Desarrollo del diagnóstico molecular de virus exantemáticos: epidemiología molecular del virus del sarampión en España

Facultad de Ciencias de la Salud Departamento de Ciencias Clínicas II Programa de Doctorado de Microbiología y Parasitología AGNÓSTICO MOLECULAR DE VIRUS EXANTEMÁTICOS. EPIDEMIOLOGÍA MOLECULAR DEL VIRUS DEL SARAMPIÓN EN ESPAÑA. Tesis Doctoral presentada por Dª María del Mar Mosquera Gutiérrez Dirigida por el Dr. D. Juan Emilio Echevarría Mayo Madrid, a 15 de febrero de 2010 DESARROLLO DEL DI Quiero expresar mi agradecimiento a todas las personas que de una forma u otra me han empujado a scribir y me han demostrado su apoyo en tan ardua tarea. A Juan, que tuvo toda la paciencia que tiene la versión atea del santo Job. A Fernando, cuya contribución y apoyo han sido como mínimo estimulante. A Paco que comprendía perfectamente lo que significaba para mí tener que escribir la tesis. A Carolina que supo traspasarme un poco de toda su energía. A Ana Avellón que ha sido un ejemplo de voluntad permanente. A Inma que se ha “tragado este tocho”. A Sonia, Ana Bárcena, Quique, Alex y Marta que estuvieron ahí para aguantarme, tarea nada fácil. A Lourdes que me empujó gracias a una apuesta. A Juan Carlos que me brindó su ayuda y conocimientos. A Conchita, Irene, Ana, Paloma, Carmen, Manolo, Paco, José Miguel, Nieves, Lala, Lourdes, Isabel y Jesús por su inestimable trabajo. A Teo y Pilar que me decían “sin prisa pero sin pausa”, y desde luego lo hice “sin prisa”. A todos, que sois parte de este trabajo, muchas gracias. e i ÍNDICE DE CONTENIDOS ÍNDICE DE FIGURAS..........................................................................................................v ÍNDICE DE TABLAS .........................................................................................................vii ABREVIATURAS................................................................................................................ix RESUMEN.............................................................................................................................1 INTRODUCCIÓN...........................................................................................3 1. VIRUS DEL SARAMPIÓN...........................................................................................5 1.1 Estructura y composición.........................................................................................5 1.2 Ciclo de replicación del virus...................................................................................8 1.3 Patogenia..................................................................................................................9 1.3.1 Virulencia........................................................................................................11 1.3.2 Infección persistente........................................................................................11 1.4 Respuesta inmune...................................................................................................12 1.4.1 Inmunidad humoral.........................................................................................13 1.4.2 Inmunidad celular............................................................................................13 1.4.3 Supresión inmune............................................................................................14 1.4.4 Autoinmunidad................................................................................................14 1.5 Manifestaciones clínicas ........................................................................................14 1.6 Diagnóstico.............................................................................................................17 1.7 Epidemiología........................................................................................................18 1.8 Profilaxis. Vacuna triple vírica...............................................................................25 1.8.1 Pautas y vías de administración. .....................................................................26 1.8.2 Contraindicaciones..........................................................................................28 1.8.3 Efectos secundarios.........................................................................................28 1.8.4 Futuro de la vacuna triple vírica......................................................................29 2. CONTROL DEL SARAMPIÓN..................................................................................30 3. OTROS VIRUS PRODUCTORES DE EXANTEMA................................................36 3.1 Virus de la rubéola. ................................................................................................36 3.1.1 Manifestaciones clínicas. ................................................................................37 3.1.2 Epidemiología y control..................................................................................39 3.1.3 Diagnóstico......................................................................................................40 3.2 Parvovirus B19.......................................................................................................42 3.2.1 Manifestaciones clínicas. ................................................................................43 3.2.2 Epidemiología. ................................................................................................44 ii 3.2.3 Diagnóstico......................................................................................................45 3.3 Otros virus exantemáticos......................................................................................46 3.3.1 Adenovirus......................................................................................................46 3.3.2 Enterovirus......................................................................................................47 3.3.3 Herpesvirus......................................................................................................49 3.3.4 Virus del dengue..............................................................................................51 OBJETIVOS.................................................................................................53 MATERIAL Y MÉTODOS..............................................................................57 1. MUESTRAS Y CEPAS...............................................................................................59 1.1 Cepas de virus. .......................................................................................................59 1.2 Muestras post-vacunación y del biobanco del ISCIII. ...........................................59 1.3 Muestras clínicas del Plan Nacional de Eliminación del Sarampión.....................60 1.4 Muestras de sangre seca en papel de filtro y exudado faríngeo en tampón de lisis de extracción de ácidos nucleicos................................................................................63 1.5 Muestras clínicas de exantema vírico infantil en el contexto de una alta cobertura de vacunación con triple vírica.....................................................................................65 2. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO................................................................................66 2.1 Sarampión...............................................................................................................67 2.2 Rubéola...................................................................................................................67 2.3 Parvovirus B19.......................................................................................................68 2.4 Otros virus..............................................................................................................68 3. AISLAMIENTO EN CULTIVO CELULAR..............................................................68 3.1 Pretratamiento de las muestras...............................................................................68 3.2 Muestras post-vacunación y del biobanco del ISCIII. ...........................................69 3.3 Muestras clínicas del Plan Nacional de Eliminación del Sarampión.....................69 3.4 Muestras clínicas de exantema vírico infantil en el contexto de una alta cobertura de vacunación con triple vírica.....................................................................................70 4. MÉTODOS DE AMPLIFICACIÓN GENÓMICA .....................................................70 4.1 Extracción de ácidos nucleicos. .............................................................................71 4.2 PCR de enterovirus-herpesvirus.............................................................................71 4.3 PCR de adenovirus.................................................................................................71 4.4 Purificación de los productos de la PCR de genotipificado de MeV.....................71 4.5 Secuenciación de ácidos nucleicos.........................................................................72 4.6 Análisis de secuencias de ácidos nucleicos............................................................72 5. ANÁLISIS ESTADÍSTICO.........................................................................................73 iii RESULTADOS .............................................................................................75 1. DESARROLLO DE UNA PCR MÚLTIPLE PARA VIRUS DEL SARAMPIÓN, DE LA RUBÉOLA Y PARVOVIRUS B19...........................................................................77 1.1 Diseño de los iniciadores o “primers”....................................................................77 1.2 Ajuste de parámetros de primera reacción de PCR................................................79 1.3 Ajuste de parámetros de segunda reacción de PCR o anidada...............................82 1.4 Inclusión de un control interno...............................................................................84 1.5 Obtención de un control positivo de ADN cuantificable de cada virus.................85 2. EVALUACIÓN DE LA PCR MÚLTIPLE..................................................................85 2.1 Sensibilidad y especificidad de la PCR múltiple de exantemáticos.......................85 2.2 Valoración de la PCR múltiple de exantemáticos en muestras clínicas del biobanco del ISCIII y en muestras clínicas post-vacunación. .....................................................87 3. VALORACIÓN DE LA PCR MÚLTIPLE EN EL CONTEXTO DE UN BROTE DE MeV OCURRIDO EN LA PROVINCIA DE ALMERÍA...............................................89 3.1 Marcadores de infección. .......................................................................................89 3.2 Caracterización de casos PCR positiva e IgM negativa.........................................91 4. PCR, GENOTIPIFICADO Y DETECCIÓN DE IgM EN SANGRE SECA EN PAPEL DE FILTRO Y EXUDADO FARÍNGEO EN TAMPÓN DE LISIS...............................94 4.1 Brote de sarampión en Guinea Ecuatorial en 2001................................................94 4.2 Brote de sarampión en Guinea Ecuatorial en 2008................................................95 5. ESTUDIO DE EXANTEMA VÍRICO INFANTIL EN EL CONTEXTO DE UNA ALTA COBERTURA DE VACUNACIÓN CON TRIPLE VÍRICA.............................96 6. DESARROLLO DE UNA PCR PARA GENOTIPIFICADO DEL VIRUS DEL SARAMPIÓN ..................................................................................................................98 6.1 Diseño de los iniciadores o “primers”....................................................................98 6.2 Ajuste de parámetros de primera reacción de PCR..............................................101 6.3 Ajuste de parámetros de segunda reacción de PCR o anidada.............................103 6.4 Secuenciación.......................................................................................................106 6.6 Análisis de la secuencia........................................................................................108 7. GENOTIPOS DE MeV ENCONTRADOS EN ESPAÑA, 2001-2008.....................108 8. ANÁLISIS DE SECUENCIAS DE GENOTIPO A ..................................................116 9. ANÁLISIS DE SECUENCIAS DE GENOTIPO B3.................................................119 10. ANÁLISIS DE SECUENCIAS DE GENOTIPO C2...............................................126 11. ANÁLISIS DE SECUENCIAS DE GENOTIPO D3 ..............................................129 12. ANÁLISIS DE SECUENCIAS DE GENOTIPO D4 ..............................................130 iv 13. ANÁLISIS DE SECUENCIAS DE GENOTIPO D5 ..............................................136 14. ANÁLISIS DE SECUENCIAS DE GENOTIPO D6 ..............................................139 15. ANÁLISIS DE SECUENCIAS DE GENOTIPO D7 ..............................................143 16. ANÁLISIS DE SECUENCIAS DE GENOTIPO D8 ..............................................145 17. ANÁLISIS DE SECUENCIAS DE GENOTIPO D9 ..............................................147 18. ANÁLISIS DE SECUENCIAS DE GENOTIPO H1 ..............................................148 19. ANÁLISIS DE VARIABILIDAD MOLECULAR EN EL CONTEXTO DE BROTES.........................................................................................................................152 DISCUSIÓN..............................................................................................155 CONCLUSIONES.......................................................................................171 BIBLIOGRAFÍA.........................................................................................175 ARTÍCULOS..............................................................................................193 v ÍNDICE DE FIGURAS Figura 1. Incidencia anual de sarampión en España, 1940-1999. Cobertura de vacunación contra el sarampión, 1978-1999. ................................................................................................................20 Figura 2. Distribución de genotipos del MeV, 1995-2006. ..............................................................23 Figura 3. Cobertura de la vacuna de MeV en la Región Europea de la OMS, 2008 (primera y segunda dosis)................................................................................................................................33 Figura 4. Ficha epidemiológica de caso sospechoso de sarampión..................................................62 Figura 5. Iniciadores de cada virus..............................................................................................78 Figura 6. Estandarización de la concentración de SO4Mg para B19V. ..............................................79 Figura 7. Estandarización combinada de la concentración de iniciadores y dNTPs en el caso de MeV. ..................................................................................................................................80 Figura 8. Estandarización de la temperatura de hibridación de MeV................................................80 Figura 9. Estandarización de la temperatura de desnaturalización para los tres virus, RUBV, MeV y B19V. ..................................................................................................................................81 Figura 10. Estandarización de la concentración de Cl2Mg para los tres virus......................................82 Figura 11. Estandarización de la concentración de desoxinucleótidos trifosfato e iniciadores para MeV, RUBV y B19V..........................................................................................................................82 Figura 12. Estandarización de la temperatura de hibridación a 50, 55, 60 y 65ºC..............................83 Figura 13. Estandarización de la temperatura de desnaturalización de MeV, RUBV y B19V a 92, 93, 94 y 95ºC. ..................................................................................................................................83 Figura 14. Inclusión de un control interno......................................................................................85 Figura 15. Bandas de RUBV (289 pb), MeV (229pb), B19V (94 pb) y control interno (140 pb) obtenidas con la PCR múltiple de exantemáticos. ...............................................................................86 Figura 16. ID50 de cultivo de MeV vacunal en B95a detectada por PCR.............................................86 Figura 17. ID50 de cultivo de RUBV vacunal en RK13 detectada por PCR...........................................87 Figura 18. Distribución por edad de los casos positivos a MeV.........................................................89 Figura 19. Esquema de resultados obtenidos en el brote de Almería. ...............................................90 Figura 20. Distribución de los resultados de la detección de IgM en suero (IgM), resultados de PCR en suero (PCR S), resultados de PCR en exudado faríngeo (PCR F), resultados de PCR en orina (PCR Or) y aislamiento de SAR en orina (Cult Or) en porcentaje, por día después de la aparición del exantema. ..................................................................................................................................90 Figura 21. Número de infecciones por edad incluyendo infecciones dobles y la única triple. ..............97 Figura 22. Porcentaje de infecciones por edad. ..............................................................................97 Figura 23. Gráfico de similaridad entre secuencias completas del genoma de los genotipos D3, D6 y H1 respecto a la secuencia K01711 de genotipo A..............................................................................99 Figura 24. Iniciadores de MeV para PCR de genotipificado. ...........................................................100 Figura 25. Estandarización de la concentración de SO4Mg.. ...........................................................101 Figura 26. Estandarización de la concentración de desoxinucleótidos trifosfato e iniciadores. ...........102 Figura 27. Estandarización de la temperatura de hibridación: 45, 50, 55 y 60ºC..............................102 vi Figura 28. Estandarización de la temperatura de desnaturalización: 92, 93, 94 y 95ºC. ...................102 Figura 29. Determinación del número de ciclos de la primera reacción...........................................103 Figura 30. Estandarización de la concentración de Cl2Mg...............................................................104 Figura 31. Estandarización de la concentración de desoxinucleótidos trifosfato e iniciadores. ...........104 Figura 32. Estandarización de la temperatura de hibridación entre 50, 55, 60 y 65ºC. .....................105 Figura 33. Estandarización de la temperatura de desnaturalización a 92, 93, 94 y 95ºC...................105 Figura 34. Cromatograma de una secuencia de MeV obtenida con ABI PRISM 3700. .......................107 Figura 35. Genotipos detectados en España en el periodo 2001-2008 por Comunidad Autónoma......111 Figura 36. Filograma de secuencias encontradas en España en el periodo enero 2001-diciembre 2008 y secuencias de referencia de cada genotipo. ..........................................................................111 Figura 37. Distancias por pares de Clustal W (Equilibrado) entre los genotipos de referencia de MeV y las secuencias españolas de genotipo D5......................................................................................114 Figura 38. Distancias por pares de Clustal W (Equilibrado) entre los genotipos de referencia de MeV y la secuencia española de genotipo D9. .........................................................................................115 Figura 39. Filograma de secuencias pertenecientes al genotipo A. .................................................116 Figura 40. Filograma de secuencias pertenecientes al genotipo B3.................................................119 Figura 41. Filograma de secuencias pertenecientes al genotipo C2.................................................126 Figura 42. Filograma de secuencias pertenecientes al genotipo D3. ...............................................129 Figura 43. Filograma de secuencias pertenecientes al genotipo D4. ...............................................130 Figura 44. Filograma de secuencias pertenecientes al genotipo D5. ...............................................136 Figura 45. Filograma de secuencias pertenecientes al genotipo D6. ...............................................139 Figura 46. Filograma de secuencias pertenecientes al genotipo D7. ...............................................143 Figura 47. Filograma de secuencias pertenecientes al genotipo D8. ...............................................145 Figura 48. Filograma de secuencias pertenecientes al genotipo D9. ...............................................147 Figura 49. Filograma de secuencias pertenecientes al genotipo H1. ...............................................148 vii ÍNDICE DE TABLAS Tabla 1. Cepas de referencia de genotipos de MeV definidas por la OMS en 2005. .........................23 Tabla 2. Porcentaje de coberturas de vacunación Sarampión-Rubéola-Parotiditis (SRP). Total Nacional, 2003-2007........................................................................................................................26 Tabla 3. Niños de 1 a 2 años de edad vacunados con una primera dosis de vacuna triple vírica (SRP) y niños de 3 a 6 años vacunados con segunda dosis. Año 2007..................................................26 Tabla 4. Incidencia de sarampión en España, 2001-2008. ............................................................35 Tabla 5. Casos del Plan Nacional de Eliminación del Sarampión estudiados en el CNM desde el año 2001. ..................................................................................................................................63 Tabla 6. Casos del Plan Nacional de Eliminación del Sarampión recibidos en el CNM por CCAA y año, indicando cuantos tienen un grupo completo de muestras. ..........................................................63 Tabla 7. Pruebas serológicas realizadas en un panel de muestras de niños con exantema de la Comunidad Autónoma de Madrid......................................................................................................66 Tabla 8. Resultados de muestras clínicas con la RT-PCR múltiple de exantemáticos (MeV, RUBV, B19V). ..................................................................................................................................88 Tabla 9. Resultados en casos IgM negativa.................................................................................93 Tabla 10. Resultados de IgM y PCR sobre sangre completa secada en papel de filtro, 2001..............95 Tabla 11. Resultados de IgM y PCR sobre sangre completa secada en papel de filtro, 2008..............96 Tabla 12. Genotipos de MeV encontrados en España en el período 2001-2008...............................110 Tabla 13. Comparación de las sustituciones nucleotídicas entre la vacuna utilizada en nuestro país, las secuencias de genotipo A detectadas en España y las secuencias próximas detectadas en otros países. ................................................................................................................................118 Tabla 14. Comparación de las sustituciones nucleotídicas entre secuencias del caso de Madrid de 2001 procedente de Guinea Ecuatorial, del brote de Guinea Ecuatorial del mismo año y de las secuencias próximas detectadas en otros países. .............................................................................120 Tabla 15. Cambios nucleotídicos y aminoacídicos producidos durante el brote de Almería 2003.......121 Tabla 16. Cambios nucleotídicos y aminoacídicos producidos durante el brote de Madrid 2006........122 Tabla 17. Comparación de las sustituciones nucleotídicas entre secuencias de los brotes de Madrid, Las Palmas y casos esporádicos de Valencia y Santander; y secuencias próximas detectadas en otros países. ................................................................................................................................123 Tabla 18. Comparación de las sustituciones nucleotídicas entre una secuencia esporádica de Málaga, un caso del brote ocurrido en Malmoe (Suecia) y secuencias próximas detectadas en otros países. ................................................................................................................................123 Tabla 19. Sustituciones nucleotídicas entre secuencias del brote de Alcorcón y de Guinea Ecuatorial, 2008. ...........................................................................................................................124 Tabla 20. Cambios nucleotídicos y aminoacídicos producidos durante el brote de Alcorcón y el de Guinea Ecuatorial 2008..................................................................................................................125 Tabla 21. Sustituciones nucleotídicas entre secuencias C2 detectadas en España y otras secuencias próximas detectadas en otros países...............................................................................................128 La primera unidad de transcripción corresponde a la nucleoproteína (N), de 525 aminoácidos, y es la primera que se transcribe, por lo que es la más abundante de entre todas las proteínas virales. Su función principal es formar la cápsida viral. La señal específica de encapsidación se cree que se encuentra en los extremos 5´ de las secuencias “líder” del antigenoma (ARN de polaridad positiva) y “trailer” del genoma del ARN. Sin embargo, en ausencia de fosfoproteína (y de ARN viral u otras proteínas víricas) las nucleoproteínas de los Mononegavirales son capaces de autoensamblarse entorno al ARN celular para formar partículas similares a la nucleocápsida que incluye el ácido nucleico y la cápsida. En células infectadas existen dos formas de N: una monomérica no ensamblada (Nº), y una forma ensamblada (NNUC). En la forma ensamblada, N interacciona con la fosfoproteína (P) y el complejo polimerasa (L-P), mientras que en la forma monomérica es responsable de la encapsidación de la cadena de ARN recién sintetizado durante la replicación. Durante el ensamblado del virus N interacciona con la proteína matriz (M). Otra de sus funciones es interaccionar con factores celulares, incluyendo componentes del citoesqueleto [4]. La nucleoproteína presenta en el MeV dos módulos: un dominio N-terminal (N-CORE, aa 1-400) y un dominio C-terminal (N-TAIL, aa 401-525). N-CORE contiene todas las regiones necesarias para el autoensamblado y unión al ARN, forma un dominio globular localizado hacia el eje helicoidal de la nucleocápsida y puede reaccionar también con la superficie celular. Mientras que N-TAIL es análoga a una familia de proteínas que estructuralmente son similares a los dominios de activación de factores de transcripción celular. N-TAIL está localizada en el exterior de la estructura de N y sobresale de la superficie, está implicada en la inducción del plegamiento en la interacción con el dominio C-terminal de P (PCT) e interacciona con distintas proteínas de la célula hospedadora. N tiene varios lugares de unión para P en NCORE y N-TAIL [5]. La segunda unidad de transcripción corresponde al gen P de MeV, también llamado P/V/C, el cual codifica, de forma solapada, varias proteínas incluyendo la fosfoproteína (P), la proteína C y la proteína V. La fosfoproteína, de 507 aminoácidos, es un cofactor de la polimerasa que se activa por fosforilación, y une L a N para formar el complejo de la replicasa. La organización del gen P sugiere que la proteína P es modular, con al menos dos dominios: uno N-terminal (PNT) común con la proteína V y un dominio C-terminal Introducción 6 (PCT) único para la proteína P. La transcripción del genoma vírico necesita sólo el dominio PCT que se une a NTAIL como parte de la estructura de la nucleocápsida y es responsable de la unión de la polimerasa L a su molde, mientras que la replicación también necesita el PNT mediante la unión a Nº [4]. La proteína C, de 186 aminoácidos, interfiere con la respuesta inmune innata inhibiendo la respuesta mediada por interferón, modula la actividad polimerasa vírica y ha sido implicada en la prevención de la muerte celular [2]. La proteína V, de 298 aminoácidos, afecta a la interacción N-P y puede interferir con la respuesta mediada por IFN en células infectadas por MeV [2]. Una cuarta proteína del gen P/V/C, R, cuya función se desconoce, se produce por cambio de posición en el ribosoma, lo cual permite el acceso a un marco de lectura abierto situado 24 nucleótidos antes del codón de terminación de la proteína V. Una tercera unidad de transcripción se corresponde con la región codificadora de la proteína matriz (M), de 335 aminoácidos. Esta proteína forma la envuelta del virión junto con las dos glicoproteínas transmembrana F y H. En células infectadas, M está asociada con la nucleocápsida y con la capa interna de la membrana plasmática. Parece interaccionar con las regiones intracitoplasmáticas de una o ambas glicoproteínas transmembrana, modulando la capacidad de las glicoproteínas de la envuelta para alcanzar la diana y fusionarse con ella, y dirige la liberación del virus desde la superficie apical de las células epiteliales [6]. Cuando se une al complejo ribonucleoproteína, M inhibe la transcripción. La proteína M obtenida a partir de virus que causan infección persistente no tiene capacidad para unir nucleocápsidas e inhibir la transcripción del ARN [2]. La proteína de fusión (F), que constituye la cuarta unidad de transcripción del genoma de MeV, es una glicoproteína transmembrana tipo I altamente conservada sintetizada como una proteína precursora inactiva (F0) de unos 60 kd. F0 se escinde para producir las proteínas F1 y F2, que unidas por un puente disulfuro suponen la proteína F activa. F2 es necesaria para el procesamiento proteolítico y transporte a la superficie celular. Se ha postulado que F1 juega un papel importante en la interacción con la proteína H y ambas en el proceso de fusión. El dominio citoplasmático de F está frecuentemente alterado en virus asociados con infección persistente, interfiriendo con el ensamblado de las proteínas virales y la salida de la envuelta del virus e incrementando la fusión entre células [2]. Introducción 7 La proteína hemaglutinina (H), quinta unidad de transcripción de 617 aminoácidos, es el lugar de unión al receptor celular y debido a su función hemaglutinante se considera un importante determinante del tropismo celular de los Morbillivirus . Carece de la función neuraminidasa que tienen otras proteínas similares de otros miembros de la familia Paramyxoviridae . Es una glicoproteína transmembrana tipo II y la cola citoplasmática es esencial en el transporte eficiente a la superficie celular para la liberación del virus. Actúa junto con la proteína F durante la fusión y entrada del virus. La proteína H se une a la proteína cofactor de membrana (CD46) mediante la hoja 4 en el lateral de la β-hélice, mientras que, el sitio de unión de CD150 (o SLAM) está asociado con los aminoácidos 429 al 438 de la hoja 5 de la β–hélice [2]. La proteína “large” (L) es la sexta unidad de transcripción del genoma y consta de 2183 aminoácidos. Es la ARN polimerasa ARN dependiente y está altamente conservada. Está presente en pequeñas cantidades en la célula infectada, interacciona y realiza su función ARN polimerasa en asociación con P, y es parte de la nucleocápsida viral en la célula y en el virión [2]. 