Evaluación de la liberación in vivo de iones metálicos a partir de aparatología ortodóncica en diversas matrices y sus potenciales efectos tóxicos

UNIVERSIDAD DE SEVILLA FACULTAD DE ODONTOLOGÍA DEPARTAMENTO DE ESTOMATOLOGIA ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! “EVALUACIÓN DE LA LIBERACIÓN IN VIVO DE IONES METÁLICOS A PARTIR DE APARATOLOGÍA ORTODÓNCICA EN DIVERSAS MATRICES Y SUS POTENCIALES EFECTOS TÓXICOS” ! Memoria que presenta la Licenciada ANA MARIA MARTIN CAMEÁN para optar al título de Doctor por la Universidad de Sevilla con la Mención Internacional ! ! ! Sevilla, 2015! ÍNDICE / INDEX Índice / Index I ÍNDICE / INDEX I. RESUMEN / Summary II. INTRODUCCIÓN / Introduction 1. APARATOLOGIA ORTODÓNCIA: ASPECTOS GENERALES / Orthodontic appliances: General aspects 2. CORROSIÓN. RESISTENCIA A LA CORROSIÓN / Corrosion. esistence corrosion 2.1. Tipos de corrosión 2.2. Resistencia a la corrosión 3. LIBERACIÓN DE METALES A PARTIR DE APLICACIONES ORTODÓNTICAS / Metals release from orthodontic appliances 3.1. Tipos de estudio: in vitro e in vivo 3.1.1. Estudios in vitro 3.1.2. Estudios in vivo 3.2. Técnicas analíticas, matrices y procedimientos para la evaluación de la liberación de metales a partir de aparatología ortodóncica. 3.2.1 Métodos de análisis 3.2.2. Matrices y procedimientos de preparación 4. IMPLICACIONES TOXICOLÓGICAS DERIVADAS DE LA LIBERACIÓN DE METALES A PARTIR DE APARATOLOGÍA ORTODÓNCICA /Toxicological implications derived of the release of metals from orthodontic appliances 4.1. Aspectos toxicológicos de los iones metálicos liberados de aplicaciones ortodóncicas 4.1.1. Níquel 4.1.1.1. Ni y sensibilización 4.1.2. Cromo 4.1.3. Cobre Índice / Index II 4.1.4. Cobalto 4.1.5. Hierro 4.2. Citotoxicidad de Aparatología ortodóncica 4.3. Genotoxicidad de Aparatología ortodóncica y su evaluación 5. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS III. JUSTIFICACIÓN Y OBJETIVOS / Significance and Purposes IV. RESULTADOS Y DISCUSIÓN / Results and Discussion CAPÍTULO 1/Chapter 1. Validation of a method to quantify titanium, vanadium and zirconium in oral mucosa cells by inductively coupled plasmamass spectrometry (ICP-MS). CAPÍTULO 2/Chapter 2. Development and validation of an inductively coupled plasma mass spectrometry (ICP-MS) method for the determination of cobalt, chromium, copper and nickel in oral mucosa cells. CAPÍTULO 3/Chapter 3. Biomonitorization of chromium, copper, iron,manganese and nickel in scalp hair from orthodontic patients by atomic absorption spectrometry CAPÍTULO 4/Chapter 4. In vivo determination of Aluminum, Cobalt, Chromium, Copper, Nickel, Titanium and Vanadium in oral mucosa cells from orthodontic patients with mini-implants by Inductively coupled plasma-mass spectrometry (ICP-MS). CAPÍTULO 5/Chapter 5. Evaluation of genotoxicity of orthodontic miniscrews on mucosa oral cells by the alkaline comet assay CAPÍTULO 6/Chapter 6. In vitro and in vivo evidence of the cytotoxic and genotoxic effects of metal ions released by orthodontic appliances: A review. Índice / Index III CAPÍTULO 7/ Chapter 7. Genotoxic, cytotoxic effects and gene expression changes induced by orthodontic fixed appliances over oral mucosa cells: a systematic review. V. DISCUSIÓN GENERAL / General Discussion 1. DESARROLLO Y VALIDACIÓN DE MÉTODOS DE DETERMINACIÓN DE IONES METÁLICOS EN CÉLULAS DE LA MUCOSA ORAL DE PACIENTES EN TRATAMIENTO ORTODÓNCICO / Development and validation of determination methods of metallic ions in oral mucosa cells of orthodontic patients 2. LA LIBERACIÓN IÓNICA EN PELO DEL CUERO CABELLUDO DE PACIENTES EN TRATAMIENTO DE ORTODONCIA: IDONEIDAD DE DICHA MATRIZ Y BIOMONITORIZACIÓN DE IONES METÁLICOS / Ionic release in scalp hair from orthodontic patients: Matrix suitability and biomonitorizaton of metal ions 3. LIBERACIÓN DE METALES IN VIVO Y POTENCIAL GENOTÓXICO DERIVADO DEL EMPLEO DE MICROTORNILLOS, EN CELULAS DE LA MUCOSA ORAL / In vivo metals release and potencial genotoxicity from miniscrews in oral mucosa cells VI. CONCLUSIONES / Conclusions Índice de Figuras y Tablas / Figures and Tables Index IV Figura 1. Diferentes tipos de corrosión que puede sufrir la aparatología ortodóncica (Chaturvedi, 2008) Figura 2. Apariencia del esmalte tras el descementado de un bracket metálico (a) y un bracket de plástico (b). La descoloración de la capa de adhesivo se atribuye a la difusión de productos de corrosión a partir de la base del bracket metálico o del arco de acero inoxidable, respectivamente (Eliades y Athanasios, 2002) Figura 3. Reacción positiva al ensayo (Pazzini y col., 2009) Figura 4. Inflamación eritematosa de la región anterior del labio inferior tras el cementado de brackets de acero inoxidable y la inserción de un arco de NiTi (Eliades y Athanasios, 2002) Figura 5. Manifestaciones extraorales de reacción alérgica al Ni (Schmalz, 2009) Figura 6. Dermatitis vesicular tras colocación de aparatología ortodóncica (Arenholt-Bindslev y col., 2009) Figuras 7-9. Micrografías fluorescentes de células de la mucosa oral del ensayo cometa. Fig. 7, célula sin daño en el ADN; Fig. 8, típica célula cometa con ADN dañado; Fig. 9, célula apoptótica (Faccioni y col., 2003). Tabla 1. Material ortodóncico con Ni en su composición (Eliades y col., 2002). Tabla 2. Concentración de metales liberados in vitro en medios de inmersión (nanogramos/mL) (tomada de Mikuliewicz y Chojnacka, 2011, modificada y contrastada con artículos originales) Índice de Figuras y Tablas / Figures and Tables Index V Tabla 3. Concentración de metales traza en fluidos de pacientes debido a la liberación de iones metálicos a partir de diferentes aparatologías ortodóncicas (Adaptado de Mikulewicz y Chojnacka, 2010; Matusiewicz, 2014) Tabla 4. Alternativas de tratamiento para aquellos pacientes con alergia al Ni (Eliades y Athanasios, 2002) Índice de Abreviaturas / Abbreviations Index VI ÍNDICE DE ABREVIATURAS / ABBREVIATIONS INDEX ADN: Ácido desoxirribonucleico AAS: Espectrometría de absorción atómica Al: Aluminio ATSDR: Agencia para Sustancias Tóxicas y el Registro de Enfermedades βTi: Beta Titanio Cd: Cadmio col: colaboradores CONTAM: Panel de Contaminantes en la Cadena Alimentaria de EFSA Cr: Cromo CRMs: Materiales de referencia certificados Cu: Cobre DL50: Dosis Letal -50 EC: Comisión Europea EFSA: Autoridad Europea de Seguridad Alimentaria EGVM: Expertos en Vitaminas y Minerales de Reino Unido Endo III: Endonucleasa III ERO: Especies reactivas de oxígeno Fe: Hierro g: gramos FPG: Formamidopirimidina glicosilasa GFAAS: Espectrometría de absorción atómica horno de grafito GPx: Glutatión peroxidasa Índice de Abreviaturas / Abbreviations Index VII GSH: Glutatión reducido HGF: Fibroblastos humanos gingivales H2O2: Peróxido de hidrógeno HNO3: Ácido nítrico IARC: Agencia Internacional para la Investigación sobre el Cáncer ICP-OES: Espectroscopia de emisión atómica de plasma acoplado ICP-MS: Espectrometría de Masas con Plasma Acoplado Inductivamente IDT: Ingesta Diaria Tolerable IgA: Inmunoglobulina A i.p.: intraperitoneal LA: Disolución de ácido láctico y acético, pH 2,5 LOD: Límite de detección LOQ: Límite de cuantificación LPO: Peroxidación lipídica mg: miligramo(s) MIM brackets: Metal Injection Molding Brackets mL: mililitro(s) MN: Micronúcleos Mn: Manganeso Mo: Molibdeno MTT: (3,-[4,5-dimetiltiazol-2-il]2,5difeniltetrazolio bromuro] NaCl: Cloruro sódico Ni: Níquel NiTi: Níquel Titanio Resumen / Summary 5 monitorización ambiental. A pesar de las numerosas ventajas que presenta el pelo en biomonitorización humana, los procedimientos analíticos para la determinación de liberación de metales en ortodoncia en dicha matriz son escasos, existiendo únicamente un estudio preliminar (procedimiento no validado, muy escaso número de pacientes) que demostró la no existencia de diferencias significativas en el