Elaboración de aceitunas de mesa utilizando cultivos iniciadores de bacterias lácticas con potencial probiótico

INDICE __________________________________________________________________ i 1. RESUMEN…………………………………………………………. ………………..1 2. INTRODUCCIÓN………………………………………………….………….…....5 2.1. Aceitunas de mesa…………………………………………………………….....5 2.1.1. Generalidades……………………..……………………………….…….….5 2.1.2. Elaboración de aceitunas verdes aderezadas al estilo español o sevillano.…………………..…………….………………………………………….......11 2.1.2.1. Recolección..…………………...………….……………….….…….11 2.1.2.2. Cocido, lavado y colocación en salmuera….….…………….……11 2.1.2.3. Fermentación y conservación…………………….…………….….14 2.1.2.4. Envasado y pasterización..……………………………………..…..15 2.1.2.5. Alteraciones e intoxicaciones……………..…………………….....17 2.1.2.6. Posibles intoxicaciones alimentarias que se pueden producir....18 2.2. Cultivos iniciadores……….……………………………………….………...…..21 2.2.1. Generalidades…………………………………………….…………..……21 2.2.2. Aplicación de cultivos iniciadores en la fermentación de aceitunas de mesa……………………………………………………………………………...…24 2.2.3. Criterios de selección y utilización de un cultivo iniciador para la elaboración de aceitunas de mesa estilo sevillano……………………………....…..26 2.3. Alimentos funcionales……………………………..……………….……….......29 2.3.1. Alimentos prebióticos…………………….……………………………..…31 2.3.2. Alimentos probióticos……………….………………………………..……32 INDICE __________________________________________________________________ ii 2.3.3. Alimentos simbióticos…………………………….……………..…………35 2.4. Aceitunas de mesa: Hacia un posible alimento funcional “integral”….…….37 2.4.1. Actividad biológica de las aceitunas de mesa…………………………..37 2.4.2. La aceituna de mesa como alimento simbiótico…………..……….…...39 3. HIPÓTESIS Y OBJETIVOS DE TRABAJO…………………....………...45 4. MATERIALES Y MÉTODOS……………………………………………...….49 4.1. Variedad de aceitunas empleadas…………………….………………………49 4.2. Cepas utilizadas como inóculos……………………….…..…….………….…50 4.3. Proceso de elaboración de aceitunas……….………………………………..52 4.4. Planificación de las experiencias………………………..…………….…….…54 4.4.1. Fermentación, conservación y envasado a escala laboratorio…….....56 4.4.1.1. Fermentación……………………………………...……………....…56 4.4.1.2. Conservación…………………………………………….…………..57 4.4.1.3. Envasado…………………………………………..….……………..58 4.4.1.3.1. Envasado sin conservación previa………………………….59 4.4.1.3.2. Envasado con conservación previa…………………………61 4.4.2. Fermentación, fortificación y envasado a escala piloto……………..…62 4.4.2.1. Fermentación…………………………..…………………………….63 4.4.2.2. Envasado……………………………………………………………..63 INDICE __________________________________________________________________ iii 4.4.3. Fermentación a escala industrial……………………………...………….64 4.4.3.1. Campaña 2011/2012……………………..…………………………64 4.4.3.2. Campaña 2012/2013………………………….………………….…65 4.4.4. Fortificación……………………………………………….…………….…..68 4.5. Análisis físico-químicos………………..……………………….………..….….69 4.5.1. EN SALMUERA……………………………………….…….……….….....69 4.5.1.1. Concentración en cloruro de sodio……….....…..……….…..……69 4.5.1.2. Acidez libre, acidez combinada y pH……….………….………....69 4.5.1.3. Concentración de ácido láctico, ácido acético y etanol……….…70 4.5.1.4. Concentración de azúcares…………..…..………………..…....…70 4.5.2. En frutos………………………………………….……….…………………71 4.5.2.1. Color Superficial………………………………………………..……71 4.5.2.2. Textura……………………………………….……………………….72 4.6. Análisis microbiológicos……………………..…………….…………..…..……73 4.6.1. Cuantificación de la población en líquidos y aceitunas………………...73 4.6.2. Caracterización de las bacterias ácido lácticas presentes en las salmueras de fermentación……………………………………………………….….75 4.6.3. Caracterización de las bacterias acido lácticas presentes en la epidermis de las aceitunas……………………………………………….…………...…77 4.6.4. Identificación de las levaduras presentes en la epidermis de las aceitunas…………………………………………………………….………………….…78 4.6.5. Microscopia electrónica de barrido……….…………….……..…….…...80 INDICE __________________________________________________________________ iv 4.7. Análisis sensorial………………………………………………………………...81 4.7.1. Método del COI…………………………………………………………..…81 4.7.2. Cata de consumidores……………………………………………….….…84 4.8. Estadística y modelización de los resultados……………………….…….….87 4.8.1. Modelización de los parámetros físico-químicos…………….…..….….87 4.8.2. Modelización de la población microbiana en las salmueras……..……89 4.8.3. Modelización de la población presente en la epidermis de las aceitunas……………………………………………………………………….…….…....90 5.1. Experiencias a escala de laboratorio…………………………………...……..93 5.1.1. Etapa fermentación…………………………………….……..……....…...93 5.1.1.1 Cambios físico-químicos……………………………………..…..….93 5.1.1.2. Cambios microbiológicos……………………………………….....100 5.1.1.2.1. En la salmuera de fermentación……………..………....…100 5.1.1.2.2. En la epidermis de las aceitunas……………………….….106 5.1.1.3. Caracterización molecular de los microorganismos……….…...111 5.1.1.4. Análisis multivariante de la etapa de fermentación a escala laboratorio ……………………………………………………………….….….…121 5.1.2. Etapa de conservación……………………………………..……….…...124 5.1.2.1. Cambios físico-químicos………………………………….….……124 5.1.2.2. Cambios microbiológicos………………………………….……....127 5.1.2.3. Análisis sensorial……………………………………….………….131 INDICE __________________________________________________________________ v 5.1.3. Envasado y vida de mercado……………………………………………135 5.1.3.1. Cambios físico-químicos…………………………………………..139 5.1.3.2. Cambios microbiológicos……………………………………….…140 5.1.4. Toma de decisiones………………………………………………..…….147 5.2. Experiencias a escala piloto…………………………………………………..148 5.2.1. Etapa de fermentación…………………………………………………...148 5.2.1.1. Cambios físico-químicos…………………………………………..148 5.2.1.2. Cambios microbiológicos………………………………………….151 5.2.1.3. Caracterización molecular de las poblaciones de BAL………..158 5.2.2. Envasado piloto…………………………………………………………...167 5.2.2.1. Cambios físico-químicos…………………………………………..167 5.2.2.2. Cambios microbiológicos…………………………………….……174 5.3. Análisis sensorial………….…………………………..…………….…………181 5.3.1. Características físico-químicas y microbiológicas de las aceitunas…………………………..……………………………………….…………….181 5.3.2. Análisis mediante paneles de cata y de consumidores………………184 5.4. Experiencia a escala industrial…………………………………………….…188 5.4.1 Campaña 2011/2012……………………………………………………...188 5.4.1.1. Evolución de los parámetros físico-químicos en las salmueras de fermentación………………………………………………………...……189 5.4.1.2. Evolución de las poblaciones de microorganismos en frutos…190 INDICE __________________________________________________________________ vi 5.4.1.3. Caracterización molecular de las BAL presentes en la epidermis de las aceitunas durante la fermentación………..………….……………192 5.4.2 Campaña 2012/2013…………………………………………….………..194 5.4.2.1. Cambios físico-químicos en las salmueras de fermentación………………………………………………………………..………..…194 5.4.2.2. Evolución de los microorganismos durante el proceso fermentativo………………………………………………………………………….…..198 5.4.2.3. Caracterización e identificación molecular de la microbiota presente en la epidermis de las aceitunas durante la fermentación………202 5.4.2.3.1. Caracterización molecular de las BAL presentes en la epidermis de las aceitunas durante la fermentación……………………203 5.4.2.3.2. Caracterización molecular de las levaduras presentes en la epidermis de las aceitunas durante la fermentación………………..206 5.5. Fortificación de aceitunas…………………………………………………..…207 5.5.1. Evolución de las poblaciones microbianas durante la vida de mercado…………………………………………………………………………………..208 5.5.2. Presencia de la cepa inoculada en las aceitunas fortificadas……….212 6. CONCLUSIONES…………………………………………………………….…221 7. BIBLIOGRAFÍA………………………………………………………………….225 8. ABREVIATURAS……………………………………………………………….249 9. APORTACIONES CIENTIFICAS DE LA TESIS………………………253 10. CURRICULUM VITAE……………………………………………………….257 INTRODUCCIÓN __________________________________________________________________ 9 declaradas como alimento saludable por organismos públicos de control alimentario. Según la norma cualitativa unificada del Consejo Oleícola Internacional (COI, 2004), se denomina aceituna de mesa: “al producto preparado a partir de frutos sanos de variedades del olivo cultivado (Olea europaea L.) elegidas por producir frutos cuyo volumen, forma, proporción de pulpa respecto al hueso, delicadeza de la pulpa, sabor, firmeza y facilidad para separarse del hueso los hacen particularmente aptos para la elaboración; sometidos a tratamientos para eliminar el amargor natural y conservados mediante fermentación natural o tratamiento térmico, con o sin conservantes, envasados con o sin líquido de gobierno”. La Norma del COI (2004) indica que según como se elimine el amargor de las aceitunas se tendrán las siguientes preparaciones comerciales (Figura 2.1): Figura 2.1. Clasificación de las aceitunas según la Norma del COI (2004). Aceitunas aderezadas: “aceitunas verdes, de color cambiante o negras sometidas a un tratamiento alcalino y acondicionadas en salmuera, donde sufren una fermentación total o parcial, conservadas con o sin acidificantes.” Aceitunas al natural: “aceitunas verdes, de color cambiante o negras tratadas directamente con una salmuera, donde sufren una fermentación total o parcial, y conservadas con o sin acidificantes.” Aceitunas deshidratadas y/o arrugadas: “aceitunas verdes, de color cambiante o negras, sometidas o no a un ligero tratamiento alcalino, conservadas en INTRODUCCIÓN __________________________________________________________________ 10 salmuera o parcialmente deshidratadas con sal seca y/o aplicando calor o cualquier otro proceso tecnológico”. Aceitunas ennegrecidas por oxidación: “aceitunas verdes o de color cambiante conservadas en salmuera, fermentadas o no, ennegrecidas por oxidación en medio alcalino y conservadas en recipientes herméticos mediante esterilización térmica. Su coloración negra es uniforme”. Las principales variedades de aceitunas empleadas en España para el consumo de mesa son Manzanilla, Hojiblanca, Cacereña, Gordal, Morona y Aloreña. Cada una de estas variedades tiene unas características intrínsecas diferenciales que las hacen adecuadas, o no, para algunos tipos de presentaciones comerciales. INTRODUCCIÓN __________________________________________________________________ 11 2.1.2. ELABORACIÓN DE ACEITUNAS VERDES ADEREZADAS AL ESTILO ESPAÑOL O SEVILLANO. En la Figura 2.2 se presenta un esquema de las distintas fases que conforman el proceso de elaboración de esta preparación comercial (la mas importante a nivel mundial con un 50-60% de la producción) y que a continuación se comentan detalladamente. Figura 2.2. Esquema del proceso de elaboración típico de aceitunas verdes estilo español o sevillano. 2.1.2.1. Recolección. Los frutos se recolectan cuando tienen un color verde a verde amarillento. La forma tradicional de recogida del fruto ha sido la manual aunque debido al elevado coste económico de esta operación hoy día se está empezando a implantar la recolección mecánica. 2.1.2.2. Cocido, lavado y colocación en salmuera (Aderezo). El tratamiento con una disolución diluida de hidróxido sódico, operación denominada ‘cocido’, es la operación fundamental en el proceso del aderezo. Su principal objetivo es la hidrólisis del glucósido amargo oleuropeína, responsable del característico amargor de este fruto (Brenes y colbs., 1999; Ciafardini y colbs., INTRODUCCIÓN __________________________________________________________________ 12 1994). Además, ejerce una acción muy compleja cuya consecuencia más importante es que, al colocar las aceitunas en salmuera, esta se convierte en un medio adecuado de cultivo en la que se desarrolla la típica fermentación láctica (Borbolla y Rejano, 1979). La concentración de la lejía de cocido se ajusta de forma que, considerando la temperatura ambiente, el tratamiento dure un número determinado de horas que suele ser distinto para cada variedad. A mayor concentración de lejía y temperatura, la acción es más enérgica y provoca una mayor permeabilidad de la piel, pero permanece más cantidad de sosa en el interior de la pulpa, lo que dificulta que se alcance un valor adecuado de pH al final de la fermentación. La penetración de la lejía en la pulpa se da por terminada cuando el frente ha alcanzado los 2/3 a 3/4 de la distancia de la piel al hueso. Si la penetración es insuficiente, las aceitunas resultan amargas y fermentan mal, quedando una zona próxima al hueso que con el tiempo vira a un color violeta y la piel adquiere un color pardo; por otro lado, si se van a deshuesar, el hueso no queda limpio y arrastra mucha pulpa. Si la penetración es excesiva, resulta difícil obtener unas buenas características químicas para su conservación a largo plazo, la textura es deficiente y, si van a ser deshuesadas se tiene un elevado porcentaje de unidades rotas durante dicha operación. Para facilitar que todos los frutos alcancen una penetración adecuada en el mismo tiempo, las partidas de aceitunas destinadas al cocido deben ser lo más homogéneas posibles en tamaño medio y madurez. Cada variedad precisa un tratamiento de cocido en función de sus características, principalmente, textura y amargor, y también de las condiciones ambientales, especialmente la temperatura. Al finalizar el cocido se retira la lejía y se cubren las aceitunas con agua, operación denominada lavado, cuyo principal objetivo es la eliminación de la mayor cantidad posible de la sosa que penetró en la pulpa. No obstante, el lavado no debe ser excesivo para evitar la pérdida de aquellos compuestos hidrosolubles que son necesarios para la fermentación. El número y duración de los lavados es variable y la tendencia actual, considerando la escasez de agua y la INTRODUCCIÓN __________________________________________________________________ 13 contaminación que producen estos vertidos, es realizar un solo lavado de unas 5-6 horas. Una vez retirada el agua de lavado, las aceitunas se colocan en una salmuera de 10-12% (p/v) en NaCl donde es también común adicionar un ácido fuerte para rebajar el contenido de las sales sódicas de los ácidos orgánicos producidos en la fermentación por reacción con la sosa residual (acidez combinada o lejía residual) (Rejano y colbs., 1985). Normalmente, se usa ácido clorhídrico o ácido acético de grado alimentario que está admitido por la normativa en vigor (BOE, 2001). Para la fermentación, el conjunto líquido-aceitunas se suelen transportar a recipientes enterrados (Figura 2.3) distintos a los de cocido, que suelen ser aéreos para facilitar el trasvase por gravedad de los frutos. A los pocos días, la sal se equilibra en valores comprendidos entre 5-6 % (p/v). Si la concentración inicial de sal es más elevada se provoca una salida excesiva de jugo, debido a la mayor presión osmótica exterior, lo que tiene como consecuencia el arrugado permanente de los frutos, y además, la velocidad de fermentación se ve alterada; si es menor del 5 % se puede favorecer el desarrollo de ciertas alteraciones. Figura 2.3. Patio de fermentadores enterrados. Como se detalla a continuación las experiencias a nivel industrial se llevaron a cabo en este tipo de instalaciones. INTRODUCCIÓN __________________________________________________________________ 14 2.1.2.3. Fermentación y conservación. Durante los primeros días de estancia de las aceitunas en salmuera, debido a la lejía que va saliendo de la pulpa, el valor de pH del líquido de gobierno se encuentra entre 8-9 unidades. A lo largo de las diversas etapas de la fermentación, el desarrollo sucesivo de diversos microorganismos hace que el pH descienda a valores de 4 unidades, o incluso inferiores, lo que facilita la adecuada conservación del producto. Tradicionalmente se consideraba que la primera fase de la fermentación se extendía desde la colocación en salmuera hasta que, a los 5-7 días, el valor del pH era próximo a 6 unidades; en ella se detectan los siguientes grupos de microorganismos: bacilos Gram-negativos, esporulados Gram-positivos y bacterias cocáceas del ácido láctico de los géneros Leuconostoc, Pediococcus y Enterococcus. Los Gram-negativos inician el descenso del pH; no obstante, para evitar un desarrollo profuso de los mismos, dado que pueden provocar alteraciones, se recomienda el descenso del pH pasando una corriente de CO2 a las 24 horas; también se pueden emplear otros ácidos, como acético o láctico (Fernández y colbs., 1985). Hoy en día, esta fase se acorta acidificando la salmuera inicial con HCl. Una vez que comienza el desarrollo de los lactobacilos, se inicia la segunda fase, la cual dura hasta que el valor de pH es de 4,5 unidades aproximadamente. Durante esta fase desciende la población de cocos lácticos y desaparecen los bacilos Gram-negativos. Normalmente transcurre en unos 15-20 días. La tercera fase se caracteriza por el predominio de microorganismos del genero Lactobacillus, esencialmente cepas de las especies Lactobacillus pentosus y Lactobacillus plantarum. Esta fase dura hasta que cesa la producción de ácido láctico por consumo de la materia fermentable. El valor óptimo final de pH debe ser igual o inferior a 4 unidades. Junto a los microorganismos citados en las tres fases de la fermentación, se encuentra, habitualmente, un desarrollo variable de levaduras (Fernández y colbs., 1985). INTRODUCCIÓN __________________________________________________________________ 15 Una vez terminada la fermentación láctica, se inicia la conservación de las aceitunas y, si no se establecen adecuadas condiciones físico-químicas, puede darse una cuarta fase de la fermentación por desarrollo de bacterias del género Propionibacterium (González y colbs., 1980). Ello origina un aumento del pH, pues estos microorganismos consumen el ácido láctico formado y producen una mezcla de los ácidos acético y propiónico que, al ser más débiles, provocan el incremento del pH, la aparición de aminas biógenas y un posible desarrollo de especies patógenas (García y colbs., 2004). Para evitar este problema, se debe aumentar, al final de la fermentación láctica la concentración de NaCl hasta niveles de 8,5- 9,5 %, lo que evita el desarrollo de estas bacterias alterantes y garantiza una adecuada conservación. La subida de sal se debe realizar en varias etapas para evitar el posible arrugado de los frutos (El-Makhzangy y Abdel-Rhman, 1999). 