Variantes génicas asociadas a neuroinflamación en la enfermedad de Alzheimer en Canarias

VARIANTES GÉNICAS ASOCIADAS A NEUROINFLAMACIÓN EN LA ENFERMEDAD DE ALZHEIMER EN CANARIAS Tesis Doctoral presentada por Mª Cándida Déniz Naranjo para optar al grado de Doctor Vº Bº DIRECTORES DEL TRABAJO D. Florentino Sánchez García Dña. Carmen Muñoz Fernández Las Palmas de Gran Canaria, a Julio de 2009 AGRADECIMIENTOS En 1998 me hicieron una pregunta un tanto delicada: “¿Tienes novio?”, “No”, contesté. “Mejor, porque no ibas a tener mucho tiempo para verle”. Afortunadamente, no me acobardé, y desafortunadamente, tenía razón quien me hizo esta pregunta. Así comenzó esta andadura junto a Florentino y Carmen, y junto a otros compañeros, amigos y familiares, que en mayor o menor medida, han estado durante todo este largo período y que he de mencionar. Empezaré a dar las gracias por el final, es decir, por mis actuales compañeros en Microbiología del Hospital Son Dureta de Mallorca: mis “queridos mallorquines”. Gracias a los chicos de la Unidad de Investigación, Carlos, Tomeu y Laura, que me han aceptado como a una más, prácticamente sin conocerme. A mis compañeros TEL y auxiliares administrativos del servicio, por enseñarme y guiarme en todo lo que saben. A los adjuntos, Pedro Alomar, José Gil, Jordi Reina, Xisco Salvá, Antonio Ramírez y Nuria Borrell, por animarme y enseñarme. A mi tutor, Antonio Oliver, y a mi actual jefe, José Luis Pérez, por animarme y apoyarme en la elaboración de la tesis, aún a costa de sacrificar tiempo para la residencia. A mis compañeros residentes, Virginia, Carmen, Elena y el mejor co-residente que he tenido nunca jamás, Xavi; ellos han sido mis compañeros de guardias, de sesiones bibliográficas, de sesiones clínicas, de protestas, de alegrías... Con ellos, y, sobre todo, de ellos, he aprendido muchas cosas, además de estar cuando los he necesitado de veras. Tengo una mención especial para Mariló y Aina, que además de ser mis “adjuntas y superiores favoritas”, se han convertido, junto con Laurita, en esas personas que a una se les queda en el corazón para siempre. Gracias chicas. De vuelta a Canarias, mi primer agradecimiento es para todos los pacientes, familiares y voluntarios sin deterioro cognitivo, que colaboraron con nosotros en los proyectos que se llevaron a cabo. Sin ellos, evidentemente, nada de todo esto hubiera sido posible. Espero que estos trabajos aporten un granito de arena a todo el esfuerzo que se está haciendo en la lucha contra esta terrible enfermedad. Gracias y mucha fuerza. Gracias al Fondo de Investigación Sanitaria (FIS), del Instituto de Salud Carlos III, y a la Fundación Canaria de Investigación y Salud (FUNCIS), por el apoyo y financiación de todos los proyectos que han dado lugar a esta tesis. Mi agradecimiento, también, a los neurólogos de los distintos hospitales canarios que han participado en los proyectos de investigación de estos años, puesto que han colaborado desinteresadamente, con gran esfuerzo y dedicación por su parte: -Hospital De Gran Canaria Dr. Negrín (Gran Canaria): Mª Jesús Alemany, Mª Carmen Pérez Viéitez, Jesús Rodríguez Gallego, Alberto Cubero y Yolanda Aladro. -Hospital Insular (Gran Canaria): Rafael García -Hospital Nuestra Señora de Candelaria (Tenerife): Antonio Alayón. De entre ellos, permítanme que destaque a Carmen Muñoz, codirectora de esta tesis: Gracias, no sólo por codirigir y orientar los trabajos, sino también por enseñarme lo que es ser una gran profesional y, sobre todo, lo que es una persona trabajadora, luchadora, y con mucha fuerza para tirar pa’lante en los peores momentos. Gracias, Carmen, por ser un modelo a seguir. Gracias a la Unidades de Investigación y de Ilustración del Hospital de Gran Canaria Dr. Negrín, con José Carlos Rodríguez a la cabeza, y con muy buenos compañeros, con los que también he pasado buenos momentos: Ramón, Juan Verona, Inma, Fran, Rula, Octavio, Yaridé, Antonio, Alejandro, Arantxa, Heriberto y Lidia. Y a los que estuvieron en algún momento en la Unidad, pero “emigraron a otros lares”: Fayna, Sandra y Araceli. Inmuno: ¿Como se le puede dar las gracias a toda esta gente, con la que tantos momentos buenos (y también algún que otro menos bueno) he pasado?. La verdad es que no lo sé. Nombrarles parece poco, y si fuera a contar todo lo que he vivido con ellos, creo que tendría para escribir más de un libro. Gracias a los que siempre serán mis compañeros y amigos: Belén, Rita, Isa Molina, Ana, Nereida, Maika, Esther, Mari, Elisa, Ithaisa, Carlos y Carmela (reconoce que he sido tu mejor pesadilla). A los que llegaron cuando yo casi me iba: Toni, Fausto y Mari Nieves. Y a los que se fueron: Ana Manzanedo, Ione, Ayoze, Jessica, Auri, Alicia, Gina y María. A los “satélites” del servicio: María y Juncal Irurita (no concibo el servicio sin ellas y sin sus deliciosos “queques” de especias); Antoli, reconocida y deseada fisioterapeuta (creo que casi todos hemos caído en sus manos…); Paqui y Paco, de TB Diagnost, S.A. (no se imaginan lo buena gente que son y todo lo que han hecho por mí); Popo e Inma Alarcón, los amigos de enfrente; Juani Perera, por las buenas risas que nos hemos echado en los congresos. Y perdonar si he olvidado a alguien, han sido muchas personas en estos años. En el terreno más personal: A mis amigos “de fuera de la ciencia”, por aguantar las lloreras, los momentos de precariedad, de no poder estar con ellos, por estar siempre conmigo, por animarme, por enfadarse, por reírse… Por todo: Jose Luis, Nory, Alonso, Ana, Paco, Pino, Lidia, Enrique, Raquel, Enrique Armas, Mario, MªCarmen, Cristina, Esther, Eva, Pilar y Paco Navarro. A las verdaderas chicas de oro, porque valen su peso en el ídem: Isabel, Maite, y María José, por todo este tiempo de ayuda, consejos, llantos, risas y “auto-homenajes”. Gracias por estar, chicas, no sé si ésto hubiera salido adelante si ustedes no hubieran estado cerca. A Florentino No sabía en que parte ponerte: ¿director?... ¿jefe del servicio?... He decidido mencionarte en el apartado del terreno personal porque ya que hace mucho que dejaste de ser mi jefe, en el sentido estricto, para convertirte en uno de mis mejores amigos. Y es mucho lo que tengo que agradecerte: Por confiar en mí. Por darme una… no, perdón, más de una oportunidad en esta vida: estoy donde estoy gracias a ti. Por guiarme y enseñarme, no sólo profesionalmente, sino también para intentar ser mejor persona. Por apoyarme y animarme, tanto profesional como personalmente. Gracias. Y por último, mi mayor agradecimiento es para mis padres, Rafael y Maquita, que son lo mejor que me ha dado la vida. Gracias por concederme siempre la libertad para elegir y hacer (incluso cuando me equivocaba). Por enseñarme y darme todo sin esperar nada. Por animarme y apoyarme, confiando siempre en mí. Les quiero mucho. Candi Las Palmas de Gran Canaria Junio de 2009 DEDICADO A LOS QUE, INVOLUNTARIAMENTE, OLVIDARON Y NOS DEJARON… SIN IRSE. INDICE ABREVIATURAS ABREVIATURAS...........................................................................................................................I INTRODUCCIÓN INTRODUCCIÓN ..........................................................................................................................1 1.- Envejecer ................................................................................................................................. 1 1.1.- ¿Qué es el envejecimiento? .............................................................................................. 1 1.2.- Demencia........................................................................................................................... 2 2.- Enfermedad de Alzheimer........................................................................................................ 3 2.1.- Prevalencia e Incidencia .................................................................................................... 5 2.2.- Características patológicas................................................................................................ 6 2.2.1.- Anatómicas ................................................................................................................ 6 2.2.2.- Histopatológicas......................................................................................................... 6 2.2.3.- Neuroquímicas...........................................................................................................7 2.3.- Tipos de Enfermedad de Alzheimer................................................................................... 9 2.4.- Principales factores de riesgo.......................................................................................... 10 2.4.1.- Edad......................................................................................................................... 10 2.4.2.- Historia familiar ........................................................................................................ 10 2.4.3.- Género ..................................................................................................................... 11 2.4.4.- Susceptibilidad genética .......................................................................................... 11 2.5.- Fenotipo neuropatológico de la EA.................................................................................. 12 2.5.1.- Placas amiloideas, neuríticas o seniles ..................................................................12 2.5.2.- Ovillos o redes neurofibrilares................................................................................. 13 2.6.- Bases genética y molecular de la EA ................................................................................. 14 2.6.1.- Gen APP y proteína precursora del amiloide......................................................... 15 2.6.2.- Genes PSEN1 y PSEN2. Presenilinas 1 Y 2 .......................................................... 19 2.6.3.- Hipótesis del amiloide ............................................................................................. 21 2.6.4.- Gen APOE y apolipoproteína E............................................................................... 23 2.6.5.- Proteína tau hiperfosforilada ................................................................................... 27 2.6.6.- ¿Cómo se relacionana el péptido amiloide y la proteína tau?................................ 28 2.6.7.- Otros genes............................................................................................................. 30 3.- Neuroinflamación ................................................................................................................... 33 3.1.- Butirilcolinesterasa........................................................................................................... 34 3.2.- Mieloperoxidasa............................................................................................................... 38 3.3.- Sistema HLA .................................................................................................................... 39 3.4.- Citoquinas ........................................................................................................................ 41 3.4.1.- Interleuquina-1 (IL-1)............................................................................................... 42 3.4.2.- Interleuquina-6 (IL-6)............................................................................................... 43 3.4.3.- Factor de necrosis tumoral-alfa (TNF-alfa) ............................................................. 45 3.4.4.- Interferón gamma (IFN-gamma).............................................................................. 46 3.4.5.- Interleuquina 10 (IL-10)........................................................................................... 46 3.4.6.- Factor de Crecimiento Transformante (TGF-β1)..................................................... 47 3.4.7.- Influencia de los polimorfismos genéticos de citoquinas en el tratamiento.-.......... 48 4.- Otros factores asociados ....................................................................................................... 49 4.1.- Traumatismo craneoencefálico........................................................................................ 49 4.2.- Metales............................................................................................................................. 49 4.3.- Agentes patógenos ..........................................................................................................50 4.4.- Estrógenos ....................................................................................................................... 52 4.5.- Síndrome metabólico ....................................................................................................... 52 4.6.- Micronutrientes................................................................................................................. 53 OBJETIVOS OBJETIVOS................................................................................................................................54 MATERIAL Y MÉTODOS SUJETOS.................................................................................................................................... 56 1.- Diseño .................................................................................................................................... 56 2.- Pacientes................................................................................................................................ 56 3.- Controles................................................................................................................................ 56 4.- Variables estudiadas..............................................................................................................57 5.- Limitaciones del estudio......................................................................................................... 58 MATERIAL Y MÉTODOS............................................................................................................ 59 1.- Extracción de ADN................................................................................................................. 59 2.- Amplificación genómica de los genes a estudio .................................................................... 63 2.1.- Estudio de los genes APOE, BCH, MPO e IL-1 ............................................................. 65 2.1.1.- APOE....................................................................................................................... 66 2.1.2.- BUTIRILCOLINESTERASA .................................................................................... 67 2.1.3.- MIELOPEROXIDASA.............................................................................................. 69 2.1.4.- INTERLEUQUINA-1................................................................................................ 70 2.2.- Estudio del sistema HLA (HLA-A Y HLA-DR) ................................................................. 74 2.2.1.- HLA-A......................................................................................................................74 2.2.2.- HLA-DR ...................................................................................................................76 2.3Estudio de los genes de citoquinas: TNF-alfa, TGF-beta, IL-10, IL-6, IFN-gamma ......... 78 3.- Análisis estadístico................................................................................................................. 80 RESULTADOS RESULTADOS...………………………………………………………………………………………..81 1.- Casuística............................................................................................................................... 81 2.- Edad al diagnóstico................................................................................................................ 82 3.- Género ................................................................................................................................... 82 4.- Variables genéticas................................................................................................................ 83 4.1.- Apolipoproteína E.............................................................................................................84 4.2.- Butirilcolinesterasa........................................................................................................... 87 4.3.- Mieloperoxidasa............................................................................................................... 91 4.4.- Citoquinas: TNF-alfa, TGF-beta1, IFN-gamma, IL-10, IL-1alfa, IL-1beta e IL-6.............. 93 4.4.1.-TNF-alfa (-308 G/A).................................................................................................. 94 4.4.2.- TGF-beta1 (+10T/C)................................................................................................ 95 4.4.3.-TGF-beta1 (+25 G/A) ............................................................................................... 96 4.4.4.- IFN-gamma (+874 T/A) ........................................................................................... 97 4.4.5.- IL-10 (-1082 G/A)..................................................................................................... 98 4.4.6.- IL-10 (-819 C/T).......................................................................................................99 4.4.7.