1.2 Ciclo de replicación del virus En el caso del MeV el proceso de adsorción celular se inicia con la unión de la proteína H a los receptores CD46 y CD150/SLAM de la superficie celular, provocando la entrada al fusionarse la membrana viral con la membrana plasmática celular y liberando las nucleocápsidas en el citoplasma. Estudios de distintas cepas de MeV han mostrado que tanto las vacunales como las salvajes pueden usar SLAM como receptor. Sin embargo, las cepas salvajes a menudo no pueden usar CD46 eficientemente. Los paramixovirus han desarrollado mecanismos de control de la transcripción vírica tanto del nivel, como del tipo de ARN vírico que se sintetiza. Al principio de la infección, antes de que se acumulen altos niveles de productos de la traducción viral, la función polimerasa vírica (ARNPv) está restringida a la producción de ARNs líder (polaridad +) y ARNm desde la nucleocápsida entrante, en la fase denominada transcripción primaria. Después de la entrada, la nucleocápsida se usa como molde para producir antigenomas (+), usados a su vez como moldes para producir Introducción 8 genomas ARN negativos. Cuando se han producido progenies abundantes de genomas, éstos sirven como moldes adicionales en la fase llamada transcripción secundaria para producir niveles mucho mayores de transcritos de ARNm vírico. La replicación del MeV ocurre en el citoplasma. Después de la traducción y acumulación de proteínas virales, el genoma de sentido negativo se replica para producir una copia complementaria completa, antigenoma (+), que solamente se encuentra ensamblado con la proteína N. En este momento, la ARNPv copia el mismo molde y sintetiza una copia complementaria exacta (-). Se cree que la única función de este antigenoma es ser un intermediario en la replicación del genoma. La síntesis del genoma y la encapsidación parecen ocurrir concomitantemente. Los genomas negativos sintetizados pueden tener tres funciones: moldes de ARNm en la transcripción secundaria, moldes para antigenomas adicionales o incorporación en la progenie de viriones durante la salida de la célula. El lugar de ensamblaje de la nucleocápsida es el citoplasma. Primero se produce la asociación de subunidades libres de N con el genoma para formar la nucleoproteína y, posteriormente, se asocia el complejo proteico P-L a dicha estructura. El ensamblado de la envuelta ocurre en la superficie celular. Las glicoproteínas víricas, sintetizadas en el retículo endoplasmático, maduran y se pliegan, y solamente las que están correctamente plegadas y ensambladas son transportadas fuera del retículo. En el aparato de Golgi se modifican las cadenas de carbohidratos y finalmente las glicoproteínas son transportadas a la membrana plasmática. El mecanismo de liberación del virus es desconocido. Se cree que las proteínas M juegan un importante papel en llevar el núcleo ribonucleoproteico ensamblado al lugar de la membrana citoplasmática donde se formará una gemación [7]. 1.3 Patogenia El MeV se transmite por aerosoles y entra en el organismo a través de las vías respiratorias. La infección inicial se establece en el tracto respiratorio con una primera replicación en células epiteliales. Desde el tracto respiratorio se extiende a tejidos linfáticos locales, quizás gracias a macrófagos o células dendríticas. La replicación en tejido linfático produce aparición de células reticuloendoteliales o linfoides gigantes denominadas células Warthin-Finkeldey. Son células grandes de Introducción 9 aproximadamente 100 µm de diámetro que pueden contener 100 núcleos agregados, normalmente sin cuerpos de inclusión. Dichas células tienden a localizarse en la periferia de los centros germinales y en tejido linfoide submucoso. La amplificación del virus en nódulos linfáticos regionales produce la aparición de viremia e infección de distintos órganos. Raramente se ha detectado viremia en plasma, ya que el virus se encuentra asociado a células y solamente antes de la aparición de anticuerpos neutralizantes, sin embargo se puede detectar ARN en plasma por PCR. La primera célula infectada son los monocitos. La infección de monocitos y macrófagos por algunas cepas de MeV aumenta la expresión de LFA-1, una molécula que promueve la adherencia a células endoteliales y puede contribuir a la diseminación del virus. Los linfocitos T y B pueden ser infectados in vitro y probablemente también in vivo . Los órganos y tejidos linfáticos son lugares importantes para la replicación del virus. En el bazo, las áreas ricas en macrófagos son sitios primarios de replicación de MeV. En el timo, se infectan las células epiteliales, provocando apoptosis de timocitos y una disminución prolongada del grosor de la corteza del timo, mientras que otros tejidos linfáticos se recuperan rápidamente. El MeV también infecta otros órganos como piel, conjuntiva, riñón, pulmón, tracto gastrointestinal, mucosa respiratoria, mucosa genital e hígado. En estos lugares, el virus se replica primariamente en células endoteliales, epiteliales y/o monocitos y macrófagos. La infección endotelial está acompañada por dilatación vascular, permeabilidad vascular aumentada, infiltración de células mononucleares e infección de tejido próximo. La histopatología del exantema por MeV sugiere que el inicio es la infección de las células endoteliales dérmicas. Posteriormente afecta a la epidermis, con infección de queratinocitos en el estrato granuloso que produce queratosis focal y edema. Se forman células epiteliales gigantes y se acumula un infiltrado mononuclear perivascular. Las manchas de Koplik de la mucosa oral son similares patológicamente al exantema e incluye a las glándulas submucosas. El examen patológico de otros tejidos muestra células epiteliales gigantes multinucleadas que se parecen a las que se forman en cultivos tisulares. Estas células se pueden localizar en secreciones nasales y conjuntiva durante el pródromo y primeros días del exantema. Las células epiteliales infectadas por MeV también se secretan con la orina [2]. Introducción 10 Los datos epidemiológicos sugieren que las personas infectadas son infecciosas unos días antes del comienzo del exantema. En este momento el virus puede aislarse desde membranas mucosas de la nasofaringe, conjuntiva y boca, sugiriendo que el aparato respiratorio es el lugar de secreción del virus. 1.3.1 Virulencia. Las cepas vacunales atenuadas de MeV pueden diferir claramente en su virulencia, puesto que apenas causan enfermedad en humanos, con respecto a las salvajes, que causan sarampión. La carencia de modelos animales adecuados ha impedido, en gran medida, los intentos de determinar las bases moleculares de los cambios en la virulencia. No se han descrito diferencias de virulencia entre los distintos genotipos del virus. Las cepas salvajes tienden a usar el receptor CD46 menos eficientemente que las cepas vacunales, pero no se ha demostrado que esto sea un determinante de virulencia. La atenuación en células Vero está asociada a cambios de aminoácidos en los genes P y L, pero los cambios específicos responsables de la disminución de virulencia no se conocen todavía. 1.3.2 Infección persistente. El MeV puede establecer infección persistente tanto en células in vitro como in vivo . Se han establecido líneas celulares permanentemente infectadas con el virus, y la infección persistente de neuronas y células gliales puede dar lugar a enfermedad neurológica. Los elementos que determinan infección persistente no citopática frente a infección lítica no se comprenden completamente, pero a ello contribuyen tanto las propiedades de la célula infectada como del virus. La infección persistente no citopática se establece más fácilmente en células neuronales, pero se ha establecido también en líneas celulares linfoides, epiteliales y gliales. Algunos factores identificados que afectan a la capacidad de MeV para establecer y mantener la infección persistente son la expresión de proteínas de choque térmico, proteínas inducidas por IFN y la regulación del metabolismo lipídico. Panencefalitis esclerosante subaguda (PEES). Es una enfermedad neurológica de curso progresivo y lento cuya patogénesis no es aún bien conocida. Probablemente el virus entra al cerebro en un momento dado (durante la infección aguda original posiblemente) y luego gradualmente se extiende. Cuando aparecen Introducción 11 los síntomas neurológicos, las neuronas y la glía contienen cuerpos de inclusión víricos en citoplasma y núcleo, la respuesta de anticuerpos frente al virus es alta en suero y LCR y hay una reacción inflamatoria mononuclear extensa en el SNC. Durante la enfermedad la replicación del virus es defectiva y se ha sugerido que el virus puede extenderse dentro del SNC por transmisión sináptica de la ribonucleoproteína de célula a célula. Se ha asociado diversas alteraciones en cualquiera de las proteínas de la envuelta del MeV, que de alguna manera interfieren en el ensamblado y salida de virus infecciosos, con infección persistente y PEES. Se ha visto que el virus tiene mutaciones en los genes que codifican las proteínas M, F y H con frecuencia. Finalmente, se ha sugerido la posibilidad de que la PEES esté asociada a un defecto en la respuesta inmune. La respuesta local de anticuerpos frente a MeV está incrementada, siendo particularmente abundantes los anticuerpos contra las proteínas N y P presentes en el complejo ribonucleoproteína, mientras que los dirigidos contra la proteína M son particularmente deficientes. La actividad de células T citotóxicas específicas y la producción de IFN-γ está disminuida comparada con individuos seropositivos sanos. En cualquier caso, no hay evidencia de un defecto global en las respuestas inmunes, pero éstas son ineficaces en el aclaramiento del virus del SNC [2]. 1.4 Respuesta inmune La respuesta inmune ante MeV es importante para el aclaramiento del virus, la recuperación de la infección y el establecimiento de inmunidad a largo plazo, además es directamente responsable de varias de las manifestaciones clínicas del sarampión. El virus puede aislarse de orina hasta quince días después del exantema y el ARN viral puede detectarse durante muchas semanas, indicando que el aclaramiento viral completo es un proceso largo. El comienzo de la enfermedad clínica coincide con la aparición de respuestas inmunes específicas. Se produce una marcada activación del sistema inmune frente al virus, que coincide con la aparición de la supresión inmune frente a antígenos diferentes a los del MeV. Ambas, supresión inmune genérica y activación de la Introducción 12 inmunidad específica, continúan muchas semanas después de la aparente recuperación. La infección por MeV de células in vitro induce producción de interferón α yβ, que disminuye la replicación del virus e incrementa la expresión de antígeno MHC de clase I en células infectadas. Las células asesinas naturales (NK) constituyen otro mecanismo temprano de defensa importante, pero su actividad es más baja de lo normal durante la enfermedad. Tanto el virus como las células infectadas activan la vía alternativa del complemento, independiente de anticuerpos, provocando que las células sean susceptibles a lisis por el complemento [2]. 1.4.1 Inmunidad humoral. Los anticuerpos se detectan por primera vez cuando aparece el exantema. El isotipo inicial es IgM, más tarde cambia a IgG en la fase de memoria. Inicialmente la IgG es de baja avidez, pero ésta aumenta firmemente en varios meses. En diversas secreciones se ha encontrado IgA, IgM e IgG. Todos estos anticuerpos se producen frente a la mayoría de las proteínas virales. Los que aparecen más temprano y en mayor abundancia son los anticuerpos frente a N. La proteína M induce solo pequeñas cantidades de anticuerpos, excepto en sarampión atípico. Los anticuerpos contra las proteínas H y F tienen actividad neutralizante, evitándose probablemente la adsorción y la fusión de la membrana vírica con la membrana celular [2]. 1.4.2 Inmunidad celular. La importancia de la inmunidad celular queda demostrada por la capacidad observada en niños con agammaglobulinemia para recuperarse completamente del sarampión, mientras que en niños con defectos graves en la función de linfocitos T a menudo se desarrolla enfermedad fatal o grave. En respuesta a la infección se activan células T CD8 y se establecen células T CD8 de memoria. Los antígenos que inducen células T citotóxicas CD8+ son las proteínas N, P, H y F. También se activan células CD4+ en respuesta a la infección que proliferan durante el exantema, estimulando la producción y proliferación de citoquinas inducidas por MeV. Gracias a estudios epidemiológicos, se ha visto que la protección a largo plazo Introducción 13 no requiere una nueva exposición al virus. La memoria inmunológica incluye producción continua de anticuerpos y circulación de células T específicas de MeV [2]. 1.4.3 Supresión inmune. Existe evidencia in vivo e in vitro de supresión inmune durante el sarampión. Posiblemente es la base del aumento de susceptibilidad a otras infecciones víricas y bacterianas secundarias tan característico del sarampión. In vivo , la respuesta a pruebas epidérmicas de hipersensibilidad retardada, tales como la tuberculina, se encuentran suprimidas antes del exantema y durante varias semanas después de la recuperación. La producción de anticuerpos y de una respuesta celular ante nuevos antígenos está debilitada. El análisis de anomalías ocurridas in vitro sugiere defectos en la respuesta tanto de monocitos como de linfocitos [2]. 1.4.4 Autoinmunidad. La encefalomielitis postinfecciosa, o encefalomielitis diseminada aguda, supone una complicación importante del sarampión y está asociada con una respuesta inmune cruzada frente a la proteína básica de la mielina. El mecanismo de inducción no está claro. Las hipótesis expuestas incluyen presentación alterada de los antígenos de la mielina resultado de la infección de oligodendrocitos por MeV, mimetismo molecular de los antígenos de mielina por el MeV y regulación anómala de las respuestas inmunes [2]. 1.5 Manifestaciones clínicas El sarampión clásico se adquiere a través de aerosoles y tiene un período de incubación de 10 a 14 días. El período prodrómico comienza con fiebre (39-40º), malestar y anorexia, seguidos de tos, coriza y conjuntivitis. Un día antes del exantema aparece un enantema en la mucosa bucal y velo del paladar formado por unas manchas pequeñas con centro blanco o blanco azulado sobre una base eritematosa, son las manchas de Koplik, patognomónicas de la enfermedad, que persisten durante 2 ó 3 días. El período prodrómico acaba cuando aparece el exantema, eritematoso y maculopapular, en la cara y detrás de las orejas, extendiéndose en forma centrífuga al tronco y extremidades. En cara y tronco, con Introducción 14 frecuencia, se hace confluente y empieza a desaparecer a los 3-4 días de la misma forma en que apareció, a veces con una ligera descamación que se hace muy evidente en niños desnutridos. La fiebre persiste 2 ó 3 días después del comienzo del exantema y la tos puede persistir otros 10 días. Puede producirse fotofobia, dolor de cabeza, dolor abdominal, linfadenopatía y esplenomegalia moderada. La enfermedad es transmisible desde tres días antes hasta 4 días después de la aparición del exantema y la recuperación, cuando la enfermedad no se complica, comienza poco después de la aparición del exantema. [2, 8]. El MeV presenta afectación multiorgánica e infecta a células epiteliales, reticuloendoteliales y leucocitos, incluyendo monocitos, macrófagos y linfocitos T. La infección provoca disminución de linfocitos CD4 desde el comienzo del exantema hasta un mes después, y produce supresión de la hipersensibilidad de tipo retardado como se puede ver por la detección de anergia a antígenos de la piel, incluyendo la prueba de la tuberculina. Se han observado complicaciones en todos los sistemas orgánicos [8]. Aunque se puede producir pericarditis o miocarditis (detectadas por electrocardiografía aunque sin importancia clínica) o diarrea en el 2,5% de los casos (más frecuente en niños desnutridos, en general asociada con los vómitos que pueden aparecer en la fase aguda) las complicaciones más frecuentes del sarampión afectan al sistema respiratorio, o al sistema nervioso central [9]. Los síntomas respiratorios se deben a inflamación de la mucosa en respuesta a la infección de las células epiteliales. La neumonitis intersticial resultante de la replicación del virus y la inflamación del tracto respiratorio inferior es común en la enfermedad no complicada y frecuentemente se detecta sólo por radiografía o midiendo el gradiente de oxígeno alveolo-arterial. Es más probable que la neumonitis sea más grave clínicamente durante el embarazo. En individuos con compromiso del sistema inmune se puede producir neumonía de células gigantes, aunque la mayoría de las neumonías graves producidas como complicación del sarampión y que se complican con enfermedad pulmonar crónica se deben a infecciones bacterianas secundarias favorecidas por la supresión inmune. Otras complicaciones respiratorias comunes causadas por infecciones secundarias son otitis media y laringotraqueobronquitis. Además de un incremento de susceptibilidad a nuevas infecciones, se pueden reactivar infecciones virales y bacterianas latentes [2]. Introducción 15 pertenecen a este genotipo, a partir de la introducción de la vacuna es necesario el estudio de al menos la secuencia completa del gen de la hemaglutinina (H) y/o los antecedentes de vacunación para definir estos hallazgos como virus salvaje o vacunal. Durante los años 90 se detectan, aparentemente en toda Europa, dos genotipos principalmente, C2 y D6. Estos genotipos en algunos países han sido endémicos, como ocurrió en Alemania, al menos hasta el año 2000, en que se produjo un reemplazo brusco debido al genotipo D7 [27]. Entre los países en que se detecta C2 en los 90 se encuentran la República Checa (1992) [28], Dinamarca (1997) [29], Luxemburgo y Holanda durante los años 1991-1994 [30], Reino Unido en el periodo 1992-1995 [31] y España entre los años 1992 y 1994 [32]; mientras que el genotipo D6 se detectó en Reino Unido (1992-1995) [31], Rusia (1997) y Polonia (1998) [28], Turquía (1998) [33], Italia y Luxemburgo (1996-1997) [30], Dinamarca (1998) [29] y España (1994-1997) [32]. Introducción 22 Genotipo ActividadaCepa referencia Acceso gen Hb Acceso gen Nb Nombre este trabajo A Activo Edmonston-wt.USA/54 U03669 U01987 AUSA54 B1 Inactivo Yaounde.CAE/12.83 “Y-14” AF079552 U01998 B1CAE83 B2 Activo Libreville.GAB/84 “R-96” AF079551 U01994 B2GAB84 B3 Activo New York.USA/94 Ibadan.NIE/97/1 L46752 AJ239133 L46753 AJ232203 B3USA94 B3NIE97 C1 Activo Tokyo.JPN/84/K AY047365 AY043459 C1JPN84 C2 Activo Maryland.USA/77 “JM” Erlangen.DEU/90 “WTF” M81898 Z80808 M89921 X84872 C2USA77 C2DEU90 D1 Inactivo Bristol.UNK/74 (MVP) Z80805 D01005 D1UNK74 D2 Activo Johannesburg.SOA/88/1 AF085198 U64582 D2SOA88 D3 Activo Illinois.USA/89/1 “Chicago-1” M81895 U01977 D3USA89 D4 Activo Montreal.CAN/89 AF079554 U01976 D4CAN89 D5 Activo Palau.BLA/93 Bangkok.THA/93/1 L46757 AF009575 L46758 AF079555 D5BLA93 D5THA93 D6 Activo New Jersey.USA/94/1 L46749 L46750 D6USA94 D7 Activo Victoria.AUS/16.85 Illinois.USA/50.99 AF247202 AY043461 AF243450 AY037020 D7AUS85 D7USA99 D8 Activo Manchester.UNK/30.94 U29285 AF280803 D8UNK94 D9 Activo Victoria.AUS/12.99 AY127853 AF481485 D9AUS99 D10 Activo Kampala.UGA/51.00/1 AY923213 AY923185 D10UGA00 E Inactivo Goettingen.DEU/71“Braxator” Z80797 X84879 EDEU71 F Inactivo MVs/Madrid.SPA/94 SSPE Z80830 X84865 FSPA94 G1 Inactivo Berkeley.USA/83 AF079553 U01974 G1USA83 G2 Activo Amsterdam.NET/49.97 AF171231 AF171232 G2NET97 G3 Activo Gresik.INO/17.02 AY184218 AY184217 G3INO02 H1 Activo Hunan.CHN/93/7 AF045201 AF045212 H1CHN93 H2 Activo Beijing.CHN/94/1 AF045203 AF045217 H2CHN94 a: Genotipos activos son los que han sido aislados en los últimos 15 años. b: Secuencias disponibles en la base de datos GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov) Tabla 1. Cepas de referencia de genotipos de MeV definidas por la OMS en 2005. Figura 2. Distribución de genotipos del MeV, 1995-2006. El sarampión ha sido eliminado del continente americano y Australia (no mostrados en la figura), aunque se han detectado múltiples casos importados. Extraído de Weekly Epidemiological Record, 2006, 81, p. 475. Introducción 23 Gris: Países de los que se conocen genotipos. Blanco: Países sin información sobre genotipos. Otro genotipo detectado en años previos al 2005 fue D7, que circuló de forma endémica por Europa a principios de los años 2000, incluyendo países como por ejemplo Alemania (2000-2001) [34], Bielorrusia (2003) [35], España (2001-2003) [36], Francia [37] e Italia (2002) [38], y dejó de detectarse en el año 2004. El genotipo D4 se detectó en Rusia (2003) [39], en Croacia en un brote ocurrido en 2003-2004 [40], en Alemania en 2000 [27] y en Dinamarca (1998) [29]. H1 se detectó en Rusia en el año 2000 [39] y en Alemania en 2001 [34]. El genotipo D8 en Suiza en 2003 [41]; el B3 en Alemania (2000) [27] y España (2003) [36]. D5 se observó en Suiza en 2003 [41] y Alemania en 2002 [34]. G2 en Alemania (2001) [27], D2 en un brote importado a Irlanda en 2000 [42], y, finalmente, D3 se detectó en Dinamarca en 1997 [29]. Durante los años 2005-2006 se encontraron en la Región Europea de la OMS 9 de los 17 genotipos activos de MeV. Las mayores epidemias fueron causadas por diferentes variantes de los genotipos D4, D6 y B3. Los mayores brotes ocurrieron en Ucrania (D6, >46000 casos), Rumania (D4, >8500 casos), Alemania (D6, aproximadamente 1700 casos) y la Federación Rusa (D6, >1100 casos). Varias epidemias que afectaron Introducción 24 a 100-500 casos ocurrieron en Reino Unido (B3), España (B3, D4), Alemania (D4, D6, B3), Italia (D4), Bielorrusia (D6) y Grecia (D6, D4). Los genotipos mencionados, además de B2, D5, D8, D9, H1 y G3, causaron brotes más pequeños y casos esporádicos. Por otro lado hay que destacar la ausencia de genotipos que circularon previamente, como C2 y D7, y la baja diversidad genética del genotipo D6, lo cual sugiere la interrupción de varias cadenas de transmisión del virus atribuible a un aumento en la vacunación. [43]. Durante el año 2007 se detectaron los siguientes genotipos: B3 en Italia [44]; D4 en Bélgica [45], Noruega [46], Irlanda [47] y Reino Unido [48]; D5 en Suiza [49], Alemania [50] y Rusia [51]; D6 en Polonia [52] y Rusia [51]; D8 y H1 en Rusia [51]. Finalmente, en 2008 se detectó B3 en Dinamarca [53]; D4 en Italia [54], Francia [55], Alemania [50], Dinamarca [56], Suecia [57] y Gibraltar [58]; D5 en Austria [59], Alemania [60] y Francia [55], procedente de Suiza en todos los casos; D8 en Holanda [61] y Francia [62]. Es de destacar que en el año 2008 el Reino Unido ha declarado la endemicidad del MeV debido a la continuidad de la aparición de la misma cepa de genotipo D4 desde abril del año 2007 [63]. 1.8 Profilaxis. Vacuna triple vírica. En nuestro país la vacunación frente a sarampión comenzó en 1978 en niños de 9 meses de edad utilizando la cepa Schwartz, y en 1981 se introdujo la vacuna triple vírica (SRP: MeV, RUBV y parotiditis) a los 15 meses. La administración de una segunda dosis a los 11 años se inicia en 1988, y en 1999 el Sistema Nacional de Salud acuerda adelantar esta segunda dosis a los 3-6 años en base a los resultados obtenidos en la encuesta seroepidemiológica realizada en 1996 que denotaba un exceso de casos susceptibles (10%) entre los 6 y los 9 años de edad [64]. La cobertura vacunal conseguida en los años 2003-2007 gracias al calendario vacunal descrito se muestra en la Tabla 2, y en la Tabla 3 se observa el número de niños de 1 a 2 años de edad vacunados con una dosis de SRP y el de niños de entre 3 y 6 años vacunados con una segunda dosis en todas las CCAA en el año 2007. Introducción 25 % DE VACUNACIÓN 2003 2004 2005 2006 2007 Triple Vírica: Sarampión, Rubéola y Parotiditis (SRP) Primera dosis: niños de 12-15 meses 96,7 97,3 96,8 96,9 97,2 Segunda dosis: niños de 3-6 años 91,2 92,7 91,6 94,1 95 Ministerio de Sanidad y Consumo: http://www.msc.es/profesionales/saludPublica/prevPromocion/vacunaciones/coberturas.htm Tabla 2. Porcentaje de coberturas de vacunación Sarampión-Rubéola-Parotiditis (SRP). Total Nacional, 2003-2007. SRP-Primera dosis SRP-Segunda dosis CC.AA Población Fuente nº dosis % Población nº dosis % Andalucía 90.526 Registro nominal 87.310 96,4 87.540 84.047 96 Aragón 12.281 IAE 11.994 97,7 11.146 10.621 95,3 Asturias 7.482 INE 7.460 99,7 7.107 7.180 101 Baleares 10.926 IBAE 10.702 97,9 10.184 9.926 97,5 Canarias 20.885 ISTAC 19.971 95,6 19.797 18.920 95,6 Cantabria 4.986 INE 5.358 107,5 4.299 4.646 108,1 Castilla y León 18.865 Metabolopatías 18.398 97,5 19.266 17.323 89,9 Castilla La Mancha 19.724 TIS 18.678 94,7 17.653 16.562 93,8 Cataluña 81.163 IDESCAT 80.351 99 72.984 71.524 98 C. Valenciana 51.696 SIP 51.174 99 47.677 46.429 97,4 Extremadura 9.948 INE 9.163 92,1 10.298 10.054 97,6 Galicia 21.245 IGE 21.152 99,6 21.193 20.494 96,7 Madrid 69.485 Padrón/2006 65.593 94,4 70.027 61.162 87,3 Murcia 17.339 Registro nominal 17.169 99 14.875 14.307 96,2 Navarra 6.269 Padrón 6.123 97,7 5.683 5.308 93,4 P. Vasco 20.012 Metabolopatías 19.422 97,1 20.000 19.250 96,3 Rioja 3.026 Registro de vacunas 2.953 97,6 3.027 2.906 96 Ceuta no disponible Melilla 1.156 PMH 1.138 98,4 1.128 1.038 92 TOTAL 467.014 454.109 97,2 443.884 421.697 95 Ministerio de Sanidad y Consumo: http://www.msc.es/profesionales/saludPublica/prevPromocion/vacunaciones/coberturas.htm. INE: Instituto Nacional de Estadística. ISTAC: Instituto Canario de Estadística. IDESCAT: Instituto de Estadística de Cataluña. IBAE: Instituto Balear de Estadística. IAE: Instituto Aragonés de Estadística. IGE: Instituto Gallego de Estadística. PMH: Padrón Municipal de Habitantes. SIP: Sistema de Información Poblacional. TIS: Tarjeta Sanitaria Individual. CRE: Centro Regional de Estadística. NOTA: Las coberturas superiores al 100% se deben a la inclusión en el numerador de niños vacunados que no están incluidos en la población objeto. Tabla 3. Niños de 1 a 2 años de edad vacunados con una primera dosis de vacuna triple vírica (SRP) y niños de 3 a 6 años vacunados con segunda dosis. Año 2007. 