contenido de algunos elementos metálicos en pelo de pacientes bajo tratamiento. Nuestro estudio se centró en la evaluación de niveles de Cu, Cr, Fe, Mn y Ni en pelo humano de una amplia población tratada con aparatología ortodóncica (n=70) para determinar, si la concentración de un metal dado estaba influenciado por el tratamiento ortodóncico en comparación a un grupo control (n=56). Los niveles de los compuestos metálicos se determinaron a través de espectrometría de absorción atómica (AAS), con diferentes modalidades, llama (Cu, Fe) y cámara de grafito (GF-AAS) (Cr, Mn, Ni). Se estudió la influencia de factores individuales (género, edad) en las concentraciones de metales, se estudiaron interacciones interelementales mediante la evaluación de coeficientes de correlación entre elementos, así como mediante un análisis de regresión múltiple. Las diferencias en el contenido metálico en pelo fue significativamente mayor sólo en el caso de Mn cuando se comparó con el grupo control, aunque los contenidos pueden considerarse de la misma magnitud que otras poblaciones control y, consecuentemente, no se asocian a riesgos debidos al tratamiento. El tratamiento de ortodoncia incrementó significativamente los niveles de Mn en pacientes jóvenes (<20 años) cuando se compararon con el grupo control. El análisis del pelo humano es un buen método para investigar la liberación de elementos a partir de la aparatología ortodóncica. Los resultados de este experimento dieron lugar a la siguiente publicación: BIOMONITORIZATION OF CHROMIUM, COPPER, IRON, MANGANESE AND NICKEL IN SCALP HAIR FROM ORTHODONTIC PATIENTS BY ATOMIC ABSORPTION SPECTROMETRY (Martín-Cameán A y col., 2014. Environmental Toxicology and Pharmacology 37:759-771) Resumen / Summary 6 Los microtornillos se utilizan, a día de hoy, habitualmente en los tratamientos de ortodoncia gracias a sus buenos resultados en la práctica clínica. Estos aditamentos se han popularizado ampliamente debido a su simplicidad en el manejo, bajo coste y la mínima necesidad de colaboración por parte del paciente. A pesar del elevado uso de los microtornillos en ortodoncia recientemente, los datos en la literatura ortodóncica en relación a su biocompatibilidad son muy escasos. Algunos metales propios de su composición como Ni y Cr pueden causar hipersensibilidad, dermatitis, asma y citotoxicidad. Así mismo, tienen un potencial genotóxico y carcinogénico significativo, efectos no relacionados con la dosis de exposición. La evaluación de los agentes genotóxicos se puede llevar a cabo mediante el análisis del daño de ADN primario, como se realiza en el ensayo cometa o “alkaline single cell gel electrophoresis”. Este ensayo es el método de elección para la medición de daño de ADN en células humanas en poblaciones expuestas a agentes genotóxicos. Hasta ahora, no existían estudios acerca del potencial genotóxico de los microtornillos en células de mucosa oral en humanos. Teniendo en cuenta la ausencia de estudios en este campo, el objetivo de nuestro estudio fue investigar el daño de ADN en células bucales de pacientes en tratamiento de ortodoncia mediante el ensayo del cometa en comparación con pacientes en tratamiento ortodóncico con microtornillos, y con respecto a un grupo control no tratado y un grupo de personas fumadoras (grupo control positivo). En el grupo de pacientes con tratamiento ortodóncico y en el de ortodoncia+microtornillos se obtuvo un incremento significativo (2 veces más) de %ADN en la cola del cometa en comparación con el grupo control. Las mujeres mostraron un aumento significativo del %ADN en todos los tratamientos en comparación con el grupo control, mientras que los hombres mostraron daño de forma significativa únicamente en el grupo de ortodoncia y microtornillo. En conclusión, la aparatología ortodóncica convencional induce genotoxicidad, y la incorporación Resumen / Summary 7 de los microtornillos estudiados no implica un aumento adicional de daño del ADN. Los resultados de este experimento dieron lugar a la siguiente publicación: EVALUATION OF GENOTOXICITY OF ORTHODONTIC MINISCREWS ON MUCOSA ORAL CELLS BY THE ALKALINE COMET ASSAY (Martín- Cameán A y col., 2014. Toxicology Mechanisms and Methods, aceptado abril 2015) Tras confirmar el efecto genotóxico de la aparatología ortodóncica y la inocuidad de los microtornillos en cuanto al daño celular adicional, quisimos cuantificar las diferencias en la liberación de metales como el aluminio (Al), cobre (Cu), cromo (Cr), manganeso (Mn), níquel (Ni), titanio (Ti) y vanadio (V) en células orales de pacientes bajo tratamiento ortodóncico convencional (brackets, bandas y arcos) en comparación con pacientes tratados adicionalmente con microtornillos, y con, respecto a un grupo control, utilizando ICP-MS. Las resultados obtenidos revelaron el siguiente orden ascendente: Cr < Ni < Ti < Cu < Al, y el Co y V fueron prácticamente no detectados. Se encontraron diferencias significativas en comparación con el grupo control para el Cu en el grupo ortodóncico, y para el Ni en ambos grupos, tanto grupo ortodóncico como grupo ortodoncia+microtornillo. Se realizaron correlaciones potenciales entre los elementos metálicos, encontrándose una correlación positiva Al/Ti, y en relación a varios factores clínicos. Se concluye que los microtornillos no incrementan de forma significativa la liberación de metales. Los resultados de este experimento dieron lugar a la siguiente publicación: IN VIVO DETERMINATION OF ALUMINIUM, COBALT, CHROMIUM, COPPER, NICKEL, TITANIUM AND VANADIUM IN ORAL MUCOSA CELLS FROM ORTHODONTIC PATIENTS WITH MINI-IMPLANTS BY INDUCTIVELY COUPLED PLASMA-MASS SPECTROMETRY (ICP-MS) (Martín-Cameán A y col., 2015. Enviado a Journal of Trace Elements in Medicine and Biology, en revisión) Para finalizar, teniendo en cuenta los resultados derivados de los experimentos realizados en la presente Tesis Doctoral, queda demostrada la liberación de iones metálicos a partir de aparatología ortodóncica, incluyendo Resumen / Summary 8 microtornillos, a partir de pelo y células de mucosa oral, y su componente genotóxico, contribuyendo de esta forma a ampliar el conocimiento que actualmente podemos encontrar en la bibliografía científica en relación a estos materiales. Resumen / Summary 9 Summary The biocompatibility of orthodontic appliances has been worth of research in the last years as it is closely related with the release of metallic ions in the human body and the induction of potential biologic effects. Inside the intraoral environment, during an orthodontic treatment, that usually takes 2-3 years, oral cells are in direct contact with the orthodontic appliance. Also, the oral cavity is an ideal place for corrosion processes, taking into account its characteristics such as humidity, pH and microbiology. Orthodontic appliances are composed by bands, brackets, arches and springs, among other devices. Along the years, orthodontic materials have evolved following the treatment needs, with the appearance of materials such as nickel-titanium alloy in the 70s, which contains 55% Ni and 43% Ti in its composition. This is used in the early stage of the treatment, for the alignment and leveling. Moreover, other materials have appeared, such as steel, ßTi and TMA (titanium-molybdenum-aluminum). With the aim of compiling the scientific orthodontic literature in relation to the release of metallic ions in the oral cavity, a review including the most recent studies dealing with metallic ions release and their toxic effects, with a special focus on cytotoxicity and genotoxicity, was performed. Previous studies suggest that a case by case evaluation is required, taking into account the increase of material’s variability, their composition and the different manufacturing processes. Also, in vivo toxicity studies are scarce. Therefore, further