Caracteríticas y funciones de las proteinas desestructuradas

UNIVERSIDAD DE SEVILLA FACULTAD DE FARMACIA CARACTERISTICAS Y FUNCIONES DE LAS PROTEÍNAS INTRINSECAMENTE DESECTRUCTURADAS Cristina Rodríguez Saucedo Trabajo de fin de grado FACULTAD DE FARMACIA GRADO EN FARMACIA CARACTERÍTICAS Y FUNCIONES DE LAS PROTEINAS DESESTRUCTURADAS Cristina Rodríguez Saucedo Sevilla, Septiembre 2016 Departamento de Bioquímica y Biología Molecular Tutora: Elisa Revilla Torres Revisión Bibliográfica 1 RESUMEN Las proteínas son macromoléculas que están presentes en casi todos los procesos que tienen lugar en el organismo. Siempre se ha creído que la desestructuración de una proteína conllevaba a la pérdida de su función, pero se ha podido comprobar que esto no es así. Existen proteínas intrínsecamente desestructuradas (PDIs), que van a tener una elevada flexibilidad, la cual les va a permitir adoptar estructuras desordenadas, esto no implica que no tengan una función. Aunque durante mucho tiempo la falta de plegamiento se consideraba una patología, se sabe ahora que ese rasgo no impide necesariamente la operatividad de la proteína. De hecho, a menudo resulta crucial para su funcionamiento. Las proteínas intrínsecamente desestructuradas son abundantes en organismos superiores, juegan un papel importante en la regulación de los organismos pluricelulares y su función depende de su flexibilidad. Esta plasticidad permite la integración de de señales complejas y la capacidad de evolucionar hacia nuevas funciones. En los últimos años se ha hallado una clara relación tanto en la prevención como en el desarrollo de diversas enfermedades y proteínas intrínsecamente desestructuradas. En humanos, se han relacionado con IDPs enfermedades tan comunes como el cáncer, enfermedades cardiovasculares, neurodegenerativas, el sida, la obesidad, la diabetes y la amiloidosis. Pero no todas las proteínas desestructuradas tienen efectos negativos para el organismo, así, la p53 (proteína parcialmente desestructurada) y p27 (proteína totalmente desestructurada) que intervienen en el control y regulación del ciclo celular. Palabras claves: estructura, proteínas, desestructuradas, relación estructuctura - función. 2 ÍNDICE 1. INTRODUCCIÓN………………………………………………………………….3 2. OBJETIVOS…………………………………………………………………………6 3. METODOLOGÍA………………………………………………………………… 6 4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN………………………………………………. 7 4.1. PROTEÍNAS INTRINSECAMENTE DESECTRUCTURADAS……………..7 4.2. MÉTODOS DE IDENTIFICACIÓN…………………………………………………7 4.3. CARACTERÍSTICAS GENERALES………………………………………………….8 4.4. EVOLUCIÓN………………………………………………………………………………9 4.5. FUNCIONES DE LAS PDIS…………………………………………………………..10 4.5.1. PDIs: Regulación del ciclo celular, cáncer y apoptosis….....11 4.5.2. PDIs y enfermedades neurodegenerativas………………….…21 4.5.3. Otras PDIs……………………………………………………………………...26 5. CONCLUSIONES…………………………………………………………..…..28 6. BIBLIOGRAFÍA………………………………………………………………...29 3 1. INTRODUCCIÓN Las proteínas son las macromoléculas más abundantes del organismo, participan prácticamente en todos los procesos que tienen lugar en el mismo. Hay una gran diversidad de proteínas; el conjunto de ellas, que se encuentran en una célula en unas condiciones determinadas se denomina proteoma. Esta gran diversidad funcional de debe a su diversidad estructural. Cada proteína va a tener una disposición de todos sus átomos que viene determinada por su secuencia de aminoácidos, en la cual es funcional. En el plegamiento específico de cada proteína intervienen las características físicas del entorno así como la presencia de compuestos simples o complejos que las estabilizan en dicha conformación estructural, la más estable y la de menor energía. A esta estructura se le denomina conformación nativa. Para alcanzar su conformación la proteína nativa debe plegarse durante y/o después de su síntesis. Cambios pequeños en el entorno de la proteína pueden acarrear cambios estructurales capaces de afectar a la función. Las estructuras proteicas han evolucionado para funcionar en entornos celulares concretos. Condiciones diferentes a las de la célula pueden provocar cambios grandes y pequeños en las estructura