Células somáticas y extracción con CO[2] supercrítico perfeccionamiento para la producción de queso de cabra bajo en grasa

UNIVERSIDAD DE LAS PALMAS DE GRAN CANARIA FACULTAD DE VETERINARIA TESIS DOCTORAL CÉLULAS SOMÁTICAS Y EXTRACCIÓN CON CO2 SUPERCRÍTICO: PERFECCIONAMIENTO PARA LA PRODUCCIÓN DE QUESO DE CABRA BAJO EN GRASA Davinia Sánchez Macías Las Palmas de Gran Canaria, enero 2012 Anexo II UNIVERSIDAD DE LAS PALMAS DE GRAN CANARIA Departamento: Instituto Universitario de Sanidad Animal y Seguridad Alimentaria Programa de Doctorado: Sanidad Animal Título de la Tesis “CÉLULAS SOMÁTICAS Y EXTRACCIÓN CON CO2 SUPERCRÍTICO: PERFECCIONAMIENTO PARA LA PRODUCCIÓN DE QUESO DE CABRA BAJO EN GRASA”. Tesis Doctoral presentada por Doña Davinia Sánchez Macías Dirigida por el Dr. D. Anastasio Argüello Henríquez El Director, La Doctoranda, Las Palmas de Gran Canaria, a 18 de octubre de 2011 ANASTASIO ARGÜELLO HENRÍQUEZ, PROFESOR TITULAR DE UNIVERSIDAD EN EL DEPARTAMENTO DE PATOLOGÍA ANIMAL, PRODUCCIÓN ANIMAL, BROMATOLOGÍA Y TECNOLOGÍA DE LOS ALIMENTOS DE LA FACULTAD DE VETERINARIA DE LA UNIVERSIDAD DE LAS PALMAS DE GRAN CANARIA INFORMA: Que Davinia Sánchez Macías, Licenciada en Biología, ha realizado bajo mi dirección y asesoramiento el presente trabajo titulado “CÉLULAS SOMÁTICAS Y EXTRACCIÓN CON CO2 SUPERCRÍTICO: PERFECCIONAMIENTO PARA LA PRODUCCIÓN DE QUESO DE CABRA BAJO EN GRASA” considerando que reúne las condiciones y calidad científica para optar al grado de Doctor en Veterinaria. Las Palmas de Gran Canaria, octubre 2011 Fdo. Anastasio Argüello Henríquez Agradecimientos Agradecimientos A medida que iba escribiendo esta Tesis Doctoral, en cada página, en cada frase y en cada palabra, me acordaba de alguien a quien me decía a mí misma: “no te olvides de agradecerle lo que ha hecho por ti”. Son tantas las personas que, directa o indirectamente, me han echado una mano, me han dado un consejo o simplemente me ha dicho “venga, que tú puedes”, que seguramente se me van quedar muchas atrás. Estos cuatro años que han pasado están llenos de momentos, de todos los colores y sabores, que han marcado mi vida, y de los que no me quiero olvidar, por que son las cosas que hacen crecer a uno. Sobre todo, me quedo con aquellos momentos que han pasado a “mi Historia” como los más anecdóticos, y que nombraré algunos de ellos, simplemente por el hecho de que queden grabados para siempre en algún lado. A los primeros que quiero agradecer son a Tacho y Noemí: gracias, gracias y gracias, por brindarme esta oportunidad. Han sido mis Maestros, el dejarme entrar y enseñarme el mundo de la investigación ha sido como cumplir el sueño que tenía desde chiquitita: manipular cosas en un laboratorio y darle rienda suelta a mi imaginación. He disfrutado como una niña pequeña, de verdad. Ambos crean un equilibrio perfecto, con la velocidad adecuada en el camino de la investigación. Tacho por apretar el acelerador, eres el optimismo en persona y una de las personas más humanas que he conocido nunca desde todos los puntos de vista. Nunca se me olvidará el “!Habemus proteólisis¡” cuando miramos mi primer gel de electroforesis. Fue justo ese momento cuando me dije “esto es lo mío”. Noemí por apretar el freno, por ver donde no se puede ver y resolver lo que no tiene solución, gracias por tu experiencia y por esos dulces que a veces nos traías para darnos energía. Lo que siempre recordaré será aquella vez que dijiste “hemos conectado mal algunos nervios en el baifo, tenemos que volver a abrir”. Me encanta esa seriedad que pones en las bromas, digna de alguien con gran capacidad de convencimiento. Agradecimientos A mis compañeros de laboratorio y granja, ¡qué grandes son! Isabel, gracias por tu experiencia con las electroforesis, ayudarme en las catas, y sobre todo por esas conversaciones tan cálidas a través de Skype, el mayor apoyo que he tenido en la distancia. Siempre me acordaré del momento “los golpes de las cabras hacen crecer cosas…”. Antonio, gracias por tu ayuda en el laboratorio y en la granja, eres increíble resolviendo todo con “un trocito de madera” y enseñarme a manejar el “ganado”, entre otras cosas. Serás recordado por tus mezclas culinarias, te lo aseguro. Lorenzo, muchas gracias por dar ese toque de “exotismo” al grupo, pasarás a la posteridad como el que quería “mandar” alimentos a África (no te preocupes, yo te entendí). Las proteínas extraídas con el caprichoso vortex “hago lo que me da la gana” llevan tu nombre, sin duda alguna. Alexandr, tú has tocado el laboratorio con una varita mágica, lo sé; después de ti, todo tiene otro color (rojo, por ejemplo). Gracias por darle un toque de perfección al laboratorio, por tu ayuda incondicional en mis experimentos y por los juegos de palabras: transthriller, Davinja y loga-rítmica. Vanessa, ¿cómo consigues mantener la feminidad sacando sangre y dando de comer a los baifos? De grande quiero ser como tú. Gracias por ese toque juvenil que has traído al grupo. A Diego le agradezco esas miradas de “estás loca” que me hacen reír tanto, y porque me recuerda a mí cuando llegué al laboratorio la primera vez. Me has ayudado muchísimo, cuanta conmigo para lo que sea. A Marichu y a Sergio, los grandes del queso en Canarias: sin ustedes esta tesis no hubiera sido posible. Gracias por enseñarme los entresijos de los quesos, los sabores, colores, aromas y texturas. Con ustedes empecé a valorar este maravilloso producto y a darme cuenta que no es simplemente “queso”: es cultura y tradición. Y de igual manera, con la cabra: gracias Capote por enseñarme a descalificar animales supernumerarios y con despigmentaciones, y sobre todo por esos momentos de risas inteligentes que sólo tú eres capaz de crear. A Rafael Ginés, por esa inestimable ayuda para preparar las catas y las clases de análisis sensorial, muchas gracias por todo. Índice de la Tesis Doctoral V Capítulo IX: Effects of supercritical fluid extraction pressure on chemical composition, microbial quality, polar lipids profile and microstructure of goat cheese 197 1. Planteamiento y Metodología 197 1.1. Planteamiento 197 1.2. Metodología 198 2. Trabajo experimental 199 Capítulo X: Conclusiones/Conclusions 229 1. Conclusiones 229 2. Conclusions 232 1 Capítulo I. Contenido de la Tesis Doctoral 1. Estructura, enfoque y objetivos principales 2. Focus of the work and main targets Capítulo I. Contenido de la Tesis Doctoral 2 Capítulo I: Contenido de la Tesis Doctoral 1. Estructura, enfoque y objetivos principales El presente trabajo de investigación está centrado en la producción de quesos de leche de cabra bajos en grasa y la búsqueda de alternativas para mejorarlos. Los temas tratados al inicio de este manuscrito, que pueden parecer inconexos entre sí, como puede ser la implicación de las células somáticas y los quesos desnatados, se han combinado para intentar encontrar nuevas formas de abordar los defectos encontrados en los quesos bajos en grasa. Así, este trabajo de investigación se ha tratado como un manuscrito científico subdividido en capítulos, los cuales corresponden a una introducción divulgativa, los artículos científicos con cada uno de los experimentos realizados, algunos ya publicados y otros bajo revisión, y un capítulo final de conclusiones. Este proyecto de investigación comenzó con la idea general de ampliar el mercado actual del queso de cabra, tan importante en Canarias, a partir de la elaboración de un queso artesano bajo en grasa. Los resultados preliminares nos mostraron una serie de defectos en este tipo de quesos, por lo que decidimos ahondar más y describir las características físicoquímicas, bioquímicas y sensoriales de los mismos, con la idea de entender desde la base qué es lo que pasa cuando se elabora queso con leche de cabra baja en grasa. Existen muchos trabajos en la literatura sobre quesos desnatados elaborados a partir de leche de vaca, pocos de oveja y muy escasos de cabra. Hasta ahora, muchas de las prácticas usadas para mejorar los quesos desnatados han tenido poco éxito, por lo que se hace necesario buscar alternativas a su producción. Esta tesis doctoral se ha centrado en dos alternativas totalmente diferentes e independientes una de la otra, y de los procesos convencionales hasta ahora usados en la industria, para mejorar y producir quesos de cabra bajos en grasa: la aceleración de la maduración a partir de las células somáticas de la leche y la extracción de grasa con fluidos supercríticos. Capítulo I. Contenido de la Tesis Doctoral 3 El capítulo II se ha centrado, de una manera muy simple y amena, en una introducción divulgativa, sin perder el carácter de revisión bibliográfica, que introduce al lector en el sector lechero caprino, los quesos de cabra, los quesos desnatados, las células somáticas y los fluidos supercríticos. Se ha evitado la extensión que normalmente se desarrolla en otras tesis doctorales, por el hecho de que en los posteriores capítulos hay una introducción más específica e integrada según el tema tratado y una discusión relacionada con los resultados obtenidos de cada uno de los trabajos experimentales. Los siguientes capítulos corresponden a cada uno de los trabajos experimentales relacionados con esta tesis, y la idea general y los objetivos principales son los siguientes: Capítulo IV: se elaboraron quesos de formato pequeño (300 gramos) a partir de leche cruda de cabra entera, semidesnatada y desnatada, siguiendo los procedimientos artesanales que normalmente llevan a cabo los queseros artesanos. Estos quesos se dejaron madurar hasta 28 días a 12ºC y 75-80% de humedad relativa. Los objetivos principales eran la caracterización de las propiedades físico-químicas (composición química, pH, densidad, etc.) de la leche y suero resultante de la elaboración, y la composición química, pH, textura instrumental y color de los quesos a 1, 7, 14 y 28 días de maduración. Capítulo V: en este apartado se profundizó a nivel bioquímico en los quesos descritos en el capítulo IV. Los objetivos de este trabajo experimental fueron realizar un perfil de proteínas de los quesos de cabra con distinto contenido graso y evaluar la proteólisis y lipólisis durante los 28 días de maduración. Capítulo VI: para evaluar sensorialmente las posibles diferencias de los quesos medidas a nivel instrumental, este capítulo se ha centrado en el análisis sensorial de los quesos de leche cruda de cabra descritos en el capítulo IV. Para alcanzar los objetivos principales de este estudio, nos basamos en pruebas de diferenciación y aceptación por parte de consumidores, y perfiles sensoriales por parte de jueces expertos, de los quesos enteros (realizados con leche Capítulo I. Contenido de la Tesis Doctoral 4 entera), reducidos (realizados con leche semidesnatada) y bajos en grasa a 1, 7, 14 y 28 días de maduración. Capítulo VII: se elaboraron quesos, de formato miniatura (8-10 gramos), de leche de cabra cruda y pasteurizada a la que se le añadieron células somáticas obtenidas de leche de cabra sana, con el objeto de estudiar la capacidad potencial de las células en aceleración de la maduración. Los objetivos de este experimento fueron caracterizar el perfil de proteínas, proteólisis y lipólisis, y efectos en el color, de los quesos elaborados con leche cruda y pasteurizada, con 3 niveles de células somáticas (200.000, 1.000.000, y 2.500.000 células/ml), madurados 1 y 7 días. Capítulo VIII: en este capítulo, se sigue un procedimiento parecido al capítulo anterior, pero esta vez se añade el factor grasa de la leche. Los objetivos fueron estudiar la posible aceleración de la proteólisis y lipólisis midiendo el perfil proteico y nivel de ácidos grasos libres en quesos elaborados a partir de leche cruda o pasteurizada, con 2 niveles de células somáticas (200.000 y 2.000.000 células/ml), leche entera o desnatada, madurados 1 y 7 días. Capítulo IX: se estudió la utilización de la tecnología de los fluidos supercríticos para la extracción de grasa de los quesos de cabra elaborados con leche entera después de su maduración variando la presión. En este capítulo, los objetivos fueron estudiar los efectos de 4 presiones diferentes (100, 200, 300 y 400 bares) de tratamiento sobre las composición química, perfil de lípidos polares, microbiología y microestructura de dos quesos de leche de cabra curados 5 meses: Majorero y queso tipo Gouda de cabra. Capítulo X: conclusiones obtenidas de la presente Tesis Doctoral. Capítulo I. Contenido de la Tesis Doctoral 5 2. Focus of the work and main targets The present research work is focused in the production of goat cheese low in fat, especially in the looking for alternative to improve them. The topics at the beginning of this manuscript could seem disjointed each others, as somatic cells and low fat cheese. But they have been combined in such a way that might make sense, with the objective to find new methods to avoid the defects founds in low fat cheese. This work is a research manuscript divided in chapters, which correspond to a divulgative introduction, the scientific papers, and conclusions. This project began with the main objective to develop an artisan low fat goat cheese, focusing in amplifying of the market in Canary Islands. The preliminary results showed some atypical properties in cheeses. Because of this, we decided to deep and describe the physicochemical, biochemical and sensory characteristics of these cheeses lower in fat, to enable an understanding and provide a baseline of the effect of milk fat reduction on goat cheese. In the literature there is amply information about low fat cheese made with cow milk, not too much from sheep milk and very scarce from goat milk. So far, the conventional practices used to improved low fat cheese have had not too much success. It makes necessary to look for alternative to produced