- IL-10 (-592 C/A)..................................................................................................... 100 4.4.8.- IL-1 alfa (-889 C/T) ................................................................................................ 101 4.4.9.- IL-1 beta (+3953 T/C)............................................................................................ 102 4.4.10.- IL-1 beta (-511 T/C).............................................................................................103 4.4.11IL-6 (-174 G/C) ..................................................................................................... 105 4.5.- Sistema HLA .................................................................................................................. 107 4.5.1.- HLA-A2..................................................................................................................107 4.5.2.- HLA-DR2 ............................................................................................................... 108 5.- Estudio multivariable de los polimorfismos analizados........................................................ 109 DISCUSIÓN DISCUSIÓN……………………………………………………………………………………………111 1.- Edad al diagnóstico.............................................................................................................. 111 2.- Género ................................................................................................................................. 112 3.- Marcadores genéticos..........................................................................................................113 3.1.- Apolipoproteína E...........................................................................................................114 3.2.- Butirilcolinesterasa......................................................................................................... 116 3.3.- Mieloperoxidasa.............................................................................................................118 3.4.- Citoquinas TNF-alfa, TGF-beta1, IFN-gamma, IL-10, IL-1alfa, IL-1beta e IL-6 y sistema HLA............................................................................................................................................120 4.- Estudio multivariable de los marcadores analizados...........................................................123 5.- ¿Son útiles estos marcadores para el diagnóstico clínico?................................................. 123 CONCLUSIONES CONCLUSIONES......................................................................................................................125 BIBLIOGRAFÍA BIBLIOGRAFÍA.....….................................................................................................................128 ANEXO I: CRITERIOS DIAGNOSTICOS CRITERIOS DIAGNÓSTICOS..……………………………………………………………………...151 Diagnóstico de Demencia ......................................................................................................... 151 Diagnóstico de Enfermedad de Alzheimer................................................................................ 153 ANEXO II: PUBLICACIONES • Gender has a strong modulating effect on the risk of Alzheimer's disease conferred by the apolipoprotein E gene in the population of the Canary Islands, Spain • Butyrylcholinesterase, ApoE and Alzheimer's disease in a population from the Canary Islands (Spain) • Cytokine IL-1 beta but not IL-1 alpha promoter polymorphism is associated with Alzheimer disease in a population from the Canary Islands, Spain INTRODUCCIÓN pérdida patológica, sino biológica, y sus manifestaciones fenotípicas son diferentes de las que originan las enfermedades crónicas. Todos los órganos y sistemas del individuo sufren el envejecimiento, aunque en cada uno de ellos se presenta con algunas características especiales en base a diversas circunstancias propias de las células que los forman [Peinado, 2000]. Dentro de las enfermedades del envejecimiento, la demencia se ha convertido en la gran amenaza para el bienestar y la salud de las personas mayores, de sus familias y de la sociedad en general, e implica una carga sanitaria, social, psicológica y económica significativa [Boada,1999; López-Pousa, 2004]. 1.2.- DEMENCIA El término demencia deriva del latín "demens, dementatus" que significa “sin mente” y se define como una pérdida de las funciones intelectuales, debido a daños o desórdenes cerebrales más allá de los atribuibles al envejecimiento normal, que impide el funcionamiento independiente del sujeto en su medio social habitual. Según Cummings y Benson es "un deterioro intelectual adquirido persistente que afecta al menos tres de los siguientes dominios: lenguaje, memoria, percepción visual-espacial, emociones/personalidad y funciones cognitivas ejecutivas" [Cummings, 1980]. Estas funciones no degeneran todas al mismo tiempo, sino que el proceso es continuo, aumentando el número de funciones afectas con deterioro progresivo, siendo generalmente el déficit de memoria, asociada o no a trastornos de conducta, la primera alteración que percibe el enfermo o sus parientes más cercanos. Hoy en día y en la mayoría de los países, el diagnóstico de demencia se hace siguiendo las recomendaciones propuestas por la Organización Mundial de la Salud (OMS) en la Décima Clasificación Internacional de Enfermedades (CIE-10, 1992) y - 2 - INTRODUCCIÓN por la Asociación Americana de Psiquiatría (American Psychiatric Association), recogido en el Manual de Diagnóstico Estadístico (DSM-IV, 1994) (ANEXO I). Dentro de las demencias, la Enfermedad de Alzheimer representa el 65-70% de todos los casos de demencia, seguida por la demencia vascular o mixta, según algunos autores [Bermejo-Pareja, 2008], o la demencia por cuerpos de Lewy, como se sugiere en otros trabajos [Aarsland, 2008]. 2.- ENFERMEDAD DE ALZHEIMER Alois Alzheimer presentaba por vez primera, en 1906, la descripción de una enfermedad de la corteza cerebral en una mujer de 51 años, la cual presentaba pérdida de memoria, desorientación, alucinaciones y demenciación progresiva que la llevaron a morir con sólo 55 años de edad. Al mismo tiempo, Alzheimer presentó el estudio anatomopatológico de su cerebro, mostrando que la corteza cerebral estaba atrófica y existían, además, dos tipos de anomalías muy llamativas: una especie de esferas o acúmulos extraneuronales, constituidos por un material anómalo (placas seniles); y unas acumulaciones de material aparentemente fibroso en el interior de las neuronas (ovillos neurofibrilares). Esta enfermedad está caracterizada por un declive gradual e irreversible de las funciones cerebrales superiores o cognoscitivas, con desorientación, daños en memoria y lenguaje, agnosia y apraxia [Rubin, 1987; Starkstein, 1996]. En algunos casos, en las primeras fases de la enfermedad se acompaña de alteraciones mentales de carácter no cognoscitivo (depresión, ansiedad, apatía, alucinaciones, psicosis, etc.) y del comportamiento (irritabilidad, indiferencia, agitación psicomotriz, agresividad, trastornos sexuales, del sueño y el apetito etc). Cuando la enfermedad progresa aparecen otros síntomas: clínica extrapiramidal, mioclonías, crisis, reflejos de liberación frontal, espasticidad, incontinencia, apraxia masticatoria y disfagia. La enfermedad se puede estratificar en tres estadios: el primero dura de 1 a 3 años, los - 3 - INTRODUCCIÓN primeros trastornos de memoria se inician con dificultad para aprender material nuevo, en menor grado se afecta la memoria tardía, hay dificultad para encontrar palabras, desorientación topográfica, irritabilidad y síntomas depresivos. El segundo dura de 2 a 10 años, la memoria reciente y tardía están afectas de forma severa, aparece una afasia afluente, apraxia ideomotora, falla la orientación espacial, el cálculo y tienden a la inquietud psicomotriz. En el último estadio que dura de 8 a 12 años, el deterioro neuropsicológico es severo, aparecen síntomas motores extrapiramidales y termina en tetraplejia espástica en flexión [Cummings, 1992]. La progresión de los síntomas produce una interferencia grave en la realización de las tareas diarias y en los cuidados básicos, originándose una gran discapacidad y una dependencia, que llega a ser total, del cuidador. Casi 80 años después de la descripción de Alzheimer, en 1984, el Instituto Nacional de Desórdenes y Daños Neurológicos y Comunicativos, y las Asociaciones de Enfermedad de Alzheimer y Desórdenes Relacionados (NINCDS & ADRDA), establecía los criterios clínicos estandarizados para el diagnóstico de la Enfermedad de Alzheimer. Estos criterios no permiten un diagnóstico temprano, en fases precoces en ausencia de demencia, ni un diagnóstico etiológico directo ya que se basan en la exclusión de otros procesos. La figura del deterioro cognitivo leve (DCL) tampoco ha mejorado la rentabilidad diagnóstica. Identifica un estado incipiente de EA en pacientes con DCL tipo amnésico, pero por su definición clínica, incluye una amplia heterogeneidad de pacientes que pueden evolucionar a otros tipos de demencia diferente de EA, permanecer estables o mejorar [Gauthier, 2006]. La combinación de biomarcadores específicos de neuroimagen y de LCR se ha utilizado con la finalidad de aumentar la certeza diagnóstica. Así se recoge en la revisión de 2002 de Robles et al, apoyada por la Sociedad Española de Neurología (SEN) [Robles, 2002], y en los nuevos criterios de investigación para el diagnóstico de EA de Dubois et al en 2007 [Dubois, 2007] (ANEXO I). - 4 - INTRODUCCIÓN Desde el punto de vista macroscópico, la atrofia del hipocampo medida por RM, aunque no es específica de EA, se correlaciona sensiblemente con los cambios patológicos de la EA [Jack, 2002]. La neuroimagen funcional puede demostrar hipometabolismo en estructuras límbicas y corteza de asociación temporo-parietal y frontal mediante tomografía por emisión de positrones (PET) [Nestor, 2003] o hipometabolismo por tomografía computarizada por emisión de fotones simples (SPECT) [Jagust, 2001]. Los nuevos trazadores de imagen del PET se unen a los depósitos de amiloide y también a los ovillos neurofibrilares suministrando imágenes de su distribución“in vivo [Tolboom, 2009]. El descenso de Aβ42 y el aumento de los niveles de la proteína tau total y fosforilada en LCR, comentados más adelante, son biomarcadores que se asocian significativamente con las alteraciones neuropatológicas de la EA [Tapiola, 2009]. También se han identificado proteínas sanguíneas relacionadas con la desregularización sistémica y la muerte neuronal en la EA [Ray, 2007]. La búsqueda actual se centra en el desarrollo de biomarcadores que permitan un diagnóstico etiológico e identificar la fase preclínica de la EA en vistas a modificar terapéuticamente su progresión. 2.1.- PREVALENCIA E INCIDENCIA.- El número de casos de enfermedad de Alzheimer aumenta a medida que aumenta la edad media de la población. En nuestro país, esta enfermedad tiene una prevalencia global del 4,6%, donde, por grupos de edad, afecta a un 0,6% de la población entre 65-74 años, a un 7,9% de la población entre 75-84 años, y a un 16,2% de la población mayor de 85 años (22,2% mayor de 90 años) [García-García, 2001; Lobo, 2000], y con una media de los ratios de incidencia (per 1.000 personas-año), de 7,4 en población de 65 a 90 años [Bermejo, 2008], pudiendo llegar hasta 20,7 [Fratiglioni, 2000]. - 5 - INTRODUCCIÓN 2.2.- CARACTERÍSTICAS PATOLÓGICAS.- 2.2.1.- ANATÓMICAS El estudio post mórtem de los cerebros de enfermos de Alzheimer refleja, a simple vista, una disminución del peso, del volumen cerebral y del espesor de la corteza, ensanchamiento de ventrículos, aumento de líquido cefalorraquídeo y disminución de sustancia blanca [Peinado, 2000] (fig.I1). Figura I1.- Comparación de un cerebro sano (izqda) y un cerebro de EA (dcha) (Imagen tomada y modificada de http://www.javeriana.edu.co/Facultades/Ciencias/neurobioquimica/libros/neurobioquimic a/Alzheimer.htm) 2.2.2.- HISTOPATOLÓGICAS El estudio microscópico del cerebro de un paciente de Alzheimer, revela una disminución en el número de neuronas en las zonas más relacionadas con las funciones cognoscitivas, en especial en la corteza entorrinal, el hipocampo, la corteza temporo-parietal y la corteza frontal en la zona superficial, así como en diversos núcleos grises internos, como la sustancia innominada o región del núcleo de Meynert y el locus coeruleus. Además, en muchas de las neuronas restantes se observan alteraciones patológicas como signos de atrofia del cuerpo y acortamiento y reducción - 6 - INTRODUCCIÓN del número de dendritas y de las conexiones sinápticas neuronales, engrosamientos y varicosidades a lo largo de las prolongaciones [Brun, 1976; Brun, 1981]. Los depósitos extracelulares descritos por Alois Alzheimer están compuestos por amiloide extracelular, formando las placas neuríticas circundadas de neuritas anómalas y de microglía, la cual, generalmente, se observa dentro y adyacente al núcleo central de la placa y que se encuentra expresando antígenos de superficie relacionados con activación, tales como el CD45 o el HLA-DR. Estos depósitos están, además, rodeados por astrocitos reactivos con abundantes filamentos gliales. Las placas difusas (preamiloides) se encuentran frecuentemente a nivel meningovascular y no se acompañan de neuritas distrófica. El amiloide se deposita también en arteriolas, capilares y vénulas de la meninge y corteza cerebral, raramente en sustancia blanca, constituyendo la angiopatía amiloide que produce una perturbación importante de la barrera hematoencefálica. La zona inicial de acumulación parece ser la parte externa de la membrana basal y puede extenderse al parénquima circundante [Selkoe, 2001]. La degeneración neurofibrilar esta compuesta por agregados intraneuronales de parejas de filamentos plegados helicoidalmente, fundamentalmente formados por proteína tau, proteína asociada a los microtúbulos en estado hiperfosforilado. Las redes neurofibrilares, exhiben un diseño característico de distribución que permite la diferenciación de seis estadios progresivos de la enfermedad [Braak, 1991]. 2.2.3.- NEUROQUÍMICAS 2.2.3.1. NEUROTRANSMISORES La acetilcolina (ACh) es un importante neurotransmisor que transmite las señales, principalmente, entre las neuronas cerebrales, uniéndose a dos tipos de receptores, nicotínicos y muscarínicos, y cuya actividad, en el cerebro, finaliza con la acción hidrolítica de las colinesterasas, principalmente acetilcolinesterasa (AChE). - 7 - INTRODUCCIÓN Una de las anormalidades neuroquímicas más pronunciadas en la EA es la disfunción colinérgica en el sistema nervioso central, de tal manera que las neuronas colinérgicas de los núcleos de la región cerebrobasal, que se proyectan al hipocampo y a extensas áreas corticales, van degenerando. Este defecto colinérgico podría ser responsable de muchas de las alteraciones cognitivas y de algunos de los síntomas psíquicos de los pacientes de Alzheimer [Davies, 1976]. Pero el déficit colinérgico no es el único que se encuentra en estos pacientes: desde principio de los años 80, se ha observado como otros neurotransmisores (noradrenalina, ácido gamma-aminobutírico (GABA), somastotatina, y dopamina), también tienen sus niveles reducidos [Rossor, 1984; Gottfries, 1985; Beal, 1986; Garcia-Alloza, 2006]. 2.2.3.2. ESTRÉS OXIDATIVO El estrés oxidativo es el resultado del desequilibrio entre la producción elevada de radicales libres (átomos o moléculas que tienen orbitales con un solo electrón impar que son muy inestables) y el descenso en la eliminación de éstos o de los mecanismos necesarios para reparar las macromoléculas oxidadas. Los radicales libres, tales como el ión hidroxilo, el peróxido de hidrógeno y el peroxinitrito, inducen citotoxicidad a través de la oxidación de proteínas, lípidos y ácidos nucleicos [Thomas, 2007]. Las neuronas son particularmente vulnerables a los efectos dañinos de los radicales libres, debido a sus niveles bajos de antioxidantes naturales y de la alta demanda de oxígeno necesario para el mantenimiento del metabolismo cerebral, el cual es también un buen sustrato en reacciones cuyos compuestos primarios producen radicales libres [Christen, 2000]. - 8 - INTRODUCCIÓN Diversos estudios han confirmado la participación del estrés oxidativo en la enfermedad de Alzheimer [Mecocci, 1998; Gabbita ,1998], observándose daño nuclear y mitocondrial en los cerebros de pacientes de Alzheimer [Christen, 2000], así como marcadores oxidativos colocalizados en las lesiones neuropatológicas de la EA [Guimera, 2002]. 2.2.3.3. INFLAMACIÓN Las células gliales regulan la actividad nerviosa ya que intervienen en fenómenos de plasticidad neuronal, supervivencia de las neuronas, nutrición neuronal, regulación del crecimiento, detoxificación y regulación homeostática [Guimera, 2002]. El aumento de la reactividad microglial es otro de los fenómenos que contribuyen a exacerbar la lesión neurodegenerativa en las áreas cerebrales afectadas, produciéndose pérdida sináptica y muerte celular neuronal [Aisen, 1994; Tanzi, 2000; Griffin, 2006]. 2.3.- TIPOS DE ENFERMEDAD DE ALZHEIMER.- La enfermedad de Alzheimer puede ser clasificada atendiendo a dos criterios principales: (1) la edad en la que se presenta y (2) los antecendentes familiares: 1) Según la edad de aparición tenemos la EA de inicio temprano o presenil (EOAD), que representa el 1% de los casos, y EA de aparición tardía o esporádica (LOAD) cuando aparece después de los 60/65 años [Bullido, 2002; Manzano, 2009], con un 90% de los casos. 