Interacción de "Photobacterium damselae" subsp. "Piscida" con células SAF-1

Instituto Universitario de Sanidad Animal y Seguridad Alimentaria UNIVERSIDAD DE LAS PALMAS DE GRAN CANARIA TESIS DOCTORAL JUDIT VEGA ALONSO ARUCAS, 2015 INTERACCIÓN DE PHOTOBACTERIUM DAMSELAE SUBSP. PISCICIDA CON CÉLULAS SAF-1 ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ANEXO I Dª MARÍA SORAYA DÉNIZ SUÁREZ, SECRETARIA DEL INSTITUTO UNIVERSITARIO DE SANIDAD ANIMAL Y SEGURIDAD ALIMENTARIA DE LA UNIVERSIDAD DE LAS PALMAS DE GRAN CANARIA. CERTIFICA Que el consejo de Doctores del Departamento en su sesión de fecha 13 de noviembre de 2015 tomó el acuerdo de dar el consentimiento para su tramitación, a la tesis doctoral titulada: “INTERACCIÓN DE PHOTOBACTERIUM DAMSELAE SUBSP. PISCICIDA CON CÉLULAS SAF-1”, presentada por la doctorando D. Judit Vega Alonso, dirigida por el Catedrático D. Fernando Real Valcárcel y por el doctor D. Daniel Padilla Castillo. Y para que así conste, y a efectos de lo previsto en el Art° 73.2 del reglamento de Estudios de Doctorado de esta Universidad, firmo la presente en Las Palmas de Gran Canaria, a dieciséis de noviembre de dos mil quince ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ANEXO II UNIVERSIDAD DE LAS PALMAS DE GRAN CANARIA Instituto Universitario de Sanidad Animal y Seguridad Alimentaria PROGRAMA DE DOCTORADO SANIDAD ANIMAL Y SEGURIDAD ALIMENTARIA Título de la Tesis INTERACCIÓN DE PHOTOBACTERIUM DAMSELAE SUBSP. PISCICIDA CON CÉLULAS SAF-1 Tesis Doctoral presentada por Dña. Judit Vega Alonso. Dirigida por el Catedrático D. Fernando Real Valcárcel y el Doctor D. Daniel Padilla Castillo. La Doctoranda Judit Vega Alonso Arucas, a 12 de Noviembre de 2015 El Director Fernando Real Valcárcel El Director Daniel Padilla Castillo ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! D. FERNANDO REAL VALC Á RCEL, CATEDR Á TICO DE LA UNIVERSIDAD DE LAS PALMAS DE GRAN CANARIA EN EL DEPARTAMENTO DE PATOLOG Í A ANIMAL, PRODUCCI Ó N ANIMAL, BROMATOLOG Í A Y TECNOLOG Í A DE LOS ALIMENTOS DE LA FACULTAD DE VETERINARIA INFORMA: Que la presente tesis doctoral titulada: “INTERACCIÓN DE PHOTOBACTERIUM DAMSELAE SUBSP. PISCICIDA CON CÉLULAS SAF-1” realizada por D ñ a. Judit Vega Alonso, Licenciada en Veterinaria, ha sido realizada bajo mi direcci ó n y considerando que re ú ne las condiciones y calidad cient í fica para optar al grado de Doctor, autorizo su presentaci ó n para que pueda ser juzgada por el tribunal correspondiente. Y para que as í conste, firmo la presente en Arucas, 12 de Noviembre de 2015. Fdo. Fernando Real Valcárcel ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! El trabajo realizado ha sido posible gracias a una beca de Formación de Personal Docente e Investigador (FPI) de la Agencia Canaria de Investigación, Innovación y Sociedad de la Información del Gobierno de Canarias. ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! A mi familia ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ÍNDICES ÍNDICE GENERAL I.- INTRODUCCIÓN 1 II.- OBJETIVOS 7 III.- REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA 11 III.1.- Las enfermedades infecciosas en acuicultura 13 III.2.- Estudio de la pasterelosis 17 III.2.1.- Importancia de la enfermedad en acuicultura continental y marina 17 III.2.2.- Etiología 19 III.2.3.- Epidemiología 22 III.2.4.-Patogenia 24 III.2.5.- Clínica y lesiones 28 III.2.6.- Diagnóstico 31 III.2.7.- Control de la enfermedad 35 III.2.7.1.- Quimioterapia 35 III.2.7.2.- Inmunoprofilaxis 37 III.3.- Cultivos celulares 39 III.3.1.- Cultivos celulares en peces 45 III.3.2.- Línea celular SAF-1 47 III.3.3.-Aplicación de métodos de cultivo celular en la sanidad animal en acuicultura 49 III.3.4.- Métodos de cultivo celular en el diagnóstico de enfermedades infecciosas 49 III.3.5.- Estudios de adherencia e invasión celular 52 III.4.- Aplicaciones de la inmunofluorescencia al estudio de la adherencia, invasión y tráfico intracelular 56 ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! III.5.-Sistema inmunológico de peces 61 III.5.1.- Inmunidad celular no específica 61 III.5.2.- Citoquinas 63 III.5.2.1.- Interleuquinas 64 III.5.2.2.- Factor de necrosis tumoral 64 III.5.2.3.- Interferón 65 III.5.2.4.- Quimioquinas 65 III.5.3.- Proteína Mx 66 IV.- MATERIAL Y MÉTODOS 67 IV.1.- Origen y conservación de las cepas de Photobacterium damselae subespecies piscicida utilizadas 69 IV.2.- Línea celular 70 IV.3.- Ensayos de invasión bacteriana 71 IV.3.1.- Evaluación del efecto del tiempo de infección en la internalización 71 IV.3.2.- Determinación del efecto de la concentración bacteriana en la eficacia de invasión 72 IV.3.3.- Valoración de la supervivencia intracelular 73 IV.3.4.- Implicación del citoesqueleto celular en la entrada de Photobacterium damselae subsp. piscicida 74 IV.3.5.- Efecto de la incubación a 4ºC en la internalización bacteriana 75 IV.3.6.- Efecto de la temperatura de crecimiento bacteriano sobre la internalización 75 IV.3.7.- Efecto de la presencia de glucosa en la internalización bacteriana 76 ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! IV.4.- Análisis de la interacción celular por inmunofluorescencia 77 IV.4.1.- Análisis de la adherencia e internalización intracelular por inmunofluorescencia 77 IV.4.2.- Análisis del tráfico intracelular por inmunofluorescencia 81 IV.5.- Expresión de citoquinas y gen Mx en SAF-1 tras la infección con Photobacterium damselae subsp. piscicida 83 IV.5.1.- Determinación de la multiplicidad de la infección (M.O.I.) 83 IV.5.2.- Expresión de citoquinas y gen Mx en SAF-1 tras la infección de Photobacterium damselae subsp. piscicida cultivadas con y sin glucosa 83 IV.5.3.- Extracción de ARN 84 IV.5.4.- Transcripción inversa 85 IV.5.5.- Expresión génica mediante PCR a tiempo real (qPCR) 85 IV.6.- Análisis estadístico 88 V.- RESULTADOS 89 V.1.- Ensayos de invasión bacteriana 91 V.1.1.- Evaluación del efecto del tiempo de infección en la internalización 91 V.1.2.- Determinación del efecto de la concentración bacteriana en la eficacia de invasión 92 V.1.3.- Valoración de la supervivencia intracelular 93 V.1.4.- Implicación del citoesqueleto celular en la entrada de Photobacterium damselae subsp. piscicida 94 ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! Figura XII.- Expresión de citoquinas y gen Mx 4 horas después de la infección de SAF-1 con la cepa C2 de Photobacterium damselae subsp. piscicida 103 Figura XIII.- Expresión de citoquinas y gen Mx 4 horas después de la infección de SAF-1 con la cepa PP3 de Photobacterium damselae subsp. piscicida 103 Figura XIVa.- Expresión génica de Mx en células SAF-1 infectadas con 5 cepas de Photobacterium damselae subsp. piscicida 105 Figura XIVb.- Expresión génica de Mx en células SAF-1 infectadas con 5 cepas de Photobacterium damselae subsp. piscicida crecidas en un medio con glucosa 105 Figura XVa.- Expresión génica de IL-1β en células SAF-1 infectadas con 5 cepas de Photobacterium damselae subsp. piscicida 107 Figura XVb.- Expresión génica de IL-1β en células SAF-1 infectadas con 5 cepas de Photobacterium damselae subsp. piscicida crecidas en un medio con glucosa 107 Figura XVIa.- Expresión génica de IL-1r2 en células SAF-1 infectadas con 5 cepas de Photobacterium damselae subsp. piscicida 109 Figura XVIb.- Expresión génica de IL-1r2 en células SAF-1 infectadas con 5 cepas de Photobacterium damselae subsp. piscicida crecidas en un medio con glucosa 109 Figura XVIIa.- Expresión génica de COX-2 en células SAF-1 infectadas con 5 cepas de Photobacterium damselae subsp. piscicida 111 Figura XVIIb.- Expresión génica de COX-2 en células SAF-1 infectadas con 5 cepas de Photobacterium damselae subsp. piscicida crecidas en un medio con glucosa 111 ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! Figura XVIIIa.- Expresión génica de TNF-α en células SAF-1 infectadas con 5 cepas de Photobacterium damselae subsp. piscicida 113 Figura XVIIIb.- Expresión génica de TNF-α en células SAF-1 infectadas con 5 cepas de Photobacterium damselae subsp. piscicida crecidas en un medio con glucosa 113 ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ABREVIATURAS ADN Á cido desoxirribonucleico ADNc Á cido desoxirribonucleico complementario AFLP Amplified fragment length polimorphism AIP Apoptosis inducing protein ANOVA An á lisis de la varianza API Índice an a lítico de perfil APROMAR Asociaci ó n Empresarial de Productores de Cultivos Marinos de Espa ña ARN Á cido ribonucleico ASK Atlantic salmon kidney ATCC Colección Americana de Cultivos Tipo BAB Base agar sangre BF Bluegill fry BFP Proteína fluorescente azul BHIA Agar infusi ó n cerebro coraz ó n BHIB Caldo infusi ó n cerebro coraz ón BSA Albúmina sérica bovina CHSE Chinnok salmon embryo CIB Centro de investigaciones biológicas ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! COX Ciclooxigenasa CSIC Consejo superior de investigaciones científicas Ct Valores de umbral de ciclo DEPC Dietilpirocarbonato DL50 Dosis letal ECP Producto extracelular EDTA Ácido etilendiaminotetraacético EEA Early endosomal auto-antigen EHN Necrosis hematopoyética epizoótica ELISA Ensayo por inmunoadsorción ligado a enzimas EPC Epitelioma papullusum cyprini FAO Organizaci ó n de las Naciones Unidas para la Agricultura y la Alimentaci ó n FHM Fathead minnow GF Blue striped Grunt fin GFP Proteína fluorescente verde GTP Guanosín trifosfato IFN Interfer ó n IgM Inmunoglobulinas M IHNV Necrosis hematopoyética infecciosa IL Interleuquina ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! IPRO Índice de replicación intracelular IU Unidades internacionales LAMP Lysosomal associated membrane protein LDH Lactato deshidrogenasa LPS Lipopolisac á ridos MEM Medio mínimo esencial MOI Multiplicidad de infecci ó n NK C é lulas Natural Killer OIE Oficina Internacional de Epizootias OMP Outer membrane protein PBS Tamp ó n fosfato salino PCR Reacci ó n en cadena de la polimerasa Poly I:C Ácido poliinosínicopolicitidílico qPCR Reacci ó n en cadena de la polimerasa semicuantitativa RAPD Random amplified polimorphic DNA RNA Á cido ribonucleico rpm Revoluciones por minuto RTG Rainbow trout gonad SAF Sparus aurata fin ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! SFB Suero fetal bovino SHK Salmon head kidney SPSS Statistical product and service solutions TNF Factor de necrosis tumoral VHS Septicemia hemorrágica viral ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! INTRODUCCIÓN ! ! ! ! ! Introducción! ! ! 3! ! ! ! ! ! I.- INTRODUCCIÓN La acuicultura es una actividad que puede definirse como el cultivo de organismos acuáticos con técnicas encaminadas a hacer más eficiente la producción. El cultivo acuático abarca muy variadas prácticas y una amplia gama de especies, sistemas y técnicas de producción. El mayor reto al que se enfrenta la humanidad para las próximas décadas, a parte de la obtención de energía, es alimentar a los 9.600 millones de personas que habitarán el planeta tierra hacia el año 2050. El reto es complejo dada la limitada disponibilidad de los recursos naturales y dada la necesidad de respetar los ecosistemas y la persistencia, aún hoy, de los más de 800 millones de personas que sufren desnutrición crónica (APROMAR, 2015). Actualmente, la acuicultura juega un papel importante en los esfuerzos por eliminar el hambre y la malnutrición al proveer alimentos ricos en proteínas, vitaminas y minerales. Además puede contribuir a reducir la pobreza mejorando los ingresos económicos, fomentando el comercio local e internacional y ofreciendo oportunidades de empleo. La acuicultura ha superado en producción a la pesca por primera vez en 2013 con 97,20 millones de toneladas a nivel mundial, frente a las 93,8 millones de toneladas de las capturas. Por tanto, más del 50% de los productos acuáticos en 2013 provienen de la acuicultura (APROMAR, 2015). La FAO (2010) considera que la acuicultura contribuye de manera efectiva a la utilización eficaz de los recursos naturales, a la seguridad alimentaria y al desarrollo económico, con un limitado y controlable impacto sobre el medio ambiente. ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! Revisión!bibliográfica! ! ! 13! ! ! ! ! ! III.- REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA III.1.