Papel de MVP en la reparación del ADN, la progresión tumoral y la hipoxia en carcinoma cervical: impacto pronóstico
Abstract
Programa de doctorado: Cáncer: Biología y Clínica
Full text
Papel de MVP en la reparación del ADN, la progresión tumoral y la hipoxia en carcinoma cervical: impacto pronóstico Fausto Góes Fontes Neto Tesis Doctoral Universidad de Las Palmas de Gran Canaria Diciembre de 2010
PROGRAMADEDOCTORADO CÁNCER:BIOLOGÍAYCLÍNICA Título PapeldeMVPenlareparacióndelADN,laprogresión tumoralylahipoxiaencarcinomacervical:impacto pronóstico MemoriaqueparaoptaralgradodeDoctorporlaUniversidaddeLasPalmasdeGran CanariapresentaelLicenciado FaustoGóesFontesNeto Director Dr.PedroCarlosLaraJiménez ProfesorTitulardeCancerologíaGeneraldelaULPGC Codirectores Dra.MartaLloretSáez‐Bravo ProfesoraAsociadadeCancerologíaGeneraldelaULPGC Dr.LuisAlbertoHenríquezHernández ProfesorAsociadodeToxicologíadelaULPGC LASPALMASDEGRANCANARIA–DICIEMBREDE2010
EstetrabajohasidofinanciadoporelInstitutoCanariodeInvestigacióndelCáncer(ICIC)
PEDROCARLOSLARAJIMÉNEZ,PROFESORTITULARDECANCEROLOGÍAGENERALDEL DEPARTAMENTODECIENCIASCLÍNICAS,FACULTADDEMEDICINADELAUNIVERSIDAD DELASPALMASDEGRANCANARIA CERTIFICA: Queeltrabajodeinvestigacióntitulado“PAPELDEMVPENLAREPARACIÓNDEL ADN,LAPROGRESIÓNTUMORALYLAHIPOXIAENCARCINOMACERVICAL:IMPACTO PRONÓSTICO”,hasidorealizadoporDFAUSTOGÓESFONTESNETO,enelDepartamento deCienciasClínicasdelaUniversidaddeLasPalmas,bajosudirecciónyasesoramiento técnicoycientífico,yqueunavezrevisadalapresenteMemoria,laencuentraaptapara sudefensaantetribunal. Yparaqueasíconsteysurtalosefectosoportunos,extiendeelpresente certificadoenLasPalmasdeGranCanariaasietedeoctubrededosmildiez. Fdo:PedroCarlosLaraJiménez
MARTALLORETSÁEZ‐BRAVO,PROFESORAASOCIADADECANCEROLOGÍAGENERALDEL DEPARTAMENTODECIENCIASCLÍNICAS,FACULTADDEMEDICINADELAUNIVERSIDAD DELASPALMASDEGRANCANARIA CERTIFICA: Queeltrabajodeinvestigacióntitulado“PAPELDEMVPENLAREPARACIÓNDEL ADN,LAPROGRESIÓNTUMORALYLAHIPOXIAENCARCINOMACERVICAL:IMPACTO PRONÓSTICO”,hasidorealizadoporDFAUSTOGÓESFONTESNETO,enelDepartamento deCienciasClínicasdelaUniversidaddeLasPalmas,bajosudirecciónyasesoramiento técnicoycientífico,yqueunavezrevisadalapresenteMemoria,laencuentraaptapara sudefensaantetribunal. Yparaqueasíconsteysurtalosefectosoportunos,extiendeelpresente certificadoenLasPalmasdeGranCanariaasietedeoctubrededosmildiez. Fdo:MartaLloretSáez‐Bravo
LUISALBERTOHENRÍQUEZHERNÁNDEZ,PROFESORASOCIADODETOXICOLOGÍADEL DEPARTAMENTODECIENCIASCLÍNICAS,FACULTADDEMEDICINADELAUNIVERSIDAD DELASPALMASDEGRANCANARIA CERTIFICA: Queeltrabajodeinvestigacióntitulado“PAPELDEMVPENLAREPARACIÓNDEL ADN,LAPROGRESIÓNTUMORALYLAHIPOXIAENCARCINOMACERVICAL:IMPACTO PRONÓSTICO”,hasidorealizadoporDFAUSTOGÓESFONTESNETO,enelDepartamento deCienciasClínicasdelaUniversidaddeLasPalmas,bajosudirecciónyasesoramiento técnicoycientífico,yqueunavezrevisadalapresenteMemoria,laencuentraaptapara sudefensaantetribunal. Yparaqueasíconsteysurtalosefectosoportunos,extiendeelpresente certificadoenLasPalmasdeGranCanariaasietedeoctubrededosmildiez. Fdo:LuisAlbertoHenríquezHernández
Dedico esta tesis a mi novia Cyntia, mi hija Myla, mis padres Suzana y Fausto, mis hermanos Rodrigo y Caroline, mi sobrina Laís, mis tíos Ricardo y Virgínia y a todos los míos. Siempre estuvieron conmigo aún en la distancia. A D. Holmes Andrade, al Dr. Luis Gustavo Rosa Ferreira y al Dr. Wanderley Fraga (in memoriam).
Agradecimientos
Agradecimientos Al profesor Dr. Pedro Carlos Lara Jiménez, director principal de esta Tesis Doctoral, por la confianza, ejemplo, estímulo, dedicación y competencia, además de una magnífica dirección de este estudio multidisciplinar, lo que propició el desarrollo de esta Tesis. Al Instituto Canario de Investigación del Cáncer (ICIC), con especial mención al profesor Dr. Nicolás Díaz Chico, por haber sido un factor imprescindible para la realización de este trabajo. A los co-directores de esta Tesis Doctoral, Dr. Luís Alberto Henríquez Hernández y Dra. Marta Lloret Saéz-Bravo por la amistad y apoyo personal y la primorosa co-orientación de este estudio. A los doctores Beatriz Pinar Sedeño, Maria Auxiliadora Cabezón Pons, Gustavo González Machín, Bernardino Clavo Varas, Ana Ruíz Alonso, Elisa Bordón Rodríguez, Cristina Bilbao Sieyro, Agustín Rey, Jose Carlos Rodríguez Gallego y Maria Antonia Hernández Martín, por el incentivo y la colaboración directa, permitiendo un magnífico trabajo en equipo. A Araceli Caballero, de la Unidad de Investigación del Hospital Universitario de Gran Canaria Dr. Negrín, por ayudar a dar sentido a los datos encontrados en este trabajo. A todo el equipo del Laboratorio de Inmunología del Hospital Universitario de Gran Canaria Dr. Negrín, por el cariño, auxilio, comprensión y por soportarme durante tanto tiempo. A todo el personal del Servicio de Oncología Radioterápica del Hospital Universitario de Gran Canaria Dr. Negrín, en especial a Maria Dolores Rey-Baltar (Lola) por sus grandes consejos. A los increíbles profesores que tuve durante mi formación, ellos fueron los que despertaron mi inquietud por los caminos de la ciencia: Lúcia Castro, Adhemar Longatto, Rita Goreti do Amaral, Silvia Helena Rabelo dos Santos, Márcia Cirilo. A mis amigos Eduardo Simas, Plínio Lawinsky, Alfredo Luxán y Valéria Mariotti. A los pacientes, sus historias personales con el eterno “plantar cara” a los desafíos diarios y sus estimulantes ganas por la vida. A todos los amigos, profesores, médicos y personal que ayudaron en la realización de este trabajo y cuyos nombres no fueron mencionados. Deseo transmitirles mis más sinceros agradecimientos.
INTRODUCCIÓN 3 2. ETIOLOGÍA 2.1. Potencial oncogénico del Virus del Papiloma Humano (HPV) La infección por el HPV ocurre generalmente durante la actividad sexual, cuando el virus penetra a través de los microtraumas causados en el epitelio genital, particularmente a nivel de la zona de unión de los epitelios malpighiano y cilíndrico, conocido como unión escamo-columnar (JEC). Ésta es la zona anatómica del cuello uterino donde las células se muestran en mayor actividad de proliferación. Este contacto inicial permite la exposición al virus de las células basales que, por estar en constante proliferación, colabora con la multiplicación del genoma viral que hace uso del aparato génico del huésped para su multiplicación. (Gavillon et al., 2010). El virus penetra en la célula a través de cualquier tipo de solución de continuidad de la piel o mucosas y, por medio de una serie de reacciones, estimula el crecimiento de las células superficiales a partir de la replicación de las células basales. El crecimiento se hace por expansión clonal, pudiendo generar formaciones verrugosas en el epitelio. (Burd, 2003; Pereyra y Parellada, 2003). Una vez infectadas, las células epiteliales son transformadas por el HPV pudiendo aparecer fenómenos de hiperplasia. A medida que los virus maduran y sus partículas se agrupan, se produce una migración hacia la superficie. En consecuencia, se pueden encontrar virus completos en los estratos epiteliales superiores (Bibbo y Longatto, 2001). La asociación del HPV con las verrugas y las neoplasias genitales, ha quedado demostrada por la presencia de ADN y ARN del virus, en un alto porcentaje de los carcinomas epidermoides de cérvix, vagina y pene (Bibbo y Longatto, 2001). La unión del virus a la célula basal ocurre por intermedio de la proteína L1, presente en la cápside viral y en el extremo carboxi-terminal del receptor celular. La proteína ha sido aislada para los tipos virales 16-33 y con α-6-integrina para HPV 6. (Giroglou et al., 2001; Evander et al., 1997, Bousarghin et al., 2003). Tras la unión, se produce una internalización al citoplasma de la célula huésped. (Bousarghin et al., 2003). Durante el ciclo viral, se puede definir una infección productiva y otra no productiva. La primera, se trata de una infección en la que se amplifica la expresión de los genes virales tempranos (a través de la región codificante (URR)), los cuales permiten producir grandes cuantidades de copias del ADN viral. Esto ocurre cuando las
4 Papel de MVP en la reparación del ADN, la progresión tumoral y la hipoxia en carcinoma cervical: impacto pronóstico células basales en proliferación migran a los estratos parabasal y espinoso. (Frattini et al., 1994; Doorbar et al., 2000). En la infección no productiva, el genoma del virus se encuentra en la forma episomal o extracromosómica. En eso caso, el material genético del virus se encuentra localizado en los estratos basales, generando un bajo número de copias (entre 30 y 50 copias) por célula infectada. (Ruesch et al., 1998; Holmgren et al., 2005; Del Vecchio et al., 1992). Se ha sugerido que durante esta fase, el ADN viral podría estar difusamente distribuido por las células basales en proliferación y que la generación de un bajo número de copias impediría que el material génico del HPV fuera reconocido por los mecanismos de respuesta inmune (Ling Peh et al., 2002). 2.1.1. Proteínas que participan en la replicación de ADN viral Se han identificado dos proteínas virales que son productos completos de los genes E1 y E2. Las proteínas E1 son multiméricas con actividad ATPasa y helicasa con capacidad para unirse a las llamadas “regiones de origen de replicación” (ORI) contenidas en sitios específicos del ADN viral, formando un complejo de iniciación con la proteína E2, ciclinas (especialmente la E), quinasas dependientes de ciclinas (CDK) y α-DNA polimerasa. Este complejo se produce en la región p68, y participan además otras proteínas de la célula huésped (Conger et al., 1999; Masterson et al., 1998; Ciang et al., 1992; Ustav et al., 1991). El producto del gen E2 es una proteína dimérica activadora de la transcripción que se une a la proteína E1, formando un complejo proteico. Durante la formación de este complejo, E2 es fosforilado por acción de kinasas, generando mayor control transcripcional (Penrose et al., 2000). Además, se ha observado que la proteína E2 puede inhibir al promotor P97 del HPV 16 y al promotor P105 del HPV 18, que se localizan cerca de la región TATAbox, responsable de la transcripción de las proteínas E6/E7 y de esa forma, reduciendo significativamente la síntesis de los productos de los genes E6 y E7 (Desaintes et al., 1997). Se ha observado además que la proteína E2 actúa directamente promoviendo la síntesis de la proteína p53, favoreciendo la detención del ciclo celular entre las fases G1 y la apoptosis (Webster et al., 2000). La detención del ciclo celular en G2 se produce a través de la unión de su región intermediaria a ciclinas y kinasas dependientes de ciclinas, así como por el bloqueo de E7 (Raj et al., 2004). La integración viral ocurre debido a un clivaje entre los genes E1/E2, con la consecuente interrupción de lo control transcripcional ejercido por el gene E2. (Villa et al., 1998; Kalantari et al., 2001).
INTRODUCCIÓN 5 Aproximadamente el 30% del contenido proteico celular está constituido por la expresión de las proteínas E1-E4 cuando las células están infectadas por el virus (Davy et al., 2002; Raj et al., 2004). Estas proteínas forman complejos hexaméricos que, a través de su región N-terminal, se une a la red de citoqueratina celular produciendo su desestabilización. También producen cambios en el potencial de la membrana mitocondrial y otras alteraciones a nivel celular (Wang et al., 2004). El resultado de todos estos procesos, lleva a la desestructuración celular por la inestabilidad del citoesqueleto, produciendo daño mitocondrial y del metabolismo energético (Raj et al., 2004). La transformación de las células infectadas como consecuencia de la integración del genoma viral en la célula huésped ocurre a nivel del estrato espinoso. Este proceso conduce a una inhibición del promotor P97 o P105, responsables de mantener bloqueada la expresión de las proteínas E6 y E7, por lo que en última instancia se genera la síntesis sin restricción de estas proteínas virales (Bosch et al., 2002).La proteína E6 está compuesta de 150 aminoácidos y su función es de primordial importancia para garantizar la multiplicación de la progenie viral (Hausen et al., 2000), formando un complejo con el gen P53 y la enzima ubiquitina ligasa generando su degradación (Nakahara et al., 2002). El producto del gen p53 (localizado en el cromosoma 17), es la proteína p53 que, en condiciones normales permite detener el ciclo celular en la fase G1 en el caso de que sea detectada alguna alteración perjudicial para la célula y, de esa manera, impedir la proliferación de células potencialmente dañinas para el organismo. Esta función de p53 es mediada por el complejo p21cip1/WAF1 que inhibe las CDKs y activa el mecanismo de inducción de la apoptosis mediada por Bax. Por lo tanto, cuando la función protectora de p53 es alterada, en este caso por la acción de la proteína viral E6 del HPV, la célula dañada sigue viva y en proliferación, garantizando la multiplicación intracelular del virus (Hausen et al., 2000). Diversos trabajos demuestran una asociación entre p53 mutado y diversas enfermedades malignas (Lane DP, 1992/1993), así como la mayor eficiencia en la interacción de las proteínas E6 y E7 de los HPV 16 y 18 relacionados con cáncer (Efeyan y Serrano, 2007). La principal función de la proteína E7 del HPV de alto riesgo, es desregular el ciclo celular de la célula infectada, principalmente por la inducción de la transición de la fase G0/S. Esta desregulación se produce por la activación de
6 Papel de MVP en la reparación del ADN, la progresión tumoral y la hipoxia en carcinoma cervical: impacto pronóstico diversos genes celulares mediados por E7 así como por la interacción de esa proteína con las proteínas que regulan el ciclo celular (Kisseljov et al., 2000). Se sabe que existe una interacción entre la proteína E7 de los HPV de alto riesgo con las proteínas de la familia retinoblastoma (pRB), lo que permite que E2F (una familia de factores de transcripción) cumpla su papel en la activación constitutiva de los factores transcripcionales, llevando a la progresión del ciclo celular (Zur et al., 2000). Por lo tanto, la unión de E7 con pRb permite la expresión de genes como c-myc, α-DNA-polimerasa, PCNA, Ki-67, proteína de manutención de minicromosomas (MCM), p16, ciclina A y E, incluso la inactivación de p21 y p27 (Zur et al., 2000; Middleton et al., 2003). Otra importante proteína producida por el genoma viral es la E5. Se trata de una proteína hidrofóbica que puede expresarse tanto en la membrana celular como en el aparato de Golgi o el retículo endoplamático (Conrad et al., 1993). Poco se sabe acerca de E5, aunque se ha sugerido que juegue algún papel en la estimulación de la proliferación celular, interactuando con factores de crecimiento epidérmico, derivados de plaquetas, factor p 185-neu y factor estimulantes de colonias (Gu et al., 1995). Figura 1. Mecanismo de acción del virus del papiloma humano. Harald zur Hausen, 2002 (Nature Reviews Cancer. 2:342-350) El aparato génico de HPV asociado al genoma de la célula infectada caracteriza el potencial oncogénico del virus. Los productos virales de los oncogenes E6 y E7 son los principales protagonistas cuando reaccionan con las
INTRODUCCIÓN 7 proteínas controladoras del ciclo celular p53 y pRb, respectivamente. En respuesta a esa interacción, la célula infectada se transforma primero y se maligniza después. 3. FACTORES PRONOSTICOS CLASICOS 3.1. Edad El valor pronóstico de la edad en el carcinoma de cérvix no está del todo constatado. En un estudio realizado en 1300 pacientes con carcinoma de cérvix el pronóstico no cambiaba con independencia de la edad (Kyriakos et al., 1971; Berkowitz et al., 1979). No obstante, los resultados son contradictorios. Así, Prempree et al observaron una menor supervivencia en mujeres menores de 35 (Prempree et al., 1983). Esta contradicción puede explicarse por el análisis de Rutledge, que demostró una interacción entre la edad y el estadio en 250 pacientes menores de 35 años elegidos al azar e individuos controles (Rutledge et al., 1992). En otro estudio se evaluó 398 pacientes en estadio I y III de carcinoma cervical tratados con radioterapia. Los pacientes se dividieron en dos grupos, uno con pacientes de 35 a 69 años y otro con pacientes mayores de 70 años. Aunque la supervivencia libre de enfermedad a los 5 años y la supervivencia causa-específica eran comparables en los dos grupos, la recidiva tumoral y la muerte por cáncer era más frecuentes en el segundo grupo de pacientes (Mitchell et al., 1998). En otro reciente estudio, donde se incluyeron 125 pacientes con carcinoma cervical, las mujeres mayores de 65 años de edad tuvieron un aumento de riesgo de muerte de 3.39 veces, en comparación con las pacientes más jóvenes, después de ajustar por etapa avanzada de la enfermedad y la modalidad de tratamiento (Federico et al., 2010). 3.2. Anemia Diversos estudios han corroborado el impacto pronóstico de la anemia en el cáncer cervical (Petersen et al., 1995; Grogan et al., 1999; Caro et al., 2001). Sin embargo, otros estudios han observado que el papel de la anemia resulta de una asociación con otras variables clínicas como el volumen tumoral, y que la anemia no ejerce un impacto independiente (Fyles et al., 2000). En un estudio retrospectivo realizado en siete centros de Canadá, se observó que la anemia durante la radioterapia era más importante que los niveles de hemoglobina (Hb) antes del tratamiento (Grogan et al., 1999). Posteriormiente en un otro estudio realizado en 87 pacientes con cáncer de
8 Papel de MVP en la reparación del ADN, la progresión tumoral y la hipoxia en carcinoma cervical: impacto pronóstico cérvix, el nivel de hemoglobina durante la radioterapia fue el factor pronóstico más importante para la supervivencia y control local de la enfermedad (Dunst et al., 2003). 3.3. Volumen tumoral El estadio clínico sigue siendo el factor pronóstico más relevante en la mayoría de estudios realizados. Sin embargo, existen otros factores dependientes de las características del tumor que están tomando importancia en los últimos años y que están siendo objeto de estudio. Los más importantes son: el volumen tumoral, el grado histológico, la invasión estromal y la presencia/ausencia de ganglios afectos. El tamaño del tumor (diámetro clínico) está fuertemente asociado con el pronóstico en pacientes tratadas con radiación o cirugía. Son numerosos los estudios publicados que tratan de establecer una relación entre el tamaño y el volumen tumoral con el pronóstico del paciente (Dubben et al., 1998). Ambas variables han aparecido como factor independiente de supervivencia incluso en análisis multivariante (Landoni et al., 1995; Ogino et al., 1997). La importancia del tamaño tumoral en el pronóstico del cáncer cervical es tan importante que motivó que en la revisión de la clasificación hecha por la Federación Internacional de Ginecología y Obstetricia (FIGO) en 1995, se subdividiera el estadio IB en función de dicha variable, tanto por la mayor incidencia de metástasis ganglionares y extrapélvicas como por la menor supervivencia (Rotman et al., 1981; Álvarez et al., 1989). En un estudio reciente se analizaron 179 pacientes con carcinoma cervical avanzado tratados con radioterapia donde se observó que el volumen tumoral estaba asociado de forma significativa con la supervivencia global (P = 0.004) (Narayan et al., 2006). 3.4. Grado de diferenciación e histología La relación entre la supervivencia y el grado de diferenciación en el carcinoma escamoso y el adenocarcinoma cervical es controvertida, aunque en estudios recientes esta relación parece sólida (Yeh et al., 1999), especialmente para el adenocarcinoma (Grisaru et al., 2001; Chargui et al., 2006). Por lo general se considera que los adenocarcinomas tienen un peor pronóstico que los carcinomas escamosos (Davy et al., 2003), aunque este hecho no está absolutamente demostrado (Hopkins et al., 1991; Shingleton et al., 1995; International
INTRODUCCIÓN 9 Collaboration of Epidemiological Studies of Cervical Cancer, 2006). Alfsen y colaboradores analizaron 417 pacientes con adenocarcinoma y 88 con carcinoma de células no escamosas de cérvix, observando que el carcinoma de células pequeñas era el único subgrupo con importancia pronóstica independiente en pacientes con adenocarcinomas de cérvix uterino (P<0.001) (Alfsen et al., 2001). 3.5. Afectación ganglionar El estado de afectación de los ganglios linfáticos tiene gran importancia en la progresión de la enfermedad y en la supervivencia (Stehman et al., 1991). En función de los ganglios afectados y su localización, el pronóstico puede variar considerablemente. - Ganglios parametriales: la enfermedad parametrial con ausencia de ganglios pélvicos positivos, tiene escasa repercusión en la supervivencia (72% a los 5 años), pero si se asocia con ganglios pélvicos positivos, la supervivencia se reduce en un 44%. La existencia de afectación parametrial y de ganglios pélvicos positivos reduce la supervivencia en un 50% comparada con pacientes con ganglios negativos y sin afectación parametrial. - Ganglios pélvicos: En el estadio IB (FIGO), la presencia de ganglios pélvicos afectados reduce la supervivencia en un 32% (de una supervivencia media del 89% para los ganglios negativos a un 57% cuando son positivos). El impacto en la supervivencia depende prioritariamente del número, la localización y la posibilidad de resección de los ganglios afectados. En el estudio realizado por Uno et al., el estado de los ganglios pélvicos tuvo un impacto significativo en la supervivencia. La supervivencia global a los 5 años en pacientes con ganglios positivos y negativos fue de 52% y 89%, respectivamente (P = 0.0005). La supervivencia libre de enfermedad a los 5 años en pacientes con ganglios negativos, uno positivo y dos o más positivos fue de 83%, 61% y 31%, respectivamente (P=0.0001) (Uno et al., 2005). - Ganglios aórticos: la presencia de ganglios aórticos afectados es del 18% en casos de tumores localmente avanzados y ejerce un efecto en la supervivencia mayor que en el caso de ganglios pélvicos. Las metástasis paraórticas confieren un pronóstico desfavorable con supervivencias cercanas al 40% (Odunski et al., 2001).
