Oxigenación cerebral y fatiga durante ejercicio en hipoxia aguda

Anexo I D/Dª...............................................................SECRETARIO/A DEL DEPARTAMENTO DE....................................................................... DE LA UNIVERSIDAD DE LAS PALMAS DE GRAN CANARIA, CERTIFICA, Que el Consejo de Doctores del Departamento en su sesión de fecha.............................tomó el acuerdo de dar el consentimiento para su tramitación, a la tesis doctoral titulada “Oxigenación Cerebral y Fatiga Durante el Ejercicio en Hipoxia Aguda” presentada por el/la doctorando/a D/Dª Rafael Sánchez de TorresPeralta y dirigida por el/la Doctor/a Jose Antonio López Calbet Y para que así conste, y a efectos de lo previsto en el Artº 6 del Reglamento para la elaboración, defensa, tribunal y evaluación de tesis doctorales de la Universidad de Las Palmas de Gran Canaria, firmo la presente en Las Palmas de Gran Canaria, a...de.............................................de dos mil............ Anexo II UNIVERSIDAD DE LAS PALMAS DE GRAN CANARIA Departamento/Instituto/Facultad___ Educación Física__________ Programa de doctorado___ Avances en Traumatología, Medicina del Deporte y Cuidado de Heridas_______________________________________________ Título de la Tesis Oxigenación Cerebral y Fatiga Durante Ejercicio en Hipoxia Aguda Tesis Doctoral presentada por D/Dª ____ Rafael Sánchez de Torres-Peralta___ Dirigida por el Dr/a. D/Dª. __________José Antonio López Calbet___________ Codirigida por el Dr/a. D/Dª. ________________________________________ El/la Director/a, El/la Codirector/a El/la Doctorando/a, (firma) (firma) (firma) Las Palmas de Gran Canaria, a 4 de noviembre de 2015 !!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!Contenidos! ! Rafael!Sánchez!de!Torres5Peralta!! Página!9! CONTENIDOS Agradecimientos ……………………………………………………………… 11 Lista de publicaciones originales ……………………………………………………………… 13 Fuentes de financiación ……………………………………………………………… 15 Abreviaturas ……………………………………………………………… 17 Resumen general ……………………………………………………………… 21 Summary ……………………………………………………………… 23 1. Introducción ……………………………………………………………… 25 1.1. Aparato músculo-esquelético……………………………………………………………. 25 1.2. Aspectos cardiovasculares y de flujo sanguíneo...................................................... 27 1.2.1 Respuesta cardiovascular al sprint……………… 31 1.3. Aspectos neuromusculares........................……...................................................... 32 1.4. Cambios que se mantienen tras el ejercicio .............…………………..................... 33 1.5. Fatiga . ……………………………………………………………. 35 1.6. Fatiga e hipoxia …………………………………………………………..... 37 1.7 Consideraciones metodológicas.............................................................................. 40 2. Objetivos ……………………………………………………………… 43 3. Hipótesis ……………………………………………………………… 45 4. Metodología ……………………………………………………………… 47 5. Resultados ……………………………………………………………… 63 6. Discusión ……………………………………………………………… 69 7. Conclusiones ……………………………………………………………… 81 8. Conclussions ……………………………………………………………… 83 9. Bibliografía ……………………………………………………………… 85 10. Apéndices-estudios I-III ……………………………………………………………… !!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!Listado!de!Abreviaturas! ! Página!16!!Rafael!Sánchez!de!Torres5Peralta! !!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!! Listado!de!Abreviaturas! ! Rafael!Sánchez!de!Torres5Peralta!! Página!17! LISTADO DE ABREVIATURAS ADP: Adenosín difosfato. ATP: Adenosín trifosfato. AMP: Adenosín monofosfato. BF: (Biceps femoris), bíceps femoral. BMC: (Bone mineral content), contenido mineral óseo. Ca: Calcio. CNS: (Central Nervous System), sistema nervioso central. d.w.: (Dry weight), peso seco. diff a-vO2: (arteriovenous oxygen difference), diferencia arteriovenosa de oxígeno. DXA: (Dual -energy X-ray absorptiometry), absorciometría fotónica dual de rayos X. ECG: (Electrocardiogram), electrocardiograma. EMG: (Surface electromyogram), electromiograma de superficie. EMGRMS: (Root mean square of EMG), raíz cuadrada de la media de los cuadrados del EMG. FIO2: (Inspired oxygen fraction), fracción inspiratoria de oxígeno. H+: (Hydrogen ion) hidrón. Hb: (Hemoglobine), hemoglobina. HR: (Heart Rate), frecuencia cardiaca. HRmax: (Maximal heart rate), frecuencia cardiaca máxima. Hyp: (Hypoxia), hipoxia. Hypb: (Session in hypoxia with biopsies taken), sesión en hipoxia con obtención de biopsias. IE: (Incremental exercise to exhaustion) ejercicio incremental hasta el agotamiento Lac: (Lactate), lactato. MAP: (Median arterial pressure), presión arterial media. MdPF: (Median power frequency), frecuencia mediana de la densidad espectral de potencia. MPF: (Mean power frequency), frecuencia media de la densidad espectral de potencia. MPO: (Wingate Mean Power Output), potencia media en el test de Wingate. !!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!Listado!de!Abreviaturas! ! Página!18!!Rafael!Sánchez!de!Torres5Peralta! MVC: (Maximal voluntary contraction), contracción máxima voluntaria (fuerza isométrica máxima). NO: (Nitric Oxide), óxido nítrico. Nx: Normoxia Nxb: (Session in normoxia with biopsies taken), sesión en normoxia con obtención de biopsias. ODC: (Oxygen dissociation curve), curva de disociación del oxígeno. PaO2: (Arterial oxygen pressure), presión arterial de oxígeno. PCr: (Phosphocreatine), fosfocreatina. PETCO2:(End tidal Carbon Dioxide Pressure), presión de CO2 al final de la espiración. PETO2: (End tidal Oxygen Pressure), presión de O2 al final de la espiración. Pi: (inorganic phosphate), fosfato inorgánico. PIO2: (Inspiratory O2 pressure), presión inspiratoria de oxígeno. PO2: Presión de oxígeno en vena femoral PPO: (Peak Power Output), pico de potencia en el test de Wingate. Q: (Cardiac output) , gasto cardíaco. RER: (Respiratory Exchange Ratio), cociente respiratorio. RF: (Rectus femoris), recto femoral del cuadriceps. RMS: (Root mean square), raíz cuadrada de la media de los cuadrados. RMSNz: (Normalized root mean square), RMS normalizado. RPM: (Revolutions per minute), revoluciones por minuto. RR: (Respiratory Ratio), frecuencia respiratoria. CNS: (Central Nervous System), sistema nervioso central. SaO2: (oxygen arterial saturation), saturación arterial de oxígeno. SD: (standard deviation), desviación standard. SV: (Systolic Volume), volumen sistólico TAI: (Total activation index), índice de activación total. TPR: (Total peripheral resistance), resistencia periférica total. VE: (Minute ventilation), ventilación por minuto. !!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!! Listado!de!Abreviaturas! ! Rafael!Sánchez!de!Torres5Peralta!! Página!19! VM: (Vastus medialis), vasto medial del cuádriceps. VL: (Vastus lateralis), vasto lateral del cuádriceps. VO2: (Oxygen consumption), consumo de oxígeno. VO2max: consumo de oxígeno máximo VO2peak: (Peak oxygen uptake), pico de consumo de oxígeno. Wingate: (30s all out test on cycloergometer), sprint máximo de 30s en cicloergómetro. Wmax: (Peak power output at exhaustion during the incremental exercise test), vatios máximos en el test incremental realizado para determinar el VO2max. Wmean: (Mean power output during the 10s sprint test), potencia media durante sprints de 10s. Wpeak-i: (Instantaneous peak power output), potencia instantánea máxima en el test de sprint. w.w.: (wet weight), peso húmedo. !!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!Resumen! ! Página!20!!Rafael!Sánchez!de!Torres5Peralta! !!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!! !!!Resumen! ! Rafael!Sánchez!de!Torres5Peralta!! Página!21! RESUMEN GENERAL La fatiga humana es la incapacidad para mantener el nivel de potencia o generar máxima potencia durante el esfuerzo, que puede ser causada por mecanismos neurales, de transmisión o musculares. Las diferencias entre el rendimiento en condiciones de hipoxia aguda o normoxia han sugerido un posible papel de la oxigenación cerebral en estos procesos. Para comprobar si la oxigenación cerebral es el factor determinante en el cese del esfuerzo en una prueba incremental hasta el agotamiento reclutamos a 11 sujetos sanos que realizaron 8 ejercicios incrementales hasta la fatiga, muchos de ellos con sprints previos y posteriores, en distintas condiciones de oxigenación. Estos experimentos combinaron hipoxia severa aguda, distintos cambios en fatiga a distintas oxigenaciones relativas, normoxia y oclusión de los miembros inferiores durante distintas recuperaciones. En el estudio I demostramos que los durante el ejercicio incremental hasta el agotamiento la activación muscular es mayor en hipoxia que en normoxia a la misma intensidad absoluta, pero menor en hipoxia que en normoxia a la misma intensidad relativa..En el estudio II la recuperación del muscular fue bloqueada ocluyendo la circulación con un compresor rápido durante los descansos entre el test incremental y el sprint subsiguiente. Como consecuencia se produjo un aumento del 20% de la concentración muscular de lactato tras un minuto de isquemia, sin que ello produjera deterioro alguno de la capacidad de sprint, a pesar de un descenso de la actividad registrada en el electromiograma. En el estudio II demostramos que el fallo en la tarea o imposibilidad de continuar el ejercicio incremental hasta el agotamiento se debe a mecanismos centrales y no a incapacidad del músculo para responder a las órdenes del sistema nervioso. La suma de resultados muestran que la decisión de detener un esfuerzo incremental radica fundamentalmente en el sistema nervioso y que la oxigenación del mismo juega un papel importante en la percepción del esfuerzo y la capacidad de activación de los sistemas cardiorespiratorio y músculo-esquelético durante el ejercicio incremental. En el estudio III de la presente tesis se demostró que la hipoxia severa equivalente a una altitud superior a los 4300 !!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!Resumen! ! Página!22!!Rafael!Sánchez!de!Torres5Peralta! m sobre el nivel del mar, pero no la hipoxia moderada, genera una disminución en la activación muscular durante el ejercicio. !!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!Summary! ! Rafael!Sánchez!de!Torres5Peralta!! Página!23! SUMMARY Human fatigue is the inability to maintain the intensity of exercise or generate maximum power, which may be caused by neural mechanisms or muscular mechanism. The differences in performance between exercise in acute hypoxia and normoxia have suggested a possible role of cerebral oxygenation in these processes. To test whether brain oxygenation is the main determining factor in the cessation of effort during an incremental test to exhaustion, we recruited 11 healthy subjects who performed eight incremental exercise test to fatigue, many with preand post sprints at different oxygenation levels. These experiments combined incremental exercise to exhaustion in severe acute hypoxia, with transitions to different levels of oxygenation, and incremental exercise followed by vascular occlusion of the lower extremities of different durations and sprint exercise. In the study I, it has been shown that muscle activation is higher in hypoxia than in normoxia at the same absolute intensity, but lower in hypoxia than in normoxia at the same relative intensity, during incremental exercise to exhaustion. In the study II, we showed that the task failure or inability to continue the incremental exercise to exhaustion is due to central mechanisms rather than inability of the muscle to respond to the orders of the central nervous system. In study II, muscle recovery was blocked by occluding circulation with a fast compressor during the breaks between the incremental test and subsequent sprint. As a result there was a 20% increase in muscle lactate concentration after 60 s of ischemia. However, performance was increased with ischemic recovery despite lower root mean square electromyogram values. In the study III of this thesis, it has been shown that severe hypoxia equivalent to an altitude above 4300 m, but not moderate hypoxia, causes a decrease in muscle maximal activation during incremental exercise to exhaustion. Overall, this thesis shows that the decision to stop an incremental exercise to exhaustion relies primarily on the central nervous system, with brain oxygenation playing a critical role in the perception of effort and the ability to activate the cardiorespiratory and musculoskeletal systems during exercise incremental. !!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!Introducción! ! Página!24!!Rafael!Sánchez!de!Torres5Peralta! !!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!Introducción! ! Rafael!Sánchez!de!Torres5Peralta!! Página!25! 1.INTRODUCCIÓN El ejercicio incremental hasta el agotamiento (IE) probablemente sea el test más usado para examinar la condición física y las capacidades cardiorespiratorias. Este tipo de test es considerado el “gold standard” para determinar el consumo de oxígeno máximo (VO2max) (Mitchell et al., 1958; Tipton, 2003). Pero paradójicamente los mecanismos que determinan el agotamiento o fallo en la tarea, es decir, la incapacidad para continuar el esfuerzo no son suficientemente conocidos todavía. 1.1 Aparato músculo-esquelético El movimiento como herramienta fundamental para la supervivencia es imprescindible para los humanos desde el momento en que los movimientos cardiacos y respiratorios son inevitables. Pero más allá de estos pequeños movimientos inevitables, los que nos permiten mover nuestro esqueleto son también cruciales para la conducta de relación con el medio y, por ello, para la supervivencia. Para lograrlo tenemos células responsables de generar fuerza, la fibra muscular. Estas fibras son capaces de contraerse para transformar energía metabólica en fuerza física de tracción. No obstante tienen límites. Algunos de ellos en cuanto a la capacidad de generación de potencia son fundamentalmente conocidos y tienen que ver con la estructura o la función de la célula. Pero existen otros que aún desconocemos. La activación muscular se ha representado frecuentemente utilizando la amplitud de la señal electromiográfica (EMG). Esta señal va aumentando a medida que se aumenta la intensidad de un ejercicio incremental hasta el agotamiento (Taylor & Bronks, 1996; Osawa et al., 2011) debido a la combinación de reclutamiento adicional de unidades motoras junto al aumento en las frecuencias de descarga de las motoneuronas aumentando la intensidad de la contracción y aumentando la potenia generada (Gottlieb & Agarwal, 1971; Ericson, 1986; Weir et al., 1992; Gonzalez-Izal et al., 2012). Pero también aumenta cuando realizamos contracciones repetidas submáximas (Viitasalo & Komi, 1977), estáticas o dinámicas, aun sin !!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!Introducción! ! Página!32!!Rafael!Sánchez!de!Torres5Peralta! detectan HR elevadas, especialmente altas justo antes de la extenuación (MacDougall et al., 1985). La resistencia periférica aumenta a niveles importantes pero no extremos durante ejercicios de fuerza (MacDougall et al., 1985), así que la presión sistólica aumenta y la HR aumenta modestamente por lo que podemos asumir un incremento similar de consumo de oxígeno miocárdico (Nelson et al., 1974). Esta resistencia periférica y la HR han resultado ser mayores en ejercicios cíclicos hasta la extenuación a diferentes cargas, mientras que la presión sistólica fue similar (Featherstone et al., 1993). La evidencia sugiere un equilibrio más favorable de aporte de oxígeno al corazón durante ejercicios cíclicos de resistencia por una presión diastólica más alta y una HR más baja (Braith & Stewart, 2006). En ejercicios de fuerza con cargas muy altas no obstante aumenta la presión sanguínea más que en los ejercicios aeróbicos tanto la sistólica como en diastólica con poco incremento del gasto cardiaco. Durante una serie o un sprint va aumentando la presión sanguínea. La maniobra Vasalva, mantener el aire inspirado, aumenta significativamente esta presión (McCartney, 1999), y se ha sugerido que podría tener un efecto protector de la presión que sufriría el arbol cerebrovascular y el corazón. Por otro lado espirar permite bajar la presión sanguínea un 40% (Narloch & Brandstater, 1995) pero intcrementa la presión intracraneal (Haykowsky et al., 2003) y la presión en la pared ventricular al final de la fase sistólica (Haykowsky et al., 2001). La resistencia periférica total (TPR) depende de la intensidad del ejercicio de fuerza, siendo su comportamiento simliar a la aeróbica mientras se trate de intensidades bajas pero con un menor descenso (Lewis et al., 1985), mientras que a altas intensidades la TPR aumenta, probablemente, debido al aumento de presión intramuscular y los valores retornan a los valores de resposo durante las fases no activas (Lentini et al., 1993). 1.3 Aspectos neuromusculares El reclutamiento de fibras musculares ha sido explicado por el principio de Heinemann o principio del tamaño, que dicta que las fibras más pequeñas son más fáciles de activar que !!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!Introducción! ! Rafael!Sánchez!de!Torres5Peralta!! Página!33! las mayores y por ello serían reclutadas antes. Este principio ha sido comprobado en animales y humanos con varios modelos experimentales (Rothwell et al., 1991; Bawa & Lemon, 1993), y la conclusión lógica sería que el orden de reclutamiento estaría muy relacionado con el tipo de fibras de la unidad motora y, por ende, del tamaño de la motoneurona. Esto sería así de tratarse de incrementos de estímulo progresivos o de trabajo muscular exclusivamente isométrico con contracciones tetánicas máximas, pero no explica todas las formas de movimiento posibles. Actualmente se está cuestionando el verdadero sentido del tamaño de la motoneurona y se están teniendo en cuenta algunos otros factores en la explicación del movimiento voluntario humano, como que sólo usamos algunas fibras de cada músculo en un movimiento, que las usamos en cualquier grado de sus capacidades de creación de fuerza y que la generación de fuerza de las fibras no está sincronizada de manera que cada movimiento es una suma de contracciones de distintos tipos (Gardiner, 2011), pero parece que existen una serie de maneras sistremáticas de reclutar fibras durante el ejercicio. Parece que neuronas de varios tipos son utilizadas por el sistema nervioso central en combinaciones de reclutamiento y dedicaciones variadas apropiadas para cada tarea. Afortunadamente las propiedades de la señal electromiográfica de superficie permiten estimar los patrones de reclutamiento, dado que las unidades motoras rápidas y lentas tienen potencia espectral similar pero frecuencias distintas y se están investigando variaciones en los patrones de reclutamiento motor durante ejercicios cíclicos (Wakeling, 2004). . 