- Las enfermedades infecciosas en acuicultura Son muchas las infecciones bacterianas que pueden afectar a las granjas de acuicultura. En la bibliografía se describen infecciones por Vibrio spp., Aeromonas spp., Photobacterium damselae subsp. piscicida, Tenacibaculum maritimum y otras flexibacterias, Pseudomonas spp., y Streptococcus spp., entre otras. La mayoría de estos microorganismos forman parte del medio acuático, y sólo en determinadas circunstancias van a sobrepasar las barreras defensivas de los peces. Es de especial interés en Canarias, la infección causada por Photobacterium damselae subespecies piscicida, sobre la que profundizaremos más adelante. Algunas de las enfermedades más importantes de origen bacteriano que afectan a las granjas de acuicultura marina y continental son: • Vibriosis: dentro de la familia Vibrionaceae, las especies que causan mayores pérdidas económicas son Vibrio anguillarum, V. ordalii, V. salmonicida y V. vulnificus biotipo 2 (Toranzo, 2004). Vibrio anguillarum, agente etiológico de la vibriosis clásica, tiene una amplia distribución mundial causando septicemia hemorrágica en gran variedad de peces de importancia económica, como el salmón pacífico (Oncorhynchus!kisutch) y salmón Atlántico (Salmo salar), trucha arcoíris (Oncorhynchus mykiss), rodaballo (Psetta maxima), lubina (Dicentrarchus labrax), dorada (Sparus aurata), lubina estriada (Morone saxatilis), bacalao (Gadus morhua), anguila japonesa (Anguilla japónica), anguila europea (Anguilla anguilla) y ayu (Plecoglossus altivelis altivelis) (Toranzo y Barja, 1993; Actis y cols., 1999). Los peces afectados muestran signos típicos de una septicemia generalizada con hemorragia en la base de las aletas, exoftalmia y opacidad corneal. Los peces moribundos ! ! ! ! ! Revisión!bibliográfica! ! ! 14! ! ! ! ! ! frecuentemente tienen anorexia con branquias pálidas que indican una anemia severa. A menudo se observan edemas, sobre todo en la hipodermis. • Forunculosis: Aeromonas salmonicida subsp. salmonicida es el agente etiológico de esta enfermedad que causa graves pérdidas económicas en salmónidos. También afecta a peces no salmónidos y tiene una amplia distribución (Toranzo y cols., 1991a; Toranzo y Barja, 1992; Austin y Adams, 1996; Bernoth, 1997; Ellis, 1997; Bricknell y cols., 1999; Hiney y Oliver, 1999). La enfermedad típica se desarrolla con una septicemia hemorrágica crónica o aguda, a menudo con necrosis por licuefacción extensa. En los casos agudos, suelen aparecen úlceras profundas. • Flexibacteriosis marina: causada por Tenicibaculum maritimum (Wakabayashi y cols., 1986; Bernardet y Grimont, 1989; Sukui y cols., 2001). Presenta una amplia distribución en peces de cultivo y salvajes en Europa, Japón, Norte América y Australia (McVicar y White, 1979 y 1982; Wakabayashi y cols., 1986; Devesa y cols., 1989; Pazos y cols., 1993; Chen y cols., 1995; Handlinger y cols., 1997; Ostland y cols., 1999; Santos y cols., 1999; Avendaño-Herrera y cols., 2004). Entre los peces de acuicultura, la enfermedad se ha descrito en rodaballo, lenguado (Solea senegalensis), dorada, lubina, besugo (Pagellus bogaraveo), chopa (Acanthopagrus schlegeli), platija (Platichthys flesus) y salmónidos. Aunque pueden verse afectados tanto adultos como juveniles, los peces más jóvenes sufren una forma más severa de enfermedad. Se ha descrito un aumento en la prevalencia y severidad de la enfermedad con temperaturas cercanas a los 15ºC. Además de la temperatura del agua, influyen factores como el estrés y relacionados con el hospedador (estado de la piel) (Magariños y cols., 1995). En general, los peces afectados tienen la ! ! ! ! ! Revisión!bibliográfica! ! ! 15! ! ! ! ! ! boca erosionada y hemorrágica, lesiones ulcerativas en piel, aletas deshilachadas y podredumbre de la cola. La pérdida de la superficie epitelial, es una puerta de entrada para otras bacterias o parásitos (Toranzo, 2004). • Pseudomonadiasis: dentro del Género Pseudomonas, Pseudomonas anguilliseptica se considera el patógeno más importante para los peces de acuicultura (Toranzo y Barja, 1993; Austin y Austin, 1999). La enfermedad se ha descrito en anguilas (Japón, Taiwan, Dinamarca, Escocia), chopa y ayu (Japón), salmónidos (Finlandia), arenque (Mar Báltico) (Toranzo, 2004) y desde 1995 se considera responsable de la enfermedad del invierno “Winter disease síndrome” de la dorada cultivada en el Mediterráneo (Berthe y cols., 1995; Doménech y cols., 1997). También se ha descrito como un patógeno emergente en rodaballo y besugo en España (López-Romalde y cols., 2003a y b). La enfermedad se da a bajas temperaturas (alrededor de 16ºC) durante los meses de invierno. Los principales signos clínicos y lesiones son distensión abdominal y hemorragias petequiales en piel y órganos internos, pero las lesiones en anguilas son siempre más severas que las observadas en dorada. • Estreptococosis: las infecciones por estreptococos en peces se considera una enfermedad reemergente que afecta a gran variedad de especies salvajes y de cultivo en el mundo (Kitao, 1993; Bercovier y cols., 1997; Romalde y Toranzo, 2002). Causó altas mortalidades en el cultivo del rodaballo a principios de los años 90. Gracias al desarrollo y registro de una vacuna la enfermedad se erradicó y, a finales de la década, incluso se dejó de vacunar. Sin embargo, en los últimos años, las elevadas temperaturas alcanzadas en ! ! ! ! ! Revisión!bibliográfica! ! ! 16! ! ! ! ! ! algunas granjas han provocado la aparición de nuevos casos graves, llevando a varias explotaciones a tener que vacunar de forma sistemática para prevenir la enfermedad (Skretting, 2007). Debe entenderse como un complejo de enfermedades similares producidas por diferentes géneros y especies capaces de provocar un daño nervioso central caracterizado por exoftalmia supurativa y meningoencefalitis (Toranzo, 2004). Los agentes etiológicos de las estreptococosis de “agua caliente” son zoonósicos. La fuente de infección suele estar relacionada con actividad humana y animal (ganadería) cercana a la explotación. • Enfermedad de la boca roja: también conocida como yersiniosis, es una enfermedad emergente causada por Yersinia ruckeri. Aunque se ha aislado de otras especies, produce importantes pérdidas económicas en salmónidos, siendo especialmente sensible la trucha arcoíris (Furones y cols., 1993). Presenta una amplia distribución por Norte América, Sudáfrica, Australia y Europa (Tobback, 2009). La enfermedad se transmite por contacto directo con peces enfermos o portadores. Afecta a peces de todas las edades, pero se presenta de una forma aguda en los jóvenes. Los peces presentan letargia, hemorragias con enrojecimiento en la base de las aletas, línea lateral y en la cabeza. Las hemorragias características dentro y alrededor de la boca, no aparecen siempre en todos los peces afectados. También hay distensión abdominal y exoftalmia. Los parásitos más comunes que pueden aparecer en peces de acuicultura marina son Criptocaryon irritans, Amiloodinium ocellatum, Enteromyxum leei, Furnestinia echenis y Sparycotyle chrysophrii. ! ! ! ! ! Revisión!bibliográfica! ! ! 17! ! ! ! ! ! Las enfermedades más importantes producidas por virus en acuicultura marina son la Nodavirosis y Enfermedad Linfoquística. En cuanto a la acuicultura continental, las enfermedades víricas más importantes son la Septicemia Hemorrágica Viral, Necrosis Hematopoyética Epizoótica, Necrosis hematopoyética infecciosa, Anemia Infecciosa del Salmón, Herpesvirosis de la carpa Koi y Viremia Primaveral de la carpa. III.2.- Estudio de la pasterelosis III.2.1.- Importancia de la enfermedad en acuicultura continental y marina En un principio esta enfermedad se denominó como pseudotuberculosis debido a la aparición de granulomas en el bazo e hígado de los peces infectados. La bacteria se aisló originariamente de mortalidades en poblaciones naturales de perca blanca (Morone americanus) y lubina estriada (M. saxatilis) en 1963 en Chesapeake Bay en Estados Unidos (Sniezko y cols., 1964). Posteriormente, pasó a llamarse pasterelosis, enfermedad que provoca grandes pérdidas económicas a las empresas que afecta. Es un patógeno capaz de provocar mortalidades masivas en peces salvajes y en acuicultura. Entre 1963 y 1967 se desarrollaron graves epizootias en la costa este de Estados Unidos, por las que la industria acuícola en esa región decreció en un 42%. La única causa significativa de este decrecimiento se encontró en los brotes de enfermedad causada por la antiguamente encuadrada como Pasteurella piscicida (Sinderman, 1990), y hoy en día, denominada Photobacterium damselae subspecies piscicida (Gauthier y cols., 1995). Los porcentajes de mortalidad en peces debido a brotes de pasterelosis varían según la especie y edad de los afectados y de la cepa de Photobacterium damselae subsp. piscicida. En larvas causa mortalidades del 50-100% y en juveniles la ! ! ! ! ! Revisión!bibliográfica! ! ! 18! ! ! ! ! ! mortalidad puede alcanzar el 50% de la población (Toranzo y cols., 1991; Rodgers y Furones, 1998). Así, en alevines, Hawke y cols. (1987) describen un brote donde en un periodo de tres semanas muere el 80% del colectivo de peces; en el primer brote de pasterelosis descrito en España, Toranzo y cols. (1991), la mortalidad fue del 40%. Balebona y cols. (1992) describieron un brote de esta enfermedad en lubinas del sudoeste de España, donde entre septiembre y octubre de 1991 murieron 30.000 peces, un 15% del total de animales producidos. En una granja piscícola de jurel (Pseudocaranx dentex) en Japón, se produjo un brote de pasterelosis que provocó una pérdida de 10.000 animales en un mes, equivalente al 34% del total de juveniles de la explotación (Nakai y cols., 1992). Candan y cols. (1996) estudiaron en Turquía un brote de este proceso, con unas pérdidas de unos 18.250 peces, lo que representó el 9% del colectivo en un periodo de dos semanas. En Portugal, Baptista y cols. (1996) describen el primer brote de pasterelosis, donde se observaron mortalidades diarias entre 0,9 y 11%. Dicha enfermedad afectó a toda la población de alevines. En Canarias, el primer brote de esta enfermedad fue descrito por Real y cols. (1997), viéndose afectados los animales juveniles de una explotación de lubinas, observándose mortalidades de unos 2.000 peces diarios durante una semana. Estas cifras se han mantenido constantes en brotes sucesivos ocurridos de forma rutinaria en verano. En salmón Atlántico, Jones y Cox (1999) en su descripción de la enfermedad, reflejan una mortalidad muy baja, siendo esta desde abril a octubre, de un 6% en total. ! ! ! ! ! Revisión!bibliográfica! ! ! 19! ! ! ! ! ! III.2.2.- Etiología Gauthier y cols. (1995) basándose en el estudio del ARN ribosómico y relacionándolo con el ADN completo y con las características bioquímicas, reasigna a Pasteurella piscicida en una subespecie de Photobacterium damselae, aunque Thyssen y cols. (1998), basándose en estudios morfológicos y bioquímicos, concluyen que Photobacterium damselae subsp. piscicida está relacionado con especies del Género Photobacterium pero es fácilmente distinguible de Photobacterium damselae subsp. damselae. La caracterización de cepas de esta bacteria utilizando la AFLP “Amplified fragment length polimorphism” o polimorfismo en la longitud de fragmentos amplificados, realizada por Thyssen y cols. (2000), demuestra que existe una homología entre Photobacterium damselae subsp. piscicida y Photobacterium damselae subsp. damselae de un 77%, lo cual ratifica la idea de una proximidad taxonómica. A pesar de todo esto, la denominación de “pasterelosis” se mantiene más por motivos de tipo histórico que por taxonómicos (Daly, 1999). Photobacterium damselae subsp. piscicida es un bacilo Gram negativo inmóvil con tinción bipolar (Austin y Austin, 1999), y no produce esporas. El tamaño de las células varía con las condiciones de cultivo. Koike y cols. (1975) describen tamaños desde 0,6-1,2 x 0,8-2,6 µm. Son polimórficas y pueden ser observadas desde formas de micrococos hasta largos bacilos dependiendo de las condiciones de cultivo. Photobacterium damselae subsp. piscicida presenta un metabolismo anaerobio facultativo (Austin y Austin, 1999). Para su cultivo se han usado diferentes medios como son el Agar Infusión Cerebro Corazón, Agar Triptona-Neopeptona, Agar Levadura-Peptona, Agar Leche y Agar Sangre, conteniendo todos entre un 1,5 y un 2% de NaCl (Egusa, 1992). En estos medios se observan colonias redondas, ! ! ! ! ! Revisión!bibliográfica! ! ! 