este estrato superficial.. Esta proteína es de origen mesencefálico, por lo que se observa en estas dos secciones la reacción intensa de las células inmunopositivas del mesencéfalo. Señalado con flechas, en la parte izquierda de ambas imágenes observamos una ligera inmunorreacción a la proteína En-2 en el lugar donde se localizará el futuro relieve del núcleo Ectomamilar. Se encuentra en la zona caudal del diencéfalo, en la imagen se observa por encima del techo óptico. En un embrión de estadio HH37 (11 días de incubación) se observa agrupaciones de células En-2 positivas localizadas en el mesencéfalo (mes) (Fig. 13). Por encima del mesencéfalo, en la parte derecha de la imagen observamos otro grupo de células inmunopositivas localizadas en la zona caudoventral del diencéfalo, estas células inmunopositivas pertenecen al núcleo Ectomamilar. Como se puede observar en esta imagen en la zona del diencéfalo no encontramos más células En-2 positivas, por lo que las células de los demás núcleos ópticos son En-2 negativas. Fijándonos en la intensidad de inmunoreacción de las células En-2 positivas dentro del núcleo, observamos que existe una mayor Resultados 72 expresión de las células de la zona caudal, es decir, la más cercana al techo óptico. En la figura 13F se observa con mayor detalle las células En-2 positivas. En la parte inferior de la imagen destacan las células En-2 positivas del mesencéfalo y en la zona superior también encontramos una gran cantidad de células que expresan la proteína, es el núcleo Ectomamilar. Destaca en esta imagen que el espacio entre ambos dominios, entre el mesencéfalo y el núcleo Ectomamilar, existe la presencia de células Engrailed positivas. Esto revela la existencia de un desplazamiento de las células del mesencéfalo hacia el diencéfalo y más concretamente al núcleo Ectomamilar, ya que es el único núcleo observado en el diencéfalo que expresa la proteína. En el embrión de estadio HH38 (Fig. 13K) se muestra también la expresión de la proteína Engrailed, y la migración de las células desde el mesencéfalo hasta el núcleo ectomamilar (su color es diferente porque la reacción de esta inmunohistoquímica se intensificó con sulfato amónico de níquel. Desde el estadio HH 38 (12 días de incubación) en adelante la expresión de la proteína en el núcleo continua con el mismo patrón, pero a medida que nos adentramos en estadios más maduros se hace más evidente qué células del núcleo expresan la proteína En-2 (Fig. 14 E, F). Las células del núcleo que presentan la mayor intensidad de expresión de la proteína engrailed-2 son aquellas que se encuentran localizadas más caudalmente dentro del núcleo y forman una concha alrededor de la zona central del núcleo. También existen células inmunopositivas en la parte ventral y rostral del núcleo pero se encuentran más dispersas. Esto se observa claramente gracias al abultamiento característico que presenta el núcleo y que ya en este estadio se encuentra totalmente desarrollado. Esta Resultados 73 agrupación de células En-2 positivas forma lo que se denomina una concha de células parvocelulares que rodea a las células centrales del núcleo que son inmunonegativas. Observamos en estos estadios más avanzados que ya están perfectamente definidos los diferentes núcleos retinorecipientes del diencéfalo y resalta que éstos son En-2 negativos y que las células inmunopositivas del núcleo ectomamilar no invaden los dominios de aquellos núcleos que se encuentran más próximos (Fig. 15 G, H, I). 3. Seguimiento temporal del nacimiento de las neuronas que van a formar el núcleo con Timidina Tritiada La timidina tritiada es un marcador de la proliferación celular acumulativo que permite precisar para cada área histogenética dónde se producen neuronas del núcleo Ectomamilar y los momentos en los que comienza y termina su periodo de producción. En el embrión inyectado en HH33 A221 (Fig. 23 A-F) se observa con la tinción de Cresil violeta la disposición de las células. En la parte más dorsal del núcleo existe una mayor cantidad de células grandes mientras que en la zona ventral las células son más pequeñas y dispersas. Fijándonos en el marcaje de Timidina Tritiada, son aquellas células en las que se observa el núcleo de color negro, existe dispersión de las células marcadas pero hay un gran número de estas células que se dirigen hacia la línea