2) Cuando tenemos en cuenta la historia familiar, se divide en forma familiar y forma esporádica, siendo esta última la más abundante (90-95% del total de los casos) [Manzano, 2009]. - 9 - INTRODUCCIÓN Con esto, la enfermedad ha sido universalmente dividida en dos grandes grupos: EA familiar-temprana, con un 10% de los casos, y EA esporádica-tardía, que es el tipo mayoritario, representando al, aproximadamente, 90% de los casos [Thinakaran, 1999]. Aunque las características anatomopatológicas son similares en ambos grupos, las manifestaciones clínicas difieren en algunos aspectos, de tal manera que las formas tempranas son más frecuentes en el género masculino, predominando los trastornos de conducta, mientras que las formas tardías son más frecuentes en mujeres, predominando los trastornos cognitivos [Blennow, 2006; Vilalta-Franch, 2007]. 2.4.- PRINCIPALES FACTORES DE RIESGO.- 2.4.1.- EDAD Es el principal factor de riesgo de esta enfermedad, de tal modo que la prevalencia se incrementa de forma exponencial con la edad. Como ya se ha comentado, la EA afecta a un 0,6% de la población entre 65-74 años, a un 7,9% de la población entre 75-84 años, y a un 16,2% de la población mayor de 85 años (22,2% mayor de 90 años) [García-García, 2001; Lobo, 2000], aunque lo que ocurre exactamente por encima de los 90 años, tiene una explicación más compleja, debido a los escasos estudios sobre incidencia en esta franja de edad, y al bajo poder estadístico de los datos por el pequeño número de casos [Manzano, 2009]. 2.4.2.- HISTORIA FAMILIAR Cuando existen antecedentes familiares, el riesgo de padecer la enfermedad se incrementa cuatro veces más; de hecho, se piensa que cerca del 33% de los casos de EA son de origen familiar [Rocca, 1991]. - 10 - INTRODUCCIÓN 2.4.3.- GÉNERO Tradicionalmente se admite que la enfermedad de Alzheimer tiene mayor prevalencia en el género femenino que en el masculino. Primero se achacó esta diferencia a que las mujeres suelen vivir más tiempo que los hombres, sin embargo, estudios de incidencia han demostrado la “preferencia” de esta enfermedad por el sexo femenino [Rocca, 1991]. 2.4.4.- SUSCEPTIBILIDAD GENÉTICA El estudio de las formas familiares de EA, condujo al descubrimiento e identificación de tres genes (de los que se hablará más adelante) en los cromosomas 21, 14 y 1, como portadores de mutaciones que explican la mayoría de los casos de este tipo de EA. La historia familiar de síndrome de Down (trisomía del cromosoma 21), aumenta de forma significativa el riesgo de EA, lo que podría vincularse con los hallazgos neuropatológicos de EA cuando fallecen de adultos [Masters, 1985]. Aún así, hay familias con una forma hereditaria clara de EA en las que no se detecta mutaciones en ninguno de estos genes, de tal manera que no es descartable la posibilidad de que haya más genes con mutaciones causantes de EA [Bullido, 2002]. Respecto a los casos de EA tardía y esporádica, sin embargo, en la gran mayoría de éstos los factores genéticos no son los causantes de la enfermedad, sino que condicionan una mayor susceptibilidad, es decir, los factores genéticos de predisposición no tienen la fuerza necesaria para la expresión de la enfermedad pero sí producen un aumento del riesgo a los individuos portadores cuando se compara con los no portadores. En la actualidad, se han analizado un gran número de variaciones o polimorfismos de diferentes genes en pacientes con EA esporádica y tardía [Hoenicka, 2006], sin - 11 - INTRODUCCIÓN péptido amiloide: si corta en el residuo 711, se generará el Aβ40, mientras que si corta en 713 se formará Aβ42 [Selkoe, 2001; San Miguel, 2006]. El péptido amiloide resultado del corte proteolítico de estas dos enzimas, puede autoagregarse para formar las placas seniles (fig.I3). Figura I3.- Ruta amiloidogénica En 1991 se descubrieron las primeras mutaciones en el gen APP (cromosoma 21q21). Sin embargo, no han sido muchas las mutaciones que se presentan en el mismo, considerándosele responsable de tan sólo el 5-10% de las formas familiares autosómicas dominante de inicio precoz [Selkoe, 2001; Marchesi, 2005]. Estas mutaciones se concentran en las zonas adyacentes a los sitios de corte de app por alfa, beta y gamma secretasa [Theuns, 2000; Selkoe, 2001] [fig.I4]. En el primer caso, las mutaciones resultan en una inhibición del corte de app por la alfa-secretasa; en los otros casos, las mutaciones dan lugar al proceso inverso, es decir, facilitan el corte de app por las secretasas beta y gamma [Herl, 2009]. - 18 - INTRODUCCIÓN En cualquier caso, todas estas mutaciones interfieren con el procesamiento normal de la app, conduciendo a un incremento en la secreción de péptido amiloide. Figura I4.- Algunas de las mutaciones descritas para APP 2.6.2.- GENES PSEN1 y PSEN2. PRESENILINAS 1 Y 2 (ps1, ps2) El descubrimiento de la forma autosómica dominante de herencia de la enfermedad de Alzheimer, llevó a la búsqueda intensiva de loci en el genoma, además del de app, que pudieran explicar muchos de los casos familiares no unidos al cromosoma 21. Así, en 1992, se describió la existencia de ligamiento genético del cromosoma 14 con algunas de estas familias [Schellenberg, 1992], identificándose un gen en 14q, cuyo producto, presenilina 1 (ps1), contenía múltiples dominios transmembrana [Sherrington, 1995]. Poco tiempo más tarde se descubrió un gen homólogo en el cromosoma 1, que codifica para ps2, cuyas mutaciones también explicaban la aparición temprana de la enfermedad en dos familias [Levy-Lahad, 1995]; muchos e intensos estudios genéticos - 19 - INTRODUCCIÓN han identificado hasta 140 mutaciones en el gen de la presenilina 1 y 10 en la presenilina 2, como causantes moleculares de la EA temprana-familiar [Theuns, 2000; Marchesi, 2005; Vetrivel, 2006]. La presenilina 1 es una proteína integral de membrana, con 8 dominios transmembrana y constituída por 467 aminoácidos. Los análisis de mutación dirigida indican que la edad de inicio de EA en las diferentes familias de ps1 se relaciona con la posición y el tipo de sustitución aminoacídica. La proteína presenilina 2 es también una proteína transmembrana de 448 aminoácidos, con una homología con la secuencia aminoacídica de la ps1 del 67%. Sin embargo, el número de mutaciones descritas es más reducido. Ambas proteínas se encuentran localizadas, principalmente, en el retículo endoplasmático y en el aparato de Golgi [Cook, 1996; Kovacs, 1996], donde se solapa con los sitios intracelulares de generación del péptido amiloide [Xia, 1997]. Entre las funciones fisiológicas que se atribuyen a ps1 se encuentran la participación en la apoptosis, la homeostasis del calcio, el crecimiento neurítico y la plasticidad sináptica [Revisado en Thinakaran, 2004]. Además, estudios de deleción en ratones (ratones knock-out) reveló una somitogénesis y desarrollo del esqueleto axial anormal, así como hemorragias cerebrales. Además, estos ratones, que morían antes o durante el nacimiento, mostraron un neurodesarrollo embrionario anormal en el cerebro anterior, marcado por una pérdida prematura de precursores neuronales [Shen, 1997; Wong, 1997]. El estudio de estos ratones knock-out también demostró que, mientras que los niveles de los productos de las alfa y beta secretasas se mantenían iguales, la función de la gamma secretasa era anormal, disminuyendo la producción tanto de Aβ40 como de Aβ42 hasta en un 70%, lo que sugería que la expresión de ps1 era necesaria para la actividad de la gamma-secretasa [De Strooper, 1998; Li; 2000], el complejo enzimático que participa en la formación del péptido amiloide, compuesto también por otras tres proteínas (nicastrina, aph-1 y pen-2) [Revisado en Vetrivel, 2006]. - 20 - INTRODUCCIÓN Aunque se han encontrado mutaciones en los genes de ambas presenilinas en más de la mitad de los casos de enfermedad de Alzheimer tipo familiar-temprano, es aún un misterio cómo estas mutaciones diversas dan lugar al mismo fenotipo, es decir, a un aumento en la producción de beta amiloide [Marchesi, 2005]. Sin embargo, no siempre la presencia de mutaciones en éstas, dan lugar a un aumento del péptido beta amiloide, como se ha visto en la enfermedad de Pick, donde PSEN1 puede ser un gen candidato para determinadas taupatías [Dermaut, 2004]. En apoyo de esto último, estarían trabajos como el de Baki et al, donde proponen que mutaciones en ps1 promueven la actividad de la kinasa gsk-3, que a su vez da lugar a una mayor fosforilación de la proteína tau [Baki, 2004]. 2.6.3.- HIPÓTESIS DEL AMILOIDE Esta hipótesis establece que la sobreexpresión de beta amiloide o una deficiente clarificación del mismo es, probablemente, la génesis de la enfermedad de Alzheimer. El aumento en la síntesis de péptidos Aβ desde la app, en las formas de inicio temprano de la enfermedad, sería debido a mutaciones en los genes APP, PSEN1 y/o PSEN2. Así, la acumulación incrementada de los péptidos amiloidogénicos Aβ40/Aβ42 tendría lugar en los primeros inicios de la enfermedad, debido bien al incremento en la actividad de las beta y gamma secretasa, o bien al descenso en la eliminación de los péptidos Aβ. Tanto por una como por otra causa, estos péptidos Aβ se agregan para formar primero una placa difusa y generar, finalmente, una placa neurítica madura [Revisado en Suh, 2002] (fig. I5). - 21 - INTRODUCCIÓN Figura I5.- Secuencia hipotética de los pasos de la EA familiar [Selkoe, 2001] Se podría pensar que la inmunización de los pacientes con Aβ42 eliminaría el depósito de amiloide. En un estudio llevado a cabo entre 2003 y 2006, por Holmes et al, se observó que, aunque había una variación importante en la carga de Aβ y grado de la eliminación de las placas entre los participantes inmunizados, esta clarificación no prevenía la neurodegeneración progresiva [Holmes, 2008]. - 22 - INTRODUCCIÓN 2.6.4.- GEN APOE Y APOLIPOPROTEÍNA E La EA de inicio tardío puede aparecer como resultado de la presencia de variabilidad genética en diversos genes, de manera que cada uno de los alelos implicados, de manera aislada, no tenga ningún efecto en cuanto a la presencia de la enfermedad y, únicamente en combinación con otros alelos de genes distintos, llegan a verse comprometidas las vías sobre las que actúan. Dentro de estos genes, el que ha sido más claramente asociado con estas formas de EA, es el que codifica para la apoliproteína E (apoe) [Saunders, 1993b]. La apoe es una glicoproteína de 299 aminoácidos implicada en el transporte del colesterol y en el metabolismo de las partículas lipídicas, encontrándose presente en las lipoproteínas VLDL, IDL y HDL; su función concreta es la unión, internalización y catabolismo de partículas de lipoproteína, actuando como ligando del receptor de LDL; además está encargada de la movilización y redistribución del colesterol durante el crecimiento neuronal y en caso de daños; también interviene en la regeneración nerviosa, en la promoción de la plasticidad sináptica que sigue al daño neuronal, en inmunorregulación y en la activación de algunas enzimas lipolíticas [Handelmann, 1992 ; Nathan, 1994; Gaynor, 2003]. Se sintetiza principalmente en el hígado y en el cerebro, aunque también en otros tejidos, incluídos astrocitos, macrófagos y monocitos [Basu, 1982]. Existen 3 isoformas de la apoe, conocidas como E2, E3 y E4, productos de 3 formas alélicas (E2, E3 y E4) del gen APOE, que se encuentra en el cromosoma 19q; el más común de estos alelos es el E3, ya que está presente en el 40-90% de la población. Las distintas combinaciones de estos alelos generan 6 genotipos posibles, entre los que destaca el APOE E3/3, por ser el más común. Estas 3 isoformas se diferencian únicamente en cambios aminoacídicos en las posiciones 112 y 158: - 23 - INTRODUCCIÓN TABLA I3CAMBIOS AMINOACÍDICOS SEGÚN POSICIÓN EN apoe POSICIÓN 112 POSICIÓN 158 apoe E2 Cisteína Cisteína apoe E3 Cisteína Arginina apoe E4 Arginina Arginina Este ligero cambio tiene efectos a nivel de la función de la proteína, y se refleja en la existencia de asociaciones genéticas entre varias de las isoformas y diversas patologías, como la esclerosis múltiple [Chapman, 2001], la enfermedad de Parkinson [Zareparsi, 2002a], la angiopatía amiloide cerebral [O'Donnell, 2000], pero sobre todo, la enfermedad cardiovascular [Breslow, 1982; van Bockxmeer, 1992; Novaro, 2003]. En 1993 se descubrió que la frecuencia del alelo E4 estaba incrementada en los enfermos de Alzheimer, concretamente en los casos de inicio tardío, tanto en los familiares como en los esporádicos, observándose que los individuos heterozigóticos para este alelo tenían 3 veces más riesgo de padecer EA (oscilaría entre 4 y 20 veces en función de la población en la que se estudie su efecto), mientras que en los homocigóticos, este riesgo se incrementaba en 8 veces más cuando se sobrepasaban los 75 años de edad. Así pues, el riesgo conferido por la posesión de este alelo era dependiente de la dosis génica [Saunders, 1993a; Corder, 1993]. Además, esta asociación era más pronunciada en la mujer que en el hombre [Poirier, 1993; Payami, 1996]. Sin embargo, hemos de resaltar que la presencia de este alelo E4 no es ni necesaria ni suficiente para desarrollar EA, así como la no presencia de dicha variante garantiza la ausencia de EA, de tal manera que hay individuos E4/E4 que no han desarrollado la enfermedad e individuos con EA que no presentan este alelo. Por tanto, el gen APOE no es un gen causante de la enfermedad de Alzheimer, pero sí es un factor de - 24 - INTRODUCCIÓN riesgo importante, estimándose que puede tener un efecto considerable en el 50% de la población de pacientes, aproximadamente [Myers, 1996]. ¿Cuál es la relación exacta de esta proteína con la EA?. Apoe se encuentra colocalizada en las lesiones del Alzheimer, es decir, en las placas amiloideas y en las redes neurofibrilares intracelulares. Con respecto a las primeras, en estudios iniciales se observó que mostraba gran afinidad por el péptido amiloide, lo que sugería un rol patogénico funcional de esta lipoproteína [Strittmatter, 1993a]. Además, esta afinidad era dependiente de la isoforma apoe, de tal manera que, in vitro, E4 se unía más ávidamente al péptido amiloide que la isoforma E3 [Strittmatter, 1993b], aunque estudios en cultivos celulares revelaron lo contrario, es decir, una mayor afinidad de la isoforma E3 [LaDu, 1994]. Esta discrepancia quedó resuelta al observarse que esto ocurría en condiciones de no purificación de apoe, es decir, cuando ésta se deslipidaba y desnaturalizaba, era E4 quien mostraba mayor avidez por el péptido amiloide, lo que sugería que también la conformación de esta apolipoproteína era importante en su relación con las placas amiloideas [LaDu, 1995]. También se observó una relación entre la dosis génica en este locus y la cantidad de depósitos de amiloide del parénquima cerebral de los afectados: aquellos enfermos con una copia del alelo E4 presentan un mayor número de depósitos que aquellos enfermos sin ninguna copia de este alelo, mientras que los individuos E4 homozigotos son los que presentan una mayor densidad de placas seniles [Schmechel, 1993]. En cuanto a su relación con las redes neurofibrilares, estudios in vitro demostraron que apoe se unía también a tau, sólo que en esta ocasión era la isoforma E3 la que lo hacía, y no la E4, de modo que E3 se unía a la región de unión de tau al microtúbulo, la misma que se piensa causa su autoensamblaje en PHF, con lo que apoe podría regular el metabolismo intraneuronal de tau y alterar el ratio de formación de PHF y redes neurofibrilares [Strittmatter, 1994]. - 25 - INTRODUCCIÓN El estudio posterior de las variantes genéticas dentro de la región reguladora de la transcripción del gen APOE, mostró la presencia de tres polimorfismos en -219 G/T, -427 T/C y -491A/T que generaban diferencias en la actividad transcripcional del mismo, debido, probablemente, a diferencias en la unión de proteínas nucleares. Así, la sustitución del nucleótido A por T en -491 daba lugar a un descenso significativo en la actividad del promotor, al igual que la presencia del alelo C en -427, mientras que la sustitución de T por G en -219 provocaba un incremento en la línea celular humana HepG2 (hepatoma). Por tanto, incrementos en la concentración de apoe debido a la presencia de los alelos -219T, -427T y -419A, pueden ser los responsables de su asociación con la patogénesis del Alzheimer. Así pues, es posible que polimorfismos en el promotor génico de la apoe contribuyan directamente al riesgo de desarrollo de Alzheimer en individuos que no presentan el alelo E4 [Artiga, 1998a; Artiga, 1998b; Artiga, 1998c]. Basándose en esto, Artiga et al, sugieren que hay dos mecanismos por los que el riesgo de Alzheimer puede ser modificado por el gen APOE: un mecanismo que incluye variantes en la región codificante que altera las propiedades funcionales de la molécula apoe, y un segundo mecanismo que incluye variantes en la región promotora que resulta en diferencias cuantitativas en la expresión de apoe. Estos dos factores están asociados con el riesgo de desarrollo de Alzheimer independientemente; cada uno produce riesgo por sí mismo, pero pueden interactuar entre ellos resultando en un sobrerriesgo para los individuos que portan el alelo E4 y formas del promotor de alta expresión del gen APOE. - 26 - INTRODUCCIÓN 2.6.5.