1.4. Cambios que se mantienen tras el ejercicio También tenemos que tener en cuenta ciertos cambios que se producen después de terminado el ejercicio que pueden afectar a ejercicios realizados a continuación, como el sprint posterior. En primer lugar el volumen de plasma disminuye debido a la pérdida de fluido durante el ejercicio y al cambio de compartamento del mismo. Durante los ejercicios de fuerza se ha hallado una fuerte correlación entre este descenso de plasma y el aumento de área debido a !!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!Introducción! ! Página!34!!Rafael!Sánchez!de!Torres5Peralta! un movimiento de fluido desde el espacio vascular a los músculos activos tras este tipo de ejercicios (Ploutz-Snyder et al., 1995) probablemente causado por aumento de osmolaridad del músculo debido a un aumento en lactato y otros solutos (Sjogaard & Saltin, 1982) y a una mayor presión hidrotstática por aumento de la presión sanguínea. En cualquier caso los volúmenes de plasma desplazados por este motivo se normalizan de nuevo tras 30 minutos. El ejercicio aeróbico también aumenta la distensibilidad arterial durante y hasta 30 minutos después del ejercicio favoreciendo un descenso de lapresión arterial (Kingwell et al., 1997). Esta vasodilatación pobablemente está causada por cambios en tono simpático, niveles de hormonas circulantes o liberación de metabolitos desde los tejidos. Con ello la velocidad de pulso de la onda, relacionada con esta distensibilidad, se mantiene disminuida durante una hora en las arterias (Kingwell et al., 1997) pero no tiene relación con la presión arterial media (MAP), que se normaliza apenas diez minutos después del ejercicio (Naka et al., 2003). Tras ejercicio aeróbico el Q de reposo se mantiene usando una más baja HR (Rowland & Roti, 2004) posiblemente relacionado con el tono vagal (Shi et al., 1995). El ejercicio agudo altera la función de los factores sanguíneos relacionados con la coagulación y la fibrinolisis que inducen un estado procoagulatorio y profibrinolítico. Se activan las plaquetas y la agregación de las mismas en proporción directa a la intensidad del ejercicio Además se produce un aumento de rigidez de las arterias centrales cuando se ejercita el cuerpo entero a alta intensidad. Se ha sugerido que podría ser debido a la alta presión sanguínea (Fahs et al., 2009). a pesar de que dura 30 minutos tras el ejercicio mientras que la presión vuelve a valores iniciales a los 15 minutos (DeVan et al., 2005) por lo que otras explicaciones como un aumento del tono simpático que aumentaría el tono vasoconstrictor de la musculatura lisa (Heffernan et al., 2007) se han propuesto a pesar de la pequeña cantidad de musculatura en estas arterias y una similar modulación en ejercicios aeróbicos y de fuerza. Por otro lado se produce y mantiene una disminución en la rigidez de las arterias periféricas que se cree sea debida a la vasodilatación en respuesta al ejercicio al aparecer sólo en los músculos ejercitados (Heffernan et al., 2006). Algunos estudios muestran aumentos en la microcirculación tras ejercicio agudo de fuerza independiente del nivel de entrenamiento !!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!Introducción! ! Rafael!Sánchez!de!Torres5Peralta!! Página!35! previo (Fahs et al., 2009). Contrariamente a lo anteriormente pensado se ha aceptado el descenso de la presión arterial de reposo tanto sistólica como diastólica tras un ejercicio de fuerza (Cornelissen & Fagard, 2005) y se piensa que puede tener que ver con la modulación del tono vascular miogénica (Heffernan et al., 2009). 1.5. La fatiga La fatiga muscular podemos entenderla como cualquier reducción reversible por el descanso (Gandevia, 2001) en la capacidad de generar potencia o fuerza muscular, independientemente de la capacidad o no de mantener una tarea (Bigland-Ritchie & Woods, 1984). Existe dentro del concepto un aspecto que genera más complicación en el proceso de medida de este fenómeno que sería la pérdida de eficiencia durante el ejercicio, de manera que conllevaría la necesidad de hacer más esfuerzo para generar el mismo trabajo. Se entiende que conllevaría la disminución de la capacidad de generar una potencia máxima, lo que en parte simplifica su medición, pero se comienza a generar antes de que se interrumpa una tarea. Puede haber mecanismos que causan este fenómeno tanto a nivel neural (central) como muscular (periférico) y a efectos de esta tesis vamos a incluir los fenómenos que se produzcan en la unión neuromuscular dentro de la categoría de fenómeno "periférico". No parece probable que exista una sola explicación para el fenómeno de la fatiga durante el ejercicio, que describe fenómenos y respuestas a estímulos muy variados, pero aún en un sólo tipo de esfuerzo se han descrito multitud de posibles mecanismos que causarían distintas formas de fatiga y que no son mutuamente excluyentes tanto como probablemente sinérgicos. Dentro de las posibles causas neuromusculares de la fatiga se han descrito factores de origen periférico que podrían afectar a la eficiencia de la contracción provocando un aumento del esfuerzo para generar la misma potencia. Estas propuestas se basan en estudios que muestran que las fibras fatigadas tienen contracciones más lentas y de menor amplitud y una menor capacidad de fuerza máxima junto a una ratio de desarrollo de la tensión menor (Fitts, 2008). Al darse un cambio en la relación fuerza-velocidad la pérdida de potencia sería mayor. !!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!Introducción! ! Página!36!!Rafael!Sánchez!de!Torres5Peralta! Estas deficiencias podrían estar relacionadas con cambios en las concentraciones de calcio (Ca), hidrogeniones (H+), fósforo inorgánico (Pi) o radicales libres, que causarían cambios en la velocidad de la cinética de las uniones de la miosina, en el número de puentes o en la fuerza que se generaría en cada puente. Se está cuestionando el papel de la acumulación de metabolitos, especialmente del lactato, y la acidificación del músculo (Cairns, 2006; Knuth et al., 2006; Karatzaferi et al., 2008) proponiéndose su efecto, de tenerlo, sobre el sistema nervioso. Además durante actividad contráctil submáxima se ha descrito una serie de cambios en el sistema nervioso a medida que progresa el esfuerzo que pueden influir sobre la eficacia de los patrones de reclutamiento de las fibras contráctiles.Se ha descrito cierta fatiga neuromuscular que podría estar causada por consumo de los neurotransmisores, fallo de la membrana postsináptica o fallos en la propagación del potencial de acción en los ramales del axón (Aldrich et al., 1986; Van Lunteren & Moyer, 1996). Se ha sugerido que la velocidad a la que se produce o acumula fatiga está regulada desde el sistema nervioso central , el cual recibe retroalimentación a través de los aferentes metaboreceptores desde los músculos que responden a la acumulación de metabolitos (Amann & Dempsey). Se ha comunicado inhibición del impulso corticoespinal por estimulación de los aferentes tipo III/IV (Amann & Dempsey, 2008; Rossman et al., 2012; Kennedy et al., 2015) con más efecto sobre los músculos extensores que sobre los flexores (Martin et al., 2006). El aumento de presión sanguínea desde el inicio hasta el final de una serie de movimientos de fuerza o un sprint podría tener relación con niveles incrementales de fatiga y una producción relativamente más alta de producción de fuerza al final del esfuerzo (MacDougall et al., 1985; MacDougall et al., 1992), que es la variable principal determinante de la presión por encima de factores omo tamaño del músculo, o fuerza absoluta. Pero para complicar la determinación de las causas de la fatiga, algunas variables pueden afectar mecanismos centrales y periféricos simultáneamente, como la hipoxia. !!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!Introducción! ! Rafael!Sánchez!de!Torres5Peralta!! Página!37! 1.6. Fatiga e hipoxia. La hipoxia puede generarse por cambios de la fracción inspiratoria de oxígeno (FIO2), en la presión inspiratoria de oxígeno (PIO2) de encontrarnos en altitud, de la saturación de oxígeno de la hemoglobina (SaO2) , por cambios en la concentración de hemoglobina (Hb) o por la llamada hipoxemia arterial inducida por el ejercicio (EIAH) que se podría producir en humanos tras ejercicio de resistencia de larga duración a alta intensidad. La hipoxia genera cambios de consumo de oxígeno que pueden ser debidos al transporte del contenido arterial de oxígeno al músculo, a cambios en el flujo sanguíneo o a ambos. Cuando se realiza ejercicio en hipoxia el descenso de oxígeno disponible conlleva descensos en los rendimientos y en el VO2max especialmente pronunciados en esfuerzos de resistencia. Cuando el IE se realiza en hipoxia parece que los niveles de fatiga periférica podrían ser menores, como también lo es la potencia alcanzada y el trabajo total llevado a cabo, indicando que posiblemente sean mecanismos centrales probablemente relacionados con la oxigenación del cerebro (Rasmussen et al., 2010) los que predominan sobre los mecanismos locales determinando el cese del esfuerzo (Amann et al., 2007a). Parece que el oxígeno entregado sería la variable regulada en los procesos más que el flujo sanguíneo per sé (Marsh & Ellerby, 2006) y se ha sugerido que estaría mediado por el oxígeno unido a la hemoglobina independientemente de la presión de oxígeno en sangre (Gonzalez-Alonso et al., 2001; Calbet et al., 2007). Coincidente con esta hipótesis el incrementar instantáneamente el oxígeno inspirado no cambia los síntomas de fatiga al final de un incremental cuando se realiza en normoxia y el suministro al final es hiperóxico (Calbet et al., 2003a), pero genera un cambio instantáneo significativo cuando se trata de un ejercicio realizado en hipoxia severa aguda normobárica, sea incremental o constante (Kayser et al., 1994; Calbet et al., 2003a, b; Amann et al., 2007a). Complica un poco las conclusiones el hecho de que la hiperventilación que se produce cuando la intensidad de ejercicio es elevada en hipoxia (comparada con la de los mismos valores absolutos en normoxia) podría causar la fatiga del diafragma y la musculatura respiratoria, lo que a su vez activa aferentes que causarían vasoconstricción sobre el miembro activo a través de reflejos supraespinales (Dempsey et al., 2006) para desviar parte del flujo !!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!Introducción! ! Página!38!!Rafael!Sánchez!de!Torres5Peralta! sanguíneo a los músculos respiratorios, lo que aumentaría la fatiga del miembro ejercitado (Amann et al., 2007a) como ha sido mostrado dificultando y facilitando el trabajo ventilatorio. Aunque se ha sugerido que los aumentos de flujo atenuarían los efectos de la fatiga y que la restricción aumentaría la fatiga por el lavado incompleto de metabolitos, lo cierto es que no parece ser el factor principal (Hogan et al., 1999; Hepple, 2002). Curiosamente al redirigir flujo sanguíneo al aparato respiratorio la extracción de oxígeno de los músculos de la pierna no cambió causando una relación directa entre flujo sanguíneo en las piernas y VO2 max (Harms et al., 1997). El aumento en consumo de O2 dentro del músculo causa el gradiente de PO2 mientras que aumenta la superficie capilar al aumentar la perfusión aumentando la difusión de oxígeno al músculo esquelético activo. Esto lleva al límite a la difrencia arterio-venosa (diff avO2). Recientemente se ha mostrado efectos de fatiga en hipoxia independientes del trabajo ventilatorio y de sus efectos sobre el flujo de la musculatura activa (Amann et al., 2007a). La medición de fatiga periférica medida con descensos de la contracción potenciada de cuadriceps (potentiated twitch) confirmó menos fatiga periférica tras ejercicio a intensidad constante en hipoxia (Amann et al., 2007a). Se asume que cuando la fuerza que produce una contracción isométrica máxima no aumenta por estimulación eléctrica o magnética sobre nervio, músculo o corteza motora estaríamos el mecanismos predominante en la fatiga sería periférico, mientras que en el caso de aumentar se trataría de fatiga central (Goodall et al., 2010; Rasmussen et al., 2010; Goodall et al., 2012; Fernandez-del-Olmo et al., 2013). Esta técnica de valoración de la fatiga ha sido cuestionada dado que la fatiga es específica para cada tarea por lo que los patrones de movimiento utilizados en la medición del fenómeno han de ser los mismos que lo han provoado para que el reclutamiento utilice vías neurales similares (Gandevia, 2001). Pero además es necesario obtener un registro de los metabolitos en estas situaciones para poder comparar fatiga periférica, que además comienza a recuperarse rápidamente en cuanto se termina la contracción y en el caso de la fosfocreatina es casi completa para cuando se hacen las mediciones de algunos estudios (Bogdanis et al., 1996; Dawson et al., 1997; Yoshida et al., 2013). No respetar estos tiempos impide registrar el impacto de la recuperación temprana (Marcora & Staiano, 2010b; Coelho et al., 2015). Es !!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!Introducción! ! Rafael!Sánchez!de!Torres5Peralta!! Página!39! además importante comprobar los descensos de potencia pico porque es posible tener descensos de contracción potenciada sin descensos en pico de potencia (Fernandez-del-Olmo et al., 2013; Hureau et al., 2014). Debido a estas consideraciones entre otras, se han documentado todas las combinaciones posibles de resultados tras ejercicios dinámicos en normoxia e hipoxia y se han interpretado como diferentes contribuciones de fatiga central o periférica en un amplio abanico de posibilidades (Amann et al., 2007b; Sidhu et al., 2009; Goodall et al., 2010; Marcora & Staiano, 2010a; Millet et al., 2012; Sidhu et al., 2012; Fernandez-del-Olmo et al., 2013). Además es posible que haya habido diferentes niveles de retroalimentación desde los aferentes III/IV, dado que no se puede medir su descarga directamente en el ejercicio corporal dinámico de humanos junto a las dificultades de interpretación que ofrecen los experimentos con fentanilo al alterara la ventilación y el contenido de O2 y CO2 arteriales, la frecuencia cardiaca y la presión arterial en función de la intensidad y duración del ejercicio, así como de la población objeto de estudio (Dempsey et al., 2014; Olson et al., 2014; Poon & Song, 2015). Por ello, aunque algunos modelos han demostrado que inhibición de las aferencias musculares del grupo III y IV puede disminuir la fatiga muscular (Sidhu et al., 2014), áun se discute su contribución real al descenso del rendimiento a través de mecanismos centrales (Millet et al., 2009; Marcora, 2010; Millet et al., 2012; Kennedy et al., 2015). Se desconoce si en el momento de máxima fatiga, justo antes del fallo en la tarea, la activación muscular es menor en hipoxia que en normoxia o hiperoxia lo que podría significar que la hipoxia esté efectivamente conduciendo a un menor impulso motor desde el sistema nervioso central y produciendo una menor activación en el músculo. Se cree que este efecto está predominantemente causado por mecanismos centrales debidos a la sensibilidad a la disminución del aporte de oxígeno al cerebro (Goodall et al., 2012) o bien a la presión intersticial de oxígeno en el cerebro (Amann & Calbet, 2008). Pero además el aplicar normoxia (Calbet et al., 2003a) o hiperoxia (Amann et al., 2007b) en el momento de la extenuación alivia rápidamente estos síntomas de fatiga permitiendo continuar con la tarea. Sería lógico pensar !!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!Introducción! ! Página!40!!Rafael!Sánchez!de!Torres5Peralta! que si la hipoxia disminuye la activación muscular, un aumento de la oxigenación podría acompañarse de un aumento de la activación muscular a la misma carga absoluta. Además es relevante señalar que existe una importante diferencia entre realizar esfuerzos en hipoxia moderada o severa. A efectos de nuestros estudios resulta importante porque en hipoxia severa el intercambio de gases ocurre en la región más recta de la curva de disociación de oxígeno (ODC), lo que conlleva que un pequeño aumento de presión arterial de oxígeno significa una gran elevación de la saturación arterial de oxígeno (Calbet et al., 2003a; Calbet & Lundby, 2009) mientras que en hipoxia moderada el efecto es mucho menor. Es posible que la oxigenación sólo mitigue la fatiga cuando se aplica en hipoxia severa si es precisa una elevación significativa de contenido arterial de oxígeno. Pero también podría deberse a que la fatiga sólo se solucione con oxigenación cuando se haya alcanzado un cierto nivel de hipoxia durante el ejercicio, lo que implicaría que el aumento de PaO2 sería más crítico que la elevación del contenido de oxígeno. 