Regulación de la proliferación tumoral y la apoptosis en tumores epidermoides de cavidad oral: papel del receptor para el factor de crecimiento insulínico tipo 1 (IGF-1R) y major vault proteína (MVP)

Regulación de la proliferación tumoral y la apoptosis en tumores epidermoides de cavidad oral: papel del receptor para el factor de crecimiento insulínico tipo 1 (IGF-1R) y major vault proteína (MVP) Mercedes Moreno González Tesis Doctoral Universidad de Las Palmas de Gran Canaria Enero 2012 PROGRAMA DE DOCTORADO CÁNCER: BIOLOGÍA Y CLÍNICA Título    Regulación de la proliferación tumoral y la apoptosis en tumores epidermoides de cavidad oral: papel del receptor para el factor de crecimiento insulínico tipo 1 (IGF-1R) y major vault proteína (MVP) Memoria que para optar al grado de Doctor por la Universidad de Las Palmas de Gran Canaria presenta la Licenciada Mercedes Moreno González Director Dr. Pedro Carlos Lara Jiménez Profesor Titular de Cancerología General de la ULPGC Codirectores Dra. Marta Lloret Sáez-Bravo Profesora Asociada de Cancerología General de la ULPGC Dr. Luis Alberto Henríquez Hernández Profesor Asociado de Toxicología de la ULPGC LAS PALMAS DE GRAN CANARIA – ENERO DE 2012 Este trabajo ha sido financiado por el Instituto Canario de Investigación del Cáncer (ICIC) PEDRO CARLOS LARA JIMÉNEZ, PROFESOR TITULAR DE CANCEROLOGÍA GENERAL DEL DEPARTAMENTO DE CIENCIAS CLÍNICAS, FACULTAD DE MEDICINA, DE LA UNIVERSIDAD DE LAS PALMAS DE GRAN CANARIA CERTIFICA: Que el trabajo de investigación titulado “REGULACIÓN DE LA PROLIFERACIÓN TUMORAL Y LA APOPTOSIS EN TUMORES EPIDERMOIDES DE CAVIDAD ORAL: PAPEL DEL RECEPTOR PARA EL FACTOR DE CRECIMIENTO INSULÍNICO TIPO 1 (IGF-1R) Y MAJOR VAULT PROTEÍNA (MVP)”, ha sido realizado por Dña MERCEDES MORENO GONZÁLEZ, en el Departamento de Bioquímica y Biología Molecular, Fisiología, Genética e Inmunología de la Universidad de Las Palmas de Gran Canaria, bajo su dirección y asesoramiento técnico y científico, y que una vez revisada la presente Memoria, la encuentra apta para su defensa ante tribunal. Y para que así conste y surta los efectos oportunos, extiende el presente certificado en Las Palmas de Gran Canaria a veintiocho de octubre de dos mil once. Fdo: Pedro Carlos Lara Jiménez MARTA LLORET SÁEZ-BRAVO, PROFESORA ASOCIADA DE CANCEROLOGÍA GENERAL DEL DEPARTAMENTO DE CIENCIAS CLÍNICAS, FACULTAD DE MEDICINA, DE LA UNIVERSIDAD DE LAS PALMAS DE GRAN CANARIA CERTIFICA: Que el trabajo de investigación titulado “REGULACIÓN DE LA PROLIFERACIÓN TUMORAL Y LA APOPTOSIS EN TUMORES EPIDERMOIDES DE CAVIDAD ORAL: PAPEL DEL RECEPTOR PARA EL FACTOR DE CRECIMIENTO INSULÍNICO TIPO 1 (IGF-1R) Y MAJOR VAULT PROTEÍNA (MVP)”, ha sido realizado por Dña MERCEDES MORENO GONZÁLEZ, en el Departamento de Bioquímica y Biología Molecular, Fisiología, Genética e Inmunología de la Universidad de Las Palmas de Gran Canaria, bajo su dirección y asesoramiento técnico y científico, y que una vez revisada la presente Memoria, la encuentra apta para su defensa ante tribunal. Y para que así conste y surta los efectos oportunos, extiende el presente certificado en Las Palmas de Gran Canaria a veintiocho de octubre de dos mil once. Fdo: Marta Lloret Sáez-Bravo LUIS ALBERTO HENRÍQUEZ HERNÁNDEZ, PROFESOR ASOCIADO DE TOXICOLOGÍA DEL DEPARTAMENTO DE CIENCIAS CLÍNICAS, FACULTAD DE MEDICINA, DE LA UNIVERSIDAD DE LAS PALMAS DE GRAN CANARIA CERTIFICA: Que el trabajo de investigación titulado “REGULACIÓN DE LA PROLIFERACIÓN TUMORAL Y LA APOPTOSIS EN TUMORES EPIDERMOIDES DE CAVIDAD ORAL: PAPEL DEL RECEPTOR PARA EL FACTOR DE CRECIMIENTO INSULÍNICO TIPO 1 (IGF-1R) Y MAJOR VAULT PROTEÍNA (MVP)”, ha sido realizado por Dña MERCEDES MORENO GONZÁLEZ, en el Departamento de Bioquímica y Biología Molecular, Fisiología, Genética e Inmunología de la Universidad de Las Palmas de Gran Canaria, bajo su dirección y asesoramiento técnico y científico, y que una vez revisada la presente Memoria, la encuentra apta para su defensa ante tribunal. Y para que así conste y surta los efectos oportunos, extiende el presente certificado en Las Palmas de Gran Canaria a veintiocho de octubre de dos mil once. Fdo: Luis Alberto Henríquez Hernández A los compañeros del Servicio de Radiología, en especial a los doctores Tatiana Marrero Pulido, Olga Suárez Cabrera, Pilar López Facal y Fernando Rezola Sáez, que tan amablemente ponen a nuestra disposición su conocimiento para comprender mejor los estudios radiológicos. A los compañeros del Servicio de Anestesiología, todos en general, sin los que no podríamos desarrollar nuestra actividad quirúrgica. A los compañeros del Servicio de Inmunología, especialmente al Dr.Florentino Sánchez García, por poner a mi disposición sus medios e instalaciones para realizar este trabajo. A la Dra. Sofía Pérez, que amablemente me inició en el estudio de la apoptosis. A la Dra. Rosa Apolinario, que dentro de sus obligaciones profesionales y personales, encontró tiempo para ayudarme en la lectura de los marcadores tumorales. A la Dra. Elisa Bordón Rodriguez, por tantas tardes de trabajo compartidas. A los pacientes, que se ponen en nuestras manos con la confianza de que podamos ayudarles en un momento tan importante de su vida, y con la esperanza de que así sea. Índice ÍNDICE CAPITULO I INTRODUCCIÓN _____________________________________________________________ ____ 1 1. GENERALIDADES _____________________________ ______________________________ 3 1.1. Epidemiología y factores de riesgo 3 1.2. Histología 11 1.3. Patogénesis 12 1.4. Presentación clínica y diagnóstico 12 1.5. Estadiaje 15 1.6. Tratamiento 18 2. FACTORES PRONÓSTICOS CLÁSICOS ______________________________ 25 2.1. Factores relacionados con el paciente 25 2.2. Factores relacionados con el tumor 27 2.3. Factores relacionados con el tratamiento 30 3. FACTORES PRONÓSTICOS BIOLÓGICOS ______________________________ 31 3.1. Angiogénesis 31 3.2. Expresión tumoral de ciclooxigenasa-2 (COX-2) 31 3.3. Marcadores moleculares 32 4. NUEVOS FACTORES PRONÓSTICOS MOLECULARES ____________________________ 35 4.1. Receptor para el factor de crecimiento dependiente de insulina 1 (IGF-1R) 35 4.2. Proteínas reguladoras de la resistencia a drogas. Pepel de major vault proteína (MVP) 47 4.3. Proteínas reguladoras de la apoptosis. Papel de BCL-2 61 4.4. Proliferación celular (Ki67) 69 CAPITULO II O BJETIVOS _____________________________________________________________________ ____ 75 CAPITULO III REVISIÓN DE LA SITUACIÓN DEL CÁNCER DE CAVIDAD ORAL EN LOS SERVICIOS DE CIRUGÍA MAXILOFACIAL Y ONCOLOGÍA RADIOTERÁPICA DEL HOSPITAL DR. NEGRÍN (1989-2005) ______________________________________________________ ________ 79 Análisis descriptivo de la serie de pacientes 81 CAPITULO IV LA EXPRESIÓN DE IGF-1R PREDICE EL RESULTADO CLÍNICO EN PACIENTES CON CARCINOMA DE CÉLULAS ESCAMOSAS DE CAVIDAD ORAL LOCALMENTE AVANZADO _______________ __________________ 95 R ESUMEN /A BSTRACT 97 I NTRODUCCIÓN 101 M ATERIALES Y M ÉTODOS 102 R ESULTADOS 104 D ISCUSIÓN 106 CAPITULO V LA EXPRESIÓN DE IGF-1R Y MVP SE ENCUENTRAN RELACIONADAS EN LA PREDICCIÓN DEL PRONÓSTICO CLÍNICO DE LOS PACIENTES CON CARCINOMA ESCAMOSO DE CAVIDAD ORAL _______________________ __________ 111 R ESUMEN /A BSTRACT 113 I NTRODUCCIÓN 117 M ATERIALES Y M ÉTODOS 119 R ESULTADOS 121 D ISCUSIÓN 123 CAPITULO VI PAPEL DE LA APOPTOSIS Y LA PROLIFERACIÓN CELULAR EN RELACIÓN A LA EXPRESIÓN DE IGF-1R Y MVP _ ______________________ __________ 127 R ESUMEN /A BSTRACT 129 I NTRODUCCIÓN 133 M ATERIALES Y M ÉTODOS 135 R ESULTADOS 138 D ISCUSIÓN 144 CAPITULO VII C ONCLUSIONES ___________________________ _________________________________________ 149 CAPITULO VIII B IBLIOGRAFÍA _______________________ _______________________________________________ 153 CAPÍTULO I INTRODUCCIÓN INTRODUCCIÓN 3 1. GENERALIDADES El cáncer de cabeza y cuello (CCC) se sitúa entre el 5º y el 6º lugar en incidencia de todos los tipos de tumores, con más de 500.000 nuevos casos diagnosticados en todo el mundo cada año. La edad media de aparición es la 6ª década de la vida, siendo más frecuente en varones, sobre todo el cáncer de laringe. La supervivencia a 5 años de todos los estadios del CCC es del 60%, pero es significativamente inferior en localizaciones específicas como la hipofaringe. El cáncer de cabeza y cuello comprende múltiples localizaciones (cavidad oral, orofaringe, hipofaringe, laringe y senos paranasales) cada una con diferentes características (histología, epidemiología, diseminación loco-regional, diseminación a distancia y tratamiento). 1.1. Epidemiología y factores de riesgo 1.1.1. Epidemiología El carcinoma de células escamosas de la cavidad oral (OCSCC) supone el 5% de los tumores diagnosticados en el hombre, y el 2.5% de los de la mujer. La mortalidad por OCSCC es alta, tanto en países desarrollados como en vías de desarrollo, con aproximadamente 127.000 muertes registradas en el año 2008 (Ferlay et al. 2010). Su incidencia varía según la región del mundo estudiada. Así, en la India y el sureste asiático, el cáncer de cavidad oral es el mayoritario entre los hombres, y países como Hungría o Francia tienen unas incidencias de 52 por cada 100.000 habitantes al año. Este tipo tumoral es raro en individuos menores de 35 años, con independencia del sexo. A partir de ese segmento de edad, y tal y como ocurre para otros tumores de origen epitelial, el riesgo de desarrollo tumoral aumenta con la edad. En general, la incidencia de OCSCC es menor entre las mujeres que entre los hombres, debido fundamentalmente a los factores de riesgo asociados a este tipo de tumores. En España, las estimaciones realizadas para el año 2010 indicaban el registro de 5.600 nuevos casos y 1.780 muertes debidas al cáncer de cavidad oral y faringe (clásicamente agrupados en estudios epidemiológicos) entre los hombres, y de 1.600 nuevos casos con 430 muertes relacionadas entre las mujeres (de Souza et al. 2011). Los ratios de incidencia ajustados para el 2008 colocan a España entre los países europeos con mayor incidencia (16/100.000 habitantes por año), a pesar de que entre las mujeres este ratio es especialmente bajo (3.3/100.000 habitantes por año) (Ferlay INTRODUCCIÓN 4 et al. 2010). No obstante, según los datos de los que se dispone en los registros de cáncer de las diferentes Comunidades Autónomas de nuestro país, se detecta una disminución significativa de la incidencia del cáncer de cavidad oral entre los hombres, sin que se modifique entre las mujeres (de Souza et al. 2011). El universo de pacientes de esta Tesis Doctoral fue reclutado entre los años 1989 y 2005. Según datos del Centro Nacional de Epidemiología (acceso: http://www.isciii.es/htdocs/centros/epidemiologia/epi_cancer.jsp), la incidencia de este tipo de tumores entre la población masculina de nuestra Comunidad Autónoma, registrada entre los años 1997 y 2002 (según últimos datos actualizados a junio de 2009), era de 34.95 casos por cada 100.00 habitantes, siendo esta tasa la más alta de todo el territorio nacional. La supervivencia media a 5 años para este tipo de pacientes en nuestro país está en torno al 50%. La Comunidad Autónoma de Canarias, coloca a sus dos provincias entre las tres con mayores índices de mortalidad por esta causa. Así, la provincia de Tenerife registró una tasa de mortalidad por cáncer de cavidad oral y faringe (típicamente agrupadas) de 15.25/100.000 habitantes para el año 2005, ocupando el primer puesto. La provincia de Las Palmas ocupa el tercer lugar, con una tasa de 13.13 defunciones por esta causa por cada 100.000 habitantes para el mismo año (Figura 1). La tasa de mortalidad media nacional para ese mismo año era de 7.55/100.000 habitantes. Figura 1. Mapas de mortalidad por provincias del cáncer de cavidad oral y faringe entre los hombres para los años 1989 (A) y 2005 (B). Tasa ajustada a la población europea por cada 100.000 habitantes. Fuente: Centro Nacional de Epidemiología (programa Ariadna). La tendencia temporal en cuanto a mortalidad por este tipo de tumores entre los hombres de la provincia de Las Palmas, parece haber sufrido un ligero descenso INTRODUCCIÓN 5 durante el periodo de tiempo señalado (Figura 2). La misma tendencia se observa para el global del país. Según los últimos datos disponibles en el Centro Nacional de Epidemiología, el índice de mortalidad para el año 2008 era de unos 13.09 y 6.56 por cada 100.000 habitantes para Las Palmas y España, respectivamente. Figura 2. Tendencia temporal de la mortalidad por cáncer de cavidad oral y faringe en la provincia de Las Palmas (línea negra) y de España (línea azul) entre los años 1989-2005, para los hombres. Tasa ajustada a la población europea por cada 100.000 habitantes. Fuente: Centro Nacional de Epidemiología (programa Ariadna). La proximidad anatómica entre la cavidad oral y la orofaringe, sumado a la similitud en los factores de riesgo, a menudo resulta en un erróneo análisis agrupado de los dos tipos de cáncer. Algunos estudios han incluido el cáncer nasofaríngeo y de hipofaringe, que tienen factores de riesgo claramente diferentes a los de la cavidad oral. Este tipo de agrupamientos son erróneos y hay que tomar sus resultados con precaución y en el contexto del tipo tumoral analizado (Moore et al. 2000). La epidemiología del cáncer de cavidad oral se ve seriamente obstaculizada por su clásico agrupamiento con el cáncer de orofaringe. Los factores de riesgo entre ambos tipos tumorales son diferentes, así la infección por el virus del papiloma humano (HPV) parece estar relacionado con la orofaringe, mientras que el alcohol o el tabaco lo están con la cavidad oral (Curado et al. 2009). Por tanto, es recomendable tratar al cáncer de cavidad oral independientemente, aunque para muchas clasificaciones se agrupe con orofaringe o más aún, dentro de los cánceres de cabeza y cuello. INTRODUCCIÓN 12 1.3. Patogénesis En la patogenia del cáncer de cabeza y cuello tienen lugar numerosos acontecimientos genéticos que conducen a la inactivación de genes supresores de tumores, a la activación de proto-oncogenes que conllevan al desarrollo posterior del carcinoma o a ambos. Actualmente, las técnicas moleculares nos ayudan a conocer todas las alteraciones que se producen en las lesiones premalignas y malignas invasivas siendo posible realizar un modelo hipotético de la carcinogénesis. A través de estas técnicas se sabe que algunas mutaciones de determinados genes (pérdida de heterocigocidad, inactivación, hipermetilación, etc.) están asociadas con el desarrollo de tumores de peor pronóstico. Por ejemplo, la amplificación de 11q13, la mutación de TP53 y la sobreexpresión de la ciclina D1 podrían correlacionarse con un comportamiento más agresivo en este tipo de tumores, tal y como se describirá más en profundidad en capítulos posteriores. El receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) es necesario para la proliferación, supervivencia y diferenciación de las células normales, habiéndose observado que su desregulación puede producir oncogénesis (ver capítulo 3.3.1. de esta Tesis Doctoral para más detalles). EGFR se sobreexpresa en más del 95% de los CCC a través de distintos mecanismos de desregulación que llevan a la hiperactivación de la vía de transmisión de señales dependientes de EGFR y sus efectores. Algunas lesiones premalignas en el tracto aerodigestivo superior pueden degenerar en una neoplasia. Se trata de la leucoplasia, la eritroplasia, la hiperplasia y la displasia. Esta última progresa a carcinoma entre el 15% y el 30% de los casos y su tratamiento varía desde la observación clínica hasta la cirugía parcial (láser) o radical. 