Estudio del impacto de la sobreexpresión de los genes MN1 y BAALC en una serie de pacientes con leucemia mieloblástica aguda homogéneamente tratados con un esquema de inducción con idarrubicina y citarabina

1 Estudio del impacto de la sobreexpresión de los genes MN1 y BAALC en una serie de pacientes con LMA homogéneamente tratados con un esquema de inducción con idarrubicina y citarabina 2 . 3 Índice. Índice. ------------------------------------------------------------------------------------------------------- 3 Resumen de abreviaturas más frecuentes --------------------------------------------------------- 6 1.- Introducción. ------------------------------------------------------------------------------------------ 9 2.- Revisión del problema: Estado actual de la Leucemia Mieloblástica Aguda ---------- 13 2.1 Leucemia Mieloblástica Aguda (LMA). Concepto y epidemiología. ----------------- 13 2.1.1 Definición. ---------------------------------------------------------------------------------- 13 2.1.2 Antecedentes históricos. --------------------------------------------------------------- 13 2.1.3 Etiología de la Leucemia Mieloide aguda. ------------------------------------------ 20 2.1.4 Epidemiología. ----------------------------------------------------------------------------- 24 2.1.5 Clasificación. ------------------------------------------------------------------------------ 26 2.1.6 Factores pronósticos. -------------------------------------------------------------------- 27 2.1.6.1 Dependientes del paciente. ------------------------------------------------------ 27 2.1.6.2 Dependientes de la enfermedad. ----------------------------------------------- 29 2.1.6 Bases de tratamiento. ------------------------------------------------------------------- 35 2.1.6.1 Tratamiento de inducción. -------------------------------------------------------- 36 2.1.6.2 Terapia post remisión. Tratamiento adaptado al riesgo. ------------------ 37 2.2 Patobiología de la LMA. Modelo actual de leucemogénesis ------------------------- 41 2.2.1 Regulación de la hematopoyesis. ----------------------------------------------------- 41 2.2.1.1 Visión global de la mielopoyesis. ------------------------------------------------ 41 2.2.1.2 Reguladores de la mielopoyesis. ------------------------------------------------ 43 2.2.1.2.1 Factores de Transcripción. Genes HOX. ------------------------------------- 43 2.2.1.2.2 Factores de crecimiento hematopoyéticos. -------------------------------- 48 2.2.1.2.3 Mecanismos epigenéticos. ARN de interferencia (miRNA).------------- 50 2.2.2 Fisiopatología y bases moleculares de la LMA. ------------------------------------ 53 2.2.2.1 Proceso Secuencial. Evidencia a favor de leucemogénesis como modelo multi-step. -------------------------------------------------------------------------------------- 54 2.2.2.2 Mutaciones en LMA ---------------------------------------------------------------- 59 2.2.2.2.1 Mutaciones en NPM1. ----------------------------------------------------------- 59 2.2.2.2.2 Factores de transcripción: fusiones y mutaciones. ----------------------- 61 2.2.2.2.3 Maquinaria epigenética del ADN. Genes de metilación y modificadores cromatina. -------------------------------------------------------------------------------------- 62 2.2.2.2.4 Supresores tumorales. ---------------------------------------------------------- 69 2.2.2.2.5 Mutaciones en genes de vías señalización celular. ----------------------- 70 2.2.2.2.6 Mutaciones en la maquinaria de splicing. ---------------------------------- 72 2.2.2.2.7 Mutaciones en el complejo de la cohesina. -------------------------------- 73 4 2.3 Sobreexpresión de genes en LMA. Utilidad de la sobreexpresión de genes en el manejo clínico de LMA. Arrays de expresión y clasificación. Los genes MN1 y BAALC. ---------------------------------------------------------------------------------------------------------- 73 2.3.1 Expresión de genes. Técnicas de estudio en ARNm ------------------------------ 73 2.3.2 Perfiles de expresión: Gene Expression Profile (GEP) en LMA ----------------- 75 2.3.3 Sobreexpresión de genes en LMA ---------------------------------------------------- 78 2.3.4 MN1 ----------------------------------------------------------------------------------------- 81 2.3.5 BAALC --------------------------------------------------------------------------------------- 91 3.- Fundamento del presente trabajo. Utilidad de la sobreexpresión de genes MN1 y BAALC en el manejo de los pacientes con LMA ------------------------------------------------- 97 4.- Objetivos -------------------------------------------------------------------------------------------- 101 4.1 Objetivo principal: ---------------------------------------------------------------------------- 101 4.2 Objetivos secundarios: ----------------------------------------------------------------------- 101 5.- Material y métodos ------------------------------------------------------------------------------- 103 5.1 Planteamiento metodológico y población a estudio ---------------------------------- 103 5.2 Procedimientos técnicos--------------------------------------------------------------------- 103 5.2.1 Diagnóstico de LMA --------------------------------------------------------------------- 103 5.2.2 Análisis citogenético y FISH. ----------------------------------------------------------- 105 5.2.3 Estudio de citometría. ------------------------------------------------------------------ 105 5.2.4 Estudios moleculares. ------------------------------------------------------------------ 106 5.2.4.1 Extracción de ácidos nucleicos y síntesis de ADNc. ------------------------ 106 5.2.4.2 Mutaciones NPM1 y FLT3. ------------------------------------------------------- 107 5.2.4.3 Estudio de sobreexpresión de los genes MN1 y BAALC ------------------- 108 5.3 Definiciones y variables a estudio. -------------------------------------------------------- 109 5.3.1 Clasificación LMA ------------------------------------------------------------------------ 109 5.3.2 Clasificación por tratamiento --------------------------------------------------------- 109 5.3.3 Sobreexpresión de los genes a estudio MN1 y BAALC -------------------------- 109 5.3.4 Definición de las respuestas obtenidas. -------------------------------------------- 111 5.3.5 Definición de tiempos de supervivencia. ------------------------------------------- 112 5.4 Método de recogida y explotación de datos. ------------------------------------------ 113 6.- Resultados. ----------------------------------------------------------------------------------------- 115 6.1 Análisis descriptivo de la serie. Características demográficas, biológicas y terapéuticas. ---------------------------------------------------------------------------------------- 115 6.2 Características de las variables a estudio ------------------------------------------------ 120 6.2.1 Características descriptivas y analíticas de la variable expresión MN1 en relación al resto de variables. ---------------------------------------------------------------- 120 5 6.2.2 Características descriptivas y analíticas de la variable expresión BAALC en relación al resto de variables. ---------------------------------------------------------------- 123 6.3 Análisis bivariante y mutivariante de la probabilidad de fracaso a la quimioterapia de inducción, de supervivencia global y libre de progresión. --------- 126 6.3.1 Análisis respecto a la remisión completa y persistencia ------------------------ 126 6.3.1.1 Influencia de MN1 y BAALC sobre la RC y persistencia -------------------- 129 6.3.1.2 Modelos multivariantes respecto a la influencia de las variables categóricas en la persistencia tras inducción. ----------------------------------------- 140 6.3.2 Estudio de supervivencia global de la serie. --------------------------------------- 145 6.3.2.1 Impacto de las variables MN1 y BAALC en la supervivencia global ----- 152 6.3.3 Estudio de supervivencia libre de progresión. ------------------------------------ 156 6.3.3.1 Influencia en la supervivencia libre de progresión de las variables MN1 y BAALC ------------------------------------------------------------------------------------------ 158 6.4 Estudio de los niveles de expresión de MN1 y BAALC medidos tras primer ciclo de quimioterapia. Frecuencia de RC e impacto pronóstico. ------------------------------ 160 6.4.1 Asociación del nivel de expresión de MN1 y BAALC tras el primer ciclo de quimioterapia con la respuesta morfológica. ------------------------------------------- 163 6.4.2 Impacto pronóstico de los niveles de expresión de MN1 y BAALC medidos tras primer ciclo de inducción en la supervivencia global ---------------------------- 163 6.5 Patrones de expresión de los genes MN1 y BAALC medidos en el momento de la recaída de los pacientes. Estudio descriptivo. ----------------------------------------------- 170 7.- Discusión de resultados. ------------------------------------------------------------------------- 176 7.1 Características generales de la serie. ----------------------------------------------------- 176 7.2 Características globales de las variables MN1 y BAALC ------------------------------- 180 7.2.1. Variable MN1 ---------------------------------------------------------------------------- 180 7.2.2 Variable BAALC ------------------------------------------------------------------------- 182 7.2.3 Asociación entre MN1 y BAALC ----------------------------------------------------- 183 7.3 Análisis de MN1 y BAALC al diagnóstico y asociación con persistencia de la enfermedad tras primer ciclo de quimioterapia. ------------------------------------------- 184 7.4 Impacto de MN1 y BAALC al diagnóstico en la probabilidad de supervivencia global y libre de progresión. --------------------------------------------------------------------- 188 7.5 Análisis de niveles de MN1 y BAALC post primera quimioterapia de inducción. --------------------------------------------------------------------------------------------------------- 191 7.6 Análisis de MN1 y BAALC en el momento de la recaída. ---------------------------- 195 7.7 Limitaciones del presente trabajo. -------------------------------------------------------- 197 7.8 Vías de potencial desarrollo futuro. ------------------------------------------------------ 197 8.- Conclusiones: -------------------------------------------------------------------------------------- 199 9.- Bibliografía ------------------------------------------------------------------------------------------ 202 6 Resumen de abreviaturas más frecuentes ADN: Ácido desoxirribonucleico. ARN: Ácido ribonucleico. Alo-TPH: Trasplante alogénico progenitores hematopoyéticos. AUC: Área bajo la curva. CFU: unidad formadora de colonias. CFU-GEMM: Célula formadora de colonias Mieloide-monocitica-eritroidemagacariocitica. CFU-L: célula formadora de colonias linfoides. CG: Citogenética. DS: Desviación estándar. ELN: European LeukemiaNET. EMR: Enfermedad mínima residual. FT: Factor de transcripción. FC: Factor de crecimiento. GEP: Perfil de expresión génica. HR: hazard ratio. HSC: Célula madre hematopoyesis. IC: Intervalo de confianza. LMA: Leucemia mieloblástica aguda. LMC: Leucemia mieloide crónica. LLA: Leucemia linfoblástica aguda. MO: Médula ósea. NMPC: Neoplasia mieloproliferativa crónica. P50: percentil 50. PCR: reacción en cadena de la polimerasa. PETHEMA: Programa de estudio y tratamiento de hemopatías malignas. RC: remisión completa. RR: Riesgo relativo. SG: Supervivencia global. SLP: Supervivencia libre de progresión. 7 SP: Sangre periférica. SMD: síndrome mielodisplásico. TAPH: Trasplante autólogo de progenitores hematopoyéticos. TCGA: The Cancer Genome Atlas Research Network. VPP: valor predictivo positivo. VPN: valor predictivo negativo. 8 Introducción 9 1.- Introducción. La leucemia mieloblástica aguda (LMA) constituye una neoplasia de progenitores hematopoyéticos comprometidos hacía la línea mieloide de la hematopoyesis, y aparece como consecuencia de alteraciones genéticas y epigenéticas que alteran procesos claves en el desarrollo de la mielopoyesis como son la auto-renovación, proliferación y diferenciación de la célula stem hasta los estadios madurativos finales. (Arber et al., 2008; Faderl & Kantarjian, 2012). El avance en el conocimiento en su patobiología ha puesto de manifiesto que se trata de una enfermedad tremendamente compleja y heterogénea, con más de 100 alteraciones citogenéticas recurrentes descritas, con una media de 13 mutaciones en regiones codificantes por paciente, (Cancer Genome Atlas Research, 2013) y que se expresa clínicamente con una situación de fallo medular, con alta prevalencia de procesos infecciosos y diátesis hemorrágica sobre los que si no se interviene, acaba en un curso clínico fatal de rápida evolución Según la información disponible de los registros nacionales, en especial del SEER de EEUU (Dores, Devesa, Curtis, Linet, & Morton, 2012)y del Registro Nacional de Tumores de Suecia (Juliusson et al., 2009), la edad media de presentación de la LMA se sitúa a partir de la sexta década de la vida, entre los 63 y los 67 años según la fuente consultada, con una muy baja incidencia en los menores de 10 años, que va aumentando progresivamente con los años de vida ganados, de tal manera que la prevalencia pasa de 3,5 casos por 100000/año a los 50 años de edad hasta los 35 casos por 100000/ año para mayores de 90 años (Faderl & Kantarjian, 2012). En definitiva, y citando a Kenneth Miller en la introducción al tratamiento de la LMA en la cuarta edición del Manual Hoffman de Hematología, desde hace ya más de diez años debemos asumir que la “la LMA no es una enfermedad única sino un conjunto heterogéneo de entidades neoplásicas caracterizadas por la proliferación y acumulación de células hematopoyéticas inmaduras”(Kenneth Miller, 2004), por lo Revisión del problema: Estado actual de la LMA 16 Es decir, en estos dos puntos, define con claridad y en base a la simple observación del microscopio las bases que ha sustentado la patogenia de la LMA hasta fechas recientes: La ventaja proliferativa y el bloqueo en la maduración de la mielopoyesis. A partir de este y otros autores se empieza ya a distinguir la presencia de leucemias agudas y de formas crónicas, por lo que podemos afirmar que entre los años 20 y 30 del pasado siglo concluye el entramado argumental que lleva a la definición como entidad de la LMA, casi 90 años después de ser introducido el término leucemia por R. Virchow y J.H. Bennett. Y si lento ha sido el reconocimiento como entidad nosológica propia, más ardua ha sido la tarea de desarrollo de terapias eficaces para la LMA. Si los trabajos y autores descritos, y otros muchos aquí no reseñados, eran prolíficos en las interpretaciones morfológicas y hábiles en la comprensión de las bases de la enfermedad, esto no iba de la mano de avances en el soporte terapéutico. Hasta la década de los 40, las únicas opciones disponibles eran la Solución de Fowler, un remedo empírico para las fiebres creado a finales del siglo XVIII, con el que se observaba mejorías sintomáticas y temporales en algunos pacientes, siempre limitadas en el tiempo y la posibilidad de la radioterapia, que se hacía de manera casi constante sobre el lecho esplénico, que en manos de algunos grupos conseguía aumentar la supervivencia de las leucemias crónicas (Naegeli, 1934) y en combinación con la solución de Fowler muy discretas ventajas en las variantes agudas. Sin embargo, merece la pena detenernos en una pequeña anécdota. Otto Naegeli, también pasa por ser el primer autor en describir una curación de LMA, tal y como se muestra en el gráfico adjunto reproducido de la 5ª edición de su manual de Hematología Revisión del problema: Estado actual de la LMA 17 Figura 2.1 Esquema de evolución de un paciente con LMA y tratamiento con solución de Fowler. Tomado de O. Naegeli La base del tratamiento de este caso, acontecido a finales de los años 20 del siglo pasado consistía en el principio activo de la Solución de Fowler: Trióxido arsénico. Con los conocimientos actuales es tentador especular, que probablemente estaríamos ante la primera curación de una leucemia promielocítica aguda. Hemos de esperar hasta la llegada de la década de los 40 para ver surgir el nacimiento de la quimioterapia como tal. Es conocido que los primeros trabajos se realizaron en base a mostazas nitrogenadas y que su primera aplicación clínica fue en el contexto de los linfomas, en especial, del linfoma de Hodgkin (Goodman et al., 1948) donde en 1946 se observaron respuestas iniciales prometedoras con el uso de estos compuestos, pero es en 1948 cuando se publica el primer trabajo especifico dirigido hacia pacientes con leucemias agudas. El trabajo fue dirigido Sidney Farber, quien siendo conocedor de los avances en la fisiología de la hematopoyesis, en particular de la importancia de los metabolitos del ácido fólico, plantea la hipótesis experimental que el uso de este puede contribuir a recuperar el equilibrio inicial a favor de la hematopoyesis sana en perjuicio de los blastos leucémicos. Los resultados iniciales fueron desalentadores pero esto dio pie a plantear la hipótesis contrario mediante el uso de inhibidores del ácido fólico puede inhibir la ventaja proliferativa de los blastos leucémicos (Mukherjee, 2011) Revisión del problema: Estado actual de la LMA 18 La fase experimental fue rápida y el 3 de junio de 1948 se publicaba en el New England Journal of Medicine el trabajo que por primera vez documentaba la presencia de remisiones en el manejo de pacientes con leucemias agudas. Figura 2.3 Imágenes de la médula ósea de uno de los pacientes antes y después de ser tratados con aminopterina. Extraída del artículo original. Farber, S. et al (1948) El trabajo recurría a fotografías de la médula y a la descripción de la evolución clínica y de las analíticas de los pacientes para poder sostener el impacto del hallazgo (Sidney Farber, Louis Diamond, Robert Mercer, Robert Sylvester, & Wolff, 1948), y casi inmediatamente, aparecía el siguiente hito, el descubrimiento de la utilidad de los esteroides en las leucemias infantiles (Piller, 2001). Pero a pesar de que durante la década de los 50 comienza una carrera de síntesis de nuevos fármacos, las armas terapéuticas disponibles hasta bien entrados los años 60 muestran una eficacia limitada en la LMA tal y como se recoge en el cuadro adjunto. (Farreras, 1963). Figura 2.4 Esquema de abordaje diagnóstico y terapéutico de las leucemias agudas publicado en Patología y Clínica Médicas. Pedro Farreras. 