1.7.Consideraciones metodológicas Estudios previos usando EMG pueden diferir de los hallazgos que reportamos debido a la variabilidad intrínseca de la señal de EMG (Taylor & Bronks, 1995; Hug et al., 2004), la cual aumenta cdurante el ejercicio dinámico, debido a que la amplitud the EMG aumenta con la velocidad angular en las contracciones concéntricas (Westing et al., 1991). Para reducir la variabilidad se han utilizado diferentes métodos de normalización, comparando la señal RMS en el experimento con la recogida en condiciones estandarizadas reproducibles considerada la referencia. Esto permite la comparación de amplitud de las activaciones entre sujetos, músculos o momentos distintos (Albertus-Kajee et al., 2010). El sistema más utilizado ha sido comparar la señal del experimento sea dinámico o estático con la registrada durante contracciones estáticas máximas (MVC) (Marsh & Martin, 1995; Hug & Dorel, 2009) pero parecería más apropiado usarlo para condiciones estáticas en ángulos de movimiento cercanos a los utilizados para la esñal de referencia. Para la amplitud de señal EMG de movimientos dinámicos se está utilizando señal del movimiento dinámico en !!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!Introducción! ! Rafael!Sánchez!de!Torres5Peralta!! Página!41! condiciones de referencia (Westing et al., 1991; Taylor & Bronks, 1995; Amiridis et al., 1996). Otro aspecto para reducir la variabilidad es promediar varias repeticiones del experimento como se ha hecho en los estudios de cinética de O2 (Jones et al., 2012) aunque este procedimiento no ha sido aplicado a estudios electromiográficos con anterioridad. !!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!Resumen!de!Métodos! ! Página!48!!Rafael!Sánchez!de!Torres5Peralta! Añó Sayol, Barcelona, España) de 50 g de precisión, calibrada a 50.0, 70.0 ó 90.0 Kg, mediante masas patrón de la clase M1. 4.1.2 Masa muscular, masa ósea y porcentaje de masa grasa. La masa magra (masa corporal – [masa grasa + masa ósea]) se determinó mediante absorciometría fotónica dual de rayos X (DXA) (QDR-1500, Hologic Corp., Software versión 7.10, Waltham, MA). Los sujetos fueron escaneados tumbados en posición supina junto a una barra de calibración de diferentes grosores y densidades. A partir del análisis regional y de cuerpo entero se calculó la masa magra (g), la masa grasa (g), el área ósea total (cm2) y el contenido mineral óseo (BMC) (g), tal como se ha hecho en trabajos previos de nuestro laboratorio (Ara et al., 2004; Ara et al., 2006). 4.2 Aspectos generales Estos estudios formaron parte de un proyecto mayor que incluyó varios experimentos diseñados para estudiar los mecanismos limitantes de la capacidad de ejercicio en humanos. Los resultados que se enfocaban al transporte de oxígeno y el metabolismo muscular han sido publicados recientemente (Calbet et al., 2015; Morales-Alamo et al., 2015c). Inicialmente realizaron varias visitas al laboratorio en un proceso de familiarización. El primer día se les realizaron las mediciones antropométricas y las medidas de composición corporal. El proceso de familiarización de los sujetos con los procedimientos incluyó ejercicios incrementales hasta el agotamiento en normoxia e hipoxia (FiO2= 0.21 y 0.104, presión barométrica 735-745mmHg) para detectar su consumo de oxígeno máximo (VO2max), su frecuencia cardiaca máxima (HRmax) y su potencia máxima (Wmax). Una semana después se familiarizaron con el test de Wingate isocinético a 80rpm. A partir de entonces se realizaron diferentes pruebas en días separados para llevar a cabo los experimentos. !!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!Resumen!de!Métodos! ! Rafael!Sánchez!de!Torres5Peralta!! Página!49! Figura 1. Estudio I. Invasivos Estudio I. Invasivos Estudio Ia. Invasivo Incremental Los sujetos participaron en un estudio invasivo que incluía ejercicio incremental hasta el agotamiento en cicloergómetro (Excalibur Sport 925900, Lode) en normoxia (PIO2 ~143 mmHg) e hipoxia severa aguda (PIO2 ~73 mmHg) en orden aleatorio. Se midieron hemodinámicas central y local, transporte de oxígeno e intercambio pulmonar de gases y muscular. El consumo de oxígeno se midió con un ergoespirómetro (Vmax N29 Sensormedics) calibrado antes de cada test con gases de calibración (Carburos Metálicos, Las Palmas de Gran Canaria) y se recogieron respiración a respiración. Las respiraciones fueron promediadas cada 20 segundos para determinar el consumo de oxígeno. Se cateterizó a los sujetos previa anestesia local (lidocaína 2%) en ambas venas femorales y una arteria femoral (Calbet et al., 2006). Se inyectó solución salina helada para !!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!Resumen!de!Métodos! ! Página!50!!Rafael!Sánchez!de!Torres5Peralta! medir el flujo sanguíneo de la pierna por termodilución (Andersen & Saltin, 1985). También se midió la temperatura de la sangre en la vena femoral, y se midió la presión arterial y la temperatura en la sangre arterial. Se obtuvieron muestras sanguíneas periódicas de sangre arterial y venosa antes de finalizar cada escalón de carga y al final de la prueba. Los gases sanguíneos fueron inmediatamente analizados en un analizador de gases (ABL90 Radiometer). Durante toda la prueba se registro un electrocardiograma (ECG). Todos los datos fueron recogidos en un sistema de captación y procesamiento de señales (Powerlab ML880 de ADInstruments) a 200Hz y guardados para el análisis posterior. Para más detalles puede consultarse el artículo donde se exponen en detalle estos experimentos (Calbet et al., 2015). Estudio Ib. Invasivo Sprint Se llevaron a cabo dos sprints máximos de 30 segundos ( Wingate) isocinéticos a 80rpm utilizando servocontrol con ajuste instantáneo (Excalibur Sport 925900). Uno de ellos se llevó a cabo en normoxia y otro en hipoxia, en orden aleatorio y con las mismas presiones inspiratorias que en los test incrementales. Antes de cada test de Wingate sólo calentaron realizando 3 minutos de pedaleo sin carga. Entre ellos los ejercicios de sprint descansaron unos 90 minutos. Durante los sprints se midió el gasto cardiaco y el flujo sanguíneo de la pierna junto con la diferencia arteriovenosa de oxígeno para determinar el consumo de oxígeno de la pierna. También se recogió el consumo de oxígeno respiración a respiración (Vmax N29, Sensormedics), que fue posteriormente promediado cada 5 segundos de sprint. Las muestras sanguíneas se recogieron de arteria y vena femorales simultáneamente antes de cada sprint y durante el ejercicio cada 5 segundos de sprint en el caso de la vena y cada 10 segundos en el caso de la arteria. Las muestras se colocaban en hielo y eran analizadas en el mismo orden en que se obtuvieron utilizando el mismo analizador de gases que en los incrementales. De ellas se obtuvo concentración de hemoglobina y saturación de gases. Durante el sprint se midió el flujo de la pierna por termodilución. !!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!Resumen!de!Métodos! ! Rafael!Sánchez!de!Torres5Peralta!! Página!51! Estudio II. Oclusión Fig2. Estudio II Oclusión El procedimiento experimental del estudio llamado Oclusión se resume en la figura 3. Los voluntarios llegaron en ayunas en una primera visita al laboratorio y se les determinó la composición corporal utilizando absorciometría fotónica dual de rayos-x (DEXA) (Hologic QDR-1500, Hologic Corp., software versión 7.10, Waltham, MA) (Calbet et al., 1997) y se calculó la masa muscular de la pierna utilizando el modelo de Wang (Wang et al., 1999). !!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!Resumen!de!Métodos! ! Página!52!!Rafael!Sánchez!de!Torres5Peralta! Figura 3. Estudio II. Oclusión En los días de experimento los sujetos llegaron al laboratorio a las 8:00 tras ayuno desde las 22:00h. Se les colocaron manguitos de inflado en los muslos conectados a un inflador rápido (SCD10, Hokanson E20 AG101, Bellevue, USA). Los sujetos llevaron a cabo un calentamiento en cicloergómetro (2 minutos a 50W, 2 min a 100W y 1 min a 160W) y después 4.5 min de pedaleo sin carga. A continuación descansaron inmóviles durante 30 s antes de realizar un sprint máximo de 10 s de duración en un cicloergómetro en modo isocinético a 80 rpm que utilizamos como sprint control (Excalibur Sport 925900, Lode, Groningen, The Netherlands). El servo-control del cicloergómetro varió instantáneamente la resistencia aplicada a los pedales en función de la fuerza ejercida lo que causa un pedaleo constante de 80rpm. Cinco minutos después iniciaron dos ejercicios incrementales en cicloergómetro en normoxia (PIO2: ~143 mmHg) e hipoxia (PIO2: ~73 mmHg, Altitrainer200, SMTEC, Switzerland) separados por 120 min, efectuados en orden aleatorio. El test en normoxia se inició a 80W y aumentando las cargas en 30W cada 2 minutos hasta la extenuación. El test en hipoxia se inició con 60W y la carga se incrementó en 20W cada 2 minutos. Se consideró que el sujeto estaba exhausto !!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!Resumen!de!Métodos! ! Rafael!Sánchez!de!Torres5Peralta!! Página!53! cuando a pesar de fuerte apoyo verbal fue incapaz de mantener una frecuencia de pedaleo superior a 50 rpm durante 5 s o incluso se detuvo. Inmediatamente de la interrupción del esfuerzo (con el sujeto agotado) se inflaron los manguitos con velocidad y presión máximas (300mmHg) ocluyendo completa e instantáneamente la circulación (isquemia). En apenas 3 a 5 s se produjo anoxia dentro del miembro como se constata en una de las publicaciones ya mencionadas (Morales-Alamo et al., 2015c). Se emplearon dos duraciones distintas de 10 y 60 s de descanso mientras la circulación sanguínea permanecía ocluida. Las duraciones de la oclusión fueron aplicadas de forma aleatoria. Al final del período de oclusión se desinflaron los manguitos reinstaurándose instantáneamente el flujo sanguíneo al inicio del sprint post-isquemia. Se registró la potencia durante los sprints y el test incremental, determinándose la potencia instantánea y la media. El intercambio de gases se midió con un equipo (Vmax N29; Sensormedics, Yorba Linda, California, USA) calibrado previamente antes de cada test siguiendo las instrucciones del fabricante usando gases para la calibración (Carburos Metálicos, Las Palmas de Gran Canaria). Se analizaron las variables respiratorias respiración a respiración y se promediaron cada 20s durante los test incrementales, utilizando el valor más alto de estos promedios como VO2max. Las variables respiratorias y electromiográficas se midieron del mismo modo que en el estudio II. Resumen de Métodos Página 54 Rafael Sánchez de Torres-Peralta Todas las variables se comportaron de manera similar en los cuatro sprints de control (uno antes de cada incremental) por lo que para disminuir la variabilidad se promediaron los valores. También para reducir variabilidad se promediaron los valores de EMG de vastus medialis y lateralis, aunque también se presentan los valores por separado también. Puesto que los test incrementales en hipoxia y normoxia fueron repetidos en dos ocasiones, se generaron promedios representativos de hipoxia y normoxia, respectivamente. Figura 4. Señal EMG de los experimentos de oclusión. !!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!Resumen!de!Métodos! ! Rafael!Sánchez!de!Torres5Peralta!! Página!55! Estudio II. Biopsias Figura 5. Estudio II. Biopsias Unas semanas más tarde se realizaron los experimentos denominados Biopsias. Para ello se emplearon dos sesiones experimentales, llamadas respectivamente Nxb (PIO2: ~143 mmHg) y Hypb (PIO2: ~73 mmHg), realizadas en orden aleatorio. Las sesiones comenzaron con 10 minutos de descanso en decúbito supino y a continuación se les realizó una biopsia con anestesia local (lidocaína al 2%, 2ml) del vasto lateral. Se llevó a cabo teniendo en cuenta que la aguja apuntara distalmente a 45º de inclinación (Guerra et al., 2011) y usando la técnica Bergstrom con succión (Bergstrom, 1962). Antes de iniciar el ejercicio también se llevó a cabo una incisión en la pierna contralateral y se le colocó un manguito en la pierna izquierda. Durante el ejercicio ambas incisiones fueron cubiertas con plástico transparente. Una vez los sujetos estuvieron sentados en el cicloergómetro se les realizaron las mediciones de reposo. Dos minutos después se inició el ejercicio incremental en normoxia o tras cinco minutos de exposición a la hipoxia, para los ejercicios en hipoxia. Cuando el sujeto alcanzó el final del test !!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!Resumen!de!Métodos! ! Página!56!!Rafael!Sánchez!de!Torres5Peralta! de esfuerzo (extenuación) se infló el manguito instantáneamente (300mmHg) y se tomó una biopsia perpendicular al muslo a los 10 s del final del test incremental. Por último 60 s después del final del incremental se obtuvo una última biopsia con la punta apuntando proximalmente a 45º de inclinación. Todas las biopsias fueron inmediatamente congeladas en nitrógeno líquido y guardadas a -80ºC. Se registró la potencia durante los ejercicios a través de la potencia instantánea y la media proporcionada por el cicloergómetro. El resto de técnicas comunes fueron las mismas que en el estudio I. Para más detalles consultar la sección de material y métodos del Estudio II anexado. Los metabolitos musculares se obtuvieron mediante el análisis de 30mg de tejido húmedo de cada biopsia, liofilizado, limpiado y pulverizado refrigerado en hielo con un mortero manual. A continuación las muestras se suspendieron en 0.5 M HClO4 y se centrifugaron a 15000g a 4ºC durante 15 minutos. El sobrenadante se neutralizó con KHCO2 2.1 M y se determinaron las concentraciones de ATP, PCr, creatina, piruvato y lactato enzimáticamente en extracto neutralizado usando análisis fluorométrico (Lowry & Passonneau, 1972; MoralesAlamo et al., 2013). !!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!Resumen!de!Métodos! ! Rafael!Sánchez!de!Torres5Peralta!! Página!57! Estudio III. Ejercicio incremental Figura 6. Ejercicio incremental Unas semanas más tarde los sujetos realizaron cuatro test incrementales en dos días distintos separados por al menos una semana. Entre cada test descansaron 90 minutos. Cada test se compuso de una fase inicial incremental (20-30W cada 2 minutos, a 80rpm) en hipoxia severa (PIO2 73-74mmHg), similar a la de los test invasivos, que llevan hasta el agotamiento (Exh 1). En este momento se les suministró una mezcla de gases con la misma o menor hipoxia y se les animó a continuar el ejercicio incremental con el mismo ritmo hasta llegar al agotamiento de nuevo (Exh 2). Cuando no pudieron continuar con el esfuerzo, se les cambió a respirar aire ambiental y se les animó de nuevo a continuar con el esfuerzo hasta llegar al agotamiento final en normoxia (Exh 3). Las mezclas de gases que se les suministraron en Exh1 !!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!Resumen!de!Resultados! ! Página!64!!Rafael!Sánchez!de!Torres5Peralta! amplitud de señal (EMGRMS y TAI) fue mayor en normoxia que en hipoxia para todos los músculos, aunque en el vasto medial fue similar. La frecuencia mediana (MdPF) aumentó significativamente con la intensidad del ejercicio en ambos vastos pero no fue significativa en RF y BF. A una misma intensidad absoluta la frecuencia mediana del VL era mayor en hipoxia pero no se vio ningún efecto significativo de la FIO2 sobre la mediana de frecuencias en los demás músculos, ni diferencias cuando se comparan las mismas intensidades relativas. Las medias de frecuencia (Xie & Hampf) fueron similares. La duración de las contracciones musculares aumentaron con la intensidad del ejercicio sólo en los vastos (p<0.05) a pesar de tener en cuenta el efecto de pequeños cambios en la frecuencia de pedaleo, pero lo hicieron de manera independiente de la proporción de oxígeno en el aire inspirado. !!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!Resumen!de!Resultados! ! Rafael!Sánchez!de!Torres5Peralta!! Página!65! 5.2 Resumen de resultados artículo II. Task failure during exercise to exhaustion in normoxia and hypoxia is due to reduced muscle activation caused by central mechanisms while muscle metaboreflex does limit performance. Rafael Torres-Peralta, David Morales-Alamo, Miriam Gonzalez-Izal, Jose Antonio L Calbet, Jose Losa Reyna, Ismael Perez Suarez, Mikel Izquierdo. (under review). Los últimos diez segundos de ejercicio incremental en hipoxia muestran una disminución de las variables respiratorias como ventilación pulmonar, frecuencia respiratoria, pico de consumo de O2, así como de frecuencia cardiaca y de la potencia máxima alcanzada, comparadas con los valores en normoxia determinados en este estudio II. El rendimiento en el ejercicio de sprint, es menor tras un incremental, como ya se ha reportado antes (MoralesAlamo et al., 2015b), en un (32-46% P ≤ 0.05). La potencia pico y la potencia de un sprint fueron ~11% menores tras un incremental en normoxia comparado con el sprint tras un incremental en hipoxia (P ≤ 0.05). El rendimiento en el sprint aumentó con la recuperación isquémica. Tras 60 segundos de isquemia la potencia pico y potencia media fueron un 11 y 23% mayores que las observadas cuando el sprint se realizó a los 10 s (P ≤ 0.05) (MoralesAlamo et al., 2015b). Durante los test incrementales el pH, ATP, y PCr se redujeron en la misma proporción, independientemente de la oxigenación (ANOVA de efecto tiempo: P ≤ 0.05). Se mantuvieron al menos igual de bajos desde los 10 a los 60 segundos de isquemia. A la inversa el lactato aumentó igualmente en ambas condiciones y siguió acumulándose durante la isquemia. La respuesta de la señal EMG de los dos vastos fue similar y se combinaron ambos para reducir la variabilidad. La amplitud registrada en los últimos 10 segundos de prueba fue menor ambos vastos en hipoxia, comparada con la observada en el test incremental en normoxia. La RMS fue un 16% menor y el TAI normalizado un 23% (P ≤ 0.05). Comparados con los sprint control la amplitud durante los sprints tras el incremental se redujo en un 36% (RMS) y un 35% (RMSNz) y el TAINz se redujo un 42% tras el test incremental en normoxia y un 34% tras el test incremental en hipoxia. Durante los sprints postincremental la amplitud de señal RMS, RNSNz y TAINz fue aún 1.6, 1.7 y 2.9 veces mayor que la recogida durante los 10 s finales de los incremental anteriores (P ≤ 0.05). También la !!