media. En la Fig 23 F. Las células marcadas están formando unas bandas alternas con células no marcadas. La gran mayoría de células marcadas Resultados 80 diferentes neuropilos con actividad AChE positiva. Y como se puede observar en la zona central del núcleo se observa una menor intensidad de actividad acetilcolinesterasa positiva, al contrario de lo que ocurre en la zona dorsocaudal y en la que se corresponde con la llamada concha parvocelular que rodea a la zona central y resulta tener una actividad más intensa. A medida que avanzamos en los diferentes estadíos la actividad se vuelve cada vez más intensa en el neuropilo del núcleo Ectomamilar pero no existe variación en el patrón de expresión (Figs 15-17, 19, 20). Figuras 82 4.Figuras Figuras 83 FIGURA 1 Sección horizontal de un embrión en estadio HH34 (8 días de incubación). Tinción cresil violeta. A. sección más superficial, de dorsal a ventral. Se observa (señalado con la flecha de la izquierda) en el borde apical una banda de células teñidas que se corresponden con los núcleos ópticos. B. Sección intermedia, al finalizar el tectum óptico (OT), encontramos el Griseum tectal (GT). C. Sección más profunda, muestra una voluminosa masa de células, el tálamo (T), que se corresponde con el prosómero 2. Rostral al Tálamo se encuentra la zona limitante intratalámica, límite interneuromérico entre p2 y p3. Caudal al Tálamo nos encontramos el prosómero 1, señalado con P1. Figuras 84 P1 GT T P2 Figuras 85 FIGURA 2 Sección horizontal de un embrión en estadio HH35 (9 días de incubación). Tinción cresil violeta. A. microfotografía en la que se observan los diferentes núcleos ópticos del diencéfalo. B. el núcleo Ectomamilar se localiza por debajo del tracto tectotalámico. C. sección en la que se observa en núcleo Ectomamilar en el abultamiento ventral del diencéfalo que lo caracteriza. D. El núcleo ectomamilar y los núcleos retinorecipientes. EM, núcleo ectomailar; GV, Geniculado ventral; HT, hipotálamo; ITO, núcleo intersticial del tracto óptico; PE, pretectal externo; R, rotundus; SS, sinencefálico superficial; to, tracto óptico. Figuras 86 Figuras 87 FIGURA 3 Sección horizontal de un embrión en estadio HH36 (10 días de incubación). Tinción cresil violeta. A. microfotografía que muestra el lado izquierdo del diencéfalo. Se observa el núcleo ectomamilar separado del resto de núcleos ópticos por el tracto tectotalámico. B. A mayor aumento se distingue una mayor intensidad de tinción en la porción más caudal del núcleo, hacia el techo óptico (OT) .C. microfotografía que muestra el lado derecho del diencéfalo observándose el núcleo Ectomamilar y resto de núcleos diencefálicos. EM, núcleo ectomailar; GV, Geniculado ventral; HT, hipotálamo; ITO, núcleo intersticial del tracto óptico; mes, mesencéfalo; PE, pretectal externo; R, rotundus; SS, sinencefálico superficial; to, tracto óptico. Figuras 88 FIGURA 4 Sección horizontal de un embrión en estadio HH37 (11 días de incubación). Tinción cresil violeta. A. microfotografía en la que se distinguen los distintos núcleos ópticos diencefálicos. B. se observa ambos lados del hipotálamo los núcleos ectomamilares debajo del tracto tectotalámico. En la parte inferior de distingue el quiasma óptico.C. Detalle del núcleo ectomamilar. EM, núcleo ectomamilar; GV, Geniculado ventral; HT, hipotálamo; ITO, núcleo intersticial del tracto óptico; mes, mesencéfalo; PE, pretectal externo; R, rotundus; SS, sinencefálico superficial; to, tracto óptico. Figuras 96 Figuras 97 FIGURA 8 Sección horizontal de un embrión en estadio HH42 (16 días de incubación). Tinción cresil violeta. A. Sección donde se observan los el núcleo ectomamilar y su situación con respecto al resto de núcleos ópticos. B. Mayor aumento de la sección anterior. C. mismo nivel de corte que la imagen A pero lado contrario. D. Detalle del núcleo Ectomamilar a mayor aumento. EM, núcleo ectomamilar; GV, Geniculado ventral; HT, hipotálamo; ITO, núcleo intersticial del tracto óptico; mes, mesencéfalo; PE, pretectal externo; SS, sinencefálico superficial; to, tracto óptico. Figuras 98 Figuras 99 FIGURA 9 Sección horizontal de un embrión en estadio HH43 (17 días de incubación). Tinción cresil violeta. A y C. microfotografías que muestra los distintos núcleos diencefálicos. B y D. Relación que existe entre el núcleo Ectomamilar y los núcleos ópticos que limitan