Mejora de dietas para caballito de mar: efectos en su producción y modulación del color

Anexo I D/Dª...............................................................SECRETARIO/A DEL DEPARTAMENTO DE....................................................................... DE LA UNIVERSIDAD DE LAS PALMAS DE GRAN CANARIA, CERTIFICA, Que el Consejo de Doctores del Departamento en su sesión de fecha.............................tomó el acuerdo de dar el consentimiento para su tramitación, a la tesis doctoral titulada “..........................................................................................................” presentada por el/la doctorando/a D/Dª................................................................. y dirigida por el/la Doctor/a............................................................................................... Y para que así conste, y a efectos de lo previsto en el Artº 6 del Reglamento para la elaboración, defensa, tribunal y evaluación de tesis doctorales de la Universidad de Las Palmas de Gran Canaria, firmo la presente en Las Palmas de Gran Canaria, a...de.............................................de dos mil............ Anexo II UNIVERSIDAD DE LAS PALMAS DE GRAN CANARIA Departamento/Instituto/Facultad: Instituto Universitario de Sanidad Animal y Seguridad Alimentaria Programa de doctorado: Acuicultura: Producción controlada de animales acuáticos Título de la Tesis "Mejora de dietas para caballito de mar (Hippocampus hippocampus). Efectos en su producción y modulación del color" Tesis Doctoral presentada por Ángel Segade Botella Dirigida por la Doctora Lucía Molina Domínguez Codirigida por la Doctora Lidia Esther Robaina Robaina. La Directora La Codirectora El Doctorando Las Palmas de Gran Canaria, a _____ de_________________ de 20__ LUCÍA MOLINA DOMÍNGUEZ, PROFESORA Y JEFA DEL DEPARTAMENTO DE ACUICULTURA DEL INSTITUTO DE EDUCACIÓN SECUNDARIA PROFESOR ANTONIO CABRERA PÉREZ E INVESTIGADORA DEL GRUPO DE INVESTIGACIÓN EN ACUICULTURA DE LA UNIVERSIDAD DE LAS PALMAS DE GRAN CANARIA. INFORMA: Que Don Ángel Segade Botella, Licenciado en Ciencias del Mar, ha realizado bajo mi dirección y asesoramiento el presente trabajo titulado: "Mejora de dietas para caballito de mar (Hippocampus hippocampus). Efectos en su producción y modulación del color", el cual considero que reúne las condiciones y calidad científica para optar al Grado de Doctor. Fdo: Lucía Molina Domínguez LIDIA ESTHER ROBAINA ROBAINA, PROFESORA TITULAR EN EL ÁREA DE CONOCIMIENTO DE ZOOLOGÍA DEL DEPARTAMENTO DE BIOLOGÍA DE LA UNIVERSIDAD DE LAS PALMAS DE GRAN CANARIA E INVESTIGADORA DEL GRUPO DE INVESTIGACIÓN EN ACUICULTURA DE LA UNIVERSIDAD DE LAS PALMAS DE GRAN CANARIA. INFORMA: Que Don Ángel Segade Botella, Licenciado en Ciencias del Mar, ha realizado bajo mi dirección y asesoramiento el presente trabajo titulado: "Mejora de dietas para caballito de mar (Hippocampus hippocampus). Efectos en su producción y modulación del color", el cual considero que reúne las condiciones y calidad científica para optar al Grado de Doctor. FDO: LIDIA ESTHER ROBAINA ROBAINA I Lista de tablas Tabla 1.1. Principales países comercializadores de caballitos de mar (modificado deVincent et al., 2011). 11 Tabla 1.2. Resumen de artículos publicados sobre peces ornamentales referidos al color. 27 Tabla 1.3. Listado de empresas que cultivan caballitos de mar y especies producidas. 30 Tabla 1.4. Estudios publicados sobre aspectos de biología y acuicultura de los caballitos de mar. 34 Tabla 1.5. Resumen de experimentos realizados con diferentes especies para consumo humano alimentadas con Artemia en distintas fases de desarrollo. 37 Tabla 1.6. Resumen de experimentos realizados con diferentes especies ornamentales alimentadas con Artemia en distintas fases de desarrollo. 37 Tabla 3.1. Dietas experimentales y sus correspondientes nomenclaturas 51 Tabla 3.2. Documento de registro del comportamiento alimentario observado durante 5 minutos en todas las tomas administradas con las siguientes claves: 0, negativo; 1, positivo. 55 Tabla 3.3. Dietas experimentales y sus correspondientes nomenclaturas. 59 Tabla 3.4. Dietas experimentales y sus correspondientes nomenclaturas. 61 Table 4.1. Proximate composition (g 100g-1 wet weight) and total carotenoid (µg g-1) content of five experimental diets. 76 Table 4.2. Fish growth response parameters at the end of the experiment. 78 Table 4.3. Proximate composition and total carotenoid body content (g 100g-1 wet weight) of whole fish at the end of the trial. 78 Table 4.4. Fish color parameters at the end of the experiment. 81 Table 5.1. Biochemical composition (g kg-1 wet weight, media ± standard deviation) of experimental diets. 94 Table 5.2. Fatty acid composition (g kg-1 of fatty acid wet weight) and their main relation in the different diets. 97 Table 5.3. Biochemical composition (g kg-1 wet weight; media ± standard deviation) of seahorses fed on the different experimental diets. 98 Table 5.4. Analysis of variance (ANOVA) of the main fatty acids (% of total ± SD) and their relation in the whole body composition in seahorses fed on different diets, p<0.05. 99 Table 6.1. Proximate composition (% wet weight) of Artemia enriched with five experimental products. 120 Table 6.2. Total carotenoid concentration (µg g-1) in Artemia enriched with five experimental products along 24 h enrichment. 120 II Table 7.1. Proximate composition and total carotenoid content (mg kg-1 wet weight) of the experimental diets. 136 Table 7.2. Seahorse body mass values (g ± SD) in each sampling, p<0.05. 140 Table 7.3. Proximate composition (mg kg-1 wet weight ± SD), total carotenoid body content (µg g-1 ± SD) and weight (g) of whole fish at the end of the trial. 140 Table 7.4. Analysis of variance (ANOVA) of the main fatty acids (g kg-1 ± SD) and their relation in the whole body composition in seahorses fed different diets, p<0.05 142 Table 7.5.Colorimeter fish color parameters at the beginning and the end of the experiment. 143 III Lista de figuras Figura 1.1. Exportaciones (arriba) e importaciones (abajo) por continente en 2007 (modificado de Monticini, 2010). 4 Figura 1.2. Técnicas de pesca destructivas: pesca con dinamita (izquierda) y pesca con cianuro (derecha). Fuente: Internet (www.tacticalfanboy.com; http://envirohonper7.wikispaces.com) 7 Figura 1.3. Caballitos secos comercializados como medicina tradicional o souvenir. Fuente: www.eckerd.edu;www.smallworldbeauty.com 9 Figura 1.4. Diferentes especies pertenecientes a la familia syngnathidae. 1, Histiogamphelus; 2, Selenostomus paradoxus; 3, Haliichthys taeniophorus; 5, Hippocampus procerus; 6, Phycodurus eques. Fuente: www.fishesofaustralia.net.au 12 Figura 1.5. Distribución geográfica de los caballitos de mar (modificado de Lourie et al., 1999) 13 Figura 1.6. Caballitos mimetizándose con el entorno. Fuente: Internet (www.uicnmed.org; www.blueworldfotos.com) 14 Figura 1.7. Morfología del caballito de mar (Hippocampus hippocampus) (adaptado de Lourie et al., 2004) 17 Figura 1.8. Precios de dos caballitos de la misma especie pero de distinto color. Fuente: Internet (www.tiendadecaballitos.es) 24 Figura 1.9. Imágenes del pez payaso Picasso (Amphiprion percula) de ORA® Farm (izquierda), el fire red (centro) y sunburst® (derecha) mustangs (Hippocampus erectus) de Ocean Rider. (Fuente: www.orafarm.com y www.seahorse.com) 24 Figura 1.10. Momentos clave en la evolución del comercio y la acuicultura del caballito de mar de 1960 a 2009 (Modificado de Koldewey y Martin-Smith, 2010). 29 Figura 1.11. Dos variedades de H. reidi del mismo criador (Brazilero, izquierda; Sunburst, derecha) Fuente: Ocean Rider. 33 Figura 1.12. Ciclo de vida de la Artemia (Fuente: adaptado de learn.genetics.utah.edu). 36 Figura 1.13. Imagen en la que se observa el digestivo de una Artemia adulta repleto de pequeñas micelas de enriquecedor lipídico. 39 Figura 2.1. Instalación general, detalle de un acuario y del sistema de filtración. 47 Figura 3.2. SEP-Art Separator (Fuente: www.primo.net.au) 49 Figura 3.3. Caballito marcado con VIFE color verde, emitiendo fluorescencia. Fuente: Ángel Segade 50 Figura 3.4. Esquema general de las medidas tomadas. Fuente: Modificado de www.projectseahorse.com 53 Figura 3.5. Medidas tomadas en los muestreos: A, cola; B, tronco2; C, tronco1; D, cabeza y E, hocico 53 IV Figura 3.6. Medición del color mediante un colorímetro (Minolta Chroma Meter CR-200, Minolta, Osaka, Japan) 56 Figura 3.7. Recipientes de 1l en los que se realizó el enriquecimiento de la Artemia con distintos productos. 59 Figura 3.8. Funcionamiento del colorímetro Minolta CR-400 (Fuente: manual Minolta CR-400) 63 Figura 3.9. Se muestra un ejemplo de los datos de salida del software FISCEAPP con la imágen recortada y segmentada de un pez payaso, y la distribución del color en el cuerpo del pez. 63 Figure 4.1. Relation between weight and % of lipids in seahorse whole body 79 Figure 4.2. Total carotenoids in diets (black) and seahorses (grey). 80 Figure 4.3.Variation of the mean values of a* (red) and b* (yellow) over time in seahorses fed live enriched Artemia (LEA). End of main experiment (A), maximum accumulation reached (B) and end of experiment (C). 81 Figure 5.1. Relation between lipid percentage in seahorses and their weight (p<0.05) 97 Figure 5.2. Image of a seahorse liver 100 Figure 5.3. Image (4x, bar = 500μm) midgut with a whole Artemia (left) and detail (10x, bar = 200μm), revealing the eye, thoracopods and one antenna of Artemia (right). (H & E staining). A, Artemia; E, Eye of Artemia; T, Thoracopods. 100 Figure 5.4. Seahorse liver at the end of the experiment: a) Diet LEA (Live enriched Artemia. x10, bar = 200µm and x40, bara = 50µm) shows many lipidic vacuoles;b) Diet FEA (Frozen enriched Artemia. x10 and x40) shows hepatic cells (H) surrounding pancreas (P) and many lipidic vacuoles; c) Diet M (Frozen mysisx10 and x 40), shows a liver with all the hepatocytes with centered nuclei (Staining: H&E) 102 Figure 6.1. Variation in the mean values of DHA content in Artemia enriched with five different oil mixtures. 121 Figure 6.2. Variation in the mean values of EPA content in Artemia enriched with five different oil mixtures. 121 Figure 6.3. Variation in the mean values of AA content in Artemia enriched with five different oil mixtures. 122 Figure 6.4. Variation in the mean values of total carotenoid content in Artemia enriched with five different oil mixtures. 122 Figure 6.5. Variation in the mean values of EPA/DHA ratio in Artemia enriched with five different oil mixtures. 123 Figure 6.6. Image of Artemia's gut content at two hours of enrichment (left; x10, bar = 0.3mm) and eight hours of enrichment (right; x20, bar =0.1mm). 123 Figure 6.7. Respiration and potential respiration time-courses during the six hours experiments. All measurements are normalized by mg proteins and expressed as percentages of their initial value (7.93 µl O2·h-1·mg prot-1and 30.01 µl O2·h-1·mg prot-1 for respiration and potential respiration, respectively) 124 V Figure 7.1. Image of the Fisceapp interface, showing the different options for working with the images. 138 Figure 7.2. Relation between seahorses carotenoid content and the enriched Artemia carotenoid content. 141 Figure 7.3. Variation in the mean values of Hue over time in seahorses fed with the three different diets: S, Selco; SK06, a mixture of 0.6g/l of Selco with 0.6g/l of krill oil; SM03, a mixture of 0.3g/l of Selco with 0.3 g/l of mussel oil. 143 Figure 7.4. Plot of the PCA study of Hue comparing data between day 0 and day 90. 144 Figure 7.5. Plot of the PCA study of HUE comparing data between samplings (D, day) and diets: S, Selco; SK06, a mixture of 0.6g/l of Selco with 0.6g/l of krill oil; SM03, a mixture of 0.3g/l of Selco with 0.3 g/l of mussel oil. 144 Figure 7.6. Seahorses carotenoid content and seahorses Hue color relatioships. 145 VI Abreviaturas EPA Eicosapentaenoic Acid DHA Docosaexaenoic Acid ARA Araquidonic Acid HPLC High Performance Liquid Cromatography RGB Red, Green and Blue LEA Live Enriched Artemia FEA Frozen Enriched Artemia M Mysis SEM Selco Enriched Mysis CEM Cyclops Enriched Mysis VIFE Visible Implant Fluorescent Elastomer S Selco SK03 Mix of 0.6g/l of Selco and 0.3g/l of Kril Oil SK06 Mix of 0.6g/l of Selco and 0.6g/l of Kril Oil SM03 Mix of 0.6g/l of Selco and 0.3g/l of Mussel Oil SM06 Mix of 0.6g/l of Selco and 0.6g/l of Mussel Oil FISCEAPP Fish Skin Color Evaluation Application PUFA Poly Unsaturated Fatty Acid HUFA Highly Unsaturated Fatty Acid ETS Electron Transport Chain VII Agradecimientos A lo largo de estos últimos años han pasado muchas cosas importantes en mi vida, siendo la culminación de este trabajo una de ellas. Es por ello que me gustaría agradecer la ayuda y apoyo ofrecido a las personas que han hecho posible todo esto. En primer lugar debo agradecer a La Universidad de Las Palmas de Gran Canaria la beca que me otorgaron sin la cual no estaría aquí en estos momentos. En general al Grupo de Investigación en Acuicultura, por acogerme en su seno como uno más y darme la posibilidad de llevar a cabo mis experimentos en sus instalaciones. Especialmente agradecer a mis directoras Lucía Molina y Lidia Robaina, el esfuerzo y apoyo mostrado en todo momento así como la ayuda prestada en algunos momentos que fueron más difíciles. Del mismo modo hay que agradecer la ayuda y transferencia de conocimientos aportados por los compañeros y técnicos que han pasado por las instalaciones de ornamentales: Fran Otero todo un "Doctor de caballitos"; Bruno Novelli, el de los huesos de larvas de caballito; y Yaiza y Ana (técnicos de caballitos). Ellos estuvieron al pie del cañón echando una mano en las instalaciones cuando hizo falta. Por otra parte aunque no han estado literalmente en el ajo de esta tesis, quiero dedicársela a ellos, MI FAMILIA, a la que gradezco con todo mi corazón el apoyo y la ayuda ofrecida. A mis Padres, siempre pendientes y preocupados (¿cómo va lo tuyo?) mis hermanas que me dieron ánimos y mi "Esposa" Mariana, que me apoyó y me animó cuando más lo necesitaba y me "tiró" de las orejas cuando no me esforzaba lo suficiente (¡Primero la tesis y luego lo otro!) que debía. Finalmente aunque no sabe de qué va todo esto ya se enterará y algún día podrá leer este documento. Y verá que el empujón final fue gracias a ella que me dio ánimos para acabar y buscar un futuro para ella: GARA, mi pequeña. VIII 1 1. Introducción INTRODUCCIÓN 8 la salud del arrecife, eliminando parásitos y partículas de mucus o tejidos muertos en otros organismos. Por ejemplo, desde Sri Lanka se exportaban anualmente más de 20,000 lábridos limpiadores (Woods y Rajasuriya, 1999), desconociéndose realmente el impacto de su pesca en el arrecife. Es difícil estimar globalmente los daños ocasionados por la extracción de organismos ornamentales. Algunas voces, especialmente las partes implicadas en el comercio, abogan por el escaso efecto global de estas prácticas en las poblaciones de los arrecifes, sin embargo, sus repercusiones deben ser valoradas a nivel local más que a nivel global y focalizándose en las especies objetivo. Por ejemplo, en el archipiélago Revillagigedo (México), se ha constatado que la población de Holacanthus clarionensis disminuyó un 95% debido a su sobreexplotación (Almenara-Roldan y Ketchum, 1994). Serían necesarios estudios concretos focalizados en las especies que se extraen en una zona determinada para evaluar el efecto de su explotación. 