1.4. Presentación clínica y diagnóstico Los signos y síntomas más frecuentes de los tumores de cabeza y cuello en general son: disfonía, odinofagia, disfagia, hemoptisis, disnea, dolor lingual, masa o úlcera en cavidad oral o en orofaringe, masa cervical, dificultad para la deglución, sinusitis y epistaxis. Para el caso particular de la cavidad oral, los síntomas más típicos son: manchas de color blanco y/o rojo en el interior de la boca o en los labios, llagas en las mismas localizaciones que sanan con dificultad o que no sanan, sangrado oral, caída de dientes, dificultad y/o dolor al deglutir, dificultad/dolor para llevar dentadura postiza, INTRODUCCIÓN 13 bultos en el cuello o dolor de oídos. Cualquier paciente con este tipo de sintomatología debería ser revisado por un médico o un dentista a la mayor brevedad posible, para diagnosticar el problema en el menor tiempo posible. El diagnóstico se basa en la observación clínica (inspección, palpación, endoscopia directa o indirecta con toma de biopsia) (Figura 4), así como las pruebas de imagen, tanto para definir la extensión loco-regional como a distancia. La prueba más utilizada para definir la diseminación local y la afectación ganglionar en el momento del diagnóstico es la Tomografía Axial Computerizada (TAC), debido a su accesibilidad. Con esta técnica, se definen mejor la afectación ósea y los órganos móviles como la laringe; al tiempo que presenta menos artefactos con la deglución. La Resonancia Magnética Nuclear (RMN) permite obtener una mejor definición de la extensión a tejidos blandos, de la diseminación perineural y vascular, así como de la afectación intracraneal, por lo que debe realizarse en determinadas localizaciones como la nasofaringe. Figura 6. La exploración física de la cavidad oral debería comprender las ocho localizaciones especificadas en la figura (A-H), en busca de masas, llagas, manchas y cualquier otro signo relevante. INTRODUCCIÓN 14 En los últimos años, se ha desarrollado una nueva prueba diagnóstica: la Tomografía por Emisión de Positrones (PET), que se utiliza habitualmente con 18-F-fluoro-deoxyD-glucosa, aunque se están investigando otros trazadores. La PET y la TAC combinadas constituyen una herramienta de gran utilidad en la planificación del tratamiento con radioterapia, el estadiaje tumoral, la detección de los tumores ocultos, la valoración de la respuesta a los tratamientos y el seguimiento. La característica principal de los tumores de cabeza y cuello es su rápida diseminación a los ganglios linfáticos regionales, que varía para cada localización y está relacionada con la extensión tumoral y con el grado de infiltración en profundidad. Por ello, es preciso definir de forma clara y precisa las regiones ganglionares. La clasificación más utilizada es la creada por la American Head and Neck Society, y la American Academy of Otolaryngology-Head Neck Surgery, en la que se definen los siguientes niveles ganglionares: IA submentonianos, IB submandibulares, II yugulares superiores (IIA anteriores, IIB posteriores), III yugulares medios, IV yugulares inferiores, V cervicales posteriores (VA superiores, VB inferiores), VI paratraqueales, VII mediastínicos superiores. También se deben destacar otras áreas ganglionares de riesgo como: retrofaríngea, parafaríngea, subocciptal, preauricular, periparotídea o intraparotídea y facial (músculo buccinador). El riesgo de metástasis a distancia está más relacionado con la afectación ganglionar que con la extensión del tumor primario. La localización más frecuente de diseminación a distancia es la pulmonar, seguido de la ósea y la hepática. La afectación de los ganglios linfáticos mediastínicos también se considera metástasis a distancia, excepto los situados en el nivel VII (adenopatías mediastínicas superiores anteriores, situadas por encima de la arteria innominada). La supervivencia de este tipo de tumores empeora drásticamente cuando se detectan metástasis ganglionares por debajo del primer escalón ganglionar, sobre todo en las regiones ganglionares inferiores (niveles IV-VB, región supraclavicular). En el 5% de los pacientes no se puede determinar el origen del tumor, debutando la enfermedad como una adenopatía o un conglomerado cervical. En estos casos, se debe realizar una inspección cuidadosa mediante endoscopia de toda la mucosa del área ORL, realizando biopsias de amígdala, base de lengua y nasofaringe, ya que son las localizaciones de origen más frecuente. También se realiza habitualmente una amigdalectomía y un PET/CT. INTRODUCCIÓN 15 La realización de una analítica general y una radiografía de tórax es imprescindible para descartar tanto la diseminación a distancia como la existencia de otros tumores en el tracto aerodigestivo (los tumores sincrónicos son frecuentes, sobre todo en pulmón y esófago). 1.5. Estadiaje El estadiaje tumoral se determina a través de la clasificación Tumor-Nódulos o ganglios linfáticos-Metástasis (TNM) del American Joint Comittee on Cancer (AJCC) Cancer Staging Handbook, que es revisada periódicamente (Tabla 2a y 2b). La clasificación por estadios es útil en la práctica clínica a la hora de confeccionar la pauta del tratamiento. El estadio clínico se determina mediante pruebas diagnósticas (observación y pruebas de imagen: TAC, RMN, PET y ecografía), mientras que el estadio patológico se basa en el estudio histológico de la pieza quirúrgica. El estadio patológico no reemplaza al clínico, sino que deben señalarse los dos a la vez, como recomienda la AJCC. Para definir el estadio patológico es muy importante que el anatomopatólogo especifique el tamaño del tumor, el estado de los bordes quirúrgicos, el grado de diferenciación y la afectación ganglionar, así como el estado de la cápsula ganglionar. El examen de los ganglios linfáticos aislados tras la cirugía debe incluir el tamaño y número de los ganglios afectos, su localización y el nivel en el que se sitúan y la extensión extracapsular (ECS). Cuando la afectación ganglionar clínicamente mide más de 3 cm, se considera como conglomerado adenopático, siendo muy probable la afectación de los tejidos blandos adyacentes. En lo que se refiere a la cápsula ganglionar, es imprescindible determinar si existe ECS, lo que puede ser detectado mediante pruebas de imagen o examen histológico de la pieza quirúrgica. Los signos radiológicos de la ECS son: alteración de la morfología ganglionar, márgenes espiculados y afectación de tejidos blandos periganglionares. INTRODUCCIÓN 16 Tabla 2a. Clasificación TNM clásica del carcinoma de cabeza y cuello TUMOR PRIMARIO Labio, cavidad oral, faringe Laringe Nasofaringe Cavidad nasal y Senos paranasales Glándulas salivales T1 Hasta 2 cm Supraglotis. una localización Glotis: limitado a cuerda vocal a: una cuerda b: ambas cuerdas Subglotis: limitado subglotis Confinado a nasofaringe Seno maxilar: limitado al seno sin erosión ósea CN y seno etmoidal: una localización. Hasta 2 cm T2 Diámetro mayor entre 2 y 4 cm Supraglotis: más de una localización, movilidad de cuerda normal Glotis: extensión a supra o subglotis, movilidad de la cuerda disminuida Subglotis: extensión acuerda, movilidad cuerda normal o disminuida Afecta a orofaringe o fosa nasal a: sin extensión parafaringea b: con extensión parafaringea CN y seno etmoidal: dos sublocalizacio nes o localizaciones nasoetmoidal es adyacentes Seno maxilar: erosión ósea, paladar duro, meato nasal medio. Diámetro mayor entre 2 y 4 cm T3 Mayor de 4 cm Supraglotis: cuerda vocal fija, invasión área postcricoidea, espacio paraglótico o preepiglótico, erosión cartílago tiroideo Glotis: cuerda vocal fija, pero limitado a la laringe, erosión cartílago tiroideo Subglotis: fijación de la cuerda vocal Invade huesos o senos paranasales Seno maxilar: invade pared posterior de seno maxilar, tejido subcutáneo, pared medial/suelo de órbita, fosa pterigoidea, seno etmoidal CN y seno etmoidal: pared medial/suelo de la órbita, seno maxilar, paladar, lámina cribiforme Extensión extraparenquima -tosa, sin afectación del nervio facial o bien tamaño de 4-6 cm T4 Invade estructuras adyacentes Invasión cartílago tiroideo o estructuras adyacentes Extensión intracraneal o infiltra pares craneales, fosa infratemporal, hipofaringe u órbita Extensión al resto de los tejidos adyacentes. Invade base cráneo, paladar, pterigoide, arteria carótida, nervio facial o bien mayor de 6 cm. INTRODUCCIÓN 17 Tabla 2b. Clasificación TNM clásica del carcinoma de cabeza y cuello Afectación ganglionar Metástasis a distancia N0 No hay metástasis en los ganglios regionales M0 No N1 Metástasis en un ganglio homolateral de hasta 3 cm M1 Sí N2 A: Metástasis en ganglio homolateral entre 3 y 6 cm B: Metástasis en múltiples ganglios homolaterales, ninguno > 6 cm C: Ganglios bilaterales o contralaterales, ninguno > 6 cm N3 Metástasis en uno o más ganglios > 6 cm Tabla 3. Clasificación por estadios Estadio I T1 N0M0 Estadio II T2 N0M0 Estadio III T3 N0M0 o T1-2-3 N1M0 Estadio IV IVa: T4 N0-1 M0, cualquier N2M0 IVb: cualquier N3M0 IVc: cualquier M1 En la última revisión (séptima edición) del AJCC Cancer Staging Handbook se modifican algunos conceptos en el cáncer de cabeza y cuello estadio IV: - En todas las localizaciones excepto la nasofaringe, los términos resecable e irresecable han sido reemplazados por moderadamente avanzado y muy avanzado. Es decir, los tumores T4 están subdivididos en T4a moderadamente avanzado y T4b muy avanzado. - El estadio IV se reagrupa en IVa: enfermedad local/regional moderadamente avanzada, IVb: enfermedad local/regional muy avanzada y IVc: enfermedad metastásica. No se han realizado cambios en el estadiaje ganglionar, pero sí se han añadido algunos conceptos complementarios: definir la extensión extracapsular (ECS+ o ECS- ), que tras la cirugía se debe señalar como En (no determinada), Eg (macroscópica), Em (microscópica) y especificar si las adenopatías patológicas están situadas por INTRODUCCIÓN 18 encima o por debajo del borde inferior del cartílago cricoides (región superior U o inferior L). 1.6. Tratamiento La estrategia de diseño de tratamiento en el cáncer de cabeza y cuello tiene en cuenta la comorbilidad del paciente así como su estado general. Para ello, se recomienda utilizar las escalas ECOG o Karnofsky que puntúan estos factores del 0 al 5 y del 0% al 100%, respectivamente, en función de la capacidad del paciente para llevar a cabo su vida normal hasta su fallecimiento. Algunos factores externos al tumor, tales como el modo de vida (consumición habitual de tabaco y alcohol), el estado nutricional (que es determinante si la pérdida de peso es mayor 10% de la masa corporal) y el estado psicológico (el estado depresivo) van a afectar negativamente la supervivencia. El tratamiento del cáncer de cabeza y cuello es multidisciplinar, por lo que la decisión terapéutica se debe tomar en un Comité de Tumores formado por especialistas en cirugía, oncología radioterápica y oncología médica. En general, los tumores precoces (T1-T2) sin afectación ganglionar, se tratan con cirugía o radioterapia (RT) según la localización y la experiencia de cada centro. El tratamiento combinado puede ser útil en los tumores intermedios (infiltrantes, T2 extensos, T3 exofíticos, No-N1). Por último, los tumores avanzados (T3-T4, N2, N3) pueden ser resecables, por lo que precisan adyuvancia con RT con/sin quimioterapia (QT); o irresecables, siendo su tratamiento la combinación de RT y QT, valorando tratamiento quirúrgico del cuello (en caso de residuo tumoral ganglionar). A continuación se describe brevemente cada técnica. 1.6.1. Cirugía El tratamiento quirúrgico del cáncer de cabeza y cuello está limitado frecuentemente por la extensión tumoral y la necesidad de conservar el órgano para mejorar la calidad de vida. Los tumores de pequeño tamaño en localizaciones accesibles de la cavidad oral, faringe y laringe se pueden resecar al tiempo que se preserva la función del órgano y se obtienen los resultados deseados en cuanto a control local y supervivencia. Las nuevas técnicas quirúrgicas, que utilizan resección con láser por endoscopia así como los avances en reconstrucción de defectos con colgajos vascularizados, permiten realizar extensas cirugías reconstructivas tanto inicialmente como en las recidivas tumorales. INTRODUCCIÓN 19 El análisis de la pieza quirúrgica ofrece información relevante sobre la extensión del tumor primario y los ganglios linfáticos regionales (habitualmente se realiza vaciamiento cervical). La biopsia del ganglio centinela es una técnica ya utilizada en otros tumores con excelentes resultados que actualmente se está estudiando en tumores de cavidad oral y orofaringe. Habitualmente se realiza una disección cervical tras los tratamientos con radioquimioterapia (RT/QT) en enfermedad avanzada con afectación ganglionar extensa. Este tipo de cirugía puede ser obviada para reducir la toxicidad final si existe una remisión tumoral completa determinada por exploración clínica y por imagen radiológica (TAC o PET/TAC). 1.6.2. Radioterapia La RT constituye un arma esencial en el tratamiento del cáncer de cabeza y cuello. Su uso exclusivo es beneficioso sobre todo en tumores precoces de laringe, orofaringe y nasofaringe. En los últimos años, ha experimentado un gran desarrollo debido a los avances en ingeniería, informática e imagen diagnóstica. La radiación externa se administra con un Acelerador Lineal. La planificación de los tratamientos ha avanzado de forma continua y en la última década se ha pasado de realizar tratamientos sencillos basados en una simulación radiográfica en dos dimensiones a realizar una RT tridimensional mediante planificación con TAC o PET/TAC con la que se pueden delimitar de forma más adecuada los volúmenes de interés y los órganos de riesgo. Los planificadores de última generación permiten visualizar de manera más exacta la dosis administrada e implementar nuevas técnicas como la intensidad modulada de dosis (IMRT) (Figura 5). Esta nueva modalidad de radiación permite aumentar la dosis en el tumor primario, manteniendo la dosis administrada en órganos de riesgo en niveles adecuados que permitan su función (como es el caso de las glándulas salivares) y que no produzcan toxicidad tardía. En la actualidad, se están realizando numerosos estudios con IMRT, tanto en tumores precoces extensos como en reirradiación, y es la técnica indicada como tratamiento estándar en los tumores nasofaríngeos. INTRODUCCIÓN 20 Figura 7. Tratamiento con IMRT en un cáncer de pared faríngea posterior. El fraccionamiento convencional se basa en la administración de una dosis diaria de radiación hasta conseguir la dosis prescrita. A partir de 1980, se comenzaron a estudiar las alteraciones del fraccionamiento convencional para intentar mejorar los resultados obtenidos en los tumores avanzados de cabeza y cuello. Los dos fraccionamientos alterados más utilizados son el hiperfraccionamiento y el fraccionamiento acelerado. Con el primero, se puede aumentar la dosis total fraccionando la radiación dos veces al día, con dosis por fracción menor que la convencional. En el fraccionamiento acelerado, se administran dosis por fracción similares a las del fraccionamiento convencional varias veces al día, lo que obliga a disminuir la dosis total. Con estas variaciones del fraccionamiento se han conseguido aumentar los resultados de control loco-regional y la supervivencia de los tumores avanzados (Bourhis et al. 2006; Budach et al. 2006; Michiels et al. 2009), aunque aumentan la toxicidad del tratamiento. Los resultados y la toxicidad también son superiores a los obtenidos con el fraccionamiento convencional. Los numerosos estudios que se han realizado valorando la asociación de QT y nuevos agentes biológicos a los fraccionamientos alterados muestran una importante toxicidad aguda, por lo que en la actualidad se recomienda utilizar el fraccionamiento estándar cuando se asocia a QT. La braquiterapia es una técnica de radiación que consiste en introducir vectores plásticos o agujas vectoras en el seno del tumor para administrar una dosis mayor de radiación en menos tiempo al volumen estricto donde se localiza la enfermedad tumoral, lo que trae consigo una menor irradiación de los tejidos sanos circundantes (menor toxicidad). Comenzó a utilizarse a principios del siglo XX, y está indicada especialmente en los tumores localizados en cavidad nasal, piel facial, labios, INTRODUCCIÓN 21 párpados, cavidad oral, lengua y orofaringe. Las tasas de curación en dichas localizaciones son comparables a las conseguidas con cirugía, siendo cercanas al 90% para tumores mayores de 2 cm y entre el 60% y el 80% para tumores entre 2 y 4 cm, al tiempo que se consigue preservar la función del órgano y la estética del paciente. Otro avance en RT es la utilización de la Imagen Guiada (IGRT). Se utilizan diferentes técnicas con la finalidad de disminuir los movimientos que se producen durante la administración de la radiación. En algunos centros de referencia, se puede utilizar la radioterapia con protones. Esta modalidad permite disminuir la dosis administrada en los tejidos que rodean al tumor, siendo de gran utilidad en las neoplasias próximas a estructuras como médula espinal o base de cráneo. Los estudios actuales van dirigidos a realizar tratamientos de Intensidad modulada con protones. 