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!Resumen!de!Resultados! ! Página!66!!Rafael!Sánchez!de!Torres5Peralta! mediana de frecuencia (MdPF) se redujo, un 18% tras normoxia y un 9% tras hipoxia (ambos P ≤ 0.05), siendo por tanto un 9% menor tras normoxia. La frecuencia media (Xie & Hampf) tuvo un compartimento similar. Tras 60s de reposo isquémico la RMSNz comparada con la de 10s de oclusión tendió a ser un 14% menor (P=0.059). También se redujo un 9% la duración de los burst tras la oclusión de 10 s comparados con el sprint control, pero se recuperó tras 60 s de oclusión. La duración de los burst fue un 3% más larga en sprint tras hipoxia que tras normoxia. !!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!Resumen!de!Resultados! ! Rafael!Sánchez!de!Torres5Peralta!! Página!67! 5.3 Resumen de resultados artículo III (Rafael Torres-Peralta et al, Submitted). Oxygenation at fatigue in hypoxia increases muscle activation and relieves fatigue: influence of PIO2. Rafael Torres-Peralta, Jose Losa Reyna, David Morales-Alamo, Miriam Gonzalez-Izal, Ismael Perez Suarez, Mikel Izquierdo, Jose Antonio L Calbet. (Submitted). Los últimos treinta segundos de ejercicio incremental en hipoxia se caracterizaron por una menor potencia máxima (Wmax), un menor consumo de oxígeno (VO2peak), una menor ventilación (VEpeak), frecuencia respiratoria (RR), frecuencia cardiaca (HRpeak), saturación de la oxígeno de la hemoglobina (SpO2), así como de las presiones parciales de oxígeno y dióxido de carbono al final de la espiración (PETO2, PETCO2), que en normoxia (ver tabla 1, en el artículo incorporado en el anexo). No obstante, la tasa de intercambio respiratorio (RER) fue mayor en hipoxia (todos P≤0.05). La activación muscular medida como RMS en bruto, RMSNz y TAI de los vastos lateral y medial fue de un 8 a 20% menor en hipoxia que en normoxia. La MPF fue un 5% menor en normoxia que en hipoxia, mientras que el comportamiento fue similar para la MdPF. Cuando se administra un gas más oxigenado se pudo continuar el ejercicio en todos los casos. Comparados con los valores obtenidos en los últimos 30 s de hipoxia, en los primeros 30 s de la nueva oxigenación siempre aumentaron los consumos de oxígeno y la PETO2, a la vez que disminuyó la RER. Cuando se aumentó la SpO2 desde 68 hasta 70 o 78% correspondiente a 92 o 99mmHg la activación RMS, RMSNz, TAINz aumentó un 8%, y cuando se aumentó a 82 mmHg aumentó un 6% (SpO2 de 63 a 67%). Sin embargo la MPF y la MdPF no cambiaron. Hicimos un análisis de 10 s obviando los 5s posteriores al cambio de gas inspirado para confirmar estos cambios y así fue. No hubo efecto del paso a normoxia (143 mmHg) desde 92 y 99mmHg. Sin embargo, aumentó de un 5 a 9% la activación desde 82 a 143 mmHg y la de las dos condiciones más hipóxicas combinadas, aunque no lo hizo el TAI. Tampoco en este caso se modificaron las MPF o MdPF. No hubo cambios de activación al pasar al placebo, aunque mantuvieron el esfuerzo brevemente. !!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!Resumen!de!Resultados! ! Página!68!!Rafael!Sánchez!de!Torres5Peralta! Las duraciones de las contracciones (bursts) se redujeron al aumentar la cadencia con el aumento de la PIO2. ! ! !!Discusión! ! Rafael!Sánchez!de!Torres5Peralta!! Página!69! DISCUSIÓN GENERAL Se han presentado datos confirmando que la activación muscular aumenta casi linealmente con la intensidad del ejercicio. Los datos confirman que esta activación muscular está modulada por la fracción inspiratoria de O2, pero que esta influencia es específica para ciertos grupos musculares durante el ejercicio en cicloergómetro. Pueden darse diferentes comportamientos en distintos músculos debido a un cambio de patrones de activación de origen central (Amann et al., 2007b; Millet et al., 2012), una modulación de la activación de origen corticoespinal (Gerdle & Fugl-Meyer, 1992), diferentes respuestas metabólicas a la hipoxia (Parolin et al., 2000) o diferencias en el tipo de fibras y la vascularización de los músculos (Moritani et al., 1992). En roedores se ha demostrado una respuesta metabólica a la hipoxia específica de cada región en función del tipo de fibra predominante y el grado de capilarización (Wust et al., 2009). Este efecto de la fracción inspiratoria de oxígeno se muestra con una activación mayor en hipoxia de los extensores de la rodilla a una misma carga absoluta si la comparamos con normoxia. Consecuentemente esta mayor activación resulta en una mayor amplitud de la señal EMG. Posiblemente durante la mayor actividad de las motoneuronas se cause una demanda metabólica superior que, en el caso de aporte de oxígeno al cerebro limitado, como puede ocurrir en un ejercicio incremental en hipoxia aguda, puede aumentar la glicolisis, la liberación de lactato por el cerebro y alterar el metabolismo neuronal (Rasmussen et al., 2010; Overgaard et al., 2012). El aumento de la actividad de EMG a cargas submáximas podría reflejar un reclutamiento más de unidades motoras para compensar la fatiga de las unidades motoras que han estado más activas (Moritani et al., 1992). Esta mayor activación puede depender del grado de hipoxia durante ejercicio dinámico con grandes masas musculares (whole-body exercise), dado que experimentos realizados con mayores fracciones inspiratorias que las usadas en este experimento no han encontrado diferencias (Amann et al., 2007b). Lo mismo ha sucedido en el caso de tratarse de pequeños grupos musculares donde, de darse impacto de la hipoxia sobre la activación muscular, sería de menor entidad y no ha sido encontrada (Goodall !!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!Discusión! ! Página!70!!Rafael!Sánchez!de!Torres5Peralta! et al., 2010; Millet et al., 2012; Donnelly & Green, 2013). Dado que, de tratarse de un efecto de la oxigenación sobre el cerebro, sabemos que durante ejercicio con grupos musculares pequeños se perturba menos el intercambio gaseoso pulmonar, por lo que parece razonable que la oxigenación del cerebro se vea menos alterada (Amann & Calbet, 2008; Calbet & Lundby, 2009; Calbet et al., 2009) y los efectos sobre metabolismo del músculo y la capacidad de ejercicio son menores (Roach et al., 1999) o sólo se observan en hipoxia severa (Goodall et al., 2010). Cuando analizamos la mayor activación en hipoxia comparada con normoxia en nuestro modelo de manera relativa vemos que la activación es menor en hipoxia comparada con normoxia en todas las cargas relativas similares, desde el inicio hasta el máximo del ejercicio incremental donde se manifiesta una finalización prematura del ejercicio al no alcanzar los mismos valores de activación o potencia que en normoxia. La duración de las contracciones aumenta don la intensidad del ejercicio para los vastos, músculos responsables de generar gran parte de la fuerza de la extensión de rodilla, independientemente de la oxigenación que se reciba durante el incremental. Paralelamente la MPF y la MdPF se incrementan con la intensidad del esfuerzo (Peltonen et al., 1997) sin diferencias entre ambas oxigenaciones. Se ha propuesto que las estrategias de reclutamiento motor podrían ser determinadas indirectamente a través de la MPF y la MdPF (Solomonow et al., 1990; Sbriccoli et al., 2003). El hecho de tener que reducir la cadencia de pedaleo al alcanzar los 140 a 160W en hipoxia confirma un patrón de activación muscular alterado. Se sabe que este aspecto puede aumentar la señal EMG en algunos músculos (Marsh & Martin, 1995; Neptune et al., 1997; Sarre et al., 2003; Bieuzen et al., 2007). Al aumentar la cadencia de pedaleo por encima de 60 rpm podría aumentar la intensidad relativa del ejercicio (aunque la intensidad absoluta no cambie) (Chavarren & Calbet, 1999). Por ello, al menos una parte de ese incremento en EMG que se produce con cadencias mayores se debe probablemente al aumento en intensidad relativa. Pero en este caso aún habiendo descendido la cadencia en hipoxia ha seguido siendo superior a la que se produce en normoxia para la misma carga absoluta. Dado que la frecuencia de pedaleo disminuyó en ambas condiciones de oxigenación al alcanzar el 86% de su VO2max, ! ! !!Discusión! ! Rafael!Sánchez!de!Torres5Peralta!! Página!71! parece claro que sería la intensidad relativa y no las pequeñas diferencias en la cadencia de pedaleo la que dicta la estrategia de activación motora. Parecería que la fatiga supraespinal, entendida como una disminución en la fuerza debida a un impulso nervioso inferior al óptimo desde la corteza motora (Gandevia, 2001), podría estar relacionada con una oxigenación del cerebro reducida en hipoxia severa aguda causando inhibición corticospinal de la activación central. Nuestro estudio II confirma que la imposibilidad de continuar un ejercicio incremental en normoxia no está causado por fatiga muscular, como ya se había propuesto en estudios anteriores de ejercicio incremental (Coelho et al., 2015) y de intensidad constante (Marcora & Staiano, 2010a). Se extienden estos hallazgos también a los ejercicios incrementales en hipoxia aguda severa. Al haber realizado registro de la ergoespirometría incluyendo HR tenemos más información sobre el sistema respiratorio en estas condiciones y sabemos que la ventilación y la frecuencia respiratoria así como la frecuencia cardiaca fueron menores durante los últimos 10 segundos de un incremental en condiciones de hipoxia severa comparado con un incremental en normoxia. Pero simultáneamente mostramos que la activación muscular durante los últimos 10 segundos de un incremental en condiciones de hipoxia severa es menor que la obtenida en un incremental en normoxia. Es una diferencia que no puede explicarse de acuerdo a la acumulación de metabolitos. Sabemos que la percepción del esfuerzo por parte del sujeto es máxima, pero sin embargo la potencia generada es mucho menor en hipoxia que en normoxia y sin embargo no refleja un agotamiento de reservas energéticas de las fibras que tienen que realizar esta actividad, puesto que son capaces de realizar una activación y una potencia mucho mayor durante un sprint 10 s, que la potencia desarrollada en el momento de la extenuación durante el ejercicio incremental. Esto probablemente refleje un mecanismo central de fatiga que se habrá recuperado al menos parcialmente durante la isquemia de los miembros inferiores en los siguientes 10 s o 60 s antes del sprint. La oclusión durante estos periodos de reposo provocó un aumento de las señales aferentes de las terminaciones nerviosas del grupo III/IV musculares al exacerbar la fatiga periférica. En caso de ser un problema de disponibilidad de energía del músculo o de acumulación de metabolitos, el !!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!Discusión! ! Página!72!!Rafael!Sánchez!de!Torres5Peralta! descenso de reservas y la mayor acumulación de metabolitos hubieran debido causar un descenso aún mayor de la activación y la potencia generadas. Al realizar los sprints tras tan solo 10 s de reposo y compararlos con las recuperaciones tras 60 s tenemos información sobre recuperación central temprana. Hemos demostrado que la fatiga muscular, medida a través del rendimiento en un ejercicio de sprint al final de un ejercicio incremental, resulta ser menor tras un incremental en cicloergómetro en hipoxia severa aguda de lo que resulta en el caso de realizarlo en normoxia, a pesar de que la acumulación de metabolitos fue similar en ambos casos. Esto es compatible con el predominio de un mecanismo central de fatiga. Al emplear sprints isocinéticos se han evitado las diferencias de potencia que se generan con distintas cadencias de pedaleo, que en cualquier caso son menores en sujetos fatigados, en los que a 80 rpm se puede alcanzar el pico máximo de potencia (Beelen & Sargeant, 1991). Esta reducción en el rendimiento en sprint conlleva aparejada una disminución de la activación muscular que monitorizamos con EMG. Al haber medido la activación muscular con EMG ha sido posible detectar cambios de activación neural. El usar como test de potencia sprints nos ha permitido emplear un test específico de las tareas desarrolladas durante el test incremental. La disminución de la activación muscular tras el esfuerzo incremental (más notoria en normoxia que en hipoxia) podría significar la presencia de una recuperación más lenta de la fatiga central tras el incremental en normoxia, donde no hay cambio de oxigenación en la extenuación que pudiera tener un efecto ergogénico; o bien podría tratarse de que se haya producido una mayor activación de las rutas de utilización de oxígeno en la hipoxia que permitiera una mayor recuperación central en el mismo tiempo de descanso al normalizar la oxigenación. Curiosamente cuando el descanso se produce con los miembros en isquemia pero se alarga en su duración, el rendimiento de sprint aumentó en ambas condiciones (Morales-Alamo et al., 2015b). Este hallazgo no es compatible con un gran impacto de las aferentes musculares del grupo III/IV sobre el rendimiento de sprint. Curiosamente se realizó un aumento de rendimiento con menor activación EMGRMS que la recogida en los sprints tras 10 segundos de ! ! !!Discusión! ! Rafael!Sánchez!de!Torres5Peralta!! Página!73! isquemia, lo que demuestra una disociación entre la recuperación de señal EMGRMS y la recuperación del pico de potencia. Dada esta disociación cuando la potencia se ha recuperado relativamente no parece razonable creer que una menor EMGRMS tras 60 segundos de isquemia refleje realmente un fallo de las fibras musculares para responder a la activación neural. Al realizar biopsias y medir los metabolitos se puede conocer el estado metabólico de los músculos. En nuestros experimentos se produjo acumulación de lactato y H+ tras 60 segundos de oclusión. Puesto que la señal EMGRMS fue menor, pero la potencia mayor, tras 60 s de recuperación isquémica, nuestros datos indican que la acidificación de los músculos reduce la señal EMGRMS sin necesariamente reflejar aumento de fatiga muscular o reducción de activación desde el sistema nervioso central. Sin embargo, a pesar de unas concentraciones similares de metabolitos al inicio de los sprints la MPF y MdPF durante el ejercicio de sprint se vieron reducidas por fatiga muscular sin signos de recuperación, lo que indicaría que la MPF y la MdPF son sensibles al estado metabólico del músculo y no son buenos marcadores del patrón de reclutamiento de la motoneuronas medulares. Estos resultados parecen confirmar que las reducciones de MPF y MdPF estarían relacionadas con factores periféricos (Brody et al., 1991) completamente independientes de la acumulación de lactato y de H+ (VestergaardPoulsen et al., 1995). Hemos medido también las duraciones de las contracciones, que deberían ser siempre iguales al tratarse de un esfuerzo isocinético. No obstante, esta investigación demuestra que la duración de los burst disminuye con la fatiga. Este cambio revierte durante los 60s de recuperación en isquemia mientras la concentración de metabolitos sigue incrementándose. Para demostrar fatiga central es necesario mostrar que se produce un incremento de fuerza durante una contracción máxima estimulando eléctrica o magnéticamente la corteza, las vías nerviosas o el músculo (Gandevia et al., 1996), pero estos procedimientos tienen graves problemas para ser aplicados a tareas complejas como pedalear, por lo que se aplican a otros tipos de tareas máximas lo antes posible tras una tarea agotadora. Como ya se ha mencionado en la introducción, esto tiene asociados algunos problemas, desde la diferencia de las vías de !!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!Conclusiones! ! Página!80!!Rafael!Sánchez!de!Torres5Peralta! ! ! !!Conclusiones! ! Rafael!Sánchez!de!Torres5Peralta!! Página!81! CONCLUSIONES Las siguientes conclusiones han sido extraídas de los resultados de los estudios experimentales incluidos en la tesis. 1/ La activación muscular aumenta en relación casi lineal con la intensidad en el ejercicio incremental en cicloergómetro con un patrón específico para cada músculo. 2/ El patrón de incremento de la activación se ve modulado por la fracción inspiratoria de oxígeno y la intensidad relativa del esfuerzo. 3/ A una misma intensidad absoluta la activación es mayor en hipoxia severa aguda. 4/ A una misma intensidad relativa la activación es menor en hipoxia severa aguda. 5/ La duración de las contracciones del vasto medial y lateral del cuádriceps aumenta con la intensidad del ejercicio. 6/ En hipoxia severa equivalente a altitudes superiores a 4300 m sobre el nivel del mar la activación muscular máxima que se puede alcanzar durante un ejercicio incremental hasta el agotamiento es menor que en normoxia. 7/ La oxigenación en el punto de fatiga permite continuar el ejercicio cuando el agotamiento se ha producido en hipoxia moderada y severa de manera independiente de su efecto sobre la activación muscular. !!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!Conclusiones! ! Página!82!!Rafael!Sánchez!de!Torres5Peralta! 8/ La oxigenación en el momento de la extenuación aumenta la activación muscular cuando el esfuerzo se ha efectuado en hipoxia equivalente a altitudes sobre los 4300 m (PIO2 ≤ 82 mmHg) si logra una SaO2 ≥67%. ! ! !!Conclusiones! ! Rafael!Sánchez!de!Torres5Peralta!! Página!83! CONCLUSIONS The following conclusions have been extracted from the results of the experimental studies includes in this thesis. 1/ Muscle activation increases linearly with intensity during incremental exercise in whole body exercise following a muscle-specific pattern. 2/ The pattern of muscle activation is modulated depending on FIO2 and relative intensity of exercise. 3/ At a given absolute intensity muscle activation will be higher under severe hypoxia compared to normoxia. 4/ At a given relative intensity muscle activation will be lower under severe hypoxia compared to normoxia. 5/ Duration of burst of vastus medialis and vastus lateralis increases with exercise intensity. 6/ Under severe hypoxia equivalent to altitudes above 4300m the maximal muscular activation attainable in an incremental exercise to exhaustion is lower than under normoxia.. 7/ Oxygenation at task failure under moderate or severe hypoxia will allow continuing to exercise independently of the effect of the new inspired fraction of oxygen on the activation of the muscles. !!