research should be performed to try to clarify the contradictory results available nowadays, as well as to elucidate the toxic mechanisms involved in the observed effects, particularly oxidative stress. On the other hand, in vitro and in vivo monitoring studies are required to establish cause-effect relationships between the release of metallic ions and cytotoxicity and genotoxicity biomarkers. The results obtained led to the following publication: Resumen / Summary 10 IN VITRO AND IN VIVO EVIDENCE OF THE CYTOTOXIC AND GENOTOXIC EFFECTS OF METAL IONS RELEASED BY ORTHODONTIC APPLIANCES: A REVIEW (Martín-Cameán A et al., 2015. Submitted to Environmental Toxicology and Pharmacology, under revision) ) Moreover, a systematic review has been performed in accordance with Preferred Reporting Items for Systematic Reviews and Meta-Analyses (PRISMA) guidelines. Electronic [CENTRAL,MedLine;SCOPUS; EMBASE, Cochrane Library, ISI Web of Science, PASCAL, OVID HealthSTAR, and EBM] and manual searches [OpenGrey; Google Scholar] were employed to analyze the genotoxic/cytotoxic effects of these types of oral appliances in humans. From the initial electronic search (27902), 17 articles were retrieved and 6 studies [low risk of bias(LRB)] finally met the eligibility criteria [PICOS]. Significant differences were observed by most of the studies (5 out of 6) regarding a critically acute detectable geno and cytotoxic effects after appliance using, in the short (at 1 and 3 months) and long term (24-48 months) evaluation. Nevertheless, some of the studies evaluating post-removable effects (2 out of 3) conclude that this effects at the DNA or cellular level were not statistically significant different to controls after removing the oral aggression. In conclusion, despite no further detection of these effects is described by a few studies after removing the appliances, additional rigorous randomized clinical trials are needed to explore to what extent no acquired damage is observed in the oral mucosa in the young target population (12-26 years old). The results obtained led to the following publication GENOTOXIC, CYTOTOXIC EFFECTS AND GENE EXPRESSION CHANGES INDUCED BY ORTHODONTIC FIXED APPLIANCES OVER ORAL MUCOSA CELLS: A SYSTEMATIC REVIEW. Martín-Cameán A et al., 2015. Submitted to Dental Materials (under revision) Different studies have evaluated the release of metallic ions from orthodontic appliances in biologic fluids. The release of elements has been measured mainly by Atomic Absorption Spectrometry (AAS), Inductively Coupled Plasma Atomic Emission Spectrometry (ICP-AES) or Inductively Resumen / Summary 11 Coupled Plasma Mass Spectrometry (ICP-MS). Most of them concluded that toxic concentrations are not reached in saliva and serum. However, non toxic concentrations can be enough to induce biologic effects in the oral mucosa. Due to the scarce research on the release of metals in oral mucosa cells, in direct contact with fixed orthodontic appliances in orthodontic patients, and the lack of validation data available, we considered important to develop and optimize an analytical procedure to determine titanium (Ti), vanadium (V), zirconium (Zr), cobalt (Co), chromium (Cr), copper (Cu) and nickel (Ni) in oral mucosa cells from patients with and without orthodontic treatment by ICP-MS. The analytical procedure is based on the extraction and digestion of the samples in acid conditions and quantification of the elements simultaneously. The method was properly validated: the regression equation was calculated from standards prepared with the same matrix without oral mucosa cells and the linear range was 0.5-50.0 ng/mL for Zr, 5.0-50.0 ng/mL for Ti and V, and 2.0-100.0 ng/mL for Co, Cr, Cu and Ni. Detection limits were 0.9, 2.8 and 0.4 ng/mL for Ti, V and Zr, respectively, and 0.10, 0.38, 0.49 and 0.67 ng/mL for Co, Cr, Cu and Ni, respectively. Quantification limits were 1.8, 3.4 and 0.7 ng/mL for Ti, V y Zr, respectively, and 0.20, 1.13, 0.98 and 1.81 ng/mL for Co, Cr, Cu y Ni, respectively. Recovery percentages (%) obtained ranged between 101-108 for Ti, 98-111 for V, 92-104 for Zr, 104-109 for Co, 103-107 for Cr, 106-113 for Cu and 84-110 for Ni. Intermediate precision data (RSD%) were adequate for all the elements at the three concentration levels selected. The present method showed to be robust for the three factors considered: heating time, volume of the deionized water, and volume of PlasmaPure 65% HNO3 used to dilute the samples, which permits its validation and application to oral mucosa cells from orthodontic patients. The validated methods were successfully applied to the determination of the above mentioned metallic ions in 40 patients, 20 of them under an orthodontic treatment (13-15 months) and 20 control subjects. Results obtained were evaluated and significant higher levels of Co, Cr, Cu and Ni were found in the Resumen / Summary 12 orthodontic group in comparison to the control group. The concentrations detected were lower than the Tolerable Daily Intake (TDI) (Ni, Co) or to the Tolerable Upper Intake Levels (UL) established for the selected elements (Cr, Cu). The results of these experiments led to the following publications: VALIDATION OF A METHOD TO QUANTIFY TITANIUM, VANADIUM AND ZIRCONIUM IN ORAL MUCOSA CELLS BY INDUCTIVELY COUPLED PLASMA-MASS SPECTROMETRY (ICP-MS) (Martín Cameán A et al., 2014. Talanta 118:238-244) DEVELOPMENT AND VALIDATION OF AN INDUCTIVELY COUPLED PLASMA MASS SPECTROMETRY (ICP-MS) METHOD FOR THE DETERMINATION OF COBALT, CHROMIUM, COPPER AND NICKEL IN ORAL MUCOSA CELLS (Martín-Cameán A et al., 2014. Microchemical Journal 114:73-79) The oral cavity is particularly an ideal environment for the biodegradation of metals due to its ionic, thermal, microbiologic and enzymatic properties. In this context, the orthodontic alloys emit electrogalvanic currents with saliva, and consequently, release metal ions to the oral mucosa. Different factors influence the ionic release, such as the manufacturing process, type of alloy, superficial characteristics of the material and the alloy ageing. Metals are not biodegradable substances and their constant release can lead to irreversible toxic effects due to their accumulation into tissues. The human scalp hair is an excretion vehicle for different compounds (heavy metals, drugs of abuse, etc.) and this non invasive matrix is considered as one of the most important biologic materials for environmental monitoring. In spite of the high number of advantages that the hair has for human biomonitoring purposes, the analytical procedures for the determination of metal release from orthodontic appliances in this matrix are scarce. To the extent of our knowledge there is only one preliminary study (not validated, with a short number of patients) that showed that there were no significant differences in the content of some metallic elements in hair from patients with orthodontic treatment. Resumen / Summary 13 Our study focused on the evaluation of Cu, Cr, Fe, Mn and Ni contents in the scalp hair of a wide population under orthodontic treatment (n=70) to determine whether the concentration of a particular metal was influenced by the orthodontic treatment in comparison to the congrol group (n=56). Metallic ions contents were determined by Atomic Absorption Spectrometry (AAS) with different variants, flame (Cu, Fe) and graphite furnace (GF-AAS) (Cr, Mn, Ni). The influence of individual factors (sex, age) on the metal concentrations was studied. Also, interelemental interactions were studied by evaluation of the correlation coefficients between elements, and by a multiple regression analysis. Differences in the metallic content in scalp hair were only significantly higher for Mn in comparison to the control group, but its contents were similar to those found