Estudio de la respuesta inmune frente a Haemonchus Contortus en dos razas ovinas canarias

UNIVERSIDAD DE LAS PALMAS DE GRAN CANARIA FACULTAD DE VETERINARIA Instituto Universitario de Sanidad Animal y Seguridad Alimentaria Arucas JUNIO 2011 ESTUDIO DE LA RESPUESTA INMUNE FRENTE A HAEMONCHUS CONTORTUS EN DOS RAZAS OVINAS CANARIAS Álvaro Hernández Barral Tesis Doctoral A mi abuelo Dionisio ÍNDICES Índices ÍNDICE INTRODUCCIÓN Y OBJETIVOS 3 REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA 9 1. INTRODUCCIÓN 9 2. GENERALIDADES SOBRE HAEMONCHUS CONTORTUS Y OTROS NEMATODOS GASTROINTESTINALES DEL GANADO OVINO 10 2.1. Clasificación taxonómica y descripción morfológica 10 2.1.1. Superfamilia Trichostrongyloidea Cram, 1927 10 2.1.2. Familia Trichostrongylidae Leiper, 1912 11 2.1.3. Género Haemonchus Cobb, 1898 11 2.1.4. Haemonchus contortus (Rudolphi, 1803) 11 2.2. El ciclo biológico de los tricostrongílidos en el ganado ovino, con especial referencia a H. contortus 12 2.3. Factores epidemiológicos de relevancia en la parasitación por H. contortus 14 2.3.1. Contaminación del pasto con huevos de H. contortus 14 2.3.2. Desarrollo larvario en las heces 15 2.3.3. Modelos epidemiológicos para H. contortus 15 2.3.3.1.Climas templados 15 2.3.3.2.Climas tropicales 17 2.3.3.3.Península Ibérica 17 2.3.3.4.Isla de Gran Canaria 17 2.4. Acción patógena de H. contortus 18 2.4.1. Signos clínicos y lesiones 19 2.5. El uso de fármacos antihelmíticos en la lucha frente a los nematodos gastrointestinales 21 2.5.1. Resistencias a los antihelmínticos 22 3. RESPUESTA INMUNE FRENTE A LOS NEMATODOS GASTROINTESTINALES 23 3.1. Introducción 23 3.2. Factores que influyen en la respuesta inmune 24 3.2.1. Edad 24 3.2.2. Sexo 24 I Índices aaaaaaaaa aaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa 3.2.3. Especie, raza e individuo 25 3.2.4. Estado hormonal 25 3.2.5. Nutrición 26 3.2.6. Tratamientos antihelmínticos 27 3.2.7. Patogenicidad de la cepa parasitaria 27 3.3. Inmunidad innata frente a parásitos 28 3.4. Inmunidad adaptativa 30 3.4.1. Presentación del antígeno y orientación de la respuesta inmunológica 30 3.4.1.1.Teoría común de la mucosa 32 3.4.1.2.El binomio Th1/Th2 en pequeños rumiantes 32 3.4.2. Mecanismos efectores de resistencia 33 3.4.2.1.Respuestas linfocitarias 33 a) Respuestas linfocitarias en inoculaciones primarias 34 b) Respuestas linfocitarias en inoculaciones secundarias 35 c) Marcadores de linfocitos T 35 3.4.2.2.Mastocitos, basófilos y leucocitos globulares 36 a) Activación de los mastocitos 37 b) Mastocitos y fenómeno de autocura 38 c) Asociación entre hiperplasia de mastocitos/leucocitos globulares y resistencia 38 d) Función de los mastocitos en la expulsión de nematodos gastrointestinales 39 3.4.2.3.Eosinófilos 40 a) Activación de los eosinófilos 41 b) Eosinofilia en infecciones primarias 42 c) Eosinofilia en infecciones secundarias. Inmunidad adquirida 42 3.4.2.4.Células mucosas y caliciformes 45 3.4.2.5.Efecto del mucus y de la motilidad gastrointestinal 46 3.4.2.6.Efecto de las citoquinas en la respuesta inmune frente a nematodos gastrointestinales en rumiantes 47 a) Perfiles de citoquinas en respuestas primarias y secundarias 49 3.4.2.7.Respuesta inmune humoral frente a nematodos gastrointestinales. 51 3.5. Manifestaciones de la respuesta inmune frente a nematodos gastrointestinales 54 3.5.1. Frente a estadios larvarios 54 3.5.1.1.Hipobiosis 54 3.5.1.2.Fallo en el establecimiento larvario 55 3.5.2. Manifestaciones de resistencia frente a nematodos adultos 56 3.5.2.1.Expulsión de los vermes adultos 56 3.5.2.2.Cambios en la morfología 57 II Índices 3.5.2.3.Reducción de la fecundidad 58 3.6. Evasión de la respuesta inmune por el parásito 59 4. ESTIMULACIÓN DE LA RESPUESTA INMUNE COMO MÉTODO ALTERNATIVO PARA EL CONTROL DE LOS NEMATODOS GASTROINTESTINALES EN EL GANADO OVINO 60 4.1. Control nutricional 61 4.2. Vacunación 61 4.2.1. Uso de larvas atenuadas 62 4.2.2. Uso de antígenos naturales 62 4.2.3. Uso de antígenos ocultos 63 4.3. Selección genética de la resistencia a los nematodos gastrointestinales 63 4.3.1. Dentro del rebaño 64 4.3.2. Aprovechamiento de razas genéticamente resistentes a) Importancia y utilidad de las razas resistentes 67 • Explotación de las razas en su medio natural 67 • Utilización de cruces entre razas 67 • Conservación de genes de resistencia 69 • Modelos de respuesta inmune y dianas farmacológicas 69 b) Razas descritas como resistentes frente a H. contortus 70 5. EL OVINO EN LAS ISLAS CANARIAS: OVINO CANARIO DE PELO Y OVINO CANARIO 73 5.1. Introducción 73 5.2. El Ovino Canario de Pelo 76 5.3. El Ovino Canario 78 MATERIAL Y MÉTODOS 83 1. ANIMALES 83 2. PARÁSITOS 83 3. PROTOCOLO EXPERIMENTAL 84 3.1. Inoculación experimental 84 3.2. Recogida de sangre y suero 84 3.3. Recogida de heces 84 3.4. Recogida de muestras tras el sacrificio 85 3.4.1. Recogida de muestras para estudio histólogíco e inmunohistoquímico 85 3.4.2. Recogida del contenido abomasal 87 III Índices aaaaaaaaa aaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa X ABREVIATURAS DE USO MÁS FRECUENTE APC: células presentadoras de antígeno (antigen presenting cells) CAN: Canario (ovino) CAP: Canario de Pelo (ovino) dpi: días post-inoculación ES: excreción-secreción (antígenos de) FEC: recuento fecal de huevos (fecal egg count) GI: gastrointestinales (nematodos) hpg: huevos por gramo de heces IFN γ: interferón γ IL: interleuquina L3, L4: larvas 3 ó 4 MHC I/II: complejo mayor de histocompatibilidad I/II (major histocompatibility complex) pi: post inoculación p.v.: peso vivo p/v: peso / volumen s: desviación estándar muestral v/v: volumen/volumen : media muestral x INTRODUCCIÓN Y OBJETIVOS Introducción y Objetivos INTRODUCCIÓN Y OBJETIVOS La enorme importancia de la ganadería ovina en España estriba no sólo en los productos derivados de la misma, leche y carne fundamentalmente, sino también en la gran cantidad de empleos directos e indirectos que genera, especialmente en áreas rurales. La cabaña ganadera ovina de las Islas Canarias representa un pequeño porcentaje del total nacional, y está orientada principalmente a la producción de queso, generalmente a base de mezcla de leche de oveja y cabra, así como a la de carne. Se trata de una ganadería en crecimiento, en la que las condiciones naturales de aislamiento han permitido la selección de razas autóctonas de gran interés productivo y genético, muy adaptadas al medio ambiente y a los sistemas de producción locales, entre las que destacan el ovino Canario (CAN) y el ovino Canario de Pelo (CAP). Una de las mayores amenazas para la rentabilidad de la ganadería de pequeños rumiantes en todo el mundo son las gastroenteritis parasitarias, causadas por nematodos de la familia Trichostrongylidae. En climas tropicales y subtropicales destaca por su elevada prevalencia y patogenicidad la especie hematófaga Haemonchus contortus, que se aloja en el abomaso de ovejas y cabras. Hasta hoy, el control de estos parásitos se ha basado en el uso de fármacos antihelmínticos de probada eficacia. Sin embargo, diversos factores, entre los que destacan la aparición de cepas resistentes del parásito a los distintos fármacos, y el interés creciente entre los consumidores por disminuir los residuos farmacológicos en los productos de origen animal, hacen necesaria la búsqueda de nuevos métodos de control complementarios y/o alternativos. Muchos de ellos tratan de estimular la respuesta inmune del hospedador, mediante la dieta, la administración de vacunas o la selección de animales que manifiesten resistencia natural frente al parásito. La comprensión de la respuesta protectora frente a estos parásitos se plantea como una de las claves para afrontar con éxito la lucha contra los mismos en el futuro. El estudio de los mecanismos de resistencia natural a la parasitación por parte de algunas razas, proporcionaría modelos de respuesta eficaces, y sería de gran utilidad para el conocimiento de nuevas dianas farmacológicas, la síntesis de vacunas y la selección ganadera. Tan sólo algunas pocas razas ovinas en todo el mundo han sido identificadas como resistentes frente a nematodos gastrointestinales. Habitualmente se trata de razas locales, de elevada rusticidad y censo reducido, dado su progresivo desplazamiento por otras razas de mayor - 3 - Introducción y Objetivos aaaaaaaaa aaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa productividad. A su valor como fuente de riqueza y patrimonio cultural en sus regiones, se le sumaría en estos casos su capacidad para resistir estas parasitosis mejor que otras razas más comerciales. Por ello, organismos internacionales como la FAO han insistido en su conservación y promoción. En análisis fecales realizados rutinariamente por la Unidad de Parasitología y Enfermedades Parasitarias del Departamento de Patología Animal, Producción Animal, Bromatología y Ciencia y Tecnología de los Alimentos de la Facultad de Veterinaria de la Universidad de las Palmas de Gran Canaria, se había observado que los recuentos de huevos de nematodos del Orden Strongylida eran sistemáticamente más bajos en los Ovinos CAP que en los ovinos CAN en granjas en las que ambas razas se explotaban conjuntamente. Este dato sugirió la posibilidad de que la raza de pelo (CAP) fuera más resistente que el ovino CAN a la infección por nematodos gastrointestinales. Como planteamiento inicial de la presente Tesis Doctoral, se consideró comprobar experimentalmente estos resultados y ahondar en los mecanismos que potencialmente podrían explicar esta situación. En el desarrollo de este trabajo se realizó una única inoculación experimental con L3 de Haemonchus contortus en ovinos de las dos razas. Asimismo, se llevó a cabo un seguimiento de la infección parasitaria, in vivo, mediante la determinación de los recuentos fecales de huevos y, tras el sacrificio de los animales, se contabilizaron y midieron los vermes en abomaso. Para valorar la tolerancia, en términos fisiopatológicos, o resiliencia de los hospedadores, se realizaron análisis hematológicos semanales de todos los animales. Finalmente, se llevó a cabo un estudio de la respuesta celular en sangre periférica y a nivel local en la pared del abomaso de los animales sacrificados y de la producción de inmunoglobulinas específicas, tanto en suero como en el mucus gástrico, así como de la producción local de algunas galectinas. Los datos recogidos no sólo fueron expuestos de modo descriptivo, sino que también se analizaron estadísticamente en profundidad. Por un lado se evaluó la significación estadística de las diferencias observadas en las medias de los diferentes parámetros para ambas razas. A su vez, las diferentes variables fueron correlacionadas entre sí, intentando establecer una asociación entre ellas. - 4 - Introducción y Objetivos - 5 - Por tanto, los objetivos planteados en la presente Tesis Doctoral fueron los siguientes: Objetivo general: • Comparar los resultados parasitológicos, hematológicos y la respuesta inmune celular y humoral tras una infección experimental con 20000 L3 de una cepa de H. contortus de reconocida patogenicidad en dos razas ovinas autóctonas canarias, ovino Canario de Pelo (CAP) y Canario (CAN) Objetivos específicos: Comparar, tras la inoculación experimental con H. contortus en ovinos CAP y CAN: 1. La resistencia a la infección por H. contortus en ambas razas, valorando: a. Cargas parasitarias y longitud de los vermes. b. Fecundidad parasitaria. c. Establecimiento y desarrollo larvario. 2. La resiliencia / tolerancia a la infección en ambas razas, valorando: a. Evolución semanal del valor hematocrito. b. Evolución semanal de las proteínas plasmáticas. 3. La respuesta inmunitaria desarrollada por las dos razas ovinas, comparando: a. Los recuentos de células efectoras (eosinófilos, mastocitos y leucocitos globulares), diversas subpoblaciones linfocitarias (CD4+, CD8+, γδ+, WC1+, CD2+, CD5+ y CD45R+) y células presentadoras de antígeno (CD1+ y MHC II+) y producción de galectinas-14 y 15; a los 7 y 28 dpi. b. La evolución semanal de linfocitos, eosinófilos y neutrófilos, en sangre periférica. c. La evolución semanal de la IgG y de la IgA séricas específicas de antígeno somático de L3 y verme adulto, así como de productos de excreción/secreción (ES) de estos últimos. d. Niveles de IgA específica frente a antígeno somático de L3 y de adultos, así como frente a antígeno ES de adultos en mucus, a los 7 y 28 dpi. 4. Comparar las relaciones entre variables parasitológicas, hematológicas e inmunológicas en ambas razas. Revisión Bibliográfica REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA 1. INTRODUCCIÓN Entre los distintos parásitos que afectan al tracto gastrointestinal del ganado ovino y caprino, Haemonchus contortus destaca por su amplia distribución y por su elevada patogenicidad. Es un nematodo perteneciente al Orden Strongylida, Superfamilia Trichostrongyloidea, que se aloja en el abomaso de los pequeños rumiantes (Soulsby, 1987). Entre los efectos patógenos que produce destacan la anemia, la hipoproteinemia y el retraso en el crecimiento, llegando a provocar en ocasiones la muerte en animales jóvenes fuertemente parasitados. Actualmente el control se realiza mediante tratamientos estratégicos con antihelmínticos, lo que se estima corresponde al 10% del gasto mundial en fármacos veterinarios (Kassai, 1999). Las pérdidas económicas debidas a este parásito son especialmente severas en países en vías de desarrollo. En Etiopía Biffa et al., 2007 cuantificaron en 82 millones de dólares anuales las pérdidas causadas por nematodos GI en pequeños rumiantes y, sólo en fármacos, se calculó que la hemoncosis podría provocar gastos anuales del orden de 46 y 103 millones de dólares en Sudáfrica e India, respectivamente (Mcleod, 2004; Waller y Chandrawathani, 2005). Para Australia, un país desarrollado con una gran cabaña ovina, Sackett et al. 2006, valoraron en 369 millones de dólares (AUD$) las pérdidas debidas a nematodos GI. A estas pérdidas han de añadirse los inconvenientes asociados al uso de fármacos antihelmínticos. A pesar de la magnífica aceptación que originariamente tuvieron entre ganaderos y veterinarios por su tremenda eficacia, en la actualidad su utilidad profiláctica y terapéutica se cuestiona, pues los parásitos han desarrollado resistencias a todos los grupos de antihelmínticos presentes en el mercado (FAO, 2004; van Wyk et al., 2006). Además, los consumidores exigen productos animales libres de residuos farmacológicos, lo que tiende a restringir su uso. Por todo ello, se plantea como una prioridad la búsqueda de métodos de control alternativos o complementarios. (Kassai, 1999). En esa línea, diferentes estudios han evaluado la eficacia de distintos procedimientos como la modificación de la dieta (Waller, 1997b; Bricarello et al., 2005; Valderrábano et al., 2006), la utilización de hongos vermicidas para el control de los estadios preparasíticos (Waller et al., 2004), o el uso de vacunas (Knox et al., 2003; Newton y Meeusen, 2003). La utilización de estos métodos en un programa integrado de control de gastroenteritis de origen parasitario, que incluya un uso racional de los - 9 - Revisión Bibliográficaaaaaaaaaaa aaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa antihelmínticos y un manejo adecuado, podría minimizar las pérdidas antes reseñadas (Stear et al., 2007). Por otra parte, no todos los animales son igualmente susceptibles a este parásito. Diversos factores relacionados tanto con el hospedador (tales como la edad, el estado nutricional, la alimentación, la especie, raza y el sexo), como con el parásito (tales como la carga y la cepa parasitaria involucrada en cada caso) influyen en esta mayor o menor susceptibilidad. Factores como la especie y raza hospedadora sugieren que, al menos parcialmente, existe una cierta base genética en estas diferencias. Múltiples trabajos evidencian que, incluso entre individuos de una misma raza sometidos a idénticos regímenes de infección, existen claras diferencias en el establecimiento y desarrollo parasitario, reforzando con ello la idea de que la resistencia a estas especies parásitas puede tener una base genética (Soulsby, 1987). En cualquier caso, el avance en el control de las nematodosis gastrointestinales en general, y de la hemoncosis en particular, probablemente exige de un conocimiento exhaustivo de los mecanismos implicados en una respuesta inmune eficaz frente al parásito. Estos mecanismos brindarían nuevas dianas farmacológicas, permitirían optimizar el rendimiento de posibles vacunas y servirían para la selección de individuos resistentes. El estudio de la respuesta inmune protectora frente a H. contortus en razas e individuos naturalmente resistentes se ha planteado como un método válido para alcanzar estos fines (Gill et al., 2000; Bricarello et al., 2002; Amarante et al., 2005). 2. GENERALIDADES SOBRE HAEMONCHUS CONTORTUS Y OTROS NEMATODOS GASTROINTESTINALES DEL GANADO OVINO 2.1. CLASIFICACIÓN TAXONÓMICA Y DESCRIPCIÓN MORFOLÓGICA 2.1.1. Superfamilia Trichostrongyloidea Cram, 1927 Esta superfamilia incluye vermes de cuerpo fino y bolsa copuladora bien desarrollada en los machos, que además poseen dos espículas que permiten diferenciar géneros y especies entre sí. La cápsula bucal es rudimentaria y no poseen corona radiada, presentando seis, tres o ningún labio (Soulsby, 1987). El ciclo biológico es directo, siendo la larva 3 (L3) envainada el estadio infectante. Las familias más importantes son Trichostrongylidae, Ollulanidae y Dictyocaulidae. - 10 - Revisión Bibliográfica 2.1.2. Familia Trichostrongylidae Leiper, 1912 Las especies pertenecientes a esta familia son parásitos de pequeño tamaño, cuyas fases adultas, de entre 0,3 y 3 cm, se localizan en el tracto digestivo de rumiantes, équidos y otros vertebrados. Como rasgo distintivo, la bolsa copuladora del macho, bien desarrollada, presenta dos lóbulos laterales y un lóbulo dorsal más pequeño. Los géneros más importantes son Trichostrongylus, Graphidium, Ostertagia (Teladorsagia), Marshallagia, Cooperia, Nematodirus, Haemonchus y Mecistocirrus. Su distribución es mundial (Kassai, 1999). 2.1.3. Género Haemonchus Cobb, 1898 Las especies pertenecientes a este género se localizan en el abomaso de los rumiantes. Los adultos miden entre 10 y 30 mm, con una cápsula bucal pequeña que posee una lanceta. Las papilas cervicales son prominentes y la bolsa copuladora del macho es grande, siendo característico el lóbulo dorsal pequeño y asimétrico. La vulva suele estar protegida por una solapa o lengüeta (Soulsby, 1987). Su distribución es mundial, siendo mayor su prevalencia en regiones tropicales y subtropicales. La especie que afecta a las ovejas y cabras se denomina H. contortus, y la del vacuno, H. placei, pudiéndose establecer entre ambas algunas diferencias morfológicas y genéticas (Lindqvist et al. 2001). Sin embargo, actualmente algunos autores consideran una sola especie, H contortus, con cepas adaptadas al ganado bovino y a los pequeños rumiantes (Urquhart et al., 1996). 2.1.4. Haemonchus contortus (Rudolphi, 1803) Esta especie se localiza principalmente en el abomaso de ovejas y cabras, aunque no se descarta que su ciclo pueda cerrarse de modo excepcional en el vacuno (Mahieu y Aumont, 2009). Los machos miden entre 10 y 20 mm, y son de un color rojizo uniforme. Las hembras miden entre 18 y 30 mm, y en su coloración se alternan el rojo y el blanco, debido a que el aparato digestivo, rojizo por la ingesta de sangre, se enrolla en espiral alrededor del reproductor, blanquecino. Esto le hace recibir en inglés el nombre de barber´s pole worm (“gusano de cilindro de peluquero”). La bolsa copuladora del macho tiene lóbulos laterales alargados sustentados por radios largos y finos, mientras que el lóbulo dorsal está desviado hacia un lado, sustentado por un radio, muy característico, en forma de Y. Las espículas miden entre 0,46 y 0,51 mm, y presentan un pequeño repliegue en el extremo. El tamaño de la solapa vulvar de la hembra es variable, pudiendo ser muy prominente, o prácticamente inapreciable. Los huevos, de morfología - 11 - Revisión Bibliográficaaaaaaaaaaa aaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa típicamente estrongiloide, miden 70-85 x 41-48 μm, y salen con las heces del hospedador conteniendo una mórula de 16-32 blastómeros (Soulsby, 1987). Fig. 1: Cilindro de peluquero 2.2. EL CICLO BIOLÓGICO DE LOS TRICOSTRONGÍLIDOS EN EL GANADO OVINO, CON ESPECIAL REFERENCIA A H. CONTORTUS El ciclo biológico de Haemonchus contortus es directo, y no difiere del de otros tricostrongílidos. Los huevos eliminados con las heces eclosionan y la larva 1 muda a larva 2 en 1-2 días. Las dos primeras fases larvarias permanecen en las heces, alimentándose de materia orgánica y microorganismos presentes en las mismas. La larva 2 muda hasta el estadio infectante de larva 3, conservando la cutícula del estadio anterior que cubre completamente la larva a modo de vaina, aislándola del medio externo. Este estadio larvario migra hacia la hierba en condiciones de humedad adecuadas. El tiempo que transcurre entre la salida al exterior del huevo y la aparición de larvas infectantes podría ser de 5-6 días, aunque el desarrollo puede retrasarse incluso varios meses si la temperatura y la humedad no son las óptimas (Lacroux, 2006). Las L3 son ingeridas con el pasto por el hospedador, comenzando así su ciclo parasitario, descrito por Veglia, 1915. En el rumen se liberan de la vaina que las envuelve y se introducen en las glándulas epiteliales de la mucosa abomasal, preferentemente en la región del fundus, para continuar su desarrollo. Las L4 aparecen en la superficie de la mucosa a los 4-5 días del contagio, y tras una nueva muda se transforman en L5 o preadulto, que maduran sexualmente dando lugar a los adultos, que copulan y empiezan a producir huevos. El periodo de prepatencia oscila entre 15 días (Soulsby, 1987) y tres semanas (Bowman, 2004), a menos que se desarrolle un proceso de hipobiosis. - 12 - Revisión Bibliográfica Tabla 1: Etapas del desarrollo de H. contortus en el hospedador (Veglia, 1915) Presencia de L3 en la mucosa Día 2 Muda de L3 a L4 Día 4-5 Muda de L4 a L5 Día 9-11 Aparición de los primeros adultos Día 18 El fenómeno de hipobiosis o arresto larvario —presente también en otras especies de tricostrongílidos— consiste en la permanencia durante varios meses de las L4 en la mucosa en un estado de latencia, generalmente coincidiendo con situaciones ambientales adversas. En el caso de H. contortus, parece ser que la escasa humedad ambiental es el factor selectivo que acompaña a este fenómeno. De hecho, en las regiones de clima tropical la hipobiosis tiene lugar en la estación seca (Bonfoh et al., 1995; Fritsche et al., 1993; Ng´ang´a et al., 2004). Con respecto a climas templados, Langrova et al., 2008 realizaron un amplio estudio sobre la frecuencia con la que aparece el fenómeno de hipobiosis en las diferentes especies de tricostrongílidos, y los factores ambientales que influyen en su desarrollo en Europa central. En