3ªd 1963. Revisión del problema: Estado actual de la LMA 19 De tal manera que en 1966, William Damesheck concluía: “dudamos que cualquiera de los agentes antileucémicos disponibles representen un avance significativo en el manejo de la LMA (Damesheck, 1966) Sin embargo los cambios eran inminentes. A finales de la década de los 60, y a lo largo de los 70, el germen del grupo cooperativo CALGB, lidera trabajos con nuevos fármacos que por primera vez mostrarán resultados esperanzadores en LMA. En 1968 se publican los resultados iniciales del tratamiento con citarabina en monoterapia para la LMA (Rose Ruth Ellison, 1968) y en 1973, su experiencia con daunorrubicina, un antibiótico obtenido por investigadores franceses desde cultivos de cepas de Actinomyces, y que desde 1967 había sido documentada su actividad en LMA (Marise Weil, Cuttner, & Silver, 1973) estos hallazgos dieron pie inmediatamente a las primeros ensayo exploratorios usando combinaciones, para concluir publicando en 1981 lo que continúa siendo el estándar de tratamiento de inducción para la LMA en nuestros días: La combinación de una infusión continua durante 7 días de Ara-C junto con tres días de administración en bolo de daunorrubicina (CD Bloomfield, Prager, KR Rai, & Henry, 1981; Fernandez, 2010) Figura 2.5 Resultados en supervivencia del trabajo inicial del CALGB según respuesta morfológica alcanzada. Tomado K Rai et al Blood 1981 Además, desde sus publicaciones en 1968, estos autores introducen el concepto de Remisión completa y lo definen de manera conjunta con las cifras en sangre periférica (< de 5% de blastos en el aspirado de médula ósea, más de 1500 neutrófilos, Revisión del problema: Estado actual de la LMA 20 hemoglobina >11 gr/dl), criterios que con discretas modificaciones se mantienen hoy en día de plena vigencia (Cheson et al., 2003). Estos hallazgos terapéuticos son correlativos con los avances en los esfuerzos por homogeneizar los criterios diagnósticos, de tal manera que en 1976 se publican los criterios diagnósticos basados en los hallazgos morfológicos propuestos por el grupo cooperativo FAB, (Bennett et al., 1976) quedando definidas las leucemias agudas, en tres subtipos de leucemias linfoblásticas agudas y en seis las leucemias mieloblásticas agudas. De tal manera que a comienzos de la década de 1980, momento en el que damos por finalizada esta introducción ya existen criterios uniformes para definir, diagnosticar y clasificar la LMA, y se dispone de protocolos terapéuticos específicos para su abordaje. Resumen de los principales hitos en la evolución de la LMA: 1847. J.H Bennet, R Virchow: concepto de Leucemia 1880-1890 Paul Erlich: Leucemias mieloides y linfoides 1900-1930: Otto Naegeli, Paul Ernest: Enfermedad de progenitores. Mieloblastos. Leucemias agudas vs leucemias crónicas 1948: Sidney Farber: Primera quimioterapia específica para leucemias agudas 1968: Rose Elliot et al: Citarabina. Primera quimioterapia eficaz para LMA 1968: Concepto de RC validado por el Acute Leukemia Group B 1978: Clasificación FAB 1980: Congreso ASH: 7+3 tratamiento de elección como inducción. 2.1.3 Etiología de la Leucemia Mieloide aguda. “(…) al final del congreso Americano de Hematología, noviembre de 1959, el presidente invitó a los 600 concurrentes a que expresaran su opinión acerca de la naturaleza etiológica del proceso (LMA). Obtuvo 26 votos a favor de las radiaciones, 15 a favor Revisión del problema: Estado actual de la LMA 21 agentes químicos, 15 factores genéticos, 10 por virus y el resto, no quisieron pronunciarse” (Farreras, 1963) En aproximadamente el 80% de los casos de LMA no es posible identificar el agente desencadenante del daño genotóxico que acaba iniciando el proceso de leumogénesis, de tal manera que en la actualidad la mayoría de los pacientes son etiquetados como leucemias de novo o espontáneas sin que se puede identificar exposición a agente causal. El conocimiento creciente del proceso de patogénesis de la LMA, sugiere que se trata de un proceso “multistep” de larga evolución por lo que con los estudios epidemiológicos actuales resulta difícil identificar agentes desencadenantes (Deschler & Lübbert, 2006). Una salvedad serían los casos de LMA secundarias al uso terapéutico de radiaciones ionizantes y quimioterapia, que constituyen entre el 1020% de los casos totales de LMA (Kenneth Miller, 2004). Los factores con potencial leucemógeno se pueden resumir de la siguiente manera.(Kenneth Miller, 2004; Stock & Thirman, 2014) a) Factores genéticos: LMA familiar y síndromes predisponentes b) Factores ambientales c) Radioterapia y quimioterapia. Entre los factores genéticos predisponentes se ha demostrado epidemiológicamente el mayor riesgo para el desarrollo de LMA infantil en pacientes afectos de síndromes hereditarios en los que la inestabilidad genética y cromosómica es clave. Así se ha demostrado para enfermedades como la Anemia de Fanconi, Ataxia-telangiectasia de Friedrich, Síndrome de Bloom, sdr de Li-Fraumeni, o síndrome de Klinefelter que en trabajos de casos y controles se ha documentado este aumento de la incidencia. De especial relevancia es la asociación encontrada entre Síndrome de Down (trisomía cromosoma 21), con una incidencia de LMA diez veces mayor que para la población sana, y 500 veces más frecuente si hacemos referencia al subtipo concreto LMA M7 de la FAB (Kenneth Miller, 2004). En estos casos se ha descrito la presencia de mutaciones en el factor de transcripción GATA1, elemento esencial en la regulación de la Revisión del problema: Estado actual de la LMA 22 maduración eritroide y megacariocítica (Xavier & Taub, 2010) y que en el contexto de la trisomía 21 produce un transcrito anómalo GATA1s, que favorece la proliferación mieloide anómala. Este conjunto de hallazgos, ha motivado que actualmente la OMS clasifique estas LMA como una entidad propia, con la definición de “Proliferaciones mieloides relacionadas con el Síndrome de Down” (Arber et al., 2008). Entre las alteraciones congénitas se debe valorar también la presencia de casos de agregación familiar y LMA congénitas. Son casos en principio, extremadamente infrecuentes, con mecanismos genéticos definidos en los últimos años, que no están en la rutina de trabajo de los laboratorios de hematología, por lo que es extraordinariamente complejo saber cuál es su incidencia real. Se caracterizan por la presencia de mutaciones en línea germinal que predisponen al desarrollo de LMA, pero que por sí mismas no son suficientes para establecer el diagnóstico de LMA (Churpek & Godley, 2014; Owen, Barnett, & Fitzgibbon, 2008). Entre los síndromes más conocidos destacan: - LMA familiar con mutaciones en CEBPA. - Desordenes familiares asociados a alteraciones de plaquetas con: - Mutaciones en RUNX1 - Mutaciones en ANKRD26 - LMA familiar con mutaciones en GATA2 Entre los factores ambientales destaca la exposición a solventes orgánicos, en especial al benceno que es el modelo más estudiado y sobre el que existe legislación específica desde 1947 en las administraciones de salud pública de EEUU y Europa. El más reciente meta-análisis publicado en 2010, confirma la asociación, dependiente de dosis de exposición para LMA y LLC, pero no para LLA y LMC (Khalade, Maritta S Jaakkola, Pukkala, & Jaakkola, 2010). En lo referente a radiaciones, la experiencia en supervivientes a la bomba atómica de Hiroshima confirma un aumento del riesgo asociado para LMA y LLA que parece mostrar una relación lineal con las dosis recibida (distancia superviviente a zona Revisión del problema: Estado actual de la LMA 23 impacto) y que no se confirmo para linfomas o mielomas con una tasa de exceso de riesgo de 1,1 casos por 10.000 habitantes/año (Preston et al., 1994). Si bien estos hallazgo son congruentes con literatura previa que documentaban el aumento de incidencia de LMA en profesionales sanitarios expuestos a radiaciones ionizantes antes de la universalización de las medidas de protección, en la actualidad no se puede definir con claridad el riesgo inherente a la realización estudios radiológicos convencionales. Únicamente se ha objetivado un discreto aumento de la incidencia de leucemia para pacientes que han recibido antes de los 22 años, una dosis equivalente a la realización de 5 TAC craneales (Stock & Thirman, 2014). En cuanto a factores ambientales con efecto cancerígeno conocido, como tabaco o la exposición solar parecen tener un papel marginal sin clara asociación en los estudios epidemiológicos publicados hasta la fecha (Stock & Thirman, 2014). Sin embargo, todos estos factores anteriormente descritos juegan un papel casi marginal en la etiología de LMA en cuanto impacto real en el número de casos. De todos los agentes etiológicos conocidos sin duda el más importante es la quimioterapia y el uso de la radioterapia, de tal manera que la clasificación oficial OMS 2008 los reconoce como entidad propia y separada del resto de LMA, definiéndolas como “Neoplasias mieloides relacionadas con la terapia” (Arber et al., 2008). Entre los agentes quimioterápicos, destacan dos grupos de fármacos bien diferenciados (Stock & Thirman, 2014) . a) LMA secundaria al uso agentes alquilantes. (Metocloretamina, busulfan, clorambucil, ciclofosfamida o cisplatino): generalmente la aparición se difiere en el tiempo unos 3-5 años tras la exposición al fármaco, suele venir precedida de un síndrome mielodisplásico (SMD) y al diagnóstico puede presentar alteraciones citogenéticas características de SMD como monosomías de los cromosomas 3, 5 o 7. b) LMA secundaria al uso de inhibidores de la Topoisomerasa II. (Fármacos como etopósido, antraciclínicos): en este caso el tiempo medio de presentación es Revisión del problema: Estado actual de la LMA 24 inferior, aproximadamente un año y se caracteriza por la asociación a cariotipos con reordenamientos de MLL (región 11q23). Sin embargo la clasificación OMS actual, no los reconoce como entidades clínicopatológicas independientes, y opta por agruparlas todas dentro del epígrafe LMA relacionadas con el tratamiento (Arber et al., 2008) en el que se reconoce el efecto de cualquier agente quimioterápico o radiación ionizante con intención terapéutica (Deschler & Lübbert, 2006). En los últimos años ha cobrado importancia las LMA secundarias que aparecen después de quimioterapia a altas dosis seguido de rescate con progenitores hematopoyéticos criopreservados (TAPH). Recientemente autores italianos han definido una incidencia global de LMA/SMD de aproximadamente el 4,5 % a los diez años del TAPH a través del estudio de una cohorte de más de 1300 pacientes con LNHB con más de 20 años de seguimiento (Tarella et al., 2011) . 2.1.4 Epidemiología. La LMA es una neoplasia que se presenta a cualquier edad de la vida, con casos documentados de LMA al nacimiento e incluso con presencia de mutaciones intra útero (Wiemels et al., 2002). Sin embargo, su incidencia aumenta progresivamente con los años de vida alcanzando su pico de incidencia en la séptima década de la vida (Faderl & Kantarjian, 2012). La información disponible actualmente para el análisis de aspectos epidemiológicos de la LMA proviene especialmente de los registros de Swedish National Acute Leukemia Registry en Suecia y los registros poblacionales vinculados al registro SEER-17 del programa Surveillance, Epidemiology and End Results (SEER) desarrollado por el National Cancer Institute de Estados Unidos (EEUU). La incidencia estimada por 1.000.000 hab/año para LMA en EEUU es de 38 casos, con predominio de varones sobre mujeres, pero con una distribución por edad bimodal, con un discreto aumento en menores de 1 años (10-15 casos/1.000.000 y año) para después descender y aumentar progresivamente desde la tercera década de la vida Revisión del problema: Estado actual de la LMA 25 hasta alcanzar incidencias por encima de 100 casos/1.000.000 año a partir de la séptima década de la vida. Todo ello, configura un panorama general con una edad media de presentación de 66 años (Dores et al., 2012). Los hallazgos provenientes del estudio sueco, son similares, con la salvedad de una edad media de presentación de 72 años, debido a que en Swedish National Acute Leukemia Registry se excluyen casos de menores de 14 años, pero igualmente se objetiva el aumento progresivo de la incidencia según aumenta la edad, con menos de 10 casos/año por millón de habitantes para el segmento de menores 35 años que contrasta con una incidencia de 120 casos/1.000.000 para mayores de 74 años.(Juliusson et al., 2009) Figura 2.6 Relación incidencia LMA con edad de los pacientes. Estudios poblacionales de EEUU (arriba) y Suecia (abajo). Citas referidas en el texto Revisión del problema: Estado actual de la LMA 32 Las principales determinaciones, recomendadas para el abordaje clínico de los pacientes por el comité de expertos de la red European Leukemia Net son las siguientes (Dohner et al., 2010): a) Mutaciones en FLT3. Pertenece a la familia de los receptores tirosina quinasa de clase 3, conocido también como stem cell quinasa 1 (STK1) y se expresa fundamentalmente en las células hematopoyéticas progenitoras y media la diferenciación y proliferación de las mismas. El gen se encuentra en el cromosoma 13q12. Se han descrito mutaciones asociadas a LMA que dan como resultado una activación del receptor (Grafone, Palmisano, Nicci, & Storti, 2012). Entre las alteraciones más importantes destacan por su frecuencia e implicación pronóstica las duplicaciones internas en tándem de FLT3 (FLT3-ITD) que observan en LMA con una prevalencia entre el 20 y 27%, siendo tema de debate si la carga alélica, definida por la ratio entre alelo mutado y germinal es clave para definir el mal pronóstico de estos pacientes (Thiede et al., 2002), pero con hallazgos en la literatura contradictorios (Dohner et al., 2010). El otro tipo de alteraciones encontradas son las mutaciones puntuales de Asp 835 afectando al dominio tirosina quinasa de FLT3, con una frecuencia en torno al 7% en los pacientes con LMA y su relación con el pronóstico mucho más discutible (Miguel Angel Sanz & Moscardo, 2007). En conjunto, se asume que la presencie de mutaciones en FLT 3 ITD en pacientes con cariotipo normal y en ausencia de otras mutaciones, en especial NPM1 se asocia con un mayor riesgo de recaída y que ello impacta negativamente en el pronóstico de los pacientes (Dohner et al., 2010; David Grimwade & Hills, 2009; Miguel Angel Sanz & Moscardo, 2010). b) mutaciones en NPM1. El gen se encuentra localizado en el cromosoma 5q35 con mutaciones constantes en el exon12. Su función no es del todo conocida, pero se cree que juega un papel en la inducción de la apoptosis por su interacción con ARF para activar la vía de P53 (Brunangelo Falini et al., 2005). Se encuentra en una frecuencia alta en LMA con cariotipo normal donde representa el 25-35 % de los casos (Dohner et al., 2010). Revisión del problema: Estado actual de la LMA 33 La evidencia actual parece ser concluyente en que la presencia de la mutación de NPM1 en pacientes con cariotipo normal y ausencia de mutaciones de en FLT3, se asocia a una mayor tasa de remisiones completas a la quimioterapia de inducción y una menor probabilidad de recaídas (Dohner et al., 2010; David Grimwade & Hills, 2009; Miguel Angel Sanz & Moscardo, 2010). c) mutaciones en CEBPA. El gen CEBPA se localiza en el cromosoma humano 19q13.1 y codifica para un factor de transcripción pertenecientes a la familia “CCAAT/enhancer binding protein” (C/EBP) que parece jugar un papel clave en la maduración de los progenitores mieloides. Su frecuencia es relativamente baja, de aproximadamente el 10% de todas las LMA, pero en el que su valor pronóstico aparece limitado solo para aquellos con presencia de mutación en los dos alelos del gen (Dohner et al., 2010). Recientemente un estudio retrospectivo de los grupos HOVON/SAKK y AMLSG ha demostrado el buen pronóstico en forma de SLP y SG superiores al 75% a los 5 años, pero solo para aquellos pacientes que reciben trasplante hematopoyético en primera remisión completa (Schlenk et al., 2013) . d) Otros genotipos: la afectación de otros genes se ha propuesto para mejorar la clasificación pronóstica del grupo de riesgo intermedio. Así, la existencia de múltiples mutaciones y la sobreexpresión de genes se han barajado como de potencial utilidad e interés pronóstico para el manejo clínico de estos pacientes (Damm et al., 2011; Dohner et al., 2010; David Grimwade & Hills, 2009). Las alteraciones con un mayor papel parecen la sobreexpresión del gen EVI1 (Valk et al., 2004), y nuevas mutaciones, especialmente en la maquinaria epigenética, como son DNMT3A, IDH1/2, o TET2. Hasta la fecha el trabajo de mayor complejidad y potencia estadística es el publicado por Patel y et al en 2012(Jay P. Patel, Kety Huberman, & Omar AbdelWahab, 2012) donde mediante el análisis de las mutaciones de estos genes implicados en la maquinaria epigenética (DNMT3A, TET2, IDH1, IDH2, y ASXL1) asociados a los descritos previamente, son capaces de redefinir nuevos subgrupos dentro de las LMA de riesgo intermedio. Sin embargo, estos hallazgos requieren de validación prospectiva, para ser trasladados a la práctica clínica asistencial. Revisión del problema: Estado actual de la LMA 34 - Cifra de Leucocitos: Tradicionalmente la hiperleucocitosis ha sido considerado un factor de riesgo independiente (Kenneth Miller, 2004), pero existe discordancia en cuanto a definir un punto de corte, con valores que oscilan entre las distintos autores y series publicadas. En cualquier caso, en la actualidad no se considera en los protocolos asistenciales como un factor pronóstico independiente que permita definir de manera apriorística el abordaje terapéutico del paciente salvo en dos situaciones concretas (Miguel Angel Sanz & Moscardo, 2010). a) Paciente ancianos: Los distintos scores predictivos publicados por los grupos ALFA(Malfuson et al., 2008), SAL (Rollig et al., 2010) y MDACC (Kantarjian et al., 2010), han demostrado que la hiperleucocitosis es una variable que confiere mal pronóstico a los pacientes mayores candidatos a recibir quimioterapia. b) Pacientes con LMA CBF. En este grupo de especial buen pronóstico y buena sensibilidad a la quimioterapia, la leucocitosis al diagnóstico es uno de los factores que anulan el buen pronóstico de la citogenética (Paschka & Döhner, 2013), de tal manera que en la actualidad se recomiendan cambios en la estrategia terapéutica para pacientes con LMA CBF que asocian hiperleucocitosis al momento del diagnóstico. (Schlenk, 2014). - Respuesta obtenida al tratamiento. Distintas series de pacientes en ensayos clínicos han demostrado que el fallo a la quimioterapia de inducción en conseguir una respuesta completa morfológica se configura como un indicador de especial mal pronóstico (Miguel Angel Sanz & Moscardo, 2010; Schlenk, 2014) por lo que debe de implicar un cambio en la terapia de intensificación del paciente independiente del riesgo citogenético inicial. A modo de resumen podemos concluir que en el momento actual, y gracias al aumento de información sobre los factores biológicos de la LMA disponemos de una auténtica avalancha de datos que permiten individualizar la aproximación terapéutica de los pacientes. La propuesta que asumimos como vigente es la publicada por el grupo de expertos del European LeukemiaNET publicada en 2010, que mantiene la definición de cariotipo complejo a partir de 3 alteraciones genéticas estructurales y la propuesta del grupo cooperativo PETHEMA en su protocolo asistencial LMA 2010 (v. Revisión del problema: Estado actual de la LMA 35 febrero 2011) (Dohner et al., 2010; Miguel Angel Sanz & Moscardo, 2010), que integra los hallazgos de la citogenética, mutaciones de FLT3, NPM1, CEBPA y respuesta al tratamiento de inducción, para asignar el tratamiento post-remisión. Tabla 2.3 Estratificación de riesgo del grupo PETHEMA en su protocolo asistencial PETHEMA LMA 2010. 