26! ! ! ! ! ! Es posible que Photobacterium damselae subsp. piscicida pueda eludir los mecanismos de defensa del hospedador y de los agentes antimicrobianos manteniéndose viable dentro de células no fagocíticas (Magariños y cols., 1996b), aspecto ya demostrado por la capacidad que presenta esta bacteria de invadir diferentes líneas celulares de peces (Magariños y cols., 1996b; Yoshida y cols., 1997). Los productos extracelulares (ECPs) son letales para trucha y rodaballo, lo que indica que éstos deben jugar un importante papel en el mecanismo de acción patógena de esta bacteria (Magariños y cols., 1992a). Magariños y cols. (1992b) han demostrado que los ECPs de Photobacterium damselae subsp. piscicida presentan actividad fosfolipasa y hemolítica sobre eritrocitos de oveja, salmón y rodaballo, pero no sobre eritrocitos de trucha. La suplementación del medio de cultivo con un 1% de glucosa induce la presencia de una capa capsular lipopolisacárida que produce un aumento en la virulencia de Photobacterium damselae subsp. piscicida ( Bonet y cols., 1994), provocando que la DL50 se pueda reducir hasta 4 logaritmos (Magariños y cols., 1996a). De la misma forma, la disponibilidad de hierro y los ECPs intervienen en la virulencia (Magariños y cols., 1992a y 1994b). Se han llevado a cabo varios estudios sobre proteínas (extracelulares, periplásmicas, etc) de Photobacterium damselae subsp. piscicida para aclarar su patogenia. Do Vale y cols. (2005) comprobaron que todas las cepas virulentas de Photobacterium damselae subsp. piscicida analizadas eran capaces de producir una exotoxina de 56 KDa llamada AIP56 “Apoptosis Inducing Protein”. Dicha proteína, como su nombre indica, es capaz de inducir apoptosis en las células inmunitarias (neutrófilos y macrófagos) de muchas especies de peces provocando, además, una necrosis secundaria debida a la falta de eliminación de las células dañadas y como ! ! ! ! ! Revisión!bibliográfica! ! ! 27! ! ! ! ! ! resultado último un daño tisular irreversible que conlleva a!la muerte del animal. La AIP56 de Photobacterium damselae subsp. piscicida por sí sola es capaz de reproducir la enfermedad y matar al pez afectado y, por lo tanto, cabe pensar que esta proteína sea uno de sus principales mecanismos de patogénesis. En la Tabla III se muestran las proteínas más destacadas descritas en Photobacterium damselae subsp. piscicida y, posiblemente, asociadas a su patogénesis. Tabla III. Proteínas descritas en Photobacterium damselae subsp. piscicida Proteína Características Efecto Referencia Damselina) ) Proteína! extracelular! ! Hemólisis!en!eritrocitos! de!conejo! Cutter!y!Kreger,!1990! AIP56) Proteína! extracelular! presente!sólo!en!las! cepas!patógenas! analizadas! Induce!apoptosis!en! granulocitos!y! macrófagos! de!peces! Do!Vale!y!cols.,!2005! Proteína) transportadora) de)vitamina)B12) ) Proteína! periplásmatica! Transporta!la!vitamina! B12!en!el!interior!de!la! célula! Boiani!y!cols.,!2009! Metaloproteasa) Proteína! extracelular! Letal!en!cobia! (Rachycentron! canadum)! Liu!y!cols.,!2011! Lipoproteína) PDP_0080) Lipoproteína!de! membrana! Adherencia! Andreoni!y!cols.,!2013! ! ! ! ! ! Revisión!bibliográfica! ! ! 28! ! ! ! ! ! III.2.5.- Clínica y lesiones Una de las principales características de esta enfermedad es la ausencia de signos patognomónicos, pudiéndose encontrar manifestaciones clínicas en los peces infectados, pero no de forma específica y exclusiva de esta enfermedad. Además, Roberts (1978) afirma que una de las características de esta enfermedad es que no se producen anormalidades externas en los peces afectados. Algunos síntomas de la enfermedad, como son la debilidad de los peces e irse al fondo de las redes donde morían ya eran descritos por Kubota y cols. (1970a y b, y 1972). Snieszko y cols. (1964) describen en la “pseudotuberculosis” de la perca blanca la presencia de pequeñas zonas hemorrágicas en las branquias y en la base de las aletas, además de un aumento de la pigmentación de la piel. La presencia de estos signos inespecíficos se repiten de forma rutinaria en la mayoría de las descripciones de la enfermedad, y sólo en alguna ocasión se observa algún síntoma de localización corporal distinta, como los descritos por Toranzo y cols. (1991) y Baptista y cols. (1996), los cuales observaron la aparición de hemorragias en la zona de la cabeza. La forma de presentación de la enfermedad no es constante, existiendo cuadros desde sobreagudos a crónicos. La forma sobreaguda de la enfermedad suele darse en alevines con escasa o nula inmunidad frente al agente causal, o cuando el medio ambiente es muy favorecedor para que la enfermedad se presente. En estas condiciones los peces suelen morirse sin manifestar casi ningún signo previo; a lo sumo, cierta anorexia y melanosis, presentando muerte súbita que puede afectar al 60-80% del colectivo ! ! ! ! ! Revisión!bibliográfica! ! ! 29! ! ! ! ! ! afectado. No encontramos ninguna lesión externa ni interna en los peces afectados, al morir de forma súbita por shock endotóxico. En la forma aguda encontramos melanosis, anorexia, e inflamación de branquias con gran presencia de mucus. Esta forma se produce en peces juveniles con escasa o nula inmunidad. En la necropsia, observamos esplenomegalia y congestión hepática (Daly, 1999), el riñón lo podemos encontrar aumentado de tamaño y anémico. La forma crónica suele presentarse en peces que poseen una cierta inmunidad natural o artificial frente a dicho agente causal, en peces que hayan sobrevivido al brote de enfermedad, o cuando las condiciones ambientales no son las más adecuadas para que la enfermedad se presente. En estas circunstancias, los peces enfermos manifiestan una intensa debilidad, y cierto retraso en el crecimiento y anorexia. Además, hay un goteo continuado de animales muertos llegando a alcanzar un 20-30% del colectivo, pudiendo mostrar hinchazón del abdomen. No existen otros síntomas de la enfermedad. En la necropsia observamos la presencia de pequeños nódulos blanquecinos en el hígado, bazo y riñón que han destruido la estructura del tejido. La presencia de estos focos se asocia siempre a estos cuadros crónicos más que a muertes de forma aguda, la cual en las especies marinas es la más común (Toranzo y cols., 1991b; Balebona y cols., 1992). Microscópicamente, estos nódulos se corresponden con granulomas, donde la parte central necrótica se rodea por una cápsula epitelioide (Kubota y cols., 1970b). Las infecciones subclínicas, donde los peces se transforman en portadores, también ocurre con temperaturas bajas (Magariños y cols., 2001). Los peces jóvenes son más susceptibles al patógeno (Toranzo y cols., 2005). ! ! ! ! ! Revisión!bibliográfica! ! ! 30! ! ! ! ! ! En su trabajo sobre la pasterelosis de la lubina estriada, Hawke y cols. (1987) describen los cambios histológicos encontrados en los peces, observándose en el bazo una necrosis aguda multifocal del tejido linfoide caracterizada por la pérdida de células, necrosis por coagulación, cariorrexis y por la presencia de muchas bacterias. En el hígado, hallaron una moderada necrosis aguda multifocal de los hepatocitos con una prominente cariorrexis. También observaron gran cantidad de bacterias en los sinusoides y dentro de los vasos hepáticos. Amplias áreas del hígado mostraron zonas de hiperplasia de las células reticuloepiteliales de revestimiento de los sinusoides hepáticos. En el páncreas describieron una necrosis aguda multifocal, acompañada con la pérdida o reducción del tamaño de los gránulos de zimógeno. Sin embargo, no se detectó infiltrado inflamatorio en ninguno de los tejidos afectados. En el estudio en España del primer brote de esta enfermedad en dorada, Toranzo y cols. (1991b) encontraron alteraciones histológicas, tanto en peces infectados de forma natural como experimentalmente, una necrosis aguda con infiltrado de eritrocitos y la presencia de muchas bacterias en capilares y espacios intersticiales en bazo y riñón. En el hígado se observó la presencia de una necrosis multifocal moderada de los hepatocitos, así como bacterias en los sinusoides y espacios hepáticos. Las lesiones crónicas (granulomas) solo fueron encontradas en peces con infección natural, después de que estos fueron tratados y hubiesen superado el brote de la enfermedad. En los peces de la infección experimental no se encontró ningún animal con granulomas. Noya y cols. (1993) inocularon tanto la bacteria como los ECPs de varias cepas de Photobacterium damselae subsp. piscicida en doradas para estudiar los cambios histológicos que estos provocaban en los peces, observando la inexistencia ! ! ! ! ! Revisión!bibliográfica! ! ! 31! ! ! ! ! ! de lesiones externas e internas, a excepción de un oscurecimiento de la superficie dorsal y lateral del cuerpo de los peces inoculados. En la sangre de ambos grupos de peces (inoculados con bacteria o con ECPs) el número de leucocitos, principalmente neutrófilos y eosinófilos, aumentó considerablemente. También se apreciaron abundantes leucocitos inmaduros y eritrocitos degenerados. Algunos de los peces inoculados con bacterias mostraron septicemia, observándose que neutrófilos y monocitos contenían a menudo bacterias fagocitadas, y que un porcentaje elevado de estas células sufría necrosis. En la cavidad peritoneal observaron neutrófilos, macrófagos, con gran cantidad de bacterias fagocitadas y eosinófilos. En la descripción de la enfermedad en salmón Atlántico, Jones y Cox (1999) observan como lesiones macroscópicas más importantes, hemorragias petequiales en intestino grueso y superficie peritoneal, y puntos blancos en hígado, bazo y corazón. Con el tiempo, se apreció también una peritonitis generalizada así como la formación de pseudomembranas difteroides entre los órganos y la vejiga natatoria. III.2.6.- Diagnóstico La identificación de esta bacteria se puede realizar por pruebas bioquímicas clásicas (Smibert y Krieg, 1981; West y Colwell, 1984) y por características morfológicas. Kent y cols. (1982) describieron el uso del sistema miniaturizado API 20E (BioMérieux) como una herramienta útil en el diagnóstico de la enfermedad, dando la bacteria resultados positivos a Arginina dehidrolasa, Glucosa, Galactosa, Manosa y Fructosa, y negativo al resto de pruebas de la galería. Santos y cols. (1993) evalúan la utilidad del sistema miniaturizado API 20E para identificar a esta bacteria obteniendo como resultado que ninguna de las cepas usadas pudo ser identificada como Photobacterium damselae subsp. piscicida, debido a que el perfil de esta bacteria ! ! ! ! ! Revisión!bibliográfica! ! ! 32! ! ! ! ! ! no se encuentra incluido en la base de datos de este sistema. Sin embargo, Magariños (1992a) sugiere que este sistema puede dar un diagnóstico presuntivo en base a un perfil característico que mayoritariamente corresponde al código 2005004, pudiéndose encontrar otros perfiles diferentes (Figura I). ! ! ! Figura I. Perfil bioquímico más habitual de Photobacterium damselae subsp. piscicida mediante el sistema API 20E Kitao y Kimura (1974), así como Kawahara y cols. (1986) describen como técnica de diagnóstico para esta enfermedad el uso de anticuerpos fluorescentes para detectar la bacteria en tejidos de peces infectados. La técnica de hibridación del ADN fue utilizada por Zhao y Aoki (1989) para evaluar la presencia de Photobacterium damselae subsp. piscicida a partir de colonias bacterianas crecidas en medios de cultivo, pero la sensibilidad de esta técnica no fue descrita. También usaron la misma técnica para detectar directamente la bacteria sobre tejido (bazo y riñón), siendo capaces de detectar 3,9 ng de ADN, ó 10⁵ células de este agente patógeno. Zhao y Aoki (1992) describieron el uso de la técnica de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para el diagnóstico de la infección por Photobacterium damselae subsp. piscicida utilizando unos cebadores elaborados a partir de la secuencia génica de un plásmido específico de esta bacteria y con un peso molecular de 5,1 Kb. ! ! ! ! ! Revisión!bibliográfica! ! ! 33! ! ! ! ! ! Un estudio comparativo realizado por Romalde y cols. (1995a) entre la técnica de aglutinación tradicional y unos sistemas para aglutinación en látex fabricados por Bionor®, muestra que en ambos casos se detectaron todas las cepas usadas de esta especie, no existiendo reacciones cruzadas con otros patógenos importantes en acuicultura como son Vibrio anguillarum y Aeromonas salmonicida, ni con otras bacterias pertenecientes a la Familia Pasteurellaceae. Sí hubo diferencias notables en cuanto a la sensibilidad, donde los sistemas con látex sólo detectaron a partir de 10¹0 bacterias por ml. La técnica de aglutinación en placa fue capaz de detectar a partir de 10⁷ bacterias por ml. Romalde y cols. (1995b) evaluaron el sistema Aquararid-Pp de Bionor® para la detección de Photobacterium damselae subsp. piscicida observando que es una buena herramienta de diagnóstico al detectar todas las cepas del estudio, y que su especificidad también era buena al no tener reacciones cruzadas con otros patógenos importantes en acuicultura como son Vibrio anguillarum y Aeromonas salmonicida, ni con otras bacterias pertenecientes a la Familia Pasteurellaceae. La sensibilidad de la prueba permitió detectar 106 bacterias por 0,5 gr de tejido. Un método para detectar este agente infeccioso en el agua fue descrito por Reali y cols. (1997). Para ello tomaron una muestra de agua y la pasaron por un filtro de nitrocelulosa de 0,45 µm de poro y pusieron este filtro sobre un medio de cultivo (Agar Marino con un 1% de manitol y 0,5 % de rojo fenol), siendo este método capaz de detectar la bacteria con 8 días de antelación a la aparición de un brote de enfermedad, lo que permitió instaurar un tratamiento precoz frente a este patógeno. Bakopoulos y cols. (1997) desarrollaron un ELISA para detectar la presencia de esta bacteria. Para ello probaron cepas de diferentes orígenes tanto en cultivos in ! ! ! ! ! Revisión!bibliográfica! ! ! 