de la proteína. La pérdida de estructura tridimensional suficiente para originar la pérdida de la función se denomina desnaturalización. En la mayoría de condiciones las proteínas desnaturalizadas existen como un conjunto de estados parcialmente plegados de los que se sabe muy poco. Algunas proteínas experimentan un plegamiento asistido por la acción de las chaperonas moleculares (proteínas que interaccionan con polipéptidos parcial o incorrectamente plegados, facilitando rutas de plegamiento correctas o aportando microentornos en los que tenga lugar el plegamiento). (Nelson y Cox, 2006) A partir del descubrimiento de las primeras estructuras cristalográficas comenzó a establecerse la idea de que la función de cada proteína depende en gran medida de su estructura tridimensional, a tal grado que se postuló que: para que una proteína sea funcional, debe poseer una estructura tridimensional bien definida, idea que por muchos años ha prevalecido en muchas áreas de la ciencia. El paradigma de estructura-función fue totalmente aceptado por la comunidad científica durante muchos años. Los conceptos de estructuras secundarias como hélices alfa y láminas beta fueron ampliamente utilizados y se aceptaron como las unidades estructurales fundamentales de las 4 proteínas. Sin embargo a lo largo del tiempo se han encontrado proteínas a las cuales no se les ha podido asignar , con las metodologías especializadas, alguna estructura secundaria conocida , lo que generó la noción de que existen proteínas que carecen de una estructura estable ; es decir , que poseen una “estructura o plegamiento azaroso". A medida que ha aumentado el número de estructuras cristalográficas descritas, también han aumentado el número de proteínas con regiones con plegamientos azarosos, que varían en longitud y en número en una misma proteína. Esto ha sido un reto para el concepto clásico de estructura-función, ya que de acuerdo a este concepto, estas proteínas no tendrían función alguna; sin embargo ya se demostró que proteínas en las que abunda este tipo de plegamiento están involucradas en diferentes vías de señalización, algunas otras funcionan como factores transcripcionales, o bien son proteínas abundantes en algunos tejidos de diferentes organismos. Este cúmulo de evidencias, junto con el hecho de que son proteínas comunes en todas las especies ha llevado a abrir una nueva sección en el capítulo estructura-función de las proteínas, en el que se incluyen a este nuevo grupo de proteínas como “proteínas intrínsecamente desestructuradas“(PIDS o IDPS, DEL INGLES Intrinsically Disordered Proteins) o “proteínas no estructuradas” (PINEs o IUPs del inglés Intrisically Unstructured Proteins). Estas proteínas pueden contener regiones desordenadas y ser así parcialmente desordenadas, o carecer de un plegamiento estructurado en su conjunto. (Cuevas y Covarrubias, 2011). Las PDI / IDPRs son estructuralmente heterogénea, sus funciones pueden surgir a partir de una forma desordenada específica, de interconversión entre las formas desordenadas, y de transiciones entre desordenado a ordenada u ordenado a los estados desordenados. Además, un plegamiento dependiente de molde de algunas PDI define su capacidad para unirse a múltiples parejas, ganando estructuras muy diferentes en el estado de enlace, y no por ser capaz de poseer funciones no relacionadas, incluso opuestas. (Uversky, 2015). Sorprendentemente, algunos ejemplos de proteínas que en condiciones fisiológicas carecen de aparente estructura pero que realizan conocidas funciones, han ido apareciendo en la literatura científica en las últimas décadas. Estos ejemplos fueron en principio ignorados principalmente por desviarse del dogma estructura-función y sólo hace aproximadamente 10 años se ha empezado a aceptar la posibilidad de que proteínas sin estructura (desordenadas) puedan ser funcionales. (De Alba, 2012) (Figura 1) 5 Figura 1. Aumento del interés en proteínas desordenadas desde 1996 reflejado en el número de publicaciones científicas. (De Alba, 2012). Trabajos experimentales de finales del siglo XX han demostrado desordenes estructurales en proteínas y dominios de proteínas. En 1950, la espectroscopia de Raman mostró que la caseína de la leche no estaba plegada. Muchas proteínas no se podían cristalizar, pero estos problemas no tuvieron mucho peso porque muchas proteínas de las que se sabe la estructura, no se pudieron cristalizar. Dispersiones de proteína con rayos X de ángulo pequeño indicaron un inesperado gran tamaño, lo que ahora se sabe que era consecuencia de regiones sin estructura. También, un gran número de proteínas desarrollaron un comportamiento extraño, ya que a diferencia de las proteínas estructuradas, eran resistentes al calor. 