con él. EM, núcleo ectomamilar; GV, Geniculado ventral; HT, hipotálamo; ITO, núcleo intersticial del tracto óptico; mes, mesencéfalo; PE, pretectal externo; R, rotundus; SS, sinencefálico superficial; to, tracto óptico. Figuras 100 Figuras 101 FIGURA 10 Sección horizontal de un embrión en estadio HH44 (18 días de incubación). Tinción cresil violeta. A. * Microfotografías que muestran el diferente tamaño de las células que componen el núcleo Ectomamilar B. localización del núcleo Ectomamilar C. Detalle de la imagen B. Figuras 102 * Figuras 103 FIGURA 11 Sección horizontal de un embrión en estadio HH45 (19 días de incubación). Tinción cresil violeta. A y C.microfotografías que muestran la localización del núcleo Ectomamilar y el resto de núcleos retinorecipientes. B y D. muestran las subpoblaciones de células que encontramos dentro del núcleo. Se distinguen las células parvocelulares, células de mayor tamaño, que forman la concha que rodea a las células del centro. EM, núcleo ectomamilar; GV, Geniculado ventral;; ITO, núcleo intersticial del tracto óptico; mes, mesencéfalo; PE, pretectal externo; SS, sinencefálico superficial; to, tracto óptico. Figuras 104 Figuras 105 FIGURA 12 Sección horizontal de un embrión en estadio HH34 (8 días de incubación). A, B, C y D. expresión de las células AChE + la inmunoreactividad es baja debido a que los núcleos están en proceso de formación. E y F. Expresión de la proteína en-2. Existe baja expresión de esta proteína en el diencéfalo, al contrario de lo que ocurre en el mesencéfalo. Figuras 112 Figuras 113 FIGURA 16 Imágenes de secciones horizontales corregidos del diencéfalo en un embrión en estadio HH 40 (14 días de incubación) mostrando tinción de tionina rojo-neutro (A-D) en el núcleo ectomamilar y núcleos y estructuras vecinas comparadas con la expresión de la proteína en-2 en el núcleo y mesencéfalo (E-G) y la intensidad de expresión de los núcleos diencefálicos (H-J). B: detalle de la imagen A que muestra una sección superficial del núcleo ectomamilar por debajo del tracto óptico. F: detalle de la imagen E, en la que se observa la expresión de la proteína engrailed-2 en el núcleo ectomamilar. G: muestra las células en-2 positivas del núcleo ectomamilar. EM, núcleo ectomamilar; GV, Geniculado ventral;; ITO, núcleo intersticial del tracto óptico; mes, mesencéfalo; PE, pretectal externo; SS, sinencefálico superficial; to, tracto óptico. Figuras 114 Figuras 115 FIGURA 17 Imágenes de secciones horizontales corregidos del diencéfalo en un embrión en estadio HH 41 (15 días de incubación) mostrando la intensidad de expresión de la acetilcolinesterasa en los núcleos ópticos (A,C, D) y con mayor detalle en el núcleo ectomamilar (B). EM, núcleo ectomamilar; GV, Geniculado ventral;; ITO, núcleo intersticial del tracto óptico; mes, mesencéfalo; PE, pretectal externo; SS, sinencefálico superficial; to, tracto óptico. Figuras 116 Figuras 117 FIGURA 18 Microfotografías de una sección horizontal de un embrión en estadio HH41 (15 días de incubación) que muestran la expresión de la proteína engrailed-2 en el núcleo ectomamilar (A-D). B: detalle de la imagen A que muestra una mayor acumulación de las células en-2+ en la zona caudal del núcleo. Las células que forman el centro del núcleo se observan menos inmunoreactivas que las células que forman la concha (C, D). Figuras 118 FIGURA 199 Imágenes de secciones horizontales corregidos del diencéfalo en un embrión en estadio HH 42 (16 días de incubación) mostrando tinción de tionina rojo-neutro (A-F) en el núcleo ectomamilar y núcleos ópticos comparadas con la expresión de la proteína engrailed-2 (G-L) en el núcleo ectomamilar y la intensidad de expresión de la acetilcolinesterasa (AChE) en los núcleos diencefálicos (M-O). H: detalle de la imagen G donde se muestra las células en-2 + del núcleo ectomamilar. N: detalle de la imagen M, donde se muestra la nueva terminoñogía de los núcleos (en rojo). EM, núcleo ectomamilar; GV, Geniculado ventral;; ITO, núcleo intersticial del tracto óptico; mes, mesencéfalo; PE, pretectal externo; SS, sinencefálico superficial; to, tracto óptico. Figuras 120 FIGURA 20 Imágenes de secciones horizontales corregidos del diencéfalo en un embrión en estadio HH 45 (19 días de incubación) mostrando tinción de tionina rojo-neutro (A, B) en el núcleo ectomamilar y núcleos ópticos comparadas