- PROTEÍNA TAU HIPERFOSFORILADA Las neuronas presentan dos tipos de extensiones citoplasmáticas, axones y dendritas, donde tiene lugar la transmisión neuronal, por lo que cualquier cambio en la morfología neuronal afectaría esta transmisión y podría llevar a eventos patológicos. Los microtúbulos, componentes del citoesqueleto, son estructuras muy dinámicas, de tal manera que el ensamblaje de sus componentes puede darse al mismo tiempo que la despolimerización de los mismos; este equilibrio genera la morfología típica de las células. Sin embargo, durante la diferenciación de los neuroblastomas en neuronas, los microtúbulos se estabilizan en direcciones específicas, generando las ya mencionadas extensiones citoplasmáticas [Avila, 2004]. Entre las proteínas propuestas para la estabilización de los microtúbulos se encuentra la proteína tau [Kosik, 1986]. Tau es una proteína hidrofílica expresada, principalmente, en las células neuronales, mientras que en el resto de las células no neuronales podrían existir elementos silenciadores de su expresión [Avila, 2004]. Puede sufrir distintas modificaciones: fosforilación, glicosilación, ubiquitinización, oxidación, etc. En muchos casos, la fosforilación controla la unión de tau a los microtúbulos, por lo que parece que esta modificación es la predominante en la regulación de las funciones de tau. La fosforilación es un proceso muy relacionado con el desarrollo, de tal manera que es alta en las neuronas fetales y decrece con la edad. Por tanto, el aumento de la fosforilación de tau conllevaría a situaciones patológicas o taupatías, al igual que el aumento de la cantidad de tau no fosforilada. En cuanto a las funciones concretas de tau, hay que tener en cuenta que muchos de los estudios que se han llevado a cabo, se han realizado a través de la sobreexpresión de la misma, por lo que es posible que algunos de los resultados obtenidos hayan exagerado el papel de tau en algunos procesos. De cualquier manera, parece claro que tau facilita el ensamblaje de la tubulina, componente de los microtúbulos, además de unirse a otras proteínas con funciones diversas [Avila, 2004]. Sin embargo, la unión - 27 - INTRODUCCIÓN Por otro lado, cabría esperar que la inflamación tuviera un efecto beneficioso y un papel protector en el cerebro, puesto que se induciría la fagocitosis del beta amiloide por parte de la microglia, reduciéndose su deposición en las placas. Bajo determinadas circunstancias se ha visto que esto es así: que la microglía puede degradar el beta amiloide fibrilar [Schenk, 1999] y es responsable de la clarificación de la placa [Bard, 2000]. Sin embargo, aún no está claro de que manera tiene lugar esta degradación por parte de la microglia, aunque sí se ha observado como la acidificación de los lisosomas de ésta, juega un papel importante en la habilidad de la microglía para degradar el beta amiloide [Majumdar, 2007]. Los equipos que han documentado la presencia de un gran número de moléculas inflamatorias en el cerebro de los enfermos de Alzheimer son diversos, compilándose así todo un catálogo de productos de las células inmunes que están presentes en niveles elevados en el cerebro de estos pacientes [Rogers, 1996], e identificándose proteínas inflamatorias asociadas con las placas neuríticas y las células gliales que rodean a éstas, como son los antígenos HLA, proteínas del complemento y citoquinas, que, junto con polimorfismos en sus genes codificadores, aumentan el riesgo o predisponen para un desarrollo más temprano de la enfermedad [Hoozemans, 2001a]. 3.1.- BUTIRILCOLINESTERASA Como ya se ha mencionado, la anormalidad neuroquímica más pronunciada en la enfermedad de Alzheimer es la disfunción colinérgica en el sistema nervioso central. Un aspecto importante de la función colinesterásica cerebral es que está asociada con diferencias enzimáticas: el cerebro de los mamíferos contiene, principalmente, dos formas de colinesterasas: acetilcolinesterasa (AChE) y butirilcolinesterasa (BChE). Estas dos formas difieren genética, estructural y cinéticamente [Lane, 2006], aunque - 34 - INTRODUCCIÓN ambos compuestos catalizan la hidrólisis del neurotransmisor acetilcolina sobrante en el espacio sináptico en colina y ácido acético, reacción necesaria para permitir que la neurona colinérgica vuelva a su estado de reposo después de la activación, evitando así una transmisión excesiva de acetilcolina. Otra diferencia entre los dos tipos de colinesterasa son sus preferencias por los sustratos sobre los que actúan: la primera hidroliza acetilcolina más rápido, mientras que la segunda hidroliza más rápido la butirilcolina. Sin embargo, aunque la BChE es menos eficiente en la hidrólisis de la acetilcolina a bajas concentraciones, es altamente eficiente a altas concentraciones de este neurotransmisor, donde la AChE se vuelve menos resolutiva [Darvesh, 2003]. Con respecto a la enfermedad de Alzheimer, mientras que la actividad de la AChE decrece progresivamente en el cerebro de estos pacientes, la actividad de la BChE muestra un incremento [Giacobini, 2004; Lane, 2006]. La BChE humana es una enzima glicoproteica sérica, de la familia de las serinesterasas, que contiene 4 subunidades idénticas, cada una de las cuales posee un sitio catalítico activo. Se cree que se sintetiza en el hígado y su función fisiológica no está clara, ya que la butirilcolina no es un sustrato fisiológico en el cerebro de los mamíferos, lo que hace difícil la interpretación del papel de la BChE en humanos. En 1978, a través de la realización de medidas bioquímicas de la actividad de la BChE en tejidos de cerebros sanos, de demencias seniles tipo Alzheimer y de desórdenes mentales sin anormalidades tipo Alzheimer, se observó que la actividad BChE estaba aumentada significativamente en el hipocampo y en el córtex temporal de los casos de Alzheimer comparada con los tejidos sanos, y que existía, además, una correlación positiva significativa entre la actividad BChE con el incremento de la edad (60-90 años) [Perry, 1978]. Años más tarde se demostró que las placas amiloideas y las redes neurofibrilares que se encuentran en los cerebros de los enfermos de Alzheimer presentaban, efectivamente, actividad AChE y BChE [Geula, 1989]. La presencia de las colinesterasas fue confirmada en todas las estructuras con degeneración - 35 - INTRODUCCIÓN neurofibrilar, estando asociadas con la proteína amiloidea desde los estados muy tempranos de la enfermedad, cuando la estructura beta-plegada aún se está formando. De este modo, funciones atribuídas a la AChE y BChE, como sus actividades proteolíticas, pueden jugar un papel en la agregación o proceso de consolidación que tiene lugar en los primeros estadios de la formación de las placas difusas [Moran, 1993; Moran, 1994; Gomez-Ramos, 1997; Guillozet, 1997], es decir, la BChE podría participar en la transformación del beta amiloide de una forma inicialmente benigna a una forma maligna, asociada con la degeneración del tejido nervioso y demencia clínica. Se sabe que la BChE juega un papel importante en la hidrólisis de algunas drogas, como el mivacurio (bloqueante neuromuscular), la cocaína (alcaloide estimulador del SNC) o la succinilcolina (bloqueador de la placa neuromuscular que se utiliza como miorrelajante); en base a la sensibilidad a esta última se han identificado la mayoría de los fenotipos conocidos de la BChE. La mayoría de éstos son fenotipos raros, siendo la variante K el más común de todos (22% de la población general es heterocigota y un 1,5% es homocigota) [La Du, 1990; Bartels, 1992]. A nivel genómico se han encontrado varias mutaciones que codifican para hasta 65 variantes distintas de BChE [Mikami, 2007; Mikami, 2008]. De todas éstas, se ha observado que en la variante K cambia el aminoácido 539 de alanina a treonina (GCA- --ACA; Ala539---Thr) debido a una transición de guanina a adenina en el nucleótido 1615 (exón4) [La Du, 1990; Bartels, 1992]. La mutación que genera esta variante K provoca un 30% de reducción de la actividad BChE sérica [La Du, 1990], y podría estar asociada con una fosforilación reducida de tau en los pacientes con demencia tipo Alzheimer y de Cuerpos de Lewy [Ballard, 2005]. Además, también se ha observado un menor declive cognitivo en los pacientes que portan esta variable [Holmes, 2005]. Sin embargo, los estudios realizados sobre posibles asociaciones entre la EA y las variantes de la BChE son diversos y, en ocasiones, contradictorios: - 36 - INTRODUCCIÓN a) Trabajos donde la variante K era más común en los casos de EA de inicio tardío que en los casos de inicio temprano [Panegyres, 1999] b) Trabajos donde la variante K por sí sola ya constituye un factor de riesgo, pudiendo actúar sinergísticamente con APOE E4 [Raygani, 2004; Beyer, 2005; Lane, 2008] o no [Ghebremedhin, 2002]. c) Trabajos en los que, cuando se tiene en cuenta el estatus apoe, se ve que la frecuencia alélica aumenta en los individuos que portan el alelo E4, indicando una interacción entre BChE-K y apoe E4 [Lehmann, 1997; Wiebusch, 1999]. d) Trabajos donde la homocigosidad de la variante K está asociada con un aumento del riesgo de formación de redes neurofibrilares, pero no placas amiloideas [Ghebremedhin, 2007]. e) Y trabajos donde no han encontrado asociación alguna con la enfermedad [Cook, 2005; Rakonczay, 2005; Piccardi, 2007]. ¿Cuál es la relación de la butirilcolinesterasa con la inflamación? Se sabe que la acetilcolina posee propiedades antiinflamatorias; por tanto, un aumento en la actividad butirilcolinesterásica incide indirectamente sobre la inflamación, puesto que se reducirán los niveles de acetilcolina y aumentarán los eventos inflamatorios debido a la ausencia del control de feed back negativo [Thomas, 2007]. El principal estudio de esta enzima se ha realizado desde el punto de vista del tratamiento, ya que las terapias con más éxito se han centrado, principalmente, en mejorar la transmisión colinérgica usando inhibidores de las colinesterasas [Tasker, 2005]. Muchos de estas drogas inhiben únicamente a la AChE (p.ej, donezepilo), aunque algunas inhiben a ambas enzimas (p.ej, rivastigmina), observándose como la doble inhibición de ambas colinesterasas tiene efectos neuroprotectores [Venneri, 2005]. - 37 - INTRODUCCIÓN 3.2.- MIELOPEROXIDASA La mieloperoxidasa (mpo) es una hemoproteína lisosomal localizada en los gránulos azurofílicos de los leucocitos polimorfonucleares (PMN o neutrófilos) y monocitos/macrófagos, formando, por tanto, parte del sistema de defensa de los PMN humanos a través de la generación de ácido hipoclórico y otras especies oxígenoreactivas. Se encuentra localizada tanto en el citoplasma como en el núcleo, donde se cree que podría ayudar a proteger el ADN contra el daño resultante de los radícales oxígeno producidos durante la maduración y funcionamiento de las células mieloides [Murao, 1988]. A raíz del estudio del promotor del gen de esta proteína y, más concretamente, del polimorfismo -463 G/A, se han producido interesantes asociaciones de éste con la incidencia de enfermedades, tales como el cáncer de pulmón [Le Marchand, 2000; London, 1997], cáncer del tracto aerodigestivo [Cascorbi, 2000], la esclerosis múltiple [Nagra, 1997; Chataway, 1999] o la enfermedad de Alzheimer [Reynolds, 1999; Galeazzi, 1999]. Confirmada su presencia en las neuronas, se ha observado que la expresión de la mpo es mayor en los cerebros de los pacientes de Alzheimer, de tal manera que podría contribuir al estrés oxidativo implicado en la patogénesis de esta enfermedad [Green, 2004; Casado, 2008], condición que precede a la aparición de las placas amiloideas y las redes neurofibrilares [Zafrilla, 2006]. En 1999 se observó que la mpo colocalizaba con el beta amiloide de las placas seniles de las secciones de córtex cerebral de cerebros de enfermos de Alzheimer, con lo que se supuso que los componentes de las placas inducían la expresión de mpo en la microglia; además, el alelo E4 de la apolipoproteína E se correlacionaba con la deposición aumentada de mpo en las placas; por último, se vió también que la mayor expresión del genotipo homocigoto G/G en el promotor de la mpo se encontraba - 38 - INTRODUCCIÓN sobrerrepresentado en la mujeres con enfermedad de Alzheimer y no en los hombres [Reynolds, 1999], donde el genotipo asociado era el A/A [Reynolds, 2000], lo que sugería que el genotipo de la mpo era un factor de riesgo género-específico. En 2000 se vió que la oxidación de las tres isoformas recombinantes de la apoe es diferencial, de modo que apoe E4 es más susceptible que apoe E3, que a su vez es más susceptible que apoe E2. De esta manera, quizás la oxidación de la apoe pueda contribuir a un ineficiente reciclaje lipídico en el cerebro, particularmente si es apoe E4 o E3 [Jolivalt, 2000]. Aunque el mecanismo exacto de interacción de este polimorfismo con la enfermedad permanece desconocido, recientemente se ha visto que el alelo G está fuertemente expresado en los astrocitos y se ha sugerido que la expresión aberrante de la mpo conduciría a peroxidación fosfolipídica y disfunción neuronal [Maki, 2009]. Sin embargo, al igual que ocurre con los estudios sobre la butirilcolinesterasa, los realizados sobre la mpo y la enfermedad de Alzheimer son controvertidos, donde los resultados publicados en la literatura parecen depender de factores como el género, el polimorfismo APOE o la estructura genética de la población. Así, podemos encontrar trabajos donde se relacionan a esta proteína con la enfermedad en asociación con la apolipoproteína E [Reynolds, 2000], como trabajos donde no hay sinergia entre ambas proteínas, aunque sí de la mpo con la enfermedad [Crawford, 2001; Leininger-Muller, 2003; Zappia, 2004] o trabajos donde ni siquiera hay relación con la EA [Combarros, 2002a; Usui, 2006]. 3.3.- COMPLEJO MAYOR DE HISTOCOMPATIBILIDAD O SISTEMA HLA La tarea de presentar antígenos asociados a células, para que sean reconocidos por los linfocitos T, corre a cargo de proteínas especializadas codificadas por genes presentes en un locus denominado complejo principal de histocompatibilidad (CPH o - 39 - INTRODUCCIÓN MHC). En humanos, este complejo recibe el nombre de sistema HLA, del inglés “Human Leukocyte Antigen”. Es un locus altamente polimórfico (el más polimórfico del genoma), que regula la expresión de glicoproteínas de la superficie celular que a su vez participan en las interacciones celulares durante la respuesta inmune. De este modo, se puede decir que los genes del sistema HLA son los reguladores de la respuesta inmune por excelencia, puesto que permite al sistema inmune discriminar entre lo que es propio del individuo y lo que es extraño a él. El MHC se localiza en el brazo corto del cromosoma 6, donde los genes que lo componen están divididos en tres grandes grupos: 1.- Clase I: compuesta por los genes HLA-A, HLA-B y HLA-C; las moléculas que expresan se encuentran distribuídas por todas las células del organismo, excepto los hematíes. 2.- Clase II: compuesta por los genes HLA-DP, HLA-DQ y HLA-DR; las moléculas que expresan se encuentran únicamente en linfocitos B, monocitos/macrófagos, precursores hematopoyéticos inmaduros y células dendríticas. 3.- Clase III: compuesta por los genes que codifican diversos componentes del sistema del complemento, tres citoquinas y algunas proteínas del choque térmico. [Abbas, 2005; Roitt, 2003] Es característica, en los cerebros de enfermos de Alzheimer, la presencia de proteínas inmuno-asociadas y células, como las de la microglia activada, que expresan altos niveles de estas moléculas. Ya desde 1984 se observó que determinados alelos HLA parecían estar relacionados con la enfermedad de Alzheimer [Renvoize, 1984]. A partir de aquí, surgen muchos y diversos trabajos que relacionan la enfermedad de Alzheimer con el sistema HLA, sobre todo con el alelo HLA-A2, donde son varios los autores que observan como este alelo se asocia con la edad de aparición de la enfermedad, de tal modo que individuos que poseen este alelo son más jóvenes que los pacientes que no lo poseen [Payami, - 40 - INTRODUCCIÓN 1997; Small, 1986; Payami, 1991; Zareparsi, 2002b]; además, se habla de una posible interacción entre este alelo y el alelo E4 del gen de la apoe, de modo que ambos podrían tener efectos aditivos sobre la edad de aparición de la enfermedad [Payami, 1997; Combarros, 1998; Ballerini, 1999]. Pero no es el alelo HLA-A2 el único del sistema HLA vinculado a la enfermedad; en diversos estudios se habla de asociación con el alelo HLA-B5 [Chabrieres, 1998] y del HLA-DR, donde se ha visto que existen diferencias en la frecuencia de distribución de algunos alelos HLA-DR entre pacientes con enfermedad de aparición tardía y de aparición temprana. Además, en individuos que no portan el alelo E4 de la apoe, la influencia combinada de DR1, 2 y 3, genera un riesgo once veces mayor; o por el contrario, la influencia combinada del DR4 y 6 lleva a un descenso once veces más del riesgo [Curran, 1997]. También se habla de los alelos DRB1*03, asociado con un riesgo incrementado, y DRB1*09, asociado con una posible disminución del mismo [Neill, 1999]. 3.4.- CITOQUINAS Son pequeñas proteínas secretadas por las células de la inmunidad innata y adaptativa, mediando muchas de sus funciones. Se sintetizan en respuesta a microorganismos y otros antígenos, de modo que diferentes citoquinas estimulan distintas respuestas de células que participan en la inmunidad y en la inflamación, generando cambios en la expresión de genes en las células diana y dando lugar a la expresión de nuevas funciones, y a veces, a la proliferación de las células diana o la dirección de un programa coordinado de expresión de genes pro y antiinflamatorios [Abbas, 2005; Roitt, 2003]. Existe una relación cercana entre los sistemas nervioso, inmune y endocrino, de tal modo que algunas citoquinas están presentes en cantidades elevadas en los cerebros de pacientes de Alzheimer, sugiriéndose que el daño celular y la neurodegeneración pueden ser debidos a reacciones neuroinmunes junto con mecanismos inflamatorios - 41 - INTRODUCCIÓN [Bruunsgaard, 1999; Hoozemans, 2001b; Serrano-Sanchez, 2001; Apelt, 2001]. Así, la “ocasión” para que un individuo desarrolle EA podría estar afectada por un perfil de susceptibilidad, reflejado en la influencia combinada de heredar múltiples alelos de alto riesgo [McGeer, 2001], de tal manera que las citoquinas proinflamatorias (IL-1, IL -6, TNF-alfa, IFN-gamma), podrían estar sobreexpresadas y/o las antiinflamatorias (IL -10, TGF-beta1) todo lo contrario [Meda, 1999; Remarque, 2001]. 