algunas especies, como H. contortus, Teladorsagia circumcincta o Nematodirus fillicolis, el porcentaje de larvas hipobióticas durante los meses de invierno superó el 65%, mientras que para Trichostrongylus spp. estuvo en torno al 25%. Por su parte, las larvas de otras especies, como Cooperia curticei, Oesophagostomum venulosum o Nematodirus battus, no desarrollaron hipobiosis. T. circumcincta, N. filicollis y, en menor medida, Trichostrongylus spp. fueron las especies en las que la relación con las condiciones ambientales fue más relevante para el desarrollo del arresto larvario. Blitz y Gibbs, 1971 llegaron a afirmar que la inhibición de las L4 de H. contortus durante el invierno obedece a factores exclusivamente ambientales, sin ninguna influencia de la respuesta inmune del hospedador, como demostró el hecho de que la inoculación en el mes de enero de L4 recogidas del abomaso de ovejas en pastoreo en animales que nunca habían estado en contacto con nematodos gastrointestinales (GI), determinó un periodo prepatente de 10-12 semanas, mucho más prolongado de lo habitual, a pesar de la escasa sensibilización previa de los animales inoculados. En otras especies de nematodos GI, como Ostertagia spp., se ha sugerido que la hipobiosis podría estar relacionada con una mayor exposición larvaria, y que el empleo de antiparasitarios que provocan una reducción de la población de adultos, facilitaría la reanudación del desarrollo - 13 - Revisión Bibliográficaaaaaaaaaaa aaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa El cuadro agudo se presenta habitualmente en animales jóvenes muy parasitados. La anemia aparece a partir de la segunda semana de infección, estabilizándose entonces el hematocrito gracias a la actividad hematopoyética de la médula ósea. Sin embargo, la pérdida continua de proteínas y hierro produce finalmente un agotamiento de la médula ósea, que al final es incapaz de reponer eficazmente las células perdidas. Con ello se agrava el proceso, que puede desencadenar la muerte del animal. Los síntomas principales son la palidez de mucosas (Fig. 3), edema (especialmente submandibular y abdominal), letargia, presencia de heces oscuras y caída de la lana. La diarrea no suele ir asociada a este proceso, a diferencia de los causados por otros miembros de la familia Trichostrongylidae. En las hembras se produce agalactia (Urquhart et al., 1996) y el análisis sanguíneo muestra anemia e hipoalbuminemia (Kassai, 1999). a) b) Fig. 3: Mucosa pálida en animal con hemoncosis aguda (a) y rosada en animal sano (b) Las canales aparecen pálidas y con edema acumulado en las zonas indicadas anteriormente. En el interior del abomaso se puede observar abundante líquido edematoso rojizo, y vermes de color también rojizo sobre la mucosa, en la que se aprecian numerosas petequias y erosiones (Fig. 4) (Soulsby, 1987; Meana y Rojo, 1999). En los escasos cuadros hiperagudos, producidos por infecciones masivas (Fig. 4b), pueden llegar a darse casos de muerte súbita de animales aparentemente sanos, incluso en el periodo de prepatencia, como consecuencia de una gastritis hemorrágica severa. En la necropsia se puede observar inflamación de la mucosa abomasal, que presenta un color rojizo, con abundantes vermes (maduros y/o inmaduros) y sangre en la cavidad gástrica. - 20 - Revisión Bibliográfica a) b) Fig. 4: Abomaso de un animal con hemoncosis aguda (a) e hiperaguda (b) El cuadro crónico se produce en animales con una carga parasitaria baja, de algunos cientos de vermes, en condiciones de alimentación deficiente debida, por ejemplo, a una prolongada estación seca que limite la disponibilidad de pasto. La morbilidad es muy alta, en torno al 100%, y la mortalidad, escasa. Los recuentos fecales no llegan a superar los 2000 huevos por gramo (hpg) (Soulsby, 1987; Meana y Rojo, 1999). La continua pérdida de sangre en esta situación repercute en el metabolismo, produciendo pérdida de peso, debilidad e inapetencia. No se suelen observar manifestaciones de la anemia ni edemas (Urquhart et al., 1996). Las lesiones son poco evidentes; la canal puede mostrar diversos grados de emaciación, observándose los vermes en el interior del abomaso y gastritis hiperplásica. El número de vermes encontrados en el abomaso varía en función de la susceptibilidad de la raza y del individuo. En cualquier caso, los animales con una infección crónica suelen albergar entre 100 y 1000 adultos, y los que presentan un cuadro agudo entre 1000 y 10000. En cuadros hiperagudos podemos encontrar más de 10000 vermes en el abomaso del animal (Soulsby, 1987). 2.5. EL USO DE FÁRMACOS ANTIHELMÍTICOS EN LA LUCHA FRENTE A LOS NEMATODOS GASTROINTESTINALES Hasta el momento, el tratamiento y control de las nematodosis gastrointestinales se ha basado fundamentalmente en el uso de fármacos antihelmínticos, en combinación con determinadas medidas de manejo en el pastoreo que reduzcan el riesgo de infección. El objetivo del tratamiento y control mediante fármacos es eliminar las dos fuentes principales de contaminación del pasto: los huevos eliminados en periparto y las larvas que han sobrevivido - 21 - Revisión Bibliográficaaaaaaaaaaa aaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa al invierno en climas templados, o al verano en zonas tropicales o subtropicales (Soulsby, 1987). La aplicación a gran escala de antihelmínticos de probada eficacia ha transformado la industria ganadera, especialmente en el caso de los rumiantes. Se llega a afirmar que la ganadería de rumiantes en su forma actual no sería posible sin fármacos antihelmínticos (Stear et al., 2000). Los fármacos más utilizados son los benzimidazoles y probenzimidazoles, los imidazotiazoles y las avermectinas. En el pasado también fueron usados los organofosforados, que dejaron de utilizarse debido a su elevada toxicidad. 2.5.1. Resistencias a los antihelmínticos Como consecuencia del uso incontrolado de fármacos antihelmínticos han aparecido cepas resistentes de nematodos GI frente a estos fármacos en todo el mundo. En el ganado ovino el problema adquiere especial gravedad. El fenómeno se pone de manifiesto cuando un fármaco con una eficacia mayor del 95% frente a nematodos GI es incapaz de mantenerla al administrar la dosis terapéutica recomendada. Aparte de los factores relacionados con una mala administración (dosis insuficiente y frecuencia excesiva, fundamentalmente), se considera que un elevado potencial biótico del parásito favorece la aparición de resistencias (Meana y Rojo, 1999). Son muy abundantes las referencias bibliográficas que nos indican la aparición de cepas de H. contortus resistentes a los distintos grupos de fármacos antihelmínticos. Las primeras citas de cepas de H. contortus resistentes a un benzimidazol, en concreto el tiabendazol, datan del año 1964 (Conway, 1964), al levamisol, del año 1976 (Le Jambre et al., 1976), y a la ivermectina, del año 1987 (Carmichael et al., 1987). Ya en 1997 Waller, y la FAO en 2004, alertan sobre la evidencia de resistencias en todos los continentes, siendo Oceanía, Sudáfrica y, sobre todo, Sudamérica, los territorios más afectados. En España, la primera cita sobre la existencia de cepas de nematodos GI resistentes a antihelmínticos es de 1997 (Requejo Fernández et al., 1997). Posteriormente, diversos estudios han confirmado la aparición de resistencias a las tres grandes familias de antihelmínticos, sin que la situación, por ahora, parezca tan grave como en otros países (Álvarez Sánchez et al., 2006; Díez Baños et al., 2008). - 22 - Revisión Bibliográfica Este problema quizá no fue valorado en su momento, al confiar en la comercialización de nuevos fármacos por parte de las empresas farmacéuticas. Sin embargo, durante 25 años no ha aparecido en el mercado ningún nuevo antihelmíntico destinado a animales de abasto, fundamentalmente por razones económicas (van Wyk el al., 2006). Recientemente, han sido descubiertos nuevos grupos farmacológicos con efecto antihelmíntico, lo que permitirá disponer de fármacos, al menos temporalmente, libres de resistencias. Se pueden destacar los derivados del amino-acetonitrilo (AADs), en concreto el monepantel (Kaminsky et al., 2008) cuya comercialización ya ha sido aprobada en Europa para ganado ovino. Otros grupos de fármacos como los ciclooctadepsipéptidos (von Sammson Himmelstjerna et al., 2005), o los spiroindoles, también podrían ver la luz a corto plazo (Sangster, 2009). En cualquier caso, se hace necesaria una nueva política en el tratamiento de estos parásitos, que implique un uso correcto y racional de los fármacos, con rotaciones de los mismos (Urquhart et al., 1996; van Wyk, 2001; Sangster, 2009) y tratamiento selectivo de los animales (van Wyk et al., 2006), y diferentes medidas de control. 3. RESPUESTA INMUNE FRENTE A LOS NEMATODOS GASTROINTESTINALES 3.1. INTRODUCCIÓN La mayoría de los autores se muestran de acuerdo en que la respuesta inmune protectora que desarrollan los rumiantes frente a nematodos gastrointestinales (GI) es el resultado de una compleja interacción entre mecanismos específicos e inespecíficos vinculados tanto a la inmunidad celular como a la humoral (Miller, 1984; González et al., 2003). La importancia de la inmunidad celular se ha evidenciado, por ejemplo, bloqueando sus mecanismos efectores mediante la administración de corticoides en infecciones experimentales por diversos tricostrongílidos tales como Trichostrongylus colubriformis y H. contortus (Adams, 1988; Jackson et al., 1988; Emery et al., 1992; Peña et al., 2004). A su vez, la exposición a nematodos GI genera un incremento en los niveles de inmunoglobulinas específicas, tanto en el suero como en las mucosas locales (abomaso e intestino) y sistémicas, y muchos autores las utilizan para evaluar la exposición a estos parásitos (Ploeger et al., 1990; Schallig et al., 1995; Martínez Valladares et al., 2005a; Molina et al., 2009). - 23 - Revisión Bibliográficaaaaaaaaaaa aaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa El conocimiento de los mecanismos inmunológicos que generan esta protección y su base genética son aspectos de gran importancia para el desarrollo de programas de selección de ovinos resistentes a estos parásitos. Esta información también resultaría útil para optimizar la capacidad inmunogénica y protectora que podrían proporcionar futuras vacunas o la identificación de dianas terapéuticas (Miller y Horohov, 2006; Piedrafita et al., 2010). 3.2. FACTORES QUE INFLUYEN EN LA RESPUESTA INMUNE La respuesta inmune frente a los nematodos gastrointestinales se encuentra afectada por la influencia de distintos factores, dependientes del hospedador (constitución genética, edad, estado hormonal y nutricional), del parásito (especie, cepa…) y del manejo. 3.2.1. Edad Como ya se ha señalado anteriormente, los corderos y cabritos de menos de un año de edad son más susceptibles que los adultos (Kassai, 1999; Schallig, 2000), y esta menor resistencia parece ser consecuencia de la deficiente inmunidad celular, que tarda en desarrollarse en rumiantes al menos entre cuatro y seis meses. La transferencia de factores de tolerancia en el calostro y un desarrollo progresivo de las respuestas inmunitarias frente a los distintos antígenos también podrían explicar esta susceptibilidad etaria (Soulsby, 1987). Muchos autores asumen que los corderos desarrollarán una respuesta inmunitaria protectora tras la exposición a las larvas presentes en el pasto, a partir de los 10-12 meses de edad, y sólo perderán esta capacidad en caso de malnutrición, enfermedad o estrés (Vlassoff et al., 2001). Probablemente, estos datos expliquen que no se haya podido conferir protección tras la inmunización con L3 atenuadas de H. contortus en animales jóvenes, menores de seis meses (Soulsby, 1987; Newton y Meeusen, 2003) y sí en adultos, tal y como queda recogido en el apartado “4.2.1. Uso de larvas atenuadas”. 3.2.2. Sexo Los machos de los rumiantes son más susceptibles que las hembras a los nematodos GI (Asanji, 1988; Barger, 1993; Mandonnet et al., 2003), lo que se manifiesta en mayores FEC (recuento fecal de huevos, del inglés faecal egg count), tasas de establecimiento larvario y cargas parasitarias (Aumont et al., 2003; Gauly et al., 2006). En infecciones experimentales con H. contortus en Scottish Blackface, Stear et al., 1995a estiman la influencia del sexo del animal y sus interacciones sobre el peso, en la carga parasitaria, en un 14%. Dado que existe una - 24 - Revisión Bibliográfica susceptibilidad distinta, se recomienda realizar experimentos de inmunización con animales de un único sexo (Adams, 1989). 3.2.3. Especie, raza e individuo Entre las especies hospedadoras, el caprino manifiesta una mayor susceptibilidad que el ovino frente a la infección por nematodos GI, hecho que se refleja en distintos parámetros inmunológicos y parasitológicos (Huntley et al., 1995, Hoste et al., 2008). Las cabras, en particular, muestran dificultades para establecer una respuesta inmunitaria protectora tras inoculaciones repetidas de L3 de H. contortus y T. circumcincta, a diferencia de lo que ocurre en las ovejas (González, 2002). Estos aspectos deben ser tenidos en cuenta a la hora de aplicar programas de control en sistemas de explotación en los que conviven cabras y ovejas, circunstancia muy habitual en la ganadería de las Islas Canarias. Evidentemente, este hecho diferencial deberá valorarse al escoger métodos de control alternativos al uso de fármacos. Existe una variación importante entre razas e individuos en la resistencia a nematodos GI, probablemente causada por diferencias genéticas (Sayers y Sweeney, 2005; Stear et al., 2007). Diversas experiencias en corderos han estimado que existe una alta repetibilidad (0,3) en los recuentos fecales de huevos de nematodos GI en la primera y segunda estación de pastoreo, lo que indica que corderos con recuentos bajos probablemente serán adultos con recuentos bajos de huevos en heces (Stear et al., 2000a). Esta circunstancia puede ser aprovechada para disminuir los niveles de parasitación en el rebaño mediante selección reproductiva, y por ello será analizado en profundidad en el capítulo 4.3, “Selección genética de la resistencia a los nematodos GI”. 3.2.4. Estado hormonal La compleja interacción que se establece entre el sistema endocrino del hospedador y los agentes parasitarios puede llegar a modificar sustancialmente la respuesta inmune. Algunas especies parásitas se benefician directamente del efecto de determinadas hormonas que estimulan su crecimiento y multiplicación (Escobedo et al., 2005) o bien lo hacen indirectamente, al inducir determinados estados hormonales situaciones de inmunosupresión de las que se benefician los parásitos. El incremento de huevos fecales que experimentan durante el periparto las hembras parasitadas por nematodos gastrointestinales, tal y como se señaló anteriormente, podría ser consecuencia de cambios hormonales. Actualmente no se conocen en profundidad los mecanismos - 25 - Revisión Bibliográficaaaaaaaaaaa aaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa inmunitarios implicados, pero sí se sabe que durante este periodo se produce un incremento de la susceptibilidad de los animales a adquirir nuevas infecciones, así como un incremento de la fecundidad de los vermes adultos, además de una maduración de las larvas hipobióticas (Soulsby, 1987). Algunos autores atribuyen a la prolactina algún papel en este fenómeno que experimentan las ovejas en torno al parto, puesto que al administrarla en corderos antes o después de ser inoculados con H. contortus, induce un aumento en los recuentos fecales de huevos y de la fecundidad de las hembras del parásito (Fleming, 1993). Sin embargo, no existe acuerdo unánime, puesto que otros autores no han logrado reproducir estos efectos en ovinos inoculados con T. circumcincta (Jeffcoate et al., 1990; Barger, 1993). La influencia de las hormonas adrenales en las infecciones por Plasmodium falciparum, Entamoeba histolytica y Schistosoma mansoni es un hecho reconocido (Escobedo et al., 2005). En el caso concreto de H. contortus, el parásito podría verse favorecido por el incremento de los niveles de cortisol que se asocia a esta infección, fenómeno que podría inhibir a algunos mecanismos inmunológicos efectores como los relacionados con la activación de los mastocitos (Fleming, 1997). 3.2.5. Nutrición La respuesta inmune del hospedador eleva los requerimientos nutricionales, modifica la distribución de los recursos y, a causa de la anorexia, disminuye la disponibilidad de los mismos (Colditz, 2008; Greer et al., 2008). Por ello, una adecuada alimentación es importante para mantener una respuesta inmune adecuada. Al ser el metabolismo proteico el más afectado durante las infecciones por nematodos GI, un aumento de proteína metabolizable en la dieta puede mejorar la resistencia y la tolerancia a la parasitación, aunque no pueda prevenir el establecimiento inicial del parásito. Por contra, cuando se suministran dietas con bajos aportes proteicos, las consecuencias de la enfermedad se agravan (Kassai, 1999; Coop y Kyriazakis, 2001) y los genotipos más resistentes pueden no mostrar ninguna superioridad en comparación con los más susceptibles (Bricarello et al., 2005; Martínez Valladares et al., 2005b). Este aporte proteico repercute directamente en la mejora de distintas respuestas efectoras, aumentando los niveles de mastocitos, eosinófilos y leucocitos globulares en la mucosa, e incrementando los niveles de anticuerpos sanguíneos. Es de esperar que las nuevas herramientas moleculares disponibles para el análisis de ácidos nucleicos, proteínas y metabolitos permitan conocer los factores que median en esta interacción (Athanasiadou y Huntley, 2008). - 26 - Revisión Bibliográfica 3.2.6. Tratamientos antihelmínticos Cuando los tratamientos profilácticos se administran de forma excesiva, puede suceder que no exista contacto entre el parásito y el hospedador, impidiendo el desarrollo de una respuesta inmune adecuada. Por ello, se aconseja que, en general, al plantear la quimioprofilaxis se permita que se establezca esta relación entre el parásito y el hospedador (Claerebout, 2002; Taylor et al., 2007). Así, por ejemplo, programas de control que combinen el tratamiento antihelmíntico de los animales jóvenes con el traslado a pastos limpios, pueden provocar que el hospedador no desarrolle ninguna respuesta inmunitaria frente a nematodos GI, siendo estos individuos más susceptibles en sucesivas estaciones de pastoreo que otros animales que no se hayan tratado previamente de esta manera (Claerebout et al., 1998 a,b, 1999a). 3.2.7. Patogenicidad de la cepa parasitaria La gran variabilidad genética de las distintas cepas de H. contortus les ha permitido responder a la presión de selección derivada del uso de antihelmínticos (Roos et al. 2004). La selección por resistencia a fármacos puede haber generado distintos genotipos con diferencias en la inmunogenicidad y patogenicidad (Barret et al., 1998). En ocasiones, resistencia frente a antihelmínticos y mayor patogenicidad pueden ir asociadas, como reflejaron Kelly et al., 1978 al comparar ovinos inoculados con cepas de H. contortus resistentes o susceptibles a los benzimidazoles. Sin embargo, no se trata de una regla fija, puesto que Maclean et al., 1987 observaron justamente lo contrario con una cepa de Trichostrongylus colubriformis resistente a benzimidazoles. No se han podido constatar diferencias en la inmunogenicidad de las distintas cepas que afectan a los ovinos, aunque sí en su acción patógena, su establecimiento larvario y su fecundidad (Barret et al., 1998; Aumont et al., 2003). Aumont et al., 2003 realizan un estudio de inoculación en el que incluyen dos razas, la Barbados de Barriga Negra (resistente) y la INRA 401 (susceptible), y dos cepas de H. contortus, propias de las regiones en que se cría cada raza. Los resultados muestran, por una parte, una patogenicidad similar para ambas cepas, y a la vez, diferentes tasas de asentamiento larvario y fecundidad de las cepas en los ovinos Barbados de Barriga Negra. - 27 - Revisión Bibliográficaaaaaaaaaaa aaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa 3.3. INMUNIDAD INNATA FRENTE A PARÁSITOS La inmunidad innata constituye la primera línea de defensa frente a los parásitos. Comprende una serie de mecanismos celulares y moleculares, presentes antes del encuentro con el agente patógeno, y capaces de activarse rápidamente, de modo previo a la aparición de respuestas adaptativas. Estos mecanismos pueden reconocer los antígenos sin gran capacidad de discriminación, es decir, con independencia del tipo de antígeno identificado, aunque no parecen estar capacitados para desarrollar memoria inmunológica. Una serie de barreras externas físicas, químicas o biológicas previenen la entrada del agente infeccioso o parasitario; una vez que éste ha burlado estas barreras, y ha entrado en el organismo, intervienen células y factores solubles (Cutuli, 2007; de Veer et al. 2007). En el aparato digestivo hay múltiples mecanismos de inmunidad innata. El pH gástrico y las enzimas contenidas en el mucus, así como la flora bacteriana, constituyen las principales barreras externas. En caso de que algunos agentes patógenos superen estas barreras, pueden entrar en acción algunas células fagocitarias (macrófagos y neutrófilos), una subpoblación de linfocitos conocidos como asesinos naturales (NK, del inglés Natural Killer), y diversos factores solubles, tales como los componentes de la vía alternativa del complemento, citoquinas y otros mediadores químicos de la inflamación. Algunos componentes característicos de la inmunidad innata serán descritos a continuación, dado que, al menos teóricamente, podrían tener un papel relevante en la respuesta frente a nematodos GI. Se trata de los receptores tipo Toll, los linfocitos T γδ y la subpoblación de linfocitos B-1a. En el reconocimiento del antígeno y activación de los fagocitos intervienen receptores tipo Toll (TLR, del inglés toll-like receptors), presentes en la membrana de células presentadoras de antígeno (APC, del inglés antigen-presenting cells), tales como macrófagos, células dendríticas y algunas células epiteliales. Estos receptores detectan moléculas expresadas frecuentemente por los agentes exógenos que no están presentes en los hospedadores, denominadas Patrones Moleculares Asociados a Patógenos (PAMP, del inglés pathogen-associated molecular patterns) (Medzhitov y Janeway, 1997). Inducen señales internas que promueven, entre otras acciones, la destrucción microbiana en el fagosoma mediante rutas dependientes de oxígeno o del NO, la liberación de citoquinas estimuladoras de la inflamación, y la activación de los leucotrienos (Werling et al., 2006). En ovinos y bovinos se han identificado homólogos de los diez TLR reconocidos hasta el momento en humanos (Menzies e Ingham, 2006). El papel de los TLR en el reconocimiento de antígenos parasitarios y la activación de la respuesta efectora - 28 - Revisión Bibliográfica ha sido poco estudiada hasta el momento, y