in other control populations, and therefore they are not associated to the treatment. The orthodontic treatment increased significantly Mn content in young patients (<20 years) in comparison to the control group. The analysis of scalp hair is a good method to investigate the release of elements from orthodontic appliances. The results obtained in this experiment were published in the following manuscript: BIOMONITORIZATION OF CHROMIUM, COPPER, IRON, MANGANESE AND NICKEL IN SCALP HAIR FROM ORTHODONTIC PATIENTS BY ATOMIC ABSORPTION SPECTROMETRY (Martín-Cameán A et al., 2014. Environmental Toxicology and Pharmacology 37:759-771) Miniscrews are frequently used nowadays in orthodontic treatments due to their good results in the clinical practice. The use of these devices has been widely extended due to their simple use, low cost and almost no need of the patient cooperation. In spite of their wide use in the last years, data in the orthodontic literature in relation to their biocompatibility are very scarce. Some characteristic metals of their composition, such as Ni and Cr can cause hypersensitivity, dermatitis, asthma and cytotoxicity. Also, they have a significant genotoxic and carcinogenic potential, effects that are not related with the dose of exposure. Resumen / Summary 14 The evaluation of genotoxic agents can be performed by the analysis of primary DNA damage, such as the application of the comet assay or “alkaline single cell gel electrophoresis”. This assay is the selected method for detecting DNA damage in human cells in populations exposed to genotoxic agents. Up to now, there were no studies regarding the genotoxic potential of miniscrews in human oral mucosa cells. Taking into account the lack of studies in this field, the aim of our study was to investigate the DNA damage in buccal cells from orthodontic patients by using the comet assay, in comparison to patients with orthodontic appliances and miniscrews and in comparison with a control (non treated) group and a group of smokers (positive control group). The orthodontic and the orthodontic + miniscrew groups showed a significant and similar increase (2-fold) of the %DNA in tail in comparison to the control group. Women showed a significant increase in the % DNA in all treatments in comparison to the control group, whereas men showed significant changes only in the orthodontic + miniscrew group. In conclusion, conventional orthodontic appliances induced genotoxicity and the incorporation of the miniscrews selected to the treatment does not result in a higher increase of DNA damage. The results of this experiment were published in the following manuscript: EVALUATION OF GENOTOXICITY OF ORTHODONTIC MINISCREWS ON MUCOSA ORAL CELLS BY THE ALKALINE COMET ASSAY (Martín- Cameán A et al., 2014. Submitted to Toxicology Mechanisms and Methods, under revision). Once the genotoxic effect of orthodontic appliances was confirmed and also that miniscrews did not increase this damage, we aimed to quantify the differences in the released content of metals such as aluminum (Al), copper (Cu), chromium (Cr), manganese (Mn), nickel (Ni), titanium (Ti) and vanadium (V) in oral cells from patients with a traditional orthodontic treatment (brackets, bands and arches) in comparison to patients treated additionally with miniscrews, and in comparison to a control group, by ICP-MS. The results obtained showed the following increasing trend: Cr < Ni < Ti < Cu < Al, and Co and V were Introducción / Introduction 20 Johansson, 1977). Las propiedades electroquímicas de la saliva dependen de las concentraciones de sus componentes, pH, tensión superficial y su capacidad buffer (tampón). Con ello, podemos decir que la magnitud del proceso de corrosión resultante puede estar controlado por estas variables (Chaturvedi, 2008). Los productos que se liberan pueden ser tragados por el paciente, o bien, se pueden adherir a las superficies mucosas o dentarias (Janson y col., 1998), Una serie de factores puede influir en la corrosión de una aleación que se utilice en materiales dentarios (Lucas y Lemons, 1992; Macedo y Cardoso 2010): - Composición de la aleación (particularmente en la superficie) - Fases en la estructura de la aleación-estructura de la superficie (rugosidad, presencia de óxidos) - Superficie (fisuras, hoyos, etc.) - Tratamiento térmico - Combinaciones de aleaciones - Tiempo de servicio 2.1. Tipos de Corrosión Existen diversas formas de corrosión que afectan a las aleaciones utilizadas en arcos con fines ortodóncicos (Eliades y Athanasios, 2002): 1. Corrosión uniforme: (“Uniform attack”) Es el tipo de corrosión más común, que ocurre en todos los metales en diferentes cantidades. El proceso se origina a partir de la interacción de metales con el medio ambiente, produciendo la consecuente formación de hidróxidos y compuestos organometálicos. Un requisito fundamental en este tipo de corrosión es que el medio corrosivo debe tener el mismo acceso a todas las partes de la superficie, presentando el metal una uniformidad en cuanto a su composición y metalurgia. Este tipo de corrosión no se detecta hasta que se disuelven elevados niveles de metal (Chaturvedi, 2008; Eliades y Athanasios, 2002). 2. Corrosión por picadura/hoyo/fosa (“Pitting Corrosion”) Este es uno de los tipos de corrosión que tienen lugar en los brackets y arcos. Un hoyo/picadura/fosa se considera un poro con una profundidad igual a su anchura. Sorprendentemente, el proceso de corrosión comienza antes de ser Introducción / Introduction 21 colocado en el medio intraoral ya que se han encontrado superficies porosas en productos sin utilizar (Papadopoulos y col., 2000). Las superficies de arcos de acero inoxidable y NiTi previos a ser utilizados presentan grietas y poros. Dichos poros favorecen el ataque ya que representan superficies susceptibles a la corrosión. En arcos compuestos de acero inoxidable, CoCr, NiCr, NiTi, y ßTi expuestos a corrosión electroquímica en saliva artificial se han observado evidencias de la formación de “pitting corrosion” sobre sus superficies (Oshida y col., 1992; Barret y col., 1993). Estudios electroquímicos han demostrado, igualmente, que este tipo de corrosión ocurre en los arcos de NiTi en una solución salina al 1%. Sin embargo, recordemos que muchos de los poros presentes en este tipo de arcos proceden del proceso de fabricación (Brantley, 2000). 3. Corrosión de grietas (“Crevice Corrosion or Gasket Corrosion”): Este tipo de corrosión ocurre entre dos superficies o en zonas constreñidas donde el intercambio de oxígeno no es posible (Chaturvedi, 2008). Tiene lugar al poner en contacto estructuras no metálicas y un metal, como es el caso de una ligadura elastomérica sobre un bracket, produciéndose debido a las diferencias en iones metálicos o en concentración de oxígeno entre la grieta y sus alrededores. En el material clínico, la profundidad de las fisuras puede alcanzar 2-5 mm, perforando la base del bracket, llegando, por tanto, a alcanzar altos niveles de metales disueltos. El ataque puede producirse debido a la falta de oxígeno en asociación a la formación de placa y bioproductos de la microflora, los cuales agotan el oxígeno alterando la regeneración de la capa pasiva de óxidos de Cr (Olefjord y Wegrelius, 1990; Eliades y Athanasios, 2002). La reducción del pH y el incremento en la concentración de iones cloruros son dos factores esenciales en la iniciación y en la propagación del fenómeno de corrosión de grietas. A medida que la acidificación del medio aumenta en el tiempo, la capa pasiva de la aleación se disuelve, acelerándose, con ello, el proceso de corrosión local (Chaturvedi, 2008). Introducción / Introduction 22 La corrosión de grietas y la disolución de Ni de las regiones cercanas han sido investigadas, a su vez, en arcos de distintos materiales (Nitinol, acero inoxidable, Elastinol) in vitro por Grimsdottir y col. (1992). Sin embargo, estos cambios de composición se han registrado en grietas tanto en arcos de NiTi nuevos como los usados, implicando, por ello, la posibilidad de considerar los defectos de fabricación. Se observaron varias diferencias importantes en la morfología de la superficie entre ambos tipos de arcos. La superficie de las regiones acopladas a la ranura del bracket se mostraba excesivamente desgastada y se observaron patrones característicos de delaminación. El deterioro aumentado de esta región específica puede atribuirse a las fuerzas compresivas que se dan en la activación del arco a través del ligado y al posible daño friccional que se produce en el interior de la ranura. 