3.4.1.- Interleuquina-1 (IL-1) Existen 2 formas estructuralmente distintas de la IL-1: IL-1alfa, que es la forma acídica, e IL-1beta, que es la forma neutra. Ambas son proteínas de 17 kD codificadas por genes distintos localizados en el brazo largo del cromosoma 2. Estas proteínas, que son sintetizadas por una variedad de tipos celulares, incluyendo macrófagos activados, queratinocitos, linfocitos B estimulados y fibroblastos, son mediadores muy potentes en la inflamación e inmunidad. En los astrocitos, la IL-1 induce la producción de IL-6, estimula la actividad de la óxido nítrico sintasa inducible, y promueve la producción del factor estimulante de colonia de macrófagos, productos que pueden, además, aumentar la actividad de la microglia [Bamberger, 2001]. La interleuquina 1 es, junto con la IL-6 y el TNF-alfa, la citoquina más estudiada en relación con la enfermedad de Alzheimer. Experimentos in vitro y en ratas demostraron que la IL-1 puede regular la sobreexpresión y procesamiento de app [Buxbaum, 1992; Forloni, 1992; Sheng, 1996], asociándosele también con la hiperfosforilación de tau [Sheng, 2000], de tal manera que la implantación de IL-1 dentro del cerebro de ratas, aumenta los niveles de ARNm de tau y de tau hiperfosforilada. Poco tiempo después se comprobó que la IL-1 estaba sobreexpresada en el cerebro de los pacientes de Alzheimer, sobreexpresión directamente relacionada con la formación y progresión de las placas amiloideas [Mrak, 2001], y con un ligero - 42 - INTRODUCCIÓN incremento en plasma del ARNm IL-1 alfa y de la proteína [Dominici, 2002; Zuliani, 2007; Tan, 2007]. Se ha observado que algunos polimorfismos en los promotores y en los genes de estas interleuquinas están asociados con el riesgo de padecer EA [Grimaldi, 2000], así, la homocigosidad TT para la IL-1alfa en la posición -889 de la región promotora del gen, genera un riesgo entre tres y diez veces mayor para el desarrollo de EA, siendo un factor de riesgo de manera dosis-dependiente; mientras que la homocigosidad para el alelo 2 de la IL-1beta está asociada con un riesgo mayor de 10 veces [Combarros, 2002b; Nicoll, 2000; Mrak, 2001]. Además, los individuos homocigotos TT para la posición -889 del gen de la IL-1alfa presentaron un declive cognitivo más rápido [Murphy, 2001]. Sin embargo, y como viene siendo habitual en esta enfermedad, también existen trabajos donde no se encuentra asociación de este polimorfismo con la EA [Tsai, 2003; Wang, 2007; Déniz-Naranjo, 2008; Hu, 2009] Lo mismo sucede con la IL-1beta, donde son dos los polimorfismos más estudiados con respecto a la enfermedad, concretamente el -511 C/T y el +3953 T/C, e igualmente encontramos trabajos que observan asociación con la enfermedad y trabajos que no [Grimaldi, 2000; Nicoll, 2000; Ehl, 2003; Ma, 2003; Rosenmann, 2004; Licastro, 2004; Seripa, 2005; Déniz-Naranjo, 2008; Wang, 2007]. 3.4.2.- Interleuquina-6 (IL-6) La IL-6 es una proteína de 185 aminoácidos que está producida por muchos tipos celulares diferentes. La principal fuente in vivo son los monocitos/macrófagos estimulados, fibroblastos y células endoteliales. Los monocitos/macrófagos expresan al menos cinco formas moleculares diferentes de la IL-6, que se diferencian por alteraciones postraduccionales, tales como la glicosilación y la fosforilación [Abbas, 2005; Roitt, 2003]. La IL-6 promueve astrogliosis, activa la microglia y estimula la - 43 - INTRODUCCIÓN controvertido: algunos estudios muestran relación de éste con la EA, mientras que otros no encuentran asociación alguna [Revisado en Thomas, 2007]. 4.3.- AGENTES PATÓGENOS Debido a su naturaleza ubicua y neurótropa, y al hecho de estar presente en las mismas áreas cerebrales afectadas en la enfermedad de Alzheimer [Jamieson, 1992], el virus Herpes Simplex-1 (HSV-1) se ha convertido en el principal patógeno investigado [Pyles, 2001], aunque también se ha estudiado el papel de otros posibles patógenos como predisponentes para la EA, pero con escasos resultados [Taylor, 1986; Lin, 1997]. Ya en 1982 se sugería el posible papel del HSV-1 en la enfermedad de Alzheimer [Ball, 1982], y desde entonces, son numerosos los trabajos que se han llevado a cabo para evidenciar la influencia de este virus en la EA. Los primeros estudios realizados fallaron en demostrar la presencia del HSV-1 en los cerebros de los pacientes de Alzheimer [Taylor, 1984], posiblemente debido a la falta de las técnicas suficientemente sensibles y adecuadas para este cometido; sin embargo, el desarrollo de técnicas más sensibles, como la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), dieron lugar a otros estudios donde sí se observaba una fuerte correlación de este virus con la EA, incluído el tipo familiar [Cheon, 2001; Mori, 2004]. En 1988 se observó que la glicoproteína B del HSV-1 poseía una región entre los residuos 22-44 (gB22-44), que se unía a los complejos apoe/LDL [Huemer, 1988] y, posteriormente, que los individuos con recurrencias frecuentes del herpes labial eran mayoritariamente portadores del alelo E4 de la apolipoproteína E [Lin, 1995]. Esto dio lugar al estudio de la relación entre las isoformas de esta apolipoproteína, el HSV-1 y la EA, con trabajos donde se observa una clara relación entre estas dos variables - 50 - INTRODUCCIÓN entre sí y/o con la enfermedad [Lin, 1996; Itzhaki, 1997; Burgos, 2007; Letenneur, 2008]. Así, se ha teorizado que la frecuente reactivación en el SNC del HSV-1 podría conducir a un mayor daño y pérdida neuronal, predisponiendo de esta manera al desarrollo de la enfermedad de Alzheimer. Si además está presente el alelo E4 de la apolipoproteína E, éste podría favorecer la reactivación del virus [Itzhaki, 1997]. También puede ocurrir que la actividad de la apoe E4, comparada con la de E2 o la de E3, conlleve a una menor capacidad de ésta para reparar el daño neuronal, lo que favorecería la reactivación del herpes virus. Sí se ha observado, en modelos murinos, que el perfil de apoe afecta a los niveles de virus latente, donde la isoforma E4 está asociada con cantidades de hasta 10 veces más ADN viral con respecto a la isoforma E3 [Burgos, 2006]. Junto con la relación entre el HSV-1 y la apolipoproteína E, se observó que existía una región de homología entre el beta amiloide y la glicoproteína B del HSV-1; además, la región comprendida entre los residuos 22-44 de esta proteína, forma fibrillas similares a las que forma el beta amiloide, sugieriéndose así que este péptido podría estar iniciando la formación fibrilar que aparece en las placas seniles [Cribbs, 2000]. Estudios en cultivos celulares neuronales y gliales han revelado que la infección con HSV-1, además de intervenir en la síntesis y procesamiento de app [Shipley, 2005], conduce a un incremento en los niveles intracelulares de beta amiloide, tanto Aβ40 como Aβ42, y a una mayor deposición amiloidea Aβ42 en modelos murinos [Wozniak, 2007]. Es más, recientes trabajos demuestran la localización de ADN viral dentro de un 90% de las placas amiloideas con un 72% de éste asociado con las placas, mientras que en los individuos mayores sin demencia tipo Alzheimer, aunque hay un 80% de placas con ADN del HSV-1, sólo un 24% de este ADN está asociado a las mismas [Wozniak, 2009]. - 51 - INTRODUCCIÓN 4.4.- ESTRÓGENOS Se ha observado que las mujeres postmenopausicas tienen un mayor riesgo de desarrollar EA que los hombres, sugiriéndose que quizás esto sea debido a la disminución de los niveles estrogénicos que siguen a la menopausa. Los efectos protectores de los estrógenos podrían incluír la promoción de la actividad colinérgica, la reducción de la pérdida neuronal y la estimulación del crecimiento axonal. Así pues, el tratamiento estrogénico, con estradiol, en mujeres postmenopausicas con EA podría conducir a una mejora de éstas, tal y como se ha observado [Asthana, 2001]. Sin embargo, este papel protector de los estrógenos y, por tanto, la terapia estrogénica, queda en entredicho con trabajos donde ocurre lo contrario, es decir, determinadas terapias, como la del uso de estrógeno más progestina, parece que incrementan el riesgo de probable demencia en las mujeres postmenopausicas mayores de 65 años, y que además, no previenen del daño cognitivo medio en éstas [Shumaker, 2003; Rapp, 2003]. 4.5.- SÍNDROME METABÓLICO También relacionado con la EA, este síndrome constituye un conjunto de factores de riesgo cardiovascular, identificados además como factores de riesgo para la EA. Se caracteriza por anormalidades en el metabolismo de la insulina, la glucosa y las lipoproteínas, asociado a hipertensión arterial y obesidad, siendo esta última una condición que se vuelve muy común en los países occidentalizados. De este modo, se ha visto que la restricción calórica y el ejercicio, y dietas con bajo contenido en grasas y alta en antioxidantes y trazas minerales, se han asociado con un descenso en el riesgo de padecer EA [Martins, 2006; Vilalta-Franch, 2008]. - 52 - INTRODUCCIÓN - 53 - 4.6.- MICRONUTRIENTES Muchos estudios de caso-control han demostrado que los pacientes de EA eran deficientes en ciertos micronutrientes, como el ácido fólico o la vitamina B12, mientras que tenían niveles elevados de homocisteína [Revisado en Mattson, 2002]; el desequilibrio de estos factores está asociado con la formación incrementada de micronúcleos y la alteración de la metilación, lo cual podría modificar la expresión génica, por ejemplo, a través de aneuploidía y rotura del cromosoma 1, que porta el gen PSEN2, y aumento de la expresión de los genes PSEN1 y BACE. Además, en el caso concreto del ácido fólico, se ha visto que su deficiencia incrementa la trisomía de los cromosomas 17 y 21, portadores de los genes TAU y APP, respectivamente; respecto a la homocisteína, se ha observado una fuerte correlación entre niveles altos de ésta y reducción del volumen hipocampal y cortical [Revisado en Thomas, 2007]. OBJETIVOS OBJETIVOS OBJETIVOS La enfermedad de Alzheimer representa entre el 50% y el 80% de las demencias que se dan en las personas mayores de 60 años. El impacto de esta enfermedad sobre los pacientes, cuidadores y personal sanitario, es inmenso, dando lugar a una tremenda carga económica y física de los recursos sanitarios. En España, esta enfermedad afecta a un 0,6% de la población entre 65-74 años, a un 7,9% de la población entre 75-84 años y a un 16,2% de la población mayor de 85 años, e implica un coste anual de unos 259 millones de euros [García-García, 2001]. Como ya se ha explicado en la Introducción, la EA es una enfermedad con un marcado componente genético y una expresión heterogénea, donde hasta ahora, sólo cuatro genes han sido claramente relacionados: APP, PSEN1, PSEN2 (forma familiar y temprana) y APOE (forma esporádica y tardía). Sin embargo, estos cuatro genes no explican todos los casos de Alzheimer, por lo que otros factores han de estar interactuando con éstos para que la enfermedad tenga lugar. Han sido muchos los genes propuestos y estudiados, sobre todo, aquellos que codifican para proteínas halladas en las placas amiloideas extraneuronales. Y toda la información surgida a raíz de la gran cantidad de trabajos que se han llevado a cabo, ha dado lugar a controversia y discrepancia en los resultados, posiblemente debida a diferencias poblacionales, metodologías y elección de los grupos a estudio. - 54 - OBJETIVOS - 55 - El objetivo del presente trabajo consiste en caracterizar, a través del estudio de los genes APOE, BChE, MPO, HLA, IL-1alfa, IL-1beta, IL-6, TNF-alfa, IL-10, IFN-gamma y TGF-beta, entre pacientes y controles, un perfil genético que nos permita ayudar en el diagnóstico de esta enfermedad, o caracterizar aquellos individuos que presentan una mayor susceptibilidad al desarrollo de la misma. Pretendemos alcanzar este objetivo a través del estudio de las frecuencias de genotipos, de alelos o de caracteres génicos, en relación al diagnóstico, a la edad de diagnóstico de la enfermedad y al género, de nuestra serie de pacientes y controles. SUJETOS Y MÉTODOS SUJETOS Y MÉTODOS SUJETOS 1.- DISEÑO Para el estudio de factor de susceptibilidad, el diseño que se ha utilizado es el del tipo caso-control. 2.- PACIENTES Se han estudiado 282 pacientes consecutivos diagnosticados de Probable Enfermedad de Alzheimer por el Servicio de Neurología del Hospital Universitario de Gran Canaria Dr.Negrín, basándose en los criterios NINCDS-ADRDA (National Institute of Neurological and Communicative Disorders and Stroke - Alzheimer's Disease and Related Disorders Association workgroup) (ANEXO I). Nuestro estudio se ha centrado en la EA de tipo esporádico-tardío, es decir, pacientes sin herencia de EA y mayores de 60 años, puesto que éste es el tipo de EA que presenta una mayor incidencia. 3.- CONTROLES Han participado 312 individuos, también mayores de 60 años, y sin déficit cognitivo, medido por el test de CAMGOG [sección del test CAMDEX (Cambridge Mental Disorders of the Elderly Examination)]. A todos los individuos se les ha solicitado su consentimiento informado para la participación en el estudio. En el caso de los pacientes sin capacidad para decidir, se solicitó a los familiares que cuidaban de ellos. - 56 - SUJETOS Y MÉTODOS Además, los distintos proyectos de investigación que han dado lugar a este trabajo, fueron aprobados por el Comité Etico del Hospital Universitario de Gran Canaria Dr. Negrín. 4.- VARIABLES ESTUDIADAS 4.1.- Edad al diagnóstico 4.2.- Género de los sujetos a estudio 4.3.- Frecuencias genotípicas y alélicas de los genes: • Apolipoproteína E (APOE E: exón 4) • Butirilcolinesterasa (BChE: variantes W-K; exón 4: +1615 G/A) • Mieloperoxidasa (MPO: -463 G/G) • Factor de Necrosis Tumoral-alfa (TNF-alfa: -308 G/A) • Factor Transformador del Crecimiento-beta1 (TGF-beta1: +10 T/C y +25 G/A) • Interferon-gamma (IFN-gamma: +874 T/A) • Interleuquina-10 (IL-10: -1082 G/A, -819 C/T y -592 C/A) • Interleuquina-1alfa (IL-1alfa: -889 C/T) • Interleuquina-1beta (IL-1beta: +3953 T/C y -511 T/C) • Interleuquina-6 (IL-6: -174 G/C) • Antígeno Leucocitario Humano A (HLA-A2) • Antígeno Leucocitario Humano DR (HLA-DR2) - 57 - SUJETOS Y MÉTODOS Algunos de los tipos de PCR utilizadas en el presente trabajo son: PCR-RFLP. En algunos casos, los productos amplificados poseen secuencias que son reconocidas y cortadas por ciertas enzimas, denominadas endonucleasas de restricción; de esta manera, si dos regiones amplificadas por PCR presentan variaciones en la secuencia nucleotídica en los sitios de reconocimiento de las enzimas de restricción, se generarán distintos patrones de fragmentos. Nested-PCR (PCR anidada). Consiste en realizar dos reacciones de PCR consecutivas. Al finalizar la primera, una alícuota de la misma es sometida nuevamente al proceso de multiplicación tras haber colocado dos primers internos, que amplificaran una región contenida dentro de la región amplificada en primer lugar. PCR-SSO. El fundamento de esta técnica es una hibridación reversa post-PCR. El soporte de la hibridación consiste en tiras de nitrocelulosa con sondas de oligonucleótidos específicos inmovilizadas en líneas paralelas. Estas sondas son complementarias a la secuencia de mutaciones conocidas. La amplificación de la muestra se realiza con primers biotinilados que permitirán el revelado de la reacción. Tras la hibridación se añade un conjugado compuesto por estreptavidina-fosfatasa alcalina, que se unirá a cualquier híbrido formado sobre la tira. Al añadir el sustrato de la enzima se producirá un precipitado marrón-púrpura en las posiciones correspondientes. PCR-SSP. Bajo condiciones de PCR estrictamente controladas, los primers que emparejan perfectamente dan lugar a amplificación de la secuencia que interesa (resultado positivo), mientras que si existe algún emparejamiento erróneo, o mismatch, no habrá amplificación (resultado negativo). La interpretación de los resultados de la PCR-SSP se basa en la presencia o ausencia de fragmentos específicos de ADN amplificados. También se incluye una pareja de primers que sirven de control interno para controlar que la PCR ha tenido lugar y no se ha visto afectada por cualquier otro factor (fig. SM1). - 64 - SUJETOS Y MÉTODOS 2.1.- ESTUDIO DE LOS GENES APOE, BCH, MPO E IL-1 (PCR-RFLP Y NESTEDPCR) El estudio de los polimorfismos de los genes de la apolipoproteína E, butirilcolinesterasa, mieloperoxidasa, e interleuquinas-1alfa y -1beta, siguieron todos el mismo procedimiento, esto es, una PCR-RFLP en la que primero se amplificó la zona génica a estudiar por medio de PCR, seguida de un corte enzimático con la enzima de restricción correspondiente. Las amplificaciones se realizaron en un volumen final de 50μl, con ADN a una concentración de 100ng/μl, MgCl2, desoxinucleótidos trifosfato (dNTP), primers y enzima polimerasa en su propio tampón. Las distintas PCR se llevaron a cabo en un termociclador Perkin Elmer 9600 siguiendo cada una su propio protocolo de amplificación. Una vez terminada la reacción de amplificación, en un gel de agarosa al 2% en TBE 1X y con bromuro de etidio, se comprobó si la misma había tenido lugar con éxito, sometiendo las muestras a electroforesis de 200 V durante unos 40-60 minutos; para ésto, se tomaron 3μl de cada muestra y se mezclaron con 7μl de tampón de carga, en un volumen final de 10μl. Una vez comprobado que existía producto de amplificación, se tomó una cantidad de éste y se sometió a la acción de una enzima de restricción, generándose un determinado patrón de bandas que nos daba el tipaje deseado. Las electroforesis posteriores tuvieron lugar en geles de poliacrilamida de distinto porcentaje según las bandas a identificar. - 65 - SUJETOS Y MÉTODOS 2.1.1.