algunos autores sugieren que podrían tener gran relevancia en el desarrollo de este tipo de respuestas (Jackson et al., 2006; Vanhoutte et al. 2007). Mención particular merece la actividad de la población de linfocitos T γδ, denominados así por el tipo de cadenas presentes en su receptor TCR (del inglés, T-cell receptor). Intervienen en las respuestas innatas, expresando funciones efectoras y secretando citoquinas que estimulan la respuesta inmune adaptativa de base celular (Cutuli, 2007). En los rumiantes presentan varias particularidades. Son especialmente abundantes, y se estima que pueden llegar a constituir el 60 % de los linfocitos circulantes en animales jóvenes, frente al 5-15 % habitual en humanos y ratones (Tizard, 2000). Además, gran parte de los linfocitos T γδ expresan en su superficie un marcador de activación específico denominado WC-1 (del inglés, Workshop cluster). Las funciones de esta molécula no se conocen en profundidad, pero las células que los expresan son siempre T CD4CD8-, lo que nos permite establecer en el ovino una subpoblación definida de linfocitos T implicados en la respuesta innata (Howard y Morrison, 1994). El aumento de la población de linfocitos B y T γδ en mucosa, en detrimento de la de linfocitos T αβ, es un hallazgo frecuente en vacunos durante el curso de una infección primaria por Ostertagia ostertagi, aunque no siempre asociado a protección (Almería et al., 1997a). En el ovino y caprino se han realizado estudios histopatológicos de la mucosa abomasal en animales inoculados primariamente con H. contortus en los que se han encontrado elevadas cantidades de este tipo celular entre los días 3 y 13 pi, sugiriéndose su intervención en respuestas rápidas frente al parásito (Balic et al. 2000a; Pérez et al., 2008). Sin embargo, un estudio anterior en ovinos parasitados con Trichostrongylus colubriformis reveló que la depleción de linfocitos T WC1+, realizada con anticuerpos monoclonales, mejoraba la respuesta frente a una inoculación desafío en un 88% (McClure et al., 1996). Estos resultados son difíciles de comparar, debido a la variedad de especies parásitas y protocolos utilizados en cada caso, si bien señalan que la población de linfocitos T γδ estaría jugando un papel importante en la respuesta inmune frente a nematodos GI, ya sea favoreciendo o dificultando la implantación de los parásitos. Por otra parte, también existe una subpoblación importante de linfocitos B a la que se asigna un papel específico en la inmunidad innata. Los linfocitos B-1a expresan, junto con otras células, el marcador CD5, estimándose en el vacuno que un 5-35% de los linfocitos B de sangre periférica corresponde a esta subpoblación (Howard y Morrison, 1994). Sintetizan principalmente anticuerpos IgM de baja afinidad y especificidad antigénica. Estos anticuerpos podrían jugar un papel importante como primera barrera frente a agentes invasores o - 29 - Revisión Bibliográficaaaaaaaaaaa aaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa Finalmente, la expresión de algunas moléculas de membrana determina el grado de activación de los linfocitos T. El marcador CD2, por ejemplo, es una molécula de adhesión intercelular implicada en la activación y diferenciación de linfocitos T. Es expresado por la mayoría de los linfocitos T CD4+ y CD8+, y en ovinos, también por una pequeña subpoblación de macrófagos. No se expresa, en cambio, en los linfocitos T WC1+, y por ello suele considerarse como marcador genérico de linfocitos T αβ (Baldwin et al., 1988; Sopp et al., 1991; Haig et al., 1991). La molécula CD5, por su parte, es expresada por la mayoría de las células T maduras, aunque más fuertemente en las CD2+ que en las WC1+. Como se dijo anteriormente, también es expresada por la subpoblación de linfocitos B-1. Con respecto a su función en los linfocitos T, fue descrita inicialmente como una molécula coestimuladora de la unión del antígeno al TCR, y se investiga su papel regulador de la respuesta inmune (Ceuppens y Baroja, 1986; Dalloul, 2009). 3.4.2.2. Mastocitos, basófilos y leucocitos globulares Los mastocitos y los basófilos son células con características similares, especialmente en lo que se refiere a la composición de sus gránulos y a sus mecanismos de activación. Comparten receptores de membrana para IgE y TLRs, y también se ha sugerido su procedencia de un antecesor común (Arinobu et al., 2005). Sin embargo, tienen localizaciones muy distintas. Los basófilos se encuentran en el torrente circulatorio y los mastocitos, por su parte, se hallan en los tejidos, principalmente en áreas perivasculares y subepiteliales, y pueden responder rápidamente ante la acción de un agente invasor. Mientras que los basófilos constituyen una población celular bastante homogénea, existen por el contrario poblaciones diferenciadas de mastocitos. Basándose en la diferente composición de sus gránulos se ha distinguido entre mastocitos del tejido conectivo (CTMC, del inglés conective tissue mast cells) y mastocitos de mucosa (MMC, del inglés mucosal mast cells). Dentro de la subpoblación de MMC las células pueden residir en la lámina propia o en el epitelio. Los mastocitos intraepiteliales se caracterizan por tener gránulos de mayor tamaño, especialmente en rumiantes. Se les denomina también leucocitos globulares y se consideran una última fase efectora de la célula, en una localización en la que liberan sus gránulos alterando el medio ambiente parasitario con una mínima lesión tisular (Balic et al., 2000b). Los gránulos citoplásmicos de estas células incluyen potentes mediadores celulares que son liberados en pocos minutos tras la estimulación (mediadores primarios), como proteasas, - 36 - Revisión Bibliográfica proteoglicanos o histamina. Los mediadores secundarios son sintetizados tras una adecuada estimulación. Entre ellos se encuentran leucotrienos, factor de activación plaquetaria (PAF, del inglés platelet-activating factor), prostaglandina D2 y diversas interleuquinas entre las que destaca la IL-4. Los efectos principales de la liberación de estas sustancias consisten en vasodilatación e incremento de la permeabilidad vascular, contracción de la musculatura lisa y aumento de la secreción de mucus. Destaca la estrecha asociación entre la degranulación mastocitaria y el sistema nervioso entérico, estimulándolo mediante un incremento de las señales eléctricas y liberación de acetilcolina (McKay y Bienenstock, 1994). Con ello se incrementa el peristaltismo y se libera gran cantidad de fluidos a la luz, facilitándose la expulsión de los parásitos. El resultado de la activación de los mastocitos determina, por tanto, la creación de un ambiente hostil para el parásito, que facilita a su vez la activación de otros elementos de la respuesta inmune frente a helmintos (Balic et al., 2000b). a) Activación de los mastocitos La activación de los mastocitos durante la infección por helmintos ocurre generalmente tras contactar con moléculas de excreción/secreción del parásito o procedentes del tejido como consecuencia del daño tisular inducido por este. Los mastocitos participan en la inmunidad innata, al poder ser activados directamente por componentes de la vía alternativa del complemento, productos bacterianos u otras moléculas. Esta participación en los mecanismos de respuesta innata no es óbice para que puedan intervenir a modo de puente entre esta y la inmunidad adaptativa. En su membrana poseen receptores de alta afinidad para IgE (FcεRI); los complejos antígeno-IgE unidos al FcεRI desencadenan la degranulación mastocitaria, y por ello su papel principal se asocia a procesos de hipersensibilidad (Serrano y Uceda, 2007). En algunos casos, el patrón de liberación de sustancias por parte de los mastocitos puede ser dependiente de la estimulación de un determinado receptor o población de mastocitos, pudiendo diferir del modelo general producido por la estimulación con IgE. En la especie humana se ha observado que la liberación de IFN-α se produce únicamente cuando existe una activación a través del TLR-3, y no cuando se produce la unión de la IgE al FcεRI (Kulka et al., 2004). Esto sugiere un papel de los mastocitos en el desarrollo y orientación de las respuestas adaptativas, al constituir uno de los primeros eslabones en la estimulación de la activación de los linfocitos T. A la vez, existe un creciente reconocimiento del papel protector específico de los mastocitos, derivado de sus funciones en la inmunidad innata (Metcalfe, 2008). - 37 - Revisión Bibliográficaaaaaaaaaaa aaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa b) Mastocitos y fenómeno de autocura La expulsión de la población adulta de H. contortus (denominada “autocura”) tras la ingestión de nuevas larvas es una de las respuestas inmunológicas frente a helmintos mejor caracterizadas. Es provocada por la liberación de productos de excreción/secreción del parásito que se unen a IgE, provocando la degranulación masiva de los mastocitos de la pared abomasal, y la consiguiente expulsión de los vermes (McClure y Emery, 1994; Salinas 2007). Sin embargo, este fenómeno de hipersensibilidad con características similares al asma bronquial no va asociado necesariamente a protección, ni confiere memoria inmunológica, y ha llegado a considerarse como un mecanismo de renovación de la población parasitaria presente en el abomaso, asociado a la aparición de las condiciones ambientales más favorables para el desarrollo de larvas infectantes y la consiguiente reinfestación de los animales (Soulsby, 1987; Meana y Rojo 1999). c) Asociación entre hiperplasia de mastocitos/leucocitos globulares y resistencia En el modelo murino, las infecciones con nematodos GI dan lugar al aumento de los mastocitos en los tejidos parasitados, fenómeno dependiente de la IL-3 y de la IL-4 liberadas por linfocitos T activados (Lantz et al., 1998; Behnke et al., 2003). Este incremento se debe tanto a la multiplicación de los propios mastocitos de los tejidos afectados, como a la migración de células de los tejidos adyacentes, y al reclutamiento y maduración de precursores presentes en el torrente sanguíneo (Wang et al., 1998). La hiperplasia de mastocitos de mucosa y la aparición de leucocitos globulares son fenómenos frecuentes en roedores y rumiantes infectados con nematodos GI (Rothwell, 1989; Balic et al., 2000b), coincidiendo estos procesos con la aparición de parásitos adultos (Salma y Duncan, 1984; Pfeffer et al., 1996; Winter et al., 1997; Balic et al., 2000a; Lacroux et al., 2006). Esta hiperplasia de mastocitos también aparece frecuentemente asociada a la resistencia frente a la infección parasitaria, especialmente cuando se analizan los leucocitos globulares. En algunos estudios se han encontrado correlaciones negativas entre carga parasitaria y número de leucocitos globulares, lo que no se observa al relacionar los recuentos de vermes con los mastocitos de lámina propia (Douch et al., 1986; Stear et al., 1995b). Diversos estudios, en los que se comparan las respuestas locales en razas ovinas resistentes y susceptibles a nematodos GI, han permitido observar recuentos de leucocitos globulares significativamente mayores en los abomasos de las razas resistentes en comparación con las susceptibles, sin que dichas - 38 - Revisión Bibliográfica diferencias se detectaran en los recuentos de mastocitos (Gamble y Zajac, 1992; Bricarello et al., 2004). En esta línea, Stankiewicz et al., 1993 describen un perfil similar al comparar dos grupos de corderos de raza Romney seleccionados atendiendo a sus recuentos altos/bajos de huevos de nematodos en heces. d) Función de los mastocitos en la expulsión de nematodos gastrointestinales Los datos sobre el papel de los mastocitos en la expulsión de los nematodos GI, inmaduros o adultos, son mucho más contradictorios. Mientras que Emery et al., 1993 indican una activación de estas células en el proceso de expulsión del parásito en el ovino, otros autores como Huntley et al., 1992 sugieren, por el contrario, que la hiperplasia de mastocitos no es un requisito para la expulsión del parásito, al encontrar altos niveles de resistencia sin incrementos en el número de estas células. En cualquier caso, parece bastante probable que la eficacia de la acción de los mastocitos dependa de la localización tisular del parásito, siendo mucho más efectiva frente a especies o estadios que se alojan en la mucosa que frente a aquellos localizados en la luz del órgano afectado (Anthony et al., 2007). Como señalan distintos autores, la presencia de mastocitos y leucocitos globulares no es indicativa de su funcionalidad (Rothwell, 1989; Miller, 1996; Balic et al., 2000b). Se puede constatar su activación, y en particular el grado de degranulación, si se detectan los distintos mediadores químicos que liberan estas células. Así, por ejemplo, el estudio en ovinos de los niveles de proteasas derivadas de los mastocitos (SMCP, del inglés sheep mast cell proteinase) en el mucus y en los tejidos puede mostrar su relación con la expulsión inmediata de nematodos GI en animales inmunizados. Así, se pudo observar un pico de SMCP en el suero a las pocas horas de la inoculación con L3 de H. contortus en animales inmunizados, asociado a la expulsión inmediata de los vermes. Los niveles elevados de SMCP se mantuvieron en el mucus 48 horas después del desafío, pero no en la mucosa, lo que sugiere su liberación por los leucocitos globulares. Por el contrario, este pico no se produjo en animales no infectados previamente y pudo ser abolido con la administración de dexametasona (Huntley et al., 1987, 1992). Algunos autores consideran que la mayor susceptibilidad del caprino frente a los nematodos GI podría deberse, al menos parcialmente, a que muestran niveles más bajos de SMCP tisular que el ovino (Huntley et al., 1995). Otros mediadores químicos evaluados como indicadores de la actividad de los mastocitos frente a nematodos GI son los leucotrienos y la histamina (Jones et al., 1990; Steel et al., 1990; Douch et al., 1996). - 39 - Revisión Bibliográficaaaaaaaaaaa aaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa Algunos autores sugieren que el papel de los mastocitos/leucocitos globulares esté limitado a la expulsión inmediata de los vermes en animales hiperinmunizados, y sea muy poco relevante en mecanismos de expulsión larvaria más retardados. La inoculación de 50000 L3 de H. contortus en ovinos previamente inmunizados ha permitido observar dos modelos de distribución de estas células en la mucosa abomasal de los animales, ligados cada uno a un tipo de respuesta concreta. Sólo se observaron cambios en la cantidad de leucocitos globulares en la mucosa en aquellos animales en los que las larvas no alcanzaron el tejido, pues estas células mostraban un claro descenso a los 5 dpi. Por el contrario, en aquellos animales en los que las larvas llegaron a penetrar en la mucosa los niveles de leucocitos globulares permanecieron estables durante toda la experiencia (Balic et al., 2002). Esta posibilidad también está sustentada por estudios en los que se realizaron cultivos larvarios en secciones de mucosa abomasal extraídos de animales con diferentes grados de sensibilización. En ellos pudo observarse degranulación mastocitaria asociada a una expulsión inmediata de las larvas 3 de H. contortus y T. circumcincta únicamente en animales previamente sensibilizados (Jackson et al., 2004; Kemp et al., 2009) Por otra parte, algunos autores han encontrado una correlación negativa entre los niveles de leucocitos globulares y la carga parasitaria de vermes adultos en animales con infección natural por nematodos gastrointestinales (Douch et al., 1986), o en inoculaciones secundarias con 50000 L3 de T. circumcincta (Stear et al., 1995b). Estos datos no justifican necesariamente un efecto directo de los niveles de mastocitos/leucocitos globulares sobre los recuentos de vermes adultos, ya que, como se indicó anteriormente, los niveles máximos de SMCP se producen poco después de la inoculación de las larvas, y el descenso en la carga parasitaria de vermes adultos podría derivar del efecto sobre el establecimiento larvario. 3.4.2.3. Eosinófilos A diferencia de los mastocitos, los eosinófilos constituyen una población celular homogénea. Los eosinófilos maduros son continuamente transferidos en pequeñas cantidades desde la médula ósea a la sangre y de ahí a los tejidos, en los que se pueden encontrar habitualmente, de modo especial en la mucosa digestiva. En infecciones por helmintos es frecuente observar un incremento de los eosinófilos (eosinofilia) tanto en sangre como en tejidos (Balic et al., 2000b; Gill et al., 2000; Bricarello et al., 2002). En las tinciones histológicas estas células muestran una fuerte apetencia por la eosina, lo que se debe a la composición de sus gránulos. En ellos existen proteínas fuertemente catiónicas, como son la proteína básica mayor, la peroxidasa eosinofílica, la proteína catiónica de los eosinófilos - 40 - Revisión Bibliográfica y la neurotoxina derivada de eosinófilos, e hidrolasas lisosomales. También producen lisofosfolipasa, arilsulfatasa, fosfatasa ácida y peroxidasa (Serrano y Uceda, 2007). Además, los eosinófilos activados producen metabolitos tóxicos derivados de oxígeno y sintetizan un amplio rango de mediadores lipídicos, como prostaglandinas, factor activador plaquetario y leucotrienos. También se ha demostrado su capacidad para producir una serie de citoquinas (IL-1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10, GM-CSF, TNF-α, TGF-β, IFN-γ) y quimoquinas (MIP-1α, RANTES, eotaxina) (Balic et al., 2000b; Rothenberg y Hogan, 2006). Entre las sustancias liberadas por los eosinófilos se encuentra la galectina-14, considerada como un buen marcador de la actividad de estas células (Young et al., 2009). Los niveles de esta molécula en el mucus aparecen aumentados en animales parasitados en comparación con los que no lo están, así como en animales sometidos a un protocolo de inoculaciones repetidas en comparación con los que reciben una inoculación única (Kemp et al., 2009; Robinson et al, 2011). a) Activación de los eosinófilos La IL-5 es la citoquina responsable de la eosinofilia dependiente de linfocitos T en sangre y tejidos tras la infección por helmintos (Balic et al., 2000b). Sin embargo, se han observado niveles basales de eosinófilos en tejidos en ratones knock-out para la IL-5, probablemente mantenidos por otras citoquinas, tales como la IL-3 y GM-CSF (Factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos, del inglés Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor) (Yoshida et al., 1996). La acción efectora del eosinófilos sobre los helmintos parece estar basada en la degranulación de estas células sobre el parásito, mediada por la unión de los receptores de membrana a anticuerpos específicos frente a los vermes. Los eosinófilos tienen receptores para diversas proteínas del complemento y distintas inmunoglobulinas: IgG, IgA y de baja afinidad para IgE (Balic et al., 2000b; Salinas, 2007). Por esto, se requiere normalmente una inmunidad adquirida que permita desarrollar anticuerpos específicos para que los eosinófilos puedan adherirse a los parásitos, y desarrollar, de este modo, su acción efectora. Estos mismos anticuerpos podrán estimular simultáneamente a otras poblaciones celulares, como los mastocitos, que además liberarían sustancias con efecto quimiotáctico sobre los eosinófilos (Meeusen y Balic, 2000; Salinas, 2007). - 41 - Revisión Bibliográficaaaaaaaaaaa aaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa b) Eosinofilia en infecciones primarias Las infecciones primarias de larvas de nematodos GI producen una moderada eosinofilia. En ovinos primariamente infectados con H. contortus los mayores niveles de eosinófilos en el tejido se encuentran a los 5 días post-inoculación (dpi). A los 27 ó 36 días la eosinofilia es menor, aunque con niveles mayores que los observados en animales control (Balic et al., 2000a). En infecciones con T. circumcincta se observa también eosinofilia tisular a los 10 y 21 dpi (Stevenson et al., 1994). En helmintos con fases larvarias que queden albergadas en estructuras quísticas se ha podido observar eosinofilia en el momento de la salida al exterior de los adultos a los 21-23 dpi en el caso de Nematodirus battus (Winter et al., 1997), o de las larvas 4 de Oesophagostomum columbianum, a los 5 dpi (Shelton y Griffiths, 1967). La eosinofilia en infecciones primarias por nematodos GI, se produce fundamentalmente asociada a los estadios larvarios, más que a la presencia de los vermes adultos, lo que podría deberse al elevado poder quimiotáctico de las larvas de estos helmintos sobre los eosinófilos (Adams y Colditz, 1991; Wildblood et al., 2005). Sin embargo, la repercusión de esta eosinofilia sobre el asentamiento y desarrollo larvario es escasa, probablemente por requerirse una mayor activación de los eosinófilos mediada por anticuerpos tal y como sugieren Meeusen y Balic, 2000 y Terefe et al., 2009. Por otra parte, Gill et al., 2000, al realizar un estudio en dos grupos de corderos seleccionados genéticamente por su resistencia a los nematodos GI, hallaron a los 28 días de una inoculación primaria con 20000 L3 de H. contortus, niveles más altos de eosinófilos y mastocitos en la mucosa abomasal de los ovinos más resistentes. Aunque no se recogieron datos previamente, ni se correlacionaron los parámetros celulares con las cargas parasitarias, estos datos sugieren que la resistencia de estos animales podría estar relacionada con la presencia de eosinófilos en el tejido. En este trabajo se resalta también el papel de los linfocitos T en la estimulación y proliferación de los eosinófilos, dado que, en los animales resistentes, los niveles de IL-5 producidos por los linfocitos de los linfonódulos locales fueron muy superiores a los observados en los animales susceptibles. c) Eosinofilia en infecciones secundarias. Inmunidad adquirida En infecciones secundarias por helmintos, los incrementos de eosinófilos en sangre y tejidos son sensiblemente superiores a los detectados en animales primoinfectados, existiendo una estrecha - 42 - Revisión Bibliográfica asociación con las larvas del parásito localizadas en la mucosa (Shelton y Griffiths, 1967; Stevenson et al., 1994; Balic et al., 2003, 2006). La eosinofilia en sangre muestra en estos casos sus valores más altos a los 12 días post infección tras la inoculación secundaria de ovinos Barbados Barriga Negra e INRA 401 con larvas 3 de H. contortus. Este pico también se observa en ovinos Barbados Barriga Negra, raza ovina resistente, al ser inoculados por primera vez, pero no en los pertenecientes a INRA 401, raza susceptible (Aumont et al., 2003). Amarante et al., 1999 también observan niveles más altos de eosinófilos en sangre a los 21 dpi, en una inoculación secundaria con H. contortus, especialmente en la raza resistente Florida Native, en comparación con la raza Rambouillet, susceptible. El papel de los eosinófilos en la inmunidad adquirida frente a nematodos GI se relaciona fundamentalmente