1.8.1 Pautas y vías de administración. Las vacunas disponibles contienen al menos 1000 dosis infecciosas en cultivo de tejidos (DICT) de cada uno de los tres virus. En nuestro país existen tres presentaciones: Priorix® (GlaxoSmithKline), Triviraten® (Berna) y Vacuna Triple Introducción 26 MSD® (Aventis Pasteur MSD). Se administra por vía subcutánea en la región externa del deltoides en un volumen de 0,5 ml una vez reconstituida la vacuna. La primera dosis se administra a los 15 meses de edad para evitar la interferencia de anticuerpos maternos transplacentarios. No obstante, en un futuro esta edad podría adelantarse porque actualmente estos anticuerpos deben de ser menos duraderos puesto que provienen mayoritariamente de madres vacunadas, es decir, no inmunizadas de forma natural tras la enfermedad y que, además, no hacen respuestas secundarias después de la vacunación por no verse expuestas a virus circulante. De hecho, en Cataluña ya se adelantó la primera dosis a los 12 meses al comprobarse que en brotes de más de 50 casos el número de menores de 15 meses afectados por la enfermedad se incrementaba. En casos de retraso o inmunización incompleta se ha propuesto un calendario acelerado que consiste en la administración de dos dosis de SRP separadas por un mes en el supuesto de que el niño no haya recibido ninguna dosis, o una única dosis si el niño ha sido vacunado anteriormente, siempre con un mes de diferencia entre ellas [65]. Si un niño no vacunado se expone al virus del sarampión se le vacunará en las 72 horas siguientes, siendo posible prevenir la clínica derivada de la infección. En casos en que la vacunación esté contraindicada se puede administrar inmunoglobulina en los 3-5 días desde la exposición, aunque no es una práctica habitual. Se recomienda la vacunación en niños infectados con VIH e incluso en los enfermos de SIDA asintomáticos, aunque la respuesta inmunitaria sea menor que en los niños sanos; por eso, si se exponen al virus, se administrará inmunoglobulina específica. Por otro lado, la vacuna está indicada en los pacientes con leucemia en remisión que lleven más de 3 meses sin tratamiento oncológico. La administración de inmunoglobulinas u otros productos sanguíneos que contengan anticuerpos puede interferir con la respuesta inmune a la vacuna. Por ello la vacunación debe retrasarse 3-11 meses después de la administración de sangre o productos sanguíneos, dependiendo de la dosis de anticuerpos de sarampión. Después de la vacunación frente a sarampión la administración de dichos productos sanguíneos debe evitarse durante 2 semanas, si es posible [66]. La hiperatenuación de los virus contenidos en la vacuna hace que éstos sean muy lábiles a la luz y el calor. La vacuna reconstituida pierde el 50% del potencial del Introducción 27 componente sarampión después de una hora a una temperatura de 20ºC y casi todo su potencial después de una hora a 37ºC. El vial del liofilizado con la mezcla de virus debe conservarse entre 4 y 8ºC [66, 67]. 1.8.2 Contraindicaciones. La vacuna SRP está contraindicada en el embarazo por la teórica posibilidad de afectación fetal por virus de la rubéola y debe desaconsejarse el embarazo durante los 3 meses siguientes a la fecha de la vacunación. También debe posponerse cuando haya fiebre elevada, aunque los cuadros febriles leves de vías respiratorias altas no suponen una contraindicación. La tuberculosis activa es una contraindicación por la inmunosupresión vacunal inducida por el virus del sarampión. Una contraindicación absoluta es la alergia grave a los componentes de la vacuna. Si existe alergia al huevo se puede vacunar bajo vigilancia hospitalaria. Si se ha administrado inmunoglobulina humana recientemente se puede inhibir la multiplicación vírica y resultar ineficaz la vacunación, por ello debe retrasarse [66, 67]. 1.8.3 Efectos secundarios. Generalmente son efectos moderados y transitorios. En la SRP son debidos a los efectos de cada uno de sus componentes. El componente de sarampión puede producir: • Reacciones sistémicas, como erupción en ≈2% de los vacunados y fiebre superior a 39ºC entre los 5 y 12 días desde la administración y de forma autolimitada (1-2 días). • Reacciones locales que se producen en las primeras 24 horas, como calor, enrojecimiento, tumefacción o linfadenopatía local. • Reacciones infrecuentes, como trombocitopenia en las 2 ó 3 semanas siguientes a la vacunación con una incidencia de 1/30-40.000 vacunados o 1/100.000-1.000.000 de dosis; o como encefalitis en los 30 días siguientes en 1/1.000.000 de vacunas administradas. La virtual desaparición de PEES en países donde el sarampión ha sido eliminado, sugiere que la vacuna previene la aparición de PEES al prevenir la infección por MeV. Introducción 28 Es necesario mencionar que varios estudios cuidadosamente realizados han sido incapaces de confirmar informes anteriores que sugerían una asociación entre la recepción de vacuna de sarampión viva atenuada o de SRP, y la aparición de autismo o inflamación intestinal crónica [66]. El componente rubeólico puede dar lugar a fiebre, linfadenopatías, exantema y artralgias, esto último sobre todo en 10-25% de mujeres en edad fértil. Se han descrito casos de trombopenia transitoria, sin púrpura. Finalmente, en lo que se refiere al componente parotídico los efectos secundarios son raros. La frecuencia de complicaciones en el SNC ha sido menor que la incidencia observada en la población no inmunizada. La orquitis, reacciones alérgicas y parotiditis son raras [66, 67]. 1.8.4 Futuro de la vacuna triple vírica. En septiembre del 2005, la “Food and Drugs Administration” (FDA) aprobó la vacuna combinada tetravalente (SRPV) para prevenir el sarampión, la parotiditis, la rubéola y la varicela administrándola a niños de 12 meses a 12 años de edad. Esta vacuna podía ser usada en lugar de la vacuna triple vírica. La pauta vacunal recomendada es de 2 dosis, la primera a los 12-15 meses de edad y la segunda a los 4-6 años. En los estudios previos a la comercialización de la vacuna SRPV, ésta se asociaba a una mayor incidencia de fiebre entre los 5 a 42 días de su administración, que cuando se administraban por separado la vacuna de la varicela y la SRP, incluso aunque se hiciese en la misma visita. Debido a la conocida asociación entre fiebre y convulsiones febriles [68] el CDC instó a la compañía Merck a realizar estudios postcomercialización que descartaran la posible asociación entre la vacuna SRPV y un incremento de las convulsiones febriles. El 27 de febrero del 2008 ha sido presentada una nueva información al “Advisory Committee on Immunization Practices” (ACIP) acerca del mayor riesgo de convulsiones febriles en niños de 12-23 meses de edad que recibieron la vacuna SRPV (ProQuad®, Merck & Co., Inc., Whitehouse Station, New Jersey). Esta información fue presentada por el “Kaiser Permanent Vaccine Study Center” y el “Vaccine Safety Datalink” y ha llevado al ACIP a cambiar sus recomendaciones acerca de la vacuna. Así, si antes se abogaba por la introducción de la vacuna combinada SRPV, ahora se aconseja la administración de la vacuna SRP y varicela por separado. Introducción 29 Esta nueva recomendación se ha publicado el 14 de marzo de 2008 en el Morbidity and Mortality Weekly Report [69]. 2. CONTROL DEL SARAMPIÓN El sarampión sigue siendo una causa importante de muerte infantil en el mundo, sobre todo en países en desarrollo. En regiones con un plan de eliminación ya establecido, la OMS y UNICEF tienen como objetivo conseguir y mantener la interrupción de la transmisión de cepas salvajes de MeV. Por otro lado, en 47 países, prioritarios porque presentan la mortalidad más alta, dichos organismos implantaron una estrategia de “Reducción de la Mortalidad por Sarampión, 2001-2005”. Dicha estrategia incluía conseguir una alta cobertura vacunal de rutina (>90%), proporcionar una segunda oportunidad de vacunación frente al virus, mejorar la vigilancia de la enfermedad y mejorar el manejo de cada caso incluyendo suplementos de vitamina A y uso de antibióticos si fuera necesario. Gracias a este planteamiento, la cobertura global con la primera dosis de vacuna aumentó desde 71% en 1999 a 83% en 2008, aunque con variaciones significativas según el área geográfica. África y el Sureste de Asia son las regiones donde se ha producido el mayor incremento en la cobertura de rutina entre los años 1999 y 2008, de 49 a 73% y de 54 a 75% respectivamente. Además, se ha aumentado la proporción de países que ofrecen una segunda oportunidad de vacunación a niños a través de Actividades de Inmunización Suplementarias (AIS) o de vacunación rutinaria. Durante 2004 ciento sesenta y ocho países ofrecieron una segunda dosis de vacuna comparado con los 150 del año 2001. En 2007, veinte de los 47 países prioritarios llevaron a cabo AIS, alcanzando aproximadamente a 91 millones de niños. En 2008 fueron 16 los países prioritarios que llevaron a cabo AIS alcanzando en este año aproximadamente a 109 millones de niños y adolescentes [70, 71]. En 2008, 173 (90%) de los 193 estados miembros de la OMS habían implementado la vigilancia basada en cada caso, comparado con los 120 (62%) países que la habían implementado en 2004, que fue el primer año del que se obtuvo este dato. La mortalidad global debida a sarampión disminuyó un 78%, de 757000 muertes estimadas en 2000 a 164000 en 2008. La mayor reducción en el porcentaje por regiones en la mortalidad estimada debida a sarampión durante 2000-2008 ocurrió Introducción 30 en las Regiones del Mediterráneo Oriental (93%) y de África (92%), lo cual supone el 17% y 60% de la reducción global respectivamente [71, 72]. Cuando la incidencia de sarampión y rubéola es baja, como ocurre en muchos países desarrollados o con un avanzado programa de control o eliminación, es necesaria una vigilancia de los casos individuales basada en el diagnóstico de laboratorio, utilizando la detección de IgM de forma complementaria con el genotipificado de las cepas de virus circulantes. LabNet, grupo global de laboratorios de sarampión y rubéola de la OMS, se formó en 2003 para proporcionar pruebas estandarizadas para la detección de ambos virus, una estructura informativa y un programa global de garantía de calidad de los laboratorios [26]. La ausencia de confirmación por el laboratorio de los casos de MeV podría causar una sobreestimación de la incidencia especialmente en países con casos esporádicos o escasos, porque la baja incidencia de la enfermedad da como resultado un pobre valor predictivo positivo del diagnóstico clínico de sarampión [73]. En lo que respecta a la Región Europea de la OMS, en 2002 se desarrolló e implantó el Plan estratégico para sarampión e infección congénita por rubéola, que propone la interrupción de la transmisión de MeV salvaje y la reducción de la incidencia del síndrome de rubéola congénita (SRC) a <1/100.000 nacidos vivos para el año 2010. Posteriormente, en 2004 los responsables nacionales de los programas de inmunización de la Región Europea y el grupo técnico de expertos en inmunización, asesor de la OMS (WHO European Technical Advisory Group of Experts on Immunization; ETAGE) revisaron los objetivos del plan y recomendaron la inclusión de la eliminación de la rubéola en la estrategia [74]. Las claves de la estrategia para alcanzar los objetivos de eliminación del sarampión y de la rubéola en la Región Europea recogidas en el plan estratégico de la OMS para 2005-2010 son: a. Alcanzar y mantener coberturas de vacunación ≥95% con 2 dosis de vacuna que contenga MeV y al menos con 1 dosis de vacuna que contenga RUBV de forma rutinaria, prestando especial atención a poblaciones de riesgo con bajas coberturas. b. Ofrecer una segunda oportunidad mediante recaptación de susceptibles a sarampión por medio de AIS. Introducción 31 Otra complicación habitual es la trombocitopenia asintomática transitoria, aunque la púrpura trombocitopénica sintomática sólo se produce en 1 de 1500 casos. En muy pocas ocasiones se ha asociado rubéola epidémica con anemia hemolítica. También son esporádicos los casos publicados de arritmia cardiaca en rubéola infantil aguda y de tiroiditis y disfunción hepática en adultos con rubéola. La complicación más seria de la rubéola postnatal es la encefalopatía postinfecciosa o encefalomielitis. Se estima que ocurre en uno de cada 6000 casos. No se han encontrado evidencias de la implicación directa del virus en la patogénesis de esta encefalopatía, pero sí se han detectado antígenos de RUBV in situ en tejido cerebral y se ha aislado el virus en una muestra de LCR, indicando la capacidad que tiene el RUBV de invadir el SNC. Un 80% de los pacientes se recupera espontáneamente. Síndrome de rubéola congénita (SRC). La infección materna por RUBV poco antes de la concepción no parece provocar infección intrauterina. No obstante, durante las 8 primeras semanas de gestación la transmisión transplacentaria se produce en hasta un 90% de casos, disminuyendo durante el segundo trimestre a un 25-35% y aumentando de nuevo al final del embarazo. La infección en una fase muy temprana del embarazo provoca reabsorción del embrión. En fases posteriores, aumenta la posibilidad de supervivencia del feto, aunque también se producen partos prematuros o muertes de recién nacidos a término. La mayoría de los niños con SRC (80%) tienen afectación neurológica, pudiendo aislarse virus en el LCR de un 30 % de los casos. Por otro lado, se puede aislar RUBV de casi cualquier órgano en el momento del nacimiento, y en algunos tejidos durante el primer año o más después del nacimiento. Enfermedad neurológica retardada. Una complicación inusual es la panencefalitis progresiva por rubéola (PPR), la cual se caracteriza por un período asintomático prolongado, seguido de síntomas de deterioro neuronal durante la segunda década de la vida. Se producen asimismo, cambios del comportamiento, deterioro intelectual, ataxia, espasticidad y, a veces, convulsiones. La muerte se produce en aproximadamente 8 años. Aunque esta enfermedad se asocia más a menudo con SRC en niños y jóvenes, también puede ser una complicación muy rara de la rubéola aguda en niños [84]. Introducción 38 3.1.2 Epidemiología y control. Son escasas las estadísticas fiables sobre tasas de incidencia de SRC en países en desarrollo, sin embargo, antes de la introducción de la vacuna frente a RUBV las tasas de incidencia variaban entre 0,1-0,2 por 1000 nacidos vivos en periodos endémicos; mientras que en periodos epidémicos variaba entre 1 y 4 por 1000 nacidos vivos sin que existieran grandes diferencias entre países industrializados y países en desarrollo [85]. La vigilancia epidemiológica impulsada por la OMS desde 1996 en países en desarrollo evidenció una tasa de incidencia de SRC entre 0,4 y 4,3 por 1000 nacidos vivos. Esta incidencia es comparable, o incluso mayor en algunos casos, a la encontrada en países industrializados en la era prevacunal [86]. En EEUU y Europa la vacuna se autorizó en 1969, y actualmente se aconseja incluirla en la agenda infantil de inmunizaciones sólo si se puede mantener una cobertura >80% a largo plazo, debido a que una cobertura inadecuada provocaría un riesgo de alterar la dinámica de transmisión de la enfermedad comportando un aumento en la susceptibilidad de mujeres en edad fértil, con el potencial aumento en los casos de SRC [85]. Las recomendaciones de la OMS para la vigilancia de SRC y rubéola incluyen la definición de caso y algoritmos para la investigación de los casos sospechosos [87]. En 2004, dicha organización estableció la nomenclatura para describir las características de los RUBV salvajes y recomendó una región del gen E1 de 739 nucleótidos (nucleótidos 8731 al 9469 del genoma completo) para el análisis molecular de rutina. En base a esa región se han designado dos grupos filogenéticos denominados 1 y 2, los cuales difieren en un 8-10% en sus nucleótidos [88]. En 2007 se publicó una actualización de los genotipos estableciéndose 9 reconocidos (1B, 1C, 1D, 1E, 1F, 1G, 2A, 2B y 2C) y 4 provisionales (1a, 1h, 1i y 1j) [89]. El Comité Regional de la OMS para Europa aprobó en 2005 el Plan Estratégico 20052010: Eliminación del Sarampión y de la Rubéola y P evención de la IRC en 2010 , con el cual se establecieron los objetivos de mantener una incidencia de sarampión y rubéola menor de 1 caso por 100.000 habitantes y una incidencia de SRC menor de 1 caso por 100.000 nacidos vivos. Con respecto a la vacunación frente a RUBV, en el año 2006, 51 de los 53 países de la Región Europea de la OMS usaban una vacuna que contenía RUBV frente a los 39 que lo hacían en el año 2001 [75, 90]. r Introducción 39 Aún así, la incidencia de rubéola sigue siendo alta en la Región Europea, con períodos cortos interepidémicos. Durante el período 2001-2003 por ejemplo, se informaron 47 casos de SRC, 17 de ellos en un solo país, Rumania, que experimentó un gran brote de rubéola en 2003 [75]. En España, la introducción de los programas de vacunación ha supuesto una disminución progresiva de la incidencia de la rubéola, paralela a la observada en el caso de sarampión, pasando de 9,63 casos por 100.000 habitantes en 1997 a 0,15 en el año 2007. Las tasas de incidencia de los últimos cinco años indican escasa circulación del virus, con la aparición de algunos brotes localizados en algunas Comunidades Autónomas, que han afectado principalmente a adultos jóvenes en población inmigrante de ambos sexos y a varones adultos españoles no cubiertos por los programas de vacunación y que hicieron que la tasa del año 2005 sobrepasara el 1 por 100.000, concretamente 1,34 por 100.000. Durante el año 2007 todas las CCAA, excepto Ceuta (1,31) y las Islas Canarias (1,14), presentaron tasas inferiores a 1 por 100.000. Respecto al SRC, desde la implantación de la Red Nacional de Vigilancia Epidemiológica en 1997 hasta 2005, se han notificado trece casos, cuatro de los cuales están asociados a un brote de rubéola ocurrido en Madrid en el año 2005. La incidencia media anual es <1 caso por 100.000 nacidos vivos, excepto en el año 2005 que fue de 1,09 por 100.000 [91]. 3.1.3 Diagnóstico. Es preciso destacar que la rubéola se puede confundir con otras enfermedades asociadas a exantema maculopapular. Por ello el diagnóstico diferencial debe hacerse con sarampión, escarlatina, exantema súbito, eritema infeccioso y exantema asociado a infecciones por algunos enterovirus o adenovirus. Además, en áreas endémicas el diagnóstico diferencial se debe establecer con virus dengue, Sindbis, Chikungunya y Ross River [92]. El diagnóstico de la rubéola aguda se realiza por serología mediante detección de IgM específica por técnica de ELISA, que se puede detectar desde la aparición de los síntomas hasta 6 u 8 semanas después de que desaparezcan. Los resultados falsos positivos son más probables si se usa la técnica de ELISA indirecto que la de captura y pueden producirse también por reacción cruzada con otras IgM o por presencia de factor reumatoide. Por tanto, se debe realizar un segundo test de distinto formato Introducción 40 para confirmar un resultado positivo sobre todo en pacientes embarazadas. También puede detectarse por técnica de ELISA aumento de anticuerpos IgG desde los 4-7 días desde el comienzo de los síntomas, aunque a veces la respuesta se retrasa [93]. Además, la medición de la avidez de IgG específica de RUBV es una alternativa para el diagnóstico de infección reciente, ya que en éstas suele ser baja y es la base de la confirmación de los resultados positivos a IgM. Durante la infección aguda, el virus se puede aislar de secreciones nasofaríngeas durante 6 días antes y después de la aparición del exantema, así como de orina. La detección del ARN vírico por RT-PCR en estas mismas muestras es más sensible que el cultivo y aumenta el período de tiempo en el que el virus es detectable [94]. La confirmación del diagnóstico de rubéola congénita requiere aislamiento del virus o evidencia serológica de infección aguda en el niño. En ausencia de confirmación por el laboratorio, un diagnóstico clínico compatible con SRC requiere la presencia de al menos dos de los siguientes síntomas: cataratas o glaucoma congénito, enfermedad cardiaca congénita, pérdida auditiva, o retinopatía pigmentaria. El diagnóstico de laboratorio en niños infectados en el útero incluye la detección de IgG e IgM después del nacimiento. Sin embargo, al presentar también IgG específica materna, el diagnóstico de laboratorio de SRC suele hacerse por detección de IgM. Ésta se detecta en casi el 100% de casos desde el nacimiento hasta los tres meses de edad. Luego la respuesta disminuye progresivamente a menos del 50% a los doce meses y, ocasionalmente, se detecta después de los 18 meses [93]. La infección se puede confirmar a veces por aislamiento del virus en sangre del cordón umbilical o tejido de la placenta. Además, el virus puede aislarse de secreciones nasofaríngeas en un 80-90% de neonatos con SRC durante el primer mes de vida disminuyendo progresivamente en el primer año. También se aísla de orina y LCR. La detección de genomas por RT-PCR mejora la sensibilidad del diagnóstico directo, además, se ha aplicado al diagnóstico in utero en muestras de amniocentesis, cordocentesis o vello coriónico. La técnica es específica y sensible y proporciona resultados más rápidamente que el aislamiento [84]. Introducción 41 3.2 Parvovirus B19. La familia Parvoviridae se divide en dos subfamilias en relación a la capacidad de producir infección en vertebrados o invertebrados, Parvovirinae y Densovirinae respectivamente. A su vez, Parvovirinae comprende cinco géneros: Parvovirus , Dependovirus , , Erythrovirus, al cual pertenece B19V, Amdovirus y Bocavirus [95, 96]. Los Erythrovirus son virus pequeños, sin envoltura, con una cápsida de simetría icosaédrica formada por dos proteínas, VP1 y VP2, que encapsidan un número equivalente de cadenas de ADN linear monocatenario de sentido negativo y de sentido positivo, de 5,6 kb (5596 nt) [97]. El B19V tiene predilección por células eritroides humanas. Sus células diana son las progenitoras eritroides, y la célula madre no se afecta, es decir, se reproducen en células que se dividen rápidamente [95]. La principal ruta de transmisión es probablemente a través del aparato respiratorio superior, aunque también se excreta por orina. La infección intrauterina, otra de sus vías de transmisión, produce frecuentemente pérdida fetal. También se puede adquirir por medio de hemoderivados o tejidos contaminados. Los principales lugares de multiplicación del virus son la médula ósea en el adulto y el hígado en el feto. Aunque la replicación del virus en adultos solo se ha documentado en médula ósea, el ADN del virus puede detectarse en cualquier tejido perfundido por sangre. Durante la infección, el B19V puede detectarse en suero en el quinto y sexto día, y los mayores niveles se encuentran 8 ó 9 días después en el caso de inoculación intranasal. La viremia se acompaña de síntomas no específicos que son similares a los de la gripe. La aplasia de células rojas causada por la multiplicación en médula ósea coincide con la viremia. Los pacientes con crisis aplásica transitoria desarrollan los síntomas precozmente en el curso de la infección. La aparición de IgM e IgG específicas a los 10 a 14 días de la infección se acompaña de los síntomas clásicos de la denominada quinta enfermedad, es decir, erupción eritematosa e inflamación de las articulaciones. Las manifestaciones clínicas coinciden con la formación de inmunocomplejos circulantes que juegan un papel importante en el desarrollo de la enfermedad [97]. Introducción 42 3.2.1 Manifestaciones clínicas. Eritema infeccioso y artropatía. En torno a un 25% de infecciones por B19V son asintomáticas, y hasta un 50% no presentan exantema, el síntoma más obvio. La infección aguda causa eritema infeccioso o quinta enfermedad de la infancia. Se trata de un eritema característico en “cara abofeteada” y una erupción maculopapular reticulada en tronco y extremidades. Esta enfermedad se puede confundir con otros exantemas infantiles [97]. Aproximadamente un 50% de casos de eritema infeccioso en adultos se han asociado con manifestaciones articulares que persisten durante 1 mes, en lugar de con exantema. Sin embargo, alrededor de un 20% de mujeres afectadas sufren artropatía persistente o recurrente. Este síndrome, que puede durar semanas, meses o años, es, probablemente, una consecuencia de la respuesta inmune del hospedador. También se ha propuesto al B19V como el agente causante de artritis reumatoide, artritis reumatoide juvenil y poliartritis erosiva, ya que se ha detectado infección reciente por B19V y altos niveles de anticuerpos frente al mismo en muchos de estos pacientes [98]. Sin embargo ésta es una asociación controvertida, pues también se ha encontrado ADN del virus en líquido sinovial de individuos sanos [99101]. El hallazgo reciente de ADN de B19V en un 64% de biopsias de piel en un grupo control, comparado con el 50% encontrado en pacientes con urticaria confirma que no se pueden obtener conclusiones precipitadas sobre la implicación de este virus en distintos desórdenes cutáneos [98]. Después de la infección por B19V, natural o experimental, se producen inmunoglobulinas tipo M y G. La IgM frente a epítopos lineales o conformacionales de VP1 y VP2 aparece entre 10 y 12 días después de la infección y puede encontrarse en suero hasta 5 meses después, aunque en algunos pacientes puede durar más incluso. La IgG aparece sobre 2 semanas después de la inoculación y probablemente persiste a lo largo de toda la vida. Se pueden detectar también anticuerpos IgA y presumiblemente juegan un papel en la protección contra la infección vía nasofaringe [97, 102]. Anemia aplásica transitoria y desórdenes hematológicos. En pacientes con desórdenes hematológicos subyacentes la infección aguda por B19V causa crisis aplásica transitoria, un abrupto cese de la producción de células rojas Introducción 43 caracterizado por reticulocitopenia, ausencia de precursores eritroides en la médula, viremia masiva y un empeoramiento de la anemia. Es una situación autolimitada, sin embargo, el paciente puede presentar enfermedad aguda con síntomas de anemia grave. La resolución de la crisis ocurre entre 7 y 10 días después del comienzo, concomitantemente con la aparición de anticuerpos antivíricos y el aclaramiento del virus [97]. Infección fetal e hidropesía fetal. Se ha asociado la infección por B19V con la pérdida fetal en la embarazada. La mayor mortalidad corresponde a aquellos casos en los que la madre se infectó en el primer trimestre de la gestación. La infección en el segundo trimestre se asocia predominantemente a hidropesía fetal. La infección en el tercer trimestre solo supone riesgo para el feto de forma muy excepcional. Conviene destacar que no todos los casos de hidropesía conducen a la pérdida fetal. La infección cuando no desemboca en muerte del feto puede persistir después del nacimiento como aplasia pura de células rojas [97]. Infección persistente. Muchos pacientes con infección persistente por B19V sufren anemia pura de células rojas o anemia crónica. La infección persistente se ha asociado con una amplia variedad de desórdenes inmunes adquiridos y congénitos [103]. 3.2.2 Epidemiología. La infección por B19 tiene una distribución mundial y su presentación puede ser tanto epidémica como esporádica. La seroprevalencia aumenta con la edad y la población adulta es seropositiva en más del 70% de casos [98]. Los patrones de seroprevalencia son generalmente similares en distintos países. Tanto el eritema infeccioso como la crisis aplásica transitoria son estacionales con un pico en invierno y primavera. Se producen epidemias de ambos al mismo tiempo con ciclos periódicos de 3-4 años. La infección se transmite vía respiratoria, a través de sangre y sus derivados administrados de forma parenteral y, verticalmente, de la madre al feto. Puede detectarse ADN específico de B19V en secreciones respiratorias en el momento de la viremia. B19V puede transmitirse con escasa frecuencia a través de médula ósea y derivados sanguíneos como plaquetas, inmunoglobulina intravenosa y fibrina [103]. Introducción 44 Como resultado del incremento en la búsqueda y estudio de este virus se han definido varios genotipos. Se ha sugerido que B19V debería clasificarse como eritrovirus de genotipo 1 (cepa prototipo Pvbaua), con las nuevas cepas A6 y K71 o LaLi como prototipos de genotipo 2 y el eritrovirus V9 como prototipo del genotipo 3 [98, 104]. Sin embargo y a pesar de la baja tasa de mutación de B19V, se están describiendo nuevas cepas que conllevan incluso la propuesta de nuevos subtipos del genotipo 3 (B19/3a y B19/3b) o del genotipo 1 (B19-1A y B19-1B) [105, 106]. 