2.1.6 Bases de tratamiento. Desde que a finales de los años 70 se estableciera la combinación de un antraciclínico con una perfusión continua de citarabina como el tratamiento estándar de inducción de los pacientes con LMA (esquema 3+7) y dado que dicha combinación se asocia a unas altas probabilidades de alcanzar remisión completa(CD Bloomfield et al., 1981), el tratamiento de la LMA en las últimas décadas ha ido orientado a buscar las estrategias 1. GRUPO DE RIESGO FAVORABLE Se consideran pacientes de riesgo favorable los que presentan uno o más de los siguientes criterios:  LMA con inv(16) o t(16;16), o bien el reordenamiento molecular correspondiente (CBFβ/MYH11), con EMR negativa (≤ 0,1%) y que hayan alcanzado RC con el primer ciclo de inducción.  LMA con t(8;21) o bien el reordenamiento molecular correspondiente (AML1/ETO), con EMR negativa (≤ 0,1%) y que hayan alcanzado RC con el primer ciclo de inducción.  Mutaciones de NPM1 en paciente con cariotipo normal y ausencia de mutaciones de FLT3-ITD y de otros factores de mal pronóstico.  Mutaciones bialélicas de CEBPα en pacientes con cariotipo normal en ausencia de mutaciones de FLT3 y de otros factores de mal pronóstico. 2. GRUPO DE RIESGO INTERMEDIO Se consideran pacientes de riesgo intermedio los que no presenten ninguno de los factores de buen pronóstico ni de mal pronóstico. 3. GRUPO DE ALTO RIESGO Se consideran pacientes de alto riesgo los pacientes que presenten al menos uno de los siguientes criterios:  EMR > 0.1%  Alteraciones citogenéticas catalogadas como de alto riesgo  Duplicaciones en tándem de FLT3 con ratio ≥ 0.8  Pacientes que no hayan alcanzado RC con el primer ciclo de inducción y la alcancen con un segundo ciclo Revisión del problema: Estado actual de la LMA 36 post-remisión o de intensificación adecuadas para conseguir la eventual curación de los pacientes. Actualmente, nuestra terapia de inducción sigue consistiendo en el esquema de 3+7, pero a partir de ese punto los pacientes se individualizan en función de su riesgo clínico y biológico. Es lo que se conoce como terapia adaptada al riesgo (Schlenk, 2014; Sierra & Brunet, 2009). En líneas generales la decisión de asignar un paciente a una estrategia de intensificación se basará en las probabilidades que existan a priori de tener una recaída después de alcanzar la remisión completa y si esas probabilidades no superan las de la morbi-mortalidad asociada al procedimiento más eficaz como terapia de intensificación como es el trasplante alogénico de médula ósea (Alo-TPH en adelante) (Dombret, 2012; Schlenk, 2014). 2.1.6.1 Tratamiento de inducción. El tratamiento estándar consiste en el esquema clásico “3+7” en el que se administra durante 7 días una perfusión continua de citarabina a dosis entre 100 y 200 mgr/m2 en combinación con la administración durante 3 días de un bolo de un fármaco antraciclínico. La citarabina es un antimetabolito, que compite con la pirimidin-citidina, y que requiere transformación a su forma trifosfato (ara-CTP) para ser activo incorporándose al ADN. Tiene una vida media corta de apenas 15 minutos. Los antraciclínicos son (daunorrubicina, idarrubicina) fármacos que actúan sobre la unión del ADN con la enzima Topoisomerasa II, por lo que acaban induciendo la muerte celular (Faderl & Kantarjian, 2012). Desde la introducción del esquema clásico se han probado nuevas aproximaciones, añadiendo un tercer fármaco (mitoxantrone, etopósido, tioguanina, fludarabina, topotecan) aumentando la dosis de los fármacos (escalada de dosis de daunorrubicina, citarabina a altas dosis) añadir factor estimulante de colonias (G-CSF) en inducción, Revisión del problema: Estado actual de la LMA 37 pero en líneas generales ninguna de estos cambios ha supuesto una mejora significativa en las tasa de remisión completa ni supervivencia global, por lo que el estándar 3+7 continúa siendo en la actualidad el tratamiento de elección, siguiendo las recomendaciones de European LeukemiaNET y el protocolo asistencial PETHEMA LMA 2010(Dohner et al., 2010; Fernandez, 2010; Miguel Angel Sanz & Moscardo, 2010). 2.1.6.2 Terapia post remisión. Tratamiento adaptado al riesgo. Una vez alcanzada la remisión completa con la quimioterapia de inducción, los pacientes se asignan a una terapia de intensificación que se deberá elegir en virtud del riesgo biológico de la clona leucémica, las características del paciente y de la morbimortalidad de las distintas opciones terapéuticas disponibles para la intensificación. Es lo que se conoce como terapia adaptada al riesgo (Dohner et al., 2010; Dombret, 2012; Stone, 2013). A continuación se describen las opciones de terapia post-remisión para cada uno de los grupos de riesgo biológico. a) Pacientes de buen pronóstico. Incluimos en este grupo a los pacientes con LMA CBF (aquellos con t (8;21), con inv16 o con t(16;16)); LMA con cariotipo normal y el genotipo NMP1 mutado con FLT3 germinal; y LMA con cariotipo normal y presencia de mutaciones bialélicas de CEBPA (Miguel Angel Sanz & Moscardo, 2010). El estudio clásico para este subtipo de LMA fue el publicado por el Cancer and Leukemia Group B (CALGB) en 1999 en el que se demostraba que la administración de 3-4 ciclos de altas dosis de citarabina (HiDAC) era claramente superior en términos de supervivencia global y probabilidad de recaída frente a 1 ciclo, convirtiéndose en el estándar de tratamiento para este subgrupo la intensificación con altas dosis de quimioterapia con una dosis total de citarabina administrada máxima de 72 gr/m2 a los largo de 3-4 ciclos (Byrd et al., 1999). Revisión del problema: Estado actual de la LMA 38 Figura 2.11 Gráfica original de los trabajos del CALGB sobre intensificación post remisión completa. Probabilidad de supervivencia para pacientes con LMA t (8;21) según reciban 1 ciclo o 3 o-4 de HiDAC. Cita referida en el texto. Sin embargo desde esa fecha numerosos trabajos han encontrado resultados similares en cuanto a supervivencia global y probabilidad de recaída con distintas aproximaciones, modificando dosis, numero de ciclos y fármacos incluidos. De tal forma que en la actualidad, es una cuestión abierta definir con exactitud la mejor terapia de intensificación para este grupo de pacientes en cuanto al número de ciclos, dosis de citarabina y si es preciso asociar otros fármacos (Dombret, 2012). Aún mas, el uso del trasplante autólogo de progenitores hematopoyéticos (TAPH) se ha demostrado como una aproximación tan eficaz como la HiDAC, con similares tasas de RC, y menor probabilidad de recaída en algún estudio, como el del grupo HOVON/SAKK (Löwenberg et al., 2011) por lo que se mantiene su recomendación como terapia de intensificación para este grupo de pacientes, no en vano para el protocolo PETHEMA LMA 2010 (Miguel Angel Sanz & Moscardo, 2010) el abordaje terapéutico de estos pacientes consiste en 2 ciclos de HiDAC y concluir con un TAPH. En lo referente al Alo-TPH, los estudios publicados en la pasada década han demostrado razonablemente que no procede su realización en primera remisión completa para este grupo de pacientes, por no aportar ventajas en supervivencia global, tal y como se reconoció en el metaanálisis publicado en 2009 en JAMA (Koreth et al., 2009), mientras que el grupo cooperativo German–Austrian Acute Myeloid Revisión del problema: Estado actual de la LMA 39 Leukemia Study Group, demostró que el Alo-TPH no aporta ventaja para el genotipo NPM1 mutado FLT germinal ni en términos de SLP ni de SG (Schlenk et al., 2008) De esta manera en el momento actual, y dado que este grupo de pacientes se caracteriza por marcadores moleculares reproducibles y validados para el seguimiento de la enfermedad mínima residual (Yin et al., 2012), la indicación de Alo-TPH queda reservada para aquellos pacientes definidos como de alto riesgo por cualquiera de los siguientes circunstancias (Jourdan et al., 2013; Kadia, Ravandi, O'Brien, Cortes, & Kantarjian, 2015): - Fracaso a la inducción - LMA CBF con hiperleucocitosis - Persistencia de enfermedad tras consolidación o reaparición de la EMR por PCR en el seguimiento post tratamiento. b) pacientes de riesgo intermedio. Se incluyen en este grupo aquellos pacientes con cariotipo normal y alteraciones no características de los grupos de buen y mal pronóstico (Dohner et al., 2010; David Grimwade & Hills, 2009; Miguel Angel Sanz & Moscardo, 2010). Tres son los estudios claves que han marcado las directrices a seguir en la terapia post remisión de los pacientes con cariotipos de riesgo intermedio. En el primer lugar, el estudio publicado en 1994 por Mayer y et al en que compararon tres dosis de citarabina durante cuatro ciclos post remisión: Dosis de 3 gr/m2 cada 12 por 6 dosis, 400 mgr/m2 cada 12 por 6 dosis, y 1gr/m2 cada 12 horas por 6 dosis, cada uno administrada por cuatro ciclos. Las conclusiones demostraron una ventaja significativa para los pacientes que recibieron una dosis total de 72 gr/m2 post remisión (Mayer et al., 1994), lo cual comienza a generar una corriente de opinión claramente favorable hacia el uso de quimioterapia a altas dosis como terapia de consolidación que se ve reforzada por el trabajo intergrupos americano publicado en 1998 en el que esta aproximación con altas dosis de citarabina es superior a TAPH y Alo-TPH (Cassileth et al., 1998), como se puede comprobar en la revisión que sobre la LMA publican autores tan consolidados como Elihu Estey y Hartmut Döhner en The Lancet en 2006, donde Revisión del problema: Estado actual de la LMA 40 la opción del Alo-TPH queda restringida a los pacientes con citogenéticas de mal pronóstico o fracasos a la quimioterapia de inducción (Estey & Döhner, 2006). Sin embargo, en 2009 se produce la publicación del mayor metaanálisis sobre el papel del Alo-TPH, donde tras la revisión de 24 ensayos clínicos con metodología prospectiva, se confirma la ventaja para el Alo-TPH en términos de supervivencia tanto libre de progresión como global para los pacientes con cariotipos de riesgo intermedio (Koreth et al., 2009). Por todo ello, actualmente la recomendación en pacientes jóvenes con donante, es proceder a Alo-TPH en primera remisión, pero siempre con la valoración individualizada previa de sus comorbilidades y del riesgo de mortalidad asociado al procedimiento, así como considerar regímenes de intensidad reducida o fuentes alternativos de progenitores (Dohner et al., 2010). En nuestro entorno, el protocolo asistencial del grupo PETHEMA, mantiene como primera recomendación la opción de Alo-TPH y en caso de no disponer de donante, realizar TAPH con ciclo previo de citarabina a altas dosis (Miguel Angel Sanz & Moscardo, 2010). c) pacientes de alto riesgo citogenético. Se incluyen los pacientes con cariotipos con -5/del(5q), -7/del(7q), abn(3q), 20q, 21q, 17p, t(6;9), t(9;22), cariotipos complejos con 3 o más anomalías, aquellos que fracasan a la inducción, o con FLT3 mutados y NPM1 germinal (David Grimwade & Hills, 2009; Miguel Angel Sanz & Moscardo, 2010) . Este grupo de pacientes son especialmente pobres respondedores a la quimioterapia, por lo que se deben considerar como candidatos para Alo-TPH en primera remisión completa, con un nivel de evidencia bastante alto, no solo por el resultado del metaanálisis anteriormente citado (Koreth et al., 2009), si no por nueva evidencia publicada a posteriori de ensayos clínicos prospectivos, tanto de grupos cooperativos franceses (Hospital et al., 2012) grupo cooperativo Alemán-austriaco (Schlenk et al., 2010) o los resultados del ensayo AML12 del MRC británico, (Alan K. Burnett et al., Revisión del problema: Estado actual de la LMA 41 2010) que muestran superioridad para el Alo-TPH en pacientes de mal pronóstico por citogenética. 2.2 Patobiología de la LMA. Modelo actual de leucemogénesis 2.2.1 Regulación de la hematopoyesis. 2.2.1.1 Visión global de la mielopoyesis. Definimos como mielopoyesis el proceso mediante el cual se obtienen los elementos maduros de la serie mieloide a partir de una célula madre pluripotencial (Berliner, 2012). Estas células con capacidad stem, en el contexto de la hematología, se definen como células madres de la hematopoyesis (HSC, en adelante). Definidas mediante técnicas de citometría, sorting y enriquecimiento de medios de cultivos, de tal manera que es conocido su fenotipo mediante la combinación CD34+/CD38-. Son las células que, a continuación, se dividirán y originarán la célula definida unidad formadora de colonias mieloide-monocítica-eritroide-magacariocítica (CFU-GEMM) capaz de crear colonias de granulocitos, monocitos, eritrocitos y megacariocitos y por otro lado la unidad Figura 2.12 Probabilidad de supervivencia global en dos ensayos clínicos prospectivos para pacientes de alto riesgo según procedan a Alo TPH o no. A la izquierda datos de el ensayo francés (Hospital et al., 2012) y a la derecha datos del grupo Austriaco-alemán (Schlenk et al., 2010) Revisión del problema: Estado actual de la LMA 48 Figura 2.17 Representación esquemática de los principales factores de transcripción implicados en ha hematopoyesis y en los pasos en que su papel es primordial. Adaptado de Hoffman 6ª Ed 2012. 2.2.1.2.2 Factores de crecimiento hematopoyéticos. Los factores de crecimiento (FC) son sustancias, la mayoría de naturaleza proteica, que junto con las hormonas y los neurotransmisores desempeñan una importante función en la comunicación intercelular mediante el control externo del ciclo celular, induciendo en la célula receptora del estímulo el abandono de la quiescencia (G0) y la entrada en fase G1 (Sieff, 2015b). Si bien los estadios más iniciales de la maduración las células de la hematopoyesis expresan receptores para múltiples citoquinas a medida que van avanzando en el desarrollo y comprometiéndose hacia una determinada línea va disminuyendo el número de receptores. Ejemplos de receptores de FC son los de G-CSF, TPO, EPO y GM-CSF, pertenecientes a la familia de los receptores ligados a JAK-STAT. Una vez se ha producido la unión ligando-receptor se produce el cambio estructural (generalmente homodimerización), lo cual induce la fosforilación de la quinasa JAK que activa los segundos mensajeros de la vía STAT. Estos acaban pasando al núcleo donde actúan como factores de transcripción capaces de iniciar el ciclo celular (Berliner, 2012). Revisión del problema: Estado actual de la LMA 49 Figura 2.18 Esquema general de señalización de los receptores de citoquinas y factores de crecimiento. Tomado de http://www.sinobiological.com En conjunto, se podría definir un grupo de FC de acción temprana (IL-1, IL-3, IL-6, ligando FLT3, CSF, GM-CSF) con capacidad para estimular los HSC no comprometidas a línea y un segundo grupo de acción tardía (EPO, TPO, G-CSF, M-CSF, IL-5) con afinidad para las CFU comprometidas. Dentro de los de acción temprana, parece ser IL-3 la que muestra especial afinidad para dirigir HSC hacia CFU-GEMM, así como GM-CSF muestra una actividad no restringida a línea mieloide, pudiendo estimular también a CFU-E. Las citoquinas mas tardías como CSF-G y CSF-M muestran afinidad de línea para los estadios finales de la maduración mieloide, de igual manera que TPO y EPO lo hacen para la series plaquetar y eritroide respectivamente (Kaushansky, 2006). Revisión del problema: Estado actual de la LMA 50 Figura 2.19 Representación esquemática de las principales citoquinas implicadas en los distintos estadios de la hematopoyesis. Tomado de Hoffman 6ª ed 2012. 2.2.1.2.3 Mecanismos epigenéticos. ARN de interferencia (miRNA). En condiciones normales la mayor parte del ADN en una célula se muestra inaccesible a la maquinaria transcripcional, en virtud de la estructura terciaria y cuaternaria en la que se encuentra empaquetado el ADN. La accesibilidad de determinados genes en un momento concreto para proceder a su transcripción no se produce al azar sino que se encuentra regulado por múltiples factores que inciden sobre esta superestructura. Estos mecanismos de control que influyen en la expresión genética sin interferir en la secuencia del ADN es lo que se conoce como epigenética (Chute, 2012). Los principales mecanismos de regulación epigenética incluyen las modificaciones de las histonas, principalmente mediante introducción en regiones concretas de residuos de grupos acetilos y metilos. Las histonas en las que predomina la acetilación favorecerán la expresión de los genes que contienen, mientras que la desacetilación implica un perfil de represión de la transcripción. Los cambios en el perfil de acetilación lo realizan enzimas especificas (histonas acetiltransferasa o HAT e histonas deacetiltransferasas o HDAC). Revisión del problema: Estado actual de la LMA 51 Por el contrario la metilación influye de una manera más específica, pues en función de la posición del residuo cambiará el patrón de expresión. Por ejemplo la presencia de un residuo metilo en la lisina 4 de la histona 3 (H3K4me) implica transcripción abierta, mientras que la metilación de H3K27 condiciona un cierre del programa de lectura. El otro gran mecanismo de control es la metilación en posición 5´de la citosina en regiones de alta repetición de pares CpG en la secuencia de ADN (conocidas como islas CpG) que se sitúan próximas a los promotores (Alvarez, 2014). En situación basal, la mayoría de las regiones CpG se encuentran metiladas, pero existen regiones de alta variabilidad en el patrón de metilación, denominadas orillas de las islas CpG, y que son las regiones dianas para intervenir en le regulación de la expresión génica. La maquinaria enzimática encargada del control de la metilación lo constituyen la DNMT1, que mantiene el perfil de metilación existente durante la replicación celular, y DNMT3A y DNMT3B que son las encargadas de la metilación de novo. El proceso de desmetilación se encuentra dirigido por las enzimas TET, en especial TET2 que cataliza el paso de citosina metilada (5´mC) a 5-hidroxi-metil-citosina (5´hmC). En líneas generales, se puede asumir que una región con alta incidencia de metilación se encuentra cerrada para la transcripción genética y que la hidroximetilación equivale funcionalmente a la desmetilación de los residuos de citosina (Chedin, 2011; Shih, Abdel-Wahab, Patel, & Levine, 2012). Con estos antecedentes, es lógico suponer que la regulación epigenética debe jugar un papel clave en la hematopoyesis, controlando la expresión de los FT necesarios en cada momento de la mielopoyesis. Los trabajos realizados en modelos murinos confirman que enzimas como DNMT3A y DNMT3B son necesarias para el control de los genes que mantienen activo el programa de células stem. (Alvarez-Errico et al., 2015) Así mismo, se ha demostrado que los patrones de metilación durante la hematopoyesis no se distribuyen al azar (Ji et al., 2010) sino que existe un control exquisito de las regiones que muestran Revisión del problema: Estado actual de la LMA 52 patrones cambiantes de metilación y modificación de histonas. De esta manera, “la diferenciación celular es un proceso epigenético que requiere programas específicos y altamente ordenados de modificación de la metilación del ADN y modificación de histonas”(Issa, 2013). En general se asume que existe una tendencia progresiva a la hipometilación a lo largo de la maduración, pero con cambios puntuales, probablemente por la necesidad de silenciar la expresión de genes relacionados con funciones stem. Figura 2.20 Representación esquemática de los cambios en los patrones de metilación a lo largo de la mielopoyesis (Alvarez-Errico, et al 2015). Finalmente, otro nivel de regulación de interés creciente, es la constituida por el ARN de interferencia o microARN. Consiste en pequeños fragmentos de ARN no codificante, monocatenario que tiene la capacidad de unirse a ARNm circulante con lo que es capaz de bloquear su traducción.