con su asociación a un estado de resistencia (Gill et al., 2000) y con la observación histológica o in vitro de su efecto lesivo sobre las larvas del parásito (Rainbird et al., 1998; Balic et al., 2006). Sin embargo, el papel de los eosinófilos como células protectoras no deja de ser controvertido. Es llamativo el efecto quimiotáctico de los productos de excreción/secreción de larvas y adultos sobre los eosinófilos, y el daño que producen las enzimas liberadas por el eosinófilo sobre los tejidos del propio hospedador. Algunos autores sugieren que el medio ambiente generado por los eosinófilos podría ser incluso beneficioso para los parásitos, y por tanto estos inducirían el reclutamiento de estas células (Klion y Nutman, 2004; Wildblood et al., 2005). Esto podría ser especialmente cierto en especies parásitas, como Teladorsagia circumcincta, que se alojan en las criptas gástricas, lo que dificultaría la interacción directa entre el eosinófilo y las fases evolutivas del parásito en esta localización (Balic et al., 2000b). Algunos autores han observado correlaciones positivas entre los niveles de eosinófilos en sangre y la longitud de los parásitos adultos, sugiriendo que la presencia de estas células podría favorecer el desarrollo de T. circumcincta en particular (Henderson y Stear, 2006), aunque también podría reflejar simplemente un mayor reclutamiento celular ante una mayor biomasa parasitaria. De cualquier manera, su incremento en los tejidos parasitados sugiere un papel importante en la defensa frente a los parásitos, o al menos frente algunas especies. Numerosos estudios in vitro reflejan la unión específica de los eosinófilos de roedores y humanos a la superficie de las larvas de los parásitos, en un proceso mediado por anticuerpos y el complemento, que concluye con la muerte del parásito (Butterwoth y Thorne, 1993). En el caso de los ovinos, Rainbird et al., 1998, demuestran que los eosinófilos son capaces de unirse específicamente a las L3 de - 43 - Revisión Bibliográficaaaaaaaaaaa aaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa H. contortus in vitro, en presencia de inmunoglobulinas específicas, IL-5 humana recombinante y complemento, y Terefe et al., 2007b, a su vez, observan una menor capacidad infectiva de las L3 de H. contortus cuando estas se incubaron en presencia de eosinófilos antes de inocularlas. Se ha comprobado finalmente como los eosinófilos se congregan alrededor de las larvas de H. contortus en ovinos previamente inmunizados. Las larvas rodeadas presentan diferentes grados de lesión, indicando así que los eosinófilos pueden dañar o incluso matar las larvas de nematodos in vivo. El mecanismo de activación de los eosinófilos no pudo ser determinado en su totalidad, aunque los resultados obtenidos sugieren que los niveles de citoquinas en los tejidos pueden ser determinantes (Balic et al., 2006). Además de este efecto citotóxico directo, los eosinófilos liberan leucotrienos, capaces de promover efectos similares a los leucotrienos liberados por los mastocitos (Costa et al., 1997; Weller, 1997). La mayoría de los autores encuentran mayores recuentos de eosinófilos en sangre en ovinos seleccionados por su resistencia frente a nematodos GI que en ovinos susceptibles (Dawkins et al., 1989; Buddle et al., 1992). Sin embargo, esto no es una constante. Así, Woolaston et al., 1996 sugieren excluir la eosinofilia sanguínea como criterio de selección de resistencia frente a nematodos GI al no encontrar diferencias entre líneas de Merino resistentes y susceptibles frente a H. contortus. Por otra parte, niveles particularmente elevados de eosinófilos en los tejidos son un hallazgo frecuente en razas e individuos resistentes (Gill et al., 2000; Bricarello et al., 2002, 2004). En otros casos los recuentos no difieren entre razas resistentes y susceptibles, pero sólo se encuentran correlaciones negativas entre los eosinófilos en abomaso y los recuentos de huevos en heces en las razas resistentes (Amarante et al., 2005). En general, se acepta que los nematodos adultos no suelen inducir eosinofilia, y que su expulsión está mediada por los mastocitos (autocura). En el caso de la expulsión larvaria, diferentes estudios sugieren que los eosinófilos están implicados en un fenómeno de expulsión diferida o tardía de las larvas que han alcanzado la mucosa. Dado que las distintas fases del parásito expresan distintos antígenos, se requieren varios contactos con el parásito para adquirir inmunidad, explicándose así la mayor efectividad de los eosinófilos en infecciones secundarias (Meeusen y Balic, 2000). - 44 - Revisión Bibliográfica En resumen, el papel de esta población celular en la defensa frente a las infecciones parasitarias por nematodos GI no parece desarrollarse de forma similar en todos los casos, y se encuentra sujeta a numerosos factores, tanto relacionados con el hospedador como con la especie parásita implicada en cada caso. Por ello, los diferentes estudios realizados han obtenido resultados muy dispares, tal y como se ha reflejado en este capítulo. A su vez, algunas observaciones son referidas frecuentemente: • los niveles de estas células aumentan en los animales parasitados, especialmente tras infecciones repetidas. • los eosinófilos liberan sustancias al exterior de efecto proinflamatorio y lesivo para el parásito. • su efecto parece limitarse a los estadios larvarios, requiriéndose una activación previa. 3.4.2.4. Células mucosas y caliciformes Las células caliciformes, verdaderas glándulas unicelulares, se encuentran situadas en el intestino y aparato respiratorio. El abomaso carece de ellas, y en su lugar existe un epitelio de células productoras de mucus que tapiza las fosillas en las que se abren las glándulas gástricas y las crestas situadas entre ellas. También se encuentran células similares en el cuello de las glándulas (Fawcett, 1991). Estas células liberan a la luz el mucus, que protege la pared abomasal del efecto del HCl y la pepsina. La hiperplasia de células mucosas y caliciformes, y la modificación de la composición del mucus (típicamente la glicosilación de la mucina) son fenómenos frecuentes en las infecciones por nematodos GI y parecen estar mediados por las células T (Nawa et al., 1994; Balic et al., 2000b; Khan y Collins, 2004). Sin embargo, no existe un acuerdo unánime. Así tras inducir la depleción de los linfocitos T en ratones infectados con el nematodo Nippostrongylus brasiliensis, no se observan diferencias importantes en el número de células caliciformes ni en la composición del mucus, si bien, este procedimiento reduce su producción y retrasa la expulsión de los vermes (Khan et al., 1995). Entre las citoquinas implicadas en la hiperplasia de las células mucosas y en el aumento de la producción de mucus se encuentran la IL-13, IL-4, IL-1 y la IL-12 (Kobayashi et al., 1991; Dahlman-Hoglund et al., 1996; Ishikawa et al., 1997; McKenzie et al., 1998; Wills-Karp et al., 1998). En el ovino, la inoculación de larvas 3 y adultos de T. circumcincta produce hiperplasia de las células mucosas en la totalidad de la pared gástrica, así como menor actividad de las células - 45 - Revisión Bibliográficaaaaaaaaaaa aaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa únicamente los animales sensibilizados los que muestran una respuesta de IgG1 similar frente a vermes adultos (Schallig et al., 1995; Gill et al., 2000). Los niveles de IgG2 específicas aparecen especialmente elevados en ovinos parasitados con T. circumcincta (Yong et al., 1991) y también en bovinos parasitados con O. ostertagi (Frankena, 1987). Este hecho puede sugerir distintas vías en la respuesta efectora frente a los distintos géneros de nematodos GI (Gill et al., 1993b; Claerebout y Vercruysse, 2000) o incluso el desarrollo de mecanismos parasitarios de evasión de la respuesta inmune del hospedador. Gill et al., 2000, por su parte, asocian la producción de IgG1 e IgE a resistencia frente a H. contortus al observar diferencias en los niveles de estas inmunoglobulinas entre ovinos resistentes y susceptibles, 28 días después de una inoculación primaria. La IgA es la inmunoglobulina más abundante en las mucosas, responsable de prevenir la entrada de agentes patógenos (exclusión inmune), y de evitar reacciones exacerbadas frente a antígenos alimentarios inocuos (tolerancia oral). Es secretada en forma de dímero por las células plasmáticas de la mucosa, y liberada a la luz unida a un receptor presente en las células epiteliales denominado “componente secretor”, que además evita su digestión por las proteasas del mucus (Brandtzaeg, 1974; 2009). La elevación de los niveles de IgA, especialmente en las mucosas infectadas, suele asociarse a la parasitación por helmintos gastrointestinales, hecho que no suelen reflejar sus niveles séricos (Balic et al., 2000b). Existe una fuerte asociación entre los niveles de IgA en el mucus y la disminución de la longitud de adultos (Stear et al., 1995c; Stear y Bishop 1999; Strain et al., 2002; Martínez Valladares et al., 2005a; Henderson y Stear, 2006) y la fecundidad de las hembras de T. circumcincta (Stear et al., 1996; Martínez Valladares et al., 2005a). Este hecho podría estar relacionado con un bloqueo directo de los órganos sexuales del parásito (Salinas, 2007). Otros estudios muestran una clara influencia de la IgA en la respuesta inmune frente H. contortus (Amarante et al., 2005) y T. colubriformis (Pernthaner et al., 2006). El papel de la IgE parece estar relacionado con un mecanismo de hipersensibilidad de tipo I, con activación de la degranulación de los mastocitos y eosinófilos, previa unión de los complejos antígeno-IgE a los FcεRI de la membrana del mastocito, así como a los receptores de baja afinidad para IgE del eosinófilo. - 52 - Revisión Bibliográfica Pernthaner et al., 2006 observan un doble pico de IgE e IgA (el primero coincidiendo con la primera muda larvaria, y el segundo con la aparición de adultos) tras la inoculación secundaria con T. colubriformis en ovinos con inmunidad adquirida. Asimismo, se señalan fuertes incrementos en los niveles de IgE totales y de IgE específicos frente a antígeno excretor/secretor de adultos en la inoculación secundaria de ovinos con H. contortus, si bien 2-3 semanas después de la inoculación primaria ya se puede observar un pico de IgE. Sin embargo, no se detecta la misma elevación utilizando antígeno somático de L3 (Kooyman et al., 1997). También Huntley et al., 1998 observan un claro incremento en los niveles de IgE en suero y vasos linfáticos locales en ovinos infectados con T. circumcincta, especialmente en animales previamente inmunizados. Sin embargo, pese a que el aumento de IgE, tanto específica como inespecífica, es una de las respuestas más características en las infecciones por nematodos GI, el papel protector de esta inmunoglobulina aún no está aclarado (Shaw et al., 2009). Algunos autores cuestionan la función protectora de la IgE al observar que, si bien se produce un aumento de IgE tras la infección, lo habitual es que la producción de IgE inespecífica supere ampliamente la de IgE específica frente al parásito. Se sugiere por tanto que estas IgE inespecíficas podrían saturar los FcεRI de los mastocitos impidiendo la unión de los complejos antígeno-IgE específica, y con ello la degranulación celular (Jarrett y Miller, 1982; Pritchard, 1993). Curiosamente, en bovinos infectados con O. ostertagi, algunos autores han encontrado correlaciones positivas (Baker y Gershwin, 1992) y otros negativas entre los niveles de IgE específicos y la resistencia a la parasitación (Thatcher et al., 1989; Baker y Gershwin, 1993), con lo que su papel es controvertido. El papel de las IgM parece ser muy poco relevante. Dado el gran tamaño de esta molécula, es rara su salida a los tejidos desde la circulación, aunque se ha demostrado, al menos en el hombre, que es posible su secreción a la luz del tubo digestivo unida a una molécula transportadora, como ocurría con la IgA (Brandtzaeg et al., 1968). La discreta elevación de los niveles de IgM en algunos animales inoculados parece más bien producto de reacciones cruzadas con antígenos víricos o bacterianos (Schallig et al., 1995). Los linfocitos B, diferenciados en células plasmáticas, son las células productoras de las diferentes inmunoglobulinas y su cuantificación puede ayudar a valorar la dinámica de infiltración celular local (Balic et al., 2000a; Lacroux et al., 2006; Pérez et al., 2008). Su marcaje inmunohistoquímico se realiza con diferentes anticuerpos monoclonales. En estudios realizados en la mucosa gástrica ovina es frecuente el uso de anticuerpos frente a la molécula CD45R, dado que, además de linfocitos B, tan sólo reconocen una pequeña subpoblación de - 53 - Revisión Bibliográficaaaaaaaaaaa aaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa linfocitos T, prácticamente ausente en la pared abomasal (Meeusen et al., 1989; Balic et al., 2000a). 3.5. MANIFESTACIONES DE LA RESPUESTA INMUNE FRENTE A NEMATODOS GASTROINTESTINALES 3.5.1. Frente a estadios larvarios 3.5.1.1. Hipobiosis La inhibición del desarrollo larvario o hipobiosis es un fenómeno frecuente en la infección por nematodos GI en rumiantes, tal y como se ha comentado anteriormente. Se ha asociado a la resistencia frente a Ostertagia ostertagi (Michel, 1963) y Haemonchus placei (Roberts, 1957) en vacuno, y frente a H. contortus (Barger et al., 1985), T. circumcincta (Seaton et al., 1989a, Halliday et al., 2007)), T. colubriformis (Barnes y Dobson, 1993) y Trichostrongylus vitrinus en el ovino (Seaton et al., 1989b). Consiste en el cese temporal del ciclo del nematodo en un momento preciso del desarrollo parasitario, que sirve para sincronizar el desarrollo del parásito con las condiciones del hospedador y del ambiente (Soulsby, 1987). Varios autores han señalado la hipobiosis como un mecanismo de resistencia frente T. circumcincta en el ovino, puesto que es observada en animales inmunizados, aunque no estén claros los mecanismos que provocan esta situación (Stear et al., 1995b; Halliday et al., 2007). Stear et al., 1995b, postulan que la hipobiosis se asocia a los niveles de IgA frente a L4, de IgG1 frente a L3 y con la carga de vermes adultos. Sin embargo, en otro estudio, realizado también con ovinos infectados con T. circumcincta, no se llegó a observar ninguna asociación entre los niveles de IgA en linfonódulos abomasales y la hipobiosis larvaria (Halliday et al., 2007). Por otra parte, la hipobiosis se ha relacionado en múltiples trabajos con otros factores, como son la estacionalidad, la cepa del parásito o la carga parasitaria adulta, tal y como se señaló en el apartado 3 (Blitz y Gibbs, 1971; Eysker, 1997). La importancia epidemiológica de la hipobiosis radica en que promueve una presencia masiva en el pasto de L3 infectantes en momentos en los que hay gran disponibilidad de hospedadores susceptibles, asegurando la supervivencia del parásito en situaciones adversas para el mismo y en que, tras la activación masiva de un elevado número de larvas quiescentes, desencadena patologías graves en los hospedadores (Urquhart, 1996). - 54 - Revisión Bibliográfica Se ha sugerido que la presencia de larvas quiescentes es una estrategia que permite al parásito mantener un nivel de carga parasitaria adulta mediante la renovación de los vermes adultos que van siendo eliminados con la movilización de larvas hipobióticas. Sin embargo, también se ha observado que animales hiperinmunizados son capaces de disminuir progresivamente la carga adulta hasta eliminar todos los vermes (Michel, 1963; Barger et al., 1985). En infecciones naturales de animales en pastoreo, y dado que la respuesta inmune individual es muy variable, la renovación paulatina de la carga parasitaria adulta por las larvas quiescentes, permite un cierto nivel de eliminación de huevos en el pasto que asegura el mantenimiento de la población parasitaria. El hecho de que la hipobiosis sea un fenómeno frecuente en distintas especies de nematodos GI podría sugerir que sea una estrategia de supervivencia efectiva mas que un mecanismo defensivo del hospedador (Balic et al., 2000b). 3.5.1.2. Fallo en el establecimiento larvario La manifestación principal de la inmunidad adquirida frente a nematodos GI es la reducción del número de larvas que se asientan en la mucosa intestinal tras ser ingeridas (Balic et al., 2000b). En este hecho parecen influir una serie de elementos clave: • La resistencia al establecimiento larvario se expresa más contundentemente tras contactos repetidos con el parásito. Esto se ha observado en bastantes especies de nematodos GI tales como H. contortus (Barger et al., 1985), Trichostrongylus vitrinus (Seaton et al., 1989b), T. circumcincta (Seaton et al., 1989a), T. colubriformis (Dobson et al., 1990b) y Ostertagia ostertagi (Michel, 1973; Claerebout et al., 1996). • Existen mecanismos específicos de resistencia para cada fase de desarrollo del parásito. Además, las distintas fases larvarias estimulan en distinto grado la respuesta inmune y activan distintos mecanismos efectores. Por ejemplo, animales inmunizados con inoculaciones repetidas de L3 de diferentes especies de la familia Trichostrongylidae adquieren antes la capacidad de inhibir el establecimiento larvario, que de reducir la carga parasitaria adulta (Chiejina y Sewell, 1974; Dobson et al., 1990b). • Para la activación de la resistencia frente al establecimiento de las larvas de determinada especie se requieren múltiples reinfecciones por la misma especie, pero la expresión de esta resistencia puede afectar a múltiples especies presentes en el mismo tejido. De esta manera, animales que han adquirido inmunidad mediante inoculaciones con larvas de T. colubriformis, pueden expulsar otras larvas de nematodos intestinales, como Nematodirus spathiger o - 55 - Revisión Bibliográficaaaaaaaaaaa aaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa Trichostrongylius vitrinus, pero no las de los nematodos gástricos T. circumcincta o H. contortus (Dineen et al., 1977; Barnes y Dobson, 1993; Emery et al., 1993). • La infección natural de los animales que pastan en el campo puede tener una intensidad muy variable, desde periodos de gran carga parasitaria en el pasto, en los que la infección es continua, a temporadas en las que la supervivencia de las larvas en la hierba es prácticamente nula, lo que activa diferentes mecanismos de expulsión larvaria. En el caso de las larvas, se contempla su expulsión inmediata, en un proceso en el que intervienen mastocitos intraepiteliales específicamente sensibilizados (“leucocitos globulares”), capaces de impedir el acceso de las larvas a la mucosa en caso de infecciones repetidas, en un mecanismo mediado por IgE. Una gran ventaja de este tipo de respuesta es la escasa inflamación de los tejidos del hospedador, al no producirse la penetración larvaria en los mismos. Cuando el nivel de parasitación disminuye y los niveles de leucocitos globulares no son suficientes para expulsar las larvas, algunas de estas consiguen alcanzar la mucosa, desencadenando una respuesta inflamatoria caracterizada por la presencia abundante de eosinófilos y linfocitos en las mucosas y la liberación de citoquinas, principalmente del tipo Th2. Estos eosinófilos son capaces de destruir las larvas alojadas en la mucosa liberando el contenido de sus gránulos, mecanismo también mediado por anticuerpos, en un proceso de expulsión retardada del parásito (Meeusen et al., 2005). 3.5.2. Manifestaciones de resistencia frente a nematodos adultos 3.5.2.1. Expulsión de los vermes adultos La inmunidad frente a los estadios adultos se manifiesta fundamentalmente en la expulsión de los vermes, cambios en su morfología y reducción de la fecundidad de las hembras. La expulsión de los vermes adultos tras una inoculación primaria es un fenómeno raro en rumiantes (Behnke et al., 1992), con la excepción de las infecciones por Nematodirus battus (Lee y Martin, 1976; Winter et al., 1997). En cambio, la expulsión de la población adulta como resultado de infecciones repetidas es un fenómeno frecuente en ovinos en las infecciones por H. contortus, (Barger et al., 1985), Ostertagia leptospicularis (Hertzberg et al., 1995), T. circumcincta (Seaton et al., 1989a), T. vitrinus (Seaton et al., 1989b) y T. colubriformis (Dobson et al., 1990b), así como en terneros, por O. ostertagi (Michel, 1963). - 56 - Revisión Bibliográfica La expulsión de los vermes adultos es dependiente de la dosis infectante, al menos en las infecciones por H. contortus y T. colubriformis (Barger et al., 1985; Dobson et al., 1990b), siendo necesario un umbral mínimo para que se desencadene el proceso de eliminación. En ovinos este fenómeno es atribuido a un mecanismo de hipersensibilidad inmediata desencadenado por la entrada de larvas, que afecta de modo inespecífico a los adultos, incluso de especies distintas a la de las larvas infectantes. Esta reacción, denominada de “autocura”, es muy característica de la parasitación por H. contortus, y no necesariamente implica la adquisición de inmunidad frente a futuras infecciones (Soulsby, 1987; Meana y Rojo, 1999). Sin embargo, existen datos que pueden hacer pensar en fenómenos de resistencia específicos frente a nematodos adultos. Se observa, por ejemplo, que la expulsión de las larvas y adultos de nematodos GI sucede de forma diferida en el tiempo. Por otra parte, existen evidencias de la capacidad que tienen los adultos de T. colubriformis de generar una resistencia específica frente a adultos en ausencia de inmunidad larvaria (Emery et al., 1992). Por ello, en general se considera que la expulsión de los nematodos adultos sería el resultado de mecanismos inespecíficos inducidos por larvas infectantes y de mecanismos específicos inducidos por los propios vermes adultos (Balic et al., 2000b). 3.5.2.2. Cambios en la morfología Entre los cambios morfológicos descritos como manifestación de la respuesta inmune frente a los vermes adultos se encuentran la ausencia de solapa vulvar en las hembras y la disminución de la longitud total del verme. Diversos autores han observado como el tamaño de los vermes se reduce como manifestación de la resistencia. Así, Coyne y Smith, 1992 mostraron como los vermes obtenidos en ovinos infectados con 30000 L3 de H. contortus, tras una inoculación previa con la misma cantidad de larvas y posterior desparasitación, fueron más cortos que los vermes de animales primoinfectados. En el caso de H. contortus el menor tamaño de los vermes adultos implica una menor ingesta de sangre, y por tanto, un menor grado de anemia. También Douch, 1988 observa como animales con bajos recuentos de huevos albergan hembras de Trichostrongylus spp. de menor tamaño que animales con recuentos altos. Por otra parte, Seaton et al., 1989a, al medir los vermes de animales inoculados semanalmente con 1000 L3 de T. circumcincta, observaron curiosamente una disminución de la longitud en los vermes de los animales inoculados durante cuatro semanas en comparación con los que fueron inoculados durante ocho semanas, y que por tanto deberían haber desarrollado mayor inmunidad. Posteriormente, Stear et al., 1995b - 57 - Revisión Bibliográficaaaaaaaaaaa aaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa demuestran una clara influencia de la producción de IgA frente a productos de excreción/secreción de L4 en la longitud de los adultos de T. circumcincta, aunque en este caso la disminución de la longitud de los vermes podría ser consecuencia de los efectos de la respuesta inmune frente a los estadios larvarios. El desarrollo anómalo de la solapa vulvar en los vermes hembra ha sido constatado como una manifestación de la inmunidad adquirida tras sucesivas infecciones con O. ostertagi (Michel et al., 1973) y T. circumcincta (Denham, 1969), pero en H. contortus este hecho aún no ha podido ser confirmado. 