10 Papel de MVP en la reparación del ADN, la progresión tumoral y la hipoxia en carcinoma cervical: impacto pronóstico 3.6. Otros factores pronósticos Grado de extensión tumoral: Se ha observado que el carcinoma de cérvix se extiende dentro del segmento uterino inferior y la cavidad endometrial en el 10-30% de los pacientes (Pérez et al., 1981). Se ha observado un descenso en la supervivencia y un aumento en la incidencia de metástasis, en aquellas pacientes con afectación endometrial por invasión del estroma endometrial o reemplazamiento del endometrio normal por carcinoma cervical (Pérez et al., 1998). Grado de invasión estromal: Se ha establecido una relación entre la profundidad de la invasión estromal y la supervivencia. Así, la supervivencia es del 86-94% en aquellos tumores con menos de 10 mm de invasión estromal; 71-75% en el caso de 1120 mm; y del 60% de supervivencia para los tumores con más de 20 mm de infiltración estromal (Delgado et al., 1989). Samlal y colaboradores confirmaban estos resultados en una serie de pacientes con estadios IB-IIA y ganglios negativos (p<0.01) (Samlal et al., 1997). Sin embargo, cuando se analizaban las pacientes con ganglios positivos, la invasión estromal perdía significación en el análisis multivariante. En un estudio posterior, la invasión estromal fue el único factor pronóstico de relevancia (Van de Putte et al., 2004). Invasión vascular: La invasión vascular linfática no es considerado un factor de gran relevancia pronóstica. En una revisión de 25 estudios evaluando un total de 6500 pacientes, solo tres de ellos pudieron demostrar que la invasión vascular linfática era un factor de riesgo independiente (Creasman et al., 2004). La presencia o ausencia de dicho factor se relaciona con procesos de metástasis linfática (Memarzadeh et al., 2003). Marcadores tumorales: Los marcadores moleculares, en relación con otros de tipo clínico, podrían aportar información relevante a la hora de definir el tratamiento más adecuado; y podrían además proporcionar información importante relativa a la supervivencia, la recaída y el pronóstico en general. Algunos de esos marcadores tumorales son: MVP, Ku70/80, p53, pRb, BAX, BCL2, IGF-1R entre otros.
INTRODUCCIÓN 11 4. FACTORES PRONÓSTICOS BIOLÓGICOS 4.1. Proliferación celular en cáncer de cérvix uterino El cáncer es una proliferación descontrolada de células con anomalías en su material genético (Lara et al., 2004). La proliferación celular está sometida, en primer término, a la presencia de factores externos como son los factores de crecimiento y las interacciones con otras células y nutrientes. Los factores de crecimiento son generalmente proteínas que actúan mediante uniones de alta afinidad a receptores, cuya función principal es la del control externo del ciclo celular, mediante el abandono de la quiescencia celular (G0) y la entrada en la fase G1 del ciclo celular, pudiendo realizar su función como inductores (IGF-1) o supresores (TGFβ) de la proliferación celular, promoviendo la diferenciación celular, la movilidad y la adhesión celular entre otros fenómenos. Estos factores de crecimiento actúan sobre la célula a través de mecanismos endocrinos, paracrinos o autocrinos. Cuando el factor de crecimiento se une a su receptor, se inicia una cascada de procesos bioquímicos, denominados sistemas de transducción de señales, que permiten la llegada de esta señal proliferativa hasta el núcleo. Allí, por inducción de la expresión de diversos mediadores, incluidas las ciclinas (especialmente la ciclina D), se favorece la proliferación celular. Sin embargo, cuando la señal proliferativa llega al núcleo, la división celular queda regulada por los llamados puntos de control del ciclo celular o check-points, que impiden la progresión de células dañadas y mantienen la homeostasis celular (Ivanchuk et al., 2004). El ciclo celular se divide en fases: La fase S y la fase M son fases que corresponden a la síntesis de ADN y mitosis. Ambas fases están separadas por la fase G1 (fase de crecimiento plástico de la célula) y G2 (fase de preparación para la división celular). Existe una gran variedad de proteínas que controlan y coordinan el ciclo celular. Las principales son las quinasas dependientes de ciclina (CDKs), que presentan en dos subunidades: - subunidad catalítica con actividad quinasa, que permite fosforilar proteínas - subunidad de unión al sustrato (Ciclinas)
12 Papel de MVP en la reparación del ADN, la progresión tumoral y la hipoxia en carcinoma cervical: impacto pronóstico Figura 2. Ciclo celular y principales proteínas involucradas en el mismo. (Disponible en: http://www.fisicanet.com.ar/biologia/informacion_genetica/ap1/ciclo_celular03.jpg) Las ciclinas son necesarias en diferentes momentos del ciclo celular, fluctuando sus niveles en las distintas fases del mismo. La fosforilación/defosforilación de la proteína codificada por el gen retinoblastoma (pRb) constituye el evento central en la regulación de este punto de control (restriction checkpoint). Cuando pRb está hipofosforilada inhibe a E2F, evitando que ésta induzca la expresión de genes que regulan la síntesis de ADN. La fosforilación de pRb impide su unión a E2F, que queda libre para promover la síntesis de ADN. Este punto de restricción está regulado por las CDKs, que a su vez se encuentran reguladas por inhibidores (CDKIs) y otros moduladores (Ivanchuk et al., 2004; DeWolf y Gaston, 2004). La síntesis de ciclina D es inducida por factores de crecimiento, y disminuida por inhibidores de la proliferación. La formación del complejo ciclina D-CDK4/6 provoca la fosforilación de pRb y posterior liberación de E2F. Además, el complejo ciclina D-CDK4/6 secuestra a los inhibidores de CDK2, lo que reduce el efecto inhibidor de los inhibidores de ciclinas sobre la ciclina E-CDK2, incrementando la capacidad de fosforilación de CDK2 sobre pRb y favoreciendo la proliferación celular (Masamha yBenbrook, 2009).
INTRODUCCIÓN 19 sin relación con otros factores pronósticos; y en uno de ellos, la expresión de IGF1R resultó ser un factor pronóstico desfavorable (Nakamura et al., 2004). Existen pocos estudios sobre la expresión de IGF-1R en carcinoma cervical. Steller observó que la expresión del IGF-1R estaba aumentada de tres a cinco veces en el tumor que en células normales y que dicho incremento en la expresión era un componente importante que controlaba la proliferación en células de carcinoma cervical (Steller et al., 1996). Efectivamente, estudios recientes demuestran que IGF-1R parece tener un papel relevante en la estimulación de la invasión y la proliferación tumoral en células de cáncer de cérvix (Shen et al., 2006). En un estudio realizado en 32 pacientes con carcinoma de cérvix, se observó una alta expresión de IGF-1R en el 87,5% de los casos, pero ninguna relación entre la expresión de IGF-1R y la edad, estadio y grado histológico de la paciente. En esta misma serie, los tumores de endometrio y epiteliales de ovario expresaban IGF-1R en el 91,3% y 80% de los casos (Hirano et al., 2004). En un estudio realizado sobre 60 pacientes con carcinoma cervical seguidas durante siete años, se observó que altos niveles de expresión de IGF-1R se relacionaban significativamente con un menor control local de la enfermedad, debido probablemente a fenómenos de quimio-radio-resistencia tumoral (Lloret et al., 2007). El bloqueo genético de IGF-1R en líneas celulares de cáncer de colon humano incrementa la eficacia a la quimioterapia por aumento de la tasa de apoptosis (Adachi et al., 2002). Además, usando anticuerpos antagonistas de IGF1R se incrementa el porcentaje de respuesta del tratamiento combinado con 5fluorouracilo (5-FU) y radioterapia externa en células de cáncer de colon (Perer et al., 2000). Actualmente hay en marcha nuevos estudios que pretenden incrementar la radiosensibilidad tumoral bloqueando los receptores de IGF-1R, pero también modificando otras dianas terapéuticas como HDAC, HSP90, PI3K y Ras (Chinnaiyan et al., 2006). 4.3.2. Ciclina D1 Como otras ciclinas, la ciclina D1 está implicada en el avance de la progresión del ciclo celular. Alcanza su pico de expresión durante la fase G1, al mismo tiempo que mantiene los niveles de CDK. El complejo ciclina D1-CDK4/6 fosforila pRb para liberar las células que están en fase G1 y favorecer la entrada en la fase S del ciclo celular. Este paso es impedido por los inhibidores de
20 Papel de MVP en la reparación del ADN, la progresión tumoral y la hipoxia en carcinoma cervical: impacto pronóstico quinasas dependientes de ciclinas (CDKI), como las proteínas p15, p16, p18 y p19, que interfieren de forma selectiva sobre el complejo ciclina D1-CDK4/6. La ruta CDKI/ciclinaD1/CDK4/pRb es uno de los puntos de control de la proliferación celular. Las alteraciones de esta ruta podrían acelerar la proliferación celular, aumentar la inestabilidad genómica y favorecer el desarrollo de células cancerígenas. En general, el aumento en la expresión de ciclina D1 se asocia con un peor pronóstico en carcinoma de células escamosas de diferentes localizaciones: cáncer esofaríngeo, cabeza y cuello, pancreático, tiroides y pulmón (Michalides et al., 1997; Ishikawa et al., 1998; Caputi et al., 1999). Sin embargo, en carcinoma cervical, esta asociación no es tan clara debido a que la expresión de ciclina D1 se encuentra disminuida por la acción del virus HPV (Bae et al., 2001). En un estudio publicado por Skomedal, se observó un aumento en la expresión de ciclina D1 en el 3% de los pacientes (Skomedal et al., 1999). Por su parte, Cho observó en carcinoma de células escamosas invasivo, una expresión significativamente baja (p = 0.004), especialmente cuando se asociaba con el HPV (Cho et al., 1997). Sin embargo, en un estudio posterior, se observó un aumento en la expresión de ciclina D1 en el 33.3% de los tejidos de carcinoma cervical (Cheung et al., 2001). Se ha observado expresión de ciclina D1 en lesiones intraepiteliales de bajo grado infectadas por HPV de bajo riesgo, pero no en lesiones infectadas por HPV de alto riesgo (Southern et al., 1998). Según Cheung, la baja expresión de ciclina D1 puede deberse a que en el carcinoma cervical la proteína E7 de HPV puede inactivar a pRb. Por ello, las mutaciones y/o amplificaciones de los reguladores del gen Rb, tales como ciclina D1, son poco frecuentes en cáncer cervical (Cheung et al., 2001). En un estudio posterior se observó que en carcinoma de cérvix, la ciclina D3 puede compensar los bajos niveles de ciclina D1, mientras que en otros tipos de cáncer, ambas isoformas pueden contribuir al fenotipo neoplásico (Skomedal et al., 2003). En pacientes con cáncer cervical en estadio temprano, la expresión de ciclina D1 no se correlaciona con los factores pronósticos de la enfermedad. Sin embargo, la expresión de ciclina D1 se correlacionaba con una baja supervivencia libre de enfermedad (p = 0.017), una baja supervivencia global (p = 0.018), y era un factor pronóstico para la recidiva de la enfermedad (p = 0.0004) (Bae et al., 2001). En otro estudio, 106 pacientes con carcinoma de células escamosas de cérvix uterino se correlacionaba con un peor pronóstico de la enfermedad
INTRODUCCIÓN 21 (Cheung et al., 2001). Bahnassy observó que la expresión de ciclina D1 se relacionaba con el tamaño tumoral y con el estadio, así como con la supervivencia global (p = 0.011). Concluyeron que el estadio (FIGO), ciclina D1, p53, Ki67 y p27 eran los principales factores pronóstico de la enfermedad (Bahnassy et al., 2007). En la misma línea, se ha observado también una correlación positiva entre la ciclina D1 y la proteína Ki-67, en 103 pacientes con carcinoma de células escamosas de cérvix uterino (Shiohara et al., 2005). No obstante, no se observó significación pronóstica en la expresión de ciclina D1 en 53 casos de adenocarcinomas de cérvix uterino (Suzuki et al., 2004). En un estudio con 43 pacientes con carcinoma cervical, el incremento de la ciclina D1 se asoció significativamente al tamaño tumoral (p = 0.003) y al estadio FIGO (p = 0.008), comportándose como un factor de mal pronóstico (Bahnassy et al., 2006). En un estudio posterior del mismo autor, se encontró asociación significativa entre el tamaño tumoral (p = 0.033), el estado de diferenciación celular (p = 0.047), la afección ganglionar (p = 0.021), el estadio FIGO (p = 0.011), la alta expresión de Ki-67 (p= 0.034), ciclina D1 (p = 0.011) y p53 (p = 0.04), y la reducción de p27KIP1 (p = 0.023); con una menor supervivencia global. En análisis multivariable, FIGO, Ki-67, ciclina D1, p53 y p27KIP1 fueron significativas (Bahnassy et al., 2007). 4.4. Proteínas reguladoras de la apoptosis en cáncer de cérvix uterino En 1885, Walther Flemming observó que la atresia del epitelio de los folículos ováricos se debía a una muerte celular con unos cambios nucleares característicos, a la que denominó cromatolisis y que constituían una nueva forma de muerte celular diferente Tabla 2. Relación de ciclina D1 con supervivencia en carcinoma epidermoide cervical Nº de pacientes Tratamiento Estadio Ciclina D1/ Supervivencia Skomedal (1999) 61 I-IV No Bae (2001) 28 CX Ib-IIa Si Cheung (2001) 106 CX I-IV Si Suzuki (2004)* 53 RT I-IVa No Shiohara (2005) 103 CX,RT/QT Ib+II/III+IV No Bahnassy (2006) 43 No I-IV No Bahnassy (2007) 43 No I-IV Si *Adenocarcinoma. CX: cirugía, RT: radioterapia, QT: quimioterapia
22 Papel de MVP en la reparación del ADN, la progresión tumoral y la hipoxia en carcinoma cervical: impacto pronóstico a la conocida hasta ese momento, la necrosis (Majno y Joris, 1995). En los años 70, Allison Crawford definió la “muerte celular programada en los tejidos normales durante la embriogénesis y el desarrollo”, concluyendo que este proceso era el mismo descrito por Flemming. Se le denominó apoptosis (del griego “cayendo”), para subrayar esa eliminación celular aislada (“como caen las hojas de los árboles”). Se postuló que el inicio inadecuado, o la inhibición, de la apoptosis podría influir en la génesis de enfermedades como el cáncer. Durante la apoptosis se produce i) la condensación de la cromatina con rotura del ADN internucleosomal (aproximadamente cada 180 pares de bases), ii) la condensación citoplasmática y iii) el encogimiento celular (manteniéndose las organelas prácticamente intactas). El fenómeno se puede observar por microscopía óptica con tinción de hematoxilina-eosina (Kerr et al., 1972), aunque también se puede estudiar por métodos más complejos (microscopio electrónico, citometría de flujo, ruptura de ADN). La apoptosis se puede iniciar en cualquier fase del ciclo, dependiendo de la célula y del tipo de estímulo. Durante la apoptosis, la célula sufre el daño principalmente a nivel del núcleo, sin producirse reacción inflamatoria y generalmente de forma aislada (Mikulski, 1994). Se caracteriza por ser un proceso biológico ordenado, que resulta necesario para evitar la sobreproducción celular, siendo de vital importancia durante la morfogénesis. Los términos apoptosis y muerte celular programada, son a menudo utilizados como sinónimos. Sin embargo, hay otros procesos de muerte celular como son la autofagia y la necrosis, en los que se han identificado a nivel molecular componentes que justifican la existencia de un programa de ejecución. A pesar de la idea de que la muerte celular programada genéticamente requiere de la síntesis proteica, todos estos procesos (apoptosis, autofagia, necrosis) parecen estar listos previamente para ser ejecutados, lo que sugiere que la definición de muerte celular programada englobaría todos los casos (Lockshin & Zakeri, 2001). Durante la necrosis, la muerte va acompañada de un aumento del volumen celular, vacuolización del citoplasma, aumento de la permeabilidad de la membrana plasmática y lisis nuclear, sin fragmentación específica de la cromatina. Esta forma de muerte celular, se produce en respuesta a daños importantes causados por isquemia e hipoxia severas o por exposición a dosis elevadas de compuestos genotóxicos, que afectan al metabolismo energético celular. La muerte celular por autofagia es un proceso menos estudiado, que se caracteriza por la destrucción de componentes celulares dentro
INTRODUCCIÓN 23 de la célula en vacuolas autofágicas. Las características morfológicas de la autofagia incluyen vacuolización, degradación del contenido citoplásmico y ligera condensación de la cromatina (Fink & Cookson, 2005). 4.4.1. Proteínas reguladoras El proceso de apoptosis tiene una regulación compleja. En principio, cualquier célula tiene capacidad para entrar en apoptosis. La pérdida de integridad de las uniones intercelulares, las hormonas y factores de crecimiento, los impactos ambientales (agentes químicos, radiaciones ionizantes e isquemia) y el sistema inmune, son algunos de los desencadenantes extracelulares de la apoptosis. Estos agentes actúan a través de receptores de membrana, receptores intracelulares o de manera directa sobre el núcleo, dando lugar a la liberación o inhibición de reacciones intracelulares que conducen a la fragmentación del material genético y a la muerte celular (Raff, 1992). Existen decenas de genes implicados en la apoptosis. Los genes cuya expresión promueven la supervivencia celular, disminuyendo la susceptibilidad a la apoptosis, se llaman oncogenes, destacando entre ellos Bcl-2. Aquellos que promueven la apoptosis se les denominan genes supresores, entre los que destaca p53 y el gen del retinoblastoma. La mutación y/o el cambio en la expresión de estos genes, pueden provocar un desequilibrio en el destino celular, de forma que una célula sana podría ser eliminada erróneamente, mientras que una célula con aberraciones genéticas podría quedar protegida, perpetuándose en su descendencia las mutaciones potencialmente carcinogénicas. Anomalías o ausencia de Bcl-2 podrían dar como resultado un acortamiento de la supervivencia celular. Sin embargo, un incremento en su expresión produciría un alargamiento de la misma, mientras que mutaciones o ausencia de p53 producirían una ausencia de muerte celular por apoptosis. De manera didáctica, el daño nuclear inducido aumentará la expresión de p53. Su mensaje apoptótico será alentado por Bax y contrarrestado por Bcl-2. p53 centraliza la coordinación de otros procesos relacionados con el daño celular, como son la reparación de daños en las bases o roturas dobles de cadena, la progresión del ciclo celular y la muerte por apoptosis. A p53 se la conoce comúnmente como el “guardián del genoma”, porque mantiene la estabilidad genética celular (Levine et al., 1991). Su relación con el cáncer es bien conocida, tanto por su frecuencia de alteraciones
24 Papel de MVP en la reparación del ADN, la progresión tumoral y la hipoxia en carcinoma cervical: impacto pronóstico (más del 50% de los tumores muestran alteraciones en p53), como por la frecuencia de aparición de tumores en personas con mutaciones germinales de p53 (Síndrome Li-fraumeni). Además, en tumores sin mutaciones del gen, la función de p53 puede estar alterada debido a su secuestro citoplasmático por oncoproteínas virales (HPV-E6) (Morris, 2002). P53 es una proteína de 393 aminoácidos cuyo gen codificador se encuentra en el cromosoma 17 y que puede ser dividida en varios dominios discretos (May & May, 1999): • En el domino N-terminal se encuentran: - Dominio transactivador (TA), en el cual las interacciones entre proteínas, facilitan o bloquean la capacidad de transactivación de p53. - Región poliprolina, que podría mediar las funciones apoptóticas de p53 y la supresión del crecimiento celular independiente de transcripción. - Nuclear Export Signal (NES), relacionada con el transporte de p53 desde el núcleo al citoplasma para su degradación mediada por MDM-2. • El dominio central contiene: - La secuencia específica de unión al ADN, que permite la unión de p53 con los sitios promotores de genes diana como p21 (WAF1/Cip1). - Cuatro regiones conservadas que regulan las interacciones proteína-ADN. En esta región ocurren más del 90% de las mutaciones identificadas en cánceres humanos. Algunas mutaciones limitan la actividad de transcripción de p53 y otras tienen la capacidad de transactivar genes específicos como c-Myc (proliferación celular), MDR-1 (resistencia a drogas), tolerancia al estrés celular, radioresistencia relacionada con mejoras en la capacidad de reparación del ADN o inhibición de la apoptosis (Sigal et al., 2000). Además, se producen uniones a otras proteínas de tipo i) inhibidoras de p53 (SV40 Large T antigen protein), ii) favorecedoras de la misma (P53BP1/2) o iii) proteínas de reparación (BRCA1, BLM y Rad51) que facilitan la reparación homóloga de las roturas dobles de cadena del ADN inducidas por acción de la radiación. • El dominio C-terminal incluye: - Un dominio de oligomerización que permite la óptima configuración de p53 en forma de tetrámeros.