them. This Ph.D. thesis is focused in two different alternatives, independent each other, to the conventional processes and methods used in the industry. The aim is to produce and improve low fat goat cheese using somatic cells from goat milk to accelerate the ripening or the supercritical fluid extraction technology to get goat cheese lower in fat after ripening. The Chapter II is dedicated, in a very simple and readable way, to a divulgative introduction. Without losing the scientific revision propose, the reader is introduced in the caprine world, goat milk and cheese, low fat cheese, somatic cells topic, and supercritical fluid extraction. The extended concept of bibliographic revision was avoid due to in the next Capítulo I. Contenido de la Tesis Doctoral 6 chapters there is an introduction more specific for each experiment and there is a section where the main results are discussed comparing with other works. The next chapters correspond to each experimental work relationed with this thesis. The main objectives are as follow: Chapter IV: small cheeses (300 grams) were made with full-fat, reduced-fat and low-fat raw goat milk using the artisan method. The cheeses were ripened during 28 days at 12ºC and 75-80% relative moisture. The aims were to characterize the physicochemical milk and whey properties (gross composition, pH, density, etc.), and the chemical composition, pH, instrumental texture and color of the cheese ripened at 1, 7, 14 and 28 days. Chapter V: the biochemical profiles of the cheese described in the chapter IV were studied. The objectives of this study were to characterize the protein profile of the cheeses and quantified the proteolysis and lipolysis during 28 days of ripening. Chapter VI: to evaluate in a sensorial way the differences found with the instrumental analysis, this chapter was focused in the sensory analysis of the cheese described in the chapter IV. The main objective was to evaluate the sensory differences based in triangular test for differentiation, acceptation test for consumers, and sensory profile elaborated by expert judges, among the full-fat, reduced-fat, a-nd low-fat cheese at 1, 7, 14 and 28 days of ripening. Chapter VII: Miniature cheeses (8-10 grams) were elaborated with raw or pasteurized milk and with different levels of added somatic cells from health goats, to evaluate the potential of somatic cells in the accelerated ripening. The aims of this experiment were to characterized the protein profile, quantified the proteolysis and lipolysis, and evaluate the effects on instrumental color of cheese elaborated with three different somatic cells levels (200,000, 1,000,000, or 2,500,000 cells/ml), raw or pasteurized goat milk, and ripened at 1 and 7 days. Chapter VIII: in this chapter is described a similar procedure than in the chapter VII, but in this case, the parameter “fat content in milk” was introduced, with the proposal of Capítulo I. Contenido de la Tesis Doctoral 7 improve the biochemical defects found in low-fat goat cheese. The main objectives of this experiment were to characterize the protein profile, and quantified the proteolysis and lipolysis in cheeses elaborated with raw or pasteurized milk, two levels of somatic cells (200,000 or 2,000,000 cells/ml), and full-fat or low-fat goat milk, during 7 days of ripening. Chapter IX: in this chapter, the supercritical fluid technology was used to extract fat from full-fat goat cheese after ripening varying the pressure of the treatment. The aims were evaluated the effect of four different pressures (100, 200, 300, and 400 bars) on the chemical composition, polar lipids profile, microbiology quality and microstructure of two varieties of goat cheese (Majorero and Gouda goat cheese) ripened during 5 months. Chapters X: conclusions of this PhD thesis. 8 Capítulo II: Introducción Divulgativa 1. La leche de cabra 2. El queso de cabra 3. Las células somáticas 4. Quesos bajos en grasa 5. Los fluidos supercríticos Capítulo II. Introducción Divulgativa 9 Capítulo II: Introducción Divulgativa 1. La leche de cabra En los países desarrollados más del 95% de los productos lácteos consumidos son derivados de la leche de vaca. Una excepción a esta regla incluye los países de la cuenca Mediterránea, donde la leche de cabra y oveja, así como sus respectivos productos derivados, forman una parte fundamental del patrimonio cultural (Michaelidou, 2008). La leche de cabra comprende sólo el 1,98% de la producción mundial, siendo el área Mediterránea uno de los mayores productores (18%) después de India (22%). De acuerdo a la FAO (Food and Agriculture Organization) de las Naciones Unidas (FAOSTAT, 2010), la población mundial de caprinos de aptitud lechera alcanzó 179 millones de cabezas en el 2008, y la producción de leche de cabra sobrepasó las 15,2 millones de toneladas, representando un incremento significante de 15 y 17 %, respectivamente, comparado con hace una década. Hay que destacar que la producción total de leche en los países en vías de desarrollo no incluye las cantidades desconocidas utilizadas para en autoconsumo, procesamiento directo de los ganaderos y las vendidas a la industria láctea para ser introducidas en el mercado organizado (Pirisi et al, 2007). Dubeuf y Boyazoglu (2009) sugirieron que el incremento en la población caprina durante los últimos 25 años significa que las cabras no son sólo “las vacas de los pobres”, y que el creciente interés en sus productos lácteos a nivel mundial significa que la presente situación favorable se consolidará para explotar el comportamiento de los consumidores y todas las oportunidades de mercado potenciales (Dubeuf, 2005). 1.1. Situación actual de la leche de cabra en España y Canarias La población caprina nacional, comprende el 22,0% del censo comunitario después de Grecia (39,8%), con un total de 2.906.517 cabezas en el 2009. En la Figura 1 se puede Capítulo II. Introducción Divulgativa 16 La producción de queso puro de cabra en España se ha ido incrementando de manera gradual en los últimos años, pasando de 14.000 toneladas en el año 2005 a 21.600 toneladas en 2007. En el año 2008 sin embargo se registró un ligero descenso en la producción situándose esta en 20.400 toneladas según los últimos datos oficiales provisionales. A partir de estos datos, aplicando un coeficiente de transformación de 10 (litros de leche necesarios para fabricar un kg de queso puro de cabra) únicamente el 40% de la leche de cabra recogida en España se destina a la fabricación de queso puro de cabra, siendo el resto de la leche destinada a quesos de mezcla, otros productos lácteos o exportada a otros países (MARM, 2011). 2.2. Importancia cultural y económica del queso en Canarias El queso en Canarias forma parte del patrimonio cultural del Archipiélago Canario, resultado del esfuerzo y labor de los ganaderos y maestros queseros de las islas, los cuales aseguran la calidad y adaptación de los productos y procesos a las nuevas necesidades de los consumidores. La mayoría de los quesos producidos en Canarias se elaboran, principalmente, con leche de cabra y se destina al mercado interior. Sin embargo, la singularidad y calidad de los mismos ha aumentado su importancia y valor en el mercado nacional e internacional. En las Islas Canarias se producen más de 91.000 toneladas de leche de cabra cada año (MARM, 2010) para ser usadas en la elaboración de queso, la mayor parte de los cuales se elaboran con leche cruda usando métodos tradicionales y son consumidos tras breves periodos de maduración (7 días) (Fresno et al., 2008). La economía agrícola se ha beneficiado en los recientes años por el mayor interés en los quesos de cabra, lo cual puede ser factible para muchos ganaderos que producen queso de alta calidad a pequeña escala. Actualmente existe un interés en preservar la producción tradicional de quesos. La variedad de los quesos en Canarias está vinculada a las características climáticas y paisajísticas de las islas, a las excelentes razas autóctonas productoras de leche de alta calidad y las aptitudes tradicionales en su elaboración. Así como la Capítulo II. Introducción Divulgativa 17 riqueza genética caprina y forrajera, las Islas Canarias tienen una excepcional situación sanitaria debido al estar oficialmente libres de Brucelosis Caprina y Ovina, lo cual permite a aproximadamente 500 productores artesanos la venta de quesos de leche cruda con menos de 60 días de maduración (Fresno y Álvarez, 2007). En la comunidad autónoma de Canarias destaca la elaboración de dos quesos puros de leche de cabra que poseen una Denominación de Origen Protegida, Majorero y Palmero, y un queso de mezcla de oveja con leche de vaca y/o cabra, el “Queso Flor de Guía y Queso de Guía” que tiene concedida la Protección Nacional Transitoria a la Denominación de Origen Protegida, aunque en este último caso, la leche de cabra podrá ser utilizada en un 10% como máximo. 2.3. Composición química La composición química del queso de cabra está directamente relacionada con la de la leche de partida, lo que no implica que ambos tengan la misma composición, la cual a su vez dependerá de la raza caprina y su genética (Soryal et al., 2005), dieta de los animales (Álvarez et al., 2007) y estado de lactación (Zeng et al., 2007), entre otros factores. Durante el proceso de elaboración, algunos compuestos sufren una transformación y otros se pierden en el suero. Además, los componentes del queso sufrirán cambios a lo largo de la maduración, debido a factores químicos y físicos, propios del queso y del ambiente. La composición del queso también depende del tipo de queso (fresco, curado, cremoso, duro, coagulación ácida o enzimática, etc), tal como se puede observar en la Tabla 2 recogida por Raynal-Ljutovac et al. (2008), donde resume la composición química de algunos quesos de cabra. Por tanto, dar una visión general sobre la composición química del queso de cabra es, cuanto menos, complicada. Sin embargo, según el Real Decreto 1113/2006, donde se aprueban las normas de calidad para quesos y quesos fundidos en España, sólo se recoge una clasificación de quesos en cuanto a su composición química basada en el contenido de grasa sobre la materia seca. Así, se pueden denominar los quesos de la siguiente manera: Capítulo II. Introducción Divulgativa 18 Extragraso: el que contenga un mínimo de 60%. Graso: el que contenga un mínimo de 45 y menos de 60%. Semigraso: el que contenga un mínimo de 25 y menos de 45%. Semidesnatado: el que contenga un mínimo de 10 y menos de 25%. Desnatado: el que contenga menos de 10%. Así mismo, el Real Decreto prohíbe expresamente el uso de grasas, proteínas o ambas distintas a las de la leche, así como que el extracto seco lácteo inferior al 15% en el queso. Tabla 2. Composición química de algunos quesos de cabra. Adaptado de Raynal-Ljutovac et al. (2008). Producto Tipo País Materia seca, % Grasa % Proteína % Cenizas % Referencias Tipo Manchego Fresco España 59 34 22 4 Cabezas et al. (2005) Semicurado España 65 36 23 5 " Curado España 71 36 25 4 " Tipo Cheddar USA 58 27 30 Park (2000) Tipo Cheddar Duro, 6m. USA 62 28 22 Fekadu et al. (2005) Tipo Colby Pasta lavada, 6m. USA 54 21 18 " Láctico Láctico cremoso USA 34 16 13 Soryal et al. (2005) Láctico Láctico cremoso USA 40 23 19 Park (2000) Servilletta Ligeramente prensado España 38 18 14 Sendra and Saldo (2004) Domiati Fresco y cremoso USA 38 15 12 Soryal et al. (2004) Cacioricotta Fresco, 7d. Italia 47 17 17 Albenzio et al. (2006) Apulian Cacioricotta Fresco cremoso, cuajo enzim. Italia 36 17 14 1.7 Pasqualone et al. (2003) Ricotta Queso de suero, 1d. Italia 31 21 7 0.9 Pizzillo et al. (2005) Brocciu Queso de suero Francia 29 17 6 Guerrini et al. (1997) Queso de suero mezcla Francia 25 13 6 " Capítulo II. Introducción Divulgativa 19 Vadeteja 27 d. España 73 43 26 4.5 Carballo et al. (1994) Armada Queso prensado, 120d. España 79 57 37 3 Fresno et al. (1996) Ibores Prensado, 6m. España 59 31 23 Mas et al. (2002) QuesoTravnicki Blanco en salmuera, 30d. Bosnia 53 29 20 Saric et al. (2002) Tipo Feta 21d. S. Africa 41 17 15 Pitso and Bester (2000) Prensado Prensado, 3m. Grecia 69 38 Kondyli and Katsiari (2001) Prensado Prensado, 45d. España 67 37 Trujilllo et al. (1999) Mato Fresco España 33 16 12 1.5 Capellas et al. (2001) Tipo Paneer Fresco India 53 20 1.9 Agnihotri and Pal (1996) Rocamadour Láctico cremoso Francia 43 23 Lucas et al. (2006a) Ste Maure 21d Láctico cremoso Francia 49 27 12 Pierre et al. (1999) Ste Maure 58d Láctico cremoso Francia 66 36 16 . " Valencay Láctico cremoso Francia 40 20 16 2 Hosono and Sawada (1995) Crottin de Chavignol Láctico cremoso Francia 41 23 15 2.6 Hosono and Shirota (1994) Queso fresco 15d. España 44 22 16 2.7 Martin Hernandez et al. (1992a) Pasta lavada 60d. España 55 30 20 3.7 " Majorero 90 d. España 61 32 22 4.5 " Majorero 2d. España 52 19.73 19.5 Álvarez et al. (2007) Majorero 15d. España 55 23 21 " Majorero 60d. España 58 28 22 " Bastelicaccia Cremoso, 30d. Francia 60 33 Casalta et al. (2001) Cendrat del Montsec Mezcla de cuajos, 63d. España 51 31 18 2.2 Carretero et al. (1992) Láctico Madurado Francia 51–58 28–32 17–22 Favier and Dorsainvil (1987) and CIQUAL et al. (2002) Láctico Fresco Francia 15 6.1 4.7 " Cremoso Madurado Francia 35 18 11 " En un estudio de evaluación nutricional de más de 30 variedades de quesos de cabra comerciales en Estados Unidos, se observó que la mayor parte de ellos mostraban un mayor Capítulo II. Introducción Divulgativa 20 contenido en humedad y proteína, y menor contenido graso que su correspondiente o similar tipo hecho con leche de vaca (Park, 1990). 