1.6.3. Quimioterapia y nuevos agentes biológicos La QT puede tener un papel paliativo en el cáncer de cabeza y cuello o formar parte de un tratamiento multidisciplinario en el cáncer localmente avanzado. Se denomina de inducción, concomitante o adyuvante según sea administrada antes, durante o después del tratamiento loco-regional. Los agentes quimioterápicos que han mostrado actividad en este tipo tumoral son los derivados del platino, los antimetabolitos y los taxanos. El cisplatino administrado de forma concomitante a la radiación se considera el tratamiento estándar en los tumores localmente avanzados. El carboplatino no ha demostrado aumentar la eficacia del cisplatino. Los taxanos forman parte del tratamiento estándar de la QT de inducción, junto con el cisplatino y el 5-fluorouracilo. Los agentes moleculares han surgido como una nueva estrategia en el tratamiento del cáncer de cabeza y cuello, tanto en monoterapia como en asociación con RT, QT o ambas. El cetuximab, inhibidor del EGFR, se ha integrado en la práctica habitual de tratamiento de los tumores localmente avanzados, administrándose en los pacientes que no toleran el esquema de QT tradicional. Otros inhibidores de EGFR son Panitumumab, Bevacizumab, Erlotinib, Gefitinib y Lapatinib. Los efectos secundarios más frecuentes relacionados con estos agentes son erupciones, diarrea, fatiga y anorexia. INTRODUCCIÓN 28 pacientes en estados avanzados (Munoz Guerra et al. 2003); Lo y col. publicaron supervivencias a 5 años del 75, 65.6, 49 y 30% para los estadios I, II, III y IV respectivamente (Lo et al. 2003); Nguyen y col. encontraron ratios de supervivencia a 1 año del 60% para pacientes en estadio I y del 32% para pacientes en estadio IV (Nguyen et al. 2002). La afectación ganglionar tiene una incidencia variable, pero se acepta que éste es uno de los principales factores pronóstico para los pacientes con OCSCC (Shingaki et al. 2003; Woolgar et al. 2003). La presencia de ganglios linfáticos afectos se asocia a un decrecimiento significativo de la supervivencia y a una mayor posibilidad de recurrencia (Genden et al. 2003; Greenberg et al. 2003b; Shingaki et al. 2003; Woolgar et al. 2003). La afectación ganglionar debe ser clasificada en dos grandes grupos: abierta o clínica y no-abierta u oculta. Esta última a su vez debe ser categorizada como i) afectación detectable por métodos tradicionales (por ejemplo, tinción microscópica con hematoxilina/eosina) o ii) afectación submicroscópica (solo detectables por técnicas inmunohistoquímicas o por análisis moleculares). Este tipo de técnicas son muy relevantes en la actualidad, ya que se detecta un 20-40% de afectación ganglionar oculta en pacientes que clínica e incluso radiológicamente habían sido catalogados como N0 (Greenberg et al. 2003b). En un análisis retrospectivo con 266 pacientes diagnosticados con OCSCC y sometidos a cirugía y disección cervical, se observó que el 34% de los pacientes inicialmente clasificados como cN0, tenían afectación oculta (pN+) (Greenberg et al. 2003a). Dado que los pacientes con afectación ganglionar presentan unos ratios de supervivencia menores (Greenberg et al. 2003a; Shingaki et al. 2003), el estadiaje anatomopatológico tras disección cervical debe realizarse para identificar aquellos pacientes de mayor riesgo que además deban ser tratados de manera adyuvante tras la cirugía. 2.2.3. Grosor del tumor El grosor del tumor primario condiciona el riesgo de afectación ganglionar y el ratio de supervivencia (Al-Rajhi et al. 2000; Gonzalez-Moles et al. 2002; P et al. 2003). Se ha reportado que un grosor superior a los 5 mm es un factor predictivo de afectación ganglionar oculta, recomendándose la disección cervical selectiva para aquellos pacientes con este tipo de tumores (P et al. 2003). Algunos autores sugieren incluso que esta variable tiene más influencia en la supervivencia que otras como estadio (Gonzalez-Moles et al. 2002). INTRODUCCIÓN 29 2.2.4. Invasión extracapsular La invasión extracapsular (ECS por sus siglas en inglés, extracapsular spread) se define como la extensión tumoral más allá de la cápsula del nódulo linfático. La presencia de ECS es un relevante factor pronóstico asociado a mayor probabilidad de recaída locorregional, metástasis a distancia y menor ratio de supervivencia (Greenberg et al. 2003a; Greenberg et al. 2003b; Woolgar et al. 2003). Se han publicado datos de supervivencia a 5 años del 21% para pacientes con ECS y del 64% para pacientes sin invasión extracapsular (Woolgar et al. 2003). La ECS puede ser dividida en dos tipos: i) macroscópica, evidente a simple vista o ii) microscópica, solo observable tras estudios histológicos. No obstante, los estudios llevados a cabo para ver si el subtipo de ECS es relevante en la supervivencia parecen concluir que el pronóstico es el mismo con independencia de que la ECS sea micro o macroscópica, aunque siempre peor en comparación con pacientes que no sufren invasión extracapsular (Woolgar et al. 2003). Más aún, se ha reportado que aquellos pacientes N+ que además son ECS+ tienen mayor riesgo de recidiva y mayor mortalidad (Greenberg et al. 2003b). Este tipo de pacientes tienen una alta posibilidad de fracaso en el tratamiento, y deben ser considerados como serios candidatos a tratamientos adyuvantes. Con todo, parece ser importante incorporar la ECS a los sistemas de estadiaje patológicos (Woolgar et al. 2003). 2.2.5. Diferenciación histológica El papel que el grado tumoral tiene en el pronóstico del OCSCC es controvertido. Hay autores que han establecido una asociación entre ambas variables, siendo peor el pronóstico cuanto mayor sea el grado de diferenciación (Nguyen et al. 2002; Piccirillo et al. 2002; Lo et al. 2003; Kosunen et al. 2004; Takes 2004); mientras que otros autores no han visto esta asociación (Leite et al. 1998; Al-Rajhi et al. 2000; P et al. 2003). 2.2.6. Invasión perineural La invasión perineural se asocia aparentemente a una mayor probabilidad de recaída locorregional y metástasis a distancia, mayor profundidad de invasión tumoral, menor grado de diferenciación y menor supervivencia (Rahima et al. 2004). Así mismo, se ha INTRODUCCIÓN 30 observado que la presencia de invasión perineural aumenta el riesgo de afectación nodal (Rodolico et al. 2004). 2.3. Factores relacionados con el tratamiento 2.3.1. Disección cervical La disección radical del cuello es el procedimiento quirúrgico clásico empleado para el tratamiento de tumores con afectación ganglionar. Este procedimiento, no obstante, aumenta la morbilidad de complicaciones secundarias a la cirugía, sobre todo en términos de disfunción en el hombro. La disección cervical selectiva, que depende de la localización tumoral, parece reportar similares ratios de control regional y supervivencia a los ofrecidos por la disección cervical radical (Ferlito et al. 2003). Para valorar la extensión de la disección cervical, se ha propuesto la determinación del ganglio centinela mediante la inyección de colorante o la linfocintografía, que ayudaría a decidir la agresividad de la intervención quirúrgica. La implantación de la determinación del ganglio centinela en este tipo tumoral no debe ser de difícil implantación, habiéndose reportado beneficios para los pacientes a este respecto (Taylor et al. 2001; Ross et al. 2002). 2.3.2. Resección de márgenes Se ha demostrado una fuerte correlación entre la resección de márgenes quirúrgicos libres de enfermedad y mayores ratios de supervivencia, registrándose tiempos más largos en cuanto a recurrencia de la enfermedad (Al-Rajhi et al. 2000; Munoz Guerra et al. 2003; Woolgar et al. 2003). INTRODUCCIÓN 31 3. FACTORES PRONÓSTICOS BIOLÓGICOS 3.1. Angiogénesis Los tumores malignos tienen la habilidad de inducir el crecimiento de nuevos vasos, fenómeno importante para la progresión tumoral, la agresividad y la capacidad de metastatizar. Este fenómeno tiene una regulación intrincada y compleja, siendo denominado angiogénesis (Carmeliet 2003). La angiogénesis tumoral se ha determinado clásicamente contando el número de nuevos vasos generados (densidad de microvasos, MVD) en secciones de tejido y usando técnicas inmunohistoquímicas (Hannen et al. 2004). La angiogénesis parece ser un importante factor relacionado con la hostilidad de tumores de cavidad oral (Shpitzer et al. 1996). Además, mayor angiogénesis incrementa el riesgo de afectación ganglionar y aparece como un factor pronóstico independiente de recurrencia, condicionando tratamientos adyuvantes más agresivos para los pacientes con mayores niveles de MVD (Bettendorf et al. 2004). El factor de crecimiento vascular endotelial (VEGF) tiene un papel fundamental en el desarrollo de nuevos vasos (Uehara et al. 2004). Se han observado correlaciones entre la expresión de VEGF y el pronóstico, de tal manera que cuanto mayor es la expresión de este marcador, peor es el pronóstico de los pacientes con OCSCC (Uehara et al. 2004). 3.2. Expresión tumoral de ciclooxigenasa-2 (COX-2) Se ha observado una fuerte correlación entre la sobreexpresión de COX-2 y el riesgo de afectación ganglionar, el mayor grado de recurrencia y el menor grado de supervivencia en pacientes con carcinoma de cavidad oral (Itoh et al. 2003). COX-2 parece expresarse no solo en las células tumorales, sino también en células del estroma tumoral y en los vasos sanguíneos circundantes, lo que sugiere una participación de esta molécula en otros procesos tumorales como invasión y metástasis (Day et al. 1994; Thomas et al. 1999). Terakado y col. reportaron una relación de la expression de COX-2 con la radioterapia. Así, aquellos tumores de cavidad oral con sobreexpresión de COX-2 eran más radiorresistentes (Terakado et al. 2004). Más aún, la inhibición de COX-2 in vitro mostró mayor sensibilidad de las células tumorales a la radioterapia (Terakado et al. 2004). INTRODUCCIÓN 32 3.3. Marcadores moleculares Se han identificado numerosas aberraciones genéticas en tumores de cavidad oral, frecuentemente ligadas a los cromosomas 3, 9, 11, 13 y 17. Entre otras alteraciones relacionadas con la carcinogénesis del OCSCC se han descrito i) la inactivación de genes supresores como p16 y p53, ii) la sobreexpresión de oncogenes como PRAD-1, iii) o la alteración de genes relacionados con la metabolización de carcinógenos o iv) involucrados en la reparación del ADN (Scully et al. 2000c). Además, gran parte de los tumores de cavidad oral tienen actividad telomerasa (Bettendorf et al. 2004). El estudio de estos marcadores es importante para caracterizar las células tumorales, teniendo implicaciones relativas al riesgo (familiar), el diagnóstico, el estadiaje, el pronóstico o el tratamiento (Scully et al. 2000b). Oncogenes 3.3.1. Receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) El receptor para el factor de crecimiento epidérmico es un receptor de membrana activado por ligando, que una vez activo promueve una serie de cascadas de señalización complejas que llegan hasta el núcleo celular promoviendo la transcripción de una serie de genes. EGFR está relacionado con fenómenos de proliferación celular, diferenciación, migración, y antiapoptosis. Su sobreexpresión es común en tumores de mama, próstata, pulmón o vejiga, implicando un peor pronóstico (Scully et al. 2000c; Bettendorf et al. 2004). En relación al cáncer de cavidad oral, EGFR se ha asociado a mayor tamaño tumoral (T), invasión y afectación ganglionar (Bettendorf et al. 2004), así como a menor grado de diferenciación tumoral (Ulanovski et al. 2004). El OCSCC no está al margen de los ensayos realizados con inhibidores de EGFR (Myers et al. 2002; Shintani et al. 2004). 3.3.2. Otros oncogenes Se ha estudiado el papel de otros oncogenes en el contexto del cáncer de cavidad oral, destacando ciclina D1 y ciclina A. La ciclina D1 regula el ciclo celular, fosforilando a la proteína retinoblastoma promoviendo la transición de la fase G1 a la S del ciclo celular. La sobreexpresión de ciclina D1 es un factor pronóstico independiente en diversos tumores incluyendo cabeza y cuello, y se asocia a estadios más avanzados y mayor riesgo de afectación ganglionar (Schneeberger et al. 1998; Miyamoto et al. INTRODUCCIÓN 33 2003), aunque hay resultados contradictorios al respecto (Scully et al. 2000b; Bettendorf et al. 2004). La ciclina A juega un papel fundamental en la síntesis de ADN en fase S y la progresión de la fase G2 a la fase M. La sobreexpresión de ciclina A se asocia a estadios más avanzados de la enfermedad, mayor volumen tumoral, más afectación ganglionar y recurrencia (Chen et al. 2003). Genes supresores 3.3.3. p53 La proteína p53 es considerada una de las más influyentes en la carcinogénesis humana. Está involucrada en el control del ciclo celular, apoptosis y preservación de la estabilidad genética. Su sobreexpresión se asocia a mayor grado de indiferenciación tumoral y peor pronóstico. Las mutaciones en el gen p53 han sido motivo de extensos estudios, y son consideradas mejores factores predictivos de recurrencia y supervivencia que la simple expresión (Scully et al. 2000b). El impacto de p53 en respuesta a la radioterapia es confuso, reportándose resultados contradictorios en la bibliografía (Dijkema et al. 2000; Scully et al. 2000a; Bettendorf et al. 2004). 3.3.4. Otros genes supresores Se ha estudiado el papel de otros genes supresores en el contexto del carcinoma de cavidad oral, destacando la proteína retinoblastoma (Rb), p16, p21 y otros. En algunos casos, se ha observado relación entre Rb (Takes et al. 2002), p16 (Scully et al. 2000b; Bettendorf et al. 2004) o p21 (Xie et al. 2002) y el pronóstico de los pacientes con OCSCC, aunque también se han reportado resultados contradictorios. Ploidía Un contenido anormal de ADN se ha asociado a estadios más avanzados de OCSCC así como a otros marcadores de peor pronóstico como un menor grado de diferenciación o mayor afectación ganglionar. La ploidía parece ser un factor pronóstico independiente de recaída y muerte causa específica en este tipo tumoral (Byers et al. 1998; Rubio Bueno et al. 1998). Se considera que el estudio del contenido de ADN de las células presentes en el tumor invasivo, da una idea de la agresividad INTRODUCCIÓN 34 tumoral y sugiere una influencia sobre la supervivencia causa-específica, sobre todo en combinación con otros hallazgos clínicos (Noguchi et al. 2002). INTRODUCCIÓN 35 4. NUEVOS FACTORES PRONÓSTICOS MOLECULARES 4.1. Receptor para el factor de crecimiento dependiente de insulina 1 (IGF-1R) El receptor del factor de crecimiento dependiente de insulina 1 (IGF-1R) es un receptor de membrana de tipo tirosin-kinasa involucrado en el desarrollo y la progresión del cáncer, cuya activación promueve el crecimiento y la supervivencia celular. IGF-1R ejerce su acción principal a través de la activación de las rutas de mitogen-activated protein kinase (MAPK) y de phosophoinositol-3 kinase (PI3K). Además de los roles asignados tradicionalmente a IGF-1R, su activación también se ha asociado con un incremento de la radioresistencia tanto en estudios in vitro como in vivo, aunque los mecanismos moleculares que están detrás de este procesos son todavía inciertos. Recientemente, IGF-1R se ha relacionado con otros marcadores como B-cell Leukemia Protein (Bcl-2), Bcl-2-associated X Protein (Bax) o Ku70/80, los cuales están implicados en la resistencia a radioterapia, regulación de la apoptosis y mecanismos de reparación de ADN mediante unión de extremos no homólogos (non homologous end joining (NHEJ) DNA repair). 