INTRODUCCIÓN 25 - Una región de señalización de localización nuclear (NLS) relacionada con la translocación de p53 desde el citoplasma al núcleo. - Una región de unión con secuencias no específicas de ADN y roturas dobles de cadena inducidas por radiación ionizante, permitiendo el reconocimiento del ADN dañado y favoreciendo su papel en la reparación del daño mediado por XPD, XPB, BLM, Rad51, etc. (Cuddihy y Bristol, 2004). En condiciones fisiológicas, p53 muestra bajos niveles de la proteína con una vida media corta (10-20 minutos). El recambio viene controlado por la proteolisis inducida por MDM-2. En caso de daño al ADN, p53 se acumula y se activa, desarrollándose un complejo sistema de regulación (Ashcroft & Voudsen, 1999). La proteína Bcl-2 consta de 239 aminoácidos y su gen codificador está en el cromosoma 18. Contiene cuatro dominios estructuralmente conservados: BH1, BH2, y BH3 que son necesarios para interaccionar con otros miembros de la familia Bcl-2, y dominio BH4 que media las funciones de control del ciclo celular. Existe un dominio transmembranal de gran importancia funcional, necesario para la localización subcelular de Bcl-2 (Belka & Budach, 2002). En condiciones normales, la expresión de Bcl-2 disminuye cuando las células están maduras o cuando tienen que ser eliminadas, mientras que se expresa en células que deben sobrevivir (células hematopoyéticas precursoras y células del sistema nervioso). Bcl-2 tiene un importante papel en la embriogénesis, donde la mayoría de las células expresan altos niveles de esta proteína (Jacobson et al., 1997). En general, las células que expresan Bcl-2 bloquean la apoptosis y promueven la supervivencia celular, facilitando la adquisición de mutaciones y la transformación maligna (Vaux et al., 1988; Pezzella & Gatter, 1995). Bcl-2 inhibe la apoptosis (Hockenbery et al., 1991) bloqueando el citocromo C liberado por la mitocondria durante la ruta de apoptosis mitocondrial (Brustugun et al., 1998). Bax (Bcl-2 associated X protein) es una proteína cuyo gen codificador está en el cromosoma 19. Aunque posee una alta homología con la proteína Bcl-2, carece del dominio BH4. Participa en la ruta de apoptosis mitocondrial induciendo la liberación del citocromo C. Bax se asocia con el complejo del poro de la mitocondria, que participa en la regulación del Ca2+ de la matriz, pH, potencial de
26 Papel de MVP en la reparación del ADN, la progresión tumoral y la hipoxia en carcinoma cervical: impacto pronóstico membrana mitocondrial, etc. La proteína Bax se une a un componente de este complejo induciendo la apertura del poro con la consiguiente rotura del potencial de membrana mitocondrial y la liberación de moléculas pro-apoptóticas como el citocromo C (Marzo et al., 1998; Narita et al., 1998; Susin et al., 1999). Bcl-2 interactúa con Bax a nivel de la mitocondria modulando la inactivación de Bax a través de la heterodimerización. Cuando la proteína Bcl-2 está en exceso forma homodímeros Bcl-2/Bcl-2 y heterodímeros Bcl-2/Bax, quedando la célula protegida de la apoptosis. Pero cuando Bax está en exceso, dominan los homodímeros Bax/Bax y la célula es susceptible de apoptosis (Korsmeyer et al., 1993; Petros et al., 2004). Figura 3. Principales factores que influencian el ciclo celular y la apoptosis. (Disponible en: www.biocancer.com) Bax, Bcl2 y p53, son las principales proteínas involucradas en la apoptosis. No obstante, recientemente se ha descrito el papel que estas moléculas pueden tener en los procesos de reparación del ADN. Aparte de Bcl2, Ku70 es capaz de secuestrar a Bax desde la mitocondria, provocando una regulación negativa de la apoptosis. El mecanismo a través del cual se produce este fenómeno es el de ubiquitinación (Chang et al., 2008). Ku70 es una proteína fundamental en los procesos de reparación no homóloga del ADN, y se la considera además un relevante supresor de Bax (Sawada et al., 2003). Bcl2 por su parte, es capaz de inhibir los procesos de reparación homóloga reduciendo la actividad de la proteína Ku (Ku70/80). Bcl2 desorganiza de manera directa el complejo Ku/DNA-Pkcs, tanto in vivo como in vitro. Así, la supresión de la vía de reparación no homóloga al ADN por Bcl2 conduce a la acumulación de daño en el ADN, inestabilidad
INTRODUCCIÓN 27 genómica, y aumento de la probabilidad de desarrollo de procesos carcinogénicos (Wang et al., 2008). 4.5. Hipoxia en cáncer de cérvix uterino El microambiente tumoral está constituído por el flujo sanguíneo, la microcirculación, el aporte de oxígeno y nutrientes, el pH residual y el estado bioenergético y metabólico del tumor. Este microambiente influye en las características biológicas de los tumores, condicionando la tasa de proliferación celular, la capacidad de reparación de la lesión sub-letal o potencialmente letal, la inducción de la apoptosis, el potencial de invasión metastásico y angiogénico, la expresión de genes responsables de la resistencia a drogas, etc. También influye en la respuesta de los tumores al tratamiento radioterápico y/o quimioterápico (Lavey y Dempsey, 1993; Kumar, 2000). Entre un 50 y un 70% de los pacientes oncológicos, se someten a radioterapia en alguna fase de la enfermedad, con el objetivo de maximizar el control loco-regional del tumor y aumentar la supervivencia. Algunos estudios han demostrado que cerca de un 60% de los tumores de cérvix localmente avanzados, tienen áreas de tejido con hipoxia, las cuáles están heterogéneamente distribuidas dentro de la masa tumoral (Vaupel et al., 2001, Höckel et al., 2001). Aquellos pacientes con niveles elevados de hipoxia intratumoral, presentan un peor control de la enfermedad y una menor supervivencia que aquellos pacientes con tumores mejor oxigenados, en igualdad de estadio y tamaño tumoral (Lartigau, 2007). La hipoxia tumoral hace más resistentes a los tumores sólidos, frente a la radioterapia y quimioterapia, a través de mecanismos directos, indirectos o ambos: - Mecanismo directo: la hipoxia puede inducir directamente resistencia a la radioterapia por deprivación del oxígeno molecular. - Mecanismo indirecto: las moléculas de O2 reaccionan rápidamente con los radicales libres producidos por la radiación, produciendo fenómenos de ionización y excitación de átomos y moléculas originando radicales altamente reactivos, tales como los radicales peroxilo (RO2·), hidroxilo (OH·) y superóxido (O2 .), que causan la destrucción de las biomoléculas con la consecuente muerte celular generada por el efecto radiobiológico inicial (Wolff, 1981; Hellman y Rosenberg, 1999).
28 Papel de MVP en la reparación del ADN, la progresión tumoral y la hipoxia en carcinoma cervical: impacto pronóstico Por tanto, en presencia de oxígeno, el daño causado al ADN por la radiación se mantiene, mientras que en ausencia de oxígeno el efecto radiobiológico disminuye, debido a que decrece la formación de radicales altamente reactivos en las macromoléculas y estructuras celulares. La hipoxia tumoral depende de distintos factores: tamaño tumoral, tipo histológico, estadio, aporte de hemoglobina y extensión de la necrosis. La hipoxia aparece cuando el tamaño del tumor supera la capacidad de la micro-circulación del mismo para aportar el oxígeno necesario a las células tumorales. Varios estudios muestran que el grado de hipoxia es mayor en la área tumoral que en los tejidos adyacentes normales (Clarke y Pallister, 2005; Varlotto y Stevenson, 2005). La relación entre hipoxia tumoral y evolución o gravedad del proceso neoplásico se puede explicar por 3 hipótesis: 1) La hipoxia puede inducir cambios en la expresión de las proteínas dependientes de oxígeno tumoral, resultando en estímulo de la angiogénesis y aumento del potencial de crecimiento del tumor y de la metastatización. 2) La hipoxia impediría la formación de moléculas reactivas de oxígeno que, cuando están sometidas a la radioterapia, causan daños en el ADN de las células tumorales. De esta manera, la reducción de los niveles de oxígeno contribuye a la resistencia frente a la radioterapia. 3) La hipoxia puede producir un crecimiento acelerado de las células tumorales resistentes a la apoptosis, dificultando el proceso de curación y control de la enfermedad (Clarke y Pallister, 2005). La hipoxia tumoral podría aumentar la expresión del gen supresor p53, un fenotipo celular que presenta un mayor potencial de malignidad (Littlewood, 2001). También se ha descrito que determinados factores relacionados con la perfusión, difusión o anemia, pueden producir hipoxia (Höckel et al., 2001; Vaupel et al., 2001 y 2002). La hipoxia relacionada con la perfusión (aguda) se produce por una circulación sanguínea inadecuada en los tejidos. La microvascularización de los tumores posee anormalidades estructurales y funcionales generando una red vascular desorganizada con dilataciones, formas tortuosas y alargadas, ausencia de regulación del flujo, etc. La hipoxia relacionada con la difusión (crónica) ocurre por el aumento de la distancia de difusión. Como resultado se produce un inadecuado suplemento de O2 en las células distantes (>70μm) de los vasos sanguíneos nutricios. La hipoxia relacionada con la
INTRODUCCIÓN 35 pacientes con hipoxia tumoral, así como peor respuesta al tratamiento en pacientes con tumores hipóxicos (Höckel, 1996). Posteriormente, el mismo grupo observó que los tumores cervicales hipóxicos y con bajos índices de apoptosis mostraban gran capacidad de extensión linfática y de recurrencia con independencia del tratamiento; demostrando, por lo tanto, el comportamiento agresivo de esos tumores (Höckel et al., 1999). Por su parte, Fyles confirmó la relación entre hipoxia, recaída y supervivencia en pacientes con cáncer cervical (Fyles et al., 1998). Knocke et al, comparando pacientes con tumores en distinto grado de oxigenación (pO2 ± 10mmHg), encontraron que la supervivencia libre de enfermedad era distinta entre ambos grupos de enfermos (34 vs. 69%, respectivamente (p<0.02)). Además, el nivel de oxigenación, estadio y concentración inicial de hemoglobina se mostraron significantes en relación a la respuesta al tratamiento. También encontraron que la presencia de hipoxia está asociada con un peor control local así como menor respuesta a la radioterapia en pacientes con carcinoma cervical (Knocke et al., 1999). Los resultados relativos a la relación existente entre la hipoxia y el control de la enfermedad han sido reproducidos por otros autores. Presiones parciales de oxígeno <5mmHg, en 40 pacientes con cáncer de cérvix uterino, se correlacionaban significativamente con esta variable. Aquellos pacientes que presentaban estos bajos niveles de oxigenación antes de iniciar el tratamiento tuvieron una mayor probabilidad de control después de 50 meses de seguimiento que pacientes con mayor pO2<5mmHg (p<0.001). La oxigenación pretratamiento era el factor predictivo más importante para el control de la enfermedad, más importante que la oxigenación después de 2 semanas de radioterapia o los cambios en la oxigenación durante este tiempo. También encontraron relación significativa con la supervivencia libre de enfermedad (p = 0.004) y la supervivencia global (p < 0.0001) (Lyng et al., 2000). En análisis multivariante, Rofstad y colaboradores encontraron que los valores de pO2 por debajo del 5 mmHg eran el único factor predictivo significativo para el control loco-regional, la supervivencia libre de enfermedad y la supervivencia global. El fracaso del tratamiento fue principalmente resultado de la hipoxia inducida por la radiación (Rofstad et al., 2000). Estudiando 40 pacientes, Sundfør y colaboradores encontraron que la peor respuesta al tratamiento se asociaba con la baja tensión de oxígeno en tumor primario en los pacientes con carcinoma cervical avanzado. También identificaron los valores de pO2 por debajo de 5 mmHg como un importante factor pronóstico para el control loco-regional, la supervivencia libre de enfermedad y la supervivencia global (Sundfør et al., 2000). La supervivencia libre de progresión tumoral, tras 3 años de seguimiento para los pacientes con tumores con niveles de oxigenación
36 Papel de MVP en la reparación del ADN, la progresión tumoral y la hipoxia en carcinoma cervical: impacto pronóstico por debajo de 5 mmHg fue de un 37%, en comparación con el 67% observado en aquellos pacientes con tumores mejor oxigenados (p = 0.004) (Fyles et al., 2002). Hill midió los niveles de hipoxia tumoral antes y durante el tratamiento, y los relacionó con las medidas de Tpot y LI (Labelling Index) en pacientes con cáncer de cérvix uterino tratados con radioterapia radical. Observó una relación entre la medida de pO2 antes del tratamiento y la respuesta al mismo, aunque la re-oxigenación no mostró ninguna relación (Hill et al., 2003). Por otro lado, Nordsmark et al, en un estudio prospectivo, analizaron el valor pronóstico del oxígeno antes del tratamiento y no encontraron relación alguna entre la hipoxia y el control loco-regional o la supervivencia global. Solo el tamaño del tumor (por arriba de 5 cm) y bajos niveles de hemoglobina pretratamiento mostraron relación con una peor supervivencia global (Nordsmark et al., 2006). Tabla 4. p O 2 antes del tratamiento en relación con respuesta, recidiva y supervivencia libre de enfermedad en carcinoma de cérvix Nº de pacientes Estadio Tratamiento Respuesta Recidiva Supervivencia libre de enfermedad Höckel (1996) 103 Ib-IVb/IIa-IVa Cx y/o RT con/sin QT Si Si (AM) Fyles (1998) 74 IIa/Ib-IIIb RT Si Si (AU) Knocke (1999) 51 IIa, IIIa/Ib-IVb RT Si Si Lyng (2000) 40 IIa-IVa/Ib-IIIb RT Si Si (AU) Rofstad (2000) 32 IIa-IVa/Ib-IIIb RT Si Si (AM) Sundfør (2000) 40 IIa-IVa/Ib-IIIb RT Si Si (AM) Fyles (2002) 106 IIa/Ib-IIIb RT Si Si(AM)* Hill (2003) 28 Ib-IIIb RT Si Si (AM)* Nordsmark (2006) 127 Ib-IV RT, Cx, QT No (AU, AM) RT: radioterapia. Cx: cirugía. QT: quimioterapia. AM: análisis multivariante. AU: análisis univariante. *Solo en pacientes con ganglios negativos.
INTRODUCCIÓN 37 4.7. Angiogénesis en cáncer de cérvix uterino Las bases moleculares de la carcinogénesis y la metástasis han sido objeto de extensos estudios. La metástasis es la causa más importante en el fallo de los tratamientos oncológicos y, por consiguiente, de la muerte del paciente (Bibbo & Longatto, 2001). A través de un proceso lento y extremadamente complejo, las células neoplásicas adquieren la capacidad para escapar del tumor, entrar en el torrente sanguíneo y asentarse en otra zona del organismo. Este fenómeno necesita de la acumulación de distintas alteraciones genéticas y celulares, que llevarán a una pérdida del control del crecimiento celular, desregulación de la motilidad, proteólisis, modificación de la respuesta inmune y la angiogénesis. Las células tumorales interaccionan con la matriz celular a través de distintas glicoproteínas específicas, que actúan como receptores de superficie. Las células permanecen ancladas a su matriz celular a través de proteínas como las caderinas. Distintas enzimas glicolíticas y las proteasas, como las metaloproteinasas, las serinas proteasas, el uPA (urokinase plasminogen activator) y sus inhibidores (PAI-1,2,3) y las catepsinas, tienen un papel fundamental en la degradación de la membrana basal, en la migración celular y en la angiogénesis durante el fenómeno metastásico. Finalmente, para que la metástasis se complete, las células tumorales necesitan desprenderse de su tejido original, invadir el tejido adyacente y entrar en el sistema circulatorio (linfático o sanguíneo); sobrevivir a la respuesta del sistema inmunitario, llegar a otro órgano, extravasar el intersticio y después de inducir la angiogénesis, multiplicarse para formar una colonia metastásica (Meyer & Hart ,1998). La entrada de las células tumorales dentro de los vasos sanguíneos, da lugar al inicio de la diseminación de las células cancerígenas desde el tumor primario a otros órganos. Esta primera fase no depende solo de las propiedades invasivas intrínsecas de la célula tumoral sino también de la presencia de una red vascular que forme parte del estroma. El crecimiento estimulado de nuevos vasos sanguíneos puede originarse de dos formas diferentes: 1.- El aumento del número de vasos sanguíneos aumenta el área de contacto entre las células tumorales y las rutas de escape potencial, de este modo se aumenta la probabilidad de extravasación. 2.- Los vasos sanguíneos tumorales desarrollan una morfología distinta al sistema vascular fisiológico facilitando la entrada de las células. Estos vasos son más largos, tortuosos y presentan huecos debido al fraccionamiento de la membrana basal y a un revestimiento incompleto de los pericitos.