2.4. Color El color, definido por la norma CIE (Commission International d´Eclairage) incluye los siguientes parámetros o planos cromáticos de coordenadas (Fig. 3), donde a* representa en sus valores positivos tonos rojos y negativos en tonos verdes y la b* representa en sus valores positivos tonos amarillos y negativos en tonos azules, situándose perpendicular a ellos el eje L (luminosidad) de acuerdo con Wyszecki y Stiles (1982). Por último, el valor de C* (Chroma o cromatismo) representa el módulo o longitud del vector determinado por las coordenadas a* y b* y el valor de Hº (ángulo Hue) la rotación del mismo sobre el eje x. Figura 3. Representación espacial de los parámetros L, a* y b*. En un material sólido como el queso, la luz penetra las capas superficiales y es dispersada por los glóbulos grasos (Lemay et al., 1994) y por poros formados por el suero (Paulson et al., 1998). La luminosidad disminuye con la maduración (Khosrowshahi et al., 2006), el suero difunde a través de los poros del queso hacia la salmuera o al exterior, Capítulo II. Introducción Divulgativa 21 acompañado por una pérdida de humedad. Por tanto, el área antes ocupada por estos centros dispersores de luz disminuye, con la consiguiente disminución de la luminosidad de los quesos. De acuerdo a Rohm y Jaros (1996) y Fresno et al. (2006), durante la maduración del queso ocurren modificaciones bioquímicas con las cuales se adquieren los aromas y sabores, así como que se alcanza unos colores más oscuros e incrementa el ángulo hue. Como norma general, y como ya se explicó anteriormente, las cabras transforman prácticamente todo el βcaroteno en vitamina A, de manera que la leche, y por tanto los quesos, de cabra son más blancos que la leche y los quesos de vaca. 2.5. Maduración Durante la distribución y almacenamiento de los quesos ocurren numerosos cambios bioquímicos y físicos debido a la maduración y degradación de los componentes presentes en el mismo. La proteólisis y lipólisis son los dos principales procesos. La calidad de un queso está altamente influenciada por los niveles de péptidos, amino ácidos y ácidos grasos libres como resultados de estos procesos bioquímicos, aunque también existen cambios en el pH y la calidad microbiológica, aunque este último parámetro no será tratado en este manuscrito. 2.5.1. pH En los quesos de cabra de Canarias, típicamente de coagulación enzimática, el pH es de aproximadamente 6.6 el día 1 de maduración (Fresno y Álvarez, 2007), lo que está dentro del rango reportado por Martín-Hernández y Ramos (1984) y Juárez et al. (1991) para quesos de cabra de España, lo cual también ha sido observado por Álvarez et al. (2007) en quesos Majoreros. Durante los siguientes días y semanas de maduración, el pH en el queso disminuye por la acción de las bacterias ácidos lácticas, bien propias de la leche o añadidas como iniciadores, al convertir la lactosa retenida en la cuajada en ácido láctico, para luego Capítulo II. Introducción Divulgativa 22 incrementarse ligeramente debido a la liberación de aminoácidos básicos, metabolismo del lactato y formación de iones NH3 (Alais, 1985). 2.5.2. Proteólisis La proteólisis es probablemente el evento bioquímico más importante en la maduración de un queso, ya que provee cambios en el sabor y la textura. Debido a las diferencias de composición de los tipos de caseínas entre la leche de cabra y de vaca, tal como se explicó anteriormente, es de esperar que los quesos de ambas especies, en cuanto a la maduración y propiedades proteolíticas, sean significantemente diferentes (Park, 2001). Existen al menos 5 agentes proteolíticos involucrados en la maduración del queso: las enzimas endógenas de la leche, enzimas coagulantes, las bacterias iniciadoras, iniciadores secundarios como bacterias propiónicas o mohos, y bacterias no iniciadoras que oportunistamente forman parte de queso (Fox, 1989). La proteólisis se puede dividir en tres estados dependiendo del momento de la elaboración del queso: a) antes de la elaboración, ya que existe muchas proteinasas endógenas de la leche, de las que la plasmina es la principal, e hidroliza preferentemente β-caseína, b) durante la elaboración, por ejemplo en caso de la coagulación con enzimas, las cuales hidrolizan la -caseína formándose principalmente la para--caseína y facilitando la agregación del resto de la caseínas, y c) después de la elaboración, durante la maduración, donde las enzimas retenidas en la cuajada y las enzimas procedentes de los microorganismos y otras células contribuyen a la formación del aroma y cambios en la matriz del queso (Park, 2001). Trujillo et al. (1997) describió que el orden de susceptibilidad de las caseínas de quesos elaborados con leche de cabra a la actividad del cuajo animal es αS1-caseína > β-caseína > αS2caseína. La proteólisis durante la maduración de quesos se pueden dividir en dos grandes fases (Park, 2001). En la primera fase, durante las primeras dos semanas de maduración, la matriz Capítulo II. Introducción Divulgativa 23 del queso se vuelve más cremosa, con una textura más homogénea. La matriz de caseína es considerablemente debilitada por la proteólisis de sobre el 20% en un solo corte de la αS1caseína para producir el péptido αS1-I por acción del coagulante (descrito en queso Cheddar de leche de vaca, Creamer y Olson, 1982) y una acción menos extensiva sobre la β-caseína, ya que la acción del coagulante residual es más intensa que la actividad de la plasmina (Grappin et al., 1985; Fox, 1993; McSweeney y Sousa, 2000). En la segunda fase, ocurre un cambio más gradual, sobre todo en la textura, por la degradación del resto de la αS1-caseína durante un tiempo más prolongado de maduración. 2.5.3. Lipólisis La composición e integridad de la fracción lipídica es importante en la calidad final de un queso. La lipólisis resulta en la formación de ácidos grasos libres, especialmente aquellos de cadena corta y media que contribuyen al aroma del queso y también sirven como sustrato en otras reacciones, produciéndose productos finales altamente aromáticos (Collins et al., 2003). El nivel de lipólisis varía considerablemente de una variedad a otra de queso. Especialmente en algunas variedades, como en los quesos italianos y azules, los ácidos grasos libres son los mayores contribuyentes al desarrollo de sus aromas característicos (Fenelon y Guinee, 2000). Raynal-Ljutovac et al. (2005) han observado que la lipólisis en los quesos durante la maduración tiene un mayor efecto que el nivel de lipólisis inicial de la leche. La lipólisis en los quesos se debe a la presencia de enzimas lipolíticas, las cuales hidrolizan la unión éster de ácido graso y la molécula de glicerol del triglicérido a lo largo de la maduración, dando como resultado ácidos grasos libres y monoy diglicéridos (Deeth y Touch, 2000). Las lipasas que intervienen en el queso provienen de las mismas 5 fuentes que la de las proteinasas discutidas anteriormente (McSweeney y Sousa, 2000). Las peculiaridades de los ácidos grasos de la leche de cabra y su sistema lipolítico juegan un papel muy importante en el desarrollo del aroma del queso. La actividad de la lipasa Capítulo II. Introducción Divulgativa 24 lipoproteica, aunque menor que en la leche de vaca, está más unida a los glóbulos de grasa (Chilliard et al., 1984) y está más correlacionada con la lipólisis espontánea de la leche de cabra y, posiblemente, en el queso. 3. Células somáticas en la leche de cabra 3.1. ¿Qué son las células somáticas? Las células somáticas están presentes en la leche de todos los mamíferos, no tienen capacidad para multiplicarse y provienen del propio animal. Según su origen, se clasifican en dos grandes grupos: células de origen sanguíneo y células epiteliales. Las células de origen sanguíneo son leucocitos: macrófagos, polimorfonucleares (PMN) y linfocitos (Sordillo y Streicher, 2002). Normalmente estas células se encuentran en la glándula mamaria sana, aunque puede considerarse un indicador de inflamación y/o infección debido a que en estas situaciones se produce un incremento en el trasvase de leucocitos a la leche, especialmente PMN. Las células epiteliales provienen de la descamación del epitelio alveolar y de los conductos de la glándula mamaria. En la leche también podemos encontrar material extracelular membranoso, restos nucleares y fragmentos celulares (Gonzalo et al., 1998), llamados partículas citoplasmáticas, originados a partir de la porción distal de las células secretoras alveolares. Son abundantes cuando la secreción de leche es apocrina y muy escasos cuando la secreción es merocrina (Fig. 4). La producción de leche de cabra es altamente apocrina y las partículas citoplasmáticas de tamaño similar a las células somáticas son constituyentes normales de la leche de esta especie (Dulin et al., 1983). Capítulo II. Introducción Divulgativa 25 Figura 4. Esquema general de los tipos de secresión holocrina, merocrina y apocrina (http://lahistotecadenico.blogspot.com/2010/11/tejido-epitelial-glandular.html). En ausencia de infección, y en comparación con la leche de oveja y vaca, la leche de cabra presenta tres características relacionadas con los elementos celulares: elevado contenido de partículas citoplasmáticas (Paape y Capuco, 1997), elevado porcentaje de PMN (Paape et al., 2001), tanto en glándulas mamarias infectadas como no infectadas, y un mayor recuento de células somáticas (RCS) (Dulin et al., 1983; Contreras et al., 1997; Paape et al., 2007), con hasta 5 millones de células somáticas por mL en ausencia de infección (Tabla 3). Tabla 3. Recuento de células somáticas (RCS) y partículas citoplasmáticas por ml, y porcentaje de células epiteliales, polimorfonucleares (PMN), linfocitos y macrófagos en la leche de distintas especies (Boutinaud y Jammes, 2002; Paape et al., 2001). Especie RCS x 1000/mL Part. Citopl. x 1000/mL Cels. Epit. % PMN % Linfocitos % Macrófagos % Humano 9 90 50-90 6 5-9 8 Bovino 75 No detect. Muy bajo 5-20 20-30 61 Ovino 110 15 Muy bajo 22 10-25 70 Caprino 1100 128 10-20 45-75 3-10 10-35 Porcino 1 --- 60-90 5-10 15-25 5-10 Capítulo II. Introducción Divulgativa 32 Duranti y Casoli (1991) observaron una disminución del contenido de α-caseínas y βcaseína asociado con un incremento de células somáticas en la leche de oveja; Bianchi et al. (2004) encontraron que las caseínas estaban sujetas a hidrólisis, lo cual resultaba en una disminución de β-caseína e incremento de -caseína, así como mayores índices proteolíticos en la leche de oveja proveniente de ubres infectadas comparadas con la de ubres sanas. Respecto a la leche de cabra, Politis et al. (1994) demostraron que la células somáticas contienen un tipo de activador del plasminógeno, y que las actividades de la plasmina y estos activadores son mayores en la leche de cabra que en la de oveja y vaca, incrementándose con mayores niveles de RCS (Leitner et al., 2004) en aquellos cuarterones de cabras naturalmente infectados comparados con sus respectivos paralelos no infectados. Existe un desacuerdo en cuanto al efecto de las células somáticas sobre la actividad lipolítica. Jaubert et al. (1996) observó una correlación positiva entre la intensidad de sabor de cabra, lipólisis y RCS en la leche de cabra. Se ha sugerido que las células podrían ser responsables de suficiente lipólisis de los triglicéridos de los glóbulos de grasa, proveyendo defectos de sabor en la leche vaca (Azzara y Dimick, en leche mamítica; 1985; y Ma et al., 2000, en leche mamítica; Santos et al., 2003, en leche agrupada según el recuento de células somáticas). Por el contrario, otros estudios no han encontrado ninguna relación entre el recuento células somáticas y el nivel de lipólisis (Lee et al., 1980; Cartier y Chilliard, 1990). La lipólisis es un proceso que sólo ocurre en la leche de vaca cuando la membrana de los glóbulos de grasa se rompe y la grasa es accesible a las lipasas, como la lipasa lipoproteica, la cual en la leche de vaca está asociada a la fracción de caseína de la leche. Azzara y Dimick (1985) encontraron que los macrófagos de leche mamítica de vaca secretaban enzimas lipolíticas las cuales se unían a la membrana del glóbulo de grasa y la dañaban, exponiendo así los lípidos a la degradación por la lipasa lipoproteica. Capítulo II. Introducción Divulgativa 33 3.5. Efectos de las células somáticas en el queso Raynal-Ljutovac et al. (2005) concluyeron que las células somáticas, aunque son un indicador de la calidad higiénica de la leche de cabra, no parecen necesariamente empeorar la elaboración de queso. Sin embargo, Raynal-Ljutovac et al. (2007) revisaron en profundidad los aspectos analíticos, sanitarios, productivos y tecnológicos de las células somáticas sobre la leche de cabra y oveja. La mayoría de los estudios realizados compararon la leche, las propiedades de coagulación o los quesos, a partir de diferentes grupos de cabras, incluyendo infectadas y no infectadas, o cabras agrupadas de acuerdo a su nivel de RCS. Algunos de estos trabajos también fueron comparados, difiriendo entre sí al utilizar diferentes procedimientos de elaboración de queso, leche cruda o pasteurizada, o coagulación enzimática y ácida. En la Tabla 5 se resumen algunos de los resultados de los trabajos sobre el queso de cabra anteriormente citados (adaptado de Raynal-Ljutovac et al., 2007). Debido a estas diferencias, no parecen claros y objetivos los efectos que producen las células somáticas en las propiedades de la leche, calidad del queso, lipólisis y proteólisis. Tabla 5. Resumen de algunos efectos del incremento del recuento de células somáticas en la leche de cabra sobre las propiedades de coagulación y producción de queso (adaptado de Raynal-Ljutovac et al., 2007). Parámetro Efecto Referencias Propiedades de coagulación Tiempo de coagulación ↑ Pizzillo et al. (1996) y Le Mens et al. (1996) = Jaubert et al. (1996) Tiempo para adquirir firmeza = Jaubert et al. (1996) Firmeza = Jaubert et al. (1996) Propiedades