4.1.1. Receptor del factor de crecimiento dependiente de insulina 1: una breve introducción sobre su estructura y función El factor de crecimiento dependiente de insulina 1 (IGF-1R) es un receptor de membrana celular extensamente distribuido en los tejidos humanos. Su estructura y funciones han sido profundamente exploradas durante los últimos veinte años. La estructura final de IGF-1R es un homodímero con dos subunidades extracelulares α y dos subunidades transmembrana β, unidas mediante puentes disulfuro (Adams et al. 2000). La subunidad α contiene el dominio de unión al ligando, mientras que la subunidad β está formada por un dominio yuxtamembranal, un dominio intracelular con actividad tirosin-kinasa y un dominio C-terminal con función de interacción con otras proteínas (Ullrich et al. 1986). IGF-1 se une con alta afinidad a IGF-1R. Pero existen otros ligandos capaces de unirse a IGF-1R, como IGF-2 o la insulina. La concentración de IGF-1 circulante depende principalmente de su producción en el hígado, la cual está estrechamente controlada por la hormona de crecimiento (GH). La biodisponibilidad de los ligandos está controlada por una familia de proteínas de unión denominadas IGF-binding proteins (IGFBP 1-6). La proporción entre IGF libre y unido a IGFBPs es importante en la determinación de la potencia de este factor de crecimiento. Una vez que el receptor es activado por la unión de una molécula de IGF- INTRODUCCIÓN 36 1, se desencadenan una serie de cascadas de transducción de la señal hacia el núcleo celular, modulando así algunas de las funciones celulares mediante la regulación de factores de trancripción. La variedad de respuestas celulares mediadas por IGF-1R es el resultado de la combinación de varias de estas rutas de señalización, entre las que encontramos la ruta de mitogen-activated protein kinase (MAPK) y la ruta de phosphoinositol 3-kinase (PI3K), que median la proliferación y supervivencia celular (Figura 8). Figura 8. Principales vías de señalización mediadas por la activación de IGF-1R, así como las principales moléculas efectoras. La ruta de MAPK es una gran cascada de señalización que engloba un gran número de proteínas kinasa y que promueve principalmente el incremento de la proliferación y diferenciación celulares. IGF-1R enlaza con la ruta MAPK a través de la activación, mediante fosforilación, de la proteína Src homology and collagen (Shc). Esta activación es seguida por una secuencia de fosforilaciones de proteínas kinasa a través del citoplasma (Ras –human homologue of rat sarcoma-, Raf –protein serine/threonine kinase encoded by the raf oncogeny MEK –MAPK kinase kinase-) las cuales llegan hasta la proteína extracellular-signal regulated kinase 1 y 2 (ERK1 y INTRODUCCIÓN 37 ERK2) (Robbins et al. 1992). No obstante, esta ruta parece controlar también los procesos de apoptosis a través del protooncogén Crk-II mediante una ruta dependiente de Ras, pero independiente de Raf-1/MAPK (Parrizas et al. 1997). La proteína insulin receptor substrate 1 (IRS-1) también se activa cuando IGF-1R es fosforilada. Esta proteína interactúa con p85 (que es la subunidad reguladora del PI3K), activando a la subunidad catalítica (p110) de PI3K, la cual induce a la producción de fosfolípidos activados (Oskouian et al. 2010). La proteína kinasa B (Akt) se activa gracias a estos fosfolípidos con la mediación de las proteínas 3phosphoinositide-dependent protein-kinase (PDKs). Una vez esto ocurre, Akt es capaz de inactivar a la proteína Bcl associated death promoter (BAD), que forma parte del complejo BCL-2/BAD (B-cell leukemia protein/Bcl associated death promoter), y así liberar a la proteína antiapoptótica BCL-2, todo ello regulado principalmente a través de las caspasas (del Peso et al. 1997). La fosforilación de BAD es uno de los mecanismos más importantes por los que IGF-1R induce antiapoptosis y supervivencia celular (Sell et al. 1995). La activación de IGF-1R se ha relacionado también con la adhesión celular, motilidad celular y la metástasis tumoral (Tai et al. 2003). La activación de IGF-1R desorganiza los complejos β-catenina/E-cadherina, favoreciendo la separación celular. La motilidad y migración celulares están incrementadas por la interacción entre IGF-1R, las integrinas, la proteína focal adhesion kinase (FAK) y las proteínas RACK1, y por la activación de Rho-A, todo lo cual conduce a una reorganización del citoesqueleto de actina y mayor contractilidad de actina/miosina (Chitnis et al. 2008). IGF-1R estimula la secreción de anexina II a la matriz extracelular promoviendo la activación del plasminógeno, la adhesión celular y la metástasis e invasión tumorales (Tressler et al. 1993; Hajjar et al. 1999). Se ha sugerido que el mecanismo por el cual IGF-1R interacciona con anexina II es independiente de las principales rutas de señalización conocidas para IGF-1R (Zhao et al. 2003). Las proteínas IGF además inducen la expresión de metaloproteínas, necesarias para la invasión y estimula la angiogénesis mediante la activación de endothelial nitric oxide synthase y la expresión de las proteínas hypoxia-induciable factor1α (HIF-1α) y vascular endothelial growth factor (VEGF) (Chitnis et al. 2008). Las funciones celulares están controladas no sólo por IGF-1R, sino también por otros receptores tirosin-kinasa que comparten las mismas rutas de señalización. Este es el caso del receptor para el factor de crecimiento epidérmico (EGFR), extensamente INTRODUCCIÓN 44 aparentemente sanos. La complementación de las células AT con moléculas de cDNA de ATM resultó en un incremento de la actividad promotora de IGF1R y en los niveles de IGF-1R, lo que a su vez supuso un incremento de la radioresistencia. Los estudios moleculares sugieren que la señalización desencadenada por IGF-1R puede controlar la función de ATM, y apoya el concepto de la inhibición de IGF-1R como tratamiento potencial para los tumores radio-resistentes (Macaulay et al. 2001). Las Vaults son partículas ribonucleoproteicas compuestas por tres proteínas: MVP (104 kD), el vault poly(adenosine diphosphate-ribose) polymerase también denominado VPARP (193 kD) y la proteína telomerase-associated protein-1 o TEP-1 (240 kD), junto con pequeñas moléculas de ARN no traducido (vRNA) de 141 bases. Las proteínas VPARP pertenecen a la misma familia que la proteína poly(ADP-ribose) polymerase 1 (PARP-1), la cual posee un papel importante en el control de la reparación del daño al ADN y el mantenimiento de su integridad (Bouchard et al. 2003). Se ha publicado una asociación entre IGF-1R y MVP (Lloret et al. 2008). Los tumores que presentan alta expresión de MVP también tienen elevada la expresión de IGF-1R. Las expresiones de MVP e IGF-1R se relacionaron entre sí en pacientes con cáncer de cérvix y confieren peor control local a largo plazo de estas pacientes tratadas con quimio-radioterapia, sugiriendo por primera vez una fuerte correlación entre estas dos proteínas (Lloret et al. 2008). La interacción entre IGF-1R y MVP es de gran interés, y puede ayudarnos a explicar el papel predictivo de estas oncoproteínas en la respuesta a radioterapia. En un estudio llevado a cabo en 116 mujeres con cáncer de cérvix localizado, Lloret y cols. mostraron una asociación inversa entre MVP y BAX, IGF-1R y BAX, así como una asociación directa entre IGF-1R y BCL-2, sugiriendo que IGF-1R podría colaborar con MVP en la prevención de la apoptosis mediante la estimulación de BCL-2 y la inhibición de BAX (Lloret et al. 2009). El rol de BCL-2 en este escenario parece ser complejo y estar estrechamente relacionado con IGF-1R. Esta asociación ha sido recientemente estudiada por Henríquez-Hernández y cols. también en pacientes con cáncer de cérvix (Henriquez-Hernandez et al. 2011). Los tumores que sobreexpresaron IGF-1R mostraron un incremento en los niveles de expresión de BCL-2 y MVP. BCL-2 apareció como un factor importante en el pronóstico de los pacientes, permitiendo seleccionar a un grupo de pacientes con excelentes tasas de supervivencia. De este modo, todos los pacientes con cáncer de cérvix tratados con quimio-radioterapia que INTRODUCCIÓN 45 presentaban niveles de expresión bajos para MVP y/o IGF-1R y/o BCL-2 sobrevivieron durante los 10 años que duró el seguimiento. Parece que es necesaria la sobreexpresión de las tres oncoproteínas para desarrollar un fenotipo de mal pronóstico. Se han observado resultados similares para la supervivencia libre de recidiva local, supervivencia libre de metástasis a distancia y supervivencia libre de enfermedad (Henriquez-Hernandez et al. 2011). MVP se ha asociado con mecanismos de reparación no homólogos al DNA (NHEJ) a través de su interacción con la proteína Ku70/80 (Lloret et al. 2009). El dímero Ku70/80 se une a los extremos rotos de las cadenas de ADN al mismo tiempo que atrae a otras proteínas para constituir el complejo de reparación. Por otro lado, Ku70/80 tiene un efecto regulador muy potente sobre la interacción entre BCL-2 y BAX. Esta proteína ha sido propuesta como un modulador clave en la función de apoptosis (Amsel et al. 2008; Wang et al. 2008). Lloret y cols. publicaron que niveles bajos de expresión de Ku70/80 se relacionaron de forma inversa con la expresión de BCL-2 y la proliferación tumoral, mientras que estaban directamente relacionados con la expresión de BAX y p53 alterada (Lloret et al. 2009). La actividad de Ku70/80 está suprimida por PARP-1 (que forma parte de los complejos vaults), promoviendo la recombinación homóloga frente a NHEJ (Hochegger et al. 2006). La relación entre Ku70/80 y los complejos vaults se ha corroborado recientemente a nivel clínico (Lloret et al. 2009). La expresión de MVP y Ku70/80 estaba inversamente relacionada, sugiriendo que MVP podría favorecer el aumento de la inestabilidad genética reduciendo la reparación del ADN dañado en términos de NHEJ, e inhibición de la expresión de Ku70/80. La progresión tumoral y la resistencia a quimioterapia y radioterapia también parecen estar mediadas por la supresión de BAX y la sobreexpresión de IGF-1R, resultando en un aumento de la proliferación y una inhibición de la apoptosis, causado todo ello por el incremento de BCL-2 y la sobreexpresión de p53 alterada (Lloret et al. 2009). La inhibición de la señal inducida por IGF-1R produce radiosensibilidad a través de varios mecanismos. Cuando la función de IGF-1R está dañada, se aumenta la radiosensibilidad mediante un mecanismo que implica el descenso en la actividad de unión de Ku al ADN y la inhibición de Ku86 nuclear. Este mecanismo parece ser dependiente de la proteína p38 kinasa (Cosaceanu et al. 2007). A nivel clínico, Henríquez-Hernández y cols. han demostrado recientemente, en 50 pacientes con cáncer de cérvix que presentaron INTRODUCCIÓN 46 respuesta completa a la quimio-radioterapia, que la expresión de Ku70/80 estaba significativamente inhibida en tumores que sobreexpresaban IGF1R/MVP/BCL-2 (Henriquez-Hernandez et al. 2011). Ku parece ser un regulador central de la apoptosis por su interacción con BAX (Amsel et al. 2008) y BCL-2. Se ha demostrado, además, que este último suprime a Ku70/80 y así inhibe la reparación NHEJ (Wang et al. 2008). IGF-1R podría estar implicado en este proceso a través de la fosforilación de BAD, que posteriormente promueve la liberación de BCL-2, o mediante su asociación con MVP y la subsecuente modulación de Ku. Aunque el valor pronóstico de IGF-1R no está del todo claro, parece ser que esta oncoproteína podría ser un buen factor pronóstico en pacientes tratados con radioterapia, y actuar como una diana directa para mejorar la respuesta a la radiación de los pacientes con cáncer. IGF-1R podría afectar a la reparación del ADN mediante la regulación de Ku70/80 a través de su interacción con MVP y la ulterior modulación de NHEJ. Los mecanismos celulares por los que IGF-1R podría afectar a la actividad de Ku70/80 mediante MVP son desconocidos, y esta asociación teórica podría considerarse como una nueva hipótesis a estudiar para mejorar el conocimiento sobre el papel de IGF-1R en la resistencia a radioterapia. INTRODUCCIÓN 47 4.2. Proteínas reguladoras de la resistencia a drogas. Papel de Major vault protein (MVP) Las células tumorales insensibles a las drogas antineoplásicas poseen un fenotipo de resistencia a drogas. Las proteínas que pueden estar envueltas en esta resistencia están asociadas al transporte de xenobióticos: P-glicoproteína, la proteína 1 de resistencia a multidroga (MDR1), la proteína de resistencia en cáncer de mama (BRP) y la proteína relacionada con la resistencia en pulmón (LRP). 4.2.1. Estructura y composición A la proteína LRP se la llamó posteriormente proteína vault mayor (MVP). En su forma humana, el complejo Vault está compuesto por partículas de ribonucleoproteína que se encuentran en el citoplasma de las células eucarióticas y que se constituye por múltiples copias de tres proteínas: la proteína vault de mayor peso molecular (MVP) y dos proteínas vault menores (VPARP y TEP1), además de moléculas de ARN sin traducir. MVP supone más del 70% de la masa total del complejo (Steiner et al. 2006a). Los estudios de vaults en mamíferos han puesto de manifiesto que el complejo contiene al menos, cuatro componentes distintos (Kedersha et al. 1986): tres proteínas de alto peso molecular y varias moléculas pequeñas de ARN no traducido. La proteína Mr100.000 (masa relativa), conocida como major vault protein (MVP), domina la estructura y constituye más del 70% de la masa molecular del complejo. Dos proteínas adicionales, Mr193.000 y 240.000, componen las proteínas menores de vaults. Se ha observado que la subunidad Mr193.000 presenta actividad poli (ADP-ribosa) polimerasa (PARP), motivo por el cual ha esta unidad se la ha llamado vault PARP (VPARP o p193) (Kickhoefer et al. 1999a). La subunidad Mr240.000 presenta cierta similitud con la proteína asociada a la telomerasa 1 (TEP1) (Kickhoefer et al. 1999b). Además, esta subunidad de vault es compartida con al menos otro complejo de ribonucleoproteína, el complejo telomerasa. Por último, la vault ARN (vARN) representa aproximadamente el 5% de la masa total de vaults (Kedersha et al. 1986). Un modelo estequiométrico ha propuesto que cada partícula de vaults se compone por 96 moléculas de MVP, 8 moléculas de VPARP, 2 moléculas de TEP1 y al menos seis moléculas de vARN (Kong et al. 2000). El gen humano para el MVP, localizado en el cromosoma 16p13.1-p11.2 (Slovak et al. 1995), se expresa de manera diferencial en los diferentes tejidos. Así, los tejidos que presentan mayores niveles de MVP son pulmón, hígado e intestinos; mientras que por INTRODUCCIÓN 48 otro lado, el músculo esquelético y el cerebro presentan niveles relativamente bajos de esta proteína. Figura 9. Estructura de Vault presente en hígado de rata (resolución, 3.5 A) (Tanaka et al. 2009). El gen que codifica para la proteína Mr193.000, llamada VPARP, se encuentra en el cromosoma humano 13q11 (Still et al. 1999) y está heterogéneamente expresada en los tejidos humanos. Se ha demostrado que VPARP cataliza la ribosilación ADP de sí mismo y, en menor medida de MVP (Kickhoefer et al. 1999a). Aún no se conoce la importancia de la actividad de VPARP para la función de vaults. Es importante destacar que las partículas del complejo vaults mantienen esta actividad enzimática. La Poli ADP-ribosilación de las proteínas constituye una modificación postraduccional reversible que juega un papel importante en el mantenimiento de la estabilidad genomica del ADN (Smith 2001). Se ha establecido que la proteina menor de vault (Mr240.000) es idéntica a la proteína asociada a la telomerasa 1 (TEP1). El gen TEP1 en humanos ha sido localizado por inmunofluorescencia de hibridación in situ (FISH) en el cromosoma 14q11.2 (Saito et al. 1997). El papel de TEP1 dentro del complejo telomerasa no está claro, sin embargo, se ha demostrado que TEP1 interactúa específicamente con la ARN telomerasa (Harrington et al. 1997; Nakayama et al. 1997). Vaults ARN (vARN) constituye menos del 5% de la masa del complejo y se cree que es una particula funcional más que un componente estructural, ya que la degradación de la vARN no afecta a la estructura de valts (Kedersha et al. 1986; Kedersha et al. INTRODUCCIÓN 49 1991; Kickhoefer et al. 1993; Kong et al. 2000). El gen vARN es diferente para cada especie, presentando desde 86 hasta 141 bases. Los seres humanos presentan tres tipos de vRNAs (hvg1, hvg2 y hvg3) de 98, 88 y 88 bases, respectivamente. . Al parecer, los vARNs humanos individuales poseen afinidades diferentes para con TEP1. La mayor parte de vARN asociados a vaults son del tipo hvg1, y sólo pequeñas cantidades de hvg2 y hvg3 (van Zon et al. 2003). Curiosamente, en al menos tres líneas celulares resistentes a múltiples drogas, el tipo hvg3 está consistentemente asociado en comparación con sus contrapartes sensibles a los medicamentos (van Zon et al. 2001). Esto sugiere que la proporción en que los tipos de vARN aparecen asociados a vaults puede ser de importancia funcional. 