34! ! ! ! ! ! vitro como a partir de tejidos infectados. Estos autores obtuvieron que en cultivos in vitro y en tejidos infectados podían detectar valores desde 103 células/ml, lo que indicaba que el método ELISA podía ser una herramienta rápida, fácil y específica para detectar a Photobacterium damselae subsp. piscicida en brotes de enfermedad. La sensibilidad y especificidad del “Magnetic Beads-EIA” de Bionor® Aquaeia kit para el diagnóstico de pasterelosis fue demostrada por Romalde y cols. (1999b), detectando todas las cepas de Photobacterium damselae subsp. piscicida probadas hasta una dosis de 104u.f.c./ml y dando resultados negativos para las cepas probadas de Photobacterium damselae subsp. damselae y Photobacterium histaminum hasta dosis de 109-1010u.f.c./ml. El resultado fue positivo en gónadas, huevos, fluido ovárico y seminal, lo cual abrió una puerta a la posibilidad de la transmisión vertical de la pasterelosis. Para realizar el diagnóstico de la enfermedad, Osorio y cols. (1999) diseñaron una serie de cebadores, a partir de una región conservada del ARN 16S de la bacteria, desarrollando una Nested-PCR la cual era capaz de detectar de forma específica solo a Photobacterium damselae subsp. piscicida, discriminándola perfectamente de otros patógenos en acuicultura. Esta técnica presenta una sensibilidad que permite detectar entre 1-10 fg de ADN (20-200 células). Osorio y cols. (2000) para realizar el diagnóstico diferencial de la infección por Photobacterium damselae subsp. piscicida frente a Photobacterium damselae subsp. damselae utilizaron dos juegos de cebadores, uno a partir de una región conservada del ARN 16S de la bacteria y otro para el gen de la ureasa, desarrollando un método PCR, el cual fue capaz de detectar de forma específica solo a Photobacterium damselae subsp. piscicida discriminándolo perfectamente de Photobacterium damselae subsp. damselae, ya que esta última especie muestra dos bandas, una correspondiente al ! ! ! ! ! Revisión!bibliográfica! ! ! 35! ! ! ! ! ! ARN 16S y otra al gen de la ureasa, en cambio Photobacterium damselae subsp. piscicida solo muestra la banda del ARN 16S, lo cual revela que ésta es una buena técnica para el diagnóstico de la enfermedad. Independientemente del origen geográfico y de la fuente de aislamiento, todas las cepas son bioquímica y serológicamente homogéneas (Magariños y cols., 1992a y b, 1996c; Bakopoulos y cols., 1997). Sin embargo, métodos de “ADN fingerprinting” como el ribotipado (Magariños y cols., 1997b), polimorfismo en la longitud de fragmentos amplificados o AFLP realizada por Thyssen y cols. (2000), y amplificaciones aleatorias de ADN polimórfico o RAPD “random amplified polimorphic DNA” (Magariños y cols., 2000 y 2003; Hawke y cols., 2003) han demostrado ser buenas herramientas epidemiológicas ya que permiten detectar dos linajes clonales separados dentro de Photobacterium damselae subsp. piscicida (Toranzo y cols., 2004). Mientras que un linaje engloba a todos los aislados europeos, el segundo incluye a los aislados de Japón y Estados Unidos. III.2.7.- Control de la enfermedad III.2.7.1.- Quimioterapia La susceptibilidad antibiótica de 60 cepas japonesas de Photobacterium damselae subsp. piscicida a 14 agentes quimioterápicos fue descrita por Aoki y Kitao (1985). Todas las cepas fueron sensibles a la ampicilina, 21 resistentes a furazolidona, y 5 a cloranfenicol, tetraciclina, kanamicina y sulfamonometoxin, siendo detectado en estas cinco el plásmido R. Takashima y cols. (1985) describieron las resistencias antibióticas de cepas de Photobacterium damselae subsp. piscicida de diferentes distritos de Japón. De 281 cepas probadas, 262 presentaban resistencia a la combinación de antibióticos ! ! ! ! ! Revisión!bibliográfica! ! ! 42! ! ! ! ! ! mantenimiento del cultivo pero cuya naturaleza se desconoce. Estas soluciones complejas están sujetas a variación de lote a lote. • Caracterización y homogeneidad de la muestra. Las células en cultivo de una línea celular (cultivo primario propagado), o de una línea continua son homogéneas, con morfología y composición uniformes. Se pueden obtener con facilidad un número elevado de réplicas idénticas, con lo que se supera el grave problema de heterogeneidad de las muestras inherente asociado al uso de animales de experimentación. • Economía. Suponen una economía en el uso de reactivos o drogas a estudiar pues al realizarse en volúmenes reducidos, y con un acceso directo de las células a la droga las concentraciones requeridas son mucho más bajas que en animal completo. • Motivaciones éticas. La investigación biomédica supone el sacrificio cada año de muchos miles de animales de experimentación. El cultivo celular no puede reemplazar siempre al ensayo in vivo pero es una alternativa válida en muchas situaciones. Incluso un cultivo celular primario permite realizar experimentos que suponen el sacrificio de uno o pocos animales, pero con ellos se pueden ensayar un número de condiciones experimentales que pueden suponer si el estudio se hace con animales de experimentación el sacrificio de decenas o cientos. Desventajas de los cultivos celulares • Técnica sensible. El crecimiento de las células animales es mucho más lento que el de los contaminantes más habituales (hongos, bacterias, micoplasmas,...) y además dado que proceden de organismos pluricelulares son incapaces de crecer en ausencia de una compleja mezcla de nutrientes que simula el ! ! ! ! ! Revisión!bibliográfica! ! ! 43! ! ! ! ! ! plasma o el fluido intersticial. Esto supone la necesidad de mantener las condiciones de asepsia en todo momento, lo cual es limitante a nivel tanto del instrumental requerido como del personal cualificado para su manipulación. • Cantidad y coste. El coste de producción de 1 g de tejido en cultivo es más de 10 veces superior al obtenido en el animal. Asimismo existe una limitación de producción en laboratorios normales. • Inestabilidad. Muchas de las líneas celulares continuas son inestables, como consecuencia de la dotación cromosómica aneuploide. La población celular puede variar su composición si alguna de las subpoblaciones celulares es capaz de crecer con una tasa ligeramente superior, es decir podemos encontrar diferencias significativas en la línea celular de una generación a la siguiente. La única manera de evitarlo es emplear líneas estables que se resiembran a partir de un stock congelado cada determinado tiempo, o después de un determinado número de generaciones. • Validez del modelo in vitro. Cuando nos referimos a un cultivo celular nos estamos refiriendo exactamente a un disgregado celular de un tejido de origen y que se diferencia de éste en que: - se ha perdido la organización espacial tridimensional propia del tejido. - se han perdido las interacciones heterotípicas, entre los distintos tipos celulares, y entre las células y la matriz extracelular. Es de destacar que los avances más excitantes en la función celular proceden del reconocimiento de la importancia de las interacciones específicas de las células con otras células o con el sustrato. ! ! ! ! ! Revisión!bibliográfica! ! ! 44! ! ! ! ! ! - carece de los componentes sistémicos de regulación, implicados en la regulación de la homeostasis in vivo, especialmente los sistemas nervioso y endocrino. Cuando se establece el cultivo, las células se desdiferencian, y entre otras cosas se hacen móviles e inician su proliferación. Esta desdiferenciación puede, en algunos casos ser revertida por procedimientos de diferenciación inducida por hormonas, confluencia, inductores químicos,…pero no está claro si el estado rediferenciado es equivalente al estado de diferenciación in vivo. ! ! ! ! ! Revisión!bibliográfica! ! ! 45! ! ! ! ! ! III.3.1.- Cultivos celulares en peces Son muchas las líneas celulares establecidas para peces. Las siguientes son las necesarias para ensayos de los patógenos de peces mencionados en el Código Acuático de la Organización Mundial de Sanidad Animal (OIE) (Tabla V). Tabla V.- Líneas celulares de peces para ensayos oficiales de la OIE Línea celular Nombre completo Especie Morfología BF-2 Bluegill fry (Células de pedúnculo de cola de carpa) Mojarra oreja azul (Leponis macrochirus) Fibroblástica CHSE-214 Chinook salmon embryo (Células embrionarias de salmón real) Salmón real (Oncorhynchus tshawytscha) Epitelial EPC Epitelioma papullusum cyprini (Papiloma epitelial de carpa) Carpita cabezona (Pinephales promelas) Epitelial RTG-2 Rainbow trout gonad (Gónada de trucha arcoíris) Trucha arcoíris (Oncorhynchus mykiss) Fibroblástica FHM Fathead minnow (Línea epitelial de carpita cabezona) Carpita cabezona (Pinephales promelas) Epitelial GF Blue striped Grunt fin (Aleta de ronco catire) Ronco catire (Haemulon sciurus) Fibroblástica SHK-1 Salmon head kidney (Riñón anterior de salmón) Salmón atlántico (Salmo salar) Leucocítica ASK Atlantic salmon kidney (Riñón de salmón) Salmón atlántico (Salmo salar) Leucocítica ! ! ! ! ! Revisión!bibliográfica! ! ! 46! ! ! ! ! ! En cuanto a los medios de cultivo, el medio usado más ampliamente para el cultivo de células de peces es el tradicional medio mínimo esencial de Eagle (MEM) con sales de Earle y suplementado con suero fetal bovino (SFB) al 10%, antibióticos y 2mM de L-glutamina. No obstante, el medio de Stocker, que es una forma modificada del medio anterior con doble concentración de algunos aminoácidos y vitaminas, se recomienda particularmente para aumentar el crecimiento celular, empleando los mismos suplementos que los arriba indicados más un 10% de triptosa fosfato. Alternativamente, para algunas líneas celulares, se puede usar el medio de Leibovitz (L15) suplementado con SFB al 5 ó 10%, L-glutamina (4mM) y gentamicina (50 µg/ml). Para el crecimiento celular, el contenido normal de SFB en el medio es del 10%, mientras que para el aislamiento de virus o para la producción de virus el SFB puede reducirse hasta el 2%. De modo similar, el pH del medio de cultivo para el crecimiento de las células es de 7,3-7,4 y se ajusta a 7,6 para la producción de virus o para el ensayo de virus. La composición de la mezcla de antibióticos utilizada con más frecuencia es penicilina (100 IU/ml) y dihidroestreptomicina (100 µg/ml). Si se espera una contaminación por hongos puede usarse nistatina u otros antifúngicos (50 IU/ml). Se pueden emplear otros antibióticos y otras concentraciones de antibióticos según la conveniencia dependiendo de la sensibilidad antibiótica de las cepas bacterianas encontradas. ! ! ! ! ! Revisión!bibliográfica! ! ! 47! ! ! ! ! ! III.3.2.- Línea celular SAF-1 Desde la primera descripción de una línea celular de peces (Wolf y Quimby, 1962), se han desarrollado un gran número de éstas. Su principal aplicación ha sido el aislamiento, identificación y estudio de virus que provocan brotes epizoóticos, causando pérdidas económicas (Nicholson, 1989; Bols, 1991). En los últimos años, la dorada se ha convertido en la especie más importante para la acuicultura marina en los países mediterráneos europeos. Por tanto, se ha puesto mucho interés en mejorar su producción, mediante técnicas genéticas y/o previniendo enfermedades bacterianas y víricas. Sin embargo, antes de la creación de esta línea celular estable, ningún enfoque había sido adecuadamente estudiado in vitro, debido a la falta de líneas celulares apropiadas. Solamente se habían usado líneas celulares heterólogas, hasta entonces, en estudios de patogenia (Balebona y cols., 1995) y no se había intentado nada en el campo de la genética. Por estas razones, era necesario el establecimiento de una línea específica para la dorada para probar la susceptibilidad de esta especie a virus y bacterias, realizar ensayos in vitro en planes de manipulación genética, así como otras aplicaciones potenciales. En 1997, Bejar y cols. establecieron esta línea celular de fibroblastos de aleta de dorada. Para evaluar la utilidad de la línea SAF-1 para diagnóstico virológico se evaluó su habilidad para permitir la replicación de varios virus comunes en peces. Se valoró el efecto citopático en las células 7 días post inoculación. Aunque la línea funcionó para todos los virus probados, se detectó una mayor susceptibilidad para Rabdovirus, especialmente para IHNV (necrosis ! ! ! ! ! Revisión!bibliográfica! ! ! 