4. Corrosión Galvánica (“Galvanic Corrosion”): Este tipo de corrosión es la disolución de metales provocada por diferencias macroscópicas en sus potenciales electroquímicos, generalmente ocasionado por la proximidad de dos metales diferentes (Chaturvedi, 2008). Cuando dos o más metales distintos entran en contacto, o bien, las mismas aleaciones pero sujetas a diferentes tratamientos mientras se exponen a fluidos orales, tiene lugar un proceso combinado de oxidación y disolución debido a la diferencia entre sus potenciales de corrosión (Eliades y Athanasios, 2002). El metal menos noble se oxida y se convierte en ánodo, dando lugar a la liberación de electrones de algunos átomos y produciendo iones solubles (Merritt y Brown, 1995). El metal más noble se convierte en cátodo y es más resistente a la corrosión con respecto al menos noble (Eliades y Athanasios, 2002). En una situación clínica, este fenómeno tiene lugar al poner en contacto brackets y arcos ortodóncicos (Chaturvedi, 2008). El acero inoxidable se caracteriza por un comportamiento activo-pasivo dependiendo de las condiciones medioambientales en las que la capa de óxido de cromo será!eliminada (forma activa) o regenerada (forma pasiva). Por ello, la Introducción / Introduction 23 corrosión galvánica tiene lugar dependiendo del estado del acero inoxidable (Eliades y Athanasios, 2002). !! Reed y Willman (1940) demostraron por primera vez, con detalle, la presencia de corrientes galvánicas en la cavidad oral, estableciendo magnitudes aproximadas de los iones liberados. Iijima y col. (2006) investigaron la corrosión galvánica en la combinación de dos tipos de brackets (Ti y stainless steel, SS) con diversos materiales de arcos (NiTi, CrCoTi, SS y βTi). Demostraron que la unión de la aleación de NiTi con SUS 304 o Ti exhibía una densidad de corriente galvánica relativamente alta incluso tras 72 horas. Se ha sugerido que la combinación de SUS 304-NiTi y Ti-NiTi acelera marcadamente la corrosión de aleaciones de NiTi, actuando este último como ánodo. En la combinación de aleaciones de NiTi con Ti, el Ti actúa como ánodo y se corroe en los primeros estadíos; sin embargo, la polaridad es inversa después de la primera hora, dando lugar a la corrosión de NiTi. Las diferencias en las proporciones de áreas entre ánodo-cátodo utilizados en este estudio tuvieron muy poco efecto en el comportamiento de corrosión galvánica. Estudios previos (Iijima y col., 2001) han demostrado que la película de óxido existente en los arcos comerciales de NiTi, formada por el proceso de fabricación con calor, da lugar a un incremento de la resistencia a la corrosión. Sin embargo, otros estudios anteriores (Yuasa y col., 2004) que miden el potencial de corrosión libre en una solución de NaCl al 0,9% en arcos ortodóncicos, brackets y coil Springs, demostraron que los brackets fabricados a partir de dos piezas a través de soldadura poseen un potencial de corrosión mucho menor en comparación con aquellos brackets de una sola pieza, ya que el punto de contacto entre la ranura y la base del bracket es susceptible de corrosión localizada. 5. Corrosión Intergranular (“Intergranular Corrosion”): Los brackets de acero inoxidable que se encuentran bajo un rango de temperatura, conocidos como temperaturas de sensibilización, dan lugar a una Introducción / Introduction 24 alteración de su microestructura. Este fenómeno se debe a la precipitación de carburo crómico en los límites de los granos (Eliades y Athanasios, 2002). Como resultado, los alrededores de los granos y regiones adyacentes poseen a menudo menor resistencia a la corrosión, provocando un mayor grado de corrosión en estas zonas (Chaturvedi, 2008). A diferencia de la corrosión uniforme y de fisuras, este tipo de corrosión afecta principalmente a la solubilidad del carburo de cromo (Eliades y Athanasios, 2002). 6. Corrosión fretting y erosión-corrosión (“Fretting and Erosion- Corrosion”): La combinación de un fluido corrosivo y una elevada velocidad de flujo da lugar a fenómenos de erosión-corrosión. El propio estancamiento o la disminución de la velocidad de fluidos causarán una tasa de corrosión baja o moderada, pero el movimiento rápido del fluido corrosivo físicamente erosiona y elimina la película protectora a la corrosión, exponiendo la aleación reactiva subyacente y acelerando la corrosión. La corrosión fretting es un tipo de erosión-corrosión. Se refiere al proceso que ocurre en las áreas de contacto de materiales bajo carga, encontrando su análogo en la interfase entre arco y ranura del bracket. Es la responsable de la mayor parte de liberación de metales en los tejidos, existiendo una acción conjunta de ataque químico y mecánico (Chaturvedi, 2008). Resulta interesante resaltar que la aparición de esta corrosión es muy diferente de la superficie típica del arco producida en métodos de envejecimiento in vitro tras la aplicación de soluciones de saliva artificial o electrolíticas. Alternativamente, la mayoría de los metales están cubiertos por una fina capa de óxidos que se altera y produce desechos de óxidos, produciendo una oxidación acelerada (Eliades y Athanasios, 2002). Introducción / Introduction 25 7. Corrosión Microbiológicamente Influenciada (“Microbiologically influenced corrosion”): Matasa (1995) fue el primero en mostrar evidencias del ataque microbiano a los adhesivos en el campo ortodóncico. Sin embargo, anteriormente se había informado acerca del efecto de la actividad enzimática y la degradación de las resinas de composite. La aplicación ortodóncica se caracteriza por la formación de cráteres en la base del bracket (Eliades y Athanasios, 2002). Diferentes estudios corroboran que las bacterias sulfato y nitratoreductoras son agresivas e inflamatorias para los tejidos huéspedes, así!como el hecho de que estas bacterias también afectan los procesos de corrosión de diversas aleaciones (Margelos y col., 1991). Durante el ataque microbiano a las aplicaciones metálicas ortodóncicas se generan diversos ácidos en el medio intraoral. En la superficie de los dientes se crea un biofilm con la ayuda de restos alimenticios y productos del metabolismo microbiano. Los microorganismos aeróbicos utilizan azúcares simples en el proceso de glicolisis, liberando CO2. Generalmente, los facultativos quimioorganotropos utilizan los azúcares y producen ácidos orgánicos, alcoholes y CO2. En condiciones anaeróbicas, los quimioorganotropos, como las Bacteria Reductoras de Sulfato (Sulphate Reducing Bacteria, SRB) utilizan lactato como fuente de carbón, reduciendo el sulfato a sulfuro. Finalmente, el sulfuro se combina con iones de hierro para formar sulfuro ferroso como producto de corrosión final. En presencia de Bacterias Oxidativas de Sulfato (Sulphate Oxiding Bacteria, SOB), el sulfuro se oxida a sulfato. En la cavidad oral, el hidrógeno se combina con sulfato para formar ácido sulfúrico, siendo éste mucho más corrosivo. El pH reducido, producido por la formación de ácido, influye en la descalcificación de los dientes y en la corrosión de los aparatos ortodóncicos (Chaturvedi, 