Factores de virulencia y patogenicidad de hafnia alvei en la acuicultura con especial aplicación a la dorada (Sparus aurata, L.)

15/2003-04 UNIVERSIDAD DE LAS PALMAS DE GRAN CANARIA UNIDAD DE TERCER CICLO Y POSTGRADO Reunido el día de la fecha, el Tribunal nombrado por el Excmo. Sr. Rector Magfco. de esta Universidad, el/a aspirante expuso esta TESIS DOCTORAL. Terminada la lectura y contestadas por el/a Doctorando/a las objeciones formuladas por los señores miembros del Tribunal, éste calificó dicho trabajo con la nota de ^^hSjZérfifií f^t^-'T^ Las Palmas de C^an-Canaria, a 25 de noviembre de 2003. El/la uis León Vizcaíno El/la Secretario/a: Dra. Dña. Begoña Acosta Hernández El/la Vocal: Dr. D. Ronstóa.-«©berts. El/la Vocal: Dr. D. Zoilo González Lama El/la Vocal: Dr. D. Luis Alfonso Rodríguez López El/la Doctorando/a: D. Daniej, Fermín Padilla Castillo M BisuoTECA i;:.:v • • •". LAS PALMAS DE G N." Doeumenio N." Copia UNIVERSIDAD DE LAS PALMAS DE GRAN CANARIA FACULTAD DE VETERINARIA DEPARTAMENTO DE MORFOLOGÍA TESIS DOCTORAL FACTORES DE VIRULENCIA Y PATOGENICIDAD DE HAFNIA ALVEI EN LA ACUICULTURA CON ESPECIAL APLICACIÓN A LA DORADA {SPARUS AURATA, L.) Daniel Fermín Padilla Castillo Las Palmas de Gran Canaria, 2003 UNIVERSIDAD DE LAS PALMAS DE GRAN CANARIA DEPARTAMENTO DE MORFOLOGÍA D'' ENCARNACIÓN CASTELLANO SANTANA, SECRETARIA DEL DEPARTAMENTO DE MORFOLOGÍA DE LA UNIVERSIDAD DE LAS PALMAS DE GRAN CANARIA, CERTIFICA, Que el Consejo de Doctores del Departamento en su sesión de fecha 2 de septiembre de 2003 tomó el acuerdo de dar el consentimiento para su tramitación, a la tesis doctoral titulada "FACTORES DE VIRULENCIA Y PATOGENICIDAD DE HAFNIA ALVEI EN LA ACUICULTURA CON ESPECIAL APLICACIÓN A LA DORADA {SPARUS AURATA, L.)" presentada por el doctorando D. Daniel Padilla Castillo y dirigida por el Doctor D. Fernando Real Valcárcel Y para que así conste, y a efectos de lo previsto en el Art° 73.2 del Reglamento de Estudios de Doctorado de esta Universidad, firmo la presente en Las Palmas de Gran Canaria, a 2 septiembre de dos mil tres. UNIVERSIDAD DE LAS PALMAS DE GRAN CANARIA FACULTAD DE VETERINARIA DEPARTAMENTO DE MORFOLOGÍA PROGRAMA DE DOCTORADO '«SANIDAD Y PATOLOGÍA ANIMAL" Tesis Doctoral presentada por D. Daniel Fermín Padilla Castillo Dirigida por el Dr. D. Fernando Real Valcárcel Codirigida por el Dr. D. Félix Acosta Arbelo El Director El Codirector El Doctorando Femando Real Valcárcel Félix Acosta Arbelo Daniel Padilla Castillo Las Palmas de Gran Canaria a 15 de septiembre de 2003 FERNANDO REAL VALCÁRCEL, CATEDRÁTICO DE UNIVERSIDAD EN EL DEPARTAMENTO DE PATOLOGÍA ANIMAL, PRODUCCIÓN ANIMAL, BROMATOLOGÍA y TECNOLOGÍA DE LOS ALIMENTOS DE LA FACULTAD DE VETERINARIA DE LA UNIVERSIDAD DE LAS PALMAS DE GRAN CANARIA. INFORMA: Que D. Daniel Fermín Padilla Castillo, Licenciado en Veterinaria, ha realizado bajo mi dirección y asesoramiento el presente trabajo titulado "Factores de virulencia y patogenicidad de Hafnia alvei en la acuicultura con especial aplicación a la dorada {Sparus aurata^ ^•)**, el cual considero reúne las condiciones y calidad científica para optar al grado de Doctor en Veterinaria. Las Palmas de Gran Canaria a 15 de septiembre de 2003 Fdo. Fernando Real Valcárcel FÉLIX AGOSTA ARBELO, DOCTOR EN VETERINARIA POR LA UNIVERSIDAD DE LAS PALMAS DE GRAN GANARÍA Y COLABORADOR DE INVESTIGACIÓN DE LA UNIDAD DE IGTIOPATOLOGÍA DE LA FACULTAD DE VETERINARIA INFORMA: Que D. Daniel Fermín Padilla Castillo, Licenciado en Veterinaria, ha realizado bajo mi dirección y asesoramiento el presente trabajo titulado "Factores de virulencia y patogenicidad de Hafnia alvei en la acuicultura con especial aplicación a la dorada {Sparus cairata^ L.)", el cual considero reúne las condiciones y calidad científica para optar al grado de Doctor en Veterinaria. Las Palmas de Gran Canaria a 15 de septiembre de 2003 Fdo. Félix Acosta Arbelo A mis padres y hermanos A Eli, que le prometí mi vida a cambio de una sonrisa. índice 1.-INTRODUCCIÓN 1 2.- REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA 5 2.1.-MICROBIOLOGÍADEÍÍAFMAALVEI. 5 2.2.-CARACTERÍSTICAS DE LA INFECCIÓN O LA ENFERMEDAD PRODUCIDA POR HAFNIA ALVEI. 9 2.2.1.-En ictiopatologia 9 2.2.2.- En otras especies animales 14 2.2.3.- En humanos 18 2.3.-LA INFECCIÓN EXPERIMENTAL EN ACUICULTURA: APLICACIONES 20 2.4.-.MECANISMOS DE VIRULENCIA DE BACTERIAS GRAM NEGATIVAS 27 2.4.1.- Factores de adherencia 27 2.4.1.1.- Gen eae 27 2.4.1.2.-Fimbrias 29 2.4.1.2.1.-Caracteres generales 29 2.4.1.2.2.-Relación de las fimbrias con la patogenicidad 32 2.4.2.- Resistencia al suero 35 2.4.3.-Hemólisis 40 2.4.4.-Producción de sideróforos 42 2.5.-EVALUACIÓN DE LA INMUNOHISTOQUÍMICA PARA DETECTAR INFECCIONES BACTERIANAS EN LOS TEJIDOS ANIMALES " 2.5.1.- Aplicaciones frente a la infección por Híifhia alvei 49 Introducción comparta muchos aspectos comunes con aquellos ya descritos para otras enterobacterias. Por otro lado, es conocido que Hafnia alvei está presente de forma natural en el medio ambiente canario, y se ha relacionado, ocasionalmente, con la aparición de cuadros clínico-patológicos en otras especies animales distintas de los peces (REAL y cois., 1997). Aunque nunca se ha detectado en especies marinas de esta o de otras regiones del mundo, si bien, la proximidad de los tanques y jaulas de cria de la dorada a zonas donde se desarrollan diversas actividades humanas como baño, turismo, red de alcantarillado, etc, hace posible el contacto entre dicho agente patógeno y los peces. Además, en los últimos años, uno de los temas preponderantes de nuestro grupo de trabajo ha sido el estudio de diversos aspectos relacionados con la infección producida por Hafnia alvei (REAL y cois., 1997; RODRÍGUEZ y cois., 1998; RODRÍGUEZ y cois., 1999; AGOSTA y cois., 2002), por lo que parece lógico que centrásemos la finalidad de este estudio en conocer más de cerca los efectos de la infección por este patógeno en la acuicultura, con especial relevancia en la acuicultura marina. Conocer si la dorada [Sparus aurata, L.) es una especie susceptible de enfermar tras su infección experimental con Hafnia alvei y profundizar en el conocimiento de los factores de virulencia y su relación con la patogenicidad de esta bacteria para la dorada, constituyen la finalidad básica de este trabajo. Introducción Por todo lo expuesto, en el desarrollo del presente estudio nos hemos planteado los siguientes objetivos: 1.- Estudiar qué factores de virulencia posee Hafnia alvei con aplicación a especies de acuicultura continental (trucha arcoiris, Oncorhynchus myhdss) y marina (dorada, Sparus aurata, L.). 2.- Relacionar los factores de virulencia estudiados con el grado de patogenicidad mostrado por distintas cepas de Hafnia alvei en dorada (Sparus aurata, L.). 3.- Determinar la patogenicidad de Hafnia alvei en dorada (Sparus aurata, L.) en el curso de una infección aguda mediante experiencias de DLso. 4.- Verificar la patogenicidad de Hafnia alvei en dorada (Sparus aurata, L.) en el curso de una infección crónica, realizando el seguimiento mediante análisis microbiológico, anatomopatológico e inrounohistoquímico. 5.- Dilucidar, en su caso, el papel de esta especie (dorada) como portadora de la infección en el habitat en el que se desenvuelve para la acuicultura. Revisión Bibliográfica Revisión bibliográfica 2.- REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA 2.1MICROBIOLOGÍA DE HAFNIA ALVEJ El Género Hafnia esta encuadrado dentro de la Familia Enterobacteriaceae. Este Género consta de una única especie, Hafnia alvei. La actual nomenclatura de Hafnia alvei fue propuesta por M0LLER en 1954 (M0LLER, 1954, cit. SAKAZAKI y TAMURA, 1992), ya que hasta entonces se le denominaba Enterobacter alvei, así como Enterobacter hafniae o Enterobacter aerogenes subsp. hafniae. Estudios de taxonomía numérica demostraron que Hafnia alvei está lo suficientemente alejada del Género Enterobacter como para pertenecer a otro Género. Estos resultados quedan confirmados por modelos de hibridación ADN-ADN que confirman una homología inferior al 27% entre Hafnia alvei y Enterobacter spp. La hibridación también revela la existencia de 2 genoespecies dentro del taxón Hafnia alvei, pero al ser imposible la diferenciación fenotípica, estas dos genoespecies se agrupan bajo la denominación de Hafnia alvei (SAKAZAKI, 1984). En extensiones teñidas por el método de GRAM se presenta como un bacilo gram negativo, de 1.0 ixm de diámetro y de 2.0 a 5.0 ^m de largo, no capsulado (M0LLER, 1954, cit. SAKAZAKI y TAMURA, 1992). Presenta todas las características de Enterobacteriaceae spp. Cierta actividad bioquímica, metabólica y enzimática está íntimamente relacionada con la temperatura de incubación, siendo más intensa a 22°C que a 37°C. C. RICHARD y JM. ALONSO (1976) describen a Hafnia 5 Revisión bibliográfica alvei como una enterobacteria móvil por flagelos perítricos a temperaturas de 22°C, pero esta movilidad se ve anulada cuando la cultivamos a 35°C. La temperatura máxima de crecimiento oscila entre 40 y 42''C, y no crecen por debajo de los 5°C. Es anaerobia facultativa y presenta tanto metabolismo respiratorio como fermentativo (M0LLER, 1954, cit SAKAZAKI y TAMURA, 1992). No existen medios específicos para su aislamiento. Normalmente se utilizan medios no selectivos o poco selectivos que son usados de forma rutinaria para el aislamiento de enterobacterias (M0LLER, 1954, cit. SAKA2AKI y TAMURA, 1992). En este grupo destacamos el agar Mac Conkey, el Xüosa-Lisina-desoxicolato (XLD) y el medio Infusión Cerebro Corazón (BHI). También se usa en laboratorios clínicos el medio Agar Hektoen Entérico, inicialmente diseñado para el aislamiento selectivo de salmonelas. En medios poco selectivos como el agar Salmonetla-Shigella (SS) no se consigue el crecimiento en uno de cada 4 intentos de cultivo de Hafhia alvei En agar Sulfato-Bismuto tampoco crece (M0LLER, 1954, cit. SAKAZAKI y TAMURA, 1992). En Agar Nutritivo esta bacteria crece muy bien presentando unas colonias mayores de su tamaño habitual, midiendo de 2 a 3 |am de diámetro. No existen medios de enriquecimiento para el crecimiento de Hafnia alvei Algunas cepas crecen en medios como el Caldo Selenito y el Remsíón D'bkográj-ica Caldo de Tetrathionato, usados habitualmente para el enriquecimiento de SaZmoneHa spp.(M0LLER, 1954, cit. SAKAZAKI y TAMURA, 1992). R. SAKAZAKI y K. TAMURA (1992) usaron agar Mac Conkey adicionado con vm 1% de sorbitol para diferenciar Hafhia alvei de otras bacterias intestinales como Escherichia coli, Klebsiella, Enterobacter y Serratia spp., las cuales fermentan el sorbitol dando colonias rosas o rojas, cosa que no ocurre en el caso de Hafhia alvei Además, el Género Hafhia se caracteriza por ser bacterias oxidasa negativas y catalasa positivas. Según JJ. FARMER (1999) reducen los nitratos a nitritos, siendo positivas en más de un 90% las pruebas de la Usina y omitina decarboxilasa. El crecimiento en el medio KCN también es positivo, así como la presencia de la enzima p-galactosidasa (ONPG). Fermenta la D-glucosa con producción de ácido y gas. Produce ácido, pero no gas a partir de L-arabinosa, glicerol, D-manitol, D-manosa, maltosa, L-ramnosa, trehalosa y xilosa (FARMER, 1999). El acetilmetilcarbinol (VP) es producido, en más de un 98%, a partir de la glucosa entre 22 y 28°C, pero no a 35°C. Por el contrario, la prueba de rojo metilo da positiva a 35''C pero negativa a 22°C. Dan un resultado variable el uso del malonato, acetato, y la fermentación de la celobiosa y salicina (FARMER, 1999). JJ. FARMER (1999) asegura que Hafhia alvei no produce ácido sulfhídrico (H2S) en el medio TSI. Más del 90% de las cepas son negativas para las pruebas de arginina dehidrolasa, producción de RexÁsión bibliográfica indol y ureasa. No produce gelatinasa, lipasa ni desoxiribonucleasa. No utiliza el alginato ni produce fenilalanina desaminasa. La hidrólisis de la escuHna es negativa. Es citi-ato de Simmons negativa. No produce ácido a partir de la fermentación del adonitol, inositol, raíinosa, sorbitol, sacarosa y lactosa. No obstante, aproximadamente un 5% de las cepas pueden acidificar la lactosa tras la incorporación de un plámido metabólico por conjugación con Salmonella typhi y E^cheñchia coli (FARMER, 1999). Existe cierta dificultad para diferenciar microbiológicamente esta bacteria de otros patógenos comunes en Medicina Veterinaria (REAL y cois., 1997; RODRÍGUEZ y cois., 1998; AGOSTA y cois., 2002). Las lesiones que aparecen en el curso septicémico de la infección en muchas especies animales son muy similares a las producidas por Salmonella spp. Según C. RIDELL (1987) y WR. KELLY (1993) y las infecciones causadas por Salmonella spp. pueden ser particularmente problemáticas en su diferenciación, debido a que las colonias de Hajhia alvei se confunden con las de Salm.onella spp. en los medios rutinarios de cultivo causando confusión a la hora de determinar la identidad de ese m^icroorganismo (SAKAZAKI y TAMURA, 1992). Según WC. EVELAN y JE. FABER (1953) y K. HARADA y cois. (1957) cultivos de Hajrda spp. han sido aglutinados con antígeno O de Salmonella spp. lo cual lleva a error en la identificación. Además, también se han descrito ciertos problemas en su diferenciación con otros géneros como Enterobacter {E. aerogenes y E. gergoviae) y Serratía spp. (SAKAZAKI y TAMURA, 1992). A tales efectos ha demostrado ser extraordinariamente útil el sistema de identificación Microscan (Dade Microscan, Irúc, Sacramento, Califomia) (RODRÍGUEZ y Revisión bibliográfica cois., 1999), así como la utilización de un bacteriófago específico de Hafhia, el fago 1672 (REAL y cois., 1997; RODRÍGUEZ y cois., 1998). Más del 96% de las cepas de Hafhia alvei son Usadas por este bacteriófago, que fue aislado por PAM. GUIÑEÉ y JJ. VALKENBURG en 1968 a partir de agua, utilizándose rutinariamente para la identificación de esta especie. Hafnia alvei forma parte de la flora gastrointestinal de los seres humanos, siendo a su vez su habitat habitual el suelo y el agua (ALLEN, 1982; ALLENy cois., 1983; SAKAZAKI y TAMURA, 1992). También se ha aislado de diferentes alimentos (TEXDORFy cois., 1975; SALIMOV, 1978; REFAlEy cois., 1993; TORNAJADlLLOy cois., 1993), siendo a veces el responsable del deterioro de carnes empaquetadas bajo una atmósfera pobre en oxígeno. Recientes estudios le otorgan una gran importancia como agente patógeno oportunista, tanto en la especie humana como en varias especies animales (GÜNTHARD y PENNEKAMP, 1996; RODRÍGUEZ y cois., 1998). 