6 2. OBJETIVOS Los objetivos de la revisión bibliográfica realizada en el presente TFG han sido obtener conocimientos sobre el paradigma de las proteínas estructura-función. También se analizará la información necesaria sobre la desestructuración de una proteína, que puede llevar a diferentes funciones, algunas relacionadas con diferentes patologías. Como último objetivo, se pretende aprender a manejar fuentes bibliográficas, ser capaz de elaborar un trabajo y tener la capacidad de exponerlo con la ayuda de la realización de una presentación con diapositivas. 3. METODOLOGÍA Anteriormente a la búsqueda de la bibliografía sobre el tema asignado para el TFG, comenzamos consultando libros sobre Bioquímica general y haciendo una lectura comprensiva de los conceptos generales y básicos de las proteínas. Para esto hemos usado diferentes libros. Cuando ya teníamos las ideas generales del tema, se unió la búsqueda a través de internet, usando el buscador Pubmed que nos proporciona la base de datos MEDLINE elaborada por la Biblioteca Nacional de Medicina de Estados Unidos. Usamos artículos disponibles que fueran completos y gratuitos y también buscamos a través de páginas de internet. Para nuestra búsqueda usamos palabras claves como por ejemplo: las siglas PDIs, proteína, regla estructura función, proteínas intrínsecamente desestructuradas, proteína. Y optamos por artículos que según nuestro punto de vista tenían más información y más valor para este tema y los que fueran más recientes. 7 4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 4. 1 .PROTEÍNAS INTRÍNSECAMENTE DESESTRUCTURADAS 4.2. MÉTODO DE IDENTIFICACIÓN DE LAS PDIS. La razón por la que las PDIs no se habían descubierto antes es porque para determinar la estructura tridimensional de una proteína se usaban métodos bioquímicos clásicos en los que había que homogeneizar la muestra donde se encontraba la proteína de interés. Al homogeneizar se dejan expuestas todas las proteínas a proteasas, y las que tengan dominios desordenados serán mucho más sensibles a estas condiciones y por lo tanto más difícil de estudiar. Las proteínas plegadas se pueden “ver” por difracción de Rayos X, así se han obtenido la mayor parte de las estructuras de proteínas. Para ello las proteínas deben formar cristales. Un cristal está formado por millones de moléculas idénticas ordenadas y empaquetadas de forma compacta .Podemos comparar un cristal con una formación de soldados uniformados o un panal de abejas formado por numerosas celdas idénticas. El éxito de la difracción de rayos X llevó a imaginar que todas las proteínas existentes adoptan una estructura tridimensional bien definida en su forma nativa. Ocasionalmente, se encontraban proteínas con comportamientos “anómalos” en el sentido que parecían no estar plegadas, pero eran consideradas casos patológicos o posibles artefactos experimentales. La investigación de casos aparentemente excepcionales, llevo a desarrollar herramientas informáticas capaces de predecir a partir de su secuencia, si una proteína adoptaría o no, una estructura tridimensional bien definida. Las proteínas desestructuradas, no forman cristales y por tanto son invisibles para la difracción de Rayos X. Otro método especializado para las PDIs sería la espectroscopia RMN de donde obtenemos una información más completa sobre la frecuencia de dominios desordenados, con este método no necesitamos cristalizar. Otro método utilizado es la espectroscopia de dicroísmo circular, donde tampoco hace falta cristalizar pero este método tiene la desventaja que no sirve para aquellas proteínas que contengan tanto regiones ordenadas como desordenadas. 