1.3.- Comercio de Singnátidos y su impacto en el medio El comercio de singnátidos, especialmente de caballitos de mar en el planeta, alcanza volúmenes importantes, con Asia como el principal comercializador (Vincent et al., 2011). Los países involucrados en el comercio exportan sobretodo caballitos secos a Asia para su uso en la medicina tradicional. Los individuos vivos son importados principalmente por los países europeos y los Estados Unidos de América para los acuarios. El mayor consumidor mundial de caballitos de mar es China que los utiliza como medicina tradicional y alimento tonificante (Fig 1.3), pero en el resto del mundo también son comercializados como souvenir (secos) (Fig. 1.3) o vivos para acuarios. INTRODUCCIÓN 9 Figura 1.3. Caballitos secos comercializados como medicina tradicional o souvenir.Fuente: Internet (http://www.eckerd.edu; http://www.smallworldbeauty.com) En la Tabla 1.1 se resumen los principales países comercializadores (excluyendo a China) y la forma de comercio del producto ya sea vivo o seco. Aún sabiendo que el principal consumidor de caballitos de mar es China no existen datos reales acerca del volumen total de importaciones de este país. Algunos estudios realizados advirtieron que en 2001 Japón importó desde países africanos 242 kg de caballitos secos. Por otra parte, Estados Unidos importó 622,619 caballitos de mar secos entre los años 1996-2000, principalmente provenientes de Filipinas, China y México. En Europa se importaron un total de 39,928 caballitos de mar vivos sólo en dos años, entre los años 1997-1999 (Vincent et al., 2011). Todo este comercio de caballitos de mar se centra únicamente en 15 especies, en concreto Hippocampus abdominalis, H. barbouri, H. borboniensis, H. camelopardalis, H. comes, H. erectus, H. fuscus, H. histrix, H. ingens, H. kelloggi, H. kuda, H. reidi, H. spinosissimus, H. Subelongatusy H. Zosterae, de las 48 que se han descrito en este género. La principal amenaza para las poblaciones naturales de caballitos es la sobrepesca ya sea accidental (“bycatch”) o como especie objetivo, mediante artes de pesca de arrastre principalmente para su comercialización como producto seco para el INTRODUCCIÓN 10 mercado asiático. En 1995 en Asia se comercializaron 45 toneladas de caballitos secos. Sin embargo, en determinadas zonas de India, Filipinas y Vietnam (Vincent, 1995), los pescadores obtienen entre el 80 y el 100% de sus beneficios por la pesca de caballitos vivos para su exportación a los mercados europeos y estadounidenses. En los últimos años, aunque se ha aumentado el esfuerzo pesquero las capturas han seguido disminuyendo, estimándose una disminución entre un 15% y un 50% de las poblaciones naturales en las principales zonas de extracción en los últimos cinco años (Vincent et al., 2011). Aun teniendo estos datos en cuenta, no se conoce el impacto global que puede tener la disminución de las poblaciones de caballitos de mar en el ecosistema, sin embargo es evidente que constituye una grave amenaza para la biodiversidad. INTRODUCCIÓN 11 Tabla 1.1. Principales países comercializadores de caballitos de mar (modificado de Vincent et al., 2011) Región País Comercializado seco comercializado vivo Origen Consumidor Origen Consumidor África Egipto X Gambia X Guinea X Kenia X Madagascar X Mozambique X X Nigeria X Senegal X Seychelles X R. Sudafricana X X X Tanzania X X Togo X América del Norte Canadá X x3 X México X X X X USA X X X X Centro América Belice X x1 X Costa Rica x1 X X Cuba X Guatemala X x1 Honduras X x1 Nicaragua X X x2 Panamá X x1 América del Sur Argentina x1 X Bolivia X Brasil X x1 X Chile X Ecuador X X1 x2 Perú X x1 Surinam X Uruguay X Venezuela X Europa Austria X Bélgica X Dinamarca X Francia X Alemania X X Grecia x1 Hungría X Irlanda X Italia X X Holanda X X Noruega X Portugal x1 X España X X X Suecia X Suiza X Reino Unido X x3 X Oceanía Australia X X X X Nueva Zelanda X X X X Islas Fiji X Islas Salomón X 1 Comercio local principalmente. 2 Tras la recogida de información la comercialización no se llevo a cabo. 3 Cría en cautividad (Modificado de Vincent et al., 2011). INTRODUCCIÓN 12 1.4.- Taxonomía y distribución de los Singnátidos Los miembros de la familia Syngnathidae pertenecen a la clase Actinopterigii, al igual que el resto de peces óseos. El término Syngnathidae (Fig. 1.4) proviene del griego y significa de mandíbulas fusionadas. En la actualidad FishBase y el World Register of Marine Species (WoRMS) reconocen la existencia de dos subfamilias. La familia Hippocampinae incluye los géneros: -Hippocampus, que engloba todos los caballitos de mar -Histiogamphelus, el cual solo posee dos especies similares a los peces pipa. La familia Syngnathinae engloba un total de 56 géneros, incluyendo a dragones de mar y peces pipa. Teniendo entre todos los géneros un total de 298 especies. Figura 1.4. Diferentes especies pertenecientes a la familia syngnathidae. 1, Histiogamphelus; 2, Selenostomus paradoxus; 3, Haliichthys taeniophorus; 5, Hippocampus procerus; 6, Phycodurus eques. Fuente: www.fishesofaustralia.net.au Todos los caballitos forman parte del género Hippocampus, término compuesto de las palabras griegas hippos (caballo) y campus (monstruo marino). La mayoría INTRODUCCIÓN 13 de los integrantes de esta familia son marinos o de aguas salobres aunque con alguna excepción, como es el caso de algunos peces pipa. Se distribuyen en los océanos Atlántico, Pacífico e Indico y la mayoría en las aguas templadas y tropicales. 1.5.- Características generales de la subfamilia Hippocampinae El número total de especies de caballito de mar no está del todo claro, debido a sus variaciones morfológicas dentro de una misma especie dependiendo del hábitat, geografía, etc… en la actualidad se reconocen 48 especies diferentes (Vincent et al., 2011), aunque la IUCN solo reconoce 38 especies. Esta diferencia en el número de especies reconocidas es debida a las dificultades para su identificación basándose en características morfológicas, llegándose a demostrar que la misma especie había sido nombrada de formas distintas, dándose por tanto en la familia un alto grado de sinonimia. Por esta razón se han desarrollado técnicas de identificación genéticas que actualmente se utilizan para corroborar la identificación de las especies (Teske et al., 2005; López et al., 2010). Todas las especies de caballito de mar son especies marinas (aunque pueden encontrarse en estuarios de aguas salobres), y viven generalmente en aguas poco profundas de zonas templadas y cálidas de todo el planeta (Fig. 1.5). Figura1.5. Distribución geográfica de los caballitos de mar (modificado de Lourie et al., 1999) INTRODUCCIÓN 14 No se conoce exactamente la esperanza de vida de las poblaciones naturales de caballitos de mar, la mayoría de datos existentes provienen de experiencias en laboratorios o acuarios. Al parecer, la supervivencia varía entre el año para las especies más pequeñas, hasta los 5 ó 6 años para las especies más grandes (Foster y Vincent, 2004; Curtis y Vincent, 2006). Se trata de especies que basan su supervivencia en el camuflaje, tratando de mimetizarse con su entorno, pudiendo cambiar de color o generar apéndices cutáneos (Foster y Vincent, 2004) (Fig. 1.6). Tiene pocos predadores naturales, aunque se han encontrado caballitos de mar en el estómago de peces como el atún o el dorado; sus principales predadores podrían ser sepias y cangrejos. La mayor amenaza para el caballito es el ser humano, ya que viven en aguas poco profundas por lo que la actividad antropogénica les afecta directamente. Figura 1.6. Caballitos mimetizándose con el entorno. Fuente: Internet (www.uicnmed.org; www.blueworldfotos.com) La principal característica que los diferencia del resto de peces es su cabeza situada en ángulo recto con el cuerpo. Tienen el cuerpo comprimido lateralmente y carecen de escamas, pero poseen un esqueleto formado por placas óseas formando anillos alrededor del cuerpo y recubierto por una fina capa de epitelio. Estos anillos INTRODUCCIÓN 15 son útiles para realizar la diferenciación entre especies. Carecen de aleta caudal y ventral, y las dorsales son pequeñas y con forma de abanico. Sus ojos se mueven independientemente uno del otro y no tienen estómago ni dientes, por lo que para alimentarse succionan a sus presas a través de un hocico tubular. Existe un claro dimorfismo sexual (Fig. 1.7), y posiblemente sea la característica que más define a estos peces, puesto que el macho posee un tejido en forma de bolsa en el vientre, en el cual incuban la puesta. Durante la reproducción los progenitores producen los gametos, pero al contrario de la mayoría de seres vivos es el macho quién incuba los huevos que la hembra le introduce en la bolsa incubadora, tras un cortejo que ha sido descrito (Anónimo, 1999). En el interior de la bolsa paterna los huevos eclosionarán, aunque las larvas no saldrán hasta absorber totalmente el saco vitelino. Es esta característica de la reproducción, además de su aspecto, lo que los hace tan llamativos para los acuarios. 1.5.1.- Estatus del caballito de mar de hocico corto (Hippocampus hippocampus) Esta especie está catalogada en la categoría de “Datos Insuficientes” (“Data Deficient”) por la Unión Internacional para la Conservación de la Naturaleza (International Union for Conservation of Nature, IUCN) debido principalmente a la falta de datos sobre las tendencias de las poblaciones naturales, además hay una carencia de información acerca de las áreas ocupadas por esta especie y no existen análisis cuantitativos que evalúen la probabilidad de extinción de la especie. Está considerada como especie de “Interés para los ecosistemas canarios” en el Catálogo Canario de Especies Protegidas (Gobierno de las Islas Canarias, Ley 4/2010, de 4 de Junio). Del mismo modo que el resto de integrantes de la subfamilia Hippocampinae está incluida en el Apéndice II de CITES (Convention on INTRODUCCIÓN 16 International Trade in Endangered Species of Wild Fauna and Flora), un acuerdo internacional entre gobiernos que asegura que el comercio de flora y fauna silvestres no amenace su existencia. El Apéndice II incluye especies que aunque no se encuentran en peligro de extinción, podrían llegar a estarlo si no se controla su comercio. El comercio con especies silvestres o nacidas en cautividad incluidas en este apéndice está permitido siempre que se cumplan ciertos requisitos. 1.5.2.- Biología del caballito de mar de hocico corto (Hippocampus hippocampus) El estado de conservación tanto de esta especie como del resto de miembros de su familia es consecuencia de su distribución y forma de vida. La especie objeto de estudio posee las características generales descritas anteriormente para el resto de miembros de su familia. Se distribuye desde el Sur del Reino Unido hasta las aguas noroccidentales del continente africano, estando presente en las costas de las Islas Canarias. Se trata de una especie morfológicamente muy similar a H. guttulatus (Figura 6), que se alimenta principalmente de pequeños crustáceos como misidáceos, anfípodos y copépodos (Kitsos et al., 2008). Al igual que la mayoría de sus parientes es una especie sedentaria que habita en aguas poco profundas con fondos arenosos o rocosos y con abundancia de algas, características que la hacen especialmente vulnerable debido a la proximidad de factores antropogénicos que afectan a su entorno (como la pesca de arrastre, vertidos y desagües urbanos, etc.) INTRODUCCIÓN 17 Figura 1.7. Morfología del caballito de mar (Hippocampus hippocampus) (adaptado de Lourie et al., 2004) 1.6.