2.2.~ CARACTERÍSTICAS DE LA INFECCIÓN O LA ENFERMEDAD PRODUCIDA POR HAFNIA ALVEI 2.2.1.- EN ICTIOPATOLOGÍA I. GELEV y cois. (1990) aislaron en Bulgaria una bacteria de un brote epizoótico produciendo septicemia hemorrágica en trucha arcoiris. Tras realizarle una serie de pruebas bioquímicas, fagotipia e hibridación Revisión bibliográfica del DNA, logran identificar a la bacteria causante del brote como Hafnia alvei Las tnachas afectadas presentaban oscurecimiento de la piel, exoftalmia, hemorragias oculares y petequias cutáneas. En la necropsia se observaron estas petequias en pared abdominal, hígado, bazo, riñon, músculos y vejiga natatoria. Infecciones por Hafnia alvei también han sido descritas en salmón rojo (Oncorhynchus masou) (TESHIMA y cois., 1992) en una explotación situada en Japón. Los peces presentaban externamente oscurecimiento de la piel y abdomen distendido, no observándose la presencia de exoftalmia. Internamente se observó la presencia de unos forúnculos de color blanco-grisáceo en el riñon. Posteriormente estos mismos autores realizaron un estudio de patogenicidad para lo cual se inocularon vía intraperitoneal cinco lotes de salmón rojo: uno testigo, un segundo de 40 peces de unos 15 g de peso que se inoculó una sola vez, un tercer grupo de 30 peces que se inoculó dos veces con una separación de dos semanas entre ambas inoculaciones, y un cuarto grupo de 30 peces que se inoculó tres veces con una separación de cuatro días, entre cada vma de las inoculaciones. Además de estos cuatro grupos se inoculó un grupo de peces juveniles de un peso de unos 60 g vía intraperitoneal con un cultivo puro de Hafnia alvei en cuatro ocasiones a intervalos de cuatro días. Los ríñones de todos los peces fueron examinados para determinar la presencia o no de lesiones después de dos semanas a un mes de haber comenzado a mostrar síntoroas clínicos. Este protocolo es el único que existe en la bibliografía para estudiar las consecuencias de este patógeno a medio plazo. 10 Revisión bibliográfica Los peces testigo no mostraron ningún signo de enfermedad. Un 40% de los peces del grupo segundo mostraron signos a los 3 meses de la inoculación mientras los peces del tercer grupo mostraron signos de enfermedad a los 32 días de la primera inoculación, y los signos fueron evidentes en un 41% de los peces después de los 57 días. Lx)S peces del cuarto grupo comenzaron a mostrar alguna evidencia a partir del día 12 de la primera inoculación, y en vin 36% de ellos los signos fueron evidentes después de 26 días. En los peces juveniles inoculados la incidencia fue de un 15% después de los 41 días de la primera inoculación. Lx)s signos que mostraron los peces externamente fueron oscurecimiento de la superficie corporal, abdomen hinchado y natación errática. No presentaban exoftalmia. Internamente aparecían diferentes focos blanco-grisáceos prominentes en la cara ventral del riñon. Las lesiones anatomopatológicas encontradas sólo hacen referencia al riñon, y se pueden dividir en tres tipos diferentes: tipo I, tipo II y tipo III, en concordancia con el grado de severidad o progresión de la enfermedad. Las lesiones tipo I corresponden al estadio más precoz de la enfermedad, caracterizándose por la aparición de focos celulares anormales con zonas de mitosis (células de proliferación), con un predominio de neutrófilos sobre los macrófagos. En estas lesiones, se observan pocas o ninguna bacteria, así como tampoco se observan células necróticas en el riñon. Se aprecia degeneración de melanocitos. 11 Revisión bibliográfica 2.2.3.- EN HUMANOS En 1957, K. HARADA y colaboradores describen un aislamiento de H. alvei asociado a cuadros de vómitos y diarrea, tanto en niños como adultos. Años más tarde, R. SAKASAKI (1961) describe a H. alvei como un potencial patógeno intestinal tras unos estudios de toxicidad realizados en conejos. En 1991, MJ. ALBERT y colaboradores del Centro Internacional para la Investigación de la Enfermedad Diarreica, Bangladesh (ICDDRB), aislaron una cepa de Hafnia alvei (designada H. alvei 19982) en cultivo puro de un caso clínico de un niño de 9 meses, con una sintomatología de vómitos, deshidratación, fiebre, distensión abdominal y diarrea con una duración de 72 horas. Se demostró que esta bacteria estaba dotada de capacidad enteropatógena en 8 de los 12 conejos inoculados experimentalmente, siendo capaz de adherirse al epitelio intestinal, causando pérdida de las vellosidades del íleon y produciendo lesiones en la mucosa, las cuales se interpretan como lesiones con "fijación y ocultación" de la bacteria (lesiones AE, del ingles "attaching and effadn^). Posteriores estudios de los mismos investigadores del ICDDRB identificaron otras 6 cepas de H. alvei con caracteristicas similares (ALBERT y cois., 1992). Al igual que los E. coli enteropatógenos, estas 7 cepas de H. alvei dieron resultados positivos a la tinción fluorescente de la actina y 18 Revisión bibliográfica a la presencia del gen eae, un gen involucrado directamente en la capacidad de producir las lesiones AE. Sobre la base de estas investigaciones, diferentes casos clínicos relacionados con H. alvei fueron estudiados, describiéndola como un patógeno entérico (RATNAM, 1991 ; WESTBLOM y MlLLlGAN, 1992; REINA y cois., 1993; RiDELL y cois., 1994), no pudiéndose confirmar la presencia del gen eae. En 1999, JM. JANDA y colaboradores analizaron 5 de las cepas aisladas por MJ. ALBERT en el ICDDRB, y sus resultados sugieren que estas cepas son biotipos atípicos de Escherichia coli o por el contrario representan una nueva especie dentro del Género Escherichia, si bien, no está del todo claro y hoy en día se continúa la investigación, no estando descartado que pueda tratarse realmente de H. alvei. Lo que si está del todo demostrado es la relación epidemiológica entre cepas de H. alvei negativas a la presencia del gen eae y los casos clínicos con sintomatología de vómitos, diarrea y deshidratación. Su aislamiento en tejidos diferentes al intestino es relativamente raro, pero representa en estos casos un agente etiológico que puede comportarse como patógeno oportunista (GÜNTHARD y PENNEKAMP, 1996), pudiendo provocar cuadros septicémicos (ENGLUND, 1969), neumonías (KLAPHOLZ y cois., 1994) y abscesos (AGUSTÍN y CUNHA, 1995). 19 Reiñsión bibliográfica 2.3.-LA INFECCIÓN EXPERIMENTAL EÍÑ ACUICULTURA: APLICACIONES La experimentación animal mediante modelos de dosisrespuesta es un procedimiento utilizado para comparar la virulencia, capacidad de colonización de una bacteria o potencia de una toxina bacteriana, que en condiciones naturales produce un organismo determinado (WELKOS y O'BRIAN, 1994). La respuesta puede ser medida por muerte, infectividad o algún otro efecto cuantificable. Un ejemplo es la determinación de la dosis letal 50 (DL50), en donde el investigador calcula la dosis (toxina, bacteria o algún otro factor) que produce la muerte del 50% de los animales sujetos a estudio. Para generar estos valores, el modelo para pequeños animales consiste en tomar 3 ó 6 grupos con 5 ó 10 animales por grupo. Cada grupo recibe una dosis diferente del microorganismo o toxina y dichas dosis deben ir en relación geométrica mediante diluciones seriadas (REED y MUENCH, 1938; WELKOS y O'BRIAN, 1994). Como la virulencia, toxicidad, e infectividad son dependientes tanto del agente causal como del hospedador, S. WELKOS y A. 0'BRL\N (1994) concluyen que los estudios de DL50 requieren de la perfecta estandarización de todos los componentes que intervienen en el experimento, como es el uso de la misma cepa para todos los animales, que todos los animales inoculados sean de la misma edad y tamaño, y que todos los animales estén bajo las mimas condiciones de mantenimiento. 20 Revisión bibliográfica El método de JL. REED y M. MUENCH (1938) es probablemente el más utilizado para la determinación de la DL50, usándose en multitud de estudios y con muy diversos animales de experimentación (WELKOS y O'BRIAN, 1994). Una dosis letal, en un procedimiento biológico, tal como la titulación de un suero o un virus, consiste en la dilución máxima del producto en la cual ciertos animales sometidos al experimento reaccionan o mueren. Según estos autores para cubrir un amplio rango de posibles variaciones en la titulación es necesario usar un gran número de pequeños grupos de animales probados en diferentes diluciones. El uso de la DL50 en el mundo de la ictiopatología ha sido ampliamente utilizado a lo largo de los años para diversas experiencias, como son la determinación del grado de patogenicidad de una cepa determinada mediante la reproducción experimental de la enfermedad y la determinación de la patogenicidad de los productos extracelulares bacterianos mediante inoculación de los mismos. M. FAISAL y cois. (1989) describen en el bajo Egipto unas mortalidades por un proceso septicémico en Oreochromis niloticus que oscilaban entre el 10 y el 70%. Se lograron aislar un total de 17 Aeromonas hydrophila, realizándose posteriormente inoculaciones experimentales para determinar el nivel de virulencia de cada una de las cepas. Las DL50 oscilaron desde 10^ a 10'^ unidades formadoras de colonia por mi (ufc/ml). A su vez, se analizaron diferentes factores de patogenicidad, concluyéndose que fueron las cepas con DL50 del orden de 10^ ufc/ml las que presentaban in vitro mayores factores de virulencia. 21 Remsión bibliográfica GR. MALATHI y cois. (1989) determinaron las DL50 de varias cepas mcirinas de Vibrio vulnificus aisladas de productos del mar, utilizando como animal de experimentación el ratón, obteniendo unos valores entre 10^ a 10^ ufc/ml. Al contrario que lo descrito por M. FAlSALy cois. (1989), tanto las cepas más patógenas (DL50 del orden de 103), como las menos patógenas (DL50 del orden de 10^) contenían in xÁtro los mismo factores de virulencia. Y. SANTOS y cois. (1991) describieron la patogenicidad de Vibrio anguillarum y sus toxinas en rodaballo (Scophtalmus maximus), salmón coho (Oncorhynchus kisutch) y trucha arcoiris (Oncorhynchus mykiss) con 12 cepas diferentes mediante la metodología anteriormente descrita por JL. REED y M. MUENCH (1938). Utilizaron 6 peces por grupo, con unos pesos comprendidos entre los 4.5 y 6.5 g. Los peces se inocularon intraperitonealmente con suspensiones bacterianas que oscilaron entre los 10^ a 10^ ufc/ml. Los resultados demostraron que era la trucha arcoiris la especie más susceptible a la infección experimental, con unos valores de DL50 del orden de 10^ a 103 ufc/ml. B. FOUZ y cois. (1994) realizaron experiencias de DL50 para determinar el papel que juega el hierro en la patogenicidad de Vibrio damselae en rodaballo (Scophthalmus maximus). Mediante estas experiencias se logró demostrar la correlación existente entre la adquisición de hierro por parte de las bacterias y el aumento del grado de patogenicidad de las mismas. 22 Revisión bibliográfica B. MAGARIÑOS y cois. (1995) determinaron el grado de patogenicidad de 6 cepas de Photobacterium damselae subsp. piscicida de probada capacidad patógena en doradas y rodaballo mediante inoculación experimental vía intraperitoneal y baño de 60 minutos en unas suspensiones bacterianas seriadas de 10^ a 10'* células por mi. El resultado fue la demostración de que Photobacterium damselae subsp. pñscicida era capaz de infectar a la dorada por vía oral, obteniéndose unos valores de DL50 del orden de 10^ a 10^ ufe/mi mediante la metodología descrita por JL. REED y M. MUENCH (1938). Las mortalidades comenzaron a los 3 ó 7 días postinfección en función de la cepa utüizada. Las DL50 obtenidas en dorada mediante la infección por baño fueron siempre menores que las obtenidas mediante la inoculación intraperitoneal, situándose entre lO'* a 10^ en dorada y 10^ a 10^ en rodaballo. En contraste, el rodaballo demostró ser una especie no susceptible a la pasterelosis por baño. En Israel, en el año 1984, hubo un brote de meningitis y meningoencefalitis que afectó a varias especies piscícolas, como híbridos de tilapia, trucha arcoiris (Oncorhynchus mykiss) y carpa común (Cyprinus carpus), con alta morbilidad y una mortalidad del 50% en trucha y del 30% en tilapia. Se aislaron dos especies nuevas de Streptococcus, el Streptococcus shiloi y el Streptococcus difficile. La experiencia de DL50 se llevó a cabo para reproducir experimentalmente la enfermedad en trucha y tilapia, obteniendo unos valores de 10^ a 105 ufe por mi (ELDAR y cois., 1995). Un experimento similar fue realizado por AM. BAYA y cois. (1997) en lubina (Dicentrarchus labrax), dorada (Sparus aurata, L.) y rodaballo (Scophthalmus maximus) para 23 Remsión bibliográfica reproducir experimentalmente la enfermedad causada por Edwardsiela tarda en un brote epizoótico ocurrido en Maryland (Estados Unidos) en el año 1994, que fue el primero descrito para este agente patógeno en esta zona. B. MAGARIÑOS y cois. (1996) realizaron experiencias de DL50 para determinar diferencias de patogenicidad de Photobacterium damselae subsp. piscicdda con o sin cápsula bacteriana, comprobándose que las cepas capsuladas reducían los valores de DL50 en 4 logaritmos, confiriéndoles factores de virulencia tales como resistencia al suero, que no poseían cuando no estaban capsuladas. Este resultado puso de manifiesto el papel tan importante que juega la cápsula bacteriana en la patogenicidad de Ph. damselae subsp. piscicida. La patogenicidad de Vibrio alginolyticus en dorada (Sparus aurata, L.) se cuestionaba hasta hace pocos años. MC. BALEBONA y cois. (1998) dilucidaron este aspecto. Para ello utilizaron doradas entre 5 y 10 gramos, analizando un total de 10 cepas diferentes. La DL50 fue determinada mediante inoculación intraperitoneal, en grupos de 5 peces por lote, con suspensiones bacterianas de entre 10^ a 10» ufc/ml, obteniéndose unos resultados de DL50 que oscilaron entre los 5.4 X 10"* a 1.0 X 10^ unidades formadoras de colonia por gramo de pez. Este trabajo permitió considerar a