48! ! ! ! ! ! hematopoyética infecciosa), donde se observa efecto citopático dentro de los dos primeros días. En cuanto a los productos extracelulares, la mayoría de los ECPs de diferentes especies del Género Vibrio probados son citotóxicos para SAF-1. Los efectos citotóxicos pueden verse 3-6 horas después de la inoculación, aunque los resultados se recogen hasta 24 horas después para evitar descartar efectos positivos que se produzcan más tarde. Los cambios morfológicos detectados son similares a los del efecto citopático que se produce por los virus. Las células se redondean, encogen y se pierden las uniones y finalmente se destruye la monocapa, además debido al efecto de los productos extracelulares de algunas especies del Género Vibrio, se forman numerosas vesículas y formaciones dendríticas. Muchas ventajas hacen que esta línea sea fácil de mantener: 1. Buena adaptación para el crecimiento con un medio estándar sin requerimientos especiales, como añadir NaCl, que suele ser necesario para otras células marinas. 2. Su habilidad para el crecimiento óptimo con una concentración de SFB del 5%, lo que es muy inusual en peces. 3. La temperatura óptima de 25ºC permite el mantenimiento a temperatura ambiente sin estufas especiales (en zonas donde el clima lo permite habitualmente). 4. Una tasa de supervivencia de las células congeladas del 50%, siendo mayor que la descrita para otras líneas celulares de peces. ! ! ! ! ! Revisión!bibliográfica! ! ! 49! ! ! ! ! ! A una temperatura de incubación apropiada, la línea celular SAF-1 permite la replicación de los virus causantes de la necrosis pancreática infecciosa, necrosis hematopoyética infecciosa y septicemia viral hemorrágica. Por tanto, es útil en el aislamiento y estudio de virus no detectados en esta especie y otros espáridos. III.3.3.-Aplicación de métodos de cultivo celular en la sanidad animal en acuicultura Varios métodos de cultivo celular y ensayos in vitro asociados, que analizan los mecanismos biológicos (por ejemplo, respuestas inmunitarias) son útiles para la aplicación de medidas preventivas y de control de enfermedades en acuicultura. Los modelos in vitro son sistemas experimentales que permiten un mayor control de las condiciones de los ensayos, reduciendo también la variabilidad de respuestas debido a las inevitables reacciones al estrés, en las que las interacciones entre agresores y hospedador pueden ser analizadas. Estos métodos están siendo aplicados para estandarizar y validar métodos de diagnóstico, y para desarrollar nuevas metodologías de control de enfermedad seguras, terapéuticas y efectivas (Villena, 2003). Se han desarrollado un número considerable de líneas celulares de peces (Fryer y Lannan, 1994), pero hay muy pocas disponibles para especies de mariscos (Tapay y cols., 1995; Chen y Wang, 1999a; Neumann y cols., 2000b). III.3.4.- Métodos de cultivo celular en el diagnóstico de enfermedades infecciosas Los métodos de cultivo celular son herramientas esenciales para el diagnóstico de enfermedades víricas en granjas de acuicultura (Wolff, 1988; Hetrick y Hedrick, 1993). Estas técnicas se basan principalmente en el uso de líneas celulares sensibles a los diferentes virus (Ahne, 1985; Hetrick y Hedrick, 1993; O.I.E, 2000), en las que la infección viral se demuestra por el efecto citopático (debido a la lisis celular) o sincitial (producido por la fusión de células). Además, la infección viral in ! ! ! ! ! Revisión!bibliográfica! ! ! 50! ! ! ! ! ! vitro de líneas celulares susceptibles facilita varias técnicas serológicas para la vigilancia y diagnóstico de enfermedades víricas (O.I.E, 2000), incluyendo la detección de anticuerpos de peces contra virus patógenos por medio del test de neutralización viral (LaPatra, 1996). La susceptibilidad de las líneas celulares a un virus concreto no tiene que estar relacionada con la susceptibilidad in vivo a la enfermedad, y varias líneas celulares que no proceden de salmónidos se usan rutinariamente para el diagnóstico de enfermedades virales de salmónidos (Lorenzen y cols., 1999a; Hostnik y Jencic, 2000). Como el efecto citopático/sincitial puede llevar varios días, y en algunos casos no ocurren los mismos efectos bajo algunas condiciones de cultivo, en los últimos diez años los métodos serológicos que usan anticuerpos monoclonales (Nicholson, 1993; Lorenzo y cols., 1995) y las técnicas de biología molecular, como la PCR (Miller y cols., 1998a), o combinación de ambas (Estepa y cols., 1995), se han utilizado para hacer más rápido el diagnóstico de virus de peces. El cultivo celular se ha usado también para la detección de algunas bacterias intracelulares patógenas para peces, como en Rickettsia spp. (Fryer y Lannan, 1996) y Renibacterium salmoninarum (McIntosh y cols., 1997). Una característica compartida por estos microorganismos es que son de crecimiento complicado en medios de cultivo bacteriológicos, pero puede crecer en una semana en la línea celular con origen en epitelioma de carpa (EPC), un pez que no es susceptible al patógeno (McIntosh y cols., 1997). El patógeno crece intracelularmente en las células EPC, y este método de cultivo también permite la expresión de factores de virulencia específicos de R. salmoninarum y el mantenimiento de la virulencia in vitro de los aislados (McIntosh y cols., 1997). ! ! ! ! ! Revisión!bibliográfica! ! ! 51! ! ! ! ! ! El uso de cultivos celulares es clave para estudiar la biología y mecanismos patogénicos de virus cultivables que afectan a la acuicultura (Wolff, 1988; Hetrick y Hedrick, 1993; Bernard y Bremont, 1995; Essbauer y Ahne, 2001). Estos estudios no incluyen solo procedimientos diagnósticos, sino también análisis de las interacciones entre virus de peces y sus células hospedadoras para identificar alguno de los mecanismos involucrados en los diferentes pasos de la infección viral. Sin embargo, los métodos de cultivo celular también se han desarrollado para estudiar factores de virulencia de bacterias (Toranzo y Barja, 1993; Austin y Cross, 1998; Austin y Austin, 1999) y parásitos (Nielsen y Buchmann, 2000; Buchmann y cols., 2000; Nolan y Johnson, 2000) patógenos de peces. Gran parte de los estudios sobre patogenicidad bacteriana se han centrado en los efectos citotóxicos de los productos extracelulares en células de peces para identificar factores de virulencia (Villena, 2003). Además, los métodos de cultivo celular han dado un conocimientos más profundos sobre los mecanismos de la interacción hospedador-patógeno para algunas bacterias patógenas. Los ensayos in vitro se han usado para analizar los mecanismos de patogenicidad incluidos en los diferentes estadíos de las enfermedades, como fijación bacteriana y entrada en el hospedador, anulación de los mecanismos de defensa e infección (Evenden y cols., 1993; Austin y Austin, 1999). Este es el caso de bacterias que son patógenos intracelulares obligados o facultativos como Mycoplasma spp., Mycobacterium spp., algunas Aeromonas spp., o Renibacterium salmoninarum. Al mismo tiempo, la combinación de cultivo celular y métodos de biología molecular aportan nuevas y útiles herramientas para la investigación de patógenos y hospedador (Villena, 2003), como se ha demostrado con Edwardsiella tarda (Ling y cols., 2000). En este estudio, cepas virulentas y ! ! ! ! ! Revisión!bibliográfica! ! ! 58! ! ! ! ! ! de 2001 por la que se establecen los planes de muestreo y los métodos de diagnóstico para la detección y confirmación de determinadas enfermedades de los peces y se deroga la Decisión 92/532/CEE). Además, se utiliza en el diagnóstico de otras enfermedades víricas no incluidas en la lista de la OIE, como encefalopatía y retinopatía viral (causada por betanodavirus), y necrosis hematopoyética epizoótica (EHN). La inmunofluorescencia también tiene su aplicación en el diagnóstico de enfermedades de peces causadas por bacterias como: Flavobacterium psychrophilum (Lorenzen y Karas, 1992), Renibacterium salmoninarum, Piscirickettsia salmonis (OIE). La inmunofluorescencia indirecta utilizando anticuerpos monoclonales se ha usado con éxito en la detección de Streptococcus iniae en tejidos (Klesius y cols., 2006). Panangalal y cols. (2006) desarrollaron una técnica de inmunofluorescencia indirecta que permite detectar simultáneamente dos patógenos de peces, como Edwardsiella ictaluri y Flavobacterium columnare, usando fluorocromos con diferentes espectros de emisión, Alexa Fluor 488 y 594, emitiendo en verde y rojo, respectivamente. La inmunofluorescencia es una técnica útil para el estudio de la relación patógeno-hospedador. La supervivencia de patógenos intracelulares dentro del hospedador viene determinada por la evasión microbiana, que puede ser parcialmente atribuida a sus estrategias de tráfico intracelular. Las técnicas de microscopía han ido cobrando importancia para entender la biología celular de las infecciones microbianas. Estas técnicas pueden usarse para la localización subcelular de antígenos en cultivos celulares y en tejidos (van der Wel y cols., 2005). ! ! ! ! ! Revisión!bibliográfica! ! ! 59! ! ! ! ! ! Un ejemplo de tráfico intracelular habitual de una bacteria dentro de una célula no fagocítica sería el que sigue Brucella abortus. Hablamos de un patógeno intracelular facultativo que favorece su propia internalización en este tipo de células. Inicialmente, la bacteria interactúa con compartimientos de la cascada endocítica temprana. Luego, rápidamente se asocia con la cascada autofagocítica. En fases más tardías de la infección, Brucella prolifera en el retículo endoplasmático de las células hospedadoras (Pizarro-Cerdá y cols., 2000). La técnica de inmunofluorescencia para marcar estructuras que se forman durante el tránsito intracelular bacteriano es útil para dilucidar las distintas fases. El EEA-1 y el LAMP1 son marcadores utilizados para poder evidenciar este tipo de estructuras en multitud de estudios relacionados con el tráfico intracelular, tanto en macrófagos como en líneas no fagocíticas. El EEA-1 “early endosomal auto-antigen 1” es un marcador específico de membranas de endosomas primarios o vacuolas. Por lo tanto, se localizará en estructuras de tipo vacuolar, que marcarán el borde de un compartimento donde se encuentren partículas que hayan entrado en el interior celular. El LAMP-1 “Lysosomal-associated membrane protein 1” es una proteína presente en la membrana de endosomas tardíos y lisosomas. La presencia de LAMP-1 sugiere que la partícula está en compartimentos lisosomales dentro de la célula. Muchos estudios han empleado la inmunofluorescencia utilizando anticuerpos frente EEA-1 y LAMP-1 para tratar de marcar dichas estructuras (con la ayuda de un anticuerpo secundario fluorescente) y conocer el tráfico intracelular de virus, bacterias o proteínas. Es el caso del Virus del Síndrome Reproductivo y Respiratorio Porcino (Van Gorp y cols., 2009),!Parvovirus!(Harbison y cols., 2009), ! ! ! ! ! Revisión!bibliográfica! ! ! 60! ! ! ! ! ! Clostridium perfringens (Nagahama y cols., 2012), Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis (Nazareth y cols., 2015),!Bordetella pertussis (Lamberti, 2010), Brucella abortus (Bellaire y cols., 2005) y Péptido C (Luppi y cols., 2009). López-Doriga y cols. (2000) observaron, mediante microscopía electrónica de transmisión, que Photobacterium damselae subsp. piscicida no estaba libre en el citoplasma de las células de la línea celular de carpa EPC, sino dentro de grandes vacuolas citoplasmáticas. Por tanto, la inmunofluorescencia utilizando anticuerpos frente a EEA-1 y LAMP-1 puede ser útil para tratar de elucidar si determinadas estructuras está involucradas en el tráfico intracelular de Photobacterium damselae subsp. piscicida en la línea célular no fagocítica SAF-1. ! ! ! ! ! Revisión!bibliográfica! ! ! 61! ! ! ! ! ! III.5.