14 Figura 4 (Nelson y Cox, 2006). La p53 se une por su carbono terminal a diferentes tipos de proteínas como por ejemplo la ciclina A (proteína de puntos de control del ciclo celular. Se une a su correspondiente quinasa dependiente de ciclina CdK2, participando en la progresión de la fase S o de síntesis del ciclo celular), según a la proteína a la que se una tendrá una estructura y una función característica (Figura 4). La información actual de la estructura tanto del tetrámero como del monómero de p53 proviene de datos obtenidos de estructuras resueltas de dominios individuales o de dominios interaccionando con proteínas y ADN (figura 5). No ha sido posible aun obtener una estructura completa de la proteína. Esto se debe a la presencia de zonas con estructura muy flexible y poco definida en alguno de los dominios que dificultan la determinación de la misma. (Segovia y cols, 2014) 15 Figura 5. Estructura de los dominios de unión al ADN del tetrámero de p53 unido a su secuencia concenso. Representación de la estructura cristalográfica de los 4 dominios de unión al ADN del tetrámero de p53. A B C y D corresponden a los distintos monómeros. Los átomos de Zinc se ven en amarillo. En rojo se resalan las bases del ADN correspondiente a la secuencia consenso del elemento de respuesta a p53. En el monómero B (cian) se señalan distintas estructuras secundarias del DBD (L: bucle, S: hebra, H: hélice α) y los extremos carboxilos (C) y amino (N) terminales. (Segovia y cols, 2014). Durante el ciclo celular, si el ADN es dañado se genera una señal que retrasa la entrada en la fase M y se genera un mecanismo que depende de la proteína p53, que se acumula en la célula en respuesta a las alteraciones del ADN, deteniendo el sistema de control en G1 y por tanto impidiendo la posterior entrada en mitosis. El gen p53 es uno de los genes supresores de tumores más conocido, que no solo detiene el ciclo celular, sino también participa en la apoptosis forzando a las células al suicidio cuando el daño 16 en el ADN es irreparable. Las mutaciones del gen p53 presentan una alta incidencia en la mayoría de los canceres humanos. Cuando el ADN presenta un daño “limitado”, aumentan los niveles de proteína p53. Dicha proteína activa la transcripción del gen p21, que codifica a la proteína p21. Esta última proteína ejerce su efecto inhibidor uniéndose al complejo ciclina-cdk2 y deteniendo el ciclo. Cuando el ADN es reparado, la proteína p53 se libera del promotor del gen p21, provocando el descenso en los niveles de p21. ADN DAÑADO  GEN p53 ↓ (La proteína p53 es un factor p53 De transcripción de p21) ↓ gen p21→ p21 ↓ P21 DETENCIÓN DEL CICLO ← Ciclina-cdk p21 (Marquez y cols ,2016) Por otro lado para crecer y producir metástasis, las células tumorales estimulan la angiogénesis, es decir, la formación de nuevos vasos sanguíneos. Se descubrió en cultivos de fibroblastos humanos que el gen supresor p53 evita ese proceso, mediante el estímulo de la producción de un inhibidor de la angiogénesis llamado trombospodina-1. Por ello la pérdida o deterioro del gen p53 estimula el progreso de la malignización. (Lozano, 2002) 17 Por otra parte, la mayoría de los tumores adquieren mutaciones en el gen supresor p53 a lo largo de la progresión. La pérdida de función de p53 provoca la caída de los niveles de trombospondina-1, liberando así a las células endoteliales del efecto inhibitorio de esta molécula. Los inhibidores naturales de angiogénesis juegan un papel fundamental en el mantenimiento del estado quiescente de la vasculatura. (Jiménez y cols, 2001). (Figura 6) Figura 6 (Silva y cols, 2002) Existe una batería de genes que son directamente regulados por p53 como factor de transcripción y cuya función está directamente implicada en la apoptosis. El más conocido es Bax, un miembro de la familia Bcl-2 que promueve la apoptosis celular. Este gen está inducido por p53 aunque no en todos los tipos celulares. Proteínas miembros de la familia de Bcl-2 se han visto que funcionan, al menos en parte, regulando la liberación de citocromo C de la mitocondria, un evento observable