2.1.2.4. Envasado y pasterización. El principal objetivo del envasado es conservar el producto manteniendo sus características químicas y organolépticas estables, durante el tiempo que dure la comercialización. Según los mercados a los que vayan destinadas las aceitunas, en el equilibrio el valor de acidez libre debe oscilar entre 0,4 y 0,7 % (expresado como ácido láctico) y la concentración en NaCl entre 4 y 7 % (p/v). La preparación de los líquidos de gobierno para el envasado se rige por la Ecuación 1 que está basada en un balance de materia (Figura 2.4). Durante la vida de mercado se debe evitar el desarrollo de microorganismos, bien por adecuación de las características químicas, con o sin aditivos, o mediante su destrucción con los tratamientos térmicos adecuados. Los Gram-negativos y clostridios se inhiben si se mantiene el pH en valores inferiores a 4,5 unidades. Las levaduras fermentativas y las BAL precisan para su desarrollo algo de materia fermentable, por lo que si el proceso de elaboración se ha llevado correctamente, no es posible encontrarlas en el producto envasado. INTRODUCCIÓN __________________________________________________________________ 16 Figura.2.4. Ecuación para calcular las concentraciones de la salmuera de envasado. Finalmente, para que las bacterias propiónicas no se desarrollen, se precisan condiciones enérgicas de acidez y sal, a fin de obtener un pH<4 y una concentración en NaCl superior al 5-5,5 % (p/v). En condiciones menos estrictas estos microorganismos se destruyen aplicando un tratamiento de pasterización (Fernández y colbs., 1985). Las condiciones del tratamiento térmico se fijaron por González y Rejano (1984) tomando como microorganismos de referencia las bacterias propiónicas por ser las de más fácil desarrollo y las más termorresistentes de las que habitualmente se pueden desarrollar en los envasados de aceitunas verdes estilo sevillano. Para destruir las bacterias propiónicas, se deben alcanzar, al menos, 15 unidades de Letalidad Acumulada (UP62,4=15) en el punto frío del recipiente (COI, 2004). Como es lógico, la duración INTRODUCCIÓN __________________________________________________________________ 17 del tratamiento térmico depende del tamaño y características del envase, de la temperatura del baño y de la inicial en el recipiente. 2.1.2.5. Posibles durante la elaboración y vida de mercado. Cuando la secuencia de microorganismos no es la adecuada y se desarrollan otros ajenos a los de un proceso normal de fermentación, se producen distintos tipos de alteraciones. Las principales, según el origen y las fases de la fermentación en que suceden, son las siguientes: - Alambrado. Se caracteriza por la formación de hendiduras en el exterior de las aceitunas y huecos internos en la pulpa. Se relaciona con el desarrollo excesivo de Gram-negativos muy productores de CO2. A veces, la formación de gas produce vejigas o ampollas bajo la piel. Se evita ajustando el valor del pH inicial. - Fermentación Butírica. Se debe al desarrollo de distintas especies de clostridios durante las primeras fases de la fermentación. El ácido butírico que produce altera el sabor, pudiéndose evitar su formación manteniendo un nivel adecuado de sal (nunca menor de 5 %) y siguiendo unas buenas prácticas higiénicas de fabricación. - Zapatería. Producida por el desarrollo de bacterias propiónicas y clostridios. Se origina durante la conservación cuando el valor de pH no se mantiene por debajo de 4,2 unidades y la concentración de sal es inferior al 7%. Se identifican en la salmuera por la presencia de una serie de compuestos volátiles que producen aromas anómalos a la fermentación (Montaño y colbs., 1992). Se evita subiendo la sal para inhibir el desarrollo de los microorganismos responsables y, de esta forma, estabilizar el valor de pH durante la conservación. - Ablandamiento. Debido a un desarrollo excesivo de microorganismos con actividad peptinolítica y proteolítica: bacilos, levaduras y mohos. Se debe evitar su desarrollo especialmente durante la conservación, manteniendo un buen cierre anaeróbico de los fermentadores. INTRODUCCIÓN __________________________________________________________________ 18 - Consumo de ácido láctico. En presencia de oxígeno ciertas especies de levaduras y mohos son capaces de consumir el ácido láctico producido por las BAL originando una subida del pH que puede comprometer la seguridad microbiológica del producto. El desarrollo de estas levaduras y mohos en la superficie de los fermentadores da lugar a las conocidas natas o velos. - Sedimento y gas. Se da en el producto envasado cuando no se mantiene estable, bien por desarrollo de diversos tipos de bacterias o levaduras cuando hay restos de materia fermentable en las aceitunas, o bien por desarrollo de las bacterias propiónicas que consumen ácido láctico. Se evita usando un producto bien fermentado y ajustando un valor de pH inferior a 3,3 unidades en el envasado, o bien, pasterizando. 2.1.2.6. Posibles intoxicaciones alimentarias que se pueden producir. Aunque, en general, la aceituna de mesa se considera un alimento seguro, y una gran cantidad de trabajos muestran la inhibición de diversas especies patógenas en el mismo (Grounta y colbs., 2013; Medina y colbs., 2013), unas malas prácticas de elaboración pueden suponer un riesgo sanitario para los consumidores. De hecho, han existido diversos brotes de intoxicaciones alimentarias debido al crecimiento de microorganismos patógenos en aceitunas. Ello refuerza la necesidad de mantener siempre unas condiciones higiénicosanitarias estrictas y seguir las normas establecidas por la legislación vigente. Entre los principales peligros de origen microbiano destacan: - Botulismo. Su aparición se debe al desarrollo de Clostridium botulinum y la producción de la toxina botulínica, considerada el veneno más poderoso que se conoce ya que con solo 70 µg puede producirse la muerte de una persona adulta. El desarrollo de las esporas de Clostridium ocurre cuando el pH es superior a 4,6 unidades y suele estar ligado a unas malas prácticas de esterilización del producto en condiciones de anaerobiosis. Se han reportado intoxicaciones en diferentes países como Estados Unidos, Francia e Italia con muertes asociadas. En las aceitunas verdes estilo sevillano por las condiciones físico-químicas que se tiene no es habitual que se produzca aunque si es posible en las negras por oxidación. INTRODUCCIÓN __________________________________________________________________ 25 de mesa. En particular aconsejaba su uso para el caso de las aceitunas de la variedad manzanilla. Algunos años más tarde, Borbolla y Alcalá y colbs. (1952), después de diferentes experimentos, concluyeron que la adición de un cultivo de lactobacilos era importante para asegurar la normal evolución de la fermentación y prevenir la aparición de alteraciones. El primer starter comercial fue un cultivo puro de L. plantarum preparado mediante secado por atomización (Brighigna, 1984). Mediante esta metodología se garantizaba un fácil manejo y una alta tasa de supervivencia cuando las células eran revitalizadas en un medio que contenía 8.5 g/L de NaCl, 10 g/L de glucosa, 3 g/L de extracto de levadura y un pH de 6.4 unidades. Algunos autores, como consecuencia de la necesidad de obtener un producto más seguro, con una mayor vida de mercado y libre de conservantes químicos, han propuesto el uso como starter, de cepas productoras de bacteriocinas (Ruiz-Barba y Jiménez-Diaz, 1994; Leal-Sánchez y colbs., 2003; Delgado y colbs., 2005). Las levaduras también pueden usarse como agente de biocontrol, gracias a la producción de inhibidores (factores killer, etanol, etc.) de otras cepas de levaduras o bacterias no deseadas pudiéndose reducir la concentración de cloruro sódico o de otros conservantes manteniendo los envasados su estabilidad y seguridad microbiológica (Arroyo-López y colbs., 2012a). Sin embargo, a pesar de estas buenas perspectivas, el uso de cultivos iniciadores aún es muy limitado, probablemente debido a diferentes razones, como es la falta de conocimientos sobre como seleccionar, aplicar y controlar el funcionamiento del starter; o la observación de que en algunos casos la fermentación espontánea puede ser bastante bien controlada, además de no necesitar un producto altamente estandarizado. Asimismo, algunos elaboradores industriales observan que la limitación de la biodiversidad impuesta por el starter comercial da lugar a una pérdida de diferenciación organoléptica. INTRODUCCIÓN __________________________________________________________________ 26 2.2.3. CRITERIOS DE SELECCIÓN Y UTILIZACIÓN DE UN CULTIVO INICIADOR PARA LA ELABORACIÓN DE ACEITUNAS DE MESA ESTILO SEVILLANO. La selección de una cepa como starter para la elaboración de aceitunas de mesa está basada en diferentes criterios, entre los que destacan: tener un metabolismo homofermentativo, alta capacidad de producción de ácido láctico, un rápido agotamiento de la materia fermentable y una buena tolerancia a la composición salina, fenólica y orgánica de la salmuera. También son importantes, el flavor desarrollado, su adaptación a la temperatura de fermentación, y su capacidad para hidrolizar la oleuropeína y/o producir bacteriocinas (Tabla 2.1) (Duran-Quintana y colbs., 1999; Delgado y colbs., 2005; Hurtado y colbs., 2012). Otra característica a tener en cuenta es su imposición o prevalencia sobre la microbiota endógena (Daeschel y Fleming, 1984; Daeschel y colbs., 1987). Esta imposición normalmente se debe a su rápido y predominante crecimiento en las condiciones de fermentación o por la producción de sustancias antagonistas (Marugg, 1991). Además, para su uso comercial un starter necesita ser resistente a la congelación y liofilización. Un paso adelante para el desarrollo de estos cultivos iniciadores en aceitunas de mesa seria también la selección de cepas con características probióticas/funcionales, de modo que estos microorganismos pasen a nuestro sistema digestivo al ser ingeridos junto con las aceitunas. Entre otros beneficios, dichos microorganismos pueden reducir la cantidad de patógenos y reforzar las defensas naturales del cuerpo mediante la estimulación del sistema inmune. Ello, además, podría ser de un gran interés para el aumento de las ventas de las aceitunas. Mediante la obtención de un producto revalorizado. Los principales cultivos iniciadores utilizados en aceitunas de mesa pertenecen a las especies L. plantarum (Etchells y colbs., 1966; Leal-Sánchez y colbs., 2003; Chorianopoulos y colbs., 2005; Lamzira y colbs., 2005; Marsilio y colbs., 2005; Sabatini y colbs., 2008) y L. pentosus (De Castro y colbs., 2002; Panagou y colbs., 2003,2008; Servili y colbs., 2006). Un claro ejemplo de esta utilización, es el uso de la cepa L. plantarum LPCO10 (Ruiz-Barba and Jiménez- Diaz, 1994; Leal-Sánchez y colbs., 2003). Esta cepa, aislada de la salmuera de INTRODUCCIÓN __________________________________________________________________ 27 fermentación de aceitunas elaboradas como estilo sevillano, mostró su capacidad para producir bacteriocina, concretamente dos bacteriocinas denominadas plantaricina S y T (Jiménez-Diaz y colbs., 1993). Estas bacteriocinas tenían actividad antimicrobiana tanto contra otras cepas de L. plantarum como contra otros tipos de bacterias que podrían deteriorar las aceitunas (Ruiz-Barba y colbs., 1991). Tabla 2.1. Principales criterios y características metabólicas para seleccionar cultivos iniciadores para la fermentación de aceitunas de mesa estilo sevillano. (++, Importante; + ventajoso; - perjudicial). Criterios Características metabólicas Relevancia Criterios tecnológicos relevantes Crecimiento rápido y predominante ++ Metabolismo homofermentativo ++ Tolerancia a la sal ++ Crecimiento y tolerancia a bajos valores de H ++ Alta tasa de acidificación ++ Crecimiento a baja temperatura ++ Tolerancia a compuestos fenólicos ++ Producción de compuestos antimicrobianos + Síntesis de peróxido de hidrogeno + Alta capacidad y rapidez fermentativa ++ Actividad peptinolítica - Formación de dextranos - Producción de Bacteriocinas + Resistencia a bacteriófagos + Criterios sensoriales relevantes Metabolismo heterofermentativo - Síntesis de flavores o precursores de estos + Criterios nutricionales beneficiosos Síntesis de aminas biógenas - Síntesis de exopolisacáridos + Actividad probiótica ++ En concreto, Leal-Sánchez y colbs. (2003) compararon el perfil de fermentación entre aceitunas fermentadas espontáneamente y otras inoculadas con L. plantarum LPCO10, mostrando que esta cepa era capaz de imponerse en la fermentación, induciendo un rápido descenso del pH durante la primera fase de INTRODUCCIÓN __________________________________________________________________ 28 la fermentación inhibiendo, por tanto, el desarrollo de bacterias gram-negativas;, además, se obtienen unos altos valores finales de acidez libre que ayudan a estabilizar el producto ya fermentado. Recientes estudios demuestran que el crecimiento de BAL puede ser incrementado cuando se utiliza un cultivo mixto con levaduras. De hecho, las levaduras pueden producir algunas sustancias tales como vitaminas (B1 y B6), aminoácidos, purina o, incluso romper carbohidratos complejos, esenciales para el crecimiento de Lactobacillus spp. (Abbas, 2006). Segovia Bravo y colbs. (2007) demostraron que la presencia de Saccharomyces cerevisiae favoreció la actividad fermentativa de L. pentosus encontrándose un mayor rendimiento en la producción de láctico. Asimismo, se ha observado que se incrementa la velocidad de desarrollo de L. plantarum cuando 48 horas antes se inocula Debaryomyces hansenii, probablemente debido a su capacidad de producir vitaminas del tipo B (B3, B5, B6 y B7) las cuales son esenciales para su crecimiento. Hurtado y colbs. (2010) también demostraron que la co-inoculación de L. pentosus y Candida diddensiae para la fermentación de aceitunas arbequinas reduce la supervivencia de las enterobacterias durante la primera fase de la fermentación mejorando la calidad sensorial de las aceitunas elaboradas. En España, se han empezado a dar los primeros pasos para la selección de cepas con características probióticas y/o funcionales, con la finalidad de ser utilizadas como cultivos iniciadores. De este modo, Bautista-Gallego y colbs., (2013a) obtuvieron 111 aislamientos de BAL procedentes de salmueras de aceitunas elaboradas según el estilo sevillano que habían fermentado espontáneamente. El 97% de los aislamientos se correspondía con cepas de L. pentosus, lo cual es indicativo de una posible mejor adaptación de L. pentosus frente a L. plantarum en este tipo de elaboración. Posteriormente, estudiaron “in vitro” el potencial probiótico de dichas cepas. Esta investigación se ha convertido en el motor de arranque para la posible utilización de cepas de L. pentosus con características probióticas y funcionales como cultivos iniciadores en la elaboración de aceitunas de mesa estilo sevillano, manteniendo al mismo tiempo propiedades tecnológicas (cultivos multifuncionales). INTRODUCCIÓN __________________________________________________________________ 29 2.3. ALIMENTOS FUNCIONALES. Aunque no hay clara unanimidad en la definición de alimento funcional, el concepto más aceptado es el del documento de consenso Functional Food Science in Europa (FUFOSE) elaborado por el Internacional Life Science Institute (ILSI): “un alimento puede considerarse funcional cuando se demuestra adecuadamente que, además de sus efectos nutritivos, afecta beneficiosamente a una o más funciones del organismo de forma que mejora su estado de salud o bienestar o reduce el riesgo de padecer enfermedad” (Diplock y colbs., 1999). Tabla 2.2 Posibilidades de modulación: funciones diana y componentes funcionales de los alimentos (Ferrer Lorente, B. y Dalmau Serra, J. 2001). Funciones diana Componente funcional Crecimiento y desarrollo Ca, Vit D, Vit C Factores crecimiento Vitaminas antioxidantes Probióticos Metabolismo PUFA ω3/ω6 Fibra Aminoácidos/proteínas específicas Estrés oxidativo Vit E Vit C Carotenos Polifenoles Sistema cardiovascular MUFA/PUFA Sustitutos de la grasa Ácido fólico Fisiología intestinal Prebióticos Probióticos Simbióticos Funciones psicológicas y de conducta Proteínas Tirosina y triptófano Sustitutos grasa/azúcares A lcohol Cafeína INTRODUCCIÓN __________________________________________________________________ 30 Puede ser bien un alimento natural, otro al que se ha añadido, eliminado o modificado un componente por medios biotecnológicos, o al que se ha modificado la biodisponibilidad de uno o más de sus componentes o una combinación de cualquiera de estas posibilidades. El alimento funcional natural por antonomasia es la leche humana, que contiene gran número de elementos bioactivos (enzimas, factores de crecimiento, aminoácidos libres, inmunoglobulinas, oligosacáridos, etc.). Entre los alimentos funcionales, destacan los que contienen determinados minerales, vitaminas, ácidos grasos o fibra alimenticia, y los que transportan o se les ha añadido sustancias biológicamente activas, como los yogures con bifidus. Los alimentos funcionales no sólo alimentan, sino que modulan o actúan sobre determinadas funciones del organismo y producen un efecto beneficioso más allá del puramente nutricional. En la Tabla 2.2 se puede observar los compuestos bioactivos más destacados y que funciones modulan. INTRODUCCIÓN __________________________________________________________________ 31 2.3.1. ALIMENTOS PREBIÓTICOS. Con este nombre se conocen los compuestos o alimentos con ingredientes no digeribles, que estimulan de forma selectiva el crecimiento y/o la actividad de una cepa o de un grupo determinado de bacterias residentes en el colon. Generalmente son de origen vegetal, no son digeribles por los jugos gástricos y llegan intactos al intestino grueso, donde potencian la acción de los microorganismos probióticos. Un ejemplo de prebióticos son la fibra dietética y los carbohidratos de estructura compleja y cadena corta como los fructooligosacáridos, oligosacáridos e inulina, que sirven de medio de intercambio con las bifidobacterias, fomentando que se sinteticen sustancias más simples y asimilables. Estos compuestos suelen encontrarse en gran variedad de verduras y frutas de forma natural por lo que incluir en la dieta vegetales crudos y/o frutas entre horas es suficiente para obtener beneficios prebióticos de forma regular. Otra fuente de oligosacáridos seria el consumo de alimentos fermentados lácticamente, ya que estos son un metabolito típico de este tipo de fermentaciones (Vuist y colbs., 2001). Últimamente, la industria alimentaria está enriqueciendo alimentos no prebióticos con compuestos tales como fructoologosacáridos, galactosacáridos, lactulosa, lactilol, etc., dotándolos de esta cualidad y mejorando sus expectativas comerciales. Así, cuando ingerimos oligosacáridos o inulina, las bacterias intestinales del colon los usan como nutrientes y son transformados en ácidos grasos de cadena corta y