2008). Debido a la deposición del biofilm, la superficie del metal bajo éste está!expuesta a diferentes cantidades de oxígeno en comparación a otras áreas. Las zonas con menor disposición de oxígeno actúan como ánodo, la cual da lugar a la corrosión, liberando iones metálicos a la saliva. Estos iones metálicos se combinan con los productos finales de las bacterias en la Introducción / Introduction 26 saliva actuando ésta como electrolito, dando lugar a productos de mayor corrosión, como MnCl2, FeCl2, entre otros (Maruthamuthu y col., 2005). La incidencia y la severidad de la corrosión microbiana puede reducirse manteniendo dicho área lo más limpia posible, así!como con la utilización de sprays antibióticos, con el fin de reducir las poblaciones de microorganismos. Chang y col., (2003) demostraron el incremento de la corrosión de los materiales dentales metálicos en presencia de Streptococcus mutans y sus subproductos de crecimiento. Maruthamuthu y col., (2005) estudiaron el comportamiento electroquímico de los microorganismos en los arcos ortodóncicos en saliva artificial con y sin saliva. De acuerdo con su estudio, las bacterias reducen levemente la resistencia e incrementan la corriente de corrosión. La liberación de Mn, Cr, Ni y Fe de los arcos ortodóncicos se debe a la existencia de factores oxidativos de Mn, factores oxidativos de Fe y bacterias heterotrópicas en la saliva (Chaturvedi, 2008). 8. Corrosión por estrés (“Stress Corrosion”): Cuando ligamos un arco a brackets en casos de apiñamientos severos, se incrementa el estado de reactividad de las aleaciones. La reactividad aumentada resulta de la generación de estrés de tensión y compresión que se desarrolla localmente debido a la sobrecarga multiaxial y tridimensional del arco. En consecuencia, se produce una diferencia de potencial electroquímico, con unas zonas específicas actuando como ánodos y, otras, como cátodos (Eliades y Athanasios, 2002). Wang y col. (2007) estudiaron el agrietamiento debido a la corrosión por estrés del NiTi en saliva artificial y demostraron que los arcos ortodóncicos de NiTi se fracturaban por el agrietamiento de la corrosión por estrés durante su uso. 9. Fatiga de Corrosión (“Corrosion Fatigue”): Un proceso importante en el envejecimiento de las aleaciones ortodóncicas es la tendencia del metal a la fractura bajo situaciones de estrés cíclico de Introducción / Introduction 27 repetición. Este proceso de fatiga se acelera debido a la reducción de la resistencia inducida por la exposición a un medio corrosivo como la saliva. Este fenómeno ocurre frecuentemente en arcos que permanecen en el medio intraoral durante extensos periodos de tiempo bajo carga y, por lo general, se caracteriza por la suavidad en las áreas de fractura, las cuales incluyen, a su vez, zonas de rugosidad aumentada, así!como de apariencia cristalina (Eliades y Athanasios, 2002). En la Figura 1 se muestra un esquema de los distintos tipos de corrosión anteriormente citados. Figura 1. Diferentes tipos de corrosión que puede sufrir la aparatología ortodóncica (Chaturvedi, 2008). 2.2. Resistencia a la corrosión Los estudios más recientes se han centrado en las alteraciones de arcos de NiTi, así!como en el análisis de su superficie interna. Se ha encontrado que las superficies de los materiales están cubiertas de unos tegumentos proteínicos que enmascaran la topografía de superficie de la aleación, dependiendo de las condiciones medioambientales orales de cada paciente individualmente y del periodo de exposición intraoral. Estos filamentos proteínicos constituyen el Introducción / Introduction 28 denominado biofilm. Los constituyentes orgánicos de la película adquiridos sobre la superficie de la aleación fueron amida, alcohol y carbonato, mientras que las especies elementales predominantes fueron sodio, potasio, cloruro, calcio y fósforo. La distribución elemental del biofilm consiste en la formación de cloruro sódico, cloruro potásico y el fosfato cálcico cristalino que, posteriormente, precipita en la superficie del arco. Las regiones mineralizadas proporcionan un efecto protector sobre el sustrato de la aleación, especialmente bajo condiciones de pH disminuido, en las que la corrosión de acero inoxidable y NiTi está! aumentada (Eliades y Athanasios, 2002). La adsorción y calcificación del biofilm proporciona una película interna protectora, reduciendo de este modo la incidencia de la respuesta inmune del huésped ya que se disminuye la exposición de la superficie de la aleación al ambiente oral. Esta formación del biofilm proporciona la denominada “Resistencia a la Corrosión”. El deterioro de la resistencia a la corrosión de los arcos ortodóncicos tiene dos consecuencias: o Pérdida de las propiedades físicas, las cuales juegan un papel muy importante en el éxito del tratamiento clínico. o Liberación de iones de Ni, los cuales pueden ser, como ha sido demostrado, tóxicos, e incluso, causar reacciones alérgicas. Aunque las disoluciones para los ensayos suelen tener pH 6-7, en la cavidad oral el pH usualmente oscila entre 4-5,5, y después de una comida, en determinadas zonas incluso se logran pH inferiores. Por ello, se ha estudiado como varía la resistencia a la corrosión en función de la acidez del medio. En concreto, el estudio realizado por Huang (2003) demostró que la resistencia a la corrosión disminuye de forma significativa con la acidificación del medio en el que se encuentren. Se analizaron cuatro arcos de NiTi inmersos en saliva artificial Fusayama modificada, diferentes pH: 2.5, 3.75, 5.0 y 6.25, manteniéndolos a 37º durante 1, 3, 7, 14 y 28 días, y determinaron mediante Espectroscopía de absorción atómica (AAS) la cantidad de iones de Ni y Ti liberados. Se conluyó Introducción / Introduction 29 que tanto la fabricación, el pH, como el tiempo de inmersión tenían una influencia estadísticamente significativa en la liberación de iones de Ni y Ti de los arcos NiTi sin utilizar. La liberación de los iones metálicos se incrementó con el tiempo de inmersión en todas las soluciones estudiadas, siendo la media de iones liberados mucho menor que en la solución a pH 2.5. En pH=2.5 la cantidad de iones de Ni liberados era de magnitud muy similar a la de los iones de Ti liberados; sin embargo, en la solución de pH ≥ 3, 75 la cantidad de iones de Ti liberados fue mucho menor en comparación con los de Ni, siendo en ambos casos inferiores a la concentración crítica considerada necesaria para producir alergia (600-2500 µg) y a la ingesta dietética diaria de 300-500 µg. Las diferencias en la resistencia a la corrosión entre arcos de diferentes fabricantes pueden deberse a variaciones en la caracterización de su superficie, tales como la topografía de su superficie y técnicas de procesado para su producción. Los defectos preexistentes de fabricación en la superficie de los arcos de NiTi son sitios preferentes para la corrosión, mientras que los arcos de NiTi con una superficie más áspera no mostraron una liberación iónica mayor. Por último, en relación a la liberación de iones de Ti, la película pasiva (generalmente de TiO2) de los arcos de NiTi resultó muy protectora frente a la corrosión en la saliva artificial levemente acidificada. En los arcos NiTi, los riesgos potenciales de la corrosión están ligados a los efectos del Ni, pero un aumento de la liberación de iones Ti indica el deterioro de la película protectora de su superficie, y ello puede conducir a un aumento de la liberación de iones Ni (Huang, 2003). Las aleaciones de alto contenido en Au son extremadamente resistentes a la corrosión debido a su estabilidad termodinámica (Canay y Oktermer, 1992). La resistencia a la corrosión en aparatología ortodóncica es importante para la prevención de la liberación iónica en la cavidad oral. Los brackets metálicos se diseñan con diferentes aleaciones de acero inoxidable entre la base y las aletas, siendo posteriormente unidos a través de aleaciones de plata, oro o Ni (Zinelis y col., 2004). La aleación de la base del bracket es un metal más suave Introducción / Introduction 36 bucal que se debe prescribir a los pacientes, dependiendo de la fase del tratamiento en que se halle y de la aleación. Los medios que contienen fluoruros penetran en los espacios estrechos existentes entre arco y bracket, donde no se puede llevar a cabo una completa limpieza. Las concentraciones tópicas de alto contenido en fluoruro se disponen en dichos espacios y atacan la interfase arco/bracket, en función de la concentración de fluoruros. Este fenómeno incrementa la fricción entre ambas superficies. La utilización de agentes tópicos fluorados al mismo tiempo que arcos NiTi puede disminuir las propiedades mecánicas y funcionales de los arcos y contribuir a un mayor tiempo de tratamiento ortodóncico (Walker y col., 2005). 