- La acuicultura de especies ornamentales La alta demanda de organismos ornamentales marinos y la preocupación creciente por la conservación del medio ambiente con una normativa cada vez más restrictiva para su captura, han llevado a distintos organismos e instituciones a promover la acuicultura de estas especies como una de las posibles soluciones para abastecer el mercado. Además, el desarrollo de la acuicultura de ornamentales proporcionar nuevos conocimientos acerca del comportamiento y la biología de muchas especies. Todos estos conocimientos resultan de interés para los estudios de ecología y pueden colaborar en la mejora de la gestión de las poblaciones naturales e incluso apoyar acciones de repoblación o reforzamiento de poblaciones con los ejemplares obtenidos en cautividad. INTRODUCCIÓN 24 Figura 1.8. Precios de dos caballitos de la misma especie pero de distinto color. Fuente: Internet (www.tiendadecaballitos.es) Figura 1.9. Imágenes del pez payaso Picasso (Amphiprion percula) de ORA® Farm (izquierda), el fire red (centro) ysunburst® (derecha) mustangs (Hippocampus erectus) de Ocean Rider. (Fuente: www.orafarm.com y www.seahorse.com) Observando las referencias de la Tabla 1.2, los estudios realizados en los últimos años van por el mismo camino, la búsqueda de fuentes de pigmentos para peces ornamentales: algunos utilizan pigmentos sintéticos como el lucantin pink (astaxantina) o pigmentos purificados (cantaxantina o β-caroteno) y otros harinas de origen vegetal como la harina de pétalo de caléndula, la harina de cúrcuma o el polvo de Porphiridium cruentum (microalga roja). También se ha observado que efecto puede tener la intensidad lumínica sobre la coloración de los peces así como el efecto del tanque sobre el mismo. INTRODUCCIÓN 25 En todos los estudios se pone de relieve la necesidad de unas técnicas válidas de medición del color, ya sea mediante extracción de pigmento para observar la acumulación o metodologías de análisis de imagen. A continuación se describirán algunas de las técnicas utilizadas en estos experimentos: - Espectrofotometría: se extraen los pigmentos de las muestras mediante un disolvente orgánico, para su posterior análisis mediante un espectrofotómetro (Ezhil et al., 2008; Kop y Durmaz, 2008; Mukherjee et al., 2009; Wallat et al., 2011). - HPLC (High performance Liquid Cromatography): se trata de una técnica que permite determinar el pigmento existente en el animal previo sacrificio y extracción de los pigmentos (Yasir y Quin, 2009a y 2009b; Wallat et al., 2011). - Colorimetría: se trata de una técnica no invasiva en la cual con la ayuda de un colorímetro portátil se aplica un haz de luz sobre la muestra (pez) y una centralita recibe la señal dividiéndola en diferentes factores (a*, rojo; b*, amarillo y L*, luminosidad), mediantes las cuales a través de unas fórmulas es posible calcular la saturación y el color (Baron et al., 2008). - Análisis de imagen: existen diferentes formas de realizar el análisis de imagen, en todas ellas se sacan fotografías de forma estándar para todas las muestras y posteriormente se analizan con programas informáticos de tratamiento de imagen. Uno de esos métodos es el denominado RGB (Red, Green and Blue): se aísla la zona que se desea analizar y el programa realiza un recuento de píxeles de cada uno de los colores primarios (Novelo y Gomelsky, 2009; Yasir y Quin, 2009a y 2009b). Otro método más rudimentario pero válido para INTRODUCCIÓN 26 patrones de coloración con parches como es el caso de las carpas es rodear el contorno con una línea, imprimir la imagen y recortarla comparando el peso de los parches o manchas con el peso total (Novelo y Gomelsky, 2009). INTRODUCCIÓN 27 Método de análisis Espectrofotometría y HPLC Análisis de imagen y HPLC Espectrofotometría Análisis de imagen y HPLC Análisis de imagen y HPLC Análisis de imágen Colorimetría Espectrofotometría Espectrofotometría Tabla 1.2. Artículos publicados sobre peces ornamentales referidos al color Objetivo Determinar el efecto de 7 dietas comerciales en el color Determinar el efecto de la astaxantina, βcaroteno y cantaxantina a diferentes concentraciones en el color del pez Evaluar el efecto de diferentes porcentajes de cúrcuma en la dieta sobre el color Analizar el efecto de 3 intensidades lumínicas sobre el color Evaluar el color del tanque sobre la coloración del pez Comparar dos técnicas de análisis de color Comparar el efecto de una dieta enriquecida con un pigmento sintético y pigmentos naturales de remolacha y zanahoria negra sobre el color del pez Evaluar el efecto de la harina de caléndula en la coloración de los peces Determinar el efecto de la astaxantina, β-caroteno y Porphiridium cruentum sobre el color del pez Especie Carassius auratus Amphiprion ocellaris Poecilia reticulata Amphiprion ocellaris Amphiprion ocellaris Ciprinus carpio Colisa lalia Xiphophorus helleri Cichlasoma severum Referencia Wallat et al., 2011 Yasir y Qin, 2010 Mukherjee et al., 2009 Yasir y Qin 2009 a, Yasir y Qin, 2009 b Novelo y Gomelsky, 2009 Baron et al., 2008 Ezhil et al., 2008 Kop y Durmaz, 2008 INTRODUCCIÓN 28 1.8.- El cultivo del caballito de mar Los primeros datos del cultivo de la subfamilia Hippocampinae son de 1957 en el Sur de China (Fan, 2005), aunque no se consiguió realizar una producción comercial. En otros países, durante los años 70-80, se comenzó a llevar a cabo de forma experimental la reproducción de diferentes especies de caballito de mar en centros de investigación y acuarios públicos (Correa et al., 1989; Scarratt, 1996). Pero no fue hasta los años 90 cuando se llevó a cabo el primer cultivo comercial de H. abdominalis (Woods, 2000) para abastecer al mercado chino con caballitos secos para la medicina tradicional. El interés de China por cultivar otras especies de caballitos de mar creció (Fig. 1.10), pero surgieron múltiples dificultades como problemas con la alimentación y la aparición de enfermedades (Vincent y CliftonHadley, 1989). Fue a final de los 90 cuando comenzó la investigación con estos peces, y se publicaron los primeros datos al respecto. INTRODUCCIÓN 29 Figura 1.10. Momentos clave en la evolución del comercio y la acuicultura del caballito de mar de 1960 a 2009 (Modificado de Koldewey y Martin-Smith, 2010). Fue en este momento cuando se crearon diferentes empresas que cultivaban caballitos de mar (Tabla 1.3) y los vendían principalmente vivos a acuarios públicos, pero alguna empresa los vendía secos o sacaba provecho mediante visitas organizadas de turistas.Actualmente existen varios centros donde se producen caballitos de mar ya sea para investigación o de forma comercial, se estimó que entre 2005 y 2006 existían al menos 28 centros que cultivaban caballitos, pero dos tercios de ellos operaban en instalaciones de menos de 200m2 o con menos de 40.000 litros (Koldewey y Martin-Smith, 2010). INTRODUCCIÓN 30 Tabla 1.3 Empresas que cultivan caballitos de mar y especies cultivadas Seahorse Australia Australia Detalle y Mayorista H. abdominalis H. barbouri H. breviceps H. whittei H. taeneopterus INGENS Cultivos Marinos México Mayorista H. ingens Seahorse Canada Canadá Detalle y mayorista H. erectus Esir Bred denizatı Turquía Mayorista H barbouri H. kuda H. reidi ORA Farm USA Mayorista H. erectus H. kuda H. reidi Ocean rider USA Detalle y mayorista H. abdominalis H. ingens H. erectus H. reidi H. taeneopeterus Seahorse Source USA Detalle y mayorista H. abdominalis H. barbouri H. comes H. erectus H. breviceps H. ingens H. kuda H. reidi H. zosterae Southwatch Seahorse Farm USA Detalle H. erectus H. reidi H. barbouri Empresa País Comercio Especies Cultivadas INTRODUCCIÓN 31 En la actualidad existen diversos grupos de investigación en todo el mundo que trabajan con caballitos de mar, estudiando su biología, su ecología, mejorando las técnicas de cultivo y refiriéndolas al cultivo de otras especies con el objetivo de mejorar los puntos críticos como son el cultivo larvario y la primera alimentación, que al igual que en otras especies suponen un obstáculo para su cultivo (Tabla 1.4). 1.8.1.- Alimentación del caballito de mar en cautividad El caballito de mar además de las particularidades ya descritas en su anatomía y comportamiento presenta también otra característica peculiar referida a su alimentación en cautividad. Se trata de un depredador visual que no acepta alimento seco, por lo que se debe alimentar con presas vivas o congeladas (Job et al., 2002; Woods, 2005) (Tabla 1.4). Dada la estrecha gama de alimentos disponibles en el mercado y el desconocimiento de sus requerimientos nutricionales y en previsión de posibles deficiencias, por lo general las presas vivas empleadas se suelen enriquecer con productos comerciales (González et al., 2003; Olivotto et al., 2006; Palma et al., 2011), el problema de estos productos es que aportan nutrientes muy concretos (ácidos grasos, minerales, vitaminas…)y al carecer de estudios contrastados sobre sus requerimientos podrían estar generando interacciones o deficiencias de otros nutrientes. En cautividad se suele alimentar a los caballitos con Artemia sp. enriquecida con productos comerciales (Job et al., 2002). Se han realizado algunas experiencias en las que se utilizan otras presas vivas: misidáceos (Otero-Ferrer et al., 2009), anfípodos (Murugan et al., 2009), e incluso dietas inertes ya sean presas congeladas como los misidáceos (Woods, 2005) o alimento formulado (Thangaraj y Lipton, 2008), obteniendo diferentes resultados (Tabla 1.4). INTRODUCCIÓN 32 En las experiencias en las cuales se utilizó una presa viva diferente a la Artemia, el crecimiento de los caballitos fue mayor o mejoró su reproducción (Murugan et al., 2009; Otero-Ferrer et al., 2009), a su vez Thangaraj y Lipton (2008) observaron que la mezcla de Artemia y misidáceos mejoraba el crecimiento frente a ambas presas por separado y que con la harina de pescado se obtenían resultados mucho más bajos; y por otra parte Woods (2005) determinó la ración diaria de misidáceos congelados para el Hippocampus abdominalis. 1.8.2El color del caballito de mar en cautividad Como se comentó con anterioridad el precio de un pez ornamental depende principalmente de su color. Pero no se conoce realmente como poder modificar o modular el color de los caballitos. Se sabe que el caballito puede cambiar de color para mimetizarse con el entorno, pero existen otros factores como el genotipo y la alimentación que pueden influir. Aunque se hayan llevado a cabo muchos experimentos sobre el cultivo de caballitos de mar (Woods y Valentino 2003; Woods, 2005; Palma et al., 2011; Zhang et al. 2011), prácticamente no se ha realizado ninguno que haga referencia al color de los mismos (Lin et al., 2009a; Lin et al., 2011), y ninguno que aporte datos del efecto de la dieta en el color del cuerpo del caballito de mar adulto. A pesar de esto, diferentes empresas que cultivan estos organismos venden variedades de color diferentes y con precios que oscilan entre los 40 y los 400 € para una misma especie. Esta gran diferencia de precio se debe a las variaciones de color obtenidas respecto a la coloración estándar en cautividad de una especie. Es por ello por ejemplo que la empresa Ocean Rider (Hawai) vende al público los H. reidi (Fig. 1.11) variedad amarilla por 90 US$ y una variedad llamada sunfire (Fig. 11) por 450 US$. INTRODUCCIÓN 33 Figura 1.11. Dos variedades de H. reidi del mismo criador (Brazilero, izquierda; Sunburst, derecha) Fuente Ocean Rider. INTRODUCCIÓN 40 especies de crustáceos son asimismo alimentadas con Artemia adulta en alguna etapa de sus vidas (Nair et al., 1995; Tong et al., 1997; Ruscoe et al., 2004; Ut et al., 2007). Debido al amplio abanico de especies en las que se utiliza este organismo no existen protocolos estándar de cultivo y enriquecimiento, por lo que se han desarrollado múltiples técnicas y productos enriquecedores para ser utilizados en los diversos experimentos realizados. Pero aun existiendo todo este conocimiento, a nivel comercial sólo existen unos pocos productos enriquecedores y elementos que facilitan su cultivo, siempre basándose en las principales especies comercializadas para consumo humano. Es por ello que se hace necesaria la investigación y comercialización de nuevos enriquecedores, para adaptarse a la variedad cada vez mayor de especies producidas en acuicultura, especies ornamentales incluidas. 41 2. Objetivos 42 OBJETIVOS 43 Objetivo general: Profundizar en el conocimiento de la nutrición del caballito de mar, prestando especial atención al efecto de la alimentación sobre el crecimiento y la supervivencia, así como la influencia sobre el color del animal y la acumulación de pigmentos. Los objetivos específicos son los que se detallan a continuación: -Mejorar la dieta para el caballito de mar, centrándose en el enriquecimiento de Artemia y su manejo, con la finalidad de proporcionar un alimento con valor nutritivo y un perfil optimizado para la especie objetivo. -Evaluar el efecto distints dietas diferentes sobre el crecimiento, supervivencia y composición bioquímica del caballito de mar. -Determinar la influencia de la alimentación en la expresión y variación del color. -Determinar patrones de la evolución del color a lo largo del tiempo para evaluar el nivel de expresión máximo del mismo, así como la capacidad de reversión en su caso. -Examinar histológicamente el sistema digestivo de los caballitos de mar y determinar las consecuencias de las distintas dietas sobre su estructura y funcionalidad. -Formular y ensayar enriquecedores específicos, evaluando los patrones de incorporación de ácidos grasos y carotenoides en Artemia adulta y caballitos de mar. -Comparar el análisis del color en la piel del caballito de mar, utilizando un método colorimétrico convencional frente al análisis de imagen. 44 45 3. Material y métodos 46 MATERIAL Y MÉTODOS 47 3.1.- Instalaciones 3.1.1.