enzimas, que convierten los carbohidratos complejos en monosacáridos, fáciles de absorber. Así mismo, se producen ácidos orgánicos especialmente antioxidantes que regulan el pH y previenen la posibilidad de desarrollar cáncer de colon. INTRODUCCIÓN __________________________________________________________________ 32 2.3.2. ALIMENTOS PROBIÓTICOS. El termino probiótico, aunque no está definido legalmente en muchos países, se refiere a “preparaciones microbiológicas que cuando son ingeridas ejercen una influencia positiva a nivel saludable y fisiológico en el anfitrión” (Tannock, 2002). Hace algo más de un siglo, Metchnikoff (1907) escribió en su libro “The prolongation of life” que el consumo de alimentos lácteos fermentados mediante lactobacilos mejoraba la salud y prolongaba la vida. Así, para la elaboración de productos como yogurt y ciertos suplementos dietéticos se utilizan primordialmente cepas de lactobacilos y bifidobacterias como probióticos. Hoy en día hay una gran proliferación en el mercado de preparaciones farmacéuticas o de alimentos considerados beneficiosos para la salud o funcionales apoyándose en alegaciones saludables basadas en las características probióticas de determinadas bacterias. Entre ellas destacan diferentes especies de Lactobacillus como L. acidophilus, L. rhamnosus y L. casei, las bifidobacterias y las propionibacterias debido, en parte, a su progresiva utilización como fortificantes en la industria de los alimentos lácteos (Cogan y colbs., 2007). Como ya se ha comentado la microflora intestinal juega un importante papel en la salud del anfitrión. De ahí la importancia de los microorganismos presentes en los alimentos que ingerimos, ya que si consiguen alcanzar el ecosistema del intestino, este puede modificar su microflora. Así, se pueden ingerir desde microorganismos nocivos para la salud, conocidos como patógenos, hasta los que favorecen y protegen la salud del anfitrión, conocidos como probióticos. El consumo de estos últimos puede jugar un papel clave en el mantenimiento de la salud del anfitrión confiriéndole a este diferentes beneficios, tales como, regulación de la microbiota intestinal, estimulación de la respuesta inmune, producción de sustancias antimicrobianas, inhibición de la actividad enzimática fecal, producción de ácidos grasos de cadena corta permitiendo una aconsejable acidificación del intestino, etc. (Perdigon y colbs., 1988; Picard y colbs., 2005). Los probióticos refuerzan las barreras intestinales, bien mediante la simple ocupación del nicho ecológico, impidiendo que otras bacterias de tipo patógeno se fijen en la superficie del epitelio, o bien, teniendo un papel activo en la síntesis de INTRODUCCIÓN __________________________________________________________________ 33 metabolitos que impiden el desarrollo de patógenos (ácidos láctico y acético, peróxido de hidrogeno, óxido nítrico, bacteriocinas, etc.). Específicamente, cuando se han utilizado microorganismos probióticos del genero Lactobacillus se observan diversos efectos beneficiosos como son la mejora en la digestión, absorción y disponibilidad de nutrientes (Turpin y colbs., 2010). Así, ciertas cepas evitan la aparición de posibles dolencias abdominales gracias a su capacidad para degradar lactosa o α-galactosa. Otras, facilitan la biodisponibilidad de minerales debido a su capacidad de producir fitasas y tanino acilhidrolasas que hidrolizarían los fitatos y taninos que “secuestran” estos nutrientes. También se ha apreciado la capacidad que tienen algunas cepas para producir vitaminas del grupo B y K, y, últimamente, se están realizando estudios sobre la posible influencia de los lactobacilos en la “energía” de homeostasis particularmente en el caso de pacientes obesos, en la diminución de problemas cardiovasculares, en la reducción de los niveles de colesterol o en su capacidad de producción de metabolitos con actividad anticancerígena. Desde el punto de vista de la regulación inmune, aún no se ha determinado exactamente como contribuye a ello cada especie microbiana. La mejora del sistema se atribuye a un fortalecimiento de defensas no específicas contra la infección produciendo un incremento de la actividad fagocítica de los leucocitos, un aumento en la producción de inmunoglobulina A, una proliferación de los linfocitos intraepiteliales, un efecto adyuvante en antígenos específicos de respuesta inmune y la regulación en el balance entre células Thelper 1 (Th1) y Thelper 2 (Th2) (Mercenier y colbs., 2003). Todas estas funciones se realizan gracias a la aparente capacidad para modular diferencialmente la expresión de citoquinas y moléculas coestimuladoras (Miettinen y colbs., 1996; Tejada-Simón y colbs., 1999a, b; Marín y colbs., 1997a,b; Christensen y colbs., 2002). Recientemente, los microorganismos probióticos han sido declarados como moduladores tanto del control inmune innato como del adquirido o adaptativo, contribuyendo a ajustar con precisión las respuestas inmunes de Th1 y Th2. Sería necesario realizar un estudio específico de la funcionalidad probiótica de cada cepa, pues cada una puede provocar unos efectos específicos en el INTRODUCCIÓN __________________________________________________________________ 34 sistema inmune, ejerciendo su efecto intestinal o influyendo, bien en el sistema inmune innato o en el adquirido. Además, hay que tener en cuenta que los microorganismos permanecen en el sistema gastrointestinal por un periodo variable de tiempo y que sus efectos serán mayores cuanto más tiempo permanezca viva una población no inferior a 106 UFC (Shah, 2000), por lo que es necesario una ingesta repetitiva del probiótico para asegurar un nivel de población suficiente a lo largo del tiempo (Cogan y colbs., 2007). INTRODUCCIÓN __________________________________________________________________ 41 son las que se localizan en el biofilm (Bautista-Gallego colbs., 2013a). Se ha descrito que la especie L. pentosus se encuentra entre las principales especies de BAL presentes en los biofilms, mientras que entre las levaduras podemos destacar C. boidinii, P. membranifaciens, W. anomalus, G. candidum, C. sorbosa, P. galeiformis y S. cerevisiae (Arroyo-López y colbs. 2012b; Domínguez-Manzano y colbs. 2012; Grounta y Panagou 2014; León-Romero, 2014). Esta característica hace que sea primordial que el microorganismo probiótico a transportar por parte de la aceituna de mesa tenga una alta afinidad para asociarse con otros microorganismos para formar el biofilm. Además, debe tener una viabilidad y supervivencia alta durante la vida de mercado del alimento que la transporta, una supervivencia aceptable durante el transito gástrico, condicionado por las condiciones de pH y la presencia de las sales biliares, y por último ser capaz de colonizar y reproducirse en el intestino grueso. El compromiso de cumplir con todas estas premisas está provocando que se estén buscando alternativas a la habitual fortificación con bacterias probióticas exógenas, ya que como demuestran algunos estudios, tienen una baja viabilidad y supervivencia en las preparaciones probióticas presentes en los lineales de los supermercados (Shah y colbs. 1995; Shah, 2000). De ahí la importancia de seleccionar bacterias endógenas del propio alimento (con alta supervivencia y viabilidad) en nuestro caso de fermentaciones de aceitunas, que atraviesen el transito gástrico, que colonicen el colon y finalmente comprobar mediante estudios médicos su capacidad probiótica. Sin embargo, son necesarios estudios previos (tecnológicos y científicos) que determinen si es factible utilizarlas como cultivos iniciadores de la fermentación, su capacidad de formar biofilms sobre la superficie de las aceitunas, como afectan a las características organolépticas del producto fermentado y posterior supervivencia en el producto envasado. HIPÓTESIS Y OBJETIVOS DE TRABAJO __________________________________________________________________ 45 3. HIPÓTESIS Y OBJETIVOS DE TRABAJO. Nuestra hipótesis de partida es la capacidad que tenemos de dirigir la elaboración de aceitunas de mesa hacia la obtención de aceitunas simbióticas mediante la utilización de cultivos multifuncionales con buenas características tecnológicas y potencialmente probióticos. De este modo, la presente tesis doctoral tiene como objetivo fundamental determinar cuáles de los microorganismos potencialmente probióticos, previamente aislados de fermentaciones de aceitunas de mesa, son los que por sus características tecnológicas se podrían emplear como cultivos iniciadores en la fermentación de aceitunas verdes estilo español o sevillano. La finalidad no es una simple fortificación del producto, sino el desarrollo de un cultivo iniciador que además de contribuir a una fermentación controlada que dote al producto final de unas adecuadas características organolépticas, sea portador de un elevado número de microorganismos beneficiosos para la salud adheridos a su superficie. En concreto, se pretenden alcanzar los siguientes objetivos específicos: i) Determinar la supervivencia e imposición de las cepas seleccionadas durante el proceso fermentativo, su capacidad para formar biofilms sobre la epidermis de las aceitunas y conocer la carga microbiana que porta el fruto fermentado, garantizando un correcto proceso fermentativo a diferentes escalas (laboratorio, piloto e industrial) comprobando de este modo la viabilidad tecnológica de su utilización. ii) Conocer cómo el proceso de conservación de las aceitunas una vez fermentadas, previamente a su envasado, afecta a la supervivencia de los microorganismos potencialmente probióticos. iii) Evaluar la aceptabilidad por parte de los consumidores de las aceitunas fermentadas con los microorganismos seleccionados frente al producto tradicional. HIPÓTESIS Y OBJETIVOS DE TRABAJO __________________________________________________________________ 46 iv) Determinar qué formato de envase y conservación son las más apropiadas para favorecer una mayor supervivencia de las cepas potencialmente probióticas durante la vida de mercado del producto acabado. v) Evaluar la posibilidad de fortificar aceitunas ya fermentadas mediante inoculación con las cepas seleccionadas justo antes del envasado, determinando su supervivencia a lo largo de la vida de mercado del producto. MATERIALES Y MÉTODOS __________________________________________________________________ 49 4. MATERIALES Y METODOS. La presente tesis doctoral ha sido abordada desde un enfoque multidisciplinar, utilizando técnicas de microbiología predictiva, biología molecular, química analítica, bioinformática y escalado de procesos, lo cual se refleja como se muestra a continuación, en los materiales y métodos utilizados. 4.1. ACEITUNAS. Los frutos utilizados en todas las experiencias contempladas en la presente tesis doctoral han sido de la variedad Manzanilla (Olea europaea var. pomiformis), recogidas a mano en su etapa de maduración verde y suministradas por la empresa JOLCA S.L (Huevar del Aljarafe, Sevilla, España) (Figura 4.1). El criterio de selección de esta variedad se fundamentó en el hecho de ser el cultivo mayoritariamente utilizado para la elaboración de aceitunas de mesa verdes estilo español o sevillano. Figura 4.1. Aceitunas Manzanilla utilizadas en el desarrollo de las experiencias. Al llegar las distintas partidas de aceitunas a la planta piloto del Departamento de Biotecnología de Alimentos del Instituto de la Grasa (CSIC, Sevilla), se pasaron por una cinta de escogido, retirándose hojas, ramas y frutos excesivamente maduros o dañados. Posteriormente, se pasaron por una clasificadora por MATERIALES Y MÉTODOS __________________________________________________________________ 50 tamaños para escoger frutos del mismo calibre (peso aproximado de 4,1 g y 11 cm2 de superficie, valores medios de 50 medidas). 4.2. CEPAS UTILIZADAS COMO INÓCULOS. Como cultivos iniciadores de la fermentación fueron utilizadas cuatro cepas nativas de L. pentosus aisladas de diferentes procesos de elaboración de aceitunas de mesa pertenecientes a la colección de microorganismos del Instituto de la Grasa (TOMC). En concreto, las cepas elegidas fueron: TOMC LAB2, TOMC LAB3, TOMC LAB4 y TOMC LAB5 (en adelante LAB2, LAB3, LAB4 y LAB5, respectivamente). Su selección se basó en estudios previos que revelaban su potencial probiótico y su buen desarrollo en las condiciones ambientales en las que se llevan a cabo las fermentaciones de aceitunas. Tabla 4.1. Resumen de las principales características potencialmente probióticas y tecnológicas de los aislados utilizados como cultivos iniciadores en la presente tesis doctoral. Lc Sh y Lr GG son la referencia para las cepas Lactobacillus casei var. Shirota y Lactobacillus rhamnosus GG utilizados como controles probióticos por Bautista-Gallego y col. (2013). Características Probióticas LAB2 LAB3 LAB4 LAB5 Lc Sh Lr GG Auto-agregación 55,3% 76,5% 58,1% 27,5% 33,3% 39,1% Hidrofobicidad 5,2% 8,5% 25,7% 1,3% 1,1% 0,2% Supervivencia digestión gástrica 0,041% 0,045% 0,025% 0,020% 0,004% 0,043% Supervivencia digestión pancreática 6,5% 18,0% 15,7% 36,1% 2,0% 2,1% Inhibición Salmonella enteritidis + - - - + + Inhibición Listeria monocytogenes + - - - + + Inhibición Escherichia coli + + - + + + Características tecnológicas LAB2 LAB3 LAB4 LAB5 Lc Sh Lr GG NIC NaCl (g/l)* 61,7 45,4 52,3 56,9 Nd Nd MIC NaCl (g/l)** 126,2 107,17 117,5 104,5 Nd Nd Tmax crecimiento 42,3ºC 40,2ºC 42,2ºC 40,2ºC Nd Nd Tmin crecimiento 1,7ºC 6,7ºC 6,4ºC 9,5ºC Nd Nd Topt crecimiento 36,5ºC 33,4ºC 35,6ºC 34,7ºC Nd Nd *NIC, concentración de NaCl a la cual empieza a observarse un efecto inhibidor. **MIC, concentración de NaCl a partir de la cual ya no se observa crecimiento. MATERIALES Y MÉTODOS __________________________________________________________________ 51 Así, en diferentes test in vitro se observó que estas cepas destacaban por su resistencia a las digestiones gástrica y pancreática, su capacidad de autoagregación, su hidrofobicidad, su actividad hemolítica y su capacidad para degradar las sales biliares (Bautista Gallego y colbs., 2013), además de presentar una elevada resistencia a la sal y temperaturas cambiantes (Romero-Gil y colbs., 2013). La Tabla 4.1 muestra, a modo de resumen, sus principales características potencialmente probióticas y tecnológicas. MATERIALES Y MÉTODOS __________________________________________________________________ 52 4.3. PROCESO DE ELABORACIÓN DE ACEITUNAS. En todas las experiencias llevadas a cabo en las instalaciones del Instituto de la Grasa los frutos fueron sometidas a un proceso de elaboración “típico” de aceitunas de mesa verdes estilo español o sevillano. Inicialmente, se realizó la etapa conocida como cocido, en la cual las aceitunas se sumergieron en un solución de hidróxido sódico (2,2 %, p/v) en la que permanecieron hasta que esta penetro 2/3 de la distancia de la piel al hueso (6 h). Seguidamente, se retiró la lejía, dando paso a la etapa conocida como lavado, que consiste en sumergir las aceitunas en agua durante 20 h para eliminar el exceso de álcali. Posteriormente, una vez retirada el agua de lavado, se añadió una solución del 11% (p/v) en NaCl (salmuera de fermentación), que fue suplementada, en las experiencias llevadas a cabo a escala de laboratorio, con un 0,5% de ácido acético, y en las realizadas a nivel de planta piloto, con 0,35% de glucosa y 0,8 mL/L de HCl (grado alimentario del 35% de riqueza). La adición de ácido se realiza para neutralizar parte del álcali remanente en las aceitunas y producir una primera bajada de pH, mientras que la adición de glucosa tiene como objetivo enriquecer en materia fermentable la salmuera y acelerar la primera fase de fermentación. A los 2 días de su colocación en salmuera, se burbujea CO2 en cada fermentador hasta que el pH del líquido desciende a valores próximos a 6,5 unidades, procediéndose posteriormente a su inoculación. En las experiencias a nivel de laboratorio (primer año de estudio) se realizaron dos aportaciones de glucosa (0,65 g/100 mL de salmuera) a los 55 y 100 días del inicio del proceso para que continuara la producción de ácido y obtener un pH final con valores inferiores a 4,2 unidades. Esta práctica es habitual cuando el contenido inicial de materia fermentable en las aceitunas es bajo (frutos de finales de campaña) y no se alcanzan niveles de pH óptimos para una posterior conservación del producto (Garrido-Fernández y colbs., 1997; Chorianopoulos y colbs., 2005). En el caso de las experiencias a escala de planta piloto (segundo año de estudio), se realizaron diversas actuaciones tecnológicas de uso común en las in- MATERIALES Y MÉTODOS __________________________________________________________________ 53 dustrias. De este modo, se efectuó la retirada a los 18 días de 2 litros de salmuera del fondo de cada fermentador y su sustitución por una salmuera blanca (nueva) del 5% en NaCl y el 15% de glucosa; otra actuación destacable fue suplementar a los 78 días del inicio del proceso la salmuera de cada fermentador con 224 g de glucosa (equivalente a enriquecer con 0,56 % la salmuera de fermentación) con el fin de alcanzar unos valores de pH inferiores a 4,2 unidades. Las fermentaciones fueron controladas y monitorizadas, durante un periodo de tiempo comprendido entre 120 y 135 días, con una evolución de la temperatura ambiente similar en las diferentes campañas de estudio, descendiendo progresivamente desde los 28ºC del mes de octubre a los 15°C en el mes de febrero (Figura 4.2). Figura 4.2. Evolución de la temperatura ambiente en las plantas piloto del Departamento de Biotecnología de Alimentos del Instituto de la Grasa durante la fermentación de las aceitunas. MATERIALES Y MÉTODOS __________________________________________________________________ 60 Tabla 4.2. Experiencias de envasado de los frutos después de la fermentación en los ensayos realizados a nivel de laboratorio sobre una mezcla de frutos obtenido de los 10 fermentadores. Un total de 10 replicados fue realizado para cada uno de los tratamientos. Nota: Los recipientes se almacenaron a 7, 13 y 22 ºC. Nota: * el 30% del volumen libre del envase se rellena con N2. Figura 4.7. Cerrado de bolsas con líquido gobierno. Figura 4.8. Cerradora al vacío. Para los envasados en frascos de vidrio fueron empleados frascos del tipo A-314 (75 mm de diámetro y 103,5 mm de altura) en los que se colocaron 175 g de frutos y 145 mL de líquido de gobierno. Los frascos se cerraron con una tapa metálica twist-off. En la Figura 4.9 se pueden observar los distintos tipos de envasados realizados. TIPO ENVASE FORMA DE ENVASAR Con líquido de gobierno Sin líquido de gobierno Vacío Atmósfera inerte* Frasco de vidrio SI - - Bolsa plástico SI SI SI MATERIALES Y MÉTODOS __________________________________________________________________ 61 Figura 4.9. Formatos de envasado de las aceitunas fermentadas a escala de laboratorio. 