(Chute, 2012) Si bien se ha demostrado que un microRNA puede inhibir la expresión de múltiples genes, en los últimos años se ha demostrado la importancia de miR-115, miR-125b, miR-126, miR-130 y miR-223 en el desarrollo del compartimento mieloide. Sin embargo la tremenda complejidad de estas redes de control dificulta el desarrollo de un modelo esquemático global de su papel en la hematopoyesis(MF Alemdehy, 2012). Revisión del problema: Estado actual de la LMA 53 2.2.2 Fisiopatología y bases moleculares de la LMA. Desde los trabajos realizados a principios del siglo 20, se ha puesto de relieve la importancia de los mecanismos que inducen ventaja proliferativa y bloqueo en el proceso madurativo de la célula tienen en el desarrollo de la LMA (Naegeli, 1934). Estos datos iniciales, basados en la observación de los cambios citológicos, han tenido una reproducibilidad importante con los hallazgos moleculares y citogenéticos observados durante las últimas décadas del siglo 20, documentándose mutaciones que sustentaban esa ventaja proliferativa (mutaciones en FLT3 o K-RAS) y translocaciones genéticas que explicaban el bloqueo en la maduración mieloide (PMLRARα, AML1-ETO…). De esta manera, a comienzos del siglo 21 se postula como idea dominante un modelo basado en la cooperación de dos tipos de mutaciones o alteraciones genéticas: mutaciones tipo I, encargadas de dar ventaja proliferativa a la clona tumoral y tipo II, que interfieren sobre el proceso de maduración celular.(Gilliland & Griffin, 2002) Figura 2.21 Esquema original de Guilliland publicado en 2002 en el que se hace referencia a la necesidad y cooperación de dos tipos de eventos genéticos (Guilliland & Griffin, 2002). Sin embargo, este modelo de doble hit se ha visto superado en los últimos años por el aumento de información disponible por la mejora de las técnicas de análisis de secuencias de ADN y de perfiles de expresión de ARNm, la proteómica, el descubrimiento de los microARN y la definición del epigenoma. Revisión del problema: Estado actual de la LMA 54 De tal manera que se ha podido definir un perfil de expresión de ARNm característico para las distintas LMA (Valk et al., 2004) se ha propuesto una clasificación basada en los hallazgos de proteómica (Kornblau et al., 2009) , por los cambios de expresión de microRNA, (K. M. z. Guido Marcucci, Michael D. Radmacher, Ramiro Garzon, Clara D. Bloomfield, 2011) y de perfiles epigenéticos (Cancer Genome Atlas Research, 2013) que pudieran relacionarse con los distintos subtipos de LMA y aportar valor pronóstico. En definitiva, se ha puesto de relieve un panorama muchos más complejo en el que se producen interacciones a múltiples niveles de la expresión génica, de tal manera que podemos concluir, citando a J. Chen et al, quienes en 2010 definieron la leucemogénesis como un proceso en el que están implicados algo más que mutaciones de genes, y titularon literalmente su artículo como “Leukemogenesis: more than mutant genes”(Chen, Odenike, & Rowley, 2010). 2.2.2.1 Proceso Secuencial. Evidencia a favor de leucemogénesis como modelo multi-step. El modelo de “doble hit” implica que la LMA es la consecuencia de al menos dos mutaciones o alteraciones genéticas. Actualmente se asume que este proceso es mucho más complejo, y que la génesis de la LMA es consecuencia de múltiples hits genéticos que van generando un proceso de selección clonal de tal manera que en el momento del diagnóstico puedan coexistir varias clonas(Murati et al., 2012). La evidencia a favor de la existencia de múltiples hits genéticos que generan un proceso secuencial es amplia y se basa en los siguientes aspectos: a) Modelos animales: Existen múltiples modelos de leucemogénesis en los que se observa que la presencia de una única alteración genética no es capaz de inducir un fenotipo de LMA. Por ejemplo, Moriya et al, demostraron que la inserción mediante retrovirus de genes K-ras y MLL-AF10 mutados por separado eran incapaz de inducir Revisión del problema: Estado actual de la LMA 55 LMA, sin embargo cuando se insertaba ambas alteraciones simultáneamente se desarrollaba LMA en un corto periodo de tiempo (Moriya et al., 2012). Hallazgos similares han sido reproducidos en LMA con alteraciones genéticas bien definidas, como son la translocación t (8;21) o la t(15;17) que, a pesar de inducir su expresión en ratones, precisan de segundos eventos genéticos para desarrollar la leucemia (Kelly et al., 2002) (Higuchi et al., 2002). b) LMA secundarias a otras neoplasias mieloides: Aproximadamente un 20% de las LMA son secundarias a enfermedades hematológicas previas, lo que las convierte en buenos modelos para el estudio de la evolución a leucemogénesis. En 2012, M. Walter, mediante técnicas de secuenciación masiva en las muestras al diagnóstico de SMD y del momento de su transformación a LMA secundaria, describieron los cambios genéticos observados en esta transición. Como hechos destacados, encontraron un aumento en el número de clones y que la progresión venía dada por la ganancia de nuevas mutaciones en los clones presentes en el momento del diagnóstico de SMD (Matthew J. Walter, 2012). c) LMA en recaída: El estudio citogenético convencional ya había demostrado que las LMA en recaída se caracterizaban por la ganancia de nuevos eventos genéticos (OM Garson, 1989), pero la llegada de las técnicas de secuenciación masiva ha permitido profundizar en este campo. Ding et al secuenciaron las muestras al diagnóstico y recaída de una serie de pacientes, observando dos patrones moleculares distintos en las recaídas. En primer lugar, encontraron pacientes en los que la recaída provenía del clon mayoritario al diagnóstico pero con ganancia de nuevas mutaciones, y otros en los que la recaída acontecía de un clon minoritario, pero que durante la evolución adquiría nuevas mutaciones y se transformaba en el mayoritario en el momento de la recaída. En ambos casos, la presencia de nuevas mutaciones es clave para el desarrollo de la recaída clínica de la LMA (Ding et al., 2012). Revisión del problema: Estado actual de la LMA 56 d) Secuenciación masiva al diagnóstico: Entre las conclusiones del proyecto The Cancer Genome Atlas Research Network (TCGA) sobre LMA, se encontró la presencia de al menos un subclón minoritario al diagnóstico en más de la mitad de los pacientes, y un máximo de 5 subclones por paciente (Cancer Genome Atlas Research, 2013). Previamente, investigadores del grupo de Washington describieron la evolución clonal de LMA. Así, observaron como una mutación que confiere ventaja a una célula HSC (definidas como driver), era transmitida junto con todas las mutaciones no leucémicas (“passengers”) a la siguiente progenie. Luego, sucesivos hits genéticos iban añadiendo mutaciones de ambos tipos hasta el desarrollo clínico de la enfermedad, en la que se pueden identificar los distintos subclones cada uno con sus mutaciones drivers y “passengers” características (Welch et al., 2012). Figura 2.22 Evolución clonal propuesto por investigadores del grupo de Washington. Donde “X” define las mutaciones inherentes al proceso de división de toda HSC, al que se van sumando mutaciones driver que en sucesivas divisiones se irán transmitiendo a los clones con todo el cortejo de mutaciones no leucemogenas, definidas como passengers ( representadas como “X”, Y” ó “Z”) de nueva adquisición (Welch et al., 2012) e) LMA CBF: Las LMA con reordenamientos del CBF permiten el seguimiento de los pacientes mediante técnicas de PCR por tratarse de una alteración genética estable y considerada imprescindible para el desarrollo del clon leucémico. Sin embargo se ha demostrado la persistencia del transcrito AML1-ETO en largos supervivientes fuera de Revisión del problema: Estado actual de la LMA 57 tratamiento e incluso en pacientes con trasplante alogénico, todos ellos en situación en remisión completa (Jurlander et al., 1996). Estos hallazgos sugieren que la presencia del transcrito AML1-ETO, si bien es un evento inicial necesita de otras lesiones cooperantes para el desarrollo clínico de la LMA. Igualmente, Wiemels y et al desarrollaron un trabajo en 12 niños con diagnóstico de LMA CBF con t(8;21) de los cuales se recuperaron muestras al nacimiento. Consiguieron demostrar la presencia del reordenamiento AML1-ETO en cinco de ellos, observando periodos de latencia hasta la presentación clínica de la LMA de 3 a 10 años, lo cual ahonda en la necesidad de lesiones cooperantes aún a pesar de tratarse de LMA con lesiones genéticas bien definidas (Wiemels et al., 2002). f) Hematopoyesis clonal en pacientes ancianos sin evidencia de LMA: Recientemente dos grupos han demostrado de manera simultánea la presencia de mutaciones asociadas a LMA en pacientes ancianos, sin evidencia de neoplasia hematológica activa. Ambos coinciden en que, la frecuencia aumenta con la edad, observando diferencias significativas incluso entre los segmentos de edad entre 70 y 90 años, y en que las mutaciones de la maquinaria epigenética y del splicing son las más frecuentes. Estos trabajos ponen en evidencia la presencia de hematopoyesis clonal como lesiones pre-malignas en población anciana, que aumentan el riesgo de desarrollo de LMA especialmente cuando se asocian dos o más lesiones. Este hecho constituye una prueba de concepto importante a favor de la presencia de mutaciones como DNMT3A, TET, ASXL1, como lesiones pre leucémicas y de la necesidad de eventos genéticos sucesivos para el desarrollo de la enfermedad (McKerrell et al., 2015) (Jaiswal et al., 2014). En conjunto, y citando a Murati y Welch, ante la evidencia disponible se puede concluir que la leucemogénesis es un proceso secuencial donde una serie de mutaciones iniciales o drivers confieren una ventaja inicial a la HSC sobre la que ha ocurrido este primer evento y que ya cuenta con una serie de mutaciones no codificantes que Revisión del problema: Estado actual de la LMA 64 reproducidos en otras neoplasias mieloides con mutaciones en TET2 como SMD NMP. Es por esto por lo que en la actualidad no se puede asumir que las mutaciones de TET2 condicionen una hipermetilación global del ADN, de igual manera que las de DNTM3A tampoco condicionan una hipometilación general. Se asume por tanto, que condicionan cambios en las marcas de metilación de determinados genes implicados en la hematopoyesis (Chen et al., 2010; Schoofs et al., 2014; Shih et al., 2012). Por último, se deben mencionar las mutaciones en los reguladores metabólicos de las enzimas TET, las enzimas IDH 1 e IDH2, que forman parte del ciclo de Krebs en el que se encargan del paso del metabolito isocitrato a α-ketoglutarato (α-KG), producen un patrón similar de metilación del ADN a las de TET2. Los reguladores metabólicos de TET2, constan de dos isoformas, IDH1 de localización citoplasmática e IDH2 mitocondrial. Se han identificado mutaciones de IDH1 de forma recurrente en distintos tumores de órgano sólido, como glioblastomas o cáncer colorrectal (Cohen, Holmen, & Colman, 2013). En el contexto de LMA fueron inicialmente descubiertas en IDH1 y a continuación se observaron en IDH2 con una frecuencia algo más elevada, y que oscila en LMA de cariotipo normal entre 7-8% según las series consultadas (Marcucci et al., 2010). Las mutaciones son generalmente heterocigotas y la consecuencia de estos cambios es una ganancia de nueva función (mutación neomórfica ) en la que se convierte el α-KG, necesario para el funcionamiento de TET2, en 2-Hidroxiglutarato (2-HG), de tal manera que en pacientes con LMA y mutación en IDH1/2 es posible identificar aumentos en los niveles séricos de de 2-HG (Ward et al., 2010). La consecuencia funcional se cree que es una pérdida del poder de desmetilación enzimática del ADN, probablemente por pérdida de los metabolitos necesarios para el correcto funcionamiento de la hidroximetilación de TET (Figueroa et al., 2010). Esta correlación funcional entre TET2 y las enzimas IDH se ve reforzado por dos hallazgos. En primer lugar, el TGCA ha puesto de manifiesto que las mutaciones entre Revisión del problema: Estado actual de la LMA 65 ambas son excluyentes entre sí (Cancer Genome Atlas Research, 2013) y en segundo lugar , estudios de patrones de metilación muestran que las mutaciones de ambos genes muestran un perfil de metilación del ADN similar, caracterizada por la hipermetilación global de regiones promotoras. Es por esto que, citando a Ross Levine “las mutaciones de IDH1/2 y TET2 constituyen un nuevo grupo funcional mutacional en LMA” (Shih et al., 2012). b) Mutaciones en genes modificadores de histonas. Los cambios en la expresión de genes motivados por los cambios estructurales en la configuración de las histonas son claves para el correcto desarrollo de una hematopoyesis sana (Chen et al., 2010). En los estudios de secuenciación masiva se han identificado dos grupos de eventos: las alteraciones en MLL, y por el otro las que afectan al complejo Polycomb, en especial PRC2. 1. Alteraciones en MLL La proteína MLL forma parte de un complejo con actividad histona metiltransferasa, encargado de mantener la transcripción del locus de genes HOX mediante control epigenético a través de de la metilación del residuo de lisina 4 en la histona 3 (H3K4), que condiciona un cambio estructural en la histona que se asocia con actividad transcripcional. El gen se encuentra localizado en el cromosoma 11 región q23.(Zhang, Chen, Yan, & Huang, 2012) Las leucemias con alteraciones en MLL representan hasta el 85 % de las LMA infantiles y aproximadamente el 10% de las LMA de adultos. El principal mecanismo genético es el reordenamiento con otro gen, que producen una translocación balanceada entre la región amino terminal de MLL con la región Cterminal del “partner” habiéndose identificado más de 100 posibles combinaciones, y por otro, las mutaciones en tándem de extremo N-Terminal (MLL-PTD) (Muntean & Hess, 2012). Revisión del problema: Estado actual de la LMA 66 Figura 2.25 Representación esquemática de la estructura de MLL y del punto de corte de algunos de los principales reordenamientos conocidos (Muntean & Hess, 2012). El gran número de genes acompañantes con los que se puede reordenar MLL hace difícil definir una función común, de manera esquemática, se asume que se pierde la capacidad de catalizar la metilación de H3K4, pero con aumento de actividad de otro de los componentes del complejo, en concreto la proteína Dot1L que aumenta su actividad de dimetilación de H3K79 que se asocia a aumento de la actividad transcripcional del locus de genes HOXA (Zhang et al., 2012). Figura 2.26 Consecuencia de las fusiones de MLL y aumento actividad BRD4 y de poder de dimetilación de DOT1L (Zhang, Chen, Yan, & Huang, 2012). Revisión del problema: Estado actual de la LMA 67 La importancia funcional que tienen estos reordenamientos, se aprecia en el hecho que este grupo de LMA es la que necesita menor número de mutaciones cooperantes, solo una media de 2,09 mutaciones además de la alteración de MLL (Cancer Genome Atlas Research, 2013). Además las translocaciones de MLL son especialmente frecuentes en LMA secundarias a quimioterapia, da idea de la potencia leucemógena de las alteraciones de este complejo enzimático. 