con la expresión de la proteína engrailed-2 (E, F) en el núcleo ectomamilar y la intensidad de expresión de la acetilcolinesterasa (AChE) en los núcleos diencefálicos (C, D). F: detalle de la imagen E donde se muestra las células en-2 + del núcleo ectomamilar. EM, núcleo ectomamilar; GV, Geniculado ventral;; ITO, núcleo intersticial del tracto óptico; mes, mesencéfalo; PE, pretectal externo; SS, sinencefálico superficial; to, tracto óptico. Figuras 128 FIGURA 24 Expresión de la proteína Calretinina en una sección horizontal de un embrión en estadio HH34 (8 días de incubación). Imagen que muestra los paquetes de fibras calretinina positivas (CR+) que atraviesan el diencéfalo (B, C) comparadas con la tinción de Cresil violeta (A). En secciones más profundas comienza a distinguirse la expresión CR+ (D-G) en el Tálamo. Figuras 130 FIGURA 25 Expresión de la proteína Calretinina (CR) en una sección horizontal de un embrión en estadio HH36 (10 días de incubación). Se muestra la actividad calretinina positiva que existe en el núcleo ectomamilar y las fibras calretinina positivas (CR+) que limitan hipotálamo y el diencéfalo (AC)). D: detalle de la imagen C, que muestra la actividad CR+ en el núcleo ectomamilar. E: detalle a mayor aumento de los neuropilos CR+. EM, núcleo ectomamilar;; to, tracto óptico. Figuras 132 FIGURA 26 Expresión de la proteína Calretinina (CR) en una sección horizontal de un embrión en estadio HH37 (11 días de incubación) (A-C) y embrión en estadio HH 39 (13 días de incubación) (D-F). Se muestra la actividad calretinina positiva que existe en el núcleo ectomamilar y resto de núcleos ópticos. EM, núcleo ectomamilar; GV, Geniculado ventral; ITO, núcleo intersticial del tracto óptico; mes, mesencéfalo; PE, pretectal externo; SS, sinencefálico superficial; to, tracto óptico; HYP, hipotálamo; XSOi, decusación supraóptica. Figuras 134 XSOi FIGURA 27 Expresión de la proteína Calretinina (CR) en una sección horizontal de un embrión en estadio HH41 (15 días de incubación) (A-D).Se muestra la actividad calretinina positiva que existe en el núcleo ectomamilar y resto de núcleos ópticos (A,C). B y D: detalles de las imágenes Ay B respectivamente en la que se muestra las células CR+ del núcleo ectomamilar. EM, núcleo ectomamilar; GV, Geniculado ventral;; ITO, núcleo intersticial del tracto óptico; mes, mesencéfalo; PE, pretectal externo; SS, sinencefálico superficial; to, tracto óptico. Figuras 136 FIGURA 28 Expresión de la proteína Calretinina (CR) en una sección horizontal de un embrión en estadio HH43 (17 días de incubación) (A-E).Se muestra la actividad calretinina positiva que existe en el núcleo ectomamilar y resto de núcleos ópticos. E: detalle en la que se muestra las células CR+ del núcleo ectomamilar y cómo este se continúa con el PE. EM, núcleo ectomamilar; GV, Geniculado ventral;; ITO, núcleo intersticial del tracto óptico; mes, mesencéfalo; PE, pretectal externo; SS, sinencefálico superficial; to, tracto óptico. Discusión 144 Discusión 1. Citoarquitectura y origen del Núcleo Ectomamilar en el embrión de pollo Nuestros resultados corroboran lo anteriormente publicado sobre la citoarquitectura del núcleo Ectomamilar (MT, Puelles et al, 2007, Atlas) el cual se caracteriza por su relieve en la superficie caudoventral del Diencéfalo (Martínez de la Torre, 1985) y los diferentes tamaños de células que presenta el núcleo (Brecha y col, 1980). El núcleo Ectomamilar consiste en una masa nuclear central formada por una mezcla de células de diferentes tamaños y que se encuentra rodeada dorsalmente por una concha parvocelular, conocida anteriormente como núcleo periectomamilar o subnúcleo dorsal del BOR. También se corrobora con los datos obtenidos que el núcleo Ectomamilar se extiende a lo largo de los tres prosómeros. Para obtener nuestros datos se han realizado los cortes horizontales corregidos a nivel superficial e intermedio y la descripción se ha hecho siguiendo el atlas de cerebro de pollo de Puelles y col.