3.2.3 Diagnóstico. El diagnóstico de infección reciente o pasada por B19V recae en la detección de anticuerpos específicos contra proteínas de la cápsida. La detección de ADN del virus mediante técnicas de PCR, que pueden estandarizarse con un patrón internacional de ADN de parvovirus B19, resulta muy útil para el diagnóstico, ya que es la única técnica de detección directa disponible [98, 107]. Por el contrario, no existe un método adecuado para el aislamiento diagnóstico de rutina, aunque sí se pueden utilizar cultivos de médula ósea para investigación. Diagnóstico serológico. Las infecciones agudas por B19V se confirman por reactividad de IgM específica, que es la prueba fundamental en el diagnóstico, mientras que la infección pasada se detecta por reactividad de IgG. En la mayoría de los casos, los anticuerpos IgM se dirigen a epítopos lineales y conformacionales de VP1 y VP2. Los anticuerpos IgM aumentan a partir de 3-7 días después de la infección. La producción de IgG coincide con la disminución de la producción de IgM, aparece en torno a las dos semanas del inicio de la infección, y dura toda la vida. La reactividad de IgG frente a epítopos conformacionales de VP1 y VP2 persiste después de la infección, sin embargo la reactividad contra epítopos lineales, sobre todo frente a VP2, va disminuyendo y normalmente desaparece a lo largo de los 6 primeros meses de la infección [98]. Detección de genomas por PCR. La técnica de PCR incrementa la sensibilidad de detección de B19V, especialmente en casos de infección crónica en los que la demanda diagnóstica a menudo ocurre cuando ya se ha producido el aclaramiento de la IgM. Sin embargo, hay que tener en cuenta varios factores: es necesario evitar falsos positivos debidos a la carga de productos de amplificación Introducción 45 resultante de la alta viremia asociada a la infección, la detección de ADN de B19V en determinados tejidos no siempre indica infección aguda, la sensibilidad de los ensayos de PCR caseros debe contrastarse con el Estándar Internacional de la OMS para ADN de B19V (NIBSC 99/800), la variabilidad entre genotipos puede dar lugar a falsos negativos y, finalmente, los métodos de extracción deben ser adecuados para tejidos y no solo para suero o plasma. En pacientes inmunocompetentes, el ADN del virus puede detectarse en suero durante al menos un mes después de la infección. En infecciones crónicas el ADN viral puede persistir en el hospedador durante meses e incluso años en la médula ósea y en tejidos sinoviales cuando ya no se detectan anticuerpos. Además, se ha visto que puede persistir en individuos inmunocompetentes sanos a bajos niveles durante largos períodos de tiempo [95]. Con la introducción del Estándar Internacional de la OMS para ADN de B19V (NIBSC 99/800) es posible la normalización de los ensayos de PCR. La estandarización de estos métodos permitirá su uso para la selección rápida de productos de sangre y plasma. Además la PCR se puede convertir en una herramienta de detección de los nuevos genotipos de B19V [107]. 3.3 Otros virus exantemáticos. 3.3.1 Adenovirus. Los AdV se incluyen en el género Mastadenovirus (de 100 serotipos distintos, 51 afectan al hombre) de la familia Adenoviridae . Son virus icosaédricos, sin envoltura y con ADN bicatenario. La cápsida presenta proteínas en forma de hexones y pentones. Los AdV son causa frecuente de infección en edad pediátrica. El contagio se produce de persona a persona por inhalación, contacto de la mucosa conjuntival con manos sucias o secreciones suspendidas en el aire o por vía fecal-oral. También puede llegar al organismo por toallas, juguetes o agua contaminada, incluso de piscinas. En nuestro clima templado, se diagnostican infecciones por AdV durante todo el año. La mitad de las infecciones son subclínicas y la mayoría autolimitadas, e inducen inmunidad específica que no evita la infección por serotipos diferentes. El período de incubación es de 2-14 días. Produce infecciones respiratorias, conjuntivitis, Introducción 46 infecciones gastrointestinales, cistitis hemorrágica e infecciones en inmunodeprimidos. El diagnóstico microbiológico de AdV se realiza en muestras de lavados nasofaríngeos, exudados faríngeos y lavado broncoalveolar, raspados conjuntivales mediante detección de antígenos por inmunofluorescencia, aislamiento en células susceptibles y detección de genomas por PCR. La serología es de utilidad con fines epidemiológicos [108]. No existen demasiados antecedentes bibliográficos de exantemas producidos por AdV. En un estudio reciente se ha detectado AdV 4 y 5 mediante aislamiento en células A549 y PCR en cuatro niños con exantema morbiliforme y fiebre, vacunados con vacuna triple vírica [109]. El artículo de Ramsay et al de 2002 sobre las causas de exantema morbiliforme en niños con alta cobertura vacunal para sarampión y rubéola muestra 7 casos de infecciones por AdV de serotipos 1 (4 niños), 2 (2 niños) y 3 (un niño), una de ellas combinada con infección por estreptococo del grupo A, [110]. En otro estudio del año 2002 en el que se comparan los síntomas clínicos de niños con neumonía por AdV y niños con neumonía por causas diferentes se detecta una frecuencia significativamente mayor de exantema, entre otros síntomas extrapulmonares, en los pacientes con neumonía por AdV que en los pacientes con neumonía sin AdV [111]. 3.3.2 Enterovirus. El género Enterovirus pertenece a la familia Picornaviridae . Los EV no presentan envoltura, son icosaédricos con una cápsida compuesta por cuatro proteínas (VP1 a VP4) y su ARN es monocatenario de polaridad positiva. El género incluye 95 serotipos diferentes agrupados en tres especies: poliovirus, coxsackievirus A y B y echovirus, aunque algunos aún no se han podido asignar a ninguna especie. Recientemente, se ha propuesto otra clasificación en ocho especies en base a su homología genética. La mayoría de las infecciones por enterovirus son asintomáticas. Suelen transmitirse por vía respiratoria y oral-fecal replicando en faringe e intestino y excretándose durante largos períodos de tiempo, especialmente por heces. Excepcionalmente pueden producir afectación sistémica infectando a diversos órganos como meninges, Introducción 47 1. Desarrollo y evaluación de una técnica de PCR múltiple para la detección simultánea del virus del sarampión, virus de la rubéola y parvovirus B19, que permita el diagnóstico de infecciones por virus del sarampión al mismo tiempo que se inicia el diagnóstico diferencial con los dos virus que “a priori” son los más importantes en la producción de cuadros exantemáticos clínicamente similares. Evaluación comparativa de su eficacia para el diagnóstico de sarampión frente al cultivo y la detección de IgM específica como técnicas de referencia. 2. Evaluación de muestras alternativas al suero, como la sangre seca en papel de filtro y el exudado faríngeo en tampón de lisis de ARN, para el diagnóstico de la infección por virus del sarampión en lugares donde las condiciones para la obtención, conservación y envío de muestras clínicas clásicas (suero, orina y/o exudado faríngeo) no sean adecuadas por diferentes motivos. 3. Estudio de la etiología de los exantemas víricos infantiles en el contexto de una alta cobertura de vacunación frente a sarampión y rubéola, mediante la realización de un estudio prospectivo en niños con exantema que no cumplan la definición de caso de sarampión atendidos en consultas pediátricas de atención primaria. 4. Desarrollo de tecnología molecular para genotipificado del virus del sarampión basada en las recomendaciones de la Organización Mundial de la Salud para la armonización del genotipificado de dicho virus. 5. Estudio de los patrones generales de circulación de genotipos de virus del sarampión en España entre los años 2001 y 2008 y de su significado como indicadores del estadio de eliminación de la enfermedad. 6. Determinación del origen geográfico de las cepas de virus del sarampión detectadas en España entre los años 2001 y 2008 y establecimiento de las fuentes principales de importación. Objetivos 55 MATERIAL Y MÉTODOS 1. MUESTRAS Y CEPAS. 1.1 Cepas de virus. Para la realización de este trabajo se utilizaron las cepas vacunales Schwarz de MeV y Wistar RA27/3 de RUBV (GlaxoSmithKline S.A., Madrid) y una muestra que contiene partículas de B19V observables por microscopía electrónica. Asimismo, se dispuso de un panel de B19V procedente de un ensayo multicéntrico de control de calidad para PCR de B19V del “National Institute for Biological Standards and Control” (Hertfordshire, Reino Unido) [130] y de otro panel de distintos genotipos de MeV [21, 131] preparado por el Laboratorio de Referencia de Sarampión de los Centros para el Control y Prevención de la Enfermedad (Atlanta, USA). Este panel de MeV incluía las cepas Edmonston-wt.USA/54 (genotipo A, nº de acceso en GenBank: U03669, U01987), Illinois.USA/89/1 “Chicago 1” (D3; M81895, U01977), Palau.BLA/93 (D5; L46757, L46758), Bangkok.THA/93/1 (D5; AF009575, AF079555), Maryland.USA/77 “JM” (C2; M81898, M89921), New Jersey.USA/94/1 (D6; L46749, L46750), Hunan.CHN/93/7 (H1; AF045201, AF045212), Montreal.CAN/89 (D4; AF079554, U01976) y Yaounde.CAE/12.83 “Y-14” (B1; AF079552, U01998). Las cepas del panel de MeV se subcultivaron en la línea celular B95a para su posterior mantenimiento a –80ºC. Para evaluar la especificidad del ensayo se usaron cepas de virus parainfluenza 1, 2, 3, 4A y 4B, AdV 5, virus de la parotiditis, virus respiratorio sincitial A y B y virus de la encefalitis equina del este, procedentes de la colección del Instituto de Salud Carlos III. 1.2 Muestras post-vacunación y del biobanco del ISCIII. Se utilizaron las muestras procedentes de la colección del ISCIII que se detallan en la Tabla 8 de la sección 2.2 de Resultados. Estas muestras se dividieron en cinco grupos para una mejor valoración de los resultados. El grupo 1, constituido por cinco exudados faríngeos y cuatro sueros, procedían de cinco niños implicados en un brote de MeV en Soria en 1992. El grupo 2 incluye 22 LCR y 11 sueros de pacientes con encefalitis asociada a MeV. El grupo 3 está compuesto por 3 muestras de orina, 3 Material y Métodos 59 sueros IgM positivos para RUBV y 2 exudados faríngeos procedentes de un recién nacido con síndrome de rubéola congénita; además de un suero positivo a IgM de RUBV, de la madre. En este grupo, una orina, un exudado faríngeo y un suero se recogieron 15 días después del nacimiento; la segunda orina, exudado faríngeo y suero 37 días después del nacimiento, y las últimas muestras de orina y suero se recogieron 38 días después del nacimiento. El grupo 4, procedente del Centro de Salud Condes de Barcelona (Galapagar, Madrid), estaba constituido por muestras postvacunales: 27 exudados faríngeos y 4 muestras de orina de 26 niños vacunados recogidos entre los días 10 y 14 después de la vacunación con vacuna triple vírica en el año 1998. Finalmente, el grupo 5 estaba formado por 19 muestras de suero (14 positivas y 5 negativas a IgM frente a B19V) de 19 pacientes afectados por un brote de eritema infeccioso ocurrido en Soria en 1998. Las condiciones de almacenamiento fueron diferentes para cada grupo de muestras: las de los grupos 2 y 5 se mantuvieron congeladas a –20 ºC; las del grupo 2, al igual que los sueros de los grupos 1 y 3, fueron congeladas y descongeladas un número de veces desconocido con el fin de realizar diferentes pruebas serológicas a lo largo del tiempo. Las distintas muestras de sueros, de los grupos 1 y 3, se mantuvieron varios días a 4ºC antes de congelarlas a –70ºC. Las muestras del grupo 4 se dividieron en dos alícuotas y se congelaron a –80ºC inmediatamente después de su llegada al laboratorio (Tabla 8). 1.3 Muestras clínicas del Plan Nacional de Eliminación del Sarampión. La definición de caso de sarampión dada por la OMS e incluida en el Plan Nacional de Eliminación del Sarampión, incluye: 1. Exantema maculopapular de más de tres días de duración. 2. Fiebre mayor de 38ºC. 3. Al menos uno de los siguientes síntomas: tos, coriza o conjuntivitis. En todos los casos compatibles con esta definición se recomienda que se recojan muestras de suero, exudado faríngeo y orina en la primera visita médica de los pacientes. De cada paciente sospechoso de presentar la enfermedad se solicita una ficha epidemiológica (Figura 4) y se le asigna un número constituido por las iniciales SAR, Material y Métodos 60 año de declaración, número de la provincia que lo declara y número de caso en dicha provincia. Por ejemplo: SAR0105555 sería el caso 555 ocurrido en la provincia de código 05 en el año 2001 (Figura 4). Las muestras son enviadas a los laboratorios de cada Comunidad Autónoma, que constituyen la Red de Laboratorios del Plan de Eliminación del Sarampión. Para aquellas determinaciones de técnicas no disponibles en los laboratorios primarios, las muestras se envían al Laboratorio Nacional de Referencia del CNM (Instituto de Salud Carlos III). Los sueros se ensayan para IgM de MeV, RUBV y B19V y, tanto la orina como el exudado faríngeo se inoculan en la línea celular B95a. Además, se realiza determinación de RT-PCR múltiple para MeV, RubV y B19 en todas las muestras. Entre los años 2001 y 2008 se estudiaron en el CNM 3551 muestras procedentes de 2132 casos, sobre los que se realizaron 8776 determinaciones (Tabla 5), con una distribución por comunidades autónomas que se muestra en la Tabla 6. Se utilizaron para el estudio muestras procedentes de un brote de sarampión ocurrido en la provincia de Almería entre enero y junio del año 2003 con un total de 317 casos. De estos casos, se incluyeron en el estudio los 246 pacientes de los que se disponía de grupos completos de muestras (suero, orina y exudado faríngeo). Ciento veintiocho eran hombres (52.1%) y 118 (47.9%) mujeres, con una media de edad de 15,5 ± 12,5 años y un rango de 0 a 60 años. Ciento dieciséis (47,15%) tenían entre 20 y 35 años mientras que 44 (17,9%) eran menores de 15 meses. Las muestras fueron recogidas y procesadas siguiendo las recomendaciones de la OMS [132]. La mayoría de las muestras se enviaron a 4ºC tan pronto como fueron recogidas, mientras que una minoría se recibió congelada en nieve carbónica. Después de procesadas, dichas muestras se almacenaron a –80ºC. Material y Métodos 61 Figura 4. Ficha epidemiológica de caso sospechoso de sarampión. Material y Métodos 62 2001 2002 2003 2004 2005 2006 2007 2008 Total Nº Casos Estudiados 65 133 497 84 85 459 498 313 2132 Nº Muestras 102 165 1124 118 147 736 586 573 3551 Nº Determinaciones 332 500 4114 382 326 1081 1096 945 8776 Tabla 5. Casos del Plan Nacional de Eliminación del Sarampión estudiados en el CNM desde el año 2001. CCAA 2001 2002 2003 2004 2005 2006 2007 2008 Total C* I* C I C I C I C I C I C I C I Andalucía 2 10 3 3 246 86 9 6 1 8 0 6 0 7 21 176 584 Aragón 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Asturias 0 1 0 0 0 3 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 4 I.Baleares 0 7 0 0 0 2 1 6 0 2 1 0 0 0 1 0 20 I.Canarias 1 0 0 2 0 0 2 1 2 0 5 49 0 1 0 0 63 Cantabria 0 0 0 1 0 0 0 1 0 0 0 1 0 0 0 0 3 Castilla-La Mancha 0 3 0 2 3 21 0 1 1 2 0 2 2 7 0 3 47 Castilla y León 0 5 1 1 0 0 0 0 0 2 1 1 10 16 2 1 40 Cataluña 0 1 0 0 0 0 0 12 1 7 0 24 0 375 0 0 420 Ceuta 0 3 0 2 0 2 0 4 0 2 0 1 0 0 3 3 20 Extremadura 1 9 1 8 0 5 0 1 0 2 0 2 0 2 0 1 32 Galicia 0 2 0 3 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 0 0 7 La Rioja 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 17 13 2 0 0 2 34 Madrid 2 2 0 35 4 63 1 18 5 30 6 294 2 57 3 77 599 Melilla 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Murcia 0 1 0 0 1 5 0 1 0 1 1 9 0 3 1 2 25 Navarra 0 1 0 0 0 4 0 0 0 0 0 4 0 1 1 1 12 País Vasco 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 4 0 1 1 0 0 6 C.Valenciana 0 14 0 71 0 52 0 19 0 19 0 17 0 11 1 14 218 Total 65 133 497 84 85 459 498 313 *C: casos sospechosos con grupo de muestras completo: suero, exudado faríngeo y orina. I: casos sospechosos sin grupo de muestras completo. Tabla 6. Casos del Plan Nacional de Eliminación del Sarampión recibidos en el CNM por CCAA y año, indicando cuantos tienen un grupo completo de muestras. 1.4 Muestras de sangre seca en papel de filtro y exudado faríngeo en tampón de lisis de extracción de ácidos nucleicos. Se obtuvieron 43 muestras de sangre completa secada en papel de filtro procedentes de dos brotes de sarampión ocurridos en Guinea Ecuatorial en los años 2001 (20 muestras) y 2008 (23 muestras). De los pacientes del segundo brote se recogieron además 23 exudados faríngeos incluyéndolos, para su transporte, en el tampón de Material y Métodos 63 lisis del extractor automático de ácidos nucleicos totales MagNA Pure LC v3.01 (Roche Diagnostics, Mannheim, Alemania). Sobre estas muestras se determinó IgM específica de MeV mediante dos equipos comerciales, uno basado en una técnica de ELISA indirecto (Enzygnost, Siemens Healthcare Diagnostics Inc., EEUU) y el otro en la captura de cadenas pesadas (µ) por ELISA (Chemicon, USA). Asimismo se determinó la presencia de genomas de MeV, RUBV y B19V mediante PCR. Posteriormente, los casos positivos fueron genotipificados. Durante el primer brote se consiguieron 20 muestras de 19 pacientes con edades comprendidas entre 3 meses y 7,5 años desde febrero a mayo de 2001 en Bata (Guinea Ecuatorial). Las muestras fueron recogidas durante los tres primeros días de aparición del exantema. Se tomaron en el Hospital Regional de Bata y se mantuvieron a temperatura ambiente (22-30ºC) con una humedad relativa del 90% hasta su envío a nuestro laboratorio. Fueron almacenadas a 4ºC hasta que fueron ensayadas no más de dos meses después. Teniendo en cuenta que una pieza circular de papel de 3 mm de diámetro correspondía aproximadamente a 4,8 µl de sangre completa [133], en cada ensayo serológico se usó el volumen adecuado de tampón de dilución de muestra para alcanzar la dilución correspondiente (1:40 para ELISA indirecto y 1:200 para el de captura). Las pruebas serológicas se llevaron a cabo siguiendo las instrucciones del fabricante. La PCR de exantemáticos se llevó a cabo con una gota completa de sangre seca, dejando que el papel de filtro se embebiera en 500 µl de agua libre de ARNasas durante 15 min del que luego se extrajeron 100 µl de sobrenadante como se describe más adelante en la sección 4.1. En las muestras positivas se estudió el genotipo del virus mediante PCR de genotipificado y secuenciación genómica. En el brote del año 2008 se obtuvieron 23 muestras de exudados faríngeos en tampón de lisis y 23 de sangre seca en papel Whatman de 23 niños con síntomas de sarampión agudo procedentes de nueve barrios diferentes de Malabo y cuatro de Bata (Guinea Ecuatorial). Las muestras se recogieron entre 2 y 15 días desde el comienzo de los síntomas y se mantuvieron a 4ºC hasta su envío a nuestro laboratorio en España, donde fueron almacenadas a 4ºC hasta que fueron ensayadas no más de dos meses después. La edad de los pacientes estaba comprendida entre 4 meses y 7 años. Todas las muestras de exudado faríngeo y de sangre seca en papel Material y Métodos 64 Whatman fueron analizadas para ARN de MeV en la PCR de exantemáticos y además, se probaron todas las muestras de sangre seca en papel Whatman para IgM específica de MeV por ELISA indirecto. En ELISA indirecto se usaron 4 piezas circulares de papel de 3 mm de diámetro y el volumen adecuado de tampón de dilución de muestra para alcanzar la dilución 1:40. Las pruebas serológicas se llevaron a cabo siguiendo las instrucciones del fabricante. La PCR de exantemáticos se llevó a cabo con 2 piezas circulares de papel de 3 mm de diámetro, primero se permitió que el papel de filtro se embebiera en 150 µl de agua libre de ARNasas durante 15 min, luego se extrajeron 100 µl de sobrenadante en el robot de extracción de ácidos nucleicos MagNA Pure LC, versión 3.01 (Roche Diagnostics, Mannheim, Alemania). En las muestras positivas se estudió el genotipo del virus mediante PCR de genotipificado y secuenciación genómica. 1.5 Muestras clínicas de exantema vírico infantil en el contexto de una alta cobertura de vacunación con triple vírica. La etiología de los exantemas que afectan a niños en la actual situación de alta cobertura vacunal se evaluó gracias a un estudio realizado entre el 5 de junio de 2001 y el 6 de junio del 2003 en la Comunidad de Madrid en el cual se extrajo suero y exudado faríngeo a ochenta y ocho pacientes. Los criterios de inclusión de los pacientes en el estudio fueron: 1. Edad menor de 15 años. 2. Presencia de exantema. 3. Fiebre, febrícula y/o afectación general. Ante la presencia de un caso que cumplía los criterios de inclusión, los médicos pediatras de atención primaria participantes, tras informar a los padres y obtener el consentimiento para participar en el estudio, les realizaron un cuestionario. Se recogió información sobre el estado de vacunación con vacuna triple vírica de los niños a través de las cartillas de vacunación y de los registros de las historias clínicas. Se recogieron muestras de exudado faríngeo y suero de 51 niños y 37 niñas con exantema, cuya media de edad era de 30 meses con un rango entre 3 meses y 12 Material y Métodos 65 años. La cobertura vacunal incluía 37 pacientes vacunados con una dosis de vacuna triple vírica, 8 con dos y 43 sin precedentes confirmados de vacunación. En los exudados faríngeos recolectados se realizó una PCR múltiple de enterovirusherpesvirus (EV, HHV1, HHV2, HHV3, HHV-4, HHV-5 y HHV-6) [134], PCR múltiple para virus exantemáticos (MeV, RUBV, B19V) [135] y PCR frente a AdV [136]. Los resultados positivos se confirmaron en una segunda alícuota. En los sueros se realizaron las pruebas de detección de IgM, IgG e índice de avidez para cada uno de los virus mencionados (Tabla 7). IgG IgM IA Sarampión Si Si No Rubéola Si Si Si Parvovirus B19 Si Si No Virus herpes humano 6 No Si No HHV-5 (Citomegalovirus) Si Si No HHV-4 (Virus Epstein-Barr) Si Si No Tabla 7. Pruebas serológicas realizadas en un panel de muestras de niños con exantema de la Comunidad Autónoma de Madrid. Se establecieron los siguientes criterios para la interpretación de los resultados obtenidos: • Infección aguda por MeV: IgM positiva y/o PCR positiva. • Infección aguda por RUBV: IgM positiva e índice de avidez de IgG menor de 40 y/o PCR positiva. • Infección aguda por HHV-6, HHV-5 o HHV-4: IgM positiva o IgM indeterminada. • Reactivación de infección por HHV-6, HHV-5 o HHV-4: IgM negativa, IgG positiva y PCR positiva. • Infección aguda por B19V: IgM positiva y/o PCR positiva. • Infección por EV: PCR positiva y tipificación Poliovirus/No Poliovirus. • Infección por AdV: PCR positiva. 2. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO. El diagnóstico serológico se realizó en el Laboratorio de Serología del Servicio de Microbiología Diagnóstica del Centro Nacional de Microbiología, ISCIII. Excepto en el Material y Métodos 66 siguiendo el método Neighbor-Joining (Kimura 2 parámetros, 1000 replicaciones de “bootstrap”) [143]. Como criterio de asignación de genotipo se estableció que la secuencia detectada estuviera asociada a una secuencia de referencia de la OMS con un “bootstrap” mínimo de 90. 5. ANÁLISIS ESTADÍSTICO. En el estudio de marcadores diagnósticos del brote de Almería 2003, se utilizó el test t de Student para comparar las medias de los días transcurridos desde la aparición del exantema hasta el diagnóstico por detección de IgM específica o por PCR de virus exantemáticos. Asimismo, se utilizó el método estadístico Chi cuadrado corregido con el test exacto de Fisher de dos colas para comparar la efectividad diagnóstica de las dos técnicas de detección de MeV, IgM y PCR. Material y Métodos 73 RESULTADOS Resultados 77 1. DESARROLLO DE UNA PCR MÚLTIPLE PARA VIRUS DEL SARAMPIÓN, DE LA RUBÉOLA Y PARVOVIRUS B19. 1.1 Diseño de los iniciadores o “primers”. Para el diseño de los iniciadores de la PCR, denominada en este trabajo PCR múltiple de virus exantemáticos, se obtuvieron secuencias desde la base de datos GenBank, de los genes de la nucleoproteína N del MeV, la glicoproteína E1 del RUBV y las proteínas de la cápsida VP1 y VP2 de B19V. Los genes para el diseño se eligieron teniendo en cuenta el número de secuencias encontradas en GenBank, los trabajos publicados en cada virus, y en el caso de MeV el hecho de que el gen de la nucleoproteína es el primero en replicarse incluso en casos de PEES. Las secuencias de cada virus fueron alineadas usando la aplicación MEGALIGN del paquete informático DNASTAR (DNASTAR INC., Madison, WI, EEUU), alineamiento que se usó para el diseño de los iniciadores (Figura 5) [135]. Estos iniciadores fueron sintetizados por la empresa Pharmacia (Biotech Freeburg, Alemania). Los criterios para el diseño de los iniciadores fueron los siguientes: 1. El tamaño debía estar entre 18 y 22 nucleótidos. 2. El tamaño del fragmento amplificado de los tres virus debía de ser lo suficientemente diferente como para ser fácilmente discriminable por electroforesis en gel de agarosa. 3. La base del extremo 3´ no debía situarse en la tercera posición del codón. 4. La temperatura de hibridación de cada par de iniciadores debía ser similar. Resultados 78 Sar1F 5´C G G A G C T A A G A A G G T G G A T A A3´ SecA×62 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . SecB×2 . . . . . T . . . . . . . . . . . . . . . SecC×1 . . . . . . . T . . . . . . . . . . . . . Sar1R 5´C T C C C A T G G C A T A G C T C C A3´ Alineam 5´T G G A G C T A T G C C A T G G G A G3´ SecA×64 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Sec B×1 . . . . . . . . . . . T . . . . . . . Sar2R 5´A A C T T T G T T C T G A A T T G A G T T C T C3´ Alineam 5´G A G A A C T C A A T T C A G A A C A A G T T3´ SecA×49 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . SecB×16 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . A . . ar2F 5´C C A G G A T T G C T G A A A T G A T A T G3´ SecA×52 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . SecB×13 . T . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Rube1F 5´C G T C T G G C A A C T C T C C G T3´ SecA×36 . . . . . . . . . . . . . . . . . . SecB×2 T . . . . . . . . . . . . . . . . . SecC×1 . . . G . . . . . . . . . . . . . . Ru1TR 5´C G T A T G T G G A G T C C G A C A C T T3´ Alineam 5´A A G T G T G G A C T C C A C A T A C G3´ SecA×35 . . . . . C . . . . . . . . . . . . . . SecB×3 . . . . . T . . . . . . . . . . . . . . SecC×1 . . . . . C . . . . . . . . . . . G . . Rube 2F 5´C A C G C C G C A C G G A C A A C T3´ SecA×38 . . . . . . . . . . . . . . . . . . SecB×1 . . . . . . . G . . . . . . . . . . Rube2R 5´G A G A G C C T A T G A C A G G G C G T G A3´ Alineam 5´T C A C G C C C G T C A T A G G C T C T C3´ SecB×26 . . . . . . . T . . . . . . . . . . . . . SecA×11 . . . . . . . C . . . . . . . . . . . . . SecC×2 . . . . . . . C . . T . . . . . . . . . . EPV1+ 5´C A G A A G C C A G C A C T G G T G C A3´ SecA×47 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . SecB×2 . . . . T . . . . . . . . . . . . . . . EPV15´A T G G T G C A A A C C T T T G C C T C3´ Alineam 5´G A G G C A A A G G T T T G C A C C A T3´ SecA×43 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . SecB×5 . . . . . . . . . . . . . . . . . A . . SecC×1 . . . . . . . . A . . . . . T . . . . . EPV2+ 5´C A A A A G C A T G T G G A G T G A G G3´ SecA×40 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . SecB×6 T . . . . . . . . . . . . . . . . . . . SecC×1 A . . . . . . . . . . . . . . . . . . . SecD×1 G . . . . . . . . . . . . . . . . . . . SecE×1 . M . . . . . . . . . . . . . . . . . . EPV25´G T G C T C T G G G T C A T A T G G A A3´ Alineam 5´T T C C A T A T G A C C C A G A G C A C3´ SecA×39 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . SecB×5 . . . . T . . . . . . . . . . . . . . . SecC×2 . . . . . . . . . . T . . . . . . . . . SecD×1 . C . . . . . . . . . . . . . . . . . . SecE×1 . . . . . . . . . . G . . . . . . . . . SecF×1 . C . . . . . . . G . . . . . . . . . . A. INICIADORES DE SARAMPIÓN Primera reacción. Tamaño de la banda: 443 pb. Iniciador Sar1F, situado entre las posiciones 680 y 700. Iniciador Sar1R, entre las posiciones 1105 y 1123. Posiciones referidas a la secuencia K01711(cepa Edmonston), Billeter 1984. S Segunda reacción. Tamaño de la banda: 229 pb. Iniciador Sar2F, entre las posiciones 851 y 872. Iniciador Sar2R, entre las posiciones 1057 y 1079. Posiciones extraídas de la secuencia K01711 (cepa Edmonston), Billeter 1984. Números de acceso de las secuencias incluidas en el alineamiento: AF045205, AF045206, AF045207, AF045208, AF045209, AF045210, AF045211, AF045212, AF045213, AF045214, AF045215, AF045216, AF045217, AF045218, D63925, D63927, E04903, K01711, L46728, L46730, L46740, L46744, L46733, L46746, L46748, L46750, L46753, L46756, L46760, L46764, L46758, M89921, M89922, S58435, U01974, U01976, U01977, U01978, U01987, U01988, U01989, U01990, U01991, U01992, U01993, U01994, U01995, U01996, U01998, U01999, U03650, U03653, U03656, U03658, U03661, U03664, U03668, U29317,X01999, X13480, X16566, X16567, X16568, X16569, Z66517. B. INICIADORES DE RUBÉOLA Primera reacción. Tamaño de la banda: 380 pb. Iniciador Rube1F, entre las posiciones 8745 y 8762. Iniciador Ru1TR, entre las posiciones 9106 y 9125. Posiciones obtenidas de la secuencia M15240, cepa Therien. Frey 1986. Segunda reacción. Tamaño de la banda: 289 pb. Iniciador Rube2F entre las posiciones 8808 y 8825. Iniciador Rube2R entre las posiciones 9077 y 9097. Posiciones extraídas de la secuencia M15240, cepa Therien. Frey 1986. Números de acceso: AB003337, AB003338, AB003339, AB003340, AB003341, AB003342, AB003343, AB003344, AB003345, AB003346, AB003347, AB003348, AB003349, AB003350, AB003351, AB003352, AB003355, D00156, D50673, D50674, D50675, D50676, D50677, L16228, L16229, L16230, L16231, L16232, L16233, L16234, L16235, L16236, L78917, L19420, L19421, M15240, M30776, X05259, X14871. C. INICIADORES DE PARVOVIRUS B19 Primera reacción. Tamaño de la banda: 211 pb. Iniciador EPV1+, entre las posiciones 3323 y 3342. Iniciador EPV1entre las posiciones 3514 y 3533. Posiciones extraídas de la secuencia completa de la cepa HV: AF162273, Gallinella (no publicada). Segunda reacción. Tamaño de la banda: 94 pb. Iniciador EPV2+ entre las posiciones 3366 y 3385. Iniciador EPV2entre las posiciones 3440 y 3459. Posiciones extraídas de la secuencia completa de la cepa HV: AF162273, Gallinella (no publicada). M: A ó C. Números de acceso: AB015949, AB015950, AB015951, AB015952, AB015953, AB015959, AB030673, AB030693, AB030694, AF113323, AF161223, AF161224, AF161225, AF161226, AF161228, AF162273, AF221904, AF221905, AF264149, N000883, M13178, U31358, U38506, U38507, U38508, U38509, U38510, U38511, U38512, U38513, U38514, U38515, U38516, U38517, U38518, U38546, U53593, U53594, U53595, U53596, U53597, U53598, U53599, U53600, U53601, Z68146, Z70528, Z70560, Z70599. Figura 5. Iniciadores de cada virus. En la primera columna se indica, después del signo “x”, el número de secuencias de cada tipo encontradas. 