2. Mutaciones en EZH2 y ASXL1 Ambas enzimas forman parte del conjunto de proteínas Polycomb (PcG) encargados de actuar como represores de la transcripción mediante la inducción de cambios en la estructura de las histonas. PcG se encuentra altamente conservado en mamíferos y se organiza a través de dos complejos enzimático conocidos como PRC1 y PRC2, siendo este último el de papel y función mejor conocida especialmente en el contexto de la mielopoyesis y las hemopatías malignas. Está constituido por cuatro miembros principales: EZH1 o EZH2, EED, SUZ12 y JARID12, mientras que ASXL1 es responsable del reclutamiento y estabilización de estos cuatro componentes del complejo (Margueron & Reinberg, 2011). La función de EZH2 a nivel molecular se realiza a través de su actividad metiltransferasa sobre el residuo H3K27, en concreto cataliza la trimetilación de dicho residuo, tras lo cual se producen cambios estructurales con condensación de la cromatina que conducen al silenciamiento transcripcional. La frecuencia de las mutaciones de EZH2 en hemopatías malignas es variable, pues oscila entre el 7 y el 20% en neoplasias linfoides del centro germinal, en donde acontecen mutaciones con ganancia de función (Kahn, 2013), mientras que en el contexto de neoplasias mieloides la frecuencia muestra un patrón distinto. Así en LMA secundarias a neoplasias mieloproliferativas, se observa en aproximadamente entre 812%, mientras que en LMA de novo, baja hasta el 2-3 % de los casos (Shih et al., 2012) . Los estudios in vitro han demostrado que estas mutaciones en el contexto de neoplasias mieloides confieren perdida de función, por lo que se asume que esto Revisión del problema: Estado actual de la LMA 68 conduciría a una situación de aumento de la transcripción de los genes implicados, entre los que se ha demostrado que la perdida de expresión de EZH2 implica un aumento de la del cluster HOXA9 (Kahn, 2013). Figura 2.27 Representación esquemática y funcional del complejo PRC2 y ASXL1 y sus implicaciones funcionales en la transcripción génica. Arriba situación en condiciones fisiológicas, y abajo con pérdida de función del reclutador ASXL1 Modificado de Sara Álvarez:”Epigenética en LMA” Congreso Nacional SEHH 2014 Por su parte, ASXL1, se encuentra mutado en LMA en aproximadamente en un 5% de los casos, y de igual manera a EZH2 también se encuentra mutado con frecuencias entre el 5-25% en otras neoplasias mieloides como SMD, NMP o SMD/NMP. (Shih et al., 2012). La función fisiológica de ASXL1 es la de reclutar y estabilizar el complejo PRC2 para que lleve a cabo su función. Sin embargo, parece menos claro las consecuencias funcionales de las mutaciones, estando descritas, tanto como para pérdida como para ganancia de función, si bien en el contexto de neoplasias mieloides se han relacionado con más frecuencia los eventos que conducen a una situación de pérdida de actividad (Alvarez-Errico et al., 2015; Shih et al., 2012). Revisión del problema: Estado actual de la LMA 69 2.2.2.2.4 Supresores tumorales. La presencia de mutaciones en los mecanismos celulares de muerte celular, tanto en respuesta a situaciones externas como internas de la célula está bien establecida como uno de las vías básicas de oncogénesis. Ya en el año 2000, Hanahan y Weinberg, consideraron que toda célula tumoral debería desarrollar capacidades para evadir la apoptosis y ser resistentes las señales exógenas de inhibición del crecimiento, de tal manera que, en su opinión eran dos de las seis capacidades básicas que permitían a la célula tumoral desarrollarse (Douglas Hanahan, 2000). En general, estas funciones son realizadas por los genes supresores tumorales, en especial TP53 o RB que actúan como integradores de toda una red de señales, tanto externas como internas de la célula y la traducen a los puntos de control del ciclo celular encargados de activar las vías de muerte celular programada con el fin de minimizar los errores genéticos que puedan conducir al desarrollo del cáncer u otras enfermedades (Arnold Levine, 2004). En el contexto de LMA, el trabajo del TCGA, ha confirmado la presencia de mutaciones en varios genes supresores tumorales, en especial TP53, WT1 y PHF6. A continuación se describen las principales características de las mutaciones de TP53 y WT1. a) Mutaciones en TP53 El gen TP53 es el más frecuentemente mutado en tumores humanos con frecuencias que alcanzan el 50% de los casos en tumores digestivos como esófago (Vogelstein, Lane, & Levine, 2000), Esto es debido al papel clave de TP53 en el control de ciclo celular en respuesta a situaciones de estrés celular como daño al ADN siendo capaz de activar una series de vías intracelulares que conducen a la parada del ciclo celular, activar los mecanismos de reparación ADN, y en última instancia si fuera preciso, inducir la apoptosis celular (Soussi, 2012). El gen se encuentra alojado en el brazo corto del cromosoma 17 (17p13.1) y codifica para una proteína con cinco regiones siendo la sección central de unión al ADN dónde se concentran la mayoría de las mutaciones (80%) (Vogelstein et al., 2000). Revisión del problema: Estado actual de la LMA 70 En el contexto de la LMA, las mutaciones en TP53 tiene una frecuencia que oscila entre el 5-8% según series (Cancer Genome Atlas Research, 2013), con clara asociación con citogenéticas de mal pronóstico (Zhao et al., 2010), por lo que no es de sorprender el impacto pronóstico negativo que muestra en la supervivencia de los pacientes (Frank G. Rucker et al., 2012) b) Mutaciones en WT1. El gen del WT1 se encuentra alojado en el cromosoma 11p13 y codifica para una proteína con estructura en dedos de Zn, que se considera con función de FT. En el contexto de la hematopoyesis se asume que tiene un función de supresor tumoral, con capacidad de controlar el ciclo celular, por lo que en LMA, sus mutaciones se han considerado que son de pérdida de función en base a los altos niveles de ARNm observados (Yang, Han, Saurez Saiz, & Minden, 2007). La frecuencia de mutaciones en LMA es baja, entre 5-10% (Hou et al., 2010) y se consideran en general de mal pronóstico. A pesar de esta baja frecuencia, parecen mostrar un patrón mutuamente excluyente con mutaciones en otros supresores tumorales (Cancer Genome Atlas Research, 2013). En la actualidad, es campo activo de investigación el estudio de los niveles de expresión de WT1 por su potencial como marcador pronóstico tras la quimioterapia de inducción (Buccisano et al., 2012; David Grimwade & Hills, 2009). 2.2.2.2.5 Mutaciones en genes de vías señalización celular. Desde que en la década pasada se postuló la teoría de los eventos tipo I y tipo II se reconocía que era obligatorio la presencia de mutaciones en las vías de señalización celular para el desarrollo de la LMA (Gilliland & Griffin, 2002). En la actualidad los estudios de secuenciación masiva han puesto de manifiesto que sólo entre 50 y el 60% de los casos muestran mutaciones en alguno de los elementos de estas vías de señalización celular. Revisión del problema: Estado actual de la LMA 71 A pesar de ello, continúan siendo el grupo más frecuentemente mutado, si bien son múltiples los genes afectados en este grupo. Entre los más importantes por su frecuencia destacan FLT3, KIT y KRAS/NRAS (Cancer Genome Atlas Research, 2013). Las vías de señalización celular ligadas a estímulos externos, están bien establecidas como elemento etiológico en la oncología molecular y constituyen vías moleculares bien definidas, pero con múltiples redundancias que hacen difícil su control farmacológico. Las alteraciones las podemos encontrar a nivel de cantidad de ligando, alteraciones estructurales de receptores o lesiones que configuran ganancia o pérdida de función en segundos mensajeros, o traductores de la señal intracelular. Con diferencia, el efecto genético más frecuentemente alterado son las mutaciones en los efectores situados debajo de los receptores (Hanahan & Weinberg, 2011). A modo de resumen, podríamos identificar como principales vías intracelulares en la hematopoyesis mieloide las siguientes (Grafone et al., 2012; Hanahan & Weinberg, 2011; Krause & Van Etten, 2005): - La vía RAS: Que a través de segundos mensajeros como Raf-MEK y las MAP quinasas puede llegar a inducir el paso nuclear de Myc y traducir el estimulo de proliferación celular. - La vía JAK-STAT. Muy vinculada a receptores de la hematopoyesis como TPO y EPO, y que traducen estímulos de proliferación celular - La vía PI3K-AKT. Que a través del estimulo sobre mTOR puede inducir supervivencia celular. - La vía de IKβNFκβ. capaz de actuar sobre la apoptosis. Los resultados del TCGA mostraron una frecuencia de mutaciones en FLT3 similar a la descrita en la bibliografía, de aproximadamente el 35% en pacientes con cariotipo normal, de aproximadamente el 5 % en KIT y del 10% para NRAS/KRAS. Sin embargo, lo más relevante, fue el hecho de que muchas de estas mutaciones fueron excluyentes entre sí, lo cual da pie a establecer que solo es preciso una mutación en este conjunto de genes para el desarrollo de la LMA (Cancer Genome Atlas Research, 2013) Revisión del problema: Estado actual de la LMA 72 Figura 2.28 Vías moleculares relacionadas con FLT3 ligando. A pesar de tratarse de una representación esquemática con fines didácticos se aprecian las interconexiones y redundancias de las vías por debajo del receptor (Grafone, Palmisano, Nicci, & Storti, 2012). 2.2.2.2.6 Mutaciones en la maquinaria de splicing. La presencia de mutaciones en la maquinaria genética encargada del splicing, constituida por ocho elementos (SF3B1, SRSF2, U2AF35, ZRSR2, U2AF65, SF1, SF3A1 y PRPF40B) fue inicialmente puesta de manifiesto en los pacientes con SMD, en especial en las formas con sideroblastos en anillo donde la mutación de SF3B1, se posiciona como un criterio diagnóstico cada vez con mayor peso. Algunos grupos han descrito una incidencia global de mutaciones en este grupo del 27% en pacientes con LMA secundaria a SMD (Dolnik et al., 2012), pero a través de los trabajos de secuenciación masiva se ha puesto de manifiesto que en pacientes con LMA de novo también pueden existir mutaciones en este grupo de genes, con incidencias globales que oscila entre el 15% del trabajo TCGA y el 7% de otros grupos (Cancer Genome Atlas Research, 2013; Taskesen et al., 2014). Revisión del problema: Estado actual de la LMA 73 En la actualidad es difícil conocer el impacto pronóstico de estas lesiones, pero lo es aún más intuir el impacto funcional en el desarrollo de la leucemogénesis de estas mutaciones que afectan al proceso de maduración del ARNm, con lo que se pueden producir múltiples formas de transcritos alternativos o desarrollo de proteínas truncadas, con ganancia o pérdidas de función (Visconte, Makishima, Maciejewski, & Tiu, 2012). 2.2.2.2.7 Mutaciones en el complejo de la cohesina. La cohesina es un complejo de proteínas involucrado en la separación de las cromátidas, y de mediar su unión en la metafase. Es pues uno de los complejos proteicos responsables de mantener la estructura de los cromosomas, y su estructura consta de dos proteínas de gran tamaño, SMC1A y SMC3, encargadas de dar estabilidad estructural a las cromátidas y de otras dos proteínas STAG1/STAG2, con función de adaptar el complejo (Thota et al., 2014). Dado esta función de estabilizar cromátidas durante la mitosis, se ha postulado su relación con cariotipos complejos e inestabilidad cromosómica. Sin embargo, los trabajos más sólidos hasta la fecha han descartado esta asociación, por lo que en la actualidad su mecanismo de acción en la leucemogénesis continua siendo desconocido, si bien parece juegan un papel en la evolución clonal, siendo más frecuentes en las recaídas que en el momento del diagnóstico, por lo que se les postula como lesiones cooperantes, más que iniciadoras (Thol et al., 2014; Thota et al., 2014). 2.3 Sobreexpresión de genes en LMA. Utilidad de la sobreexpresión de genes en el manejo clínico de LMA. Arrays de expresión y clasificación. Los genes MN1 y BAALC. 2.3.1 Expresión de genes. Técnicas de estudio en ARNm El dogma central de la biología molecular propuesto por Francis Crick en 1970 asume que existe unidireccionalidad en la expresión de la información contenida en los genes, es decir, el ADN es transcrito a ARN mensajero (ARNm) (transcripción) y que éste es traducido a proteína (traducción), elemento que finalmente realiza la acción celular. El Revisión del problema: Estado actual de la LMA 80 El gen WT1 o Tumor de Wilm´s, se encuentra localizado en el cromosoma 11p13 y codifica para un factor de transcripción en dedos de Zinc conocido por un jugar un papel clave en el control de la apoptosis a nivel celular. Es uno de los genes encontrados como frecuentemente mutados en el estudio TCGA para la LMA, (frecuencia aproximada del 5%), agrupado junto a otros genes supresores tumorales como TP53 (Cancer Genome Atlas Research, 2013), previamente se habían publicado resultados de importancia pronóstica en relación a su sobreexpresión. Los primeros trabajo en este campo corresponden a autores alemanes, quienes en 1997 demostraron que elevados niveles de expresión de WT1 al diagnóstico en una serie que incluía pacientes tanto con LLA como LMA, mostraban peor SLP y SG. Ya en este trabajo, los autores comprobaron que el nivel de expresión de WT1 era una marcador potencialmente fiable y estable para predecir la posibilidad de recaída, sugiriendo un papel como marcador de enfermedad mínima residual (Bergmann et al., 1997). Similares hallazgos han sido reportados por autores británicos (Garg, Moore, Tobal, & Yin, 2003) españoles (Barragán et al., 2004) o chinos (Lyu et al., 2014). En la actualidad, es un tema de investigación su utilidad como potencial marcador de seguimiento de enfermedad mínima residual y predictor de recaída, con trabajos recientes que avalan su utilidad (Lambert et al., 2014). d) Sobreexpresión PRAME El gen PRAME fue descrito por primera vez en el contexto de pacientes con melanoma en el año 1997. Se encuentra localizado en la región 22q11 y codifica para una proteína que participa en el reconocimiento y presentación de antígenos a los linfocitos citotóxicos. Varios grupos han demostrado niveles elevados en células leucémicas e incluso algunos autores han observado menores probabilidades de SLP y SG para aquellos pacientes con niveles de expresión más elevados (Paydas et al., 2005), si bien otros autores como el trabajo anteriormente referido del grupo de Salamanca no reprodujeron esos resultados (Santamaria et al., 2009). Revisión del problema: Estado actual de la LMA 81 En definitiva, a pesar de que la evidencia disponible se sostiene sobre trabajos de base retrospectiva, cada vez más autores reclaman que estos marcadores de expresión deben ser incluidos en la batería de pruebas diagnósticas a realizar en los pacientes con LMA, aunque continua siendo un tema de debate abierto (Dohner et al., 2010; David Grimwade & Hills, 2009; T. H. Guido Marcucci, Hartmut Döhner, 2011; Mrozek, Marcucci, Paschka, Whitman, & Bloomfield, 2007). 2.3.4 MN1 El gen MN1 se encuentra situado en el cromosoma 22 en la banda 22q12, y codifica una proteína nuclear de 136 kDa, que se encuentra altamente conservada entre vertebrados. Su nombre “meningioma1” hace referencia a que fue identificado por primera vez en un paciente con meningioma portador de la translocación t (4;22)(p16;q11) (Heuser et al., 2006). Su función exacta continua siendo desconocida, y se ha postulado su papel con los receptores nucleares ligados al ácido retinoico (RAR-RXR) por presentar una secuencia de nucleótidos de la que se deduce una similitud estructural (Grosveld, 2007). Su implicación en la hematopoyesis se ha definido a través de dos tipos de evidencias. En primer lugar, la vía de los receptores del acido retinoico es una de las principales vías fisiológicas encargadas del control de la proliferación y maduración celular, con funciones bien establecidas en el desarrollo embrionario en especial de las estructuras derivadas del tubo neural. Los receptores del ácido retinoico (RAR) y receptores retinoides X (RXR) , son factores de transcripción nucleares con capacidad de reconocer al ácido retinoico, que a su vez es metabolizados a partir de carotenoides y retinoides, y unirse a regiones concretas del ADN (Das et al., 2014) ejerciendo una función activadora o represora de la transcripción según las interacciones con coactivadores y correpresores. En este grupo de co-metabolitos se incluye a MN1, dado que se ha descrito su interacción con coactivadores de los receptores RAR/RXR como P300 y RAC3 (van Wely et al., 2003), Revisión del problema: Estado actual de la LMA 82 siendo esta la vía por lo cual regularía la expresión de genes claves en la hematopoyesis. Y en segundo lugar, se ha documentado niveles de expresión de MN1 elevados en células madre de la hematopoyesis en estadios iniciales, mientras que en estados más avanzados de la hematopoyesis ni en los elementos presentes en sangre periférica es prácticamente ausente (Heuser et al., 2006), lo cual sugiere un papel clave en mantener las capacidades funcionales de las células stem. Figura 2.30 Niveles de expresión de CD34 (gris) y MN1 en muestras de donantes sanos. Se observa diferencias significativas según sean la expresión de CD34. Gráfica extraída del trabajo original (Heuser et al., 2006) En lo referente a que genes son modulados por la acción de MN1 los resultados no son concluyentes. Magda A.Meester-Smoor et al demostraron en 2008, que MN1 puede tener una acción dual, potenciando e inhibiendo la expresión de genes claves en la hematopoyesis entre los que encontraron un marcado aumento de la expresión de BMI1, SPAG6, DNAJC1 y COMMD3 (Magda A. Meester-Smoor et al., 2008). Por su parte Liu et al mediante técnicas de arrays de, observaron aumento de expresión de genes como FLT3 y CD34, postulándolos como posibles dianas “downstream” de MN1 (Liu et al., 2010). Revisión del problema: Estado actual de la LMA 83 Por último en modelos murinos, Suzan Imren et al, demostraron que inducir la sobreexpresión de MN1 en células hematopoyéticas CD34+ es capaz de promover las capacidades de auto renovación e inhibir la diferenciación al mantenerlas en cultivos in vitro (Imren et al., 2014) lo cual constituye una prueba de que participa en la maquinaria genética necesaria para mantener el fenotipo stem. Figura 2.31 Esquema del mecanismo de acción de MN1. A) unido al cofactor p300 se une a receptores nucleares RAR/RXR sobre los que inducirá una acción positiva o negativa de la transcripción. B) Unión directa sobre factores de transcripción aún no identificados y modulación de la expresión. Adaptado de G. Grosveld et al 2007. Su papel en la LMA se puso de relieve por primera vez en relación a la descripción de la translocación t(12;22)(p13;q11) cuyo resultado es la proteína de fusión MN1-TEL, a partir de lo cual se ha estudiado en distintos modelos el mecanismo a partir del cual interviene MN1 en la leucemogénesis. En primer lugar a partir del estudio de las consecuencias de la proteína de fusión MN1-TEL resultante de la t(12;22)(p13;q11). Trabajos de ingeniería genética en modelos murinos han permitido la inserción de la proteína quimérica para poder estudiar sus consecuencias desde el desarrollo embriológico. Así Hiroyuki Kawagoe y Gerard C. Grosveld demostraron que MN1-TEL puede ser considerado como un oncogén sobre la hematopoyesis al demostrar que esta proteína de fusión era capaz de generar fenotipos de expansión mieloide y linfoide a partir de progenitores, si bien por sí sola no era capaz de generar un cuadro de leucemia aguda, siendo necesario el desarrollo de mutaciones cooperantes (Kawagoe & Grosveld, 2005b). Revisión del problema: Estado actual de la LMA 84 Estos mismos autores crearon un modelo de leucemogénesis secuencial a partir de MN1 mediante la asociación de la proteína MN1-TEL con la sobreexpresión de HOXA9 que fue capaz de generar LMA en animales (Kawagoe & Grosveld, 2005a). De igual manera se ha demostrado que la sobreexpresión de MN1 puede actuar funcionalmente como un oncogén para la hematopoyesis. Michael Heuser et al demostraron que la inserción mediante retrovirus del gen MN1 en modelos animales, era capaz de inducir un fenotipo de LMA con una latencia atenuada, y que lo hace induciendo dos tipos de cambios en las células leucémicas, en primer lugar promoviendo la capacidad de auto renovación y proliferación y bloqueando la diferenciación. Esta doble acción justifica, según estos autores que se pueda generar un modelo de LMA animal con un solo hit genético. De hecho en sus conclusiones, se refieren a MN1 como uno de los más poderosos oncogenes hematológicos descritos hasta la fecha (Heuser et al., 2007). Otros autores también han demostrado el efecto leucemógeno de la sobreexpresión de MN1 pero en mecanismo de doble-hit. Por ejemplo, Suzan Imren et al demostraron que el trasplante de células CD34+ con inserción por retrovirus de MN1+, desarrollaba en los animales un fenotipo transitorio similar a un sdr mieloproliferativo (Imren et al., 2014), pero cuando asociaban además la expresión de un gen HOX, en concreto NUP98HOXD13, la transferencia de estas células generaba un fenotipo de LMA. Hallazgos similares son los aportados por Liu et al, que consiguen desarrollar el fenotipo de LMA con la asociación de la sobreexpresión de MN1 y el transcrito MLLENL (Liu et al., 2010). O por C. Carrella et al que asociando a la sobreexpresión de MN1 el gen quimérico Cbfb–SMMHC, generó un modelo de LMA de desarrollo rápido y con fenotipo similar al característico de la LMA CBF con inv16 (Carella et al., 2007). Revisión del problema: Estado actual de la LMA 85 Figura 2.32 Ejemplo de experimento de en modelos animales con transfeccion por retrovirus del gen MN1 comparada con controles sanos (GFP), tiempo hasta muerte