del queso Rendimiento quesero ↓ Leitner et al. (2004) = Queso cremoso: Morgan y Gaspard (1999) y Galina et al. (1996) Capítulo II. Introducción Divulgativa 34 Humedad en queso ↓ Queso cremoso: Morgan y Gaspard (1999) Proteólisis y lipólisis ↑ Queso fresco cremoso: Morgan y Gaspard (1999) = Queso cremoso madurado: Morgan y Gaspard (1999) Calidad sensorial = Queso cremoso: Morgan y Gaspard (1999) y Zeng y Escobar (1996) Auldist et al. (1996) detectó que la leche de vaca con más de medio millón de células somáticas reducía el rendimiento quesero, ya que la leche estaba asociada a una mayor actividad proteolítica, menor concentración de grasa y caseínas, y un mayor contenido de proteínas séricas, especialmente albúmina e inmunoglobulinas. Pirisi et al. (2000) y Vianna et al. (2008) han descrito que mayores niveles de células somáticas en la leche resultó en un incremento del pH del queso, mientras que otros autores (Jaeggi et al., 2003) no observaron variaciones significativas. Marino et al. (2005) al añadir células somáticas aisladas de la leche de vaca mamítica a leche en buenas condiciones no encontraron diferencias significativas de pH entre los quesos. Como ya se señaló anteriormente, las células somáticas son una fuente de enzimas lisosomales (Le Roux et al., 2003), muchas de las cuales pasan a la leche y causan proteólisis y lipólisis más intensa (Le Roux et al., 1995; Albenzio et al., 2005). Muchas de estas enzimas han sido encontradas o medidas en fracciones de la leche más que en las propias células, lo que sugiere que existe una secreción o liberación desde las células, o que las células se lisan y liberan las enzimas intracelulares (Kelly y Fox, 2006). Además, hay que tener en cuenta que el incremento de las células somáticas, o su causa, normalmente viene acompañado por un desbalance de otros parámetros de la leche, por lo que es muy difícil hacer responsables a las células somáticas de los cambios en la leche y en el queso. Capítulo II. Introducción Divulgativa 35 3.5.1. Proteólisis Marino et al. (2005) recuperaron y aislaron células somáticas a partir de leche mamítica de vaca, las añadieron a leche de buena calidad higiénica, y después evaluaron su contribución a la proteólisis durante la maduración de queso Cheddar. Estos autores encontraron que añadiendo células somáticas de leche mamítica a leche sana de vaca resultó en una mayor degradación de αS1-caseína en los quesos a los 15 días de maduración, indicando una acelerada proteólisis de esta caseína. Caroprese et al. (2007), por su parte, aislaron macrófagos a partir de leche de ovejas sanas y estudiaron su actividad sobre la proteólisis y actividad de la plasmina. Cuando se lisaron estos macrófagos de la leche de oveja y se incubaron con Na caseinato, tras 24 horas se observaron cambios porcentuales en la composición de las caseínas y sus productos de degradación: las α-caseínas disminuyeron sobre un 20%, mientras que para la βcaseína no se observó ninguna degradación apreciable. Conney et al. (2000) sugirieron una influencia directa de las proteasas (en especial la catepsina D) de los PMN sobre la maduración de queso tipo suizo y sobre el alto nivel de proteólisis endógena de la leche de vaca con alto recuento de células somáticas y PMN. En este experimento, los autores tomaron leche (no especifican si era mamítica) con aproximadamente 2 millones de células por mL con más del 90% de PMN y la mezclaron con leche sana para obtener distintos porcentajes de recuento total y PMN. Kelly et al. (2000) sugirió que debería ligarse los incrementos en el contenido de PMN y no sólo el incremento del RCS al efecto en leche y derivados lácteos de vaca, ya que los PMN tienen distintos perfiles enzimáticos que los macrófagos. Y hay apreciar que, tal como se describió anteriormente, en la leche de cabra los PMN son los principales leucocitos tanto en leche mamítica como sana, por lo que las comparaciones con los resultados de experimentos con leche de vaca son ambiguos o no concluyentes. Moslehishad y Ezzatpanah (2010) describieron que un mayor recuento de células somáticas en la leche de vaca afecta a la microestructura y propiedades de las micelas de Capítulo II. Introducción Divulgativa 36 caseína, las cuales se presentaban con un menor tamaño y agregadas, debido a la hidrólisis de las partículas de caseína por un incremento de la actividad proteolítica de enzimas como la plasmina, proteasas neutras y ácidas, lo que las hace más susceptibles a la degradación. 3.5.2. Lipolisis Chen et al. (2010) no encontró diferencias significativas, en cuanto a nivel de lipólisis, en quesos de cabra elaborados con leche de animales agrupados según el nivel de células somáticas, y resultados similares has sido descritos por Jaeggi et al. (2003) en quesos curados de leche de oveja. En ambos casos, la leche fue recolectada y agrupada de acuerdo al RCS, por lo que es posible que otros componentes de la leche estuvieran involucrados, restando objetividad al efecto de las células somáticas sobre la lipólisis en los quesos. Colectivamente, se han reportados pocos estudios en la literatura sobre los efectos directos de las células somáticas de animales sanos en los quesos, y no se ha encontrado en la literatura ningún trabajo objetivo acerca de la contribución a la capacidad lipolítica de las células somáticas sobre el queso de cabra. 4. El queso bajo en grasa 4.1. Situación actual Los lípidos son componentes vitales en nuestra dieta: son una fuente de energía y de ácidos grasos esenciales. Sin embargo, el consumo de grasa saturada está altamente correlacionado con un incremento de riesgo de obesidad, arterioesclerosis, enfermedades coronarias y elevación de la presión sanguínea (Watts et al., 1996; Van Horn y Ernest, 2002). Aunque esta información hoy en día es controvertida (Astrup et al., 2011), el consumo de comidas altamente procesadas con harinas, azúcares, grasas y aceites refinados se ha incrementado considerablemente y a menudo fallan en el contenido de nutrientes esenciales (Kant, 2000). Al mismo tiempo, la disminución de las tareas del hogar y avances en los medios Capítulo II. Introducción Divulgativa 37 de transporte han incrementado la vida sedentaria en los últimos 30 años (Hill et al., 2003). Fuertemente influenciado por el cambio de la conciencia de los consumidores, la industria alimentaria se ha visto presionada para reducir la cantidad de grasa, azúcar, colesterol, sal y otros componentes en la dieta. El interés actual hacia las alimentos más saludables y la tendencia de los consumidores hacia comidas con menor contenido graso ha resultado en un creciente interés en los quesos bajos en grasa (Johansen et al., 2011). Sin embargo, la percepción de los consumidores por esos productos no ha sido especialmente positiva, y el consumo aún es bajo debido a su sabor y textura inadecuados (Childs y Drake, 2009). 4.2. Características 4.2.1. Composición química La regulación española requiere unos rangos de contenido de grasa sobre materia seca para la designación de queso graso (60-45%), semigraso (45-25%), semidesnatado (25-10%) y desnatado (<10%). De acuerdo a la literatura (Bryant et al., 1995; Rudan et al., 1999; Lteif et al., 2009), los quesos desnatados presentan mayor contenido de proteína y humedad que sus respectivos quesos grasos. La grasa y humedad actúan rellenando la matriz de caseína del queso. Cuando la grasa se reduce, la humedad no reemplaza en equivalencia la grasa eliminada (Rudan et al., 1999), lo cual resulta en un mayor contenido de proteína a medida que el contenido graso disminuye en el queso, así como un menor contenido en humedad sobre sólidos no grasos. 4.2.2. Textura La textura, especialmente en quesos, es uno de los atributos más importante que ayudan a determinar la identidad de un producto. En los quesos grasos, la grasa forma cavidades en la matriz proteica, dándole una estructura más abierta, mejorando la Capítulo II. Introducción Divulgativa 38 masticabilidad del queso (Johnson et al., 2009). La eliminación de la grasa de la leche y posterior elaboración de queso, da como resultado la formación de una red de caseína mucho más cerrada y compacta, lo que produce un queso mucho más firme (Aryana y Haque, 2001; Banks, 2004; Rahimi et al., 2007), de mayor dureza (Küçüköner y Haque, 2006; Rogers et al., 2009) y cohesividad (Bryant et al., 1995; Rudan et al., 1999; Sahan et al., 2008). 4.2.3. Proteólisis Algunos autores han descrito que reduciendo el contenido de grasa en quesos Cheddar (Fenelon y Guinee, 2000) y Mozzarella (Tunick et al., 1995) elaborados con leche de vaca resultó en mayores niveles de αS1-caseína y β-caseína durante la maduración. Este efecto podría ser debido a ciertos factores asociados a los quesos: la disminución del ratio de actividad de enzimas coagulantes y nivel de proteínas (Fenelon y Guinee, 2000) y al mayor pH en quesos desnatados, lo cual los hace menos favorables a la actividad proteolítica del cuajo residual (Tam y Whitaker, 1972; O’Keeffe et al., 1976). Dado que la proteólisis de las caseínas en el queso es inadecuada, el resultado es que el queso presenta una textura relativamente firme (Mistry et al., 1996; Mistry, 2001), y otros defectos en otros parámetros texturales, tal como se ha descrito en el apartado anterior. 4.2.4. Lipólisis En cuanto a la lipólisis en quesos desnatados, hay muy poca información en la literatura. En los quesos, a medida que el contenido de grasa es reducido, evidentemente el nivel de ácidos grasos libres también lo hace (Banks et al., 1989; Aly, 1994; Kondyli et al., 2002) cuando se expresa en relación al queso total o materia seca. Pero sería más conveniente expresar el nivel de ácidos grasos en relación a la materia grasa para estudiar el grado de lipólisis real. Dimos et al. (1996) observó que ciertos ácidos grasos expresados sobre materia grasa en quesos Cheddar reducidos en grasa aparecían en menor cantidad de lo esperado Capítulo II. Introducción Divulgativa 39 comparado en su respectivo queso graso, y sugirieron que la lipólisis fue casi completamente suprimida. La explicación que estos autores dan es que la enzima lipasa lipoproteica se ve inhibida en parte o que la matriz proteica de los quesos protege la grasa y la hace menos accesible a la lipasa (Fox et al., 1993). Sin embargo, habría que tener en cuenta otro proceso que está relacionado con la lipólisis: el catabolismo de los ácidos grasos libres. Existen reacciones metabólicas de degradación de los ácidos grasos libres en los quesos dando lugar a otros compuestos, muchos de los cuales son volátiles (Collins et al., 2003). Es posible que el menor nivel de ácidos grasos libres encontrados en los quesos bajos en grasa se deba no a una inhibición de la lipólisis, sino al catabolismo de los mismos. De hecho, Drake et al. (2010), en un análisis exhaustivo de componentes aromáticos en quesos Cheddar grasos y bajos en grasa, tanto a nivel instrumental como sensorial, observaron grandes diferencias de concentración (desbalances entre ambos quesos) de estos componentes. Los mismos componentes fueron encontrados en todos los quesos, pero en distintas concentraciones, por lo que se sugiere que la bioquímica que ocurre en quesos grasos y bajos en grasa es diferente. 4.2.5. Microestructura López et al. (2007) identificaron 4 formas de presentación de la grasa en el queso graso Emmental estudiado a nivel de microscopía laser confocal: a) Glóbulos de grasa intactos, los cuales son pequeños, esféricos y se dispersan a través del queso, b) glóbulos de grasa agregados, que aparece como un grupo de glóbulos circulares, c) glóbulos de grasa coalescentes, que se han unido y forman glóbulos esféricos pero más grandes que los típicos glóbulos de grasa, y c) grasa no globular o libre. Gunasekaran y Ding (1999) y Guinee et al. (2000) examinaron las características de los glóbulos de grasa en quesos Cheddar y encontraron que a menor contenido graso en el queso, los glóbulos de grasa eran más pequeños, se encontraban en más cantidad y disminuía la unión o coalescencia de los glóbulos remanentes. Rogers et al. (2010), reportó que, según imágenes Capítulo II. Introducción Divulgativa 40 con microscopía laser confocal, el tamaño de los glóbulos de grasa aumentaban al incrementar el contenido de grasa en el queso. Al mismo tiempo, todos estos autores coinciden en que la red proteica de los quesos bajos en grasa aparece mucho más intrincada. 4.2.6. Color Los quesos elaborados con leche baja en grasa presentan una menor opacidad y parecen más traslúcidos que sus respectivos quesos grasos (Fife et al., 1996; Merrill et al., 1996). El queso mozzarella con 6 y 10% de contenido en grasa pareció tener un índice de color verde (a* negativo) mayor, lo cual ha sido atribuido a una disminución del porcentaje de grasa (Tunick et al., 1993; Merril et al., 1994; Rudan et al., 1998a). Rudan et al. (1998b) observó que cuando añadía un sustituto de grasa, el queso se volvía más luminoso que su respectivo bajo en grasa. En general, poco se ha descrito acerca del color instrumental en quesos de cabra bajos en grasa, básicamente porque existe muy poca literatura acerca de este tipo de quesos. 