1.2 Ajuste de parámetros de primera reacción de PCR. Se usó el equipo comercial Access RT-PCR de Promega (Madison, WI, EEUU) para realizar una reacción de transcripción inversa y amplificación en un sólo paso. Inicialmente se titularon en unas condiciones tentativas las cepas vacunales Schwarz de MeV, Wistar RA27/3 de RUBV (GlaxoSmithKline S.A., Madrid) y una muestra que contiene partículas de B19V observables por microscopía electrónica, para establecer una dilución de trabajo A (alta concentración vírica) con la que observar posibles efectos de aparición de bandas inespecíficas múltiples y otra B (baja concentración vírica) con la que evaluar el efecto sobre la sensibilidad. Seguidamente, se llevaron a cabo una serie de experimentos utilizando ambas diluciones de cada uno de los tres virus, para establecer las concentraciones óptimas de SO4Mg (Figura 6), desoxinucleótidos trifosfato e iniciadores (Figura 7), así como las temperaturas óptimas de hibridación (Figura 8) y de desnaturalización (Figura 9). Figura 6. Estandarización de la concentración de SO4Mg para B19V. P: Tubo de PCR sólo con iniciadores de B19V. M: Tubo de PCR con iniciadores de los tres virus. 1 a 6 mM: concentraciones de SO4Mg probadas. 211 pb M P M P M P M P M P M P M P M P M P M P M P M P 1 2 3 4 5 6 Pm 1 2 3 4 5 6 mM Alta concentración de virus Baja concentración de virus Concentración seleccionada 211 pb M P M P M P M P M P M P M P M P M P M P M P M P 1 2 3 4 5 6 Pm 1 2 3 4 5 6 mM Alta concentración de virus Baja concentración de virus M P M P M P M P M P M P M P M P M P M P M P M P 1 2 3 4 5 6 Pm 1 2 3 4 5 6 mM Alta concentración de virus Baja concentración de virus Concentración seleccionada Resultados 79 Figura 7. Estandarización combinada de la concentración de iniciadores y dNTPs en el caso de MeV. 22: dilución de 200 µM dNTPs y 0,2 µM de iniciadores; 25: dilución de 200 µM dNTPs y 0,5 µM de iniciadores; 210: dilución de 200 µM dNTPs y 1 µM de iniciadores; 52: dilución de 500 µM dNTPs y 0,2 µM de iniciadores; 55: dilución de 500 µM dNTPs y 0,5 µM de iniciadores y 510: dilución de 500 µM dNTPs y 1 µM de iniciadores. S: Tubo de PCR sólo con iniciadores de sarampión. M: Tubo de PCR con iniciadores de los tres virus. M S M S M S M S M S M S M S M S M S M S M S M S 22 25 210 52 55 510 22 Pm 25 210 52 55 510 Alta concentración de virus Baja concentración de virus Concentración seleccionada 443 pb M S M S M S M S M S M S M S M S M S M S M S M S 22 25 210 52 55 510 22 Pm 25 210 52 55 510 Alta concentración de virus Baja concentración de virus M S M S M S M S M S M S M S M S M S M S M S M S 22 25 210 52 55 510 22 Pm 25 210 52 55 510 Alta concentración de virus Baja concentración de virus Concentración seleccionada 443 pb Figura 8. Estandarización de la temperatura de hibridación de MeV. M: tubo con iniciadores de los tres virus. S: tubo con iniciadores de MeV. 0 a -3: diluciones 10-1 a 10-3 de MeV. 55º 60º 65º 0M 0S -1M -1S -2M -2S -3M -3S 0M 0S -1M -1S -2M -2S -3M -3S Pm 0M 0S -1M -1S -2M -2S -3M -3S 443 pb Temperatura de hibridación seleccionada 55º 60º 65º 0M 0S -1M -1S -2M -2S -3M -3S 0M 0S -1M -1S -2M -2S -3M -3S Pm 0M 0S -1M -1S -2M -2S -3M -3S 443 pb 55º 60º 65º 0M 0S -1M -1S -2M -2S -3M -3S 0M 0S -1M -1S -2M -2S -3M -3S Pm 0M 0S -1M -1S -2M -2S -3M -3S 443 pb Temperatura de hibridación seleccionada Resultados 80 Figura 9. Estandarización de la temperatura de desnaturalización para los tres virus, RUBV, MeV y B19V. R: tubos con iniciadores de RUBV. S: tubos con iniciadores de MeV. P: tubos con iniciadores de B19V. MR, MS, MP: tubos con iniciadores de los tres virus probados para RUBV, MeV y B19V respectivamente. -1, -3, -2, -5: diluciones 10-1, 10-3, 10-2 y 10-5 utilizadas con los distintos virus. R MR S MS P MP Pm 93º94º 95º93º94º95º 93º 94º 95º 93º 94º 95º 93º 94º 95º 93º 94º 95º -1 -1 -3 -1 -3 -1 -3 -1 -3 -1 -3 -1 -3 -2 -5 -2 -5 -2 -5 -2 -5 -2 -5 -2 443pb 211pb 380pb Temperatura seleccionada R MR S MS P MP Pm 93º94º 95º93º94º95º 93º 94º 95º 93º 94º 95º 93º 94º 95º 93º 94º 95º -1 -1 -3 -1 -3 -1 -3 -1 -3 -1 -3 -1 -3 -2 -5 -2 -5 -2 -5 -2 -5 -2 -5 -2 R MR S MS P MP Pm 93º94º 95º93º94º95º 93º 94º 95º 93º 94º 95º 93º 94º 95º 93º 94º 95º -1 -1 -3 -1 -3 -1 -3 -1 -3 -1 -3 -1 -3 -2 -5 -2 -5 -2 -5 -2 -5 -2 -5 -2 443pb 211pb 380pb 443pb 211pb 380pb Temperatura seleccionada Temperatura seleccionada En base a estos experimentos se seleccionaron las condiciones óptimas de la primera reacción de PCR: 5 µl del extracto obtenido de la muestra a estudiar se mezclaron con 3 mM de SO4Mg; 500 µM de cada uno de los dNTPs (dATP, dGTP, dCTP y dTTP); 0,5 µM de cada uno de los iniciadores de MeV, RUBV y B19V específicos para la primera reacción (Figura 5); 10 µl de AMV/Tfl 5x (tampón de la reacción); 5 U de transcriptasa inversa del virus de la mieloblastosis aviar y 5 U de ADN polimerasa de Thermus flavus en un tubo de PCR hasta conseguir un volumen final de 50 µl. En la mezcla final se incluyeron un par de iniciadores específicos del plásmido de control interno a una concentración final de 0,2 µM cada uno (sección 1.4). Se utilizó un termociclador PTC-200 Peltier (MJ Research, Watertown, MA, EEUU) para estandarizar las temperaturas de la primera reacción de PCR. Se obtuvo así el siguiente programa: 45 min a 48ºC para la transcripción inversa y 2 min a 94ºC para inactivar la transcriptasa inversa y desnaturalizar el ADNc, seguido de 30 ciclos de: 1 min de desnaturalización a 93ºC, 1 min de hibridación a 55ºC y 1 min de elongación a 72ºC. La elongación se extendió a 5 min en el último ciclo [135]. Resultados 81 1.3 Ajuste de parámetros de segunda reacción de PCR o anidada. Las condiciones de segunda reacción se obtuvieron realizando experimentos de estandarización similares a los de la primera reacción (Figura 10,Figura 11,Figura 12 yFigura 13). Figura 10. Estandarización de la concentración de Cl2Mg para los tres virus. MA: tubos con iniciadores para los tres tipos de virus y probados con una concentración alta de cada uno. MB: tubos con iniciadores para los tres tipos de virus y probados con una concentración baja de cada uno. 289 pb 94 pb 229 pb Rubéola Sarampión Parvovirus B19 MA1 MA2 MA3 MA4 MA5 MA6 Pm MB1 MB2 MB3 MB4 MB5 MB6 Concentración seleccionada 289 pb 94 pb 229 pb Rubéola Sarampión Parvovirus B19 MA1 MA2 MA3 MA4 MA5 MA6 Pm MB1 MB2 MB3 MB4 MB5 MB6 289 pb 94 pb 229 pb Rubéola Sarampión Parvovirus B19 Rubéola Sarampión Parvovirus B19 MA1 MA2 MA3 MA4 MA5 MA6 Pm MB1 MB2 MB3 MB4 MB5 MB6 Concentración seleccionada Figura 11. Estandarización de la concentración de desoxinucleótidos trifosfato e iniciadores para MeV, RUBV y B19V. 22: dilución de 200 µM dNTPs y 0,2 µM de iniciadores; 25: dilución de 200 µM dNTPs y 0,5 µM de iniciadores; 210: dilución de 200 µM dNTPs y 1 µM de iniciadores, 52: dilución de 500 µM dNTPs y 0,2 µM de iniciadores; 55: dilución de 500 µM dNTPs y 0,5 µM de iniciadores, 510: dilución de 500 µM dNTPs y 1 µM de iniciadores; 102: dilución de 1000 µM dNTPs y 0,2 µM de iniciadores; 105: dilución de 1000 µM dNTPs y 0,5 µM de iniciadores y 1010: dilución de 1000 µM dNTPs y 1 µM de iniciadores. Dilución alta Dilución baja 22 25 210 52 55 510 102 105 1010 Pm 22 25 210 52 55 510 102 105 1010 Rubéola Sarampión Parvovirus B19 Concentración seleccionada Dilución alta Dilución baja 22 25 210 52 55 510 102 105 1010 Pm 22 25 210 52 55 510 102 105 1010 Rubéola Sarampión Parvovirus B19 Concentración seleccionada Resultados 82 Figura 12. Estandarización de la temperatura de hibridación a 50, 55, 60 y 65ºC. B: tubo con concentración baja de cada virus. A: tubo con concentración alta de cada virus. 50º 55º 60º 65ºC B A B A B A B A Pm Rubéola Sarampión Parvovirus B19 Temperatura seleccionada 50º 55º 60º 65ºC B A B A B A B A Pm Rubéola Sarampión Parvovirus B19 Rubéola Sarampión Parvovirus B19 Temperatura seleccionada Figura 13. Estandarización de la temperatura de desnaturalización de MeV, RUBV y B19V a 92, 93, 94 y 95ºC. B: tubo con concentración baja de cada virus. A: tubo con concentración alta de cada virus. 92º 93º 94º 95ºC B A B A B A B A Pm Rubéola Sarampión Parvovirus B19 Temperatura seleccionada 92º 93º 94º 95ºC B A B A B A B A Pm Rubéola Sarampión Parvovirus B19 92º 93º 94º 95ºC B A B A B A B A Pm Rubéola Sarampión Parvovirus B19 Rubéola Sarampión Parvovirus B19 Temperatura seleccionada En la segunda reacción de la PCR de exantemáticos se añadió 1 µl del producto de la primera amplificación a 49 µl de una nueva mezcla en la que se incluyeron los distintos componentes a las concentraciones óptimas obtenidas durante la estandarización: 4 mM de Cl2Mg, 500 µM de cada dNTP (dATP, dGTP, dCTP y dTTP), 0,2 µM de iniciadores de segunda reacción (Figura 5), 0,2 µM de los iniciadores del control interno específicos para la reacción anidada (sección 1.4), 5 µl del tampón 10x PCR II (Roche Molecular Systems Inc., NJ, USA) y 0,25 U de Taq DNA Polymerase (Amplitaq DNA polymerase, Roche Molecular Systems Inc., NJ, USA). En Resultados 83 el termociclador PTC-200 Peltier (MJ Research, Watertown, MA, EEUU) se utilizaron las temperaturas óptimas de hibridación y desnaturalización según el siguiente programa: 2 min a 94ºC, seguido de 30 ciclos de: 1 min de desnaturalización a 94ºC, 1 min de hibridación a 55ºC y 1 min de elongación a 72ºC. La elongación también se prolongó 5 min en el último ciclo. Se visualizaron los productos de la PCR mediante electroforesis en gel de agarosa al 2% con 0,5 µg de bromuro de etidio por ml en tampón Tris-borato-EDTA bajo luz ultravioleta. El tamaño esperado de las bandas era de 289 pb en el caso de RUBV, 229 pb en el de MeV y 94 pb en el de B19V. Las muestras positivas presentaban la banda específica para uno de los tres virus y la banda de 140 pb del control interno (sección 1.4). Cuando aparecía solamente la banda de control interno, las muestras se consideraban negativas. Las muestras que no mostraban banda alguna se repitieron desde la fase de extracción, y las que continuaban careciendo de bandas después de la repetición se asumió que contenían inhibidores de enzimas [135]. 1.4 Inclusión de un control interno. Como control interno de cada tubo de PCR se utilizó un sistema puesto a punto previamente en el laboratorio para la técnica de PCR múltiple de enterovirus y herpesvirus humanos, que detectaba un fragmento de 194 pb del gen de la polimerasa del virus de la pseudorrabia porcina (PRV) [134]. Se comprobó que no se producía ninguna pérdida en el rendimiento de la PCR diseñada enfrentando la mezcla que incluía el plásmido y sus iniciadores correspondientes a otra mezcla sin plásmido ni sus iniciadores en tres diluciones distintas de cada uno de los tres virus (Figura 14). Resultados 84 3.2 Caracterización de casos PCR positiva e IgM negativa. Con el fin de caracterizar mejor la respuesta inmune en los casos PCR positiva con ausencia de IgM se utilizó el ensayo de avidez de la IgG específica de MeV, cuando ésta era detectable. Para minimizar la variación interensayo, los valores de avidez de IgG fueron corregidos en cada ensayo, asignando un valor de 100% al porcentaje de reducción medio de dos determinaciones del control positivo del ensayo y refiriendo a este valor el porcentaje de reducción de cada muestra, para obtener así un índice de avidez corregido (IAC). Para ello se estudiaron los siguientes grupos de pacientes: i. Treinta y nueve pacientes con resultado de detección directa (PCR de exantemáticos y/o cultivo de MeV) e IgM positivos, ii. Sesenta y nueve pacientes con detección directa e IgM negativos, iii. Dos pacientes con detección directa negativa e IgM positiva, iv. Nueve pacientes con detección directa positiva e IgM negativa, de los 27 que mostrando este perfil eran IgG positivos; v. Un grupo control constituido por 23 mujeres sanas seropositivas para IgG de MeV, que sirvió para valorar la avidez de IgG en ausencia de infección. Se compararon los resultados de los pacientes de cada uno de los grupos con los resultados del grupo control. El valor medio de IAC obtenido en el grupo control fue de 99,5%. Se obtuvo un IAC medio de 65,2% en los casos con resultado positivo en ambas aproximaciones diagnósticas, de 73,0% para las muestras de casos con resultados positivos solo por detección directa y 83,6% para los casos negativos según ambos tipos de técnicas. En la Tabla 9 se relacionan los resultados de los 27 casos positivos referidos en el apartado iv teniendo en cuenta el resultado de IgG y su índice de avidez. Utilizando como valor de corte un 50% en el IA se pudieron establecer las posibles interpretaciones de cada uno de los casos de sarampión con IgM negativa. El caso 1 presenta PCR positiva solo en una muestra, lo cual quizá indicaría una excreción baja del virus; con un título muy alto de IgG (18.325 UI/ml) de alta avidez y tratándose de un corto tiempo de evolución (6 días) se clasificó como posible reinfección. El caso 2 al no poder medir el IA no se pudo interpretar. El paciente 3 presentaba una IgG de baja avidez, y aunque había sido vacunado recientemente el genotipo encontrado era el del brote no el vacunal, así que se interpretó como una infección primaria con resultado falso negativo de la IgM. El caso 4, con 0 días de Resultados 91 Resultados 92 evolución y un IA en el valor de corte podría ser una reinfección o una infección primaria con resultado falso negativo de la IgM. Los pacientes 5 y 8, con poco tiempo de evolución y título de IgG e IA bajos, se interpretaron como infecciones primarias con resultado falso negativo de la IgM. El caso 6 presenta una avidez mayor del 50% tan solo con 2 días de evolución y un título moderado de IgG, lo que nos lleva a suponer que podría tratarse de una reinfección, aunque no puede descartarse la infección primaria con IgM falso negativo. Los casos 7 y 9, debido a su bajo tiempo de evolución, un título de IgG moderadamente alto y un IA en el valor de corte, presentan dos posibles interpretaciones como reinfecciones o infección primaria con resultado falso negativo de la IgM. Por último, el caso 10, el único positivo solamente por cultivo, se trata probablemente de un falso negativo de la PCR y la IgM dado el bajo IA. Sin embargo, la posibilidad de un aislamiento falso positivo no se puede descartar dada la cantidad de aislamientos de MeV que se produjeron en el momento de la inoculación de esta muestra de orina. En lo que respecta a los casos con resultado IgG negativo, en 6 de ellos se daba un antecedente de vacunación reciente (1 a 13 días antes del comienzo, casos 11 y 17 al 21). De éstos, sólo el caso 18 fue confirmado como genotipo A a los 10 días del comienzo, genotipo que contiene todas las cepas vacunales. Por otra parte, las muestras recogidas más de 3 días después de la aparición del exantema (pacientes 23 al 26) se podrían clasificar como probables resultados falsos negativos de la IgM, ya que más del 88% de las muestras tomadas a los 4 días desde el comienzo dieron resultados IgM positivos, como se ve en la Figura 20. Los casos restantes fueron recogidos demasiado pronto para obtener un resultado IgM positivo. Resultados 93 Caso Edad TsíntaDosis(Tvac)bCult OrcPCR ScPCR EFcPCR OrcIgG (UI/ml)cAV (%)dGenot Interpretacióne 1 27 a 6 DESC N N P N 18325 84 B3 Reinfección 2 30 a 1 1 d (9 días) N N P N 720 S.I. B3 No interpretable 3 31 a 3 1 d (7 días) P N P P 700 25 B3 IP con FIgM 4 24 a 0 1 d (13 a) N N P P 630 50 B3 Reinfección/ IP con FIgM 5 22 a 2 DESC N N P N 290 34 B3 IP con FIgM 6 21 a 2 DESC N N P P 2700 65 B3 Reinfección/ IP con FIgM 7 22 a 3 DESC Cont P P P 3000 50 B3 Reinfección/ IP con FIgM 8 25 a 3 DESC P P P P 400 33 B3 IP con FIgM 9 34 a 4 DESC N N P N 1100 50 B3 Reinfección/ IP con FIgM 10 5 a 9 2 d (1a 8m) P N N N 1297 54 B3 F+ cultivo/ IP con FIgM 11 10 a 0 1 d (13 días) P P P P N B3 Recogida temprana 12 10 a 0 0 d N P P P N B3 Recogida temprana 13 13 a 0 1 d N P P P N B3 Recogida temprana 14 20 a 0 DESC P P P P N B3 Recogida temprana 15 5 m 1 0 d P P P P N B3 Recogida temprana 16 20 a 1 DESC P P P P N B3 Recogida temprana 17 27 a 2 1 d (10 días) N I P P N B3 Recogida temprana 18 34 a 2 1 d (10 días) N N P P N A Vacunal 19 22 a 3 1 d (1 día) Cont P P P N B3 Recogida temprana 20 26 a 3 1 d (1 día) P P P P N B3 Recogida temprana 21 11 m 3 1 d (7 días) N P P P N B3 Recogida temprana 22 27 a 3 DESC N P P P N B3 Recogida temprana 23 25 a 4 0 d P P P P N B3 FIgM 24 9 m 4 0 d N N P N N B3 FIgM 25 20 a 4 DESC P P P P N B3 FIgM 26 26 a 4 DESC Cont P P P N B3 FIgM 27 23 a DESC 1 d P P P P N B3 No interpretable a Tsínt: días desde el comienzo del exantema a la recogida de la muestra. b Número de dosis vacunales (tiempo desde la administración al comienzo del exantema). DESC: desconocido. c P: positivo; N: negativo; Cont: contaminado; I: inhibido. d Resultado de avidez de la IgG específica para MeV. S.I.: Suero insuficiente. e IP: Infección primaria. F+: falso positivo; F-: falso negativo. Tabla 9. Resultados en casos IgM negativa [94]. 4. PCR, GENOTIPIFICADO Y DETECCIÓN DE IgM EN SANGRE SECA EN PAPEL DE FILTRO Y EXUDADO FARÍNGEO EN TAMPÓN DE LISIS. 4.1 Brote de sarampión en Guinea Ecuatorial en 2001. En las 20 muestras recogidas se buscó ARN de MeV mediante la RT-PCR de exantemáticos, 14 muestras se ensayaron para IgM específica de MeV por ELISA indirecto y 15 para IgM específica de MeV por ELISA de captura de cadenas µ. El ensayo de ELISA indirecto incluyó pocillos de antígeno y de control de antígeno para cada muestra; los sueros que presentaban una diferencia de valores de absorbancia frente al patrón de referencia mayor de 0,20 se consideraron positivos, indeterminados si el valor de la diferencia se situaba entre 0,10 y 0,20 y negativos si estaba por debajo de 0,10. En el ensayo de captura el valor umbral se estableció como la “absorbancia media de tres determinaciones del control negativo multiplicada por 3”, estableciéndose un rango de indeterminación de ±20%. En la Tabla 10 se muestran los resultados obtenidos en 20 muestras de sangre seca sobre papel de filtro procedentes de Guinea Ecuatorial. Por la técnica de ELISA indirecto, 4 muestras resultaron positivas, 4 equívocas y 4 negativas, mientras que las 2 restantes presentaban un resultado no interpretable, ya que se obtuvieron altos valores de absorbancia en los pocillos de control de antígeno. Ambos resultados, positivo y equívoco, indican una infección reciente con virus MeV [145, 146], de forma que la sensibilidad del ELISA indirecto fue del 57,1%. En lo que respecta al ensayo de captura, 11 muestras fueron positivas, 2 equívocas y 2 negativas, por tanto la sensibilidad fue del 86,7%. Utilizando la PCR de exantemáticos se detectó ARN de MeV en un 40% de las muestras y ADN de B19V en una (caso 6, Tabla 10) positiva a IgM de MeV según el ensayo de captura. Sin embargo, esta muestra fue negativa cuando se ensayó con un ELISA de captura de cadenas µ específico para IgM frente a B19V. El paciente presentaba infección por Plasmodium falciparum y falleció unos días más tarde. La secuenciación del fragmento de 456 pares de bases de la región variable del gen N mostró que los casos pertenecían al genotipo B3 en las muestras 7 y 19 [147], que es uno de los genotipos encontrados en África Central y Occidental [148-151]. Resultados 94 Nº. Muestra Edad PCR MeV EIA IgM MeV IND EIA IgM MeV CAP 1 21 m Pos Equiv Pos 2 3 m Pos Pos Pos 3 DESC Neg Neg Neg 4 3 a Neg Pos Pos 5 DESC Pos Equiv Pos 6 5 a Neg RNI Equiv 7 6 a Pos NH NH 8 DESC Neg NH NH 9 8 m Neg NH NH 10 DESC Neg Equiv Equiv 11 DESC Neg NH NH 12 7.5 a Pos Neg Pos 13 14 m Neg Pos Pos 14 5 a Pos NH NH 15 4 m Neg Pos Pos 16** 1 a Neg RNI Pos 17* 7 a Pos Neg Pos 18* 7 a Neg Neg Pos 19 9 m Pos Equiv Pos 20 6 m Neg NH Neg Positivos/total (%) 8 /20 (40%) 8/14 (57,1%) 13/15 (86,7%) PCR MeV: PCR múltiple de exantemáticos. EIA MeV IND: ELISA indirecto para detección de IgM de MeV. EIA MeV CAP: ELISA de captura de cadenas µ para detección de IgM de MeV. RNI: Resultado no interpretable. DESC: desconocido. NH: No hecho. *Muestras del mismo paciente. **Paciente B19V positivo por PCR de exantemáticos. Tabla 10. Resultados de IgM y PCR sobre sangre completa secada en papel de filtro, 2001. 4.2 Brote de sarampión en Guinea Ecuatorial en 2008. En diciembre de 2008 se recibieron en el laboratorio de Aislamiento y Detección de Virus del Centro Nacional de Microbiología, desde Bata y Malabo (Guinea Ecuatorial), muestras de exudados faríngeos en tampón de lisis y sangre seca en papel Whatman de niños con sintomatología de sarampión. Los resultados de PCR sobre exudado faríngeo en tampón de lisis y sangre seca en papel Whatman, de ELISA indirecto en sangre seca en papel Whatman y del genotipo del virus se muestran en la Tabla 11. Todas las muestras de exudado faríngeo fueron positivas a MeV por PCR de exantemáticos. Y todas las muestras de sangre seca en papel de filtro fueron positivas a IgM específica de MeV excepto una, la cual se recogió tan sólo tres días después de la aparición de los síntomas. La PCR de exantemáticos en sangre seca en papel Whatman sólo detectó 3 positivos. El estudio del genotipo dio como resultado B3. Resultados 95 Nº Muestra Edad Tiempo evolución fiebre PCR MeV ExFar PCR MeV Papel Whatman EIA IgM MeV Ind Papel Whatman Genotipo MeV ExFar M1 3 a 7 Pos Neg Pos M2 2 a 7 Pos Neg Pos B3 M3 3 a 6 Pos Neg Pos B3 M4 2 a 5 Pos Neg Pos B3 M5 3 a 4 Pos Neg Pos M6 3 a 9 Pos Neg Pos B3 M7 2 a 15 Pos Neg Pos B3 M8 8 m 5 Pos Pos Pos B3 M9 22 m 6 Pos Neg Pos M10 8 m 3 Pos Pos Neg B3 M11 2 a 6 Pos Neg Pos B3 M12 6 a 6 Pos Neg Pos M13 3 a 6 Pos Neg Pos B3 M14 15 m 5 Pos Neg Pos B3 M15 15 m 7 Pos Neg Pos M16 11 m 5 Pos Pos Pos M17 7 m 4 Pos Neg Pos M18 3 a 3 Pos Neg Pos M19 4 m 15 Pos Neg Pos B1 18 m 4 Pos Neg Pos B3 B2 7 m 6 Pos Neg Pos B3 B3 6 m 15 Pos Neg Pos B3 B4 7 a 6 Pos Neg Pos B3 Positivos/Total (%) 23/23 (100%) 3/23 (13%) 22/23 (95,6%) PCR MeV: PCR múltiple de exantemáticos. EIA MeV IND: ELISA indirecto para detección de IgM de MeV. EIA MeV CAP: ELISA de captura de cadenas µ para detección de IgM de MeV. ExFar: exudado faríngeo. Tabla 11. Resultados de IgM y PCR sobre sangre completa secada en papel de filtro, 2008. 5. ESTUDIO DE EXANTEMA VÍRICO INFANTIL EN EL CONTEXTO DE UNA ALTA COBERTURA DE VACUNACIÓN CON TRIPLE VÍRICA. De los 88 pacientes que presentaron exantema se detectaron 62 (70,5%) con evidencias de infección por algún virus de acuerdo a los criterios manejados, según la distribución que sigue: 26 infecciones por HHV-6 (34,7%), 20 por EV (26,7%), 15 por HHV-4 (20,0%), 7 por AdV (9,3%), 3 por B19V (4,0%), 2 por MeV (2,7%), 1 por HHV-5 (1,3%) y 1 por RUBV (1,3%), lo que significa 75 infecciones por algún virus en los 62 pacientes en el momento de la extracción de las muestras, ya que 13 infecciones fueron dobles (17,3%). El gráfico A de la Figura 21 muestra el total de pacientes positivos, el gráfico B incluye los niños de 0 a 14 meses, el C ilustra los Resultados 96 pacientes de 15 meses a 3 años (3 años no incluidos) y el D presenta los niños de 3 a 12 años (3 años incluidos). En los cuatro gráficos se indica el número de pacientes negativos. El porcentaje de infecciones según la edad se muestra en la Figura 22. Figura 21. Número de infecciones por edad incluyendo infecciones dobles y la única triple. 1 AdV 44 EV 11 HHV4 1 HHV5 1 HHV6 B19V RUBV MeV 61291018202 AdVEVHHV4HHV5 HHV6 B19V RUBV MeV TOTAL N = 88 Neg = 26 (29,5%) 1 AdV 2 EV 1 HHV4 1 HHV5 HHV6 B19V RUBV MeV 23207000 AdVEVHHV4HHV5 HHV6 B19V RUBV MeV 0-14 MESES N=29 Neg = 10 (34,5%) AdV 31 EV HHV4 HHV5 1 HHV 6 B19V RUBV MeV 35509101* AdVEVHHV4HHV5HHV6B19VRUBVMeV 15 m – 3 AÑOS N=36 Neg=7 (19,4%) AdV 11 EV 1 HHV4 HHV5 HHV6 B19V RUBV MeV 14202101* AdVEVHHV4HHV5HHV6B19VRUBVMeV 3 – 12 AÑOS N=23 Neg = 9 (39,1%) AB CD 1 AdV 44 EV 11 HHV4 1 HHV5 1 HHV6 B19V RUBV MeV 61291018202 AdVEVHHV4HHV5 HHV6 B19V RUBV MeV TOTAL N = 88 Neg = 26 (29,5%) 1 AdV 44 EV 11 HHV4 1 HHV5 1 HHV6 B19V RUBV MeV 61291018202 AdVEVHHV4HHV5 HHV6 B19V RUBV MeV TOTAL N = 88 Neg = 26 (29,5%) 1 AdV 2 EV 1 HHV4 1 HHV5 HHV6 B19V RUBV MeV 23207000 AdVEVHHV4HHV5 HHV6 B19V RUBV MeV 0-14 MESES N=29 Neg = 10 (34,5%) 1 AdV 2 EV 1 HHV4 1 HHV5 HHV6 B19V RUBV MeV 23207000 AdVEVHHV4HHV5 HHV6 B19V RUBV MeV 0-14 MESES N=29 Neg = 10 (34,5%) AdV 31 EV HHV4 HHV5 1 HHV 6 B19V RUBV MeV 35509101* AdVEVHHV4HHV5HHV6B19VRUBVMeV 15 m – 3 AÑOS N=36 Neg=7 (19,4%) AdV 31 EV HHV4 HHV5 1 HHV 6 B19V RUBV MeV 35509101* AdVEVHHV4HHV5HHV6B19VRUBVMeV 15 m – 3 AÑOS N=36 Neg=7 (19,4%) AdV 11 EV 1 HHV4 HHV5 HHV6 B19V RUBV MeV 14202101* AdVEVHHV4HHV5HHV6B19VRUBVMeV 3 – 12 AÑOS N=23 Neg = 9 (39,1%) AdV 11 EV 1 HHV4 HHV5 HHV6 B19V RUBV MeV 14202101* AdVEVHHV4HHV5HHV6B19VRUBVMeV 3 – 12 AÑOS N=23 Neg = 9 (39,1%) AB CD *Casos de sarampión vacunal. Figura 22. Porcentaje de infecciones por edad. 0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% 100% Total Múltiples HHV6 HHV5 HHV4 EV AdV <15m 15m-< 3a 3a-12a Resultados 97 Resultados 98 ipificado que se trataba del genotipo A que contiene la cepa vacunal usada en España, mientras que en el caso detectado de RUBV aparece como una do vacunado 34 días antes del comienzo la IgM detectada represente IgM bida a la vacunación, siendo el HHV-6 el causante del exantema. ciosas, Departamento de Medicina, Jonhs Hopkins University, Baltimore, MD, EEUU) en base a las secuencias completas de MeV encontradas en GenBank, el fragmento recomendado por la OMS no corresponde a los más variables del genoma viral, situados en los genes M y F, aunque sí que presenta una variabilidad similar e incluso algo superior a la del gen de la hemaglutinina, que es el segundo fragmento recomendado por la OMS para genotipificación. En lo que se refiere al aislamiento de virus, se realizó en 20 muestras de exudado faríngeo correspondientes a 20 pacientes basándose en los resultados de las técnicas de PCR. Cinco presentaban PCR positiva a AdV, 12 pacientes eran positivos a EV, 2 eran positivos a EV y HHV-4 y, por último, otro era positivo a HHV-6 por la misma técnica. De las 20 inoculaciones 11 resultaron positivas a EV y 3 a AdV, todas ellas coincidentes con los resultados de PCR. En los dos casos en los que se detectó sarampión por PCR se trataba de un niño y una niña, ambos de 15 meses, con antecedente de vacunación 6 y 8 días antes de la aparición de los síntomas respectivamente. En el caso de la niña se pudo comprobar por genot caso del niño no fue posible genotipificarlo. El único infección doble junto con HHV-6, el paciente tenía 16 meses de edad y había si del exantema, con lo cual es de suponer que residual de 6. DESARROLLO DE UNA PCR PARA GENOTIPIFICADO DEL VIRUS DEL SARAMPIÓN 6.1 Diseño de los iniciadores o “primers”. El diseño de los iniciadores se llevó a cabo de forma que permitieran la detección del fragmento hipervariable de 450 nucleótidos del extremo COOH del gen N, que presenta una variabilidad del 12% entre cepas salvajes del virus, siguiendo las recomendaciones de la OMS [21]. Como puede observarse en el gráfico de similaridad (Figura 23), creado con el programa SimPlot v3.5.1 (Stuart C. Ray, División de Enfermedades Infec Resultados 99 Figura 23. Gráfico de similaridad entre secuencias completas del genoma de los genotipos D3, D6 y H1 respecto a la secuencia K01711 de genotipo A. Los límites de los genes se refieren a la secuencia DQ227321. NPMFH L 56 16851748 34023438 44454875 72477271 91249212 15894 Límites de los genes Fragmentos recomendados por la OMS para la genotipificación Genes NPMFH L 56 16851748 34023438 44454875 72477271 91249212 15894 Límites de los genes Fragmentos recomendados por la OMS para la genotipificación GenesGenes Para el diseño de los iniciadores de la PCR de genotipificado de Mev se obtuvieron secuencias del genoma completo del virus del sarampión y del virus del moquillo del perro (CDV) en la base de datos GenBank, las cuales fueron alineadas mediante la aplicación MegAlign del paquete informático DNASTAR (Lasergene, DNASTAR, Inc., Madison, WI, EEUU). Sobre estos alineamientos se diseñaron los iniciadores siguiendo criterios similares a los descritos en la sección 1.1 para la PCR múltiple de exantemáticos. El tamaño del fragmento conseguido fue de 700 pb. En este caso los iniciadores se diseñaron para ser capaces, no solo de amplificar diversas cepas del virus del sarampión, sino incluso también de CDV, un virus diferente del mismo género, lo cual convierte en poco probable la existencia de cepas de MeV de secuencia desconocida con desapareamientos en el extremo 3´o posiciones adyacentes que pudiesen evitar la amplificación. Los iniciadores de primera reacción de PCR de genotipificado de MeV se denominaron GSAR1F (“sense”), situado entre los nucleótidos 1067 y 1088 y GSAR1R (“antisense”), emplazado en 1862-1844; mientras que los de la segunda reacción anidada o “nested” se denominaron GSAR2F (“sense”), ubicado en 1127-1148; GSAR2R (“antisense”), constituido por las posiciones entre los nucleótidos 1827 y 1808 (Figura 24). Las posiciones de los iniciadores se refieren a la cepa Edmonston cuyo número de acceso en la base de datos GenBank es K01711 (X16565). Estos iniciadores fueron sintetizados por SigmaGenosys Ltd. (Cambridgeshire, UK). Figura 24. Iniciadores de MeV para PCR de genotipificado. GSAR1F 5´T T C A R A A C A A R T T Y A G T G C A G G3´ SecA×20 . . . . G . . . . . G . . T . . . . . . . . SecB×4* . . . . A . . . . . A . . C . . . . . . . . SecC×1* . . . . G . . . . . A . . C . . . . . . . . GSAR1R 5´G R G C C C G G A K G C A T T C C A G3´ Alineam. 