4.4.1.3.2. Envasado con conservación previa. A los 3 meses de conservación, las aceitunas de cada garrafa fueron envasadas en frascos de vidrio A-314 en las mismas condiciones que las comentadas previamente para este tipo de formato. Los envases fueron introducidos en una cámara fría (6-8 ºC) durante un mes para que el equilibrio fuera completado y minimizar la posibilidad de fermentaciones extrañas. MATERIALES Y MÉTODOS __________________________________________________________________ 62 4.4.2. FERMENTACIÓN Y ENVASADO A ESCALA PILOTO. Estas experiencias fueron realizadas en fermentadores PVC de 100 L de capacidad con unas dimensiones de 40 cm de diámetro y 80 cm de alto y un estrechamiento en la zona superior de llenado de 15 cm de diámetro y 15 cm de alto (Figura 4.10.). En dicho estrechamiento fue colocada una tapadera flotante con el fin de asegurar unas condiciones relativamente anaerobias, siendo instalado un grifo en la parte inferior para el vaciado de líquidos. En los fermentadores se introdujeron 64 kg de aceitunas y 40 L de salmuera. Dichos fermentadores se inocularon con las cepas que por su capacidad de imposición, tanto en las salmueras de fermentación como en la superficie de las aceitunas, durante la experiencia a escala laboratorio, habían mostrados los resultados más prometedores: L. pentosus LAB2 y LAB4. Figura 4.10. Fermentadores utilizados en las experiencias a escala de planta piloto. MATERIALES Y MÉTODOS __________________________________________________________________ 63 4.4.2.1. Fermentación Se llevaron a cabo tres tratamientos diferentes por duplicado, para los cuales se utilizaron las siguientes referencias: F1, para el proceso espontáneo, mientras que F2 y F3 fueron tratamientos en los que se inocularon cultivos puros de LAB2 y LAB4 respectivamente. La fermentación fue monitorizada físicoquímicamente y microbiológicamente por un total de 135 días. 4.4.2.2. Envasado. Terminada la etapa de fermentación, las aceitunas procedentes de los fermentadores F2 (inoculados con LAB2) fueron envasadas y almacenadas como se muestra a continuación. Con el fin de alargar la vida de mercado al menos a 8 meses. Las condiciones químicas previstas en el equilibrio fueron mas restrictivas que las del año anterior: 0,6 % de acidez libre como ácido láctico a fin de que el pH se mantenga cercano a 3,7 unidades y concentración de NaCl al 5,5%. En esta segunda campaña, y basado en los resultados obtenidos en la primera, se decidió realizar solo tres tipos de envasado: con líquido de gobierno, en bolsa y frasco de vidrio (A-314), y el envasado en bolsa de plástico con atmósfera inerte (N2). Los envasados fueron realizados con proporciones de frutos y líquidos de gobierno similares a los de la campaña anterior. En esta ocasión fue desechada la alternativa de envasado al vacío debido a la deformación que sufrían las aceitunas al ser sometidas al mismo. El almacenamiento de los envases se realizó a temperatura ambiente, 20±2°C, y en cámara refrigerada a 7°C. La evolución de los envasados se evaluó durante 8 meses, realizándose análisis físico-químicos y microbiológicos mensuales por duplicado, así como caracterización molecular de las poblaciones de BAL por rep-PCR con el primer GTG5 al final del envasado. Por lo tanto, el diseño experimental consistió en un factorial completo con un total de 6 tratamientos diferentes (3 métodos envasado x 2 temperaturas x duplicado). MATERIALES Y MÉTODOS __________________________________________________________________ 64 4.4.3. FERMENTACIÓN A ESCALA INDUSTRIAL. Las experiencias a nivel industrial se llevaron a cabo en dos campañas sucesivas 2011/2012 y 2012/2013 en las instalaciones de Jolca SA en Huevar del Aljarafe (Sevilla, España), empleándose tanques de fermentación de 16.000 L de capacidad en los que se colocaban unos 9.700 kg de aceituna y 5.900 L de salmuera (Figura 4.11). Figura 4.11. Patio de fermentadores en Jolca, SA. 4.4.3.1. Campaña 2011/2012. El proceso de cocido, lavado y puesta en salmuera fue el que habitualmente utiliza la empresa, en concreto, consistió en un cocido con una solución de NaOH al 2,6% durante 6 h a 18 °C, un posterior lavado (8 h), y finalmente puesta en salmuera al 11% NaCl. Posteriormente, las salmueras y frutos son trasladados a los tanques de fermentación, añadiéndose a continuación 25 L de HCl grado alimentario (35% de riqueza) por fermentador. A los dos días, dos fermentadores fueron inoculados con la cepa LAB2 (tratamiento F2) y otros dos con la cepa LAB4 (tratamiento F3), eligiéndose también otros dos fermentadores sin inocular como testigos (tratamiento F1). Los inóculos fueron preparados utilizando un cultivo de la- MATERIALES Y MÉTODOS __________________________________________________________________ 65 boratorio de forma que su población inicial fuera aproximadamente de 5 log10 UFC/mL en la salmuera. A lo largo de la fermentación fue realizado un seguimien- to microbiológico, tomando muestras de salmuera y aceitunas, mientras que los parámetros físico-químicos fueron controlados por la industria mediante sus protocolos habituales. 4.4.3.2. Campaña 2012/2013. Después de los estudios realizados a escala de planta piloto y la primera campaña industrial, se apreció que la cepa LAB2 tenía los mejores resultados de supervivencia e imposición en la epidermis de las aceitunas, decidiéndose usar tan solo dicha cepa como cultivo iniciador en el proceso de fermentación industrial en una segunda campaña, pero valorando la incidencia de otros factores que podrían afectar a la instauración del inóculo, entre ellos fueron considerados: - Volumen inicial del inóculo. Debido al gran volumen de los fermentadores industriales se estudió el efecto de inocular la misma población de BAL pero en dos volúmenes muy diferentes: 5 L (cultivo de laboratorio) y 200 L (cultivo adaptado). - Acidificación inicial de la salmuera. Se investigó si la fuerte acidificación inicial de la salmuera (25 L de HCl/fermentador) como se realizaba habitualmente en esta industria podría tener algún efecto sobre el desarrollo de los microorganismos, por ello, también, se ensayó la adición de una menor cantidad de ácido (10 L HCl/fermentador). - Madurez de los frutos y climatología. Para ello, fueron realizadas experiencias a principio de campaña (mes de septiembre), en el que las aceitunas, habitualmente, tendrían un estado de madurez poco avanzado, siendo la temperatura ambiente moderadamente alta, y a finales de octubre con un estado de madurez más avanzado y una temperatura ambiente inferior. A continuación se describe como fueron preparados los dos tipos de inóculos y como fueron realizadas las experiencias en los fermentadores industriales: MATERIALES Y MÉTODOS __________________________________________________________________ 66 Cultivo de laboratorio (L). Un cultivo puro de la cepa LAB2 fue preparado en 5 L de MRS líquido + 5% NaCl hasta niveles poblacionales de 9 log10 UFC/mL. Una vez lleno el fermentador con las aceitunas y la salmuera acidificada con HCl, dicho volumen de cultivo fue añadido de la forma más homogénea posible en el fermentador (Figura 4.12). Pasadas 24 h, se volvió a re-inocular el fermentador con otros 5 L de un cultivo con las mismas características, alcanzando un nivel poblacional teórico, próximo a los 5 log10 UFC/mL. Figura 4.12. Inoculación de un fermentador con el cultivo de laboratorio. Cultivo adaptado (A). Un cultivo puro de la cepa LAB2 fue añadido a 200 L de una salmuera con la siguiente composición: NaCl (4%), MRS (0,1%) y glucosa (2,5%). La bombona (Figura 4.13) se mantuvo durante 24 h en el patio de la industria (incubación) a temperatura ambiente (15-26 °C). Ello permitió obtener un gran volumen de inoculo con una población cercana a 8 log10 UFC/mL. Este inoculo se añadió tras llenar el fermentador con las aceitunas y la salmuera acidificada. Esta operación fue realizada mediante una bomba de trasiego, asegurando que el inoculo se distribuía homogéneamente en todas las zonas del fermentador (Figura 4.13). Pasadas 24 h se repitió el proceso de inoculación, reforzándose así la población inicial del cultivo iniciador, alcanzando un nivel poblacional teórico, próximo a los 6 log10 UFC/mL. MATERIALES Y MÉTODOS __________________________________________________________________ 67 Figura 4.13. Preparación del cultivo adaptado e inoculación de un fermentador mediante bomba. Los resultados físico-químicos y microbiológicos fueron comparados con los de un fermentador de referencia en cada fecha de inoculación (testigos). Un resumen de las experiencias se muestra en la Tabla 4.3. Tabla 4.3. Experiencias de inoculación a escala industrial llevadas a cabo en Jolca SA. (Campaña 2012/13) en los meses de septiembre y octubre. CULTIVO ADAPTADO CULTIVO LABORATORIO CONTROL Acrónimo A25 A10 L25 L10 C HCl/fermentador 25 L 10 L 25 L 10 L 25 L Inoculación 1er día 1er día 1er día 1er día NO Re-inoculación 2 o día 2o día 2 o día 2 o día NO MATERIALES Y MÉTODOS __________________________________________________________________ 68 4.4.4. FORTIFICACIÓN. Para llevar a cabo estas experiencias se utilizaron aceitunas Manzanilla fermentadas durante 6 meses, procedentes de las experiencias de fermentación realizadas el segundo año a nivel de planta piloto, tanto de los tratamientos espontáneos como de los inoculados con la cepa LAB2. Aceitunas de cada uno de estos fermentadores fueron utilizadas para llenar frascos de vidrio modelo A-314 (175 g de aceitunas + 145 mL salmuera) añadiéndose una salmuera nueva con unas concentraciones de NaCl y ácido láctico para que en el equilibrio la concentración de cloruro de sodio y la acidez libre fuesen 5,5% y 0,6%, respectivamente. Los recipientes fueron almacenados en una cámara frigorífica (6-8ºC), comprobándose que a los 10 días se había alcanzado el equilibrio entre salmuera y aceitunas, con valores cercanos a los previstos (5,48±0,04% NaCl y 0,61±0,02% de acidez libre). Posteriormente, parte de los envasados fueron sometidos a un tratamiento térmico mediante inmersión en un baño termostatizado a 85°C durante 5 min. Por tanto, la experiencia fue llevada a cabo utilizando 3 tipos diferentes de frutos: i) procedentes de una fermentación espontánea (F1); ii) previamente fermentados con una alta implantación de la cepa potencialmente probiótica, LAB2 (F2); iii) aceitunas fermentadas espontáneamente y tratadas térmicamente para destruir la flora que podría llevar adherida (F3). En todos los casos la mitad de los frascos (pasterizados y no pasterizados) fueron abiertos en esterilidad (cámara de flujo laminar) e inoculados con un cultivo en fase estacionaría temprana de la cepa L. pentosus LAB2, de forma que su población inicial en la salmuera de envasado alcanzase los 6,5 log10 UFC/mL, cerrándose a continuación. El resto de frascos que no fueron inoculados e utilizados como control (evolución espontánea). Los envases fueron almacenados a temperatura ambiente en la planta pilo- to del Instituto de la Grasa, con una temperatura que fluctuó entre los 18 y 31ºC. Se tomaron muestras a los 0, 40, 80 y 200 días de envasado para determinar las poblaciones de microorganismos (levaduras, BAL y enterobacterias) en la epider- MATERIALES Y MÉTODOS __________________________________________________________________ 69 mis de la aceitunas, así como la presencia de la cepa inoculada LAB2 al final del envasado por rep-PCR con el primer GTG5. 4.5. ANÁLISIS FISICO-QUÍMICOS. Para el control y seguimiento de los distintos ensayos fueron realizadas determinaciones analíticas tanto en las salmueras de fermentación y/o líquidos de gobierno como en las aceitunas. Las analíticas fueron llevadas a cabo de forma periódica, para de esta manera, poder realizar un estudio de la evolución de los principales parámetros físico-químicos a lo largo de la fermentación , conservación. o envasado. 4.5.1. EN SALMUERA. 4.5.1.1. Concentración en cloruro de sodio. A 0,5 mL de salmuera se le añade unos 100 mL de agua destilada, utilizándose como indicador 8 gotas de una solución de cromato de potasio 5% (p/v). Posteriormente, se valora con una solución de nitrato de plata 0,086 N. El momen- to del viraje se considera cuando la solución cambia de un color amarillo intenso a una tonalidad rojo ladrillo. La concentración de NaCl en la salmuera, expresada como porcentaje (g de NaCl en 100 mL de muestra) es igual al volumen gastado en la valoración de la disolución de nitrato de plata 0,086N (Fernández y colbs., 1985). 4.5.1.2. Acidez libre, acidez combinada y pH. Los análisis de pH, acidez libre (expresados como g de ácido láctico/100 ml de solución) y acidez combinada (meq de HCl que son necesario añadir a 1 L de salmuera para alcanzar un pH de 2,6) fueron realizados con un equipo Titroprocessor 670 (Metrohm Instrumental INC, Suiza), que analiza dichos parámetros mediante valoración con soluciones de NaOH (0,5N) y HCl (2N). Para las determinaciones se empleó un volumen de salmuera de 25 mL (Fernández y colbs., 1985). MATERIALES Y MÉTODOS __________________________________________________________________ 76 Finalmente se confirmo el perfil de bandas (de 100 a 4000 pb) de los aislamientos obtenidos al azar con el de la cepa inoculada en cada tratamiento. Para ello, fueron realizadas electroforesis con un gel de agarosa del 2% (Seakem, Biowhittaker Molecular Applications, USA) a 70v durante aproximadamente 2 h. Los geles fueron teñidos en una solución de bromuro de etidio (5 µg/ml) durante 30 min y posteriormente visualizados y digitalizados mediante un sistema de captación de imágenes Gelprinter PLUS (TDI, Madrid, España). Los resultados obtenidos fueron posteriormente analizados mediante el paquete informático BioNumerics 6.6 (Applied Maths, Kortrijk, Belgica). La similitud entre los distintos perfiles digitalizados fue calculada mediante dendogramas que fueron construidos en base al coeficiente de correlación de Pearson y el método de agrupamiento de pares con la media aritmética no ponderada como algoritmo de formación de clústeres (UPGMA). En dicho procedimiento se utilizó la calibración de clúster automática para obtener los mejores valores de los parámetros de optimización del coeficiente de similitud. Entre estos parámetro destacan: “Optimization”, que es el valor, dentro de un pequeño rango de traslación entre dos perfiles de bandas, para el que se obtiene mayores coeficientes de similitud entre los aislamientos con los que se construyen los clústeres de un dendograma y “Curve Smoothing”, que se utiliza para reducir distorsiones en las curvas densiométricas, provocadas sobre todo, por diferencias de brillo y contraste en las capturas digitales de los perfiles de ADN tras el revelado con luz ultravioleta. MATERIALES Y MÉTODOS __________________________________________________________________ 77 4.6.3. CARACTERIZACIÓN DE LAS BACTERIAS ACIDO LÁCTICAS PRESENTES EN LA EPIDERMIS DE LAS ACEITUNAS. En este caso fueron utilizadas dos técnicas de análisis molecular, la anteriormente descrita de RAPD-PCR y la amplificación por PCR de elementos palindrómicos extragénicos repetitivos (rep-PCR) descrita por Gevers y colbs. (2001). Para el análisis de los perfiles de ADN de los aislamientos procedentes de la fermentación a escala industrial, la fortificación y el envasado a escala piloto, se realizó la amplificación de ADN mediante la técnica rep-PCR, dada su mayor repetitividad como quedó demostrado tras experiencias de normalización. Los pasos a realizar para conseguir los aislamientos, extraer su ADN, separar las bandas, digitalizar y analizar los perfiles de ADN de estos fueron los mismos que en el caso de RAPD-PCR, salvo por el cambio del cebador utilizado, en este caso se usó GTG5 (5’-GTGGTGGTGGTGGTG-3’) (Operon Biotechnologies) y las condiciones de amplificación del ADN. De este modo la programación del termociclador (eppendorf) fue la siguiente: Una desnaturalización inicial de 5 min a 95 °C seguida de 30 ciclos con las siguientes condiciones: 1º) desnaturalización de 30 s de duración a 94 °C, 2º) alineamiento durante 30 s a 40 °C y 3º) elongación durante 8 min a 65 °C; finalmente se realizó una elongación durante 16 min a 65 °C. Una vez acabado el proceso se programó un descenso de temperatura hasta 4 °C para evitar la degradación del ADN amplificado. MATERIALES Y MÉTODOS __________________________________________________________________ 78 4.6.4. IDENTIFICACIÓN DE LAS LEVADURAS PRESENTES EN LA EPIDERMIS DE LAS ACEITUNAS. Su identificación fue realizada tanto en las aceitunas fermentadas a escala de laboratorio como en las fermentadas a escala industrial. En ambos casos su origen es espontáneo, queriéndose evaluar si su presencia fue dependiente o independiente, del inoculo utilizado en cada tratamiento de la fermentación. Las técnicas empleadas para la identificación de las levaduras presentes en las epidermis fueron las siguientes: i) RFLP 5.8S ITS, la cual se basa en el análisis de los perfiles de restricción generados por una batería de endonucleasas sobre los amplificados del gen ribosómico 5.8S y sus espacios intergénicos asociados ITS1- ITS2 (Esteve-Zarzoso y colbs., 1999), ii) secuenciación de los dominios D1/D2 del gen ribosómico 26S. La utilización de esta última técnica se hizo necesaria en aquellos casos en los que el análisis de restricción no fue concluyente, y para la confirmación de especies de levaduras no descritas anteriormente en aceitunas de mesa. La metodología RFLP 5.8S ITS es la siguiente: cada aislamiento de levadura, tomado al azar, se hizo crecer en 1 mL de YM líquido durante al menos 12 h y posteriormente se realiza la extracción de ADN siguiéndose el mismo protocolo que para las BAL (extracción con cloroformo alcohol-isoamílico, 24:1), salvo la variación del volumen de ADN extraído y la composición de la mezcla para la reacción de amplificación; en concreto, la mezcla esta compuesta por: 20 µL de la solución acuosa de ADN, 2 µL (5 u/µL) de Taq polimerasa (Roche molecular Biochemicals, Alemania), 2 µL (0,5 µM) de los cebadores ITS1 (5'- TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3') e ITS4 (5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'), 8 µL (50 µM de cada uno), de una mezcla con los cuatro dNTP (Operon Biotechnologies) 10 µL de buffer de reacción 10x (Operon Biotechnologies y 56 µL de agua desionizada (sigma). Posteriormente, se lleva a cabo la amplificación en un termociclador (eppendorf) con el siguiente programa: desnaturalización inicial de 94 ºC durante 5 min y 40 