4.2.7. Características sensoriales El análisis sensorial es una herramienta de alto valor para entender los aspectos que diferencian los quesos (Foegeding y Drake, 2007). La textura, color, sabor, aroma y la apariencia visual son características que pueden ser usadas para definir la calidad sensorial (Di Monaco et al., 2008). Drake (2008) ha evaluado la aceptación por parte de los consumidores de los quesos bajos en grasa, y ha identificado varios inconvenientes como son la falta de aroma, textura gomosa y pegajosa, baja fundición con el calor, y percepción sensorial por parte de los consumidores como no natural y poca atractiva comparada con los sus respectivos quesos grasos. Childs y Drake (2009) demostraron que cuando el sabor y la textura son diferentes de la versión grasa del queso, incluso si las diferencias son muy pequeñas, los consumidores no lo aceptan. Sin embargo, los consumidores estarían dispuestos a sacrificar ligeramente el sabor y Capítulo II. Introducción Divulgativa 41 la textura de estos quesos si estuvieran interesados en quesos bajos en grasa, aunque en realidad, los consumidores interesados en esta opción son pocos. Los menores niveles de ácidos grasos como el butanoico y hexanoico, y de metil-cetonas, así como el incremento de otros componentes, han sido atribuído al sabor atípico de, por ejemplo, queso Cheddar bajo en grasa (Carunchia-Whestine et al., 2006). Drake et al. (2010) evaluaron el impacto de la reducción de la grasa sobre los componentes aromáticos a nivel sensorial, y observaron que al inicio de la maduración las diferencias ya eran evidentes entre los quesos grasos y los bajos en grasa, pero que éstas se acentuaron durante la maduración prolongada: algunos descriptores se presentaban con mayor intensidad en los quesos bajos en grasa, como rosal y chamuscado, los cuales no se encontraron en los quesos grasos. No está muy claro aún que la falta de sabor en los quesos bajos en grasa sea debido a la falta de precursores de aromas derivados de la grasa, la falta de grasa como solvente de los componentes aromáticos o por las diferencias estructurales de los quesos reducidos en grasa, lo cual podría modificar el ratio de algunas reacciones enzimáticas que son esenciales para la formación de los componentes del aroma (Urbach, 1997). Siguiendo esta línea, CarunchiaWheststine et al. (2006) realizaron análisis sensoriales e instrumentales para caracterizar los aromas encontrados en quesos grasos Cheddar, los mismos quesos reducidos en grasa usando un método de centrifugación y la grasa extraída tras el proceso. Los resultados de los análisis sensoriales e instrumentales resultaron en que los quesos reducidos en grasa tenían perfiles aromáticos similares a sus respectivos quesos grasos, y la grasa extraída fue caracterizada por una baja intensidad de aromas. De esta manera, se demuestra que la mayoría de los componentes aromáticos permanecen en el queso tras la maduración y no se eliminan con la grasa. Por otro lado, Yee et al. (2007) observaron que, eliminando la grasa del queso Cheddar y Parmesano con CO2 supercrítico tras la maduración, los resultantes quesos reducidos en grasa no diferían de sus respectivos quesos grasos en cuanto a componentes aromáticos Capítulo II. Introducción Divulgativa 48 quieren purificar, como la desacidificación de aceites (Brunetti, 1989; Ayorinde y Hassan, 1995) y la descafeinización (Roselius et al., 1974; Zosel, 1974). Los fluidos supercríticos también se han usado en los procesos de extrusión para la producción de nuevos alimentos, lo que permite el uso de ingredientes termolábiles (Berry, 2000). Tabla 6. Resumen de algunos estudios sobre la extracción de componentes con fluidos supercrítico en la industria alimentaria (adaptado de Sahena et al., 2011). Producto Analito Presión (MPa) Temp. (ºC) Referencia Huevo Colesterol y lípidos 31 45 Froning et al. (1998) Leche Lípidos 10,0–35,0 50–70 Arul et al. (1987) 6,9–24,1 40–80 Lim y Rizvi (1995) Carne vacuno Colesterol y lípidos 10,3–31,0 30–50 Chao et al. (1991) 10,3–27,6 40 Merkle y Larick (1995) Carne porcina Lípidos 10,0–31,0 30–50 Chao et al. (1991) Zanahoria Carotenos 34,2–57,0 30–50 Vega et al. (1996) Hojas de alfalfa Caroteno y lutieno 10,0–70,0 40 Favati et al. (1998) Batata β-caroteno 13,8–41,4 38–48 Spanos et al. (1993) Semillas de Bixa Orellana Bixina 20,7–48,3 40–55 Degnan et al. (1991) Pasta de tomate β-caroteno y licopenos 20,0–30,0 35–65 Baysal et al. (2000) Piel de tomate Licopenos 40,5 60–110 Ollanketo et al. (2001) Piel de uva roja Antocianinos 7,0–15,0 80 Blasco et al. (1999) Aceite de piel de naranja amarga Terpenos 7,7–12,0 40 Chouchi et al. (1996) Piel de naranja seca Aceites esenciales 10,0–28,0 40–50 Blasco et al. (1999) Jugo de frutas cítricas Limonin 20,7–41,4 30–60 Kimball (1987) Plantas aromáticas Aceites esenciales 20 40 Blasco et al. (1999) Setas Oleo-resinas 11,5–14,9 del Valle y Aguilera (1989) Capítulo II. Introducción Divulgativa 49 Semillas de Tamarindo Antioxidantes 10,0–30,0 40–80 Tsuda et al. (1995) Hojas de Eucalipto Aceites con alta actividad antioxidante 20 50 Fadel et al. (1999) Lúpulo Humulona, lupulona and aceites esenciales 20 40 Langezaal et al. (1990) Por otro lado, el SC-CO2 tiene capacidad microbicida, lo que hace que tenga un gran potencial en el campo de la esterilización o reducción de carga microbiana (Perrut, 2011; Checinska et al., 2011) y así garantizar la seguridad microbiológica de los alimentos. Spilimbergo et al. (2009) describió que, durante el tratamiento con SC-CO2 a 36ºC y 100 bares de presión, existe una progresiva permeabilización de las células, y evidenció una correlación positiva entre la muerte célular y el CO2 dentro de la células, el cual es efectivo tras 10 minutos de tratamiento. La cantidad de CO2 acumulado en la fase lipídica podría entonces alterar la estructura y funcionalidad de la membrana celular al perderse la cadena lipídica al incrementar su fluidez (Isenschmid et al., 1995). En cuanto a su aplicación en productos lácteos, Astaire et al. (2003) y Costa et al. (2010), por ejemplo, usaron la tecnología de extracción con CO2 supercrítico para obtener suero de mantequilla enriquecido aún más con fosfolípidos al extrae los lípidos no polares. Fatouh et al. (2007) ensayó la extracción con SC-CO2 en un procedimiento por pasos para fraccionar la mantequilla de búfala, obteniendo 4 fracciones con propiedades químicas y físicas diferentes. En la primera fracción, obtuvieron colesterol, ácidos grasos de cadena corta y saturados a baja presión, mientras que los ácidos grasos de cadena larga y no saturados se concentraban en las siguientes fracciones a mayor presión. Spano et al. (2004) consiguieron fraccionar la grasa a partir de la leche de oveja a 40ºC y 250 bares de presión. La grasa fraccionada a partir de la grasa de la leche se puede comercializar con distintos propiedades Capítulo II. Introducción Divulgativa 50 funcionales en la industria pastelera, confitería, del chocolate y la láctea (Gibon, 2006; Kontkanen et al., 2011). Yee et al. (2007) sugirieron que esta tecnología puede ser usada en la industria láctea para desarrollar quesos con menos grasa, reteniendo todo los componentes aromáticos de los quesos grasos, y que normalmente no se desarrollan en los típicos o más comunes procesos de producción de quesos reducidos o bajos en grasa. Yee et al. (2008) demostraron que la SFE puede ser aplicada a los quesos madurados, especialmente aquellos de baja humedad y duros. La aplicación de la tecnología de extracción con fluidos supercríticos a los quesos podría ser una alternativa ventajosa, sencilla y menos destructiva para la producción de quesos con menor contenido graso, que mantengan todas las características de aroma y textura de sus respectivos quesos originales, aumentando así su valor comercial. 51 Capítulo III: Referencias Bibliográficas Capítulo III. Referencias Bibliográficas 52 Capítulo III: Referencias bibliográficas Alais, C. H. 1985. Ciencia de la leche. Principios de la Técnica Lechera. 2da Ed. Reverté. 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Physicochemical analysis of full-fat, reduced-fat, and low-fat artisan-style goat cheese 80 Capítulo IV. Physicochemical analysis of full-fat, reduced-fat, and low-fat artisan-style goat cheese 81 Capítulo IV. Physicochemical analysis of full-fat, reduced-fat, and low-fat artisan-style goat cheese 82 Capítulo IV. Physicochemical analysis of full-fat, reduced-fat, and low-fat artisan-style goat cheese 83 Capítulo IV. Physicochemical analysis of full-fat, reduced-fat, and low-fat artisan-style goat cheese 84 Capítulo IV. Physicochemical analysis of full-fat, reduced-fat, and low-fat artisan-style goat cheese 85 86 Capítulo V: Short communication: Lipolysis and proteolysis profiles of fresh artisanal goat cheese made with raw milk with three different fat contents 1. Planteamiento y Metodología. 2. Trabajo experimental Capítulo V. Short communication: Lipolysis and proteolysis profiles of fresh artisanal goat cheese made with raw milk with three different fat contents 87 Capítulo V: Short communication: Lipolysis and proteolysis profiles of fresh artisanal goat cheese made with raw milk with three different fat contents 1. Planteamiento y Metodología 1.1. Planteamiento Existen tres rutas primarias de actividad bioquímica en los quesos durante la maduración: proteólisis, lipólisis y el metabolismo del lactato, citrato y lactosa residual (McSweeney, 2004a). La proteólisis contribuye a la maduración del queso a través de la formación de componentes aromáticos y cambiando la textura del queso debido a la rotura de la red proteica (Sousa et al., 2001). La lipólisis se debe principalmente a la presencia de enzimas lipolíticas que liberan ácidos grasos de los triglicéridos, los cuales contribuyen, junto con los ácidos grasos ramificados, a las peculiares características de la leche y queso de cabra (Salles et al., 2002). Información acerca de la inadecuada proteólisis (Tunick et al., 1995; Fenelon and Guinee, 2000) y lipólisis (Banks et al., 1989; Aly, 1994; Kondyli et al., 2002) de los quesos bajos en grasa es bastante extensa, pero escasa en quesos de cabra y no existiendo la misma sobre el perfil proteico y nivel de lipólisis de quesos frescos artesanos elaborados con leche de cabra cruda. 1.1. Metodología El material y los métodos usados en este experimento y resultados han sido aceptados para publicación con el título “Short communication: Lipolysis and proteolysis profiles of fresh artisanal goat cheese made with raw milk with three different fat contents” (Comunicación corta: Perfiles de lipólisis y proteólisis de queso fresco de cabra artesano hecho con leche cruda con tres contenidos de grasa diferentes) en Journal of Dairy Science (doi:10.3168/jds.2011-4423, en prensa). Capítulo V. Short communication: Lipolysis and proteolysis profiles of fresh artisanal goat cheese made with raw milk with three different fat contents 88 En este trabajo se estudió el efecto de tres contenidos de materia grasa en el queso de cabra madurados a 1, 7, 14 y 28 días, descrito en el capítulo IV, sobre el nivel de lipólisis medido como contenido de ácidos grasos libres usando el método de “copper soap” modificado para quesos, y sobre la proteólisis medida mediante el perfil de proteínas en SDSPAGE. Los datos se analizaron mediante el paquete estadístico SAS (versión 9.0; SAS Institute Inc., Cary, NC) mediante una ANOVA de medidas repetidas de dos vías (contenido graso de la leche de origen y tiempo de maduración) considerando un valor de P<0,05 como estadísticamente significativo. Para evaluar las diferencias entre grupos se usó el test de Tukey. 2. Trabajo experimental Capítulo V. Short communication: Lipolysis and proteolysis profiles of fresh artisanal goat cheese made with raw milk with three different fat contents 89 Capítulo V. Short communication: Lipolysis and proteolysis profiles of fresh artisanal goat cheese made with raw milk with three different fat contents 96 97 Capítulo VI: Sensory analysis of full-fat, reduce-fat, and low-fat cheese elaborated with raw gaot milk 1. Planteamiento y Metodología. 2. Trabajo experimental Capítulo VI. Sensory analysis of full-fat, reduced-fat, and low-fat cheese elaborated with raw goat milk 98 Capítulo VI: Sensory analysis of full-fat, reduce-fat, and low-fat cheese elaborated with raw goat milk 1. Planteamiento y Metodología 1.1. Planteamiento La tendencia actual de comer saludablemente, junto con la preferencia de los consumidores a comidas más bajas en grasa ha resultado en un creciente interés en los quesos bajos en grasa (Johansen et al., 2011). Sin embargo, la percepción sobre los quesos reducidos y bajos en grasa no ha sido muy positiva, y su consumo aún es muy bajo debido a su inadecuado sabor y textura. Debido a la percepción integral de las características sensoriales de los productos lácteos, medir éstas es el paso final de muchos experimentos o aplicaciones. Un panel sensorial entrenado es una herramienta de gran valor para diferenciar y describir los quesos (Foegeding y Drake, 2007), así como las pruebas de consumidores nos darán una visión sobre el futuro comercial de un nuevo producto. El queso de cabra forma parte de la economía y tradición de las Islas Canarias, la mayoría producido con leche cruda y usando métodos tradicionales (Fresno et al., 2008). No existen quesos canarios reducidos o bajos en grasa en el mercado. El presente estudio de análisis sensorial forma parte de un proyecto con el objetivo de demostrar los efectos de diferentes contenidos en materia grasa de la leche cruda de cabra sobre las características de queso elaborado artesanalmente y madurado 28 días. 1.2. Metodología El material y los métodos usados en este experimento, así como los resultados obtenidos, están aceptados para publicación con el título “Sensory analysis of full-fat, reduce-fat, and low-fat cheese elaborated with raw gaot milk” (Análisis sensorial de quesos Capítulo VI. Sensory analysis of full-fat, reduced-fat, and low-fat cheese elaborated with raw goat milk 99 enteros, reducidos y bajos en grasa elaborados con leche cruda de cabra) en Journal of Applied Animal Research. El objetivo principal de este trabajo, siguiendo la línea de los dos capítulos anteriores, era profundizar en el entendimiento y proveer una línea base del efecto de la reducción de grasa en leche sobre las características sensoriales, diferencias y aceptabilidad de los quesos artesanos de leche cruda de cabra elaborados con tres contenidos de material grasa y madurados durante 1, 7, 14 y 28 días. Para ello, se desarrollaron una variedad de métodos diferentes: test triangular para detectar pequeñas diferencia en el conjunto de atributos de los quesos, de acuerdo a la norma ISO 4120 (2004); test de preferencia por los consumidores, de acuerdo a la norma ISO 4121 (2003); y perfiles descriptivos por 7 expertos especializados en quesos de cabra, de acuerdo a la metodología descrita por Beròdier et al. (1996) y Lavanchy et al. (1999) y adaptados para quesos de cabra, según lo descrito por Fresno y Álvarez (2007). Los datos de los perfiles sensoriales y resultados de las pruebas de aceptación se analizaron mediante el paquete estadístico SAS (versión 9.0; SAS Institute Inc., Cary, NC) mediante una ANOVA de medidas repetidas de dos vías (contenido graso de la leche de origen y tiempo de maduración) considerando un valor de P<0,05 como estadísticamente significativo. Para evaluar las diferencias entre grupos se usó el test de Tukey. Capítulo VI. Sensory analysis of full-fat, reduced-fat, and low-fat cheese elaborated with raw goat milk 100 2. Trabajo experimental Sensory analysis of full-, reducedand low-fat cheese elaborated with raw goat milk Davinia Sánchez-Macías1, Isabel Moreno-Indias1, Sergio Álvarez2, Megan Clevelan3, Noemi Castro1, Anastasio Argüello1*, María del Rosario Fresno2 1Department of Animal Science, Universidad de Las Palmas de Gran Canaria, Arucas 35413, Spain. 