- APOE El genotipaje de los polimorfismos exónicos del gen APOE se realizó de acuerdo al método descrito por Hixson et al [Hixson, 1990], con ligeras modificaciones: Se amplificó el ADN con los cebadores 5’-ACA GAA TCC GCC CCG GCC TGG TAC AC3’ y 5’-TAA GCT TGG CAC GGC TGT CCA AGG A-3’, generándose una banda de 244 pares de bases. Además del buffer descrito por el fabricante de la taq polimerasa (Perkin Elmer), cada reacción de amplificación contenía 1μM de cada primer, 200 μM dNTP, 1,5mM MgCl2, 10% DMSO, 1,25 u taq polimerasa, y 200-400ng ADN en un volumen final de 50μl. Cada mezcla de reacción se calentó a 95ºC durante 5 minutos, siendo sometida a 30 ciclos de amplificación mediante desnaturalización (95ºC, 30 segundos), anillamiento, (60ºC, 20 segundos), y extensión, (72ºC, 20 segundos), y un ciclo final de extensión de 72ºC durante 10 minutos. CORTE CON ENDONUCLEASA Una vez comprobado la presencia de producto amplificado, se añadieron 5 unidades de la enzima de restricción HhaI (New England Biolabs, Ref. R0139L) directamente a cada uno de éstos. Esta enzima reconoce la secuencia: 5’ G C G ↓C 3’ 3’ C↑ G C G 5’ La nueva reacción se incubó a 37ºC durante 3 horas y, por último, se realizó una electroforesis del producto de corte en gel de poliacrilamida no desnaturalizante al 20%. - 66 - SUJETOS Y MÉTODOS Los distintos patrones de bandas del genotipo resultante podían ser: E4/4: 72 pb + 48 pb + 35 pb E4/2: 91 pb + 83 pb + 72 pb + 48 pb + 35 pb E3/4: 91 pb + 72 pb + 48 pb + 35 pb E3/3: 91 pb + 48 pb + 35 pb E3/2: 91 pb + 83 pb + 48 pb + 35 pb. E2/2: 91 pb + 83 pb 2.1.2.- BUTIRILCOLINESTERASA Aunque las variantes “salvaje” (W) y K del gen de la butirilcolinesterasa son las más comunes, existen otras variantes; así pues, para comprobar que las variantes que encontrabamos eran éstas (W y/o K) , a cada individuo de este estudio se le realizó un doble tipaje, es decir dos PCR-RFLP: una para el tipaje de la variante K y otro para el tipaje de la variante W, de acuerdo al método descrito por Altamirano et al, con ligeras modificaciones [Altamirano, 2000]. Los primers utilizados fueron los siguientes: - Variante K : 5’ TTA ATA CAA CTT ATT CCA TAT TTT ACA GGA AAT ATT GAT GTA 3’ y 5’ AAG CTC CTG ATA TTT TTG CCT TGA TCT AAA GGA AAA 3, que generan una banda de 217 pb. - Variante salvaje (W): 5’ TGT ACT GTG TAG TTA GAG AAA ATG GCT TTT GT 3’ y 5’ ATG TTA TTG TTC CAG CGA TGG AAT CCT GCT TTC CAC GCC CAT TCG G 3’, que generan una banda de 169 pb. Además del buffer descrito por el fabricante de la taq polimerasa (Ecogen), cada reacción de amplificación contenía 0,5μM de cada primer, 200μM dNTP, 3mM MgCl2, 2,5u taq polimerasa y 300-500ng ADN en un volumen final de 50μl. Cada mezcla de reacción se calentó a 95ºC durante 5 minutos, siendo sometida a 30 ciclos de amplificación mediante desnaturalización (95ºC, 1minuto), anillamiento, - 67 - SUJETOS Y MÉTODOS (60ºC, 1 minuto), y extensión, (72ºC, 1 minuto), y un ciclo final de extensión de 72ºC durante 5 minutos. Los genotipos BChE-K y BChE-W se identificaron tras digestión con Mae III y Bgl I, respectivamente, y resolución por electroforesis en un gel de poliacrilamida al 13%; los fragmentos individuales de ADN se visualizaron y fotografiaron tras su tinción con bromuro de etidio. CORTES CON ENDONUCLEASAS A) Variante K Utilizamos la enzima Mae III (Roche Ref. 822248), que reconoce la secuencia: 5’ ↓G T N A C 3’ 3’ C A N T G↑ 5’ Incubamos a 55º durante 3 horas, con las siguientes condiciones de corte de restricción: 12,5μl del buffer descrito para Mae III, 0,08u de Mae III y 10μl de producto amplificado en un volumen final de 25μl. Los productos generados eran: Corte con MaeIII (alelo A = variante K): 178 pb + 39 pb No corte con MaeIII: 217 pb B) Variante salvaje (W) Utilizamos la enzima Bgl I (New England Biolabs Ref. R0143L), que reconoce la secuencia: 5´ G C C N N N N↓N G G C 3´ 3´ C G G N↑N N N N C C G 5´ Incubamos a 37ºC durante 3 horas, con las siguientes condiciones: 2μl del buffer descrito para Bgl I, 10u de Bgl I y 10μl de producto amplificado en un volumen final de 25μl. Los productos generados eran: Corte con Bgl I (alelo A = variante W): 119 pb + 50 pb No corte con Bgl I: 169 pb - 68 - SUJETOS Y MÉTODOS 2.1.3.- MIELOPEROXIDASA El genotipaje del polimorfismo -463 G/A del promotor del gen MPO se realizó de acuerdo al método descrito por Reynolds et al [Reynolds,1999; Reynolds, 2000], con ligeras modificaciones: Se amplificó el ADN con los cebadores 5’- CGG TAT AGG CAC ACA ATG GTG AG 3’ y 5’ GCA ATG GTT CAA GCG ATT CTT C -3’, generándose una banda de 350 pb. Además del buffer descrito por el fabricante de la taq polimerasa (Ecogen), cada reacción de amplificación contenía 0,25μM de cada primer, 200μM dNTP, 0,75mM MgCl2, 10% DMSO, 2,5u taq polimerasa y 500ng ADN en un volumen final de 50μl. Cada mezcla de reacción se calentó a 95ºC durante 5 minutos, siendo sometida a 30 ciclos de amplificación mediante desnaturalización (95ºC, 1 min), anillamiento (60ºC, 1 min), y extensión (72ºC, 2 min). CORTE CON ENDONUCLEASA El polimorfismo de G a A en la posición –463 en la región promotora del gen de la mpo destruye (alelo A) o crea (alelo G) un sitio de restricción Aci I dentro de un fragmento de amplificación de 350 pb. Existen tres posibles genotipos definidos por tres diseños de bandeados distintos cuando realizamos una PCR-RFLP: A/A, G/A, G/G. Una vez comprobado la presencia de producto amplificado, se añadió 1 unidad de la enzima de restricción Aci I (New England Biolabs, Ref. R0551L) directamente a 10 μl de producto amplificado e incubamos a 37ºC durante 3 horas. Esta enzima que reconoce la secuencia: 5’ C↓C G C 3’ 3’ G G C↑G 5’ - 69 - SUJETOS Y MÉTODOS El distinto patrón de bandas que se puede generar es: Genotipo A/A (menor actividad promotora): 289 pb + 61 pb Genotipo A/G : 289 pb + 169 pb + 120 pb + 61 pb Genotipo G/G (mayor actividad promotora) : 169 pb + 120 pb + 61 pb 2.1.4.- INTERLEUQUINA-1 El genotipaje de los polimorfismos de los genes de estas interleuquinas se realizó de acuerdo a los métodos descritos por Kanemoto et al [Kanemoto, 2000] y Foster et al [Foster, 2000], con ligeras modificaciones; la amplificación del ADN con los primers para IL-1beta (- 511C/T) 5’-TGG CAT TGA TCT GGT TCA TC-3’ y 5’-GTT TAG GAA TCT TCC CAC TT-3’, generan una banda de 299 pb; para IL-1beta (+3953C/T): 5’ GTT GTC ATC AGA CTT TGA CC 3’ y 5’ TTC AGT TCA TAT GGA CCA GA 3’, generaron una banda de 249 pb; y para IL-1alfa (-889 C/T), los primers fueron 5’-GGG GGC TTC ACT ATG TTG CCC ACA CTG GAC TAA-3’ y 5’-GAA GGC ATG GAT TTT TAC ATA TGA CCT TCC ATG-3’, que generan una banda de 304 pb. Además del buffer descrito por el fabricante de la Taq polimerasa (Perkin Elmer), cada reacción de amplificación contenía 0,5μM de cada primer, 100μM dNTP, 1,5mM MgCl2, 1,25u taq polimerasa, y 200ng ADN en un volumen final de 50μl. Cada mezcla de reacción se calentó a 95ºC durante 5 minutos, siendo sometida a 35 ciclos de amplificación mediante desnaturalización (94ºC, 45 segundos), anillamiento, (54ºC, 50 segundos), y extensión, (72ºC, 1minuto), y un ciclo final de extensión de 72ºC durante 5 minutos. - 70 - SUJETOS Y MÉTODOS CORTES CON ENDONUCLEASAS Los genotipos IL-1beta (- 511C/T) e IL-1beta (C+3953T) se identificaron tras digestión con las enzimas Ava I y Taq I, respectivamente, resolviéndose por electroforesis en un gel de poliacrilamida al 20%; mientras que los genotipos IL-1alfa (-889 C/T) se identificaron tras digestión con Nco I y resolución por electroforesis también en un gel de poliacrilamida al 20%; los fragmentos individuales de ADN se visualizaron y fotografiaron tras su tinción con bromuro de etidio. CORTE CON ENDONUCLEASA PARA ESTUDIO IL-1beta: PROMOTOR (C511T) Utilizamos la enzima de restricción Ava I (New England Biolabs Ref. R0152L), que reconoce la secuencia: 5’ C ↓Y C G R G 3’ 3’ G R G C Y ↑C 5’ Las condiciones de corte son las siguientes, durante 3 horas a 37ºC: 2 μl del buffer descrito para Ava I, 10u de Ava I y 8μl de producto amplificado en un volumen final de 25μl. Los productos generados fueron: Corte con Ava I (alelo C):190 pb + 114 pb No corte con Ava I (alelo T): 304 pb CORTE CON ENDONUCLEASA PARA ESTUDIO IL-1beta: EXON V (C+3953T) Utilizamos la enzima de restricción Taq I (New England Biolabs Ref.149L), que corta la diana 5’ T ↓C G A 3’ 3’ A G C↑ T 5’ Las condiciones de corte son las siguientes, durante 3 horas a 65ºC: 2μl del buffer descrito para Taq I, 2μl de BSA (albúmina de suero bovino), 10u de Taq I y 10μl de producto amplificado en un volumen final de 25μl. - 71 - SUJETOS Y MÉTODOS Los productos generados fueron: Corte con Taq I (alelo C): 135 pb + 114 pb No corte con Taq I (alelo T): 249 pb CORTE CON ENDONUCLEASA PARA ESTUDIO IL-1alfa: PROMOTOR (C-889T); Utilizamos la enzima de restricción Nco I (New England Biolabs Ref. R0193L), que reconoce la secuencia: 5’ C↓ C A T G G 3’ 3’ G G T A C ↑C 5’ Las condiciones de corte son las siguientes, durante 3 horas a 37ºC: 2μl del buffer descrito para Nco I, 10u de Nco I y 8μl de producto amplificado en un volumen final de 25μl. Los productos generados fueron: Corte con Nco I (alelo C): 267 pb + 32 pb No corte con Nco I (alelo T): 299 pb REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA: REACTIVOS, TAMPONES Y GELES • dNTP mix: dATP (ROCHE Ref.1051440), dCTP(ROCHE Ref.1051458), dGTP(ROCHE Ref.1051466), dTTP(ROCHE Ref.1051482) Cada uno de los 4 desoxinucleótidos está a una concentración de 100mM en un volumen de 250μl. Se mezclan los cuatro y se les añade agua bidestilada (9ml) hasta quedar a una concentración de 2,5mM cada uno. Esta mezcla se alicuota en tubos eppendorf de 0,5ml y se congelan. - 72 - SUJETOS Y MÉTODOS • Tampón de carga 6X (para geles de electroforesis de bandas con bajos pesos moleculares) Stock Concentración Final Volumen (50 ml) H2O bidestilada (BRAUN Ref.387875) 8,75 ml Azul de bromofenol (BPB) 10 % 0,25 % 1,25 ml Sacarosa (SIGMA Ref. S0389-500G) 50 % 40 % 40 ml - Azul de bromofenol: Pesar 5 g y disolver en agua destilada hasta un volumen final de 50 ml. - Sacarosa 50% (p/v): Pesar 50 g y disolver en agua destilada hasta un volumen final de 100 ml. • Tampón TBE 1X Se toman 500 ml de tampón TBE 10X (BIO-RAD Ref.161-0770), y se diluyen en agua destilada hasta un volumen final de 5 litros. • Bromuro de Etidio 10 mg/ml (SIGMA Ref. E7637-25G) Pesar 0,5g y disolver en agua destilada hasta un volumen final de 50 ml. • Gel de agarosa 2% Pesar 4,8g de agarosa (ECOGEN Medium EEO agarose 250 gr. Ref AG0220) y disolver en TBE 1X. Calentar en microondas y añadir 11,5μl de bromuro de etidio cuando enfríe. Dejar gelificar en una bandeja de electroforesis con sus correspondientes peines para hacer los pocillos. Una vez gelificado, poner en una cubeta de electroforesis y cubrir con TBE 1X. - 73 - SUJETOS Y MÉTODOS - 80 - 3.- ANALISIS ESTADÍSTICO El análisis estadístico se llevó a cabo con el programa informático SPSS versión 10.0 para Windows (Chicago, IL, USA). Las frecuencias genotípicas y alélicas, tanto del grupo de pacientes como del grupo de controles, se obtuvieron por recuento directo de los genotipos y alelos, y cálculo de proporciones simples. Así mismo, hemos realizado el estudio de la presencia o ausencia de un determinado alelo, en cada sujeto, como un carácter cuantificable. Las comparaciones de alelos, genotipos y presencia/ausencia de un carácter, se realizaron con el test de Chi-cuadrado de Pearson (χ2), o el test exacto de Fisher, cuando fue necesario, en el módulo “crosstab” del paquete estadístico SPSS. Se utilizó el método de Wolf-Haldane para el cálculo de los odds ratio (O.R.) y los intervalos de confianza (I.C.) del 95%. La comparación de edad al diagnóstico se realizó por medio del test no paramétrico de Mann-Whitney. Respecto a los estudios de Regresión Logística, se han realizado con el módulo apropiado del paquete estadístico SPSS versión 10.0, lo mismo que la Regresión de Cox para variables de tiempo. Como es habitual en estos estudios, en este trabajo, todas las p superiores a 0,05, se han considerado no significativas. RESULTADOS RESULTADOS RESULTADOS 1.- CASUÍSTICA De los 282 pacientes mayores de 60 años, 88 fueron hombres y 194 mujeres. El rango de edad de los enfermos fue de 60 a 97 años, con una edad media de 76,05 años. Por género, la edad media de los hombres fue de 75,22, mientras que la de las mujeres fue de 76,43. De los 312 controles, 192 fueron hombres y 120 mujeres. El rango de edad de los controles fue de 60 a 90 años, con una edad media de 70,10 años. Por género, la edad media de los hombres fue de 70,36, mientras que la de las mujeres fue de 69,68. TABLA R1DESCRIPCIÓN DE LOS GRUPOS DIAGNÓSTICO GÉNERO N MEDIA MÍNIMO MÁXIMO Hombre 88 75,22 60 88 Mujer 194 76,43 60 97 Pacientes TOTAL 282 76,05 60 97 Hombre 192 70,36 60 90 Mujer 120 69,68 60 88 Controles TOTAL 312 70,10 60 90 Hombre 280 71,89 60 90 Mujer 314 73,85 60 97 TOTAL TOTAL 594 72,93 60 97 - 81 - RESULTADOS 2.- EDAD AL DIAGNÓSTICO Cuando estudiamos la edad al diagnóstico, evidentemente sólo podemos hacerlo en el grupo de pacientes. Estos fueron divididos por grupos de 5 años, tal y como se muestra en la tabla R2, donde podemos ver que el porcentaje de pacientes va aumentando a medida que aumenta la edad hasta los 80 años, donde empieza a descender el número de pacientes. TABLA R2GRUPOS DE EDAD EN PACIENTES GRUPOS DE EDAD 60-64 65-69 70-74 75-79 80-84 ≥ 85 TOTAL 18 (6,4%) 28 (9,9%) 66 (23,4%) 74 (26,2%) 67 (23,8%) 29 (10,3%) 282 (100%) 3.- GÉNERO Cuando estudiamos la posible relación del género con la enfermedad observamos que existen diferencias significativas entre hombres y mujeres, de tal manera que el género femenino es un factor de susceptibilidad para la enfermedad (tablas R3 y R40): TABLA R3RELACIÓN GÉNERO x DIAGNÓSTICO GENERO Hombre Mujer TOTAL Pacientes N (%) 88 (31,2) 194 (68,8) 282 (100,0) DIAGNOSTICO Controles N (%) 192 (61,5) 120 (38,5) 312 (100,0) TOTAL N (%) 280 (47,1) 314 (52,9) 594 (100,0) p = 0,000; O.R. = 3,527; I.C. (2,511 – 4,955) - 82 - RESULTADOS Decidimos comprobar también si existía alguna relación entre el género y la edad al diagnóstico de la enfermedad, para lo cual realizamos este estudio en el grupo de los pacientes. Así, aplicando el test de Mann-Whitney, que nos sirve para comparar medias de dos grupos, no encontramos diferencias estadísticamente significativas entre hombres y mujeres, aunque estas últimas son más longevas. TABLA R4RELACIÓN GÉNERO x EDAD AL DIAGNÓSTICO GÉNERO N MEDIA DESVIACIÓN ESTÁNDAR Hombre 88 75,22 7,08 EDAD Mujer 194 76,43 6,72 p = 0,167 4.- VARIABLES GENÉTICAS Como ya se indicó en el apartado de Material y Métodos, las distintas variables genéticas estudiadas fueron: • Apolipoproteína E (APOE E: exón 4) • Butirilcolinesterasa (BChE: variantes W-K; exón 4: +1615 G/A) • Mieloperoxidasa (MPO: -463 G/G) • Factor de Necrosis Tumoral-alfa (TNF-alfa: -308 G/A) • Factor Transformador del Crecimiento-beta1 (TGF-beta1: +10 T/C y +25 G/A) • Interferon-gamma (IFN-gamma: +874 T/A) • Interleuquina-10 (IL-10: -1082 G/A, -819 C/T y -592 C/A) • Interleuquina-1alfa (IL-1alfa: -889 C/T) • Interleuquina-1beta (IL-1beta: +3953 T/C y -511 T/C) • Interleuquina-6 (IL-6: -174 G/C) • Antígeno Leucocitario Humano A (HLA-A2) • Antígeno Leucocitario Humano DR (HLA-DR2) - 83 - RESULTADOS La distribución de los genotipos de todos los genes propuestos en este estudio, en ambos grupos de sujetos (pacientes y controles), mostró que todos éstos se encontraban en equilibrio de Hardy-Weimberg, esto es, los genotipos observados no presentaron desviaciones de los genotipos esperados, asumiéndose, por tanto, el equilibrio genético en la población. 4.1.- APOLIPOPROTEÍNA E Ya mencionado en el apartado Introducción, es el alelo E4 del gen de la apolipoproteína E el que se ha encontrado asociado con la enfermedad de Alzheimer de tipo esporádico y tardío. 4.1.1. GENOTIPOS Y ALELOS La distribución de los genotipos y alelos de este gen, en nuestro grupo de estudio, se muestran a continuación en las siguientes tablas (Tablas R5 y R6): TABLA R5DISTRIBUCIÓN DE GENOTIPOS APO-E x DIAGNÓSTICO GENOTIPO APOE E4/4 E4/3 E4/2 E3/3 E3/2 E2/2 TOTAL Paciente N (%) 22 (7,8) 108 (38,3) 8 (2,8) 129 (45,7) 15 (5,3) 0 282 (100,0) DIAGNÓSTICO Control N (%) 1 (0,3) 64 (20,5) 4 (1,3) 220 (70,5) 22 (7,1) 1 (0,3) 312 (100,0) TOTAL N (%) 23 (3,9) 172 (29,0) 12 (2,0) 349 (58,8) 37 (6,2) 1 (0,2) 594 (100,0) p = 0,000 - 84 - RESULTADOS TABLA R6DISTRIBUCIÓN DE ALELOS APO-E x DIAGNÓSTICO ALELOS APOE E2 E3 E4 TOTAL Paciente N (%) 23 (4,1) 381 (67,6) 160 (28,4) 564 (100,0) DIAGNOSTICO Control N (%) 28 (4,5) 526 (84,3) 70 (11,2) 624 (100,0) TOTAL N (%) 51 (4,3) 907 (76,3) 230 (19,4) 1188 (100,0) p = 0,000 Podemos ver que existe algún tipo de relación de estos alelos con la EA, de manera que es el alelo E4 el que aparece en mayor número en el grupo de nuestros pacientes, mientras que el E3 lo hace en el grupo control (el E2 aparece por igual en ambos grupos). Si estratificamos nuestro grupo de estudio por presencia / ausencia de este alelo E4, podemos ver que el casi el 50% de los pacientes lo presentan, mientras que el otro 50% no lo tiene. Sin embargo, no ocurre lo mismo con los controles, donde casi un 78% de los individuos no portan este alelo: TABLA R7PRESENCIA DEL ALELO E4 x DIAGNÓSTICO PRESENCIA DE E4 E4 pres No E4 TOTAL Pacientes N (%) 138 (48,9) 144 (51,1) 282 (100,0) DIAGNÓSTICO Controles N (%) 69 (22,1) 243 (77,9) 312 (100,0) TOTAL N (%) 207 (34,8) 387 (65,2) 594 (100,0) p = 0,00; O.R. = 3,37; I.C. (2,36 – 4,81) Vemos que existe una fuerte asociación de la presencia del alelo E4 con la enfermedad, incluso cuando hacemos este mismo estudio separando por género, donde la asociación se mantiene igual de fuerte en ambos sexos (Tabla R8): - 85 - RESULTADOS TABLA R8PRESENCIA DEL ALELO E4 x DIAGNÓSTICO x GÉNERO PRESENCIA DE E4 HOMBRES E4 pres No E4 TOTAL Pacientes N (%) 39 (44,3) 49 (55,7) 88 (100,0) DIAGNÓSTICO Controles N (%) 39 (20,3) 153 (79,7) 192 (100,0) PRESENCIA DE E4 MUJERES E4 pres No E4 TOTAL Pacientes N (%) 99 (51,0) 95 (49,0) 194 (100,0) DIAGNÓSTICO Controles N (%) 30 (25,0) 90 (75,0) 120 (100,0) Hombres: p = 0,000; OR = 3,122; I.C.