V. alginolyticus como un agente bacteriano con capacidad patógena para la dorada. LA. RODRÍGUEZ y cois. (1998) analizaron el grado de patogenicidad de Hafnia alvei en trucha común (Salmo trutta, L.), 24 Revisión bibliográfica usando peces con un peso comprendido entre los 6 y los 12 gramos, inoculando intraperitonealmente 0.1 mi de una suspensión bacteriana que oscüaba entre las 10^ y las 10^ unidades formadoras de colonia por mililitro según la metodología de JL. REED y M. MUENCH (1938), y obtuvieron unas DL50 comprendidas entre 1.3 x 10'^ y 2.5 x 10^ ufe/pez. B. SOFFIENTINO y cois. (1999) realizaron una experiencia de DL50 con Vibrio carchariae tras la aparición de un brote de enfermedad con enteritis necrótica y muerte en lenguado [Paralichthys dentatus). El brote natural de la enfermedad cursó con signos de enteritis necrótica, produciendo petequias hemorrágicas alrededor de la zona anal, distensión abdominal con presencia de líquido serohemorrágico, enteritis y posterior necrosis del intestino distal. La experiencia de DL50, cuyo valor fue 5 x lO^ ufe/pez, permitió determinar el grado de virulencia de la cepa, y confirmó que, efectivamente, Vibrio carchariae fue el agente responsable del brote natural de enfermedad. Las experiencias de DL50 también se utilizan para determinar el papel que juegan los productos extracelulares bacterianos en la patogenia de la enfermedad, como en el estudio de B. MAGARIÑOS y cois. (1992) que compararon los datos de DL50 de 11 cepas de Photobacterium damselae subsp. piscicida (DL50 entre 10^ y 10^ células por pez), con los datos obtenidos con la inoculación experimental de los productos extracelulares (ECP) de estas mismas cepas. Los resultados fueron que los productos extracelulares de esta especie bacteriana eran extraordinariamente tóxicos para los peces, al 25 Remsión bibliográfica obtenerse unos valores de DL50 para los ECP del orden de 1.0 a 4.6 microgramos de proteína por gramo de pez. Otros autores que han utilizado experiencias de DL50 para determinar el efecto de los ECP son AH. KHALIL y cois. (1997) en Tüapia del Nüo con Aeromonas hydrophila, JL. ROMALDE y cois. (1993) con Yersinia ruckeri, LA. RODRÍGUEZ y cois. (1992) en trucha arcoiris con Aeromonas hydrophila, así como KK. LEE y cois. (1989) en salmón atlántico (Salmo salar, L.) con Aeromonas salmonicida. 26 Revisión bibliográfica 2.4.- MECANISMOS DE VIRULENCIA DE BACTERIAS GRAM NEGATIVAS 2.4.1.- FACTORES DE ADHERENCIA 2.4.1.1.-GEN EAE Cepas de Escherichia coli enteropatógenas (EPEC) y enterohemorrágicas (EHEC) productoras de enteritis y enterocolitis hemorrágicas se han aislado en varias especies animales como en: perros y gatos (BROES, 1993; BEUTIN y cois., 1993; BEUTIN, 1999), ganado porcino (FAIRBROTHER, 1993; BEUTIN y cois., 1993; Ríos y cois., 1999), ganado bovino (MAINIL y cois., 1987; MAINIL y cois., 1994; WlELER y cois., 1998), conejos (MlLON y cois., 1999), ganado ovino (BEUTIN y cois., 1993; HEUVELINK y cois., 1998), ciervos (RiCE y cois., 1995), palomas (DELL'OMO y cois., 1998) y gallina (FUKUl y cois., 1995). Tanto las cepas enterohemorrágicas como las enteropatógenas producen una lesión histopatológica característica conocida por "attaching and effacin^, las cuales se interpretan como lesiones con "fijación y ocultación" de la bacteria, también denominada lesión A/E, produciendo una alteración de las células epiteliales del intestino. Esta lesión se caracteriza por la ocultación de la bacteria entre las microveUosidades intestinales provocando una destrucción focal, la íntima adherencia entre la bacteria y la membrana de los enterocitos y la acumulación de filamentos de actina polimerizada, provocando fijertes cambios en el citoesqueleto del enterocito bajo el área de localización de la bacteria (MOON y cois., 1983). A esta capacidad de producir este tipo de lesión A/E se le reconoce como un importante 27 Revisión bibliográfica especies de la Familia Enterobacteriaceae como Serrada marcescens (46%), pero sí fue signicatívamente menor (p<0.0001) que las MSHA expresadas en aislamientos clínicos de Enterobacter cloacae (89%) o Klebsiella pneumonie (86%). La hemoaglutinina MRHA, indicativa de la presencia del pili tipo III se observó en el 50% de las cepas de Hafnia alvei, siendo significativamente mayor (p<0.05) que en Serratia marcescens, pero significativamente menor que en Klebsiella pneumoniae (70%). Aunque la bibliografia existente sobre la presencia de las hemoaglutininas MSHA y MRHA en especies de la Familia Enterobacteriaceae es muy extensa, hasta el estudio de R. PODSCHUN y colaboradores (2001) no existían datos sobre la incidencia de estas hemoaglutininas en Hafnia alvei, ya que estudios anteriores de JAGIELSKI y colaboradores (1992), así como GRAVEN y WILLIAMS (1997) se limitabíin a reseñar el simple hallazgo de la hemoaglutinina MSHA en algunas cepas de Hafnia alvei analizadas. Los datos aportados por R. PODSCHUN y colaboradores (2001) sugieren que la presencia de los pili tipo I y tipo III son una característica común a Hafnia alvei, encontrándose aproximadamente en la mitad de los aislamientos clínicos. 34 Revisión bibliográfica 2.4.2.- RESISTENCIA AL SUERO La acción bactericida del sistema del complemento es un importante mecanismo de defensa del hospedador frente a las infecciones causadas por bacterias Gram negativas (FRANK y cois., 1992; McQuiLLEN y cois., 1994), actuando en la primera línea de defensa del organismo junto a la fagocitosis por poHmorfonucleares. La actividad bactericida del suero está mediada principalmente por las proteínas del complemento. Tras la activación de su sistema, estas proteínas se acumulan formando el complejo C5b-C9 en la superficie de la membrana de las bacterias Gram negativas (RAMM y cois., 1983), lo cual produce una serie de poros que atraviesan dicha membrana, facilitando la entrada de iones Na+, provocando consecuentemente la lisis osmótica de la bacteria (TAYLOR y cois., 1985). También se ha demostrado la implicación del sistema del complemento en la inactivación de la toxicidad de los productos extracelulares liberados por bacterias patógenas de peces como Aeromonas salmonicida (MUNRO y cois., 1980; CIPRIANO, 1983; SAKAI, 1984; ELLIS, 1987). La activación del sistema del complemento se puede realizar mediante dos mecanismos diferentes: la vía clásica (requiere de la presencia de anticuerpos para su activación) y la vía alternativa del complemento (se activa sin la presencia de anticuerpos). Ambas vías de activación tienen como resultado final la formación del complejo C5b-C9 (RAMM y cois., 1983). 35 Revisión bibliográfica Como respuesta a esta defensa por parte del hospedador, los microorganismos patógenos han encontrado estrategias de defensa efectivas contra el efecto bactericida del suero. La mayoría de las bacterias Gram negativas saprofitas son sensibles al efecto bactericida del suero, mientras que las bacterias patógenas a menudo exhiben capacidad de resistencia (OLLING, 1977). El mecanismo de resistencia bacteriana al efecto bactericida del suero no está del todo claro, si bien se conoce que la estructura del lipopolisácarido O bacteriano juega un papel sumamente importante en dicha resistencia, al contrario que ocurre con la cápsula bacteriana y ciertas proteínas de membrana (TAYLOR, 1992). En los mamíferos, la activación del sistema del complemento juega un papel sumamente importante en la lisis bacteriana, fagocitosis, reacción inflamatoria y producción de anticuerpos. Los peces parecen poseer una activación de este sistema similar a la de los mamíferos, y además, las proteínas del complemento identificadas en los peces son similares a las de los mamíferos (HOLLAND y LAMBRIS, 2002). Actualmente se tiene poca información acerca de las proteínas reguladoras y receptores del complemento en los peces, siendo todavía confuso si todas las funciones del sistema del complemento identificadas en los mamíferos también las poseen los peces. Sin embargo, lo que sí ha quedado del todo demostrado es que el complemento de los peces puede lisar células no reconocidas como propias por su sistema inmune, así como opsonizar a estas células 36 4 c ,,..4Revisión bibliográfica para la destrucción por células fagocíticas y participar en reacciones inflamatorias (NONAKA y cois., 1981; HOLLAND y LAMBRIS, 2002). Las cepas aisladas de casos clínicos suelen ser por lo general más resistentes al efecto bactericida del suero que aquellas cepas aisladas de origen no clínico. Este hecho queda demostrado en estudios como los realizados por RJ. ROANTREE y LA. RANTZ (1960), así como J. FlERERy colaboradores (1972) donde se encontró una mayor proporción de bacterias Gram negativas resistentes al efecto bactericida del suero de aislamientos clínicos de bacteriemia humana que en las aisladas de heces u orina, y en el de KL. VOSTI y E. RANDALL (1970) donde se encontraron susceptibilidades significativamente menores al efecto bactericida del suero en cepas de E.coli aisladas en casos clínicos con bacteriemia que en las aisladas de orina y heces. A su vez, las cepas resistentes a los efectos bactericidas del suero presentan a menudo una mayor severidad de los síntomas observados (GoWERy cois., 1972; BJÓRKSTÉN y KAIJSER, 1978). Existen multitud de estudios realizados que analizan el efecto bactericida del suero sobre bacterias patógenas de peces, aunque la especie más investigada en este sentido es la trucha arcoiris (Oncorhynchus mykiss). En el estudio de HT. BOESEN y cois. (1999) se analizó la resistencia de los serogrupos OÍ y 02 a de Vibrio anguillarum frente al suero de la trucha arcoiris. Todas las cepas analizadas de V. anguillarum fueron capaces de activar el sistema del complemento de esta especie de pez, siendo resistentes al efecto bactericida del suero el 37 Reiñsión bibliográfica 80% de las cepas de V. anguillarum serogrupo 02a, encontrándose además una correlación positiva entire el tamaño del lipopolisacárido O y la resistencia al efecto bactericida del suero. CB. MUNN y cois. (1982) compararon la resistencia de cepas de Aeromonas salmonicida al efecto bactericida del suero humano, conejo y trucha arcoiris, determinándose unas resistencias que oscilaron de altas a intermedias para el suero de trucha. La correlación entre resistencia al efecto bactericida del suero y una mayor virulencia de una determinada cepa ha sido demostrada por multitud de estudios. RL. DAVIES (1991) demostró que las cepas de mayor virulencia para trucha arcoiris de Yersinia ruchen eran las que poseían una mayor resistencia al efecto bactericida del suero, comportándose las cepas virulentas como resistentes a dicho efecto, mientras que las avirulentas eran sensibles. Un estudio simüar fue realizado por TJ. TRUST y cois. (1981) donde se analizó la resistencia al efecto bactericida del suero de trucha arcoiris sobre varias cepas patógenas para los peces de Vibrio spp., demostrándose una correlación positiva entre la menor resistencia al afecto bactericida del suero y una marcada reducción de la virulencia de la cepa. Otros estudios que demuestran esta asociación son los de CB. MUNN y cois. (1982) con Aeromonas salmonicida en trucha arcoirs, M. FAISAL y cois. (1989) con Aeromonas hydrophila en tilapia del Nilo {Oreochromis niloticus), así como A. SUTTON y cois. (1982) con Haemophilus influenzae tipo b. 38 Revisión bibliográfica Y con respecto a Hafnia alvei, en un estudio realizado por S. JANKOWSKI y cois. (1996) con 26 cepas se obtuvo como resultado que sólo 5 cepas eran resistentes al efecto bactericida del suero bovino. También se puso de manifiesto el papel decisivo que juegan los lipopolisacáridos en este mecanismo de resistencia, ya que cepas sensibles al efecto bactericida del suero, aumentaban enormemente su resistencia al adicionar lipopolisacáridos de cepas de Hafnia alvei al suero bovino. Además, este efecto demostró ser dosis-dependiente. Igualmente, R. PODSCHUN y cois. (2001) realizaron un estudio de la resistencia de Hafnia alvei al efecto bactericida del suero humano, comparando los resultados con los obtenidos en otras bacterias de la Familia Enterobacteriaceae como Serratia marcescens, Enterobacter cloacae y Klebsiella pneumonie. La frecuencia de cepas de Hafnia alvei que mostraban resistencia al suero fue del 34%, asemejándose a los resultados obtenidos en Serratia marcescens (26%) y Klebsiella pneumonie (25%), pero significativamente inferior que lo que ocurrió con las cepas de Enterobacter cloacae (92%). La estructura de los lipopolisacáridos de las cepas "Le Minor" (INSTITUTO PASTEUR) de Hafnia alvei 1199, 1216 y 2386 fue determinada por A. ROMANOWSKA y cois. (1994), así como por A. GAMIAN y cois. (1991), poniendo de manifiesto que los lipopolisacáridos de las cepas 1199 y 2386 tenían una estructura especialmente compleja, pudiendo atribuírsele la responsabilidad de la resistencia de dichas cepas a la acción bactericida del suero encontradas en el trabajo de S. JANKOWSKI y cois. (1996). Si bien, está demostrado que la 39 Revisión bibliográfica naturaleza del carácter "resistencia al efecto bactericida del suero" es compleja (TAYLOR, 1992; MERINO y cois., 1992; JOINER, 1998). 2.4.3.