38 Papel de MVP en la reparación del ADN, la progresión tumoral y la hipoxia en carcinoma cervical: impacto pronóstico La propagación hematógena de las células cancerígenas puede ocurrir como resultado de la metástasis linfática, no solo sanguínea. Debido a que el sistema linfático drena al sistema venoso, y a que los ganglios linfáticos generan vasos sanguíneos aferentes y eferentes, las células tumorales circulantes por la linfa pueden entrar en la circulación sistémica sanguínea (Carmeliet et al., 2000). La angiogénesis está regulada por factores pro y anti-angiogénicos secretados por el tumor (Folkman et al., 2003). Está principalmente inducida por rutas de señalización transformante y por la hipoxia tumoral, lo que provoca el aumento en la expresión de factores angiogénicos tales como VEGF y PLGF. Además, varios tipos de células del estroma tumoral parecen contribuir en la angiogénesis: - Las células endoteliales secretan factores angiogénicos que afectan al estado de activación del endotelio y su diferenciación dentro de los vasos maduros. - Los macrófagos y células mastoides secretan factores angiogénicos (VEGF, FGF-2, TGF-β y IL-8, y MMPs) que activan formas latentes de estos factores de crecimiento. - Los fibroblastos asociados al cáncer secretan factores de crecimiento adicionales. - Las citoquinas y quimioquinas modulan la matriz extracelular y las células del sistema inmune o de la homeostasis tisular (Bergers et al., 2003; Joyce et al., 2005). 4.7.1. Factor de crecimiento vascular endotelial (VEGF) VEGF es considerado uno de los factores más importantes en la angiogenesis tumoral, y es el único mitógeno que actúa sobre las células endoteliales de los vasos sanguíneos. Se une a dos receptores tirosina kinasa: VEGFR-1 y VEGFR-2, siendo este último el principal mediador de los efectos mitogénicos, angiogénicos y de incremento de la permeabilidad de VEGF. VEGFR-1 tiene capacidad para secuestrar a VEGF y prevenir su interacción con VEGFR-2 (Ferrara et al., 2004). Hay datos que sugieren que VEGFR-1 desempeña un rol relevante en la hematopoyesis y en el reclutamiento de monocitos y otras células que pueden residir en los vasos tumorales y promover la angiogénesis (Hattori et al., 2002; Gerber et al., 2002). VEGFR-1 está relacionado con la inducción de metaloproteinasas de la matriz (MMPs) y con la liberación
INTRODUCCIÓN 39 paracrina de factores de crecimiento desde células endoteliales (Le couter et al., 2003). La expresión génica de VEGF se ve aumentada por la hipoxia, a través de HIF-1 (Safran et al., 2003); así como por otras citoquinas como βFGF (fibroblast growth factor beta), factor de crecimiento tumoral (TGFα) y factor de crecimiento epidérmico (EGF). La mutación de p53 disminuye la transcripción de VEGF (Bouvet et al., 1998), lo que provoca una inhibición de la angiogénesis. Altos niveles de VEGF están relacionados con una peor respuesta en varios tipos tumorales incluyendo ovario (Paley et al., 1997; Yamamoto et al., 1997), mama (Linderholm et al., 1998), y pulmón (Fontanini et al., 1999). Sin embargo, el estudio de su expresión en relación a factores pronósticos clásicos en el carcinoma cervical no ha mostrado correlación en la mayoría de las series publicadas (Tabla 5). Tabla 5. Relación entre angiogénesis y factores pronósticos clásicos Nº de pacientes Tipo Histológico Tamaño (T) Estadio Invasión Vascular Ganglios Tokumo (1998) 73 Si No No Santin (1999) 8 Si Kodama (1999) 66 No No Si No No Loncaster (2000) 100 No No Tjalma (2000) 152 Si No Cheng (2000) 135 Si Si Si Lee (2002) 117 No Si Mitsuhashi (2005) 78 Si Si Si No Goncharuk (2009) 75 Si Si Si En pacientes con estadio IB y IIA de cáncer cervical, la cantidad de proteína VEGF aumentaba de forma significativa con el aumento del tamaño tumoral (p = 0.013), la invasión linfovascular (p = 0.003) y la metástasis ganglionares pélvica (p = 0.003) (Cheng et al., 2000). En pacientes con cáncer cervical estadio IB se observó que la metástasis ganglionar pélvica era significativamente más prevalente en pacientes con alta intensidad de VEGF que en aquellos con baja intensidad (Lee et al., 2002). Los datos referidos a la relación entre VEGF y el tipo histológico no son del todo claros. Se ha observado que la expresión de VEGF aparece aumentada en
40 Papel de MVP en la reparación del ADN, la progresión tumoral y la hipoxia en carcinoma cervical: impacto pronóstico los adenocarcinomas en comparación con los carcinomas epidermoides (Tokumo et al., 1998), aunque estos resultados son contradictorios (Tjalma et al., 2000, Mitsuhashi et al., 2005). Se ha observado que los niveles de VEGF son mayores en los pacientes que en los controles sanos (p = 0.0002). Además, en carcinomas epidermoides, las concentraciones de VEGF aumentaron significativamente (pacientes frente a controles p <0.0001), al contrario que en los adenocarcinomas (pacientes frente a controles p = 0.298). Los niveles de VEGF estaban directamente relacionados con el tamaño del tumor y con el estadio, pero no con la metástasis ganglionar (Mitsuhashi et al., 2005). Por su parte, los estudios de Loncaster y Lee no encontraron diferencias significativas entre la expresión de VEGF y el tipo histológico (Loncaster et al., 2000; Lee et al., 2002). En un reciente estudio, Goncharuk y colaboradores demostraron que la expresión de VEGF se correlacionada con el estadio (FIGO) de la enfermedad (RR = 0,52, p <0.05) y con el tipo histológico (la expresión de VEGF fue detectado en el 55,3% de los carcinomas de células escamosas y en el 68,4% de los adenocarcinomas). También se observó correlación entre la sobreexpresión de VEGF y el estado de los ganglios linfáticos de la pelvis (RR = 0,39, р <0.05). No se estableció asociación alguna entre la expresión de VEGF y metástasis a distancia (р> 0.05) (Goncharuk et al., 2009). Los niveles de VEGF aumentan progresivamente desde el epitelio normal a carcinoma de células escamosas invasivo (p < 0.0001), y se correlaciona con la proliferación (PCNA) en carcinoma in situ (p < 0.01) y carcinoma microinvasivo (p < 0.05) (Fujiwaki et al., 2000). Dai y colaboradores analizaron la expresión de VEGF en relación a diferentes tipos patológicos del cérvix, observándose una mayor expresión de la proteína en carcinoma de cérvix en comparación con el tejido normal, el tejido inflamatorio y la neoplasia intraepitelial CIN (p < 0.001) (Dai et al., 2005). En cuanto a la relación de VEGF con la supervivencia en carcinoma de cérvix, la mayoría de los estudios encuentran una relación significativa (Tabla 6). Estadios tempranos de carcinoma de cérvix presentan una expresión aumentada de VEGF, conformando un factor pronóstico independiente de supervivencia libre de enfermedad (p<0.001) y de supervivencia global (p=0.045) (Cheng et al., 2000; Loncaster et al., 2000; Lee et al., 2002; Gaffney et al., 2003), aunque hay resultados contradictorios (Tjalma et al., 2000). Kang y Hong mostraron en su estudio que la tasa de supervivencia a cinco años era de un 89% para el grupo
INTRODUCCIÓN 41 VEGF negativo frente a un 47% para el grupo VEGF positivo (p = 0,02) (Kang y Hong, 2004). En un estudio reciente donde se analizaron 150 pacientes con carcinoma de células escamosas y 152 CIN, se observó que VEGF-C mostraba un incremento lineal de su expresión, siendo menor para los CIN de bajo grado, aumentando en los CIN grado III y alcanzando los niveles mayores en cáncer. No obstante, VEGF-C no tuvo valor pronóstico para la supervivencia (Branca et al., 2006). Tabla 6. Relación entre VEGF y supervivencia en carcinoma de cérvix Nº de pacientes Estadio Supervivencia libre de enfermedad Supervivencia global Hawighorst (1998) 57 IA-IVB No (AU) Cheng (2000) 135 IB-IIA Si (AM) Si (AM) Loncaster (2000) 100 IB-IIIB Si (AU) Si (AU) Tjalma (2000) 152 IA-IVB No (AU) Lee (2002) 117 IB Si (AM) Si (AM) Gaffney (2003) 55 IB-IVA Si (AM) Si (AM) Ryu (2003) 47 I-IV No (AU) * Kang & Hong (2004) 42 IB-IV Si (AU) Gombos (2005) 111 IA-IB-IIA Si (AU) Branca M (2006) 302 I-IV No (AU /AM) AM: análisis multivariante. AU: análisis univariante. * Adenocarcinoma. 4.7.2. Medida de densidad de microvasos (MVD) La medición de microvasos intratumorales, constituye uno de los métodos utilizados para estimar la angiogénesis tumoral. Estos microvasos pueden identificarse utilizando técnicas de inmunohistoquímica que tiñen las células endoteliales. Mediante inmunohistoquímica (IHQ) es posible estimar la
42 Papel de MVP en la reparación del ADN, la progresión tumoral y la hipoxia en carcinoma cervical: impacto pronóstico vascularización intratumoral i) cuantificando microvasos, ii) determinando la distancia intercapilar y iii) la densidad de microvasos (MVD). Los anticuerpos más usados para ellos son los de tipo panendotelial, entre los que se encuentran el anti-CD31, el anti-factor VIII y el anti-CD34. El CD-31 identifica vasos largos y pequeños en el tejido normal y tumoral. El antígeno CD34 marca células endoteliales neoplásicas, aunque puede marcar, además, tumores vasculares, capa de músculo de la aorta, fibroblastos, estroma cervical, células linfáticas del endotelio y adipocitos, pudiendo interferir por tanto en el contaje de microvasos. El anticuerpo antifactor VIII detecta capilares pudiendo teñir además vasos linfáticos (Vieira et al., 2004). La angiogénesis valorada mediante MVD ha sido asociada con el pronóstico. Los tumores con una alta densidad de microvasos, tienen un peor pronóstico frente a los que tienen una menor densidad (Abulafia et al., 2000; Lenczewski et al., 2002). Los estudios de angiogénesis en los que se utiliza MVD en relación con factores pronósticos clásicos en el carcinoma cervical, no han mostrado correlación en la mayoría de las series publicadas (Tabla 7). En tres estudios se ha encontrado relación entre MVD y la presencia de afectación ganglionar (Bremer et al., 1996; Lenczewski et al., 2002; Cantu et al., 2003). Hockel y colaboradores analizaron el potencial angiogénico de las células neoplásicas y su posible relación con la malignidad del tumor y la vascularización primaria del tejido huésped en pacientes con cáncer cervical. Tabla 7. Relación entre MVD y factores pronósticos clásicos Nº de pacientes Método Tipo Histológico Tamaño (T) Estadio Invasión Vascular Ganglios Wiggins (1995) 29 Antifactor-VIII No Si No Bremer (1996) 144 Antifactor-VIII Si Avall-Lundqvist (1997) 113 Antifactor-VIII No Si (1) Si (2) No No Kaku (1998) 53(3) Antifactor-VIII No No No Zaghloul (2000) 40 Antifactor-VIII No No Höckel (2001) 52 Antifactor-VIII Si Lenczewski (2002) 73 CD34 Si Si Cantu (2003) 118 CD34 Si En-Lin S (2010) 159 CD34 Si Si (1) Estadios IB-IIA (p<0.05), (2) sólo entre estadios IB-IIA (p<0.01), (3) adenocarcinomas.
INTRODUCCIÓN 43 La densidad vascular del tumor periférico se relacionaba con la densidad vascular del estroma cervical normal y no dependía del tamaño tumoral, mientras que la densidad vascular del tumor era independiente de la densidad vascular del estroma cervical normal y disminuía con el aumento del tamaño tumoral (Höckel et al., 2001). Además, se vio que MVD era un factor pronóstico significativo para la supervivencia global y la supervivencia libre de enfermedad (Fox et al., 2001). En el estudio de En-Lin y colaboradores, los niveles de expresión de MVD y VEGF se correlacionaron positivamente con la expresión de EFEMP1 (Epidermal growth factor-containing fibulin-like extracellular matrix protein 1 ), una proteína que participa en el proceso angiogénico que además parece estar relacionada con metástasis a ganglios linfáticos, invasión vascular y con una pobre supervivencia global ( En-Lin S et al., 2010). La mayoría de los estudios publicados coinciden en considerar la neovascularización como un factor pronóstico independiente de la supervivencia en carcinoma cervical (Tabla 8). Así, cuanto mayor es la vascularización, menor es la supervivencia (Bremer et al., 1996; Dellas et al., 1997; Tjalma et al., 1998; Obermair et al., 1998), aunque hay trabajos publicados en los que no se estableció dicha relación (Avall-Lundqvist et al., 1997; Hawighorst et al., 1998). En el estudio de Cantu et al. se analizó la expresión de MVD en 118 pacientes con carcinoma epidermoide cervical en estadio II-III tratados con radioterapia. La supervivencia libre de enfermedad era menor para el estadio IIA con MVD>20 y para el estadio IIB (p = 0.0193, p < 0.05, respectivamente), pero no para los pacientes con estadio IIIB (p = 0.1613). Además, se observaba una menor supervivencia global en pacientes con MVD>20 (p = 0.0316). Aquellos pacientes con estadio IIA-B y MVD>20 presentaban una supervivencia global menor (p = 0.0008, p < 0.05, respectivamente). No ocurría lo mismo para el estadio IIIB (p = 0.14). Los pacientes menores de 40 años y MVD>20 tenían peor supervivencia global y supervivencia libre de enfermedad (p = 0.0029) (Cantu et al., 2003). En adenocarcinomas precoces de cérvix uterino, los pacientes con altos niveles de MVD tenían una peor supervivencia libre de enfermedad (p = 0.018) y supervivencia global (p = 0.019) que pacientes con un bajo MVD (Kaku et al., 1998). Estudios posteriores han confirmado estos resultados (Lee et al., 2004). Zaghloul y colaboradores analizaron 40 pacientes con carcinoma de cérvix escamoso tratados con radioterapia y observaron que la supervivencia libre de
44 Papel de MVP en la reparación del ADN, la progresión tumoral y la hipoxia en carcinoma cervical: impacto pronóstico enfermedad a los 3 años era del 18% para aquellos pacientes que tenían una medida de MVD por encima de la media, mientras que fue de 86% para aquellos pacientes con MVD por debajo de la media. Además, observaron una fuerte correlación entre el estadio IA y el nivel de MVD. Así, aquellos pacientes en estadio IA y baja expresión de MVD tenían una supervivencia libre de enfermedad a los 3 años del 100% (Zaghloul et al., 2000). Tabla 8. Relación entre MVD y la supervivencia Nº de pacientes Método Supervivencia causa-específica Supervivencia global Schlenger (1995) 42 Antifactor-VIII Si (AU/M) Si (AU/M) Rutgers (1995) 70 Antifactor-VIII No (AU) No (AU) Bremen (1996) 144 Antifactor-VIII Si (AM) Avall-Lundqvist (1997) 113 Antifactor-VIII No (AU) No (AU) Dellas (1997) 138 Anti-CD31 Si (AM) Obermair (1998) 166 Antifactor-VIII Si (AM) Tjalma (1998) 134 Anti-CD31 Si (AM) Davison (1998) 75 Anti-CD31 Si (AU) Hawighorst (1998) 33 Antifactor-VIII No (AU) Kaku (1998) 56 Antifactor-VIII Si (AU) Si (AU) Cooper (1999) 74 Antifactor-VIII Si (AM) Tjalma (2000) 152 Anti-CD31 Si (AU) Zaghloul (2000) 40 Antifactor-VIII Si (AU) Cantu (2003) 118 CD34 Si (AB) Si (AB) Lee (2004) 39 CD34 Si (AM) AM: análisis multivariante. AU: análisis univariante. Varios estudios han mostrado una correlación entre la MVD y la expresión de VEGF (Tokumo et al., 1998; Fujimoto et al., 1998), aunque hay autores que no han encontrado esa relación (West et al., 2001). Se ha visto que una elevada expresión de VEGF se asociaba a bajos niveles de MVD en pacientes con cáncer cervical invasivo (Tjalma et al., 2000). Además, hay estudios en donde se observa una relación significativa entre MVD, el estadio IA, la proliferación y la hipoxia tumoral.
INTRODUCCIÓN 51 Hay evidencias que sostienen que PAI-1 podría estar relacionado con la regulación de la apoptosis en células sanas y tumorales. Más concretamente, parece que esta proteína es un factor que favorece la supervivencia de las células tumorales (Kwaan et al., 2000), lo que ayuda a entender por qué los tumores que sobre-expresan PAI-1 tienen un peor pronóstico. Se ha observado que esta acción está relacionada con cambios en los niveles de expresión de proteínas antiy proapoptóticas de la familia Bcl-2 (Soeda et al., 2001). Aquellas líneas celulares de fibrosarcoma deficientes en PAI-1 crecen de manera más moderada que las no deficientes (Rømer et al., 2005). No obstante, las vías de señalización intracelular que median la acción anti-apoptótica de PAI-1 son desconocidas. Se sabe que PI3K/Akt está involucrado (Rømer et al., 2008). Es más, el silenciamiento de PAI-1 reduce el nivel de activación de Akt y hace a las células más sensibles a la apoptosis (Romer et al., 2008). No obstante, otros estudios han encontrado una relación inversa entre PAI-1 y Akt (Balsara et al., 2006; Kortlever et al., 2006). El tipo celular y la malignidad de la célula puede condicionar la acción final de PAI-1 sobre Akt. - Hipoxia y angiogénesis Los niveles de expresión de PAI-1 pueden verse intensamente aumentados bajo condiciones de hipoxia (Gertler et al., 1993), aunque los mecanismos postulados para explicar este fenómeno son varios. Se han identificado en la proteína distintos elementos de respuesta a hipoxia que sirven como lugar de unión para HIF-1 (Kietzmann et al., 1999; Zhang et al., 2004). A través del factor de transcripción SP1, existe un vínculo con otras vías de señalización mediadas por Smad3 y TGFβ, relacionadas con la modulación de la maquinaria transcripcional de la célula (Datta et al., 2000). La inhibición del sistema Erk MAP kinasa suprime la inducción de la expresión de PAI, sin modificar los niveles de HIF, cosa que no ocurre si lo que se inhibe es el sistema PI3 kinasa que afecta a ambos factores de transcripción (Zhang et al., 2004). Se ha observado en línea celular de hepatocito humano (HepG2), que IGF-1 es capaz de aumentar la expresión de PAI-1 a través de un mecanismo que incluye el aumento de los elementos de respuesta a hipoxia y de los niveles de HIF (Dimova et al., 2005). La inhibición de PI3 kinasa y de Erk1/2 kinasa, así como la inducción del dominante negativo Raf-1, eran capaces de suprimir el efecto inductor iniciado por IGF-1 (Dimova et al., 2005). Por el contrario, el factor estimulante USF-2A parece competir con HIF-1 por los elementos de respuesta a hipoxia de PAI-1, disminuyendo su expresión (Samoylenko et al., 2001). Por último, el factor de transcripción Net, parece ser
52 Papel de MVP en la reparación del ADN, la progresión tumoral y la hipoxia en carcinoma cervical: impacto pronóstico capaz de inhibir la expresión de PAI-1 en condiciones de hipoxia, aunque el mecanismo de acción aún es desconocido y se desconoce realmente el papel que esta molécula tiene (Fink et al., 2002; Gross et al., 2007). En cualquier caso, todos estos estudios moleculares se han llevado a cabo en distintas líneas celulares, y poco se sabe del efecto in vivo global. Los niveles de PAI-1 aparecen alterados en distintas patologías asociadas con la remodelación vascular. Existen diversos estudios que han sugerido que PAI-1 tiene un efecto estimulante sobre la angiogénesis (Isogai et al., 2001). En líneas celulares deficientes de PAI, la angiogénesis queda totalmente abolida, y puede ser restablecida mediante a adición exógena de PAI (Devy et al., 2002). La acción angiogénica de PAI parece ser dual y dosis-dependiente, de tal manera que a concentraciones fisiológicas parece tener un efecto pro-angiogénico, mientras que a altas concentraciones el efecto es anti-angiogénico (Devy et al., 2002). 4.9. Reparación del daño al ADN tras la radiación Las alteraciones en la secuencia del ADN pueden producirse por causas intrínsecas (errores en la replicación) o por cambios químicos espontáneos generados en las bases nitrogenadas. Los cambios más importantes se producen por errores ocasionados por i) agentes ambientales (químicos, radiación), ii) agentes biológicos (virus) y iii) otros agentes generados dentro de la célula durante el metabolismo (p.e.: especies reactivas del oxígeno). La reparación del daño es determinante para la supervivencia de la célula. Los defectos en la reparación del ADN pueden generar importantes alteraciones genéticas asociadas con múltiples enfermedades entre las que se encuentra el cáncer. Los tipos de daño que sufre el ADN son: formación de dímeros, formación de aductos, daño oxidativo de una base, entrecruzamientos intra e inter-catenarios, entrecruzamientos DNA-proteína, roturas simples y doble de la cadena de ADN. En una población celular normal el número de células debe mantenerse estable de manera que las pérdidas celulares por agresiones sean compensadas por la producción de nuevas células, a este comportamiento se le denomina cinética celular. Solo en los embriones y en los tumores existe un aumento real de células. La "Teoría del blanco" define la respuesta celular a la irradiación, y asume tres postulados: i) en las células de los organismos vivos existe una zona sensible denominada blanco celular (ADN), ii) la
INTRODUCCIÓN 53 ionización del blanco lleva a la inactivación de la célula irradiada y iii) la interacción entre radiación y blanco celular es de tipo probabilística. Las células eucariotas tienen una gran capacidad para reparar el daño que la radiación produce sobre el ADN, por ello cada impacto sobre la célula no lleva a la muerte de la misma (hacen falta varios impactos). Por ello, las lesiones que la radiación produzca sobre una célula pueden ser de varios tipos: Lesiones subletales: La lesión producida, no conlleva la muerte celular, sino que esas lesiones pueden ser reparadas por mecanismos enzimáticos. Lesiones letales: No pueden ser reparados. Son lesiones irreversibles que conllevan la muerte celular. Lesiones potencialmente letales: La lesión es grave y de muy difícil reparación. La reparación de los daños va a depender de los requerimientos de dicha célula (si se encuentra en reposo en mitad del ciclo celular, fundamentalmente). Así, dosis bajas de radiación sólo producen unas cuantas lesiones letales y producen muchas lesiones subletales que son fácilmente reparadas. A medida que aumentamos la dosis de radiación administrada, se produce un mayor número de lesiones letales, debido a la mayor acumulación de lesiones subletales, lo que conlleva igualmente a la muerte celular. Figura 4. Curva de supervivencia a la radiación de una población de células eucariotas. Existen distintos mecanismos de reparación del daño. Cada proceso de reparación posee un componente de reconocimiento del daño que es específico para cada tipo de lesión (Friedberg et al., 2003). Las bases dañadas pueden ser reparadas por excisión de un nucleótido (NER), por excisión de una base (BER) o mediante reparación mal emparejada (mismatch repair (MMR)). El daño inducido por la radiación en el DNA
54 Papel de MVP en la reparación del ADN, la progresión tumoral y la hipoxia en carcinoma cervical: impacto pronóstico implica, la expresión de dos protein-quinasas: ATM (Ataxia Teleangiectasia mutated) y ATR (ATM and Rad3-related). ATM es el mediador más importante del daño inducido por radiaciones ionizantes. ATR es el principal mediador del daño inducido por radiación ultravioleta. Una vez se ha producido el daño, ATM y ATR acumulan y activan a p53, uno de los principales reguladores del punto de restricción o "check point G1", que a su vez induce la sobreexpresión dep21/cip, un inhibidor de ciclina E/Cdk2, lo que induce la detención del ciclo celular en G1. Pero ATM y ATR también inducen el bloqueo del checkpoint en fase S, a través de la inactivación de Cdc25, un factor liberador de los complejos ciclina E/Cdk2 y ciclina A/Cdk2. Una vía alternativa con un mecanismo poco claro, es la que incluye la formación de una macroproteína (BRCA 1-associated genome surveillance complex) formada por ATM, NSB1 (Nijmegen Break Syndrome) y BRCA 1. Finalmente, el checkpoint de fase G2 es regulado primariamente por ATR, a través de la activación de chks1, que inhibe Cdc25 y por tanto mantiene inhibido el complejo ciclina B1/Cdk1, impidiendo la síntesis de DNA (Sun & Yang, 2010). La radiación ionizante produce una variedad de daños en el ADN tales como: daño oxidativo de una base, roturas dobles y simples de cadena (DSB y STB), así como múltiples daños locales a través de interacciones directas e indirectas. Las lesiones más complejas (DSB y lugares de daño múltiple) requieren de otras estrategias de reparación denominadas recombinación homóloga (HR) y no homóloga (NHEJ). La diferencia fundamental entre estos mecanismos de reparación es que la recombinación homóloga (HR) promueve una reparación del daño de manera precisa, copiando la información intacta de una cadena de ADN molde homóloga no dañada; mientras que NHEJ es un mecanismo independiente de la homología que simplemente une extremos rotos. NHEJ es el mecanismo predominante responsable de la reparación de la mayoría de las roturas dobles de cadena en las células somáticas. La proteína de reparación del daño, Ku, en este sistema de reparación es absolutamente esencial para el mantenimiento de la estabilidad genómica. Se ha visto que Ku participa en los mecanismos de proliferación y supervivencia de las células cancerígenas. La expresión de Ku se encuentra controlada de tal forma que la sobreexpresión de la proteína promueve fenotipos oncogénicos (incluyendo hiperproliferación y resistencia a la apoptosis), mientras que la baja/nula expresión de Ku conduce a una inestabilidad genómica y oncogénesis. Tales observaciones indican que Ku puede actuar tanto como oncoproteína como supresor tumoral (Gullo et al., 2006).