(1,80–5,40) Mujeres: p = 0,000; OR = 3,126; I.C.(1,89–5,15) 4.1.2. EFECTO DOSIS Quisimos estudiar también si existía un “efecto dosis” respecto a este alelo, es decir, si existían diferencias en cuanto a tener un alelo E4 (heterocigoto E x/4) o dos (homocigoto E 4/4) frente a no tener ninguno. Para esto, realizamos una regresión logística y pudimos observar que tener un alelo E4 conlleva un riesgo casi 3 veces mayor que no tener ningún alelo E4, mientras que tener dos alelos E4 (ser homocigoto E 4/4) conlleva un riesgo 37 veces mayor que cuando no se tiene ninguno (Tabla R9): TABLA R9ESTUDIO DE DOSIS DE ALELO E4 x DIAGNÓSTICO Nº DE ALELOS E4 N p O.R. I.C. 0 144 1 116 0,000 2,879 2,001 – 4,140 2 22 0,000 37,008 4,950 – 276,64 En este tabla, donde la categoría de referencia es no tener ningún alelo E4, podemos ver que el I.C. para el caso de tener 2 alelos E4 es muy amplio; esto es debido a que en alguna de las casillas tenemos muy poco número de individuos, concretamente en - 86 - RESULTADOS la casilla "control-4/4" de la tabla R5 sólo hay 1 individuo (si este número hubiera sido mayor, el I.C. sería más corto). 4.1.3. EDAD AL DIAGNÓSTICO En cuanto a si este alelo presentaba alguna relación con la edad al diagnóstico, no encontramos ninguna relación entre ambos: TABLA R10PRESENCIA DEL ALELO E4 x EDAD AL DIAGNÓSTICO PRESENCIA DE E4 N MEDIA DESVIACIÓN ESTÁNDAR E4 presente 138 75,78 6,48 EDAD E4 ausente 144 76,31 7,19 p = 0,517 4.2.- BUTIRILCOLINESTERASA 4.2.1. ALELOS Y GENOTIPOS En cuanto al estudio de los genotipos de la BChE realizados en este trabajo, el porcentaje de pacientes que portaban el alelo K de la BChE fue muy similar al de los controles, al igual que el porcentaje de individuos que portaban el alelo salvaje, por lo que ninguno de éstos presentó asociación alguna con la susceptibilidad a la enfermedad: TABLA R11RELACIÓN DE GENOTIPOS BChE x DIAGNÓSTICO GENOTIPOS ALELOS KK KW WW K W Pacientes (%) 14 (5,0) 82 (29,1) 186 (66,0) 192 (34,0) 372 (66,0) DIAGNOSTICO Controles (%) 16 (5,1) 89 (28,5) 207 (66,3) 210 (33,7) 414 (66,3) TOTAL (%) 30 (5,1) 171 (28,8) 393 (66,2) 402 (33,8) 786 (66,2) p = 0,987 p = 0,902 - 87 - RESULTADOS TABLA R12PRESENCIA DEL ALELO K BChE x DIAGNÓSTICO PRESENCIA DE K K pres No K TOTAL Pacientes N (%) 96 (34,0) 186 (66,0) 282 (100,0) DIAGNÓSTICO Controles N (%) 105 (33,7) 207 (66,3) 312 (100,0) TOTAL N (%) 201 (33,8) 393 (66,2) 594 (100,0) p = 0,931 4.2.2. INTERACCIÓN CON APOE4 Tampoco hubo asociación con la enfermedad cuando estratificamos por presencia / ausencia de BChE-K, ni siquiera estratificando por género o por presencia / ausencia de APOE E4 (Tabla R13): TABLA R13PRESENCIA ALELO K x DIAGNÓSTICO x PRESENCIA DE APOE E4 PRESENCIA DE K ALELO E4 PRESENTE K pres No K TOTAL Pacientes (%) 44 (31,9) 94 (68,1) 138 (100,0) DIAGNÓSTICO Controles (%) 24 (34,8) 45 (65,2) 69 (100,0) PRESENCIA DE K ALELO E4 AUSENTE K pres No K TOTAL Pacientes (%) 52 (36,1) 92 (63,9) 144 (100,0) DIAGNÓSTICO Controles (%) 81 (33,3) 162 (66,70) 243 (100,0) Presencia APOE E4 → p = 0,754 Ausencia APOE E4 → p = 0,582 4.2.3. EDAD AL DIAGNÓSTICO Sin embargo, cuando hacemos el estudio de asociación con la edad al diagnóstico, encontramos que la presencia / ausencia del alelo K sí que tiene relación con la - 88 - RESULTADOS 4.4.2.- TGF-BETA1 (+10T/C) 4.4.2.1. GENOTIPOS Y ALELOS En nuestro estudio no encontramos ninguna relación de los genotipos y alelos del polimorfismo +10T/C del gen TGF-beta1 con la EA. TABLA R22RELACIÓN DE GENOTIPOS Y ALELOS TGF-BETA 1 (+10 T/C) x DIAGNOSTICO GENOTIPOS ALELOS TT TC CC T C Pacientes (%) 94 (33,3) 139 (49,3) 49 (17,4) 327 (58,0) 237 (42,0) DIAGNOSTICO Controles (%) 102 (32,7) 143 (45,8) 67 (21,5) 347 (55,6) 277 (44,4) p = 0,435 p = 0,412 4.4.2.2. INTERACCIÓN APOE E4 Cuando estratificamos por presencia / ausencia de APOE E4, tampoco encontramos ningún tipo de asociación de los genotipos y/o alelos del polimorfismo +10T/C del gen TGF-beta1 con el diagnóstico de la EA. 4.4.2.3. EDAD AL DIAGNÓSTICO No encontramos relación de los genotipos y/o alelos del polimorfismo +10T/C del gen TGF-beta1 con la edad al diagnóstico de la enfermedad. 4.4.2.4. EFECTO DOSIS Al no existir ningún tipo de relación con la enfermedad, no fue necesario estudiar el efecto dosis de los alelos que conforman los genotipos de esta citoquina. - 95 - RESULTADOS 4.4.3.-TGF-BETA1 (+25 G/A) 4.4.3.1. GENOTIPOS Y ALELOS En nuestro estudio no encontramos ninguna relación de los genotipos y alelos del polimorfismo +25 G/A del gen TGF-beta1 con la EA. TABLA R23RELACIÓN DE GENOTIPOS Y ALELOS TGF-BETA 1 (+25 G/C) x DIAGNOSTICO GENOTIPOS ALELOS GG GC CC G C Pacientes (%) 254 (90,1) 26 (9,2) 2 (0,7) 533 (94,5) 31 (5,5) DIAGNOSTICO Controles (%) 267 (85,6) 44 (14,1) 1 (0,3) 578 (92,6) 46 (7,4) p = 0,151 p = 0,197 4.4.3.2. INTERACCIÓN APOE E4 Cuando estratificamos por presencia / ausencia de APOE E4, tampoco encontramos ningún tipo de asociación de los genotipos y/o alelos del polimorfismo +25 G/A del gen TGF-beta1 con el diagnóstico de la EA. 4.4.3.3. EDAD AL DIAGNÓSTICO No encontramos relación de los genotipos y/o alelos del polimorfismo +25 G/A del gen TGF-beta1 con la edad al diagnóstico de la enfermedad. 4.4.3.4. EFECTO DOSIS Al no existir ningún tipo de relación con la enfermedad, no fue necesario estudiar el efecto dosis de los alelos que conforman los genotipos de esta citoquina. - 96 - RESULTADOS 4.4.4.- IFN-GAMMA (+874 T/A) 4.4.4.1. GENOTIPOS Y ALELOS En nuestro estudio no encontramos ninguna relación de los genotipos y alelos del polimorfismo +874 T/A del gen IFN-gamma con la EA. TABLA R24RELACIÓN DE GENOTIPOS Y ALELOS IFN-GAMMA (+874 T/A) x DIAGNOSTICO GENOTIPOS ALELOS TT TA AA T A Pacientes (%) 62 (22,0) 143 (50,7) 77 (27,3) 297 (52,7) 267 (47,3) DIAGNOSTICO Controles (%) 65 (20,8) 163 (52,2) 84 (26,9) 331 (53,0) 293 (47,0) p = 0,920 p = 0,907 4.4.4.2. INTERACCIÓN APOE E4 Cuando estratificamos por presencia / ausencia de APOE E4, tampoco encontramos ningún tipo de asociación de los genotipos y/o alelos del polimorfismo +874 T/A del gen IFN-gamma con el diagnóstico de la EA. 4.4.4.3. EDAD AL DIAGNÓSTICO No encontramos relación de los genotipos y/o alelos del polimorfismo +874 T/A del gen IFN-gamma con la edad al diagnóstico de la enfermedad. 4.4.4.4. EFECTO DOSIS Al no existir ningún tipo de relación con la enfermedad, no fue necesario estudiar el efecto dosis de los alelos que conforman los genotipos de esta citoquina. - 97 - RESULTADOS 4.4.5.- IL-10 (-1082 G/A) 4.4.5.1. GENOTIPOS Y ALELOS En nuestro estudio no encontramos ninguna relación de los genotipos y alelos del polimorfismo de promotor -1082 G/A del gen IL-10 con la EA. TABLA R25RELACIÓN DE GENOTIPOS Y ALELOS IL-10 (-1082 G/A) x DIAGNOSTICO GENOTIPOS ALELOS GG GA AA A G Pacientes (%) 49 (17,4) 128 (45,4) 105 (37,2) 338 (59,9) 226 (40,1) DIAGNOSTICO Controles (%) 51 (16,3) 152 (48,7) 109 (34,9) 370 (59,3) 254 (40,7) p = 0,719 p = 0,859 4.4.5.2. INTERACCIÓN APOE E4 Cuando estratificamos por presencia / ausencia de APOE E4, tampoco encontramos ningún tipo de asociación de los genotipos y/o alelos del polimorfismo de promotor -1082 G/A del gen IL-10 con el diagnóstico de la EA. 4.4.5.3. EDAD AL DIAGNÓSTICO No encontramos relación de los genotipos y/o alelos del polimorfismo de promotor -1082 G/A del gen IL-10 con la edad al diagnóstico de la enfermedad. 4.4.5.4. EFECTO DOSIS Al no existir ningún tipo de relación con la enfermedad, no fue necesario estudiar el efecto dosis de los alelos que conforman los genotipos de esta citoquina. - 98 - RESULTADOS 4.4.6.- IL-10 (-819 C/T) 4.4.6.1. GENOTIPOS Y ALELOS En nuestro estudio no encontramos ninguna relación de los genotipos y alelos del polimorfismo de promotor -819 C/T del gen IL-10, con la EA. TABLA R26RELACIÓN DE GENOTIPOS Y ALELOS IL-10 (-819 C/T) x DIAGNOSTICO GENOTIPOS ALELOS CC CT TT C T Pacientes (%) 144 (51,1) 113 (40,1) 25 (8,9) 163 (28,9) 401 (71,1) DIAGNOSTICO Controles (%) 162 (51,9) 123 (39,4) 27 (8,7) 177 (28,4) 447 (71,6) p = 0,978 p = 0,847 4.4.6.2. INTERACCIÓN APOE E4 Cuando estratificamos por presencia / ausencia de APOE E4, tampoco encontramos ningún tipo de asociación de los genotipos y/o alelos del polimorfismo de promotor -819 C/T del gen IL-10 con el diagnóstico de la EA. 4.4.6.3. EDAD AL DIAGNÓSTICO No encontramos relación de los genotipos y/o alelos del polimorfismo de promotor -819 C/T del gen IL-10 con la edad al diagnóstico de la enfermedad. 4.4.6.4. EFECTO DOSIS Al no existir ningún tipo de relación con la enfermedad, no fue necesario estudiar el efecto dosis de los alelos que conforman los genotipos de esta citoquina. - 99 - RESULTADOS 4.4.7.- IL-10 (-592 C/A) 4.4.7.1. GENOTIPOS Y ALELOS En nuestro estudio no encontramos ninguna relación de los genotipos y alelos del polimorfismo de promotor -592 C/A del gen IL-10 con la EA. TABLA R27RELACIÓN DE GENOTIPOS Y ALELOS IL-10 (-592 C/A) x DIAGNOSTICO GENOTIPOS ALELOS CC CA AA C A Pacientes (%) 143 (50,7) 114 (40,4) 25 (8,9) 164 (29,1) 400 (70,9) DIAGNOSTICO Controles (%) 162 (51,9) 123 (39,4) 27 (8,7) 177 (28,4) 447 (71,6) p = 0,957 p = 0,798 4.4.7.2. INTERACCIÓN APOE E4 Cuando estratificamos por presencia / ausencia de APOE E4, tampoco encontramos ningún tipo de asociación de los genotipos y/o alelos del polimorfismo de promotor -592 C/A del gen IL-10 con el diagnóstico de la EA. 4.4.7.3. EDAD AL DIAGNÓSTICO No encontramos relación de los genotipos y/o alelos del polimorfismo de promotor -592 C/A del gen IL-10 con la edad al diagnóstico de la enfermedad. 4.4.7.4. EFECTO DOSIS Al no existir ningún tipo de relación con la enfermedad, no fue necesario estudiar el efecto dosis de los alelos que conforman los genotipos de esta citoquina. - 100 - RESULTADOS 4.4.8.- IL-1 ALFA (-889 C/T) 4.4.8.1. GENOTIPOS Y ALELOS En nuestro estudio no encontramos ninguna relación de los genotipos y alelos del polimorfismo de promotor -889 C/T del gen IL-1alfa con la EA. TABLA R28RELACIÓN DE GENOTIPOS Y ALELOS IL-1 ALFA (-889 C/T) x DIAGNOSTICO GENOTIPOS ALELOS CC CT TT T C Pacientes (%) 138 (48,9) 118 (41,8) 26 (9,2) 170 (30,1) 394 (69,9) DIAGNOSTICO Controles (%) 168 (53,8) 121 (38,8) 23 (7,4) 167 (26,8) 457 (73,2) p = 0,438 p = 0,198 4.4.8.2. INTERACCIÓN APOE E4 Cuando estratificamos por presencia / ausencia de APOE E4, tampoco encontramos ningún tipo de asociación de los genotipos y/o alelos del polimorfismo -889 C/T del gen IL-1alfa con el diagnóstico de la EA. 4.4.8.3. EDAD AL DIAGNÓSTICO No encontramos relación de los genotipos y/o alelos del polimorfismo -889 C/T del gen IL-1alfa con la edad al diagnóstico de la enfermedad. 4.4.8.4. EFECTO DOSIS Al no existir ningún tipo de relación con la enfermedad, no fue necesario estudiar el efecto dosis de los alelos que conforman los genotipos de esta citoquina. - 101 - RESULTADOS 4.4.9.- IL-1 BETA (+3953 T/C) 4.4.9.1. GENOTIPOS Y ALELOS En nuestro estudio no encontramos ninguna relación de los genotipos y alelos del polimorfismo +3953 T/C del gen IL-1beta con la EA. TABLA R29RELACIÓN DE GENOTIPOS Y ALELOS IL-1BETA (+3953 T/C) x DIAGNOSTICO GENOTIPOS ALELOS CC CT TT T C Pacientes (%) 151 (53,5) 114 (40,4) 17 (6,0) 148 (26,2) 416 (73,8) DIAGNOSTICO Controles (%) 182 (58,3) 118 (37,8) 12 (3,8) 142 (22,8) 482 (77,2) p = 0,315 p = 0,176 4.4.9.2. INTERACCIÓN APOE E4 Cuando estratificamos por presencia / ausencia de APOE E4, tampoco encontramos ningún tipo de asociación de los genotipos y/o alelos del polimorfismo +3953 C/T del gen IL-1beta con el diagnóstico de la EA. 4.4.9.3. EDAD AL DIAGNÓSTICO No encontramos relación de los genotipos y/o alelos del polimorfismo +3953 C/T del gen IL-1beta con la edad al diagnóstico de la enfermedad. 4.4.9.4. EFECTO DOSIS Al no existir ningún tipo de relación con la enfermedad, no fue necesario estudiar el efecto dosis de los alelos que conforman los genotipos de esta citoquina. - 102 - RESULTADOS 4.4.10.- IL-1 BETA (-511 T/C) 4.4.10.1. GENOTIPOS Y ALELOS Al realizar el estudio genotípico y alélico de este polimorfismo, pudimos observar que existía algún tipo de relación de éste con la enfermedad y, a priori, diríamos que es el alelo T el que está más relacionado con el grupo de los pacientes (58,5% de los pacientes lo presentan frente a 49,3% controles), mientras que el alelo C está relacionado con los controles (91,9% de los controles lo presentan frente a 86,5%). TABLA R30RELACIÓN DE GENOTIPOS Y ALELOS IL-1BETA (-511 C/T) x DIAGNÓSTICO GENOTIPOS ALELOS CC CT TT T C Pacientes (%) 117 (41,5) 127 (45,0) 38 (13,5) 203 (36,0) 361 (64,0) DIAGNOSTICO Controles (%) 158 (50,6) 129 (41,3) 25 (8,0) 179 (28,7) 445 (71,3) p = 0,026 p = 0,008 Al separar por presencia / ausencia de los alelos C o T, tenemos que, efectivamente, el alelo -511T es el que se relaciona con ser paciente, mientras que el alelo -511C se relaciona más con los controles, sugiriendo una cierta protección (Tabla R31): TABLA R31PRESENCIA DE LOS ALELOS -511T Y -511C x DIAGNOSTICO PRESENCIA DE-511 T PRESENCIA DE -511 C Sí T No T Sí C No C Paciente (%) 165 (58,5) 117 (41,5) 244 (86,5) 38 (13,5) DIAGNOSTICO Controles (%) 154 (49,4) 158 (50,6) 287 (92,0) 25 (8,0) Presencia de -511 T → p = 0,026; OR = 1,44; I.C.(1,04 – 2,00) Presencia de -511 C → p = 0,033; OR = 0,55; I.C.(0,32 – 0,95) - 103 - RESULTADOS 4.4.10.2. INTERACCIÓN APOE E4 Al estudiar la relación del alelo -511T con el diagnóstico, separando por la presencia / ausencia del alelo APOE E4 (Tabla R30), tenemos que: TABLA R32PRESENCIA DEL ALELO -511T x DIAGNÓSTICO x APOE E4 PRESENCIA DE -511 T APOE E4 DIAGNÓSTICO Sí T No T TOTAL Paciente (%) 76 (55,1) 62 (44,9) 138 (100,0) PRESENTE Control (%) 30 (43,5) 39 (56,5) 69 (100,0) Paciente (%) 89 (61,8) 55 (38,2) 144 (100,0) AUSENTE Control (%) 124 (51,0) 119 (49,0) 243 (100,0) Presencia de APOE E4 → p = 0,140; OR = 1,59; I.C.(0,89 – 2,85) Ausencia de APOE E4 → p = 0,045; OR = 1,55; I.C.(1,02 – 2,36) La relación de este polimorfismo con la enfermedad únicamente es significativa en los individuos que no presentan el alelo E4 del gen APOE. En cuanto al alelo -511C, no encontramos ningún tipo de asociación con el diagnóstico de la EA cuando estratificamos por presencia / ausencia de APOE E4. 4.4.10.3. EDAD AL DIAGNÓSTICO No encontramos relación de los genotipos y/o alelos del polimorfismo -511 C/T del gen IL-1beta con la edad al diagnóstico de la enfermedad. TABLA R33PRESENCIA IL-1 BETA (-511T) x EDAD AL DIAGNÓSTICO PRESENCIA DE -511 T N MEDIA DESVIACIÓN ESTÁNDAR -511 T presente 165 75,87 6,90 EDAD -511 T ausente 117 76,31 6,80 p = 0,600 - 104 - DISCUSIÓN DISCUSIÓN DISCUSIÓN El aumento de la esperanza de vida en los países desarrollados, o en vías de desarrollo, ha dado lugar a la aparición de enfermedades propias de la edad, como es el caso de la enfermedad de Alzheimer, la principal dentro de éstas. Esta enfermedad, que afecta a unos 13,5 millones de personas en todo el planeta - unos 2 millones en España -, no sólo afecta al paciente en sí, sino también a sus familiares, con costes psicológicos imposibles de calcular, y a la sociedad en general, con una carga económica que puede estar entre 13.000 y 28.000 euros por paciente y año [LópezPousa, 2004; Lopez-Bastida, 2009]. Nuestro trabajo se ha centrado exclusivamente en la enfermedad de Alzheimer de tipo esporádico y tardío, debido a que es la que mayor porcentaje presenta en el total de los pacientes de EA, tanto a nivel global [Manzano, 2009] como en nuestra casuística. 1.- EDAD AL DIAGNÓSTICO El principal factor de riesgo de esta enfermedad es la edad. Comienza a ser frecuente en individuos mayores de 65 años, incrementándose de forma exponencial [Manzano, 2009]. En nuestra casuística, cuando agrupamos a los pacientes en subgrupos de 5 años, hemos podido constatar que el porcentaje de enfermos aumenta a medida que aumenta la edad, hasta los 80 años, donde se produce un ligero descenso, que aumenta a partir de los 85 años (Tabla R2); posiblemente, la disminución del porcentaje de pacientes en el grupo de mayores de 85 años, sea debido al fallecimiento de las personas por encima de estas edades, tal y como vemos en la tabla D1: - 111 - DISCUSIÓN TABLA D1.- PORCENTAJE DE POBLACIÓN CANARIA MAYOR DE 60 AÑOS AGRUPADA POR EDAD GRUPOS DE EDAD 60-64 65-69 70-74 75-79 80-84 ≥ 85 TOTAL Hombre (%) 48.359 29,2 38.085 23 33.969 20,5 23.630 14,3 13.015 7,9 8.330 5 165.388 100 Mujer (%) 49.415 25,3 40.096 20,5 39.032 20 30.784 15,7 19.443 10 16.641 8,5 195.411 100 Población Canarias 2008 Total (%) 97.774 27 78.181 21,6 73.001 20,2 54.414 15 32.458 9 24.971 6,9 360.799 100 Datos tomados del ISTAC (Instituto de Estadística de Canarias) a 01.01.2008 2.