por desarrollo de LMA. (Heuser et al., 2007) Además de esta evidencia obtenida de modelos in vitro y animales, se ha estudiado el impacto pronóstico que la sobreexpresión de MN1, definida a partir del número de copias de ARNm, tiene en grupos de pacientes afectos de LMA uniformemente tratadas. Los trabajos iniciales en este sentido corresponden a Michael Heuser et al del grupo cooperativo alemán AML-SHG en el año 2006 y fueron seguidos por trabajos del CALGB, Christian Langer et al en el año 2009, a los que se han ido sumando distintas series de otros grupos cooperativos y estudios unicéntricos. M .Heuser estudió una cohorte de 142 pacientes jóvenes con cariotipo normal, en el que tras análisis de la expresión de ARNm de MN1 mediante técnicas de qPCR, definieron el criterio de sobreexpresión del gen a partir del valor de la mediana poblacional, obteniendo una aproximación dicotómica de esta serie. Los resultados mostraron una menor tasa de remisión completa tras el ciclo de inducción (87,3% vs 71,8% p=0,02), mayor tasa de recaída (56.1% versus 36.5%, P =0 .03) y menor supervivencia global (38.1% versus 58.8% a 3 los años, P=0 .03) para el grupo definido como sobreexpresión de MN1. Revisión del problema: Estado actual de la LMA 86 Además, en lo referente a las características biológicas de la LMA, no encontraron diferencias en el número de leucocitos, edad, distribución por sexos, subtipos morfológicos o número de blastos al diagnóstico. Sí encontraron asociación significativa con la presencia de NPM1 germinal y con alta expresión de CD34+ por los blastos leucémicos (Heuser et al., 2006). Figura 2.33 Probabilidad de supervivencia según el nivel de expresión de MN1 en la serie original estudiada por M. Heuser. Obsérvese la distribución dicotómica de la serie. (Heuser et al., 2006). A continuación, los autores del grupo CALGB reprodujeron estos resultados en una serie de 119 pacientes con LMA con cariotipo normal, igualmente de manera retrospectiva, en una cohorte con tratamiento homogéneo (Langer et al., 2009). Si bien los resultados en términos de tasa de remisión completa, SLP y SG son reproducibles a los del trabajo original, es de interés remarcar ciertas diferencias metodológicas. En primer lugar, estos autores consideran los niveles de expresión como una variable cuantitativa, no cualitativa y reproducen los resultados a partir de aquellos por debajo del percentil 25 de la variable (SG a los 5 años del 80% frente al 40%). Revisión del problema: Estado actual de la LMA 87 Y en segundo lugar tuvieron la posibilidad de profundizar en los hallazgos biológicos y las asociaciones de MN1 mediante la realización de arrays de expresión, encontrando una fuerte asociación entre los niveles elevados de MN1 y BAALC, y además confirmaron asociación con el genotipo NPM1 germinal. Por último, el impacto pronóstico en este trabajo se mantuvo tras hacer análisis multivariable, conservando la significación tanto para tasa de RC, SLP y SG. En los años siguientes han continuado publicándose trabajos que exploran el papel de MN1. En general, estos trabajos consisten en análisis retrospectivos de series de pacientes homogéneamente tratados en los que los autores estudian MN1 en el contexto de análisis de múltiples variables, con la finalidad de determinar, primero el impacto individual de cada una de ellas en la SG y SLP, y a partir de ahí construir modelos predictivos para optimizar la estratificación pronóstica de los pacientes en especial del grupo de riesgo intermedio. En el año 2009, autores del grupo de Salamanca encabezados por Jesús San Miguel y Marcos González, proponen un modelos de estratificación para LMA de riesgo citogenético intermedio, tras estudiar marcadores que incluían la sobreexpresión de los genes ERG, EVI1, MLL-PTD, MN1, PRAME, RHAMM, y WT1, en una cohorte de 121 pacientes tratados de acuerdo al protocolo PETHEMA LMA 99 (Santamaria et al., 2009). En el análisis bivariante, MN1 no demostró significación estadística ni para SLP ni SG, por lo que no fue incluido en el modelo predictivo propuesto en el que si se incluyeron ERG, EVI1 y PRAME (Santamaria et al., 2009). El grupo HOVON en el año 2011, a partir del estudio de las muestras de 439 pacientes tratados conforme a sus protocolos desde 1986 hasta 2006, e incluyendo cualquier tipo de citogenética construyeron un modelo pronóstico a partir de los niveles de expresión de los genes EVI1, WT1, BCL2, ABCB1, BAALC, FLT3, CD34, INDO, ERG y MN1, y las mutaciones en FLT3, NPM1, N-RAS, K-RAS, IDH1, IDH2, CEBPA. Revisión del problema: Estado actual de la LMA 88 En el análisis bivariante, la sobreexpresión de MN1 mostró significación estadística para peor SG y SLP, en especial para aquellos pacientes con cariotipos de riesgo intermedio. Sin embargo, tras el ajuste estadístico multivariante MN1 perdió la significación estadística y no fue incorporado al modelo predictivo en el que si se incluyeron niveles de expresión de CD34 y mutaciones de IDH2 y CEBPA(Rockova et al., 2011). Similar aproximación realizaron los grupos AML SHG y HOVON-SAKK, para pacientes con LMA de riesgo intermedio en los que analizaron las mutaciones NPM1, FLT3, CEBPA, MLL, NRAS, IDH1/2, y WT1, junto con los niveles de expresión de BAALC, ERG, EVI1, ID1, MN1, PRAME y WT1, medidos a por qPCR y definidos a partir del valor de la mediana poblacional. En este estudio, la sobreexpresión de MN1 sí demostró un impacto en la SG por lo que se incluyó en el score predictivo (Damm et al., 2011). Haferlach et al estudiaron la sobreexpresión de MN1, BAALC, CDKN1B, y ERG con independencia del grupo citogenético. Se definió sobreexpresión a partir del percentil 50 del valor de la serie, con una distribución dicotómica. El análisis para el gen MN1, demostró impacto estadísticamente significativo tanto para SLP como SG, que se conservó al completar el estudio multivariante por lo que estos autores lo incluyen en su modelo predictivo (C. Haferlach et al., 2012). Para finalizar la revisión sobre el impacto pronóstico, recientemente se han publicado tres nuevos trabajos, basados en tecnología de qPCR y asignación dicotómica a partir del valor de la mediana de la población de pacientes con LMA a estudio. Autores del CALGB, demostraron que en pacientes mayores de 60 años, bajos niveles de expresión de MN1 se asocia mayor probabilidad de respuesta y por tanto mejor probabilidad de supervivencia (Schwind et al., 2011), autores chinos reproducen el impacto pronóstico en pacientes jóvenes tanto en tasa de RC, de SG y de recaída, (Xiang et al., 2013), y por últimos autores egipcios reprodujeron resultados pronósticos con la novedad de definir un punto de corte a partir de técnicas de qPCR (Aref, Ibrahim, Morkes, Azmy, & Ebrahim, 2013). Revisión del problema: Estado actual de la LMA 89 En último lugar, tras revisar la evidencia de su papel pronóstico en pacientes con LMA, a continuación resumiremos su posible papel como marcador biológico para selección tratamiento. Ya se ha explicado con anterioridad como MN1 actúa a través de la vía de los receptores nucleares RAR/RXR modulando su actividad al actuar como coactivador/correpresor (van Wely et al., 2003), siendo esta la diana molecular de acción del Ácido al-trans-retinoico (ATRA) de uso clave en el tratamiento de la leucemia agua promielocítica t(15;17) PML-RARα (Miguel A. Sanz et al., 2004). En los últimos años, varios grupos cooperativos han testado la posibilidad de incorporar el ATRA al tratamiento de las LMA sin presencia de la t(15;17) PML-RARα. Si bien los resultados clínicos publicados hasta la fecha no avalan su uso, análisis a posteriori en los que se han ido incluyendo nuevas variables biológicas, como MN1 han aportado información que puede avalar su uso en subgrupos de pacientes. En 2007 M. Heuser et al analizaron retrospectivamente una cohorte de 83 pacientes con LMA y mayores de 60 años tratados con quimioterapia intensiva y randomizados a recibir ATRA como tratamiento asociado. Si bien no encontraron diferencias en probabilidad de supervivencia ni de remisión completa según los niveles de expresión de MN1, cuando se analizaba a los pacientes con bajo nivel y que recibieron tratamiento con ATRA si presentaban un aumento significativo en la probabilidad tanto de SLP como de SG frente a los otros grupos de pacientes (Heuser et al., 2007). Tras la publicación de este trabajo, el grupo británico revisó su experiencia en un grupo de pacientes de similares características (n=196) pero menores de 60 años y con un diseño de ensayo clínico similar con randomización a recibir ATRA o no. En su publicación, aunque no encontraron impacto pronóstico para la sobreexpresión de MN1, ni efecto del tratamiento con ATRA en términos de SG o tasa de RC, si encontraron una ventaja estadísticamente significativa en términos de SLP, justo para aquellos pacientes con bajos niveles de MN1 y asignados a recibir tratamiento con ATRA (Carol Guy, 2008). Revisión del problema: Estado actual de la LMA 96 Fundamento del presente trabajo 97 3.- Fundamento del presente trabajo. Utilidad de la sobreexpresión de genes MN1 y BAALC en el manejo de los pacientes con LMA Tras más de diez años transcurridos desde la publicación de los primeros resultados de expresión de los genes MN1 y BAALC (Baldus et al., 2003; Heuser et al., 2006) por cuantificación de ARNm en pacientes con LMA, estas determinaciones todavía siguen fuera de la práctica clínica asistencial, permanecen sin ser recomendadas por los distintos grupos cooperativos como necesarias para el abordaje de la LMA, ni por las recomendaciones de expertos de la European LeukemiaNET (Dohner et al., 2010; Miguel Angel Sanz & Moscardo, 2010) . Todo ello a pesar de la evidencia creciente a favor del papel que los cambios de expresión de genes pueden tener en el proceso de leucemogénesis y que podemos resumir en los cinco puntos siguientes. a) Papel en la hematopoyesis: Tanto MN1 como BAALC, se encuentran sobreexpresadas en las células stem de la hematopoyesis en condiciones normales (Heuser et al., 2006; Tanner et al., 2001). b) Papel en la Leucemogénesis: Si bien existen más puntos por dilucidar en relación a BAALC, en la actualidad existen modelos animales de leucemogénesis a partir de MN1 lo que constituye una prueba de concepto de su potencial papel como oncogén de la hematopoyesis (Heuser et al., 2012; Imren et al., 2014). c) Papel en el pronóstico de los pacientes con LMA. Como se ha descrito en las páginas previas, existe abundante literatura, incluyendo un metaanálisis de publicación reciente para BAALC en que se aprecia el impacto pronóstico, en especial en términos de SLP y SG de los pacientes asociado a mayores niveles de expresión (Langer et al., 2009; Xiang et al., 2013; Xiao et al., 2015). Fundamento del presente trabajo 98 d) Plausibilidad biológica: Los estudios de secuenciación masiva de pacientes con LMA, han puesto de manifiesto que las mutaciones en la maquinaria enzimática que regula la expresión génica son un evento extraordinariamente frecuente (Cancer Genome Atlas Research, 2013). Las consecuencias funcionales de estas mutaciones, implican a su vez cambios en las expresiones de genes que juegan papeles claves en las hematopoyesis y que contribuyen al proceso de leucemogénesis (Chen et al., 2010). e) Potencial papel como marcadores de Enfermedad mínima residual: Existe publicaciones que de manera retrospectiva ha definido puntos de corte con capacidad de anticipar la recaída para los pacientes con sobreexpresión de BAALC, WT1 y PRAME (Lapillonne et al., 2006; Weber et al., 2014). Sin embargo, existe una serie de factores, que pueden explicar el por qué estas determinaciones continúan fuera de la práctica asistencial: a) Problemas de estandarización. Si bien la tecnología de cuantificación por PCR de ARNm está ampliamente extendida y validada, la definición de sobreexpresión para cada gen se realiza de manera independiente por cada grupo de trabajo, por lo que los resultados y las mediciones no son extrapolables. b) Definición de sobreexpresión. En ese sentido, es importante remarcar, que en muchos trabajos la definición de sobreexpresión se hace en base a un criterio puramente poblacional, de tal manera que se definen como portador de sobreexpresión del gen a los que se encuentran por encima del valor del percentil 50 del conjunto de la serie. Esto implica que cuando enfocamos la necesidad de tomar decisiones en un paciente requerimos del estudio previo de una población de pacientes con LMA para poder definir el patrón de expresión y asignar al nuevo paciente a un grupo de riesgo (Xiao et al., 2015). c) Tipo de investigación. Fundamento del presente trabajo 99 Hasta el momento, todos los trabajos publicados con sobreexpresión de genes son retrospectivos, no existiendo datos de estudios prospectivos, ni muchos menos, protocolos asistenciales en los que se incluyan dentro del algoritmo terapéutico. Por todo ello, se propone el presente trabajo, en el que a partir de una serie de 119 pacientes afectos de LMA, tratados homogéneamente con quimioterapia de inducción basada en la combinación de antraciclínicos y citarabina, se pretende estudiar el papel de la expresión de los genes MN1 y BAALC, en la probabilidad de alcanzar remisión completa, y secundariamente en SLP y SG. Dado que se trata de una serie retrospectiva, como novedad se investigarán dos valores para definir la sobreexpresión del gen: - A partir del percentil 50 de la población estudiada como ha sido descrito previamente en la literatura como método estándar. - A partir de 2,5 desviaciones estándar de la media observada en una población de donantes sanos. Además se explorará la relación existente entre la respuesta morfológica tras la quimioterapia de inducción y la expresión de ambos genes en el momento de estudio de la respuesta alcanzada y el papel de este nivel de expresión son la SLP y SG y por último, se estudiará el perfil de expresión de los genes MN1 y BAALC en el momento de la recaída, como análisis exploratorio de su potencial papel como marcadores de enfermedad mínima residual, si se confirman como valores estables tanto al diagnóstico como en la recaída. Fundamento del presente trabajo 100 Objetivos 101 4.- Objetivos 4.1 Objetivo principal: Estudiar el Impacto de la sobreexpresión de los genes MN1 y BAALC al diagnóstico sobre la probabilidad de alcanzar la remisión completa morfológica con el primer ciclo de quimioterapia en una serie de pacientes con LMA homogéneamente tratados. 4.2 Objetivos secundarios: 1.- Comparación de dos métodos de análisis para definir sobreexpresión de los genes estudiados: 1) Desde criterios poblacionales, a partir del percentil 50 de la población estudiada, y 2) Estableciendo como punto de corte + 2,5 desviaciones estándar del valor medio de expresión en un grupo control de pacientes sanos. 2.- Impacto de la sobreexpresión de los genes MN1 y BAALC, al diagnóstico en la supervivencia libre de progresión y supervivencia global. 3.- Asociación entre la sobreexpresión de los genes MN1 y BAALC, tras el primer ciclo de quimioterapia con la respuesta morfológica alcanzada y con supervivencia global y libre de progresión 4.- Asociación entre el perfil de expresión de los genes MN1 y BAALC, al diagnóstico con el existente en el momento de la recaída morfológica. 5.- Comparación de los niveles de expresión de MN1 y BAALC al diagnóstico con los detectados en la evaluación postquimioterapia de inducción y en el momento de la recaída. Objetivos 102 Material y métodos 103 5.- Material y métodos 5.1 Planteamiento metodológico y población a estudio Se realizó un estudio de tipo retrospectivo transversal sobre una cohorte de 119 pacientes con diagnóstico confirmado de Leucemia Mieloblástica Aguda y tratados con al menos un ciclo de quimioterapia de inducción basado en la combinación entre citarabina en perfusión continua y un antraciclínico. Se incluyeron pacientes tratados en el servicio de Hematología del Hospital Dr. Negrín entre el 1 de enero de 2004 y el 31 de diciembre de 2014, y tratados en el servicio de Hematología del Hospital Insular entre el 1 de enero de 2009 y 31 de diciembre de 2013. Se debía disponer de una muestra válida para análisis de la respuesta morfológica alcanzada tras el primer ciclo de quimioterapia. No se incluyeron en esta tesis los pacientes con diagnóstico de leucemia promielocítica (LPA) ni aquellos que cumplían alguno de los siguientes criterios: - Paciente con diagnóstico de LMA y que habiendo recibido quimioterapia de tipo intensivo, no existiese reevaluación de la respuesta obtenida. - Paciente con diagnóstico de LMA y que habiendo recibido quimioterapia de tipo intensivo, fuera exitus sin poder documentarse la respuesta obtenida al tratamiento quimioterápico. - Pacientes afectos de sarcoma mieloide sin presencia de enfermedad en médula ósea. El punto de fin de seguimiento se estableció en mayo de 2015. El trabajo ha sido de tipo observacional, no intervencionista. 