4.2.2. Funciones putativas de Vaults El detallado conocimiento estructural que se tiene de este complejo proteico contrasta con el escaso conocimiento que se tiene acerca de sus funciones y de las proteínas con las que interacciona. MVP posee un papel fundamental y esencial como proteína de resistencia a drogas, tal y como se desarrollará en el siguiente apartado. No obstante, algunos autores sugieren que MVP puede estar relacionada con las mayores cascadas de señalización citoplasmáticas. En los últimos años, se ha observado que MVP podría estar involucrado en otros procesos celulares diferentes. Los niveles de expresión de Y-boxbinding protein-1 (YB-1), proteína importante para la proliferación celular y la reparación del ADN, parece correlacionarse significativamente con los niveles de expresión de MVP (p = 0.0044) en tumores de rabdomiosarcoma embrional (Oda et al. 2008). MVP parece inhibir la apoptosis celular y favorecer la proliferación celular (Steiner et al. 2006a). MVP inhibe a fosfatasas homólogas de tensina (PTEN), que a su vez están relacionadas con el aumento de PI3K/Akt (Yu et al. 2002). Este dímero inhibe la apoptosis, inhibiendo a su vez a la proteína pro-apoptótica Bad (Rodemann et al. 2007). En células estimuladas mediante la adicción de factor de crecimiento epidérmico (EGF), se ha visto que MVP interacciona con los dominios SH2 de algunas tirosina fosfatasas, interaccionando a su vez con ras e interviniendo en la modulación de la actividad de la vía de Erk (Kolli et al. 2004). MVP también se une a los dominios SH2 de Src-quinasa, disminuyendo la activación de Erk dependiente de EGF en células que sobreexpresan Src (Kim et al. 2006). Esta proteína aumenta la proliferación celular a INTRODUCCIÓN 50 través de la vía de señalización dependiente de Erk/MAPK (Rodemann et al. 2007), y previene la apoptosis mediando la inhibición del eje COP-1/p53 (Lloret et al. 2008). Se ha observado además que los niveles de expresión de MVP están relacionados con los de IGF-1R en pacientes con cáncer cervical (Lloret et al. 2008), lo que lleva a la célula a aumentar su proliferación y a inhibir su apoptosis. El papel que MVP parece tener en los fenómenos de carcinogenésis, puede estar mediado por su relación con la proteína-asociada a telomerasa (TEP-1) (Miwa et al. 2007), así como con la relación existente con los procesos de remodelación de la cromatina (Emre et al. 2004). El receptor de estrógeno es la proteína responsable de la acción biológica del estradiol. La unión a secuencias específicas presentes en la región reguladora de genes, conocida como elemento de respuesta hormonal, constituye un evento obligatorio en el mecanismo de acción hormonal (Beato et al. 1989). Abbondanza y col., han reportado que el receptor de estrógeno podría interactuar con MVP y, por lo tanto, representar otra forma de control para la acción regulatoria hormonal a través de MVP (Abbondanza et al. 1998). Diferentes trabajos han evidenciado que la mayoría de las partículas vaults parecen estar en el citoplasma, aunque una pequeña cantidad (0.5%) se asocia con la envoltura nuclear en cortes de tejido (Kedersha et al. 1986; Kedersha et al. 1990), y con complejos de poro nuclear (NPCs) (Chugani et al. 1993). La simetría y la geometría de las partículas vaults ha llevado a pensar que ellas pueden ser el conector central/transportista de los NPCs (Kedersha et al. 1991), y, como tal, podrían desempeñar un papel en el transporte nucleocitoplásmico (Chugani et al. 1993). En el trabajo de Hamill y col, donde se buscaba establecer una función más clara para las partículas vaults y otras partículas de tipo ribonucleoproteínas del transporte nucleocitoplasmático, se concluyó que vaults podrían jugar un papel en el ensamblaje de los ribosomas y/o en el transporte de los ribosomas del núcleo. Vaults y los ribosomas pueden interactuar a través de unos débiles puentes intermedios con mARN. Si esa interacción de vaults con el ribosoma está mediada por mARN o proteínas asociadas con el mARN, la pérdida de mARN podría destruir el ribosoma y la interacción con vaults. En ese mismo trabajo, se demostró por inmunotinción la presencia de vaults en la superficie nuclear, además de una fuerte reactividad en el nucleolo (el sitio de unión en la subunidad ribosomal). Estos resultados sugieren que vaults estarían involucradas en el montaje y/o transporte de las subunidades ribosomales nucleocitoplásmicas (Hamill et al. 1997). INTRODUCCIÓN 51 La capacidad de interacción de la proteína constitutive photomorphogenic 1 ubiquitin ligase (COP1) con el factor de transcripción c-jun parece estar condicionada por el estado de fosforilación de MVP. En modelos celulares, la fosforilación de MVP inducida por radiación UV impide una interacción con COP1, lo que conduce a un aumento del complejo COP1-c-jun, lo que al final modifica la expresión de AP-1 (Yi et al. 2005). También se ha observado una asociación positiva entre los niveles del factor inducible por hipoxia-1 (HIF-1) y MVP. Así, en células sometidas a deprivación de oxígeno, los niveles de ambas proteínas se ven aumentados. Parece que MVP media la ubiquitinación y posterior degradación de HIF-1 (Iwashita et al. 2010). Figura 10. Representación esquemática propuesta para las funciones de Vault, incluyendo los procesos de transporte (1-6), captura de drogas (7) y modulación de la señal de transducción (8). Leyenda: (Transporte ), (Estímulación ), (Interacción ), (Inhibición ) (Steiner et al. 2006a). Recientemente, se ha visto que MVP puede tener un papel relevante en la modulación del sistema inmune. El interferón g activa MVP a través de la vía JAK/STAT, mediando el aumento de expresión de MVP en macrófagos y células dendríticas (Mossink et al. 2003; Steiner et al. 2006b). No obstante, el papel de MVP en el sistema inmune está aún por dilucidar. INTRODUCCIÓN 52 Aunque la trascendencia y relevancia de MVP en particular, y de la proteínas vault en general, sobre otros mecanismos celulares diferentes a la resistencia a drogas debe ser demostrada, parece evidente que esta proteína se encuentra en medio de procesos relevantes para la célula, tales como la proliferación y la apoptosis, que por otra parte son mecanismos claves en los fenómenos de carcinogénesis. 4.2.3. Resistencia a drogas: el papel más conocido de MVP Vaults transportan drogas y otros xenobióticos lejos de sus dianas subcelulares mediante mecanismos de extrusión de estas sustancias desde el núcleo o el secuestro de las mismas en vesículas de exocitosis. En tal escenario, vaults podrían funcionar como transportadores citoplasmáticos y/o nucleares de fármacos asociadas a la membrana, quizá relacionándose con otras proteínas transportadoras de la familia ABC presente en las distintas membranas intracelulares. Las proteínas de resistencia a multidrogas (MDR), entre las que se encuentran Pgp, LRP y MVP, realizan una serie de funciones relacionadas con los procesos de detoxificación celular. Así, aumentan la actividad detoxificadora de las enzimas glutatión S-transferasa (GST) y 06alquilguanina-ADN alquiltransferasa; altera la actividad de la enzima topoisomerasa 11; y aumenta la expresión génica de la metalotioneínas (Vendrik et al. 1992; Mattern et al. 1993). Estas proteínas de resistencia a droga, están presentes en distintos tejidos normales y malignos. En las células normales, la mayoría de estas proteínas presentan un papel protector contra las sustancias tóxicas. Hay evidencias que sugieren que las células conservan esta función también cuando adquieren un fenotipo maligno, manteniendo e incluso potenciando la capacidad celular para eliminar compuestos de tipo quimioterápico (Mattern et al. 1993). La cavidad central de vaults es lo suficientemente grande como para incluir complejos de hasta 330 Å de diámetro (Kong et al. 1999), o para secuestrar a cientos de proteínas menores. En un estudio elaborado por Chugani et al. se encontró una pequeña porción de las vaults de la rata, asociados con la envoltura nuclear y, posiblemente, con el complejo del poro nuclear (NPC), lo que sugiere que vaults actuarían como lanzaderas entre el núcleo y el citoplasma (Chugani et al. 1993). La masa, el diámetro y la forma de vaults son similares a las que presenta la clavija central de la NPC. Hasta hace muy poco, sin embargo, vaults no había sido detectada dentro de la NPC. Utilizando microscopía crioinmunoelectrónica e inmuno-tinción, Slesina et al. fueron los primeros en localizar a MVP dentro de NPC, proporcionando INTRODUCCIÓN 53 un indicio más para comprender las funciones de MVP/vaults y su relación con las NPC (Slesina et al. 2005). Un estudio realizado en células de carcinoma de faringe, la cuales presentaban alta expresión de LRP, demonstró una posible participación de esta proteína en el transporte nucleocitoplamático de drogas, dando como resultado la presencia de un fenotipo de resistencia a multidrogas (MDR). Tanto las células de carcinoma de faringe sensibles como las resistentes fueron sometidas a diferentes concentraciones de benzopireno y de doxirrubicina. Tras verificar la distribución intracelular de estas drogas por microscopia de fluorescencia, se observó que las células sensibles presentaban un acúmulo más pronunciado en el núcleo (lugar de acción de estas drogas), que en el citoplasma, lo que resulta en una mayor sensibilidad a estos agentes. Por otro lado, las células resistentes presentaban mayor acúmulo en el citoplasma, alejándose, por lo tanto, de su sitio de acción. Este experimiento, así como otros, sugieren que MVP puede ser muy relevante en el desarrollo del fenotipo MDR (Cheng et al. 2000). Por su parte, Silva y cols. publicaron que líneas celulares resistentes a múltiples drogas (pulmón, mieloma y carcinoma de mama), presentaban niveles elevados de MVP. Es más, se ha demostrado recientemente que el MVP no es suficiente para originar al fenotipo MDR aisladamente. De hecho, vaults constituye un complejo de múltiples subunidades que necesitan interactuar para generar el fenotipo MDR (Siva et al. 2001). La proteína MVP puede ser encontrada fisiológicamente en el cólon, pulmónes, túbulos contornados proximales renales y corteza adrenal (Filipits et al. 2000b). Además, se expresa intensamente en tejidos expuestos a agentes xenobióticos durante largos plazos; como el epitelio bronquial, la corteza adrenal y los macrófagos (van Zon et al. 2003). MVP puede generar mayor o menor sensibilidad a la quimioterapia en distintos tipos tumorales, principalmente en el pulmón, así como en leucemias, linfomas y tumores sólidos (Raaijmakers et al. 1998; Filipits et al. 2000b; Mossink et al. 2003). También participa en la resistencia a la adriamicina, y se cree que pueda estar asociado con los fenómenos de resistencia en algunos casos de neoplasias mamarias; aunque los mecanismos de acción subyacentes no han sido claramente dilucidados (Schneider et al. 2000). Estudios en mielomas han visto relación entre la expresión de MVP y la resistencia a agentes alquilantes como el melfalano (Raaijmakers et al. 1998; Mossink et al. 2003). Además, la expresión de MVP en células tumorales está asociada a la resistencia a INTRODUCCIÓN 61 4.3. Proteínas reguladoras de la apoptosis. Papel de BCL-2 4.3.1. Generalidades En 1885, Walther Flemming observó que la atresia del epitelio de los folículos ováricos se debía a una muerte celular con unos cambios nucleares característicos, a la que denominó cromatolisis y que constituían una nueva forma de muerte celular diferente a la conocida hasta ese momento, la necrosis (Majno et al. 1995). En los años 70, Allison Crawford definió la “muerte celular programada en los tejidos normales durante la embriogénesis y el desarrollo”, concluyendo que este proceso era el mismo descrito por Flemming. Se le denominó apoptosis (del griego “cayendo”), para subrayar esa eliminación celular aislada (“tal y como caen las hojas de los árboles”). Se postuló que el inicio inadecuado, o la inhibición de la apoptosis, podrían influir en la génesis de enfermedades como el cáncer. Durante la apoptosis se produce i) la condensación de la cromatina con rotura del ADN (aproximadamente cada 180 pares de bases), ii) la condensación citoplasmática y iii) el encogimiento celular (manteniéndose las organelas prácticamente intactas). El fenómeno se puede observar por microscopía óptica con tinción de hematoxilinaeosina (Kerr et al. 1972), aunque también se puede estudiar por métodos más complejos (microscopio electrónico, citometría de flujo, ruptura de ADN). La apoptosis se puede iniciar en cualquier fase del ciclo celular, dependiendo de la célula y del tipo de estímulo. Durante la apoptosis, la célula sufre el daño principalmente a nivel del núcleo, sin producirse reacción inflamatoria y generalmente de forma aislada (Mikulski 1994). Se caracteriza por ser un proceso biológico ordenado, que resulta necesario para evitar la súper-producción celular, siendo de vital importancia durante la morfogénesis. Los términos apoptosis y muerte celular programada, son a menudo utilizados como sinónimos. Sin embargo, hay otros procesos de muerte celular como son la autofagia y la necrosis, en los que se han identificado a nivel molecular componentes que justifican la existencia de un programa de ejecución. A pesar de la idea de que la muerte celular programada genéticamente requiere de la síntesis proteica, todos estos procesos (apoptosis, autofagia, necrosis) parecen estar listos previamente para ser ejecutados, lo que sugiere que la definición de muerte celular programada englobaría a todos los casos (Lockshin et al. 2001). INTRODUCCIÓN 62 Durante la necrosis, la muerte va acompañada de un aumento del volumen celular, vacuolización del citoplasma, aumento de la permeabilidad de la membrana plasmática y lisis nuclear, sin fragmentación específica de la cromatina. Esta forma de muerte celular se produce en respuesta a daños importantes causados por isquemia e hipoxia severas o por exposición a dosis elevadas de compuestos genotóxicos, que afectan al metabolismo energético celular. La muerte celular por autofagia es un proceso menos estudiado, que se caracteriza por la destrucción de componentes celulares dentro de la célula en vacuolas autofágicas. Las características morfológicas de la autofagia incluyen vacuolización, degradación del contenido citoplásmico y ligera condensación de la cromatina (Fink et al. 2005). 