INTRODUCCIÓN 55 4.9.1. Proteína Ku70/80 La recombinación no homologa (NHEJ) necesita de proteínas de unión terminal que funcionan como factores de reparación. En este proceso participa la proteína Ku, formada por Ku70 y Ku80 (para algunos autores ku86), que junto con DNA-PKcs forman el complejo DNA-PK. La proteína heterodimérica Ku se encarga de unirse a los cortes del ADN sin discriminar la naturaleza del corte, y activa a DNA PKcs para que realice la reparación (Walker et al., 2001). Ku está presente de forma abundante en el núcleo, y además de estar implicada en la reparación del ADN, realiza funciones de mantenimiento de los telomeros y la apoptosis. Koike observó que Ku70 podía translocarse al núcleo sin necesidad de heterodimerización con Ku80 y de forma independiente a la autofosforilación con DNA-PK (Koike et al., 2000). Se ha sugerido que la amplificación y sobreexpresión de Ku70 puede modificar la función de Ku70 en el complejo DNAPK, afectando el mantenimiento de la estabilidad genómica y la reducción de frecuencia de mutaciones (Leskov et al., 2003). Por su parte Myung et al, mostraron que la pérdida de Ku86 (o Ku80) producía retraso en el crecimiento, hipersensibilidad a la radiación ionizante, aumento de los niveles de p53 y acortamiento de telomeros (Myung et al., 2004). Proliferación y apoptosis. Se ha demostrado que la proteína Ku puede estar presente en otras estructuras subcelulares. Ku70 inhibe la apoptosis uniéndose a la proteína pro-apoptótica Bax e inhibiendo su translocación a la mitocondria. Por lo tanto, Ku70 tiene una función citoprotectora en el citosol controlando la localización de Bax (Sawada et al., 2003; Chang et al., 2008). Bcl-2 regula negativamente la reparación de las roturas dobles de cadena de ADN interaccionando con los mecanismos de reparación no homóloga donde Ku70/80 es clave (Wang et al., 2008). Esta función antiapoptótica está mediada por el dominio carboxilo terminal de Ku70 y es independiente de Ku80. Además, la proteína Ku participa en los fenómenos de adhesión célula-célula y célula-matriz, participando en los procesos proteolíticos extracelulares a través de su interacción específica en la superficie celular a través de la metaloproteasa 9. Esto sugiere que la función de Ku en la superficie celular puede ser importante en la invasión tumoral (Muller et al., 2005).
56 Papel de MVP en la reparación del ADN, la progresión tumoral y la hipoxia en carcinoma cervical: impacto pronóstico El papel de Ku70/80 en la proliferación celular y regulación del ciclo de las células es menos evidente, existiendo muy poca bibliografía al respecto. El heterodímero Ku70/80 + DNA-PKcs aumenta la acción de la ADN ligasa IV. Esta proteína es importante para los fenómenos de reparación no homóloga (Espejel et al., 2002). Se ha observado que NHEJ puede ser un mecanismo responsable en la formación de las uniones de telómeros, fase esencial en el ciclo celular (Critchlow y Jackson, 1998), protegiendo a los segmentos finales de los cromosomas de posibles fusiones. Utilizando técnicas de inmunoprecipitación de cromatina, se ha observado que Ku70/80 y DNA-PKcs tienen un papel protector sobre los telómeros, y a la postre, sobre el ciclo celular (d'Adda di Fagagna et al., 2001; Hsu et al., 1999). Ku70/80 puede tener cierta importancia en los procesos de reparación de los telómeros antes del inicio de cada ciclo celular (Lansdorp, 2000). Hipoxia y angiogénesis. La relación entre la depleción de oxígeno y los niveles de Ku70/80 es controvertida desde el momento en que hay trabajos publicados que no han observado modulación alguna de NHEJ por la hipoxia (Bindra et al., 2004; Sprong et al., 2006). No obstante, otros autores han reportado modulación de la expresión de genes relacionados con NHEJ, entre los que estarían Ku, DNA-PKcs y ADN ligasa, entre otros (Meng et al., 2005). En un estudio realizado por nuestro grupo en pacientes con cáncer cervical, se observó una disminución de los niveles de proteína de Ku70/80 en cortes de tejido de aquellos pacientes que presentaban mayores niveles de hipoxia (Lara et al., 2008). Además, se observó una estrecha relación entre la hipoxia y la angiogénesis, probablemente mediada por VEGF. La inhibición de NHEJ a través de la disminución de Ku, unido a un aumento de la angiogénesis, podrían ser importantes mecanismos relacionados con la promoción y progresión tumoral. 4.9.2. Proteína Ku70/80 y radioterapia Los fenómenos que dañan el genoma inducen rutas que activan mecanismos de reparación del ADN, producen parada del ciclo celular y desencadenan la apoptosis. Entre los tipos de daño inducidos por la radiación ionizante, las roturas dobles de cadena (DSB) son las más letales. Brown et al, investigaron los efectos de la radiación gamma sobre los niveles celulares de la proteína Ku, observándose que la irradiación producía una
INTRODUCCIÓN 57 estimulación de los niveles celulares de Ku70 (que se acumulaba en el núcleo) pero no de Ku80. Además observaron que el aumento de Ku70 tras la irradiación utilizaba mecanismos dependientes de p53 y ATM. Sin embargo, la activación de DNA-PK no requería del aumento en los niveles de Ku70 (Brown et al., 2000). Los estudios que han analizado la relación entre el heterodímero Ku y la respuesta a la radiación ionizante en distintos tipos tumorales han dado resultados controvertidos. En un estudio realizado por Bjork-Eriksson, se evaluó la relación entre la expresión de los componentes de DNA-PK y la radiosensibilidad celular mediante la determinación de la fracción de supervivencia tumoral (SF2) en cánceres de cabeza y cuello. No se encontró relación alguna entre SF2 y la expresión de DNAPKcs o Ku70/80, lo que descartaba la determinación de la expresión inmunohistoquímica de DNA-PK en este tipo tumoral como ensayo predictivo de radiosensibilidad tumoral (Bjork-Eriksson et al., 1999). Sakata et al, analizaron la expresión de Ku70, Ku85, DNA-PKcs, XRCC4 y Nbs1 en tejido normal y tumoral (laringe, orofaringe, pulmón, mama, páncreas, entre otros) de 134 pacientes que desarrollaron diferente radiosensibilidad sin encontrar diferencias en la expresión de las proteínas entre el tejido canceroso y su tejido normal correspondiente, ni entre los tejidos tumorales con distinta radiosensibilidad (Sakata et al., 2001). Sin embargo, la expresión de Ku70 y la actividad DNA-PK se correlacionaba con la sensibilidad a la radiación en líneas celulares de cáncer esofágico (Zhao et al., 2000). En pacientes con carcinoma rectal, la sobreexpresión de las proteínas Ku70 y Ku80 se correlacionaba con la radio-resistencia tumoral (Komuro et al., 2002), y en un estudio posterior se observó que una alta proporción de células tumorales de carcinoma nasofaríngeo Ku70 positivas eran responsables del fenotipo radio-resistente de las células tumorales, reflejando la capacidad de Ku para reparar el daño del ADN en las células tumorales (Lee et al., 2005). En los estudios realizados en carcinoma de cérvix, tampoco se observa una clara relación entre la expresión del heterodímero y la respuesta a la radiación ionizante. Mediante análisis por microarrays se identificó un grupo de genes relacionados con la radiosensibilidad en carcinoma de células escamosas de cérvix, comparando los perfiles de expresión de 9 tumores radio-sensibles y 10 radio-resistentes obtenidos por biopsia antes del tratamiento. Las células deficientes en XRCC5 (gen que codifica para la proteína Ku80) eran hipersensibles a la radiación ionizante. De este modo, la sobreexpresión de este gen se observaba en células de cáncer radio-resistentes, siendo XRCC5 uno de
58 Papel de MVP en la reparación del ADN, la progresión tumoral y la hipoxia en carcinoma cervical: impacto pronóstico los genes más importantes en la determinación del destino de las células cuando se encuentran bajo estrés causado por la radiación (Kitahara et al., 2002). Algunos estudios, relacionan la expresión del heterodímero Ku con la supervivencia en carcinoma cervical (Tabla 10). Wilson et al., observaron en 53 pacientes con cáncer de cérvix uterino una relación entre la radiosensibilidad tumoral (medida mediante SF2) y la expresión de Ku70 (p = 0.057) y Ku80 (p=0.19). Todos los tumores con baja expresión de Ku70 y Ku80 eran radiosensibles. Además, se observó una mayor supervivencia en pacientes con baja expresión de Ku70 (p = 0.046). Esta diferencia también se observó para Ku80 pero no era estadísticamente significativa (p = 0.087). El hecho de que pacientes con una baja expresión de Ku70 tengan un mejor pronóstico de la enfermedad sugiere que los tumores con capacidad para reparar el daño son los que sobreviven y proliferan después del tratamiento (Wilson et al., 2000). Harima, por su parte, observó en 89 pacientes con carcinoma de cérvix uterino una diferencia significativa en la supervivencia global entre los pacientes que no expresaban Ku80 y aquellas que expresaban la proteína (p = 0.04). Aunque no se examinaron los niveles de Ku70, la estabilidad del polipéptido Ku80 es dependiente de la expresión de Ku70 en cáncer cervical. De este modo, en tejidos donde se expresaba Ku80 se admitía que Ku70 se expresaba de forma similar (Harima et al., 2003). En pacientes con carcinoma endometrial, aunque la supervivencia libre de enfermedad era significativamente mayor en pacientes con niveles por debajo del valor medio de Ku70 (p < 0.05), la supervivencia global no mostró diferencias significativas (Saygili et al., 2004). Tabla 10. Relación entre Ku70/80 y supervivencia en distintos tipos tumorales. Nº de pacientes Marcador Tipo de tumor Supervivencia libre de enfermedad Supervivencia global Wilson (2000) 77 Ku70 Cérvix Peor (AU) Komuro (2002) 96 Ku70/86 Rectal Peor (AU) Friedberg (2003) 79 Ku86 Amígdala Mejor (AU) Harina (2003) 89 Ku80 Cérvix Peor (AU) Saygili (2004) 81 Ku70 Endometrio Peor (AU) No (AU) Grabsch (2006) 242 Ku70/80 Colorrectal No No Pavón (2008) 75 Ku70 Cabeza/cuello Mejor (AU) Mejor (AU) AM: análisis multivariante. AU: análisis univariante.
INTRODUCCIÓN 59 En 66 pacientes con carcinoma nasofaríngeo tratados con radioterapia, se observó que la tasa de control locoregional a los 5 años era significativamente mayor en el grupo de pacientes con una baja expresión de Ku (p = 0.0042). Sin embargo, no se observaron diferencias significativas respecto a la supervivencia libre de enfermedad entre ambos grupos (Lee et al., 2005). En un estudio reciente realizado en carcinoma colorrectal no se encontró relación significativa entre Ku70/Ku80 y la supervivencia (Grabsch et al., 2006). Pavón y colaboradores observaron que los pacientes que expresaban altos niveles de Ku70 mostraban una mayor supervivencia libre de recurrencia local y una mayor supervivencia global (Pavón et al., 2008). En cuanto a la relación de Ku con factores clásicos de pronóstico, en la mayoría de los estudios no se observa relación significativa (Wilson et al., 2000; Harima et al., 2003). En el estudio de Korabiowska en pacientes con carcinoma de la cavidad oral, se observó una relación entre Ku70/80 y el grado tumoral así como con la afectación ganglionar. La expresión de Ku70 se observó en un 87.5% de los tumores de grado 1 y de grado 3 y en el 82.9% de carcinomas de grado 2. Ku80 se observó en el 87.5% de los tumores de grado 1, 82.9% de grado 2 y en todos los tumores de grado 3. Se observaron células Ku70 positivas en el 90.5% de los tumores sin afectación ganglionar y en un 80% de los tumores con afectación ganglionar. Además, se vieron relaciones similares en la expresión de Ku80 (Korabiowska et al., 2006). En cuanto a la relación con otros marcadores pronósticos no se han encontrado diferencias significativas. En el estudio de Wilson et al., se analizó la relación entre Ku y Ki67 sin observarse correlación entre la proliferación tumoral y la expresión de Ku70 o Ku80 (Wilson et al., 2000). 4.10. Proteínas de resistencia a drogas Las células tumorales insensibles a las drogas antineoplásicas poseen un fenotipo de resistencia a drogas. Las proteínas que pueden estar envueltas en esta resistencia están asociadas al transporte de xenobióticos: P-glicoproteína, la proteína 1 de resistencia a multidroga, la proteína de resistencia en cáncer de mama y la proteína relacionada con la resistencia en pulmón (LRP).
60 Papel de MVP en la reparación del ADN, la progresión tumoral y la hipoxia en carcinoma cervical: impacto pronóstico Varios mecanismos pueden contribuir a que se desarrolle una quimio-resistencia: • Amplificación o aumento de la expresión de la familia P-glicoproteína de transportadores de membrana (Ej: MDR1, MRP, LRP), los cuales favorecen la eliminación de la quimioterapia. • Cambios en las proteínas celulares envueltas en la detoxificación (ej: Dihidrofulato reductasa, metalotioneinas, glutation S-transferasa pi) o activación de drogas quimioterapéuticas (DT-diaporasa, citocromo P-450 reductasa). • Cambios en moléculas envueltas en la reparación del ADN (ej: DNA topoisomerasa II, p21WAF1/CIP1). • Activación de oncogenes tal como Her-2/neu, Bcl-2, Bcl-XL, c-myc, ras, MDM2 o mutación de p53. A la proteína LRP se la llamó posteriormente proteína vault mayor (MVP). MVP es el componente principal de las partículas vaults multiméricas. En su forma humana, el complejo Vault está compuesto por partículas de ribonucleoproteína que se encuentran en el citoplasma de las células eucarióticas y que se constituye por múltiples copias de tres proteínas: la proteína vault de mayor peso molecular (MVP) y dos proteínas vault menores (VPARP y TEP1), además de moléculas de ARN sin traducir. MVP supone más del 70% de la masa total del complejo (Steiner et al., 2006). Los estudios de vaults en mamíferos ha puesto de manifiesto que el complejo contiene al menos, cuatro componentes distintos (Kedersha et al., 1986): tres proteínas de alto peso molecular y varias moléculas pequeñas de ARN no traducido. La proteína Mr100.000 (masa relativa), conocida como major vault protein (MVP), domina la estructura y constituye más del 70% de la masa molecular del complejo. Dos proteínas adicionales, Mr193.000 y 240.000, componen las proteínas menores de vaults. Se ha observado que la subunidad Mr193.000 presenta actividad poli (ADP-ribosa) polimerasa (PARP), motivo por el cual ha esta unidad se la ha llamado vault PARP (VPARP o p193) (Kickhoefer et al., 1999). La subunidad Mr240.000 presenta cierta similitud con la proteína asociada a la telomerasa 1 (TEP1) (Kickhoefer et al., 1999). Además, esta subunidad de vault es compartida con al menos otro complejo de ribonucleoproteína, el complejo telomerasa. Por último, la vault ARN (vARN) representa aproximadamente el 5% de la masa total de vaults (Kedersha et al., 1986). Un modelo estequiométrico ha propuesto que cada partícula de vaults se compone por 96 moléculas de MVP, 8 moléculas de VPARP, 2 moléculas de TEP1 y al menos seis moléculas de vARN (Kong et al., 2000).
INTRODUCCIÓN 67 vesículas sináptica en las terminales nerviosas colinérgicas de la raya eléctrica (Herrmann et al., 1996). Sin embargo, en todos estos casos, la naturaleza de la función sigue siendo un enigma. Un estudio realizado en células de carcinoma de faringe, la cuales presentaban alta expresión de LRP, demonstró una posible participación de esta proteína en el transporte nucleocitoplamático de drogas, dando como resultado la presencia de un fenotipo de resistencia a multidrogas (MDR). Tanto las células de carcinoma de faringe sensibles como las resistentes fueron sometidas a diferentes concentraciones de benzopireno y de doxirrubicina. Tras verificar la distribución intracelular de estas drogas por microscopia de fluorescencia, se observó que las células sensibles presentaban un acúmulo más pronunciado en el núcleo (lugar de acción de estas drogas), que en el citoplasma, lo que resulta en una mayor sensibilidad a estos agentes. Por otro lado, las células resistentes presentaban mayor acúmulo en el citoplasma, alejándose, por lo tanto, de su sitio de acción. Este experimiento, así como otros, sugieren que MVP puede ser muy relevante en el desarrollo del fenotipo MDR (Cheng et al., 2002). Por su parte, Silva et al. publicaron que líneas celulares resistentes a multiples drogas (pulmón, mieloma y carcinoma de mama), presentaban niveles elevados de MVP. Es más, se ha demostrado recientemente que el MVP no es suficiente para originar al fenotipo MDR aisladamente. De hecho, vaults constituye un complejo de múltiples subunidades que necesitan interactuar para generar el fenotipo MDR (Siva et al., 2001). La proteína MVP puede ser encontrada fisiológicamente en el cólon, pulmónes, túbulos contornados proximales renales y corteza adrenal (Filipits et al., 2000). Además, se expresa intensamente en tejidos expuestos a agentes xenobióticos durante largos plazos; como el epitelio bronquial, la corteza adrenal y los macrófagos (Van Zon et al., 2003). MVP puede generar mayor o menor sensibilidad a la quimioterapia en distintos tipos tumorales, principalmente en el pulmón, asi como en leucemias, linfomas y tumores sólidos (Raaijmakers et al., 1998; Mossink et al., 2003; Schneider et al., 2001). También participa en la resistencia a la adriamicina, y se cree que pueda estar asociado con los fenómenos de resistencia algunos casos de neoplasias mamarias; aunque los mecanismos de acción subyacentes no han sido claramente dilucidados (Schneider et al., 2000).
68 Papel de MVP en la reparación del ADN, la progresión tumoral y la hipoxia en carcinoma cervical: impacto pronóstico Estudios en mielomas y otras neoplasias humanas, han visto relación entre la expresión de MVP y la resistencia a agentes alquilantes como el melfalano en el caso del mieloma multiple (Mossink et al., 2003; Raaijmakers et al., 1998). Además, la expresión de MVP en células tumorales está asociada a la resistencia a doxorrubicina, vincristina, carboplatino, etoposideo, paclitaxel y gramicidina D (Filipits et al., 2000). La expresión de MVP también ha sido asociada a una respuesta deficiente a la quimioterapia y a una menor supervivencia en caso de linfomas de células B, lo que sugiere que esta proteína pueda ser un factor de resistencia clínicamente relevante en casos de linfoma (Filipits et al., 2000). En el caso de leucemia mieloide aguda, se ha observado que existe una co-expresión de Pgp, MRP1 y MVP. Generalmente las peores respuestas al tratamiento y menores tasas de supervivencia son observadas en pacientes que co-expresaron estas proteínas. Además, el mejor pronóstico lo tenían aquellos pacientes negativos para esta co-expresión (Mossink et al., 2003). La existencia de la coexpresión de estas proteínas ya fue descrita previamente por otros autores en pacientes con carcinomas de ovario (Moran et al., 1997). En relación a los tumores sólidos, la expresión de MVP fue abordada en cáncer de ovário, mama y en neoplasias de epitelio bronquial, colon, recto, melanoma, osteosarcoma y neuroblatoma (Mossink et al., 2003). Así, pocos estudios han evaluado el papel de MVP en tumores sólidos. En el cáncer de ovario avanzado FIGO estadio III/IV, el 77% de los pacientes expresaban MVP en el momento del diagnóstico. También se ha observado una cifra similar en el mismo tipo de tumor localizado en estadios iniciales (FIGO estadio I/II). En el cáncer de ovario avanzado, se ha encontrado una correlación entre la expresión de MVP y la falta de respuesta al tratamiento así como con una supervivencia global más corta. Este resultado no se reprodujo en el cáncer de ovario en etapas tempranas. Por contra, la expresión MVP en cáncer de ovario en fase inicial se asoció con las variables de pronóstico más favorables (Izquierdo et al., 1995; Artes et al., 1999). En el caso del cáncer de mama, en dos estudios en que se utilizó la inmunohistoquímica para valorar la expresión MVP, se observó que la expresión varió de un 69 hasta un 75% sin diferencias significativas entre las muestras obtenidas al momento del diagnóstico o en recaída después de la quimioterapia (Linn et al., 1997). Un segundo estudio obtuvo resultados similares: 68% de los
INTRODUCCIÓN 69 pacientes con media/alta expresión de MVP (Pohl et al., 1999). Sin embargo, en ningún caso se observó correlación significativa con la evolución clínica. Otros tejidos que expresan un alto nivel de MVP son el epitelio bronquial, el intestino/recto, colon y otros tejidos epiteliales. En los cánceres derivados de estos tejidos, se constata una expresión variable de MVP. Por ejemplo, en el cáncer pulmonar de células no pequeñas y el de células pequeñas, la expresión es variable, siendo la más alta en el cáncer de pulmón de células no pequeñas quimiorresistentes (Dingemans et al., 1996). Al igual que en otros estudios, no se observó correlación con los parámetros clínicos o patológicos (Dingemans et al., 1996; Volm et al., 1997). En los tumores colorrectales se ha observado que la expresión de MVP aumenta en las lesiones premalignas, asi como en el adenoma de colon y el carcinoma de colon agresivo, lo que sugiere una asociación de este marcador con la agresividad de la patología (Izquierdo et al., 1996; Meijer et al., 1999). Otros tumores en los que se ha reportado la expresión de MVP son el melanoma, el osteosarcoma y el neuroblastoma (Ramani y Dewchand, 1995). En el melanoma, se ha observado una alta expresión que parece corresponder con el comportamiento agresivo del tumor, como en el melanoma coroidal primario (Schadendorf et al., 1995; van der Pol et al., 1997). Puesto que este tipo de tumor rara vez responde a la quimioterapia, la importancia de la resistencia a drogas sigue siendo poco clara. En el osteosarcoma, la expresión de MVP se correlaciona con fallo del tratamiento quimioterapico y una baja supervivencia (Uozaki et al., 1997). En el estudio de Izquierdo et al., en donde se midió la expresión inmunohistoquímica de LRP en tejidos normales y en 28 tipos tumorales, se observó que la frecuencia de LRP variaba según la quimiosensibilidad de los diferentes tipos de tumores (Izquierdo et al., 1996): - Bajas tasas en cáncer testicular, neuroblastoma y leucemia mieloide aguda. - Tasas intermedias en cáncer ovárico. - Altas tasas en cáncer de colón, de riñón y en carcinoma pancreático.