5.2 Procedimientos técnicos 5.2.1 Diagnóstico de LMA El diagnóstico de LMA se estableció en base a los criterios definidos por la OMS en sus manuales de referencia para el diagnóstico de las hemopatías malignas en su edición 2001 (Vardiman, Harris, & Brunning, 2002) y 2008 (Arber et al., 2008). Material y métodos 104 Para establecer el diagnóstico se estudiaron muestras de aspirado de médula ósea, mediante tinción de May-Grünwald Giemsa y se siguieron los criterios morfológicos habituales, mediante recuento en medulograma de 500 células, que requieren un porcentaje de blastos superior al 20%. Los criterios seguidos para la correcta clasificación morfológica se complementaron con los criterios FAB (Bennett et al., 1976). Solamente en los casos en los que no se pudo disponer de muestra de medula ósea se consideró el estudio en sangre periférica como válido, con presencia de más de un 20% de blastos sobre un recuento de 200 células (Dohner et al., 2010). Las técnicas de citoquímica se realizaron a criterio de los hematólogos expertos en citología que valoraron las muestras. La codificación de las LMA se realizo según la clasificación de la OMS del año 2008 (S.H. Swerdlow, 2008), de tal manera que se definieron los subtipos de LMA en base a los hallazgos morfológicos de manera inicial y sólo tras los hallazgos de la citogenética se incluyeron en el grupo oportuno. Además, se reconocieron dos entidades ya definidas por la OMS, como son las LMA con displasia multilínea, en la que además de por los hallazgos morfológicos se incluyen los pacientes con historia previa de enfermedades del compartimento de las células stem (SMD o SMD/NMPC), y las LMA secundarias a tratamiento quimio o radioterápico, de tal manera que la clasificación por grupos morfológicos quedó de la siguiente manera tal y como se indica en la tabla 5-1. Grupo morfológico TIPO FAB DIFERENCIACIÓN PREDOMINANTE LMA mínimamente diferenciada M0 Serie granulocítica. LMA sin maduración M1 Serie granulocítica. LMA con maduración M2 Serie granulocítica. LMA Mielomonocítica M4 Serie granulocítica y monocítica. LMA Monoblástica/Monocítica M5 Serie monocítica. Leucemia eritroide aguda M6 Serie eritroide y granulocítica. LMA Megacarioblástica M7 Serie megacariocítica. LMA Basofílica aguda Serie granulocítica. Panmielosis aguda con fibrosis Con displasia multilínea Cualquiera Material y métodos 105 Secundaria a terapia Cualquiera Tabla 5.1 Clasificación morfológica según criterios OMS, independiente de la citogenética y molecular 5.2.2 Análisis citogenético y FISH. Citogenética: Se basó en el análisis de 2 ml de muestra de médula ósea en Heparina de Litio para estudio citogenético. Las muestras del hospital Dr. Negrín entre los años 2004 y 2010 se remitieron al Laboratorio externo Balagué Center, y a partir de Julio 2010 y hasta la fecha de fin del presente estudio a Reference Laboratory. Las muestras del Hospital Insular de Gran Canaria se enviaron para estudio al laboratorio externo Reference Laboratory. Ambos centros cuentan con criterios de trabajo validados por auditorías externas y con certificados de gestión de calidad expedidos por AENOR conformes a las normativas ISO 9001 (desde el año 2000 para Balague Center y desde 1998 para Reference Laboratory). De manera estándar se consideraron para el análisis 20 metafases. Cuando no se obtuvieron metafases, se investigó la presencia de alteraciones específicas mediante FISH según el criterio del citólogo responsable de estudio de la muestra y en función de los hallazgos morfológicos y clínicos del caso. FISH: El estudio FISH de las muestras del Hospital Insular se ha realizado en laboratorio externo Reference Laboratory, mientras que para las muestras del Hospital Dr. Negrín hasta el año 2010 se uso estudiaron en el laboratorio Balagué Center. Desde esa fecha hasta 2014 en la sección de biología Molecular y FISH del laboratorio de Hematología del Hospital Dr. Negrín partiendo de 2 ml de muestra de médula ósea en EDTA. 5.2.3 Estudio de citometría. En el momento del diagnóstico se obtuvieron 2 ml de médula ósea conservada en EDTA para el estudio expresión antigénica mediante citometría de flujo. Material y métodos 112 En la literatura médica se incluye una categoría no reconocida en nuestro trabajo que es la situación de Respuesta parcial definida por la presencia de un recuento en el aspirado de médula ósea de la reevaluación de blastos entre el 5 y el 25 % o un descenso del 50% comparado con la cifra inicial de blastos. Sin embargo, esta definición se considera relevante sólo en el contexto de ensayos clínicos fase 1-2, por lo que para nuestro trabajo se siguió la recomendación del grupo PETHEMA (Miguel Angel Sanz & Moscardo, 2010), quienes recomiendan repetir medulograma en el plazo de una semana aproximadamente para discernir si nos encontramos en una situación de recuperación o de persistencia de enfermedad, siendo este segundo aspirado el fue considerado para definir al respuesta obtenida. e) Recaída. Reaparición de más de un 5% de blastos en médula ósea o en sangre periférica en paciente que previamente ha alcanzado una respuesta de remisión completa o remisión completa sin recuperación periférica. En nuestro trabajo no se requirió que esta remisión completa estuviera mantenida en el tiempo. 5.3.5 Definición de tiempos de supervivencia. a) Supervivencia global. Tiempo entre el momento del diagnóstico y el último seguimiento del paciente. En este último seguimiento se codificó la situación del paciente en relación a su enfermedad, en forma de tres posibles situaciones: - Exitus: En nuestra serie se consideran todas las causas de exitus, no solo las relativas a la leucemia, si bien, dado que como criterio de inclusión se consideraron aquellos pacientes que habían alcanzado alguna respuesta a la quimioterapia de inducción, quedan excluidos los exitus en la inducción por complicaciones. - Remisión completa. Dentro de los dos primeros años de seguimiento, se codificó como último seguimiento la fecha del último aspirado de control. En pacientes Material y métodos 113 con supervivencia superior a los dos años, se incluyó la fecha de última visita en consulta de Hematología - Persistencia de la enfermedad. Paciente que la última visita realizada existen datos objetivos de persistencia o reaparición de la LMA. b) Supervivencia libre de progresión. Tiempo transcurrido entre el momento de alcanzar la primera remisión completa y la recaída. Se aplican los mismos matices definidos que para la supervivencia global. 5.4 Método de recogida y explotación de datos. La recogida de datos se realizó mediante revisión de historias clínicas informatizadas con consulta de datos analíticos en bases informáticas. Los datos de todos los casos y sus respectivas variables se recopilaron en una hoja de cálculo. Todos los pacientes firmaron un consentimiento informado que permitió el uso de esta información para su investigación. La descripción de las variables se realizó con medidas de tendencia central y dispersión en las cuantitativas y con proporciones en las categóricas. Además en aquellos casos representativos se mostró histograma (con curva de normalidad) y gráficos de caja y bigotes. La normalidad de las variables cuantitativas se analizó mediante la prueba de Kolmogorov-Smirnov (con corrección de Lilliefors) de manera global y categorizada cuando procedió. La supervivencia se estudió mediante Kaplan-Meier y curvas de supervivencia. Para valorar la sensibilidad y especificidad de una variable cuantitativa según puntos de corte se emplearon curvas ROC con su área bajo la curva (AUC). Las pruebas empleadas para el análisis bivariante fueron las siguientes: - Correlación entre variables cuantitativas: test de Pearson o Spearman según cumplieran o no normalidad. Material y métodos 114 - Asociación entre variables cuantitativas y categóricas: test de Levene para comparar varianzas, ANOVA (con test post-hoc de Bon Ferroni), test de t-Student, U de Mann-Whitney y U de Wilcoxon para datos apareados. - Asociación entre variables categóricas: test de Chi cuadrado, asociación Lineal por Lineal (LxL) y test exacto de Fisher. Como medida de asociación se empleó el Riesgo Relativo. - Análisis de supervivencia: prueba de log-rank y regresión de Cox. Como medida de asociación se empleó Hazard Ratio. - Asociación entre variables categóricas con datos apareados, prueba de MacNemar. Las pruebas empleadas para el análisis multivariantes fueron las siguientes: - Regresión logística binaria para variable dependiente dicotómica. - Regresión de Cox para supervivencia. En todos los casos se utilizó un límite de significación menor de 0,05, considerándose cuasi significativo entre 0,10 y 0,05. El software empleado fue Excel 2003 para la recogida de datos y SPSS para Windows versión 15.0 para el análisis estadístico. Resultados 115 6.- Resultados. 6.1 Análisis descriptivo de la serie. Características demográficas, biológicas y terapéuticas. Se incluyeron un total de 119 pacientes que cumplían los criterios de inclusión. La distribución por sexos reflejó un predominio de varones sobre mujeres (58,8% frente a 41,2%). La edad media de diagnóstico de la LMA fue de 53,7 años con un IC al 95% 50,8 -56,5, siguiendo una distribución no normal (prueba de Kolmogorov-Smirnov p 0,004). Por lo que usamos la mediana como estadístico de tendencia central con un valor de 56 años (rango 15-79 años) que define un recorrido de la variable de 64 años y un rango intercuartílico de 23 años. En el histograma de frecuencia con curva de normalidad, se aprecia una curva bimodal tomando como referencia la edad de 60 años. Figura 6.1 Distribución de frecuencias de los pacientes según edad al diagnóstico El estado general de los pacientes definido mediante valoración por la escala funcional ECOG reveló la distribución indicada en la Tabla 6.1 Edad al diagnóstico 80,0060,0040,0020,0010,00 Frecuencia 25 20 15 10 5 0 Resultados 116 Las características de las variables biológicas cuantitativas en nuestra serie como leucocitos, hemoglobina, blastos en médula ósea, en sangre periférica, plaquetas y creatinina, se muestran en la Tabla 6.2 Tabla 6.2 Resumen de los descriptivos de tendencia central de Leucocitos, Hemoglobina, plaquetas y blastos al momento del diagnóstico Media IC 95% Mediana Amplitud recorrido Leucocitos 36874,45 25264,92 – 48483,97 7600 40100 900-314000 Hemoglobina* 9 8,66 – 9,35 8,9 2,3 4,5-14,4 Plaquetas 75594,92 61673,3489516,49 52100 79225 2200-530000 Blastos SP 35,62 29,53-41,71 27 60 0-96 Blastos MO 55,98 51,37-60,59 53,5 45 2-99 Creatinina 0,91 0,86 -0,97. 0,8 0,3 0,5-2,4 * Variable con distribución normal La distribución de las LMA por grupos morfológicos fue la siguiente (Tabla 6.3): Tabla 6.3 Distribución por grupos morfológicos según criterios OMS Tipo Morfológico Frecuencia Porcentaje LAM indiferenciada 9 7,6 LAM sin maduración 16 13,4 LAM con maduración 19 16,0 LAM Mielomonocítica 25 21,0 LAM Monoblástica 13 10,9 Eritroleucemia 6 5,0 LAM con displasia multilínea 19 16,0 Tabla 6.1 Distribución de pacientes de acuerdo a la escala ECOG Frecuencia Porcentaje Valor Escala 0 11 9,2 1 59 49,6 2 42 35,3 3 7 5,9 Total 119 100,0 Resultados 117 LAM relacionada con terapia 12 10,1 Total 119 100,0 En la tabla 6.4 se muestran los resultados obtenidos en el estudio citogenético al momento del diagnóstico de la LMA y su frecuencia en la cohorte de pacientes. Tabla 6.4 Frecuencia de los hallazgos observados en el estudio de cariotipo al diagnóstico Cariotipo n % Cariotipo n % Normal 69 57,98 t (6,9) 1 0, 84 t (8;21) 8 6,72 t (3;4) 1 0, 84 Inv16 2 1,68 t (15;21) 1 0, 84 +8 8 6,72 48 XY 1 0, 84 Complejo (≥ alt) 13 10,92 add 15 (q26) 1 0, 84 -7 3 2,52 add 14 1 0, 84 Del 5q 2 1,68 +11 1 0, 84 Hiperdiploide 2 1,68 +21 1 0, 84 t (3;17) 1 0, 84 No creció 3 2,52 La presencia de mutaciones en NPM1 y FLT3 se estudió en los pacientes con cariotipo normal y también en los de cariotipo sin crecimiento. La incidencia se muestra en la Tabla 6.5. Tabla 6.5 Mutación NPM1 Mutación FLT3 Frecuencia Porcentaje Frecuencia Porcentaje Mutado 27 37,0 23 31,5 No mutado 45 63,0 49 68,5 Total 72 100,0 72 100,0 La frecuencia de los grupos de riesgo citogenético según clasificación recomendada por PETHEMA (Miguel Angel Sanz & Moscardo, 2010) y por European Leukemia NET en el año 2010 (Dohner et al., 2010) se indican en las Tabla 6.6 y 6.7. Resultados 118 Tabla 6.6 Grupos de riesgo según citogenética al diagnóstico Frecuencia Porcentaje Grupo de buen pronóstico 10 8,4 Riesgo Intermedio 90 75,6 Pronóstico Adverso 19 16,0 Total 119 100,0 Tabla 6.7 Riesgo biológico según clasificación ELN 2010 Frecuencia Porcentaje Grupos de riesgo Bueno 28 23,5 Intermedio 72 60,5 Intermedio 1 53 44,5 Intermedio 2 19 16,0 Adverso 19 16,0 Total 119 100,0 Las características de expresión de antígenos celulares al diagnóstico se resumen en la Tabla 6.8 Tabla 6.8 Características de inmunofenotipo POSITIVO NEGATIVO NO DISPONIBLE/NO DATOS Antígeno N % N % N % CD34 71 59,5 27 22,7 21 17,6 CD117 83 69,7 10 8,4 26 21,8 DR 84 70,6 12 10,1 23 19,3 Los 119 pacientes (100%) recibieron quimioterapia de inducción mediante dos esquemas “7+3” y” 5+2”. Las frecuencias observadas fueron las siguientes para ambos tratamientos (Tabla 6.9). Tabla 6.9 Tipo Quimioterapia inducción Esquema inducción Frecuencia Porcentaje 7+3 107 89,9 5+2 12 10,1 Total 119 100,0 Resultados 119 Tal y como se muestra en la figura 6.2, la edad media de los pacientes fue significativamente diferente según el tipo de quimioterapia de inducción recibida. Siendo de 51,66 años (IC 95%, 48,79 – 54,52) en los pacientes tratados con el esquema 7+3 y de 72,08 años (IC 95% 69,08-75,08) en los que recibieron el protocolo 5+2 (p<0,001). Figura 6.2 Comparación entre edades medias al momento del diagnóstico según el tipo de quimioterapia recibida. En cuanto al tratamiento de intensificación, en la serie se observaron cuatro posibilidades. Las frecuencias observadas para estas opciones son las siguientes (Tabla 6.10). Tabla 6.10 Tipo de tratamiento post-inducción o de intensificación. Frecuencia Porcentaje TPH Alogénico 38 31,9 Quimioterapia o TPH Autólogo 38 31,9 Hipometilantes (Azacitidina) 4 3,4 No recibe 39 32,8 Total 119 100,0 Tipo Quimioterapia inducción 5+27+3 Edad al diagnóstico 80,00 60,00 40,00 20,00 0,00 Resultados 120 6.2 Características de las variables a estudio 6.2.1 Características descriptivas y analíticas de la variable expresión MN1 en relación al resto de variables. El nivel de expresión de MN1 se obtuvo en un total de 113 casos (95%) del total de la serie con 6 casos perdidos. El recorrido de la variable discurre entre 0,00 y 36,11, sin seguir una distribución normal (prueba de Kolmogorov-Smirnov p<0,001). La media observada fue de 1,89 con IC al 95% entre 0,94-2,84. La mediana fue de 0,41 con un rango intercuartílico de 0,99. El histograma con la distribución de la variable se muestra a continuación (Figura 6.3). Figura 6.3 Gráfico de cajas y bigotes para la distribución de la variable MN1 de manera cuantitativa Como se describe en la bibliografía, se define sobreexpresión mediante estudio de la población enferma a partir del Percentil 50 o mediana, es decir, >0.41 en nuestra cohorte. En el presente trabajo planteamos un criterio alternativo, que es considerar sobreexpresión a partir de 2,5 DS de una población control, es decir, >0,14 (ver apartado 5.5.2 de Material y Métodos) Resultados 121 La frecuencia de pacientes definidos como sobreexpresión mediante P50 fue la siguiente (Tabla 6.11): Tabla 6.11 Frecuencia de Sobreexpresión MN1 si >P50 población enferma. Frecuencia Porcentaje Sobreexpresión Positiva 58 51,3 Sobreexpresión Negativo 55 48,7 Total 113 100,0 Mientras que la distribución según nuestro método (>2,5DS) se indica a continuación (Tabla 6.12): Tabla 6.12 Frecuencia de Sobreexpresión MN1 si >2,5 DS media población control. Frecuencia Porcentaje Sobreexpresión Positiva 77 68,1 Sobreexpresión Negativo 36 31,9 Total 113 100,0 El estudio analítico de la asociación de la expresión de MN1 con otras variables biológicas se hizo teniendo en cuenta sólo aquellos pacientes para los que se tenía valor de MN1 excluyéndose los 6 casos con valores perdidos. En primer lugar se analizaron las asociaciones con otras variables cuantitativas y considerando a MN1 como una variable cuantitativa. No se observó correlación entre MN1 con cifra de leucocitos (p >0,5), hemoglobina (p>0,05), plaquetas (p>0,5), blastos en sangre periférica (p >0,1), blastos en médula ósea (p>0,05) ni edad (p>0,1). El estudio de la asociación y correlación entre las variables principales del estudio, MN1 y BAALC, como variables cuantitativas reveló una correlación r² lineal de 0,28, mientras que el índice de correlación de Spearman resultó de 0,7 (p<0,001). Resultados 128 Expresión CD34 47,9% 52,1% >0,5 χ² Expresión CD117 54,2% 45,8% >0,5 χ² Expresión DR 57,1% 42,9% >0,5 χ² CG buen pronóstico 80% 20% 0,024 LxL CG riesgo intermedio 56,7% 43,3% CG pronóstico Adverso 36,8% 63,2% Quimioterapia 7+3 58,9% 41,1% 0,025 χ² Quimioterapia 5+2 25% 75% 0,025 χ² Para analizar el impacto de los grupos de riesgo citogenético se realizó regresión logística binaria, y considerándose como factor de riesgo para la condición persistencia de enfermedad y con el grupo de buen pronóstico como referencia con un Exp(B) de 6,857 (IC 95% 1,124-41,82) p=0,037 para adverso y con p>0,1 con Exp(B) 3,06 (IC 95% 0,61-15,22) para el intermedio. En la tabla 6.22 se muestra la asociación de las principales variables categóricas estudiadas con la remisión o persistencia, así como el valor de los riesgos relativos encontrados. Tabla 6.22 Asociación de variables cualitativas con la condición de PERSISTENCIA a la quimioterapia de Inducción Variable P valor RR IC Estadístico NPM1 mutado 0,011 0,472 0,240-0,929 χ² FLT3 mutado >0,5 0,997 0,618-1,611 χ² Expresión CD34 >0,5 1,563 0,877-2,787 χ² Expresión CD117 0,99 1,145 0,517-2533 Fisher Expresión DR >0,5 1,286 0,557-2,970 χ² Quimioterapia 5+2 frente 7+3 0,025 1,824 1,225-2,714 χ² Quimioterapia 7+3 frente a 5+2 0,025 0,548 0,368-0,816 χ² Resultados 129 Asociación de variables cualitativas con la condición de REMISION COMPLETA a la quimioterapia de Inducción Variable P valor RR IC Estadístico NPM1 mutado 0,011 1,552 1,156-2,083 χ² FLT3 mutado >0,5 1,002 0,683-1,471 χ² Expresión CD34 >0,5 0,718 0,877-2,787 χ² Expresión CD117 0,99 0,904 0,525-1,556 Fisher Expresión DR >0,5 0,857 0,552-1,332 χ² Quimioterapia 5+2 frente 7+3 0,025 0,425 0,157-1,146 χ² Quimioterapia 7+3 frente a 5+2 0,025 2,355 0,873-6,355 χ² 6.3.1.1 Influencia de MN1 y BAALC sobre la RC y persistencia El análisis del impacto de las variables principales del estudio MN1 y BAALC sobre la persistencia se llevó a cabo considerando las variables como cuantitativas (resultados ya mostrados en Tabla 6.20), y también como categóricas según los dos puntos de corte correspondientes a los dos criterios establecidos. A continuación se muestran los resultados para la variable MN1, para el cual solo se consideraron los casos con valor de MN1, excluyéndose 6 casos perdidos. Además de los resultados mostrados en la tabla 6.20 como variable cuantitativa con distribución no normal, se procedió realizar estudio mediante curvas ROC, para identificar la asociación entre MN1 y la condición de persistencia Resultados 130 Figura 6.6 Curvas ROC de la variable MN1 para la condición de persistencia de enfermedad A continuación, en la Tabla 6.23 se muestra el estudio de sensibilidad y especificidad de los valores de MN1 respecto a la persistencia de enfermedad tras la quimioterapia de inducción. Tabla 6.23 Correspondencia entre valores de MN1 y sensibilidad y especificidad para hallazgo de persistencia a la quimioterapia de inducción Valor MN1 Sensibilidad Especificidad Valor MN1 Sensibilidad Especificidad 0,000225 100% 2% 0,415 65% 63% 0,00515 100% 5% 0,425 65% 64% 0,0068 100% 6% 0,445 61% 66% 0,008 100% 8% 0,465 59% 67% 0,01 100% 9% 0,51 57% 69% 0,0115 98% 11% 0,535 55% 70% 0,013 98% 13% 0,56 53% 73% 0,016 96% 19% 0,625 51% 75% 0,0175 96% 20% 0,69 49% 75% 0,0195 94% 20% 0,78 49% 80% 0,0215 94% 22% 0,795 47% 80% 0,0225 92% 22% 0,81 45% 80% 1 - Especificidad 1,00,80,60,40,20,0 Sensibilidad 1,0 0,8 0,6 0,4 0,2 0,0 Curva COR Los segmentos diagonales son producidos por los empates. AUC 0,705 Resultados 131 0,0235 92% 23% 0,96 41% 81% 0,032 92% 28% 1,005 39% 81% 0,0385 92% 30% 1,06 33% 81% 0,045 90% 30% 1,325 33% 86% 0,075 90% 38% 1,4 31% 86% 0,11 90% 45% 1,635 27% 86% 0,125 90% 47% 1,705 24% 86% 0,135 90% 48% 1,83 22% 88% 0,145 88% 52% 2,21 20% 89% 0,16 86% 52% 2,575 18% 89% 0,175 82% 55% 3,08 16% 91% 0,19 82% 56% 3,835 16% 94% 0,21 82% 58% 4,54 14% 95% 0,23 76% 58% 5,2 12% 95% 0,25 76% 59% 8,045 10% 97% 0,27 76% 61% 10,08 8% 97% 0,3 71% 61% 12,585 6% 97% 0,34 69% 61% 14,735 4% 97% 0,385 67% 61% 15,48 4% 98% En rojo, los valores de corte para MN>2,5 DS (>0,14) y para MN1>P50 (>0,41) 22,89 2% 98% 37,11 0% 100% Tal y como se observa en la tabla anterior, la sensibilidad para el punto de corte de >2.5DS fue de 88% y considerando el punto >P50 de 65% y la especificidad fue del 52% frente al 63% respectivamente. Se repitió la misma aproximación pero