- GÉNERO Cuando estudiamos la relación entre la EA y el género, vemos que la literatura se decanta por una mayor presencia del género femenino entre los pacientes de EA [Rocca, 1991]. En el caso concreto de nuestro trabajo, encontramos más del doble de mujeres que de hombres en el grupo de los pacientes, por lo que pensamos que esta mayor abundancia de mujeres en el grupo de los pacientes pueda estar asociada efectivamente con la enfermedad, tal y como ya ha sido sugerido. Así, teniendo en cuenta el género en el estudio multivariable, hemos podido apreciar que el género femenino es, definitivamente, un factor de riesgo muy importante y estadísticamente significativo (Tabla de Resultados R40), confiriendo una susceptibilidad a la EA 3,2 veces mayor frente al genero masculino. Estudios recientes en ratones han demostrado que la actividad gamma secretasa que genera la formación del péptido Aβ42 es mayor en las hembras que en los machos, lo que lleva a sugerir que pueda ocurrir lo mismo en la especie humana, pudiéndose - 112 - DISCUSIÓN explicar así la mayor relación de esta enfermedad con el género femenino que con el masculino [Placanica, 2009]. Sin embargo, también es posible que los hombres fallezcan antes por otras causas, de tal manera que el número de mujeres, a determinadas edades, sea mayor que el de hombres (tabla D1) y, así, la EA aparezca más relacionada con este género y que, como además se ha especulado, exista algún tipo de protección en este género que lleve a un retraso de la aparición de la enfermedad, tal como se ha sugerido para los estrógenos [Kawas,1997; Asthana, 2001; Carroll, 2007]. También se han observado diferencias en el metabolismo antioxidante en los cerebros de hombres y mujeres, de tal manera que hay una sobrerregulación género-específica en la defensa antioxidante, mayor en el género femenino [Schuessel, 2004]. 3.- MARCADORES GENÉTICOS La búsqueda de marcadores - estructurales, bioquímicos, genéticos, ambientales, etc - que ayuden a los profesionales clínicos en un diagnóstico más certero de la enfermedad, se ha convertido en el objetivo de algunos investigadores [Clark, 2003] y en el nuestro propio. Muchas han sido las proteínas relacionadas con la placas seniles y las redes neurofibrilares, reflejándose el estudio de éstas en sus genes, tal y como se ha visto en la tabla I4 de la Introducción. A cada proteína y gen propuesto como posible implicado en algún aspecto de la EA, le ha seguido un gran número de trabajos y publicaciones que, generalmente, sólo han contribuído a una amplia controversia respecto a su implicación en esta enfermedad, encontrándose siempre trabajos a favor y en contra de cada uno de los candidatos. ¿Las causas?: Diferentes métodos de trabajo, diferentes casuísticas, diferentes poblaciones con diferencias genotípicas y alélicas, etc. - 113 - DISCUSIÓN Con los proyectos financiados y realizados a lo largo de estos años, y que han dado lugar a esta tesis, hemos intentado ayudar a esclarecer la participación de determinados genes que participan ampliamente en el proceso patogénico de esta enfermedad, y podrían ser de utilidad a los neurólogos en un diagnóstico más preciso de la misma. 3.1.- APOLIPOPROTEÍNA E El marcador “por excelencia” dentro de la EA esporádica-tardía, es el alelo E4 del gen de la apolipoproteína E [Clark, 2003], ampliamente asociado con esta enfermedad desde 1993, cuando se observó por primera vez esta relación [Saunders, 1993a; Corder, 1993]. La apolipoproteína E, implicada en el catabolismo de lipoproteínas y redistribución del colesterol, entre otras funciones, presenta 3 isoformas: E2, E3 y E4, tal y como ya se ha comentado. De estas 3 isoformas, la apoe E4 ha mostrado mayor avidez por el péptido amiloide que las otras dos [Strittmatter, 1993b], relacionándosele, por ello, con una mayor deposición amiloidea [Strittmatter, 1993a]; pero también se le ha relacionado con la proteína tau, de modo que apoe podría regular el metabolismo intraneuronal de tau y alterar el ratio de formación de PHF y redes neurofibrilares [Strittmatter, 1994]. Al igual que se ha visto en trabajos recientes [Raygani, 2005; Styczyńska, 2008; Sando, 2008], en nuestro grupo de estudio hemos podido comprobar que también esta variante E4 de la apoe, está asociada con la EA, donde 48,9% de los pacientes la presentan, frente a un 22,1% de los controles [p = 0,00; O.R.= 3,37; IC (2,36 – 4,81)]; esta asociación persiste incluso cuando estratificamos por género, donde la asociación se mantiene igual de fuerte en ambos sexos [Hombres: p= 0,000; OR=3,122; I.C.(1,80 – 5,40) // Mujeres: p= 0,000; OR=3,126; I.C.(1,89 – 5,15)], al contrario de lo publicado - 114 - DISCUSIÓN en algunos trabajos, donde parece que la asociación del alelo E4 con la EA es mayor en mujeres [Ghebremedhin, 2001]. Cuando estudiamos la importancia de tener uno o dos alelos E4 con respecto al riesgo de padecer la enfermedad, pudimos observar la existencia de un intenso efecto dosis, como ya se ha publicado en trabajos anteriores [Corder,1993], es decir, tener un alelo E4 conlleva un riesgo de padecer la enfermedad casi 3 veces mayor que cuando no se posee ningún alelo E4, mientras ser homocigoto E4/4 conlleva un riesgo 37 veces mayor que cuando no se tiene ninguno [1 alelo E4: p= 0,000; OR=2,87; I.C.(2,00 – 4,14) // 2 alelos E4: p= 0,000; OR=37,00; I.C.(4,95 – 276,64)]. Por lo tanto, el riesgo asociado con el alelo E4 es dosis dependiente, reflejándose esto en el incremento del riesgo según el número de alelos E4 presentes. Por otro lado, y al contrario que lo observado por otros autores, no pudimos constatar la relación de la presencia del alelo E4 con la edad al diagnóstico, o lo que es lo mismo, una presentación más temprana de la enfermedad [Raygani, 2005; Styczyńska, 2008; Sando, 2008]. Con estos resultados, ¿sería lícito utilizar el genotipado de apoe para predecir si una persona padecerá, o no, EA?: El gen APOE no es un gen causante de la enfermedad de Alzheimer, aunque sí un factor de riesgo notable, estimándose que puede tener un efecto importante en el 50% de la población de pacientes, aproximadamente [Myers,1996], pero sin los criterios clínicos adecuados, realizar el genotipado de apoe no ofrece resultados diagnósticos concluyentes, ya que, la presencia del alelo E4 no es ni necesaria ni suficiente para desarrollar EA, así como la no presencia de dicha variante garantiza la ausencia de la enfermedad [Mayeux, 1998; Devanand, 2005]. - 115 - DISCUSIÓN 3.2.- BUTIRILCOLINESTERASA La butirilcolinesterasa humana es una enzima cuyo papel está asociado con la hidrólisis de la acetilcolina, aunque de manera más lenta que la llevada a cabo por la acetilcolinesterasa. Esta proteína presenta distintas variantes que le hacen ser más o menos activa, como se ha visto con la variante K, la más común de éstas, y cuya actividad está reducida hasta en un 33% con respecto a la variante salvaje [La Du,1990]. Por tanto, sería lógico suponer que una menor actividad de esta proteína, llevaría a una menor hidrólisis de la acetilcolina, mejorando la trasmisión colinérgica y retrasando la aparición de los signos clínicos de la EA, que sería lo esperable con esta variante. También se ha especulado con la participación de la BChE dentro de la neuroinflamación: aunque no sea una de las proteínas directamente implicadas, la inactivación de la acetilcolina por esta enzima impediría la acción antiinflamatoria que se le supone a la acetilcolina [Thomas, 2007]. Creímos interesante comprobar si la BChE, y concretamente su variante K, se daba en nuestra casuística y si tenía relación alguna con la EA. Para esto, cada genotipo de BChE fue doblemente confirmado, tipándose tanto la variante K como la variante salvaje (W), tal y como describen Altamirano et al [Altamirano, 2000]. Al contrario que en los trabajos de Wiebusch, Raygani y Beyer [Wiebusch, 1999; Raygani, 2004; Beyer, 2005], respecto a la susceptibilidad a la enfermedad, no encontramos ningún tipo de asociación, al igual que Cook et al y Rakoncazy et al [Cook, 2005; Rakonczay, 2005], ni genotípica (p=0,987) ni alélica (p=0,902), ya que el porcentaje de pacientes que portaban el alelo K de la BChE fue muy similar al de los controles, al igual que el porcentaje de individuos que tenían el alelo salvaje; aunque la frecuencia alélica de BCHE-K es de las mayores descritas (Tabla D2): - 116 - DISCUSIÓN TABLA D2.- FRECUENCIAS ALÉLICAS DESCRITAS EN DISTINTAS POBLACIONES CASOS CONTROLES N Frecuencia N Frecuencia LOAD=74 0,17 Oxford (Lehmann,1997) EOAD=14 0,07 104 0,09 Community = 62 0,097 USA (Crawford,1998) Clinic = 329 0,17 201 0,144 Bristol (Kehoe,1998) 181 0,21 71 0,20 Finland (Hiltunen,1998) 78 0,14 97 0,15 USA (Grubber,1999) 245 0,19 241 0,23 Montreal (Wiebusch,1999) 135 0,23 70 0,13 Northern Ireland (McIlroy, 2000) 175 0,27 187 0,14 Tehran, Iran (Raygani, 2004) 105 0,24 129 0,12 España [Norte] (Combarros, 2005) 187 0,10 172 0,15 Gran Canaria (Déniz-Naranjo, 2007) 282 0,34 312 0,33 Tampoco observamos relación con la susceptibilidad a la EA cuando estratificamos por género o por presencia / ausencia de apoe E4. Pero cuando realizamos el estudio de asociación con la edad al diagnóstico, pudimos comprobar que la presencia / ausencia del alelo K sí estaba relacionado con la misma, del tal manera que este alelo se asociaba a los sujetos de más edad, o lo que es lo mismo, los individuos que no portan el alelo K enferman significativamente antes (p=0,028), lo cual es coherente con lo que se esperaba de esta variante. Si estudiamos esta relación separando por presencia / ausencia de APOE4, en ambos casos observamos que los individuos que presentan el alelo K son mayores que los que no lo presentan, lo cual sigue la tónica del resultado general, aunque esto sólo tiene significación estadística en los individuos que no presentan el alelo E4 de la apoe - 117 - DISCUSIÓN (p=0'043), donde los pacientes que tienen el alelo K son los de más edad cuando se diagnostican. Estudiamos, además, la posibilidad de que existiera distinta relación con la edad según el número de alelos K presente, pero sólo existían diferencias estadísticamente significativas cuando comparamos el tener 1 alelo K (heterocigoto K) frente a no tener ninguno. Pensamos que el haber establecido un efecto dosis con sólo la presencia de 1 alelo frente a 0 alelos es debido, sin lugar a dudas, al pequeño tamaño de nuestra casuística con respecto a los homocigotos para el alelo K, ya que, como podemos observar en la Tabla R16, el número de sujetos homocigotos para el alelo K es muy pequeño, y creemos que esto esté condicionando la significación del estadístico de 2 alelos frente a 0 alelos y edad al diagnóstico. 3.3.- MIELOPEROXIDASA La mieloperoxidasa es una proteína que forma parte del sistema de defensa de los PMN humanos a través de la generación de ácido hipoclórico y otras especies oxígeno-reactivas. Localizada tanto en el citoplasma como en el núcleo, se cree que podría ayudar a proteger el ADN contra el daño resultante de los radícales oxígeno producidos durante la maduración y funcionamiento de las células mieloides [Murao, 1988]. Respecto a la EA, la expresión de la mpo es mayor en los cerebros de los pacientes de Alzheimer, de tal manera que podría contribuir al estrés oxidativo implicado en la patogénesis de esta enfermedad [Green, 2004; Casado, 2008], que precede a la aparición de las placas amiloideas y las redes neurofibrilares [Zafrilla, 2006]. Desde 1999 se pudo observar que colocalizaba con las placas amiloideas y que presentaba un polimorfismo de promotor en su gen, -463 G/A, relacionado con la EA [Reynolds, - 118 - DISCUSIÓN 1999], concretamente, este genotipo contribuía con 1,57 veces más riesgo de padecer la enfermedad [Crawford, 2001]. Sin embargo, los estudios iniciales que relacionaron el polimorfismo -463 G/A del promotor del gen de la mieloperoxidasa con la enfermedad de Alzheimer [Reynolds, 2000; Crawford, 2001], al ser replicados en otras poblaciones, no han mostrado asociación significativa [Combarros, 2002; Styczynska, 2003; Usui, 2006]. En el caso concreto de nuestro trabajo, aunque pudimos comprobar una significación entre el alelo -463G y la EA, pensamos que este resultado es bastante débil, ya que el número de alelos -463A es muy bajo en comparación con el G, y consideramos que podría estar alterando la significación de esta asociación. Así, cuando estudiamos la presencia de estos alelos en los individuos, comprobamos que no existe relación de éstos con la EA. Lo mismo ocurrió cuando estratificamos por la presencia / ausencia de la variante E4 de la apolipoproteína E, encontrando asociación del alelo -463G del promotor de la MPO con el diagnóstico de la enfermedad, pero únicamente en aquellos individuos que no portaban el alelo E4. Creemos que esto podría estar condicionado por el pequeño número de sujetos sobre los que se basaba, sobre todo, en aquellos que no presentaban el alelo -463G, donde el número de individuos nunca superó los 22. El presente resultado es algo similar a lo publicado por Leininger-Muller et al, que, aunque encuentran asociación del polimorfismo -463 G/A con esta enfermedad, dado el bajo nivel significativo del p valor, no sugieren un efecto causal de éste con la EA, hipotetizando sobre un posible desequilibrio de ligamiento de este polimorfismo con otra variante funcional implicada en la EA [Leininger-Muller, 2003]. En cuanto a la edad al diagnóstico, aunque no pudimos encontrar relación alguna con ésta cuando estudiamos al total de los pacientes (p=0,663), al estratificar por presencia / ausencia de APOE E4, pudimos observar que los individuos homocigotos para el alelo -463G y con E4 presente, adelantaban su edad al diagnóstico (p=0,004), - 119 - CONCLUSIONES CONCLUSIONES 1. En nuestra casuística, el porcentaje de enfermos aumenta a medida que aumenta la edad. 2. En nuestra casuística, encontramos más del doble de mujeres que de hombres en el grupo de los pacientes. 3. En nuestro grupo de estudio hemos podido comprobar que el alelo E4 de la lipoproteína apoe, está asociado con la EA, incluso cuando hacemos este mismo estudio estratificando por género. 4. El riesgo asociado con el alelo E4 de la apoe es dosis dependiente, es decir, tener un alelo E4 conlleva un riesgo de padecer la enfermedad casi 3 veces mayor que cuando no se posee ningún alelo E4, mientras que ser homocigoto E 4/4 conlleva un riesgo 37 veces mayor que cuando no se tiene ninguno. 5. No encontramos relación de la presencia del alelo E4 de la apoe con la edad al diagnóstico, o lo que es lo mismo, una presentación más temprana de la enfermedad. 6. Respecto a la variante K de la butirilcolinesterasa, no encontramos ningún tipo de asociación con la susceptibilidad a la EA, ni genotípica ni alélica. 7. La presencia del alelo K de la BChE sí está relacionado con la edad al diagnóstico, de tal manera que retrasa la aparición de la enfermedad. - 125 - CONCLUSIONES 8. En el estudio del polimorfismo -463 G/A del gen de la MPO, éste no condiciona la presencia o ausencia de la enfermedad de Alzheimer, tanto en el total de individuos, como separando por géneros, aunque sí que parece estar influyendo en la edad de diagnóstico de la misma, adelantando su aparición en los individuos APOE4 positivos. 9. Del total de polimorfismos estudiados para las citoquinas (TNF-alfa, TGFbeta1, IFN-gamma, IL-10, IL-1alfa, IL-1beta e IL-6) y HLA (HLA-A2 y HLADR2), en nuestra casuística, sólo hemos observado relación con la enfermedad de Alzheimer en dos de ellos: IL-1beta (-511 C/T) e IL-6 (-174 G/C). En cuanto al resto de polimorfismos, no observamos ningún tipo de relación con la EA, ni como posibles factores de susceptibilidad, ni en relación con la edad al diagnóstico, tanto en el total de individuos como separando por género o presencia / ausencia del alelo E4 de la apolipoproteína E. 10. En este estudio, el alelo IL-1beta (-511T) actúa como factor de riesgo independiente para el desarrollo de EA. 11. Existe, además, un marcado efecto dosis del alelo IL-1beta (-511T) con respecto a la susceptibilidad a la enfermedad, aumentando el riesgo a la misma con el número de alelos. 12. No encontramos relación alguna del genotipo IL-6 (-174GG) con la EA en el total de los individuos, aunque sí hay asociación en los pacientes que no portan el alelo APOE E4. - 126 - CONCLUSIONES - 127 - 13. El alelo -174G de la IL-6 no actúa como factor de riesgo per se en la aparición de la enfermedad de Alzheimer, sino como factor modificador de otros riesgos presentes, incrementando el riesgo conferido por la presencia del alelo APOE E4, así como del alelo -511T de la IL-1beta. 14. No hay asociación del polimorfismo -174 G/C de la IL-6 con la edad al diagnóstico. 15. Estos marcadores pueden ser de utilidad a los neurólogos siempre y cuando se usen en un entorno estrictamente clínico, es decir, ante la presencia de una sospecha clínica de demencia tipo Alzheimer, de tal manera que pueden ayudar al clínico a afianzar el diagnóstico precoz, mientras que como predictores de EA, en ausencia de cuadro de demencia, no tienen validez alguna. BIBLIOGRAFÍA BIBLIOGRAFÍA BIBLIOGRAFÍA 1. Aarsland D, Rongve A, Nore SP, Skogseth R, Skulstad S, Ehrt U, Hoprekstad D, Ballard C. Frequency and Case Identification of Dementia with Lewy Bodies Using the Revised Consensus Criteria. Dement Geriatr Cogn Disord 2008;26:445-452 2. Abbas, AK. Inmunología Celular y Molecular, 5ª Edición. Elsevier. 2005 3. Aisen PS, Davis KL. Inflammatory mechanisms in Alzheimer's disease: implications for therapy. Am J Psychiatry. 1994 Aug;151(8):1105-13 4. Altamirano CV, Bartels CF, Lockridge O. 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