- HEMOLISIS La actividad hemolítica de los productos extracelulares bacterianos ha sido asociada con el grado de patogenicidad en multitud de especies bacterianas, siendo una de las variables que se proponen investigar para detectar cepas virulentas (SANTOS y cois., 1989). Eritrocitos de mamíferos han sido rutinariamente usados para determinar estas capacidades no sólo en cepas virulentas de hospedadores poiquilotermos y homeotermos, sino también con patógenos primarios de peces como Renibacterium sálmoninarum, Aeromonas salmonicdda y Yersinia ruckerí. El papel de las hemolisinas en la patogenicidad bacteriana frente animales homeotermos se ha demostrado en una gran variedad de Géneros y Famüias bacterianas: Escherichia (WELCH y cois., 1981; CAPRIOLI y cois., 1983; HACKER y cois., 1986), Proteos (KORONAKis y cois., 1987; WELCH, 1987), Morganella (KORONAKIS y cois., 1987), Mycobacterium (MASLOW y cois., 1999). Para el caso de animales poiquilotermos como son los peces, el número de trabajos publicados no es tan abundante como en el caso de especies bacterianas patógenas en homeotermos. En el estudio de Y. SANTOS y cois. (1989) se establecieron patrones hemolíticos de Aeromonas spp. móviles frente a eritrocitos humanos, de oveja, cobaya, trucha arcoiris y salmón coho (Oncorhynchus kisutch), 40 Revisión bibliográfica determinándose que un 96% de las cepas presentaban actividad hemolítica. Un porcentaje similar de cepas de Aeromonas hydrophila y A. sobria eran capaces de Usar eritrocitos de humanos, de oveja y cobaya, siendo mucho menos frecuente esta capacidad hemolítica con eritrocitos de trucha arcoiris y salmón coho. Cepas virulentas y avirulentas de Aeromonas spp. móviles hemolizaron eritrocitos de peces, pero sólo seis cepas patógenas exhibieron una actividad hemolítica específica fi-ente a los eritrocitos de trucha arcoiris. De estos resultados se desprende que la actividad hemolítica de una cepa determinada constituye un claro factor de virulencia para todas las especies de aeromonas probadas. Sin embargo, por sí sólo la presencia de este factor no contribuye a la patogenicidad que muestran las aeromonas móviles. XH. ZHANG y B. AUSTIN (2000) realizaron un estudio que analizaba la actividad hemolítica de los productos extracelulares de Vibrio harveyi, y concluyeron que la capacidad hemolítica estaba íntimamente relacionada con la patogenicidad de estas cepas para los salmónidos, existiendo una correlación positiva entre la patogenicidad y la mayor titulación con actividad hemolítica frente a eritrocitos de salmón atlántico (1:256) y trucha arcoiris (1:32). En general, las heraolisinas bacterianas son consideradas importantes factores de patogenicidad en Vibrio spp. al causar septicemia hemorrágica y diarrea en el hospedador. Estas hemolisinas han sido caracterizadas y clonadas a partir de Vibrio parahaemolyticus (NISHIBUCHI y KAPER, 1985; TANIGUCHI y 41 Revisión bibliográfica cois., 1986), V. cholerae (ARDER y MURPHY, 1988; BABA y cois., 1991), V. hollisae (YAMAMOTO y cois., 1990), V. mimicus (KiM y cois., 1997), V. vulnificus (YAMAMOTO y cois., 1990), y V. anguillarum (HiRONO y cois., 1996). Vibrio anguillarum serotípo OÍ y 02 es el agente etiológico más importante de las vibriosis, causando pérdidas millonarias en las industrias piscícolas de todo el mundo (SORENSEN y LARSEN, 1986; TORANZO y cois., 1997). Este agente bacteriano es productor de hemolisinas, existiendo varios estudios que relacionan su mayor actividad productora con su capacidad patógena (KODAMA y cois., 1984; KROVACEK y cois., 1987). 2.4.4.- PRODUCCIÓN DE SIDBRÓFOROS El hierro es un componente fundamental para el crecimiento y metabolismo microbiano. Limitar las concentraciones del hierro libre extracelular es una estrategia de defensa del hospedador contra los microorganismos patógenos (BULLEN y cois., 1978; FINKELSTEIN y cois., 1983; KONTOGHIORGHES y WEINBERG, 1995; WEINBERG y WEINBERG, 1995). La fuente de hierro libre disponible es extremadamente baja, ya que la mayor parte del hierro se encuentra retenido intracelularmente en proteínas como la hemoglobina, ferritina, hemosiderina y mioglobina, y extracelularmente en proteínas de alta afinidad por el hierro como lactoferrina y transferrina. La cantidad de hierro libre biodisponible es de 1 x lO-i^ M, insuficiente para el normal crecimiento bacteriano (BULLEN y cois., 1978). 42 Revisión bibliográfica La habilidad de las bacterias para obtener hierro a partir de las proteínas del hospedador es absolutamente esencial para el crecimiento bacteriano y para garantizar el curso de la infección (BULLEN, 1981; NEILANDS, 1981-a). Bajo condiciones restrictivas de hierro, muchas bacterias patógenas liberan al medio pequeñas moléculas de alta afinidad por el hierro llamadas sideróforos (NEILANDS, 1981-b y 1995) capaces de obtener hierro a partir de las proteínas del hospedador (GRIFFITHS y cois., 1988). Las bacterias también pueden obtener hierro a partir de proteínas del hospedador mediante una serie de receptores específicos para dichas proteínas y mediante una serie de hemolisinas o citotoxinas que liberan componentes sanguíneos que se fijan a las bacterias mediante receptores específicos (MARTÍNEZ y cois., 1990; OTTO y cois., 1992; WOOLDRIDGE y WILLIAMS, 1993). Las enterobacterias son capaces de sintetizar una gran variedad de sideróforos, los cuales pertenecen a 2 grupos, los sideróforos tipo fenolados y los sideróforos tipo hidroxamato. El grupo más importante de sideróforos son los tipo fenolados, siendo su representante más importante la enterobactina (trímero cícUco de 2,3düiidroxi-benzoylserina). Este sideróforo es sintetizado por la mayoría de las cepas clínicas de Escherichia coli y Salmonella spp. (GRIFFITHS, 1987). Los estudios realizados sobre la contribución en el grado de virulencia bacteríana por parte de la enterobactina son contradictorios. RJ. YANCEY y cois. (1979) describen que un mutante de Salmonella typhimurium incapaz de secretar este sideróforo es menos virulento en ratón, mientras que WH. BENJAMÍN y cois. (1985) no encontraron relación 43 Revisión bibliográfica tejidos, incluso en las fases iniciales. Además, el método fue capaz de confirmar la presencia de la bacteria en intestino, a pesar de que no existían lesiones a nivel macroscópico ni microscópico en dicho tejido, ocasionados por Hqfrtía alveL 50 Material y Métodos Material y Métodos aMATERIAL Y MÉTODOS 3.1.- MÉTODOS mCROBIOLÓGICOS CIBMESM.EB 3.1.1.- CEPAS UTILIZADAS EH ESTBl B3STlTI3I'eo Las cepas de Hafnia alvei utilizadas en este trabajo fueron un total de 23, 12 pertenecientes a colecciones privadas de laboratorio, 9 a la colección "Le Minor" de cultivos tipo del Instituto Pasteur y 2 a la colección americana de cultivos tipo (ATCC), que proceden de fuentes diferentes como puede comprobarse en la Tabla 1. En dicha tabla se refleja igualmente su origen, año de aislamiento y la referencia completa de su donante y/o vendedor. a 1,2.- MAKTEIIMIEMTO Y CO^ñMM^JAClíM DE Z.AS CBFAS Para el mantenimiento y conservación de las cepas en el laboratorio, se usó el medio de cultivo Mac Conkey Agar (Laboratorios Difco, Detroit, Michigan). Los medios fueron incubados durante 24 horas a 37°C. Las cepas aisladas en cvdtivo pviro se resuspendieron en Caldo Triptona de Soja (TSB) (Laboratorios Cultimed, Monteada i Reixac, Barcelona, España) adicionado con un 15% de gUcerol y fueron congeladas a -80°C para su conservación. 51 Material y Métodos TfflMa loCEPA 187 C34 OR-1 F4319 XI 4256 4094 1967 842 23 24 25 30 7 14 7 11 OU-3 OU-4 2566 19 ATCC 13337 ATCC 9760 ^(BÜacñ®!!! di® ciBjpsis ál® M.ulkfsi im'ítMñzsidlsis ®!m ®ste sstadlto ORIGEN Septicemia en gallina ponedora, España Trucha arcoins, España Crema pastelera, España Enteritis humana,Reino Unido Enteritis humana. Reino Unido Sangre humana, E.E.U.U Esputo humano, E.E.U.U Heces humanas, E.E.U.U Vejiga humana ,E.E.U.U Heces humanas, Francia Líquido gástrico humano,Francia Heces humanas, Francia Humano (desconocido), Francia Heces humanas, Francia Heces humanas, Francia Heces humanas. Marruecos Heces humanas, Francia Urología Urología Septicemia en trucha arcoiris Lagarto, Italia Heces humanas, E.E.U.U Paracolon humano, E.E.U.U AISLAMIENTO 1995 1990 1996 1995 1996 1983 1983 1982 1981 1965 1965 1965 1965 1967 1967 1968 1969 1999 1999 1983 1968 1965 1943 DONADOR F.Real J.L.Múzquiz L. A Rodríguez T.G.Winstanley T.G.Winstanley C.D.C C.D.C C.D.C C.D.C Le Minor LeMinor Le Minor LeMinor Le Minor LeMinor LeMinor LeMinor L.A Rodríguez L.A Rodríguez Gelev Le Minor ATCC ATCC F.Real. Facultad de Veterinaria. Universidad de Las Palmas de Gran Canaria. España. J.L.Múzquiz. Facultad de Veterinaria, Universidad de Zaragoza. España. L.A.Rodríguez. Facultad de Ciencias. Universidad de Vigo, Orense. España T.G.Winstanley. Hospital Royal Hallamshire, Sheffield. Reino Unido. ATCC. American Type Culture Collection, Rockville, MD. Estados Unidos. CDC. Center for Disease Control and Prevention, AÜanta. Estados Unidos Le Minor. Instituto Pasteur, París. Francia Gelev. Veterinary Institute, Plovdiv, Bulgaria 52 Material i¡ Métodos a 1.aPRUEBAS DE IDEHTÍFICACIOS: BE LAB CEPMi Las cepas fueron sometidas para su identificación a pruebas bioquímicas convencionales en tiibo y placa (SMIBERT y KRIEG, 1981) y sistemas miniatiarizados (API 20E) (BioMérieux, Madrid, España). Estas pruebas se utilizaron para garantizar la identificación de las cepas objeto de estudio, con la finalidad de distinguir H. alvei de otras bacterias taxonómicamente cercanas como Salmonella spp., Serratia spp., Edwarsiella spp. y Yersinia ruckeñ, tanto a la llegada de las cepas al laboratorio, como cada vez que una cepa se recuperó en el medio de aislamiento en todas las inociilaciones eiqjerimentales realizadas en dorada. Se aplicaron un número de pruebas reducidas pero "suficientes" (REAL y cois., 1997) para garantizar este hecho, como fue la tinción de Gram por el método de HUCKER modificado, citocromo-oxidasa por el método de KOVACS (1956), la prueba de la catalasa, oxidaciónfermentación de los azúcares glucosa, arabinosa, meüobiosa, sacarosa, sorbitol, manitol e inositol en el medio basal de HUGH-LEIFSON (SMIBERT y KRIEG, 1981), decarboxilación de aminoácidos arginina, Usina y omitina mediante el caldo de M0LLER (Difco) (M0LLER, 1955, cit. SEELEY y cois., 1991), producción de gas a partir de la glucosa mediante el caldo de HUGH-LEIFSON adicionado con un 1% de glucosa (SMIBERT y KRIEG, 1981), utilización del citrato mediante la prueba Citrato de SlMMONS (Difco), reacción de Voges-Proskauer, producción de Indol (KoVACS, 1956), detección de la p-galactosidasa (Oxoid, 53 Material y Métodos Basingstoke, Hampshire, RG24 8PW, England) y reducción de nitratos mediante el empleo del caldo nitrato (Difco). Como prueba complementaria, al comenzar este estudio se realizó la üsis de todas las cepas por el fago 1672 según el método descrito por PAM. GUIÑEE y JJ. VALKENBURG (1968), prueba que nos permitió confirmar que nuestras cepas de estudio pertenecían a la especie Hafrúa alvei, diferenciándolas así de otras enterobacterias que bioquímicamente son muy parecidas. A su vez, utilizamos el sistema API 20E (BioMérievix) para comparar, y corroborar en su caso, los resultados de identificación, con respecto a la metodología clásica, de las cepas que recibimos en el laboratorio, y, colonias aisladas a partir de la siembra de riñon y otros órganos de los animales sacrificados después de las inoculaciones experimentales realizadas en dorada, durante todo este trabajo. 54 Material v Métodos 3.2." imALISIS DE LOS FACTORES BE -^IRÜLEMCJA BE LAS CEPAS DE HAFMIA ÁLVEI 3.2.1«" DETECCIÓM DEL GEN EAB MEDIASTE KL MÉTODO BE PCS. Un total de 23 cepas de Hafnia alvei fueron analizadas para la detección del gen eae. Lx)s datos que hacen referencia a la procedencia y origen de las cepas estudiadas se presentan en la Tabla 1. Las cepas analizadas se cultivaron en Agar Infusión Cerebro Corazón (BHI agar) (Cultimed) durante 18-24 horas a 37°C para posteriormente proceder a la extracción de su ADN mediante el Kit comercial Wvzard Gervomic DNA Purification (Promega, Innogenetics Diagnóstica y Tecnología, Barcelona, España). Para detectar la presencia de este gen nos hemos basado en la descripción del método previamente hecha por A. ISMAILI y cois. (1996). Se emplearon dos juegos de cebadores, que fueron producidos por la casa comercial Genset S.A. (Paris, Francia), y fueron diseñados siguiendo las directrices de trabajos previos (LOUIE y cois., 1994) (Tabla 2). Se aplicaron dos tipos de prueba de PCR. La primera con los cebadores CÍE y C2E que debían amplificar un fragmento de 1,1 Kb y que fue reaHzada previamente por A. ISMAILI y cois. (1996) sobre cepas de Hafnia alvei con la presencia del gen eae. El segundo método incluyó los cebadores P20 y P40, que debían amplificar un fragmento de 0,4 kb. 55 Material y Métodos según la descripción que LOUIE y cois. (1994) hicieron para el serotipo OÍ 11:H8 de B. cali con la presencia de este gen. Las amplificaciones fueron realizadas en un volumen de 25 ni, conteniendo Ix de tampón (Biorad), 250 nM de cada nucleótido, 2 mM de CkMg (Biorad), lU de Taq DNA polimerasa (Biorad), 25 ng de ADN, 40 nM para los cebadores C1E-C2E, 10 nM para los cebadores P20-P40, y el resto hasta 25 \ú. de agua ultrapura estéril. Como controles positivos de la amplificación fueron utüizadas las cepas de EschericHa cali E2348/69 y RC541. Como control negativo fue utilizado iin eppendorf con agua estéril en sustitución del ADN. Como marcador de peso molecular se utüizó uno de 100 pares de bases (Amersham, Pharmacia Biotech Inc). Los geles se prepararon disolviendo agarosa (Sigma) por calentamiento en Tampón Tris-Acetato (TAE). La disolución se vierte en una placa en la que se ha dispuesto el peine para formar los pocilios en los que se depositará la muestra. La concentración de agarosa utilizada fue del 1%. Muestras de 5 (A1 del producto de PCR se depositan en los pocilios de los geles y se sumergen en el tampón Tris-Acetato (TAE). La electroforesis la realizamos a 100 voltios durante 30 minutos. Los geles fueron teñidos durante 30 minutos en una solución de agua destilada con 0.5 ii.g de bromuro de etidio por mililitro, lavadas 56 Material y Métodos en agua destilada, y fotografiadas con una cámara Polaroid MP-4 Land Camera, usando una película tipo Polaroid 665. Los tiempos, temperaturas y número de ciclos de las experiencias de PCR se muestran en la Tabla 3. Tabla 2.- Cebadores latilizados por cada una. áe las téesleas áe FCM CEBADOR CÍE C2E P20 P40 SECUENCIA 5*-3' TCGTCACAGTTGCAGGCCTGGT CGAAGTCTTATCCGCCGTAAAGT TATTTTATCAGCTTCAGT ACGTTACTGGTGACTTA TAMAÑO PRODUCTO AMPLIFICADO 1,1 Kb 0,4 Kb Tabla 3.- Protocolo de ciclos que se ttsaroa eii los éo&i tsiét&áom TEMPERATURA (°C) TIEMPO (seg) N° DE CICLOS 57 Material y Métodos 3,2.2.1.- COíüíCESJTIRaCléW MMIMA meSBITOSIA DE 2,2'- DEFlfMIBlfL La capacidad de crecimiento de cepas de Hqfhia alvei bajo condiciones restrictivas de hierro mediante la adición al medio de cultivo (BHI agar) de un quelante del hierro, el 2,2'dip3rridyl (Sigma), valoró la dependencia del hierro para la actividad metabóUca de H. alvei, determinándose así la concentración mínima del quelante que es capaz de inhibir el crecimiento bacteriano (CMI). Se preparó BHI agar con concentraciones decimales crecientes de 2,2'dipyridyl, desde 0,2 hasta 10 mM, observando la mínima concentración del quelante que era capaz de inhibir el crecimiento bacteriano de las diferentes cepas de Hafrda alvei tras una incubación durante 24-48 horas a 37"C. 3,2.2.2.