70 Papel de MVP en la reparación del ADN, la progresión tumoral y la hipoxia en carcinoma cervical: impacto pronóstico Un estudio posterior realizado en pacientes con cáncer de mama evidenció altos niveles de LRP/MVP en tumores primarios operables, tumores localmente avanzados, tumores localmente avanzados tras ser tratados con quimioterapia, y en tumores metastáticos resistentes a antraciclinas. No obstante, no se observó relación alguna con la respuesta clínica o patológica a la quimioterapia (Linn et al., 1997). LRP/MVP se expresa mayoritariamente en la superficie de las criptas de las células epiteliales de colon. Cuando estas células sufren un proceso carcinogénico, se produce un aumento rápido y abrupto de los niveles de expresión de esta proteína, que se incrementan en los adenomas y tienen su máximo nivel en los carcinomas. Así, en cáncer de colon, la sobre-expresión de LRP/MVP constituye un marcador de fenotipo agresivo y un factor de peor pronóstico (Meijer et al., 1999). Vaults está presente en todos los tejidos humanos, aunque se expresa mayoritariamente en células y tejidos crónicamente expuestos a xenobióticos, como el pulmón, las células epiteliales, el tracto digestivo y los macrófagos (Schroeijers et al., 2002). Esta distribución evidencia el papel que vaults tiene en la defensa de estos órganos y células frente a componentes tóxicos. Se estima que existen entre 10.000 y 100.000 copias de esta proteína por célula (Kickhoefer et al., 1998). Aunque su función principal es la de detoxificación, hay estudios que han sugerido que las vaults podrían estar involucradas en fenómenos de transporte de distintos sustratos (Herrmann et al., 1999; Li et., 1999), como el receptor de hormonas esteroideas (Abbondanza et al., 1998) o de ribosomas (Hamill et al., 1997). Además, la expresión de MVP y de otros componentes de vaults reflejaron el papel que tienen en la quimioresistencia de muchas líneas de células tumorales (Kickhoefer et al., 1998; Schroeijers et al., 2000; Siva et al., 2001). Se observaron niveles elevados de MVP en líneas celulares resistentes a varias clases de agentes citotóxicos. En cáncer de pulmón no microcítico, los niveles de expresión de MVP determinados por la proteína y ARN mensajero se correlacionaron con la resistencia al cisplatino, pero no se correlacionaron con otros citotóxicos (Berger et al., 2000). Para medir el papel directo de vaults en la resistencia a drogas se estabilizaron líneas celulares de carcinoma ovárico A2780 mediante transfección con la proteína MVP. Aunque los niveles de MVP aumentaron, no fueron capaces de conferir resistencia a ciertas drogas (Scheffer et al., 1995). Estudios posteriores en la misma línea celular transfectada
INTRODUCCIÓN 71 mostraron que las células presentaban niveles elevados de TEP1 y VPARP, además de un número elevado de partículas vault intactas (Silva et al., 2007). Estos autores concluyeron que vaults podía ser necesaria pero no suficiente para conferir una resistencia a droga (Tabla 11). La hipótesis de que la expresión de MVP refleja una ruta de resistencia a multidroga, ha llevado al estudio de la expresión de dicha molécula en tumores humanos. Estos estudios pretenden comprobar si la expresión de MVP es capaz de predecir la respuesta clínica tras la quimioterapia. En cáncer de ovario avanzado, los pacientes con tumores LRP positivos tuvieron una peor respuesta a la quimioterapia (p = 0.004) y una menor supervivencia libre de enfermedad (p = 0.003) y supervivencia global que los pacientes LRP negativos (Izquierdo et al., 1995). Dos estudios en cáncer de mama encontraron una alta expresión de la proteína pero sin correlación con la respuesta clínica (Linn et al., 1997; Pohl et al., 1999). En los tumores colorrectales se ha observado una creciente expresión de MVP, que se ve aumentado desde lesiones premalignas a carcinoma de colon invasivo, lo cual indica que MVP podría estar asociado con el grado de la enfermedad (Izquierdo et al., 1996; Meijer et al., 1999). En osteosarcoma, la expresión de MVP estaba correlacionada con características de la quimioterapia y con una peor supervivencia (Uozaki et al., 1997). Se ha encontrado una relación entre LRP y ciertos factores pronósticos en carcinoma ovárico. En el estudio de Arts et al, realizado con 115 pacientes con carcinoma ovárico, se observó una asociación entre LRP y factores pronósticos favorables incluyendo el estadio tumoral (p < 0.01) y el grado tumoral (p < 0.05). Sin embargo, no se encontró relación entre la expresión de LRP y la supervivencia global o libre de enfermedad (Arts et al., 1999). En un estudio posterior realizado en 29 pacientes con carcinoma epitelial ovárico, no se observaron diferencias significativas en la expresión de LRP cuando se compararon grupos quimiosensibles con quimiorresistentes. Sin embargo, se observaron diferencias en la expresión de LRP en pacientes con cáncer ovárico frente a individuos normales (Goff et al., 2001). Pohl et al. analizaron la expresión de LRP en 68 pacientes con carcinoma colorrectal observando que era un factor pronóstico independiente del grado histológico, tamaño tumoral, desarrollo de nodo linfático y metástasis a distancia. No se observaron diferencias entre la supervivencia de pacientes con tumores LRP positivos y LRP negativos. Sin embargo, pacientes con alta expresión de LRP tenían una mayor supervivencia (Pohl et al., 2001). En cáncer de vejiga se ha encontrado una asociación entre la expresión de LRP/MVP y peor respuesta a la
72 Papel de MVP en la reparación del ADN, la progresión tumoral y la hipoxia en carcinoma cervical: impacto pronóstico quimioterapia neoadyuvante, además de una baja probabilidad de conservación de la vejiga después del tratamiento (p = 0.035) (Diestra et al., 2003). En cuanto al carcinoma de cérvix hasta el momento no se han realizado estudios que relacionen la expresión de LRP/MVP con el pronóstico de la enfermedad. En carcinoma de orofaringe, una alta expresión de MVP se relacionaba con una peor supervivencia y menor respuesta a la radioterapia (Silva et al., 2007). También se han realizado estudios para analizar la capacidad predictiva de las proteínas reguladoras de distintos procesos celulares en la resistencia a droga. Volm et al. analizaron en 94 carcinomas de pulmón microcíticos, la expresión de proteínas de resistencia, factores proliferativos y factores angiogénicos, relacionándolos con la resistencia a droga. Para medir la actividad proliferativa se determinó la expresión de PCNA, Ciclina A, ciclina D y Cdk2. Sólo se observó relación entre la expresión de Cdk2 (p = 0.04) y PCNA (p = 0.05) y la respuesta a doxorubicina “in vitro”. De los factores apoptóticos analizados, sólo Fas/CD95 se asociaba significativamente con la respuesta a droga (p = 0.007). El índice apoptótico (p = 0.03) y VEGF (p =0.004) también revelaron una correlación significativa con la resistencia a drogas (Volm et al., 2000). Ciertos estudios han demostrado que los agentes que dañan el ADN ejercen su efecto genotóxico induciendo el ciclo celular y la apoptosis. Aunque el efecto de p53 en la respuesta a la quimioterapia en células de cáncer de pulmón microcítico sea controvertido, se ha observado tanto una disminución (Rusch et al., 1995; Kawasaki et al., 1997) como un aumento (Brattstrom et al., 1998) de la sensibilidad a droga asociada a mutaciones de p53. Harada et al. analizaron el valor predictivo de p53, Bcl-2 y LRP en la respuesta a la quimioterapia en 57 pacientes con cáncer de pulmón no microcítico. En los carcinomas de células no escamosas, la expresión de p53 se asoció con la respuesta a la quimioterapia (p = 0.03), y la expresión de LRP se correlacionó inversamente con la respuesta a la quimioterapia en carcinomas epidermoides (p = 0.02). No se observó relación entre Bcl-2 y la respuesta a la quimioterapia, ni entre la expresión de LRP, Bcl-2, p53 y factores clásicos de pronóstico (Harada et al., 2003).
INTRODUCCIÓN 73 Tabla 11. Relación entre LRP/MVP respuesta y supervivencia en distintos tipos tumorales Nº de pacientes Tipo de tumor Respuesta a quimioterapia Supervivencia libre de enfermedad Supervivencia global Izquierdo (1995) 57 Carcinoma Ovárico Si Si Si Schadendorf (1995) 71 Melanoma Si Ramani (1995) 21 Neuroblastoma No Dingemans (1996) 36 NSCLC No No Linn (1997) 70 Cáncer de mama No Uozaki (1997) 60 Osteosarcoma Si Si Arts (1999) 115 Carcinoma Ovárico No No No Pohl (1999) 99 Cáncer de mama No No No Volm (2000) 87 NSCLC Si No Goff (2001) 29 Carcinoma Ovárico No Pohl (2001) 68 Colorrecto No Diestra (2003) 83 Vejiga Si Harada (2003) 57 NSCLC Si Silva (2007) 78 HNSCC Si Si 4.10.2. LRP/MVP y Radioterapia Hasta ahora se ha podido observar el papel de MVP en la resistencia a drogas en varias líneas celulares así como en carcinoma ovárico, leucemia mieloide aguda, y otros tipos tumorales. Sin embargo, se conoce poco sobre su posible papel en la resistencia a la radiación. En el estudio de Shimamoto et al., realizado en líneas de cáncer colorrectal humano, los niveles de MVP aumentaban después del tratamiento con agentes que dañaban el ADN (bromuro de etidio y radiación ultravioleta), sugiriendo que el daño producido aumentaba la actividad promotora de MVP (Shimamoto et al., 2006). Recientemente se ha realizado un estudio en 78 biopsias de pacientes con carcinoma epidermoide de cabeza y cuello que recibieron radioterapia radical, en donde se analizó el posible papel de LRP en la resistencia a la radiación. En pacientes con cáncer de lengua, una alta expresión de LRP se asociaba con un peor pronóstico de la enfermedad (p < 0.0001) demostrando que LRP no sólo juega un papel importante en la
74 Papel de MVP en la reparación del ADN, la progresión tumoral y la hipoxia en carcinoma cervical: impacto pronóstico resistencia a drogas sino también en la resistencia a la radioterapia (Silva et al., 2007). 4.10.3. MVP modula otros mecanismos celulares MVP posee un papel fundamental y esencial como proteína de resistencia a drogas. No obstante, en los últimos años, se ha observado que MVP podría estar involucrado en otros procesos celulares diferentes. Los niveles de expresión de Y-box-binding protein-1 (YB-1), proteína importante para la proliferación celular y la reparación del ADN, parece correlacionarse significativamente con los niveles de expresión de MVP (p = 0.0044) en tumores de rabdomiosarcoma embrional (Oda et al., 2008). MVP parece inhibir la apoptosis celular y favorecer la proliferación celular (Steiner et al., 2006). MVP inhibe a fosfatasas homólogas de tensina (PTEN) que a su vez están relacionadas con el aumento de PI3K/Akt. Este dímero inhibe la apoptosis inhibiendo a su vez a la proteína pro-apoptótica BAD (Rodemann et al., 2007). MVP también está relacionado con src, que se encuentra en la vía de señalización del factor de crecimiento epidérmico (EGF) (Silva et al., 2007). Esta proteína aumenta la proliferación celular a través de la vía de señalización dependiente de Erk/MAPK (Rodemann et al., 2007), y previene la apoptosis mediando la inhibición del eje COP-1/p53 (Lloret et al., 2008). Se ha observado además que los niveles de expresión de MVP están relacionados con los de IGF-1R en pacientes con cáncer cervical (Lloret et al., 2008), lo que lleva a la célula a aumentar su proliferación y a inhibir su apoptosis. El papel que MVP parece tener en los fenómenos de carcinogenésis, puede estar mediado por su relación con la proteína-asociada a telomerasa (TEP-1) (Miwa y Masutani , 2007), así como con la relación existente con los procesos de remodelación de la cromatina (Emre et al., 2004). PARP-1, una proteína vault, inhibe a Ku70/80, promoviendo la reparación homóloga sobre la no homóloga (NHEJ) (Hochegger et al., 2006). Aunque la trascendencia y relevancia de MVP en particular, y de la proteínas vault en general, sobre otros mecanismos celulares diferentes a la resistencia a drogas debe ser demostrada, parece evidente que esta proteína se encuentra en medio de procesos relevantes para la célula, tales como la proliferación y la apoptosis, que por otra parte son mecanismos claves en los fenómenos de carcinogénesis. El receptor de estrógeno es la proteína reponsable de la acción biológica del estradiol. La unión a secuencias específicas presentes en la región reguladora
INTRODUCCIÓN 75 de genes, conocida como elemento de respuesta hormonal, constituye un evento obligatorio en el mecanismo hormonal de la acción (Beato, 1989). La ocupación del sitio de unión de la hormona modula la accesibilidad del dominio de unión al ADN de los receptores con el ADN, y el inicio de la transcripción (Tora et al., 1989; Beato et al., 1995). En el estudio de Abbondanza et al., se ponía de manifiesto que el receptor de estrógeno podría interactuar con MVP y, por lo tanto, representar otra forma de control para la acción regulatoria hormonal a través de MVP (Abbondanza et al., 1998). Estudios anteriores han evidenciado que la mayoría de las particulas vaults parecen estar en el citoplasma, aunque una pequeña cantidad (0,5%) se asocia con la envoltura nuclear en cortes de tejido (Kedersha y Roma, 1986; Kedersha et al., 1990), y con complejos de poro nuclear (NPCs) (Chugani et al., 1993). La simetría y la geometría de las partículas vaults ha llevado a pensar que ellas pueden ser el conector central/transportista de los NPCs (Kedersha et al., 1991), y, como tal, podríam desempeñar un papel en el transporte nucleocitoplásmico (Chugani et al., 1993). En el trabajo de Hamill et al, donde se buscaba estabelecer una función más clara para las partículas vaults y otras partículas de ribonucleoproteínas del transporte nucleocitoplasmático, se concluyó que vaults podrían jugar un papel en el ensamblaje de los ribosomas y/o en el transporte de los ribosomas del núcleo. Vaults y los ribosomas pueden interactuar a través de unos débiles puentes intermedios con mARN. Si esa interacción de vaults con el ribosoma está mediada por mARN o proteínas asociadas con el mARN, la pérdida de mARN podría destruir el ribosoma y la interacción con vaults. En ese mismo trabajo, se demostró por inmunotinción la presencia de vaults en la superficie nuclear, además de una fuerte reactividad en el nucleolo (el sitio de unión en la subunidad ribosomal). Una posibilidad a partir de estos resultados podría ser que vaults estarían involucradas en el montaje y/o transporte de las subunidades ribosomales nucleocitoplásmicas (Hamill et al., 1997).
Objetivos
90 Papel de MVP en la reparación del ADN, la progresión tumoral y la hipoxia en carcinoma cervical: impacto pronóstico (NHEJ) mediante la supresión de Ku70/80 (Hochegger et al, 2006). Ku70/80 es clave en la ruta de reparación no homologa que se activa cuando se producen roturas doble de la cadena de ADN (DSBs) inducidas por radiación. Ku70/80 parece tener un importante papel como regulador de la apoptosis a través de las interacciones de BCL-2 asociado a proteína X (BAX) (Chang et al., 2008; Wang et al., 2008). En este estudio se investigó la relación existente entre la expresión de MVP, NHEJ, Ku70/80 y genes relacionados en la regulación de la apoptosis y la proliferación, buscando posibles causas de la inestabilidad génica, la progresión tumoral y la resistencia a los tratamientos en pacientes con carcinoma cervical. MATERIALES Y MÉTODOS PACIENTES. En este estudio participaron ciento dieciséis mujeres diagnosticadas con carcinoma cervical localizado y tratadas en nuestro Servicio desde julio de 1997 a diciembre de 2003. Todas las pacientes incluidas en este trabajo dieron su libre consentimiento para la participación de este estudio, que fue previamente aprobado por el Comité Ético de Investigación de nuestra Institución. La edad media de las pacientes incluidas en este estudio fue de 52.80 ± 14.05 años (mediana de 51 años en un rango de 27-89 años). El estadiaje clínico se realizó mediante especuloscopia, examen bimanual, cistoscopia o rectoscopia. Todas las pacientes fueron exploradas mediante tomografía axial computarizada abdomino-pélvica y radiografía de tórax. Las pacientes fueron clasificadas en base al sistema de clasificación TNM (Cervix uteri, 2002). De acuerdo con los criterios citados, cuarenta pacientes presentaban estadio I, cuarenta y cinco tenían estadio II y treinta y una pacientes se encontraban en estadio III/IVA. La mayoría de las pacientes tenían tumores de tipo escamoso (98 casos) así como carcinomas de grados II-III (97 casos). La media de volumen tumoral fue de 4.23 ± 1.67cm (Tabla 1).
CAPÍTULO III 91 Tabla 1: Características de los pacientes Característica Pacientes (%) Edad (años) ≤52 60 (51.7) >52 56 (48.3) Estadio I 40 (35) II 45 (43) III-IVA 31 (22) Histologia Escamoso 98 (89) Adenocarcinoma 18 (11) Grado Histologico I 19 (6.5) II 52 (44.8) III 45 (38.7) INMUNOHISTOQUIMICA. Las oncoproteínas tumorales seleccionadas fueron estudiadas mediante técnica de inmunohistoquímica (Lloret et al., 2008). Se tomaron secciones de tejido tumoral de unos 4-mm aproximadamente, incluidos en parafina, que fueron incubados durante 1 hora a temperatura ambiente en una cámara húmeda en presencia del anticuerpo primario (Tabla 2). Tabla 2. Anticuerpos utilizados en este estudio Proteína Clon Casa comercial MVP Ab-2 Clone 1032 Neomarkers, Fremont, CA IGF-1R Ab1 Clone 24-31 Neomarkers, Fremont, CA Ku70/80 Clone 162 Neomarkers, Fremont, CA BAX Policlonales Dako, Carpintería, CA BCL-2 Clone 124 Dako, Carpintería, CA P53 Clone DO-7 Novocastra Laboratories Ltd., U.K. Ki67 Clon Mib-1 Master Diagnóstica, Granada, ES Tras esta primera incubación, se procedió a la incubación del tejido en presencia de un anticuerpo secundario biotinado (Dako kit de detección, LSBA) durante 30 minutos. Tras esto, el complejo peroxidasa-estreptavidina-biotina fue usado después.
92 Papel de MVP en la reparación del ADN, la progresión tumoral y la hipoxia en carcinoma cervical: impacto pronóstico La expresión de los marcadores celulares fue valorada por observadores que desconocían las características clínicas de las pacientes, en las zonas de máxima expresión del marcador en al menos 10 campos de alta potencia (Objetivas de 400X). La expresión de MVP, BAX, BCL-2 e IGF-1R se valoró de forma semi-cuantitativa. Así, la tinción BAX y BCL-2 se clasificó como negativo o positivo, mientras que la de MVP e IGF1R se clasificó como bajo (negativo o ligeramente positivo) o alto (fuertemente positivo) (Lloret et al. 2008). La tinción para Ki67, Ku70/80, y p53 se observó en el núcleo y se valoraron como porcentaje de células teñidas, contabilizándose hasta 1.000 células para cada paciente. ANÁLISIS ESTATÍSTICOS. Las correlaciones entre las variables clínicas e histopatológicas fueron analizadas utilizando el test de chi-cuadrado para el caso de variables categóricas. El t test y el análisis de varianza fueron usados en el caso de variables continuas que mostraban una distribución normal. Los tests de Mann-Whitney y Kruskall-Wallis fueron utilizados cuando las variables continuas presentaban una distribución no normal. Las correlaciones entre las variables que se distribuyeron de forma normal fueron determinadas mediante el coeficiente de Pearson, mientras que las correlaciones entre las variables distribuidas de manera no normal se determinaron mediante el test de Spearman. Los análisis se realizaron en el programa estadístico SPSS, versión 15.0 (SPSS Inc., Chicago, IL) RESULTADOS Se procedió a la determinación de todos los marcadores inmunohistoquímicos en los 116 casos estudiados. Se observó un aumento de la proliferación celular, evaluada por la expresión de la proteína Ki67: media, 58.27% ± 25.68%; mediana, 65%, rango, 098%. Por otro lado, observamos que la expresión de p53 alterada fue de media 40.53% ± 26.53%; mediana, 37.75%; rango, 0-98%. Parece existir una fuerte y clara correlación entre el aumento de la proliferación tumoral y la expresión de p53 alterada (coeficiente regresión de Spearman = 0.505; p <0.0001), de tal manera que a mayores niveles de expresión de Ki67 más cantidad de p53 alterado (Figura 1a). La mayoría de las muestras presentaron una tinción positiva para BAX (82 de 116 casos, 70.6%) y una tinción negativa para BCL2 (61 de 116 casos, 52.6%). Se observó una correlación inversa entre la expresión de BAX y de BCL-2 (p = 0.005, Tabla 1).