3.5.2.3. Reducción de la fecundidad Una menor fecundidad en las hembras adultas se observa frecuentemente como un mecanismo de regulación de las poblaciones de nematodos GI. Esta reducción en la fecundidad está frecuentemente vinculada a la carga parasitaria, bien porque llega a alcanzarse un umbral suficiente para desencadenar la respuesta inmune específica, o bien porque un número elevado de vermes sea capaz de provocar una competencia intraespecífica (Balic et al., 2000b). La reducción de la fecundidad se ha descrito tras infecciones repetidas con T. colubriformis (Gibson y Parfitt, 1973; Barnes y Dobson, 1990; Bisset et al., 1996), H. contortus (Dineen y Wagland, 1966) y T. circumcincta (Smith et al., 1985a; Stear et al., 1995b) en ovinos; con T. colubriformis en caprino (Pomroy y Charleston, 1989) y en vacuno infectado con O. ostertagi (Michel, 1963), y en general se acepta como una de las consecuencias de la instauración de una respuesta protectora, aunque en algunos casos no se haya observado esta reducción en la fecundidad (Coyne et al., 1991; Coyne y Smith, 1992). Los mecanismos propuestos por los diferentes autores como implicados en la reducción de la fecundidad de los vermes son variados. Se ha subrayado la estrecha asociación existente entre la longitud de los vermes y su fecundidad, tanto en H. contortus como en T. circumcincta (Stear et al., 1999; Martínez Valladares et al., 2005a; Lacroux et al., 2006; Rowe et al., 2008), llegándose a plantear la hipótesis de que el control de la fecundidad de los vermes tenga lugar de forma indirecta, mediante la regulación inmunológica del desarrollo de los vermes, en un proceso mediado por IgA (Strain y Stear, 2001; Rowe et al., 2008). Sin embargo, la IgA también podría tener un efecto directo sobre la fecundidad mediante el bloqueo directo de los órganos sexuales del parásito (Salinas et al., 2007). Finalmente, también se ha descrito la disparidad en la proporción hembras / machos como un posible mecanismo de reducción de la fecundidad de los vermes (Preston y Allonby, 1979). - 58 - Revisión Bibliográfica 3.6. EVASIÓN DE LA RESPUESTA INMUNE POR EL PARÁSITO Los parásitos han desarrollado múltiples sistemas para evitar la respuesta inmune del hospedador. En algunos casos existen mecanismos de resistencia a los sistemas efectores del hospedador, en otros se dificulta el reconocimiento de antígenos, o incluso se liberan sustancias que producen inmunosupresión, o que hacen la respuesta menos efectiva (Salinas, 2007). En el caso de los nematodos GI, diversos mecanismos les permiten evadir la respuesta inmune del hospedador. Es llamativo el hecho de que el grado de protección inducido por las distintas especies sea muy distinto, sugiriendo esto una capacidad variable de evasión de la respuesta inmune según la especie parásita. En algunos casos, como el de Oesophagostomum radiatum, la exposición leve frente al parásito induce una inmunoprotección adecuada y duradera. Otras especies, como Ostertagia spp. o H. contortus, inducen protección tras un periodo prolongado de exposición. Además, se trata de una protección poco duradera, que requiere de sucesivas reinfecciones para mantenerse (Gasbarre, 1997). En algunos casos el parásito dificulta la exposición de sus antígenos o resulta poco accesible a los mecanismos efectores. Esto lo consiguen de diversas maneras: a veces desarrollan nódulos en las mucosas como en el caso de Oesophagostomum spp., otras se mueven con rapidez, dificultando el contacto con las células defensivas del hospedador, como es el caso de H. contortus. Además, las diferentes fases del desarrollo del parásito pueden mostrar diversos antígenos somáticos y de excreción/secreción a lo largo de su ciclo endógeno, comportándose, a efectos de reconocimiento antigénico, como parásitos distintos. En el caso de O. ostertagi en vacuno y T. circumcincta en el ovino, sí parece haber una presentación adecuada de antígenos, como sugieren el incremento del volumen de los ganglios locales, la infiltración linfocitaria de la mucosa por linfocitos T específicos y la generación de respuestas humorales periféricas (Gasbarre, 1997). Sin embargo, estas respuestas no parecen ser del todo efectivas, dada la poca reactividad de estos linfocitos frente a mitógenos inespecíficos, fenómeno al menos demostrado en sangre periférica en terneros y cabras (Wiggin y Gibbs, 1990; González, 2002). A su vez, se han descrito en O. ostertagi sustancias liberadas por estos parásitos que bloquean mecanismos concretos de respuesta inmune, como antígenos de L4 y adultos que inhiben, al menos in vitro, la linfoproliferación inducida por las L3, o proteasas capaces de degradar la IgG (de Marez et al., 1997; Geldhof et al., 2000). Los helmintos se caracterizan por liberar sustancias inmunomoduladoras que modifican la respuesta inmune en su beneficio, hecho que no deja de suscitar controversia entre los - 59 - Revisión Bibliográficaaaaaaaaaaa aaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa científicos (Maizels et al., 2004; Hewitson et al., 2009). Así, en referencia a T. circumcincta, algunos autores señalan que la escasa activación de la respuesta inflamatoria, quizás provocada por el parásito, redundaría también en beneficio del hospedador, al ocasionar menor lesión tisular y diarrea, y que el cuadro agudo sería el resultado de una respuesta inmune anómala, exacerbada (Greer et al., 2008). Para H. contortus se ha descrito cómo la expresión de moléculas similares a galectinas ejerce un efecto quimiotáctico in vitro sobre los eosinófilos. Paradójicamente, esto podría crear un ambiente más adecuado para la supervivencia y alimentación de los vermes adultos (Wildblood et al., 2005; Turner et al., 2008). En algunos casos se plantea incluso el posible uso terapéutico de estas moléculas de origen parasitario en el tratamiento de enfermedades relacionadas con el sistema inmune (Falcone y Pritchard, 2005; Kujik y van Die, 2010). 4. ESTIMULACIÓN DE LA RESPUESTA INMUNE COMO MÉTODO ALTERNATIVO PARA EL CONTROL DE LOS NEMATODOS GASTROINTESTINALES EN EL GANADO OVINO En teoría, el uso combinado de antihelmínticos y medidas de manejo en pastoreo debería ser suficiente para controlar las nematodosis gastrointestinales. Sin embargo en la actualidad existen algunos elementos que han comprometido la eficacia de estos métodos tradicionales. El problema más grave, ya analizado con anterioridad, es la aparición masiva y múltiple de resistencias frente a fármacos antihelmínticos. El descubrimiento de nuevos fármacos no solucionaría este problema, dado que sería muy probable la aparición de cepas resistentes a corto-medio plazo, tal y como ha ocurrido con los fármacos de los que se dispone actualmente. Además, el consumidor muestra cada vez más preocupación por la presencia de residuos farmacológicos en los alimentos de origen animal, y crece la demanda de productos de ganadería ecológica, en la que la administración de fármacos está restringida. Estas y otras razones han llevado a buscar métodos alternativos o, al menos, complementarios a un control de las gastroenteritis parasitarias fundamentado en el uso de antihelmínticos. El objetivo es encontrar un modelo de control de la enfermedad sostenible económicamente y eficaz a largo plazo. - 60 - Revisión Bibliográfica 4.1. CONTROL NUTRICIONAL Una alimentación adecuada es necesaria para mantener la salud y el bienestar de los animales, y es determinante para evitar el desarrollo de cuadros clínicos en los animales parasitados. De hecho, la mayor parte de las hemoncosis clínicas ocurren en animales con nutrición deficiente y, en cualquier caso, ningún antihelmíntico mejorará la ganancia de peso de los animales a no ser que se acompañe de una ración adecuada (Craig, 2006). Las principales dificultades que tienen los productores para optimizar al máximo las dietas son los costes y el incremento de trabajo que esto supone (Stear et al., 2007). Diversos trabajos han demostrado que incrementos en la proteína y/u oligoelementos en la dieta permiten al hospedador minimizar los efectos del parásito y aumentar la productividad (Waller, 1997b; Strain y Stear, 2001; FAO, 2004; Stear et al., 2007). En animales inoculados con H. contortus, Bricarello et al., 2005 observaron una mejora en la resistencia y tolerancia en la raza ovina resistente Santa Inés cuando se incrementaba la proteína metabolizable en la dieta, y también observaron una mejora de la tolerancia en la raza susceptible Ile de France, alimentada de forma similar. Otros autores han constatado que el aporte de urea como fuente de nitrógeno no proteico incrementa la respuesta frente a los nematodos GI (Knox y Steel, 1999; Stear et al., 2000b; FAO, 2004), y que las hembras gestantes que mantienen una adecuada condición corporal gracias a aportes energéticos extras muestran menores incrementos en los recuentos de huevos en heces durante el periodo del periparto (Valderrábano et al., 2006). 4.2. VACUNACIÓN Ante el gran éxito obtenido en el desarrollo de las vacunas frente a virus y bacterias, se ha planteado como alternativa su búsqueda frente a parásitos. La obtención de una vacuna frente al nematodo pulmonar del ganado bovino Dictyocaulus viviparus (Anonymous, 1959; Jarrett et al., 1960), con larvas atenuadas, estimuló la investigación para el desarrollo de vacunas frente a otros nematodos de la familia Trichostrongylidae. A pesar del carácter hematófago de H. contortus, que permitiría a las inmunoglobulinas séricas entrar fácilmente en contacto con el parásito, y su alta fecundidad, que facilitaría la obtención de antígeno, no se han obtenido hasta el momento vacunas comerciales. En esta especie, las investigaciones se han desarrollado sobre tres planteamientos: el uso de larvas atenuadas, de antígenos expuestos al sistema inmune del hospedador en infecciones naturales y de antígenos ocultos del parásito, que no quedan expuestos al sistema inmune del hospedador. - 61 - Revisión Bibliográficaaaaaaaaaaa aaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa En comparación con los estudios realizados intra y entre razas, son pocos los trabajos publicados sobre cruzamientos entre razas para seleccionar resistencia frente a nematodos, y habitualmente suponen una segunda fase en el estudio de una raza resistente. Un concepto clave en los programas de cruzamiento es el de heterosis. Se define como el incremento del valor medio en la descendencia en relación a los valores medios de las razas puras progenitoras, expresado en porcentaje (Falconer, 1989). Los resultados obtenidos reflejan como los cruces entre razas resistentes y razas productivas suelen determinar individuos con características mejoradas tanto en la resistencia a enfermedades como en los parámetros productivos, es decir, con índices de heterosis positivos. Hielscher et al., 2006 comparando corderos de razas puras Rhön, susceptibles frente a H. contortus, y Merinoland, resistentes, con corderos cruzados de ambas razas, observaron una mejoría en la mayor parte de los parámetros productivos y parasitológicos en los corderos provenientes del cruce de machos Rhön con hembras Merinoland, lo que se reflejó en los porcentajes de heterosis. Li et al., 2001 recogieron datos sobre resistencia y productividad a lo largo de dos años de animales procedentes del cruce de ovinos Suffolk (raza susceptible) y Gulf Coast (raza resistente). Esta F1 presentó elevados porcentajes de heterosis en los FEC (33-81%) y hematocrito (6-20%), siendo el porcentaje de heterosis en el peso algo menor (1,2-3,8%). Otro estudio reflejó como el cruce de Merino Rambouillet (susceptible) con Florida Native (resistente) mejoró enormemente los parámetros de resistencia de los ovinos Merino a partir de la F2, pudiendo ser un buen medio para mejorar las características de ambas razas a la espera de analizar como se afectan los parámetros productivos (Amarante et al., 1999). Finalmente, en Indonesia, Romjali et al., 1996 compararon ovinos locales de raza Sumatra, resistentes a nematodos GI, con la F1 derivada del cruce con otras razas foráneas de mejor aptitud productiva. Los resultados mostraron que los cruces mejoran sustancialmente los parámetros de crecimiento de la raza local, sin verse afectada especialmente la resistencia frente nematodos GI. Todos estos datos muestran como los programas de cruzamiento de razas resistentes con razas de alta producción pueden tener efectos beneficiosos a corto plazo, mucho antes que seleccionando la resistencia dentro de una raza productiva o viceversa. Si bien hacen falta estudios que evalúen si pueden constituir una estrategia de selección a largo plazo, sí parece que - 68 - Revisión Bibliográfica podrían aplicarse en cruces finalizadores en la producción de carne en países en que las gastroenteritis parasitarias sean causa de grandes pérdidas (Li et al., 2001). • Conservación de genes de resistencia. Atendiendo a su censo, el ovino y las otras especies ganaderas rumiantes no pueden considerarse, evidentemente, amenazadas. Sin embargo, es indudable que están perdiendo diversidad genética por distintas causas (Taberlet et al., 2008). La desaparición de razas autóctonas supone la pérdida de genes de gran interés, aunque su valor sea difícilmente cuantificable en términos económicos, frente a la producción de leche, carne o lana. La rusticidad de las razas locales, entendida como la adaptación a su medio natural, les lleva a aprovechar al máximo los recursos naturales de la zona, manifestar una especial facilidad para el manejo y el pastoreo o adquirir resistencia a determinadas enfermedades. Esta última característica de las razas autóctonas sugiere la conservación del máximo material genético posible, pues se desconoce qué problemas sanitarios serán más relevantes en un futuro a largo plazo. Por otra parte, las razas de alta producción, pese a tener un gran censo, poseen en realidad un escaso tamaño efectivo de población, debido al reducido número de machos reproductores. La selección se ha realizado en función únicamente de caracteres productivos, olvidando el patrimonio genético global de cada raza. De esta manera, es inevitable la endogamia, que repercute en la aparición de caracteres indeseables (Taberlet et al., 2008). La conservación de razas autóctonas en su medio natural ha de constituir una prioridad, y dado que su utilidad a corto plazo puede ser poco percibida por los ganaderos, habrá de ser fomentada por las instituciones públicas. A la vez es de gran importancia el estudio científico, que identifique los caracteres positivos de cada raza, en orden a conservar el máximo patrimonio genético de una especie (Tapio et al., 2006). • Modelos de respuesta inmune y dianas farmacológicas Gran parte de los métodos de control de las gastroenteritis parasitarias alternativos al uso de antihelmínticos buscan explotar las respuestas inmunes (innatas o adquiridas) del hospedador frente al parásito. Las razas autóctonas genéticamente resistentes a los nematodos GI han demostrado su resistencia frente al parásito en un periodo de tiempo mucho más largo que las líneas seleccionadas dentro de una determinada raza (Miller y Horohov, 2006). Sin embargo, - 69 - Revisión Bibliográficaaaaaaaaaaa aaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa los mecanismos inmunes que subyacen en esta resistencia no están claros y podrían ser novedosos (Piedrafita et al., 2008, 2010), y su conocimiento se revela extremadamente importante para el desarrollo de nuevos fármacos y vacunas. Es muy posible que los antígenos que estimulan la respuesta inmune en algunas razas, puedan ser utilizados como vacunas, o que el estudio más profundo de la interacción parásito/hospedador pueda ofrecer nuevas dianas farmacológicas (Meeusen y Piedrafita, 2003). Además, la identificación de los mecanismos que explican la mayor protección de estas razas puede facilitar una aproximación más racional a la búsqueda de genes marcadores de resistencia. b) Razas descritas como resistentes frente a H. contortus (Tabla 2) En la literatura científica se recogen estudios que avalan la resistencia de algunas pocas razas ovinas frente a H. contortus. Además, si bien los estudios de resistencia frente a otras especies de Trichostrongylidae son escasos, no hay que descartar una resistencia conjunta frente a diferentes parásitos (Gruner et al., 2004). Los parámetros estudiados y los criterios utilizados para determinar la resistencia son bastante variables, aunque pueden resumirse en el estudio de variables parasitológicas (número y longitud de los vermes, fecundidad, huevos por gramo de heces…) y hematológicas (hematocrito y proteínas plasmáticas). A su vez, algunos autores señalan limitaciones habituales en el diseño experimental de estos estudios, dado que frecuentemente el número de animales es bajo (5-10), no se tiene en cuenta influencia individual de los progenitores, ni se especifican los criterios de elaboración de los grupos experimentales (Baker y Gray, 2004). Por ello es importante hacer notar que determinadas razas han sido señaladas como resistentes en varios estudios independientes, y por ello existe un consenso importante a la hora de valorarlas como resistentes. Se trata de algunas razas presentes en el Caribe y Sur de Estados Unidos (St. Croix, Gulf Coast Native, Florida Native y Barbados Barriga Negra) y en África tropical (Roja Africana o, en inglés, Red Massai) (Tabla 2). En algunas razas se ha llegado a estudiar la base inmune de esa resistencia, valorando el tipo de células efectoras, la producción de anticuerpos y citoquinas, etc, obteniéndose resultados muy dispares. Esto podría reflejar que las diferentes razas ovinas estarían siguiendo distintos mecanismos para alcanzar la protección, lo que muestra la complejidad que entraña el desarrollo de una respuesta inmunitaria protectora frente a estos parásitos (Piedrafita et al., 2008, 2010). Sin embargo, también habría de tenerse en cuenta que la utilización de diferentes razas - 70 - Revisión Bibliográfica susceptibles como elemento de comparación podría contribuir a esta disparidad en los resultados. La raza Florida Native se define como resistente al ser comparada con el Merino Rambouillet. Así los recuentos de huevos en heces y la carga parasitaria de vermes adultos son menores en la raza resistente, a la vez que el hematocrito es más elevado tras una primera infección natural, seguida de una inoculación con 6000 L3 de H. contortus (Amarante et al., 1999). Por otra parte, se observa una menor longitud en los vermes alojados en la raza resistente (Radhakrishnan et al., 1972). Sin embargo, no se encuentran diferencias significativas en los recuentos de eosinófilos, mastocitos y leucocitos globulares en la mucosa abomasal. Estos autores sugieren por ello que la resistencia de estas razas no se basaría en diferencias cuantitativas en estas poblaciones celulares, y podría ser el resultado, por tanto, de diferencias en su capacidad funcional (Amarante et al., 1999). Una situación similar es encontrada por Amarante et al., 2004, 2005 cuando evalúan la resistencia de otra raza local, la Sta. Inés, comparándola con las razas europeas Suffolk e Ile de France. La Sta. Inés muestra FEC y cargas parasitarias menores que las otras razas; sin embargo, no se hallan diferencias en los recuentos celulares en el abomaso ni en los niveles de IgA en mucus. La raza resistente Barbados Barriga Negra, al ser comparada con la raza INRA 401 muestra menores FEC y cargas parasitarias. A pesar de ello, el hematocrito es superior en la raza susceptible (Aumont et al., 2003). También se encuentran diferencias entre razas en la longitud y fecundidad de los vermes, más pronunciadas en la inoculación primaria que en la reinoculación (Terefe et al., 2007a). En este último estudio se comparan varias poblaciones celulares de la pared del abomaso y no se hallan diferencias significativas entre razas. El estudio de citoquinas permite observar una respuesta Th2 más pronunciada en la raza resistente, al encontrarse diferencias en la producción de IL-4, IL-5 e IL-13. Estudios realizados tras inocular corderos de las razas Merinoland (resistente) y Rhön (susceptible) muestran menores FEC y mayores niveles de hematocrito en los ovinos Merinoland, así como una diferencia en la fecundidad de los vermes, mucho mayor en la raza Rhön. Sin embargo, las cargas parasitarias y la longitud de los vermes son muy similares (Gauly et al., 2002; Hielscher et al., 2006). Existen razas resistentes en las que sí se han podido verificar diferencias cuantitativas en las poblaciones de células inflamatorias. Es el caso de la raza brasileña Criolla Lanuda, que al ser - 71 - Revisión Bibliográficaaaaaaaaaaa aaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa comparada con la Corriedale en infecciones naturales con H. contortus muestra menores FEC y cargas parasitarias, y mayores niveles de hematocrito y proteínas séricas. Entre estas razas existen diferencias significativas en los recuentos de eosinófilos y leucocitos globulares de la pared abomasal (Bricarello et al., 2004). A su vez, la raza St. Croix es más resistente que la Dorset en función de sus menores FEC y cargas parasitarias, tras infecciones naturales e inoculaciones experimentales. La evaluación de la linfoproliferación y de la respuesta humoral mostró una escasa activación de la respuesta inmune, aunque se contabilizaron más leucocitos globulares en la mucosa abomasal en la raza resistente (Gamble y Zajac, 1992). La raza Gulf Coast Native presenta una resistencia natural frente a H. contortus al ser comparada con la raza Suffolk, mostrando menores FEC y cargas parasitarias, así como mayores niveles de hematocrito. Esta resistencia está asociada a una mayor activación de la respuesta inmune, con elevados niveles de IgE e IL-4 en sangre y mayores recuentos de células inflamatorias en el abomaso en la raza resistente (Bahiratan et al., 1996; Miller et al., 1998; Shakya et al., 2009). El papel de los linfocitos T CD4+ en la resistencia de esta raza se demostró tras la administración de anticuerpos anti-CD4 y la posterior inoculación con H. contortus en corderos. Los animales a los que se les administró el anticuerpo tuvieron mayores cargas parasitarias y FEC, aunque no se observaron diferencias en los hematocritos (Peña et al., 2006). La raza Roja Africana ha sido comparada con la Dorper, observándose en la primera menores recuentos de huevos y cargas parasitarias, vermes más cortos, hematocrito más altos y tasas de mortalidad más bajas (Preston y Allonby 1978, 1979; Mugambi et al., 1996, 2005). En este caso se observan diferencias significativas en los recuentos de eosinófilos en sangre periférica, elevados de forma significativa en la raza resistente (Mugambi et al., 1996). Es importante señalar que la resistencia frente a H. contortus es una característica frecuente en las razas de pelo, siendo ésta una adaptación más a las condiciones del medio en que viven. Además de algunas ya reseñadas (Barbados de Barriga Negra, Roja Africana, St.Croix o Sta. Inés), cuya resistencia ha sido estudiada en profundidad, otras razas de pelo, como la Indonesia de Cola Fina, la Sabi o la Katahdin, han sido señaladas recientemente en la literatura como resistentes en comparación con razas de lana (Subandriyo, 2002; Matika et al., 2003; Vanimisetti et al., 2004b). Los estudios de MacKinnon et al., 2009, 2010, comparando rebaños formados por cruces entre razas de pelo con rebaños formados por cruces entre razas de lana, confirman este hecho. Ante la inoculación primaria de H. contortus los animales de pelo - 72 - Revisión Bibliográfica son claramente más resistentes que los de lana, manifestando una mayor expresión de genes relacionados con la motilidad gástrica, la producción de citoquinas proinflamatorias y la infiltración celular. Este hecho determina mayores recuentos de eosinófilos en el tejido, así como en un aumento de los niveles de IgA séricas específicas. Se puede concluir de todo ello que la existencia de variabilidad entre razas en la resistencia frente a la parasitación por H. contortus es un hecho ampliamente documentado, especialmente en razas tropicales y subtropicales. A la vez, aunque es posible una influencia de diferentes factores ambientales en la aparición de esta resistencia (nutrición, manejo), existe un componente genético importante en su base, que se manifiesta en mecanismos específicos de respuesta inmune frente al parásito, que podrían ser distintos entre unas y otras razas resistentes (Baker y Gray, 2004; Dominik 2005; Bishop y Morris, 2007; Piedrafita et al., 2010). 