3´C T G G A A T G C M T C C G G G C Y C5´ SecA×18 . . . . . . . . . A . . . . . . . T. . SecB×5* . . . . . . . . . C . . A A A . . C . SecC×2 . . . . . . . . . A . . . . . . . C . GSAR2F 5´G A G T G G A A C T T G A A A A C T C C A T3´ SecA×20 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . SecB×5* . T . . T . . . . . . . . . . . . . . . . . Resultados 100 Figura 34. Cromatograma de una secuencia de MeV obtenida con ABI PRISM 3700. Inicio de secuencia Inicio de secuencia Fin de secuencia Fin de secuencia Resultados 107 6.6 Análisis de la secuencia. Utilizando la secuencia consenso obtenida a partir de ambas cadenas de ADNc se realizaron los alineamientos múltiples que se indican más abajo con la metodología ya descrita en la sección 4.6 de Material y Métodos. Seguidamente se realizó el análisis de las distancias genéticas entre secuencias y se llevó a cabo el análisis filogenético de la homología encontrada por el método Neighbor-Joining (Kimura 2 parámetros), usando 1000 replicaciones de “bootstrap” para obtener árboles filogenéticos gracias a los cuales se asignó el genotipo a nuestras secuencias problema. Primero se analizaron las secuencias obtenidas desde enero de 2001 a diciembre de 2008 junto con las de referencia de la OMS [23], para determinar a que genotipo pertenecían (Figura 36). En segundo lugar, se genotipificó cada secuencia encontrada en la base de datos GenBank sin asignación a genotipo, siguiendo el mismo método (no mostrado) y, finalmente, se hicieron árboles individuales de cada genotipo con las secuencias españolas del periodo enero del año 2001 a diciembre del 2008, las correspondientes de las bases de datos que fueron clasificadas como pertenecientes al mismo genotipo y las secuencias de referencia (Figura 39 a laFigura 49). 7. GENOTIPOS DE MeV ENCONTRADOS EN ESPAÑA, 2001-2008 Durante el período de tiempo del estudio, se han detectado once genotipos diferentes en forma de casos esporádicos o de brotes, sin que exista en ningún momento un único genotipo predominante (Tabla 12, Figura 35). Se puede observar que el genotipo D7 detectado entre los años 2001 al 2003 interrumpió su circulación, de la misma forma que ocurrió con el genotipo C2 que se detectó durante los años 2002 al 2004, y no volvieron a producir casos en España posteriormente. Por otro lado, se advierte la aparición de genotipos como B3 y D4 que se han ido detectando de forma intermitente a lo largo de los últimos años y que también se detectaron en nuestro entorno, Europa o África, en la misma época. Sin embargo, el genotipo D6, que causó grandes brotes en Europa del Este en 2006, fue importado con frecuencia en ese mismo año, para no volver a detectarse con posterioridad. Según la Resultados 108 Resultados 109 información disponible la mayoría de los brotes, y algunos casos esporádicos de los que se conoce el origen, han sido importados desde países de África, Asia o Europa. Es de destacar la aparición de brotes de más de 50 casos como el de Madrid del año 2006 causado por el genotipo B3 y el de Barcelona en 2006-2007 por genotipo D4 cuyo origen se encontró en países europeos, Reino Unido e Italia respectivamente, donde también produjeron brotes con un número considerable de casos [152-154]. Por otra parte genotipos como D3, H1 o D5 se han encontrado en casos esporádicos o como brotes de menos de 10 casos. Resultados 110 *GEC: Guinea Ecuatorial. Desc: origen desconocido. CHI: China. RUM: Rumania. UCR: Ucrania. ALE: Alemania. MAR: Marruecos. ARG: Argelia. Alm: Almería. TAI: Tailandia. GBR: Gran Bretaña. ETI: Etiopía. ITA: Italia. Mad: Madrid. Bcn: Barcelona. Cad: Cádiz. Tabla 12. Genotipos de MeV encontrados en España en el período 2001-2008. La procedencia del caso índice se indica entre paréntesis. Los casos esporádicos se presentan en color azul y los brotes en color rojo. CCAA 2001 2002 2003 2004 2005 2006 2007 2008 Madrid B3(GEC) C2(Desc) C2(MAR) D7(Desc) C2(Desc) D4(GBR) B3(GBR) B3(ETI,MAR) D6(UCR) A D4(Cad) B3(Desc) D5(Desc) I. Baleares D7(Desc) A H1(CHI) D4(Desc) C. Valenciana D7(RUM) D4(UCR) D8(Desc) D7(Desc) C2(Desc) B3(Mad) D6(UCR) D4(Desc) A Extremadura A H1(CHI) Andalucía B3(ARG) A C2(MAR) D7(Desc) A D8(Desc) B3(Desc) D4(Desc) D9(Desc) A I. Canarias D7(ALE) C2(Desc) H1(Desc) B3(GBR) D6(ALE) Cataluña C2(Desc) D3(Desc) C2(Desc) D5(TAI, Desc) D4(RUM) D4(ITA) D4(RUM) D4 (ITA) Cantabria C2(Desc) B3(Mad) Murcia B3(Alm) Castilla-La Mancha C2(MAR) La Rioja D6(Desc) Castilla y León D4(Bcn) Ceuta D4(Desc) Figura 35. Genotipos detectados en España en el periodo 2001-2008 por Comunidad Autónoma. Cada color corresponde a un año diferente y los genotipos que produjeron brotes están subrayados y en cursiva. Código de colores: 2001, 2002, 2003, 2004, 2005, 2006, 2007, 2008, Brotes . C2 La Figura 36 muestra los genotipos encontrados en España comparándolos con las cepas de referencia establecidas por la OMS, en color rojo (Tabla 1). Se puede observar que según el criterio de asignación de genotipo establecido los casos de D5 y D9 no se sostienen con una frecuencia de aparición del clado en las réplicas del árbol (bootstrap) de 90 o mayor. Para resolver la asignación de genotipo en estos casos, recurrimos al criterio de homología de secuencia nucleotídica entre las secuencias encontradas en nuestro país y las diferentes secuencias de referencia (Figura 37 yFigura 38). En todos los casos, la secuencia de referencia más parecida a la problema en términos de homología se correspondió a la más próxima en el árbol. Figura 36. Filograma de secuencias encontradas en España en el periodo enero 2001-diciembre 2008 y secuencias de referencia de cada genotipo. El nombre de la secuencia incluye el número de acceso a la base de datos GenBank, el número de muestra, el año y la localidad. Por ejemplo, el caso GQ228457_1585F03Almería tiene número de acceso a GenBank GQ228457, número de muestra 1585F y se produjo en el año 2003 en Almería. Las secuencias españolas están coloreadas en negro y las de referencia en rojo. En la figura solo se muestran los valores de “bootstrap” mayores de 49. B3 A D7 C2 H1 B3 D6 D7 A H1 D4 B3 C2 C2 D7 D4 B3 D6 A A D4 D7 H1 D7 D8 C2 D6 D4 B3 D7 C2 C2 B3 D6 D8 B3 D3 D5 C2 D4 D4 D4 D4 A D4 D4 B3 C2 B3 A C2 D7 C2 H1 B3 D6 D7 A H1 D4 B3 C2 C2 D7 D4 B3 D6 A A D4 D7 H1 D7 D8 C2 D6 D4 B3 D7 C2 C2 B3 D6 D3 D5 C2 D4 D4 D8 B3 D4 A D4 D4 D4 B3 C2 Resultados 111 GQ228457_1585F03Almeria GQ228454_398F03Almeria GQ228456_1385F03Tabernas Almeria AY551556_1704F03Murcia AY551553_969F03Granada GQ228455_829F03Almeria AY551544_245F03Almeria AY551538Bata.EQG/01/1 B3 AY 551536Madrid.SPA/ 16.01 B3 B3NIE97 AY160945Kinshasa.COD/00/33R B3.1 AY274614Kimbanseke.DRC/37.02/4 B3.1 EU086725_529F06Granada GQ228460_768F06Madrid EU086733_964F06LasPalmasGranCanaria EU086728_386F06Madrid EU086728_386F06Madrid 486F06Valencia 651F06Cantabria GQ228459_760F06Collado Villalba Madrid 4288F06MadridEtiopia M4 Malabo08 4718F08S.SebastiánReyes B1 Bata08 M7 Malabo08 M10 Malabo08 M10 Papel Filtro Malabo08 M8 Malabo08 4664F08Alcorcon 4983F08AlcorconMadrid M16 Papel Filtro Malabo08 M14 Malabo08 M2 Malabo08 4981F08AlcorconMadrid M6 Malabo08 M3 Malabo08 4972F08AlcorconMadrid B3US A94 AY160887Dande.BFA/17.01/12 B3.2 B1CAE 83 B2GAB84 AEdmUSA54 1720F06Madrid 2104F 06M adr i d 2178F 06M adr i d AY522906_850F03Almeria EU086727_1870F06Madrid FJ911606_1542F08Cadiz 2608F 06M adr i d AY522904_1219F03Almeria FJ911608_1346F07Soria AY522905-1728F02Badajoz 2954F 06M adr i d 1469F04Almeria FJ911607_1343F07Soria AY522903_1357F01IbizaIBaleares 3166F08Alicante AY521178_558F03Almeria 2096F d06M ad r i Fspa94 Edeu71 C1JPN84 X848 8166Madrid.ESP/ C2USA77 C2DEU90 X84871Madrid.ESP/93/2 AY551535_1847F03Madrid 384F92Soria 380F92Soria AY551533_1884F03Granada AY551534_1673F02Valencia EU627192_2920F04Barcelona 1884F04Valencia 18 46F04St aCruzTene rife 10 17F04A lco r conMadrid 17 24F04C ant abr ia 1843F04IcodTenerife EU627190_2544F03Almeria G2NET97 G3INO02 G1USA83 H2C HN94 H1C HN93 H1bCHN937 AF045212 H1cCHN947 AF045216 H1aCHN932 AF045205 1156F 01I bizaIB al eares EU627186_1172F04Badajoz EU086724 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EU086729_1924F06Valencia EU086732_1184F06Barcelona FJ938030_248F07Barcelona G2NET97 G3INO02 G1USA83 H2C HN94 H1C HN93 H1bCHN937 AF045212 H1cCHN947 AF045216 H1aCHN932 AF045205 1156F 01I bizaIB al eares EU627186_1172F04Badajoz EU086724 _3390F05LaP almaS taCr uzTenerife D2SOA88 D10UGA00 EU086735_70F06LogronoLaRioja D6 2005 EU117227Mvs/Vladimir.RUS/40.05 EU086730_1438F06Valencia EU086726_1567F06Madrid D6 2000 EU117222 Mvs/Moscow.RUS/4.05 E 8F06StaCruzTenerifeU086734_254 D6NJUSA94 X84863Madrid.ESP/94/1 D1UNK74 EU627191_2919F04Barcelona03 D3Chicago1-89 AY303623_1355F01IbizaIBaleares AY 307105_57F03Valencia AY307103_263F02Valencia AY303616_1185F02TenerifeStaCruzTenerife AY303622_344F02Valencia AY307104_1082F03Cordoba AY303615_292F02Valencia D7USA99 D7AUS85 D8UNK94 AY521170_1892F03Alicante EU0854722225F05Granada FJ911609_2762F08Madrid EU627193_2927F04Barcelona EU627194_2930F04Barcelona D5THA93 D5Palau93 D9AUS99 FJ911610_3782F08Granada FJ911611_1552F08Cadiz FJ911612_2957F08Cadiz GQ228452_3633F08Cadiz GQ228451_1258F08Cadiz GQ228453_4454F08Malaga EU982301_603F08Cadiz FJ9 1775 0_12 78F08C eut a FJ917755_5520F08Mahon Menorca FJ917751_954F08Cadiz FJ917754_1636F08Malaga FJ9 1775 2_14 13F08C adiz FJ9 1775 3_377 5F08H uelv a D4 Gr4 AM849082 MVs/Ravensburg.DEU/06.06 D4 Gr4 EF017348.1| MVs/Grosseto.ITA/38.0 D4CAN89 D4 Gr3 EF079133 MVs/London.GBR/7.06/3 EU085473_3828F05Madrid D4 Gr2 EF079130 MVs/London.GBR/37.05 AY521175_472F02Valencia EU086723_2560F05Tarragona D4 Gr1 AM849091 Mvs/Bucharest.ROU/48.04/ EU627189_2426F04PalmaMallorcaIBaleares EU086729_1924F06Valencia EU086732_1184F06Barcelona FJ938030_248F07Barcelona FJ938033_308F07BarcelonaCepa EU086731_3717F06Barcelona FJ938030_248F07Barcelona FJ938034_1766F07Tarragona FJ938032_1135F07Soria FJ938031_1606F07Lerida FJ938035_326F07Barcelona GQ228458_260F07Barcelona 98 53 87 100 95 54 86 99 95 10 0 64 63 79 62 60 70 99 54 53 63 70 70 56 94 94 67 69 55 82 70 100 100 84 75 95 58 96 87 93 89 93 97 97 72 52 51 71 72 86 59 91 77 70 65 64 64 99 99 51 90 84 89 86 52 93 94 60 95 68 51 56 98 63 56 0.01 D4 D9 D5 D8 D7 D6 D3 H1 C2 A B3 Resultados 112 Resultados 113 El porcentaje de divergencia entre las secuencias D5 encontradas en nuestro país y la secuencia de referencia de ese genotipo designada por la OMS (Tabla 1) no supera el 2,5% (Figura 37, de 0,9 a 2,2%) designado por la Organización como necesario para la definición de un nuevo genotipo en base a la parte hipervariable del gen de la nucleoproteína [22] corroborando la asignación de las secuencias EU627193_2927F04 Barcelona, EU627194_2930F04 Barcelona y FJ911609_2762F08 Madrid a dicho genotipo. En lo que se refiere a la secuencia FJ911610_3782F08 Granada de genotipo D9, en la Figura 38 se aprecia que el porcentaje de divergencia con la secuencia de referencia es de 3,2%, lo cual superaría lo establecido por la OMS para definir un nuevo genotipo si no tuviéramos en cuenta que tanto el genotipo D9 como el G3 fueron aceptados como tales porque han permitido definir la características genéticas de virus salvaje en áreas con sarampión endémico y han ayudado a describir brotes. Así, ambos se establecieron como nuevos genotipos por su utilidad epidemiológica [23]. Figura 37. Distancias por pares de Clustal W (Equilibrado) entre los genotipos de referencia de MeV y las secuencias españolas de genotipo D5. A B1 B 2 B3 N B3U C1 C2U C2 D D1 D 2 D 3 D 4 D5B D5T D 6 D7A D7U D 8 D9 D10 E F G1 G2 G3 H1 H 2 EU627194 EU627193 FJ911609 A*** 96.3 96.7 95.8 96.5 97.1 95.0 93.9 96.1 97.4 95.4 95.0 95.4 96.5 94.7 95.0 92.8 95.2 94.5 94.1 96.7 96.1 94.5 94.5 95.0 93.9 92.8 96.1 95.8 95.8 A B1 3.9 *** 95.6 96.9 98.0 95.6 93.9 92.8 95.0 95.0 93.9 93.0 93.6 94.5 93.2 93.4 91.7 93.2 93.0 92.1 95.2 94.5 93.4 93.4 94.3 92.3 91.4 94.1 93.9 93.9 B1 B 2 3.4 4.6 *** 95.6 95.8 95.2 93.4 91.9 94.1 95.4 93.4 93.0 93.6 94.5 93.6 93.0 91.2 92.8 92.5 92.5 95.2 94.1 92.5 93.0 93.0 92.3 90.8 94.1 93.9 93.9 B 2 B3 N 4.3 3.2 4.6 *** 98.0 95.4 93.4 92.8 94.1 94.5 93.4 92.5 93.2 94.1 92.8 93.4 91.2 93.0 92.5 92.3 94.7 94.3 92.5 92.5 93.0 91.9 91.0 93.6 93.4 93.4 B3 N B3U 3.6 2.0 4.3 2.0 *** 95.8 94.1 93.4 94.7 95.2 94.1 93.2 93.9 94.7 93.0 94.1 91.9 93.4 93.2 92.3 95.4 94.7 93.2 93.2 93.6 92.1 91.2 94.3 94.1 94.1 B3U C1 2.9 4.6 5.0 4.8 4.3 *** 96.1 95.0 95.4 95.8 94.3 94.7 94.7 95.8 94.1 94.3 92.1 94.1 93.9 94.3 96.9 95.8 93.9 94.5 95.0 93.2 92.3 95.4 95.2 95.2 C1 C2U 5.3 6.5 7.0 7.0 6.2 4.1 *** 98.0 93.2 94.1 93.0 92.5 93.0 94.1 91.9 93.4 91.2 92.3 92.1 91.2 94.3 93.6 91.9 92.3 92.8 90.8 89.9 93.6 93.4 93.4 C2U C2 D 6.5 7.7 8.7 7.7 7.0 5.3 2.0 *** 92.3 93.2 92.5 91.7 92.1 93.2 91.0 92.1 90.8 91.4 91.2 90.4 93.2 92.5 90.8 91.2 91.7 89.7 88.8 92.8 92.5 92.5 C2 D D1 4.1 5.3 6.2 6.2 5.5 4.8 7.2 8.2 *** 96.9 95.8 95.4 96.1 96.5 95.6 95.8 93.9 95.2 95.0 94.5 95.0 94.7 93.9 93.4 93.9 93.0 92.1 96.1 95.8 95.8 D1 D 2 2.7 5.3 4.8 5.8 5.1 4.3 6.2 7.2 3.2 *** 96.7 96.3 96.7 97.4 95.6 96.3 94.1 96.3 95.8 95.8 95.4 94.7 93.6 93.6 94.1 93.6 93.2 96.9 96.7 96.7 D 2 D 3 4.8 6.5 7.0 7.0 6.3 6.0 7.5 8.0 4.3 3.4 *** 96.1 96.9 97.6 94.5 96.5 94.3 95.8 96.1 93.4 93.9 93.6 92.5 92.1 92.5 92.3 91.2 97.1 96.9 96.9 D 3 D 4 5.3 7.5 7.5 8.0 7.3 5.5 8.0 9.0 4.8 3.9 4.1 *** 96.5 97.1 94.1 96.1 93.9 95.8 96.1 93.9 93.9 93.6 92.1 92.1 92.5 92.3 91.7 96.7 96.5 96.5 D 4 D5B 4.8 6.7 6.7 7.2 6.5 5.5 7.4 8.4 4.1 3.4 3.2 3.6 *** 98.5 95.0 96.5 94.7 96.3 96.9 93.9 94.5 93.6 93.0 92.5 93.0 92.5 91.9 98.0 97.8 97.8 D5B D5 T 3.6 5.8 5.8 6.3 5.5 4.3 6.2 7.2 3.6 2.7 2.5 2.9 1.6 *** 95.8 97.1 95.0 96.9 97.1 94.5 95.4 94.7 94.1 93.6 94.1 93.2 92.3 99.1 98.9 98.9 D5 T D 6 5.5 7.2 6.7 7.8 7.5 6.2 8.7 9.7 4.5 4.6 5.8 6.3 5.3 4.3 *** 94.1 92.3 94.3 94.1 93.2 94.3 93.2 91.9 92.8 92.8 91.4 90.6 95.2 95.0 95.0 D 6 D7A 5.3 7.0 7.5 7.0 6.3 6.0 7.0 8.4 4.3 3.9 3.6 4.1 3.6 2.9 6.2 *** 96.1 96.3 95.6 93.4 93.9 93.6 92.5 92.1 93.0 93.2 91.4 96.7 96.5 96.5 D7A D7U 7.8 9.1 9.6 9.6 8.8 8.5 9.5 10.0 6.5 6.3 6.0 6.5 5.5 5.3 8.3 4.1 *** 94.5 93.4 91.2 91.9 91.4 91.0 90.4 91.2 90.4 89.5 94.5 94.3 94.7 D7U D 8 5.0 7.2 7.7 7.5 7.0 6.2 8.2 9.2 5.0 3.9 4.3 4.3 3.8 3.2 6.0 3.8 5.8 *** 95.8 93.6 93.6 93.0 91.9 92.3 93.2 93.2 91.4 96.5 96.3 96.7 D 8 D9 5.8 7.5 8.0 8.0 7.3 6.5 8.5 9.5 5.3 4.3 4.1 4.1 3.2 2.9 6.2 4.6 7.0 4.3 *** 93.0 93.4 93.6 92.5 92.1 92.5 92.1 91.4 96.7 96.5 96.5 D9 D10 6.2 8.5 8.0 8.3 8.3 6.0 9.5 10.5 5.7 4.3 7.0 6.5 6.5 5.8 7.2 7.0 9.6 6.7 7.5 *** 93.4 92.8 91.2 91.7 92.1 91.4 91.2 94.1 93.9 93.9 D10 E 3.4 5.0 5.0 5.5 4.8 3.1 6.0 7.2 5.2 4.8 6.5 6.5 5.7 4.8 6.0 6.5 8.8 6.7 7.0 7.0 *** 95.0 93.9 93.4 93.9 92.8 92.1 95.4 95.2 95.2 E F 4.1 5.8 6.2 6.0 5.5 4.3 6.7 7.9 5.5 5.5 6.8 6.7 6.7 5.5 7.2 6.7 9.3 7.5 6.7 7.7 5.3 *** 93.2 92.8 93.2 91.9 91.0 94.7 94.5 94.5 F G1 5.8 7.0 8.0 8.0 7.3 6.5 8.7 10.0 6.5 6.8 8.0 8.5 7.5 6.2 8.8 8.0 9.8 8.8 8.0 9.5 6.5 7.2 *** 94.5 95.0 93.0 92.5 94.1 93.9 93.9 G1 G 2 5.8 7.0 7.5 8.0 7.3 5.7 8.2 9.5 7.0 6.7 8.5 8.5 8.0 6.7 7.7 8.5 10.6 8.2 8.5 9.0 7.0 7.7 5.8 *** 97.4 93.6 92.3 93.2 93.0 93.0 G2 G 3 5.3 6.1 7.5 7.5 6.8 5.3 7.7 9.0 6.5 6.3 8.0 8.0 7.5 6.3 7.7 7.5 9.6 7.2 8.0 8.5 6.5 7.3 5.3 2.7 *** 93.6 92.3 93.6 93.4 93.4 G3 H1 6.5 8.3 8.2 8.8 8.5 7.2 10.0 11.3 7.4 6.7 8.2 8.2 7.9 7.2 9.2 7.2 10.6 7.2 8.5 9.2 7.7 8.7 7.5 6.7 6.7 *** 94.5 92.8 92.5 92.5 H1 H 2 7.7 9.3 10.0 9.8 9.6 8.2 11.1 12.4 8.5 7.2 9.5 9.0 8.7 8.2 10.3 9.2 11.7 9.2 9.2 9.5 8.5 9.8 8.0 8.2 8.3 5.8 *** 92.3 92.1 92.1 H 2 EU62719 4 4.1 6.3 6.3 6.8 6.0 4.8 6.7 7.7 4.1 3.2 2.93.42.00.95.13.4 5.8 3.6 3.46.34.85.56.37.26.87.78.2*** 99.8 99.8 EU62719 4 EU62719 3 4.3 6.5 6.5 7.0 6.3 5.0 7.0 7.9 4.3 3.4 3.23.62.21.15.33.6 6.0 3.9 3.66.55.05.86.57.57.08.08.50.2 *** 99.6 EU62719 3 FJ911609 4.3 6.5 6.5 7.0 6.3 5.0 7.0 8.0 4.3 3.4 3.2 3.6 2.2 1.1 5.3 3.6 5.5 3.4 3.6 6.5 5.0 5.8 6.5 7.5 7.0 8.0 8.5 0.2 0.4 *** FJ911609 A B1 B 2 B3 N B3U C1 C2U C2 D D1 D 2 D 3 D 4 D5B D5T D 6 D7A D7U D 8 D9 D10 E F G1 G2 G3 H1 H 2 EU627194 EU627193 FJ911609 PORCENTAJE DE DIVERGENCIA PORCENTAJE DE SIMILITUD B3N: B3NIE97, B3U:B3USA94, C2U: C2USA77, C2D: C2DEU90, D5B:D5BLA93, D5T: D5THA93; D7A: D7AUS85, D7U: D7USA99. Resultados 114 Resultados 115 3782F08Gra A B1 B 2 B3 N B3U C1 C2U C2 D D1 D 2 D3 D4 D5B D5 T D 6 D7A D7U D 8 D9 D1 0 E F G1 G 2 G3 H1 H 2 3782F08Gra *** 93.9 93.0 92.1 92.5 93.2 93.0 91.4 90.6 94.5 95.0 95.6 95.2 95.6 96.3 93.6 95.2 93.6 95.4 96.9 92.1 92.5 92.8 91.7 91.0 91.4 90.8 89.9 3782F08Gra A Figura 38. Distancias por pares de Clustal W (Equilibrado) entre los genotipos de referencia de MeV y la secuencia española de genotipo D9. 6.5 *** 96.3 96.7 95.8 96.5 97.1 95.0 93.9 96.1 97.4 95.4 95.0 95.4 96.5 94.7 95.0 92.8 95.2 94.5 94.1 96.7 96.1 94.5 94.5 95.0 93.9 92.8 A B1 7.5 3.9 *** 95.6 96.9 98.0 95.6 93.9 92.8 95.0 95.0 93.9 93.0 93.6 94.5 93.2 93.4 91.7 93.2 93.0 92.1 95.2 94.5 93.4 93.4 94.3 92.3 91.4 B1 B 2 8.5 3.4 4.6 *** 95.6 95.8 95.2 93.4 91.9 94.1 95.4 93.4 93.0 93.6 94.5 93.6 93.0 91.2 92.8 92.5 92.5 95.2 94.1 92.5 93.0 93.0 92.3 90.8 B 2 B3N 8.0 4.3 3.2 4.6 *** 98.0 95.4 93.4 92.8 94.1 94.5 93.4 92.5 93.2 94.1 92.8 93.4 91.2 93.0 92.5 92.3 94.7 94.3 92.5 92.5 93.0 91.9 91.0 B3 N B3U 7.2 3.6 2.0 4.3 2.0 *** 95.8 94.1 93.4 94.7 95.2 94.1 93.2 93.9 94.7 93.0 94.1 91.9 93.4 93.2 92.3 95.4 94.7 93.2 93.2 93.6 92.1 91.2 B3U C1 7.5 2.9 4.6 5.0 4.8 4.3 *** 96.1 95.0 95.4 95.8 94.3 94.7 94.7 95.8 94.1 94.3 92.1 94.1 93.9 94.3 96.9 95.8 93.9 94.5 95.0 93.2 92.3 C1 C2U 9.2 5.3 6.5 7.0 7.0 6.2 4.1 *** 98.0 93.2 94.1 93.0 92.5 93.0 94.1 91.9 93.4 91.2 92.3 92.1 91.2 94.3 93.6 91.9 92.3 92.8 90.8 89.9 C2U C2D 10.2 6.5 7.7 8.7 7.7 7.0 5.3 2.0 *** 92.3 93.2 92.5 91.7 92.1 93.2 91.0 92.1 90.8 91.4 91.2 90.4 93.2 92.5 90.8 91.2 91.7 89.7 88.8 C2 D D1 5.7 4.1 5.3 6.2 6.2 5.5 4.8 7.2 8.2 *** 96.9 95.8 95.4 96.1 96.5 95.6 95.8 93.9 95.2 95.0 94.5 95.0 94.7 93.9 93.4 93.9 93.0 92.1 D1 D 2 5.3 2.7 5.3 4.8 5.8 5.1 4.3 6.2 7.2 3.2 *** 96.7 96.3 96.7 97.4 95.6 96.3 94.1 96.3 95.8 95.8 95.4 94.7 93.6 93.6 94.1 93.6 93.2 D 2 D3 4.6 4.8 6.5 7.0 7.0 6.3 6.0 7.5 8.0 4.3 3.4 *** 96.1 96.9 97.6 94.5 96.5 94.3 95.8 96.1 93.4 93.9 93.6 92.5 92.1 92.5 92.3 91.2 D3 D4 5.0 5.3 7.5 7.5 8.0 7.3 5.5 8.0 9.0 4.8 3.9 4.1 *** 96.5 97.1 94.1 96.1 93.9 95.8 96.1 93.9 93.9 93.6 92.1 92.1 92.5 92.3 91.7 D4 D5B 4.5 4.8 6.7 6.7 7.2 6.5 5.5 7.4 8.4 4.1 3.4 3.2 3.6 *** 98.5 95.0 96.5 94.7 96.3 96.9 93.9 94.5 93.6 93.0 92.5 93.0 92.5 91.9 D5B D5 T 3.8 3.6 5.8 5.8 6.3 5.5 4.3 6.2 7.2 3.6 2.7 2.5 2.9 1.6 *** 95.8 97.1 95.0 96.9 97.1 94.5 95.4 94.7 94.1 93.6 94.1 93.2 92.3 D5 T D 6 6.7 5.5 7.2 6.7 7.8 7.5 6.2 8.7 9.7 4.5 4.6 5.8 6.3 5.3 4.3 *** 94.1 92.3 94.3 94.1 93.2 94.3 93.2 91.9 92.8 92.8 91.4 90.6 D 6 D7A 5.0 5.3 7.0 7.5 7.0 6.3 6.0 7.0 8.4 4.3 3.9 3.6 4.1 3.6 2.9 6.2 *** 96.1 96.3 95.6 93.4 93.9 93.6 92.5 92.1 93.0 93.2 91.4 D7A D7U 6.7 7.8 9.1 9.6 9.6 8.8 8.5 9.5 10.0 6.5 6.3 6.0 6.5 5.5 5.3 8.3 4.1 *** 94.5 93.4 91.2 91.9 91.4 91.0 90.4 91.2 90.4 89.5 D7U D 8 4.8 5.0 7.2 7.7 7.5 7.0 6.2 8.2 9.2 5.0 3.9 4.3 4.3 3.8 3.2 6.0 3.8 5.8 *** 95.8 93.6 93.6 93.0 91.9 92.3 93.2 93.2 91.4 D 8 D9 3.2 5.8 7.5 8.0 8.0 7.3 6.5 8.5 9.5 5.3 4.3 4.1 4.1 3.2 2.9 6.2 4.6 7.0 4.3 *** 93.0 93.4 93.6 92.5 92.1 92.5 92.1 91.4 D9 D10 8.5 6.2 8.5 8.0 8.3 8.3 6.0 9.5 10.5 5.7 4.3 7.0 6.5 6.5 5.8 7.2 7.0 9.6 6.7 7.5 *** 93.4 92.8 91.2 91.7 92.1 91.4 91.2 D1 0 E 8.0 3.4 5.0 5.0 5.5 4.8 3.1 6.0 7.2 5.2 4.8 6.5 6.5 5.7 4.8 6.0 6.5 8.8 6.7 7.0 7.0 *** 95.0 93.9 93.4 93.9 92.8 92.1 E F 7.7 4.1 5.8 6.2 6.0 5.5 4.3 6.7 7.9 5.5 5.5 6.8 6.7 6.7 5.5 7.2 6.7 9.3 7.5 6.7 7.7 5.3 *** 93.2 92.8 93.2 91.9 91.0 F G1 9.0 5.8 7.0 8.0 8.0 7.3 6.5 8.7 10.0 6.5 6.8 8.0 8.5 7.5 6.2 8.8 8.0 9.8 8.8 8.0 9.5 6.5 7.2 *** 94.5 95.0 93.0 92.5 G1 G 2 9.8 5.8 7.0 7.5 8.0 7.3 5.7 8.2 9.5 7.0 6.7 8.5 8.5 8.0 6.7 7.7 8.5 10.6 8.2 8.5 9.0 7.0 7.7 5.8 *** 97.4 93.6 92.3 G 2 G3 9.3 5.3 6.1 7.5 7.5 6.8 5.3 7.7 9.0 6.5 6.3 8.0 8.0 7.5 6.3 7.7 7.5 9.6 7.2 8.0 8.5 6.5 7.3 5.3 2.7 *** 93.6 92.3 G3 H1 10.0 6.5 8.3 8.2 8.8 8.5 7.2 10.0 11.3 7.4 6.7 8.2 8.2 7.9 7.2 9.2 7.2 10.6 7.2 8.5 9.2 7.7 8.7 7.5 6.7 6.7 *** 94.5 H1 H 2 11.1 7.7 9.3 10.0 9.8 9.6 8.2 11.1 12.4 8.5 7.2 9.5 9.0 8.7 8.2 10.3 9.2 11.7 9.2 9.2 9.5 8.5 9.8 8.0 8.2 8.3 5.8 *** H 2 3782F08Gra A B1 B 2 B3 N B3U C1 C2U C2 D D1 D 2 D3 D4 D5B D5 T D 6 D7A D7U D 8 D9 D1 0 E F G1 G 2 G3 H1 H 2 PORCENTAJE DE DIVERGENCIA PORCENTAJ DE SIMILITUDE B3N: B3NIE97, B3U:B3USA94, C2U: C2USA77, C2D: C2DEU90, D5B:D5BLA93, D5T: D5THA93; D7A: D7AUS85, D7U: D7USA99. 8. ANÁLISIS DE SECUENCIAS DE GENOTIPO A Figura 39. Filograma de secuencias pertenecientes al genotipo A. Las secuencias españolas están coloreadas en azul e incluyen el número de acceso a GenBank, el número de la cepa, año y procedencia; la vacuna utilizada en España se muestra en color verde, las obtenidas de bases de datos en negro y la de referencia de genotipo A en rojo. Las de GenBank utilizadas incluyen el número de acceso seguido del lugar de origen, la semana epidemiológica de aparición de síntomas, el año y, en su caso, el número de secuencia de esa semana. En la figura solo se muestran los “bootstrap” mayores de 49. FJ911607Soria.SPA/13.07/1 H043760443UNK04 U03668 vaccine strain Schwarz U01999Moraten DQ267520Lyon.FRA/20.04/2 U03656Edmonston B H051660661UNK05 FJ211589 strain Schwarz FJ911606Cadiz.SPA/14.08/1 FJ211583 attenuated Edmonston Enders GQ374249Almeria.ESP/22.04 AY522904Almeria.SPA/11.03/2 2096F06Madrid H041500315UNK04 EU139110NewYork.USA/43.06 GQ374248Madrid.ESP/24.06 AY522905Badajoz.SPA/34.02 DQ390255NorthCarolina.USA/20.05 GQ374245Alicante.ESP/25.08 Vacuna Merck ESP AY522906Almeria.SPA/9.03/1 2608F06Madrid EU332918strain Rouvax-schwarz 2003-05FRA05 2178F06Madrid GQ374247Madrid.ESP/20.06 H050680611UNK05 EU139104Massachusetts.USA/24.04 FJ211590 strain Schwarz 2954F06Madrid AY522903Ibiza.SPA/29.01/1 U03664Shanghai-191 AF266291 strain Edmonston (Schwarz vaccine) FJ911608Soria.SPA/13.07/2 H051840651UNK05 EU650201Ontario.CAN/11.08 EU086727Madrid.SPA/22.06/1 AY521178Almeria.SPA/8.03/2 D01001MEANEDstrain:Edmonston P9 D01006MOR/USA85 D01006MEANMORstrain:MOR D01011MEANHU strain HU2 DQ779218MVs.Tetouane.MOR/31.04/2 U01996Halonen H040640548UNK04 AEdmUSA54 U03661Leningrad-16 AY486084 Edmonston-Zagreb working seed AY873981PUNE.IND/26.96 H042120493UNK04 AB046218AIK-C/JAP X13480HalleFRA DQ779205Fes.MOR/13.04 AY873976PUNE.IND/13.97-3 AY730614strainLeningrad-4 DQ779209Kenitra.MOR/15.04/3 U03658Zagreb AY486083 Edmonston-Zagreb master seed DQ839356Edmonston U03653Changchun-47 AF045218China93-5 H040640542UNK04 U01991Philadelphia-26 U03650CAM-70 DQ390225cepaShanghai-191 H2CHN94 88 50 62 0.01 FJ911607Soria.SPA/13.07/1 H043760443UNK04 U03668 vaccine strain Schwarz U01999Moraten DQ267520Lyon.FRA/20.04/2 U03656Edmonston B H051660661UNK05 FJ211589 strain Schwarz FJ911606Cadiz.SPA/14.08/1 FJ211583 attenuated Edmonston Enders GQ374249Almeria.ESP/22.04 AY522904Almeria.SPA/11.03/2 2096F06Madrid H041500315UNK04 EU139110NewYork.USA/43.06 GQ374248Madrid.ESP/24.06 AY522905Badajoz.SPA/34.02 DQ390255NorthCarolina.USA/20.05 GQ374245Alicante.ESP/25.08 Vacuna Merck ESP AY522906Almeria.SPA/9.03/1 2608F06Madrid EU332918strain Rouvax-schwarz 2003-05FRA05 2178F06Madrid GQ374247Madrid.ESP/20.06 H050680611UNK05 EU139104Massachusetts.USA/24.04 FJ211590 strain Schwarz 2954F06Madrid AY522903Ibiza.SPA/29.01/1 U03664Shanghai-191 AF266291 strain Edmonston (Schwarz vaccine) FJ911608Soria.SPA/13.07/2 H051840651UNK05 EU650201Ontario.CAN/11.08 EU086727Madrid.SPA/22.06/1 AY521178Almeria.SPA/8.03/2 D01001MEANEDstrain:Edmonston P9 D01006MOR/USA85 D01006MEANMORstrain:MOR D01011MEANHU strain HU2 DQ779218MVs.Tetouane.MOR/31.04/2 U01996Halonen H040640548UNK04 AEdmUSA54 U03661Leningrad-16 AY486084 Edmonston-Zagreb working seed AY873981PUNE.IND/26.96 H042120493UNK04 AB046218AIK-C/JAP X13480HalleFRA DQ779205Fes.MOR/13.04 AY873976PUNE.IND/13.97-3 AY730614strainLeningrad-4 DQ779209Kenitra.MOR/15.04/3 U03658Zagreb AY486083 Edmonston-Zagreb master seed DQ839356Edmonston U03653Changchun-47 AF045218China93-5 H040640542UNK04 U01991Philadelphia-26 U03650CAM-70 DQ390225cepaShanghai-191 H2CHN94 88 50 62 0.01 Resultados 116 3 6 4 2 8 4 10 0 18 0 24 2 26 3 28 0 28 1 35 8 35 9 36 0 365 36 7 41 4 42 3 42 8 EU086728Madrid.SPA/05.06/ 1 C C TA T G C C C G C CTAATT EU086733LasPalmas.SPA/11.06/ 1 ................. GQ374255Alicante.ESP/4.0 6 ................. GQ374256Cantabria.ESP/7.0 6 ................. 2006761072Venezuela/8.0 6 ................. 2007745075Venezuela/47.0 6 ................. FJ437669Kin g ston Upon Thames.GBR/19.06/ 3 ................. EU139107Florida.USA/31.0 6 ................. DQ888755NewYorkCity.USA/16.0 6 ................. EF079127London.GBR/19.05 ..............G.. H034160213UNK0 3 ..............G.. AM849056Ibadan.NGA/05.04 ..............G.. AM849054La g os.NGA/08.04 .....A........G.. FJ222727London.GBR/16.0 8 A....A........G.. EF079141Kin g ston upon Thames.GBR/20.06/3 ...............C C FJ222728London.GBR/18.08/ 3 ...C.A........G.. AM849088Lucerne.SWI/21.06 ... . . . . Y Y ........ AM849053Shkodra.ALB/44.06 .T...AT.......G.. AM849087Aarau.SWI/07.06 .........TGNNT... EF079129London.GBR/31.05 A. C ..AT.......G.. EF468495Barletta.ITA/San0 6 .T. . C AT.......G.. EF533886Roma.ITA/43.06/ 2 .T. . C AT.......G.. Secuencias y cambios nucleotídicos Posiciones nucleotídicas Tabla 17. Comparación de las sustituciones nucleotídicas entre secuencias de los brotes de Madrid, Las Palmas y casos esporádicos de Valencia y Santander; y secuencias próximas detectadas en otros países. El número de nucleótido está referido al fragmento del extremo 3´ del gen N, de 456 nucleótidos. Asimismo, un caso esporádico ocurrido en Málaga en 2006 (EU086725 Malaga.SPA/07.06/1) resultó tener la misma secuencia de 456 nt que un caso detectado en Malmoe (Suecia) (AM849065 Malmo.SWE/10.06) ocurrido con una diferencia de 3 semanas [43] (Tabla 18). Este caso correspondía a un brote que afectó a ambas orillas del estrecho de Oresund entre Malmoe y Copenhague, ciudades que están unidas por un puente y varios ferries al día. Las secuencias detectadas en Malmoe y Copenhague eran iguales. Estas secuencias quedan incluidas en el filograma en un grupo en el que están otras de países del África subsahariana, sugiriendo un posible origen importado de esta área, aunque los valores de “bootstrap” no permiten sustentar esta posible relación. 3 3 15 9 16 8 24 6 26 6 27 9 28 6 28 9 30 0 EU086725Mala g a.SPA/07.06/1_B 3 TCGCGCGGC AM849065Malmo.SWE/10.06 ......... AM849055Ibadan.NGA/01.04 .......A. DQ388898Ban g ui.CAR/28.00/3_B3. 1 CTTT.A. DQ390241Niamey.NIG/26.03_3_B3. 