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!Conclusiones! ! Página!84!!Rafael!Sánchez!de!Torres5Peralta! 8/ Oxygenation at exhaustion under hypoxia equivalent to altitudes above 4300m (PIO2 ≤ 82 mmHg) whenever it reaches SaO2 ≥67% ! ! Bibliografía! ! Rafael!Sánchez!de!Torres5Peralta!! Página!85! Bibliografía Albertus-Kajee Y, Tucker R, Derman W & Lambert M. (2010). Alternative methods of normalising EMG during cycling. J Electromyogr Kinesiol 20, 1036-1043. Aldrich TK, Shander A, Chaudhry I & Nagashima H. (1986). Fatigue of isolated rat diaphragm: role of impaired neuromuscular transmission. J Appl Physiol (1985) 61, 1077-1083. Amann M & Calbet JA. (2008). Convective oxygen transport and fatigue. J Appl Physiol (1985) 104, 861-870. Amann M & Dempsey JA. (2008). Locomotor muscle fatigue modifies central motor drive in healthy humans and imposes a limitation to exercise performance. J Physiol 586, 161-173. Amann M & Kayser B. (2009). Nervous system function during exercise in hypoxia. High Alt Med Biol 10, 149-164. 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Calbet 1,3 Abstract Torres-Peralta, Rafael, Jose ´Losa-Reyna, Miriam Gonza ´lez-Izal, Ismael Perez-Suarez, Jaime Calle-Herrero, Mikel Izquierdo, and Jose ´A.L. Calbet. Muscle activation during exercise in severe acute hypoxia: Role of absolute and relative intensity. High Alt Med Biol 15:000–000, 2014.—The aim of this study was to determine the influence of severe acute hypoxia on muscle activation during whole body dynamic exercise. Eleven young men performed four incremental cycle ergometer tests to exhaustion breathing normoxic (F I o 2 =0.21, two tests) or hypoxic gas (F I o 2 =0.108, two tests). Surface electromyography (EMG) activities of rectus femoris (RF), vastus medialis (VL), vastus lateralis (VL), and biceps femoris (BF) were recorded. The two normoxic and the two hypoxic tests were averaged to reduce EMG variability. Peak Vo 2 was 34% lower in hypoxia than in normoxia ( p<0.05). The EMG root mean square (RMS) increased with exercise intensity in all muscles (p<0.05), with greater effect in hypoxia than in normoxia in the RF and VM ( p<0.05), and a similar trend in VL ( p=0.10). At the same relative intensity, the RMS was greater in normoxia than in hypoxia in RF, VL, and BF ( p<0.05), with a similar trend in VM ( p=0.08). Median frequency increased with exercise intensity (p<0.05), and was higher in hypoxia than in normoxia in VL ( p<0.05). Muscle contraction burst duration increased with exercise intensity in VM and VL ( p<0.05), without clear effects of F I o 2 . No significant F I o 2 effects on frequency domain indices were observed when compared at the same relative intensity. In conclusion, muscle activation during whole body exercise increases almost linearly with exercise intensity, following a muscle-specific pattern, which is adjusted depending on the F I o 2 and the relative intensity of exercise. Both VL and VM are increasingly involved in power output generation with the increase of intensity and the reduction in F I o 2 . Key Words: electromyogram; exercise; fatigue; human; hypoxia, median frequency; root mean square Introduction Muscle activation, as represented by the amplitude of surface electromyogram (EMG) increases during incremental exercise to exhaustion (Taylor and Bronks, 1996; Osawa et al., 2011). Greater EMG amplitude may originate from the combination of progressive recruitment of additional motor units and increases in the firing rate to raise muscle contraction intensity with the progression of power output, as shown using different contraction modes (Gottlieb and Agarwal 1971; Ericson 1986; Weir et al., 1992; Gonzalez-Izal et al., 2012). Muscle activation is also increased during repeated static (Viitasalo and Komi, 1977; Hausswirth et al., 2000) and dynamic (Sarre and Lepers, 2005) submaximal muscle contractions at a given absolute exercise intensity, mostly through additional motor unit recruitment as fatigue develops (BiglandRitchie et al., 1986; Fulco et al., 1996). The latter may be accompanied by increasing mean power frequency (MF) during low-intensity prolonged isometric contractions (10%– 20% of maximal voluntary contraction (MVC)) or decreasing MF at slightly higher intensities (30%–40% of MVC) (Arendt-Nielsen et al., 1989). A clear decrement of median power frequency (MPF) is observed during repeated high-intensity dynamic muscle contractions when power output is also declining due to fatigue (Tesch et al., 1990; Izquierdo et al., 2011). However, MPF increases (vastus lateralis) or remains at the same level (vastus medialis) during 5 sec knee extension isometric 1 Department of Physical Education, and 3 Research Institute of Biomedical and Health Sciences, IUIBS, University of Las Palmas de Gran Canaria, Campus Universitario de Tafira s/n, Las Palmas de Gran Canaria, Spain. 2 Department of Health Sciences, Public University of Navarra, Tudela, Spain. HIGH ALTITUDE MEDICINE & BIOLOGY Volume 00, Number 00, 2014 ªMary Ann Liebert, Inc DOI: 10.1089/ham.2014.1027 1 contractions going from 10% to 90% of the MVC interspaced with 2 min recovery periods (Pincivero et al., 2001). During repeated dynamic muscle contractions at high intensities, a decline in MPF reflects muscle fatigue (Amann et al., 2006), particularly if power output is declining (Tesch et al. 1990; Izquierdo et al., 2011), while an elevated MPF (or MF) may be indicative of fatigue during prolonged exercise at a fixed power output when the intensity of exercise is low or moderate (Sarre and Lepers, 2005). Nevertheless, a reduction in MPF has been also reported during prolonged exercise to exhaustion (Hausswirth et al., 2000). At a given absolute intensity, dynamic exercise is perceived as harder during exercise in severe hypoxia (i.e., F I o 2 <0.115), and the relative intensity of exercise is higher due to the lower Vo 2 max (Calbet et al., 2003). Consequently, the amount of muscle mass used and EMG amplitude is expected to be higher during exercise at the same absolute intensity in hypoxia, since the relative intensity is higher in hypoxia. The increase of exercise intensity, particularly above the lactate threshold, causes progressive muscle recruitment as shown using magnetic resonance (Endo et al., 2007). However, severe hypoxia has been shown to reduce central motor output (Millet et al., 2012) and, hence, muscle activation due to lower brain oxygenation in hypoxia than in normoxia (Goodall et al., 2012). So far experimental data are contradictory, with some studies reporting no effect of severe hypoxia on EMG amplitude during dynamic ( Taylor and Bronks, 1996; Donnelly and Green, 2013) or static (Millet et al., 2012) muscle contractions, and other reporting increased activity (Fulco et al., 1996). Moreover, the relationship between central motor output, voluntary activation, and EMG parameters is quite uncertain (Verges et al., 2012). Part of the discrepancies between studies could be due to the different muscles and/or different muscle type of actions (i.e., isometric vs. dynamic), evaluated in each study, since it has been recently shown that muscle activation patterns during incremental exercise in normoxia show marked intra and between-muscle heterogeneity (Hug et al., 2004), as reflected by the tissue water spin-spin transverse relaxation time (T2) from 1 H magnetic resonance imaging combined with local measures of exercise 31 P chemical shift imaging (Cannon et al., 2013). It remains unknown if EMG amplitude or MPF are affected by changes in the relative intensity of exercise due to differences in oxygenation during dynamic muscle actions. Therefore, the aim of this study was to determine the influence of severe acute hypoxia on thigh muscle activation, assessed with surface EMG, during dynamic exercise. We hypothesized that muscle activation would be higher during exercise in acute hypoxia with a muscle-specific pattern. Since severe hypoxia may reduce central motor output (Millet et al., 2012), we hypothesized also that at the same relative intensity muscle activation would be lower in severe hypoxia. To reduce EMG variability, two incremental exercise tests in normoxia were averaged and compared with the averages of two incremental exercise tests in severe hypoxia. Methods Subjects Eleven physically active and healthy men [mean –SD: 21.2 –2 years old, 71.7 –9 kg body weight, 173.6 –8cm height, 16 –5% body fat, 52.4 –5 mL.kg -1 .min -1 maximal oxygen consumption (Vo 2 max)] volunteered to participate in this project. Prior, to the experiment, all procedures and any potential risks were explained to each subject, and an informed consent document was signed. This study was approved by the ethics committee of the University of Las Palmas de Gran Canaria, and all experiments were performed in accordance with the Declaration of Helsinki. General procedures On the first visit to the laboratory, the body composition was determined by dual-energy x-ray absorptiometry (Hologic QDR-1500, Hologic Corp., software version 7.10, Waltham, MA) as described elsewhere (Calbet et al., 1998). Thereafter, subjects reported to the laboratory to become familiar with maximal exercise tests in normoxia and normobaric hypoxia (Altitrainer 200, SMTEC, Switzerland) on separate days. An average of 10 days later, subjects reported to the laboratory on 2 different test days, at least 1 week apart. In each test day, two sets of incremental cycle ergometer (Lode Excalibur Sport 925900, Groningen, The Netherlands) exercise tests to exhaustion, interspaced by a 90 min rest period, one in normoxia (inspired oxygen pressure, P I o 2 = 143 –1 mmHg) and another one in acute hypoxia P I o 2 = 74 –1 mmHg, were carried out in random order. In hypoxia, subjects were connected to the Altitrainer and after 2 min resting recordings were started. In both conditions, resting values were recorded during 2 min prior to the start of exercise. Thus, subjects were exposed to hypoxia 4 min before the start of the test in hypoxia. After the resting period, the load was set to 60W (hypoxia) or 80W (normoxia), and after 2 min the intensity was increased by 20–30W (hypoxia) or 30–40 W (normoxia) every 2 min until exhaustion, to have incremental exercise tests not too different in terms of duration between normoxia and hypoxia. Subjects were requested to keep a pedaling rate of 80 rpm. Exhaustion was defined as the inability to maintain a pedaling rate above 50 rpm despite strong verbal encouragement during 5 seconds. Oxygen uptake was measured with a metabolic cart (Vmax N29; Sensormedics, California, USA), calibrated prior to each test according to the manufacturer instructions. Respiratory variables were analyzed breath-by-breath and averaged every 20 sec for the assessment of Vo 2 peak and every minute for submaximal loads. The value recorded during the last minute of each submaximal load was used in the analyses. Electromyography Electrical muscle activation was monitored by means of surface electromyography (EMG). EMG signals were continuously recorded from four muscles of the left lower limb: rectus femoris (RF), vastus medialis (VM), vastus lateralis (VL), and biceps femoris (BF). Prior to the application of the EMG electrodes the skin surface was carefully shaved and wiped with alcohol to reduce skin impedance. Bipolar single differential electrodes were placed longitudinally on the muscles following the SENIAM recommendations (Merletti and Hermens, 2000) and taped to the skin to minimize movement artifacts. The reference electrode was placed on the skin over the acromion. The position of the electrodes was marked on the skin with indelible ink, and these references were used for precise electrode placement on repeated experiments. The EMG signals were acquired using a 16channel recording system (Myomonitor IV, Delsys Inc., 2 TORRES-PERALTA ET AL. Boston, MA) at a sampling rate of 1000 Hz using rectangularshaped (19.8 mm wide and 35 mm long) bipolar surface electrodes with 1 x 10 mm 99.9% Ag conductors, and an interconductor distance of 10 mm (DE-2.3 Delsys Inc.) and filtered with a high pass filter of 20 Hz and low pass filter of 450 Hz. The system has an input impedance of >10 15 O// 0.2pF, a common mode rejection ratio of >80 dB, signal-to-noise ratio <1.2 lV, and a pre-amplifier gain 1000 V/V –1%. Each pedal revolution was detected by using an electrogoniometer (Goniometer Biosignal Sensor S700 Joint Angle Shape Sensor; Delsys Inc.) fixed on the left knee and sampled at 500 Hz. EMG; joint movement were simultaneously recorded by a portable device (Myomonitor IV, Delsys Inc.) and wireless transmitted to a computer (EMGWorks Wireless application and EMGWorks Acquisition 3.7.1.3; Delsys, Inc.). EMG recordings were later analyzed using a custom-made application (Matlab R2012b, MathWorks, Natick, MA). The EMG signals were full wave rectified and RMS calculated using a 25 ms rolling window. Burst onset and offset detection was determined using as a reference 20% of the maximal RMS activity of each burst (Baum and Li, 2003; Hug and Dorel, 2009), rather than using a mean threshold value from 15 consecutive bursts (Ozgunen et al., 2010). This approach yielded the same result as direct simple visual discrimination, with 100% detection of all bursts in the four muscles. The RMS recorded during the last min of a 2 min 80 W load (in normoxia) was used to normalize the rest of the RMS data. In addition, we calculated a total activity index per minute (TAI) defined as TAI =RMS x burst duration (ms) x pedaling rate (rpm), which is similar to the integrated EMG signal, but computing separately each burst and excluding the baseline EMG between burst. The TAI recorded during the last min of a 2 min 80 W load (in normoxia) was used to normalize the rest of the TAI values. Mean (MF) and median (MPF) power spectrum frequencies were calculated using Fast Fourier Transform (FFT) (Solomonow et al., 1990). All variables were reported as the mean values of the pedal strokes recorded during the last minute of each load, or the fraction completed in the case of the last load. Methodological considerations Disagreements between previous studies could have been caused by the intrinsic variability of EMG recordings (Taylor and Bronks, 1995; Hug et al., 2004). For example, integrated EMG (iEMG) increases with increasing angular velocity during concentric contractions (Westing et al., 1991; Amiridis et al., 1996). Several normalization procedures have been used to reduce EMG variability. Normalization is achieved by comparing the root mean square (RMS) signal recorded during a given experimental condition to a reference RMS signal recorded during standardized reproducible conditions. This approach allows the comparison of RMS across muscles, time, and subjects (Albertus-Kajee et al., 2010). The most applied normalization method is achieved by dividing the RMS recorded during dynamic or static contractions by that obtained during a maximal voluntary contraction (MVC) under static conditions (isometric contraction) (Marsh and Martin, 1995; Hug and Dorel, 2009). This method of normalization is appropriate for static conditions, especially if performed at muscle length and joints angles close to those used in the reference contraction. However, this approach is less specific and less reproducible when the RMS obtained during an MVC is used to normalize dynamic contractions. An alternative procedure is to use RMS obtained during a reference dynamic condition as the normalizing value (Westing et al., 1991; Taylor and Bronks, 1995; Amiridis et al., 1996). Variability could be also reduced averaging some experiments performed under similar conditions, as usually done in O 2 kinetics studies (Jones et al., 2012). However, this latter approach has not been applied in EMG research. Statistical analysis A Students t-test was used to determine if there was a test order effect between the two tests performed in similar conditions. Since there were no significant test order effects, or differences between the tests performed in the same conditions, the two normoxic exercise tests were averaged and the two hypoxic tests, as well. Thus, only one set of data was left to represent each condition (normoxia and hypoxia). Exercise tests were compared using a two-wayANOVAforrepeatedmeasuresfollowedby pairwise comparisons with the Student’s t-test adjusted for multiple comparisons with the Bonferroni-Holm correction. The impact of pedaling rate on burst duration was assessed with ANCOVA for repeated measures using pedaling rate as a covariate. P£0.05 was considered significant. Analysis was performed using a commercially available software package (SPSS version 15.0, SPSS, Inc., Chicago, IL). Data are reported as means –standard deviation (SD), unless otherwise stated. Results Similar results were obtained in the two test performed in hypoxia (184 –23 and 182 –23 W, respectively, p= 0.72) and normoxia (284 –30 and 278 –34 W, respectively, p=0.34). However, the tests in normoxia were slightly longer than in hypoxia (850 –109 and 747 –84 sec, p<0.05). No significant differences were observed in the Vo 2 /power relationship between normoxia and hypoxia; however, peak Vo 2 was 34% lower in hypoxia than in normoxia ( p<0.05). At the same absolute load, pulmonary ventilation (V E ), heart rate and RER were higher in hypoxia than in normoxia (all, p<0.05), whilst P ET O 2 and P ET CO 2 were lower in hypoxia ( p<0.05) (Fig. 1). Pedaling rate was maintained around 80 rpm up to 86% of Vo 2 max; then it declined attaining a value close to 70 rpm in the last min of exercise in both conditions (Fig. 2). At high submaximal exercise intensities, pedaling rate was lower in hypoxia than in normoxia ( p<0.05), while it was notaffectedbyF I o 2 at the same relative intensity (Fig. 2). The RMS and TAIm increased with exercise intensity in all the examined muscles; this effect being more accentuated in the RF than in the other muscles ( p<0.05) (Figs. 3 and 4). The rate of increase of RMS and TAIm with absolute exercise intensity was greater in hypoxia than in normoxia in the RF and VM (interaction intensity x F I o 2 p<0.05), while a similar trend was seen in VL for RMS ( p=0.10). No significant F I o 2 effects were seen in RMS and TAI responses of the BF. However, at the same relative intensity the RMS was higher in normoxia than in hypoxia in RF, VL and BF (both p<0.05), while a similar trend was seen in VM ( p=0.08). Similar results were obtained in TAI [i.e., greater values in MUSCLE ACTIVATION DURING EXERCISE 3 normoxia than in hypoxia in RF, VM, and VL (the three, p<0.05), but not in BF ( p=0.08)] (Fig. 4). At the same absolute intensity, median frequency in VL was higher in hypoxia, while no significant effects of F I o 2 on median frequency were observed in the other muscles (Fig. 5). A significant increase of median frequency with exercise intensity was observed in VM and VL, while no significant influence of exercise intensity on RF and BF median frequencies were observed. The duration of the burst increased with exercise intensity only in VM and VL ( p<0.05), while no significant F I o 2 effects on burst duration were observed in any muscle (Fig. 5). This effect remained after accounting for small changes in pedaling rate. Mean frequency results (data not shown) were essentially similar to MPF. No significant effects of F I o 2 on frequency domain indices were observed when comparisons were performed at the same relative intensity. FIG. 1. Ergospirometric variables during incremental exercise to exhaustion in normoxia (F I o 2 =0.21, P I o 2 =141 mmHg) and hypoxia (F I o 2 =0.108, P I o 2 =74 mmHg), each point represents the mean and the error bars the standard error of the mean (n=11), only the points for which n=11 are depicted. *P<0.05 normoxia vs. hypoxia, same point. 