5. EL OVINO EN LAS ISLAS CANARIAS: OVINO CANARIO DE PELO Y OVINO CANARIO 5.1. INTRODUCCIÓN Cuando los conquistadores castellanos llegaron a las Islas Canarias encontraron una raza ovina que era explotada por los aborígenes y que en lugar de lana tenía pelo. El historiador Abreu y Galindo escribe: “críase en esta isla (La Palma) cierto género de carneros y ovejas que no tienen lana, sino pelo liso como una cabra…”. Esta raza ovina aborigen dio lugar, tras sucesivos y variados cruces con otras razas ovinas peninsulares, a las tres razas ovinas reconocidas como autóctonas de las Islas Canarias según el Catálogo Nacional de Razas de Ganado de España (RD 2129/08): el ovino Palmero, el Canario y el Canario de Pelo (Anónimo, 2005). El ovino Canario, de buena aptitud lechera, ha tenido siempre una mejor aceptación que las otras dos razas locales. De hecho, su expansión por todas las islas, junto con el ganado caprino, ha constituido un grave riesgo para la conservación del ovino Palmero, hoy casi desaparecido, y del Canario de Pelo, actualmente en expansión, pero por momentos casi extinguido (Esteban, 2003; Anónimo, 2005). Finalmente, también ha constituido un riesgo para la conservación de estas razas locales el fenómeno de despoblación rural propio de las últimas décadas, con la consecuente falta de mano de obra y abandono de las tierras, junto con la intensificación de los sistemas productivos en búsqueda de mayores rendimientos de las explotaciones, lo que lleva a despreciar la cría ganadera en extensivo. - 73 - Revisión Bibliográficaaaaaaaaaaa aaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa - 74 - Revisión Bibliográfica - 75 - Revisión Bibliográficaaaaaaaaaaa aaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa Las instituciones locales, nacionales e internacionales, muestran gran interés en la conservación de estas razas locales, por su valor histórico y genético, y por su capacidad de integrarse en sistemas de producción sostenibles. Existen Libros Genealógicos para las tres razas (Órdenes de 13 de agosto de 2001; 21 de Mayo de 2003 y 21 de junio de 2006, del Gobierno de Canarias), pertenecientes a la categoría de “razas autóctonas en peligro de extinción”, según el Catálogo Nacional anteriormente citado. Actualmente no existen programas oficiales de selección y conservación, con lo que queda en manos de los ganaderos particulares. Fig. 5: Ovino Canario y ovino Canario de Pelo criados conjuntamente El ovino Canario y el ovino Canario de Pelo están oficialmente reconocidos por la FAO (http://dad.fao.org/). Para ambas razas se incide en su elevada rusticidad y en su capacidad para explotarse en zonas tropicales y subtropicales con escasos recursos, a la vez que se recuerda que están libres de brucelosis. El ovino Canario de Pelo es considerada por la FAO en la última edición del “World watch list for domestic animal diversity” como una raza “amenazada” (Scherff, 2000) Si bien en la actualidad, con la notable expansión que ha experimentado en esta última década, es probable que la raza haya salido de esa categoría, sin embargo no se dispone de censos oficiales que permitan asegurarlo tajantemente. 5.2. EL OVINO CANARIO DE PELO Esta raza se considera relacionada con los ovinos peludos de África Occidental, que dieron lugar a una raza ovina de pelo presente en Canarias antes de la colonización de las Islas. Tras el descubrimiento de América, y al ser las Islas Canarias un lugar de paso en los viajes de las embarcaciones hacia el Nuevo Mundo, se importaron ovinos de pelo desde Canarias a América, - 76 - Revisión Bibliográfica que dieron lugar a importantes razas de pelo americanas como la Barbados de Barriga Negra, el Pelibuey, etc., extendidas fundamentalmente en zonas tropicales (Esteban, 2003). La población autóctona de ovinos de pelo entró en clara regresión, pero la introducción desde América en las últimas décadas de importantes núcleos de oveja de pelo, y su rápida expansión en las Islas, ha elevado enormemente el censo de la raza Canaria de Pelo. Fig. 6: Ovino Canario de Pelo A la buena aceptación de la raza por parte de los ganaderos contribuyen especialmente sus posibilidades productivas, relacionadas con la producción de carne y, sobre todo, de estiércol, en conexión con la agricultura intensiva, sumada a ello su elevada rusticidad. De esta manera, la expansión de cultivos intensivos como los de plataneras o de tomateros, no ha ido en detrimento, sino más bien en beneficio, de la expansión de esta raza. Además, por carecer de lana, no es necesario esquilarla, con lo que el manejo es más sencillo. Entre las características morfológicas que definen a la raza encontramos la capa, generalmente roja, aunque se admiten otras tonalidades, la ausencia de lana, si bien puede aparecer en el dorso de modo vestigial, el perfil de la cabeza subconvexo en las hembras, y convexo en los machos, el gran desarrollo testicular en el macho, el poco desarrollo de la mama en la hembra, aunque está bien implantada, además del carácter acorne de ambos sexos, admitiéndose de modo extraordinario la presencia de pequeños cuernos en algunos individuos (Orden 13 de agosto de 2001; Esteban, 2003). Se considera un animal de continua actividad reproductora a lo largo del año, con buenos índices de fertilidad y prolificidad (Anónimo, 2005; Camacho et al., 2007). Aunque los partos - 77 - Material y Métodosaaaaaaaaaa aaaaaaaa aaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa - 86 - Material y Métodos Holanda) se sumergieron en isopentano durante unos minutos, hasta que el O.C.T. adquiriera una consistencia sólida. Una vez obtenidos los bloques con las muestras recubiertas por O.C.T., se almacenaron en cámara a -80ºC hasta su posterior procesado. Muestras de un grosor de 4 μm se obtuvieron en un criostato (Reichert-Jung 2800 Frigocut N) a -20ºC. Figura 8: Criostato utilizado para cortes en congelación 3.4.2. Recogida del contenido abomasal El abomaso se abrió a través de la curvatura mayor, recogiéndose el contenido abomasal en una batea. Para retirar los vermes que pudieran quedar en la mucosa, se procedió a lavar la víscera con un volumen conocido de agua. A continuación, se homogenizó la suspensión y se recogió una alícuota de 300 ml a la que se añadieron 30 ml de formol (formaldehído 35-40% v/v, Panreac) para su conservación hasta su posterior procesado (modificado de MAFF, 1989). 3.4.3. Recogida de mucosa gástrica Finalmente, con la ayuda de un portaobjetos, se realizó un raspado profundo de la totalidad de la mucosa gástrica para estimar la población de vermes inmaduros presentes en el interior de la mucosa en el momento del sacrificio. A continuación, se pesaron las muestras recogidas de cada animal y el tejido se conservó en congelación, a -20º C hasta su posterior procesado. - 87 - Material y Métodosaaaaaaaaaa aaaaaaaa aaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa 4. ANÁLISIS HEMATOLÓGICOS Durante el periodo experimental, se valoraron diversos parámetros hematológicos en los animales inoculados. 4.1. HEMATOCRITO Para determinar la proporción relativa de glóbulos rojos respecto al plasma, la sangre se centrifugó (Mixtasel, Selecta) a 8000 r.p.m. durante 7 minutos en capilares de microhematocrito (Marienfeld, Glassware), utilizándose una escala comercial para calcular el hematocrito de cada animal. 4.2. PROTEÍNAS PLASMÁTICAS La concentración de las proteínas plasmáticas (g/dl) se halló con ayuda de un refractómetro (Comecta SA). El plasma se obtuvo a partir de las centrifugaciones efectuadas para determinar los hematocritos. Fig. 9: Recuento de leucocitos en cámara de Neubauer 4.3. RECUENTO TOTAL DE LEUCOCITOS Se realizó una dilución de la sangre de cada animal (1:20) en líquido de Türck (Panreac SA). De este modo, se produce la hemólisis y se tiñen los núcleos de los leucocitos (Voigt, 2003). El recuento total de los glóbulos blancos se realizó para cada animal con ayuda de una cámara de Neubauer (Tiefe). Se contabilizaron los leucocitos presentes en un volumen de 0,02 μl de - 88 - Material y Métodos sangre. El resultado se multiplicó por 50 y de este modo se obtuvo el nº de leucocitos/μl de sangre (Fig.9). 4.4. RECUENTO DIFERENCIAL DE LEUCOCITOS EN SANGRE PERIFÉRICA Para realizar el recuento diferencial de leucocitos, se tiñeron extensiones de sangre de cada animal con panóptico rápido (Panreac SA). A continuación se procedió al recuento diferencial de 100 leucocitos en cada preparación, discriminando entre neutrófilos, basófilos, eosinófilos, linfocitos y monocitos. A partir de este dato y del número total de leucocitos/μl de sangre, se calculó el número de células de cada tipo leucocitario/μl de sangre. b) a) Fig 10: Frotis sanguíneos (400x) en los que se pueden observar un linfocito y un neutrófilo (a), y un eosinófilo (b). 5. ESTUDIOS PARASITOLÓGICOS En este estudio se utilizaron diversas técnicas parasitológicas que permitieron comparar la implantación y posterior desarrollo de las larvas de H. contortus en el abomaso, así como la fecundidad y longitud de los vermes adultos en ovinos Canarios de Pelo (CAP) y Canarios (CAN) tras la infección experimental con 20000 L3 de H. contortus. 5.1. RECUENTO DE HUEVOS EN HECES Las heces de cada animal fueron procesadas inmediatamente después de su recogida mediante flotación en solución salina saturada (MAFF, 1989), con el propósito de valorar cualitativamente la presencia o ausencia de huevos de H. contortus en ellas. - 89 - Material y Métodosaaaaaaaaaa aaaaaaaa aaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa Los huevos presentes en las muestras positivas fueron contabilizados por medio del método de McMaster modificado (MAFF, 1989). Brevemente, se homogenizó un gramo de heces con Fig. 11: Huevos de H. contortus (100x) solución salina saturada hasta alcanzar un volumen total de 30 ml. Posteriormente, se contabilizaron todos los huevos presentes en 0,3 ml de esta suspensión, de modo que cada huevo encontrado en la cámara equivalía a 100 huevos por gramo de heces. 5.2. RECUENTO DE VERMES ADULTOS EN ABOMASO Se contabilizaron separadamente todos los vermes adultos machos y hembras presentes en cada alícuota de 300 ml de contenido abomasal de cada animal, con ayuda de una lupa binocular (Wild, Heerbrugg) a 6x. El número total de vermes de cada animal se calculó considerando el volumen total de líquido recogido (Wood et al., 1995). 5.3. MEDIDA DE HEMBRAS Y RECUENTO DE HUEVOS EN ÚTERO De cada animal se recogieron al azar 30 hembras de H. contortus, que fueron medidas a seis aumentos en una lupa binocular que disponía de una regla graduada en uno de los oculares. Posteriormente, se rompieron los vermes cuidadosamente con ayuda de un cubreobjetos y se contabilizaron todos los huevos presentes en el útero de cada verme hembra (100x) (Strain y Stear, 2001). 5.4. RECUENTO DE VERMES INMADUROS PRESENTES EN EL CONTENIDO ABOMASAL Igualmente, se procedió al recuento de los vermes presentes en las alícuotas de 30 ml de contenido abomasal obtenidas de los animales sacrificados a los 7 dpi. El número total de - 90 - Material y Métodos vermes inmaduros se calculó considerando el volumen total de contenido gástrico. Atendiendo a sus características morfológicas, todos los vermes inmaduros recogidos correspondieron a larvas 4 (Fig. 12) (Anderson, 1992). 5.4.1. Medida de vermes inmaduros presentes en el contenido abomasal Posteriormente se midieron 30 vermes inmaduros obtenidos de los lavados de abomaso realizados a los animales sacrificados a los 7 días post-inoculación. En algunos animales, las formas inmaduras recogidas presentaban primordio genital (L4 tardías), midiéndose exclusivamente los vermes hembras, mientras que en otros corderos no se podía distinguir entre sexos (L4 tempranas) (Anderson, 1992; Gómez Muñoz, 1996; Lacroux et al., 2006). La longitud de las formas inmaduras se determinó con ayuda del paquete informático ProgRes CapturePro 2.0 (Jenoptik). Las imágenes necesarias para realizar la medición de los parásitos se obtuvieron con una cámara digital, (ProgRes C12 Plus, Jenoptik), conectada a un microscopio (Olympus CKX 41). a) b) Fig. 12: Larva 4 hembra (a) y macho (b) de H. contortus a 50x, mostrando el primordio genital (flecha) 5.5. DIGESTIÓN DE LA MUCOSA GÁSTRICA Y RECOGIDA DE VERMES INMADUROS Tras descongelar previamente, se digirió una muestra de aproximadamente 15 g de la mucosa gástrica de cada animal, mediante incubación con 2 ml de una solución de pepsina y HCl (Tabla 5) por cada g de mucosa, durante 30 min, a 37 ºC y en agitación (modificado del MAFF, 1989). Posteriormente se determinó el volumen resultante y se contabilizaron las formas inmaduras del verme en una alícuota de 20 ml con la ayuda de una lupa (Wild Heerbrugg) a 16x. - 91 - Material y Métodosaaaaaaaaaa aaaaaaaa aaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa Tabla 5: Composición de la solución de digestión para mucosa abomasal dH2O Completar hasta 100 ml NaCl (Panreac) 0,85 g HCl 37 % (Panreac) 2 ml Pepsina (Sigma) 0,8 g 6. DETECCIÓN DE ANTICUERPOS EN SUERO Y MUCUS MEDIANTE ELISA INDIRECTO 6.1. PREPARACIÓN DE LOS ANTÍGENOS DE VERMES ADULTOS DE HAEMONCHUS CONTORTUS Los vermes adultos necesarios para obtener antígeno somático y excretor/secretor se recogieron de dos ovinos inoculados con 7000 L3 de H. contortus, sacrificados 25 días post inoculación. Tras el sacrificio se vertió el contenido de cada abomaso en una batea, lavando con 700 ml de agua corriente. El contenido abomasal se mezcló con una solución de agar (Sigma) en agua destilada al 1,7%, a una temperatura de 43 ºC, sobre un paño, incubándose en vertical en una cubeta con PBS a 37 ºC durante 1 hora y media. Los vermes que habían atravesado el agar se recogieron del fondo de la cubeta y traspasaron a una placa de Petri con PBS sobre una placa caliente, a 37 ºC, para eliminar los restos de agar. Los vermes se traspasaron a tubos de 20 ml con PBS atemperado a 37 ºC y se centrifugaron a 200 rpm durante 5 min, procedimiento realizado en dos ocasiones. Tras el lavado se introdujeron los vermes en cubetas de cultivo celular (Nunc), estériles, que contenían medio RPMI (Sigma) y se incubaron a 37 ºC y 5% de CO2, recogiéndose el sobrenadante a las 24 y 48 horas. Este sobrenadante se filtró (0,22 μm, Acrodisc, Pall Corporation), fue concentrado por centrifugación a 4000 g en tubos Amicon de 10 kD (Millipore) durante 30 min y el producto resultante fue utilizado antígeno excretor/secretor (ES) de verme adulto. - 92 - Material y Métodos Tabla 6: Composición del medio RPMI para recogida de antígeno ES de adultos de H. contortus RPMI-1640 medium (Gibco) Completar hasta 500 ml L-glutamina (Sigma) 2 mM D-Glucosa 1 % (p/v) Penicilina-Streptomicina 0,01 % (p/v) Anfotericina B 0,0125 % (p/v) Gentamicina 0,0025 % (p/v) Hepes (Sigma) 20 mM Los adultos, tras ser lavados en PBS-Tween 20 (Sigma) al 0,1%, se homogenizaron mecánicamente (Ultraturrax, IKA) y mediante ultrasonidos (UP100H, Hielscher) a 4 ºC, centrifugándose a 4500 g (Centrifuge 5804R, Eppendorf) durante 20 min. Se recogió el sobrenadante y el pellet volvió a ser homogeneizado y centrifugado, añadiéndose este nuevo sobrenadante al anterior. La concentración proteica del antígeno fue determinada mediante el método de Bradford. 6.2. PREPARACIÓN DEL ANTÍGENO SOMÁTICO DE L3 DE H. CONTORTUS El antígeno somático de larvas 3 (L3) de Haemonchus contortus se obtuvo tras someter a 106 L3 a tres ciclos de congelación y descongelación (-80 ºC/ 25 ºC), posterior homogenización mecánica y con ultrasonidos a 4 ºC, y ultracentrifugación a 30000 g (Optima L-100 XP Ultracentrifuge, Beckmann Counter) (Lacroux et al., 2006). La concentración proteica del sobrenadante fue determinada mediante el método de Bradford. 6.3. ANÁLISIS DE INMUNOADSORCIÓN LIGADO A ENZIMAS (ELISA) La respuesta humoral (IgG e IgA) específica de los animales inoculados fue estudiada mediante un método de ELISA indirecto frente a antígenos somáticos y de excreción/secreción de vermes adultos y somáticos de L3 de H. contortus. 6.3.1. Reactivos - Peróxido de hidrógeno (Panreac). - 93 - Material y Métodosaaaaaaaaaa aaaaaaaa aaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa - Buffer de dilución del antígeno. Tampón carbonato. Tabla 7: Composición del Buffer de dilución de antígeno Buffer Carbonato pH 9,6 NaHCO3 al 8,4% 45,3 ml NaCO3 al 10,6% 18,2 ml dH2O 936,5 ml - PBS-Tween 20 (Sigma) al 0.05%. - Albúmina sérica bovina (BSA, Sigma) - Azida de sodio (Sigma). - Conjugado sueros policlonales Anti-IgG (Donkey anti sheep IgG peroxidase conjugate, Sigma) y Anti-IgA (Rabbit anti sheep IgA HRP conjugated, Bethyl) marcados con peroxidasa - Hidroclorato de orto-fenil diamina (OPD, Sigma) - Solución de fosfato sódico al 2,8 % (p/v) - Solución de ácido cítrico al 2,1 % (p/v) - Solución de ácido sulfúrico 2M 6.3.2. Equipos: - Placa ELISA (Corning Incorporated, Costar) - Lector de placa de ELISA (Multiskan Ascent) - Estufa (P-selecta) - Pipeta multicanal (Slamed) - Micropipetas (Glison) - Balanza de precisión (Scaltec) - pH-metro (Crisol) 6.3.3. Procedimiento Tras incubar la placa durante 24 h con el antígeno diluido en buffer carbonato pH 9,6, se realizaron tres lavados de cinco minutos con 200µl de PBS-Tween 20 al 0,05% (v/v) para - 94 - Material y Métodos eliminar el antígeno que no se había fijado. La concentración final de cada uno de los antígenos utilizados se encuentra recogida en la Tabla 8. Para evitar el desarrollo de reacciones inespecíficas, las placas se incubaron a 37º C durante 45 minutos con una solución de albúmina sérica bovina al 3% (p/v) en PBS al 0,01 M, a razón de 200 μl /pocillo, tras la que se repitió el lavado de la placa con PBS-Tween 20 al 0,05% en las condiciones antes descritas. Cada una de los sueros problema se diluyó en una solución de PBS-Tween 20 al 0,05% que contenía ázida de sodio al 0,02% (p/v). Se dispensaron por duplicado 100 μl/pocillo, y se incubó durante 1 hora a 37ºC, procediendo posteriormente a un nuevo lavado de la placa. El revelado de la reacción se llevó a cabo mediante la adición de 100 µl/pocillo de una solución de conjugado en PBS-Tween 20 al 0.05% incubando 45 minutos a 37ºC. Tras el lavado correspondiente para eliminar el conjugado libre, se añadió el sustrato (12,2 ml de ácido cítrico al 2,1%, 12,8 ml de fosfato sódico al 2.8% y 10 mg de OPD). A la solución anterior, se le añadieron 50 µl de H2O2 y se dispensó a razón de 100 µl/pocillo, dejándolo reaccionar a temperatura ambiente en oscuridad durante 5 minutos. Finalmente, la reacción se frenó mediante la adición de 50 μl/pocillo de una solución de ácido sulfúrico 2M, llevándose a cabo la determinación de las densidades ópticas mediante un lector de placa de ELISA (Multiskan Ascent) a una longitud de onda de 492 nm. En el caso de los ELISA realizados en suero, se usaron como controles negativos sueros de animales no inoculados, mientras que en los ELISA realizados en mucus se utilizó el mucus abomasal de animales sacrificados en matadero procedentes de granjas libres de nematodos gastrointestinales. Como controles positivos se utilizaron sueros y mucus de animales inoculados con 7000 L3 de H.contortus, desparasitados a las 12 semanas pi y posteriormente reinoculados con 7000 L3, que se sacrificaron 20 días después de esta reinoculación. Para cada animal se consideró la densidad óptica (OD, optical density) media de los dos pocillos, en que se dispensó el suero o mucus. - 95 - Material y Métodosaaaaaaaaaa aaaaaaaa aaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa Fig. 16: Estudio inmunohistoquímico de la pared abomasal con anticuerpos frente a linfocitos T CD2+ (40x). Las áreas de recuento se muestran sombreadas. . b) a) Fig. 17: Estudio inmunohistoquímico de la mucosa abomasal (400x). Las células aparecen marcadas con anticuerpos frente a linfocitos T CD8 en el borde superior de la mucosa (a) y frente a linfocitos T γδ en el borde inferior (b). 3 2 1 0 Fig. 18: Inmunohistoquímica de la pared abomasal con anticuerpos frente a galectina 15 (100x). El grado de tinción del mucus gástrico se valoró en una escala de 0 a 3. - 102 - Material y Métodos 9. ANÁLISIS ESTADÍSTICO Para el análisis estadístico de los datos se utilizó el paquete informático PASW versión 18.0. 9.1. NORMALIDAD Y HOMOCEDASTICIDAD DE LAS VARIABLES Para la aplicación de algunos test estadísticos fue necesario la comprobación del ajuste de la variable correspondiente a una distribución normal. Se utilizó para ello el test de Shapiro-Wilk. Para comprobar la homogeneidad de la varianza u homocedasticidad se utilizó el test de Levene. 