- PMODÜCCEOEJ ®® SEB®M®FOM©e La producción de sideróforos por parte de las diferentes cepas de H. alvei se analizó mediante el medio de cultivo descrito por B. SCHWYN y JB. NEILANDS (1987). El método que hemos utilizado es el universal para la detección de sideróforos, basándose en el cambio de color que experimenta el medio CAS agar (Chrome Azurol S) al producirse una disminución en el contenido del hierro presente en el medio, ya que está siendo utilizado por el metabolismo de la cepa bacteriana que está 58 Mateñáí y Métodos suero problema y el suero control. La viabilidad, para el suero problema se determinó inmediatamente (a tiempo cero) y 1, 2 y 3 horas tras la incubación, mientras que para el suero control se determinó a tiempo cero, 1 y 3 horas. Después de mezclar, las muestras se düuyen seriadamente, y se Uevan sobre BHI agar para realizar el contaje directo tras la incubación. Según la viabilidad bacteriana, los niveles de resistencia al efecto bactericida del suero que presenta cada cepa se representaron en una gráfica, donde el eje de las "y" representa el % de viabilidad, y el eje de las "y el tiempo transcurrido de incubación. Cada cepa fue analizada por triplicado, considerándose resistentes al efecto bactericida del suero aquellas cepas que tras 3 horas de incubación mostraban un porcentaje de viabilidad superior al 100% (DAVIES, 1991), respecto al inócvdo inicial. 65 Material y Métodos Para nuestro estudio hemos utilizado la dorada (Sparus aurata, L.). Los peces eran ejemplares de aproximadamente 15 gramos procedentes de la empresa ADSA, S.A. situada en la localidad Juan Grande del sur de la Isla de Gran Canaria, siendo transportados al laboratorio en lotes pequeños para evitar el estrés en tanques con oxígeno puro mediante difusores. Los animales fueron mantenidos en tanques de 100 litros en circuito cerrado con cambios parciales de agua cada 2 días con aireación del agua mediante difusores durante vin periodo de 10 días para su aclimatación previa a los ensayos, comprobándose la ausencia de algún signo que hiciera sospechar el desarrollo de alguna enfermedad. Durante este periodo se seleccionaron aleatoriamente algunos de estos animales y se comprobó que estaban libres de patógenos mediante análisis microbiológico de sus órganos internos. 3.3.2.- BETEMEÍIMACIÓBÍ PE LA ©OBIS LMTM, S® (¡©LSD)} Con la finalidad de conocer la susceptibilidad de la dorada frente a Hqfhia alvei realizamos experiencias de dosis letal 50 para determinar la respuesta de la dorada frente a una infección aguda frente a distintas cepas de esta bacteria. Los peces se mantuvieron en tanques de 30 litros a 18-21°C con aireación constante mediante difusores aumentados por un compresor de aire. Durante la experiencia los animales se 66 Material v Métodos mantuvieron en circuito cerrado con cambios parciales de agua cada dos días. Para cada cepa estudiada se hacen siete lotes de 8 peces cada uno, los cuales se corresponden con cada una de las diluciones seriadas de Hafnia alvei a utilizar en la experiencia de dosis letal 50 (de 10» hasta 102 ufe/pez) más un lote control. Cada cepa a utilizar se siembra en medio Infusión Cerebro Corazón líquido (Cultimed) y se deja en agitación a 22-25°C diirante 1824 horas para obtener un cultivo fresco en fase exponencial. Al cabo de ese tiempo se centrifuga el medio a 4000 r.p.m. durante 20 minutos, se retira el sobrenadante y el precipitado se lava dos veces con PBS. El precipitado obtenido se resuspende en la misma solución tampón, y se ajusta a una concentración final aproximada de 3x10^ u.f.c./ml por medio del espectrofotómetro Spectronic 20D. A partir de aqm, se hacen diluciones seriadas decimales hasta una concentración de 3x103 u.f.c./ml. De cada una de estas diluciones hemos sembrado vina alícuota en BHI agar para contabilizar y conocer el número exacto de ufc/ml en cada caso. Cada lote recibe 0.1 mi de una suspensión bacteriana a concentraciones decrecientes desde 10^ hasta 10^ ufc/ml en el procedimiento de inoculación vía intraperitoneal, mientras que los ocho peces del grupo control se inocularon con 0.1 mi de PBS por la misma vía. 67 Material y Métodos Las cepas de Hafhia alvei utilizadas en la inoculación experimental para determinar su DLsoen dorada fueron un total de siete: 2566/83, OR-1/96, 187/95, 1967/82, C34/90, Xl/96 y F4319/95. Los datos sobre el origen y procedencia de estas cepas pueden apreciarse en la Tabla 1. Hemos seleccionado estas cepas por cumplir uno o varios de los siguientes motivos: 1) haber sido aisladas en el Archipiélago Canario (187/95), 2) haberse aislado a partir de peces enfermos o no enfermos (2566/83 y C34/90), y 3) comprobada virulencia previa en peces (Xl/96, OR-1/96, 1967/82 y F4319) (RODRÍGUEZy cois., 1998). Para el cálculo de la DL50 seguimos la metodología descrita anteriormente por JL.REED y M.MUENCH (1938), expresando su valor la dosis de Hafhia alvei capaz de matar al 50% de los peces inoculados. Para la determinación de la DL50, primero se calcula la distancia proporcional (DP), para posteriormente, y mediante la fórmula x = logaritmo de la dosis que mata más del 50% - DP, determinar la DL50 como 10^^, siendo la DP: %mortalidad >50% -50% DP = % mortalidad >50% - %mortalidad La mortalidad de los peces fue tenida en cuenta hasta quince días después de que cesaran las rauertes de todos los grupos inoculados. Los peces inociilados y los peces control que tuvieron que ser sacrificados al final de la fase experimental fueron mantenidos a temperatura de refrigeración y sometidos a necropsia reglada, y seguidamente se obtuvieron muestras para su posterior estudio microbiológico, histopatológico e inmunohistoquímico. 68 Material v Métodos 3.3.3.-. mOCULACIOM DE HAFMM ALWFJ. FAKA ISDIJCIR ÜMA mFECCIÓM CRÓMICA Con la finalidad de conocer las consecuencias epidemiológicas y patogénicas de la infección de curso crónico de esta especie bacteriana en dorada realizamos varias experiencias de inoculaciones experimentales. Utilizamos doradas con un peso aproximado de 15 gramos. Los peces se mantuvieron en tanques de 100 litros a 18-21°C con aireación constante mediante difusores alimentados por un compresor. También en este caso los peces se mantuvieron con un circuito cerrado, realizando cambios parciales de agua cada dos días. Para cada cepa estudiada hicimos 6 lotes de 25 peces cada uno, de los cuales 3 se inocularon con una suspensión bacteriana de Hafrúa alvei a una concentración lO^-lO^ufc/pez, mientras que los otros 3 lotes correspondían a los peces controles. La inoculación se hizo de la siguiente manera: un lote con una sola inoculación al comienzo de la experiencia (a tiempo cero), otro lote con dos inoculaciones a un intervalo de 15 días entre una inocxüación y la siguiente (a tiempo cero y día 15), y el tercer lote mediante 3 inoculaciones separadas con 4 días entre una y otra (a tiempo cero, día 4 y día 8). Los tres lotes del grupo control se inocularon con el mismo procedimiento pero con PBS estérü y fueron mantenidos en las mismas condiciones que los peces inoculados con la bacteria hasta el final de la experiencia (TESHIMA y cois., 1992). Cada cepa a utilizar se sembró en medio BHI Agar (Cultimed) y se incubó en agitación a 22-25°C durante 18-24 horas para obtener un cultivo fresco en fase exponencial. Al cabo de ese tiempo centrifugamos 69 Material y Métodos el medio a 4000 r.p.m. durante 20 minutos, retiramos el sobrenadante y el precipitado se lavó dos veces con PBS. El precipitado obtenido lo resuspendimos en la misma solución tampón, y se ajustó a una concentración final aproximada entre 10^ y 10'^ u.f.c./ml. Cada pez experimental se inoculó con 0.1 mi de la suspensión bacteriana por vía intraperitoneal, mientras que los peces de los grupos control se inocularon con 0.1 mi de PBS utilizando la misma vía. Las cepas de Hafnia alvei utilizadas en la inoculación experimental para determinar la patogenicidad de Hafnia alvei en el curso crónico de la infección fueron tres: 2566/83, 187/95 y C34/90. Los datos sobre el origen y procedencia de estas cepas pueden apreciarse en la Tabla 1. Estas cepas las seleccionamos de todas las utilizadas en la experiencia anterior en función de haber sido aisladas de cuadros de enfermedad en peces (2566/83 y C34/90) o haberla aislado directamente en nuestras islas (187/95). Para la determinación del grado de patogenicidad de Hafnia alvei en dorada en una infección experimiental de curso crónico seguimos la metodología descrita anteriormente por C.TESHIMA y cois. (1992). La posible mortalidad de los peces inoculados fue evaluada entre 1-90 días postinoculación. Los peces inoculados y los testigos, que tuvieron que ser sacrificados al final de la fase experimental, fueron mantenidos a temperatura de refiigeración y sometidos a necropsia reglada, y seguidamente se obtuvieron muestras para su posterior estudio microbiológico, histopatológico e inmunohistoquímico. 70 Material y Métodos 3.3.4.- ESTUDIO AMATOMOPATOLOG'ICfS Para el análisis anatomopatológico se tomaron muestras de riñon, hígado, bazo, intestinos y sistema nervioso, que fueron fijadas en solución tamponada de formol al 10%, embebidas en parafina y posteriormente cortadas con el microtomo en láminas de unas 4 pm. A continuación se procedió a la tinción de los cortes histológicos con hematoxüina-eosina para su estudio histopatológico. Esta fase fue realizada en coordinación con la Unidad de Anatomía Patológica de la Facultad de Veterinaria de Las Palmas de Gran Canaria. La evaluación de la intensidad de la reacción inflamatoria encontrada se hizo atendiendo a que los campos visualizados mostraran aproximadamente un 100% (muy intensa), 50-75% (intensa), 25-50% (ligera) y menos del 25% de reacción (muy ligera), respectivamente. 3.3.5=- ESTUDIO IMBKJMOHISTOQniMICO De todas las técnicas inmunohistoquímicas existentes, la peroxidasa-antiperoxidasa (PAP) según describen J. MARTÍN DE LAS MULAS y cois. (1990) fue la técnica de elección a la hora de realizar dicho estudio con las adaptaciones descritas por F. AcosTA y cois. (2002) a partir de las muestras tomadas en las experiencias anteriores de infección aguda o crónica de dorada con Hafnia alvei. La finalidad fue demostrar la presencia de Hafnia alvei en estos tejidos con independencia de las lesiones encontradas. Para ello tuvimos que elaborar previamente un antisuero policlonal anti-Hafnia alvei. 71 Material y Métodos La obtención del antisuero policlonal anti-Hafiíia alvei se realizó según la metodología descrita por E. HARLOW y D. LAÑE (1988) y F. AGOSTA y cois. (2002), utilizándose 2 conejos de unos 2 Kg de peso de raza caUfomiana, procedentes de una explotación con ion alto nivel sanitario. La granja corresponde a un colectivo que desparasita y vacuna sus ejemplares periódicamente frente a mixomatosis, enfermedad vírica hemorrágica y enterotoxemia. Ambos animales fueron adaptados a nuestro animalario y periódicamente inspeccionados para garantizar su buen estado de salud previo a la inmunización durante dos semanas. A cada animal se le administró 2 mi de un inoculo compuesto por Iml de una suspensión de Hafnia alvei inactivada y 1 mi de Ad3aavante de Freund incompleto (Sigma). La suspensión inactivada de Hafnia alvei se realizó con un cultivo en el medio BHI líquido (Cultimed) de la cepa de Hafnia alvei 187/95, a 37°C durante 24 horas con agitación continua y suave. Posteriormente se lavó dos veces la suspensión bacteriana centrifugando el medio a 3000 rpm durante 5 minutos, retiramos el sobrenadante y resuspendemos el centrifugado en PBS. Finalmente, tomamos el centrifugado y se resuspende en PBS adicionándole un 5°/oo de formol e incubando durante 24 horas a 37°C para inactivar las bacterias. A las 24 horas tomamos una alícuota de la suspensión y la sembramos en un Agar Sangre (Cultimed) a 37°C durante 24 horas para garantizar la inexistencia de bacterias vivas. Cada conejo recibió los 2 mi del inoculo (Iml de la suspensión de Hafnia alvei inactivada y 1 mi de Ad3ruvante de Freund incompleto) repartidos en 10 puntos de inyección subcutánea por diversas zonas del cuerpo. 72 Material v Métodos Tras 5 semanas desde la primera inoculación, se les aplicó una segunda dosis con el mismo inoculo, para provocar así una buena hiperinmunización. A los 15 días de esta segunda inoculación se procedió a la sangría completa de los conejos (previamente anestesiados medíante la aplicación subcutánea de una solución compuesta por 0.2 mi de acepromacina y 0.4 mi de ketamina) por punción cardíaca. Una vez obtenida la sangre se centrifugó a 3000 rpm durante 5 minutos, y el suero se conservó a -80"C para ser usado en el estudio imnunohistoquímico. El procesado de las secciones de los órganos para el anáüsís inmunohistoquimico comienza con el desparafinado de las muestras sometiéndolas a baños de xüol en tres pases de 10, 5 y 5 minutos respectivamente. Posteriormente se sumergen en una solución de alcohol al 100% y se procede al bloqueo de la peroxidasa endógena sumergiendo las secciones de los órganos en una solución de metanol absoluto con un 3% de peróxido de hidrógeno durante 30 minutos. Tras este periodo se somete a las secciones a baños de 5 minutos en alcohol de graduación decreciente (100%, 96% y 70% respectivamente). Las secciones posteriormente se aclaran en agua destilada (2 pases) y PBS durante 5 minutos antes de someterlas a la acción de la pronasa al 0.1% durante 10 minutos. Posteriormente, las secciones se someten a baño en PBS durante otros 5 minutos. Tras el baño con PBS se somete a los tejidos a la acción de suero normal de cabra al 10% en PBS durante 30 minutos para posteriormente exponerlos durante toda la noche al anticuerpo primario, 73 Material y Métodos que en este caso es el antisuero policlonal anti-Hafnia alvei obtenido de los conejos. Este antisuero policlonal, a titulo 1:500, se encontraba a su vez diluido en suero normal de cabra al 10% en PBS. A la mañana siguiente, las secciones se aclaran 3 veces durante 5 minutos cada una en PBS, para posteriormente incubarlas 30 minutos en el anticuerpo secundario (anticuerpos biotinilados frente a IgG de conejo obtenidos en cerdo a titulo 1:200) diluido en suero normal de cabra al 10%. Después de aclarar tres veces durante 5 minutos con PBS las secciones fueron expuestas al anticuerpo terciario (complejo avidinabiotina) durante 60 minutos en oscuridad y temperatura ambiente. Tras esta incubación se someten a las secciones a dos baños de 5 minutos en PBS y uno de acetato buñer durante 10 minutos. Tras estos pasos se procede al revelado con 3-amino-9-etilcarbazol (Sigma) durante 5 minutos en agitación suave. Después de este proceso se lava durante 5 minutos en agua corriente y se sumergen las secciones durante 5 minutos en una solución de Hematoxilina de Mayer. Tras unos lavados de 10 minutos en agua destilada y agua corriente, se procede al montaje de las secciones en medio acuoso (Irmnumount; Shandon, Pittsburgh, PA). Tejido hepático de aves infectadas de forma natural y de ratones infectados de forma experimental con la cepa de Hajrúa alvei 187/95 fueron usados como controles positivos. Los controles negativos 74 Resultados Figura 4.