4 TORRES-PERALTA ET AL. spired air on force production and electromyogram activity during ergometer rowing. Eur J Appl Physiol Occup Physiol 76:495–503. Pincivero DM, Campy RM, Salfetnikov Y, Bright A, and Coelho AJ. (2001). Influence of contraction intensity, muscle, and gender on median frequency of the quadriceps femoris. J Appl Physiol (1985) 90:804–810. Rasmussen P, Nielsen J, Overgaard M, Krogh-Madsen R, Gjedde A, Secher NH, and Petersen NC. (2010). 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CALBET1*, José Losa Reyna1, Ismael Pérez Suárez1, Mikel Izquierdo2 1Physical Education and Research Institute of Biomedical and Health Sciences (IUIBS), University of Las Palmas de Gran Canaria, Spain, 2Department of Health Sciences, Public University of Navarra, Public University of Navarra, Spain Submitted to Journal: Frontiers in Physiology Specialty Section: Exercise Physiology Article type: Original Research Article Manuscript ID: 174203 Received on: 27 Oct 2015 Frontiers website link: www.frontiersin.org In review Conflict of interest statement The authors declare that the research was conducted in the absence of any commercial or financial relationships that could be construed as a potential conflict of interest Author contribution statement Conception and design of the experiments: JAC; pre-testing, experimental preparation, data collection and analysis: RTP, DMA, JLR, IPS, and JAC; EMG analysis: RTP, MGI, and MI. The first version of the manuscript was written by RTP and JAC. All co-authors read, contributed comments and approved the final version of the manuscript. Keywords Fatigue, Electromyography, exhaustion, EMG, Lactate, high-intensity, hypoxia, performance Abstract Word count: 349 To determine whether task failure during incremental exercise to exhaustion (IE) is principally due to reduced neural drive and increased metaboreflex activation eleven men (22±2 years) performed a 10s control isokinetic sprint (IS; 80 rpm) after a short warm-up. This was immediately followed by an IE in normoxia (Nx, PIO2:143 mmHg) and hypoxia (Hyp, PIO2:73 mmHg) in random order an separated by a 120 min resting period. At exhaustion, the circulation of both legs was occluded instantaneously (300 mmHg) during 10 or 60s to impede recovery and increase metaboreflex activation. This was immediately followed by and IS with open circulation. Electromyographic recordings were obtained from the vastus medialis and lateralis. Muscle biopsies and blood gases were obtained in separate experiments. During the last 10s of the IE, pulmonary ventilation, VO2, power output and muscle activation were lower in hypoxia than in normoxia, while pedaling rate was similar. Compared to the control sprint, performance (IS-Wpeak) was reduced to a greater extent after the IE-Nx (11% lower P<0.05) than IE-Hyp. The root mean square (EMGRMS) was reduced by 38 and 27% during IS performed after IE-Nx and IE-Hyp, respectively (Nx vs. Hyp: P<0.05). Post-ischemia IS-EMGRMS values were higher than during the last 10s of IE. Sprint exercise mean (IS-MPF) and median (IS-MdPF) power frequencies, and burst duration, were more reduced after IE-Nx than IE-Hyp (P<0.05). Despite increased muscle lactate accumulation, acidification, and metaboreflex activation from 10 to 60s of ischemia, IS-Wmean (+23%) and burst duration (+10%) increased, while IS-EMGRMS decreased (-24%, P<0.05), with IS-MPF and IS-MdPF remaining unchanged. In conclusion, close to task failure, muscle activation is lower in hypoxia than in normoxia. Task failure is predominantly caused by central mechanisms, which recover to great extent within one minute even when the legs remain ischemic. There is dissociation between the recovery of EMGRMS and performance. The reduction of surface electromyogram MPF, MdPF and burst duration due to fatigue is associated but not caused by muscle acidification and lactate accumulation. Despite metaboreflex stimulation, muscle activation and power output recovers partly in ischemia indicating metaboreflex activation has a minor impact on sprint performance. Funding statement This study was supported by a grant from the Ministerio de Educación y Ciencia of Spain (DEP2009-11638 and FEDER) and VII Convocatoria de Ayudas a la Investigación Cátedra Real Madrid-Universidad Europea de Madrid (2015/04RM) Ethics statement (Authors are required to state the ethical considerations of their study in the manuscript including for cases where the study was exempt from ethical approval procedures.) Did the study presented in the manuscript involve human or animal subjects: Yes Please state the full name of the ethics committee that approved the study. If the study was exempt from this requirement please state the reason below. Comité Ética de Experimentación Humana de la Universidad de Las Palmas de Gran Canaria Please detail the consent procedure used for human participants or for animal owners. If not applicable, please state this. Before volunteering, subjects received full oral and written information about the experiments and possible risks associated with participation. Written consent was obtained from each subject. The study was performed by the Helsinki Declaration. In review Please detail any additional considerations of the study in cases where vulnerable populations were involved, for example minors, persons with disabilities or endangered animal species. If not applicable, please state this. Not applicable In review Task%failure%during%exercise%to%exhaustion%in%normoxia%and%hypoxia%is%due%to% reduced%muscle%activation%caused%by%central%mechanisms%while%muscle% metaboreflex%does%limit%performance%% ! Rafael!Torres+Peralta1,2,!David!Morales+Alamo1,!2,!Miriam!González+Izal3,!José!Losa+ Reyna1,2;!Ismael!Pérez+Suárez1,2,!Mikel!Izquierdo3,!José!A.L.!Calbet1,2.! ! ! ! 1!Department!of!Physical!Education,!University!of!Las!Palmas!de!Gran!Canaria,!Campus! Universitario!de!Tafira!s/n,!Las!Palmas!de!Gran!Canaria,!35017,!Spain.! 2!Research!Institute!of!Biomedical!and!Health!Sciences!(IUIBS),!Las!Palmas!de!Gran!Canaria,!Canary! Islands,!Spain.! 3!Department!of!Health!Sciences,!Public!University!of!Navarra,!Tudela,!Navarra!31500,!Spain.! ! ! ! ! Running%title:!Metaboreflex!activation!and!fatigue!in!normoxia!and!severe!acute! hypoxia! ! ! Correspondence%to:!! ! José!A!L!Calbet! Departamento!de!Educación!Física,!Campus!Universitario!de!Tafira,!! 35017!Las!Palmas!de!Gran!Canaria,!Canary!Island,!Spain.! Tel:!0034!928!458!896! Fax:!0034!928!458!867! email:[email protected]! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! In review ! 2! ! Abstract%1! To!determine!whether!task!failure!during!incremental!exercise!to!exhaustion!(IE)!2! is!principally!due!to!reduced!neural!drive!and!increased!metaboreflex!activation!3! eleven!men!(22±2!years)!performed!a!10s!control!isokinetic!sprint!(IS;!80!rpm)!4! after!a!short!warm+up.!This!was!immediately!followed!by!an!IE!in!normoxia!(Nx,!5! PIO2:143!mmHg)!and!hypoxia!(Hyp,!PIO2:73!mmHg)!in!random!order!an!separated!6! by!a!120!min!resting!period.!At!exhaustion,!the!circulation!of!both!legs!was!7! occluded!instantaneously!(300!mmHg)!during!10!or!60s!to!impede!recovery!and!8! increase!metaboreflex!activation.!This!was!immediately!followed!by!and!IS!with!9! open!circulation.!!Electromyographic!recordings!were!obtained!from!the!vastus&10! medialis!and!lateralis.!Muscle!biopsies!and!blood!gases!were!obtained!in!separate!11! experiments.!During!the!last!10s!of!the!IE,!pulmonary!ventilation,!VO2,!power!12! output!and!muscle!activation!were!lower!in!hypoxia!than!in!normoxia,!while!13! pedaling!rate!was!similar.!Compared!to!the!control!sprint,!performance!(IS+14! Wpeak)!was!reduced!to!a!greater!extent!after!the!IE+Nx!(11%!lower!P<0.05)!than!15! IE+Hyp.!The!root!mean!square!(EMGRMS)!was!reduced!by!38!and!27%!during!IS!16! performed!after!IE+Nx!and!IE+Hyp,!respectively!(Nx!vs.!Hyp:!P<0.05).!Post+17! ischemia!IS+EMGRMS!values!were!higher!than!during!the!last!10s!of!IE.!Sprint!18! exercise!mean!(IS+MPF)!and!median!(IS+MdPF)!power!frequencies,!and!burst!19! duration,!were!more!reduced!after!IE+Nx!than!IE+Hyp!(P<0.05).!Despite!increased!20! muscle!lactate!accumulation,!acidification,!and!metaboreflex!activation!from!10!to!21! 60s!of!ischemia,!IS+Wmean!(+23%)!and!burst!duration!(+10%)!increased,!while!IS+22! EMGRMS!decreased!(+24%,!P<0.05),!with!IS+MPF!and!IS+MdPF!remaining!23! unchanged.!!In!conclusion,!close!to!task!failure,!muscle!activation!is!lower!in!24! In review ! 3! hypoxia!than!in!normoxia.!Task!failure!is!predominantly!caused!by!central!25! mechanisms,!which!recover!to!great!extent!within!one!minute!even!when!the!legs!26! remain!ischemic.!There!is!dissociation!between!the!recovery!of!EMGRMS!and!27! performance.!The!reduction!of!surface!electromyogram!MPF,!MdPF!and!burst!28! duration!due!to!fatigue!is!associated!but!not!caused!by!muscle!acidification!and!29! lactate!accumulation.!Despite!metaboreflex!stimulation,!muscle!activation!and!30! power!output!recovers!partly!in!ischemia!indicating!metaboreflex!activation!has!a!31! minor!impact!on!sprint!performance.!!32! !33! %34! Keywords:%Fatigue,!electromyography,!exhaustion,!EMG,!lactate,!high+intensity,!35! hypoxia,!performance% %36! In review ! 4! Abbreviations.!!37! ADP:!Adenosine!diphosphate!38! ATP:!Adenosine!triphosphate!39! CNS;!Central!nervous!system!40! d.w.:!Dry!weight!41! DEXA:!Dual+energy!x+ray!absorptiometry!42! EMG:!Surface!electromyogram!43! EMGRMS:!Root!mean!square!of!the!EMG!!44! FIO2:!Inspired!oxygen!fraction!45! HR:!Heart!rate!!46! HRmax:!Maximal!heart!rate!47! Hyp:!Hypoxia!48! Hypb:!session!in!hypoxia!with!biopsies!taken!49! IE:!Incremental!exercise!to!exhaustion!50! MPF:!Mean!power!frequency!51! MdPF:!Median!power!frequency!52! MVC:!Maximal!voluntary!contraction!53! Nx:!Normoxia!54! Nxb:!Session!in!normoxia!with!biopsies!taken!55! PaO2:!Arterial!oxygen!pressure!56! PCr:!Phosphocreatine!57! PIO2:!Inspired!O2!pressure!58! RMS:!root!mean!square!59! RMSNz:!Normalized!root!mean!square!60! VE:!Minute!ventilation!61! In review ! 5! VO2:!Oxygen!consumption!!62! VO2max:!Maximal!oxygen!uptake!63! VO2peak:!Peak!oxygen!uptake!64! Wpeak+i:!Instantaneous!peak!power!output!65! Wmax:!Peak!power!output!at!exhaustion!during!the!incremental!exercise!test!66! Wmean:!mean!power!output!during!the!10s!sprints!67! w.w.:!wet!weight!68! TAI:!Total!activation!index! !69! In review ! 6! Introduction%70! Muscle!fatigue!has!been!defined!as!“any!exercise+induced!reduction!in!the!ability!71! to!exert!muscle!force!or!power,!regardless!of!whether!the!task!can!be!sustained!72! (Bigland+Ritchie!&!Woods,!1984),!that!can!be!reversed!by!rest”!(Gandevia,!2001).!73! The!mechanisms!leading!to!task!failure!may!involve!physiological!processes!at!74! neural!(central!fatigue)!or!muscular!levels!(peripheral!fatigue),!with!failure!at!the!75! neuromuscular!junction!included!in!the!“peripheral”!component!(Gandevia,!2001).!76! It!has!been!suggested!that!the!rate!of!muscle!fatigue!development!is!regulated!by!77! the!central!nervous!system!(CNS)!with!feedback!from!the!type!III!and!IV!muscle!78! afferents!(Amann!&!Dempsey,!2008),!which!sense!metabolite!accumulation,!79! particularly!H+,!lactate!and!ATP!(Light!et!al.,!2008).!Type!III/IV!muscle!afferents!80! have!been!reported!to!inhibit!corticospinal!drive!(Amann!&!Dempsey,!2008;!81! Rossman!et!al.,!2012;!Kennedy!et!al.,!2015),!with!greater!inhibitory!effect!on!82! extensor!than!flexor!muscles!(Martin!et!al.,!2006).!However,!whether!metabolite!83! accumulation!and!the!expected!metaboreflex!stimulation!impair!muscle!activation!84! and!limit!peak!power!during!whole!body!sprint!exercise!remains!unknown.!!85! ! During!whole+body!exercise!in!severe!acute!hypoxia!the!level!of!peripheral!86! fatigue!at!exhaustion!seems!lower,!indicating!that!central!mechanisms,!likely!87! linked!to!reduced!brain!oxygenation!(Rasmussen!et!al.,!2010),!predominate!over!88! local!mechanisms!in!determining!the!cessation!of!exercise!(Amann!et!al.,!2007).!In!89! agreement!with!this!hypothesis,!an!instantaneous!increase!of!the!inspired!O2!90! fraction!(FIO2)!from!0.21!to!1.00!does!not!eliminate!muscle!fatigue!at!the!end!of!an!91! incremental!exercise!test!performed!at!sea!level!(Calbet!et!al.,!2003a).!In!contrast,!92! during!constant+intensity!or!incremental!exercise!to!exhaustion!in!severe!hypoxia!93! In review ! 13! Power&output&and&oxygen&uptake&239! Power!output!during!the!sprint!was!reported!as!instantaneous!peak!power!output!240! (Wpeak+i)!and!mean!power!output!(Wmean)!during!the!10!s!duration!of!the!sprint.!241! Oxygen!uptake!was!measured!with!a!metabolic!cart!(Vmax!N29;!Sensormedics,!242! Yorba!Linda,!California,!USA),!calibrated!before!each!test!according!to!the!243! manufacturer!instructions,!with!high+grade!calibration!gasses!(Carburos!Metálicos,!244! Las!Palmas!de!Gran!Canaria,!Spain).!Respiratory!variables!were!analyzed!breath+245! by+breath!and!averaged!every!20!s!during!the!incremental!exercise!tests.!The!246! highest!20+s!averaged!VO2!recorded!in!normoxia!was!taken!as!the!VO2max.!The!247! same!criterion!was!applied!to!determine!the!VO2peak!in!hypoxia.!!!248! !249! Muscle&metabolites&250! From!each!muscle!biopsy,!30!mg!of!wet!tissue!were!freeze+dried,!cleaned!and!251! powdered!with!a!manual!mortar!on!ice.!Subsequently,!the!samples!were!252! suspended!in!0.5!M!HClO4!and!centrifuged!at!15000!g!at!4!°C!for!15!min.!The!253! supernatant!was!neutralized!with!KHCO3!2.1M.!ATP,!phosphocreatine!(PCr),!254! creatine,!pyruvate!and!lactate!concentrations!were!enzymatically!determined!in!255! neutralized!extracts!by!fluorometric!analysis!(Lowry!&!Passonneau,!1972;!256! Morales+Alamo!et!al.,!2013).!!257! &258! Electromyography&&259! Electrical!muscle!activation!was!monitored!using!surface!electromyography!260! (EMG).!EMG!signals!were!continuously!recorded!from!the!vastus&medialis!and!261! vastus&lateralis.!Before!the!application!of!the!EMG!electrodes!the!skin!surface!was!262! In review ! 14! carefully!shaved!and!wiped!with!alcohol!to!reduce!skin!impedance.!Bipolar!single!263! differential!electrodes!were!placed!longitudinally!on!the!muscles!following!the!264! SENIAM!recommendations!(Merletti!&!Hermens,!2000)!and!taped!to!the!skin!to!265! minimize!movement!artifacts.!The!reference!electrode!was!placed!on!the!skin!over!266! the!acromion.!The!position!of!the!electrodes!was!marked!on!the!skin!with!indelible!267! ink,!and!these!references!were!used!for!precise!electrode!placement!on!repeated!268! experiments.!!269! !The!EMG!signals!were!acquired!using!a!16+channel!recording!system!270! (Myomonitor!IV,!Delsys!Inc.,!Boston,!MA)!at!a!sampling!rate!of!1000!Hz!using!271! rectangular!shaped!(19.8!mm!wide!and!35!mm!long)!bipolar!surface!electrodes!272! with!1!x!10!mm!99.9%!Ag!conductors,!and!with!an!inter+conductor!distance!of!10!273! mm!(DE+2.3!Delsys!Inc).!The!EMG!data!were!filtered!with!a!high+pass!filter!of!20!274! Hz!and!a!low+pass!filter!of!450!Hz!using!a!fifth+order!Butterworth!filter.!The!275! system!has!an!input!impedance!of!>1015Ω!per!0.2pF!of!input!capacitance,!a!276! common!mode!rejection!ratio!of!>80!dB,!signal+to+noise!ratio!<!1.2!μV,!and!a!pre+277! amplifier!gain!1000!V/V!±1%.!Each!pedal!revolution!was!detected!using!an!278! electrogoniometer!(Goniometer!Biosignal!Sensor!S700!Joint!Angle!Shape!Sensor;!279! Delsys!!Inc.!Boston)!fixed!on!the!left!knee!and!sampled!at!500!Hz.!EMG!and!joint!280! movement!were!simultaneously!recorded!by!a!portable!device!(Myomonitor!IV,!281! Delsys!Inc.!Boston)!and!wirelessly!transmitted!to!a!computer!(EMGWorks!Wireless!282! application!and!EMGWorks!Acquisition!3.7.1.3;!Delsys,!Inc.!Boston).!!283! ! The!EMG!signal!corresponding!to!each!muscle!contraction!was!analyzed!284! using!code!developed!‘in!house’!(Matlab!R2012b,!MathWorks,!Natick,!MA,!USA).!285! The!EMG!recordings!were!full+wave!rectified!and!to!provide!an!index!of!muscle!286! In review ! 15! activation,!the!amplitude!characteristics!were!analyzed!via!average!RMS!of!a!25+287! ms!moving!window!for!the!duration!of!the!burst.!Burst!onset!and!offset!detection!288! were!determined!using!20%!of!the!maximal!EMGRMS!activity!of!each!burst!as!a!289! reference!