3.1. Tipos de Estudios: In-Vivo e In-Vitro Numerosos ensayos in vitro e in vivo han investigado la liberación metales, especialmente Ni y Cr. ! !3.1.1. Estudios IN VITRO Los ensayos in vitro realizan mediciones de niveles de metales en medios simulados que consisten en soluciones electrolíticas y ácidas (solución de cloruro de sodio), saliva y sangre. El medio simulado denominado “Saliva Artificial” tipo Fusayama modificada es uno de los medios más usualmente empleados en este tipo de estudios. Existen una serie de factores y variables responsables de dichas diferencias: ·La ausencia de variaciones extremas en cuanto a los parámetros que afectan al potencial de corrosión, así!como la reactividad de la aleación (pH, temperatura, estrés). El potencial de corrosión del acero inoxidable se aumenta en medios ácidos. ·La ausencia del ligado entre bracket y arco. Estos dos componentes son elementos móviles que inducen la “fretting corrosion”!(Fontana, 1986). Introducción / Introduction 37 ·La ausencia de la flora intraoral, acumulación de placa y los subproductos. Esta es la diferencia más importante. ·El uso de disoluciones de almacenamiento estáticas, puede dar lugar a una falsa evidencia. La liberación de Ni de los arcos en estas condiciones da lugar a una rápida obtención de equilibrio en la disolución, no teniendo en cuenta la liberación a largo plazo (Eliades y Athanasios, 2002). Los estudios in vitro presentan varios inconvenientes, debido a sus simplificaciones y adolecen de falta de relevancia clínica. La estimación de la liberación iónica a través del uso de un medio de almacenaje compuesto por una solución que no se agita (estática), que no se repone, no proporciona solidez metodológica a la prueba, según Eliades y Athanasios (2002) En estas condiciones, la tasa de liberación está forzada a alcanzar más rápidamente una meseta ya que se establece un equilibrio entre los iones metálicos presentes en la disolución y los iones metálicos en la interfase metal-disolución. Este fenómeno nos dirige a la falsa conclusión de que la tasa de liberación se acelera al inicio y permanece constante posteriormente. Esta observación se contrapone a los resultados de muchos estudios que demuestran que el envejecimiento de las aleaciones en forma de fatiga o corrosión mejora la liberación iónica (Fontana, 1986). Por contraste con los ensayos in vivo, los ensayos in vitro indican un potencial tóxico claramente dosis-dependiente por exposición al Ni. La exposición en condiciones ácidas, y dinámicas, en comparación con las condiciones estáticas (Kerosuo y col., 1995) pueden incrementar la liberación de iones Ni a partir de aleaciones de Ni. Revisando la literatura científica, exponemos los resultados más significativos en relación a este tipo de estudios in vitro. Grimsdottir y col. (1992) estudiaron la liberación de iones Ni y Cr a partir de aparatología ortodóncica: anclaje extraoral, bandas, brackets y arcos. Obtuvieron como resultado que la mayor cantidad de Ni liberado a los 14 días Introducción / Introduction 38 procedía de los anclajes extraorales, los cuales contenían una elevada cantidad de soldadura de plata. Esto concuerda con lo citado por Berge y col.(1982), quienes introdujeron que la soldadura de plata crea una pareja galvánica, influenciando tanto en la soldadura como en el acero inoxidable. La pareja galvánica facilita la liberación de Ni, así como de otros metales. Hay que indicar que la sumersión en una solución de NaCl al 0,9%, posee una salinidad bastante elevada en relación a la saliva. Por otra parte, este estudio hizo uso de condiciones estáticas, sin embargo, cuando dichos elementos son utilizados en la cavidad oral se produce una activación mecánica para conseguir el movimiento dentario, es decir, es una situación dinámica. Por lo tanto, los movimientos relativos de arcos y la fricción que se producen dan lugar a otros tipos de corrosión, como es la “fretting corrosion”, la cual favorece la liberación de los constituyentes de los aparatos (Grimsdottir y col., 1992). Como se ha comentado anteriormente, se concluye que la liberación de Ni y Cr está relacionada con la composición y el proceso de fabricación, pero no directamente con el contenido en estos elementos. Park y Shearer (1983) demostraron una liberación de 40 µg de Ni y 36 µg de Cr al día a partir de una aparatología fija completa ortodóncica. En su simulación, emplearon una solución de 0,05% de NaCl. Los signos iniciales de corrosión fueron notables a partir del día 3. Un análisis macroscópico de los aparatos reveló que la corrosión ocurría en las zonas de soldadura de la banda y, una vez iniciada, aumentaba de forma severa progresivamente. Por otra parte, no observaron evidencia de corrosión en los brackets cementados. Observaron que el volumen de Ni liberado permanece en la solución, mientras que una gran cantidad del Cr liberado estaba presente en un precipitado que se formaba durante la corrosión. La cantidad de Cr analizado en el precipitado era 18 veces mayor que el Ni precipitado. Con ello, deducen que el Ni liberado es un compuesto soluble mientras que el Cr se libera en una forma insoluble. Introducción / Introduction 39 En condiciones de laboratorio, se ha demostrado que los tratamientos de calor de las aleaciones incrementan marcadamente la liberación de los iones metálicos por factores que oscilan entre 15-60 veces (Gjerdet y Hero, 1987). Barrett y col. (1993) evaluaron los niveles de corrosión de la aparatología ortodóncica estándar concluyendo que libera cantidades detectables de Ni y Cr cuando son tratadas en medio de saliva artificial; que la liberación de Ni alcanza su máximo a la semana de la colocación de la aparatología, disminuyendo la tasa de liberación posteriormente, con el tiempo. Sin embargo, la liberación de Cr aumenta durante las dos primeras semanas y va disminuyendo los niveles de liberación a lo largo de las dos siguientes semanas. Estos autores establecieron que la liberación de Ni es 37 veces mayor que la del Cr. Iijima y col. (2006) realizaron un estudio con el fin de cuantificar el comportamiento de corrosión entre diversas parejas de brackets y arcos de distintas aleaciones. Utilizaron dos tipos de materiales de brackets: SS y Ti; mientras que de arcos ortodóncicos utilizaron NiTi, SS, CoCrNi y ®Ti, combinándolos en distintas proporciones de superficies y sumergiéndolos por inmersión en una solución de NaCl al 0,9% durante 3 días sucesivos. En todas las combinaciones de parejas la densidad de corriente galvánica disminuía en el tiempo y permanecía casi constante tras 24 horas. En la combinación de NiTi con Ti o con ®Ti, es el Ti el que se comporta como ánodo en los estadíos iniciales y se corroe. Sin embargo, en el tiempo de una hora la polaridad se invierte, resultando en la corrosión del NiTi. Este fenómeno puede ser explicado por