- Porcentaje de las cepas de Hafnia alvei encuadradas en los diferentes grupos por su comportamiento frente a 2,2'-dipyridyl presente en el medio DGRUPO I D GRUPO IV GRUPO II D GRUPO GRUPO V 17% 66% 80 Resultados 4.1.2.2.-PRODUCCIÓN DE SIDERÓFOROS Tras el ensayo realizado según la metodología anteriormente descrita por B. SCHWYN y JB. NEILANDS (1987), el 100% de las cepas de Hafnia alvei analizadas produjeron una reacción positiva en el medio Chrome Azurol S agar por medio del viraje de coloración de azul hacia un halo amarillo alrededor de cada cepa de Hafnia alvei analizada, evidenciándose así la capacidad de captación de hierro del medio mediante la producción de sideróforos (Figura 5). Podemos de esta forma asegurar que todas las cepas de Hafnia alvei probadas producen algún tipo de sideróforo en el medio. Figura 5.- Imagen de la producción de sideróforos Una vez detectada la capacidad de síntesis de sideróforos por parte de cada una de las cepas de Hafnia alvei, se procedió al análisis individual de cada cepa para determinar si alguna de estas cepas era 81 Resultados capaz de sintetizar aerobactina y/o enterobactina, dos tipos de sideróforos producidos por enterobacterias relacionados con aumento en la virulencia de las cepas. Ninguna de las 23 cepas de Hafnia alvei analizadas (100%) demostró la capacidad de sintetizar aerobactina o enterobactina. Los controles positivos y negativos representados por las cepas K311 (control positivo para la producción de aerobactina), W112 (control negativo aerobactina), cepa 390 (control positivo para la producción de enterobactina) y la cepa H1887 (control negativo de enterobactina) dieron los resultados esperados. 4.1.3.- PRODUCCIÓN DE HEMOLISIS Ninguna de las titulaciones realizadas de los diferentes sobrenadantes de las 23 cepas de Hafnia alvei empleadas hemoUzaron los hematíes de dorada. En el caso de los hematíes de trucha arcoiris los resultados fueron los mismos al no producirse la hemolisis de los eritrocitos de trucha. En ambos casos, estos resultados los obtuvimos tanto tras la incubación a 18°C como a 25"C. La cepa empleada como control positivo, Aeromonas hydrophyla J7, produjo hemolisis hasta la titulación V4 de su sobrenadante. 82 Resultados 4.1.4.- EEMAGLUTIMACION FRENTE A ERITROCITOS DE COBAYA, DORADA Y TRUCHA ARCOIRIS El efecto hemaglutínante de las cepas probadas frente a eritrocitos de cobaya, dorada y trucha arcoiris fue muy similar con pequeños matices de diferencia, aunque la hemaglutínación resultó ser más sensible cuando se utüizaron hematíes de cobaya. La hemaglutínación de eritrocitos de cobaya sensible a la mañosa (MSHA) fue detectada en las cepas ATCC 13337, LM 11/69, 4256/83, 1967/82, LM 7/67, LM 24/65, F4319, LM 7/68 y OU-4, representando el 39% de las cepas de Hafnia alvei analizadas (Tablas 4 y 13), por lo que hemos considerado en estas cepas la presencia de las fimbrias pili típo I. En la experiencia de detección del pili tipo III, la resistencia a la hemaglutinación de hematíes de cobaya con un tratamiento previo de ácido tánico con la adición de un 4% de mañosa (MRHA) se evidenció en las cepas 4256/83, 1967/82, LM 7/67, LM 24/65, LM 7/68 y LM 11/69, representando un 26% del total de cepas de Hafnia alvei analizadas (Tablas 4 y 13). Como se observa en la tabla 4 en casi todas las cepas en las que detectamos el pili típo III habíamos encontrado también el tipo I, salvo en las cepas ATCC 13337, F4319 y OU-4. De una forma similar a los resultados expuestos, en la experiencia realizada con hematíes de dorada la hemaglutinación sensible a mañosa soló fue observada en las cepas 4256/83, 1967/82 Resultados y LM 7/67, representando el 13% de total de cepas analizadas (Tabla 4). En la experiencia con hematíes de trucha arcoiris, sólo la cepa 4256/83 produjo una hemaglutinación sensible a la presencia de la mañosa (Tabla 4). En la experiencia realizada con hematíes de dorada previamente tratados con el ácido tánico, la hemaglutinación resistente a la mañosa soló fue observada en las cepas 4256/83 y LM 24/65 representando el 8.6% de total de cepas analizadas (Tabla 4). En esta misma experiencia con hematíes de trucha arcoiris, ninguna cepa produjo una hemaglutinación resistente a la mañosa (Tabla 4). 84 Resultados Tabla 4.- HeraLagiutis^ación de las cepas de Hafnia alvei con eritrocitos d® cobaya, dosada y traclaa asrcoisis ':--v'^^m^f:^f'pwms&mmmsm CEPA MSHA MRHA MSHA MRHA MSHA MRHA 187/95 C34 2556/83 ATCC 13337 XI LM 14/57 LM 30/65 LM 25/55 OR-1 ATCC 9750 4094/83 4256/83 1967/82 842/81 LM 7/67 LM 24/65 LM 23/65 F4319 LM 19/58 LM 7/68 OU-3 OU-4 LM 11/59 MSHA.- HEMAGLUTINACION SENSIBLE A MAÑOSA MRHA..- HEMAGLUTINACION RESISTENTE A MAÑOSA (+) HEMAGLUTINACION POSITIVA (-) HEMAGLUTINACION NEGATIVA 85 Resultados 4.1.5.- EFECTO BACTERICIDA DEL SUERO DE DORADA Los resultados de la sensibilidad de las 23 cepas de Hafnia alvei analizadas frente al efecto bactericida del suero se pueden observar en las Tablas 5 a 8. Los resultados se expresan como porcentaje de bacterias viables de la cepa analizada en las dos temperaturas de incubación utilizadas. En ambos casos se representan a su vez los controles de cada una de las experiencias. Los resultados muestran el valor medio de cada lectura, que fue realizado por triplicado. Según la interpretación de RL. DAVIES (1991), únicamente se considera a una cepa resistente al efecto bactericida del suero cuando tras 3 horas de incubación presenta un porcentaje de viabilidad superior al 100%. De aquí que sólo dos cepas clínicas de Hafnia alvei 187/95 (Tabla 5 y 13) y 4256/83 (Tabla 6 y 13) fueron resistentes al efecto bactericida del suero a las dos temperaturas analizadas (18 y 25°C), representando un 8.7% del total de las cepas analizadas. Sin embargo, las cepas de colección LM 23/65 (Tabla 7 y 13), LM 25/65 (Tabla 6 y 13), LM 24/65 (Tabla 7 y 13), LM 19/68 (Tabla 8 y 13) y F4319 (Tabla 7 y 13) sólo fueron resistentes a la temperatura de 25''C, representando el 21.7% del total de las cepas analizadas, que junto a las cepas 187/95 y 4256/83 (resistentes a ambas temperaturas), hacen que un total del 30.4% de las cepas sea resistente al efecto bactericida del suero de dorada a la temperatura de 25°C. De las tres cepas utilizadas en la experiencia de infección experimental crónica, la cepa 187/95 es la que presenta una mayor 86 Resultados resistencia al efecto bactericida del suero de dorada con índices de viabilidad a las tres horas del 101.2% a 18°C y 142.5% a 25°C (Tabla 5). La cepa 2566/83 presenta una sensibilidad intermedia a la acción del complemento del suero puesto que tras tres horas de incubación, el porcentaje de bacterias viables se situó en el 37.6% a 18°C y 52% a 25°C (Tabla 5). Por el contrario, la cepa C34 muestra una elevadísima sensibilidad a la acción del complemento del suero de dorada puesto que la viabilidad se sitúa a las citadas temperaturas en el 9.7% y 5.3%, respectivamente (Tabla 5). De las cepas empleadas en la experiencia de infección aguda, la única que presenta resistencia al efecto bactericida del suero a las dos temperaturas analizadas es la cepa 187/95 ya mencionada anteriormente, mientras que la cepa F4319 sólo presentó resistencia al citado efecto a la temperatura de 25°C con un nivel de bacterias viables del 134.4%, mientras que a 18°C el índice se situó en el 61.5% (Tabla 7). Por el contrario, con una sensibilidad intermedia están la cepa 2566/83 ya mencionada anteriormente, así como la XI, ésta última con unos índices de viabilidad del 47% a 18°C y 57.5% a 25''C (Tabla 5), la cepa OR-1 que muestra unos valores de 33.8% y 64.6%, respectivamente (Tabla 6) y la cepa 1967/82 con unos valores de viabilidad del 19.1% y 49%, respectivamente (Tabla 7). La otra cepa empleada en el estudio de la infección aguda por Hafnia alvei en dorada (cepa C34, ya citada) presentó una elevada sensibüidad al efecto bactericida del suero de la dorada. 87 Resultados De las cepas no empleadas en las experiencias de inoculación, las que presentaron resistencia al efecto bactericida del suero a la temperatura de 18° y/o 25°C fueron la LM 25/65 (Tabla 6), 4256/83 (Tabla 6), LM 24/65 (Tabla 7), LM 23/65 (Tabla 7), y la cepa LM 19/68 (Tabla 8), cuyos resultados se reflejan con exactitud en las tablas correspondientes. Por el contrario, mostraron sensibilidad al efecto bactericida del suero de dorada haciendo la lectura a 18 y a 25°C las cepas LM 11/69 (Tabla 8), OU-4 (Tabla 8), OU-3 (Tabla 8), LM 7/68 (Tabla 8), 842/81 (Tabla 7), LM 30/65 (Tabla 6), 4094/83 (Tabla 6), LM 7/67 (Tabla 7), LM 14/67 (Tabla 5), ATCC 13337 (Tabla 5) y ATCC 9760 (Tabla 6 ). Haciendo la lectura a 25°C el suero control se comportó, como era de esperar, con unos valores similares a una cepa que diera resistencia frente al suero, lo cual nos permite ratificar los resultados obtenidos con todos los sueros problemas a esta temperatura, mientras que haciendo la lectura tras la incubación a 18°C, algunos sueros control no alcanzaron el límite superior del 100% que representaria el nivel de resistencia frente al suero problema. A modo de resumen hemos agrupado el global de cepas analizadas en tres modelos diferentes de resistencia al efecto bactericida del suero de dorada que expresan gráficamente lo ocurrido a lo largo de las tres horas de duración de la experiencia (Figuras 6 a 8). El modelo I agrupa a todas aquellas cepas que presentan resistencia al efecto bactericida del suero de dorada medido a 25°C (porcentaje de viabüidad a las tres horas superior al 100%), mientras 88 Resultados que los modelo II y III agrupan cepas de Hafnia alvei con diferente grado de sensibilidad, incluyendo el modelo II a cepas con sensibilidad intermedia (viabilidad entre el 100 y el 20%), mientras que en el modelo III se incluyen aquellas cepas de Hafnia alvei con elevada sensibilidad al efecto bactericida del suero de dorada (viabilidad inferior al 20%). 89 Resultados 4.1.6.- EFECTO BACTERICIDA DEL SUERO DE TRUCHA ARCOIRIS En los experimentos realizados con el suero de trucha arcoiris, la resistencia al efecto bactericida del suero fue mayor que en el caso de la experiencia con suero de dorada. Las cepas de Hafnia alvei que presentaron resistencia a dicho efecto en la lectura realizada a las temperaturas de 18 y 25°C fueron la 2566/83 (Tabla 9 y 13), ATCC 9760 (Tabla 10 y 13), 4094/83 (Tabla 10 y 13), LM 24/65 (Tabla 11 y 13), F4319 (Tabla 11 y 13), LM 14/67 (Tabla 9 y 13) y LM 7/68 (Tabla 12 y 13), representando un 30,4% del total de cepas analizadas, mientras que las cepas 1967/82 (Tabla 11 y 13), 842/81 (Tabla 11 y 13) y LM 19/68 (Tabla 12 y 13) sólo fueron resistentes a la temperatura de 25°C, representando un total del 43,4% de cepas resistentes a la temperatura de 25°C. De las tres cepas utilizadas en la experiencia de infección crónica en dorada, la cepa 2566/83 es la única que presenta resistencia al efecto bactericida del suero de trucha con índices de viabilidad a las tres horas del 124.7% a 18°C y 175.2% a 25''C (Tabla 9). La cepa 187/95 presenta una sensibilidad intermedia al suero de trucha ya que tras tres horas de incubación, la viabilidad se sitúa en el 40.3% a 18"C y 56% a 25''C (Tabla 9). Al igual que ocurre en la experiencia con suero de dorada, la cepa C34 presenta una elevadísima sensibilidad a la acción del complemento del suero de trucha arcoiris puesto que la viabilidad se sitúa por debajo del 0.1% para ambas temperaturas (Tabla 9). 96 Resultados De las cepas empleadas en la inoculación experimental para la determinación de la dosis letal 50 (DL50) en dorada, las cepas F4319, y 2566/83 presentaron resistencia al efecto bactericida del suero a las dos temperaturas analizadas, mostrando la última citada una viabilidad del 124.7% y del 175.2 %, respectivamente (Tabla 9), y del 138.9% y 172.9% la cepa F4319 (Tabla 11), mientras que la cepa 1967/82 sólo presentó resistencia a la temperatura de 25°C con una viabilidad del 151.9% (Tabla 11). Por el contrario, las cepas XI (5.1 y 0.5%, respectivamente) (Tabla 9), OR-1 (6.6 y 6.6%, respectivamente) (Tabla 2), y C34 (0.1 y 0.1%, respectivamente) (Tabla 9) mostraron una elevadísima sensibilidad, mientras que la otra cepa empleada en este estudio (187/95), presentó una sensibilidad intermedia, con una viabilidad del 40.3 y 56% (Tabla 9). De las cepas no empleadas en las experiencias de inoculación experimental en dorada para determinar la DL50, las que presentaron resistencia al efecto bactericida del suero de trucha arcoiris a las dos temperaturas empleadas fueron las cepas LM 7/68 (Tabla 12), LM 14/67 (Tabla 9), 4094/83 (Tabla 10), ATCC 9760 (Tabla 10) y LM 24/65 (Tabla 11), mientras que las cepa 842/81 (Tabla 11) y LM 19/68 (Tabla 12) sólo lo fueron a la temperatura de 25°C . Por el contrario, mostraron una sensibilidad intermedia a las dos temperaturas las cepas ATCC 13337 (Tabla 9), 4256/83 (Tabla 10) y OU-3 (Tabla 12), mientras que con una elevada sensibüidad a ambas temperaturas se encuentran las cepas LM 30/65 (Tabla 10), LM 25/65 (Tabla 10), LM 7/67 (Tabla 10), LM 23/65 (Tabla 11), OU-4 (Tabla 12) yLM 11/69 (Tabla 12). 