( 2007) también se han descritos brevemente las masas de células vecinas con el mismo dominio neuromérico o las que cruzan rostral o caudal los límites interneuroméricos. De esta forma, se establecieron los límites entre los diferentes neurómeros o prosómeros y la relación que existe entre cada uno de los núcleos que se encuentran en los distintos prosómeros con el núcleo objeto de esta tesis, el núcleo Ectomamilar, confirmando de esta manera que el núcleo cruza efectivamente los tres prosómeros cuando alcanza la madurez. (Puelles y col., 2007). En nuestro estudio, en los primeros estadios del desarrollo, cuando aún el núcleo no ha finalizado su formación y no ha terminado la morfogénesis Discusión 145 secundaria, la observación del núcleo se dificulta por ello tomamos como referencias núcleos que se han originado más tempranamente como por ejemplo, el GT (García-Calero y col, 2002), el cual es una formación retinorecipiente que separa el pretecho (P1) del mesencéfalo. En este estadio no se distinguen los diferentes tamaños de las células del núcleo, esto se debe a que aún sus células están naciendo. Esta diversidad de formas citoarquitectónicas comienzan a aclararse progresivamente en los siguientes días de incubación. El principal cambio se encuentra en el incremento de la compresión rostrocaudal durante la formación de los distintos núcleos de P1 y P2. Esta compresión avanza como un gradiente desde la zona ventral a la dorsal. Puelles y col., 2007). En el estadio HH35 (9 días de incubación) el núcleo Ectomamilar se encuentra localizado debajo del Tracto óptico, ya en este estadio se observa la longitud que alcanza el núcleo desde la zona más caudal (techo óptico) hasta la zona más rostral (hipotálamo). En la zona más caudal se encuentra el antiguamente denominado Sinencéfalo o Prosómero 1 (P1), en su área comisural destaca el núcleo de células grandes PE (LM), en el área precomisural de P1se encuentra el SS en el que destaca su capa laxa con células pequeñas y una capa profunda compacta de células grandes y ventral a estos núcleos el nEM el cuál es continuo laterodorsalmente con el núcleo lateral, LM (Puelles et al 2007, Atlas). El área yuxtacomisural de P1 es prácticamente inapreciable ya que queda reducido en el estrato superficial a una línea (Ferrán y col., 2009). Lo mismo ocurre en el prosómero 2 en el cuál encontramos dorsalmente al nEm una fila de células grandes, en cortes más profundos se observa cómo abraza al núcleo Rotundus, esta fila de células se corresponde con el ITO. A medida que nos encontramos en estadios más avanzados del desarrollo, los diferentes dominios diencefálicos complican en gran medida la interpretación Discusión 146 de los datos debida a la deformación morfogenética que sufre (Ferrán JL y col., 2009). Podemos destacar, tras nuestras observaciones y basándonos en estas deformaciones morfogenéticas de cada uno de los prosómeros que los diferentes estratos del Prosómero3 no se comprimen tan fuertemente como lo hace el prosómero 2, donde los complejos nucleares intermedios se comprimen superficialmente en dirección rostrocaudal por las grandes masas superficiales del pretálamo y pretectum y esto produce que sus componentes superficiales queden reducidos , entre ellos el núcleo ITO (IGL, Puelles et al 2007, Atlas) que se extiende de una forma comprimida hacia la zona ventral hasta el núcleo Ectomamilar en cuya porción media (P2) parece contribuir, al igual que existe una continuidad entre el núcleo ectomamilar y el PE (Núcleo terminal lateral y dorsal, Puelles y col. 2007, atlas). En nuestro caso, gracias al abultamiento característico de la zona ventral del diencéfalo el núcleo ectomamilar se hace más fácilmente detectable. Como observaron Rendhal 1924 y Kuhlenbeck (1939) la histogénesis de la primera capa del manto de los diferentes prosómeros enseña pronúcleos (estrato neuronal inmaduro) en cada uno de sus dominios, cada uno de los cuales crece y se diferencia con o sin proceso de migración y al final emergen varios núcleos definitivos. Los núcleos que comparten un origen común tienden a mostrar características moleculares compartidas, aunque existen excepciones. La diferenciación neuronal ocurre entre los días 2-5 de incubación en el manto de los diferentes prosómeros (HH20-27; Puelles et al 1987), por tanto el periodo apropiado para examinar el estadio pronuclear de la capa del manto es en los estadios HH28-32 (6-7 días de incubación) el cual representa el punto final de la neurogénesis local (Crossland y Uchwat 1983, Martínez de la Torre 1987). Discusión 147 Nuestro estudio citoarquitectónico comienzan en un periodo posterior ya que los primeros datos han sido obtenidos a partir de HH34 (8 días de incubación), estadio