- Área experimental de cultivo de caballitos Los experimentos se llevaron a cabo en las instalaciones experimentales de Acuariología del Parque Científico Tecnológico Marino (PCTM) de la Universidad de Las Palmas de Gran Canaria, en Taliarte, Telde. Los acuarios experimentales están dispuestos en dos módulos abastecidos con agua de mar prefiltrada y con sistemas de filtración (Fig. 2.1) físicos y biológicos (Aquamedic Riff 500, Alemania), y esterilización por radiación ultravioleta (UV) (Teco®, TR 10 series, Italia). El caudal de agua de entrada a los acuarios se mantuvo a 30l/h con una temperatura a lo largo de todo el experimento de 23.52 ± 1.31 ºC y 8.05 ± 1.13 mg L-1de oxígeno disuelto. Durante las pruebas se estableció un fotoperiodo de 10 horas de luz / 14 horas de oscuridad (AquaMedic© of North America) T5, 24w y 10000K. La instalación dispone de 24 horas de monotorización mediante una serie de sensores conectados a una centralita AT-Control System, (Aquamedic© of North America) la cual conectada a un ordenador muestra los datos registrados de temperatura, pH, salinidad y nivel de agua de la instalación. Figura 3.1. Instalación general, detalle de un acuario y del sistema de filtración. MATERIAL Y MÉTODOS 48 Para la realización de las diferentes pruebas se utilizaron 15 acuarios de cristal de 34.96 litros (23 x 40 x 38 cm), cada uno de ellos provisto con material para la sujeción de los caballitos (Figura 2.1) consistente en una rejilla plástica de color negro. Semanalmente se limpiaban los acuarios con la ayuda de una esponja y cada dos semanas se realizaba la limpieza de los filtros. 3.1.2.- Área de presas vivas El área de presas vivas cuenta con una serie de recipientes troncocónicos de fibra de vidrio de 50 litros, provistos cada uno con aireación fuerte. Por otra parte se contaba con un separador de cistes SEP-Art Technology SEPARATOR (Inve; Dendermonde, Bélgica). El procedimiento para la obtención de las presas vivas es el siguiente: En primer lugar se eclosionan los cistes (GSL Artemia; INVE Aquaculture, Inc., Salt Lake City, U.S.A.), poniéndolos en recipientes troncocónicos de 50 litros, provistos con aireación fuerte a una temperatura de 28ºC±1ºC durante 24h. Transcurrido este tiempo se filtraba el cultivo y se pasaba por el separador magnético (Fig. 2.2), para separar los cistes del nauplio recién eclosionado. Los nauplio se introducen nuevamente en tanques troncocónicos de 50 litros con aireación fuerte a en esta ocasión a una temeperatura de 25ºC±1ºC. Diariamente se aportaba a cada uno de los tanques 2g de alimento consistente en una mezcla de Ori-Go (Skretting; Stavanger, Noruega), Nannocloropsis liofilizada (Clean Algae; Gran Canaria, España) y levadura (Bruggeman; Gante, Bélgica) (con una proporción 1:1:1); hasta alcanzar el tamaño deseado (8.81 ± 0.95mm). Esta segunda fase llevaba 30 días aproximadamente. Finalmente la Artemia adulta se enriquecía, con el producto deseado. MATERIAL Y MÉTODOS 49 Figura 3.2. SEP-Art Separator (Fuente: www.primo.net.au) 3.2.- Estudios de los efectos dietéticos en el rendimiento productivo de caballito de mar (H. hippocampus). 3.2.1.-Animales experimentales Los experimentos que se realizaron con caballitos de mar se llevaron a cabo con ejemplares de la especie H. Hippocampus nacidos en cautividad en las instalaciones del PCTM. Los ejemplares utilizados en el experimento tenían un peso medio de 1.35±0.42g y fueron marcados mediante elastómeros fluorescentes denominados VIFE (Visible Implant Fluorescent Elastomer; Northwest Marine Technology, Inc., Shaw Island, Washington), para identificarlos individualmente a lo largo de la prueba. Para realizar el marcaje se mezcla una resina coloreada con un catalizador que posteriormente se inyecta al caballito entre las placas óseas y la epidermis.Este producto solidifica rápidamente y emite fluorescencia bajo la luz ultravioleta (Fig.2.3). Mediante la inyección en diferentes puntos del pez se definen múltiples códigos que permiten la identificación simple de los ejemplares. Esta técnica se puso en práctica siguiendo la metodología descrita por Morgan y Martin-Smith (2004), y no presenta ningún efecto nocivo en la supervivencia de los animales (Curtis, 2006). MATERIAL Y MÉTODOS 56 3.4.- Estudio de los efectos dietéticos en la expresión y evolución del color de la piel en caballitos de mar (H. hippocampus) 3.4.1.- Expresión del color En cada uno de los muestreos se midió el color de la piel. En otras especies el color puede ser medido en diferentes zonas del cuerpo del pez, pero en este caso debido al reducido tamaño de los individuos la medición se realiza en todos los ejemplares en la zona abdominal mediante un colorímetro portátil Minolta Chroma Meter CR-200 (Minolta, Osaka, Japan) (Fig.2.6). Los parámetros de color determinados directamente fueron la tonalidad rojiza de la piel (a*), la tonalidad amarillenta de la piel (b*) y la luminosidad (L*) de acuerdo con las recomendaciones de International Commission on Illumination, CIE (1976), a partir de los cuales se obtuvo el color total (Hue) y la intensidad de color (Chroma). Figura 3.6. Medición del color mediante un colorímetro (Minolta Chroma Meter CR-200, Minolta, Osaka, Japan) MATERIAL Y MÉTODOS 57 3.4.2.- Evolución del color Se consideró la puesta en marcha de una segunda prueba con la finalidad de estudiar la evolución del color de los animales y la aparición en su caso de un punto de saturación del color que pudiera dar mayor información sobre la fisiología del color en el caballito de mar objetivo. Para ello, al final del experimento anterior (día 102), se utilizaron los animales procedentes de uno de los tratamientos anteriores, el LEA, dado que la respuesta de crecimiento y color fue similar a la del resto de tratamientos, además que existía una mayor disponibilidad de alimento. Para esta prueba se alimentó a los caballitos de forma similar a lo anteriormente descrito, considerándose como posible punto final de la prueba la obtención de una meseta o plató en los valores de coloración, que representaría la máxima capacidad de deposición del color en este animal. Una vez alcanzada la meseta en su caso, se pretendió la evaluación de la posibilidad de reversión del color en esta especie, para lo que se continuaría en su caso la alimentación con la dieta M. 3.5.- Determinación de la evolución de la composición bioquímica de Artemia tras su enriquecimiento con diferentes enriquecedores. Considerada la importancia de la “ongrown” Artemia como vehículo para la incorporación de determinados nutrientes en los caballitos de mar, se puso en marcha una tercera prueba experimental orientada en este sentido, con el objetivo de colaborar al esclarecimiento de la dinámica digestiva de la Artemia. En este experimento se determinó la evolución de las concentraciones de determinados MATERIAL Y MÉTODOS 58 nutrientes en Artemia adulta durante el proceso de enriquecimiento con distintos enriquecedores. 3.5.1.- Enriquecedores Para esta prueba se utilizaron cinco tratamientos con enriquecedores diferentes (Tabla 3.3): -(S): Tratamiento Control; DHA Easy Selco® (INVE, Belgica) (0.6g/l) como enriquecedor de rutina para caballitos de mar (Otero et al., 2012) - (SK03): Una mezcla de 0.6g/l de Selco® con 0.3 g/l de aceite de krill Superba™ (Aker BioMarine AS, Noruega). - (SK06): Una mezcla de 0.6g/l de Selco con 0.6g/l de aceite de krill. - (SM03): Una mezcla de 0.6g/l de Selco con 0.3 g/l de aceite de mejillón. - (SM06): Una mezcla de 0.6g/l de Selco con 0.6g/l de aceite de mejillón. Tanto el Selco como el aceite de krill son productos comerciales, pero el aceite de mejillón fue extraído en el laboratorio a partir de mejillones congelados de la especie Mytilus galloprovincialis. Para ello se siguió el procedimiento siguiente: los mejillones fueron cortados en pedazos pequeños y secados en estufa ventilada a 38ºC durante 48h. Una vez secos, se trituraron y extrajeron los lípidos con cloroformo (3/1g muestra/L por 3 veces consecutivas) mediante una bomba de vacío, para finalmente obtener el extracto graso y eliminación del disolvente con ayuda de un rotavapor en un baño termostático a 30ºC. MATERIAL Y MÉTODOS 59 Tabla 3.3. Dietas experimentales y sus correspondientes nomenclaturas Dieta Enriquecedor S 0.6g/l de Selco SK06 0.6g/l de Selco + 0.6g/l de aceite de krill SK03 0.6g/l de Selco + 0.3g/l de aceite de krill SM06 0.6g/l de Selco + 0.6g/l de aceite de mejillón SM03 0.6g/l de Selco + 0.3g/l de aceite de mejillón 3.5.2.- Diseño experimental Tras obtener la biomasa deseada de Artemia adulta, según lo descrito en el apartado 2.1.2, con un tamaño de 8.81 ± 0.95 mm, la Artemia se lavó y dividió en 45 contenedores (9 por tratamiento) de 1 litro de capacidad cada uno con aireación fuerte (Fig. 2.7). Se utilizaron cincoenriquecedores diferentes (citados en el apartado 2.3.2). Figura 3.7. Recipientes de 1l en los que se realizó el enriquecimiento de la Artemia con distintos productos. Se tomaron muestras de Artemia de cada uno de los tratamientos al inicio de la prueba y posteriormente cada hora hasta las 8 horas, y una última muestra tras 24 MATERIAL Y MÉTODOS 60 horas de enriquecimiento. Las muestras obtenidas se enjuagaron con agua destilada, eliminando previamente el exceso de agua con papel secante y finalmente se congelaron hasta -80ºC para su posterior análisis bioquímico. 3.6.- Determinación del efecto sobre el color del caballito de mar (H. hippocampus) por el enriquecimiento de Artemia con aceites conteniendo diferente fuente de pigmentos. 3.6.1.- Animales experimentales El experimento se realizó con caballitos de mar de la especie H. Hippocampus nacidos en cautividad en las instalaciones del PCTM. Los ejemplares utilizados en el experimento tenían un peso medio de 1.47±0.66g. 3.6.2.- Dietas En el experimento se utilizaron tres dietas diferentes, a base de Artemia sp. adulta, producida en las instalaciones de Taliarte según la metodología descrita anteriormente en el epígrafe 2.1.2 y enriquecida con diferentes productos que se detallan en la Tabla 3.4. Estos enriquecedores fueron preparados según la metodología descrita en el apartado 3.4.1. MATERIAL Y MÉTODOS 61 Tabla 3.4. Dietas experimentales y sus correspondientes nomenclaturas. Dieta Enriquecedor S 0.6g/l de Selco SK06 0.6g/l de Selco + 0.6g/l de aceite de krill SM03 0.6g/l de Selco + 0.3g/l de aceite de mejillón 3.6.3.- Creación de software específico para la determinación del color en peces mediante el análisis de imagen El método no invasivo utilizando imágenes digitales del cuerpo del pez se desarrolló con la ayuda de un grupo de expertos en Biología Computacional de la universidad de South Bohemia. Esta aplicación maneja la carga de computación y el consumo de memoria de grandes archivos de entrada, optimizando el procesamiento y el análisis por tramos con la relación tiempo/memoria de cálculo. La aplicación permite la comparación de las distribuciones de color de varios experimentos y diferentes espacios de color (RGB, CIELab), pudiendo comparar la representación de múltiples variables. Para llevar a cabo esta aplicación era necesario conocer la función de calibración de color y la capacidad de respuesta de la cámara utilizada (CANON EOS 650D). Es por ello que se utilizó una guía de color Pantone, de la cual se sacaron múltiples fotos para conocer la calibración de la cámara y poder generar las fórmulas y códigos necesarios para el desarrollo de la aplicación que recibió el nombre FISCEApp (FIsh Skin Color Evaluation Application) (Urban et al.,2015). Software que tiene la ventaja de que puede ser utilizado con cualquier cámara convencional y actualmente se encuentra libre en la red (http://auc.cz/software/index4.htm). MATERIAL Y MÉTODOS 62 3.6.4Diseño experimental El experimento se llevó a cabo por triplicado por tratamiento utilizando cuatro animales por acuario. Durante el experimento se realizaron 4 muestreos entre los días 0 y 90, día en que se consideró la finalización del experimento tal y como se había preestablecido en función de los resultados previos. En cada muestreo se controló el peso y el color tal y como se describe en el apartado 2.2.3, y además se tomaron imágenes de todos los individuos con una cámara Canon EOS 650D provista con un objetivo Sigma de 50mm (Sigma, Ronkonkoma, USA). La cámara fue calibrada en el área de muestreo realizando un balance de blancos manual con la ayuda de una tarjeta de balance de blancos (Novoflex Controlcard, Memmingen, Germany). Para el análisis colorimétrico se utilizó un colorímetro Minolta Chroma Meter CR-400 (Minolta, Osaka, Japan). Se trata de un utensilio portátil diseñado con un ángulo geométrico de difusión de la iluminación de 0º. Este método ilumina la muestra desde todas las direcciones y recibe la luz reflejada verticalmente desde la superficie de la muestra. Para ello se utiliza una bombilla de xenón de pulso de descarga, la luz atraviesa una cámara de difusión, posteriormente pasa a través de un disco difusor y se refleja en el objetivo. Finalmente la luz reflejada verticalmente es detectada por unas fibras ópticas de medición. El hecho de que recoja la reflexión a 0º permite que el instrumento sea lo más cercano a la visión normal y puede ser utilizado sobre diferentes objetivos (Fig. 2.8). MATERIAL Y MÉTODOS 63 Figura 3.8. Funcionamiento del colorímetro Minolta CR-400 (Fuente: manual Minolta CR-400) El colorímetro estaba provisto con un cabezal CR-A33d que posee un disco de vidrio de 22mm de diámetro. Antes de comenzar las medidas el aparato fue calibrado mediante una placa de calibración CR-A43 y los valores D65 (γ=93.8; x=0.3156; y=0.3319). Para llevar a cabo el análisis de imagen, se utilizó la aplicación FISCEAPP (Fig. 3.9) (Urban et al., 2015). Esta aplicación es capaz de eliminar el ruido de la imagen al ignorar los reflejos debidos a la iluminación y aportarnos los valores más relevantes como son el color en diferentes espacios (RGB y La*b*). Figura 3.9: Se muestra un ejemplo de los datos de salida del software FISCEAPP con la imágen recortada y segmentada de un pez payaso, y la distribución del color en el cuerpo del pez. MATERIAL Y MÉTODOS 64 3.7.