-Sistema inmunitario de peces El sistema inmunitario de los peces es fisiológicamente similar al de los vertebrados superiores, a pesar de ciertas diferencias. Al contrario de lo que ocurre con los vertebrados superiores, los peces son organismos de vida libre que desde las primeras etapas embrionarias de la vida dependen de su sistema inmunitario innato para la supervivencia (Rombout y cols., 2005). La inmunidad inespecífica es un mecanismo de defensa fundamental para el pez, y además, desempeña un papel clave en la respuesta inmunitaria adquirida y la homeostasis a través de un sistema de proteínas receptoras. Estas proteínas receptoras identifican patrones moleculares que son típicos de microorganismos patógenos, incluyendo los polisacáridos, lipopolisacáridos (LPS), peptidoglicanos bacterianos, ADN, ARN viral y otras moléculas que no están normalmente en la superficie de organismos multicelulares. Esta respuesta se divide en barreras físicas y respuesta inmunitaria celular y humoral. Estos parámetros inmunológicos incluyen los inhibidores de crecimiento, enzimas líticas, sistema del complemento, anticuerpos, citoquinas,!quimioquinas y péptidos antibacterianos. Los cambios de temperatura, el estrés, el manejo y la densidad del cultivo pueden tener efectos supresores sobre este tipo de respuesta, mientras que los alimentos, varios aditivos e inmunoestimulantes pueden mejorar su eficiencia (Magnadottir, 2006 y 2010). III.5.1.- Inmunidad celular no específica El componente celular de las defensas inmunitarias inespecíficas de los peces incluye a las células fagocíticas móviles (macrófagos y granulocitos) que son reclutadas de la sangre y de los tejidos linfoides, las células eosinofílicas granulares, que son menos móviles y están presentes en sitios mucosos como el intestino o las branquias y son consideradas análogas a los mastocitos de los mamíferos, y a las ! ! ! ! ! Revisión!bibliográfica! ! ! 62! ! ! ! ! ! células citotóxicas no específicas, consideradas el equivalente funcional en los peces de las células NK (Natural Killer) de los mamíferos. La fagocitosis es uno de los procesos defensivos más importantes en los animales poiquilotermos, porque es el proceso que está menos influenciado por la temperatura (Blazer, 1991; Lange y Magnadottir, 2003; Magnadottir y cols., 2005). Las principales células implicadas en la fagocitosis en los peces son los neutrófilos y los macrófagos (Secombes y Fletcher, 1992). Estas células eliminan las bacterias principalmente por la producción de reactivos del oxígeno en un mecanismo conocido como explosión respiratoria. Además, los neutrófilos poseen mieloperoxidasa en sus gránulos citoplasmáticos, que en presencia de peróxido de haluro de hidrógeno mata a las bacterias por halogenación de su pared celular. Por otra parte, estas células tienen lisozimas y otras enzimas hidrolíticas en sus lisosomas (Fischer y cols., 2006). Del mismo modo, los macrófagos pueden producir óxido nítrico, que durante el proceso de la explosión respiratoria se une con el superóxido (O2-) para producir el peroxinitrito, un radical libre muy potente como agente antibacteriano (Ischiropoulos y cols., 1992; Carreras y cols., 1994). Varios patógenos bacterianos pueden inducir o inhibir la apoptosis de las células hospedadoras. La modulación de las vías celulares que resulta en la inducción o el retraso de la apoptosis de la célula huésped es un mecanismo importante de la virulencia bacteriana (Cotran y cols., 1999; Häcke y cols., 2002). Estos procesos pueden ser mediados por diferentes vías de señalización de células anfitrionas que están subvertidos por las bacterias. Los patógenos pueden activar las proteínas apoptóticas tales como caspasas e inactivar proteínas anti-apoptóticas como Nf-kB. Sobre la base de sus funciones principales, se pueden agrupar las caspasas en dos subfamilias, pro-apoptóticas y proinflamatorias (Li y Yuan, 2008). ! ! ! ! ! Revisión!bibliográfica! ! ! 63! ! ! ! ! ! Caspasas pro-apoptóticas (caspasa-2, -3,!-6, -7, -8, -9, -10) son conocidas por estar principalmente involucradas en la mediación de la transducción de la señalización de la muerte celular, mientras que las caspasas pro-inflamatorias (caspasa-1, -4, -5, - 11, -12) regulan la maduración de citoquinas durante la inflamación. Durante la infección, la invasión y la transcitosis bacteriana pueden producir efectos citotóxicos sobre las células que se pueden evaluar mediante la medición de lactato deshidrogenasa (LDH), un marcador de la muerte celular (Nizet y cols., 1996). Para varios patógenos estreptocócicos, ha sido reconocido la capacidad para inducir la lesión de las células hospedadora, que se considera un primer paso en la patogénesis (Gibson y cols., 1999; Charland y cols., 2000; Fuller y cols., 2001). III.5.2.- Citoquinas Las citoquinas son un grupo de proteínas glicosiladas, generalmente de bajo peso molecular, secretadas por células inmunitarias. Como moduladores de la respuesta inmunitaria, las citoquinas se han estudiado poco en los peces y un número significativo son funcionalmente activas en los teleósteos (Secombes, 1996). Las citoquinas tienen funciones superpuestas y pleiotrópicas, lo que dificulta su clasificación. Pueden dividirse en interleuquinas (ILs), interferones (IFNs), factores de necrosis tumoral (TNFs), factor estimulante de las colonias y quimioquinas. Según sus funciones, se puede clasificar las citoquinas en diferentes familias tales como, linfoquinas, factores de crecimiento, interferones, quimioquinas e interleuquinas (IL) (Savan y cols., 2003). ! ! ! ! ! Revisión!bibliográfica! ! ! 64! ! ! ! ! ! III.5.2.1.- Interleuquinas Su principal función es regular la activación, diferenciación o proliferación de los linfocitos, la secreción de anticuerpos, la quimiotaxis y la producción de otras citoquinas. Pocas IL han sido clonadas en peces debido a su baja homología con las IL humanas y al hecho de que aparecen en el organismo solo en respuesta a determinados estímulos. En este trabajo nos vamos a centrar sobre la interleuquina 1 beta (IL-1β) y su receptor IL-1r2. La interleuquina-1 (IL-1), miembro importante del grupo de las citoquinas pro-inflamatorias, puede ser producida por monocitos, macrófagos activados, granulocitos, células endoteliales, linfocitos T y otras células. La IL-1α e IL-1β se han caracterizado en peces, así como en diferentes grupos animales como aves, anfibios y mamíferos (Secombes y cols., 2001). Es un mediador importante de la inflamación en respuesta a la infección y se ha descrito que en la trucha afecta directamente a la función del eje hipotálamo-hipófisis-interrenal, estimulando la secreción del cortisol (Holland y cols., 2002). III.5.2.2.- Factor de necrosis tumoral El factor de necrosis tumoral (TNF) es una citoquina pro-inflamatoria que pertenece a la superfamilia de mediadores que llevan su nombre, donde el TNF-α es el más conocido. El TNF puede ser producido, entre otros, por monocitos, macrófagos activados, granulocitos, células endoteliales y linfocitos T y juega un papel importante en la inflamación, organogénesis, diferenciación, apoptosis celular, siendo el principal mediador del shock séptico y de la caquexia (Idriss y Naismith, 2000). ! ! ! ! ! Revisión!bibliográfica! ! ! 65! ! ! ! ! ! III.5.2.3.- Interferón Los interferones son proteínas o glicoproteínas que producen distintos tipos celulares como respuesta a estímulos diversos entre los que destacan las infecciones víricas. Además de su propiedades antivirales, el interferón tiene un efecto regulatorio en la activación de los macrófagos y la proliferación de células T y B (Shao y cols., 2001). Se distinguen tres clases de interferones según sus características estructurales y biológicas: interferón α o tipo leucocitario, interferón β o tipo fibroblástico e interferón γ o tipo inmune, producido por linfocitos T y células NK. Los interferones α y β, también conocidos como interferones tipo I, poseen propiedades antivíricas, anti-proliferativas e inmunomoduladoras, mientras que los interferones γ, producidos por los linfocitos T en respuesta a estímulos antigénicos, actúan únicamente como inmunomoduladores. III.5.2.4.- Quimioquinas Las quimioquinas son moléculas atractivas que dirigen la migración leucocitaria e intervienen en una amplia variedad de procesos fisiológicos y patológicos, fundamentalmente en procesos inmunitarios e inflamatorios (Mantovani, 1999; Zlotnik y Yoshie, 2000). Son proteínas de bajo peso molecular (de aproximadamente 70 aminoácidos), secretadas por diversas células e involucradas en la migración y activación de leucocitos, en los procesos de angiogénesis, en la producción de colágeno y en la proliferación de los precursores hematopoyéticos. Se clasifican de acuerdo a la posición relativa de sus residuos cisteína N-terminal. Las dos familias más importantes y más estudiadas son las quimioquinas-CXC (cuando los dos residuos de cisteína están separados por un aminoácido) y las quimioquinasCC (ambas cisteínas están unidas). ! ! ! ! ! Revisión!bibliográfica! ! ! 66! ! ! ! ! ! III.5.3.- Proteína Mx Las proteínas Mx pertenecen a la familia de GTPasas y son proteínas inducidas por el interferón tipo I en vertebrados en respuesta a la infección por myxovirus. La inducción de Mx no se debe solo a virus sino también a lipopolisacáridos de membrana, a ADN sintético y también en respuesta a vacunas inactivadas frente a bacterias (Acosta y cols., 2004).La presencia y conservación de estas proteínas en mamíferos, aves, y peces teleósteos, sugiere su importancia en los mecanismos de defensa frente a virus (McBeath y cols., 2007).! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! MATERIAL Y MÉTODOS ! ! ! ! ! Material!y!métodos! ! ! 74! ! ! ! ! ! proliferación activa, entre 1 y 2 indica ligera proliferación, y menor de 1 evidencia muerte celular. Como control negativo, utilizamos la cepa no invasiva de Escherichia coli DH5-α. La integridad de las células infectadas fue examinada mediante microscopía durante todo el experimento (desde 24 horas a 7 días) y la viabilidad de las células se comprobó mediante tinción con azul tripán, donde las células alteradas adquieren color azul. IV.3.4.- Implicación del citoesqueleto celular en la entrada de Photobacterium damselae subsp. piscicida Con el objetivo de saber si la penetración de Photobacterium damselae subsp. piscicida en células SAF-1 era llevada a cabo mediante la formación de microfilamentos de actina por parte del citoesqueleto celular, se diseñó este experimento, utilizando para ello la citocalasina D, un agente disrruptor que inhibe la polimerización de los microfilamentos de actina. La citocalasina D (1µg/ml) se utilizó antes de proceder a la infección para evitar la función del citoesqueleto y, por tanto, la entrada de la bacteria. Las células se preincubaron con el agente bloqueante durante 30 minutos. Para realizar la infección celular, añadimos 5 µl del cultivo bacteriano (de la cepa que corresponda) a cada pocillo con las células SAF-1 con 500 µl de medio L15 (pH 7,2) suplementado con un 10% de suero fetal bovino y luego centrifugamos a 500 rpm durante 4 minutos para mejorar el contacto entre célula y bacteria. Las placas se incubaron a 25ºC. Tras una infección de 90 minutos, las bacterias externas no adheridas (suspendidas en el medio) se retiraron realizando 3 lavados con PBS, mediante ! ! ! ! ! Material!y!métodos! ! ! 75! ! ! ! ! ! succión cuidadosa con pipeta, y se incubaron durante 2 horas con medio L15 con gentamicina (100 µg/ml).Tras este periodo, se realizaron de nuevo 3 lavados con PBS y se añadieron 100 µl de Tritón X-100 (1% en PBS) a cada pocillo durante 5 minutos, para romper las células. Se realizaron diluciones seriadas del contenido de los pocillos y se sembraron alícuotas de 10 µl en placas de BHI Agar con 1,5% de NaCl, incubándose durante 48 horas a 25 ºC para el recuento en placa. Se realizaron controles donde se manifestó que la citocalasina D no afectaba a la viabilidad de las células ni de las bacterias. IV.3.5.- Efecto de la incubación a 4ºC en la internalización bacteriana El objetivo de este ensayo es determinar la intervención del metabolismo celular en el proceso de invasión de Photobacterium damselae subsp. piscicida en la línea celular SAF-1. Unos 20 minutos previos a la infección, incubamos una placa de cultivo celular de 24 pocillos a 4ºC. Una vez infectados los pocillos, incubamos durante 90 minutos a 4ºC y procedemos al recuento de bacterias intracelulares tras eliminación de bacterias adheridas con gentamicina. El control de la infección se realiza al mismo tiempo pero incubando a 25ºC. IV.3.6.- Efecto de la temperatura de crecimiento bacteriano sobre la internalización El objetivo de esta experiencia es determinar las tasas de internalización/invasión celular de las cepas en función de la temperatura de incubación (25ºC - 20ºC). ! ! ! ! ! Material!y!métodos! ! ! 76! ! ! ! ! ! Las cepas usadas en este estudio se cultivaron en BHIB con 1,5% de NaCl durante 48 horas y se incubaron en estufa a 20ºC y 25ºC. Cada pocillo, a una confluencia del 80-90%, se infectó con 5µl de las diferentes suspensiones bacterianas. Una vez inoculadas, las placas se centrifugaron a 500 rpm durante 5 minutos, y se incubaron a 25ºC. Transcurridos 90 minutos de incubación y tras la eliminación de bacterias adheridas con gentamicina, procedemos al recuento de bacterias intracelulares del mismo modo que en los apartados anteriores. IV.3.7.