intermedio del desarrollo, cuando el núcleo comienza a formarse y sus células aún no se encuentran situadas en su localización final. Según nuestros datos de neurogénesis, comenzar el estudio citoarquitectónico en los estadios HH28-32, dificulta la interpretación de los datos porque es en este periodo cuando el núcleo Ectomamilar aún no se ha originado por completo. Como ya se ha mencionado anteriormente el abultamiento característico donde se encuentra el núcleo facilita la interpretación. A medida que avanza el desarrollo esta deformación morfogenética junto con la maduración de los diferentes núcleos aclara la morfología de las estructuras nucleares. Neurogénesis de las células del Núcleo Ectomamilar El marcaje con timidina tritiada revela la duración del ciclo de las células progenitoras neurales. Tras la inyección en el embrión en desarrrollo las células en fase S (fase de síntesis) incorporan el marcador en su ADN y se desplazan hacia la superficie pial. Cuando las células marcadas pasan a la fase M son reconocibles como figuras mitóticas en la superficie ventricular. El número de células en fase M aumenta a medida que las células en fase S recorren el ciclo celular. Cuando estas células completan la fase M y pasan a G1 y luego a fase S, se alejan de la superficie ventricular y ya no se cuentan como figuras mitóticas. Cuando las primeras células acaban su segunda fase S y vuelven a entrar en la mitosis, aumenta otra vez el número de células mitóticas marcadas y se observa un segundo valor máximo al cabo de 12 horas. El marcaje con timidina pone de manifiesto un progresivo incremento en el número de células marcadas mientras éstas se dividen. La timidina sólo está disponible para su incorporación durante la primera hora después de la Discusión 148 inyección. Además de la información sobre el ciclo celular, la timidina también sirve para determinar los puntos temporales precisos de la embriogénesis en que se generan las neuronas y la glía, es decir, cuándo de volvieron post mitóticas. Mientras las células progenitoras se están dividiendo activamente sintetizan ADN e incorporan la timidina. Sin embargo, dado que sólo se dispone de timidina para unas cuantas horas, las células progenitoras que siguen dividiéndose diluyen su marcador con el tiempo. Por contraste, las células que se retiran del ciclo celular poco después y se vuelven post mitóticas permanecen fuertemente marcadas. Por tanto, las neuronas post mitóticas generadas (nacidas) en el plazo de un día tras la inyección presentarán núcleos claramente marcados y las generadas en fases posteriores estarán marcadas con menor intensidad. En general, en la misma región se forman antes las neuronas grandes que las neuronas pequeñas. (Sanes D, 2002). Analizamos los patrones de Neurogénesis en el núcleo Ectomamilar del embrión de pollo que habían recibido Timidina Tritiada en los estadíos HH30, HH31 y HH33 y con nuestros datos podemos concretar que el nacimiento de las primeras neuronas del núcleo son en los estadios HH30/33. Al observar el embrión que fue inyectado en el estadio HH33 (Fig. 23) las células de mayor tamaño las encontramos en la zona dorsal del núcleo y las más pequeñas en la zona ventral. Las células que se encuentran marcadas son las de mayor tamaño y están en su mayoría localizadas en la región caudal del núcleo, esto quiere decir que ya habían nacido cuando el embrión fue inyectado. Para descubrir cuándo estas células grandes nacieron, debíamos verlas desmarcadas en embriones inyectados más jóvenes. Observando estadios más pequeños podemos conocer en qué momento nacieron estas células grandes, esto quiere decir que en los estadios Discusión 149 tempranos las neuronas de nueva formación están marcadas y a medida que se desarrolla el embrión estas células se dividen y sus hijas llevan la timidina de la madre y por eso se observa un mayor número de células marcadas aunque de una forma más diluida. Observando el embrión inyectado en HH30 (Fig. 21), las células del núcleo se encuentran prácticamente sin teñir, esto quiere decir que aún no habían nacido cuando el embrión fue inyectado. Así que al observar el estadio intermedio HH31 (Fig. 22) se observa que hay un mayor número de células marcadas que en HH30 y esto nos hace pensar que estaban naciendo en el momento de la inyección. Las células nacidas en HH30 