4.3.2. Apoptosis: regulación, moléculas involucradas y fases El proceso de apoptosis tiene una regulación compleja. En principio, cualquier célula tiene capacidad para entrar en apoptosis. La pérdida de integridad de las uniones intercelulares, las hormonas y factores de crecimiento, los impactos ambientales (agentes químicos, radiaciones ionizantes e isquemia) y el sistema inmune, son algunos de los desencadenantes extracelulares de la apoptosis. Estos agentes actúan a través de receptores de membrana, receptores intracelulares o de manera directa sobre el núcleo, dando lugar a la liberación o inhibición de reacciones intracelulares que conducen a la fragmentación del material genético y a la muerte celular (Raff 1992). Existen decenas de genes implicados en la apoptosis. Los genes cuya expresión promueve la supervivencia celular, disminuyendo la susceptibilidad a la apoptosis, pertenecen al grupo de los llamados oncogenes, destacando entre ellos el gen B-cell lymphoma 2 (Bcl-2). Aquellos genes que promueven la apoptosis se engloban dentro de los llamados genes supresores, entre los que destaca p53 y el gen del retinoblastoma (pRb). La mutación y/o el cambio en la expresión de estos genes, puede provocar un desequilibrio del destino celular, de forma que una célula sana podría ser eliminada erróneamente, mientras que una célula con aberraciones genéticas podría quedar protegida, perpetuándose en su descendencia las mutaciones potencialmente carcinogénicas. La anomalía o la ausencia de Bcl-2 podrían dar como resultado un acortamiento de la supervivencia celular. Sin embargo, un incremento en su expresión produciría un alargamiento de la misma. Mientras, mutaciones o ausencia de p53 producirían una ausencia de muerte celular por apoptosis. De manera didáctica, el daño nuclear aumentaría la expresión de p53. Su mensaje apoptótico será INTRODUCCIÓN 63 alentado por Bcl-2 associated X proteína (Bax) y contrarrestado por Bcl-2. p53 centraliza la coordinación de otros procesos relacionados con el daño celular, como son la reparación de daños en las bases o roturas dobles de cadena, la progresión del ciclo celular y la muerte por apoptosis. A p53 se la conoce comúnmente como el “guardián del genoma”, porque mantiene la estabilidad genética celular (Levine et al. 1991). Su relación con el cáncer es bien conocida, tanto por su frecuencia de alteraciones (más del 50% de los tumores muestran alteraciones en p53), como por la frecuencia de aparición de tumores en personas con mutaciones germinales de p53 (Síndrome Li-Fraumeni). Además, en tumores sin mutaciones del gen, la función de p53 puede estar alterada debido a su secuestro citoplasmático por oncoproteínas virales (por ejemplo, HPV-E6) (Morris 2002). P53 es una proteína de 393 aminoácidos cuyo gen codificador se encuentra en el cromosoma 17 y que posee varios dominios (May et al. 1999): • En el domino N-terminal se encuentran: - Dominio transactivador (TA), en el cual las interacciones entre proteínas facilitan o bloquean la capacidad de transactivación de p53. - Región poliprolina, que podría mediar las funciones apoptóticas de p53 y la supresión del crecimiento celular independiente de transcripción. - Nuclear Export Signal (NES), relacionada con el transporte de p53 desde el núcleo al citoplasma para su degradación mediada por MDM-2. • El dominio central contiene: - La secuencia específica de unión al ADN, que permite la unión de p53 con los sitios promotores de genes diana como p21 (WAF1/Cip1). - Cuatro regiones conservadas que regulan las interacciones proteínaADN. En esta región ocurren más del 90% de las mutaciones identificadas en cánceres humanos. Algunas mutaciones limitan la actividad de transcripción de p53 y otras tienen la capacidad de transactivar genes específicos como c-Myc (proliferación celular), MDR-1 (resistencia a drogas), tolerancia al estrés celular, radioresistencia relacionada con mejoras en la capacidad de reparación del ADN o inhibición de la apoptosis (Sigal et al. 2000). Además, se producen uniones a otras proteínas de tipo inhibidoras de p53 (SV40 Large T antigen protein), INTRODUCCIÓN 64 favorecedoras de la misma (P53BP1/2) o proteínas de reparación (BRCA1, BLM y Rad51) que facilitan la reparación homóloga de las roturas dobles de cadena del ADN inducidas por acción de la radiación. • El dominio C-terminal incluye: - Un dominio de oligomerización que permite la óptima configuración de p53 en forma de tetrámeros. - Una región de señalización de localización nuclear (NLS) relacionada con la translocación de p53 desde el citoplasma al núcleo. - Una región de unión con secuencias no específicas de ADN y roturas dobles de cadena inducidas por radiación ionizante, permitiendo el reconocimiento del ADN dañado y favoreciendo su papel en la reparación del daño mediado por XPD, XPB, BLM, Rad51, etc. (Cuddihy et al. 2004). En condiciones fisiológicas, p53 muestra niveles bajos de la proteína, con una vida media corta (10-20 minutos). El recambio viene controlado por la proteolisis inducida por MDM-2. En caso de daño al ADN, p53 se acumula y se activa, desarrollándose un complejo sistema de regulación (Ashcroft et al. 1999). La proteína Bcl-2 consta de 239 aminoácidos y su gen codificador está en el cromosoma 18. Contiene cuatro dominios estructuralmente conservados: BH1, BH2, y BH3 que son necesarios para interaccionar con otros miembros de la familia Bcl-2, y dominio BH4 que media las funciones de control del ciclo celular. Existe un dominio transmembranal de gran importancia funcional, necesario para la localización subcelular de Bcl-2 (Belka et al. 2002). En condiciones normales, la expresión de Bcl-2 disminuye cuando las células están maduras o cuando tienen que ser eliminadas, mientras que se expresa en células que deben sobrevivir (células hematopoyéticas precursoras y células del sistema nervioso). Bcl-2 tiene un importante papel en la embriogénesis, donde la mayoría de las células expresan altos niveles de esta proteína (Jacobson et al. 1997). En general, las células que expresan Bcl-2 bloquean la apoptosis y promueven la supervivencia celular, facilitando la adquisición de mutaciones y la transformación maligna (Vaux et al. 1988; Pezzella et al. 1995). Bcl-2 inhibe la apoptosis (Hockenbery et al. 1991) bloqueando el citocromo C liberado por la mitocondria durante la ruta de apoptosis mitocondrial (Brustugun et al. 1998). INTRODUCCIÓN 65 Familia de proteínas BCL-2Familia de proteínas BCL-2 Figura 11. La familia de proteínas BCL-2 contiene muchas otras moléculas, divididas en dos grupos, anti-apoptóticas y proapoptóticas. La figura representa los dominios que presenta cada uno de sus miembros. Bax (Bcl-2 associated X protein) es una proteína cuyo gen codificador está en el cromosoma 19. Aunque posee una alta homología con la proteína Bcl-2, carece del dominio BH4 (Figura 11). Participa en la ruta de apoptosis mitocondrial induciendo la liberación del citocromo C. Bax se asocia con el complejo del poro de la mitocondria, que participa en la regulación del Ca2+ de la matriz, pH, potencial de membrana mitocondrial, etc. La proteína Bax se une a un componente de este complejo induciendo la apertura del poro con la consiguiente rotura del potencial de membrana mitocondrial y la liberación de moléculas pro-apoptóticas como el citocromo C (Marzo et al. 1998; Narita et al. 1998; Susin et al. 1999). Bcl-2 interactúa con Bax a nivel de la mitocondria modulando la inactivación de Bax a través de la heterodimerización. Cuando la proteína Bcl-2 está en exceso, forma homodímeros Bcl-2/Bcl-2 y heterodímeros Bcl-2/Bax, quedando la célula protegida de la apoptosis. Pero cuando Bax está en exceso, dominan los homodímeros Bax/Bax y la célula es susceptible de apoptosis (Korsmeyer et al. 1993; Petros et al. 2004). INTRODUCCIÓN 66 Figura 12. Bcl-2 y Bax, regulados por p53, controlan el destino final de la célula. La formación de homodímeros de Bcl-2 inhibe la apoptosis, mientras que la formación de homodímeros de Bax, propiciado por p53, induce la apoptosis celular. El equilibrio entre estas tres proteínas regula si la célula vive o muere. Figura 13. Principales factores que influencian el ciclo celular y la apoptosis. (Disponible en: www.biocancer.com) INTRODUCCIÓN 67 Bax, Bcl-2 y p53 son las principales proteínas involucradas en la apoptosis. No obstante, recientemente se ha descrito el papel que estas moléculas pueden tener en los procesos de reparación del ADN. Aparte de Bcl-2, Ku70 es capaz de secuestrar a Bax desde la mitocondria, provocando una regulación negativa de la apoptosis. El mecanismo a través del cual se produce este fenómeno es el de ubiquitinación (Chang et al. 2008). Ku70 es una proteína fundamental en los procesos de reparación no homóloga del ADN, y se la considera además un relevante supresor de Bax (Sawada et al. 2003). Bcl-2 por su parte es capaz de inhibir los procesos de reparación homóloga reduciendo la actividad de la proteína Ku (Ku70/80). Bcl-2 desorganiza de manera directa el complejo Ku/DNA-Pkcs, tanto in vivo como in vitro. Así, la supresión de la vía de reparación no homóloga al ADN por Bcl-2 conduce a la acumulación de daño en el ADN, inestabilidad genómica, y aumento de la probabilidad de desarrollo de procesos carcinogénicos (Wang et al. 2008). El papel de Ku70/80 en la regulación de la reparación del ADN tiene una trascendencia terapéutica, ya que se ha observado que su inhibición condiciona una peor respuesta a la radioterapia, existiendo además una íntima relación con otras proteínas desarrolladas en esta Tesis Doctoral como IGF-1R y MVP (Lloret et al. 2009; Henriquez-Hernandez et al. 2011). INTRODUCCIÓN 69 4.4. Proliferación celular (Ki67) El cáncer es una proliferación descontrolada de células con anomalías en su material genético. La proliferación celular está sometida, en primer término, a la presencia de factores externos como son los factores de crecimiento y las interacciones con otras células y nutrientes. Los factores de crecimiento son generalmente proteínas que actúan mediante uniones de alta afinidad a receptores, cuya función principal es la del control externo del ciclo celular, mediante el abandono de la quiescencia celular (G0) y la entrada en la fase G1 del ciclo celular, pudiendo realizar su función como inductores (IGF-1) o supresores (TGFβ) de la proliferación celular, promoviendo la diferenciación celular, la movilidad y la adhesión celular entre otros fenómenos. Estos factores de crecimiento actúan sobre la célula a través de mecanismos endocrinos, paracrinos o autocrinos. Cuando el factor de crecimiento se une a su receptor, se inicia una cascada de procesos bioquímicos, denominados sistemas de transducción de señales, que permiten la llegada de esta señal proliferativa hasta el núcleo. Allí, por inducción de la expresión de diversos mediadores, incluidas las ciclinas (especialmente la ciclina D), se favorece la proliferación celular. Sin embargo, cuando la señal proliferativa llega al núcleo, la división celular queda regulada por los llamados puntos de control del ciclo celular o check-points, que impiden la progresión de células dañadas y mantienen la homeostasis celular (Ivanchuk et al. 2004). El ciclo celular se divide en fases: La fase S y la fase M son fases que corresponden a la síntesis de ADN y mitosis. Ambas fases están separadas por la fase G1 (fase de crecimiento plástico de la célula) y G2 (fase de preparación para la división celular). Existe una gran variedad de proteínas que controlan y coordinan el ciclo celular. Las principales son las quinasas dependientes de ciclina (CDKs). CAPÍTULO II 77 OBJETIVOS 1. Evaluar la prevalencia del carcinoma escamoso de cavidad oral en los Servicios de Cirugía Maxilofacial y Oncología Radioterápica del Hospital Universitario de Gran Canaria Dr. Negrín. 2. Evaluar los principales factores de riesgo y factores pronósticos clínicos en los pacientes con carcinoma epidermoide de la cavidad oral. 3. Determinar la expresión de IGF-1R en este tipo de tumores, explorar su relación con factores pronósticos clínicos y patológicos y su papel en la predicción del resultado clínico. 4. Estudiar la expresión proteica de MVP en estos tumores, la relación de esta proteína con otros factores pronósticos clínicos y moleculares, y su papel como factor predictivo de supervivencia en estos pacientes, y explorar la relación con IGF-1R y su papel combinado en la predicción de la respuesta y la supervivencia. 5. Investigar el papel de BCL-2 y la proliferación celular en el pronóstico clínico de estos pacientes, la asociación entre todos los marcadores biológicos, su relación con factores clínicos y patológicos y su papel predictivo en este tipo de pacientes. CAPÍTULO III REVISIÓN DE LA SITUACIÓN DEL CÁNCER DE CAVIDAD ORAL EN LOS SERVICIOS DE CIRUGÍA MAXILOFACIAL Y ONCOLOGÍA RADIOTERÁPICA DEL HOSPITAL DR. NEGRÍN (1989-2005) CAPÍTULO III 81 ANÁLISIS DESCRIPTIVO DE LA SERIE DE PACIENTES Durante el periodo comprendido entre julio de 1989 y abril de 2005, se recogieron todos los casos de cáncer de cavidad oral en el Servicio de Cirugía Maxilofacial del Hospital Universitario de Gran Canaria, Dr. Negrín. Del estudio, se excluyeron aquellos casos diagnosticados en otra Institución o de los que no se dispusiera de tejido en el Servicio de Anatomía Patológica de nuestro Hospital. El mayor número de casos se registró en los años 1995, 1998 y 2000; con 15, 14 y 12 pacientes reclutados, respectivamente (Figura 1). Los años 1989, 1991 y 2005 fueron los que menos casos registraron, aunque los años 1989 y 2005 no se computaron al completo (de julio a diciembre en 1989, y de enero a abril en 2005). Figura 1. Número de pacientes reclutados en el estudio, por años. Un total de 131 casos fueron incluidos en el estudio durante 17 años. Es difícil comparar la incidencia registrada en nuestro Hospital con la reportada a otros niveles, ya que los registros estadísticos agrupan al carcinoma de cavidad oral y de faringe. Del total de casos, 116 eran hombres (88.5%) y 15 eran mujeres (Tabla 1), estableciéndose una razón de sexo de 7.73 veces más frecuente entre los hombres. Este dato está de acuerdo con lo reportado en líneas generales en nuestro país (Adami et al. 2008). De hecho, España es uno de los países con mayores diferencias entre sexo para este tipo de tumores, siendo 7 veces más frecuente entre los hombres que entre las mujeres. En el resto de países, esa diferencia está en torno a 2; y CAPÍTULO III 82 aquellos países como EEUU, que reportaban amplias diferencias, han visto recortadas las mismas en los últimos 20 años (Adami et al. 2008). La edad media de presentación de la enfermedad fue de 58.1 años (mediana, 59). Es bastante raro observar casos en pacientes menores de 35 años. En nuestra serie de pacientes, 3 tenían una edad menor o igual a esa. De ellos, dos eran mujeres (edad, 23 y 31 años) y uno solo era hombre (edad, 35 años). Este número es ligeramente superior a lo reportado por otros autores para nuestro país, donde las mujeres jóvenes presentaban mayores incidencias que los hombres en el mismo rango de edad (Adami et al. 2008). Entre los hombres, la edad media de presentación de la enfermedad fue de 58.3 años; entre las mujeres, esa edad media fue de 56.7 años, no siendo esa diferencia de edad estadísticamente significativa. Los tumores de tipo epitelial son dependientes de la edad, esto es, a mayor edad, mayor incidencia. La distribución por edad en nuestra serie no cumple estrictamente con lo reportado por otros autores (Figura 2), que observan un aumento de la incidencia exponencial conforme aumenta la edad de los pacientes (Adami et al. 2008). No obstante, este perfil de distribución, con un aumento hasta los 60 años seguido de un decrecimiento de la incidencia a partir de los 65, ha sido observado en algunas poblaciones tales como Bas-Rhin (Francia). En general, existen importantes diferencias de distribución por edad según la población en estudio (Adami et al. 2008). Figura 2. Número de pacientes reclutados en el estudio según grupo de edad en la serie global (♦), entre los hombres (■) y entre las mujeres (▲). CAPÍTULO III 83 Tabla 1. Análisis descriptivo de las variables demográficas de la serie de pacientes incluidos en esta Tesis Doctoral Variable N (%) Media ± SD Mediana (Rango) Edad 131 100 58.1 ± 10.41 59 (23-97) Sexo Hombre 116 88.5 Mujer 15 11.5 Hábito tabáquico Fumador 94 71.8 No fumador 16 12.2 Ex-fumador 21 16.0 Hábito tabáquico absoluto Fumador 115 87.8 No fumador 16 12.2 Hábito alcohólico Bebedor 74 56.5 No bebedor 35 26.7 Ex-bebedor 21 16.0 Hábito alcohólico absoluto Bebedor 95 72.5 No bebedor 35 26.7 Únicamente el 12.2% de la serie (n = 16) declaró no haber fumado a lo largo de su vida. En el momento del diagnóstico, el 71.8% de los pacientes (n = 94) fumaba. El hábito tabáquico se mostró significativamente diferente en función del sexo (Figura 3). Figura 3. Distribución del hábito tabáquico entre hombres (■) y mujeres (■). CAPÍTULO III 84 Así, el 26.7 de las mujeres eran fumadores en el momento del diagnóstico (n = 4), frente al 77.6 % de hombres fumadores al diagnóstico (n = 90) (P < 0.001). El tabaco es el principal factor de riesgo para el cáncer de cavidad oral. Observamos que la edad media al diagnóstico entre los fumadores era de 56.74 años, mientras que entre los no fumadores, la edad media fue de 59.69, siendo esta diferencia