en la apoptosis dependiente e independiente de p53. Hay dos grupos de genes o proteínas reguladoras, los anti-apoptóticos como Bcl-2 y los pro-apoptóticos como Bax. 18 Figura 7 Proteína desordenada de la familia Bcl-2(en verde), anclada a una membrana celular, que adquiere una estructura al unirse a su diana molecular, en este caso una proteína con estructura (en rojo) de la misma familia. Los nombres de las proteínas se indican en la figura. Ambas clases están localizadas en las membranas intracelulares, especialmente de la mitocondria, y se ha visto que interaccionan entre ellas. El gen Bax tiene sitios de unión a p53 en su promotor y se regula positivamente en respuesta a daño en el DNA y p53 en varios sistemas. La introducción de Bax en células resulta en una muerte celular rápida que se puede inhibir por coexpresión de Bcl-2 y Bcl-X. De manera similar, la muerte mediada por p53 puede ser inhibida por Bcl-2/Bcl-X, lo que es consistente con un papel para Bax en la vía de muerte de p53. Sin embargo, Bax no está implicada siempre en la apoptosis mediada por p53 y no representa el único mecanismo de muerte celular dependiente de p53. (Kluck y cols, 1997) (Figura 7 y 8). 19 Figura 8 (Bates y cols, 1999) BCRA1 Y BCRA2 Otras proteínas parcialmente desestructuradas que participan en el ciclo celular son BCRA1 y BCRA2. Son genes supresores de tumores que intervienen en el ciclo celular dando lugar a proteínas parcialmente desestructuradas. BCRA 1(brazo largo Cr 17) Regula el ciclo celular evitando la proliferación descontrolada. BCRA 2(brazo largo Cr 13) Implicado en la regulación del daño cromosómico, regulando la proteína producida por el RAD51 para la regulación de errores de corte en el ADN. Ambas tienen múltiples funciones en respuesta al daño en el ADN: hacen de diana para la fosforilación (puntos de control), regulan la transcripción, el transporte intracelular y la función de la RAD51. 20 En el ciclo celular, BCRA1 Y BCRA2 forman un complejo activo en los sitios donde el ADN está dañado asegurando la estabilidad del material genético. Cuando uno de estos genes está mutado, el ADN no puede regularse adecuadamente. El complejo BCRA2 + RAD51 se une a BCRA1 al fosforilarse éste último, produciéndole una relocalización del complejo al área de replicación del ADN, regulado por la PCNA Y la p53. Si el BCRA (1 y/o 2) está mutado tras localizarse el complejo en el área de replicación, pueden darse dos situaciones: Que el complejo regulado por la PCNA (sin p53) falle en su función de reparación del ADN produciéndose: incremento de p53, inducción de p21, detención del ciclo celular y apoptosis (o muerte celular); o que el complejo regulado por la PCNA (con p53) falle en la regulación de p53 u otros puntos de control, produciéndose una proliferación celular (cáncer). (Figura 9). 21 Figura 9 (Bases moleculares, jueves 27 de Marzo 2014. Universidad de San Carlos Guatemala. Facultad de ciencias médicas.) 4.5.2 PDI Y ENFERMEDADES NEURODEGENERATIVAS Además de las proteínas intrínsecamente desestructuradas que participan en la división celular, en la red de señalización, en respuesta a daños producidos en el ADN, en la muerte celular programada, etc; existen proteínas desestructuradas o parcialmente desestructuradas que intervienen en diferentes patologías neurodegenerativas como por ejemplo la proteína priónica, la Tau y la α-sinucleína. 22 Proteína priónica. Una proteína desestructurada que causa patología es la proteína prionica. Un prion es una proteína infecciosa formada por una proteína denominada priónica capaz de formar agregados moleculares aberrantes. La proteína del prion es una sialoproteína patógena, la cual tiene alterada su estructura secundaria, teniendo un plegamiento incorrecto de su estructura terciaria. El plegamiento erróneo de la Prpc (estado no patógeno) a PrpSC, confiere a PrpSC dos propiedades que la diferencian de la Prpc : la resistencia parcial a la digestión por proteasas y su insolubilidad. Estas dos propiedades hacen que la PrpSC sea estable y la capacitan para poder formar agregados proteicos responsables de la acumulación de PrpSC en forma de placas amiloides en el tejido