9.2. DIFERENCIAS ENTRE VARIABLES PUNTUALES Se utilizó el test t de Student para contrastar si existían diferencias significativas entre razas en las variables que se ajustaban a la distribución normal (longitud de los vermes adultos e inmaduros y número de huevos en útero). Para contrastar si existían diferencias entre razas en las variables puntuales que no se ajustaban a la distribución normal, (número de vermes inmaduros en mucosa y cavidad abomasal, carga parasitaria final, recuentos celulares en la pared gástrica y niveles de inmunoglobulinas específicas en mucus), se utilizó la prueba no paramétrica U de Mann Withney. Las diferencias entre razas se consideraron significativas cuando el valor p fue menor o igual que 0,05. 9.3. MODELO GENERAL LINEAL DE MEDIDAS REPETIDAS (GLM MEDIDAS REPETIDAS) Para comparar entre razas las variables tomadas en diferentes momentos a lo largo del tiempo en cada animal (hematocrito, recuentos fecales de huevos, proteínas plasmáticas, eosinófilos en sangre, niveles séricos de inmunoglobulinas), se utilizó el Modelo General Lineal de medidas repetidas, previa contrastación de la normalidad mediante el Test de Shapiro-Wilk y homogeneidad de la varianza mediante el test de Levene. Con el fin de que se ajustaran a la normalidad, las variables recuento acumulado de huevos en heces y eosinófilos en sangre periférica se transformaron tomando la raíz cuadrada del valor +1 - 103 - Material y Métodosaaaaaaaaaa aaaaaaaa aaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa - 104 - antes de aplicar el GLM medidas repetidas. Las diferencias se consideraron significativas cuando la probabilidad fue menor o igual que 0,05. 9.4. COEFICIENTE DE CORRELACIÓN DE SPEARMAN Con el propósito de correlacionar las variables parasitológicas (indicadoras de resistencia a la infección), concentración de proteínas plasmáticas y valores hematocritos (indicadoras de tolerancia a la infección) y las variables inmunológicas (indicadoras de respuesta inmune) se utilizó el coeficiente de correlación de Spearman. Las correlaciones se consideraron significativas cuando la probabilidad fue menor o igual que 0,05. 9.5. DETERMINACIÓN DE LA ECUACIÓN DE REGRESIÓN En aquellas interacciones entre variables en las que se observó una fuerte correlación (carga parasitaria adulta y recuento de huevos 27 dpi; eosinófilos en abomaso y fecundidad de los vermes, etc) se calculó las ecuación de regresión simple o múltiple en cada raza por separado. El análisis de regresión múltiple permite evaluar la influencia de varios factores tomados conjuntamente sobre una variable dependiente. La ecuación de regresión, del tipo y = a+bx1+cx2+…nxn incluye todos los factores independientes, y se ajusta mediante el método de mínimos cuadrados, tratando de explicar la máxima proporción de variación de la variable independiente. Esta tasa de variación se estima mediante el coeficiente de regresión (R2), que indica la proporción de variación de la variable independiente explicada mediante la ecuación de regresión. La significación del modelo de regresión se calcula mediante el análisis de la varianza. RESULTADOS Resultados RESULTADOS Según quedó detallado en el apartado “Material y Métodos”, a lo largo de esta experiencia se recogieron regularmente muestras de sangre y heces de todos los ovinos Canarios de Pelo (CAP) y Canarios (CAN) inoculados, con el propósito de determinar los recuentos fecales de huevos de H. contortus, así como de analizar los niveles de inmunoglobulinas específicas (IgA e IgG) en el suero, la evolución del valor hematocrito, la concentración de proteínas plasmáticas y el recuento de leucocitos en los animales investigados. Tras el sacrificio de los animales, se contabilizaron las formas inmaduras en la mucosa gástrica, previa digestión de la misma, y las larvas y vermes adultos presentes en el contenido abomasal a los 7 y 28 días post-inoculación (dpi), respectivamente. Asimismo, se midieron treinta larvas y treinta vermes hembras adultas recogidas aleatoriamente del contenido abomasal de cada uno de los animales sacrificados a los 7 y 28 dpi, y se contabilizaron los huevos en útero en cada una de las hembras adultas analizadas. También se recogieron muestras de la mucosa para realizar un estudio histopatológico e inmunohistoquímico de la mucosa abomasal, llevándose a cabo recuentos de una amplia gama de poblaciones celulares por mm2 de mucosa, y valorándose la presencia de las galectinas-14 y 15 en la misma. El estudio de la respuesta inmune se completó, finalmente, con la cuantificación de las IgA específicas presentes en el mucus gástrico frente a antígeno somático de larvas y vermes adultos, así como antígeno excretor/secretor (ES) de adultos. El estudio se completó con el análisis estadístico de los datos, mediante la comparación de los resultados obtenidos entre las dos razas, y las relaciones existentes entre las distintas variables parasitológicas, hematológicas e inmunológicas. - 107 - Resultadosaaaaaaaaaa aaaaaaaa aaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa 1. ESTUDIO PARASITOLÓGICO (Tabla 10) 1.1. RECUENTOS FECALES DE HUEVOS (Fig. 19) Al final de la experiencia, los ovinos Canarios de Pelo (CAP) habían eliminado casi cinco veces menos huevos que los ovinos Canarios (CAN). El periodo prepatente de la infección fue de 18 días en ambas razas, y a partir de este momento la eliminación de huevos fue siempre en aumento, alcanzándose los valores máximos de huevos por gramo de heces (hpg) a los 27 dpi. Las diferencias entre razas en los recuentos de huevos fueron significativas desde el día 20 pi hasta el final de la experiencia. dpi hpga * * * * Fig. 19: Recuento de huevos por gramo de heces acumulados (hpga) en los ovinos Canarios de Pelo (n=8) y Canarios (n=9) infectados con 20000 L3 de H. contortus. Cada punto representa la media de los corderos de cada raza ± el error típico de la media a lo largo de la infección. Los asteriscos (*) muestran diferencias significativas (p ≤ 0.05) en el modelo general lineal (GLM) de medidas repetidas, previa transformación de la variable en raíz cuadrada del valor + 1. 1.2. RECUENTO DE VERMES ADULTOS Al llevar a cabo el análisis del contenido gástrico de los animales estudiados a los 28 dpi, se observaron 2,4 veces más vermes adultos en los abomasos de los ovinos CAN que en los ovinos CAP (Tabla 10), aproximándose dichas diferencias a la significación estadística (p = 0,06). De - 108 - Resultados las 20000 L3 inoculadas, se desarrollaron hasta adultos un 23% en el caso de los ovinos CAN y un 10 % en los ovinos CAP. El ratio vermes hembras/machos fue de 1,66 ± 0,95 ( ± s) para los ovinos CAP y 1,36 ± 0,63 en los ovinos CAN, sin que esta diferencia fuera estadísticamente significativa. x Tabla 10: Parámetros parasitológicos Tabla 10: Parámetros parasitológicos en los ovinos CAP y CAN sacrificados a los 7 y 28 días postinoculación (dpi). Larvas totales: Inmaduros mucosa + inmaduros luminales; Larvas Intramurales: formas larvarias recogidas tras la digestión de mucosa; Larvas Luminales: formas larvarias recogidas en el contenido abomasal; Longitud Lv Lm: longitud de las formas larvarias recogidas en el contenido abomasal; Longitud: longitud de las hembras adultas; Huevos en útero: huevos en el útero de las hembras adultas; Hpg 27 dpi: recuento de huevos por g de heces el día 27 pi; Hpg acumulados: sumatorio de todos los recuentos de huevos por gramo de heces. En todos los casos se presenta x ± s. Los asteriscos indican diferencias significativas entre razas (*, p ≤ 0,05; **, p ≤ 0,01) 1.3. LONGITUD DE LOS VERMES HEMBRAS ADULTAS Y RECUENTO DE HUEVOS EN EL ÚTERO Los hembras adultas de H. contortus recogidas a los 28 dpi fueron 1,29 mm más largas en los ovinos CAN que en los ovinos CAP (Tabla 10), siendo esta diferencia estadísticamente significativa y equivalente al 7,6 % de la longitud media de las hembras en los ovinos CAN. Por otro lado, las hembras de H. contortus presentes a los 28 dpi en el abomaso de los ovinos CAN contenían el doble de huevos que las presentes en el abomaso de los ovinos CAP (Tabla 10). También se puede analizar la fecundidad de las hembras del parásito en ambos grupos experimentales, calculando el ratio entre el recuento acumulado de huevos en las heces y el - 109 - Resultadosaaaaaaaaaa aaaaaaaa aaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa número de vermes hembras, y también así se observaron diferencias significativas entre ambas razas [11 ± 11 para los ovinos CAP ( x ± s) frente a 35 ± 34 en los ovinos CAN; p=0,027]. 1.4. RECUENTO DE LARVAS TISULARES Y LUMINALES; LONGITUD MEDIA DE LAS LARVAS RECOGIDAS EN LA LUZ DEL ABOMASO No existieron diferencias significativas entre razas en el número de larvas de la mucosa abomasal a los 7 dpi. Por su parte, a los 28 dpi apenas se recogieron larvas tras las digestiones de la mucosa de los abomasos de los animales sacrificados, sin que se observaran diferencias significativas entre ambas razas. Tampoco se apreciaron diferencias en los recuentos de larvas recogidas en el contenido abomasal (Tabla 10) a los 7 dpi, siendo en su mayoría larvas 4 tardías (Anderson, 1992), en las que ya se reconocía el primordio genital, con la única excepción de un ovino Canario, que tenía un elevado porcentaje de larvas 4 tempranas. La longitud media de las formas inmaduras localizadas en la cavidad abomasal fue muy similar en ambas razas. Sumando las larvas localizadas en la mucosa gástrica, (obtenidas tras la digestión), y las encontradas en la luz del abomaso, el porcentaje de establecimiento larvario en los ovinos CAP a los 7 dpi fue del 34,1%, mientras que en los ovinos CAN fue del 28,5%, sin que estas diferencias fueran significativas. La mayor parte de las larvas recogidas a los 7 dpi se encontraban en la luz del abomaso, tanto en los ovinos CAP (70%) como en los ovinos CAN (60%). 1.5. CORRELACIONES Y REGRESIONES ENTRE VARIABLES PARASITOLÓGICAS (Tablas 11 y 12) 1.5.1. Ovino Canario Al analizar las relaciones entre las variables parasitológicas a los 7 dpi en los ovinos CAN, se observó que el recuento de larvas (totales y tisulares) y su longitud, estaban relacionados, si bien estas asociaciones no fueron estadísticamente significativas (Tabla 11). A los 28 dpi, se observó una fuerte asociación entre distintas variables parasitológicas. La carga parasitaria de vermes adultos se correlacionó positiva y significativamente con la longitud de estos (Fig. 20b), y con los recuentos de huevos en las heces a los 27 dpi (Fig. 20a) y en útero, aunque en este último caso la asociación no fue estadísticamente significativa (Tabla 12). La - 110 - Resultados longitud de los vermes se correlacionó positivamente con los recuentos de huevos en útero y heces (Tabla 12). Algo más débil fue la asociación encontrada entre los recuentos de huevos en útero y heces (Tabla 12). El análisis de regresión múltiple mostró que el recuento de huevos fecales en el momento del sacrificio dependió, en esta raza, de la interacción entre la carga parasitaria y la longitud de los vermes, tomados estos parámetros como variables independientes (Fig. 21), perdiéndose la significación cuando se introdujo en el modelo la fecundidad de los vermes (huevos en útero) (R2 = 0,83; p = 0,052). Por su parte, la fecundidad de las hembras fue también dependiente de la interacción carga parasitaria-longitud (R2 = 0,70*). 1.5.2. Ovino Canario de Pelo Al analizar las correlaciones entre variables parasitológicas a los 7 dpi en los ovinos CAP, se observó una fuerte asociación positiva entre la longitud de las larvas luminales y los recuentos de larvas tras la digestión de la mucosa, no existiendo relación entre el número de larvas obtenidas tras la digestión de la mucosa del abomaso y las presentes en el lumen en esta raza (Tabla 10). Al estudiar las correlaciones entre variables parasitológicas a los 28 dpi, éstas se asociaron de forma diferente a lo observado en los ovinos CAN (Tabla 12). En contraste con la raza más susceptible, en los ovinos CAP la carga parasitaria no evidenció correlaciones significativas con los recuentos de huevos en heces (Fig. 20a) ni en útero (Tabla 12), ni con la longitud de los vermes (Fig. 20b). El recuento de huevos en heces a los 27 dpi, al igual que ocurrió en los ovinos CAN, mostró una tendencia a la asociación con la longitud de los vermes, sin llegar a alcanzar significación estadística (Tabla 12). En cambio, a diferencia de lo constatado en la raza Canaria, estos recuentos de huevos en heces se correlacionaron significativamente con la fecundidad de los vermes (Tabla 12). Longitud y fecundidad de las hembras también estuvieron relacionadas, aunque el coeficiente de correlación de Spearman no alcanzó significación estadística (Tabla 12). En contraste con lo observado en los ovinos CAN, el recuento de huevos en las heces al final del experimento no estuvo asociado con la interacción carga parasitaria-longitud (Fig. 21), ni con el efecto conjunto carga parasitaria-longitud-huevos en útero (R2 = 0,70; p = 0,25). La - 111 - Resultadosaaaaaaaaaa aaaaaaaa aaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa fecundidad de los vermes tampoco estuvo asociada con la interacción carga parasitaria-longitud (R2 = 0,41, p = 0,27). a) b) 0 5000 10000 15000 20000 HPG 27 d.p.i. -1 V 0 1 2 alor pronosticado tipificado 0 10000 20000 30000 40000 50000 HPG 27 d.p.i. -1,50 -0,75 0,00 0,75 1,50 Valor pronosticado tipificado Figura 21: Regresión del recuento de huevos en las heces a los 27 dpi frente al valor pronosticado según las ecuaciones: y = 585,2 [longitud mm] + 4,1 [carga parasitaria adulta] – 8155,3 (CAN) e y = 4628,3 [longitud mm] + 1,7 [carga parasitaria adulta] – 71067,3 (CAP). El cálculo de la ecuación de regresión fue realizado mediante un ajuste de mínimos cuadrados, estimándose su significación mediante el análisis de la varianza. Los valores pronosticados se presentan tipificados, ajustados a una distribución normal de media = 0 y desviación típica = 1. El asterisco indica significación estadística (*, p ≤ 0,05) R2 =0,80* R2 =0,50 p =0,25 CAN CAP 0 1000 2000 0 0 5000 Carga parasitaria 3 00 4 00 15 16 16 16 17 Longitud (mm) 0 2000 4000 6000 8000 10000 Carga Parasitaria 15 16 17 18 19 Longitud (mm) Figura 20: Relación entre variables parasitológicas en ovinos CAN y CAP. a) Carga parasitaria vs. Huevos por gramo de heces 27 dpi; b) Carga parasitaria vs. Longitud vermes. Los asteriscos indican significación estadística (*, p ≤ 0,05; **, p ≤ 0,01) CAN CAP R2 =0,59* 0 1000 2000 3000 4000 5000 Carga parasitaria 0 5000 10000 15000 20000 HPG 27 dpi 0 2000 4000 6000 8000 10000 Carga Parasitaria 0 10000 20000 30000 40000 50000 HPG 27 dp CAP R2 = 0,79** R2 = 0,28 p = 0,22 R2 = 0,03 p = 0,70 CAN i - 112 - Resultados - 119 - La tinción inmunohistoquímica del tejido con anticuerpos monoclonales permitió el recuento de diferentes poblaciones de linfocitos (se utilizaron anticuerpos frente a CD2, CD4, CD5, CD8, CD45R, γδ y WC1) y células presentadoras de antígeno (anticuerpos frente a MHCII y CD1), así como para evaluar la presencia de galectinas-14 y 15 en eosinófilos y mucus, respectivamente. Las células marcadas mediante esta técnica inmunohistoquímica se contabilizaron en los tercios superior e inferior de la mucosa, valorándose ambos datos por separado y en conjunto. Los datos por grupos e individuos se encuentran recogidos en la Tabla 14. Tabla 14: Recuentos celulares en mucosa abomasal Tabla 14: Recuentos medios de células en la mucosa abomasal en ovinos Canarios (CAN) y Canarios de Pelo (CAP). El valor representa x ± s. Eos.: eosinófilos, Mast.: mastocitos, L.G.: leucocitos globulares, Gal-15: grado de tinción del mucus con anticuerpos frente a galectina-15. En algunas células se señala el recuento en el tercio inferior de la mucosa (Inf.), en el tercio superior (Sup.), y la suma de ambos (Total). Letras distintas indican diferencias significativas en los recuentos de diferentes días de sacrificio, 7 ó 28 p.i., en animales de la misma raza. El asterisco “*” señala diferencias significativas entre razas en los animales sacrificados el mismo día (p ≤ 0,05). Resultadosaaaaaaaaaa aaaaaaaa aaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa 3.1. CÉLULAS EFECTORAS (Fig. 25) 3.1.1. Eosinófilos En la mucosa abomasal de los ovinos CAN se observaron casi dos veces más eosinófilos que en los CAP a los 7 dpi si bien, esta diferencia no fue estadísticamente significativa. Esta tendencia se invirtió en los animales sacrificados a los 28 dpi. Así, los ovinos CAP mostraron más del doble de eosinófilos que los ovinos CAN, pero estas diferencias tampoco fueron estadísticamente significativas. En los ovinos CAN se observaron cuatro veces más eosinófilos en la mucosa abomasal a los 7 dpi que a los 28 dpi (p=0,003), siendo estas diferencias significativas. Sin embargo, en los ovinos CAP no hubo diferencias reseñables en los recuentos efectuados a los 7 y 28 dpi (Fig. 25). 3.1.2. Mastocitos Si bien no existió significación estadística, tanto a los 7 dpi como a los 28 dpi se observaron más mastocitos en los ovinos Canarios (CAN) en relación a los ovinos Canarios de Pelo (CAP). En las dos razas se duplicó el número de mastocitos en la mucosa del abomaso a los 28 dpi, en relación con este parámetro a los 7 dpi, aunque este incremento tampoco fue estadísticamente significativo (Fig. 25). 3.1.3. Leucocitos globulares No se observaron diferencias significativas en los recuentos de leucocitos globulares entre razas tanto a los 7 dpi como a los 28 dpi. Tampoco se observaron diferencias significativas intraraciales, cuando se compararon los recuentos de estas células a los 7 y 28 dpi dentro de cada raza (Fig. 25). - 120 - Resultados 28 dpi 7 dpi ● Fig. 25: Recuentos de eosinófilos, mastocitos y leucocitos globulares en la mucosa abomasal de ovinos Canarios de Pelo y Canarios sacrificados 7 y 28 dpi El borde superior de la barra indica el recuento medio, y la línea de error señala el error típico de la media. El punto “●” señala diferencias dentro de raza para distintos días de sacrificio (p ≤ 0,05). Células / mm2 ● 3.2. LINFOCITOS (CD2, CD4, CD5, CD8, CD45R, γδ, WC1). (Fig 26) Los anticuerpos monoclonales utilizados permitieron identificar las principales subpoblaciones de linfocitos que expresan el TCR αβ, como son los CD4+ y CD8+, así como aquellos linfocitos que expresan el TCR γδ, y su principal subpoblación, mediante el marcaje con anticuerpos antiWC1. Los anticuerpos frente a las moléculas CD2 y CD5 fueron utilizados como marcadores de activación de linfocitos T, y el CD45R, como un marcador específico en ovinos, de linfocitos B (Meeusen et al., 1989; Balic et al., 2000a). En los ovinos Canarios (CAN), algunas poblaciones de linfocitos aumentaron del día 7 al 28 pi (CD2+ y CD4+ significativamente, y γδ+), y el resto de marcadores estudiados se mantuvieron estables (CD8+, CD5+, WC1+ y CD45R+). Es destacable el incremento de los linfocitos T CD4+, especialmente en el tercio inferior de la mucosa, donde el recuento de esta célula es cinco veces mayor a los 28 dpi que a los 7 dpi y de los linfocitos T CD2+, en los que la cantidad de células se cuadruplica entre la 1ª y la 4ª semana pi (Tabla 14). En los ovinos Canarios de Pelo (CAP), las poblaciones linfocitarias que aumentaron a lo largo del estudio fueron los CD4+ y WC1+, significativamente, y también los CD8+ y γδ+. En todos los casos se trató de incrementos importantes; en el caso de los linfocitos T WC1+, por ejemplo, el número de células se triplicó entre los días 7 y 28 dpi, y en los T CD4+ se quintuplicó. En esta raza, los linfocitos CD2+ y CD5+ mantuvieron recuentos similares en ambos momentos de sacrificio, y los CD45R+ experimentaron un notable descenso, especialmente en el tercio inferior de la mucosa, aunque sin alcanzar significación estadística (Tabla 14). - 121 - Resultadosaaaaaaaaaa aaaaaaaa aaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa a) * Células/ mm2 Células/ mm2 ● ● b) ● ● ● ● ● ● ● ● Fig. 26: Recuentos celulares de distintas poblaciones linfocitarias en la mucosa abomasal de ovinos Canarios de Pelo (CAP) y Canarios (CAN) sacrificados a los 7 dpi. (a) y 28 dpi. (b): T CD4+, T CD8+, T γδ+ (gd), T γδ WC1+, B (CD45R+), CD2+ y CD5+. El borde superior de la barra indica el recuento total medio, suma de los recuentos en el tercio superior e inferior de la mucosa y la línea de error señala el error típico de la media. El asterisco señala diferencias entre razas para el mismo día de sacrificio. El punto “●” señala diferencias dentro de raza para distintos días de sacrificio (p≤0,05). Sólo se alcanzaron diferencias estadísticamente significativas entre razas al comparar las células CD2+ a los 7 dpi. También las diferencias entre razas en los recuentos de células WC1+ mostraron una fuerte tendencia a la significación estadística tanto a los 7 como a lo 28 dpi. La distribución de las células en la mucosa fue variable, aunque habitualmente las células tendieron a ser más abundantes en el tercio inferior de la mucosa o a mantener una distribución homogénea por todo el tejido. En este aspecto no existieron, en general, diferencias relevantes entre razas. Solamente a los 28 dpi, los linfocitos T CD4+ y CD2+ en los ovinos CAN fueron mucho más abundantes en el tercio inferior de la mucosa que en el tercio superior, mientras que en los ovinos CAP la distribución fue homogénea (Tabla 14). - 122 - Resultados 3.3. CÉLULAS PRESENTADORAS DE ANTÍGENO (CD1 y MHC II). (Fig. 27) Los anticuerpos monoclonales utilizados permitieron identificar células presentadoras de antígeno en el contexto del MHC de clase II, y aquellas células que expresan la molécula CD1, fundamentalmente células dendríticas. En ambas razas las células CD1+ experimentaron un incremento en su población tisular, estadísticamente significativo en el caso de los CAN, entre los días 7 y 28 pi. Sin embargo, el patrón seguido por las células MHC II+ varió según la raza. En los ovinos CAN se redujo su población en la pared del abomaso a los 28 dpi, mientras que en los ovinos CAP se produjo un ligero aumento, debido principalmente al incremento del número de estas células en el tercio superior de la mucosa (Tabla 14). No se apreciaron diferencias estadísticamente significativas entre razas al comparar los recuentos de estas células en la pared del abomaso. Con respecto a su distribución, ambas células se localizaron preferentemente en el tercio inferior de la mucosa del abomaso (Tabla 14). 