significativa (P = 0.020). Respecto al consumo de alcohol, el 72.5% (n = 95) de los pacientes declararon hábito alcohólico a lo largo de su vida, siendo activos al momento del diagnóstico el 56.5% de los individuos (n = 74) (Tabla 1). También observamos diferencias significativas respecto al sexo (P < 0.001), destacando el hecho de que ninguna mujer reportó hábito alcohólico alguno. Esto es, todas las mujeres de la serie son no bebedoras. Es de destacar el hecho de que 66 pacientes (todos hombres), lo que supone el 50.4% de la serie global y el 57.4% de los pacientes hombre, eran fumadores y bebedores activos al momento del diagnóstico. Estos datos están de acuerdo con otros previamente publicados que insisten en el efecto adverso combinado de los hábitos alcohólico y tabáquico sobre los tumores de cavidad oral (Franceschi et al. 1990). La localización tumoral más frecuente fue el borde lingual (63.6%), seguido del suelo de la boca (30.5%) y base lingual (6.15). La mayor parte de los pacientes fueron diagnosticados con lesiones de tipo ulcerada (56.5%, n = 74) (Tabla 2). Este tipo de lesiones, generalmente persistentes y resistentes a la curación, son el principal motivo de consulta de los pacientes, hecho que justifica la alta proporción de este tipo de lesiones en nuestra cohorte de enfermos (Rogers et al. 2011). Solo el 10.7% de los pacientes presentaban lesiones de tipo bilateral, dato que coincide con lo reportado por otros autores (Kolomvos et al. 2010). El 71.7% de los pacientes (n = 94) era T1-T2 clínico, N0 (71%, n = 93). Ningún paciente de la serie presentaba metástasis al diagnóstico. El estadio clínico mayoritario fue el II (Tabla 2). CAPÍTULO III 85 Tabla 2. Análisis descriptivo de las variables clínicas Variable N (%) Media ± SD Mediana (Rango) Tipo de lesión Vegetante 18 13.7 Ulcerada 74 56.5 Ulcerovegetante 30 22.9 Otros (eritematosa, indurada…) 9 6.9 Lado Bilateral 14 10.7 Derecho 55 42.0 Izquierdo 62 47.3 cT T1 24 18.3 T2 70 53.4 T3 20 15.3 T4 17 13.0 cN N0 93 71.0 N1 21 16.0 N2 16 12.2 N3 1 0.8 cM M0 131 100 Estadio clínico I 17 13.0 II 56 42.7 III 32 24.4 IV 26 19.8 Segundo tumor Si 32 24.4 No 99 75.6 Hemoglobina 124 94.6 17.4 ± 16.2 14.9 (10.3-153.0) Hematocrito 124 94.6 46.1 ± 34.6 43.7 (13.3-422.0) Plaquetas 123 93.9 244715 ± 82247 233000 (68000-580000) CAPÍTULO III 92 Figura 7. Curva de Kaplan-Meier para la supervivencia libre de enfermedad (A) y libre de metástasis (B) entre los pacientes sin afectación nodular (N0) (—) y con afectación nodular (— ). P = 0.004 y P < 0.0001 para A y B respectivamente. La comparación entre grupos se ha realizado mediante el test de Log-Rank. Figura 8. Curva de Kaplan-Meier para la supervivencia causa-específica entre los pacientes sin afectación nodular (N0) (—) y con afectación nodular (—), P < 0.0001. La comparación entre grupos se ha realizado mediante el test de Log-Rank. Se exploró la relación entre la afectación nodular y el grado tumoral, hecho reportado recientemente en pacientes con tumor de cavidad oral (Larsen et al. 2009). Se observó que si se segmentaba a la población en función de la afectación ganglionar, esto es N0 vs. N+, el grado histológico era un factor predictivo de supervivencia únicamente entre los pacientes N+ (Figura 9). La significación estadística se perdía entre los pacientes N0. Este hallazgo se muestra de acuerdo con lo reportado recientemente CAPÍTULO III 93 por otros autores (Larsen et al. 2009), e incide en la importancia del correcto estudio anatomopatológico a la hora de establecer los tratamientos y aventurar un pronóstico. El estadio tumoral no se mostró como un factor pronóstico en relación a la afectación ganglionar (P > 0,05 en cualquier caso). Figura 9. Curva de Kaplan-Meier para la supervivencia causa-específica entre los pacientes con afectación nodular (N+). (—), grados I-II; (—), grado III. P = 0.022. La comparación entre grupos se ha realizado mediante el test de Log-Rank. La radioterapia adyuvante o complementaria es el tratamiento aplicado tras la cirugía cuya finalidad fundamental es mejorar el control local de la enfermedad y disminuir el riesgo de recidiva local. Su utilidad se basa en la erradicación de restos tumorales subclínicos en la zona inicial tras el tratamiento previo con cirugía. En la serie estudiada, este tratamiento se administró a todos aquellos pacientes en estadio III-IV, así como a aquellos en estadio I-II con afectación de márgenes quirúrgicos tras la cirugía. La radioterapia no fue un factor pronóstico de supervivencia en ningún caso en la serie completa. Cuando se segmentó a la población en función del estadio, se observó que el tratamiento radioterápico era un factor de buen pronóstico relacionado con la supervivencia libre de recidiva local y la supervivencia libre de enfermedad, únicamente entre los pacientes con estadios III-IV, que son aquellos que mayoritariamente recibieron radioterapia (Figura 10). Esto es, en ese subgrupo de pacientes con estadios avanzados de la enfermedad, la administración de radioterapia aumentaba la supervivencia. Solo seis pacientes con estadios avanzados de la enfermedad dejaron de recibir tratamiento radioterápico. A pesar del escaso tamaño muestral, este resultado pone de manifiesto la necesidad de la radioterapia en aquellos pacientes con estadios tumorales avanzados. Cuando se segmentó a la CAPÍTULO III 94 población en función de la afección de los márgenes quirúrgicos, se perdió toda significación estadística (dato no mostrado). Figura 7. Curva de Kaplan-Meier para la supervivencia libre de enfermedad (A) y libre de enfermedad (B) entre los pacientes en estadios III-IV. (—), no administración de radioterapia y con afectación nodular (—). P = 0.004 y P < 0.0001 para A y B respectivamente. La comparación entre grupos se ha realizado mediante el test de Log-Rank. CAPÍTULO IV La expresión de IGF-1R predice el resultado clínico en pacientes con carcinoma de células escamosas de cavidad oral localmente avanzado CAPÍTULO IV 97 RESUMEN Los objetivos de este estudio fueron, determinar la expresión de IGF-1R en pacientes con carcinoma de células escamosas de cavidad oral, explorar su relación con factores pronósticos clínicos y patológicos, así como su papel en la predicción del resultado clínico. Se incluyeron en este estudio ciento treinta y un pacientes con carcinoma de células escamosas de cavidad oral, durante el periodo comprendido entre julio de 1989 y abril de 2005, cerrándose el seguimiento de los mismos en mayo de 2010. La media de seguimiento para los supervivientes fue de 110.26 ± 47.42 meses. Los pacientes se estadiaron siguiendo la clasificación TNM. Los pacientes en estadios I y II fueron tratados con cirugía. Los pacientes en estadios III y IV además recibieron radioterapia postoperatoria (dosis media 62.13 ± 7.74 Gy en fracciones de 1.8 – 2 Gy cada día). La expresión de IGF-1R fue estudiada mediante inmunohistoquímica de tejidos tumorales embebidos en parafina. IGF-1R estaba expresado en 101 pacientes (77.1%). La expresión de IGF-1R se relacionó con el grado tumoral (P = 0,012). El estadio tumoral fue el factor pronóstico de supervivencia más importante. La expresión tumoral baja (negativa o ligeramente positiva) de IGF-1R se correlacionó con mejor supervivencia libre de enfermedad local (P = 0.016), supervivencia libre de enfermedad (P = 0.029) y supervivencia causaespecífica (P = 0.009) en pacientes con estadios III-IV de la enfermedad. La baja expresión de IGF-1R se relacionó con un mejor control a largo plazo en pacientes con carcinoma oral localmente avanzado. CAPÍTULO IV 99 SUMMARY To assess the expression of IGF-1R in oral cavity squamous cell carcinoma patients, to explore its relation with clinical and pathologic prognostic factors and its role in predicting clinical outcome. One hundred and thirty-one consecutive patients suffering from oral cavity squamous cell carcinoma were included in this study from July 1989 to April 2005. Follow-up was closed in May 2010. The mean follow-up for survivors was 110.26 ± 47.42 months. Patients were staged following the TNM classification. Patients in tumour stages I and II were referred to surgery. Patients in stages III–IV were referred to postoperative radiotherapy. Radiation therapy was administered up to a mean dose of 62.13 ± 7.74 Gy in 1.8–2 Gy fractions. IGF-1R expression was studied by immunohistochemistry in paraffin-embedded tumour tissue. IGF-1R was expressed in 101 patients (77.1%). IGF-1R expression was related to tumour grade (P = 0.012). Tumour stage was the most important prognostic factor for survival. Low (negative and fairly) IGF-1R tumour expression was correlated to better long-term Local Disease Free Survival (P = 0.016), Disease-Free Survival (P = 0.029), and Survival (P = 0.009) in patients achieving tumour stages III–IV. Low IGF-1R expression was related to better long-term control in patients suffering locally advanced oral carcinoma. CAPÍTULO IV 101 INTRODUCCIÓN En 2008 se registraron 913.000 nuevos casos de carcinoma de células escamosas de cavidad oral (OCSCC) en todo el mundo, y 261.000 muertes relacionadas con esta enfermedad (Ferlay et al. 2010). El carcinoma oral se trata comúnmente con cirugía o radioterapia como tratamientos locales. Aunque la supervivencia a largo plazo ha mejorado con los avances en las terapias, los resultados en los casos localmente avanzados siguen siendo insuficientementes (Harrison et al. 1994). La determinación del papel que determinados factores biológicos tengan en la respuesta al tratamiento deben ser estudiados, con el fin de identificar nuevos factores pronósticos que contribuyan a elegir el mejor tratamiento para cada paciente individualmente. El receptor del factor de crecimiento dependiente de insulina (IGF-1R) es un receptor transmembrana de tipo tirosin-kinasa, estructural y funcinalmente relacionado con el receptor de insulina, y activado por los ligandos IGF-1 e IGF-2 (Ullrich et al. 1986). El IGF-1R está comúnmente sobreexpresado en bastantes tipos de tumores (Larsson et al. 2005). Se han reportado nuevas rutas de señalización desencadenadas por la activación de IGF-1R que afectan a la proliferación, adhesión, migración y muerte de células cancerígenas, funciones críticas para la supervivencia celular y la metástasis (LeRoith et al. 2003). La activación de IGF-1R lleva a la activación de las rutas de señalización ras, raf y MAPK, dando como resultado un incremento de la proliferación celular, así como de la ruta PI3K que, en definitiva, supone la prevención de la apoptosis (Baserga et al. 2003). Se ha demostrado que la expresión de IGF-1R juega un papel importante en varios tipos tumorales, pero el papel de la expresión de IGF-1R con respecto al control tumoral, la supervivencia y la respuesta a las terapias no está claro. La activación de IGF-1R se ha asociado con mayor radioresistencia mediada por el incremento de la proliferación celular y la prevención de la apoptosis (Turner et al. 1997; Yu et al. 2003). Por otro lado, su inhibición por el gen Ataxia-Telangiectasia Mutado (ATM), relacionado con la ruta de PI3K, se ha asociado a una mayor radiosensibilidad (Peretz et al. 2001). IGF-1R puede resultar inhibido a través de la señalización de la kinasa p38, induciendo así radiosensibilidad a través de ku86 nuclear, siendo este proceso independiente de la ruta PI3K (Cosaceanu et al. 2007). A nivel clínico, hay varios estudios que han reportado una asociación entre la expresión proteica de IGF-1R y la respuesta clínica y el pronóstico (Dziadziuszko et al. CAPÍTULO IV 108 La activación de IGF-1R desencadena una cascada de reacciones que envuelve diferentes rutas de transducción: Ras, Raf, proteína kinasa activada por mitógenos (MAPK) y la fosfoinositol-3-kinasa (PI3K)/AKT/BAD (Bcl-xL/BCL-2) (LeRoith et al. 2003). La expresión de IGF-1R y su activación se han vinculado a la progresión de la enfermedad, al incremento de la resistencia a radioterapia y a un peor pronóstico (Rocha et al. 1997; Turner et al. 1997). Por otra parte, la adición de oligómeros antisentido para mRNA de IGF-1R, invierte el fenotipo radioresistente en los fibroblastos (Turner et al. 1997). Recientemente, se ha especulado acerca de la relación del gen IGF-1R como diana de la ruta dependiente de Ataxia Telangiectasia Mutada (ATM), la cual está involucrada en la respuesta a la radioterapia (Peretz et al. 2001). El gen IGF-1R parece ser una de las últimas dianas de la ruta de respuesta a daños en el ADN, mediada por ATM. Así, la desregulación de la expresión del gen IGF-1R, tras un evento de radiación ionizante, puede estar relacionada con mayor inestabilidad genómica y una mayor capacidad transformante de las células tumorales (Shahrabani-Gargir et al. 2004). IGF-1R y el receptor para el factor de crecimiento epidermal (EGFR) se asocian comúnmente con carcinogénesis, progresión y pronóstico tumorales (Ludovini et al. 2009). Se ha demostrado que los entrecruzamientos entre estos receptores y sus rutas de señalización más comunes juegan un papel fundamental en algunas de las respuestas celulares a los diferentes ligandos (Gilmore et al. 2002). Dichos entrecruzamientos pueden ocurrir entre los receptores para EGF e IGF-1, los cuales son en ambos casos receptores tirosin-kinasa, y producirse así una resistencia a terapias basadas en inhibidores de tirosin-kinasa, ya que las células podrían encontrar rutas alternativas para la estimulación de proteínas antiapoptóticas, como la proteína AKT. Nuestra serie estaba compuesta por pacientes con OCSCC tratados con cirugía y radioterapia. No se emplearon ni quimioterapia ni otras terapias neoadyuvantes en ningún caso. La combinación de radioterapia e inhibición de EGFR ha demostrado recientemente un beneficio importante para la supervivencia durante la fase III del ensayo clínico en pacientes con cáncer de cabeza y cuello (Bonner et al. 2006). Por otro lado, la interrupción de la señal de IGF-1R parece ser terapéuticamente útil en combinación con la radioterapia en experimentos in vitro (Allen et al. 2007). Además, los fragmentos de siRNA específicos para mRNA de IGF-1R humano son capaces de aumentar la radiosensibilidad en cáncer de colon (Yavari et al. 2010). De este modo, CAPÍTULO IV 109 aquellos fármacos que potencialmente bloqueen a IGF-1R podrían inhibir las rutas anti-apoptóticas y proliferativas desencadenadas por su activación, conduciendo al aumento de la muerte celular por radiación (Chinnaiyan et al. 2006). La sobreexpresión tumoral de IGF-1R no sólo puede utilizarse como indicador de peor resultado clínico, sino que además, los pacientes con tumores que sobreexpresen IGF-1R pueden ser seleccionados para tratamientos futuros que mejoren el potencial clínico de dicha terapia (Tanno et al. 2006). En resumen, los resultados presentes permiten definir un subgrupo de pacientes con niveles bajos de IGF-1R los cuales, incluso presentando un estadio avanzado de la enfermedad, muestran buenas figuras de supervivencia. Estos resultados preliminares necesitan ser confirmados mediantes ensayos clínicos más grandes. CAPÍTULO V La expresión de IGF-1R y MVP se encuentran relacionadas en la predicción del pronóstico clínico de los pacientes con carcinoma escamoso de cavidad oral CAPÍTULO V 113 RESUMEN Objetivos. Evaluar la expresión de MVP en pacientes con carcinoma de células escamosas en la cavidad oral, su relación con otros factores pronósticos clínicos y patológicos y su papel como factor predictivo clínico. Además, se estudió su relación con la expresión de IGF-1R en esta cohorte de pacientes. Pacientes y Métodos. Se incluyó en la presente fase del trabajo a 131 pacientes afectados de carcinoma de células escamosas de la cavidad oral, incluidos en este estudio desde julio de 1989 a abril de 2005. El seguimiento de los pacientes fue cerrado en julio de 2011. La media del seguimiento para los supervivientes fue de 123 ± 40.36 meses. Los pacientes fueron estadiados siguiendo la clasificación TNM. Aquellos pacientes con estadio de tumor I y II fueron remitidos a cirugía. Los pacientes con estadio IIIIV fueron tratados con radioterapia postoperatoria. La radioterapia fue administrada a una dosis de 62.13 ± 7.74 Gy en