2 ..A. .TAAT EU139093Geor g ia.USA/25.02B 3 .T . . TT . A . Posición nucleotídica Sec s y n cos uencia cambios ucleotídi países. El número de nucleótido está referido al fragmento del extremo 3´ del gen N, de 456 Tabla 18. Comparación de las sustituciones nucleotídicas entre una secuencia esporádica de Málaga, un caso del brote ocurrido en Malmoe (Suecia) y secuencias próximas detectadas en otros nucleótidos. Resultados 123 En el año 2008 los genotipos B3 detectados en un brote de 19 casos en la localidad de Alcorcón (4664F08 Alcorcón Madrid) y en un niño de Guinea Ecuatorial residente en San Sebastián de los Reyes (Madrid) no relacionado con el brote (4718F08 San Sebastián de los Reyes Madrid), presentan una gran similitud con las secuencias encias del brote (representadas por 4664F08 Alcorcón adrid) como la del caso esporádico de Madrid (4718F08 San Sebastián de los Reyes Madrid) son idénticas a uno de los tipos de secuencia encontrado en el brote de Guinea Ecuatorial, sugiriendo dos episodios diferentes de importación desde un mismo origen geográfico. obtenidas de muestras de exudado faríngeo de niños recogidas en Bata y Malabo (Guinea Ecuatorial) (B1 Bata 08 y M2 Malabo 08) en el mismo período de tiempo (máxima diferencia: dos nucleótidos, Tabla 19) sugiriendo que el caso índice del brote podría ser de origen guineano o de algún país de su entorno. En el brote ocurrido en Alcorcón no se observa variación en las secuencias, mientras que en el brote de Guinea Ecuatorial se observa una mayor variación, con cinco tipos diferentes de secuencias (Tabla 19 yTabla 20). Esto reflejaría mayor tiempo de evolución del genotipo B3 en Guinea Ecuatorial, cuyo brote fue ya detectado en el mes de abril, mientras que el de Alcorcón (Madrid) solo se mantuvo activo 3 semanas. Tanto las secu M 3 0 13 6 17 1 22 1 23 1 25 8 35 4 37 0 39 2 40 5 41 4 4664F08Alcorcon_Madrid A T GA T T T T CCA 4972F08Alcorcon_Madrid ........... 4981F08Alcorcon_Madrid ........... 4983F08Alcorcon_Madrid ........... M14 Malabo0 8 ........... M16 Papel filtro Malabo0 8 ........... M2 Malabo0 8 ........... M3 Malabo0 8 ........... M6 Malabo0 8 ........... M7 Malabo0 8 .......C... 4718F08SSebastián Reyes_Madrid ..A. . . .C. . . M4 Malabo0 8 ..A. . . .C. . . B1 Bata 0 8 ..A. . . .C. . M10 Malabo0 . 8 .......C T .. M10 Papel filtro Malabo0 8 .......C T .. M8 Malabo0 8 .....C.C... EF031461Karimama.BEN/8.0 5 CC A G C G Posición nucleotídica Secuencias y cambios nucleotídicos . C C . A Tabla 19. Sustituciones nucleotídicas entre secuencias del br Ecuatorial, 2008. El número de nucleótido está referido al fragmento del extremo 3´ del gen N, de 456 nucleót os. ote de Alcorcón y de Guinea id Resultados 124 Cambios nucleotídicos (aminoác 56 nt del idos)* en 4 gen N Nº Sec Secuencia Sem/año 4 id 664F08 Alcorcón Madr 9 4664F08 Alcorcón Madrid 40 y 47-48/2008 3 4718F08 S.Sebastián Reyes Madrid 36 y 48/2008 G-a-A 1293, T-a-C 1492 1 M7 Malabo08 47/2008 T-a-C 1492 1 M8 Malabo08 48/2008 T-a-C 1380, T-a-C 1492 1 M10 Malabo08 48/2008 T-a-C 1492, C-a-T 1514 (S505L) *Los cambios están referidos al gen completo de la nucleoproteína siguiendo la secuencia U01987 Edmonston tipo salvaje Tabla 20. Cambios nucleotídicos y aminoacídicos producidos durante el brote de Alcorcón y el de Guinea Ecuatorial 2008. Por último destacar que todas las secuencias B3 encontradas en España pertenecerían al subgrupo B3.1 definido por la Dra. Waku Kouomou en su artículo del año 2002, puesto que se agrupan con la secuencia B3NIE97 de referencia que representa a dicho subgrupo. El subgrupo B3.1 se supone predominante en el África subsahariana [43, 149]. Resultados 125 10. ANÁLISIS DE SECUENCIAS DE GENOTIPO C2 Figura 41. Filograma de secuencias pertenecientes al genotipo C2. Las secuencias de referencia están coloreadas en rojo, las secuencias españolas obtenidas en este estudio en azul, una secuencia española del año 93 se muestra en verde y las obtenidas de la base de datos GenBank en negro. Las de GenBank utilizadas incluyen el número de acceso seguido del lugar de origen, la semana epidemiológica de aparición de síntomas, el año y, en su caso, el número de secuencia de esa semana. En la figura solo se muestran los valores de “bootstrap” mayores de 49. Según la información bibliográfica disponible, el genotipo C2 era el prevalente en España entre los años 1992 y 1993, hasta que fue reemplazado por D3, renombrado AJ244031ReulLUX96 AJ244033ReulerLUX96 DQ779213Taroudant.MOR/19.04/4 AF458655KalaaMAR99 DQ267527Casablanca.MOR/19.03/1 AY551533Granada.SPA/17.03 AF458652ChefchaouneMAR99 AF519493Rotterdam.NET/34.98 DQ267526Kalaa.MOR/13.03 DQ267531Temara.MOR/24.03/1 H043260493UNK04 EU627192Barcelona.SPA/42.03 03-00212DEU03 02-02019DEU00 AY551534Madrid.SPA/34.02 AF474931Kempten.DEU/23.00 AF474933Tuebingen.DEU/24.00 AF410996Calgary.CAN/23.97 DQ267529Taroudant.MOR/19.03/3 1724F04LiencresCantabria 1846F04StaCruzTenerife 1843F04IcodTenerife 1884F04Valencia 1017F04AlcorconMadrid EU627190Almeria.SPA/28.03 380F92Soria DQ779210Taroudant.MOR/19.04/1 AF458650OuarzazateMAR98 AF458656OujdaMAR99 AY037013CALUSA97 H043340148UNK04 AY037011INDUSA98 AF410997Montreal.CAN/30.97 AJ244037LuxLUX97 AF458651OuarzazateMAR98 L46748HOL91 AY551535Madrid.SPA/17.03 AJ244029WalferdangeLUX96 L46740ILUSA94 X84871Madrid.ESP/93/2 L46760TNUSA94 C2DEU90 AF410988Montreal.CAN/14.84 AF243461Victoria.AUS/90 AF243462Victoria.AUS/91 AF243463Victoria.AUS/91 A ictoria.AUS/91F243464V C2USA77 D01002cepaJM H2CHN94 92 52 81 60 83 67 65 63 65 62 0.01 AJ244031ReulLUX96 AJ244033ReulerLUX96 DQ779213Taroudant.MOR/19.04/4 AF458655KalaaMAR99 DQ267527Casablanca.MOR/19.03/1 AY551533Granada.SPA/17.03 AF458652ChefchaouneMAR99 AF519493Rotterdam.NET/34.98 DQ267526Kalaa.MOR/13.03 DQ267531Temara.MOR/24.03/1 H043260493UNK04 EU627192Barcelona.SPA/42.03 03-00212DEU03 02-02019DEU00 AY551534Madrid.SPA/34.02 AF474931Kempten.DEU/23.00 AF474933Tuebingen.DEU/24.00 AF410996Calgary.CAN/23.97 DQ267529Taroudant.MOR/19.03/3 1724F04LiencresCantabria 1846F04StaCruzTenerife 1843F04IcodTenerife 1884F04Valencia 1017F04AlcorconMadrid EU627190Almeria.SPA/28.03 380F92Soria DQ779210Taroudant.MOR/19.04/1 AF458650OuarzazateMAR98 AF458656OujdaMAR99 AY037013CALUSA97 H043340148UNK04 AY037011INDUSA98 AF410997Montreal.CAN/30.97 AJ244037LuxLUX97 AF458651OuarzazateMAR98 L46748HOL91 AY551535Madrid.SPA/17.03 AJ244029WalferdangeLUX96 L46740ILUSA94 X84871Madrid.ESP/93/2 L467 A9460TNUS C2DEU90 AF410988Montreal.CAN/14.84 AF243461Victoria.AUS/90 AF243462Victoria.AUS/91 AF243463Victoria.AUS/91 A ictoria.AUS/91F243464V C2USA77 D01002cepaJM H2CHN94 92 52 81 60 83 67 65 63 65 62 0.01 Resultados 126 D6 en 1998 [21], el cual circuló en España desde otoño de 1994 a 1997 (X84871 Madrid.ESP/93/2) [163, 164]. Las muestras de colección disponibles en el ISCIII de las que hemos podido obtener productos de amplificación para genotipificar corresponden a un brote de Soria del año 1992 (380F92 Soria) que pertenecía al genotipo C2, el cual, no obstante, no se asemeja a la secuencia del 93 (X84871 Madrid.ESP/93/2). Probablemente, el hecho de que en ese momento el MeV fuera endémico permitía que circularan diversas variantes del mismo genotipo. Posteriormente, se han observado casos esporádicos entre los años 2002 al 2004. Alguno de ellos se ha podido relacionar con viajes a Marruecos (o contacto con personas procedentes de ese país); aunque en la mayoría de casos no se ha podido establecer el origen de la cepa. Por otro lado, el genotipo detectado en Marruecos desde 1998 hasta 2003 era C2 y se consideraba endémico [156, 165]. Sin embargo, los genotipos publicados en Marruecos desde el año 2004 no corresponden al genotipo C2, sino a B3 (DQ779217Tetouane.MOR/31.04/1 por ejemplo, Figura 40) [159], aunque en la base de datos GenBank sí que hay secuencias marroquíes de genotipo C2 del año 2004 iguales a las de 2003 (Tabla 21). En la Tabla 21 se puede apreciar que la mayoría de las secuencias españolas del año 2004, una del 2003 y otra del 2002, presentan una identidad del 100% en la región variable del gen N, a pesar de ser casos esporádicos de distintas provincias. Esto podría explicarse si se tratara de importaciones desde el mismo lugar de origen, sin embargo no disponemos de esta información en todas las secuencias C2 encontradas en España. Teniendo en cuenta que se sabe por los datos epidemiológicos que la secuencia del año 2003 procede de Marruecos, podría inferirse un mismo origen geográfico para las otras dos. Por otra parte, estas secuencias no presentan diferencias nucleotídicas con otras detectadas en Marruecos en los años 2003 y 2004; como por ejemplo DQ267529 Taroudant.MOR/19.03/3, DQ779210 Taroudant.MOR/19.04/1, DQ779213 Taroudant.MOR/19.04/4, DQ267526 Kalaa.MOR/13.03, DQ267531 Temara.MOR/24.03/1. Sin embargo, son también idénticas a las cepas MVs/Calgary.CAN/23.97 y MVs/California.USA/22.97, que tienen antecedentes epidemiológicos relacionados con virus que circularon en Alemania; a la secuencia holandesa de 1991 L46748HOL91 y a la secuencia de Londres MVs/London.GBR/29.04 que circuló en el año 2004. Resultados 127 9 27 7 2 9 9 10 0 11 4 12 3 13 6 15 8 17 9 195 20 0 22 2 25 6 26 4 267 27 6 29 4 31 3 34 8 35 1 40 5 40 6 41 4 42 5 447 45 3 A Y551534Madrid.SPA/34.0 2 C A A T A CCCGGG A A A G A TTTG A CTGGCC GQ374253Cantabria.ESP/25.0 4 ........................... GQ374254Sta CruzTenerife.ESP/16.0 4 ........................... GQ374251Sta CruzTenerife /18.0.ESP 4 ......................... 74250Alicante.ESP/26.0 .. GQ3 4 ......................... EU627192Barcelona.SPA/42.0 .. 3 ........................... A F410996Cal g ary.CAN/23.97 EX GE R ........................... A Y037013CALUSA97 EX GE R ........................... DQ267526Kalaa.MOR/13.0 3 .. ......... DQ267529Taroudant.MOR/19.03/ ................ 3 ........................... DQ267531Temara.MOR/24.03/ 1 ........................... DQ779210Taroudant.MOR/19.04/ 1 ........................... DQ779213Taroudant.MOR/19.04/ 4 ........................... H043340148 MVs/London.GBR/29.0 4 ........................... L46748HOL9 1 ........................... A Y551533Granada.ESP/17.0 3 .....................T..... 380F92Sori a .G......................... H043260493 MVs/London.GBR/31.0 4 ....................... A ... 03-00212DEU0 3 C.......................... A F458651OuarzazateMAR9 8 ........................T.. A F458652ChefchaouneMAR9 9 ........................T.. A F474931Kempten.DEU/23.0 0 .............G............. A F519493Rotterdam.NET/34.9 8 ...........G............... A J244031ReulLUX9 6 ...............G........... DQ267527Casablanca.MOR/19.03/ 1 ..................C........ GQ374252Madrid.ESP/16.0 4 T............. A ............ A Y551535Madrid.SPA/17.0 3 ...C........G.............. A F458655KalaaMAR9 9 ......T.................T.. A F458656Ou j daMAR9 9 .......... A .............T.. A F458650OuarzazateMAR9 8 .......... A .............T.. 02-02019DEU0 0 C.C........................ A F410997Montreal.CAN/30.97 .....T..............G...... A F474933Tuebin g en.DEU/24.0 0 .............G........C.... A J244033ReulerLUX9 6 .......T.......G........... EU627190Almeria.SPA/28.0 3 .........T......C.. A ....... A Y037011INDUSA9 8 .. . . . T . . A ...........G...... X84871Madrid.ESP/93/ 2 T................C.......T. A J244037LuxLUX97 ....CT..............G..... A Posiciones nucleotídicas Secuencias y cambios nucleotídicos Tabla 21. Sustituciones nucleotídicas entre secuencias C2 detectadas en España y otras secuencias próximas detectadas en otros países. El número de nucleótido está referido al fragmento del extremo 3´ del gen N, de 456 nucleótidos. Resultados 128 11. ANÁLISIS DE SECUENCIAS DE GENOTIPO D3 Figura 42. Filograma de secuencias pertenecientes al genotipo D3. Las secuencias españolas están coloreadas en azul, la de referencia en rojo y las obtenidas de la base de datos GenBank en negro. Las de GenBank utilizadas incluyen el número de acceso seguido del lugar de origen, la semana epidemiológica de aparición de síntomas, el año y, en su caso, el número de secuencia de esa semana. En la figura solo se muestran los valores de “bootstrap” mayores de 49. AY160183Vancouver.CAN/45.01 AY737417Taichung.TWN/10.02 AY037046California.USA/49.00 EU139096Alabama.USA/45.02 DQ390226California.USA/20.04 H040740246UNK04 EU139076Maryland.USA/5.01 H040680413UNK04 EU627191Barcelona.SPA/4.05 AY738084Hwalian.TWN/18.03 H034080103UNK03 DQ398054PNG/24.02 DQ398056Queensland.AU/9.03 DQ398055PNG/48.01 AB088172Osaka C.JPN/30.98 AB088171Osaka C.JPN/16.98/2 AF481488Vic.AU/9.01 AB095421Tokyo.JPN/37.99 Y AF481489WA.AU/12.99 AB104875Okinawa.JPN/21.01 AB088183Osaka C.JPN/22.00 DQ839355Chicago U01988cepaJK(MIBE) EU139098Illinois.USA/46.02 DQ390227Illinois.USA/01.03 U01995cepaSanDiego D3Chicago1-89 El único caso de genotipo D3, que ocurrió en Barcelona en el año 2003, era un caso esporádico y no se encontró relación alguna con ningún otro caso de sarampión. En el árbol filogenético de la Figura 42 se puede observar que la secuencia del virus se asemeja a una de Taiwan y otra del Reino Unido del mismo año con un valor de “bootstraping” de 90. La diferencia entre ellas se encuentra en una sola sustitución nucleotídica, timina por citosina en la posición 453 del fragmento secuenciado, que no da lugar a cambio de aminoácido. Sin embargo, al no conocer los antecedentes epidemiológicos no es posible confirmar que uno u otro puedan ser el origen geográfico del caso. U97350cepaDavis87 AJ250068Taipeh.TWN/.94 AB075209Goroka.PNG/43.99/2 AB075212Goroka.PNG/43.99/5 AB075214Goroka.PNG/39.97SSPE AB075202Goroka.PNG/26.99 AB075206Goroka.PNG/42.99/4 AB075211Goroka.PNG/43.99/4 H2CHN94 87 65 55 73 97 67 51 99 65 89 85 72 90 94 69 58 66 54 0.01 AY160183Vancouver.CAN/45.01 AY737417Taichung.TWN/10.02 AY037046California.USA/49.00 EU139096Alabama.USA/45.02 DQ390226California.USA/20.04 H040740246UNK04 EU139076Maryland.USA/5.01 H040680413UNK04 EU627191Barcelona.SPA/4.05 AY738084Hwalian.TWN/18.03 H034080103UNK03 DQ398054PNG/24.02 DQ398056Queensland.AU/9.03 DQ398055PNG/48.01 AB088172Osaka C.JPN/30.98 AB088171Osaka C.JPN/16.98/2 AF481488Vic.AU/9.01 AB095421Tokyo.JPN/37.99 Y AF481489WA.AU/12.99 AB104875Okinawa.JPN/21.01 AB088183Osaka C.JPN/22.00 DQ839355Chicago U01988cepaJK(MIBE) EU139098Illinois.USA/46.02 DQ390227Illinois.USA/01.03 U01995cepaSanDiego D3Chicago1-89 U97350cepaDavis87 AJ250068Taipeh.TWN/.94 AB075209Goroka.PNG/43.99/2 AB075212Goroka.PNG/43.99/5 AB075214Goroka.PNG/39.97SSPE AB075202Goroka.PNG/26.99 AB075206Goroka.PNG/42.99/4 AB075211Goroka.PNG/43.99/4 H2CHN94 87 65 55 73 97 67 51 99 65 89 85 72 90 94 69 58 66 54 0.01 Resultados 129 12. ANÁLISIS DE SECUENCIAS DE GENOTIPO D4 Figura 43. Filograma de secuencias pertenecientes al genotipo D4. Las secuencias españolas están coloreadas en azul, la de referencia en rojo y las obtenidas de la base de datos GenBank en negro. Las de GenBank utilizadas incluyen el número de acceso seguido del lugar de origen, la semana epidemiológica de aparición de síntomas, el año y, en su caso, el número de secuencia de esa semana. En la figura solo se muestran los valores de “bootstrap” mayores de 49. GQ228458Barcelona.ESP/50.06/2 FJ938035Barcelona.SPA/2.07/1 FJ938032Soria.SPA/11.07/1 1 EU086731Barcelona.SPA/41.06/1 2 EU139111Washington.USA/49.06 FJ938030Barcelona.SPA/50.06 EF533887Roma.ITA/41.06/1 EF179547Slough.GBR/35.06 DQ355989Indiana.USA/23.05 EF607929Dublin.IRL/13.06 EF079140Stoke on Trent.GBR/19.06 EF428178Lyon.FRA/24.06/2 AM849094Meran.ITA/33.06 EU086729Valencia.SPA/22.06/2 3 AM849092Bucharest.ROU/47.05/1 AM849061Sarajevo.BIH/11.07/1 EF428176Lyon.FRA/21.06 AM849060Novi Sad.SRB/05.07 EU086732Barcelona.SPA/07.06/2 4 AM849058Guimaraes.POR/29.05/1 AM849083Berlin.DEU/16.05 AM849093Bucharest.ROU/48.04/2 05-00061GER05 AM849091Bucharest.ROU/48.04/1 EU627188Mallorca.SPA/36.04 5 DQ903068Frankfurt.DEU/03.05 AM849090Aarau.SWI/15.05 EU086723Tarragona.SPA/27.05/1 6 EF607930Dublin.IRL/19.04 H043680387Southampton.GBR/36.04 EF079122Carlisle.GBR/4.05 H050660846Carlisle.GBR/5.05 EF079139Stoke on Trent.GBR/20.06 EF079144Birmingham.GBR/17.06/2 H042060491Oxford.GBR/19.04/ H032980256Blackburn.GBR/29.03/4 EF179548Wakefield.GBR/44.06 H032980261Blackburn.GBR/29.03/2 EF079143London.GBR/18.06 EF079121Bradford.GBR/53.04 H05400603UK05 EF079126Blackburn.GBR/18.05 H05190735UK05 EF079146Birmingham.GBR/18.06/2 EU234486Sistan.IRA/30.07 EU234470Sistan.IRA/31.07/3 EU234484Sistan.IRA/31.07/2 02-00252GER01 EU598682Attiki.GRE/75.06 AM849052Elbasan.ALB/25.06/1 AM850906Athens.GRC/25.06 EU234465Golestan.IRA/48.05 EU234485Tehran.IRA/25.06 EF079133London.GBR/7.06/3 EF079138Glasgow.GBR/16.06 EF079142Manchester.GBR/19.06 EF607928Dublin.IRL/24.06/1 EF079147Manchester.GBR/1.06 EU650203Ontario.CAN/15.08 FJ222730Dundee.GBR/13.08/ H032140125Blackburn.GBR/19.03 AY971354Tushino.RUS/19.00 AY521175CAValenciana.SPA/10.02 AY920711Moscow.RUS/23.01 AY920715Moscow.RUS/15.03 AY920716Astrakhan.RUS/12.03 AY920718Moscow.RUS/19.99 H041460381Newcastle upon Tyne.GBR/13.04 EU139077Massachusetts.USA/6.01 H031600042Manchester.GBR/14.03 H040640540Portsmouth.GBR/4.04 02-11916Slough.GBR/6.02 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73 82 77 71 53 58 56 86 56 67 70 98 90 59 78 72 79 51 63 69 59 58 73 50 60 67 93 0.01 GQ228458Barcelona.ESP/50.06/2 FJ938035Barcelona.SPA/2.07/1 FJ938032Soria.SPA/11.07/1 1 EU086731Barcelona.SPA/41.06/1 2 EU139111Washington.USA/49.06 FJ938030Barcelona.SPA/50.06 GQ228458Barcelona.ESP/50.06/2 FJ938035Barcelona.SPA/2.07/1 FJ938032Soria.SPA/11.07/1 1 EU086731Barcelona.SPA/41.06/1 2 EU139111Washington.USA/49.06 FJ938030Barcelona.SPA/50.06 AM849094Meran.ITA/33.06 EU086729Valencia.SPA/22.06/2 3 AM849092Bucharest.ROU/47.05/1 AM849061Sarajevo.BIH/11.07/1 EF428176Lyon.FRA/21.06 AM849060Novi Sad.SRB/05.07 EU086732Barcelona.SPA/07.06/2 4 AM849094Meran.ITA/33.06 EU086729Valencia.SPA/22.06/2 3 AM849092Bucharest.ROU/47.05/1 AM849061Sarajevo.BIH/11.07/1 EF428176Lyon.FRA/21.06 AM849060Novi Sad.SRB/05.07 EU086732Barcelona.SPA/07.06/2 4 AM849058Guimaraes.POR/29.05/1 AM849083Berlin.DEU/16.05 AM849093Bucharest.ROU/48.04/2 05-00061GER05 AM849091Bucharest.ROU/48.04/1 EU627188Mallorca.SPA/36.04 5 DQ903068Frankfurt.DEU/03.05 AM849090Aarau.SWI/15.05 EU086723Tarragona.SPA/27.05/1 6 AM849058Guimaraes.POR/29.05/1 AM849083Berlin.DEU/16.05 AM849093Bucharest.ROU/48.04/2 05-00061GER05 AM849091Bucharest.ROU/48.04/1 EU627188Mallorca.SPA/36.04 5 DQ903068Frankfurt.DEU/03.05 AM849090Aarau.SWI/15.05 EU086723Tarragona.SPA/27.05/1 6 AY521175CAValenciana.SPA/10.02 AY920711Moscow.RUS/23.01 AY920715Moscow.RUS/15.03 AY920716Astrakhan.RUS/12.03 60 AY521175CAValenciana.SPA/10.02 AY920711Moscow.RUS/23.01 AY920715Moscow.RUS/15.03 AY920716Astrakhan.RUS/12.03 60 EU085473Madrid.SPA/50.05 EF079130London.GBR/37.05 EU170495Resafa.IRQ/17.2005 EU170496Alazezia.IRQ/20.2006 EU170484Baghdad.IRQ/2003 EU170488Alsader.IRQ/22.2004EU170486Kerkh.IRQ/20.2004 EU170493Samaraa.IRQ/22.2005 EU085473Madrid.SPA/50.05 EF079130London.GBR/37.05 EU170495Resafa.IRQ/17.2005 EU170496Alazezia.IRQ/20.2006 EU170484Baghdad.IRQ/2003 EU170488Alsader.IRQ/22.2004EU170486Kerkh.IRQ/20.2004 EU170493Samaraa.IRQ/22.2005 DQ917474Vellore.IND/50.05-1 GQ228453Malaga.ESP/45.08 EU439426Dublin.IRL/44.07 FJ175451Gibralter.GIB/32.08 EU715977NewYork.USA/7.08 FJ917755Menorca.SPA/44.08 FJ175452Gibralter.GIB/31.08 FJ222726Belfast.GBR/15.08 FJ595981Midelt.MAR/37.08/1 EU585844DenHaag.NLD/03.08 EU982301Cadiz.SPA/5.08/1 7 EF600554Enfield.GBR/14.07 GQ228451Cadiz.ESP/11.08 FJ911611Cadiz.SPA/14.08/1 FJ911612Cadiz.SPA/14.08/1 FJ222729London.GBR/19.08 GQ228452Cadiz.ESP/29.08 DQ917474Vellore.IND/50.05-1 GQ228453Malaga.ESP/45.08 EU439426Dublin.IRL/44.07 FJ175451Gibralter.GIB/32.08 EU715977NewYork.USA/7.08 FJ917755Menorca.SPA/44.08 FJ175452Gibralter.GIB/31.08 FJ222726Belfast.GBR/15.08 FJ595981Midelt.MAR/37.08/1 EU585844DenHaag.NLD/03.08 EU982301Cadiz.SPA/5.08/1 7 EF600554Enfield.GBR/14.07 GQ228451Cadiz.ESP/11.08 FJ911611Cadiz.SPA/14.08/1 FJ911612Cadiz.SPA/14.08/1 FJ222729London.GBR/19.08 GQ228452Cadiz.ESP/29.08 Resultados 130 1. Representa a 9 secuencias 2. Representa a 119 secuencias. 3. Representa a 2 secuencias 4. Representa a 2 secuencias. 5. Representa a 3 secuencias. 6. Representa a 3 secuencias. 7. Representa a 66 secuencias. A lo largo del período estudiado se han encontrado numerosas variantes de sarampión de genotipo D4. El primero de ellos, un caso esporádico ocurrido en Valencia en el año 2002 que procedía de Ucrania (AY521175 CAValenciana.SPA/10.02), y como se aprecia en la Tabla 22 las secuencias más próximas publicadas en la base de datos GenBank proceden de Rusia. Posición nucleotídica 264 428 450 AY521175CAValenciana.SPA/10.02 G T G AY920711Moscow.RUS/23.01 A AY920715Moscow.RUS/15.03 C A Secuenc y cambios nucleotíd AY920716Astrakhan.RUS/12.03/1 A C A Tabla 22. Sustituciones nucleotídicas entre las secuencias de Valencia y Rusia. El número de nucleótido está referido al fragmento del extremo 3´ del gen N, de 456 nucleótidos. Posteriormente, se produjo un brote de cuatro casos en las Islas Baleares en 2004 de origen desconocido (EU627188 Mallorca.SPA/36.04) pero que queda englobada dentro de la rama de cepas europeas de este genotipo (Figura 43). Otro caso esporádico que fue importado de Gran Bretaña se produjo en Madrid en el año 2005 (EU085473 Madrid.SPA/50.05), el cual tiene un nucleótido de diferencia con la cepa EF079130 London.GBR/37.05. Estos virus D4 tienen una o ninguna mutación comparadas con virus D4 detectados en Kenya (AY249257 Eastern.KEN/35.02) en 2002 y Etiopía en 2003 (DQ853390 DiredawaT.ETH/11.03/1), lo que sugiere su origen en África del Este (Tabla 23). La relación epidemiológica putativa de la cepa EF079130 London.GBR/37.05 con Somalia también sostiene esta hipótesis [43]. Resultados 131 Posiciones nucleotídicas 215 308 348 450 EU085473Madrid.SPA/50.05 A C A G AY249257Eastern.KEN/35.02 . . . . DQ853390DiredawaT.ETH/11.03/1 . . . . EU139086Minnesota.USA/35.01 . . . . EF079130London.GBR/37.05 . . A . EU170484Baghdad.IRQ/2003 . . A . EU170488Alsader.IRQ/22 2004 . . . A . EU170495Resafa.IRQ/17.2005 . . A . EU170496Alazezia.IRQ/20.2006 . . A . AY249252CoastKilifi.KEN/24.02 . . G A EU170486Kerkh.IRQ/20 2004 . . T A . Secuencias y cambios nucleotídicos EU170493Samaraa.IRQ/22.2005 G . A . Tabla 23. Sustituciones nucleotídicas entre la secuencia de los brotes de Madrid y Londres del año 2005 y otras secuencias próximas detectadas en otros países. El número de nucleótido está referido al fragmento del extremo 3´ del gen N, de 456 nucleótidos. En ese mismo año se produjo un brote de 3 casos en la provincia de Tarragona (EU086723 Tarragona.SPA/27.05/1) cuyo origen se hallaba en Rumania [162]. En 2006 se produjeron dos brotes en Barcelona, uno a principios de año con un escaso número de pacientes (EU086732 Barcelona.SPA/07.06/2) y origen en Rumania, lo cual se ve reforzado por la similitud de las secuencias estudiadas con la AM849092 Bucharest.ROU/47.05/1 [162], y otro que comenzó a finales de año y continuó durante 2007 afectando a 381 casos. A lo largo del tiempo, durante este último brote se produjeron los cambios en la secuencia original del caso índice que se aprecian en la Tabla 24. Cambios nucleotídicos (aminoácidos)* en 456 nt del gen N Nº Sec Secuencia Nº Acceso GenBank Sem/año EU086731Barcelona.SPA/41.06/1 116 MVs/Barcelona.SPA/41.06/1 EU086731 41/06-28/07 1 MVs/Barcelona.SPA/50.06 FJ938030 50/2006 G-a-A 1209 (sin.) 1 MVs/Barcelona.ESP/50.06/2 GQ228458 50/2006 A-a-G 1369 (S457G) 1 MVs/Barcelona.SPA/2.07/1 FJ938035 2/2007 G-a-T 1443, A-a-G 1524 (sin.) *Los cambios están referidos al gen completo de la nucleoproteína siguiendo la secuencia U01987 Edmonston tipo salvaje. Resultados 132 Resultados 139 14. ANÁLISIS DE SECUENCIAS DE GENOTIPO D6 Figura 45. Filograma de secuencias pertenecientes al genotipo D6. Las secuencias españolas obtenidas en este estudio están coloreadas en azul, la de referencia en rojo, una secuencia española del año 94 se muestra en verde y las obtenidas de la base de datos GenBank en negro. Las de GenBank utilizadas incluyen el número de acceso seguido del lugar de origen, la semana epidemiológica de aparición de síntomas, el año y, en su caso, el número de secuencia de esa semana. En la figura solo se muestran los valores de “bootstrap” mayores de 49. EU105463Khmelnytsky.UKR/11.06/1 EU107815Minsk.BLR/33.06 EU107816Minsk.BLR/20.06/2 EU109768Khmelnytsky.UKR/20.06 EU086726Madrid.SPA/18.06/1 EU109767Kyiv.UKR/20.06 AM849077Berlin.DEU/11.06 EU597253Moscow.RUS/4.07 AM849076Stuttgart.DEU/11.06 EU117231Moscow.RUS/11.06/4 EU105460Baku.AZE/07.06/1 EU117229Moscow.RUS/04.06/7 AM849084Tallinn.EST/12.06 EF179546NewcastleuponTyne.GBR/29.06 EU086735Logrono.SPA/02.06/11 EU107817Smorgon.BLR/20.06/1 EF079134Redhill.GBR/10.06 EU107814Baranovichi.BLR/03.06 EU117230Moscow.RUS/05.06/3 EU117227Vladimir.RUS/40.05 AM849075Moenchengladbach.DEU/10.06 AM849078Duesseldorf.DEU/11.06 EU086730Valencia.SPA/17.06 DQ903070Siegen.DEU/07.06 EU105462Kyiv.UKR/03.06/1 EU597263Moscow.RUS/03.06 AM849074Offenbach.DEU/09.06 AM849079Kiel.DEU/19.06 AM849069Plovdiv.BGR/28.06 AM849085Riga.LVA/16.06 EU107813Minsk.BLR/05.06 DQ888759NewMexico.USA/4.06 DQ888760Indiana.USA/3.06 EU117228Kursk.RUS/02.06/2 EU598667Imathia.GRE/40.06 EU109770NizhnyNovgorod.RUS/26.05 AM849051Berbourg.LUX/17.06 EU598665Athens.GRE/36.06 EU086734SantaCruzdeTenerife.SPA/24.06/12 AM850904Attica.GRC/09.06/2 Munich.DEU/18.06 EU925763Moscow.RUS/25.03/2 EU105465Toshkent.UZB/07.06/3 DQ888746Arizona.USA/3.05 AY920723Moscow.RUS/14.04 AM850905Attica.GRC/09.06/1 EU597255Moscow.RUS/15.07/1 EU597265Andijon.UZB/5.7/1 05-00255DEU05 481066SWI05 AY920714Moscow.RUS/13.03/2 EU117226Ryazan.RUS/26.05 EU597254NizhnyNovgorod.RUS/8.07 AM849086Geneva.SWI/02.05 AY920726N.Osetiya.RUS/51.03 EU598662Thes.GRE/17.06 EU105461Aktau.KAZ/11.06 EU105466Tver.RUS/14.06 AY899308Ankara.TR/19.01 EU117222Moscow.RUS/4.05 EU597260Novosibirsk.RUS/6.05 04-00132DEU04 EU105464Toshkent.UZB/07.06/1 EU597259Orenburg.RUS/12.06 AM849073Munich.DEU/17.05 AY920712Dagestan.RUS/20.03 EU117224Rostov-na-Donu.RUS/13.05/1 EU117225Rostov-na-Donu.RUS/13.05/2 480160SWI04 AF474936Berlin.DEU/47.00 EU109766Toshkent.UZB/07.06/2 EU109771Orenburg.RUS/16.06 DQ903069Munich.DEU/17.05 AY899307Ardahan.TR/23.01 AM778839Holon.ISR/4.05 AY899310Sirnak.TR/29.01/2 AY920719Minsk.Belarus/28.04 AY920727Novocuzneck.RUS/44.03 EU925765Moscow.RUS/19.07 AY253334BuenosAires.ARG/52.02 AY274602Oberpallen.LUX/48.00/1 AY274601EschsurAlzette.LUX/5.01/1 AY274592Dudelange.LUX/27.01/1 AY274599Belvaux.LUX/12.01/1 AF504049Glasgow.UNK/90s-sspe(UK125/90s) AY274603Eischen.LUX/46.99/1 AY899319Ankara.TR/10.98/4 AF410992Vancouver.CAN/7.97 AF410994Edmonton.CAN/9.97 03-03738DEU03 AF410993Calgary.CAN/8.97/2 D6NJUSA94 AF410995Newfoundland.CAN/12.97/1 X84863Madrid.ESP/94/1 AY899321Ankara.TR/38.00 H2CHN94 61 60 86 62 59 64 63 63 0.01 EU105463Khmelnytsky.UKR/11.06/1 EU107815Minsk.BLR/33.06 EU107816Minsk.BLR/20.06/2 EU109768Khmelnytsky.UKR/20.06 EU086726Madrid.SPA/18.06/1 EU109767Kyiv.UKR/20.06 AM849077Berlin.DEU/11.06 EU597253Moscow.RUS/4.07 AM849076Stuttgart.DEU/11.06 EU117231Moscow.RUS/11.06/4 EU105460Baku.AZE/07.06/1 EU117229Moscow.RUS/04.06/7 AM849084Tallinn.EST/12.06 EF179546NewcastleuponTyne.GBR/29.06 EU086735Logrono.SPA/02.06/11 EU107817Smorgon.BLR/20.06/1 EF079134Redhill.GBR/10.06 EU107814Baranovichi.BLR/03.06 EU117230Moscow.RUS/05.06/3 EU117227Vladimir.RUS/40.05 AM849075Moenchengladbach.DEU/10.06 AM849078Duesseldorf.DEU/11.06 EU086730Valencia.SPA/17.06 DQ903070Siegen.DEU/07.06 EU105462Kyiv.UKR/03.06/1 EU597263Moscow.RUS/03.06 AM849074Offenbach.DEU/09.06 AM849079Kiel.DEU/19.06 AM849069Plovdiv.BGR/28.06 AM849085Riga.LVA/16.06 EU107813Minsk.BLR/05.06 DQ888759NewMexico.USA/4.06 DQ888760Indiana.USA/3.06 EU117228Kursk.RUS/02.06/2 EU598667Imathia.GRE/40.06 EU109770NizhnyNovgorod.RUS/26.05 AM849051Berbourg.LUX/17.06 EU598665Athens.GRE/36.06 EU086734SantaCruzdeTenerife.SPA/24.06/12 AM850904Attica.GRC/09.06/2 Munich.DEU/18.06 EU925763Moscow.RUS/25.03/2 EU105465Toshkent.UZB/07.06/3 DQ888746Arizona.USA/3.05 AY920723Moscow.RUS/14.04 AM850905Attica.GRC/09.06/1 EU597255Moscow.RUS/15.07/1 EU597265Andijon.UZB/5.7/1 05-00255DEU05 481066SWI05 AY920714Moscow.RUS/13.03/2 EU117226Ryazan.RUS/26.05 EU597254NizhnyNovgorod.RUS/8.07 AM849086Geneva.SWI/02.05 AY920726N.Osetiya.RUS/51.03 EU598662Thes.GRE/17.06 EU105461Aktau.KAZ/11.06 EU105466Tver.RUS/14.06 AY899308Ankara.TR/19.01 EU117222Moscow.RUS/4.05 EU597260Novosibirsk.RUS/6.05 04-00132DEU04 EU105464Toshkent.UZB/07.06/1 EU597259Orenburg.RUS/12.06 AM849073Munich.DEU/17.05 AY920712Dagestan.RUS/20.03 EU117224Rostov-na-Donu.RUS/13.05/1 EU117225Rostov-na-Donu.RUS/13.05/2 480160SWI04 AF474936Berlin.DEU/47.00 EU109766Toshkent.UZB/07.06/2 EU109771Orenburg.RUS/16.06 DQ903069Munich.DEU/17.05 AY899307Ardahan.TR/23.01 AM778839Holon.ISR/4.05 AY899310Sirnak.TR/29.01/2 AY920719Minsk.Belarus/28.04 AY920727Novocuzneck.RUS/44.03 EU925765Moscow.RUS/19.07 AY253334BuenosAires.ARG/52.02 AY274602Oberpallen.LUX/48.00/1 AY274601EschsurAlzette.LUX/5.01/1 AY274592Dudelange.LUX/27.01/1 AY274599Belvaux.LUX/12.01/1 AF504049Glasgow.UNK/90s-sspe(UK125/90s) AY274603Eischen.LUX/46.99/1 AY899319Ankara.TR/10.98/4 EU105463Khmelnytsky.UKR/11.06/1 EU107815Minsk.BLR/33.06 EU107816Minsk.BLR/20.06/2 EU109768Khmelnytsky.UKR/20.06 EU086726Madrid.SPA/18.06/1 EU109767Kyiv.UKR/20.06 AM849077Berlin.DEU/11.06 EU597253Moscow.RUS/4.07 AM849076Stuttgart.DEU/11.06 EU117231Moscow.RUS/11.06/4 EU105460Baku.AZE/07.06/1 EU117229Moscow.RUS/04.06/7 AM849084Tallinn.EST/12.06 EF179546NewcastleuponTyne.GBR/29.06 EU086735Logrono.SPA/02.06/11 EU107817Smorgon.BLR/20.06/1 EF079134Redhill.GBR/10.06 EU107814Baranovichi.BLR/03.06 EU117230Moscow.RUS/05.06/3 EU117227Vladimir.RUS/40.05 AM849075Moenchengladbach.DEU/10.06 AM849078Duesseldorf.DEU/11.06 EU086730Valencia.SPA/17.06 DQ903070Siegen.DEU/07.06 EU105462Kyiv.UKR/03.06/1 EU597263Moscow.RUS/03.06 AM849074Offenbach.DEU/09.06 AM849079Kiel.DEU/19.06 AM849069Plovdiv.BGR/28.06 AM849085Riga.LVA/16.06 EU107813Minsk.BLR/05.06 DQ888759NewMexico.USA/4.06 DQ888760Indiana.USA/3.06 EU117228Kursk.RUS/02.06/2 EU598667Imathia.GRE/40.06 EU109770NizhnyNovgorod.RUS/26.05 AM849051Berbourg.LUX/17.06 EU598665Athens.GRE/36.06 EU086734SantaCruzdeTenerife.SPA/24.06/12 AM850904Attica.GRC/09.06/2 Munich.DEU/18.06 EU925763Moscow.RUS/25.03/2 EU105465Toshkent.UZB/07.06/3 DQ888746Arizona.USA/3.05 AY920723Moscow.RUS/14.04 AM850905Attica.GRC/09.06/1 EU597255Moscow.RUS/15.07/1 EU597265Andijon.UZB/5.7/1 05-00255DEU05 481066SWI05 AY920714Moscow.RUS/13.03/2 EU117226Ryazan.RUS/26.05 EU597254NizhnyNovgorod.RUS/8.07 AM849086Geneva.SWI/02.05 AY920726N.Osetiya.RUS/51.03 EU598662Thes.GRE/17.06 EU105461Aktau.KAZ/11.06 EU105466Tver.RUS/14.06 AY899308Ankara.TR/19.01 EU117222Moscow.RUS/4.05 EU597260Novosibirsk.RUS/6.05 04-00132DEU04 EU105464Toshkent.UZB/07.06/1 EU597259Orenburg.RUS/12.06 AM849073Munich.DEU/17.05 AY920712Dagestan.RUS/20.03 EU117224Rostov-na-Donu.RUS/13.05/1 EU117225Rostov-na-Donu.RUS/13.05/2 480160SWI04 AF474936Berlin.DEU/47.00 EU109766Toshkent.UZB/07.06/2 EU109771Orenburg.RUS/16.06 DQ903069Munich.DEU/17.05 AY899307Ardahan.TR/23.01 AM778839Holon.ISR/4.05 AY899310Sirnak.TR/29.01/2 AY920719Minsk.Belarus/28.04 AY920727Novocuzneck.RUS/44.03 EU925765Moscow.RUS/19.07 AY253334BuenosAires.ARG/52.02 AY274602Oberpallen.LUX/48.00/1 AY274601EschsurAlzette.LUX/5.01/1 AY274592Dudelange.LUX/27.01/1 AY274599Belvaux.LUX/12.01/1 AF504049Glasgow.UNK/90s-sspe(UK125/90s) AY274603Eischen.LUX/46.99/1 AY899319Ankara.TR/10.98/4 AF410992Vancouver.CAN/7.97 AF410994Edmonton.CAN/9.97 03-03738DEU03 AF410993Calgary.CAN/8.97/2 D6NJUSA94 AF410995Newfoundland.CAN/12.97/1 X84863Madrid.ESP/94/1 AY899321Ankara.TR/38.00 H2CHN94 61 60 86 62 59 64 63 63 0.01 1. Representa a 14 secuencias.2. Representa a 3 secuencias. En el año 2006 se produjeron dos casos esporádicos de sarampión genotipo D6, uno en Valencia (EU086730 Valencia.SPA/17.06) y otro en Madrid (EU086726 Madrid.SPA/18.06/1). Los dos brotes que también se detectaron ocurrieron en Logroño (La Rioja) en diciembre de 2005 y enero de 2006 [169], representado por la secuencia EU086735 Logroño.SPA/02.06/1; y en Santa Cruz de Tenerife (Islas Canarias), representado por la secuencia EU086734 Santa Cruz de Tenerife.SPA/24.06/1. La variante denominada D6-2005 [43], que causó un brote de más de 46.000 casos en Ucrania entre el último cuarto de 2005 y octubre de 2006 fue identificada en primer lugar en la Federación Rusa en el último cuarto del 2005 (EU117227 Vladimir.RUS/40.05). Los casos esporádicos de Valencia y Madrid presentan una secuencia similar a EU117227 Vladimir.RUS/40.05 y tienen antecedente epidemiológico con Ucrania (Tabla 29). De la misma manera la secuencia encontrada en el brote de Logroño era igual a la secuencia ucraniana, aunque no se pudo encontrar relación epidemiológica [43]. Es de destacar que esta misma secuencia, aparte de en Ucrania también fue detectada en otros países y particularmente en Alemania [170, 171]. Resultados 140 7 2 14 5 14 6 23 3 24 9 29 3 33 2 35 2 377 39 3 41 6 44 2 EU086726Madrid.SPA/18.06/ 1 AG A G C C T GCGAG EU086730Valencia.SPA/17.0 6 ............ EU086735Lo g rono.SPA/02.06/ 1 ............ EU117227Vladimir.RUS/40.0 5 ............ AM849069Plovdiv.BGR/28.06 ............ AM849074Offenbach.DEU/09.06 ............ AM849075Moenchen g ladbach.DEU/10.0 6 ............ AM849076Stutt g art.DEU/11.06 ............ AM849077Berlin.DEU/11.06 ............ AM849078Duesseldorf.DEU/11.06 ............ AM849079Kiel.DEU/19.06 ............ AM849084Tallinn.EST/12.06 ............ AM849085Ri g a.LVA/16.0 6 ............ DQ903070Sie g en.DEU/07.0 6 ............ EF079134Redhill.GBR/10.0 6 ............ EU105460Baku.AZE/07.06/ 1 ............ EU105462Kyiv.UKR/03.06/ 1 ............ EU107813Minsk.BLR/05.06 ............ EU597263Moscow.RUS/03.0 6 ............ DQ888760Indiana.USA/3.0 6 ...........A EF179546NewcastleuponTyne.GBR/29.0 6 ..... T ...... EU105463Khmelnytsky.UKR/11.06/ 1 ........ T ... EU107814Baranovichi.BLR/03.06 ......C..... EU107816Minsk.BLR/20.06/2 ........ T ... EU107817Smor g on.BLR/20.06/1 G........... EU109767Kyiv.UKR/20.06_D 6 ..G......... EU109768Khmelnytsky.UKR/20.0 6 . T .......... EU117229Moscow.RUS/04.06/7 .........A.. EU117230Moscow.RUS/05.06/ 3 ......C..... EU597253Moscow.RUS/4.07 .... T ....... DQ888759NewMexico.USA/4.0 6 .......A...A EU107815Minsk.BLR/33.06 ........ T .G. Secuencias y cambios nucleotídicos Posiciones nucleotídicas Tabla 29. Sustituciones nucleotídicas entre la secuencia de los brotes de Madrid y Logroño, un caso esporádico de Valencia y otras secuencias próximas detectadas en otros países. El número de nucleótido está referido al fragmento del extremo 3´ del gen N, de 456 nucleótidos. En lo que se refiere al brote de Santa Cruz de Tenerife, afectó a tres hermanos de origen alemán y la secuencia es igual a la encontrada en Alemania: MVs/Munich.DEU/18.06 (Tabla 30) [43]. Posición nucleotídica 24 172 173 189 EU086734SantaCruzdeTenerife.SPA/24.06/1 T T T T MVs/Munich.DEU/18.06_D6 . . . . AM850904Attica.GRC/09.06/2 . . . . EU598665Athens.GRE/36.06 . . . . Secuencias y cambios nucleotídicos AM849051Berbourg.LUX/17.06 G C C C Tabla 30. Sustituciones nucleotídicas entre la secuencia del brote de Santa Cruz de Tenerife y otras secuencias próximas detectadas en otros países. El número de nucleótido está referido al fragmento del extremo 3´ del gen N, de 456 nucleótidos. Resultados 141 Por último, conviene destacar que todas las secuencias D6 encontradas en España en el año 2006 son diferentes a la que circuló en nuestro país desde 1993 hasta 1997 (X84863 Madrid.ESP/94/1) como se observa en el filograma y en la Tabla 31 [163, 164]. Posiciones nucleotídicas 24 105 168 229 308 EU086726Madrid.SPA/18.06/1 G A A T A EU086730Valencia.SPA/17.06 . . . . . EU086735Logrono.SPA/02.06/1 . . . . . EU086734SantaCruzdeTenerife.SPA/24.06/1 T . . C . Secuencias y cambios nucleotídicos X84863Madrid.ESP/94/1 T G C . C Tabla 31. Sustituciones nucleotídicas entre las secuencias españolas de 2006 y la que circuló durante los años 1993-1997. El número de nucleótido está referido al fragmento del extremo 3´ del gen N, de 456 nucleótidos. Resultados 142 Resultados 143 15. ANÁLISIS DE SECUENCIAS DE GENOTIPO D7 Figura 46. Filograma de secuencias pertenecientes al genotipo D7. Las secuencias españolas están coloreadas en azul, las de referencia en rojo y las obtenidas de la base de datos GenBank en negro. Las de GenBank utilizadas incluyen el número de acceso seguido del lugar de origen, la semana epidemiológica de aparición de síntomas, el año y, en su caso, el número de secuencia de esa semana. En la figura solo se muestran los valores de “bootstrap” mayores de 49. 1. Representa a 4 secuencias. 2. Representa a 2 secuencias. 3. Representa a 5 secuencias. 448673SWI03 AF474942Berlin.DEU/25.01 AY303616Tenerife.SPA/20.02 02-00025DEU02 02-00787DEU02 AF481493Vic.AU/4.00 448677SWI03 03-00236DEU03 03-03633DEU03 02-00440DEU02 02-00794DEU02 AF474934Kassel.DEU/27.00 AY585729Lyon.FR/03/1 02-00487DEU02 AY303617Ibiza.SPA/23.01 1 02-00818DEU02 AF474938Mainz.DEU/07.01 02-00726DEU02 448676SWI03 02-00535DEU02 AY585732Paris.FR/01/1 02-00188DEU02 AY307104Cordoba.SPA/10.03 02-00002DEU02 02-00360DEU02 451121SWI03 AY307105CAValenciana.SPA/2.03 2 02-00297DEU02 2001FR 02-00444DEU02 02-00441DEU02 451018SWI03 02-00661DEU02 2003-02FR AF277805Mainz.DEU/06.00/1 EU139094Ohio.USA/26.02 02-01094DEU02 446604SWI03 AY303621CAValenciana.SPA/4.02 3 02-74786UNK02 H030700028UNK03 2003-04FR DQ779207Kenitra.MOR/15.04/1 EU139095California.USA/29.02 02-00585DEU02 AY585733Marseille.FR/03/3 H030420015UNK03 H033420165UNK03 H032900036UNK03 H033200176UNK03 DQ390229New York.USA/32.03 EF607931Dublin.IRL/12.03/2 H030640022UNK03 D7AYUSA99 AY953414Chennai.IND/38.03 EU139088California.USA/38.01 EU139090Arizona.USA/35.01 02-65586UNK02 DQ390235California.USA/41.02 EU139100California.USA/16.03 DQ987230Pune.Ind/11.04 DQ987231Pune.Ind/11.04 AF504048Nottingham2.UNK/80s-SSPE AF243452VicAU/52.85 AF243455VicAU/41.87 AF243454VicAU/51.86 AF243451VicAU/48.85 AF243457VicAU/42.88 D7AFAus85 AF243456VicAU/29.88 AF243458VicAU/2.89 H034980220UNK03 AF504047Nottingham1.UNK/1980s-SSPE DQ190373Dundee.UNK/82 DQ987232Bang.Ind/5.03/SSPE AF481492WA.AU/12.01 H042000335UNK04 H1CHN93 92 83 100 95 52 59 85 68 65 67 62 100 64 0.01 448673SWI03 AF474942Berlin.DEU/25.01 AY303616Tenerife.SPA/20.02 02-00025DEU02 02-00787DEU02 AF481493Vic.AU/4.00 448677SWI03 03-00236DEU03 03-03633DEU03 02-00440DEU02 02-00794DEU02 AF474934Kassel.DEU/27.00 AY585729Lyon.FR/03/1 02-00487DEU02 AY303617Ibiza.SPA/23.01 1 02-00818DEU02 AF474938Mainz.DEU/07.01 02-00726DEU02 448676SWI03 02-00535DEU02 AY585732Paris.FR/01/1 02-00188DEU02 AY307104Cordoba.SPA/10.03 02-00002DEU02 02-00360DEU02 451121SWI03 AY307105CAValenciana.SPA/2.03 2 02-00297DEU02 2001FR 02-00444DEU02 02-00441DEU02 451018SWI03 02-00661DEU02 2003-02FR AF277805Mainz.DEU/06.00/1 EU139094Ohio.USA/26.02 02-01094DEU02 446604SWI03 AY303621CAValenciana.SPA/4.02 3 02-74786UNK02 H030700028UNK03 2003-04FR DQ779207Kenitra.MOR/15.04/1 EU139095California.USA/29.02 02-00585DEU02 AY585733Marseille.FR/03/3 H030420015UNK03 H033420165UNK03 H032900036UNK03 H033200176UNK03 DQ390229New York.USA/32.03 EF607931Dublin.IRL/12.03/2 H030640022UNK03 D7AYUSA99 AY953414Chennai.IND/38.03 EU139088California.USA/38.01 EU139090Arizona.USA/35.01 02-65586UNK02 DQ390235California.USA/41.02 EU139100California.USA/16.03 DQ987230Pune.Ind/11.04 DQ987231Pune.Ind/11.04 AF504048Nottingham2.UNK/80s-SSPE AF243452VicAU/52.85 AF243455VicAU/41.87 AF243454VicAU/51.86 AF243451VicAU/48.85 AF243457VicAU/42.88 D7AFAus85 AF243456VicAU/29.88 AF243458VicAU/2.89 H034980220UNK03 AF504047Nottingham1.UNK/1980s-SSPE DQ190373Dundee.UNK/82 DQ987232Bang.Ind/5.03/SSPE AF481492WA.AU/12.01 H042000335UNK04 H1CHN93 92 83 100 95 52 59 85 68 65 67 62 100 64 0.01 En lo que se refiere al genotipo D7 es de destacar que se presentó en España entre los años 2001-2003 y posteriormente no volvió a producir ni casos esporádicos ni brotes. Este es el mismo período de tiempo que este genotipo estuvo circulando por los países de la Región Europea de la OMS (Tabla 32) [43]. El brote de Ibiza del año 2001 (AY303617 Ibiza.SPA/23.01) afectó a 8 pacientes y su origen era desconocido. Los casos esporádicos que produjo este genotipo se localizaron en Los Cristianos (Tenerife) (AY303616 Tenerife.SPA/20.02) en 2002 y en Córdoba en 2003 (AY307104 Córdoba.SPA/10.03). El brote de Valencia del año 2002, representado por la secuencia AY303621 CAValenciana.SPA/4.02 y cuyo origen epidemiológico era Bosnia, afectó a 15 casos. Mientras que el de 2003, también en Valencia (AY307105 CAValenciana.SPA/2.03), afectó a dos familiares exclusivamente sin que se conozca su lugar de origen. 1 1 3 1 7 3 3 5 7 7 8 12 6 13 5 147 14 8 15 9 18 7 19 7 22 9 24 4 24 8 25 6 25 8 295 31 9 32 3 32 8 34 4 35 3 37 6 42 3 43 1 A Y307104Cordoba.SPA/10.0 3 A A TTTT A TTCTGTTTG A TCTGGGCGT A A Y303617Ibiza.SPA/23.0 1 ........................... A Y303616Tenerife.SPA/20.0 2 ........................... A Y303621CAValenciana.SPA/4.0 2 ........................... A Y307105CAValenciana.SPA/2.0 3 ....................C...... 02-00002DEU0 2 ........................... 2001F R ........................... 2003-02F R ........................... 448673SWI0 3 ........................... 448676SWI0 3 ........................... 448677SWI0 3 ........................... 451018SWI0 3 ........................... A F277805Mainz.DEU/06.00/ 1 ........................... A F474938Mainz.DEU/07.0 1 ........................... A F481493Vic.AU/4.00 EX LKA * ........................... A Y585729Lyon.FR/03/ 1 ........................... A Y585732Paris.FR/01/ 1 ........................... 02-00025DEU0 2 .T......................... 02-00297DEU0 2 ...................C....... 02-00360DEU0 2 ..................T........ 02-00440DEU0 2 ......T.................... 02-00444DEU0 2 .......................T... 02-00487DEU0 2 ........C.................. 02-00535DEU0 2 ............ A .............. 02-00661DEU0 2 .............. A ............ 02-00726DEU0 2 ...................... A .... 02-00787DEU0 2 G.......................... 02-00794DEU0 2 ....C...................... 03-03633DEU0 3 .............C............. 451121SWI0 3 .......C................... A F474934Kassel.DEU/27.0 0 ........................ A .. A F474942Berlin.DEU/25.0 1 .....C....C................ EU139094Ohio.USA/26.0 2 ................GC......... 02-00188DEU0 2 .. . . . . . . . T . A ............... 02-00441DEU0 2 .. A ..................T..... 02-00818DEU0 2 .........................CC 02-01094DEU0 2 ...C.............C......... 03-00236DEU0 3 .............C.T........... 446604SWI0 3 ...C.............C......... Posiciones nucleotídicas Secuencias y cambios nucleotídicos *EX LKA: Exportada a Australia desde Sri Lanka [168]. Tabla 32. Sustituciones nucleotídicas entre las secuencias D7 españolas y otras secuencias próximas detectadas en otros países. El número de nucleótido está referido al fragmento del extremo 3´ del gen N, de 456 nucleótidos. Resultados 144 Resultados 145 16. ANÁLISIS DE SECUENCIAS DE GENOTIPO D8 Figura 47. Filograma de secuencias pertenecientes al genotipo D8. Las secuencias españolas están coloreadas en azul, la de referencia en rojo y las obtenidas de la base de datos GenBank en negro. Las de GenBank utilizadas incluyen el número de acceso seguido del lugar de origen, la semana epidemiológica de aparición de síntomas, el año y, en su caso, el número de secuencia de esa semana. En la figura solo se muestran los valores de “bootstrap” mayores de 49. DQ917472Tiruchirappalli.IND/49.05-1 FJ361900Mirbat.OMN/21.08/1 DQ917464Tuticorin.IND/40.05 DQ917470Virudhunagar.IND/47.05-1 DQ917469Virudhunagar.IND/43.05 EF079135Douglas.GBR/15.06 DQ917468Dindigul.IND/42.05 DQ917465Tirunelveli.IND/40.05 EU597264Moscow.RUS/33.07 EU139097Wisconsin.USA/50.02 EU139114Texas.USA/4.07D8 FJ008127Rustaq.OMN/05.08/1 FJ008130Sohar.OMN/50.07/1 DQ917457Vellore.IND/09.05-3 DQ917476Tiruvallur.IND/50.05-1 DQ917455Vellore.IND/08.05 445062SWI03 H032380061UNK03 444043SWI03 444997SWI03 AY957558cadlore.Ind/1.05/1 DQ917452Chennai.IND/06.05 DQ888761California.USA/4.06 EU139105California.USA/40.04 DQ888745NewYorkCity.USA/8.05 DQ917460Vellore.IND/20.05-1 DQ099556Tiruvannamalai.IND/49.03 DQ345392Satara.IND/15.05/4 EU139103Massachusetts.USA/24.04 EF079132Enfield.GBR/9.06 DQ917466Villupuram.IND/42.05-1 EU597252Moscow.RUS/4.07/2 EU650202Ontario.CAN/12.08 DQ983643Sydney.Aus/3.06 EU878303DenHaag.NLD/25.08 DQ888756California.USA/16.06 DQ888758Massachusetts.USA/20.06 AY873975PUNE.IND/13.97-2 DQ398062SouthAustralia.AU/39.04 D8UNK94 AY873974PUNE.IND/13.97-1 DQ099554Dindigul.IND/38.03 EU139092NewYork.USA/17.02 DQ917480Maharastra.IND/05 DQ852617Sydney.AUS/2.03 EF079137London.GBR/18.06/4 EF079136Birmingham.GBR/17.06 AY841168IND DQ923615NILWANDE.IND/9.04 AF481491Vic.AU/5.01 H031000032UNK03 AJ250069JanakpurNEP/2.99/1 AJ250070JanakpurNEP/2.99/2 H051680701UNK05 H05186718UNK05 EF079124London.GBR/14.05 H051660652UNK05 AF280801AddisAbabaETH/50.98 AF410998Montreal.CAN/19.98 481524SWI05 DQ888744NewYorkCity.USA/2.05 AJ250072KathmanduNEP/5.99 DQ390251Iowa.USA/11.04 H032560055UNK03 H032560063UNK03 H031860035UNK03 H032600036UNK03 H032600052UNK03 H032600065UNK03 EF607927Dublin.IRL/04.03/3 H033680166UNK03 H033800203UNK03 H033900229UNK03 H034300233UNK03 02 70634UNK02 02 79350UNK02 H034000192UNK03 H030540031UNK03 H041560437UNK04 H041880383UNK04 DQ390245Brooklyn.USA/10.04 DQ398060Victoria.AU/20.03 DQ398061Victoria.AU/1.02 H031660030UNK03 468477SWI04 DQ779220BenniMellal.MOR/.05/1 EU085472Granada.SPA/25.05 EU627187Alicante.SPA/17.03 1 DQ779206Tanger.MOR/16.04 EU700337Alberta.CAN/15.08 FJ217706Meknes.MOR/9.07/1 FJ217704Meknes.MOR/7.07/1 FJ217707Meknes.MOR/10.07/1 FJ217712Zagora.MOR/13.08/1 FJ217709Kenitra.MOR/15.07/1 FJ217705Meknes.MOR/8.07/1 FJ217710Kenitra.MOR/18.07/1 FJ217708Meknes.MOR/10.07/2 FJ217711ElHajeb.MOR/11.08/1 AY037034TexasUSA/28.99 AF481490VictoriaAU/37.99 AY037037WashingtonUSA/12.99 H2CHN94 96 87 78 87 54 94 55 51 80 59 91 76 58 87 84 56 51 75 71 51 60 84 67 91 92 86 64 65 54 66 95 0.01 DQ917472Tiruchirappalli.IND/49.05-1 FJ361900Mirbat.OMN/21.08/1 DQ917464Tuticorin.IND/40.05 DQ917470Virudhunagar.IND/47.05-1 DQ917469Virudhunagar.IND/43.05 EF079135Douglas.GBR/15.06 DQ917468Dindigul.IND/42.05 DQ917465Tirunelveli.IND/40.05 EU597264Moscow.RUS/33.07 EU139097Wisconsin.USA/50.02 EU139114Texas.USA/4.07D8 FJ008127Rustaq.OMN/05.08/1 FJ008130Sohar.OMN/50.07/1 DQ917457Vellore.IND/09.05-3 DQ917476Tiruvallur.IND/50.05-1 DQ917455Vellore.IND/08.05 445062SWI03 H032380061UNK03 444043SWI03 444997SWI03 AY957558cadlore.Ind/1.05/1 DQ917452Chennai.IND/06.05 DQ888761California.USA/4.06 EU139105California.USA/40.04 DQ888745NewYorkCity.USA/8.05 DQ917460Vellore.IND/20.05-1 DQ099556Tiruvannamalai.IND/49.03 DQ345392Satara.IND/15.05/4 EU139103Massachusetts.USA/24.04 EF079132Enfield.GBR/9.06 DQ917466Villupuram.IND/42.05-1 EU597252Moscow.RUS/4.07/2 EU650202Ontario.CAN/12.08 DQ983643Sydney.Aus/3.06 EU878303DenHaag.NLD/25.08 DQ888756California.USA/16.06 DQ888758Massachusetts.USA/20.06 AY873975PUNE.IND/13.97-2 DQ398062SouthAustralia.AU/39.04 D8UNK94 AY873974PUNE.IND/13.97-1 DQ099554Dindigul.IND/38.03 EU139092NewYork.USA/17.02 DQ917480Maharastra.IND/05 DQ852617Sydney.AUS/2.03 EF079137London.GBR/18.06/4 EF079136Birmingham.GBR/17.06 AY841168IND DQ923615NILWANDE.IND/9.04 AF481491Vic.AU/5.01 H031000032UNK03 AJ250069JanakpurNEP/2.99/1 AJ250070JanakpurNEP/2.99/2 H051680701UNK05 H05186718UNK05 EF079124London.GBR/14.05 H051660652UNK05 AF280801AddisAbabaETH/50.98 AF410998Montreal.CAN/19.98 481524SWI05 DQ888744NewYorkCity.USA/2.05 AJ250072KathmanduNEP/5.99 DQ390251Iowa.USA/11.04 H032560055UNK03 H032560063UNK03 H031860035UNK03 H032600036UNK03 H032600052UNK03 H032600065UNK03 EF607927Dublin.IRL/04.03/3 H033680166UNK03 H033800203UNK03 H033900229UNK03 H034300233UNK03 DQ917472Tiruchirappalli.IND/49.05-1 FJ361900Mirbat.OMN/21.08/1 DQ917464Tuticorin.IND/40.05 DQ917470Virudhunagar.IND/47.05-1 DQ917469Virudhunagar.IND/43.05 EF079135Douglas.GBR/15.06 DQ917468Dindigul.IND/42.05 DQ917465Tirunelveli.IND/40.05 EU597264Moscow.RUS/33.07 EU139097Wisconsin.USA/50.02 EU139114Texas.USA/4.07D8 FJ008127Rustaq.OMN/05.08/1 FJ008130Sohar.OMN/50.07/1 DQ917457Vellore.IND/09.05-3 DQ917476Tiruvallur.IND/50.05-1 DQ917455Vellore.IND/08.05 445062SWI03 H032380061UNK03 444043SWI03 444997SWI03 AY957558cadlore.Ind/1.05/1 DQ917452Chennai.IND/06.05 DQ888761California.USA/4.06 EU139105California.USA/40.04 DQ888745NewYorkCity.USA/8.05 DQ917460Vellore.IND/20.05-1 DQ099556Tiruvannamalai.IND/49.03 DQ345392Satara.IND/15.05/4 EU139103Massachusetts.USA/24.04 EF079132Enfield.GBR/9.06 DQ917466Villupuram.IND/42.05-1 EU597252Moscow.RUS/4.07/2 EU650202Ontario.CAN/12.08 DQ983643Sydney.Aus/3.06 EU878303DenHaag.NLD/25.08 DQ888756California.USA/16.06 DQ888758Massachusetts.USA/20.06 AY873975PUNE.IND/13.97-2 DQ398062SouthAustralia.AU/39.04 D8UNK94 AY873974PUNE.IND/13.97-1 DQ099554Dindigul.IND/38.03 EU139092NewYork.USA/17.02 DQ917480Maharastra.IND/05 DQ852617Sydney.AUS/2.03 EF079137London.GBR/18.06/4 EF079136Birmingham.GBR/17.06 AY841168IND DQ923615NILWANDE.IND/9.04 AF481491Vic.AU/5.01 H031000032UNK03 AJ250069JanakpurNEP/2.99/1 AJ250070JanakpurNEP/2.99/2 H051680701UNK05 H05186718UNK05 EF079124London.GBR/14.05 H051660652UNK05 AF280801AddisAbabaETH/50.98 AF410998Montreal.CAN/19.98 481524SWI05 DQ888744NewYorkCity.USA/2.05 AJ250072KathmanduNEP/5.99 DQ390251Iowa.USA/11.04 H032560055UNK03 H032560063UNK03 H031860035UNK03 H032600036UNK03 H032600052UNK03 H032600065UNK03 EF607927Dublin.IRL/04.03/3 H033680166UNK03 H033800203UNK03 H033900229UNK03 H034300233UNK03 02 70634UNK02 02 79350UNK02 H034000192UNK03 H030540031UNK03 H041560437UNK04 H041880383UNK04 DQ390245Brooklyn.USA/10.04 DQ398060Victoria.AU/20.03 DQ398061Victoria.AU/1.02 H031660030UNK03 468477SWI04 DQ779220BenniMellal.MOR/.05/1 EU085472Granada.SPA/25.05 EU627187Alicante.SPA/17.03 1 DQ779206Tanger.MOR/16.04 EU700337Alberta.CAN/15.08 FJ217706Meknes.MOR/9.07/1 FJ217704Meknes.MOR/7.07/1 FJ217707Meknes.MOR/10.07/1 FJ217712Zagora.MOR/13.08/1 FJ217709Kenitra.MOR/15.07/1 FJ217705Meknes.MOR/8.07/1 FJ217710Kenitra.MOR/18.07/1 FJ217708Meknes.MOR/10.07/2 FJ217711ElHajeb.MOR/11.08/1 AY037034TexasUSA/28.99 AF481490VictoriaAU/37.99 AY037037WashingtonUSA/12.99 H2CHN94 96 87 78 87 54 94 55 51 80 59 91 76 58 87 84 56 51 75 71 51 60 84 67 91 92 86 64 65 54 66 95 0.01 1. Representa a 6 secuencias. En el año 2003 se produjo un brote de sarampión genotipo D8 en Benidorm (Alicante) debido a la cepa EU627187 Alicante.SPA/17.03 que afectó a 9 casos y cuyo origen era desconocido. En el 2005 se detectó un caso esporádico en Granada (EU085472 Granada.SPA/25.05), también de origen desconocido. En el filograma se puede observar que ambas secuencias se asemejan a una secuencia de Marruecos del año 2005 (DQ779220), de la que difieren en una posición y a otra de 2004 de la que difieren en dos [159]. Las secuencias de Benidorm 2003, Granada 2005 y una procedente de Suiza del 2004 son idénticas, como se aprecia en la Tabla 33. Las secuencias marroquíes de los años 2007 y 2008 presentan más cambios, y en el árbol filogenético se asocian a las españolas con un valor de “bootstrap” del 80%. Posición nucleotídica 60 396 414 430 447 448 450 EU085472Granada.SPA/25.05 T A G T T T G EU627187Alicante.SPA/17.03 . . . . . . . 468477SWI04 . . . . . . . DQ779220BenniMellal.MOR/.05/1 C . . . . . . DQ779206Tanger.MOR/16.04 . T . . . . A EU700337Alberta.CAN/15.08 C . A . . C A FJ217704Meknes.MOR/7.07/1 C . A . . C A FJ217705Meknes.MOR/8.07/1 C . A . . C A FJ217706Meknes.MOR/9.07/1 C . A . . C A FJ217707Meknes.MOR/10.07/1 C . A . . C A FJ217708Meknes.MOR/10.07/2 C . A C . C A FJ217709Kenitra.MOR/15.07/1 C . A . . C A FJ217710Kenitra.MOR/18.07/1 C . A . . C A FJ217711ElHajeb.MOR/11.08/1 C . A . C C A Secuencias y cambios nucleotídicos FJ217712Zagora.MOR/13.08/1 C . A . . C A Tabla 33. Sustituciones nucleotídicas entre las secuencias D8 españolas y otras secuencias próximas detectadas en otros países. El número de nucleótido está referido al fragmento del extremo 3´ del gen N, de 456 nucleótidos. Resultados 146 Resultados 147 17. ANÁLISIS DE SECUENCIAS DE GENOTIPO D9 Figura 48. Filograma de secuencias pertenecientes al genotipo D9. Las secuencias españolas están coloreadas en azul, la de referencia en rojo y las obtenidas de la base de datos GenBank en negro. Las de GenBank utilizadas incluyen el número de acceso seguido del lugar de origen, la semana epidemiológica de aparición de síntomas, el año y, en su caso, el número de secuencia de esa semana. En la figura solo se muestran los valores de “bootstrap” mayores de 49. El caso de genotipo D9 encontrado en Granada en el año 2008 se detectó durante el estudio del brote de Algeciras (genotipo D4), y gracias al análisis filogenético se pudo descartar como perteneciente a dicho brote. Se trataba de un paciente que vivía en Madrid y había viajado recientemente a Portugal e Italia. Posteriormente, asociado a este paciente, se produjo un único caso secundario dentro del núcleo familiar. En el árbol filogenético se puede observar que se agrupa con una secuencia de un virus procedente de Tailandia y otro de Holanda del año 2008 (Tabla 34), aunque no existen datos epidemiológicos que puedan apoyar uno u otro origen. Posición nucleotídica 13 174 183 302 319 339 FJ911610Granada.SPA/25.08 G G G T T C FJ356078Phare.THA/27.08/1 . . . . . . EU878302Maastricht.NLD/22.08 . . . . . . FJ356076Khonkaen.THA/9.08/2 . . . . . A FJ356073Lopburi.THA/8.08/1 . A . . . . FJ150693London.GBR/22.08/9 . A . C C . DQ390258New York.USA/1.05 A . A . . . Secuencias y cambios nucleotídicos DQ390237Santander.COL/31.02 A . . . . . Tabla 34. Sustituciones nucleotídicas entre la secuencia D9 de Granada y otras secuencias próximas detectadas en otros países. El número de nucleótido está referido al fragmento del extremo 3´ del gen N, de 456 nucleótidos. FJ356076Khonkaen.THA/9.08/2 FJ911610Granada.SPA/25.08 EU878302Maastricht.NLD/22.08 FJ356078Phare.THA/27.08/1 FJ356073Lopburi.THA/8.08/1 FJ150693London.GBR/22.08/9 DQ390258New York.USA/1.05 DQ390237Santander.COL/31.02 AY738087Yilan.TWN/48.03 DQ398064Victoria.AU/14.04 DQ398063Sarawak.MAS/2.05 AB186905Yamagata.Jpn/3.04 EF079128Bristol.GBR/15.05 AB426896Aichi.JPN/44.06 EF079125Bristol.GBR/13.05 D9AUS99 H2CHN94 77 99 71 87 80 50 63 0.01 FJ356076Khonkaen.THA/9.08/2 FJ911610Granada.SPA/25.08 EU878302Maastricht.NLD/22.08 FJ356078Phare.THA/27.08/1 FJ356073Lopburi.THA/8.08/1 FJ150693London.GBR/22.08/9 DQ390258New York.USA/1.05 DQ390237Santander.COL/31.02 AY738087Yilan.TWN/48.03 DQ398064Victoria.AU/14.04 DQ398063Sarawak.MAS/2.05 AB186905Yamagata.Jpn/3.04 EF079128Bristol.GBR/15.05 AB426896Aichi.JPN/44.06 EF079125Bristol.GBR/13.05 D9AUS99 H2CHN94 77 99 71 87 80 50 63 0.01 Resultados 148 18. ANÁLISIS DE SECUENCIAS DE GENOTIPO H1 Figura 49. Filograma de secuencias pertenecientes al genotipo H1. Las secuencias españolas están coloreadas en azul, la de referencia en rojo y las obtenidas de la base de datos GenBank en negro. Las de GenBank utilizadas incluyen el número de acceso seguido del lugar de origen, la semana epidemiológica de aparición de síntomas, el año y, en su caso, el número de secuencia de esa semana. En la figura solo se muestran los valores de “bootstrap” mayores de 49. EU139101Hawaii.USA/36.03 DQ390239Majuro.RMI/44.03 DQ390228Majuro.RMI/35.03 AY737425Hsinchu.TWN/39.02 AB435247Okinawa.JPN/14.03 AB095430Fuji.JPN/21.02-S DQ398070Queensland.AU/18.03 AB095428Tokyo.JPN/23.01-Y AB104880KawasakiC.JPN/27.01 AF481496WA.AU/30.01 AY521176Ibiza.SPA/24.01/2 AY737428Taichung.TWN/40.02/2 DQ398075Victoria.AU/16.03 DQ390247MexicoCity.MEX/14.04-2 DQ390248MexicoCity.MEX/14.04-1 02-53215UNK02 AB186904Yamagata.Jpn/34.03 AB099686OsakaC.JPN/32.02 AB104874ToyotaC.JPN/30.01 DQ390246MexicoCity.MEX/14.04-4 DQ390242MexicoCity.MEX/23.03 EU557220Shanxi.PRC/42.04/1 EU557210Ningxia.PCR/23.04/1 EU715982Wisconsin.USA/15.08/2 DQ902851Shanghai.PRC/16.06/5 DQ902847Shanghai.PRC/11.06/1 EU117232Irkutsk.RUS/26.06 EU597249Buryatya.RUS/25.06 DQ888762Oregon.USA/8.06 EU597257Krasnoyarsk.RUS/19.07/1 DQ902857Shanghai.PRC/22.06/11 EF079131Aberdeen.GBR/10.06 DQ380233Taipei.TWN/11.93 EU139102Missouri.USA/26.04 DQ902852Shanghai.PRC/17.06/6 FJ415163HongKong.CHN/36.08/2 EU557208Chongqing.PRC/10.04/2 EU557195Gansu.PCR/52.04/1 EU557223Shanxi.PRC/22.04/1 AY737415Taoyuan.TWN/29.01 AY737414Taipei.TWN/16.02 EU557215Shanghai.PCR/17.04/1 EU557229Sichuan.PCR/8.04/1 EU557200Guizhou.PRC/25.04/1 EU557211Qinghai.PRC/12.04/1 EU086724SantaCruzdeTenerife.SPA/39.05 EU557232Tianjin.PRC/17.04/1 EU557213Shandong.PRC/11.04/1 EU597247Moscow.RUS/12.06 EU109772Chita.RUS/26.06 DQ390249California.USA/20.04 AB095423Tokyo.JPN/20.00-S DQ902856Shanghai.PRC/18.06/10 EU557201Hebei.PCR/24.04/1 EU557222Shanxi.PRC/18.04/2 EU557234Tianjin.PCR/17.04/2 EU557214Shandong.PRC/12.04/1 DQ902858Shanghai.PRC/20.06/12 DQ902849Shanghai.PRC/14.06/3 AY556540Zhejiang.CHN/02/2 AY556539Zhejiang.CHN/99/1 AY556541Zhejiang.CHN/16.03/3 AF417265Kwangju.KOR/04.01 AY027638Kwangju.KOR/47.00 AF417269Kanghwa.KOR/16.01/1 AF417268Seoul.KOR/07.01 AY027644Seoul.KOR/50.00 AY160181Halifax.CAN/51.00 AF481495NSW.AU/52.00 AB104879Tokyo.JPN/29.01 EU139080Washington.USA/3.01 AF427164Toronto.CAN/8.01/1 AY037042Florida.USA/25.00 EU557194Anhui.PRC/50.04/1 EU557196Guangdong.PRC/9.04/1 EU627186Badajoz.SPA/18.04 DQ011612Zhejiang.CHN/9.05/7 DQ011613Zhejiang.CHN/9.05/10 DQ902848Shanghai.PRC/11.06/2 EU557203Liaoning.PRC/11.04/1 AY737421Taipei.TWN/27.02 AY920713Moscow.RUS/13.00/2 DQ390234Ulanbataar.MOG/50.02 EU557231Tianjin.PRC/11.04/1 AY737422Pingtung.TWN/33.02 EU557205Liaoning.PRC/18.04/1 DQ398076/MGL/26.02 AY738085Taoyuan.TWN/20.03 DQ888763NewYork.USA/29.06 EU557230Sichuan.PCR/28.04/1 EU557209Chongqing.PRC/20.04/1 EU597258Vladivostok.RUS/22.07 EU557227Sichuan.PRC/43.04/5 DQ902859Shanghai.PRC/20.06/13 EU557216Shanghai.PCR/36.04/1 AY737400TWN/22.92/2 EU139109Michigan.USA/38.06 AY737397TWN/18.92/1 FJ157342Jiangxi.CHN/21.07/8 FJ157341Jiangxi.CHN/21.07/4 AF427166Hamilton.CAN/11.01 AF427165Hamilton.CAN/9.01 EU139081Minnesota.USA/9.01 AY737412Hsinchu.TWN/11.01/1 AY737411Taipei.TWN/7.01 AY737401Taoyuan.TWN/21/94 H1aCHN932 AF045205 AY737418Taipei.TWN/14.02 DQ902850Shanghai.PRC/14.06/4 AY920722Blagovecshensk.RUS/14.04 EU557237Xinjiang.PRC/13.04/2 EU557236Xinjiang.PRC/13.04/1 AF045215China94-6 AF045214China94-3 AF045213China94-2 H1bCHN937 AF045212 H1CHN93 AF045211China94-5 AF045210China94-4 AF045207China93-1 AF193512Amsterdam.Net/27.97 AEdmUSA54 AF243465Vic.AU/10.93 AY737409Taipei.TWN/36.97 AY037027Nevada.USA/20.97 H1cCHN947 AF045216 AY037047Massachusetts.USA/2.98 DQ223908Ningbo.CHN/12.05/4 EU557198Guizhou.PRC/23.04/1 DQ223907Ningbo.CHN/12.05/3 DQ223905Ningbo.CHN/12.05/1 DQ223904Ningbo.CHN/36.04/3 EU557235Xinjiang.PRC/12.04/1 EU557238Yunnan.PRC/39.04/1 EU557228Sichuan.PCR/12.04/4 EU557199Guizhou.PRC/21.04/2 AY737423Taichung.TWN/36.02 AY737416Taoyuan.TWN/45.01 EU557197Guizhou.PRC/21.04/1 AY737420Taipei.TWN/26.02 55 52 54 91 6485 83 79 71 71 54 68 90 64 83 86 63 55 56 80 54 52 64 61 53 65 53 51 73 0.005 EU139101Hawaii.USA/36.03 DQ390239Majuro.RMI/44.03 DQ390228Majuro.RMI/35.03 AY737425Hsinchu.TWN/39.02 AB435247Okinawa.JPN/14.03 AB095430Fuji.JPN/21.02-S DQ398070Queensland.AU/18.03 AB095428Tokyo.JPN/23.01-Y 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