ya en HH33 no se encuentran marcadas 2. Migración de las células del Núcleo Ectomamilar Patrón de Marcaje la proteína En-2 en el núcleo ectomamilar durante el desarrollo embrionario del pollo Los genes Engrailed, En1 y En2, son genes homeobox que se expresan durante el desarrollo del SNC de vertebrados en dominios espaciales definidos en las presuntivas regiones influenciadas por el IsO (núcleo Istmoóptico): el mesencéfalo y rombencéfalo rostral, sugiriendo su implicación en el desarrollo de estas áreas. Los genes En fueron identificados originalmente en base a su homología con el gen de Drosophila engrailed (en), perteneciente a la clase de genes denominada de polaridad de segmento (Joyner y Martin, 1987). El gen en de Drosophila tiene múltiples funciones entre las cuales se encuentra la organización de segmentos y el desarrollo del SNC de la mosca. En ratones, la expresión de los genes En comienza temprano en el desarrollo, con una expresión parcheada inicial que posteriormente se fusiona para posicionarse en el prospectivo territorio del IsO (McMahon y col., 1992). En el cerebro adulto, ambos genes presentan una Discusión 150 expresión coordinada en núcleos motores del puente y sustancia negra y En2, además, aparece en células del cerebelo. Estudios en ratones mutantes han demostrado que los miembros de la familia Engrailed son fundamentales para el correcto desarrollo de estructuras derivadas de los territorios mesencefálico y cerebelar. Ratones mutantes para el gen En2, una mutación que es viable, muestran una reducción del tamaño del cerebelo y del colículo inferior (Millen y col., 1994). Se ha demostrado que el fenotipo de este mutante no tiene mayores consecuencias funcionales, debido, posiblemente, a una redundancia funcional parcial con el gen En. Ratones mutantes homocigóticos para el gen En1 mueren en el nacimiento, presentando múltiples malformaciones, demostrando que En1 es fundamental para el desarrollo y regionalización del SNC, y que en especial es crítico para el desarrollo de las estructuras mesencefálicas y cerebelares (Wurst y col., 1994). Diversas investigaciones han demostrado que los genes En son esenciales para la regionalización de los territorios mesencefálico-rombencefálico (Joyner, 1996; Liu y Joyner, 2001; Wurst y Bally-Cuif, 2001, y referencias del IsO). La expresión temprana de la proteína En-2 (comienza en HH 9) está restringida a una porción del tubo neural que contiene el primordio del cerebelo, la región ístmica y el Grises mesencefálico y forma un gradiente decreciente caudalmente y rostralmente desde un punto alto localizado alrededor de la constricción entre cerebro medio y posterior. S. Millet y Alvarado-Mallart (1990) con experimentos pollo/codorniz sugieren que el gen En-2 podría estar implicado en la especificación mesencefálica y cerebelar y que su expresión no está restringida a células neuroepiteliales, sino que se han observado en neuronas postmitóticas a través del desarrollo del ratón y alguna vez en ratón adulto, donde podría estar envuelto en diferentes mecanismos tales como diferenciación de neuronas o establecimiento de proyecciones neuronales. Discusión 151 Según nuestros datos, a medida que avanzamos en los estadios, va quedando más patente que las células que conforman el núcleo central del Ectomamilar son químicamente diferentes a las células que las rodean formando esa concha, tanto por la diferencia del tamaño de sus células, como la diferencia química que existe entre ellas y con las masas nucleares próximas al núcleo. En embriones de estadios intermedios se observa cómo existe migración desde la zona del mesencéfalo hasta la zona rostroventral del núcleo que se corresponde con P2 y P3 (p2MT y p3MT, Puelles et al, 2007, Atlas), el abultamiento del núcleo Ectomamilar nos facilita la observación de una población de células En-2 positivas que forma una concha de células parvocelulares alrededor de lo que se denomina el núcleo central o Em propiamente dicho (nMT). Este marcaje tan heterogéneo dentro del núcleo confirma la diferencia química que existe entre las células de la zona central del núcleo y las células que forman la concha parvocelular. Las células parvocelulares de la concha son más inmunorreactivas al anticuerpo que las células centrales del núcleo en el cuál hay una mezcla de células de diferentes tamaños. En esta