2Canary Agronomic Science Institute, La Laguna 38270, Tenerife, Spain. 3Dairy Products Technology Center, California Polytechnic State University, United States *Corresponding Author: Anastasio Argüello. Facultad de Veterinaria, Transmontaña s/n, 35413-Arucas, Spain. Phone: 34+928451094; FAX: 34+928451142. E-mail: [email protected] Capítulo VI. Sensory analysis of full-fat, reduced-fat, and low-fat cheese elaborated with raw goat milk 101 Sensory analysis of full-, reducedand low-fat cheese elaborated with raw goat milk The market for goat milk cheese has grown due to the new tendencies to consume innovative products, and the fact that it has provided a profitable alternative to cow milk cheese due to its inherent health-promoting attributes. The trends toward healthier eating have increased the interest in low-fat cheese. The objective of this study is to enable an understanding and provides a baseline of the effect of fat reduction on sensory analyses and consumer acceptability of cheeses made from raw goat milk with three different fat contents and ripened for 28 d using an artisanal method. Odor and flavor intensity was lower as fat decreased in cheese, and LFC and RFC were firmer, friable, grainier, drier, acidic, and less adhesive and sweet than full-fat cheese. Both judges and consumers preferred the FFC cheeses, mainly because of the greater intensity and the combination of this with excessive hardness and high masticability was likely the main cause of non-acceptance. Keywords: goat milk, low-fat cheese, sensory profile, consumer acceptance Introduction In affluent developed countries, more than 95% of dairy products consumed are derived from cow’s milk. Exceptions to this rule include countries of the Mediterranean basin, where ewe and goat milk and their respective products form a fundamental part of their cultural heritage (Michaelidou, 2008). Goat milk comprises only 1.98% of the milk production in the world, with the Mediterranean area being the main producer (18%) after India (22%). According to recent literature reports, ewe and goat milk products can provide a profitable alternative to cow milk products due to their specific composition, sensory qualities, and inherent health-promoting attributes (Haenlein, 2004; Raynal- Capítulo VI. Sensory analysis of full-fat, reduced-fat, and low-fat cheese elaborated with raw goat milk 102 Ljutovac et al., 2008). In addition, goat milk has been found to contain more easily digestible fat and protein than cow’s milk, as well as an increased content of vitamin A, thiamine and niacin (Haenlein, 2001). Currently, consumer demand for a diversification of cheese products requires the development of innovative products. Trends toward healthier eating and a consumer preference for lower fat foods have resulted in increased interest in low-fat cheeses (Johansen et al., 2011). However, consumer perception of lowand reduced-fat cheese has not necessarily been positive and consumption is still low because of inadequate taste and texture (Childs and Drake, 2009). To support this, the traditional characteristics of a cheese and its designation of origin have been found to be two of the most important factors influencing consumer preference in the market (Bertozzi and Panari, 1993), although flavor remains an important role for cheese purchase and consumption (Childs and Drake, 2009). Cheese is an important part of the economy and traditions of the Canary Islands (Spain): about 17,000 tons of goat milk cheese is produced per year, and most of these products are made with raw milk using traditional methods (Fresno et al., 2008). The Canary Islands have an important variety of cheeses, of which three of them are designated as being protected designation of origin (PDO): Palmero, Majorero, and de Guía and Flor de Guía cheeses. As well as the caprine and forage genetic richness, the islands have an exceptional sanitary situation due to being officially free of caprine and ovine brucellosis, which allows 500 artisan producers to sell raw milk cheese with shorter than 60 days of ripening (Fresno and Álvarez, 2007). The sensory perception of dairy foods as flavorful and wholesome is one of the keys to their enjoyment by consumers. Due to the integral nature of sensory perception with dairy foods, measuring these aspects is the final step in many experiments or applications. A trained sensory panel is a valuable tool in understanding the aspects Capítulo VI. Sensory analysis of full-fat, reduced-fat, and low-fat cheese elaborated with raw goat milk 103 differentiating cheeses (Foegeding and Drake 2007). Texture, color, taste, aroma and visual appearance can be used to define the sensory quality (Di Monaco et al., 2008). No low-fat or reduced-fat Canary cheeses are available on the market. This study is part of a project aimed at demonstrating the effects of reducing fat in goat milk on the characteristics of fresh cheese elaborated using artisan procedures. The gross composition, texture profile, and color of artisanal raw goat cheeses from the Canary Islands that were produced with milk with different fat contents have been reported by Sánchez-Macías et al. (2010), and lipolysis and proteolysis profiles of the same cheeses have shown significant differences between FFC, RFC, and LFC (Sánchez-Macías et al. in press), but information about sensory characteristics or consumer acceptance has not been determined. This study enables an understanding and provides a baseline of the effect of fat reduction on the sensory profile by experts, differences and acceptability by consumers of cheeses made from raw goat milk with three different fat contents and ripened for 28 days using an artisanal method. Materials and methods Cheese Production Animals and Cheese Formulations Raw goat milk cheeses were prepared according to traditional hand-made cheese practices common in the Canary Islands (Fresno and Álvarez, 2007), and were produced at the dairy farm of the Faculty of Veterinary, Universidad de Las Palmas de Gran Canaria. Analysis of the chemical and sensory cheese characteristics was performed at the Instituto Canario de Investigaciones Agrarias. Raw goat milk was obtained from an experimental herd of the Majorera goat dairy breed from the Animal Science Unit of Universidad de Las Palmas de Gran Canaria. Duplicate batches of experimental cheeses Capítulo VI. Sensory analysis of full-fat, reduced-fat, and low-fat cheese elaborated with raw goat milk 104 were produced and consisted of full-fat cheese (FFC), reduced-fat cheese (RFC) and low-fat cheese (LFC) ripened for 1, 7, 14 or 28 days in triplicate, resulting in a total of 72 cheese products. Processing The procedure to elaborate each type of cheese with raw goat milk was exactly the same, using the method described by Sánchez-Macías et al. (2010), using animal rennet (Marshall rennet powder, Rhône-Poulenc Texel, Dangé-Saint-Romain, France) comprising 50% pepsin and 50% chymosin and no starter cultures were added. Curd was pressed in a cheese press (Arroyo, Santander, Spain) at 2 kPa of pressure for 1 h. After pressing, the cheeses were 10 ± 0.1 cm in diameter and weighed 300 ± 15 g. The cheeses for a given fat content were divided randomly into four groups of six cheeses and allowed to ripen for 1, 7, 14, or 28 d at 10–12ºC and 80–85% relative humidity. Analysis of the Physicochemical Properties of Cheese At 1, 7, 14 and 28 d of ripening, representative samples from each cheese were analyzed for proximal composition (fat, protein, moisture and fat in dry matter) using an Instalab 600 Product NIR Analyzer (Dickey-John Inc. Minneapolis, MN). pH was measured at three internal and three external locations for each cheese. Sensory Evaluation Sensory analysis was performed using a variety of methods: (1) Triangle tests to detect small differences that may affect the set of attributes or a particular attribute between FFC and RFC or LFC were performed at 1, 7, 14, and 28 d of ripening according to ISO 4120 (2004). Fifty untrained consumers who were unaware of the experimental conditions were provided with 3 Capítulo VI. Sensory analysis of full-fat, reduced-fat, and low-fat cheese elaborated with raw goat milk 105 samples, 2 of which were the same. Cheese samples were coded in a uniform manner, using three-digit numbers, chosen randomly. All the possible sequences of the three products were given to the consumers, and each consumer indicated which one of the samples was different from the other two. The consumers were also asked for the attributes that they found in the different sample. Normal distribution, as an approximation for binomial distribution, was used for data analysis. Statistics were performed at the 95% confidence level. (2) A preference test, according to ISO 4121 (2003) at 1, 14 and 28 days of ripening was performed using 50 untrained consumers, with the goal of contributing to market research for introducing or evaluating the product. In this case a hedonic scale from 1 to 5 was used to quantify the degree of acceptance. (3) A description profile was compiled using seven specialized expert assessors. The methodology for the description profile was in accordance with that described by Beródier et al. (1996) for odor and flavor attributes, and texture was determined following the guidelines published by Lavanchy et al. (1999); both tests were adapted for goat cheese sensory analysis as described by Fresno and Álvarez (2007). Sensory panelists evaluated randomly coded cheeses ripened for 28 d. The judges cleansed their palettes between samples using unsalted crackers, Granny Smith apples, and then water containing a very low level of minerals. Sensory texture terms can be separated into “texture with fingers” (roughness, surface moisture, and springiness) and “texture in mouth” (firmness, friability, adhesiveness, solubility, moisture in mouth, and granularity), as described in Table 1. The attributes sweetness, acidity, pungency, odor and flavor intensity comprised the odor and flavor analysis. In addition, each judge was allowed to describe the odor and flavor of each sample Capítulo VI. Sensory analysis of full-fat, reduced-fat, and low-fat cheese elaborated with raw goat milk 112 the same full-fat cheese with the fat removed after ripening were almost identical. Yee et al. (2007) suggested that supercritical fluid extraction technology can be used in the dairy industry to develop cheese products lower in fat, retaining flavor compounds that may not be typically fully developed with alternative methods of low-fat cheese processing. Total assessment scores of the three cheese types reveled that FFC was considered the best, and LFC the worst. Anyway, the scores decreased for FFC at 28 d, while for LFC and RFC the total assessments increased significantly at 28 d compared to the first two weeks of ripening. These results were consistent with claims that low-fat cheeses are considered less acceptable to consumers, and that defects in the texture include increases in strength, hardness, dryness and granularity (Olson and Jonhson, 1990). Increased elasticity of LFC and RFC products has also been reported (Olson and Jonhson, 1990; Madadlou et al., 2005), but was not reproduced in the present study. These results indicate that the properties of low-fat and non-fat cheese produced using traditional artisan methods need to be improved. Significant technological advances in low-fat cheese production are available to minimize sensory and functional deficiencies (Banks, 2004) and alternative methods that include variations in processing techniques or the inclusion of additives have been developed. Madadlou et al. (2005) reported that doubling the rennet concentration in low-fat cheese improved the rheological properties and sensory impression of texture, as well as increasing meltability in Iranian white cheese. Using natural rennet (Fresno et al., 2006) can be another alternative to improve the quality of low-fat goat cheese. As fat is removed from the cheese milk, cheese-making procedures that are generally used for manufacturing full-fat cheese should be modified to correct