ciclos con las siguientes etapas: 1º) desnaturalización a 94 ºC durante 1 min, 2º) alineamiento a 55,5 ºC durante 2 min y 3º) elongación a 72 ºC durante 2 MATERIALES Y MÉTODOS __________________________________________________________________ 79 min, el programa termina con una etapa a 72 ºC de 10 min de duración. Una vez que se amplifica el ADN, se lleva a cabo una electroforesis en un gel de Agarosa al 1,4% (p/v) en tampón TAE 1x y empleando un marcador molecular 1-kb+ (Life Technologies, Estados Unidos) para conocer su número de pares de bases. Posteriormente, el amplificado se digiere separadamente con las endonucleasas CfoI, HaeIII, HinfI y ScrFI (Roche Molecular Biochemicals, Alemania). La reacción de restricción contiene 2,5 µL de buffer 10x (específico de la enzima) (Roche Molecular Biochemicals), 6,5 µL de agua desionizada, 1µL (5 u/µL) de la enzima de restricción y 15 µL del amplificado por PCR. Las restricciones se incubaron a 37 ºC durante al menos 12 h. Los fragmentos obtenidos se separan posteriormente en un gel de agarosa al 3% (p/v) en tampón TAE 1x y se tiñen durante 20 min en bromuro de etidió. Los perfiles de restricción y el amplificado obtenidos para cada aislamiento de levadura fueron comparados con los existentes en la base de datos www.yeast-id.org (Universidad de Valencia y CSIC, España). En el caso de los aislamiento procedentes de la fermentación industrial se prefirió utilizar la secuenciación del gen ribosómico 26S. Para este propósito, se realizó la amplificación por PCR de dicho gen con los cebadores NL1 (5'- GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3') y NL4 (5'-GGTCCGTGTTTCAAGACGG- 3') (Kurtzman y Robnett, 1998) secuenciándose el amplificado resultante. Las secuencias obtenidas, fueron comparadas mediante BLAST con las existentes en la base de datos del NCBI GenBank. La reacción de amplificación fue idéntica a la descrita para la región 5.8S ITS, excepto en los cebadores utilizados (NL1 y NL4). MATERIALES Y MÉTODOS __________________________________________________________________ 80 4.6.5. MICROSCOPIA ELECTRONICA DE BARRIDO. Para la observación de la microbiota adherida a la epidermis de las aceitunas mediante MEB fue utilizado el protocolo desarrollado por Kubota y colbs. (2008). Este consiste en realizar dos lavados superficiales de las aceitunas de 1 h de duración cada uno con un tampón fosfato 100mM a pH 7,00. A continuación los frutos son sumergidos en una solución del 5% de glutaraldehido en el mismo tampón anterior. Después de 2 h y lavar varias veces con el tampón inicial, las aceitunas se secan y mediante un bisturí se cortan láminas (2 mm2) de su epidermis. Dichas láminas son sometidas a un proceso de deshidratación mediante 10 min de inmersión en soluciones donde la concentración de etanol incrementa desde 50% al 100% (50%, 70%, 80%, 90%, 95% y 100%). La siguiente etapa consiste en tres tratamientos de 45 min de duración cada uno con 2-metil-2-propanol, y la posterior fijación de la muestra a un portaobjetos de cristal. El último paso previo a la observación, es el recubrimiento de la muestra mediante una fina película de oro, utilizándose para ello un scancoat six SEM sputter (Edwards Gat, Israel). Una vez terminada la preparación de la muestra, se procedió a la observación de la misma en un microscopio electrónico de barrido modelo JSM-6460LV (Jeol Ltd, Tokyo, Japon) en el CITIUS (Universidad de Sevilla). MATERIALES Y MÉTODOS __________________________________________________________________ 81 4.7. ANÁLISIS SENSORIAL Uno de los principales objetivos de este trabajo de investigación era la utilización de un inoculo con características potencialmente probióticas para elaborar aceitunas de mesa sin perdida de sus características sensoriales (color, textura y sabor) con respecto a las elaboradas mediante fermentación espontánea. Por ello, a lo largo del presente trabajo de investigación se ha evaluado la calidad de las aceitunas mediante análisis sensoriales, bien aplicando el método propuesto por el Consejo Oleícola Internacional (COI, 2011) o realizando una “cata de consumidores”. 4.7.1. MÉTODO DEL COI Estos análisis sensoriales fueron realizados en la sala normalizada de cata del Departamento de Biotecnología de Alimentos del Instituto de la Grasa bajo condiciones controladas de luz, temperatura y humedad. Las pruebas se llevaron a cabo con 12 catadores expertos en aceitunas de mesa, todos ellos pertenecientes a la plantilla del propio Departamento, aplicándose el “Método para el análisis sensorial de las aceitunas de mesa”, COI/OT/MO No 1/Rev.2” (COI, 2011). Para la aplicación de dicho método fueron utilizados los descriptores relacionados con: la percepción de sensaciones negativas (“fermentación anormal” y “otros defectos”), sensaciones gustativas (ácido, amargo y salado) y de sensaciones kinestésicas (dureza, fribrosidad y crujiente), empleándose una escala no estructurada (es decir, sin ninguna marca de graduación intermedia) de una longitud de 10 cm. Cada muestra de aceitunas fue presentada en una copa normalizada según la Norma COI/T.20/Doc. Nº 5 (2007), “Copa para la degustación de aceites”, cubierta con un vidrio de reloj y codificada. La copa contenía 3-4 aceitunas que se encontraban cubiertas con su propia salmuera. El catador evaluó para cada muestra todas las sensaciones de la Hoja de Valoración (Figura 4.15), señalando en las líneas horizontales la intensidad de cada descriptor. Entre cada muestra, el catador se enjuaga la boca completamente y efectua una pausa. El número de sesio- MATERIALES Y MÉTODOS __________________________________________________________________ 82 nes realizadas al día fue de sólo una. La intensidad de los diferentes atributos fue determinada midiendo con una regla graduada el segmento que va desde el origen de la escala hasta la marca realizada por el catador. El resultado fue expresado con un solo decimal. Con los resultados de los 12 catadores se calculó la mediana, que es el parámetro estadístico utilizado en el Método COI. Figura 4.15. Hoja de valoración según el “Método para el análisis sensorial de las aceitunas de mesa”, COI/OT/MO No 1/Rev.2” (COI, 2011). De acuerdo con el método, y aunque la escala tiene un rango en todos los casos de 10 cm, el extremo izquierdo está considerado de valor “1” y el extremo derecho de valor “11”, para evitar problemas de índole matemática en el tratamien- to estadístico de la mediana. Por tanto, en las Hojas de Valoración, el punto intermedio entre el extremo izquierdo (valoración pésima de un determinado descriptor) y el extremo derecho (valoración óptima) tendrá una valoración de 6 unidades. MATERIALES Y MÉTODOS __________________________________________________________________ 83 Tras el análisis, las aceitunas se podrán clasificar en cuatro categorías según las puntuaciones obtenidas para sus sensaciones negativas (fermentación anormal y otros defectos que incluye cocinado, metálico, rancio, etc.): Extra, Primera, Segunda y aceitunas no comercializables. De acuerdo con este método, la clasificación en las diferentes categorías se realiza según el valor de la mediana del defecto mayoritariamente percibido (DMP) y los valores de referencia son los siguientes: - Extra: DMP  3 - Primera: 3 < DMP  4,5 - Segunda: 4,5 < DMP  7,0 - Aceitunas que no podrían ser comercializadas como Aceitunas de mesa: DMP>7,0 MATERIALES Y MÉTODOS __________________________________________________________________ 84 4.7.2. CATA DE CONSUMIDORES. Aceitunas fermentadas procedentes de los tratamientos F1 (fermentación espontánea) y F2 (inoculadas con LAB2) de las experiencias realizadas a nivel de planta piloto fueron acondicionadas adecuadamente en garrafas de plástico con una capacidad de 5 kg de aceitunas y 2,7 L de salmuera (Figura 4.16) de forma que tras estar almacenadas durante 3 meses a 7°C las condiciones finales de equilibrio fueron 5,5% en NaCl y 0,6% como ácido láctico. Esta operación se realizó por duplicado. Figura 4.16. Aceitunas utilizadas para la cata de consumidores. Previamente a la cata se tomaron muestras de aceitunas y salmuera para realizar diversos análisis microbiológicos (recuentos de enterobacterias, levaduras y BAL, así como la presencia de la cepa LAB2 por RAPD-PCR en el producto probiótico) y físico-químicos (pH, sal, acidez libre y combinada, textura y color instrumental de los frutos). La cata de consumidores tuvo lugar en el mercado de la Encarnación (Sevilla, España) participando 200 personas (105 mujeres y 95 hombres) como panelistas (Figura 4.17). Los consumidores tenían que haber cumplido tan solo un requisito, haber comido aceitunas de mesa en los últimos tres meses. Cada uno realizó dos catas, una por tratamiento, y tuvo que rellenar una hoja de cata (Figura 4.18) evaluando los atributos: apariencia, olor, ácido, amargo, salado, dureza, fibrosidad y crujiente; MATERIALES Y MÉTODOS __________________________________________________________________ 85 asimismo, debían puntuar su valoración global y su predisposición de compra. La evaluación se realizó mediante la inserción de una línea vertical que cortaba la escala horizontal de cada atributo según la intensidad de la percepción. Indicar que no se prefijó periodo de tiempo ni ingesta maxima de aceitunas, permitiendo asi que el consumidor tuviese una decision clara respecto a las preguntas realizadas en la hoja de cata. Figura 4.17. Cata de consumidores realizada en el mercado de la Encarnación de Sevilla. Figura 4.18. Hoja de cata para el test de consumidores. RESULTADOS Y DISCUSIÓN __________________________________________________________________ 93 5.1. EXPERIENCIAS A ESCALA DE LABORATORIO. En esta experiencia se va a estudiar la evolución de los parámetros físicoquímicos, microbiológicos y organolépticos de la fermentación, conservación y envasado de aceitunas estilo sevillano, así como la formación de biofilms mixtos sobre la epidermis de los frutos durante la etapa de fermentación. 5.1.1. ETAPA FERMENTACIÓN. 5.1.1.1 Cambios físico-químicos. Los azucares reductores, que se difunden desde los frutos a la salmuera, constituyen la mayor fuente de materia fermentable presente en la salmuera de fermentación. Estos sustratos son, principalmente, transformados por las BAL en ácido láctico, dando lugar a un aumento de la acidez libre de la salmuera y al descenso de su pH, inhibiendo el desarrollo de microorganismos patógenos y alterantes (Garrido-Fernández y colbs. 1997). Como se puede apreciar en la Figura 5.1, en el momento de la inoculación, la concentración de azucares reductores totales en la salmuera era de aproximadamente 6 g/L. Si se examinan las concentraciones individuales de cada uno de estos compuestos, los más abundantes fueron la glucosa y la fructosa, cuyas concentraciones en salmuera al inicio de la fermentación se encontraban en el rango de 2-3 g/L. Por el contrario, las concentraciones de sacarosa y manitol fueron muy bajas desde el inicio del proceso. En dicha figura se aprecia también que, independientemente de la cepa inoculada, el consumo de los azucares fue muy similar en todos los casos en los que se inocula (F2-F5), caracterizándose por un rápido descenso y un agotamiento de los mismos a los 9-10 días (concentración residual total <0,2 g/L); en el proceso espontaneo (F1) se observó una menor velocidad de agotamiento ya que no se alcanzó el agotamiento hasta el decimoquinto día, con un retraso aproximado de 5 días con respecto al resto de los tratamientos inoculados. La pequeña concentración residual de azucares observada en la salmuera de todos los tratamientos a los 15-20 días, es indicativa del alto grado de agotamiento ____ _ de lo s mos. Fi g ura ción d e taneo; 4, ino c rante unida d lenta, frutos los 5 5 do alr e una m sa, di s otra s valor e en el RES _ _______ _ s azucare s 5.1. Camb i e los distin t fermentad o c ulado con L Simultán e los 10 pri m d es hasta debido al y al efect o 5 días de f e ededor de m ayo r pro d s tribuidos egunda a e s de pH e La neces sector de ULTADO S _ _______ _ s en el int e i os observa d t os tratami e o r 2, inocul a L AB4; ferm e e amente, e m eros día s 5. Poste r agotamie n o tampón p e rmentaci ó 4,5 unida d ucción de en dos m los 100 dí n todos lo s idad de a ñ la aceitu n S Y DISC U _ _______ _ e rior de lo s d os en el c o e ntos ensa y a do con LA B e ntador 5, i n e l valor d e s de ferm e r iormente, n to de los p roducido ó n se obs e des, por l o ácido lác t m omentos as, consig s tratamie n ñ adir gluc o a, estuvo U SIÓN _ _______ _ 94 s frutos po o ntenido d e y ados a esc B 2; ferment a n oculado c o e l pH (Fig u e ntación, d esta velo carbohidr por la aci d e rvó que l o o que se d t ico. En to t distintos, u g uiendo as n tos fuero n o sa en tod o motivada _ _______ _ r el creci m e azucares d a la de labo r a dor 3, ino c o n LAB5. u ra 5. 2 ) d d esde val o c idad de d a tos disp o d ez combi n o s valores ecidió añ a t al fueron u na prime í que, al fi n de 4±0,1 o s los trat a por el av a _ ________ _ m iento de l o d e las salm u r atorio: fer m c ulado con L escendió r o res inicial d escenso o nibles en n ada. Apr o de pH se a dir glucos añadidos r a adición nal de la f unidades a mientos, a nzado es t _ _______ _ o s microo r u eras de fe r m entador 1, L AB3; ferm e rápidame n es cercan fue much el interior o ximadam e habían e s s a para fa v 15 g/L de a los 55 d f ermentaci ó (Figura 5. 2 práctica h t ado de m _ ____ r ganisr mentaespon- e ntador n te duos a 8 o más de los e nte, a s tancav orecer glucod ías, y ó n, los 2 ). abitual adura- RESULTADOS Y DISCUSIÓN __________________________________________________________________ 95 ción de los frutos empleados en la experiencia, el prolongado periodo de lavado tras el tratamiento alcalino (con objeto de eliminar el máximo álcali posible), y a la baja relación kg de aceitunas/volumen de salmuera de los fermentadores empleados (1,48) respecto de los empleados en las industrias (1,75) que hace que los nutrientes estén menos concentrados (Garrido-Fernández y colbs. 1997). Figura. 5.2. Cambios de pH en las salmueras de cada tratamiento durante la fermentación. Los datos mostrados son los valores medios de los duplicados de cada tratamiento. También se indica el momento en que fue añadida la glucosa. Las barras verticales indican los límites de confianza para una p=0,05. La acidez libre de las salmueras de fermentación es un parámetro que nos informa sobre la estabilización y seguridad microbiológica de las aceitunas durante y tras la fermentación. En la Figura 5.3 podemos observar como su valor aumentó muy rápidamente durante los primeros 20 días, sufriendo posteriormente una ralentización que se extendió hasta los 55 días, produciéndose nuevos incrementos tras cada adición de glucosa. Los valores finales obtenidos en todos los tratamientos fueron cercanos a 10 g/L expresado como ácido láctico. Los valores alcanzados son habituales para este tipo de fermentación de aceitunas (Garrido- Fernández y colbs. 1997). ____ _ ción d acéti c ción d con l a estan c to de obten i 20 g/ L Fi g ura la fer m dor 3, con L A tació n y con t mostr ó conc e un in c riodo RES _ _______ _ Tres de l o d e aceitun a c o y el eta n d e ácido l á a cepa LA B c ó, hasta q la concen t i dos muy s L . 5.3. Cambi o m entación: f inoculado c A B5. Inicialme n n de cada t t rarrestar e ó un liger e ntración fi c remento i inicial de p ULTADO S _ _______ _ o s metab o a s de me s n ol. Inicial m á ctico (Fig u B 2). Sin e m q ue la adi c t ración ha s s imilares e o s en la ac i f ermentado r c on LAB3; n te se añ a t ratamient o e l exceso d o aument o nal de ent nicial simi l p roducció n S Y DISC U _ _______ _ litos más c a estilo e s m ente tra s u ra 5.4), p m bargo, d e c ión de glu s ta el fina l e ntre los d i dez libre d e r 1, espont a fermentad o a dió ácido a o , previam e d e álcali. S o , similar re 2,5 y 3 , l ar para t o n de ácido U SIÓN _ _______ _ 96 c aracterís t s pañol o s e s la inocul a p articularm e espués d e cosa prov o l de la fer m iferentes t e las salmu e a neo; ferme n o r 4, inocul a acético (0 , e nte a la i n S u conce n en todos , 5 g/L. En o dos los tr a láctico, u n _ _______ _ t icos prod u e villano s o a ción se p e nte en el e 30 días l o có un le n m entación , ratamient o e ras de los d n tador 2, i n a do con L A , 80 g/L) e n n oculació n n tración a l los trata m la Figura 5 a tamiento s n a posteri o _ ________ _ u cidos dur a o n el ácid o p rodujo un a tratamien a producc to pero pr o , siendo l o o s, estand o d istintos tr a n oculado c o B4; fermen n las salm u , para baj a o largo d e m ientos, o b 5 .4 se mu e s , que coi n o r estabiliz _ _______ _ a nte la fer m o láctico, e a rápida p n to F2 (ino ión de lác t o gresivo a o s valores o próximo s a tamientos d o n LAB2; fe r n tador 5, in o u eras de f e a r el pH d e e la ferme n b teniéndo s e stra com o n cidió con z ación en e _ ____ m ental ácido p roducculado t ico se a umenfinales s a los d urante r menta- o culado e rmen- e estas n tación s e una o hubo el pe- e l caso ____ _ de lo s segui d adicio Fi g ura bios e Los d a ción e caso d cala, c conc e a la d e 0,5-0, RES _ _______ _ s tratamie n d o de un n nes de gl u 5.4. Evolu c n las salm u a tos repres e En cuant o e s mucho m d e grand e c omo en e e ntración e e los ácid o 8 g/L, obs e ULTADO S _ _______ _ n tos F2 y F n uevo incr e u cosa. c ión de las c u eras dura n e ntados so n o al etano l m ayor cua e s ferment a e sta expe r n las salm o s láctico y e rvándos e S Y DISC U _ _______ _ F 5, o liger o e mento de c oncentrac i n te la ferm e n los valore s , es cono c ndo se pr o a dores. Si r iencia, e s ueras no s y acético ( e como la d U SIÓN _ _______ _ 97 o descen s e la conce n i ones de ác e ntación d e s medios d e c ido que s u o duce en c n embarg o s capa fácil s uele ser m ( Figura 5. 