nervioso. Las principales diferencias entre la forma normal (Prpc) y la forma patógena (PrpSC) son: que la forma normal tiene estructura hélice α (4 regiones de proteína globular) y la forma patógena tiene estructura lamina beta (proteína plana); la forma normal es suceptible a proteasas y la patógena es resistente; la forma normal es una proteína monomérica estable, mientras que la patógena forma agregados proteicos que van a ser poco estable. Una proteína globular en forma de hélice alfa de una membrana neuronal entra en contacto con una proteína PrpSC (forma patógena), que actúa de agente infeccioso haciendo que la Prpc adquiera estructura plana en foema de lámina beta, es decir pasará a ser una PrpSC. Como consecuencia de este cambio conformacional, la nueva proteína no puede ser degradada y actúa como agente infeccioso sobre otros Prpc provocando el mal plegamiento de una manera exponencial. Este hecho es el causante de la acumulación de agregados de PrpSc en forma de placas amiloides, agregados proteicos patógenos que se acumulan en forma 23 de fibras insolubles y que matan las neuronas produciendo agujeros en el cerebro. Figura 10 Configuración normal y alterada de priones. La enfermedad del Alzheimer es una enfermedad neurodegenerativa donde también participan las proteínas intrínsecamente desestructuradas, las personas que padecen esta enfermedad presentan acumulaciones de depósitos proteicos con diferentes características morfológicas conocidos como depósitos amiloides, placas seniles y ovillos neurofibrilares. Las placas seniles y los ovillos neurofibrilares están formados por la proteína amiloide beta y la proteína Tau respectivamente. (De Alba y cols, 2012) Tau es una proteína desestructurada, mediante microscopía electrónica Tau aparece como una molécula alargada, con longitud aproximada de 35 nm. En solución, vista a través de rayos X, Tau no presenta una forma bien definida. Como otras proteínas, su molécula es descrita como un polímero desestructurado; en otras palabras, Tau en solución parece una proteína desnaturalizada. Tau puede ser tratada con desnaturalizantes (calor, ácidos diluidos) y no perder su actividad biológica. Estudio de espectroscopia mediante dicroísmo circular (CD) no proporcionan evidencia alguna de estructura secundaria regular como hélices alfa o láminas beta. (García y cols, 2004). Tau forma parte importante del citoesqueleto en neuronas; estabilizando microtúbulos, manteniendo la forma celular y como vía de transporte axonal. Sin 30 [Consultado en Junio 2016] http://es.covance.com/sdblog/dcovance/2013/11/tauphosphorylation/ Nelson, L., Cox, M. Principios de Bioquímica 4ª edición .Lehninger, OMEGA. 2006 p: 265-286 Nely,.M. La proteína alfa-sinucleína puede desencadenar el parkinson 9 de abril 2014. [Consultado en junio 2016]. http://nelyvivirelparkinsonenbaleares.blogspot.com/2014/04/la-proteina-alfa- sinucleina-puede.html Pons, M. SEBBM Divulgación. La ciencia al alcance de la mano.Las proteínas invisibles que nos hacen humanos. Instituto de investigación Biomédica del departamento de química orgánica de la Facultad de Química de Barcelona, Octubre 2011. [Consultado en junio 2016] https://issuu.com/argos/docs/nameeb0944 Puyol, X. El caso de la proteína Tau Revista Argentina de Clínica Neu-ropsiquiátrica, Año 16, Vol. 14, Nº 1, septiembre de 2007, págs. 81 a 85 Segovia, D. Clonado y Evaluación de la funcionalidad de mutantes sinónimos de Tp53 humano. Facultad de Ciencias UdeLaR. Universidad de la República (Uuguay) Sección Bioquímica y Biología Molecular. Febrero 2014. [Consultado en Junio 2016] http://www.bib.fcien.edu.uy/files/etd/pasan/uy24-17008.pdf Silva, A. Gutierrez del Arroyo, A., Arias, C., Lázaro, I. Estructura regulación y funciones del gen supresor de tumores p53. V Congreso virtual hispanoamericano de anatomía patológica, 2002. [Consultado en Junio 2016] http://www.uninet.edu/conganat/conferencias/C016/ Uversky,N. The multifacet roles of intrinsic disorder in protein complexes. FEBS Lett. 2015. 589, 15-22. Yruela, I. Proteínas desordenadas. En_ Sebastian. A, Pascual A (eds). (EEAD) Libros y partes de libros. Rayuela. 2014. 1, 333-347. 31 32