excluyendo del análisis los pacientes que han recibido quimioterapia con el esquema “5+2 “, obteniéndose una AUC de 0,712 En la tabla siguiente (tabla 6.24) se muestran los resultados de asociación con persistencia de enfermedad para la variable categórica MN1, según grupos de riesgo citogenético y según tratamiento de inducción recibido. Resultados 132 Tabla 6.24 Tablas de contingencia para MN1. Todos los grupos citogenéticos y todos los tratamientos Frecuencia de remisión completa y persistencia de enfermedad a la quimioterapia de Inducción para la variable MN1 si >P50 Variable a estudio Persistencia RC P valor estadístico Positivo 56,9% (33/58) 43,1%(25/58) 0,003 χ² Negativo 29,1% (16/55) 70,9% (39/55) RR para persistencia 1,956 (IC95% 1,223-3,128) Frecuencia de remisión completa y persistencia de enfermedad a la quimioterapia de Inducción para la variable MN1 si >2,5 DS Positivo 57,1% (44/77) 42,9% (33/77) <0,001 χ² Negativo 13,9% (5/36) 86,1% (31/36) RR para persistencia 4,114 (IC95% 1,783-9,493) Tabla 6.25 Tablas de contingencia para MN1. Todos los grupos citogenéticos y sólo 7+3 Frecuencia de remisión completa y persistencia de enfermedad a la quimioterapia de Inducción para la variable MN1 si >P50 excluidos pacientes con quimioterapia tipo “5+2” Variable a estudio Persistencia RC P valor estadístico Positivo 54,9% (28/51) 45,1%(23/51) 0,005 χ² Negativo 27,8% (15/54) 72,2% (39/54) RR para persistencia 1,976 (IC95% 1,203-3,248) Frecuencia de remisión completa y persistencia de enfermedad a la quimioterapia de Inducción para la variable MN1 si >2,5 DS excluidos pacientes con quimioterapia tipo “5+2” Positivo 55,7% (39/70) 44,3% (31/70) <0,001 χ² Negativo 11,4% (4/35) 88,6% (31/35) RR para persistencia 4,875 (IC95% 1,894-12,550) Resultados 133 Seguidamente se muestran las tablas de contingencia y riesgo relativos y la distribución de frecuencias para persistencia de los dos puntos de corte de MN1, considerando, sólo el subgrupo de pacientes con cariotipo de riesgo intermedio. Tabla 6.26 Tablas de contingencia para MN1. CG de riesgo intermedio Frecuencia de remisión completa y persistencia de enfermedad a la quimioterapia de Inducción para la variable MN1 si >P50 Variable a estudio Persistencia RC P valor estadístico Positivo 58,5% (24/41) 41,5% (17/41) 0,004 χ² Negativo 28,3% (13/46) 71,7% (33/46) RR para persistencia 2,071 (IC95% 1,222-3,511) Frecuencia de remisión completa y persistencia de enfermedad a la quimioterapia de Inducción para la variable MN1 si >2,5 DS Positivo 60,7% (34/56) 39,3% (22/56) <0,001 χ² Negativo 9,7% (3/31) 90,3% (28/31) RR para persistencia 6,274 (IC95% 2,097-18,770) A continuación, excluyendo pacientes con tratamiento de inducción tipo 5+2 Tabla 6.27 Tablas de contingencia para MN1. CG de riesgo intermedio y solo 7+3 Frecuencia de remisión completa y persistencia de enfermedad a la quimioterapia de Inducción para la variable MN1 si >P50 Variable a estudio Persistencia RC P valor estadístico Positivo 60,5% (23/38) 39,5% (15/38) 0,002 χ² Negativo 26,7% (12/45) 73,3% (33/45) RR para persistencia 2,270 (IC95% 1,312-3,928) Frecuencia de remisión completa y persistencia de enfermedad a la quimioterapia de Inducción para la variable MN1 si >2,5 DS Positivo 62,3% (33/53) 37,7% (20/53) <0,001 χ² Negativo 6,7% (2/30) 93,3% (28/30) RR para persistencia 9,340 (IC95% 2,409-36,215) Resultados 134 Seguidamente en las tablas 6.28 y 6.29 los resultados para pacientes con cariotipo normal. Tabla 6.28 Tablas de contingencia para MN1. CG normal y todos los tratamientos Frecuencia de remisión completa y persistencia de enfermedad a la quimioterapia de Inducción para la variable MN1 si >P50 Variable a estudio Persistencia RC P valor estadístico Positivo 54,8% (17/ 31) 45,2% (14/31) 0,010 χ² Negativo 25% (10/40) 75% (30/40) RR para persistencia 2,194 (IC95% 1,175-4,097) Frecuencia de remisión completa y persistencia de enfermedad a la quimioterapia de Inducción para la variable MN1 si >2,5 DS Positivo 58,1% (25/43) 41,9% (18/43) <0,001 χ² Negativo 7,1% (2/28) 92,9% (26/28) RR para persistencia 8,140 (IC95% 2,090-31,699) Tabla 6.29 Tablas de contingencia para MN1. CG normal y solo tratamiento 7+3 Frecuencia de remisión completa y persistencia de enfermedad a la quimioterapia de Inducción para la variable MN1 si >P50 excluidos quimioterapia tipo 5+2 Variable a estudio Persistencia RC P valor estadístico Positivo 57,1% (16/ 28) 42,9% (12/28) 0,007 χ² Negativo 25% (10/40) 75% (30/40) RR para persistencia 2,286 (IC95% 1,223-4,272) Frecuencia de remisión completa y persistencia de enfermedad a la quimioterapia de Inducción para la variable MN1 si >2,5 DS excluidos quimioterapia tipo 5+2 Positivo 60% (24/40) 40% (16/40) <0,001 χ² Negativo 7,1% (2/26) 92,9% (24/26) RR para persistencia 8,400 (IC95% 2,158-32,703) Resultados 135 Estos resultados muestran que, considerando ambos puntos de corte en los distintos subgrupos, existe una asociación significativa entre ausencia de sobreexpresión de MN1 y RC, que se traduce en mayor riesgo relativo (RR) para persistencia. La misma metodología se siguió para la variable a estudio BAALC. De igual manera al procedimiento seguido con MN1, se han excluido del análisis los pacientes sin valores de BAALC. El número total de casos para estudio fue de 108. En primer lugar los resultados de su análisis como variable cuantitativa, por test paramétricos y no paramétricos, se muestran en la tabla 6.20 Estudio mediante curvas ROC de la asociación con persistencia de enfermedad Figura 6.7 Curvas ROC para la variable BAALC para la situación de persistencia de enfermedad La sensibilidad y especificidad de la variable respecto a la persistencia de enfermedad se muestra en la tabla adjunta 1 - Especificidad 1,00,80,60,40,20,0 Sensibilidad 1,0 0,8 0,6 0,4 0,2 0,0 Curva COR AUC 0,628 Resultados 136 Tabla 6.30 Valor Sensibilidad y especificidad BAALC para persistencia Valor BAALC Sensibilidad Especificidad Valor BAALC Sensibilidad Especificidad 0,0000135 100% 2% 1,27 53% 59% 0,0043 98% 5% 1,475 53% 62% 0,01145 98% 8% 1,55 51% 62% 0,015 98% 11% 1,635 49% 62% 0,0215 98% 15% 1,745 47% 64% 0,032 98% 18% 1,865 45% 64% 0,037 96% 21% 2,106 43% 66% 0,048 96% 23% 2,285 43% 69% 0,063 96% 26% 2,365 40% 69% 0,0995 96% 30% 2,475 38% 69% 0,105 94% 30% 2,69 36% 70% 0,14 91% 33% 3,755 34% 74% 0,155 89% 33% 3,89 32% 74% 0,18 87% 34% 4,41 32% 79% 0,23 87% 38% 4,6 30% 79% 0,255 83% 38% 5 28% 80% 0,29 81% 41% 5,205 28% 82% 0,305 79% 43% 5,575 26% 84% 0,32 77% 44% 5,705 23% 85% 0,4 74% 44% 6,26 21% 85% 0,495 72% 44% 7,655 19% 87% 0,53 70% 46% 8,38 17% 87% 0,56 70% 48% 9,56 17% 89% 0,595 70% 49% 11,47 15% 89% 0,635 68% 49% 14,36 15% 92% 0,675 68% 51% 15,995 13% 92% 0,715 68% 52% 16,75 13% 93% 0,79 66% 52% 17,03 13% 95% 0,845 66% 54% 18,06 13% 97% 0,855 64% 56% 19,035 11% 97% 0,87 60% 56% 28,66 9% 98% 0,965 57% 56% 41,22 6% 98% 1,085 57% 57% 46,225 4% 98% 1,195 55% 59% 50,62 1% 99% 1,27 53% 59% 54,205 0% 100% En rojo, los valores de corte para BAALC>2,5 DS (>0,3) y para BAALC>P50 (>0,96) 55,8 0% 100% Tal y como se observa en la tabla, la sensibilidad para el punto de corte de >2.5DS fue de 79% y de 57% considerando punto >P50 y la especificidad fue del 43% frente al 56% Resultados 137 respectivamente. Cuando Se excluyeron los casos con quimioterapia tipo 5+2 y se realizó el estudio de curvas ROC, con un total de 100 casos válidos para análisis, con un AUC de 0,643 En cuanto al estudio como variable categórica, el análisis se realizó según los hallazgos citogenéticos y la quimioterapia de inducción. Primero con todos los pacientes por CG y tratamiento (n=108) y luego excluidos los que reciben “5+2” (n=100) Tabla 6.31 Tabla de contingencia para Sobreexpresión de BAALC incluyendo todos los cariotipos. Frecuencia de remisión completa y persistencia de enfermedad a la quimioterapia de Inducción para la variable BAALC si >P50 Variable a estudio Persistencia RC P valor estadístico Positivo 50% (27/54) 50% (27/54) 0,174 χ² Negativo 37% (20/54) 63% (34/54) RR para persistencia 1,350 (IC95% 0,871-2,093) Frecuencia de remisión completa y persistencia de enfermedad a la quimioterapia de Inducción para la variable BAALC si >2,5 DS Positivo 50% (38/76) 50% (38/76) 0,036 χ² Negativo 28,1% (9/32) 71,9% (23/32) RR para persistencia 1,778(IC95% 0,978-3,232) Tabla 6.32 Tabla de contingencia para Sobreexpresión de BAALC incluyendo todos los cariotipos y sólo paciente con quimioterapia tipo 7+3 Frecuencia de remisión completa y persistencia de enfermedad a la quimioterapia de Inducción para la variable BAALC si >P50 Variable a estudio Persistencia RC P valor estadístico Positivo 47,9% (23/48) 52,1% (25/48) 0,117 χ² Negativo 34,6% (18/52) 65,4% (34/52) RR para persistencia 1,384 (IC95% 0,860-2,228) Resultados 144 encontró impacto en los modelos ni consiguieron OR estadísticamente significativitos. (Datos no presentados). A continuación se muestran los distintos modelos construidos en base a las definiciones de sobreexpresión de BAALC. En primer lugar los desarrollados para BAALC si >P50 de la población enferma Tabla 6.39a Modelo multivariante nº1 para persistencia de enfermedad a la quimioterapia de Inducción para la variable BAALC positivo si >P50 Variables incluidas P valor OR IC 95% RR bivariante BAALC> P50 0,1 2,001 0,867-4,620 1,350* Edad 0,039 1,031 1,002-1,061 Riesgo CG Bueno frente adverso 0,088 0,169 0,022-1,305 0,146 Bueno frente Intermedio 0,178 0,444 0,137-1,447 0,326 * R2: 0,138 *: no significativo Tabla 6.39b Modelo multivariante nº2 para persistencia de enfermedad a la quimioterapia de Inducción para la variable BAALC positivo si >P50 Variables incluidas P valor OR IC 95% RR bivariante BAALC> P50 >0,5 1,084 0,441-2,661 1,350* Edad 0,013 1,036 1,008-1,065 NPM1 mutado 0,048 0,331 0,111-0,990 0,472 R2: 0,146 *: no significativo A continuación los modelos multivariantes creados a partir de BAALC mayor 2,5 DS Resultados 145 Tabla 6.40a Modelo multivariante nº1 para persistencia de enfermedad a la quimioterapia de Inducción para la variable BAALC positivo >2,5DS Variables incluidas P valor OR IC 95% RR bivariante BAALC>2,5DS 0,013 3,276 1,285-8,350 1,718 Edad 0,005 1,042 1,012-1,072 R2: 0,156 *: no significativo Tabla 6.40b Modelo multivariante nº2 para persistencia de enfermedad a la quimioterapia de Inducción para la variable BAALC positivo >2,5DS Variables incluidas P valor OR IC 95% RR bivariante BAALC>2,5DS >0,5 1,080 0,320-3,647 1,350* Edad 0,015 1,038 1,007-1,069 MN1> 2,5DS 0,002 7,648 2,086-28,041 4,114 R2: 0,276 *: no significativo De acuerdo con estos modelos, la edad al diagnóstico mantuvo su significación en todos ellos y únicamente fue significativo BAALC >2,5 en el modelo de la Tabla 6.46a (con la variable edad) y al introducir MN1>2.5DS, el BAALC pierde significación. 6.3.2 Estudio de supervivencia global de la serie. Para el total de la serie de 119 pacientes, se produjeron 73 exitus. La media de seguimiento de la serie fue de 24,51 meses (IC95% 19,9829,04), mediana de 16 meses, con rango que discurre entre 0 y 116 meses, para un rango intercuartílico de 29 meses. Mediante estudio con curvas de Kaplan Meier, se obtuvieron los siguientes resultados para la media y mediana de supervivencia de la serie. - Media de 42 meses con IC al 95% 33,3351,08 - Mediana de 22 meses con IC al 95% entre 14,5129,48 Con el siguiente gráfico de probabilidad de supervivencia. Resultados 146 Figura 6.8 Curva de supervivencia global de la serie de 119 pacientes Se estudió el impacto de variables en la probabilidad de supervivencia. La influencia de la edad categorizada en tres grupos se muestra a continuación (Fig 6.9 y Tabla 6.41). Figura 6.9 Curva de supervivencia según grupos de edad Tiempo seguimiento en meses 120,00100,0080,0060,0040,0020,000,00 Supervivencia acum 1,0 0,8 0,6 0,4 0,2 0,0 Censurado Función de supervivencia Función de supervivencia Tiempo seguimiento en meses 120,00100,0080,0060,0040,0020,000,00 Supervivencia acum 1,0 0,8 0,6 0,4 0,2 0,0 mayores 60-censurado Entre 40-59-censurado Menores 40 añoscensurado mayores 60 Entre 40-59 Menores 40 años Edad recodificada en grupo Funciones de supervivencia p 0,004 Resultados 147 El impacto del estado general del paciente definido por la escala ECOG categorizada en dos grupos, menor de 2 y mayor o igual a 2 se indica en la Fig. 6.10 y Tabla 6.41. Figura 6.10 Curva de supervivencia global según escala ECOG Tabla 6.41 Impacto en supervivencia global de la serie de las variables Edad y estado general estratificadas Variable Mediana (meses) IC 95% P (log Rank) HR IC 95% p Menor 40 años 61 20,91-101,08 0,004 ref. Edad 40-59 27 11,41-42,59 0,004 1,586 0,781-3,222 0,202 Mayores 60 12 8,73-29,48 0,004 2,785 1,399-5,543 0,004 ECOG <2 36 21,08-50,91 <0,001 ref. ECOG ≥2 10 6,27-13,72 <0,001 2,237 1,404-3,565 0,001 Tiempo seguimiento en meses 120,00100,0080,0060,0040,0020,000,00 Supervivencia acum 1,0 0,8 0,6 0,4 0,2 0,0 ECOG mayor o igual a 2-censurado ECOG 0-1-censurado ECOG mayor o igual a 2 ECOG 0-1 ECOG recodificado Funciones de supervivencia p<0,001 Resultados 148 Respecto a las variables dependientes del tratamiento, se analizó la respuesta obtenida al primer ciclo de quimioterapia de tipo 7+3 (Fig. 6.11, Tabla 6.42). Se excluyeron para el análisis los pacientes que recibieron quimioterapia tipo 5+2 por tener una tasa de persistencia significativamente superior. Figura 6.11 Curva de supervivencia global según respuesta obtenida al primer ciclo de inducción Según el tratamiento recibido en la intensificación, se consideraron como equivalentes quimioterapia a altas dosis y trasplante autólogo. En el grupo de pacientes que no recibió intensificación se incluyeron 4 pacientes que recibieron azacitidina posterior a la inducción (Tabla 6.42, Figura 6.13). Tabla 6.42 Impacto en supervivencia global de las variables dependientes del tratamiento Variable Mediana (meses) IC 95% P (log Rank) HR IC 95% p RC al primer 7+3* 36 11,39-60,61 0,001 ref. Persistencia al primer 7+3* 11 4,91-17,09 0,001 2,316 1,389-3,861 0,001 * se han excluido pacientes con quimioterapia de inducción 5+2 Alo TPH NR NR <0,001 ref. Tiempo seguimiento en meses 120,00100,0080,0060,0040,0020,000,00 Supervivencia acum 1,0 0,8 0,6 0,4 0,2 0,0 Persistencia-censurado Remisión Completacensurado Persistencia Remisión Completa Respuesta quimioterapia inducción Funciones de supervivencia p<0,001 Resultados 149 TAPH o Ara-C AD 31 9,56-52,43 <0,001 1,553 0,798-3,020 0,195 No reciben 8 3,63-12,36 <0,001 4,974 2,688-9,204 <0,001 NR: no ha alcanzado la mediana de seguimiento Figura 6.12 Supervivencia global según tratamiento de intensificación A continuación se muestra el impacto en la probabilidad de supervivencia de distintas variables biológicas. En la Figura 6.13 se describe la supervivencia en función del riesgo citogenético, y en la 6.14 en función de la clasificación propuesta por la European Leukemia Net en 2010. Se consideraron todos los pacientes de riesgo intermedio como un único grupo. Tiempo seguimiento en meses 120,00100,0080,0060,0040,0020,000,00 Supervivencia acum 1,0 0,8 0,6 0,4 0,2 0,0 No reciben intensificacióncensurado TASPE o Ara-C ADcensurado Alo-TPH-censurado No reciben intensificación TASPE o Ara-C AD Alo-TPH Intensificacion con Azacitidina en no reciben Funciones de supervivencia p<0,001 Resultados 150 Figura 6.13 Supervivencia global según citogenética al diagnóstico Figura 6.14 Supervivencia global según tratamiento de intensificación Tiempo seguimiento en meses 120,00100,0080,0060,0040,0020,000,00 Supervivencia acum 1,0 0,8 0,6 0,4 0,2 0,0 Adverso-censurado Intermedio-censurado Bueno-censurado Adverso Intermedio Bueno Riesgo CG codificado Funciones de supervivencia p 0,036 Tiempo seguimiento en meses 120,00100,0080,0060,0040,0020,000,00 Supervivencia acum 1,0 0,8 0,6 0,4 0,2 0,0 Adverso-censurado intermedio-censurado Bueno-censurado Adverso intermedio Bueno Riesgo ELN recodificado Funciones de supervivencia segun Riesgo ELN p 0,024 Resultados 151 Supervivencias medianas para los tres grupos según ELN fueron las siguientes: Buen Pronóstico 42 meses con IC al 95% entre 12,44 y 71,55 Intermedio 22 meses con IC al 95% entre 12,29 y 31,70 Adverso 8 meses con IC al 95% entre 4,87 y 11,13 En la tabla siguiente se resumen nuestros resultados respecto a las principales variables con impacto en la supervivencia, descritas en la bibliografía. Tabla 6.43 Impacto en supervivencia global de la serie de las variables biológicas Variable Mediana (meses) IC 95% P (log Rank) HR IC 95% p WBC <20000 22 12,93-31,06 >0,5 0,851 0,487-1,486 >0,5 WBC 2000050000 20 0-41,14 >0,5 0,917 0,408-2,058 >0,5 WBC>50000 19 3,53-34,47 >0,5 ref. CG buen pronóstico 42 27,46-54,34 0,036 ref. Riesgo intermedio 22 14,9529,05 0,036 1,868 0,675-5,173 0,229 Riesgo Adverso 8 4,87-11,12 0,036 3,436 1,125-10,494 0,030 NPM1 mutado* 22 17,48-26,51 >0,5 ref. NPM1 germinal* 28 11,32-44,68 >0,5 0,964 0,514-1,809 >0,5 FLT3 mutado* 11 3,53-18,47 0,123 1,636 ,0867-3,014 0,131 FLT3 germinal* 28 3,68-52,31 0,123 ref. CD34 pos 20 6,53-33,46 0,264 0,740 0,431-1,268 0,273 CD34 neg 20 11,39-28,61 0,264 ref. WBC: recuento de leucocitos al diagnóstico NR: no ha alcanzado la mediana de seguimiento Ref.: variable de referencia *: solo en pacientes con cariotipo normal Resultados 152 6.3.2.1 Impacto de las variables MN1 y BAALC en la supervivencia global El análisis se realizó con los dos puntos de corte para cada variable y según grupos de riesgo citogenético tal y como se describe a continuación: en la serie global de pacientes, en los que presentaban citogenética de riesgo intermedio y por ultimo en aquellos con cariotipo normal (Tablas 6.44-6.46 y figura 6.15). Tabla 6.44 Impacto en supervivencia global de la serie de las variables MN1 y BAALC en la serie completa de pacientes Variable Mediana (meses) IC 95% P (log Rank) HR IC 95% p MN1 >P50 positivo 14 2,39-25,60 0,196 ref. MN1 >P50 negativo 27 15,56-38,43 0,196 0,734 0,455-1,183 0,204 MN1>2,5DS positivo 19 4,79-33,20 >0,5 ref. MN1>2,5DS negativo 27 19,40-34,59 >0,5 0,848 0,505-1,424 >0,5 BAALC>P50 positivo 22 4,75-38,25 0,439 ref. BAALC>P50 negativo 27 17,99-36 0,439 0,841 0,512-1,383 0,496 BAALC>2,5DS positivo 22 9,20-34,79 0,427 ref. BAALC>2,5DS negativo 27 17,80-36,20 0,427 0,8 0,459-1,397 0,433 Ref.: variable de referencia Resultados 153 A continuación (Tabla 6.45) los resultados para pacientes con cariotipo clasificado como de riesgo intermedio para un total de 90 pacientes válidos para estudio. Tabla 6.45 Impacto en supervivencia global de la serie de las variables MN1 y BAALC en pacientes con cariotipo de riesgo intermedio Variable Mediana (meses) IC 95% P (log Rank) HR IC 95% p MN1 >P50 positivo 21 6,80-35,19 0,422 1,248 0,721-1,259 0,429 MN1 >P50 negativo 27 18,74-35,25 0,422 ref. MN1>2,5DS positivo 21 3,94-38,05 >0,5 1,093 0,618-1,934 >0,5 MN1>2,5DS negativo 27 20,08-33,91 >0,5 ref. BAALC>P50 positivo 22 13,13-30,86 0,173 1,467 0,836-2,573 0,181 BAALC>P50 negativo 27 23,09-30,90 0,173 ref. BAALC>2,5DS positivo 22 14,42-29,58 0,360 1,315 0,725-2,384 0,368 BAALC>2,5DS negativo 27 22,48-31,52 0,360 ref. Ref.: variable de referencia