4 d iferencia e _ _______ _ o para lo s n tración d e ido láctico, e los difere n e cada trata m u concent r c ondicion e o , en ferm mente a l a m uy alta. S 4 ). La con c e ntre trata m _ ________ _ s tratamie n e acético t r ácido acét i n tes trata m m iento. r ación dur a e s anaeró b entacione s a atmosfe r S u evoluci ó c entración m ientos fu _ _______ _ n tos F1, F 3 r as las su c i co y etano l m ientos ana l a nte la fer m b icas, com o s a pequ e r a por lo q ó n es muy final oscil ó e mínima. _ ____ 3 y F4, c esivas ly caml izados. m enta- o es el ña esq ue su similar ó entre RESULTADOS Y DISCUSIÓN __________________________________________________________________ 98 La Tabla 5.1 muestra los valores instrumentales obtenidos al final de la fermentación para el color superficial y la textura de las aceitunas procedentes de los cinco tratamientos ensayados. En dicha tabla se observa que los valores de los cinco tratamientos fueron muy similares, sin diferencias significativas (p<0,05) entre los tratamientos inoculados y el tratamiento espontáneo, por lo que ninguna de estas dos propiedades se vio afectada por el uso de un cultivo iniciador. De este modo, la textura estuvo comprendida entre un valor mínimo de 1853 (tratamiento F4) y 2130 N/100g (F2). El tratamiento F2, inoculado con la cepa LAB2, también fue el que mostró unos mayores valores de índice de color (Ic), 25,7 frente a los 23,8 del tratamiento F5 (inoculado con la cepa LAB5). Tabla 5.1. Valores medios para los cinco tratamientos ensayados de los parámetros de color y textura instrumental al final de la fermentación a escala piloto. Color superficial Textura Ic L* a* b* N/100g aceitunas deshuesadas F1 24,4 (0,5) 49,9 (0,5) 3,2 (0,1) 34,5 (1,1) 2006 (140) F2 25,7 (1,1) 49,6 (0,3) 3,2 (0,7) 35,0 (2,4) 2130 (28) F3 25,1 (0,4) 49,9 (0,9) 3,3 (0,1) 35,3 (0,9) 1901 (73) F4 24,3 (1,5) 49,9 (0,2) 3,4 (0,1) 35,0 (1,0) 1853 (66) F5 23,8 (0,2) 49,6 (0,2) 3,4 (0,1) 34,1 (0,5) 1875 (250) Nota: de acuerdo con la aplicación del test de comparación múltiple de Scheffé, no se apreciaron diferencias significativas entre los diferentes tratamientos para los diferentes parámetros de color y textura (p ≤ 0,05). Estos resultados ponen de manifiesto que las diferentes cepas de L. pentosus seleccionadas como cultivos iniciadores originaron una rápida acidificación y promovieron el consumo rápido de los sustratos fermentables en todos los tratamientos inoculados, coincidiendo con los efectos favorables observados para otros cultivos iniciadores utilizados previamente en la elaboración de aceituna de mesa estilo español o sevillano (De Castro y colbs., 2002; Sánchez y colbs., 2001; Skandamis y colbs., 2003). Sin embargo, el progresivo aumento de la concentra- RESULTADOS Y DISCUSIÓN __________________________________________________________________ 99 ción de ácido acético y etanol durante el desarrollo de la fermentación podría estar asociado a una determinada actividad heterofermentativa de las cepas inoculadas, aunque este aumento también podría ser debido a la actividad de las diferentes especies y cepas de levaduras presentes (Garrido-Fernández y colbs., 1997), por lo que debe ser un aspecto a confirmar en futuros estudios. Como puede apreciarse, los valores de pH y acidez libre finales fueron bastantes similares entre los diferentes tratamientos, incluido el espontáneo. Este hecho corrobora los estudios llevados a cabo por Rodríguez de la Borbolla y Alcalá y colbs. (1964), que afirman que no es necesario inocular las salmueras para conseguir una buena acidificación del medio. Sin embargo, con respecto al tratamien- to espontaneo, los estadios iniciales de las fermentaciones inoculadas fueron más rápidos, acelerando la estabilización del producto fermentado sin influir negativamente en los valores y concentraciones de los diferentes parámetros físicoquímicos al final de la fermentación. Por lo tanto, en este caso, la inoculación representa una ventaja respecto a la fermentación espontanea. Una característica interesante de todos los inóculos utilizados fue su buena capacidad para agotar el manitol, lo cual a veces no sucede cuando las fermentaciones son espontaneas, corriéndose el peligro de refermentaciones en los envasados (Garrido-Fernández y colbs., 1997; Rodríguez-Gómez y colbs., 2012b). Este adecuado consumo permitió obtener un producto final con una concentración azúcares residuales muy baja, reduciéndose los riesgos de alteración debido a una segunda fermentación que podría manifestarse durante la etapa de conservación o en la vida de mercado del envasado final. RESULTADOS Y DISCUSIÓN __________________________________________________________________ 100 5.1.1.2. Cambios microbiológicos. 5.1.1.2.1. En la salmuera de fermentación. Las salmueras en la fermentación de aceitunas verdes estilo español o sevillano se caracterizan por la aparición y alto desarrollo de BAL que coexisten con una, habitualmente menor, población de levaduras y una pequeña población inicial de enterobacterias en los estadios iniciales (Arroyo-López y colbs., 2012b; Hurtado y colbs., 2012). Si se observa la dinámica poblacional de las BAL en el tratamiento espontáneo (F1), el crecimiento de este grupo microbiano empieza 7 días después de la puesta en salmuera de las aceitunas, mostrando por tanto una marcada fase de latencia. Posteriormente, la población de BAL se incrementa hasta un máximo de alrededor de 8.5 log10 UFC/mL, valor que se obtiene alrededor del decimotercer día de fermentación (Figura 5.5, panel superior). Después de este máximo, la población mostró un ligero descenso pero siempre manteniéndose en niveles poblacionales superiores a los 7,8 log10 UFC/mL. Este comportamiento pudo ser modelado utilizando la ecuación de dos términos (crecimiento y muerte) de Gompertz desarrollada por Bello y Sánchez-Fuertes (1995). El ajuste de dicha ecuación a los datos experimentales fue bueno (R2=0,993). En la Tabla 5.2 se muestran los parámetros biológicos deducidos de este ajuste para las fases de crecimiento (parámetros k1-k3) y de inhibición (k4-k6). El análisis de estos datos nos muestra que el valor asintótico máximo de la población (k1) se estabilizó en torno a los 7,8 log10 UFC/mL, y que en valor absoluto la velocidad de crecimiento de la población (k2: 0,754 d-1) fue más rápida que la velocidad de muerte (k5: -0.645 d-1). En cuanto a los tratamientos inoculados, siempre se produjo un ligero descenso de la población inicial (1-2 unidades logarítmicas) tras la inoculación. Sin embargo a partir del cuarto día, la población de BAL empieza a crecer rápidamente alcanzándose entre los 12-14 días los máximos niveles poblacionales, comprendidos entre 8-9 log10 UFC/mL, descendiendo y estabilizándose la población en valores alrededor de 7,2 log10 UFC/mL. Como ejemplo de este proceso de adaptación del inóculo a las condiciones ambientales, en el panel inferior de la Figura 5.5 ____ _ se m u cado s bien a da la c 0,960 Fi g ura de Bel l tratam i ( 1993 ) ajust e de lo s con l a prime r d -1 ). C RES _ _______ _ u estra la e v s del trata m a justado u t c alidad de . 5.5. E j em p l o y Sánch e iento espo n de uno de l En la Ta b e de estos s tratamie n a cepa LA B r a fase de C uando se ULTADO S _ _______ _ v olución d e m iento F2 t ilizando l a l ajuste p a p lo de a j ust e e z ( 1995 ) a l o n taneo ( pa n l os replicad o b la 5. 2 ta m modelos a n tos inocul a B 4 fue el adaptaci ó aplicó el t S Y DISC U _ _______ _ e la pobla c (inoculad ecuación a ra todos l o e de las po b o s datos e xp n el superior ) o s del trata m m bién se m a los result a a dos. Los que most r ó n (1,540 d est de co m U SIÓN _ _______ _ 101 c ión de L A o con LA B de Pruitt y o s fermen t b laciones d x perimental e r) , y el a j us t m iento ino c uestra los ados exp e datos mu e r ó una m a d -1 ), mient r m paración _ _______ _ A B con el t B 2). Este y Kamau ( 1 t adores in o d e BAL en s e s obtenido s t e mediante c ulado con L parámetr o e rimentale s e stran co m a yor veloci d r as que L A múltiple d _ ________ _ iempo de u comporta m 1 993), est a o culados ( R s almuera u ti s de uno d e el modelo L AB2 ( pane l o s biológic o s procede n m o el trata m d ad de cr e A B3 fue la m e Scheffé, _ _______ _ uno de lo s m iento pu a ndo com p R 2 ) entre 0 t ilizando el m e los replica de Pruitt y l inferior ) . o s deduci d n tes de ca d m iento ino e cimiento m ás lenta no se en c _ ____ s duplid o ser p rendi- 0 ,926 y m odelo dos del Kamau d os del d a uno culado tras la (0,431 c ont r a- RESULTADOS Y DISCUSIÓN __________________________________________________________________ 102 ron diferencias significativas entre los diferentes tratamientos para los parámetros de crecimiento/inhibición obtenidos. El desarrollo de las poblaciones de levaduras en salmuera siempre mostró una fase inicial de latencia, que fue muy similar entre los diferentes tratamientos con una duración aproximada de 10 días. Después de este periodo de tiempo, se observó una fase de intenso crecimiento, hasta alcanzar un máximo nivel poblacional (~5 log10 UFC/mL) hacia los 25-30 días tras el inicio de la fermentación. Posteriormente, la población descendió aunque siempre manteniéndose niveles poblaciones por encima de 4 log10 UFC/mL. Este comportamiento fue también correctamente modelado utilizando la ecuación de Bello y Sánchez-Fuertes con un R2 comprendido para todos los casos entre 0,971 y 0,995. Los parámetros biológicos obtenidos tras los ajustes de los datos experimentales para los diferentes tratamientos los podemos encontrar en la Tabla 5.3, que muestra como el tratamiento F2 (inoculado con LAB2) fue el que experimentó un crecimiento más rápido de las población de levaduras (3,214 d-1), mientras que F4 (inoculado con LAB4) fue el menor (0,317 d-1). Estos datos también nos indican que aunque las levaduras tardan más tiempo en empezar a crecer en ciertos tratamientos, una vez que esto ocurre, la velocidad de crecimiento de estos microorganismos supera al de las BAL (ver parámetro k2 en Tablas 5.2 y 5.3). Cuando se aplicó el test de comparación múltiple de Scheffé, como en el caso de BAL, no se encontraron diferencias significativas entre los diferentes tratamientos y parámetros. Es típica la presencia de enterobacterias durante los primeros días de fermentación en las salmueras (Garrido-Fernández y colbs., 1997). Sin embargo, el desarrollo de estos microorganismos en los fermentadores inoculados fue limitado, siendo tan solo detectadas en el primer muestreo y a niveles inferiores a 3 log10 UFC/mL. A partir de la segunda semana, las enterobacterias no fueron encontradas en ninguno de los fermentadores inoculados, posiblemente debido al rápido descenso del pH. Por el contrario, en los fermentadores espontáneos, la presencia de enterobacterias fue detectada por un periodo de tiempo superior, con un área estimada bajo la curva de 99,89±113,22, mientras que el valor medio obtenido pa- RESULTADOS Y DISCUSIÓN __________________________________________________________________ 109 Figura 5.8. Recuentos en la epidermis de las aceitunas de los tratamientos ensayados en el presente estudio para las poblaciones de BAL (a) y levaduras (b). Los valores son las medias de los duplicados de cada tratamiento. Las barras de error han sido intencionadamente omitidas para facilitar la visión del gráfico, aunque siempre fueron inferiores al 10%. Sin embargo, hacia el décimo día de fermentación, ya existía un considerable número de células colonizando la epidermis de las aceitunas, alcanzándose los máximos niveles poblacionales entre los 20 y 30 días de fermentación aproximadamente con 9 log10 UFC/aceituna para BAL y 8 log10 UFC/aceituna para las levaduras. También se puede apreciar que tras tres meses de fermentación, se _ ___ _ mant e piel d e rante aceit u los m a ficie. P duras bajo l a ya qu e pobla c colbs. Figura dermi s escala pobla c los ci n metro ment e RES U _ _______ _ e nía un gr a e los fruto s la fermen t u nas. Por las c a a temático s P or este m para cad a a curva d e e este val o c iones de , 2009). 5.9. Áreas s de las ac e de laborat o En la Fig u c iones de n co tratam para las B e ), con un a U LTADO S _ _______ _ a n númer o s (>6 log 10 t ación no f a racterísti c s de las cu m otivo, el e a tratami e e la repre s o r es cons i microorga bajo la cur v e itunas de l o o rio. u ra 5.9, s e BAL y le v ientos est u B AL y las a mayor d e S Y DISCU S _ _______ _ o de amb o UFC/acei t f ueron det e c as de los rvas de c r studio de e nto fue r e s entación d derado c o nismos (B v a de creci m o s diferent e e represen v aduras o b u diados. E levaduras e sviación e S IÓN _ _______ _ 110 o s género s t una). Es i e ctadas e n datos, no f r ecimiento la evoluci ó e alizado m d e sus re s o mo un pa r B autista-G a miento bac t e s tratamie n tan conju n b tenidos p a E n ella se a fue muy s e stándar e n _ _______ _ s de micro o mportant e n terobacte f ue posibl e de los mi c ó n de las p m ediante l a s pectivos r r ámetro m u a llego y c o t eriano par a n tos ensay a n tamente e a ra la epi d a precia c o s imila r (80 n las pobl a __ _______ _ o rganism o indicar a s rias en la e el ajuste c roorganis m p oblacione s a media d e r ecuentos u y útil par a lbs., 2008 ; a BAL y le v a dos en el p e l área baj o d ermis de mo el val o 1 frente a a ciones de _ _______ __ o s recubri e s imismo, q epidermis mediante m os en la s de BAL y e l área o b frente al t a compara ; Arroyo-L ó v aduras en p resente e s o la curva las aceitu n o r de dich o 741, resp levadura s __ ___ _ e ndo la ue dude las modesuper- y levab tenida i empo, r entre ó pez y las epis tudio a de las n as en o pa r áectiva- s . RESULTADOS Y DISCUSIÓN __________________________________________________________________ 111 De este modo, con la presente tesis doctoral se ha dado un salto cualitativo en el estudio de los microorganismos en la superficie de las aceitunas, ya que, mediante microscopia electrónica de barrido, se ha podido comprobar in situ la formación de biofilms mixtos levaduras-BAL sobre la superficie de aceitunas verdes estilo español o sevillano (nunca antes descrito anteriormente), obteniéndose los niveles poblacionales que ambos grupos microbianos son capaces de alcanzar, lo que determina el potencial uso de la aceituna de mesa como transportador de microorganismos. Además, hemos de tener en cuenta que, debido a la dificultad de separar todos los microorganismos presentes en la epidermis de los frutos analizados, es muy probable que los recuentos obtenidos sean inferiores a los reales. La formación de los biofilms fue independiente del tipo de fermentación, espontanea o dirigida, lo cual indica que puede ser un proceso generalizado en la elaboración de aceitunas de mesa. 5.1.1.3. Caracterización molecular de los microorganismos La caracterización molecular de las poblaciones de BAL en los diferentes fermentadores, tanto en salmuera como sobre la epidermis de las aceitunas, se realizó al final del proceso fermentativo mediante la técnica de análisis RAPD-PCR con el primer OPL5. La reproducibilidad de la técnica previamente se determinó utilizando como controles internos en diferentes geles a las mismas cepas inoculadas. Los resultados obtenidos se pueden observar en la Figura 5.10, en ella se aprecia que el clúster con menor coeficiente de similitud (82,2%) engloba a cuatro aislados de LAB3, mientras que la máxima reproducibilidad fue obtenida para LAB5 con un 86,5%. De este modo, se consideró que aquellos aislados que estuvieran englobados en un clúster con un tanto por ciento de similitud superior al 82,2% pertenecen a la misma cepa, mientras que valores inferiores pueden ser considerados como cepas diferentes. Torriani y colbs. (2001) utilizaron RAPDPCR para diferenciar entre diferentes cepas del grupo de Lactobacillus, encontrando un valor de reproducibilidad del 92%. Una vez establecidos los límites de reproducibilidad de la técnica, se analizaron en cada tratamiento los perfiles de RAPD-PCR obtenidos para varios aisla- RESULTADOS Y DISCUSIÓN __________________________________________________________________ 112 mientos elegidos al azar, procedentes tanto de salmuera como de la epidermis de las aceitunas, y se compararon con el microorganismo utilizado para inocular el correspondiente tratamiento, realizando posteriormente un análisis de similitud y de correlación con el coeficiente de Pearson y el programa bioinformático Bionumerics 6.6. En las Figuras 5.11-5.15 se representan respectivamente los dendogramas de los tratamientos F1, F2, F3, F4 y F5. En el dendogramas mostrado en la Figura 5.11, se han agrupado prácticamente todos los aislamientos procedentes del tratamiento 1 (espontáneo) con un porcentaje de similitud del 77,4%, apreciándose dos clúster bien definidos, que cumplen el requisito de coeficiente de similitud mínima (82,2%). Los aislamientos marcados en color rojo englobaron el 100% de los aislamientos procedentes de la epidermis, el 10 % de los procedentes de la salmuera y el correspondiente a LAB2 utilizado como control, mientras que los aislamientos marcados en verde engloban 7 aislamientos procedentes de la salmuera y el correspondiente a LAB3. En rosado aparecen aislamientos independientes, no correlacionados con los inóculos y por tanto de procedencia espontanea. Figura 5.10. Dendograma generado para obtener la reproducibilidad de la técnica utilizando las cepas inoculadas como controles internos en diferentes geles. RESULTADOS Y DISCUSIÓN __________________________________________________________________ 113 Figura 5.11. Dendograma correspondiente a los aislamientos procedentes del tratamiento F1 tanto de la salmuera como de la epidermis de las aceitunas. La nomenclatura utilizada para definir cada aislamiento es: F1, aislamiento obtenido de la fermentación espontánea; S o A, si el aislamiento han sido obtenido de salmuera (S) o de la superficie de las aceitunas (A) respectivamente, y un número que indica nominalmente los distintos aislamientos tomados al azar. RESULTADOS Y DISCUSIÓN __________________________________________________________________ 114 Figura 5.12. Dendograma correspondiente a los aislamientos procedentes del tratamiento F2 tanto de la salmuera como de la epidermis de las aceitunas. La nomenclatura utilizada para definir cada aislamiento es F2, aislamiento obtenido de la fermentación inoculada con LAB2; S o A, si el aislamiento han sido obtenido de salmuera (S) o de la superficie de las aceitunas RESULTADOS Y DISCUSIÓN __________________________________________________________________ 115 (A) respectivamente, y un número que indica nominalmente los distintos aislamientos tomados al azar. Figura 5.13. Dendograma correspondiente a los aislamientos procedentes del tratamiento F3 tanto de la salmuera como de la epidermis de las aceitunas. La nomenclatura utilizada para definir cada aislamiento es: F3, aislamiento obtenido de la fermentación inoculada con LAB3; S o A, si el aislamiento han sido obtenido de salmuera (S) o de la superficie de las aceitunas (A) respectivamente, y un número que indica nominalmente los distintos aislamientos tomados al azar. RESULTADOS Y DISCUSIÓN __________________________________________________________________ 116 Figura 5.14. Dendograma correspondiente a los aislamientos procedentes del tratamiento F4 tanto de la salmuera como de la epidermis de las aceitunas. La nomenclatura