- Análisis bioquímicos Se realizaron análisis bioquímicos por triplicado de cada una de las presas, para lo que se recogieron dos muestras de cada una de ellas y se formó un “pool”. Además, dos caballitos al inicio de cada experimento y dos caballitos de cada acuario al final de los mismos, fueron sacrificados sumergiéndolos en agua y hielo durante cinco minutos, habiendo sido previamente anestesiados con aceite de clavo a una concentración de 0.04 ml/l. Este procedimiento de sacrificio ha sido considerado como adecuado por el Comité Ético de Bienestar Animal de la Universidad de Las Palmas de Gran Canaria (ULPGC) en 2011. Tras el sacrificio los caballitos fueron clasificados en bolsas individuales, y junto con las dietas se almacenaron a -80ºC, hasta el momento de realizar los análisis, momento en el que se formaron "pool" de muestras de cada acuario. 3.7.1.- Determinación de humedad y cenizas Se siguió el Método Oficial de Análisis de la Asociación de Química Analítica Oficial de Estados Unidos (AOAC, 2010), pesándose cantidades conocidas de muestra en crisoles y se pusieron en una estufa a 100º hasta peso constante, 24 horas normalmente, calculando la humedad mediante la siguiente fórmula: % ℎ𝑢𝑚𝑒𝑑𝑎𝑑 = (𝑃𝑖−𝑃𝑓) 𝑃𝑖 ×100, siendo Pi el peso húmedo y Pf el peso seco de la muestra. Para calcular el peso seco se utiliza la siguiente ecuación: % 𝑝. 𝑠. = % 𝑝.𝑓. 100−%𝐻 ×100, MATERIAL Y MÉTODOS 65 siendo % p.s. el porcentaje de peso seco del parámetro que queremos calcular, H la humedad calculada con anterioridad y p.f. el peso fresco del parámetro a transformar. Para calcular el contenido en cenizas, una vez pesada la muestra y calculada la humedad se introducía en el horno MUFLA a 600º hasta peso constante, normalmente 24 h. Una vez enfriado el crisol se pesaba y calculaba el contenido en cenizas con la siguiente ecuación: %𝑐𝑒𝑛𝑖𝑧𝑎𝑠 = (𝑃𝑐𝑐−𝑃𝑐) 𝑃𝑚 ×100, En la que Pcc es el peso del crisol con las cenizas, Pc es el peso inicial del crisol y Pm es el peso fresco de la muestra 3.7.2.- Determinación de proteínas Para realizar la determinación de la proteína bruta de nuestras muestras se utilizó el método Kjendahl (AOAC, 2010) que permite calcular la cantidad de nitrógeno total de la muestra. En primer lugar se digiere la muestra a 400ºC en ácido sulfúrico y en presencia de un catalizador en una manta calefactora (Tecator Digestor 20, Foss, Sweden). Tras la digestión se añade hidróxido sódico (NaOH) en exceso y se destila mediante un destilador (Kjeltec 2100 Destillation Unit, Foss, Sweden), el amoniaco liberado en ácido bórico, para ser posteriormente valorado con ácido clorhídrico HCl 0.1N. La ecuación para calcular el nitrógeno liberado es la siguiente: % 𝑝𝑟𝑜𝑡𝑒í𝑛𝑎𝑠 = (𝑉−𝑃)×𝑁×14.007×6.25 𝑀×100, STUDY I 72 supervivencia, crecimiento y contenido de proteína, ceniza, humedad, pero sí en el color rojo y amarillo de los peces. Se obtuvieron diferencias en el contenido de lípidos y carotenoides totales, por la alimentación con las diferentes dietas experimentales. Los peces alimentados con Artemia mostraron la mayor respuesta de patrón de color durante la prueba, alcanzando una coloración amarilla de 21. Además, los peces alimentados con Artemia, alcanzaron una meseta de la expresión del color en la piel en el día 180. Se determinó una reversión del color amarillo de la piel de los caballitos tras cambiar la dieta. 4.3.- Introduction All seahorse species have been included in Appendix II of the Convention on International Trade in Endangered Species of Wild Fauna and Flora (CITES 2002) (Gonzalez et al., 2006), due to the status of natural populations. Between the 40 species spread over the world, short-snouted seahorse (Hippocampus hippocampus) has referred in Canary Islands (Molina et al., 2007). Several field studies have pointed out the decrease in seahorse populations, in the Canary Islands (Bortone et al., 1991; Otero-Ferrer et al., 2012), Mexico (Baum et al., 2003) and Brazil (Rosa et al., 2005) mainly due to habitat loss. Reproduction in captivity is considered as one of the solutions to reduce the pressure on wild stocks by fishing bycatch and ornamental business operations (Otero-Ferrer et al., 2010). Many experiences about seahorse culture have been done on culture conditions and reproduction success (Woods 2003; Woods and Valentino 2003; Zhang et al., 2010; Palma et al., 2011), most of them without considering nutrition as an important factor affecting fish development. STUDY I 73 A special behaviour of these species in nature is their availability to change the colour of their skin to blend with the environment (Foster and Vincent 2004). Fish skin colour, on the other hand, is of great importance from the commercial point of view, being directly associated with fish acceptance and market value (Wabnitz et al., 2003). Fish are not able to synthesize carotenoids de novo (Goodwin, 1984), so they must be supplemented in their feed to promote the characteristic fish skin colours. Specimens of H. hippocampus in the wild feed on mysis, amphipods and copepods (Kitsos et al., 2008). In captivity, although mysis (Woods, 2005) and amphipods (Murugan et al., 2009) are currently used, seahorses are mainly fed on enriched Artemia (Job et al., 2002). Regarding ornamental fish, colour can be mainly controlled by genetics (Gomelsky et al., 1996; David et al., 2004; Shi et al., 2010) and food intake (Wallat et al., 2005; Kop and Durmaz 2008; Ho et al., 2013). Studies conducted in recent years search for different sources of pigments. Some of them use synthetic pigments such as astaxanthin, purified pigments (cantaxanthin or b-carotene) (Baron et al., 2008; Kop and Durmaz, 2008; Yasir and Qin, 2010; Ho et al., 2013) or other kind of flours, such as, marigold petal flour, turmeric flour or microalgae powder (Baron et al., 2008; Ezhil et al., 2008). Some other experiments have observed that light intensity and tank colour can affect the colour expression (Yasir and Qin 2009a, b). Recent studies have referred to seahorses, one of them focused on seahorse’s skin colour blend towards substratum colour (Lin et al., 2009a), and another one relating colour changing with the aquarium ambience (Qin et al., 2012). To our knowledge, no one paper has reported data about the effect of the diet on adult seahorses’ body coloration. STUDY I 74 The aim of the present study was to determine the influence of different diets in H. hippocampus growth and fish body biochemical composition and to determine their capability to change colour depending on the diet. 4.4.- Materials and methods Seahorses and culture conditions Seventy-five captive bred (in our facilities) seahorses with a mean weight of 1.22±0.45 g were used. All of them came from the same broodstock and were individually identified by visible implant fluorescent elastomer (VIFE; Northwest Marine Technology, Inc., Shaw Island, WA, USA). Seahorses, five fish per aquarium, were randomly distributed in fifteen 34.96 L glass aquaria (23 x 40 x 38 cm). They were maintained with a 10 h light/14 h dark photoperiod (T5 tubes, 24 W and 10 000K; AquaMedic, Bissendorf, Germany). Throughout, the experiment tanks were provided with physical (Riff 500; Aquamedic, Bissendorf, Germany) and UV (TR 10 series, Teco, Ravenna, Italia) prefiltered natural seawater, with a daily renewal rate of 100 ml L-1. Each aquarium had a 30 L h-1 flow rate, 23.52 ± 1.31 °C and 8.05 ± 1.13 mg L-1 of dissolved oxygen, and each tank had aeration. STUDY I 75 4.4.1.- Diets and feeding Five different diets were prepared and tested in triplicate groups of seahorses for 102 days: 1LEA, control diet consisted of live Artemia enriched in Easy DHA Selco® (INVE, Dendermonde, Belgium) (24 h of enrichment, 0.6 g L-1). 2FEA, frozen Artemia previously enriched in Easy DHA Selco® (24 h of enrichment, 0.6 g L-1). 3M, frozen commercial mysis (Ocean Nutrition™, Essen, Belgium). 4SEM, commercial Mysis supplemented with Easy DHA Selco® (80 mg g-1). 5-CEM, commercial mysis supplemented with Cyclo-peeze® (Argent Laboratories, Redmond, WA, USA) (20 mg g-1). The proximate composition and total carotenoid content of the five diets are shown in Table 4.1. Seahorses were fed with 1 g day-1 on the correspondent diet at two rations of 0.5 g each (09:00 and 14:00) and 6 days per week. Feeding ratio was maintained at approximately 150 mg g-1 of the total biomass along the entire trial according to others authors’ recommendations (Woods and Valentino, 2003; Woods, 2005; Palma et al., 2008). Seahorse feeding behaviour was observed and recorded during feeding in order to determine any differences in diets acceptance. 4.4.2.- Sampling and colour measurement Whole body mass (Job et al., 2002), total length (Lourie et al., 2004) and skin colour parameters were measured in all seahorses at the beginning of the experiment and after 20, 40, 60 and 102 days feeding to evaluate standard growth rate (SGR), STUDY I 76 feed conversion (FC) and colour change during the trial. At the end of the experiment, seahorses fasted for 1 day. Two individuals (male and female) of each aquarium were sacrificed and stored at -80 °C prior to proximate analysis. Colour measurement was taken from the left abdominal area using a portable colorimeter (Minolta Chroma Meter CR-200; Minolta, Osaka, Japan). The colour parameters directly determined were redness (a*), yellowness (b*) and lightness (L) in accordance with the recommendations of the International Commission on Illumination (CIE 1976), from where the overall colour [Hue; Hab = arctan (b*/a*)] and the intensity of the colour [chroma; Cab = (a*2 + b*2)] the intensity of the colour [chroma; Cab = (a*2 + b*2)]were calculated from a* and b* (Hunt 1977). Table 4.1.Proximate composition (g 100g-1 wet weight) and total carotenoid (µg g-1) content of five experimental diets. Means with a common letter denote no significant differences. LEA, Life Enriched Artemia; FEA, Frozen Enriched Artemia; M, Mysis; SEM, Selco Enriched Mysis; CEM, Cyclop-eeze Enriched Mysis. At day 102, the launch of a second test was considered in order to study the evolution of animal colour and the possible appearance of a plateau for skin colour saturation, using the nine fish remaining from the LEA diet. For this test, seahorses were continuously fed with LEA diet according to the described methodology (0.5 g, twice a day) until an endpoint of the expected colour saturation was observed. LEA FEA M SEM CEM Crude protein 4.74±0.12c 5.61±0.33c 9.55±0.65a 7.59±0.89b 10.23±0.2a Lipids 2.02±0.05b 1.40±0.12c 0.98±0.03d 6.12±0.13a 6.62±0.6a Ash 0.07±0.01 0.53±0.03 1.48±0.16 0.98±0.15 1.62±0.07 Moisture 93.18±0.02a 91.48±0.04b 90.13±1.47c 87.10±0.17d 86.30±0.12d Carotenoids(µg g-1) 4.82±0.98ab 3.17±0.37c 3.98±0.24bc 3.91±0.92bc 6.26±1.06a STUDY I 77 Once reached the expected colour saturation, diet was changed to M diet in order to know about possible skin colour reversion in this species. 4.4.3.- Biochemical analysis Diet and whole seahorse body composition were analysed for protein, moisture and ash content according to AOAC (2010). For total lipid extraction Folch et al. (1957), procedure was used. Carotenoids were extracted from samples according to Barua et al. (1993). For carotenoid quantification in n-hexane, the absorbance was read at k = 470 nm using E1%, 1 cm = 2100 (Britton, 1995) and expressed as astaxanthin equivalent using the following equation: Mg g-1 sample = 10 000 *V * A/W* E1%;1cm Where V is the total volume of the extract (mL), W is the weight of the sample (g), A is the absorbance and E1%, 1 cm is the extinction coefficient in n-hexane. 4.4.4.- Statistical analysis All data were tested for normality and homogeneity of variance. To study the effect of the diets on growth, a multivariate method MANOVAR with two fixed factors, time and diet, was used. Differences in biochemical composition between groups were determined by one-way ANOVA, using Tukey’s test for multiple comparisons. All statistical analyses were tested at 0.05 significance level using the SPSS statistical package (SPSS for Windows 11.5; SPSS Inc., Chicago, IL, USA). 4.5.