97 Resultados Al igual que con la experiencia realizada con suero de dorada, hemos agrupado al global de cepas en tres diferentes modelos de resistencia al efecto bactericida del suero de trucha arcoiris que expresan gráficamente lo ocurrido a lo largo de las tres horas de duración de la experiencia (Figuras 9 a 11). El modelo I agrupa a todas aquellas cepas que presentan resistencia al efecto bactericida del suero de trucha medido a 25°C (viabilidad superior al 100%), mientras que los modelo II y III agrupan cepas de Hafnia alvei con diferente grado de sensibilidad, incluyendo el modelo II a cepas con sensibilidad intermedia (viabilidad entre el 100 y el 20%), mientras que en el modelo III se incluyen aquellas cepas de Hafnia alvei con elevada sensibilidad al efecto bactericida del suero de dorada (viabilidad inferior al 20%). 98 Resultados Tabla 9.- Resistencia ai efecto bactericida del sueiro de trucha arcoirls de las cepas 187/95, C34, 2S66/83, ATCC 13337, XI, LM 14/67 y LM 30/65, raiedido como porcentaje de viabilidad en diferentes tien&pos de incubación. UNA HORA DOS HORAS TRES HORAS UNA HORA DOS HORAS TRES HORAS UNA HORA DOS HORAS TRES HORAS UNA HORA DOS HORAS TRES HORAS UNA HORA DOS HORAS TRES HORAS UNA HORA DOS HORAS TRES HORAS CEPA 187/95 C34 2566/83 ATCC 13337 XI LM 14/67 18° SUERO PROBLEMA 50.4 48.7 40.3 15.5 0.2 0.1 112.5 122.4 124.7 91.6 58.4 59.5 98.6 21.7 5.1 55.1 67.3 129.9 C SUERO CONTROL 125.4 156.9 91.9 111.6 137.7 208.1 120.3 132.9 99.9 109.3 98.6 192.9 25° C SUERO PROBLEMA 64.9 67.2 56 31.1 2± 0.1 109.2 141.07 175.24 73.3 32 26.9 8.6 2.1 0.5 63.2 97.9 157.3 SUERO CONTROL 132.2 399.9 145.5 272.7 187.9 310.94 147.8 469.9 107.9 433.3 134.3 222.4 99 Resultados Tabla 10.- Resistencia al efecto bactericida del suero de trucha arcoiris de las cepas las cepas LM 25/65, ORÍ, ATCC 9760, 4094/83, 4256/83 y 1967/82, medido como porcentaje de viabilidad en diferentes tiempos de incubación. UNA HORA DOS HORAS TRES HORAS UNA HORA DOS HORAS TRES HORAS UNA HORA DOS HORAS TRES HORAS UNA HORA DOS HORAS TRES HORAS UNA HORA DOS HORAS TRES HORAS UNA HORA DOS HORAS TRES HORAS CEPA LM 30/65 LM 25/65 OR-1 ATCC 9760 4094/83 4256/83 18" SUERO PROBLEMA 47.9 6.8 0.1 54.4 40.8 19 28.6 9.9 6.6 116.4 141.4 161.7 114.9 124.9 167.7 79.7 68.3 56.9 C SUERO CONTROL 118 155.5 83.6 111.1 99.9 104.9 170.3 279.3 166.7 257.8 93.8 115.2 25° C SUERO PROBLEMA 80.2 43.1 6.9 29.9 14.2 „,„-„.ié¿_„. 15.3 9.3 6.6 114.83 165.52 258.1 50.2 113.8 182.4 76.8 38.4 79.7 SUERO CONTROL 141.34 160.3 141.6 285.7 166.6 213.3 236 570.3 149.6 273.4 142.5 247.6 100 Resultados Tabla 11.- Resistencia al efecto bactericida del suero de trucha arcoiris de las cepas 842/81, LM 7/67, LM 24/65, LM 23/65, F4319, LM 19/68 y LM 7/68, medido como porcentaje de viabilidad en diferentes tieraapos de incubación. 1 1 UNA HORA DOS HORAS TRES HORAS UNA HORA DOS HORAS TRES HORAS UNA HORA DOS HORAS TRES HORAS UNA HORA DOS HORAS TRES HORAS UNA HORA DOS HORAS TRES HORAS UNA HORA DOS HORAS TRES HORAS CEPA 1967/82 842/81 LM 7/67 LM 24/65 LM 23/65 F4319 18° SUERO PROBLEMA 72.8 70.1 62.2 71.4 70.1 85.9 2.3 0.9 0.1 139.3 150.3 153.1 7.6 1.2 0.8 120.9 98.6 138.9 C SUERO CONTROL 90.4 120.4 107.5 121 61.9 67 212.4 357.2 103.2 124.1 135.8 274.7 25° C SUERO PROBLEMA 91,3 59.5 151.9 78.9 82.3 179.8 1.4 0.5 0.1 177.5 99.3 111.7 2.1 0.3 0.1 108.2 166.5 172.9 SUERO CONTROL 180.4 358.9 139.4 529.4 85.8 270.9 332.4 499.4 105.9 285.7 170.8 790.4 101 Resultados Tabla 12.- Resistencia al efecto bactericida del suero de trucha arcoiris de las cepas OU-3 LM 19/68, LM 7/68, OU-3, OU-4 y LM 11/69, medido como porcentaje de viabilidad en diferentes tiempos de incubación. UNA HORA DOS HORAS TRES HORAS UNA HORA DOS HORAS TRES HORAS UNA HORA DOS HORAS TRES HORAS UNA HORA DOS HORAS TRES HORAS UNA HORA DOS HORAS TRES HORAS CEPA LM 19/68 LM 7/68 OU-3 OU-4 LM 11/69 18" SUERO PROBLEMA 72.7 71.8 65.4 85.3 46.4 127.3 110 59.3 53.7 7.6 0.1 0 18.4 0.2 0.1 C SUERO CONTROL 79.9 117.2 104.1 182.4 156.2 187.5 94 153.8 73.8 98.4 25° C SUERO PROBLEMA 84 100.8 104.5 146.6 119.1 172.3 80.6 51.8 27.5 6.1 3 0.1 51.6 2.4 0.1 SUERO CONTROL 129 332.6 171.6 447.9 192.5 286.8 153 223.4 159.9 246.1 102 Resultados Figura 9.- Modelo I de resistencia al efecto bactericida del suero de trucha arcoiris (cepas 2566/83, LM 14/67, ATCC 9760, 4094/83, LM 24/65, F4319, 1967/82, 842/81, LM 19/68 y LM 7/68) (A (0 •^ (U 4-» u (Q A 0) •O <u (Q c V o ^ 0 Q. O 3 -o c — "w o «•« o 0) a tfi 0) c o u m u c 400 MODELO I Horas SUERO PROBLEMA SUERO CONTROL Figura 10.- Modelo O de resistencia al efecto bactericida del suero de trucha i arcoiris (cepas 187/95, ATCC 13337, 4256/83 y OU-3) 1 lA (0 ^ «> 4-' u 10 JQ 0) 0) tu ' c i) u ^ o Q. O 3 O •O c 75 o 4-» o 0) a. i/> (U c o U _ (Q O c •^ MODELO Horas SUERO PROBLEBIA SUERO CONTROL 103 Resultados Figura 11.- Modelo III de resistencia al efecto bactericida del suero de trucha arcoiris (cepas C34, XI, LM 7/67, LM 23/65, LM 25/65, ORÍ, LM 30/65, OU-4 y LM 11/69) (A (0 •^ 0) o (Q SI O •O 9) fíS c 0) o ^ o o. o 3 o c — 15 o 4^ U V o. l/> V ki c o u ^_ ca u c 100& 100MODELO III Horas SUERO PROBLEMA SUERO CONTROL 104 Resultados TABLA 13.- RESUMEM DE EXPRESIÓN DE FACTORES DE VIRULENCIA DE HÁFMIA ALVEIEE LAS CEPAS DE NUESTRO ESTUDIO 187/95 2566/83 C34 ATCC 13337 XI LM 14/67 GES EAE ENTEROBACrraA AEROBACrraA HEMOLISIS** MSHA*** MHHA*** RESISTENCIA SUERO* LM 30/65 LM 25/65 ORÍ ATCC 9760 4094/83 4256/83 GEN CAS BNTEROBACTINA AEROBACTINA HEMOLISIS** MSHA*** MRHA*** RESISTENCIA SUERO* 1967/82 842/81 LM 7/67 LM24/65 LM 23/65 F4319 GEN£A£ ENTEROBACTINA AEROBACTINA HEMOLISIS** MSHA*** MRHA*** RESISTENCIA SUERO* LM 19/68 LM 7/68 OU-3 OU-4 LM 11/69 GESBAE ENTEROBACTINA AEROBACTINA HEMOLISIS** MSHA*** MRHA*** RESISTENCIA SUERO* *RESISTEWCIA AL SUERO.- MEDIDA A 25-0 EN SUERO DE DORADA ** HEMOLISIS.- MEDIDA CON HEMATÍES DE DORADA ***MSHA Y MRHA.- MEDIDA CON HEMATÍES DE COBAYA 105 Resultados hígado y riñon anterior con presencia de abundantes bacterias intracelulares detectadas por la técnica inmunohistoquímica (Figura 15). Tras 3 meses de iniciada la experiencia se detecta una intensa reacción inflamatoria granulomatosa, con presencia de granulomas, en peritoneo e hígado, siendo positivos a la técnica inmunohistoquímica. En riñon medio, la presencia de inflamación granulomatosa no es tan intensa como en peritoneo e hígado. c) Inoculados tres veces, al inicio, 4° y 8" día de comenzada la experiencia. En los peces sacrificados a los 30 días de iniciada esta experiencia se observa una reacción inflamatoria granulomatosa muy intensa en peritoneo (Figura 16), hígado y riñon medio con gran presencia de bacterias intracelulares. En riñon medio se observan abundantes centros melanomacrofágicos positivos a la técnica inmunohistoquímica. 30 días más tarde los hallazgos son similares a los encontrados en los peces sacrificados anteriormente, con presencia de granulomas con bacterias en su centro. A los 90 días del comienzo de la experiencia se mantiene esa reacción inflamatoria granulomatosa muy intensa, con presencia de granulomas, localizada en hígado (Figura 17), mesenterio y riñon 112 Resultados medio, con importante presencia bacteriana detectada por la técnica inmunohistoquímica (Figura 18). 113 ^€J^ Resultados Tabla 15.- Resumen de los resultados microbiológicos, anatomopatológicos e inmunohistoquixnicos de los peces de la experiencia de infección crónica con la cepa 187/95 de Hafnia alvei. MUESTRBO («) 30 DÍAS 60 DÍAS 90 DÍAS 1 VEZ MP,H,R ttt IMC++ AISLAM + MP,H,R tt IMC++ AISLAM + MP,H,R tt IMC++ AISLAM + PBCBS INOCULADOS 2VECES MP,H,R ttt IMC++ AISLAM + MP,H,R ttt IMC++ AISLAM + MP,H ttt Rtt IMC++ AISLAM + - (a) Tiempo en que se realizó cada muestreo (en días p( - MP Reacción inflamatoria en mesenterio y/o peritoneo - H Reacción inflamatoria en hígado - R Reacción inflamatoria en riñon 3 VECES MP,H,R tttt IMC +++ AISLAM + MP,H,R tttt IMC +++ AISLAM + MP,H,R tttt IMC +++ AISLAM + jstinoculación] - Intensidad de la reacción: t muy ligera tt ligera ttt intensa tttt muy intensa - IMC Resultado de la técnica inmunohitoquímica - Intensidad de la respuesta: +ligera ++ intensa +++ muy intensa - AISLAM Aislamiento de la cepa de H. alvei probada en los peces de la experiencia 114 Resultados Experiencia de inoculación con la cepa 2566/83 a) Inoculados una sola vez al inicio de la experiencia Por lo general, en los peces inoculados con la cepa 2566/83, en el primer muestreo encontramos las mismas lesiones que en los peces inoculados con la cepa 187/95, si bien la reacción inflamatoria es menos marcada. A los 60 días postinoculación hay menor reacción inflamatoria que en los animales sacrificados a los 30 días, siendo las lesiones encontradas simüares a las observadas en los animales pertenecientes a la cepa 187/95 aunque de menor intensidad. En el último muestreo, las lesiones encontradas son simüares a las halladas en la cepa 187/95 aunque de menor intensidad. 115 Resultados b) Inoculados dos veces, al inicio y a los 15 días de comenzada la experiencia A los 30 días de iniciada la experiencia, el peritoneo apenas presenta reacción inflamatoria, siendo muy pocos los macrófagos con bacterias que se llegan a apreciar con la técnica inmunohistoquímica. La reacción inflamatoria presente en el hígado es menor que la que se apreciaba en la cepa 187/95. A los 60 días postinoculación las lesiones encontradas se limitan a unos pocos focos de inflamación granulomatosa localizados en el mesenterio, hígado y riñon positivos a la técnica inmunohistoquímica. En el último muestreo realizado (90 días postinoculación) se observa una ligera inflamación granulomatosa en peritoneo, hígado y riñon medio (Figura 19). Todas estas lesiones son positivas a la técnica inmunohistoquímica. 116 Resultados c) Inoculados tres veces, al inicio, 4° y 8° día de comenzada la experiencia A los 30 días de comenzada esta experiencia de inoculación experimental con Hafhia alvei con la cepa 2566/83, las lesiones son muy similares, aunque ligeramente inferiores, a las observadas en la cepa 187/95 en el mismo tiempo de muestreo. A los 60 días se observan pocas lesiones y apenas se detectan bacterias con la técnica de inmunohistoquímica. Al final de la experiencia (90 días) observamos una ligera reacción inflamatoria granulomatosa positiva a la inmunohistoquímica. 117 Resultados Tabla 16.- Resumen de los resultados microbiológicos, anatomopatológicos e inmunohistoquimicos de los peces de la experiencia de infección crónica con la cepa 2566/83 de Hafnia alvei. MUESTREO (>) 30 DÍAS 1 VEZ MP,H,R tt IMC + AISLAM + PECESINOCULADOS 2VECES MP,H,R tt IMC + AISLAM + 3 VECES MP,H,R ttt IMC++ AISLAM + 60 DÍAS MP,H,R t IMC + AISLAM + MP,H,R tt IMC++ AISLAM + MP,H,R tt IMC + AISLAM + 90 DÍAS MP,H,R t IMC + AISLAM+ MP,H,R tt IMC++ AISLAM + MP,H,R tt IMC + AISLAM+ - (a) Tiempo en que se realizó cada muestreo (en días postinoculación). - MP Reacción infiamatoría en mesenterio y/o peritoneo - H Reacción inflamatoria en hígado - R Reacción inQamatoria en riñon - Intensidad de la reacción: t muy ligera tt ligera ttt intensa tttt muy intensa - IMC Resultado de la técnica imnxinohitoqioímica - Intensidad de la respuesta: +ligera ++ intensa +++ muy intensa - AISLAM Aislamiento de la cepa de H. alvei probada en los peces de la experiencia. 118 Resultados Experiencia de inoculacién con la cepa C34 a) Inoculados una sola vez al inicio de la experiencia En los animales sacrificados a los 30 días la reacción inflamatoria se localiza preferentemente en peritoneo e hígado, siendo predominantemente de tipo polimorfonuclear, aunque también se observan abundantes macrófagos. Con la técnica inmunohístoquímica apenas se detecta la presencia de bacterias. En los peces sacrificados a los 60 días observamos algunos focos inflamatorios granulomatosos en los márgenes del hígado y en el peritoneo, con predominio de polimorfonucleares sobre macrófagos, sin que se hayan detectado bacterias con la técnica inmunohístoquímica (Figura 20). En el último muestro realizado, a los 90 días postinoculación, únicamente se observa un ligero infiltrado polimorfonuclear en el peritoneo y en los márgenes del hígado, siendo negativos a la técnica inmunohístoquímica para la detección de antígeno bacteriano de Hafnia álvei. 119 Resultados b) Inoculados dos veces, al inicio y a los 15 días de comenzada la experiencia En los animales sacrificados a los 30 días observamos una ligera reacción inflamatoria granulomatosa en el peritoneo y en los márgenes del hígado donde predominan los macrófagos sobre los poUmorfonucleares. Con la técnica inmunohistoquímica observamos que el número de bacterias intracelulares es escaso. A los 60 días de iniciada la experiencia de inoculación se aprecia poca reacción inflamatoria en el peritoneo, con predominio de macrófagos y polimorfonucleares. Con la técnica inmunohistoquímica apenas se detectan bacterias intracelulares. En los peces de esta experiencia sacrificados a los 90 días observamos poca reacción inflamatoria y escasa presencia de bacterias detectadas por inmunohistoquímica. 120 Resultados c) Inoculados tres veces, al inicio, 4° y 8° día de comenzada la experiencia En los peces analizados en el primer muestre© se observan pequeños focos de inflamación granulomatosa en hígado y en peritoneo si bien la presencia de bacterias por medio de la inmunohistoquímica es escasa. En uno de los animales se apreció necrosis del tejido adiposo. A los 60 días de iniciada esta experiencia con la cepa C34 se observa una ligera reacción inflamatoria granulomatosa en hígado y peritoneo con escasa presencia de bacterias según la técnica de inmunohistoquímica A los 90 días se observa una ligera reacción inflamatoria granulomatosa en mesenterio. Con la técnica inmunohistoquímica se detectan bacterias intracelulares. 