utilizada para definir cada aislamiento es: F4, aislamiento obtenido de la fermentación inoculada con LAB4; S o A, si el aislamiento han sido obtenido de salmuera (S) o de la superficie de las aceitunas (A) respectivamente, y un número que indica nominalmente los distintos aislamientos tomados al azar. RESULTADOS Y DISCUSIÓN __________________________________________________________________ 117 Figura 5.15. Dendograma correspondiente a los aislamientos procedentes del tratamiento F5 tanto de la salmuera como de la epidermis de las aceitunas. La nomenclatura utilizada para definir cada aislamiento es: F5, aislamiento obtenido de la fermentación inoculada con LAB5; S o A, si el aislamiento han sido obtenido de salmuera (S) o de la superficie de las aceitunas (A) respectivamente, y un número que indica nominalmente los distintos aislamientos tomados al azar. La Tabla 5.4 muestra, a modo de resumen, la imposición de las cepas inoculadas en cada uno de los fermentadores tanto en salmuera como sobre la epidermis de los frutos, teniendo en cuenta ese grado mínimo de reproducibilidad de la técnica del 82,2%. Se puede apreciar que, por lo general, las cepas presentes RESULTADOS Y DISCUSIÓN __________________________________________________________________ 118 en la salmuera de la aceitunas suelen ser distintas a las presentes en su epidermis, existiendo una cepa con una alta capacidad colonizadora de la epidermis de las aceitunas, LAB2, mientras que en la salmuera cobran gran importancia las cepas de procedencia espontanea. Tabla 5.4. Porcentajes de imposición al final de la fermentación de las cepas inoculadas y espontaneas en la ecología de BAL, tanto en la salmuera (S) como en la epidermis de las aceitunas (A), de cada uno de los tratamientos analizados a escala de laboratorio. Cepas Tratamientos F1 F2 F3 F4 F5 S A S A S A S A S A % LAB2 10 100 40 100 60 87,5 0 40 20 100 % LAB3 70 0 10 0 0 0 0 0 0 0 % LAB4 0 0 10 0 0 0 0 50 0 0 % LAB5 0 0 0 0 10 0 0 0 10 0 % Otras 20 0 40 0 30 12,5 100 10 70 0 La información obtenida mediante el estudio pormenorizado de la epidermis de las aceitunas de cada tratamiento nos revela que al final de la fermentación, salvo en el tratamiento F4, un alto porcentaje de los aislamientos procedentes de la epidermis de la aceitunas mostraron una alta similitud con la cepa inoculada LAB2, por lo que dicha cepa no solo colonizó la epidermis de los frutos presentes en los fermentadores donde fue utilizada como cultivo iniciador (F2), sino que también colonizó la superficie de las aceitunas de los tratamientos adyacentes. Como se ha comentado, tan solo en el caso del tratamiento F4, la cepa inoculada LAB4 consiguió imponerse en un alto porcentaje (50%), no siendo definitivamente desplazada por LAB2 que solo mostró un 40% de presencia. Otro hecho llamativo es la escasa presencia en la epidermis de los frutos de cepas espontaneas, sobre todo si se compara con la ecología de BAL de la salmuera de cada uno de los tra- RESULTADOS Y DISCUSIÓN __________________________________________________________________ 125 de cloruro de sodio que dota a las salmueras de una mayor estabilidad microbiológica (Garrido-Fernández y colbs., 1997). Tabla 5.7. Cambios fisicoquímicos globales ocurridos durante la fase de conservación. Parámetros Media del valor Inicial Media del valor Final pH 4,00 (0,05) a 4,03 (0,05) a Acidez libre (g de ácido láctico/L) 9,40 (0,30) a 7,90 (0,30) b Acidez Combinada (mEq/L) 104,00 (3,00) a 118,00 (3,00) b NaCl (g/L) 45,4 (0,30) a 89,0 (0,30) b Nota: Entre paréntesis se muestra el error típico. Los valores seguidos de diferentes letras en la misma fila, indican que estadísticamente, según el test de Scheffé, existen diferencias significativas a un p < 0,05. De este modo puede prevenirse el deterioro de los frutos debido a posibles re-fermentaciones que podrían suceder como consecuencia del aumento de la temperatura ambiental (Figura 5.17). Asimismo, se pudo observar un descenso significativo de la acidez libre (de 9,4 a 7,9 g/L) que vino acompañado de un significativo aumento de la acidez combinada (de 104 a 118 mEq/L), probablemente debido a reequilibrios químicos en la que parte de los ácidos libres pasan a estar como combinados (Garrido-Fernández y colbs., 1997). Sin embargo estos reequilibrios químicos tan solo provocaron un leve repunte (no significativo) del pH pasando de 4,00 a 4,03 unidades. Figura 5.17. Evolución de la temperatura ambiente en las plantas piloto del Instituto de la Grasa durante el periodo de conservación de las aceitunas fermentadas a escala de laboratorio. RESULTADOS Y DISCUSIÓN __________________________________________________________________ 126 Tras la medida de los parámetros característicos del color superficial de los frutos, se observó que entre los diferentes tratamientos las variaciones de estos eran mínimas. Una vez más se decidió combinar los resultados obtenidos para todos los tratamientos y así poder realizar una estadística de comparación entre dichos parámetros, previa al análisis sensorial (Tabla 5.8). Tabla 5.8. Cambios en los parámetros de color durante la conservación y el posterior equilibrado de la aceitunas previamente fermentadas. Ic L* a* b* Croma Hue Inicio conservación 24,5 (0,5) a 49,8 (0,2) a 3,3 (0,1) a 34,8 (0,5) a 34,2 (1,5) a 83,5 (0,2) a Fin de conservación 24,4 (0,4) a 49,8 (1,1) a 3,9 (0,2) b 33,4 (1,4) a 34,5 (0,7) a 84,2 (0,3) b Equilibrio antes envasado 25,1 (0,5) a 51,3 (0,6) b 3,8 (0,2) b 37,2 (0,7) b 37,4 (0,7) b 84,5 (0,3) b Nota: Entre paréntesis se muestra el error típico; valores en la misma columna con diferentes letras son, según el test de Duncan, significativamente diferentes (p < 0,05). Durante la fase de conservación no se apreciaron cambios significativos (p<0,05) para los parámetros de color Ic, L*, b* y croma. Sin embargo, se produjo un incremento de a* y del ángulo de tonalidad (Hue), lo que significa una pérdida de color verde. Estos cambios pueden estar relacionados con el llamado efecto "curado" observado en muchos productos fermentados. Figura 5.18. Cambios en la textura instrumental de las aceitunas al inicio de la conservación en azul, después de 3 meses en rojo y 1 mes de equilibrado en frascos previo a las catas de consumidores en verde. F1 proceso espontaneo, F2-F5 aceitunas previamente fermentadas con las cepas LAB2, LAB3, LAB y LAB5 respectivamente. Las barras verticales indican los límites de confianza para p= 0,05. RESULTADOS Y DISCUSIÓN __________________________________________________________________ 127 Como se puede observar en la Figura 5.18, la textura de las aceitunas disminuyó durante los 3 meses de conservación, pero las diferencias sólo fueron significativas entre los tratamientos F2 y F5. Cuando se da por terminada la conservación (3 meses) para poder envasar los frutos y sean aceptables por los consumidores hay que realizar un acondicionamiento para retirar el exceso de NaCl y acidez. Durante esta fase (un mes) se aprecian cambios en el color superficial con incrementos significativos en los parámetros L* (luminosidad), b* (tonalidad amarilla) y croma (saturación de color). Durante esta etapa de equilibrio previa a las catas, se produce también un descenso no significativo del valor medio de textura, previsiblemente debido a la difusión de NaCl del interior de la aceituna a la salmuera de envasado. Sin embargo, la textura de las aceitunas de todos los tratamientos fue superior a 1000 N/100 g de pulpa, que es el límite inferior aceptable para productos comercializables (Sánchez y colbs., 1997). Por lo tanto, se puede determinar que todas las aceitunas de estos experimentos (espontáneas e inoculadas) tienen una textura superior a los estándares mínimos recomendados. 5.1.2.2. Cambios microbiológicos. Como consecuencia de la adición progresiva de NaCl hasta valores cercanos al 9%, las poblaciones de los distintos géneros de microorganismos presentes en las salmueras y en la epidermis de las aceitunas sufrieron una serie de cambios poblacionales. Las enterobacterias siguieron sin ser detectadas ni en la salmuera ni en la epidermis de las aceitunas de ninguno de los tratamientos analizados. Las poblaciones de BAL en las salmueras sufrieron disminuciones significativas en todos los casos (Figura 5.19), siendo menos acusadas en los tratamientos F1 y F2. En ambos tratamientos, las poblaciones medias descendieron aproximadamente en 1,5 unidades logarítmicas a lo largo de los tres meses de conservación (desde aproximadamente 6 hasta 4,5 log10 UFC/mL). Sin embargo, para los RESULTADOS Y DISCUSIÓN __________________________________________________________________ 128 tratamientos F4 y F5, estas reducciones fueron ligeramente superiores a 2 unidades, mientras que él F3 sufrió un descenso superior a 4 unidades logarítmicas (población final en torno a 2,5 log10 UFC/mL). Este efecto inhibidor provocado por el incremento de la concentración de NaCl en la salmuera esta en concordancia con los resultados obtenidos previamente por Romero-Gil y colbs. (2013). Dichos autores modelizaron en medios de laboratorio la tolerancia y la resistencia de diferentes especies de levaduras y distintas cepas de BAL (entre ellas LAB2, LAB3, LAB4, y LAB5) en función de la concentración de NaCl, observándose una mayor resistencia de las levaduras a la sal comparado con las BAL. Figura 5.19. Evolución de la población de BAL en las salmueras de conservación de los 5 tratamientos ensayados a lo largo de los tres meses que duró dicha etapa. Las barras verticales indican los límites de confianza para una p=0,05. El efecto inhibidor del NaCl también quedó patente cuando se estudió la evolución de las poblaciones de BAL presentes en el biofilm de las aceitunas en los diferentes tratamientos (Figura 5.20). En este caso el descenso, por lo general, fue inferior, entre 1 y 2 unidades logarítmicas (de 7 a 5 log10 UFC/aceitunamL), siendo la población de BAL del tratamiento F2 quien sufrió un menor descenso relativo. Por el contrario, es el tratamiento F4 el que ligeramente supera a los demás en cuanto a su poblacional final, aunque si se examinan detenidamente los límites de confianza, se pueden descartar diferencias significativas entre las poblaciones finales de los 5 tratamientos analizados, estando alrededor de 5,5 log10 RESULTADOS Y DISCUSIÓN __________________________________________________________________ 129 UFC/aceituna. Estos resultados son coherentes con los obtenidos previamente durante la fase de fermentación, ya que como se ha comentado anteriormente, fue la cepa LAB2 la predominante en la superficie de las aceitunas de todos los tratamientos excepto en F4 (inoculado con LAB4). La reducción en los niveles poblacionales de las poblaciones de BAL durante la etapa de conservación pone de manifiesto lo inadecuado que es la utilización del proceso clásico de conservación cuando se quiere utilizar las aceitunas de mesa como vehículos de ingesta de microorganismos potencialmente beneficiosos para la salud. Figura 5.20. Población de BAL en la epidermis de las aceitunas al principio y al final de la etapa de conservación para los 5 tratamientos ensayados (F1-F5). Las barras verticales indican los límites de confianza para una p=0,05. Las poblaciones de levaduras en las salmueras de conservación evolucionaron de forma bastante errática, con descensos iniciales y posteriores repuntes hacia el final de la conservación en los tratamientos del F1 al F4, mientras que el tratamiento F5 se apreció un repunte al primer mes, con una bajada al segundo y una subida apreciable durante el tercer mes de conservación (Figura 5.21). Sin embargo, si observamos los límites de confianza de cada tratamiento, se puede observar que salvo el tratamiento F5, en los demás tratamientos no se produce variación significativa entre la población inicial y la final. Los cambios poblacionales de las levaduras presentes en la epidermis de las aceitunas conservadas se muestran en la Figura 5.22. En los tratamientos F2 y F4 se produjeron descensos apreciables en las medias poblacionales, aunque si se tienen en cuenta los límites RESULTADOS Y DISCUSIÓN __________________________________________________________________ 130 de confianza, el descenso tan solo fue claramente significativo en el tratamiento F4. En el tratamiento F5 también se produjo un ligero descenso poblacional de las levaduras, aunque mucho menor que en los dos tratamiento anteriores. Por el contrario en los tratamientos F1 y F3 se apreció un ligero incremento poblacional, aunque este no resultó significativo. Si se comparan los resultados obtenidos con las BAL, se puede deducir una alta capacidad adaptativa de las levaduras frente al incremento de NaCl. En general, se puede afirmar que la fase de conservación tuvo un efecto limitado sobre las poblaciones de levaduras, posiblemente debido a la mayor resistencia al NaCl de estos microorganismos con respecto a las BAL (Romero-Gil y colbs., 2013). Figura 5.21.Evolución en las salmueras de conservación de la población de levaduras a lo largo de los tres meses de la etapa de conservación para los 5 tratamientos ensayados. Las barras verticales indican los límites de confianza para una p=0,05. Figura 5.22. Población de levaduras en la epidermis de las aceitunas al principio y al final de la etapa de conservación para los 5 tratamientos ensayados. Las barras verticales indican los límites de confianza para una p=0,05. RESULTADOS Y DISCUSIÓN __________________________________________________________________ 131 5.1.2.3. Análisis sensorial. Una vez finalizada la conservación, las aceitunas fueron equilibradas en frascos de vidrio para reducir su contenido en NaCl y acidez y alcanzar valores aceptables para los consumidores para ser analizadas sensorialmente utilizando un panel de 8 catadores expertos en aceitunas pertenecientes a la plantilla del Instituto de la Grasa. Según los resultados obtenidos (Tabla 5.9), todas las aceitunas analizadas fueron clasificadas como categoría comercial “extra”, ya que, en ninguno de los tratamientos, los valores de la mediana para las “sensaciones negativas” ("fermentación anormal" y "otros defectos") superaron el valor umbral de 3,0 (COI, 2010). Las medianas del resto de las percepciones evaluadas fueron sometidas al test de Kruskale-Wallis, mostrando que el tratamiento espontaneo F1 tenía una puntuación de dureza significativamente menor que los tratamientos F2 y F3, corroborándose de este modo los valores de textura instrumental mostrados en la Figura 5.18. Tabla 5.9. Evaluación sensorial, de acuerdo con el método del COI, de las aceitunas procedentes de los 5 tratamientos experimentados, después de 3 meses de conservación y 1 mes de envasado hasta obtener el equilibrado en frascos de vidrio. Los resultados son la mediana de las observaciones (desviación estándar). F1 proceso espontáneo, F2-F5 aceitunas previamente fermentadas con las cepas LAB2, LAB3, LAB4 y LAB5, respectivamente. Notas: entre paréntesis se expresa la desviación estándar; medianas en columnas con diferentes letras son significativamente diferentes (p˂0,05) de acuerdo con el test de Kruskal- Wallis. La evaluación global de los resultados obtenidos para los diferentes descriptores, se realizó aplicando un análisis multivariante a los valores medios de las Sensaciones Negativas Sensaciones Gustativas Sensaciones Kinestésicas Acrónimo Fermentación anormal Otros Defectos Salado Amargo acido Dureza Fibrosidad Crujiente F1 1,7 (0,4) a 2,3 (0,5) a 6,6 (0,6) a 4,6 (1,0) a 4,9 (0,7) a 3,9 (0,5) a 3,3 (0,6) a 3,6 (0,6) a F2 1,2 (0,3) a 1,2 (0,3) a 7,4 (0,6) a 6,2 (1,1) a 6,6 (0,7) a 5,5 (0,4) b 3,9 (0,5) a 4,6 (0,8) a F3 1,4 (0,2) a 1,3 (0,2) a 7,1 (0,6) a 5,3 (1,0) a 5,3 (0,8) a 5,6 (0,5) b 4,8 (0,6) a 5,4(0,8) a F4 1,3 (0,1) a 1,4 (0,1) a 7,1 (0,3) a 4,6 (1,1) a 7,0 (0,8) a 5,1 (0,4) ab 4,6 (0,4) a 5,4 (0,6) a F5 2,1 (0,5) a 1,8 (0,6) a 7,5 (0,5) a 4,8 (1,0) a 6,9 (0,9) a 4,7 (0,3) ab 4,3 (0,5) a 3,5 (0,3) a RESULTADOS Y DISCUSIÓN __________________________________________________________________ 132 sensaciones gustativas y kinestésicas (ver Tabla 5.10). En dicho análisis se pudo apreciar que los resultados obtenidos eran coherentes y robustos al no encontrarse diferencias significativas en las valoraciones individuales de los catadores. Posteriormente, se realizó un análisis de componentes principales (ACP), encontrándose 3 vectores propios significativos con valores propios mayores que 1. El factor 1 representó el 54,57% de la varianza total y fue relacionado con las sensaciones kinestésicas (las correlaciones con la dureza, la fibrosidad y el crujiente fueron de 0,955, 0,901 y 0,955, respectivamente). El factor 2 representó el 28,13% de la varianza total explicada y estuvo principalmente ligado a los sabores amargo (0,876) y ácido (-0,749). Finalmente, el factor 3 explicaba el 15,34% de la varianza y estuvo asociado fundamentalmente al sabor salado (0,669). Tabla 5.10. Valores centrados en la media de cada atributo (entre paréntesis su error estándar), obtenidos para los distintos descriptores evaluados en el análisis sensorial realizado a las aceitunas procedentes de los 5 tratamientos experimentados, después de 3 meses de conservación y 1 mes de envasado y equilibrado en frascos de vidrio. F1 proceso espontáneo, F2-F5 aceitunas previamente fermentadas con las cepas LAB2, LAB3, LAB4 y LAB5 respectivamente. El grafico biplot obtenido tras el análisis sensorial de los atributos (Figura 5.23) muestra una estrecha relación entre todos los descriptores kinestésicos, estando estos resultados en la misma sintonía con los encontrados previamente por Moreno-Baquero y colbs., (2012). Por el contrario, los sabores amargo y ácido fueron casi ortogonales (no estando relacionados), y teniendo además una relación opuesta con el factor 2. El factor 1, que como muestra la figura está relacionado con las sensaciones kines- Sensaciones Gustativas Sensaciones Kinestésicas Acrónimo Salado Amargo Acido Dureza Fibrosidad Crujiente F1 -0,292 (0,303) -0,142 (0,238) -0,302 (0,229) -0,978 (0,312) -0,290 (0,261) -0,767 (0,289) F2 -0,374 (0,181) 0,277 (0,203) -0,200 (0,193) -0,319 (0,225) -0,462 (0,204) -0,322 (0,256) F3 0,094 (0,260) 0,613 (0,237) -0,083 (0,213) 0,867 (0,216) 0,374 (0,291) 0,710 (0,224) F4 0,276 (0,264) -0,260 (0,147) 0,598 (0,190) 0,358 (0,195) 0,456 (0,275) 0,460 (0,241) F5 0,762 (0,256) 0,145 (0,235) 0,217 (0,255) -0,405 (0,232) -0,440 (0,192) -0,577 (0,272) RESULTADOS Y DISCUSIÓN __________________________________________________________________ 133 tésicas, segrega los tratamientos en dos grupos claramente diferenciados: los tratamientos F3 y F4 (localizados a la derecha) y F1, F2 y F5 (situados a la izquierda). Además, en el eje del factor 2 se produce una diferenciación significativa entre los tratamientos F1 y F2 (en el cuadrante superior izquierdo) y F5 (en el cuadrante inferior izquierdo). Este mismo comportamiento ocurre en los cuadrantes derechos entre los tratamientos F3 y F4. En este tipo de gráficos también se obtiene valiosa información de la relación entre atributos y tratamientos. Así se puede apreciar que los tratamientos F3 y F4 estuvieron fuertemente correlacionados con las sensaciones kinestésicas, especialmente con valores altos de dureza, fibrosidad y crujiente (Tabla 5.10). Figura 5.23. ACP para los atributos sensoriales evaluados tras la conservación y el periodo de envasado-equilibrado. El grafico biplot muestra la relación entre factores, variables (atributos) y tratamientos. Asimismo, el tratamiento F3 se caracterizó por un marcado sabor amargo mientras que el tratamiento F4 estaba fuertemente asociado con altos valores de sabor ácido. El tratamiento F1 (espontáneo) se caracteriza por sus bajas puntuaciones en las sensaciones kinestésicas, mientras que F2 muestra una alta puntuación respecto al sabor amargo. Finalmente, el tratamiento F5 se localiza de forma RESULTADOS Y DISCUSIÓN __________________________________________________________________ 134 aislada en el cuadrante inferior izquierdo, mostrando bajos valores medios en cuanto a los atributos kinestésicos y el amargor. Sin embargo, muestra altos valores de los sabores salado y ácido. RESULTADOS Y DISCUSIÓN __________________________________________________________________ 141 nas ni del líquido de gobierno. Este hecho se debe principalmente al bajo pH inicial obtenido en todos los tipos de envasados (~3,8), el cual resulta ser un factor muy limitante para el crecimiento de estos microorganismos (Garrido-Fernández y colbs. 