- Results All diets were well accepted by seahorses since the start of the trial although those fed on LEA diet showed a greater voracity. After 102 days, no significant differences (P > 0.05) in length or weight between diets were found (Table 4.2). STUDY I 78 The observed fish mortality for all treatments was 17%, being LEA the only diet without deaths. Biochemical analysis (Table 4.3) showed no difference between treatments in protein, ash or moisture content, but showed two different levels of body lipid content, higher for the diets containing mysis and lower for the diets based on Artemia. On the other hand, the body lipid content was directly related (r2= 0.85) with seahorse weight (Fig. 4.1) and not related with dietary lipid content (r2 = 0.017; P > 0.05). Table 4.2. Fish growth responses parameters at the end of the experiment. LEA FEA M SEM CEM Weight (g) 1.27±0.2 1.28±0.28 1.34±0.5 1.14±0.35 1.32±0.3 Length (cm) 8.38±0.72 8.63±0.65 8.29±0.63 7.94±0.72 8.35±0.55 SGR 0.00±0.12 -0.19±0.13 0.07±0.12 -0.03±0.06 0.04±0.15 CF 0.66±0.14 0.68±0.11 0.58±0.10 0.73±0.17 0.65±0.14 Survival 100.00 73.33±11.55 66.67±23.09 53.33±30.55 73.33±11.55 Means without letter denote no significant differences. LEA, Life Enriched Artemia; FEA, Frozen Enriched Artemia; M, Mysis; SEM, Selco Enriched Mysis; CEM, Cyclop-eeze Enriched Mysis. Table 4.3. Proximate composition and total carotenoid body content (g 100g-1 wet weight) of whole fish at the end of the trial. LEA FEA M SEM CEM Crude protein 14.70±1.69 13.73±0.48 14.76±1.16 14.05±0.35 15.78±0.72 Lipids 0.46±0.09b 0.43±0.06b 0.75±0.16a 0.54±0.04ab 0.54±0.07ab Ash 14.71±0.19 13.55±1.06 11.52±1.36 12.69±0.89 13.78±2.45 Carotenoids (µg g1) 19.45±0.83b 17.31±3.35bc 14.81±3.21c 14.99±1.79cb 27.13±1.81a Moisture 72.53±5.81 70.91±1.23 71.17±2.28 72.13±1.02 67.48±1.02 Means with a common letter denote no significant differences. LEA, Life Enriched Artemia; FEA, Frozen Enriched Artemia; M, Mysis; SEM, Selco Enriched Mysis; CEM, Cyclop-eeze Enriched Mysis. STUDY I 79 Figure 4.1. Relation between weight and % of lipids in seahorse whole body Regarding colour change, yellow colour (b*) deposition was observed at high extent, while the skin redness (a*) was not detected along the trail (Table 4.4). Significant differences in total carotenoids whole body content were observed when animals fed on different diets (P ≥ 0.05) (Table 4.3), showing a direct relation between carotenoids in diets and the respective whole body seahorse content. Moreover, no relationship was found for fish body lipid and carotenoid content (r2=0.082) (Fig. 4.2). R² = 0,8543 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1 1260 1270 1280 1290 1300 1310 1320 1330 1340 1350 %Lipids (Wet weight) Weight mg STUDY I 80 Figure 4.2. Total carotenoids in diets (black) and seahorses (grey). The following chart (Fig. 4.3) shows the change of colour in seahorses fed on LEA along the entire experiment. In the beginning of the experiment (day 0), a turning point from which the yellowness (b*) decreased down to a point, while redness (a*) behaved opposite. During the first 30 days of the experiment, there was a period of adaptation to the new diet, where colour expression followed the above pattern and elapsed this time, only a reversal of the expression was observed. Until day 102, end of the main experiment (A), a clear increase in yellowness was observed, while the levels of redness decreased. To know the timing colour evolution, feeding was continued until a stable maximum, or plateau was observed at day 180 (B; 20.73±3.85). When the maximum was reached, diet was changed again from LEA to M, showing again an inversion of red and yellow values in seahorses’ skin until the last day of the experiment (C). 0 5 10 15 20 25 30 35 LEA FEA M SEM CEM Carotenoids (μgg-1) STUDY I 81 Table 4.4. Fish color parameters at the end of the experiment. I LEA FEA M SEM CEM a 5.28±1.54 4.55 ± 1.66 3.61 ± 1.35 4.64 ± 2.14 4.46 ± 1.35 5.34 ± 1.58 b 9.19±3.45 13.94±4.53 15.05±6.64 11.63 ± 5.17 10.48 ± 3.41 15.38 ± 5.1 L 30.37±2.52 32.97±3.00 34.18±6.46 30.73± 3.58 30.96 ± 2.65 33.20 ± 4.15 Hue 58.69±8.22 70.33±8.34ab 75.23±5.8a 66.73 ± 9.43b 65.96 ± 6.21b 70.29 ± 4.78ab Chroma 10.70±3.48 3.73±2.07 5.04±5.19 3.16 ± 2.27 3.32 ± 2.34 4.83 ± 3.83 Means with a common letter denote no significant differences. I, Initial values; LEA, Life Enriched Artemia; FEA, Frozen Enriched Artemia; M, Mysis; SEM, Selco Enriched Mysis; CEM, Cyclop-eeze Enriched Mysis. Figure 4.3. Variation of the mean values of a* (red) and b* (yellow) over time in seahorses fed live enriched Artemia (LEA). End of main experiment (A), maximum accumulation reached (B) and end of experiment (C). 0 5 10 15 20 25 050 100 150 200 250 300 Time(Days) a (redness) b (yellowness) C B A 88 STUDY II 89 5.1.- Abstract Little is known about the nutritional requirements of ornamental fish and the effects, which they may have on fish histology. Because of this 45 young, captivebred seahorses (1.37g ± 0.51) were randomly divided and put into fifteen, 35-litre, glass aquariums. Three experimental diets were tested in triplicate: life enriched Artemia (LEA); frozen enriched Artemia (FEA), and commercial Mysis (M). Seahorses were fed twice daily, six days a week for 102 days throughout the experiment. The body weight and length of the seahorses were measured every 20 days, and at the end of the experiment fish liver samples were taken for histological studies. Biochemical analyses of the diets and the seahorses fed on the experimental diets were recorded and the differences in the total lipid content in each of the three diets were also observed, each reflecting their respective liver lipid content. Seahorses fed with LEA treatment showed lipid vacuoles in the hepatocytes with nuclei displaced to the periphery. Similar results were also observed in FEA fed seahorses, but to a lesser extent. In contrast, the M fed seahorses were characterized by having livers with lower size hepatocytes and centrally located nuclei. 5.2.- Resumen Se sabe muy poco acerca de los requerimientos nutricionales de los peces ornamentales y los efectos que pueden tener en los peces a nivel histológico. Debido a esto 45 caballitos de mar jóvenes (1.37g ± 0.51) fueron divididos aleatoriamente en 15 acuarios de vidrio de 35 litros. Tres dietas experimentales se probaron con triplicados: Artemia viva enriquecida (LEA), Artemia enriquecida y congelada STUDY II 90 (FEA) y Mysis comerciales (M). Los caballitos se alimentaron dos veces al día, seis días a la semana durante 102 días de experimento. Cada 20 días se tomaban medidas de peso y longitud, y al final del experimento se tomaron muestras de hígado para su análisis histológico. Se llevaron a cabo análisis bioquímicos de las dietas y los caballitos y se observaró el contenido lipídico de las dietas y los caballitos relacionándolo con el contenido de lípidos en el hígado. Los caballitos alimentados con LEA mostraron vacuolas lipídicas en los hepatocitos con el núcleo desplazado a la periferia. Resultados similares se obtuvieron en los caballitos alimentados con FEA, pero en menor medida. En contraposición, los caballitos alimentados con M se caracterizaron por tener un hígado con hepatocitos de menor tamaño y con el nucleo posicionado en el centro. Key Words: seahorse, diet, liver, histology 5.3.- Introduction The aquarium-related market makes millions of dollars around the world, not only through living organisms, but also through feeds, and technology associated, etc. Moreover, most live organisms involved in the marine aquarium trade, come from the wild. Over the last number of years, the everincreasing demand has boosted the realization of research targeted at improving the production of ornamental marine organisms (Olivotto et al., 2011). Although various studies have been carried out by both non-professionals and commercial companies, closing the biological cycle of some species has been achieved; however, their nutritional requirements still remain unknown. Consequently, commercial diets do not respond to the animals’ needs; this having been pointed out by most experienced aquarists. STUDY II 91 Besides, adverse physiological effects may result from the lack or excess of any nutrient in the diet. Nutritional imbalances can cause immunosuppression and make specimens more likely to suffer other diseases. Thus, the lack of amino acids, fatty acids, essential minerals or vitamins can cause various effects such as scoliosis, lordosis, gill affections, etc. (Tacon, 1995). Similarly, it has been observed in several studies carried out on fish for human consumption that an excess of fat in diets can lead to liver abnormalities (Caballero et al., 2004). The liver is considered one of the first organs to identify histological biomarkers because of its central role in many metabolic functions, such as protein synthesis, accumulation of metabolites (Au, 2004), resulting from the widespread research which has been conducted concerning the effects of different types of oils on the morphology and fat deposition in the liver of many fish species (Bell et al., 2001; Caballero et al., 2004; Ruyter et al., 2006). Lipid metabolism occurs mainly in the liver, and therefore imbalances of fatty acids in the diet could modify its morphology and may result in steatosis: an accumulation of lipids as vacuoles in the liver. In recent years, some experiments have been conducted using various ingredients for the specific diet formulation for ornamental fish such as the Koi carp (Cyprinus carpio) (Vijayagopal et al., 2008), the Striped Damsel (Dascyllus aruanus) (Vasudhevan et al., 2009) or swordfish (Xiphophorus helleri) (James and Sampath, 2004). Moreover, the effect of a specific nutrient on certain factors such as growth, larval survival, and colour enhancement was tested on some species. For example, marigold petal meal was added to the swordfish diet to improve its pigmentation STUDY II 92 (Ezhil et al., 2008); Langroudi et al.,(2009) used enriched Artemia and vitamin C in order to improve the spawning in angelfish (Pterophyllum scalare); Sealey et al. (2009) tested different sources and amounts of protein in Neon Tetra (Paracheirodon innesi) diets. Nevertheless, knowledge of ornamental species is below that of fish for human consumption (Fraser et al., 2009) and the requirements of most ornamental species remain unknown. On the other hand, some fish species that are visual predators, such as seahorses (Job et al., 2002; Woods, 2005) and do not accept dry food should be fed with live or frozen prey. Besides, all seahorse species have been included in Appendix II of the Convention on International Trade in Endangered Species of Wild Fauna and Flora (CITES 2002) (González et al., 2006), due to the status of populations in the wild. Therefore reproduction in captivity is considered as one of the potential solutions aimed at reducing the pressure on populations in the wild (Otero-Ferrer et al., 2010) and respond to increasing demand in ornamental trade. If these fishes are provided with the necessary nutrients, the results become more complex and thereforetheir prey should be enriched in some way (Gonzalez et al., 2003; Olivotto et al., 2006; Palma et al., 2011). Usually these enriched products provide very specific elements (fatty acids, minerals, vitamins, amongst others), and can cause deficiencies in other nutrients. Although the effects of different enriched prey concerning survival, growth and reproduction (Otero-Ferrer, 2012) have been studied within these species, the consequences the diet has on the digestive tract in these organisms are still unknown. The aim of this study is to observe the effects of different diets on the health of the seahorse (Hippocampus hippocampus), focusing STUDY II 93 mainly on fatty acid analysis and histological analysis of the seahorse's digestive system. 5.4.- Materials and methods 5.4.1.- Seahorses and culture conditions The experiment was conducted at the facilities belonging to the Parque Científico Tecnológico Marino (PCTM) de la Universidad de Las Palmas de Gran Canaria (Spain). Forty-five captive-bred seahorses (H. hippocampus) were used, with an average weight of 1.35 ± 0.42g. The seahorses were divided into 9 aquariums with a capacity of 34.96 l (23 x 40 x 38 cm), five animals per aquarium, each of them provided with holdfast elements. The aquariums were supplied with pre-filtered seawater, using physical and biological filtration (Riff 500, AquaMedic, Bissendorf, Germany) and sterilization by ultraviolet rays (UV) systems (TR 10 series, Teco, Ravenna, Italy). The inlet flow to the tanks was 30l/h and water was maintained throughout the experiment to 23.52 ± 1.31°C and 8.05 ± 1.13 mg L-1 of dissolved oxygen, with a photoperiod of 10 hours of light / 14 hours of darkness (T5 tubes, 24w and 10000K; AquaMedic, Bissendorf, Germany). Temperature, pH, salinity and aquaria water levels were monitored twenty-four hours a day and controlled by PC (AT-Control System, AquaMedic, Bissendorf, Germany © of North America) STUDY II 94 5.4.2.- Diets and feeding Three different diets were prepared and tested in triplicate groups of seahorses for 102 days. A control diet based on “Live 24 hours Selco® (INVE, Dendermonde, Belgium) Enriched Artemia (LEA)”, a second diet based on “Frozen 24 hours Selco® Enriched Artemia (FEA)”, and a third diet of “Frozen commercial mysids (Ocean Nutrition™, Essen, Belgium) (M)”. For the grown Artemia, Artemia cysts (INVE, Dendermonde, Belgium) were hatched in 5l tanks at a temperature of 27±1°C. Subsequently nauplii were transferred to 50l fiberglass tanks with strong aeration and a temperature of 21 ± 1ºC. They were fed for 29 days with 2g daily of a mixture of Origo, yeast and Nannochloropsis sp. powder. The approximate composition is shown in table 1 and fatty acid profile is shown in Table 2, where high levelsof monogenic fatty acids in both Artemia diets (LEA and FEA) can be observed. Seahorses were fed with 1g per day (around 15% of the overall biomass) in the corresponding diet; two equal meals (09:00 and 14:00) per day and 6 days per week. The feeding ratio was maintained around 15% of the overall biomass throughout the whole trial following the recommendations by other authors (Woods and Valentino, 2003; Woods, 2005; Palma et al., 2008; Segade et al., 2014). Table 5.1. Biochemical composition (g kg-1 wet weight, media ± standard deviation) of experimental diets LEA FEA M Crude protein 47.4±1.2 56.1±3.3 95.5±6.5 Total lipid 20.2±0.5 14.0±1.2 9.8±0.3 Ash 0.7±0.1 5.3±0.3 14.8±1.6 Moisture 931.8±0.2 914.8±0.4 901.3±4.7 LEA, Life Enriched Artemia; FEA, Frozen Enriched Artemia; M, Mysids STUDY II 95 5.4.3.- Sampling During the experiment 5 sampling periods were performed between days 0 and 102. Thus, weight and length (Lourie et al., 2004) measurements of all the seahorses were taken at the beginning of the experiment and on days 20, 40, 60 and 102. Besides, six individuals from each diet-group (two per aquarium) were randomly sacrificed on day 102 for ensuing analysis of the whole fish, and whose samples were stored at -80°C until a later corresponding date. Moreover, at the end of the experiment three seahorses from each diet-group were sacrificed for histological analysis. 