CAPÍTULO III 93 Figura 1a. Correlación entre los niveles de expresión de Ki67 y p53 (expresado en porcentaje). Se observa una correlación positiva con una R de Spearman de 0.505 y una p <0.0001. Tumores con BAX negativo mostraron mayores niveles de proliferación celular medido como porcentaje de Ki67 (69.92% vs. 53.44%, p 0.001); y mayores niveles de expresión de p53 alterada (51.14% vs. 36.12%, p = 0.005), que en tumores que expresaban BAX (positivo). En el mismo análisis, los tumores que expresaban positivamente BCL-2 también mostraron mayores niveles de expresión de p53 alterada (47.45 vs. 34.28%, p = 0.007) y de proliferación (66.15% vs. 51.17%, p = 0.003), que los tumores BCL-2-negativo (Tabla 1). Por su parte, los niveles de expresión de Ku70/80 fueron de media 56.60% ± 28.23%; mediana 61% y rango 0-100%. Los niveles de expresión de Ku70/80 estaban inversamente relacionados con la proliferación celular (coeficiente regresión de Spearman, - 0.282; p = 0.002; figura. 1b), y con la expresión alterada de p53 (coeficiente regresión de Pearson, -0.193; p = 0.038; (figura. 1c). Además, la baja expresión de Ku70/80 estaba fuertemente relacionada con BAX negativo (p <0.001) y, en menor medida, con BCL-2 positiva (p = 0.042, Tabla 1).
94 Papel de MVP en la reparación del ADN, la progresión tumoral y la hipoxia en carcinoma cervical: impacto pronóstico Tabla 1. Expresión de oncoproteínas en tumores cervicales BAX BCL2 KI67 (%) P53 (%) KU70/80 (%) Negativo Positivo Negativo Positivo MVP Bajo (51) 48.95±25.95 36.89±28.14 63.92±26.94 3 31 31 20 Alto (65) 65.59±23.14 P<0.0001 43.38± 25.05 p = 0.193 50.86± 28.09 p = 0.013 48 34 p < 0.0001 30 35 p = 0.117 IGF-I R Bajo (51) 54.20±26.24 42.36±28.02 61.58±27.73 9 25 34 17 Alto (65) 61.47±24.97 p = 0.097 39.09±25.44 p = 0.512 52.69±28.22 p = 0.092 42 40 p = 0.015 27 38 p = 0.007 BAX Negativo (34) 69.92±23.08 51.14±23.52 40.44±25.88 — — 11 23 Positivo (82) 53.44±25.27 p = 0.001 36.12±26.59 p = 0.005 63.30±26.53 p < 0.0001 — — 50 32 p = 0.005 BCL-2 Negativo (61) 51.17±27.53 34.28±26.79 61.65±28.61 11 23 — — Positivo (55) 66.15±21.03 p = 0.003 47.45±24.68 p = 0.007 51.00±26.97 p = 0.042 50 32 p = 0.005 — — Abreviaciones: MVP: major vault protein; IGF-1R = Insulin-Like Growth Factor-1 receptor; BAX = BCL2-associated X protein; BCL-2=B-cell CLL/lymphoma 2. Values expressed as mean ±SD. Figuras 1b y 1c. Correlación entre los niveles de expresión de Ku70/80 con Ki67 (a) y p53 (b) (expresado en porcentaje). Se observa una correlación negativa con una R de Spearman de -0.282, p = 0.002 y de -0.193, p = 0.038 respectivamente. En lo referente a MVP, los tumores que sobreexpresan MVP (65 de 116, 56.0%) presentaban una mayor tasa de proliferación (65.59% vs. 48.95%, p <0.0001), pero sin relación alguna con la expresión de p53 (p > 0.05). La expresión de Bax (48 vs. 3, p <0.0001) y Ku70/80 (50.86% vs. 63.92%, p = 0.013) fue suprimida en estos tumores con sobreexpresión de MVP (Tabla 1).
CAPÍTULO III 95 IGF-1R aparecía sobreexpresado en 65 de los 116 casos (56.0%). Aquellos pacientes que sobreexpresan IGF-1R sobreexpresaban también BCL-2 (38 vs. 27, p = 0.007). De manera contraria, observamos una relación inversa con la supresión de BAX (42 vs. 9, p = 0.015) Tabla 1. Además, observamos una relación positiva entre la expresión de MVP e IGF-1R, de tal manera que los pacientes que sobreexpresaban una proteína presentaban igualmente sobreexpresión de la otra (p < 0.0001, dato no mostrado). La edad, características histológicas, grado, volumen tumoral y estadio clínico fueran factores independientes de la expresión de las oncoproteínas. Curiosamente, 15 de los 18 tumores de adenocarcinoma, mostraron altos niveles de MVP en comparación con 50 de 98 tumores escamosos (p = 0.011). La expresión de p53 alterada fue ligera y directamente relacionada con la edad (p = 0.042). La expresión de Ku70/80 se mostró inversamente relacionada con el grado histológico (p = 0.020). En el análisis de regresión logística binaria, la expresión de BAX fue el factor independiente más relevante relacionado con MVP (p = 0.005; riesgo relativo, 10.330; intervalo de confianza (IC95%) 2.06 a 51.74), seguida por la proliferación tumoral (p = 0.007; riesgo relativo, 1.037; IC95% 1.010 – 1.065) y los tumores de tipo adenocarcinoma (p = 0.008; riesgo relativo, 15.097; IC95% 2.02 – 112.71) (Tabla 2). Tabla 2. Relacion de BAX con MVP, Proliferación tumoral y adenocarcinoma P Riesgo Relativo IC95% BAX vs.MVP (-) 0.005 10.330 2.06 - 51.74 BAX vs.Proliferación Tumoral (-) 0.007 1.037 1.010 - 1.065 BAX vs. Adenocarcinoma (-) 0.008 15.097 2.02 - 112.71 (-) Relación inversa.
96 Papel de MVP en la reparación del ADN, la progresión tumoral y la hipoxia en carcinoma cervical: impacto pronóstico DISCUSIÓN En este estudio se mostró que MVP puede tener un papel favoreciendo el aumento de la inestabilidad genética mediante la reducción de la reparación del ADN dañado por medio de NHEJ y disminuyendo la expresión Ku70/80. La progresión y la resistencia a la quimioterapia y la radioterapia también pueden ser activadas mediante la supresión de BAX y/o la inducción de IGF-1R, resultando en una mayor proliferación celular y reducción de la apoptosis causada por una regulación positiva de BCL-2 y la sobreexpresión de p53 alterada. La resistencia a la radioterapia en el ámbito clínico como resultado de MVP (Silva et al., 2007) puede tener otras causas además de la proliferación y la inhibición de la apoptosis. Un tercer mecanismo propuesto es que MVP también puede regular la reparación de DSB mediante la supresión de la reparación mediada por NHEJ. Aunque tanto la reparación homóloga cuanto la reparación NHEJ estén relacionadas con la reparación del DSB, este último es más frecuente cuando el daño al ADN es inducido por la radiación. Las proteínas Vaults pueden estar implicadas en la modificación de reparación NHEJ a través de varios posibles mecanismos: 1. Competición de la proteína poli (ADP-ribosilación) con Ku para la reparación DSB, previniendo la reparación dirigida NHEJ/Ku. 2. La activación de las rutas PI3K/Akt y Erk/MAPK podrían aumentar la radio-resistencia a través de la regulación de los genes de reparación por NHEJ. Se ha observado que Akt interactúa con la ADN-proteína-quinasa C (PKC) (Toulany et al., 2008); y que p38 MAPK también interactúa con Ku (Cosaceanu et al., 2007) en la reparación NHEJ. 3. Los procesos de remodelación de la cromatina pueden estar también implicados, ya que se ha visto que MVP está positivamente regulado en células tratadas con inhibidores de la histona deacetilasa (Steiner et al., 2006), que, por el contrario, inhiben la reparación del ADN mediada por Ku (Chen et al., 2007). MVP parece regular negativamente el gen proapoptótico BAX por sí mismo y a través de su relación con Ku70/80. Curiosamente, se ha visto que Ku es un regulador central de la apoptosis mediante la interacción con BAX (Chang et al., 2008) y BCL-2
CAPÍTULO III 97 que, a su vez, se ha demostrado que tiene capacidad para suprimir a Ku70/80 y, de esta manera, inhibir la reparación NHEJ (Wang et al., 2008). Por lo tanto, la decisión de la célula para repararse o someterse a la apoptosis parece tener lugar en los momentos iniciales tras el daño al ADN. La inestabilidad genética como consecuencia de la supresión de Ku, llevando a una reparación defectuosa al ADN dañado por DSBs, (Teoh et al., 2008) es seguido por la progresión del tumor a través de la reducción de la apoptosis de las células alteradas y una mayor proliferación. La expresión de IGF-1R está fuertemente relacionada con MVP. Se ha observado que los altos niveles de IGF-1R se asocian a un peor pronóstico en pacientes con carcinoma de cervix tratados con quimioterapia (Lloret et al., 2008). El IGF-1R coopera con el MVP en la prevención de la apoptosis, mediando una regulación positiva de BCL-2 y, en menor medida, disminuyendo BAX. Sin embargo, también puede afectar a la reparación NHEJ través de las vías AKT/p38MAPK, principalmente mediante la modificación de la expresión de Ku (Cosaceanu et al., 2007). En conclusión y a la vista de los resultados obtenidos, se puede suponer que exista un mecanismo temprano de regulación que favorece la reparación homóloga o reparación NHEJ en un primer momento, mediados por vaults y por otros factores aún por elucidar. Si las proteínas vaults están sobreexpresadas, la reparación NHEJ puede ser suprimida por varios mecanismos, por lo que la inestabilidad genómica pueda surgir, ya sea porque la reparación de daños DSB mediante la reparación homóloga es impedida, o bien porque la reparación NHEJ es defectuosa. Estos eventos están asociados con la decisión de las células dañadas de sobrevivir y proliferar, lo que favorece la progresión del tumor y la reducción de la respuesta al tratamiento oncológico debido al desarrollo de fenotipos resistentes.
CAPÍTULO IV LA QUIMIO/RADIO RESISTENCIA INDUCIDA POR LA HIPOXIA TUMORAL ESTÁ MEDIADA POR LA SOBREEXPRESIÓN DE MVP Y LA INHIBICIÓN DE Ku70/80 EN CARCINOMAS CERVICALES
CAPÍTULO IV 101 CAPÍTULO IV Resumen La hipoxia puede inhibir la reparación no homóloga del ADN a través de la disminución de la expresión de Ku70/80 que, combinado con un aumento de la angiogénesis y la expresión de p53 alterada, resultaría en un aumento de la progresión tumoral en los carcinomas cervicales. La molécula de oxígeno modula la respuesta del tumor a la radioterapia. Para inducir la muerte celular en condiciones de hipoxia son necesarias dosis más altas de radiación. La hipoxia puede inhibir la reparación no homóloga del ADN a través de la baja expresión de Ku70/80. En los tumores clínicos, la hipoxia induce resistencia a los fármacos a través de mecanismos que no están claramente elucidados. Las Vaults son partículas de ribonucleoproteínas con una estructura semejante a un barril sin tapas y compuesto por tres proteínas: MVP (major vault protein), poli (ADP-ribosa) polimerasa, proteína-1 asociada a la telomerasa y pequeños ARN no traducibles. La sobreexpresión de MVP se ha asociado con resistencia a la quimioterapia. Además, se ha relacionado con un peor pronóstico en pacientes tratados únicamente con radioterapia. El objetivo del presente estudio fue evaluar la posible relación existente entre la expresión de MVP y la hipoxia tumoral en los tumores cervicales. Se procedió a la determinación de la expresión de MVP, p53, angiogénesis y oxigenación tumoral en cuarenta y tres pacientes consecutivos con diagnostico de carcinoma localizado del cuello uterino. Se observó una relación entre la alta expresión MVP y la hipoxia severa, en comparación con aquellos tumores que expresaron bajos niveles de MVP (p = 0.022). Los tumores que sobreexpresaban MVP también mostraron un aumento significativo de la angiogénesis (p = 0.003). Además, el estudio demostró por primera vez que la hipoxia tumoral severa se asociaba con una alta expresión de MVP en los tumores cervicales. Debido a que la quimioterapia es actualmente un tratamiento estándar para este tipo de pacientes, la regulación de MVP por la hipoxia es de fundamental importancia. A la vista de los presentes resultados se podría sugerir que la hipoxia aislada no induce el aumento de la inestabilidad genética, las propiedades oncogénicas y de metástasis, sino que lo hace a través de la asociación observada con la expresión de MVP, lo que podría desarrollar una nueva vía de resistencia a los tratamientos quimio y radioterápicos.
110 Papel de MVP en la reparación del ADN, la progresión tumoral y la hipoxia en carcinoma cervical: impacto pronóstico La determinación de MVP fue revelada mediante el uso de sustrato diaminobencidina tetra-clorhidrato (DAB cromógeno, Dako), seguido por la luz de contratinción con hematoxilina de Harris, tal y como se ha descrito previamente (Lloret et al., 2009). Tabla 2. Anticuerpos utilizados en este estudio Proteína Clon Casa comercial MVP Ab-2 Clone 1032 Neomarkers, Fremont, CA CD-31 Clon JC/70A Dako, Carpintería, CA Ku70/80 Clon 162 Neomarkers, Fremont, CA P53 Clone DO-7 Novocastra Laboratories Ltd., U.K. DETERMINACIÓN DE HIPOXIA TUMORAL. La oxigenación tumoral fue medida por un dispositivo de Eppendorf, siguiendo criterios estándar, tal y como se ha descrito anteriormente (Clavo et al., 2003; Lara et al., 2008). Se utilizó un sistema de sonda polarográfica ‘‘pO2 Histograph’’ (Eppendorf AG, Hamburg, Germany). En cada serie de mediciones obtenidas por el tumor, se registraron 200 mediciones para los valores de pO2 con un mínimo de 6 pistas de electrodos diferentes. Se obtuvieron de manera agrupada y para cada paciente: registros de los niveles de oxigenación tumoral, de la mediana de pO2 y del porcentaje de los valores de pO2 <10 y <5 mmHg. Los datos de hipoxia tumoral fueron re-analizados para detectar los casos de hipoxia severa y los porcentaje de los valores de pO2 <2.5 mmHg (valor representado por HF2.5). Los datos derivados de la inmunohistoquímica y de la hipoxia tumoral se segregaron, para garantizar un análisis ciego de los pacientes. ANALISIS ESTADÍSTICOS. Los análisis estadísticos se llevaron a cabo en el programa informático SPSS 13.0. Las variables dicotómicas o categóricas (clínicas e histopatológicas) se analizaron mediante el test de Chi cuadrado (χ2). Las variables continuas fueron estudiadas para valorar el tipo de distribución (normal vs. no normal) mediante el test de Kolmogorov-Smirnoff. Las variables continuas de distribución normal se analizaron mediante estudios de correlación de Pearson, mientras que se usó la correlación de Spearman en el caso de variables continuas no normales. Los análisis de relación entre categóricas y continuas se realizaron mediante las pruebas de MannWithney y Kruskall-Wallis en caso de distribución no normal, y prueba T y pruebas de
CAPÍTULO IV 111 ANOVA para las variables que mostraban una distribución normal. Los análisis estadísticos se hicieron de manera ciega, de tal forma que no se pudiera relacionar el resultado de la evaluación de la inmunotinción y/u oxigenación tumoral con la respuesta clínica del paciente RESULTADOS Se llevaron a cabo en los 43 pacientes, las determinaciones de todos los marcadores inmunohistoquímicos así como los valores de hipoxia. La expresión media de Ku70/80 fue 62.41 ± 27.16% (mediana 70%, rango 0-94%). La densidad vascular media (MVD) fue de 49.62 ± 33.98% (mediana 41%, rango 0-160). La expresión de p53 mostró un valor promedio de 39.15 ± 27.62% (mediana 35%, rango 0-92%). Por su parte, la expresión de MVP se consideró baja (negativo/ligeramente positivo) en 23 casos, y alta (fuertemente positiva) en los 20 casos restantes (Tabla 1). La hipoxia tumoral también fue medida en todos los pacientes. Así, la media de la pO2 tumoral fue de 7.1 ± 8.98 (mediana de 4.40 rango 0-41.9). La fracción de hipóxia tumoral <10 mmHg (HF10) presentó un promedio de 61.10 ± 21.77% (mediana 63%, rango 0-96%). Los valores de la fracción media de hipoxia tumoral <5 mmHg (HF5) fueron 51.84 ± 23.53 (mediana de 52.50%, rango 0-95%). Los valores HF10 y HF5 estaban estrechamente relacionados (r = 0.883, p <0.0001). Los valores HF10 y HF5 también se mostraban estrechamente relacionados con los valores de pO2 media (r = - 0.796, p <0.0001 y r = -0.892, p <0.0001, respectivamente). Por último, la fracción de hipoxia tumoral media (HF 2.5) fue de 35.89 ± 26.80 (mediana de 35.20%, rango 091.30%). La expresión de MVP fue independiente de las variables clínicas e histológicas, salvo para los tumores caracterizados histológicamente como adenocarcinomas. De hecho, los tumores de adenocarcinoma (5 casos incluidos en el estudio) sobreexpresaban MVP, mientras que de los 38 tumores epidermoides 15 sobreexpresaban MVP (p = 0.011). Por otro lado, la alta expresión de MVP estaba relacionada con altos niveles hipoxia, según lo determinado por el aumento de las fracciones hipóxicas HF (2.5) (45.82 ± 28.00%) en comparación con los tumores de baja expresión de MVP (27.26 ± 22.96%) (p = 0.022) (Figura 2a). Los tumores que sobreexpresaban MVP también mostraron aumento de la angiogénesis (65.41 ± 38.38) en comparación con los casos de baja expresión de dicha oncoproteína, donde los
112 Papel de MVP en la reparación del ADN, la progresión tumoral y la hipoxia en carcinoma cervical: impacto pronóstico valores de MVD fueron de 35.89 ± 22.55% (p = 0.003) (Figura 2b). La expresión de MVP fue independiente de la expresión de la proteína p53. Figura 2. Relación entre los niveles de expresión de MVP con (a) la fracción de hipoxia tumoral y (b) la densidad media vascular (MVD). La expresión de Ku70/80 y la hipoxia tumoral no se relacionaron con ninguna de las variables estudiadas. Sólo la expresión de p53 se asoció de forma marginal a la edad avanzada (p = 0.049), y al alto grado de diferenciación (p = 0.034). La baja expresión de Ku70/80 estaba relacionada con la hipoxia, determinada por los bajos valores medios pO2 tumoral (r = 0.403, p = 0.008) (Figura 3a) y mayor fracciones hipóxica HF10 (r = -0.313, p = 0.041) y HF5 (r = -0.289, p=0.060). El aumento de la angiogénesis, medida como MVD, estaba relacionada con la hipoxia, determinada por los bajos valores medios de pO2 tumoral (r = -0.363, p = 0.017) (Figura 3b) y mayor HF10 (r = 0.381, p = 0.012) y HF5 (r = 0.392, p = 0.009). También se observó alteración de la expresión de p53, principalmente en los tumores hipóxicos (r = -0.341, p = 0. 025), HF10 (r = 0.218, p = 0.206) y HF5 (r = 0.160, p = 0.186) (Figura 3c). Se observó una disminución de la tinción de Ku70/80 en aquellas células que distaban más de los vasos sanguíneos (Figura 4a); mientras que la tinción de p53 no estaba relacionada con la arquitectura vascular (Figura 4b) (p < 0.05). Los tumores con una alta expresión de Ku70/80 mostraron bajos niveles de p53 aunque esta relación no alcanzó significación estadística en esta serie de pacientes (p = 0.08).
CAPÍTULO IV 113 Figura 3. Relación entre la mediana de la pO2 y (a) la expresión de Ku70/80, (b) la densidad vascular media (MVD) y (c) la expresión de p53. Figura 4. Relación entre la cantidad de microvasos tumorales con (a) la expresión de Ku70/80 y (b) la expresión de p53.