121 Discusión En el estudio realizado hemos comprobado como ninguna de las 23 cepas analizadas mediante la prueba del PCR fue positiva a la presencia del gen eae, al igual que ha ocurrido en todos aquellos trabajos en los que se intentó la identificación del gen eae en cepas de Hafnia alvei no aisladas en Bangladesh, como en el estudio de C. SERAL y cois. (2001) en Aragón (España) donde analizaron 102 cepas de Hafnia alvei aisladas de pacientes humanos que presentaban diarrea, aunque entonces aún no estaba claro que fuera este gen el responsable del incremento de la virulencia en las cepas de Hafnia alvei que lo poseían. Tampoco se logró demostrar la presencia del gen en sdslamientos de Finlandia, Canadá y Suecia (RiDELL y cois., 1995; ISMAlLly cois., 1996). Sin embargo, se ha puesto de manifiesto la lesión característica de cepas enterohemorrágicas de E. coli y su relación con diferentes cepas de Hafnia alvei aisladas en Bangladesh, y con similar consecuencia patogénica, cuyo origen eran cuadros diarreicos humanos (ALBERT y cois., 1991 y 1992). La relación entre ambos patógenos se encontró en la presencia del gen eae en todas las cepas estudiadas. Pero la identificación de las cepas de Hafnia alvei se realizó entonces de forma exclusiva mediante pruebas bioquímicas convencionales y mediante el sistema API 20E. Trabajos posteriores (RiDELL y cois., 1995; ISMAILI y cois., 1996) demostraban la existencia del gen eae en las cepas analizadas por MJ. ALBERT (1991 y 1992), estableciéndose una correlación positiva entre 128 Discusión las cepas de Hafnia alvei productoras de lesiones AE (del ingles attaching and effadng) con la presencia de dicho gen, si bien, no se lograban identificar oti-as cepas de Hafnia alvei fuera de Bangladesh que tuvieran el gen eae, a la vez que se detectaban bajas homologías entre las secuencias ribosómicas parciales de la subunidad 16S entre cepas de Hafnia alvei positivas y negativas a la presencia del gen eae, cuestionándose por entonces la correcta posición taxonómica de las cepas de Hafnia alvei "eae positivas". A finales de 1999, JM. JANDA en colaboración con MJ. ALBERT analizaron 5 cepas de Hafnia alvei productoras de diarrea con la presencia del gen eae, de aquellas aisladas por MJ. ALBERT en Bangladesh mediante el estudio de proteínas de membrana, lisis por un fago específico de Hafnia alvei (1672 ATCC) y susceptibilidad a la cefalotina. Llegaron a la conclusión de que estas cepas estaban más cercanas a Escherichia coli que a Hafnia alvei, a pesar de diferenciarse estas a las cepas tipleas de E. coli en su incapacidad de producir ácido a partir de la lactosa y el D-sorbitol, no sintetizar la enzima p-Dglucoronidasa y no poseer otros factores de virulencia vinculados a las cepas enterohemorrágicas de E.coli. Pero un análisis de las características fenotípicas y genotipicas del Género Hafnia, comparando 73 cepas de Hafnia alvei con 5 de las cepas aisladas por MJ. ALBERT (1991 y 1992) en Bangladesh e identificadas en su momento como Hafnia alvei (JANDA y cois., 2002) ha corroborado la correcta posición taxonómica dentro del Género Escherichia de las cepas de Hafnia alvei positivas al gen eae aisladas en Bangladesh. No obstante, estos estudios continúan, y así, en el 129 Discusión trabajo de R. ESERSTAM y cois. (2002) en el que analizan la estructura de los lipopolisacaridos O de las cepas de Bangladesh, hay claras diferencias con las cepas de Bscherichia coli y Hafhia alvei en cuanto a su estructura. También realizaron estudios de hibridación, sugiriendo que los aislamientos de Bangladesh requerirían de la designación de una nueva especie dentro del Género Escherichia. Por todo lo expuesto, y a pesar de que hoy en día se sigue intentando aclarar la posición taxonómica de las cepas aisladas en Bangladesh (ALBERT y cois., 1991 y 1992), los trabajos de este último año, unido al hecho de que nunca se hayan identificado cepas de Hafnia alvei con la presencia del gen eae fuera de los aislamientos de Bangladesh a comienzos de la década de los '90, ni en nuestro estudio ni en ningún otro, y atendiendo al hecho de que todas nuestras cepas fueron debidamente identificadas como H. alvei mediante el fago ATCC 1672 (GUIÑEE y VALKENBURG, 1968) deja absolutamente en duda la posición real de las cepas aisladas en Bangladesh dentro del Género Hafnia, e invita a la realización de estudios posteriores que clarifiquen tal cuestión, como el realizado recientemente por G. HUYS y cois. (2003) proponiendo el nombre de Escherichia albertii para las cepas sorbitol y lactosa negativas aisladas en Bangladesh por MJ. ALBERT. Nuestro estudio ha corroborado que el 100% de las cepas analizadas de Hafnia alvei son productoras de algún tipo de sideróforo, hecho confirmado con anterioridad en los trabajos de R. PODSCHUN y cois. (2001), así como R. REISSBRODT y cois. (1990). R. PODSCHUN y cois. (2001) analizaron un total de 70 cepas de Hafnia alvei, siendo el 130 Discusión 100% de las mismas productoras de algún tipo de sideróforo mediante la misma metodologia empleada en nuestro estudio. En el estudio realizado por R. REISSBRODT y cois. (1990) se analizaron un total de 11 cepas de Hafnia alvei, determinándose que la ferrioxamina era producida por el 100% de las cepas analizadas, con un predominio de la ferrioxamina G sobre la E. El hecho de la no producción de aerobactina ni enterobactina por parte de las cepas de Hafnia alvei analizadas en nuestro estudio no es ni mucho menos un resultado inusual ya que otros autores a pesar de lograr aislar estos sideróforos en cepas de Hafnia alvei, su frecuencia fue siempre muy baja. Así, en el estudio de R. PODSCHUN y cois. (2001), del total de las 70 cepas investigadas, sólo una cepa (1.4% del total analizado) sintetizaba la enterobactina, mientras que la aerobactina no se detectó en las cepas analizadas. JL. MARTÍNEZ y cois. (1987) demostraron que en bacterias Gram negativas de los Géneros Enterobacter y Shigella la frecuencia en la producción de aerobactina era superior al 50%, mientras que en Géneros como Proteus, Yersinia, Serratia, Salmonella, Citrobacter, Klebsiella y Escherichia dicha frecuencia era inferior al 50%. La única cepa de Hafnia alvei analizada en este estudio fue positiva a la producción de aerobactina, pero debido al escaso número de cepas analizadas de esta especie, lógicamente no se le otorgaron porcentajes de frecuencia en la producción de este sideróforo. 131 Discusión En el trabajo de JM. RUTZ y cois. (1991) también se detecta la producción de enterobactina en Hafnia alvei, pero con una frecuencia muy baja, similar a la del trabajo de R. PODSCHUN y cois. (2001). Una vez descartada la producción de aerobactina o enterobactina en las cepas de H. alvei analizadas en nuestro estudio, junto con el hecho de que todas ellas dieran un resultado positivo en el medio universal de B. SCHWYN y JB. NEILANDS (1987) para la detección de sideróforos, nos hace pensar que dicha reacción pueda estar producida por un sideróforo como la ferrioxamina, detectada en cepas de Hafnia alvei con una frecuencia del 100% en trabajos anteriores como el de R. REISSBRODT y cois. (1990). Sin embargo, este tipo de sideróforo nunca se ha relacionado con un aumento en la virulencia bacteriana, careciendo por tanto de valor en nuestro estudio haberlo incorporado en nuestra metodología de trabajo para describir factores de virulencia en Hafnia alvei y su posible relación con el incremento de su patogenicidad en la dorada (Sparus aurata, L.) y trucha arcoiris (Oncorhynchus mykiss). Nuestras cepas de Hafnia alvei no han demostrado la capacidad de hemoUzar eritrocitos de dorada, trucha arcoiris u oveja. Dicha capacidad hemolítica está limitada (BONDARENKO y cois. 1983) a la adquisición por parte de Hafnia alvei del plásmido pIE 567 también presente en Enterobacter aerogenes y Salmonella typhimuñum. que codifica la síntesis de una a-hemoHsina, por lo que no es posible la correlación entre mayor grado de patogenicidad de Hafnia alvei en dorada y este factor de virulencia analizado. 132 Discusión La fimbrias tipo I son un importante factor de virulencia que facilita la adherencia bacteriana a las mucosas y se ha encontrado involucrada en la patogénesis de infecciones relacionadas con el aparato urinario causadas por E. coli (IWAHI y cois., 1983; MATSUMOTO y cois., 1990; MiZUNOE y cois., 1997). Por otro lado, las fimbrias tipo III facilitan la adhesión bacteriana a las células endoteliales, epitelio del tracto respiratorio y células uroepiteHales. Aunque los estudios realizados sobre la presencia de las fimbrias tipo I y tipo III en enterobacterias son muy abundantes, los datos referidos a Hafnia alvei se limitan al estudio que en el año 2001 realizaron R. PODSCHUN y colaboradores. Nuestros resultados son en valores absolutos ligeramente inferiores a los obtenidos por R. PODSCHUN y cois. (2001) ya que en su estudio la frecuencia de cepas de Hafnia alvei positivas a la presencia del pili tipo I se situaba en el 59%, mientras en nuestro estudio sólo encontramos un 39%. Respecto al pili tipo III, R. PODSCHUN y cois. (2001) describieron una frecuencia de presentación del 50%, mientras que en nuestro estudio únicamente detectamos la presencia de este pili en el 26% de las cepas analizadas. Esta diferencia podría estar influenciada por el origen de las cepas del estudio de R. PODSCHUN y cois, ya que se obtuvieron exclusivamente de aislamientos extraintestinales de Hafnia alvei, mientras que en nuestro estudio un 52% de las cepas analizadas tenían un origen intestinal, ya sean provenientes de heces humanas, como de casos clínicos de enteritis humanas. Otra posible causa que pueda explicar esta diferencia podría estar en el tamaño de la muestra, ya que el estudio de R. PODSCHUN y cois. (2001) se realizó con 70 cepas, frente a las 23 analizadas en el nuestro. 133 Discusión En nuestro estudio, el porcentaje de cepas que han mostrado poseer resistencia al efecto bactericida del suero de dorada a 25°C se sitúa en el 30.4%, resultado similar al obtenido por otros autores con Hafnia alvei en otras especies animales, como R. PODSCHUN y cois. (2001) con suero humano con un porcentaje de cepas resistentes del 34%, y S. JANKOWSKI y cois. (1996) en ganado vacuno con una resistencia del 19%. Si bien, en este último estudio la concentración final de suero empleada fue del 50% y no del 75% que es la más frecuente y la que usamos en nuestro estudio y en el realizado por R. PODSCHUN y cois. (2001). El nivel de resistencia mostrado por Hafnia alvei en dorada se presenta inferior al observado en trucha arcoiris, pues frente a esta última especie la resistencia se situó en el 43%. Dado que se ha demostrado la correlación entre efecto bactericida del suero con la mayor viabilidad del proceso infectivo (ROANTREE y cois. 1960), la dorada mostraría una mayor resistencia a la infección por Hafnia alvei que la trucha arcoiris. Ya que en las experiencias de DL50 en dorada no se encontraron diferencias significativas de patogenicidad con las diferentes cepas de Hafnia alvei empleadas en la experiencia, mostrando todas las cepas empleadas una DL50 superior a 10^ ufe/pez, estableceremos la comparación entre virulencia de cada cepa y resistencia al efecto bactericida de suero respecto a la experiencia de infección crónica donde sí encontramos diferencias significativas entre las tres cepas analizadas. De estas, la que ha demostrado poseer un mayor poder patógeno en dorada ha sido la cepa 187/95, siendo la única de las tres que presentó resistencia al afecto bactericida del suero de dorada. Además, es la cepa aislada de forma natural en 134 Discusión nuestro Archipiélago (Tabla 1). Por el contrario, la cepa más sensible al suero de dorada, la cepa C34, fue la que demostró poseer un menor poder patógeno en la experiencia de inoculación experimental para producir una infección crónica. La cepa 2566/83 mostró en nuestro estudio una patogenicidad intermedia entre la 187/95 y la C34, y presentó a su vez una resistencia al efecto bactericida del suero intermedia entre las cepas 187/95 y C34. Existe, por tanto, una elevada correlación entre el daño mostrado por cada cepa en la infección crónica en dorada y su grado de virulencia representado por la resistencia al efecto bactericida del suero de esta especie. Estos resultados se corresponden con lo descrito por otros autores que tras analizar la virulencia para peces frente a cepas de distintas especies, encuentran que aquellas con mayor poder patógeno se corresponden a su vez con las que poseen una mayor resistencia al efecto bactericida del suero. En el estudio de RL. DAVIES (1991) se analizó la virulencia de cepas de Yersinia ruckeri en trucha arcoiris, demostrándose que las cepas virulentas en experiencias de inoculación se correspondían con aquellas que en experiencias "in mtro", mostraban una mayor resistencia al efecto bactericida del suero de trucha arcoiris. 135 Discusión S.2.- COMFÁRACIOH DE LA PATOGEMICIDAD DE HáFMá ALVEI EN LA ACUICULTÜRA MAMNA Y COITIWBI'TM. La dorada (Sparus aurata, L.) como especie marina es muy susceptible frente a diferentes enfermedades causadas por patógenos como Photobacterium damselae subespecie piscicdda (TORANZO y cois., 1991; BAPTISTA y cois., 1996; REAL y cois., 1997), Aeromonas salmonicida (REAL y cois., 1994) y Vibrio spp. (BALEBONA y cois. 1998). Por otro lado, la actividad patógena de Hafnia alvei en el curso de infecciones naturales en peces continentales es cada vez más relevante. I. GELEV y cois. (1990) describieron un brote epizoótico de septicemia hemorrágica en trucha arcoiris. Dos años más tarde, TESHIMA y cois. (1992) describieron otro brote septicémico, pero esta vez en salmón rojo (Oncorhynchus masou). En pez gato (Ictalurus punctatus), Hafnia alvei es considerada un patógeno emergente que cada día cobra mayor importancia (GOODWIN y KILLIAN, 1998). En infecciones experimentales, Hafnia alvei también ha demostiado ser un agente patógeno oportunista frente a peces de aguas continentales com.o la trucha común {Salmo trutta, L.) (RODRÍGUEZ y cois., 1998) y pez gato (Ictalarus punctatus] (GOODWIN y KILLIAN, 1998). En pez gato [Ictalurus punctatus), Hafnia alvei es letal a una dosis por inmersión o vía intraperitoneal de 10^ ufe/mi y 10^ ufe/pez, respectivamente, entre las 24 y 48 horas postinoculación (GOODWIN y KILLL\N, 1998). Además, se ha comprobado también la enorme susceptibilidad de la trucha común [Salmo trutta, L.), a la infección (RODRÍGUEZ y cois., 1998; AGOSTA y cois., 2002), e incluso, la 136