fracciones de 1.8-2 Gy/día. La expresión de MVP fue estudiada mediante inmunohistoquímica en tejidos tumorales embebidos en parafina. Resultados. MVP fue expresada en 112 pacientes (85.5%) y no se encontró relación significativa alguna con las variables clínico-patológicas. La sobreexpresión de MVP apareció asociada a la sobreexpresión de IGF-1R (P = 0.014). Como se ha expuesto previamente, el estadio tumoral de la enfermedad fue el factor pronóstico más importante relacionado con la supervivencia. Los tumores en estadios avanzados de la enfermedad (III-IV) que además presentaban sobreexpresión de MVP e IGF-1R, tenían una menor supervivencia libre de enfermedad (P = 0.008, Exp (B) = 2.730, CI 95% (1.302-5.724)) y supervivencia causa-específica (P = 0.014, Exp (B) = 2.570, CI 95% (1.215-5.437)), en análisis multivariante. Conclusión. La expresión de MVP e IGF-1R parece estar relacionada en este tipo de tumores confiriendo una menor supervivencia a largo plazo en pacientes que sufren estadios avanzados de la enfermedad. CAPÍTULO V 115 SUMMARY Oral carcinoma is commonly treated by surgery or radiotherapy. However, outcomes in locally advanced cases remain suboptimal and there is a clear need for new prognostic indicators. Major vault protein (MVP) has been classically associated to multidrug resistance, although its overexpression has been associated to resistance to radiotherapy. At the clinical level, the role of MVP in predicting response to radiotherapy was recently addressed. The aim of this study was to assess the expression of MVP in oral cavity squamous cell carcinoma patients, its relation with clinical and pathologic prognostic factors and its role in predicting clinical outcome. One hundred and thirty one consecutive were included in this study, and followed during more than 20 years. MVP overexpression conferred reduced long-term survival in patients suffering from advanced stages of the disease, highlighting this protein as a predictive factor for survival in this tumour type. CAPÍTULO V 117 INTRODUCCIÓN El cáncer de cavidad oral se trata principalmente mediante cirugía y radioterapia. En las últimas décadas se ha conseguido mejorar la supervivencia en este tipo de pacientes. No obstante, el control local sigue siendo, en ocasiones difícil. Por ello, se buscan factores pronósticos y marcadores tumorales que ayuden a prever las recaídas, con la intención de mejorar los tratamientos y prestar más atención asistencial a aquellos pacientes de mayor riesgo. Las partículas vaults son ribonucleoproteínas en forma de barril, compuestas principalmente por tres proteínas diferentes, tal y como se ha detallado previamente en esta Tesis Doctoral: la proteína vault mayor o major vault proteína (MVP), la vault poly(ADP-ribose) polimerasa (VPARP) y la proteína-1 asociada a telomerasa o telomerase-associated proteína-1 (TEP1). Además, el complejo se completa con la presencia de pequeñas partículas de ARN no traducible (vRNA) (Kickhoefer et al. 1999a). Clásicamente, la función de vaults ha sido asociada a los fenómenos de resistencia a drogas (Mossink et al. 2003). No obstante, debido a las complejas interacciones que vaults tiene con otras importantes moléculas efectoras (PTEN, Erk o EGF), se le han atribuido numerosas funciones más, algunas de ellas determinantes en la fisiología celular. La sobreexpresión de MVP parece asociarse a algunos fenotipos malignos de algunos tipos tumorales, lo que sugiere que esta proteína podría ejercer alguna función en el desarrollo y la progresión de los tumores (Steiner et al. 2006a). La expresión de MVP se ha visto también asociada a fenómenos de resistencia a la radioterapia (Fichtner et al. 2003), probablemente debido a su papel como inhibidor de la apoptosis a través de la inhibición del eje COP-1/p53 (Yi et al. 2005). Diferentes agentes dañinos para el ADN, entre ellos la luz ultravioleta, induce la transcripción de MVP y la sobreexpresión de esta proteína (Shimamoto et al. 2006). Estos hallazgos indican que vaults podría ejercer algún tipo de función en relación a los fenómenos de reparación del daño al ADN, lo que coincidiría con otras publicaciones que reportan que aquellos ratones deficientes en VPARP y TEP-1 presentan un mayor riesgo de cáncer de colon carninógeno-inducido (RavalFernandes et al. 2005). A nivel clínico, el papel de MVP en la predicción de la respuesta a la radioterapia ha sido recientemente reportado (Silva et al. 2007). En el estudio de Silva y col., la sobreexpresión de MVP se asociaba a un peor pronóstico en 78 pacientes con cáncer de orofaringe tratados con radioterapia (Silva et al. 2007). El efecto de la sobreexpresión de MVP era todavía superior en el subgrupo de pacientes con carcinoma de lengua, donde MVP era un importante factor pronóstico de CAPÍTULO V 124 locales reportados en la bibliografía para aquellos pacientes en estadios avanzados de la enfermedad (III-IV) está en torno al 40%, dato similar al mostrado en nuestra serie. La expresión de MVP no fue un factor pronóstico de supervivencia en la serie completa. No obstante, cuando los pacientes fueron segregados según su estadio tumoral (I-II vs. III-IV), la expresión de MVP fue un factor predictivo de LDFS, DFS y CSS. MVP podría tener algún tipo de papel favoreciendo la inestabilidad genética mediante la reducción de los mecanismos de reparación del daño al ADN, a través de la inhibición de la expresión de Ku70/80 y por tanto de los mecanismos de reparación no homóloga al ADN (Lloret et al. 2009). El principal daño producido por la radiación ionizante al ADN es la rotura doble de cadena, que es reparada esencialmente por mecanismos de reparación no homóloga (NHEJ). Ku70/80 son genes clave en la reparación NHEJ de las roturas doble de cadena de ADN radio-inducidas. Si vaults se sobreexpresa, los mecanismos de NHEJ podrían ser inhibidos mediante diferentes formas, lo cual produciría un aumento de la inestabilidad genética ya sea por la ineficacia de NHEJ o por la participación de mecanismos de reparación homóloga, inadecuados para reparar daños de este tipo. PARP-1, parte del complejo vault, promueve la reparación homóloga sobre la NHEJ, mediante la inhibición de la expresión de Ku70/80. Estos eventos se asociarían con la decisión de las células dañadas de sobrevivir y proliferar, favoreciendo así la progresión tumoral y reduciendo la respuesta del tumor a los tratamientos oncológicos mediante la aparición de células con fenotipos resistentes. Los resultados presentados aquí están de acuerdo con los reportados previamente por Silva y cols., donde la sobreexpresión de MVP aparecía como un importante factor predictivo de supervivencia en 78 pacientes con carcinoma de orofaringe tratados con radioterapia primaria e intención curativa (Silva et al. 2007). Los presentes resultados son los primeros que evidencian una relación directa entre la expresión de IGF-1R y MVP a nivel clínico en este tipo de tumores. No obstante, esta asociación había sido observada en pacientes con cáncer de cérvix (Lloret et al. 2008), lo que parece indicar que ambas oncoproteínas necesitan estar sobreexpresadas para conferir radio-resistencia y condicionar el pronóstico y la supervivencia. Se ha sugerido que tanto IGF-1R como MVP incrementan la proliferación celular mediante la activación de Src, PTEN y ERK; e inhiben la apoptosis mediante la modulación del eje COP-1/p53, lo que resulta en un incremento de la resistencia tumoral a los tratamientos oncológicos. Por su parte, la expresión de MVP se ha visto asociada con otras moléculas también relacionadas con la proliferación y la apoptosis (Lloret et al. 2009). Así, la resistencia a la radioterapia derivada de la sobreexpresión de MVP a CAPÍTULO V 125 nivel clínico podría ser debida a ese aumento de la proliferación e inhibición de la apoptosis, así como por la regulación de los procesos de reparación del daño al ADN, fundamentalmente a través de la inhibición de Ku70/80 (Lloret et al. 2009). IGF-1R colaboraría con MVP en la prevención de la apoptosis a través de la inducción de BCL-2, así como, en menor medida, la inhibición de BAX (Lloret et al. 2009). Esto afectaría a los mecanismos de reparación no homóloga mediante la regulación de la vía AKT/p38MAPK, principalmente a través de la modificación de la expresión de Ku (Cosaceanu et al. 2007). La activación de IGF-1R promueve la puesta en marcha de una serie de vías de señalización tales como ras, raf, MAPK o PI3K/AKT/BAD. La sobreexpresión de IGF1R se ha asociado a fenómenos de progresión de la enfermedad, incremento de la resistencia a la radioterapia y peor pronóstico (Rocha et al. 1997; Turner et al. 1997; Lloret et al. 2007). Además, IGF-1R parece ser importante en relación a los fenómenos de reparación del daño al ADN mediados por ATM (Peretz et al. 2001). Así, la desregulación de la expresión de IGF-1R tras la radioterapia podría estar asociada con el incremento de la inestabilidad genética y el aumento de la capacidad transformadora de las células tumorales (Shahrabani-Gargir et al. 2004). En conclusión, la expresión de MVP e IGF-1R está relacionada en tumores de células escamosas de cavidad oral, y ambas proteínas parecen conferir menor supervivencia y peor pronóstico entre aquellos pacientes con estadios más avanzados de la enfermedad. Según esto, la expresión combinada de ambas oncoproteínas podría ser relevante como factor predictivo en este tipo de pacientes. No obstante, se deben diseñar nuevos estudios que incluyan a PTEN, p53, BCL-2 marcadores de proliferación (como Ki67) o PI3K, con el objeto de definir más concretamente el papel de estas oncoproteínas y entender los mecanismos moleculares que llevan a estos pacientes a tener un peor pronóstico. Además, estos resultados deben ser confirmados en series de pacientes más grandes. CAPÍTULO VI Papel de la apoptosis y la proliferación celular en relación a la expresión de IGF-1R y MVP CAPÍTULO VI 129 RESUMEN Una vez establecido el papel predictivo de la expresión de las oncoproteínas IGF-1R y MVP, se investigó la influencia de la apoptosis y la proliferación celular en el pronóstico clínico de pacientes con carcinoma de cavidad oral tratados con radioterapia post-operatoria. Se investigó la asociación entre todos los marcadores biológicos, su relación con factores clínicos y patológicos y su papel predictivo en este tipo de pacientes. Ciento treinta y un pacientes con carcinoma epidermoide de la cavidad oral fueron incluidos en el estudio tal y como se ha descrito previamente. Los pacientes en estadios I y II de la enfermedad fueron tratados mediante cirugía. Aquellos pacientes en estadio III-IV se trataron con cirugía y radioterapia postoperatoria tal y como se ha descrito en capítulos anteriores. La dosis de radioterapia administrada fue de 62.13 ± 7.74 Gy en fracciones de 1.8-2 Gy al día. La expresión de las oncoproteínas se estudió mediante inmunohistoquímica en tejidos embebidos en parafina. El estadio tumoral fue el factor pronóstico más importante para la supervivencia. Aquellos tumores con sobreexpresión de IGF-1R y MVP tenían una menor tasa de supervivencia causa-específica en aquellos pacientes con estadios avanzados de la enfermedad (III-IV), tanto en análisis univariante como multivariante. Entre aquellos pacientes en estadio III-IV que además mostraron expresión negativa de BCL-2, todos aquellos que además sobreexpresaban IGF-1R/MVP murieron por la enfermedad durante los primeros 5 años de seguimiento. Estos resultados muestran un papel relevante de la apoptosis y la proliferación celular en relación a la expresión de IGF-1R y MVP en tumores de cavidad oral, lo que hace pensar que estas oncoproteínas están íntimamente relacionadas y condicionan el pronóstico de la enfermedad. CAPÍTULO VI 131 SUMMARY Objectives. To assess the expression of MVP, IGF-1R, BCL-2 and Ki67 in oral carcinoma patients treated with postoperative radiotherapy, the association established among the biological markers, the relation with clinical and pathological prognostic factors, and its role in predicting clinical outcome. Patients and Methods. One hundred and thirty one consecutive patients suffering from oral cavity squamous cell carcinoma were included in this study from July 1989 to April 2005. Follow-up was closed in July 2011. The mean follow-up for survivors was 123.11 ± 40.36 months. Patients in tumour stages I and II were referred to surgery. Patients in stage III-IV were referred to surgery and postoperative radiotherapy. Radiation therapy was administered up to a mean dose of 62.13 ± 7.74 Gy in 1.8–2 Gy fractions. Oncoproteins expression was studied by immunohistochemistry in paraffin-embedded tumour tissue. Results. Tumour stage was the most important prognostic factor for survival. Tumours showing high IGF-1R and MVP expression were related to poor cause-specific survival in those patients suffering advanced stages of the disease (III-IV), in univariate and multivariate analysis. Among those patients suffering from stages III-IV who showed negative staining of BCL-2, patients overexpressing IGF-1R/MVP tumours died of the disease within the first five years of follow-up (hazard ratio 4.738, 95% CI 1.96721.414, P = 0.001). Conclusion. These results show a role of apoptosis and cell proliferation in relation to the expression of IGF-1R and MVP in oral cavity tumors, suggesting that these oncoproteins are closely related and determine the prognosis. CAPÍTULO VI 133 INTRODUCCIÓN El tumor primario de cavidad oral de tipo epidermoide (OCSCC) es tratado fundamentalmente mediante cirugía, con o sin disección cervical, o por terapia combinada de cirugía y radioterapia (RT). No obstante, a pesar de esto, es común observar entre los pacientes, resistencias a los tratamientos y altos ratios de recaídas locales. Aunque existen algunos factores pronósticos de supervivencia, se necesitan nuevos factores pronósticos que puedan ser usados en el momento del diagnóstico y que, consecuentemente, contribuya a seleccionar a los pacientes para recibir un tipo de tratamiento u otro, en función del riesgo derivado de la presencia o no de esos nuevos factores de riesgo. Las partículas vaults son ribonucleoproteínas con una estructura en forma de barril y compuestas por tres tipos de proteínas, tal y como se ha descrito anteriormente: la proteína vault mayor (MVP), dos vault menores con actividad poly(ADP-ribosa) polimerasa (VPARP) y una proteína asociada a telomerasa-1 (TEP-1). El complejo se completa con la presencia de pequeñas partículas de ARN no traducible (vRNA) de funcionalidad no del todo conocida (Kickhoefer et al. 1999a). Clásicamente, las partículas vaults se han asociado a fenómenos de resistencia a drogas, relacionadas con otras proteínas como la proteína de resistencia pulmonar (LRP) (Mossink et al. 2003). No obstante, los estudios realizados sobre vaults han demostrado una interacción de esta proteína con otras relevantes para diferentes mecanismos celulares: PTEN (Minaguchi et al. 2006), Erk (Xiang et al. 2006), o EGF (Kim et al. 2006). Además, la expresión de MVP, la proteína de mayor tamaño del complejo vault, se ha asociado a fenotipos de malignidad en algunos tumores, lo que sugiere que estas proteínas podrían ejercer algún tipo de papel en el desarrollo y la progresión tumoral (Steiner et al. 2006a). Se ha observado una participación de MVP en la resistencia a la radioterapia, probablemente debida a la inhibición de la apoptosis a través de la inhibición del eje COP-1/p53 (Yi et al. 2005; Dornan et al. 2006). Es más, algunos agentes responsables de producir daño al ADN, tales como la luz ultravioleta, inducen los niveles de expresión de MVP (Shimamoto et al. 2006). A nivel clínico, el papel de MVP en relación a la radioterapia ha sido poco estudiado. La primera evidencia se reportó en el año 2007 por el grupo de Silva y col. En ese estudio, la sobreexpresión de MVP se relacionaba con un peor pronóstico en 78 pacientes con carcinoma de orofaringe tratados con radioterapia. La mayor significación clínica se observaba entre los pacientes con tumores de lengua, que presentaban mayores niveles de recaída local y muerte causa-específica (Silva et al. 2007). No obstante, los