5.4.4.- Biochemical analysis Diets and entire seahorse body composition were analysed in triplicate for their total lipid content (Folch et al., 1957) and fatty acid methyl esters according to the methodology described by (Christie, 1982; Izquierdo et al., 1990). 5.4.5.- Histological analysis Dissection was performed to extract the liver and gastrointestinal tract, which in turn, was divided into the anterior, middle and posterior intestine. The samples were conserved in 10% buffered formalin. For processing, the samples were dehydrated in alcohol gradients with a tissue processor (Jung Histokinete 2000, Leica, Germany), embedded in paraffin using an automatic dispenser (TES 99, Ponder, Sweden) and the blocks were cut with a microtome (Jung Autocut 2055, Leica, Germany) at 5 microns. The sections, which were obtained, were then stained with hematoxylin-eosin (Martoja and Martoja-Pierson, 1970). STUDY II 96 The sections were examined and compared under a microscope (Olympus CX41, Olympus, Japan) and photographed with a lens (Olympus CX30, Olympus, Japan). During the observations, special attention was paid to the structure of hepatocytes and the presence of lipid absorption in enterocytes. 5.4.6.- Statistical analysis Firstly, all data were tested for the normality and homogeneity of variance using the Kolmogorov-Smirnov and Levene test (P <0.05), respectively (Zar, 2009). When necessary, data were processed to obtain a homogeneous variance. Differences between the seahorses fed on the three different diet groups were determined by one-way ANOVA, using the Tukey test for multiple comparisons. In all statistical analysis a significance level of 95% was tested by using a SPSS 15.0 statistical analysis pack. 5.5.- Results After 102 days, no significant differences (p ≥ 0.05) in length or weight between the diets were found as observed by Segade et al. (2014). The biochemical composition of the diets used is shown in Table 1 and 2. Referring to the composition of the seahorses as a whole, no significant differences were found amongst the animals fed on different diets in crude protein, ash and moisture contents at the end of the experiment (p ≥ 0.05). However regarding the whole body lipid content, two groups were observed (Table 3): one of them showed significantly higher values for specimens fed on the mysid-based diet (Treatment 3) and a second group with lower values for Artemia-based diets (Treatments 1 and 2). Moreover, the lipid content of the seahorses was directly related (r2 = 0.96) with their weight (Fig. 1), without any relationship with the lipid content of the diet. STUDY II 97 Figure 5.1. Relation between lipid percentage in seahorses and their weight (p<0.05) Table 5.2. Fatty acid composition (g kg-1 of wet weight) and their main relation in the three different diets. LEA FEA M AA 20.6 20.9 26.2 DHA 60.4 83.5 63.3 EPA 103.7 102.2 114.7 Linolenic 60.7 50.4 31.9 Linoleic 118.3 114.4 30.6 Oleic 229.3 230.7 94.4 AA/EPA 0.20 0.20 0.23 EPA/DHA 1.72 1.22 1.81 Oleic/DHA 3.80 2.76 1.49 Oleic/n-3HUFA 0.92 0.88 0.39 n-3/n-6 1.62 1.74 2.71 PUFA n-3+ n-6 40.19 41.34 32.89 LEA, Life Enriched Artemia; FEA, Frozen Enriched Artemia; M, Mysis; AA, Araquidonic Acid; DHA, Docosahexaenoic Acid; EPA, Eicosapentaenoic Acid R² = 0,9549 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1 1260 1270 1280 1290 1300 1310 1320 1330 1340 1350 %Lipids (Dry weight) Weight (g) STUDY II 104 and can be used by means of biocapsules that can be enriched and used as a vehicle for different substances, such as nutrients, pigments and even antibiotics (GomezGil et al., 2001; Gelabert, 2003). Furthermore, frozen mysids are commercially available and have been widely used as Artemia for growing ornamental species with more-than-satisfactory results (Olivotto et al., 2004; Lin et al., 2007; Roopin et al., 2008; Lin et al., 2009). Mysids are also an interesting foodstuff for commercial producers who want to sell seahorses capable of feeding on inert prey (Woods, 2005). The absence of differences in growth was similar to that observed by Segade et al. (in press) The low levels of total lipids in seahorse body content obtained in this investigation correspond to those observed by Lin et al. (2008) in wild adult specimens from other species. Furthermore, it has been observed that the amounts of lipids in adults (5.4 ± 1.2g kg-1) were below those found in the larval and young H. hippocampus (29.5 ± 2.2g/kg-1) (Otero-Ferrer et al., 2010), reducing the total lipid content in larvae from day zero as time progresses, as observed in H. guttulatus by Faleiro and Narciso (2010). Comparing the nutrient content of the diets and the seahorses fed on them, generally fish composition is directly related to the diet composition, as seen in lipid contents of this experiment, showing a higher lipid content in those seahorses fed on diets with a higher lipid content (Lee et al., 2002; Orban et al., 2007; Velu and Munuswamy, 2007). There was an exception: the mysids diet, characterized by having a low lipid content, gave rise to the higher fat content in animals. This could be due to the lipid quality, their assimilation by seahorses and the possibly higher digestibility of this kind of diet. Due to the fact that the seahorses were being fed on mysids before starting the experiment, didn’t STUDY II 105 result in those fed on mysids modifying their initial lipid content, unlike Artemiabased diets for which lipid values were significantly lower than the initial value, accompanied by accumulation of fat in the liver. On the other hand, as discerned by Segade et al. (in press) their body lipid content was directly related with the seahorses’ weight (r2=0.96) (Fig.1), but not related to dietary lipid content (r2=0.57; p< 0.05). The use of mysids, specifically, in relation to DHA showed a 66% increase of this fatty acid. In contrast, concerning the Artemia-based diets, there are differences between both, so in the Life Enriched Artemia diet, DHA levels rose by 200% over time, whereas in FEA, there was only a 37% increase compared to baseline values. These results may be due to the differences in digestibility of both treatments, as observed in the histological analysis. Whole Artemia appeared in the tract of seahorses fed on Life Enriched Artemia and not on Frozen Enriched Artemia, suggesting that there is low digestibility of the first as opposed to the latter. This fact could lead to an accumulation of DHA as a backup source as described by other authors (Izquierdo, 1996; Izquierdo et al., 1990; Otero-Ferrer et al., 2010; Van der Meeren et al., 1993). It is likely that, by freezing the Artemia results in a rupture of the structures and tissues that would improve digestibility by means of this diet. Furthermore, in reference to the EPA, a decrease between the diet content and the seahorse is obtained. It has already been widely documented that this fatty acid is used as an energy source, compared to DHA which tends to be preserved as demonstrated in subadults in the present study. Moreover, there are some major differences in the content of linoleic acid between Artemia-based diets and mysids, with a high content of this fatty acid in the former, possibly due to the presence of STUDY II 106 terrestrial plant sources in the feed given to the Artemia to grow. Moreover, the observed differences for diets based on Artemia, could also related to the high levels of HUFA diets containing 200g kg-1, in contrast to what was observed in wild prey such as mysids, with a 42g kg-1 (Otero-Ferrer et al., 2010). These facts suggest that neither live Artemia nor commercial enriching is the ideal food for seahorses. As already illustrated, the seahorse has no stomach (Lourie et al., 2004); it is possible that because of this their digestive capacity is weaker so it was possible to find traces of undigested food in the digestive tract. In connection with lipid content of the diets, in both diets with greater lipid values (LEA and FEA), lipid deposition increased in the liver of the seahorses, which could be observed in the corresponding stains (Fig 3). This fact cannot be considered as pathological, since the accumulation may be an adaptive response to an excess of lipids, which accumulate and create an energy reservoir (Mosconi-Bac, 1987). To determine if their existence could be considered as a nutritional pathology, electronic microscopy analysis should be carried out to observe the hepatocyte cell structure (Strüssmann and Takashima, 1990). Seahorses fed on a diet of Mysids, had a liver without signs of fat accumulation. This could be affected by two factors, the first of which would be due to the low levels of lipids in the diet, leading to its immediate use as an energy source (Caballero et al., 1999; Figueiredo-Silva et al., 2005), and a second factor that relates the phosphorus content of the diet with fat deposition, since this element can cause a slight decrease in fat accumulation in the liver (Robaina et al., 1998). In conclusion, we have observed that seahorse lipid content is directly related to its weight, this being lower than for larvae of the same species. Histological analysis STUDY II 107 showed that the seahorse has a hepatopancreas with a large number of small hepatocytes. We may say that the requirements of lipids in the diet of this species are low, because a high lipid content causes lipid accumulation in the liver, forming large number of vacuoles. In turn, the quality and availability of dietary lipids affect the animals’ fat content, resulting in differences in the use and deposition of fatty acids. And finally, by freezing Artemia after enrichment improves the use of the diet compared to the Live Enriched Artemia due to the rupture of structures that facilitate their digestibility. Bearing in mind the above, similar studies with different enriching should be conducted, to thereby further improve the techniques of this culture and fight against overexploitation of these organisms. 108 109 6. Study III. Incorporation patterns of fatty acids and carotenoids in adult Artemia franciscana fed with 5 different enriching products. Segade A.1, Robaina L.1,Martinez I.2, Packard T.T.2, Gómez M.2, Molina L.1 (1) Grupo de Investigación en Acuicultura, Universidad de Las Palmas de Gran Canaria, Parque Científico Tecnológico, Las Palmas, Spain (2)Grupo de Ecofisiología de Organismos Marinos (EOMAR). Universidad de Las Palmas de Gran Canaria, Canary Islands, Spain 110 STUDY III 111 6.1.- Abstract Artemia is the most used living organism as prey in aquaculture. Because of their poor nutritional profile there are different commercial and handmade enrichment products, which improve their biochemical composition depending on the final objective.In this experiment adult Artemia (8.81 ± 0.95 mm) was enriched with 5 different products and dosis: S, DHA Easy Selco® (0.6g/l); SK06, a mix of 0.6g/l of Selco® with 0.6 g/l of Superba™; SK03, a mix of 0.6g/l of Selco® with 0.3 g/l of Superba™, SM06 a mix of 0.6g/l of Selco with 0.6g/l of mussel oil and SM03, a mix of 0.6g/l of Selco with 0.3g/l of mussel oil. Artemia initial samples were taken, and then every hour, until 8 hours from each treatment and finally one last sample at 24 hours. Total carotenoids and fatty acid methyl esters were extracted from samples. In all five treatments both fatty acids and pigments increased in the first hour, and may be related to a rapid filling of the digestive tract of Artemia. In addition EPA / DHA ratios are higher in the SK06 and SM06 treatments, and correlation is higher in the first one (r2 = 0.977) because it is more stable over time. In addition, breathing analysis techniques confirmed that the Artemia begins to assimilate the enriching around 5 hours of enrichment. After 24 hours the concentration of all elements decreases to approximately baseline values, which may be due to depletion in rich culture medium. 6.2.- Resumen La Artemia es el organismo vivo más utilizado como presa en acuicultura. Debido a su pobre valor perfil nutricional existen diferentes productos enriquecedores comerciales y experimentales, que mejoran su composición bioquímica STUDY III 112 dependiendo del objetivo final. En este experimento se enriqueció Artemia adulta (8.81 ± 0.95 mm) con 5 productos y dosis diferentes: S, DHA Easy Selco® (0.6g/l); SK06, una mezcla de 0.6g/l de Selco® con 0.6 g/l de Superba™; SK03 una mezcla de 0.6g/l de Selco® con 0.3 g/l of Superba™; SM06, una mezcla de 0.6g/l de Selco con 0.6g/l de aceite de mejillón y SM03, una mezcla de 0.6g/l de Selco con 0.3g/l de aceite de mejillón. Se tomaron muestras iniciales de Artemia, y cada hora, hasta las 8 horas de cada uno de los tratamientos, así como una muestra final a las 24 horas. De las muestras se extrajeron los carotenoides totales y metilésteres de ácidos grasos. En los 5 tratamientos tanto los ácidos grasos como los pigentos incrementaron en la primera hora, y puede ser debido a un llenado rápido del tracto digestivo de la Artemia. Además los ratios EPA/DHA son mayores los tratamientos SK06 y SM06, y la correlación es mayor en el primero (r2=0.977) debido a que es más estable en el tiempo. Por otra parte las técnicas de análisis de la respiración confirmaron que la Artemia comienza a asimilar los enriquecedores alrededor de las 5 horas de enriquecimiento. Tras 24 horas la concentrción de todos los elementos disminuye aproximadamente hasta los niveles basales, lo que puede deberse a su agotmiento en el medio de cultivo. Key Words: Artemia, enrichment, carotenoid, fatty acid 6.3.