Capítulo VI. Sensory analysis of full-fat, reduced-fat, and low-fat cheese elaborated with raw goat milk 113 the associated textural and flavor defects, including improving moisture retention and reducing acid accumulation. Fat replacers improve the sensory and functional properties of low-fat cheeses by the bulking effect associated with moisture retention and give a sense of lubricity and creaminess (Romeih et al., 2002), but Drake and Swanson (1995) have concluded that the manufacture of acceptable cheeses with a fat reduction of up to 33% and retention of good taste and texture is commercially feasible and could be achieved without the need for fat substitutes. Different methods have been employed to accelerate cheese ripening time: elevate ripening temperatures, attenuation of started bacteria, use of adjunct cultures, addition of curd slurries, addition of exogenous enzymes and microencapsulation of enzymes (Law, 2001), even the use of microencapsulated aminopeptidase from starters over expressed in E. coli (Azarnia et al., 2011). But in general, full-fat cheeses have always been more accepted than their counterparts that are lower in fat. Conclusion Fat reduction of raw goat milk to elaborate handmade cheeses using artisan methods has important effects on the sensory characteristics and consumer acceptance. Odor and flavor intensity was lower as fat decreased in cheese, and LFC and RFC were firmer, friable, grainier, drier, acidic, and less adhesive and sweet than full-fat cheese. Both judges and consumers preferred the FFC cheeses, mainly because of the higher intensity and the combination of this with excessive hardness and high masticability was likely the main cause of non-acceptance. To compete in local markets, the properties of lowand reduced-fat artisan cheeses must be improved; newly developed additives and cheese-making technologies must therefore be considered. Capítulo VI. Sensory analysis of full-fat, reduced-fat, and low-fat cheese elaborated with raw goat milk 114 References Alais CH 1985. Ciencia de la leche. Principios de la Técnica Lechera. 2da Ed. Reverté. Barcelona. Banks J. 2004. The technology of low-fat cheese manufacture. International Journal of Dairy Technology, 57: 199–207. Beródier F, M Zannoni, L Herrero, P Lavanchy, J Casals, and Adamo C. 1996. Guide d'evaluation olfacto-gustative des fromages a pate dure ou semi-dure. European Research Program AIR-CT94-2039. G.E.CO.TE.F.T. Ed: Avenue de la Resistance-B.P. 26-F-39801 Poligny, 1–72. 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Sensory analysis of full-fat, reduced-fat, and low-fat cheese elaborated with raw goat milk 115 Drake MA and Swanson BG. 1995. Reducedand low-fat cheese technology: a review. Trends in Food Science and Technology, 6: 366–69. Fenelon MA, and Guinee TP. 2000. Primary proteolysis and textural changes during ripening in cheddar cheeses manufactured to different fat contents. International Dairy Journal, 10: 151–158. Foegeding EA, and Drake MA. 2007. Sensory and mechanical properties of cheese texture. Journal of Dairy Science, 90: 1611–1624. Fresno M, and Álvarez S. 2007. Análisis sensorial de los quesos de cabra de pasta prensada. Manual de cata para el queso Majorero DOP y Palmero DOP. Editores: Mª del Rosario Fresno, Sergio Álvarez. Editorial: Instituto Canario de Investigaciones Agrarias. La Laguna, España. ISBN: 978-84-690-9887-5. Fresno M R, Álvarez S, Rodríguez V, Castro N, and Argüello A. 2006. Evaluation of the effect of rennet type on the texture and color of goat cheese. 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Flavor partition and fat reduction in cheese by supercritical fluid extraction: processing variables. Lait, 87: 269–285. Capítulo VI. Sensory analysis of full-fat, reduced-fat, and low-fat cheese elaborated with raw goat milk 119 Table 1. Standardized definitions of attributes used for the sensory profile. Attribute Definition Texture with fingers Roughness Perception of a granular surface Surface moisture Perception of a surface water film Springiness Ability of a cheese sample to rapidly regain its initial thickness after compression and deformation Texture in mouth Firmness Resistance of the sample to a very slight opening and shutting of the jaws Friability Capacity of a sample to break up into numerous pieces from the beginning of mastication Adhesiveness The effort needed for the tongue to detach a product stuck to the palate and the teeth Solubility A sensation which emerges when sample melts extremely fast in the saliva Moistness in mouth Perception of the degree of humidity in the sample Granularity Perception in the final stages of mastication of thin rounded grains in the chewed mass Basic taste Saltiness The taste of sodium chloride Sweetness The perception associated with the sweet taste of milk Acidic The taste of lactic acid Pungent Irritant sensation Capítulo VI. Sensory analysis of full-fat, reduced-fat, and low-fat cheese elaborated with raw goat milk 120 Table 2. Means and standard error of the mean (SEM) of the proximal composition and external and internal pH of FFC, RFC and LFC1 at 1, 7, 14 and 28 d of ripening. 1 d 7 d 14 d 28 d SEM Fat, % FFC 18.48d,x 22.19c,x 25.01b,x 28.61a,x 0.89 RFC 9.38b,y 10.69b,y 12.17ab,y 13.61a,y 0.39 LFC 1.12c,z 2.60bc,z 4.43b,z 8.81a,z 0.64 Fat in DM, % FFC 37.88d,x 41.03c,x 44.75b,x 47.93a,x 0.87 RFC 19.54c,y 21.93b,y 24.85a,y 26.78a,y 0.68 LFC 2.48d,z 5.79c,z 9.88b,z 18.08a,z 1.28 Protein, % FFC 18.94b,z 20.51a,z 20.47a,z 19.96a,y 0.18 RFC 20.97c,y 23.01b,y 24.38a,y 24.65a,y 0.35 LFC 22.84d,x 25.90c,x 29.37b,x 32.66a,x 0.80 Moisture, % FFC 46.95a,z 45.92a,z 44.12b,z 40.32c,z 0.57 RFC 52.00a,y 51.61a,y 50.98a,y 49.20b,y 0.29 LFC 55.69a,x 55.28a,x 55.15a,x 51.18b,x 0.41 External pH FFC 6.58a 5.03b 4.92c 4.90c,x 0.15 RFC 6.57a 5.10b 4.89c 5.01b,y 0.14 LFC 6.59a 5.10c 4.99d 5.38b,z 0.13 Internal pH FFC 6.58a 4.99b 4.74c,y 4.81c,z 0.16 RFC 6.56a 5.06b 4.82d,y 4.94c,y 0.15 LFC 6.58a 5.08c 4.91d,x 5.32b,x 0.14 a-dMeans within a row different superscripts differ (P < 0.05). x-z Means within a column different superscripts differ (P < 0.05). 1FFC, full-fat cheese; RFC, reduced-fat cheese; LFC, low-fat cheese; DM, dry matter. Capítulo VI. Sensory analysis of full-fat, reduced-fat, and low-fat cheese elaborated with raw goat milk 121 Table 3. Means and standard error of the mean (SEM) of sensory analysis of FFC, RFC and LFC1 at 7 d of ripening: texture with fingers. Attributes were scored on a 7-point scale. Texture with fingers 1 7 14 28 SEM Roughness FFC 1.00c 1.00c 2.43b 2.79a,z 0.16 RFC 1.00c 1.00c 2.14b 2.71a,z 0.15 LFC 1.00b 1.00b 2.29a 2.42a,y 0.14 SEM 0.00 0.00 0.10 0.06 Surface moisture FFC 5.79a,y 5.85a,y 4.14b 4.07b,z 0.17 RFC 6.21a,z 6.21a,z 4.14b 3.28c,y 0.25 LFC 6.21a,z 6.21a,z 4.14b 3.07c,y 0.26 SEM 0.07 0.06 0.05 0.10 Springiness FFC 3.50a 3.26a 2.42b 1.64c 0.15 RFC 3.50a 3.36a 2.79b 1.50c 0.10 LFC 3.50a 3.07a 2.57b 1.64c 0.12 SEM 0.05 0.06 0.10 0.08 a-cMeans within a row different superscripts differ (P < 0.05). x-z Means within a column different superscripts differ (P < 0.05). 1FFC, full-fat cheese; RFC, reduced-fat cheese; LFC, low-fat cheese. Capítulo VII. Objetive characterization and in isolation effects of somatic cells on finished goat milk cheese 128 cabra y oveja. La mayoría de los estudios compararon las características de la leche y queso a partir de agrupaciones de animales en función de su recuento de células somáticas, o animales con mamitis y sanos. Los trabajos revisados fueron muy diferentes unos de otros: distintos procedimientos de elaboración, leche cruda o pasteurizada, coagulación enzimática o ácida, etc. Debido a esto, no está muy claro el efecto de las células somáticas sobre la leche, el queso, la lipólisis o proteólisis. En el experimento presentado en este capítulo se aislaron células somáticas de leche de alto recuento procedente de cabras sanas y se añadieron a leche de cabra de bajo recuento pasteurizada y sin pasteurizar, de manera que el único factor de variación fue el nivel de células somáticas. Se ha propuesto los quesos en miniatura como la mejor alternativa a los experimentos en plantas piloto, ya que pueden ser preparados bajo condiciones controladas y porque se obtienen más económica, reproducible y fácilmente (Shakeel-Ur-Rehman et al., 2001). 1.2. Metodología El material y los métodos usados en este experimento, así como los resultados obtenidos han sido enviados y están bajo revisión en formato con el título “Objetive characterization and in isolation effects of somatic cells on finished goat milk cheese” (Caracterización objetiva y aislada de los efectos de las células somáticas en quesos de leche de cabra) a la revista International Dairy Journal. Mediante el proceso de centrifugación (1500 rpm x 20 min a 4ºC) se obtuvo un pool de células somáticas procedente de 2 cabras sanas con alto recuento. La leche procedente de 4 cabras sanas de bajo recuento se separó en gupos: una parte se dejó como leche cruda y la otra sufrió un proceso de pasteurización (63ºC durante 30 min). Luego, ambos grupos de leche se subdividió a su vez en 3, los cuales presentaron distintos niveles de células somáticas: leche de bajo recuento (sin adición de células del pool), leche de recuento medio (1.000.000 de células por mL) y leche de alto recuento (aproximadamente 2.500.000 células por mL). Se elaboraron Capítulo VII. Objetive characterization and in isolation effects of somatic cells on finished goat milk cheese 129 miniquesos de la siguiente manera: a 40mL de leche se le añadió cuajo animal en tubos de centrífuga de 50mL a 32ºC. La cuajada se cortó y se centrifugó a 4500 rpm durante 20 min. Se recogieron muestras de leche y suero, para medir composición química, recuento de células somáticas, densidad, pH, acidez titulable, estabilidad en etanol y tiempo de coagulación. Los quesos resultantes se dejaron madurar 1 y 7 días a 10-12ºC y 75-80% de humedad relativa. De los quesos se midieron composición química básica, color, pH, proteólisis mediante perfil proteico en SDS-PAGE y lipólisis como nivel de ácidos grasos libres. Los datos se analizaron mediante el paquete estadístico SAS (versión 9.0; SAS Institute Inc., Cary, NC) mediante un ANOVA de una vía para las muestras de leche y suero, y un ANOVA de medidas repetidas de dos vías (pretratamiento de la leche y tiempo de maduración) considerando un valor de P<0,05 como estadísticamente significativo. Para evaluar las diferencias entre grupos se usó el test de Tukey. 2. Trabajo experimental Objective characterization and in isolation effects of somatic cells on finished goat milk cheese D. Sánchez-Macías1, A. Morales-delaNuez1, A. Torres2, L. E. Hernández-Castellano1, R. Jiménez-Flores3, N. Castro1 and A. Argüello1* 1Department of Animal Science, Universidad de Las Palmas de Gran Canaria, Arucas 35413, Spain. 2Canary Agronomic Science Institute, La Laguna 38270, Tenerife, Spain. 3Dairy Products Technology Center, California Polytechnic State University, USA Capítulo VII. Objetive characterization and in isolation effects of somatic cells on finished goat milk cheese 130 *Corresponding Author: Anastasio Argüello. Facultad de Veterinaria, Transmontaña s/n, 35413-Arucas, Spain. Phone: 34+928451094; FAX: 34+928451142. E-mail: [email protected] ABSTRACT The interest in goat milk and products has increased potential marketing opportunities. However, the milk quality criteria and limits for SCC established in many countries makes very difficult maintaining bulk tank goat milk SCC below the threshold due to non-infection factors linked to goat physiology. The aim of this study was to objectively verify the effects of somatic cells (200,000, 1,000,000, and 2,500,000 cells mL-1) on fresh goat cheese. Somatic cells were recovered from pooled healthy goat milk, which were added to low SCC raw or pasteurized goat milk. Miniature cheeses were made and evaluated after 1 and 7 d. Somatic cells intensively affected lipolysis in cheese, increasing FFA regardless if milk was raw or pasteurized. Two important conclusions about proteolysis were found in this work: somatic cell effect on proteolysis is specific for caseins, and, in addition, the proteolytic effects of somatic cells on main caseins in cheese are different if cheeses are elaborated with raw or pasteurized milk. The somatic cells addition affected the incremental color: lightness decreased in 7 d in all cheeses, while a* and b* values increased only in pasteurized milk cheeses. We concluded that somatic cells themselves in goat milk affect some cheese parameters, which could results in a different product. Keywords: goat milk cheese, somatic cell count, proteolysis, lipolysis. 