1997). La supervivencia de las poblaciones de BAL y levaduras sobre la epidermis de las aceitunas estuvo afectada por el tipo de material y tiempo de envasado como se puede observar en las Figuras 5.27 y 5.28. Figura 5.27. Valores medios obtenidos para las poblaciones de BAL y levaduras sobre la epidermis de las aceitunas y sus diferencias significativas según un análisis de ANOVA. A) Efecto del tipo de material de envasado sobre las BAL; B) efecto del tipo de material de envasado sobre las levaduras; C) efecto de las temperatura sobre las BAL; D) efecto de la temperatura sobre las levaduras. FS, envasado en frascos de vidrio con salmuera; BS, envasado en bolsas de plástico con salmuera, BN, envasado en bolsas de plástico con atmósfera modificada N2; BV, envasado en bolsa de plástico con vacío. Las barras de error muestran los intervalos de confianza al 95%. Las barras con diferentes letras son significativamente diferentes tras la aplicación de un test de comparación múltiple LSD. Media de recuentos iniciales: BAL, 7,06 (  0,09) log10 UFC/aceituna; levaduras, 6,1(  0,12) log10 UFC/aceituna. RESULTADOS Y DISCUSIÓN __________________________________________________________________ 142 Los recuentos más altos de BAL en frutos fueron encontrados sobre las aceitunas envasadas en bolsas de plástico con atmósfera modificada (N2) o en bolsas de plástico con salmuera (~6,4 log10 UFC/aceituna), mientras que los más bajos fueron significativamente obtenidos en bolsas de plástico con vacío (~5,9 log10 UFC/aceituna). La población de levaduras fue bastante similar en los envasados en bolsa de plástico con vacío, salmuera y en los frascos de vidrio (~5,9 log10 UFC/aceituna), mientras que fue estadísticamente inferior respecto a los envasados en bolsa con atmósfera de nitrógeno (~6,4 log10 UFC/aceituna). En cuan- to al efecto de la temperatura, la población de BAL se incrementó conforme subió la temperatura, mientras que el efecto observado para las levaduras fue justamente el contrario (Figura 5.27). Esta tendencia opuesta observada en el crecimiento podría indicar una competición por la supervivencia entre ambos grupos microbianos. La población de BAL sobre la superficie de las aceitunas descendió significativamente después del envasado y alcanzó su nivel poblacional más bajo al segundo mes de envasado (Figura 5.28, panel A). Después, los recuentos se incrementaron significativamente pero siempre se mantuvieron inferiores al primer pun- to. Este descenso podría haberse debido a la escasez de nutrientes o las condiciones estresantes de envasado a las que son sometidos los microorganismos. En el caso de las levaduras, fue observado un descenso paulatino de la población (Figura 5.28, panel B), ya que desde la inicial 6,5 log10 UFC/aceituna descendió hasta 5,6 log10 UFC/aceituna al final de los 3 meses de envasado. Independientemente de los materiales de envasado, la interacción temperatura*tiempo de envasado fue significativa e influyó sobre las poblaciones de microorganismos (Figura 5.28, paneles C y D). De este modo, la temperatura provocó diferencias significativas a determinados tiempos de envasado, particularmente dentro del primer y segundo mes. De este modo, a 22ºC, se obtuvieron las medias poblacionales de BAL más altas, mientras que en las aceitunas envasadas a 7ºC se obtuvieron las más bajas (Figura 5.28, panel C). Los cambios para las levaduras con respecto a la temperatura fueron opuestos comparados con las BAL, y la curva de los recuentos de levaduras a 22ºC fue siempre la más baja (Figura 5.28, panel D). RESULTADOS Y DISCUSIÓN __________________________________________________________________ 143 Figura 5.28. Valores medios obtenidos para las poblaciones de BAL y levaduras sobre la epidermis de las aceitunas y sus diferencias significativas según un análisis de ANOVA. A) Efecto del tiempo de envasado sobre las BAL; B) efecto del tiempo de envasado sobre las levaduras; C) efecto de la interacción temperatura*tiempo sobre las BAL; D) efecto de la interacción temperatura*tiempo sobre las levaduras. Temperatura: azul 7ºC, rojo 13ºC y verde 22ºC. Las barras de error muestran los intervalos de confianza al 95%. Las barras con diferentes letras son significativamente diferentes tras la aplicación de un test de comparación múltiple LSD (p<0,05). A la hora de considerar las poblaciones de microorganismos en la salmuera de envasado habrá que tener en cuenta que esta procede primordialmente de la epidermis de los frutos, ya que la salmuera de envasado fue previamente esterilizada mediante un tratamiento térmico, motivo por el cual la población inicial en todos los casos será cero. A lo largo de todo el periodo de envasado la población de BAL en la salmuera dependió de forma significativa del tipo de material utilizado, siendo más alta en los envases de vidrio que en los de plástico (Figura 5.29, panel A), produciéndose un efecto antagónico en las levaduras, cuyos recuentos fueron significativamente mayores en los envasados en plástico que en los de vi- RESULTADOS Y DISCUSIÓN __________________________________________________________________ 144 drio (Figura 5.29, panel B). Por otro lado el efecto de la temperatura sobre las BAL en la salmuera fue similar al observado sobre la superficie de los frutos, excepto en los recuentos a 22ºC que fueron menores (aunque no estadísticamente significativos) que a 13ºC (Figura 5.29, panel C). Sin embargo, el efecto de la temperatura sobre las levaduras en salmuera (Figura 5.29, panel D) fue idéntico que al observado en la superficie, y decreció progresivamente hasta alcanzar los menores recuentos a una temperatura de 22ºC. Figura 5.29. Valores medios obtenidos para las poblaciones de BAL y levaduras en las salmueras y sus diferencias significativas según un análisis de ANOVA. A) Efecto del tipo de material de envasado sobre las BAL; B) efecto del tipo de material de envasado sobre las levaduras; C) efecto de la temperatura sobre las BAL; D) efecto de la temperatura sobre las levaduras. FS, envasado en frascos de vidrio con salmuera; BS, envasado en bolsas de plástico con salmuera. Las barras de error muestran los intervalos de confianza al 95%. Las barras con diferentes letras son significativamente diferentes tras la aplicación de un test de comparación múltiple LSD (p<0,05). En la Figura 5.30, (panel A) se representa la población de BAL en función del tiempo, independientemente del tipo de envase o la temperatura de conservación. Sin embargo también hubo interacciones entre tipo de material*temperatura, RESULTADOS Y DISCUSIÓN __________________________________________________________________ 145 y entre tipo de material*tiempo de envasado sobre las poblaciones de BAL y levaduras en la salmuera. En el caso de la interacción tipo de material*temperatura, la población de levaduras fue siempre mayor en las salmueras de bolsas de plástico, aunque descendió conforme se conservan a mayor temperatura. De este modo, los niveles más bajos para este grupo microbiano fueron obtenidos a 22ºC en frascos de vidrio (Figura 5.30, panel B). Figura 5.30. Valores medios obtenidos para las poblaciones de BAL y levaduras en las salmueras y sus diferencias significativas según un análisis de ANOVA. A) Efecto del tiempo de envasado sobre las BAL; B) efecto de la interacción material de envasado*temperatura sobre las levaduras; C) efecto de la interacción material de envasado*tiempo sobre las BAL; D) efecto de la interacción material de envasado*tiempo sobre las levaduras. En azul los envasados en frascos de vidrio con salmuera, mientras que en rojo se muestran los envasados en bolsas de plástico con salmuera. Las barras con diferentes letras son significativamente diferentes tras la aplicación de un test de comparación múltiple LSD (p<0,05). Cuando se estudió la población de microorganismos en función del tipo de material*tiempo de envasado, se observó un descenso de la población de BAL en función del tiempo, sobre todo al cabo de dos meses de envasado, siendo menores los niveles poblacionales en envasados de bolsas de plástico. Los recuentos RESULTADOS Y DISCUSIÓN __________________________________________________________________ 146 para las levaduras fueron siempre mayores en los envasados con bolsas de plástico, manteniendo niveles poblacionales similares durante los 3 meses de envasado (Figura 5.30, paneles C y D). En cualquier caso, la población de BAL a los dos meses de envasado osciló entre los 6,2 y 6,5 log10 UFC/aceituna a 22ºC, constatándose la alta supervivencia de ambos grupos microbianos, BAL y levaduras, sobre la epidermis de las aceitunas en condiciones de envasado sin refrigeración. Siendo innecesaria la utilización de cadena de frio para comercializar este tipo de aceitunas. Usualmente se señala a los productos lácteos cuando se habla de alimentos mediante los que podemos ingerir microorganismos beneficiosos para la salud, y aunque en la microbiota de estos alimentos hay una gran variedad de especies de BAL, también hay presentes levaduras, las cuales pueden incrementar o interferir el crecimiento o supervivencia de las bacterias (Suharja y colbs., 2014). En esta tesis se ha demostrado que en la epidermis de las aceitunas verdes estilo español pueden sobrevivir a temperatura ambiente y durante varios meses, altos niveles poblacionales de BAL y levaduras y si a este hecho se añade el efecto protector que el biofilm ha demostrado tener sobre la supervivencia de estos microorganismos tras digestiones gástricas y pancreáticas simuladas (Arroyo-López y colbs., 2014; León-Romero, 2014), se pone de manifiesto que estas aceitunas de mesa podrían ser una alternativa a los productos lácteos para la ingesta de microorganismos beneficiosos para la salud. RESULTADOS Y DISCUSIÓN __________________________________________________________________ 147 5.1.4. TOMA DE DECISIONES. Una vez sopesados todos los resultados, se tomó la decisión de proseguir el estudio a nivel planta piloto con la cepa LAB2 la cual ha mostrado una alta capacidad de imposición, un buen comportamiento desde el punto de vista tecnológico, con un producto final de aceptables características organolépticas muy similares a las obtenidas mediante fermentación espontanea. De ahí que se pensara que esta cepa podría ser una buena candidata para elaborar aceitunas potencialmente probióticas manteniendo los estándares tradicionales de las aceitunas de mesa de estilo español o sevillano. Conjuntamente a LAB2 se decidió utilizar la cepa LAB4 que también mostro una alta capacidad de imposición y que al igual que LAB2 tuvo un buen comportamiento tecnológico durante la fermentación y que además según describe Arroyo-López y colbs., 2014 tiene una aceptable tasa de resistencia in vitro a las digestiones simuladas. RESULTADOS Y DISCUSIÓN __________________________________________________________________ 148 5.2. EXPERIENCIAS A ESCALA PILOTO. 5.2.1. ETAPA DE FERMENTACIÓN. Tras la realización de las experiencias llevadas a cabo a escala de laboratorio, se seleccionaron dos cepas de L. pentosus (LAB2 y LAB4) como las mejores candidatos como cultivos iniciadores para las posteriores experiencias de fermentación a escala de planta piloto y posterior envasado. A continuación, se muestran la evolución de los principales parámetros físico-químicos y microbiológicos en los casos en los que se inocula con dichas cepas (tratamientos F2 y F3) así como en la fermentación espontánea (tratamiento F1). 5.2.1.1. Cambios físico-químicos. La evolución del pH, acidez libre, consumo de azúcares y producción de ácido láctico y acético en las salmueras de fermentación de los diferentes tratamientos pudieron ser bien modeladas mediante el ajuste de los datos experimentales a las ecuaciones de Gompertz reparametrizada y la función exponencial de inhibición. En todos los casos se obtuvo una buena calidad de ajuste, con un R2 comprendido entre 0,83 y 0,98. En la Tabla 5.11 se muestran los valores medios de los parámetros del ajuste obtenidos para los diferentes ensayos (F1, F2 y F3) y ecuaciones utilizadas. Mediante el test de comparación múltiple de Scheffé (p˂0,05) se comprobó que no existieron diferencias estadísticamente significativas entre los diferentes tratamientos. Sin embargo, sí que se apreciaron tendencias muy interesantes en función de si el tratamiento había sido inoculado o no. De este modo, la evolución del pH en el tratamiento espontáneo muestra una clara tendencia a tener valores más bajos de la constante cinética de cambio (K) que en los tratamientos inoculados, produciéndose en estos últimos un descenso más acelerado del pH. Al final de la fermentación, el pH estuvo comprendido en un intervalo comprendido entre 3,67 (tratamiento F1) y 3,82 (tratamiento F2), lo cual garantiza un RESULTADOS Y DISCUSIÓN __________________________________________________________________ 149 producto estable y seguro en todos los casos. Esta evolución del pH está en sintonía con la producción de ácido láctico por los microorganismos. Así la constante cinética de producción (µ) fue mayor para los tratamientos inoculados F2 y F3 (1,16 y 1,35 d-1 respectivamente), que para el tratamiento espontáneo F1 (0,99 d- 1). Sin embargo, la cantidad final de ácido láctico producido (A), que estuvo comprendido entre 15,17 y 17,40 g/L, no estuvo influenciada por el uso de un cultivo iniciador. Tabla 5.11. Parámetros de ajuste obtenidos para los modelos de las características físicoquímicas más relevantes según los diferentes sistemas de fermentación. F1, tratamiento espontáneo, F2 inoculado con la cepa LAB2 y F3 inoculados con la cepa LAB4. La descripción de los parámetros del modelo se muestra en la sección de material y métodos. Características físico-químicas de las salmueras Parámetros de ajuste del modelo Tratamiento F1 F2 F3 Concentración total de azúcares D (g/L) -0,05 (0,05) 0,16 (0,16) 0,04 (0,06) S (g/L) 8,04 (0,74) 7,83 (0,04) 8,39 (0,72) K (d-1) 0,141 (0,021) 0,214 (0,009) 0,213 (0,062) pH D 3,67 (0,16) 3,82 (0,02) 3,79 (0,03) S 4,35 (0,20) 3,91 (0,42) 3,62 (0,21) K (d-1) 0,086 (0,014) 0,102 (0,017) 0,103 (0,000) Concentración de ácido láctico A (g/L) 17,22 (2,51) 15,17 (0,49) 17,40 (0,20) µ (d-1) 0,99 (0,14) 1,16 (0,16) 1,35 (0,24) λ (d) -0,13 (0,60) -0,04 (0,28) -0,86 (0,03) Acidez libre A (%) 0,93 (0,01) 0,81 (0,03) 0,86 (0,01) µ (d-1) 0,039 (0,008) 0,036 (0,000) 0,038 (0,001) λ (d) -1,249 (1,808) -1,843 (0,125) -2,506 (0,391) Concentración de ácido acético A (g/L) 1,83 (0,43) 1,85 (0,06) 1,95 (0,28) µ (d-1) 0,068 (0,013) 0,070 (0,006) 0,045 (0,016) λ (d) -12,07 (2,75) -11,62 (1,98) -23,01 (7,60) Nota: Desviación estándar entre paréntesis. La constante cinética de consumo de azucares también fue superior en los tratamientos inoculados que en él espontáneo, mostrando un baja concentración residual final de azucares en todos los casos (desde 0,00 hasta 0,16 g/L). La pro- RESULTADOS Y DISCUSIÓN __________________________________________________________________ 150 ducción de ácido acético, que se incrementa en fermentaciones heterofermentativas o dominadas por levaduras, fue reducida en relación a la de ácido láctico, con valores que variaron entre 1,83 (F1) y 1,95 g/L (F3), con unas velocidades de producción bajas, especialmente en el caso del tratamiento F3 (0,045 d-1). Finalmente, cuando el contenido en ácido fue evaluado como acidez libre (como habitualmente realiza la industria) se observa que el mayor valor asintótico se tiene para el tratamiento espontáneo (0,93%) y el menor valor para el tratamiento inoculado con LAB2 (0,81%). El contenido en etanol fue bajo para todos los tratamientos estudiados, con un valor máximo comprendido entre 0,3 y 0,4 g/L, aunque este parámetro no pudo ser modelado correctamente con ninguna ecuación matemática. Tabla 5.12. Color y textura instrumental de las aceitunas al final de la fermentación. F1 tratamiento espontáneo, F2 tratamiento inoculado con la cepa LAB2 y F3 inoculado con la cepa LAB4. Tratamiento Color Superficial Textura (N/100g de aceitunas deshuesadas) L* a* b* Ic F1 54,5 (0,3) a 2,54 (0,14) a 35,7 (0,1) a 27,0 (0,3) a 1.558 (223) a F2 53,9 (0,3) a 2,42 (0,15) a 35,0 (0,2) a 27,8 (2,1) a 1.377 (72) a F3 53,1 (0,4) a 2,51 (0,01) a 33,6 (0,2) b 26,3 (1,2) a 1.508 (123) a Nota: El valor entre paréntesis corresponde a la desviación estándar. Los valores en columnas con diferentes superíndices son significativamente (p<0,05) diferentes según el test de Scheffé. En cuanto a los parámetros de color (Tabla 5.12), los valores obtenidos oscilaron entre 53,1 y 54,5 para la luminosidad (L*), 2,42 y 2,54 para el parámetro a*, 33,6 y 35,7 para el parámetro b*, y 26,3 y 27,8 para el índice de color (Ic). Una vez aplicado el test de Scheffé, no se observaron diferencias significativas (p˂0,05) excepto para el parámetro b*, el cual fue significativamente menor en el tratamien-