- Introduction Different types of live prey have been used throughout the history of aquaculture (copepods, rotifers, nematodes, amphipods, Artemia…). These organisms have been mainly used to feed larvae (Sorgeloos et al., 2001) and juveniles of different fish species and crustaceans, such as halibut (Hippoglossus hippoglossus) (Olsen et STUDY III 113 al., 1999) or whiteleg shrimp (Litopenaeus vannamei) (Sanudin et al., 2014). Besides, some organisms do not accept dry food or prefer live or frozen prey at certain stages of development. For example seahorses are often fed on planktonic organisms, mainly mysis (Woods, 2005; OteroFerrer et al., 2012), although other researchers have used amphipods (Murugan et al., 2009) or rotifers (Fulks and Main, 1991). But the most commonly used prey is Artemia (Job et al., 2002). It has been observed that coho salmon (Oncorhynchus kisuth) initially fed on adult Artemia grows significantly faster compared to those fed with commercial diets (Kim et al., 1996). Similarly, there are problems in culturing the Octopus vulgaris, because their paralarvae must be fed on live prey; this problem has been solved by feeding them Artemia and Maja zoeae (Iglesias et al., 2004; Viciano et al., 2011). Also many crustacean species are often fed on adult Artemia at some stage in their life (Nair et al., 1995; Tong et al., 1997; Ruscoe et al., 2004; Ut et al., 2007). Having in mind all the above, it should be noted that Artemia is possibly the most widely used live prey in aquaculture; this is due to its availability, price, and ease of cultivation and enrichment. However, it is known that Artemia has nutritional deficiencies, consequently research is on-going to improve its biochemical composition. Different experiments have been carried out to understand its physiology and its fate as a prey organism (Navarro et al., 1999; Smith et al., 2002; Gelabert, 2003), resulting in many different types of enrichment and concentrations used. A widely applied term that refers to the enrichment of Artemia is bioencapsulation. This is because Artemia may not change its biochemical profile by itself, although their gut content can be manipulated by the investigator. The volume occupied by the Artemia digestive tract is moreover very large. Thus, Artemia can be used as a vehicle to feed different STUDY III 120 Table 6.1. Proximate composition (% wet weight) of Artemia enriched with five experimental products. S SK03 SK06 SM03 SM06 Crude protein 5.54 5.45 5.62 5.50 5.48 Lipids 1.53 1.43 1.35 1.24 1.57 Ash 1.10 1.15 1.07 1.20 0.95 Moisture 91.22 91.24 91.02 90.95 91.12 Means without letter denote no significant differences. S, Selco; SK03, mixture of 0.6g/l of Selco with 0.3g/l of krill oil; SK06, a mixture of 0.6g/l of Selco with 0.6g/l of krill oil; SM03, a mixture of 0.6g/l of Selco with 0.3 g/l of mussel oil; SM06, mixture of 0.6g/l of Selco with 0.6g/l of mussel oil. Table 6.2. Total carotenoid concentration (µg g-1) in Artemia enriched with five experimental products along 24 h enrichment. 1h 2h 3h 4h 5h 6h 7h 8h 24h S 4.33±0.48a 3.31±0.82a 3.23±0.51a 3.23±0.63a 2.66±0.06a 3.21±0.07a 4.16±0.91a 4.10±0.44b 3.27±0.16a SK03 6.06±0.39b 5.3±0.71b 3.96±0.18a 3.76±0.04a 3.84±0.17a 3.78±0.31a 5.58±0.64b 4.77±0.75b 3.83±0.06ab SK06 5.28±0.24ab 4.89±1.05b 4.24±1.29a 3.63±0.31a 3.72±0.16a 3.69±0.83a 5.52±0.82b 2.87±0.18a 2.87±0.58a SM03 17.11±1.28d 11.02±0.40d 6.61±1.17c 6.75±0.21c 7.8±1.01c 6.76±0.13c 8.74±0.76d 6.48±1.53c 5.38±1.79c SM06 11.96±0.33c 9.52±0.50c 10.26±1.79b 8.24±0.64b 6.09±0.48b 5.03±0.86b 8.96±1.26c 7.26±0.82c 4.83±0.10bc Means with a common letter in the same enrichment time denote no significant differences (p<0.05) S, Selco; SK03, mixture of 0.6g/l of Selco with 0.3g/l of krill oil; SK06, a mixture of 0.6g/l of Selco with 0.6g/l of krill oil; SM03, a mixture of 0.6g/l of Selco with 0.3 g/l of mussel oil; SM06, mixture of 0.6g/l of Selco with 0.6g/l of mussel oil. STUDY III 121 Figure 6.1. Variation in the mean values of DHA content in Artemia enriched with five different oil mixtures. S, Selco; SK03, mixture of 0.6g/l of Selco with 0.3g/l of krill oil; SK06, a mixture of 0.6g/l of Selco with 0.6g/l of krill oil; SM03, a mixture of 0.6g/l of Selco with 0.3 g/l of mussel oil; SM06, mixture of 0.6g/l of Selco with 0.6g/l of mussel oil. Figure 6.2. Variation in the mean values of EPA content in Artemia enriched with five different oil mixtures. S, Selco; SK03, mixture of 0.6g/l of Selco with 0.3g/l of krill oil; SK06, a mixture of 0.6g/l of Selco with 0.6g/l of krill oil; SM03, a mixture of 0.6g/l of Selco with 0.3 g/l of mussel oil; SM06, mixture of 0.6g/l of Selco with 0.6g/l of mussel oil. 1,00 1,50 2,00 2,50 3,00 3,50 4,00 4,50 5,00 0 5 10 15 20 %DHA (wet weight) Time (h) S SM06 SK03 SK06 SM03 6,00 7,00 8,00 9,00 10,00 11,00 12,00 13,00 0 5 10 15 20 % EPA (wet weight) Time (h) S SM06 SK03 SK06 SM03 STUDY III 122 Figure 6.3. Variation in the mean values of AA content in Artemia enriched with five different oil mixtures. S, Selco; SK03, mixture of 0.6g/l of Selco with 0.3g/l of krill oil; SK06, a mixture of 0.6g/l of Selco with 0.6g/l of krill oil; SM03, a mixture of 0.6g/l of Selco with 0.3 g/l of mussel oil; SM06, mixture of 0.6g/l of Selco with 0.6g/l of mussel oil. Figure 6.4. Variation in the mean values of total carotenoid content in Artemia enriched with five different oil mixtures. S, Selco; SK03, mixture of 0.6g/l of Selco with 0.3g/l of krill oil; SK06, a mixture of 0.6g/l of Selco with 0.6g/l of krill oil; SM03, a mixture of 0.6g/l of Selco with 0.3 g/l of mussel oil; SM06, mixture of 0.6g/l of Selco with 0.6g/l of mussel oil. 1,50 2,00 2,50 3,00 3,50 4,00 0 5 10 15 20 % AA (wet weight) Time (h) S SM06 SK03 SK06 SM03 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 0 5 10 15 20 25 30 Carotenoid (µg g-1) Time (h) S SM06 SM03 SK06 SK03 STUDY III 123 Figure 6.5. Variation in the mean values of EPA/DHA ratio in Artemia enriched with five different oil mixtures. S, Selco; SK03, mixture of 0.6g/l of Selco with 0.3g/l of krill oil; SK06, a mixture of 0.6g/l of Selco with 0.6g/l of krill oil; SM03, a mixture of 0.6g/l of Selco with 0.3 g/l of mussel oil; SM06, mixture of 0.6g/l of Selco with 0.6g/l of mussel oil. Looking at the most important sampling times, it can be observed that in the first two hours inside Artemia's gut, big oil drops were seen (Fig.6.6). However, from 524 hours of enrichment time the big oil droplets had been reduced to small ones inside the Artemia's intestine (Fig. 6.6). Figure 6.6. Image of Artemia's gut content at two hours of enrichment (left; x10, bar = 0.3mm) and eight hours of enrichment (right; x20, bar = 0.1mm). 1,00 1,50 2,00 2,50 3,00 3,50 4,00 4,50 5,00 5,50 0 5 10 15 20 25 30 EPA/DHA Time (h) S SM06 SM03 SK06 SK03 STUDY III 124 The specific respiration and potential respiration data are in the same range as Martínez et al. (2010) found. The respiration experiments shows that SELCO stimulates respiration for the first 4 hours (Fig. 7, p < 0.05). However, after the second hour the rate accelerates for 2 hoursand then plateaus until the end of the experiment. During this time the potential respiration remains constant for the first 2 hours (p> 0.05). Then it increases and after the 4th hour, plateaus. The initial and the final plateaus are significantly different (p < 0.05). The ratio between the respiration and Φ changes from 0.34 ± 0.04 in the first 2 hours to 0.43 ± 0.06 in the last 4 hours of the experiment. Figure 6.7.Respiration and potential respiration time-courses during the six hours experiments. Both measurements are normalized by mg proteins and expressed as percentages of their initial value. These initial values were: 7.93 µl O2·h-1·mg prot-1 for respiration and 30.01 µl O2·h-1·mg prot-1for Φ. 0 50 100 150 200 250 300 0 50 100 150 200 250 300 0 1 2 3 4 5 6 7 Specific potential respiration rate (%) Specific Respiration rate (%) Time (h) Respiration Potential respiration STUDY III 125 6.6.- Discussion Throughout the history of aquaculture, different living organisms have been used as live prey in cultures of various species, but the most commonly used organism is Artemia, because it is a commercial, affordable and easy to grow. However, because of its nutritional deficiencies it must be enriched. In this experiment the biochemical analysis does not change over time, this fact may suggest that enrichment is not about quantity but quality. Regarding total carotenoid content: it is higher in Artemia enriched with mussel-oil based mixtures. This is because the concentration of pigments in this oil is high (1445 µg g-1). However, SELCO lacks them and the pigments (echineone and canthaxanthin) are provided by Artemia (Hsu et al., 1970) in a ratio of approximately 19: 1 (Krinski, 1965). The carotenoid and fatty acid accumulation are at their peak during the first two hours and may be related to the content found in the Artemia's digestive tract, which initially has few large droplets (a fact that probably does not allow proper absorption of nutrients). However, after five hours elapsed, Artemia's digestive tract contains many small drops of oil. This oil droplet accumulation could enhance absorption and transformation of lipids and carotenoids present in the oils to the same compounds found naturally in Artemia. First, the Artemia is capable of metabolizing carotenoids by transforming them into canthaxanthin (Davies et al. 1970). Moreover, Artemia is capable of converting the fatty acid, DHA, into EPA (Navarro et al. 1999). The EPA/DHA ratios for Artemia exposed to SELCO are low which was expected since it is a DHA-based enrichment. SELCO was formulated to provide high quantities of DHA, which is both an energy source and a precursor of multiple STUDY III 126 molecules necessary for larval growth in various species (Watanabe, 1993; Sargent et al., 1999). The respiration shows that even from the beginning of the experiment the SELCO stimulated oxygen consumption. However, a strong shift, or acceleration, in the respiration occurs between the second and the fourth hour. This occurs roughly when the large oil droplets in the Artemia gut begin to be transformed into small ones. The implication is that this size transformation of the oil droplets is accompanied by enhanced metabolism. Between 4 and 6 hours the respiration rate plateaus at a higher level that during the initial part of the experiment indicating 2fold increase in metabolism. The shift in the plateau levels of the Φ from the first to the last two hours of the experiment supports this enhanced metabolism. Moreover, this transition is also observed in the increase in the R/Φ from the beginning to the end of the experiment. These biochemical and physiological measurements indicate a shift from standard to a more active metabolism (Hernández-León and Gómez, 1996). Definitively, this experiment showed an evolution in the enrichment of Artemia, which can help to design further experiments. If the objective is to produce a biocapsule then a 2 h nutrient-enrichment exposure period is sufficient to guarantee nutrient delivery to the target species. This is supported by Tocher et al. (1997). If instead the objective is the enriching Artemia assimilation and transformation, the enrichment time must be increased to, at least 7 or 8 hours. In the case where the enrichment must be longer, the enriching product must be renovated after 8 h because a part is assimilated by the Artemia and remainder could suffer autoxidation (McEvoy et al., 1995). 127 7. Study IV. Effect of Artemia enrichment with oils containing different source of pigments on seahorse color. Segade A.1, Souček P.2, Bárta A.2, Robaina L.1,Urban J.2 and Molina L.1 1) Grupo de Investigación en Acuicultura, Universidad de Las Palmas de Gran Canaria, Parque Científico Tecnológico, Las Palmas, Spain. 2) University of South Bohemia in Ceske Budejovice, Faculty of Fisheries and Protection of Waters, South Bohemian Research Center of Aquaculture and Biodiversity of Hydrocenoses, Institute of Complex Systems, Laboratory of Signal and Image Processing, Zamek 136, Nove Hrady 37333, Czech Republic. 128 STUDY IV 129 7.1.- Abstract Color is a very important parameter in our daily life, from recognizing an electronic mark until the election of our pets, especially in ornamental fish where the color is directly related to the final price of the animal. That is why in this experiment 3 different feeds were tested to observe the effect on seahorse color expression. Three different experimental diets were tested in triplicate: SELCO enriched Artemia (S), Artemia enriched with krill oil (SK06) and Artemia enriched with mussel oil (SM03). The seahorses were fed twice a day, six days a week during the 90 days of experiment. At the beginning of the experiment and every 30 days until the end of the experiment weight measurement was taken and the color was analyzed using colorimeter and also image analysis software (FISCEApp). At the end of the experiment biochemical analysis of the seahorses were carried out. There was not effect of the diets on the sea horses growth along the trial. It was observed that the pigment content of the horses is directly related to the diet content, also was observed that seahorses fed on SK06 had higher amount of EPA and seahorses fed on SM03 showed a tendency to accumulate AA. No relationship between the amount of pigments and color expression was observed. But it was determined that although both color analysis techniques are valid, the colorimeter results are more accurate but less real and the data from the image analysis although more real are less accurate.