7 dpi Células/mm2 28 dpi ● ● Fig. 27: Recuentos de células CD1+ y MHCII+ en la mucosa abomasal de ovinos Canarios de Pelo (CAP) y Canarios (CAN) sacrificados a los 7 y 28 dpi. El borde superior de la barra indica el recuento total medio, de los recuentos en el tercio superior e inferior de la mucosa y la línea de error señala el error típico de la media. El punto “●” señala diferencias dentro de raza para distintos días de sacrificio (p ≤ 0,05) 3.4. GALECTINA-14 Y GALECTINA-15 (Fig. 28-29) Utilizando el anticuerpo frente a la galectina-14, únicamente se observó inmunorreacción en el citoplasma de los eosinófilos, siendo más abundantes en el tercio inferior de la mucosa de todos - 123 - Resultadosaaaaaaaaaa aaaaaaaa aaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa los animales (Tabla 14). En los ovinos CAN los niveles de estas células permanecieron estables a lo largo de la experiencia, mientras que en los ovinos CAP se observó un ligero incremento entre los días 7 y 28 pi, debido probablemente al aumento, significativo estadísticamente, de estas células en el tercio superior de la mucosa (Tabla 14). No se observaron diferencias entre razas en ambos tiempos de sacrificio (Fig. 28). Células/mm2 Fig. 28: Recuento de células marcadas con galectina-14 en la mucosa abomasal de los ovinos Canarios de Pelo (CAP) y Canarios (CAN) sacrificados a los 7 y 28 dpi. El borde superior de la barra indica el valor medio, y la línea de error señala el error típico de la media. a ) b ) Fig. 29: Tinción inmunohistoquímica con anticuerpos frente a Galectina-15 en animales sacrificados a los 28 dpi. Ambas imágenes son representativas de los ovinos Canarios (a) y Canarios de Pelo (b). La presencia de galectina-15 pudo constatarse en el mucus, y los cortes fueron clasificados ordinalmente en una escala de 0 a 3, de menor a mayor reacción inmunohistoquímica, tal y como se recoge en el apartado correspondiente de “Material y Métodos”. En los ovinos CAN se produjo una clara disminución en la cantidad de galectina-15 en el mucus entre los días 7 y 28 pi, siendo esta diferencia estadísticamente significativa. En los ovinos CAP, en cambio, los niveles de galectina-15 fueron similares en ambos momentos de sacrificio. - 124 - Resultados A los 28 dpi los niveles de esta molécula fueron claramente superiores en los ovinos CAP en comparación con los ovinos CAN, alcanzándose significación estadística siguiendo el procedimiento de cuantificación antes reseñado (Fig. 29, Tabla 14). 3.5. CORRELACIONES ENTRE LOS DISTINTOS TIPOS CELULARES (Tabla 15) 3.5.1. Ovino Canario A los 7 dpi se pueden destacar las correlaciones positivas y estadísticamente significativas existentes entre mastocitos y linfocitos WC1+; entre leucocitos globulares y linfocitos T CD4+ del tercio superior de la mucosa (r = 0,92*) y entre linfocitos T CD8+ y células MHC II+. Por otra parte, se observó una fuerte tendencia a la asociación inversa entre linfocitos T γδ y células CD8+ y MHC II+; entre células CD2+ y mastocitos y linfocitos T WC1+; y entre células galectina-14+ y mastocitos (Tabla 15a). A los 28 dpi (Tabla 15b) se pueden destacar algunas asociaciones negativas entre variables: entre mastocitos y células CD8+; entre las células CD45R+ y los eosinófilos y mastocitos y, sin significación estadística, entre eosinófilos y linfocitos T γδ+ y células galectina-14+ del tercio inferior de la mucosa (r = 0,3; p =0,43 en este último caso). A su vez, las células galectina-14+ se correlacionaron positivamente con varias poblaciones celulares: MHCII+, linfocitos T CD4+ (p = 0,07) y WC1+. Finalmente, también eosinófilos y mastocitos estaban positivamente correlacionados en esta raza a los 28 dpi. 3.5.2. Ovino Canario de Pelo Se observaron diferencias importantes en las relaciones entre células en los ovinos CAP en comparación con los ovinos CAN. Así, a los 7 dpi (Tabla 15a) destacaron las correlaciones entre algunas poblaciones celulares y ciertas subpoblaciones de las mismas: linfocitos T γδ+ y WC1+, por una parte, y eosinófilos y células galectina-14+ por otra, estuvieron correlacionados positivamente. A su vez las células MHC II+ se correlacionaron fuertemente con los leucocitos globulares y con los linfocitos T CD4+. En este momento de sacrificio también destacó la correlación positiva entre linfocitos CD5+ y CD2+; entre eosinófilos y células CD45R+ y CD5+; así como entre estas dos células (CD5+ y CD45R+) y entre mastocitos y la producción de galectina-15. Finalmente, los mastocitos se asociaron negativamente con los linfocitos CD8+ y γδ+. - 125 - Resultadosaaaaaaaaaa aaaaaaaa aaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa - 126 - A los 28 dpi (Tabla 15b) se observó una fuerte correlación positiva entre eosinófilos y linfocitos T γδ+ (en los ovinos CAN la correlación fue inversa). Por su parte, como ya ocurriera a los 7 dpi, linfocitos T γδ+ y WC1+ aparecieron fuertemente correlacionados, mientras que en los ovinos CAN la correlación entre estas células fue inversa a los 7 dpi y débilmente positiva a los 28 dpi. También fueron significativas las correlaciones entre las células CD1+ y los linfocitos T CD4+; entre las células MHC II+ y los eosinófilos y niveles de galectina-15 y entre las células CD45R+ y la producción de esta galectina. Tabla 15a: Correlaciones entre células a los 7 dpi Resultados Tabla 15b: Correlaciones entre células a los 28 dpi Tabla 15: Coeficientes de correlación (r) de Spearman entre recuentos celulares en la pared abomasal en ovinos Canarios de Pelo (CAP) y Canarios (CAN) sacrificados a los 7 (a) y 28 (b) dpi. Eos.: eosinófilos; Mast.: mastocitos; L.G.: leucocitos globulares; Gal-15: grado de tinción del mucus con anticuerpos frente a galectina -15; Gal-14: galectina 14. Los asteriscos indican significación estadística ( *: p ≤0 , 05 ; **: p ≤0 , 01 ) - 127 - Resultadosaaaaaaaaaa aaaaaaaa aaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa 4. ESTUDIO DE LA RESPUESTA HUMORAL Mediante la técnica ELISA indirecta se valoraron los niveles de IgA en el mucus y de IgA e IgG en el suero de los animales inoculados frente a diversos antígenos del parásito: somático y excretor/secretor (ES) de vermes adultos, y somático de larvas 3 (L3). En el caso de los estudios séricos se calculó un valor basal, utilizando la media de las tres semanas anteriores a la inoculación para cada animal, y se realizó una determinación semanal hasta el final de la experiencia. En el caso de los estudios en mucus, se realizó la evaluación de los niveles de inmunoglobulinas en cada uno de los días de sacrificio, 7 y 28 post-inoculación (pi). En todos los casos se midieron los niveles de inmunoglobulinas en cada animal, y a partir de estos valores se calculó el valor medio de cada lote. 4.1. INMUNOGLOBULINAS ESPECÍFICAS SÉRICAS (Fig. 30) Las principales diferencias entre las dos razas al analizar los niveles de inmunoglobulinas séricas se pueden resumir en tres puntos: • La mayor producción de IgG total específica frente al antígeno ES de adulto en ovinos CAN. • La mayor producción de IgA sérica frente a antígeno somático de L3 en ovinos CAN a los 7 dpi. • La aparición de un pico de IgG específicas frente a este mismo antígeno larvario a los 21 dpi únicamente en los ovinos CAP, aunque en este último caso, sin significación estadística. Por lo demás, los perfiles séricos fueron muy similares en ambas razas. Los niveles de IgA frente a los distintos antígenos mostraron una elevación importante en la segunda semana pi, con independencia de que el antígeno fuera larvario o de adulto, siendo este incremento significativo respecto al valor basal, únicamente cuando se antigenaron las placas con antígeno ES. En las siguientes semanas los niveles de esta inmunoglobulina se aproximaron a los valores basales. En cambio, se observó un incremento significativo en los niveles de IgG específica del antígeno larvario a partir de la 1ª semana pi, mientras que frente a los antígenos de adulto este incremento (significativo en el caso del antígeno ES de adulto) se observó a partir de la 2ª semana pi. - 128 - Resultados - 135 - Tabla 16c: Coeficientes de correlación (r) de Spearman entre IgG e IgA séricas frente a antígeno somático de L3 de H. contortus en ovinos Canarios (CAN) y Canarios de Pelo (CAP). El dato basal fue calculado como el valor medio de las tres semanas previas a la inoculación; el resto de medidas corresponden a la media de los corderos de cada raza, en cada una de las cuatro semanas post-inoculación. Los asteriscos señalan significación estadística (* = p≤0,05; ** = p≤0,01) Tabla 16c: Correlación entre IgA e IgG séricas frente a Ag somático de L3 Resultadosaaaaaaaaaa aaaaaaaa aaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa Tabla 17a: Coeficientes de correlación (r) de Spearman entre IgA séricas frente a diferentes antígenos de H. contortus en ovinos Canarios (CAN) y Canarios de Pelo (CAP). Som Ad: Ag somático de adulto; ES Ad: Ag excretor-secretor de adulto; Som L3: Ag somático de larvas 3. El dato basal fue calculado como el valor medio de las tres semanas previas a la inoculación; el resto de medidas corresponden a la media de los corderos de cada raza, en cada una de las cuatro semanas post-inoculación. Los asteriscos señalan significación estadística (* = p≤0,05; ** = p≤0,01) Tabla 17a: Correlación entre IgA séricas frente a diferentes antígenos - 136 - Resultados Tabla 17b: Coeficientes de correlación (r) de Spearman entre IgG séricas frente a diferentes antígenos de H. contortus en ovinos Canarios (CAN) y Canarios de Pelo (CAP). Som Ad: Ag somático de adulto; ES Ad: Ag excretor-secretor de adulto; Som L3: Ag somático de larvas 3. El dato basal fue calculado como el valor medio de las tres semanas previas a la inoculación; el resto de medidas corresponden a la media de los corderos de cada raza, en cada una de las cuatro semanas postinoculación. Los asteriscos señalan significación estadística (* = p ≤ 0,05; ** = p ≤ 0,01) Tabla 17b: Correlación entre IgG séricas frente a diferentes antígenos - 137 - Resultadosaaaaaaaaaa aaaaaaaa aaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa Tabla 18: Correlación entre IgA presentes en el mucus gástrico Tabla 18: Coeficientes de correlación (r) de Spearman entre los niveles de IgA en mucus frente a diferentes antígenos de H. contortus en ovinos Canarios (CAN) y Canarios de Pelo (CAP). Los datos de los días 7 ó 28 postinoculación (dpi) de un antígeno se correlacionaron con los del mismo día de sacrificio para los otros antígenos. Som Ad: antígeno somático de adulto; ES Ad: antígeno excretor-secretor de adulto; Som L3: antígeno somático de larvas 3. Los asteriscos señalan significación estadística (** = p ≤ 0,01) Tabla 19: Correlación entre IgA del suero y mucus Tabla 19: Coeficientes de correlación (r) de Spearman entre los niveles de IgA en mucus y suero frente a diferentes antígenos de H. contortus en ovinos Canarios (CAN) y Canarios de Pelo (CAP). Los datos de los días 7 ó 28 postinoculación (dpi) de IgA en mucus frente a cada antígeno se correlacionaron con los de IgA sérica del mismo día de sacrificio y antígeno. Som Ad: antígeno somático de adulto; ES Ad: antígeno excretor-secretor de adulto; Som L3: antígeno somático de larvas 3. El asterisco señala significación estadística (* = p≤0,05) - 138 - Resultados 5. CORRELACIONES Y REGRESIONES ENTRE LAS DISTINTAS VARIABLES Las relaciones entre variables parasitológicas, hematológicas e inmunológicas (células e inmunoglobulinas) se analizaron mediante el coeficiente de correlación de Spearman (Tablas 20-31). Asimismo, en algunos casos en los que se observaron correlaciones significativas, se efectuaron diversos análisis de regresión entre los datos obtenidos en los animales sacrificados a los 7 y 28 dpi. 5.1. CORRELACIONES ENTRE VARIABLES PARASITOLÓGICAS Y HEMATOLÓGICAS (Tablas 20 y 21) 5.1.1. Ovino Canario No se observaron correlaciones significativas entre las variables parasitológicas y hematológicas en los animales de raza Canaria (CAN) sacrificados a los 7 dpi, aunque se observó una fuerte relación negativa entre el hematocrito y la longitud y número de larvas en la mucosa gástrica (Tabla 20). Igualmente, en los animales de esta raza sacrificados a los 28 dpi se observaron asociaciones negativas entre las variables parasitológicas y hematocrito y proteínas plasmáticas, siendo en ocasiones significativas (Tabla 21). El análisis de regresión múltiple mostró que la variable proteínas plasmáticas de la 4ª semana pi era dependiente en esta raza de la interacción carga parasitaria-longitud (Fig. 34). Los recuentos de eosinófilos a los 14 dpi se correlacionaron de forma positiva con la carga de vermes adultos y su longitud (Tabla 21; Fig. 33) 5.1.2. Ovino Canario de Pelo El estudio de los animales de la raza Canaria de Pelo (CAP) sacrificados a los 7 dpi no mostró ninguna relación significativa entre hematocrito y/o proteínas plasmáticas y las variables parasitológicas estudiadas, siendo además la correlación siempre positiva. Las correlaciones entre los niveles de células sanguíneas en la 1ª semana pi y el número de larvas tisulares y la longitud de los vermes inmaduros fue variable en esta raza, al ser inversa con los neutrófilos y eosinófilos (no significativas en este caso) y directa con los linfocitos (Tabla 20). - 139 - Resultadosaaaaaaaaaa aaaaaaaa aaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa Al estudiar los animales de la raza CAP sacrificados a los 28 dpi, se observaron correlaciones negativas entre las distintas variables parasitológicas y el valor hematocrito, siendo significativa en el caso de la carga parasitaria. Las correlaciones entre las distintas variables parasitológicas y la concentración de proteínas plasmáticas fueron más débiles que en los ovinos CAN, aunque siempre fueron negativas (Tabla 21). En esta raza, el análisis de regresión múltiple del valor hematocrito mostró esta variable como dependiente del efecto conjunto de carga parasitaria-fecundidad (R2 = 0,83*), mientras que en los ovinos CAN este modelo no era relevante (R2 = 0,47; p = 0,21). Sin embargo, en los ovinos CAP los niveles de proteínas plasmáticas de la 4ª semana pi no se explican por el efecto conjunto de la carga parasitaria adulta y la longitud de los vermes (Fig. 34), como ocurría en el caso de los ovinos CAN. Como ocurría en general con la raza CAN, los recuentos de células sanguíneas a los 28 dpi no se correlacionaron con los parámetros parasitológicos (Tabla 21). Figura 33: Relaciones entre eosinófilos semana 2 p.i. y carga parasitaria adulta en los ovinos CAN y CAP. (*: p ≤ 0,05) 0 200 400 600 800 1000 Eosinófilos/mm3 0 2000 4000 6000 8000 10000 Carga parasitaria 500 1000 1500 2000 Eosinófilos/mm3 0 1000 2000 3000 4000 5000 Carga parasitaria CAN CAP R2 = 0,01 p =0,85 R2 = 0,68* 4,5 5,0 5,5 6,0 6,5 PP 4 s.p.i -1 0 1 2 Valor pronosticado tipificado 6,06,26,46,66,87,07,2 PP 4 s.p.i. -1,50 -0,75 0,00 0,75 1,50 Valor pronosticado tipificado CAP R2 = 0,28 p = 0,51 CAN R2 = 0,73* Figura 34: Regresión del valor de proteínas plasmáticas de la cuarta semana pi frente al valor pronosticado según las ecuaciones: y = -0,26 [longitud mm] – 6,33*10-5 [carga parasitaria adulta] +10,39 (CAN) e y = 0,22 [longitud mm] - 6,34*10-5 [carga parasitaria adulta] – 10,17 (CAP). El cálculo de la ecuación de regresión fue realizado mediante un ajuste de mínimos cuadrados, estimándose su significación mediante el análisis de la varianza. Los valores pronosticados se presentan tipificados, ajustados a una distribución normal de media = 0 y desviación típica = 1 (*: p ≤ 0,05). - 140 - Resultados - 141 - Tabla 20: Correlación entre variables hematológicas y parasitológicas a los 7 dpi Tabla 20: Coeficientes de correlación (r) de Spearman entre variables hematológicas y parasitológicas en los ovinos Canarios (CAN) y Canarios de Pelo (CAP) sacrificados a los 7 dpi. En cada parámetro hematológico se indica el valor a los 7 dpi. Hto: hematocrito; PP: concentración de proteínas plasmáticas. El asterisco señala significación estadística (* = p ≤ 0,05; ** = p ≤ 0,01). Tabla 21: Correlación entre variables hematológicas y parasitológicas a los 28 dpi Tabla 21: Coeficientes de correlación (r) de Spearman entre variables hematológicas y parasitológicas en los ovinos Canarios (CAN) y Canarios de Pelo (CAP) sacrificados a los 28 dpi. Se recogen los valores de Hto y PP a los 21 y 28 dpi y en el caso de las células se hace referencia a las semanas en que se observó un pico en el recuento. Carga parasitaria: recuento de vermes adultos en abomaso; HPG 27 dpi: recuento fecal de huevos 27 dpi; Longitud: Medida de los vermes adultos; Hto: hematocrito; PP: concentración de proteínas plasmáticas; Leuc.: leucocitos; Eos: eosinófilos; Linf.: linfocitos; Neut.: neutrófilos. Los asteriscos señalan significación estadística (*=p ≤ 0,05; ** = p ≤ 0,01). Resultadosaaaaaaaaaa aaaaaaaa aaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa 5.2. CORRELACIONES ENTRE VARIABLES PARASITOLÓGICAS E HISTOLÓGICAS (Tabla 22) 5.2.1. Ovino Canario En los animales de raza CAN sacrificados a los 7 dpi, destaca la relación negativa entre la galectina-15 del mucus y los recuentos y longitud de las larvas (Tabla 22). También se pueden destacar las correlaciones negativas observadas entre los leucocitos globulares y linfocitos T CD4+ del tercio superior de la mucosa (r = -0,87; p = 0,054) y el número de larvas luminales, que, aunque no alcanzaron significación estadística, reflejaron una tendencia a la asociación entre estas variables. En los animales sacrificados a los 28 dpi, pudieron constatarse correlaciones inversas estadísticamente significativas entre algunos tipos celulares, linfocitos T CD4+ y células presentadoras de antígeno, y distintas variables parasitológicas (Tabla 22). Los linfocitos T CD4+ totales se correlacionaron con la carga parasitaria y la longitud de los vermes (Tabla 22, Figura 37 b, c) lo que también ocurrió con los recuentos de estas células en el tercio inferior de la mucosa (r = -0,86** y -0,81*, respectivamente); a su vez, los recuentos del tercio superior lo hicieron con la carga parasitaria y el recuento de huevos en heces 27 dpi (r = 0,71* y -0,75*, respectivamente). Los recuentos de células CD1+ se correlacionaron negativa y significativamente con el recuento de huevos en heces a los 27 dpi, mientras que las células MHCII+ lo hicieron con la longitud de los vermes (Tabla 22). El análisis de regresión múltiple permitió constatar que el efecto conjunto de los linfocitos T CD4+ y los leucocitos globulares explicaría gran parte de la variación de la longitud de los vermes y de la carga parasitaria en esta raza (R2 = 0,75* y 0,89**, respectivamente) (Fig. 35 y 36). 5.2.2. Ovino Canario de Pelo Al estudiar los animales de raza CAP sacrificados a los 7 dpi (Tabla 22) se observó una fuerte correlación inversa entre los mastocitos presentes en la mucosa abomasal y las distintas variables parasitológicas. Este dato, sin embargo, debe interpretarse con cuidado, porque se deterioraron dos muestras y sólo se pudo hacer el recuento de mastocitos en tres ovinos CAP. - 142 - Resultados Por otra parte, las galectinas 14 y 15 (significativamente en este último caso) se correlacionaron inversamente con la longitud de los vermes inmaduros y con los recuentos de larvas intramurales. Los leucocitos globulares, por su parte, se correlacionaron de manera directa con la carga parasitaria total y con las formas inmaduras presentes en la luz del abomaso, a diferencia de los ovinos CAN, en que esta correlación fue inversa. En los animales de raza CAP sacrificados a los 28 dpi también se observaron correlaciones inversas entre células y variables parasitológicas, tal y como ocurrió con los ovinos CAN, pero las células y parámetros parasitológicos implicados, en general, no coincidieron en ambas razas. 15 16 17 18 19 Longitud (mm) -2 -1 0 1 Valor pronosticado tipificado Figura 35: Regresión de la longitud de los vermes adultos frente al valor pronosticado según las ecuaciones: y = -0,008 [CD4] – 0,039 [leucocitos globulares] + 18,26 (CAN) e y = 0,003 [CD4] – 0,036 [leucocitos globulares] + 15,49 (CAP). El cálculo de la ecuación de regresión fue realizado mediante un ajuste de mínimos cuadrados, estimándose su significación mediante el análisis de la varianza. Los valores pronosticados se presentan tipificados, ajustados a una distribución normal de media = 0 y desviación típica = 1 (*: p ≤ 0,05). R2 = 0,08 p = 0,88 R2 = 0,75* CAN CAP En la raza CAP destacaron cuatro tipos celulares cuyos recuentos totales se correlacionaron significativamente con la fecundidad de los vermes: eosinófilos, linfocitos T γδ, WC1+ y MHCII+. Estas células también correlacionaron negativamente con los recuentos de huevos en heces a los 27 dpi, siendo esta asociación significativa en todos los casos, excepto en los recuentos de células WC1+ (Tabla 22). Es importante señalar que los recuentos de algunas de estas células (Tabla 14) siguieron patrones distintos en función de la raza, y que el aumento en el número de células en los ovinos CAP en ocasiones estuvo asociado con una correlación inversa con los datos parasitológicos, en particular, en el caso de los eosinófilos y los linfocitos WC1+ (Figura 37 a, d). Igualmente, las correlaciones entre los linfocitos T γδ+ del tercio superior de la mucosa, zona en la que pudo observarse un claro incremento de estas células entre los días 7 y 28 pi únicamente en la raza CAP, y la fecundidad o el recuento de huevos en heces a los 27 dpi, fueron estadísticamente - 143 - Resultadosaaaaaaaaaa aaaaaaaa aaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa significativas (r = 0,89* y 0,83*, respectivamente), en contraste con lo observado en los ovinos CAN. En esta raza no se halló ninguna asociación entre células que permitiera explicar de modo satisfactorio la variación en ninguna variable parasitológica. Aunque diversos recuentos celulares (eosinófilos y linfocitos T γδ+, p.ej.) se correlacionaron individualmente con los huevos en útero de los vermes, cuando se construyó un modelo de regresión múltiple incluyendo estos factores no se obtuvo un coeficiente de regresión significativo (R2 = 0,67; p = 0,19). R2 = 0,89** R2 = 0,74 p = 0,13 CAPCAN Figura 36: Regresión de la carga parasitaria adulta frente al valor pronosticado según las ecuaciones: y = -22,1 [CD4] – 235,2 [leucocitos globulares] + 8927,2 (CAN) e y = -3,1 [CD4] + 373,3 [leucocitos globulares] + 267,4 (CAP). El cálculo de la ecuación de regresión fue realizado mediante un ajuste de mínimos cuadrados, estimándose su significación mediante el análisis de la varianza. Los valores pronosticados se presentan tipificados, ajustados a una distribución normal de media = 0 y desviación típica = 1 (**: p ≤ 0,01). 5.3. CORRELACIONES ENTRE VARIABLES PARASITOLÓGICAS Y NIVELES DE INMUNOGLOBULINAS EN SUERO Y MUCUS (Tablas 23-25) 5.3.1. Ovino Canario Las correlaciones entre los niveles séricos de inmunoglobulinas y las variables parasitológicas fueron poco relevantes en los ovinos CAN, tanto a 7 como a 28 dpi. Se pueden destacar las correlaciones directas observadas entre los niveles de IgG frente a antígenos ES de adulto y diversas variables relacionadas con los vermes adultos a los 28 dpi (Tabla 24). En cambio, los niveles de IgA en el mucus frente a los tres antígenos estudiados se correlacionaron inversa y significativamente con la longitud de los vermes inmaduros (Tabla 25). Además, la IgA frente al antígeno somático de larvas 3 también estuvo correlacionada negativamente con el recuento de larvas (Tabla 25). Por el contrario, las correlaciones de los niveles de inmunoglobulinas en mucus con variables relacionadas con los vermes adultos no reflejaron ninguna tendencia clara (Tabla 25). - 144 -