(Hug!&!Dorel,!2009;!Baum!&!Li,!2003;!Torres+Peralta!et!al.,!2014),!rather!290! than!a!mean!threshold!value!from!15!consecutive!bursts!(Ozgunen!et!al.,!2010).!291! This!approach!yielded!the!same!result!as!direct,!simple!visual!discrimination,!with!292! 100%!detection!of!all!bursts.!The!EMGRMS!recorded!during!the!last!minute!of!a!2!293! min!80!W!load!(in!normoxia)!was!used!to!normalize!the!remaining!EMGRMS!data.!294! Besides,!we!defined!a!total!activity!index!during!the!sprint!(TAI)!as!TAI!=!EMGRMS!x!295! burst!duration!(ms)!x!number!of!pedal!strokes!during!the!sprint.!The!total!activity!296! index!is!similar!to!the!integrated!EMG!signal,!but!was!computed!separately!for!297! each!burst!and!excluded!the!baseline!EMG!between!burst!(Torres+Peralta!et!al.,!298! 2014).!The!TAI!recorded!during!the!last!minute!of!a!2!min!80!W!load!(in!normoxia)!299! was!used!to!normalize!the!rest!of!the!TAI!values.!300! !The!mean!(MPF)!and!median!(MdPF)!power!spectrum!frequencies!were!301! calculated!using!Fast!Fourier!Transform!(Solomonow!et!al.,!1990).!All!variables!302! were!reported!as!the!mean!values!of!the!pedal!strokes!recorded!during!the!last!10!303! s!of!the!incremental!exercise!or!the!10!s!sprints.!!EMG!variables!responded!304! similarly!during!the!four!control!sprints.!Therefore,!to!reduce!EMG!variability!the!305! four!control!sprints!were!averaged.!EMG!data!are!reported!separately!for!vastus&306! medialis!and!lateralis,!and!also!as!the!average!of!the!two!muscles.!Since!the!307! incremental!exercise!tests!in!normoxia!and!hypoxia!were!repeated,!the!mean!of!308! each!pair!was!used!in!further!analysis!to!represent!either!normoxia!or!hypoxia.!!309! !310! In review ! 16! Statistics!311! Normal!distribution!of!variables!was!checked!with!the!Shapiro+Wilks!test.!A!312! repeated+measures!ANOVA!with!FIO2!condition!(normoxia!vs.!hypoxia)!and!313! occlusion!duration!(10!vs.!60!s)!was!used!to!analyze!the!responses!observed!314! during!the!sprints.!Pairwise!comparisons!at!specific!time!points!were!performed!315! with!Student!t+tests,!and!adjusted!for!multiple!comparisons!using!the!Holm–316! Bonferroni!method.!Values!are!reported!as!the!mean!±!standard!deviation!(unless!317! otherwise!stated).!P!≤!0.05!was!considered!statistically!significant.!All!statistical!318! analyses!were!performed!using!SPSS!v.15.0!for!Windows!(SPSS!Inc.,!Chicago,!IL)!319! and!Excel!2011!(Microsoft,!Redmond,!WA,!USA).!320! !321! Results%322! Incremental&exercise&323! Compared!to!normoxia,!Wmax,!pulmonary!ventilation,!respiratory!rate,!heart!rate!324! and!VO2peak!were!reduced!during!the!last!10!s!of!exercise!in!hypoxia.!Additional!325! information!regarding!the!respiratory!and!cardiovascular!responses!to!the!IE!can!326! be!found!elsewhere!(Morales+Alamo!et!al.,!2015;!Calbet!et!al.,!2015).!The!327! ergospirometric!variables!corresponding!to!the!last!10!s!of!incremental!exercise!328! are!reported!in!Table!1,!together!with!the!corresponding!electromyographic!329! responses.!330! & &331! In review ! 17! Muscle&fatigue&332! Sprint!performance!was!reduced!at!the!end!of!the!IEs!(Fig.!3),!as!previously!333! reported!(Morales+Alamo!et!al.,!2015).!Compared!to!the!control!sprints,!post+IE!334! sprint!performance!was!reduced!(32+46%,!P<0.05).!Sprint!Wpeak+i!was!11%!335! lower!following!post+IE!in!normoxia!than!hypoxia.!Similar!effects!were!observed!in!336! Wmean.!Sprint!performance!was!improved!after!ischemic!recovery.!!Wpeak+I!and!337! Wmean!were!11!and!23%!higher,!respectively,!following!60!than!10!s!of!occlusion!338! (P<0.05),!as!previously!reported!(Morales+Alamo!et!al.,!2015).!339! !340! EMG&responses&341! Vastus&lateralis&EMGs.!Figure!2!depicts!an!example!of!the!EMG!recordings!during!342! one!experimental!day.!During!the!last!10!s!of!the!incremental!exercise!to!343! exhaustion!the!raw!(average!of!the!two!muscles)!and!normalized!RMS!was!16%!344! lower!in!hypoxia!than!in!normoxia,!respectively!(P<0.05)!(Table!1).!The!average!345! normalized!TAI!was!also!lower!(23%)!in!hypoxia!than!in!normoxia!(P<0.001).!The!346! median!frequency!was!6%!lower!in!normoxia!than!hypoxia!(P<0.05).!The!mean!347! and!median!frequencies!during!the!last!10s!of!the!IE!remained!at!the!same!level!348! during!the!subsequent!sprints.!349! !The!average!RMS,!RMSNz,!and!TAINz!were!1.6,!1.7!and!2.9+fold!higher!350! during!the!sprints!post+IE!than!during!the!last!10s!of!the!IE!(all,!P<0.05).!Compared!351! to!the!control!sprints,!the!RMSraw!and!the!normalized!RMSNz!were!reduced!by!36!352! and!35%,!respectively,!in!the!sprints!performed!after!the!IE!(Table!2).!Although!the!353! 60s!occlusion!caused!a!14%!lower!RMSNz!compared!to!the!10s!occlusion,!this!354! difference!did!not!reach!statistical!significance!(Main!effect!P=0.059).!Compared!to!355! In review ! 18! the!control!sprints!the!TAINz!was!reduced!by!42!and!34%!after!the!incremental!356! test!in!normoxia!and!hypoxia,!respectively!(P<0.05).!!357! Compared!to!the!control!sprint,!the!median!frequency!was!reduced!by!18!358! and!9%!following!the!IEs!in!normoxia!and!hypoxia,!respectively!(both,!P<0.05)!359! (Table!3).!Thus,!the!median!frequency!was!9%!lower!in!the!sprints!following!IE!in!360! normoxia!than!in!hypoxia!(Main!effect!P=0.011).!MPF!changes!were!essentially!361! similar!to!MdPF!(Tables!1,!2,!3,!and!4).!!362! Compared!to!the!control!sprints,!the!duration!of!the!bursts!was!reduced!by!363! 9%!in!the!sprints!performed!after!10s!occlusions.!Nevertheless,!after!60!s!of!364! occlusion,!the!duration!of!burst!in!the!following!sprints!achieved!the!same!value!as!365! in!the!control!sprints!(331.9±24.6!and!331.0±29.7!ms,!control!and!60s!after!IE,!366! respectively,!P=0.91).!The!duration!of!the!bursts!was!3%!longer!in!the!sprints!that!367! followed!an!IE!in!hypoxia!than!normoxia!(P=0.03).!The!average!contraction!time!368! (i.e.,!burst!duration!x!pedaling!rate)!was!15%!lower!during!the!last!10!s!of!IE!than!369! during!the!post+IE!sprints!(P<0.001).!370! Vastus&medialis&EMGs.!The!vastus&medialis!EMG!responses!to!incremental!(Tables!371! 1)!and!sprint!exercise!(Table!3)!were!similar!to!those!described!for!the!vastus&372! lateralis.!Therefore,!we!combined!both!vastus!EMGs!responses!to!reduce!variability!373! (Table!4).!The!combined!response!was!similar!to!that!reported!for!vastus&lateralis!374! and!medialis,!but!with!lower!variability,!confirming!some!of!the!effects!that!did!not!375! reach!statistical!significance!when!only!analysed!using!a!single!muscle!EMG!376! recordings.!377! & &378! In review ! 19! Muscle&metabolites&379! Muscle!metabolites!and!the!aerobic!and!anaerobic!energy!yield!during!the!sprints!380! have!been!reported!elsewhere!(Morales+Alamo!et!al.,!2015).!Briefly,!ATP!and!PCr!381! concentrations!were!reduced!to!a!similar!extent!both!in!normoxia!and!hypoxia!382! (ANOVA!time!effect:!P<0.05).!From!the!10th!to!60th!s!of!ischemic!recovery!ATP!383! concentration!remained!unchanged!while!PCr!declined!an!additional!~5%!(ANOVA!384! time!effect:!P<0.05!compared!to!Post!and!P<0.001,!compared!to!PRE).!Muscle!385! lactate!concentration!was!increased!to!similar!values!10!s!after!both!incremental!386! exercise!tests!(93.5±24.3!and!88.3±26.6!mmol!kg!d.w.+1,!in!normoxia!and!hypoxia,!387! respectively!(ANOVA!time!effect:!P<0.001).!From!the!10th!to!60th!s!of!ischemia!388! muscle!lactate!was!increased!by!24.0±20.7!and!21.6±24.5!mmol!kg!d.w.+1,!and!389! muscle!pH!reduced!by!0.102±0.040!and!0.109±0.041!units,!after!the!IE!in!390! normoxia!and!hypoxia,!respectively!(ANOVA!time!effect:!P<0.01).!!391! !392! Discussion%393! This!investigation!confirms,!in!agreement!with!previous!studies!using!constant!394! intensity!(Marcora!&!Staiano,!2010)!and!incremental!exercise!to!exhaustion!in!395! normoxia!(Coelho!et!al.,!2015),!that!task!failure!during!incremental!exercise!in!396! normoxia!is!not!caused!by!muscle!fatigue.!The!present!study!extends!these!397! findings!to!whole+body!incremental!exercise!in!severe!hypoxia.!We!have!also!398! shown!that!muscle!activation!during!the!last!10!s!of!an!incremental!exercise!to!399! exhaustion!is!lower!in!severe!hypoxia!than!in!normoxia.!This!reduction!in!muscle!400! activation!cannot!be!explained!by!differences!in!metabolite!accumulation!between!401! hypoxia!and!normoxia,!and!likely!reflects!central!mechanisms!of!fatigue,!which!402! In review ! 20! recovered,!at!least!partly,!during!the!next!10!or!60s!of!ischemia,!as!reflected!by!the!403! greater!activation!of!the!muscles!during!the!subsequent!sprint.!The!latter!occurred!404! despite!the!lower!energy!availability!and!the!greater!accumulation!of!metabolites!405! after!the!ischemic!recoveries.!We!have!shown!that!muscle!fatigue,!as!assessed!406! through!sprint!performance,!at!the!end!of!an!incremental!exercise!to!exhaustion,!is!407! lower!when!the!exercise!is!performed!in!severe!acute!hypoxia!than!in!normoxia!408! despite!similar!muscle!metabolite!accumulation.!This!is!also!compatible!with!the!409! incremental!exercise!in!hypoxia!ending!by!central!mechanism/s!acting!earlier,!i.e.,!410! with!a!lower!amount!of!peripheral!fatigue!in!hypoxia!than!in!normoxia.!This!411! reduction!in!sprint!performance!is!accompanied!by!a!greater!reduction!in!muscle!412! activation!(as!reflected!by!the!EMGRMS!changes)!in!the!sprints!carried!out!after!IE!413! in!normoxia!than!hypoxia.!This!could!be!interpreted!as!indicative!of!slower!414! recovery!of!central!fatigue!after!the!IE!performed!in!normoxia!than!hypoxia.!415! Strikingly,!following!60!s!of!recovery!with!complete!occlusion!of!the!circulation!416! sprint!performance!was!higher!than!that!observed!immediately!following!10!s!of!417! occlusion,!as!previously!reported!(Morales+Alamo!et!al.,!2015).!This!improvement!418! in!performance!was!achieved!with!lower!EMGRMS!compared!to!the!sprints!executed!419! after!10s!of!ischemia.!Thus,!this!investigation!demonstrates!dissociation!between!420! the!recovery!of!the!EMGRMS!and!the!recovery!of!power!output.!Since!occlusion!421! resulted!in!an!increase!of!muscle!lactate!and!H+!accumulation!from!10!s!to!60!s!of!422! occlusion!(Morales+Alamo!et!al.,!2015),!the!present!experiments!support!the!423! concept!that!muscle!acidification!reduces!the!EMGRMS!without!necessarily!424! reflecting!increased!muscle!fatigue!or!reduced!muscle!activation!by!the!central!425! nervous!system.!In!addition,!we!have!demonstrated!that!despite!similar!muscle!426! concentrations!of!lactate!and!H+!at!the!beginning!of!the!respective!sprints,!the!MPF!427! In review ! 21! and!MdPF!during!sprint!exercise!are!reduced!by!muscle!fatigue!when!the!sprint!is!428! performed!after!an!incremental!exercise!in!normoxia,!but!not!in!hypoxia.!MPF!and!429! MdPF!did!not!recover!from!the!end!of!the!incremental!exercise!to!the!start!of!the!430! sprints,!or!from!the!10th!to!the!60th!second!of!ischemia,!despite!cessation!of!neural!431! activation!and!appropriate!oxygenation!of!the!brain.!These!results!point!to!432! peripheral!mechanisms!being!primarily!responsible!for!the!reduction!of!MPF!and!433! MdPF!during!the!sprints!post+IE!(Brody!et!al.,!1991;!Juel,!1988).!Moreover,!despite!434! greater!lactate!and!H+!accumulation!after!60!s!of!ischemic!recovery,!sprint!exercise!435! MPF!and!MdPF!were!not!further!reduced;!therefore!these!two!metabolites!do!not!436! seem!to!account!for!the!observed!reduction!of!MPF!and!MdPF!with!muscle!fatigue!437! (Vestergaard+Poulsen!et!al.,!1995).!We!have!also!shown!that!the!duration!of!the!438! bursts!is!reduced!in!fatigued!muscles!contracting!under!isokinetic!conditions,!439! recovering!to!non+fatigued!levels!within!60!s,!regardless!of!the!muscular!440! concentrations!of!lactate!and!H+.!We!lastly!provided!evidence!for!a!minor!impact,!if!441! any,!of!increased!group!III/IV!afferent!feedback!on!sprint!exercise!performance.!!442! !443! Surface&EMG&changes&are&more&sensitive&to¢ral&than&peripheral&fatigue&444! To!demonstrate!the!existence!of!central!fatigue!it!is!necessary!to!show!that!during!445! a!maximal!voluntary!contraction,!direct!stimulation!of!motor!neural!pathways!or!446! cortical!motoneurons!results!in!greater!levels!of!force!than!elicited!voluntarily!447! (Gandevia!et!al.,!1996;!Merton,!1954).!These!procedures!have!several!constraints!448! limiting!their!application!to!complex!tasks,!such!as!pedaling.!To!circumvent!these!449! problems,!a!commonly!used!approach!has!been!to!carry!out!potentiated!and!450! interpolated!twitch!assessments!at!exhaustion!as!fast!as!possible,!i.e.,!1+2!minutes!451! In review ! 22! after!the!task!failure,!when!most!of!the!reduction!in!power!output!has!already!been!452! recovered!(Fernandez+del+Olmo!et!al.,!2013;!Sargeant!&!Dolan,!1987;!Coelho!et!al.,!453! 2015).!Another!limitation!of!stimulation!techniques!is!that!muscle!fatigue!is!task+454! specific!(Gandevia,!2001).!Stimulation!techniques!cannot!reproduce!the!455! complexity!of!motor!orders!involving!thousands!of!motor!units!from!different!456! muscles!firing!at!different!rates,!which!are!recruited!with!specific!timings!to!457! achieve!a!coordinated!movement.!Also,!in!fatigued!muscles,!the!increase!in!force!458! elicited!by!an!interpolated!twitch!may!be!due!in!part!to!intracellular!mechanisms!459! (i.e.,!a!peripheral!mechanism!that!is!likely!related!to!the!force/[Ca2+]i!relationship!460! (Gandevia!et!al.,!2013),!not!necessarily!reflecting!increased!central!fatigue.!!461! An!alternative!approach!for!assessing!muscle!fatigue!is!to!measure!the!462! maximal!power!that!can!be!generated!during!the!task!that!elicits!muscle!fatigue!463! (Marcora!&!Staiano,!2010;!Coelho!et!al.,!2015;!Cairns!et!al.,!2005).!However,!during!464! whole+body!exercise!on!the!cycle!ergometer,!pedaling!frequency!slows!down!close!465! to!task!failure!(Torres+Peralta!et!al.,!2014).!Given!the!dependency!of!power!on!466! muscle!contraction!velocity,!fatigue!should!ideally!be!tested!under!similar!muscle!467! contraction!velocities!as!during!isokinetic!pedaling!(Sargeant!&!Dolan,!1987).!468! In!the!present!experiments,!the!sprints!were!performed!in!isokinetic!469! conditions,!i.e.,!the!duration!of!each!pedaling!cycle!was!always!the!same,!regardless!470! of!the!state!of!muscle!fatigue!(Fig!2).!This!isokinetic!approach!was!possible!471! because!the!cycle!ergometer!servo+control!instantaneously!varied!the!resistance!472! applied!to!the!pedals!depending!on!the!force!exerted!resulting!in!a!constant!473! pedaling!rate!of!80!rpm.!These!conditions!allowed!us!to!examine!the!impact!of!474! In review ! 29! negative!influence!of!III/IV!afferent!discharge!on!voluntary!activation!was!also!622! relieved!very!rapidly.!This!quick!response!could!be!due!to!(i)!the!release!of!the!623! direct!compression!on!the!femoral!nerve,!(ii)!the!washout!of!metabolites!combined!624! with!oxygenation!due!to!reactive!hyperemia,!or!(iii)!the!combination!of!these!625! effects.!In!our!experimental!conditions,!the!hyperemic!response!to!the!release!of!626! the!cuff!was!likely!much!greater!than!in!Kennedy!et!al.!(2015)!as!reflected!by!the!627! rapid!increase!of!pulmonary!VO2!and!the!elevated!heart!rate!at!the!beginning!of!the!628! sprint!(Morales+Alamo!et!al.,!2015).!Another!interesting!aspect!of!the!study!by!629! Kennedy!et!al!(2015)!is!that!the!level!of!peripheral!fatigue!as!assessed!by!630! potentiated!twitches!remained!at!the!same!level!during!the!2!min!of!ischemia,!631! despite!5!x!2+s!long!MVC!maneuvers!(i.e.,!10!s!of!maximal!contractile!activity!with!632! occlusion!of!the!circulation).!Thus,!the!2!min!of!post+exercise!ischemia!did!not!633! worsen!peripheral!fatigue!(Kennedy!et!al.,!2015).!Although!Kennedy!et!al.!(2015)!634! did!not!measure!muscle!metabolites,!10!s!of!maximal!contractile!activity!during!635! the!2!min!of!ischemia,!in!combination!with!increased!metabolic!demand!due!to!the!636! preceding!MVC!(sustained!during!2!min),!should!have!increased!peripheral!fatigue!637! according!to!the!prevailing!paradigm.!!!638! The!present!investigation!strongly!suggests!that!the!inhibitory!role!of!639! muscle!afferent!discharge!on!the!corticospinal!motor!drive!during!maximal!640! intensity!whole+body!exercise!is!either!small!or!counteracted!by!a!strong!641! corticospinal!drive!(central!command).!Otherwise,!the!III/IV!muscle!afferent!642! feedback!due!to!ischemia!(PO2!close!to!0!mmHg!in!our!experimental!conditions)!643! and!the!metabolites!accumulated!during!the!IEs!should!have!decreased!Wpeak!and!644! Wmean!during!the!10!or!60!s!post+ischemia!sprints!below!the!Wmax!achieved!at!645! task!failure!in!the!IEs.!This!finding!contrasts!with!experiments!using!single!joint!646! In review ! 30! (Kennedy!et!al.,!2015;!Gandevia!et!al.,!1996)!or!handgrip!dynamic!contractions!647! (Broxterman!et!al.,!2015),!where!a!clear!inhibition!of!voluntary!activation!is!648! consistently!shown.!!649! In!the!present!investigation,!increased!III/IV!muscle!afferent!feedback!could!650! explain!why!the!observed!EMGRMS!were!lower!in!the!sprints!performed!after!60!s!651! than!after!10!s!of!ischemia.!Likewise,!that!MPF!and!MdPF!remained!at!task!failure!652! levels!during!the!post+IE!sprints!is!also!consistent!with!an!on+going!negative!653! feedback!reducing!motoneurons!firing!frequencies!(Broxterman!et!al.,!2015).!654! However,!the!power!output!achieved!during!the!sprints!after!60!s!of!ischemia!is!655! close!to!the!maximal!power!attainable!by!our!subjects!without!phosphagens!656! (Morales+Alamo!et!al.,!2015),!leaving!little!room!for!central!mechanisms!to!limit!657! sprint!performance!after!60!s!of!ischemia.!Thus,!it!seems!that!60!s!of!ischemic!658! recovery!allows!for!restoration!of!the!central!mechanisms!of!fatigue,!despite!the!659! discharge!from!the!III/IV!muscle!afferents.!The!latter!was!likely!counteracted!by!a!660! strong!central!command!and!a!rapid!reperfusion!of!the!muscle!upon!the!release!of!661! the!cuff!during!the!post+IE!sprints.!In!agreement!with!this!interpretation,!Amann!et!662! al.!(2009)!reported!no!effect!of!intrathecal!fentanyl!on!time!trial!performance,!663! although!the!power!output!profile!was!dramatically!changed.!664! !665! Reduced&sprint&EMGMRS&but&increased&power&output&after&60&than&10&s&postFexercise&666! ischemia&667! In&vitro!experiments!have!shown!that!lactate!and!H+!accumulation!may!facilitate!668! peripheral!recovery!by!increasing!chloride!conductance!