zona central encontramos células inmuno positivas y células inmuno negativas. También son altamente inmunorreactivas las células que se encuentran en la zona más caudal del núcleo. Esta diferencia de marcaje hace pensar que las células del centro del núcleo proceden de un origen diferente al de las células que conforman la concha parvocelular. El núcleo al contener diferentes tamaños y al ser químicamente diferente lleva a pensar que cada grupo de células según su tamaño proviene de un origen diferente. Las células parvocelulares que forman la concha y parte de la zona central parece ser que tienen su origen en el mesencéfalo ya que en las diferentes figuras podemos observar que existe una migración desde el mesencéfalo hasta el núcleo. Esto concuerda con lo publicado por Ferrán et al, 2009 en el que propone que el núcleo Em maduro del P1 (P1MT) consiste en una porción nuclear densa, MT propio con mezcla de células de diferentes tamaños, el Discusión 152 cuál está cubierto por una concha parvocelular, MTSh, (anteriormente conocido como núcleo periectomamilar o subnúcleo dorsal del BOR). Según sus estudios las células Pax-7 positivas se encuentran dentro de esta concha que rodea al centro del núcleo, cuyas células son Six-3 positivas y Pax-7 negativas. Según Ferrán, las células Six-3 positivas son elementos migrados desde un origen cercano al dominio de la placa basal, pero esto aún debe ser investigado. En las diferentes figuras donde se muestra las células inmunopositivas del núcleo Ectomamilar se observa cómo el núcleo se continúa laterodorsalmente con el PE (LT, Puelles et al 2007, Atlas) sin que sus células invadan los dominios del este núcleo, cuyas células son inmunonegativas al igual que el resto de núcleos retinorecipientes y/o tectorecipientes. Esto también confirma que aunque ambos núcleos forman el sistema óptico basal y tienen proyecciones similares, químicamente son diferentes ya que su origen es diferente. 3. Distribución de las células del Núcleo Ectomamilar. a) CB y CR La calretinina (CR) y la calbindina D-28K (CB) pertenecen a la gran familia EFhand calcium-binding proteins, proteínas ligadoras de calcio (CaBP), donde también se encuentra la parvalbúmina (PV). Las CaBP son de gran utilidad en neurociencia por su papel como marcadores neuronales. Se encuentran en diferentes neuronas que pertenecen a un mismo grupo celular o a grupos diferentes. Por ejemplo, la CB y la CR se coexpresan en un subgrupo cuantitativamente importante de las neuronas dopaminérgicas en la sustancia Discusión 153 nigra compacta, mientras que la PV se encuentra en la mayor parte de las neuronas GABAérgicas de la sustancia nigra reticular (González-Hernández y Rodríguez, 2000). Su alta solubilidad les permite estar presentes en el citosol así como en dendritas distales y axones e inclusive en los botones sinápticos. Estas características son las idóneas para estudiar la morfología celular, la integración sináptica y la distribución de poblaciones neuronales dentro del Sistema nervioso. Estudios previos muestran que las proteínas ligadoras de calcio intracelular se encuentran en diferentes poblaciones celulares del sistema nervioso de aves y que en general muestran un patrón similar de distribución en diferentes especies por lo que se han utilizado como marcadores de poblaciones neuronales concretas en diferentes especies a lo largo de la escala filogenética. (Santana y col, 2003). Nuestros resultados indican que cada proteína ligadora de calcio muestra un patrón espaciotemporal de expresión distinto durante el desarrollo del N. Em. Ambas proteínas se expresan en los estadíos iniciales del desarrollo del núcleo pero con distinta intensidad. La CR y la CB están presentes en el diencéfalo desde etapas tempranas del desarrollo embrionario aunque la abundancia de las células CR+ en mucho mayor que las células CB+. No existe ningún tipo de paralelismo de los patrones de expresión de CB y CR durante el desarrollo del diencéfalo y particularmente en el núcleo EM. La expresión de la actividad CB en el núcleo ectomamilar durante el desarrollo es prácticamente nula, aunque existen cierto número de células dispersas en el núcleo. En cambio, la expresión de la actividad CR es mucho más intensa desde el principio, ésta es la proteína ligadora de calcio más abundante y la que se expresa más temprano en el