- Efecto de la presencia de glucosa en la internalización bacteriana En las células eucariotas, muchos receptores celulares son azúcares que son reconocidos por ligandos bacterianos por lo que de existir en este caso, si previamente bloqueamos estos ligandos adicionando azúcares durante la incubación de los inóculos de Photobacterium damselae subsp. piscicida, se bloquearía la posterior unión con el receptor celular y se evitaría en parte la internalización celular de la bacteria. Para ello, preparamos los inóculos bacterianos en medio de cultivo BHIB suplementado con un 1,5% de NaCl y un 1% de glucosa, así como un inóculo control sin azúcares (lote testigo). Tras 48 horas de incubación con o sin azúcares, el ensayo prosigue como ensayos previos inoculando 5µl de las diferentes cepas y condiciones en placas de 24 pocillos con la línea celular SAF-1, observando tasas de invasión celular. Además, la adición de un 1% de glucosa al medio de cultivo induce la formación de una capa capsular lipopolisacárida que produce un aumento en la virulencia en esta bacteria (Bonet y cols., 1994), por lo que pretendemos valorar si la presencia de esta capa afecta a los índices de invasión. ! ! ! ! ! Material!y!métodos! ! ! 77! ! ! ! ! ! IV.4.- Análisis de la interacción celular por inmunofluorescencia IV.4.1.- Análisis de la adherencia e internalización intracelular por inmunofluorescencia Las células de la línea SAF-1 fueron depositadas en placas de 24 pocillos con una lentilla de vidrio de 12 mm de diámetro en el fondo de cada pocillo. Para la infección se inocularon 5 µl del cultivo bacteriano de la cepa 94/99 por pocillo. Tras la incubación de las células a 25ºC durante 90 minutos (o de 1 a 7 días), se realizaron 3 lavados con PBS y se fijaron con paraformaldehído frío (4% en PBS) durante 20 minutos a temperatura ambiente. Posteriormente, las lentillas con las células fijadas fueron extraídas cuidadosamente de los pocillos y depositadas en una cámara húmeda donde se realizó la técnica de la inmunofluorescencia. Los anticuerpos primarios y secundarios se diluyeron a una concentración de 1:500 en albúmina sérica bovina (BSA, Sigma) (1% en PBS). Las lentillas se lavaron con PBS y se incubaron durante 20 minutos con el anticuerpo primario (anticuerpo policlonal antiPhotobacterium damselae subsp. piscicida de conejo, cuya obtención se describe más adelante). Se realizaron nuevos lavados con PBS y las lentillas se incubaron durante 20 minutos con un anticuerpo secundario anti-conejo (Alexa® Fluor 594) para teñir las bacterias extracelulares. Posteriormente, las células se permeabilizaron utilizando Tritón X-100 (0,1% en PBS) durante 4 minutos a temperatura ambiente y posteriormente lavar las lentillas con PBS. ! ! ! ! ! Material!y!métodos! ! ! 78! ! ! ! ! ! Para teñir las bacterias intracelulares se añadió el anticuerpo primario siguiendo el proceso anteriormente descrito, y luego el anticuerpo secundario anticonejo, que en este caso es el Alexa® Fluor 488. Después de realizar otros 3 lavados con PBS, se procedió al montaje de las lentillas en portaobjetos con ProLong Gold con DAPI (Invitrogen®). Todas las preparaciones se examinaron con microscopio de fluorescencia usando el modelo Olympus BX51 con los objetivos de inmersión de 100 ó 60. Las imágenes digitales se obtuvieron con una cámara Olympus DP-70 y se procesaron con Photoshop CS3 (Adobe). Las imágenes fueron obtenidas en el laboratorio del Dr. José Ramos Vivas en el Departamento de Microbiología Molecular, Centro de Investigaciones Biológicas (CIB), Consejo Superior de Investigaciones Científicas (CSIC), Madrid. Los anticuerpos secundarios utilizados son anticuerpos fluorescentes del tipo Alexa® Fluor de cabra anti-conejo (Invitrogen®). El Alexa® Fluor 594 tiene una emisión roja y el Alexa® Fluor 488 emite en verde. Ambos son inmunoglobulinas tipo G. Espectro de emisión de anticuerpos Alexa Fluor ! ! ! ! ! Material!y!métodos! ! ! 79! ! ! ! ! ! Obtención del antisuero de conejo La obtención del antisuero policlonal anti-Photobacterium damselae subsp. piscicida se realizó según la metodología descrita por Harlow y Lane (1988) y Acosta y cols. (2002), utilizándose 2 conejos de unos 2 Kg de peso de raza californiana, procedentes de una explotación local que desparasita y vacuna sus ejemplares periódicamente frente a mixomatosis, enfermedad vírica hemorrágica y enterotoxemia. A cada animal se le administró 2 ml de un inóculo compuesto por 1ml de una suspensión de Photobacterium damselae subsp. piscicida inactivada y 1 ml de Adyuvante de Freund incompleto (Sigma). La suspensión inactivada de Photobacterium damselae subsp. piscicida se realizó mediante cultivo en medio BHIB de la cepa de Photobacterium damselae subsp. piscicida 94/99, a 25ºC durante 48 horas con agitación continua y suave. Posteriormente se lavó dos veces la suspensión bacteriana centrifugando el medio a 3.000 rpm durante 5 minutos, retiramos el sobrenadante y resuspendimos el centrifugado en PBS. Finalmente, tomamos el centrifugado y se resuspende en PBS, adicionándole un 5‰ de formol e incubando durante 24 horas a 25ºC para inactivar las bacterias. A las 24 horas tomamos una alícuota de la suspensión y la cultivamos en Agar Sangre con 1,5% de NaCl a 25ºC durante 48 horas para garantizar la esterilidad de la misma. Cada conejo recibió los 2 ml del inóculo (1ml de la suspensión de Photobacterium damselae subsp. piscicida inactivada y 1 ml de Adyuvante de Freund incompleto) repartidos en 10 puntos de inyección subcutánea por diversas zonas del lomo del animal. ! ! ! ! ! Material!y!métodos! ! ! 80! ! ! ! ! ! Tras 5 semanas desde la primera inoculación, se les aplicó una segunda dosis con el mismo inóculo, para provocar así una buena hiperinmunización. A los 15 días de esta segunda inoculación se procedió a la sangría completa de los conejos (previamente anestesiados mediante la aplicación intramuscular de una solución compuesta por 0,2 ml de acepromacina y 0,4 ml de ketamina) por punción cardíaca. La sangre se recolectó en tubos con gelatina y paredes siliconadas para la retracción del coagulo y obtención del suero. Una vez obtenida la sangre, se dejó coagular a 4ºC y posteriormente se centrifugó a 3000 rpm durante 5 minutos. El suero se conservó alicuotado a -80º C hasta su utilización en la técnica de la inmunofluorescencia. ! ! ! ! ! Material!y!métodos! ! ! 81! ! ! ! ! ! IV.4.2.- Análisis del tráfico intracelular por inmunofluorescencia Las células de la línea SAF-1 fueron depositadas en placas de 24 pocillos con una lentilla de vidrio de 12 mm de diámetro en el fondo de cada pocillo. Para la infección se inocularon 25 µl del cultivo bacteriano de la cepa 94/99 por pocillo. Con el objetivo de poder visualizar la posible emisión de microfilamentos de actina, las lentillas se fijaron con se fijaron con paraformaldehído frío (4% en PBS) a diferentes tiempos tras la inoculación bacteriana. Los tiempos fueron: 5, 10, 15, 30 y 45 minutos. La técnica se realizó siguiendo los pasos descritos en el apartado anterior (IV.4.1.). El anticuerpo utilizado para marcar la actina fue el Faloidina Alexa® 488 (anticuerpo primario que emite en verde). Con el objetivo de poner de manifiesto la posible formación de endosomas, las lentillas se fijaron con paraformaldehído frío (4% en PBS) a diferentes tiempos tras la infección bacteriana (1, 2 y 4 horas).!La técnica se realizó siguiendo los pasos descritos en el apartado anterior (IV.4.1.) comenzando la tinción a partir de la permeabilización con Tritón X-100 (0,1% en PBS), ya que solo nos interesa lo que ocurra en el interior celular. Los anticuerpos utilizados para marcar los endosomas fueron EEA-1 (anticuerpo primario de ratón) y Alexa® Fluor 568 (secundario anti-ratón y con emisión en rojo). Para poder ver la posible formación de lisosomas, las lentillas se fijaron con paraformaldehído frío (4% en PBS) a diferentes tiempos tras la infección bacteriana (4, 8, 24 y 48 horas). La técnica se realizó siguiendo los pasos descritos en el ! ! ! ! ! Material!y!métodos! ! ! 82! ! ! ! ! ! apartado IV.4.1., comenzando la tinción a partir de la permeabilización con Tritón X-100 (0,1% en PBS), ya que solo nos interesa lo que ocurra en el interior celular. Los anticuerpos utilizados para marcar los lisosomas fueron LAMP-1 (anticuerpo primario de ratón)!y Alexa® Fluor 568 (secundario anti-ratón y con emisión en rojo). Todas las preparaciones se examinaron con microscopio de fluorescencia usando el modelo Olympus BX51 con los objetivos de inmersión de 100 ó 60. Las imágenes digitales se obtuvieron con una cámara Olympus DP-70 y se procesaron con Photoshop CS3 (Adobe). Las imágenes fueron obtenidas en el laboratorio del Dr. José Ramos Vivas en el Departamento de Microbiología Molecular, Centro de Investigaciones Biológicas (CIB), Consejo Superior de Investigaciones Científicas (CSIC), Madrid. ! ! ! ! ! Material!y!métodos! ! ! 83! ! ! ! ! ! IV.5.- Expresión de citoquinas y gen Mx en SAF-1 tras la infección con Photobacterium damselae subsp. piscicida En este ensayo usamos las cuatro cepas descritas en el apartado IV.1., más la cepa de Photobacterium damselae subsp. piscicida PP3 aislada de Seriola coreana (Seriola quinqueradiata) en Japón y cedida por el Dr. Andrew Barnes. IV.5.1.- Determinación de la multiplicidad de la infección (M.O.I.) Con el objetivo de determinar qué proporción célula:bacteria puede favorecer la expresión de citoquinas en SAF-1, se realizó un experimento que consideramos preliminar. Para ello, se probaron cuatro multiplicidades de infección (MOI): 1:10, 1:25, 1:50 y 1:100 utilizando dos de las cinco cepas de Photobacterium damselae subsp. piscicida, la C2 y la PP3. Posteriormente, se midió la expresión génica 4 postinfección (tras 90 minutos de contacto entre bacteria y célula). IV.5.2.- Expresión de citoquinas y gen Mx en SAF-1 tras la infección de Photobacterium damselae subsp. piscicida cultivadas con y sin glucosa Las células SAF-1 (depositadas en placas de 6 pocillos) fueron infectadas durante 90 minutos con las cepas de Photobacterium damselae subsp. piscicida con un MOI de 1:10 tras analizar los resultados de la experiencia preliminar. La mitad de las células se infectaron con las 5 cepas de Photobacterium damselae subsp. piscicida crecidas en BHIB suplementado con un 1,5% de NaCl y la otra mitad, con las mismas 5 cepas de Photobacterium damselae subsp. piscicida crecidas en el mismo medio pero suplementado con 1% de glucosa. Asimismo, las células utilizadas como control (no infectadas-lote testigo) se inocularon con PBS. Las placas fueron centrifugadas, a 500 rpm durante 4 minutos para mejorar el contacto entre célula y bacteria, e incubadas a 25ºC. ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! Resultados! ! ! 91! ! ! ! ! ! V.- RESULTADOS V.1.- Ensayos de invasión bacteriana V.1.1.- Evaluación del efecto del tiempo de infección en la internalización En la Figura III, se observa la tasa de internalización intracelular de las diferentes cepas de Photobacterium damselae subsp. piscicida usadas en el estudio, en función de los diferentes tiempos de infección probados. La tasa de invasión aumenta con el tiempo de incubación en las 4 cepas. El máximo nivel de invasión se observó en la cepa 94/99, siendo de 0,21% a los 90 minutos. Las otras tres cepas mostraron patrones de invasión similares entre ellas. Como la invasión es tiempodependiente, y una vez probado que a los 90 minutos de incubación todas las cepas reflejaron una tendencia creciente, hemos utilizado este tiempo para los siguientes experimentos, permitiendo así la máxima invasión. Figura III.- Efecto del tiempo de infección en la invasión de Photobacterium damselae subsp. piscicida en células SAF-1 ! ! ! ! ! Resultados! ! ! 92! ! ! ! ! ! V.1.2.- Determinación del efecto de la concentración bacteriana en la eficacia de invasión La internalización de las cepas de Photobacterium damselae subsp. piscicida se evaluó con diferentes concentraciones bacterianas en un número fijo de células por pocillo. En la Figura IV, se observa que la tasa de internalización aumenta con el incremento de la concentración del inóculo, es decir, en general el número de bacterias intracelulares aumentó con el número de bacterias añadidas. Para la cepa 94/99 existen diferencias estadísticamente significativas (p<0,05) entre 1X y 5X. El resto de cepas estudiadas muestran una tendencia, pero no hay diferencias estadísticamente significativas. Figura IV.-Efecto de la concentración bacteriana en la eficacia de invasión de Photobacterium damselae subsp. piscicida en células SAF-1 ! ! ! ! ! Resultados! ! ! 