1. Introduction Currently, goats and goat milk have showed an increased demand to be used in diverse products and as alternative products for consumers with cow milk intolerance (Tziboula- Capítulo VII. Objetive characterization and in isolation effects of somatic cells on finished goat milk cheese 131 Clarke, 2003). According to Food and Agriculture Organization of the United Nations (FAOSTAT, 2010), the worldwide dairy goat population reached 179 million in 2008 and goat milk production surpassed 15.2 million tons, representing significant increases of 15 and 17%, respectively, as compared with a decade ago. The population of dairy goats in The United States of America and European Union in 2008 was 305,000 and 8,093,429, respectively. According to Haenlein (2004) and Park and Haenlein (2007) there are three reasons for the demand of goat milk: increased home consumption due to a growing human population, interest in goat milk products, and medical purposes. Ribeiro and Ribeiro (2010) and Silakinove, Leitner, Merin, & Prosser (2010) reinforce the healthy properties of milk and products from goats in reviews justifying its high quality and benefits. Mowlen (2005) reported that people are not overly concerned too much about the cost of both health and specialty foods markets if they can see the benefits of consuming goat products. Milk quality criteria have been established in many countries according to hygienic, technological and sensorial requirements. These milk quality criteria are part of the payment system of milk, which will, in return, ensure a better quality (hygienic and sensorial) of the final products (Raynal-Ljutovac, Laborit & Lauret, 2005). In the United States the legal limit established for SCC in milk by the Food and Drug Administration for cows is 750,000 mL-1 and for goats 1,000,000 mL-1. In the European Union (Directive 92/46ECC Council, 1992) the legal limit for cows is 400,000 mL-1 and there is no legal limit for goats and sheep. Some authors (Paape et al., 2007; Raynal-Ljutovac, Pirisi, Crémoux & Gonzalo, 2007) have reported that North American goat dairymen have difficulty maintaining bulk tank goat milk SCC below the threshold of the United States limit. This is due to non-infectious factors (Fernández, Rodríguez-Alcala, Abilleira, de la Puente & Fontecha, 2009; Haenlein and Hinckley, 1995; Paape, Poutrel, Contreras, Marco & Capuco, 2001) that have major impact Capítulo VII. Objetive characterization and in isolation effects of somatic cells on finished goat milk cheese 132 on counts in goat milk, and this should be taken into account when the European Union establishes limits on SCC in goat milk. Numerous studies have shown that increased SCC in cow milk produces a decrease in milk production and affect the milk composition, which causes a reduction in the ability to produce cheese and decreases the shelf-life of consumer milk (Erden, Atasever & Kul, 2010; Ma et al., 2000; Politis and Ng-Kwai-Hang, 1988;). The main component of the economic loss associated with SCC is the reducing milk production in cows with mastitis (Huijps, Lam & Hogeveen, 2008). Raynal-Ljutovac et al. (2005) concluded that somatic cells, although they are an indicator of the hygienic quality of goat milk, do not seem to necessarily impair cheese making. However, Raynal-Ljutovac et al. (2007) intensively reviewed analytical, sanitary, productive and technological aspects of somatic cells on goat, and controversies among the conclusions of the studies were found, probably due to the different variables, as the variety of cheese-making or using different animals in each experimental group. Despite these differences, it is not clear the effects of somatic cells on milk properties, cheese quality, lipolysis and proteolysis. Marino, Considine, Sevi, McSweeney & Kelly (2005) recovered somatic cells from mastitic cow milk and added them to good quality milk, then evaluated their contribution to proteolysis during Cheddar cheese ripening. Caroprese et al. (2007) studied the effect of macrophages to proteolysis and plasmin (PLe) activity in ewe bulk milk. Somatic cells own a range of lysosomal enzymes, like B, cathepsin D, cathepsin G and elastase (Le Roux, Laurent & Moussaoui, 2003), many of which pass to the milk where they cause proteolysis and lypolysis more intense in the milk (Albenzio et al., 2005; Le Roux, Colin & Laurent, 1995). Many of the enzymes that originate from somatic cells have been found or measured in fractions of milk other than the cells themselves (e.g., in skimmed milk or whey), suggesting that leakage or secretion of enzymes occurs, or that the cells lyse and release their intracellular enzymes (Kelly and Fox, 2006). Moreover, the increase of somatic Capítulo VII. Objetive characterization and in isolation effects of somatic cells on finished goat milk cheese 133 cells or its cause usually is accompanied by imbalances in other parameters in milk, so it is very difficult to hold somatic cells responsible for changes in milk and cheese. Milk pasteurization is commonly practiced before making cheese. This heat-treatment functions in reduction of microorganisms, activation–inactivation of indigenous milk proenzymes and enzymes, denaturation of serum proteins, and modification of starter bacteria activity. It also concomitantly reduces fermentation and degradation reactions (Grappin and Beuvier, 1997; Buchin et al., 1998). Marino et al. (2005) reported that proteolysis during ripening of cheese increased with somatic cell addition, although this effect was reduced by pasteurization after cell addition. A relationship between milk proteolysis and SCC has been described by Hachana and Kraiem (2009). In the Canary Islands, Spain, 91 tons of goat milk is produced per year for use in cheese-making, and most of these are made with raw milk using traditional methods and are mainly consumed following short ripening periods (Fresno et al., 2008). The agricultural economy has benefitted in recent years by the higher interest in goat cheese, and it can be feasible for many small-scale farmers to use traditional practices in making high quality goat cheese. Currently, there is interest in preserving the traditional cheese production methods. Sánchez-Macías et al. (2010) examined the possibility of using hand-made practices to amply the goat cheese market and to compete with industrial low-fat cheese. Collectively, few studies about the direct effect of somatic cells from healthy animals on cheese have been reported in the literature, and no objective study has been reported about the contribution of somatic cells on goat cheese elaborated by a simple rennet cheese-making process using raw milk. The aim of this study was to objectively verify the effects of somatic cells on chemical composition, proteolysis, lipolysis and color in fresh goat cheese, and at day 1 and 7 of ripening. Capítulo VII. Objetive characterization and in isolation effects of somatic cells on finished goat milk cheese 134 2. Material and methods 2. 1. Recovery of Somatic Cells Somatic cells were recovered by centrifugation (1500 rpm x 20 min at 4˚C) (Beckman, J2-CI Centrifuge, Beckman Coulter Inc., Miami, FL) from high SCC raw milk (approximately 1.78 x 106 cells/mL) from 2 healthy Majorera breed goats. The resulting pellet was resuspended in phosphate buffered saline at pH 6.8, as described by Verdi and Barbano (1991) until a pool with approximately 21 x 106 SCC/mL was obtained. The SCC of this stock preparation, before and after dilution in PBS, was determined using a DCC Device counter (DCC, DeLaval International AB, Tumba, Sweden). The type of somatic cell in the pool was not specifically determinate, but is likely that the somatic cell population in goat milk is predominated by polymorphonuclear neutrophils (45-74%), followed by macrophages (1541%) and lymphocytes (9-20%) (Dulin, Paape, Schultze & Weinland, 1983). 2. 2. Cheese Production 2. 2. 1. Cheese Formulation Miniature cheese systems have been proposed as the best alternative to pilot plant experiments, as closers to cheese than any other model proposed to date. Moreover, they can be prepared under controlled conditions and are more economical, reproducible and easier to obtain (Shakeel-Ur-Rehman, Fox, McSweeney, Madkor & Farkye, 2001). Raw goat milk with low SCC (approximately 2 x 105 SCC/mL) was obtained from four goats from a healthy experimental herd of Majorera dairy goat breed from the Animal Science Unit of Universidad de Las Palmas de Gran Canaria, and was used to elaborate the cheeses. Four batches of experimental cheeses were produced consecutively over four days using six different experimental treatments (three levels of SCC and pasteurization or nonpasteurization). Each day the raw goat milk was separated into two groups: raw milk or Capítulo VII. Objetive characterization and in isolation effects of somatic cells on finished goat milk cheese 135 pasteurized milk (63ºC for 30 min); and both groups were then divided into three subgroups with different levels of the somatic cells: low SCC milk (without somatic cells added), medium SCC milk (mean value approximately 1 x 106 SCC/mL), and high SCC milk (mean value approximately 2.5 x 106 SCC/mL). The finished cheeses were ripened for 1 and 7 d in duplicate, resulting in a total of 96 cheese products (4 batches x raw or pasteurized milk x 3 level of SCC x 2 ripening times x in duplicate). 2. 2. 2. Manufacture of Miniature Cheese. Cheeses were elaborated with six different milk treatments: raw milk low SCC (RL) cheese, raw milk medium SCC milk (RM) cheese, raw milk high SCC (RH) cheese, pasteurized milk low SCC (PL) cheese, pasteurized milk medium SCC (PM) cheese, and pasteurized milk high SCC (PH) cheese. Milk was salted with NaCl at 4%. The same procedure was used to elaborate each type of miniature cheese: 40 mL of milk were poured in four 50 mL-centrifuge tubes, which were then placed in a water bath at 32°C. Animal rennet (commercial rennin powder, Marshall rennet power), comprised of 50% pepsin and 50% chymosin was added. No starter cultures were added. Curd was cut after 45 min of clotting time with a stainless-steel spatula and allowed to stand for additional 5 min. The curds were centrifuged at 4500 x rpm for 20 min and the whey was discarded. Cheeses were divided randomly into two groups and allowed to ripen 1 or 7 d at 10-12ºC and 75-80% relative humidity. 2. 3. Gross composition, pH and intrumental color of cheese A Minolta colorimeter CR-400/410 (Illuminant D65, Konica Minolta, Osaka, Japan) was used to determine external and internal lightness (L), yellow index (b*), and red index (a*), as well the pH at central location, for each cheese in triplicate. After that, cheese samples Capítulo VII. Objetive characterization and in isolation effects of somatic cells on finished goat milk cheese 136 were cut into small pieces, weighed and freeze-dried. The weight difference before and after the freeze-drying was used to calculate the percentage of moisture content. The rest of the analysis was performed with the resultant dried matter. Soxhlet extraction was performed to quantify the fat content in dry basis using a Büchi 810 Soxhlet fat extraction apparatus (Büchi Labortechnik, Flawil, Switzerland). Protein content was determinate in duplicate as % N x 6.38 using a LECO CNS-2000 nitrogen analyzer (Leco Corporation, St. Joseph, MI). 2. 4. Extraction of Proteins and Electrophoretic Analysis All chemical reagents were of analytical grade from Panreac (Barcelona, Spain), Merck (Darmstadt, Germany), and Bio-Rad (Hercules, CA). Water-soluble proteins were extracted from the cheeses tested at 1 and 7 d of ripening using the method described by Tunick, Malin, Smith & Hilsinger (1995) with modifications. Briefly, 2.5 mL of buffer (0.166 M Tris, 0.001 M EDTA, pH 8.0) was added to 0.5 g of freeze-dried cheese and vortexed for 15 min. To this mixture, 2.5 mL of 7% SDS was added, and the sample was vortexed again for 5 min. Then 1 mL of 10 mM dithiothreitol buffer was added, and the mixture was vortexed and held in an ice bath for 20–30 min. Samples were then centrifuged for 1 h at 4ºC at 18,000 rpm (Beckman, J2-CI Centrifuge; Beckman Coulter Inc., Miami, FL). The supernatant was filtered, lyophilized, and stored at –20ºC until analysis. Lyophilized samples were prepared, separated by SDS-PAGE (Laemli, 1970), and stained according to Sánchez-Macías et al. (2011). Images of stained gels were captured with a Bio-Rad imaging device (Gel Doc EQ; Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA), and bands were quantified using Quantity One Quantitation Software (Bio-Rad Laboratories). Densitometry analysis of the gels was performed using lane-based background subtraction followed by measurement of the bands by the area under the intensity profile curve, and the values were then used for statistical analysis. Each sample was analyzed on duplicate gels. Capítulo VII. Objetive characterization and in isolation effects of somatic cells on finished goat milk cheese 137 Individual protein species from cheese samples were identified by comparing their relative mobilities with those of standard proteins (Bio-Rad Laboratories) from a previous SDSpolyacrylamide gel. 2. 5. Total FFA (Copper Soap Method) The total FFA content was determined using the copper soap method (Melilli et al., 2004; Shipe, Senyk, & Fountain, 1980) as modified for cheese analysis according to SánchezMacías et al. (In press). Absorbance was measured at 440 nm in a cuvette using a SmartSpec Plus Spectrophotometer (Bio-Rad Laboratories). A standard curve was constructed using palmitic acid crystal grade at increasing concentration in hexane. Each standar (1mL) was added to a centrifuge tube, and let to evaporate the solvent under the hood. After the solvent was completely removed, 1 mL of deionized water was added to the tube, and the set of standards was carried through the full analysis with the cheese samples and two blanks. Absorbance readings of the standards were corrected by subtracting the average of the two blanks readings, and a regression line was constructed that correlated the corrected absorbance with micrograms of palmitic acid. The level of FFA in the cheese samples was calculated from the standard curve. The final results were expressed as milligrams of FFA per 100 g of dry matter of cheese and were also converted to milligrams of FFA per g of fat in cheese. 2. 6. Statistical Analysis. Statistical analyses were performed using the SAS program package (Version 9.00, SAS Institute Inc., Cary, NC). A PROC MIXED procedure (analysis of variance with repeated measures) was used to evaluate the effect of different SCC level and times of ripening on the chemical composition, pH, lipolysis level, primary proteolysis and lightness