114 Papel de MVP en la reparación del ADN, la progresión tumoral y la hipoxia en carcinoma cervical: impacto pronóstico DISCUSIÓN En el presente estudio se ha demostrado por primera vez que la hipoxia tumoral severa se relaciona con altos niveles de expresión de MVP en tumores cervicales clínicos. MVP se expresa en distintos sitios y, además de la resistencia a la quimioterapia, se sabe que ésta proteína está implicada en la regulación de varios procesos celulares entre los que destaca i) mecanismos de transporte, ii) transmisiones de señal y iii) la respuesta inmune (Berger et al., 2009). Estudios previos han demostrado que las proteínas Vaults están positivamente reguladas en diferentes líneas celulares cancerígenas resistentes a diferentes drogas (Izquierdo et al., 1996), así como en modelos de resistencia a fármacos (Izquierdo et al., 1996; Siva et al., 2001). De esta manera, se ha observado niveles elevados de MVP en numerosas líneas celulares expuestas a un amplio panel de medicamentos citostáticos (por ejemplo, doxorrubicina, metotrexato, vincristina o cisplatino) (Lange et al., 2000). Por el contrario, el factor de necrosis tumoral o TNF provoca una inhibición de la transcripción MVP (Stein et al., 1997). En este sentido, hay evidencias científicas de una relación entre la expresión de MVP y la resistencia a los fármacos en oncología clínica (Mossink et al., 2003; Izquierdo et al., 1998). Esta relación ha sido también explorada en el caso particular de los tumores de cuello uterino (Lloret et al., 2008) y en relación a la respuesta clínica al tratamiento radio-quimioterápico (Silva et al., 2007). MVP parece regular negativamente al gen proapoptótico BAX, a través de su relación con Ku70/80. Ku70/80 son los genes clave en la vía de reparación NHEJ activada por dobles roturas en la cadena de ADN, inducidas por ejemplo, por radiación. Se ha observado que existe una asociación entre la expresión de Ku70/80 y la supervivencia en aquellos pacientes tratados con radioterapia (Beskow et al., 2006; Wilson et al., 2000). Ku70/80 es un regulador central de la apoptosis mediante la interacción con BAX (Amsel et al., 2008) y BCL-2 que, a su vez, se ha observado que inhibe a Ku, evitando de esta manera la reparación NHEJ (Wang et al., 2008). En este estudio, se mostró por primera vez que la hipoxia tumoral reduce la expresión de Ku70/80 en los tumores cervicales, lo que confirma anteriores estudios preclínicos sobre el papel de la hipoxia en favor del aumento de la inestabilidad genética através de la reducción de la reparación del daño al ADN. Estos resultados también sugieren que la supresión de la reparación del ADN inducida por hipoxia afecta a todos los mecanismos de reparación conocidos (Huang et al., 2007), incluida la reparación por escisión de nucleótidos (NER), MMR, HR y NHEJ. En el ámbito clínico, la inducción de MVP por la hipoxia es de suma importancia ya que la quimioterapia es actualmente un tratamiento estándar para estos pacientes. Por
CAPÍTULO IV 115 otro lado, la hipoxia inhibe la reparación NHEJ del ADN a través de la inhibición de Ku70/80 (Lara et al., 2008). La regulación negativa de la reparación de roturas dobles de cadena (DSB) por la hipoxia es de fundamental importancia ya que algunos tratamientos oncológicos como la radioterapia, inducen la muerte de células tumorales por DSB del ADN. Aunque tanto la reparación homóloga cuanto la reparación no homóloga (NHEJ) están relacionadas con la reparación DSB, el segundo mecanismo ocurre más frecuentemente después de que la radiación genere daño al ADN. Los estudios preclínicos sobre el papel de la hipoxia en células de cáncer mostraron que la reducción de la pO2 es un factor que favorece la quimio-resistencia (Sasabe et al., 2007; Cosse et al., 2008). En el cáncer, la hipoxia es un factor pronóstico adverso asociado con la progresión tumoral y la resistencia al tratamiento (Shannon et al., 2003). La hipoxia induce adaptaciones celulares que comprometen la efectividad de la quimioterapia. La captación de drogas por las células en zonas hipóxicas se ve afectada por la falta de oxígeno. Algunos medicamentos quimioterapéuticos requieren oxígeno para generar radicales libres que contribuyen a su citotoxicidad. Por otra parte, la expresión de varios genes que controlan la supervivencia de las células tumorales está regulada por la hipoxia (por ejemplo, factores de crecimiento que regulan la formación de nuevos vasos sanguíneos, y factores de transcripción sensibles a la hipoxia que modulan la expresión de genes). El factor de transcripción inducible por hipoxia-1 (HIF-1) es uno de los principales mediadores de la homeostasis en los tejidos humanos expuestos a la hipoxia y está implicado en casi todos los procesos de la expresión génica rápida en respuesta a niveles bajos de oxígeno (Adams et al., 2009). HIF-1 alfa está sobreexpresado en la mayoría de los cánceres humanos comunes y sus metástasis, debido a la presencia de hipoxia intratumoral y como resultado de mutaciones en genes que codifican oncoproteínas y genes supresores de tumores (Semenza, 2000; Zhong et al., 1999). En la actualidad, los autores están de acuerdo en que se produce una amplia regulación negativa de los genes relacionados con HR bajo condiciones de hipoxia. Algunos de esos genes son: XRCC2, XRCC3, BRAC2, RAD51C Rad51, RAD52, Rad54, BRCA1, BRCA2 (Huang et al., 2007; Meng et al., 2005; Sprong et al., 2006). Se ha demostrado que la reparación homologa de las DSB está regulada negativamente por la hipoxia, y que a su vez podría ser regulada positivamente por la represión de BRCA1 a través de E2F (Huang et al., 2007). En este punto es interesante plantear la hipótesis de qué ocurriría si se inhibiera la expresión de HIF-1, y de cómo ese hecho podría afectar a los fenómenos de quimioresistencia. Esta hipótesis abriría el debate de la posibilidad de revertir la quimioresistencia, fenómenos que podrían ser muy interesante a nivel clínico (Lelong-
116 Papel de MVP en la reparación del ADN, la progresión tumoral y la hipoxia en carcinoma cervical: impacto pronóstico Rebel et al., 2008). La manipulación farmacológica de HIF-1 puede ofrecer un nuevo enfoque terapéutico para enfermedades como el cáncer, especialmente en combinación con agentes anti-angiogénicos (Bergers et al., 1999), que reducirían aún más la oxigenación tumoral. Los resultados clínicos previos muestran una estrecha relación de la hipoxia clínica y el aumento de la angiogénesis y, en menor medida, con la alteración de la oncoproteína p53 (Lara et al., 2008). La respuesta clínica en pacientes que padecen tumores tratados esencialmente con radiación (como son el de cuello uterino y el cáncer de cabeza y cuello), depende, al menos en parte, de esos parámetros. La presencia de hipoxia, angiogénesis y alteración de p53 podrían conducir a las células tumorales a otras alteraciones, como el aumento de la inestabilidad genética, cambios en las propiedades oncogénicas, resistencia al tratamiento y mayor capacidad para metastatizar. Por otra parte, se ha demostrado que el gen ATM de la ataxia telangiectasia mutada, que desempeña un papel central en la respuesta al daño al ADN mediante la fosforilación de genes efectores como el Chk2 (que actúan inhibiendo la progresión del ciclo celular en respuesta a la activación de ATM), se activa por la hipoxia como respuesta al daño sobre ATM quinasa, pero no en relación con ATM quinasa y Rad3 (ATR). La proteína Chk2 es inducida por distintas señales de daño tales como radiaciones ionizantes, rayos UV, etc (Gibson et al., 2006; Zhou et al., 2000; Hangaishi et al., 2002; Tort et al., 2002) La regulación negativa del gen de la reparación no homologa (NHEJ) por la hipoxia es un tema controvertido (Meng et al., 2005; Sprong et al., 2006). Las primeras publicaciones del grupo de Glazer no mostraron cambios de los genes NHEJ en condiciones de hipoxia (Bindra et al., 2004). Pero una reciente publicación de este grupo define claramente un conjunto de genes que mostraron una disminución de su expresión en genes relacionados con NHEJ (por ejemplo, Ku70, ADN-PKcs, DNA ligasa IV, XRCC4) tanto en condiciones normales, como en malignas (Meng et al., 2005). Un estudio posterior en líneas de células de hámster chino deficiente en la recombinación homóloga mostró una disminución del ratio de mejora de oxígeno (OER) (Sprong et al., 2006). Por el contrario, el OER para la línea de DNA PKcs con deficiencia fue comparable a los controles de tipo salvaje. Sin embargo, las dos estirpes celulares de anemia de Fanconi también mostraron una reducción significativa en el OER. Pacientes con anemia de Fanconi mostraron defectos tanto en la reparación homóloga como en la no homóloga (Casado et al., 2005). En la presente serie de pacientes, la expresión tumoral de Ku70/80 está relacionada con la hipoxia también en el ámbito clínico. La hipoxia parece afectar
CAPÍTULO IV 117 ampliamente los sensores del daño al ADN y a los genes transductores de señales, mostrando un escenario impresionante de reparación de células defectuosas, en el que la NHEJ también se ve afectada. La inestabilidad genética causada por defectos en reparación inducida por hipoxia podría reducir la respuesta del tumor a la radiación a través del desarrollo de fenotipos de células resistentes. La proliferación y progresión tumoral, como se muestra en los tumores hipóxicos, podrían estar relacionados con el incremento en la expresión de E2F y también con la expresión de p53 alterada y la angiogénesis (Koumenis et al., 2001; Choi et al., 2003). Los resultados clínicos muestran una estrecha relación positiva entre la hipoxia y la angiogénesis y en menor medida con la alteración de la expresión de la oncoproteína p53. De hecho, la hipoxia parece inducir selectivamente el crecimiento del tumor, eliminando por apoptosis las células con p53 de tipo salvaje y por tanto favoreciendo la expansión clonal de las células p53 mutadas (Haensgen et al., 2001). Por otra parte, la hipoxia es un fuerte estímulo para la expresión de VEGF que, a su vez, es un importante factor angiogénico. Los pocos estudios clínicos publicados sobre el tema son controvertidos (Lyng et al., 1997; West et al., 2001). En el trabajo de West, no se observó relación entre hipoxia y la expresión de factores agiogénicos, entre los que estaba VEGF. En el estudio de Lyng, se observó una amplia heterogeneidad intratumoral respecto a la distribución del pO2. En los tumores cervicales, las regiones tumorales con densidad vascular, definida como la longitud vascular por unidad de volumen del tejido, se encontraba en el rango de 47-77 mm/mm3, y mostraron mayores niveles de p02 que las regiones tumorales con densidad vascular en el rango de 20-47 mm/mm3. Así mismo, estas últimas mostraron mayor p02 que las regiones con densidad vascular del tumor en el rango de 0-20 mm/mm3. Los resultados de este trabajo podrían sugerir que la hipoxia no está únicamente relacionada con los fenómenos de aumento de la inestabilidad genética, las propiedades oncogénicas o la metastatization, como ha sido sugerido previamente por numerosos autores. Sino que también podría estar detrás de los fenómenos de quimio-resistencia, debido fundamentalmente al nexo establecido entre la hipoxia y la expresión de MVP. Según este y otros estudios, lo esperado en los tumores de cuello uterino sería un aumento de la inestabilidad genética, de las propiedades oncogénicas, de la resistencia al tratamiento y de la mayor capacidad para realizar metástasis. Por otra parte, la regulación negativa del proceso de reparación de DSB, la expresión de p53 alterada y el aumento de la angiogénesis, son de destacada relevancia para predecir la respuesta
118 Papel de MVP en la reparación del ADN, la progresión tumoral y la hipoxia en carcinoma cervical: impacto pronóstico clínica en pacientes que padecen tumores que son tratados principalmente por radiación (es decir, de cuello uterino y cáncer de cabeza y cuello). En conclusión, la hipoxia inhibe la reparación NHEJ del ADN, disminuyendo la expresión Ku70/80, lo que combinado con un aumento de la angiogénesis y la expresión de p53 alterada crearía un ambiente propicio que favorecería a los mecanismos responsables de la progresión tumoral en el carcinoma de cuello uterino.
CAPÍTULO V LA SOBREEXPRESIÓN DE MVP Y/O IGF1R INDUCE RADIO-RESISTENCIA EN PACIENTES AFECTOS DE CARCINOMA CERVICAL TRATADOS CON RADIO Y QUIMIOTERAPIA
CAPÍTULO V 129 RESULTADOS Se llevó a cabo la determinación de la expresión de MVP para los 60 casos estudiados. Observamos una asociación positiva entre la expresión de ésta oncoproteína e IGF-1R, de tal manera que los tumores que presentaban altos niveles de expresión de MVP también tenían altos niveles de expresión de IGF-1R (χ2 test, p = 0.023) (Tabla2). T abla 2. Relación de la expresión de MVP y IGF-1R en tumores cervicales MVP (-) (+) (++) (+++) Total IGF-1R (-) 1 2 1 0 4 (+) 0 0 2 6 8 (++) 1 4 0 8 13 (+++) 0 5 4 26* 35 Total 2 11 7 40 60 *P = 0.023 Cincuenta pacientes tuvieron respuesta completa después del tratamiento (83.3% del total de individuos estudiados). La supervivencia libre de enfermedad loco-regional (LRDFS), la supervivencia libre de metástasis a distancia (DMFS), la supervivencia libre de enfermedad (DFS) y la supervivencia absoluta a los 5 años fueron de 73%, 91.9%, 73% y 72.3% respectivamente. No se observó asociación alguna entre la expresión de MVP y la evolución clínica de los pacientes (Tabla 3). La respuesta clínica al tratamiento fue el único factor predictivo relevante en relación a la supervivencia global, en análisis multivariante (p<0.0001, Exp (B) 32.835; I.C95%:5.697-189 .251). Se analizó el papel de MVP en relación al control local a largo plazo y a la supervivencia en aquellos pacientes que tuvieron respuesta clínica completa tras finalizar el tratamiento radioterápico. Todos aquellos pacientes con respuesta clínica completa que además presentaban expresión negativa o débilmente positiva para MVP (n = 17 pacientes) se mostraron libres de recidiva local, metástasis o muerte relacionada con la enfermedad; frente a 6 de los 33 pacientes que respondieron teniendo tumores con MVP fuertemente positivo.
130 Papel de MVP en la reparación del ADN, la progresión tumoral y la hipoxia en carcinoma cervical: impacto pronóstico Los resultados mostraron una tendencia a la significación estadística para la supervivencia libre de enfermedad loco-regional (LRDFS) (p = 0.087), la supervivencia libre de enfermedad (DFS) (p = 0.081) y la supervivencia global (p = 0.087) (datos no mostrados en la Tabla 3). Estos resultados son similares a otros obtenidos previamente en relación a IGF-1R. (Lloret et al., 2007). De hecho, 19 pacientes que tuvieron respuesta clínica completa y que presentaban además niveles negativos o débilmente positivos de expresión de IGF-1R, estaban libres de enfermedad local, a distancia o enfermedad relacionada con la muerte. La expresión de IGF-1R fue marginalmente predictiva para la supervivencia libre de enfermedad loco-regional (LRDFS) (p = 0.052), la supervivencia libre de enfermedad (DFS) (p = 0.051) y la supervivencia cáncer específica (CES) (p=0.049) (datos no mostrados en la Tabla 3). Los análisis combinados de la expresión de MVP y IGF-1R en los tumores, mostraron que los 27 pacientes que presentaron respuesta completa y que además tenían negativos o débilmente positivos niveles de expresión tanto de MVP como de IGF1R, estaban libres de enfermedad local, recaída o muerte relacionada a la enfermedad, en comparación con los seis de los 23 pacientes portadores de MVP y el IGF-1R fuertemente positiva, que tuvieron respuesta completa. Es más, observose que 10 Tabla 3. Relación de variables pronosticas y respuesta al tratamiento Variable Respuesta LRDFS DMFS DFS Supervivencia Edad P = 0.908 P = 0.458 P = 0.261 P = 0.465 P = 0.467 Estadio P = 0.007 P < 0.0001 P = 0.172 P < 0.0001 P < 0.0001 Histología P = 0.248 P = 0.015 P = 0.207 P = 0.015 P = 0.012 Grado P = 0.982 P = 0.661 P = 0.350 P = 0.662 P = 0.610 MVP P = 0.806 P = 0.193 P = 0.659 P = 0.190 P = 0.202 IGF-1R P = 0.198 P = 0.779 P = 0.10 P = 0.790 P = 0.803 Repuesta tumoral – – P = 0.091 – P < 0.0001* P = 0.0001 (Regresión de Cox).
CAPÍTULO V 131 pacientes con altos niveles de MVP y bajos niveles de IGF-1R, así como 8 pacientes con bajos niveles de MVP y altos niveles de IGF-1R, estaban también libres de enfermedad siempre y cuando hubieran tenido respuesta clínica completa al tratamiento. Los análisis de Long Rank para las curvas de supervivencia fueron especialmente relevantes y significativos para los casos de supervivencia libre de enfermedad loco-regional (LRDFS) (p = 0.006), supervivencia libre de enfermedad a distancia DDFS (p = 0.050), supervivencia libre de enfermedad (DFS) (p = 0.006) y supervivencia absoluta (p = 0.007) (Figura 1). Figura 1. Relación entre los niveles de expresión de MVP e IGF-1R en pacientes con respuesta clínica completa para (A) la supervivencia libre de enfermedad loco-regional (LRDFS), (B) supervivencia libre de enfermedad a distancia DDFS, (C) supervivencia libre de enfermedad (DFS) y (D) supervivencia absoluta
132 Papel de MVP en la reparación del ADN, la progresión tumoral y la hipoxia en carcinoma cervical: impacto pronóstico DISCUSIÓN Esta es la primera evidencia clínica de que existe una fuerte relación directa entre la expresión de IGF-1R y MVP, lo que sugiere que ambos genes se expresan habitualmente en los mismos tumores y, más interesante aún, que ambos necesitan expresarse para conferir quimio-radio-resistencia. Observamos excelentes cifras de supervivencia en el subgrupo de pacientes con bajos niveles de MVP y/o niveles bajos de IGF-1R que mostraron una vez que se obtuvo una respuesta completa al tratamiento. Por el contrario, no detectamos ninguna ventaja en aquellos pacientes con ambos marcadores negativos en comparación con aquellos con un marcador negativo. No hay datos disponibles sobre el papel de MVP en el carcinoma cervical o en los fenómenos de respuesta a la quimio-radioterapia. No obstante, se podría pensar que tanto MVP como IGF-1R incrementan la proliferación celular posiblemente a través de la activación de Src (Kim et al., 2006), PTEN (Minaguchi et al., 2006), o ERK (Xiang et al., 2006), asociado a una inhibición de la apoptosis a través del eje COP1/P53 ATM (Dornan et al., 2006). Este conjunto de procesos podrían conducir al desarrollo de resistencia tumoral a los agentes que dañarían al ADN, generando la subsecuente resistencia al tratamiento. Estos resultados mimetizan un reciente estudio publicado por Silva et al. donde el MVP se comportó como un fuerte predictor de la respuesta clínica en 78 pacientes con cáncer orofaríngeo. En este estudio se tuvo en cuenta que pueden haber diferencias significativas en la respuesta al tratamiento aunque las características tumorales y de tratamiento sean semejantes. De esta forma, se investigó la potencial asociación entre la expresión MVP y la respuesta al tratamiento en un grupo de pacientes con carcinoma orofaríngeo tratados con radioterapia. En un análisis multivariante, se mostró por primera vez que la elevación de la expresión de MVP estaba asociada con la resistencia a la radioterapia de los pacientes con carcinoma de células escamosas de cabeza y el cuello (HNSCC). Para este estudio, todos los pacientes recibieron radioterapia radical en el lugar principal de la afectación y, dependiendo del estado de los ganglios del cuello, también se sometieron a una disección cervical. De esta cohorte de pacientes, ninguno había recibido quimioterapia. En conclusión, la capacidad de predecir la respuesta al tratamiento, especialmente en relación a la respuesta a la radioterapia, podría aportar nuevos datos en el camino de la individualización del manejo de pacientes, facilitando la
CAPÍTULO V 133 elección de la modalidad de tratamiento primario o si se requiere o no tratamiento adyuvante (Silva et al., 2007). El presente estudio sugiere que los niveles de expresión combinados de MVP/IGF-1R pueden ser importantes para predecir la respuesta clínica en pacientes con cáncer cervical, aunque estos resultados preliminares deben ser confirmados en ensayos clínicos que incluyan un tamaño muestral mayor. Por otro lado, nuevos estudios que incluyen los marcadores PTEN, p53 y PI3K, son también necesarios para definir con precisión el papel de estas oncoproteínas en vías moleculares comunes de señalización.
CONCLUSIONES
CONCLUSIONES 137 CAPÍTULO VI CONCLUSIONES 1. Las partículas vaults, junto con otros factores aún por dilucidar, parecen ejecer algún papel en los mecanismos de reparación homóloga y no homóloga de daño al ADN. Si las vaults están sobreexpresadas, la reparación NHEJ puede ser suprimida a través de varios mecanismos. La inestabilidad genómica podría tener su origen en una inhibición de la reparación homóloga tras roturas dobles de la cadena de ADN, o por defectos en la reparación no homóloga. Estos eventos están asociados con la decisión de las células dañadas de sobrevivir y proliferar, lo que favorece la progresión del tumor y reduce la respuesta del tumor al tratamiento oncológico a través del desarrollo de fenotipos resistentes. 2. La hipoxia inhibe la reparación NHEJ del ADN por la disminución de la expresión de Ku70/80 combinado con un aumento de la angiogénesis y la inducción de la expresión de p53 alterada, por lo que aumenta la inestabilidad genómica. 3. La hipoxia en combinación con altos niveles de expresión de MVP podría estar relacionada con el desarrollo de nuevas vías de quimio-resistencia. 4. La combinación de la expresión de MVP/IGF-1R puede ser importante para predecir la respuesta clínica en pacientes con carcinoma cervical, aunque estos resultados preliminares deben ser confirmados por un ensayo clínico más grandes. Por otro lado, nuevos estudios incluyendo marcadores PTEN, P53 y PI3K serían necesarios para definir con precisión el papel en común de estas proteínas con las vías moleculares.
CONCLUSIONES 139 Conclusions 1. Vaults, together with other factors, may play a role in the homologous and nonhomologous end joining repair to the DNA. NHEJ repair systmem seems to be supressed when vaults are overexpressed. Genome instability could be caused by an inhibition of the homologous repair mechanisms after double strand breaks of the DNA or by defects in the NHEJ repair. These events may be associated with the decision of the damaged cells to survive and proliferate, fauvoring tumour progresión and reducing tumour response to treatment developing resistance phenotypes. 2. Hypoxia inhibits NHEJ repair of the DNA through the inhibition of Ku70/80 expression, together with an increment of angiogenesis and induction of altered p53. These events produce, at least, genome instability. 3. Hypoxia and high MVP expression may be associated with new mechanisms for the development of chemoresistance. 4. MVP/IGF-1R expression may be of relevante for predicting clinical response in cervical cancer patients, although additional clinical studies are necessary to test this hypothesis. PTEN, P53 or PI3K should be included in those studies to better understand the common roles that these proteins seem to have.
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