93! ! ! ! ! ! V.1.3.- Valoración de la supervivencia intracelular Para determinar si las cepas internalizadas morían, se replicaban y/o sobrevivían en la línea celular SAF-1, las infecciones se llevaron a cabo a diferentes tiempos. Después de los periodos de incubación (hasta 6 días), se contaron las bacterias intracelulares viables y los resultados se expresaron como porcentaje de bacterias intracelulares respecto al inóculo inicial. La tasa de proliferación intracelular (Indice IPRO), entendida como la relación existente entre las bacterias viables a las 24 horas y 90 minutos se situó alrededor de 1,1 para las 4 cepas analizadas, indicando una ligera replicación bacteriana en el interior celular. En la Figura V se aprecia que todas las cepas fueron capaces de proliferar ligeramente tras un periodo de supervivencia intracelular y sobrevivir durante al menos 3-5 días. La cepa que alcanzó mayor supervivencia en la línea SAF-1 fue la 94/99. Figura V.- Efecto del tiempo en la supervivencia intracelular de Photobacterium damselae subsp. piscicida en células SAF-1 ! ! ! ! ! Resultados! ! ! 94! ! ! ! ! ! V.1.4.- Implicación del citoesqueleto celular en la entrada de Photobacterium damselae subsp. piscicida Las células SAF-1 se trataron con citocalasina D para evitar la formación de microfilamentos de actina y posteriormente fueron infectadas con las cepas de Photobacterium damselae subsp. piscicida. No se recuperaron bacterias intracelulares de las cepas C2, DI-21 ni ATCC 17911, encontrando únicamente un 0,0034% de la cepa 94/99, la cepa que mostró una mayor tasa de invasión tras 90 minutos de incubación. V.1.5.- Efecto de la incubación a 4ºC en la internalización bacteriana Para evaluar la intervención del metabolismo celular eucariota en el proceso de invasión de Photobacterium damselae subsp. piscicida se realizaron las infecciones a 4ºC. No se recuperaron bacterias intracelulares de ninguna de las 4 cepas de estudio en los experimentos realizados a esta temperatura. ! ! ! ! ! Resultados! ! ! 95! ! ! ! ! ! * * * * V.1.6.- Efecto de la temperatura de crecimiento bacteriano sobre la internalización Como observamos en la Figura VI, las tasas de internalización tras 90 minutos de incubación de las cuatro cepas de Photobacterium damselae subsp. piscicida analizadas presentaron valores con diferencias estadísticamente significativas (*=p<0,05) en función de la temperatura de incubación (25ºC y 20°C). Las mayores tasas de internalización se observaron cuando la temperatura de incubación fue de 25ºC, siendo de nuevo la cepa 94/99 la que ofrece los valores más elevados. Figura VI.- Efecto de la temperatura de crecimiento bacteriano sobre la internalización de Photobacterium damselae subsp. piscicida en células SAF-1. El asterisco encima de las barras indica diferencias estadísticamente significativas (p<0,05). ! ! ! ! ! Resultados! ! ! 96! ! ! ! ! ! V.1.7.- Efecto de la presencia de glucosa en la internalización bacteriana En la Figura VII, se representa el efecto que produce en la invasión el cultivo de las diferentes cepas de Photobacterium damselae subsp. piscicida en presencia de glucosa. No se aprecian diferencias estadísticamente significativas en los índices de invasión entre las cepas cultivadas en el medio habitual con respecto a las crecidas con glucosa. Figura VII.- Efecto de la presencia de glucosa en la internalización de Photobacterium damselae subsp. piscicida en células SAF-1 ! ! ! ! ! Resultados! ! ! 97! ! ! ! ! ! V.2.- Análisis de la interacción celular por inmunofluorescencia V.2.1.- Análisis de la adherencia e internalización celular por inmunofluorescencia La técnica de la inmunofluorescencia muestra que todas las cepas de Photobacterium damselae subsp. piscicida se adhieren a las células con una distribución uniforme de la bacteria en la superficie celular, y que la bacteria es capaz de penetrar en células SAF-1 tras 30 minutos de incubación. Los niveles de invasión dependen de la cepa utilizada. En la Figura VIII, observamos la secuencia de la tinción doble por inmunofluorescencia realizada en la línea celular SAF-1 tras 90 minutos de infección con Photobacterium damselae subsp. piscicida. Las bacterias extracelulares las observamos teñidas en rojo con el fluorocromo Alexa® Fluor 594 en células sin permeabilizar (Figura VIIIa). Una vez permeabilizadas las células, en verde observamos el total de bacterias (adheridas e internas) teñidas con el fluorocromo Alexa® Fluor 488 (Figura VIIIb) en donde la flecha indica una bacteria que está siendo internalizada. La Figura VIIIc muestra la acción del DAPI, que tiñe de manera selectiva el ADN bacteriano y celular. La última imagen (Figura VIIId) se corresponde con la superposición de las imágenes anteriores, donde podemos observar en naranja, bacteria adherida teñida con ambos fluorocromos, en verde bacterias internas, y en azul, ADN bacteriano y celular. ! ! ! ! ! Resultados! ! ! 98! ! ! ! ! ! a" b" c" d" Figura VIII.- Internalización y adherencia de Photobacterium damselae subsp. piscicida en SAF1 por inmunofluorescencia No se apreciaron diferencias en la viabilidad de las células hospedadoras cuando fueron infectadas con las cepas de Photobacterium damselae subsp. piscicida durante 7 días usando el método de exclusión de azul tripán. En la Figura IX, se observa la multiplicación de Photobacterium damselae subsp. piscicida que tiene lugar en el interior de las células SAF-1. En la Figura IXa, se muestra una imagen en contraste de fase de las células SAF1 transcurridas 48 horas desde la infección. La imagen siguiente (Figura IXb) se corresponde con bacterias intracelulares teñidas en verde. Superponiendo estas dos imágenes, se obtiene la Figura IXc, donde observamos en azul el ADN celular y bacteriano, y en verde las bacterias intracelulares. La Figura IXd se corresponde con una magnificación del recuadro presente en la Figura IXc, en la que se aprecian las bacterias replicándose (flechas). ! ! ! ! ! Resultados! ! ! 99! ! ! ! ! ! Figura IX.- Replicación intracelular de Photobacterium damselae subsp. piscicida en SAF-1 Después de tres días, bacterias con forma cocobacilar coexistían con bacterias de morfología redondeada, probablemente indicando que algunas bacterias intracelulares estaban siendo degradadas o adquiriendo formas cocáceas resistentes (Figura X). En la imagen, se observan en verde las bacterias intracelulares y restos bacterianos. Las flechas señalan bacterias intracelulares que colocalizan con DAPI. ! ! ! ! ! Resultados! ! ! 106! ! ! ! ! ! V.3.2.2.- Expresión del gen IL1-β La expresión del gen IL-1β refleja un modelo de respuesta muy similar al descrito anteriormente para el gen Mx. Aunque algunas cepas (94/99, DI 21 y 17911) no producen suficiente estímulo de la línea celular, las otras dos cepas (C2 y PP3) producen una expresión notable del gen entre las 24 y 48 horas, siendo ligeramente superior en los casos en los que la glucosa no fue añadida al medio de crecimiento. La respuesta inicial al estímulo se obtiene con la cepa PP3 a las 4 horas de incubación con y sin presencia de glucosa en el medio. La máxima expresión del gen IL-1β vuelve a alcanzarse a las 24 horas con la cepa PP3 crecida con y sin glucosa, para descender notablemente a las 48 horas, como ocurre también con la cepa C2. Para el resto de los tiempos utilizados, las células no expresan el gen IL-1β, observándose una subexpresión con respecto al control. ! ! ! ! ! Resultados! ! ! 107! ! ! ! ! ! * * * * * * * * * Figura XVa.- Expresión génica de IL-1β en células SAF-1 infectadas con 5 cepas de Photobacterium damselae subsp. piscicida. Valores expresados como media ± SE de la expresión del gen relativo al control. El asterisco encima de las barras indica diferencias estadísticamente significativas (p<0,05). Figura XVb.- Expresión génica de IL-1β en células SAF-1 infectadas con 5 cepas de Photobacterium damselae subsp. piscicida crecidas en un medio con glucosa. Valores expresados como media ± SE de la expresión del gen relativo al control. El asterisco encima de las barras indica diferencias estadísticamente significativas (p<0,05). ! ! ! ! ! Resultados! ! ! 108! ! ! ! ! ! V.3.2.3.- Expresión del gen IL-1r2 Aunque el modelo de respuesta para la expresión del gen IL-1r2 es muy parecido a la IL-1β, apreciamos una cinética de expresión con mayor intensidad cuando las cepas se mantuvieron en ausencia de glucosa, aunque la duración es similar con o sin glucosa en el medio, correspondiéndose con las 48 horas de incubación. En ambos casos, las cepas que claramente provocan expresión para este gen son la C2 y PP3. La respuesta se inicia a las 4 horas postincubación para la cepa PP3 y alcanza su máximo a las 48 horas cuando se mantuvo sin glucosa añadida en el medio. Para la cepa C2, el máximo nivel de expresión llega a las 24 horas postinfección en ambas condiciones. En el resto de los tiempos estudiados con las cepas 94/99, DI-21 y 17911 se observó subexpresión respeto al control en todos los casos. ! ! ! ! ! Resultados! ! ! 109! ! ! ! ! ! * * * * * * * * * * Figura XVIa.- Expresión génica de IL-1r2 en células SAF-1 infectadas con 5 cepas de Photobacterium damselae subsp. piscicida. Valores expresados como media ± SE de la expresión del gen relativo al control. El asterisco encima de las barras indica diferencias estadísticamente significativas (p<0,05). Figura XVIb.- Expresión génica de IL-1r2 en células SAF-1 infectadas con 5 cepas de Photobacterium damselae subsp. piscicida crecidas en un medio con glucosa. Valores expresados como media ± SE de la expresión del gen relativo al control. El asterisco encima de las barras indica diferencias estadísticamente significativas (p<0,05). ! ! ! ! ! Resultados! ! ! 110! ! ! ! ! ! V.3.2.4.- Expresión del gen COX-2 En las Figuras XVIIa y XVIIb se muestra la expresión del gen COX-2 en células SAF-1 tras la incubación con cepas de Photobacterium damselae subsp. piscicida crecidas sin y con glucosa.!En!ambos!casos,!las cepas que presentan un potente efecto inmunomodulador son la C2 y PP3, mientras todas las demás provocan subexpresión del gen para todos los tiempos utilizados. La respuesta se inicia desde las 4 horas de incubación y alcanza su máximo a las 48 horas para estas dos cepas. Los valores con la cepa C2 crecida con glucosa van en aumento conforme avanza el tiempo. La mayor expresión se obtiene con la cepa PP3 sin glucosa a las 48 horas. ! ! ! ! ! Resultados! ! ! 111! ! ! ! ! ! * * * * * * * * * * Figura XVIIa.- Expresión génica de COX-2 en células SAF-1 infectadas con 5 cepas de Photobacterium damselae subsp. piscicida. Valores expresados como media ± SE de la expresión del gen relativo al control. El asterisco encima de las barras indica diferencias estadísticamente significativas (p<0,05). Figura XVIIb.- Expresión génica de COX-2 en células SAF-1 infectadas con 5 cepas de Photobacterium damselae subsp. piscicida crecidas en un medio con glucosa. Valores expresados como media ± SE de la expresión del gen relativo al control. El asterisco encima de las barras indica diferencias estadísticamente significativas (p<0,05). ! ! ! ! ! Resultados! ! ! 112! ! ! ! ! ! V.3.2.5.- Expresión del gen TNF-α Finalmente, la expresión génica para el gen TNF-α se produce también de forma más intensa en ausencia de glucosa en el medio, siendo la respuesta de mayor duración con la cepa C2, que se inicia a las 4 horas de incubación y alcanza su pico máximo de expresión a las 48 horas.. La cinética se expresa de forma mantenida a las 24 y 48 horas de incubación independientemente de la presencia de glucosa para el estímulo con las cepas C2 y PP3. No obstante, la cepa 94/99 inicia una cinética de expresión tardía a las 48 horas cuando existió presencia de glucosa en el medio. Con el resto de las cepas se obtienen niveles de subexpresión génica para todos los tiempos utilizados, independientemente de la presencia o no de glucosa del medio. ! ! ! ! ! Resultados! ! ! 113! ! ! ! ! ! * * * * * * * * * * * * Figura XVIIIa.- Expresión génica de TNF-α en células SAF-1 infectadas con 5 cepas de Photobacterium damselae subsp. piscicida. Valores expresados como media ± SE de la expresión del gen relativo al control. El asterisco encima de las barras indica diferencias estadísticamente significativas (p<0,05). Figura XIIIb.- Expresión génica de TNF-α en células SAF-1 infectadas con 5 cepas de Photobacterium damselae subsp. piscicida crecidas en un medio con glucosa. Valores expresados como media ± SE de la expresión del gen relativo al control. El asterisco encima de las barras indica diferencias estadísticamente significativas (p<0,05). ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! DISCUSIÓN