(Pedersen!et!al.,!2003;!669! Nielsen!et!al.,!2001;!Karelis!et!al.,!2004).!Thus,!an!elevated!glycolytic!rate!combined!670! In review ! 31! with!a!progressive!rise!of!muscle!temperature!due!to!flow!arrest!during!ischemic!671! recovery!could!have!exerted!two!opposing!actions.!Positively,!increased!glycolysis!672! may!have!facilitated!peripheral!recovery!by!enhancing!sarcolemmal!excitability!673! (Pedersen!et!al.,!2003),!which!was!likely!depressed!immediately!after!the!IEs.!674! Negatively,!increased!glycolysis!and!the!subsequent!metabolite!accumulation!may!675! have!increased!III/IV!muscle!afferent!discharge,!interfering!with!muscle!activation.!676! The!combination!of!both!mechanisms!could!explain!the!lower!EMGRMS!values!677! observed!during!the!sprints!performed!60!s!compared!to!10!s!after!the!IEs.!If!we!678! assume!that!EMGRMS!is!a!valid!index!of!muscle!activation!and!corticospinal!motor!679! output,!a!greater!reduction!in!sprint!EMGRMS!after!prolonged!(60!s)!compared!to!680! shorter!(10!s)!ischemia!would!lead!to!the!untenable!conclusion!that!all!of!the!681! improvement!in!Wpeak!and!Wmean!observed!from!10!to!60!s!of!ischemic!recovery!682! is!due!to!peripheral!mechanisms.!Moreover,!this!peripheral+based!improvement!683! would!have!to!be!sufficient!to!counteract!the!reduced!motor!command.!A!more!684! plausible!explanation!is!that!for!a!given!level!of!neural!activation,!EMGRMS!is!685! reduced!by!metabolite!accumulation;!i.e.,!EMGRMS!does!not!faithfully!reflect!the!686! level!of!neural!activation!(Vestergaard+Poulsen!et!al.,!1995).!In!agreement!with!687! this!interpretation,!it!has!been!shown!that!central!fatigue!recovers!rapidly!upon!688! cessation!of!contractile!activity,!even!when!peripheral!fatigue!remains!at!the!same!689! level!(Gandevia!et!al.,!1996;!Bigland+Ritchie!et!al.,!1986).!Therefore,!the!observed!690! reduction!in!sprint!EMGRMS!after!60!s!compared!to!10!s!of!ischemic!recovery!is!691! unlikely!to!be!caused!by!increased!central!fatigue.!!692! & &693! In review ! 32! Fatigue&reduces&the&duration&of&the&burst&during&isokinetic&sprints&694! The!duration!of!the!burst!was!similarly!decreased!in!the!sprints!performed!10!s!695! after!the!incremental!exercise!in!hypoxia!and!normoxia.!However,!sprint!power!696! output!was!greater!after!the!incremental!exercise!in!hypoxia.!To!generate!greater!697! power,!more!mechanical!impulse!must!be!produced.!As!the!duration!of!the!bursts!698! (a!surrogate!of!contraction!time)!was!similar!in!the!sprints!performed!10!s!after!699! both!IEs,!the!subjects!must!have!applied!a!greater!force!on!the!pedals!after!the!700! hypoxic!IE.!Therefore,!greater!motor!cortical!drive!was!required!in!the!sprint!that!701! occurred!after!hypoxia.!In!agreement,!with!this!conclusion,!the!MPF!and!MdPF!702! were!higher!in!the!sprints!preceded!by!IE!in!hypoxia!than!normoxia,!suggesting!703! greater!firing!rates!(Solomonow!et!al.,!1990;!Sbriccoli!et!al.,!2003;!Gerdle!&!Fugl+704! Meyer,!1992)!and!a!lower!degree!of!central!fatigue!during!the!sprint!10!s!after!the!705! IE!in!hypoxia.!!Alternatively,!central!fatigue!could!have!recovered!more!rapidly!706! after!the!IE!in!hypoxia,!likely!due!to!a!direct!effect!of!oxygenation!on!the!central!707! nervous!system,!as!previously!postulated!(Amann!et!al.,!2007;!Calbet!et!al.,!2003a;!708! Calbet!et!al.,!2003b;!Kayser!et!al.,!1994).!!709! !710! Perception&of&effort&and&psychological&factors&711! In!our!experimental!conditions,!the!perception!of!effort!at!exhaustion!was!always!712! maximal!since!the!subjects!exercised!to!their!limits.!At!the!end!of!the!incremental!713! exercise,!muscle!activation!was!much!lower!than!during!the!subsequent!sprints,!714! despite!the!fact!muscles!remained!ischemic.!This!finding!indicates!that!task!failure!715! was!not!due!to!muscle!fatigue;!it!was!caused!by!reduced!muscle!activation.!Our!716! data!indicate!that!the!central!component!of!fatigue!recovered!very!fast.!This!717! In review ! 33! observation!is!compatible!with!a!perception!of!effort+mediated!task!failure!718! (Marcora!&!Staiano,!2010;!Bosio!et!al.,!2012).!Subjects!stopped!because!they!felt!719! that!the!effort!was!unbearable!despite!strong!verbal!encouragement.!The!10s!rest!720! presumably!eliminated!the!perception!of!effort!negative!feedback!on!the!motor!721! drive,!allowing!our!subjects!to!attain!the!actual!amount!of!power!they!could!722! generate!during!the!first!seconds!of!the!sprint.!Thus,!the!peak!power!output!during!723! the!first!seconds!of!the!sprint!reflects!almost!exclusively!what!the!muscle!and!the!724! central!nervous!system!can!achieve,!in!absence!of!a!strong!negative!feedback!from!725! the!perception!of!effort.!This!is!supported!by!the!fact!that!the!peak!power!output!726! reached!during!10!s!post+IE!sprints!is!close!to!that!expectable!in!the!case!of!no!727! availability!of!PCr.!Furthermore,!the!greater!power!output!during!the!first!seconds!728! of!the!sprint!after!60!than!10s!of!ischemia,!can!be!explained!by!enhanced!muscular!729! recovery!facilitated!by!the!glycolysis!as!recently!reported!(Morales+Alamo!et!al.,!730! 2015).!731! ! Although!psychological!factors!were!not!analyzed!in!this!study,!these!could!732! hardly!explain!the!greater!improvement!of!sprint!performance!observed!after!60!733! compared!to!10!s!occlusions.!In!fact,!all!subjects!expected!to!have!a!lower!734! contractile!capacity!after!the!longer!occlusions,!which!were!accompanied!by!more!735! unpleasant!feelings!than!the!10!s!occlusions.!Our!subjects!knew!that!exercise!in!736! hypoxia!feels!more!difficult!that!in!normoxia,!and!this!could!have!affected!more!737! their!motivation.!In!the!case!of!a!type!II!error,!metabolite!accumulation!will!be!738! compatible!with!an!earlier!disengagement!from!the!task!during!the!incremental!739! exercise!in!hypoxia!than!normoxia.!However,!this!investigation!has!shown!that!it!is!740! not!the!level!of!muscle!lactate!or!muscle!acidification!what!causes!task!failure!741! (Morales+Alamo!et!al.,!2015),!since!with!much!greater!lactate!accumulation!and!742! In review ! 34! muscle!acidification,!performance!was!markedly!higher!after!60!than!10!s!743! occlusions.!Thus,!the!greater!sprint!performance!10!s!after!the!incremental!744! exercise!in!hypoxia!compared!to!normoxia,!cannot!be!attributed!to!the!small!745! (statistically!non+significant)!differences!in!metabolite!accumulation!at!the!end!of!746! the!respective!IE!to!exhaustion.!It!remains!to!be!ascertained!if!task!failure!during!747! hypoxia!is!caused!by!altered!corticospinal!responsiveness!to!higher!orders!or!is!748! the!consequence!of!psychological!factors,!reducing!the!motivation!to!maintain!a!749! maximal!effort!(Marcora!&!Staiano,!2010).!!750! !751! ! In!summary,!task!failure!at!the!end!of!an!incremental!exercise!to!exhaustion!752! depends!more!on!central!than!peripheral!mechanisms,!as!indicated!by!the!fact!that!753! the!level!of!muscle!activation!observed!during!the!last!10s!of!the!incremental!754! exercise!was!much!lower!than!that!reached!10!s!later!during!a!10s!sprint,!despite!755! the!fact!that!muscle!remained!ischemic!from!the!end!of!exercise!to!the!start!of!the!756! sprint.!The!central!component!of!fatigue!appears!to!recover!to!a!greater!extent,!757! during!the!first!10!s!following!an!incremental!exercise!to!exhaustion!in!hypoxia!758! than!in!normoxia,!concomitant!with!a!rapid!change!to!normoxic!breathing!during!759! the!recovery.!We!have!also!shown!that!ischemic!recovery!after!incremental!760! exercise!to!exhaustion!allows!for!a!partial!restoration!of!power!output!despite!761! increased!acidification!and!reduced!EMGRMS.!Moreover,!this!study!demonstrates!762! that!MPF,!MdPF!and!the!duration!of!the!bursts!during!isokinetic!sprints!are!763! reduced!with!fatigue.!Lastly,!this!investigation!indicates!that!increased!group!III/IV!764! muscle!afferent!discharge!has!a!minor,!if!any,!negative!impact!on!sprint!exercise!765! performance!in!healthy!humans.!766! In review ! 35! Acknowledgements 767! This!study!was!supported!by!a!grant!from!the!Ministerio!de!Educación!y!Ciencia!of!768! Spain!(DEP2009+11638!and!FEDER)!and!VII!Convocatoria!de!Ayudas!a!la!769! Investigación!Cátedra!Real!Madrid+Universidad!Europea!de!Madrid!(2015/04RM).!770! Especially!thanks!are!given!to!José!Navarro!de!Tuero!for!his!excellent!technical!771! assistance.!!!772! 773! Author%contributions.!Conception!and!design!of!the!experiments:!JAC;!pre+774! testing,!experimental!preparation,!data!collection!and!analysis:!RTP,!DMA,!JLR,!IPS,!775! and!JAC;!EMG!analysis:!RTP,!MGI,!and!MI.!The!first!version!of!the!manuscript!was!776! written!by!RTP!and!JAC.!All!co+authors!read,!contributed!comments!and!approved!777! the!final!version!of!the!manuscript.!!778! !779! Conflict%of%interest%780! None!of!the!authors!has!any!conflicts!of!interests.!781! ! !782! In review ! 36! References!783! B.!Bigland+Ritchie,!and!J.J.!Woods!(1984).!Changes!in!muscle!contractile!properties!784! and!neural!control!during!human!muscular!fatigue.!Muscle&Nerve!7,!691+699.!785! S.C.!Gandevia!(2001).!Spinal!and!supraspinal!factors!in!human!muscle!fatigue.!786! Physiol.&Rev.!81,!1725+1789.!787! M.!Amann,!and!J.A.!Dempsey!(2008).!Locomotor!muscle!fatigue!modifies!central!788! motor!drive!in!healthy!humans!and!imposes!a!limitation!to!exercise!789! performance.!J.&Physiol.!586,!161+173.!790! A.R.!Light,!R.W.!Hughen,!J.!Zhang,!J.!Rainier,!Z.!Liu,!and!J.!Lee!(2008).!Dorsal!root!791! ganglion!neurons!innervating!skeletal!muscle!respond!to!physiological!792! combinations!of!protons,!ATP,!and!lactate!mediated!by!ASIC,!P2X,!and!TRPV1.!793! J.&Neurophysiol.!100,!1184+1201.!794! M.J.!Rossman,!M.!Venturelli,!J.!McDaniel,!M.!Amann,!and!R.S.!Richardson!(2012).!795! Muscle!mass!and!peripheral!fatigue:!a!potential!role!for!afferent!feedback?!796! Acta&Physiol.&(Oxf.)!206,!242+250.!797! D.S.!Kennedy,!S.C.!Fitzpatrick,!S.C.!Gandevia,!and!J.L.!Taylor!(2015).!Fatigue+related!798! firing!of!muscle!nociceptors!reduces!voluntary!activation!of!ipsilateral!but!799! not!contralateral!lower!limb!muscles.!J.&Appl.&Physiol.!118,!408+418.!800! P.G.!Martin,!J.L.!Smith,!J.E.!Butler,!S.C.!Gandevia,!and!J.L.!Taylor!(2006).!Fatigue+801! sensitive!afferents!inhibit!extensor!but!not!flexor!motoneurons!in!humans.!J.&802! Neurosci.!26,!4796+4802.!803! P.!Rasmussen,!J.!Nielsen,!M.!Overgaard,!R.!Krogh+Madsen,!A.!Gjedde,!N.H.!Secher,!804! and!N.C.!Petersen!(2010).!Reduced!muscle!activation!during!exercise!related!805! to!brain!oxygenation!and!metabolism!in!humans.!J.&Physiol.!588,!1985+1995.!806! M.!Amann,!L.M.!Romer,!A.W.!Subudhi,!D.F.!Pegelow,!and!J.A.!Dempsey!(2007).!807! Severity!of!arterial!hypoxaemia!affects!the!relative!contributions!of!808! peripheral!muscle!fatigue!to!exercise!performance!in!healthy!humans.!J.&809! Physiol.!581,!389+403.!810! J.A.!Calbet,!R.!Boushel,!G.!Radegran,!H.!Sondergaard,!P.D.!Wagner,!and!B.!Saltin!811! (2003a).!Determinants!of!maximal!oxygen!uptake!in!severe!acute!hypoxia.!812! Am.&J.&Physiol.&Regul.!284,!R291+R303.!813! J.A.!Calbet,!R.!Boushel,!G.!Radegran,!H.!Sondergaard,!P.D.!Wagner,!and!B.!Saltin!814! (2003b).!Why!is!VO2max!after!altitude!acclimatization!still!reduced!despite!815! normalization!of!arterial!O2!content?!Am.&J.&Physiol.&Regul.!284,!R304+316.!816! B.!Kayser,!M.!Narici,!T.!Binzoni,!B.!Grassi,!and!P.!Cerretelli!(1994).!Fatigue!and!817! exhaustion!in!chronic!hypobaric!hypoxia:!influence!of!exercising!muscle!818! mass.!J.&Appl.&Physiol.!76,!634+640.!819! T.J.!Hureau,!N.!Olivier,!G.Y.!Millet,!O.!Meste,!and!G.M.!Blain!(2014).!Exercise!820! performance!is!regulated!during!repeated!sprints!to!limit!the!development!of!821! peripheral!fatigue!beyond!a!critical!threshold.!Exp.&Physiol.!99,!951+963.!822! M.!Fernandez+del+Olmo,!F.A.!Rodriguez,!G.!Marquez,!X.!Iglesias,!M.!Marina,!A.!823! Benitez,!L.!Vallejo,!and!R.M.!Acero!(2013).!Isometric!knee!extensor!fatigue!824! In review ! 37! following!a!Wingate!test:!peripheral!and!central!mechanisms.!Scand.&J.&Med.&825! Sci.&Sports!23,!57+65.!826! G.C.!Bogdanis,!M.E.!Nevill,!L.H.!Boobis,!and!H.K.!Lakomy!(1996).!Contribution!of!827! phosphocreatine!and!aerobic!metabolism!to!energy!supply!during!repeated!828! sprint!exercise.!J.&Appl.&Physiol.!80,!876+884.!829! T.!Yoshida,!D.!Abe,!and!Y.!Fukuoka!(2013).!Phosphocreatine!resynthesis!during!830! recovery!in!different!muscles!of!the!exercising!leg!by!31P+MRS.!Scand.&J.&Med.&831! Sci.&Sports!23,!e313+319.!832! B.!Dawson,!C.!Goodman,!S.!Lawrence,!D.!Preen,!T.!Polglaze,!M.!Fitzsimons,!and!P.!833! Fournier!(1997).!Muscle!phosphocreatine!repletion!following!single!and!834! repeated!short!sprint!efforts.!Scand.&J.&Med.&Sci.&Sports!7,!206+213.!835! A.J.!Sargeant,!and!P.!Dolan!(1987).!Effect!of!prior!exercise!on!maximal!short+term!836! power!output!in!humans.!J.&Appl.&Physiol.!63,!1475+1480.!837! S.!Goodall,!J.!Gonzalez+Alonso,!L.!Ali,!E.Z.!Ross,!and!L.M.!Romer!(2012).!Supraspinal!838! fatigue!after!normoxic!and!hypoxic!exercise!in!humans.!J.&Physiol.!590,!2767+839! 2782.!840! S.!Goodall,!E.Z.!Ross,!and!L.M.!Romer!(2010).!Effect!of!graded!hypoxia!on!841! supraspinal!contributions!to!fatigue!with!unilateral!knee+extensor!842! contractions.!J.&Appl.&Physiol.!109,!1842+1851.!843! S.K.!Sidhu,!A.G.!Cresswell,!and!T.J.!Carroll!(2012).!Motor!cortex!excitability!does!not!844! increase!during!sustained!cycling!exercise!to!volitional!exhaustion.!J.&Appl.&845! Physiol.!113,!401+409.!846! S.K.!Sidhu,!D.J.!Bentley,!and!T.J.!Carroll!(2009).!Locomotor!exercise!induces!long+847! lasting!impairments!in!the!capacity!of!the!human!motor!cortex!to!voluntarily!848! activate!knee!extensor!muscles.!J.&Appl.&Physiol.!106,!556+565.!849! S.M.!Marcora,!and!W.!Staiano!(2010).!The!limit!to!exercise!tolerance!in!humans:!850! mind!over!muscle?!Eur.&J.&Appl.!109,!763+770.!851! G.Y.!Millet,!M.!Muthalib,!M.!Jubeau,!P.B.!Laursen,!and!K.!Nosaka!(2012).!Severe!852! hypoxia!affects!exercise!performance!independently!of!afferent!feedback!and!853! peripheral!fatigue.!J.&Appl.&Physiol.!112,!1335+1344.!854! S.K.!Sidhu,!J.C.!Weavil,!M.!Venturelli,!R.S.!Garten,!M.J.!Rossman,!R.S.!Richardson,!B.S.!855! Gmelch,!D.E.!Morgan,!and!M.!Amann!(2014).!Spinal!mu+opioid!receptor+856! sensitive!lower!limb!muscle!afferents!determine!corticospinal!857! responsiveness!and!promote!central!fatigue!in!upper!limb!muscle.!J.&Physiol.!858! 592,!5011+5024.!859! G.Y.!Millet,!D.!Aubert,!F.B.!Favier,!T.!Busso,!and!H.!Benoit!(2009).!Effect!of!acute!860! hypoxia!on!central!fatigue!during!repeated!isometric!leg!contractions.!Scand.&861! J.&Med.&Sci.&Sports!19,!695+702.!862! S.!Marcora!(2010).!Counterpoint:!Afferent!feedback!from!fatigued!locomotor!863! muscles!is!not!an!important!determinant!of!endurance!exercise!performance.!864! J.&Appl.&Physiol.!108,!454+456;!discussion!456+457.!865! M.!Amann,!M.!Venturelli,!S.J.!Ives,!J.!McDaniel,!G.!Layec,!M.J.!Rossman,!and!R.S.!866! Richardson!(2013).!Peripheral!fatigue!limits!endurance!exercise!via!a!867! In review ! 38! sensory!feedback+mediated!reduction!in!spinal!motoneuronal!output.!J.&Appl.&868! Physiol.!115,!355+364.!869! C.S.!Poon,!and!G.!Song!(2015).!Type!III+IV!muscle!afferents!are!not!required!for!870! steady+state!exercise!hyperpnea!in!healthy!subjects!and!patients!with!COPD!871! or!heart!failure.!Respir.&Physiol.&Neurobiol.!216,!78+85.!872! T.P.!Olson,!M.J.!Joyner,!J.H.!Eisenach,!T.B.!Curry,!and!B.D.!Johnson!(2014).!Influence!873! of!locomotor!muscle!afferent!inhibition!on!the!ventilatory!response!to!874! exercise!in!heart!failure.!Exp.&Physiol.!99,!414+426.!875! J.A.!Dempsey,!G.M.!Blain,!and!M.!Amann!(2014).!Are!type!III+IV!muscle!afferents!876! required!for!a!normal!steady+state!exercise!hyperpnoea!in!humans?!J.&Physiol.!877! 592,!463+474.!878! D.!Morales+Alamo,!J.!Losa+Reyna,!R.!Torres+Peralta,!M.!Martin+Rincon,!M.!Perez+879! Valera,!D.!Curtelin,!J.G.!Ponce+Gonzalez,!A.!Santana,!and!J.A.!Calbet!(2015).!880! What!limits!performance!during!whole+body!incremental!exercise!to!881! exhaustion!in!humans?!J.&Physiol.!593,!4631+4648.!882! J.A.!Calbet,!J.!Losa+Reyna,!R.!Torres+Peralta,!P.!Rasmussen,!J.G.!Ponce+Gonzalez,!883! A.W.!Sheel,!J.!de!la!Calle+Herrero,!A.!Guadalupe+Grau,!D.!Morales+Alamo,!T.!884! Fuentes,!L.!Rodriguez+Garcia,!C.!Siebenmann,!R.!Boushel,!and!C.!Lundby!885! (2015).!Limitations!to!oxygen!transport!and!utilization!during!sprint!exercise!886! in!humans:!evidence!for!a!functional!reserve!in!muscle!O2!diffusing!capacity.!887! J.&Physiol.!593,!4649+4664.!888! J.A.!Calbet,!J.!Chavarren,!and!C.!Dorado!(1997).!Fractional!use!of!anaerobic!capacity!889! during!a!30+!and!a!45+s!Wingate!test.!Eur.&J.&Appl.!76,!308+313.!890! W.!Wang,!Z.!Wang,!M.S.!Faith,!D.!Kotler,!R.!Shih,!and!S.B.!Heymsfield!(1999).!891! Regional!skeletal!muscle!measurement:!evaluation!of!new!dual+energy!X+ray!892! absorptiometry!model.!J.&Appl.&Physiol.!87,!1163+1171.!893! A.C.!Coelho,!D.T.!Cannon,!R.!Cao,!J.!Porszasz,!R.!Casaburi,!M.M.!Knorst,!and!H.B.!894! Rossiter!(2015).!Instantaneous!quantification!of!skeletal!muscle!activation,!895! power!production,!and!fatigue!during!cycle!ergometry.!J.&Appl.&Physiol.!118,!896! 646+654.!897! A.!Beelen,!and!A.J.!Sargeant!(1991).!Effect!of!fatigue!on!maximal!power!output!at!898! different!contraction!velocities!in!humans.!J.&Appl.&Physiol.!71,!2332+2337.!899! J.!Bergstrom!(1962).!Muscle!electrolytes!in!man.!Scand.&J.&Clin.&Lab.&Invest.&Suppl.!68,!900! 1+110.!901! B.!Guerra,!M.C.!Gomez+Cabrera,!J.G.!Ponce+Gonzalez,!V.E.!Martinez+Bello,!A.!902! Guadalupe+Grau,!A.!Santana,!V.!Sebastia,!J.!Vina,!and!J.A.!Calbet!(2011).!903! Repeated!muscle!biopsies!through!a!single!skin!incision!do!not!elicit!muscle!904! signaling,!but!IL+6!mRNA!and!STAT3!phosphorylation!increase!in!injured!905! muscle.!J.&Appl.&Physiol.!110,!1708+1715.!906! O.H.!Lowry,!and!J.V.!Passonneau!(1972).!A&Flexible&System&of&Enzymatic&Analysis.!907! New!York:!Academic!Press.!908! D.!Morales+Alamo,!J.G.!Ponce+Gonzalez,!A.!Guadalupe+Grau,!L.!Rodriguez+Garcia,!A.!909! Santana,!R.!Cusso,!M.!Guerrero,!C.!Dorado,!B.!Guerra,!and!J.A.!Calbet!(2013).!910! Critical!role!for!free!radicals!on!sprint!exercise+induced!CaMKII!and!911! In review