el momento en el que el potencial de corrosión varía, ya que éste en el caso del Ti era menor que el de NiTi inmediatamente tras la inmersión, siendo inversa tras 1 hora. Sugirieron que las combinaciones de SS 304-NiTi y NiTi-Ti aceleran la corrosión de la aleación de NiTi, actuando éste como ánodo, ya que el NiTi combinado con dichas aleaciones exhibe una densidad bastante mayor incluso tras 72 horas. Introducción / Introduction 40 Gil y col. (1998) propusieron una técnica con el fin de mejorar los niveles de fricción de los arcos de NiTi, la denominaron “Nitruración Gaseosa”. En su investigación, estudian la liberación de iones al medio salivar, tanto de la aleación nitrurada como del material en estado de recepción, utilizando aleaciones de NiTi cuya composición química fue 44% Ti y 56% Ni. Los ensayos se realizaron en saliva artificial a 37º, extrayéndose 10 mL de solución an diferentes tiempos con el fin de analizar la liberación de iones metálicos. Comprobaron que la nitruración gaseosa es un eficaz método de mejora del deslizamiento de los alambres ortodóncicos de NiTi superelástico respecto al bracket. Mediante microanálisis de energía dispersiva de Rayos X, se comprobó que la capa estaba compuesta principalmente por nitruros de titanio que son los que le confieren una elevada dureza y oxinitruros de titanio. Se apreció que los iones Ti y Ni liberados al medio salivar eran menores para el caso del material que presenta la capa nitrurada respecto al que no presentaba dicha capa. La curva que presenta la liberación de iones era, para ambos elementos, de tipo potencial que llegaba hasta valores casi de saturación o de crecimiento ralentizado cuando los tiempos de exposición fueron superiores (Saez y col., 1999). La capa de nitruros de titanio ofrecía un importante obstáculo a la liberación de los iones de Ti, ya que éstos están enlazados de manera covalente con el nitrógeno; este tipo de enlace presenta una mayor energía de enlace que el enlace metálico y, por tanto, habrá una mayor estabilidad. Además, los iones Ni tienen una mayor dificultad de salir de la aleación ya que en la superficie hay una capa de nitruros que dificulta su cinética de liberación. Esta capa de nitruros hace que el medio fisiológico no esté en contacto con los iones Ni ya que la capa superficial es de nitruros de Ti y por tanto la aparición de iones Ni se produce cuando acaba la capa de nitruros de Ti. Es de esperar, que la capa de nitruros de Ti no solamente mejore la liberación iónica sino también la resistencia a la corrosión del metal ya que esta capa es inerte al ataque de los electrolitos que tenemos en boca y actúa como material cerámico (Sáez y col., 1999). Introducción / Introduction 41 Gil y col. (2004) realizaron un nuevo estudio acerca de la influencia del tratamiento de nitruración gaseosa en arcos NiTi y NiTiCu. En este estudio obtuvieron un comportamiento muy similar entre ambos materiales; en ambos casos, la concentración de iones liberados al medio se incrementó muy rápidamente al principio y, posteriormente, alcanzó un nivel de saturación. Eliades y col. (2004) caracterizaron in vitro, de forma cualitativa y cuantitativa, los iones liberados a partir de series de brackets (20) de acero inoxidable y de arcos de Ni-Ti (dos grupos de10 arcos), qu sumergieron en disolución salina al 0,9% durante 1 mes. Se analizó el medio de inmersión mediante Espectrometría de emisión atómica con plasma acoplado por inducción (ICP-AES). Los resultados indicaron que no existía liberación de iones a partir de arcos Ni-Ti y en el grupo de brackets de acero inoxidable se detectaron trazas de Ni y de Cr. Por tanto, aunque los arcos de NI-Ti tienen un mayor contenido de Ni (45-50% en comparación con el 8-14% del acero inoxidable) y sustancialmente una mayor relación superficie/volumen que los brackets de acero, no se evidenció liberación de Ni; este hecho se atribuye a la capa de precipitado de oxido de Ti sobre la superficie de la aleación, que actúa como barrera para la difusión del Ni sobre la superficie, minimizando su reactividad con el ambiente que le rodea. Huang y col. (2004) demostraron que el bracket metálico Ormco fue el que mayor concentración de Ni liberaba en medios de inmersión, y el bracket Tomy liberó menores cantidades de Ni, Cr y Cu en comparación con el resto de brackets metálicos. Luft y col. (2009) investigaron en un ensayo de inmersión estático, la liberación de iones Ni (ICP-MS), a partir de 9 sistemas de brackets de diferentes materiales y diseños, y realizaron un estudio de las alteraciones de la superficie de los brackets tras la corrosión mediante microscopía electrónica de barrido. La liberación de ión Ni varió entre 0,01 µg/día hasta un máximo de 5,24 µg/día. Todos los materiales mostraron trazas de corrosión tras el ensayo electroquímico. Sin embargo, tras el ensayo de inmersión estática, sólo se detectaron defectos Introducción / Introduction 42 menores de corrosión uniforme, o pitting corrosion, estando la mayoría de los defectos localizados en las bases de los brackets y en el hook y las cantidades de Ni liberadas fueron bajas, inferiores a la ingesta diaria dietética de Ni (300-500 µg); en algunos casos los cambios de superficie se correlacionaron con la cantidad de Ni liberado. De forma global, en la excelente revisión sistemática acerca de la liberación de iones metálicos a partir de aplicaciones ortodóncicas llevada a cabo por Mikuliewicz y Chojnacka (2011a) los autores concluyen que los ensayos in vitro más usuales son los llevados a cabo en saliva artificial, NaCl 0,9% o bien ácidos orgánicos (ej. ácido láctico), sumergiéndose los materiales y posterior cuantificación de los iones metálicos por diferentes técnicas (ver apartado 3.2.). En la Tabla 2 se exponen los estudios recogidos en dicha revisión, con indicación del material ensayado, medio experimental, metales investigados, y concentraciones halladas. Se puede observar que muchos de estos estudios emplean materiales y metodologías diferentes, con variados líquidos de inmersión, métodos analíticos de determinación diferentes, y además los materiales ensayados tienen distinta procedencia industrial. En consecuencia, todos estos factores hacen que sea difícil el poder comparar estos estudios entre sí. Por ello se recomienda elaborar unos procedimientos de trabajo estandarizados (medio inmersión-tipo y volumen, condiciones de incubación, condiciones estáticas/dinámicas, y duración del experimento) para obtener resultados potencialmente comparables. Además, sería muy adecuado completar y actualizar la revisión de los estudios in vitro existentes hasta la fecha actual. Introducción / Introduction 43 Tabla 2. Concentración de metales liberados in vitro en medios de inmersión (nanogramos/mL) (tomada de Mikuliewicz y Chojnacka, 2011, modificada y contrastada con artículos originales). Referencias Material Medio de inmersión Concentración de iones metálicos ± SD Cu Cr Fe Ni Experimental Control Experimental Control Experimental Control Experimental Control Park and Shearer 1983 Brackets, bandas, arcos NaCl 0,05% - - 28.000±4500 ND - - 31.250±5,500 ND Barret y col. 1993 Brackets, bandas, arcos Saliva artificial - - Arcos SS*: 21,2- 233,1 Arcos Nitinol: 16,4- 126,9 - - - Arcos SS: 1.260- 7.520 Arcos Nitinol: 702-8,408 - Kerosuo y col. (1995)a Brackets, bandas, arcos NaCl 0,9% - - Estático: 4,5±2 Dinámico: 2,5±0.7 - - - Estático: 17,1±3.4 Dinámico: 44,3±22.8 - Staffolani y col., 1999b Brackets, bandas, arcos HCl y ácidos orgánicos (TCA y LA)b HCl: 0.27- 10.88 Ácidos orgánicos: 1,69-3,79 ND HCl:0,36 - 3.36 Ácidos orgánicos: 2,92-3.49 ND - - HCl: 1.62- 8.73 Ácidos orgánicos: 8.40-10.49 ND Hwang y col. 2001 Brackets, bandas, arcos. A y B: arcos SS C y D: arcos NiTi Saliva artificial (C) 7,5 ND (A) 900 (B) 687±8 (C) 10,4 (D) 20,2 ND (A) ca. 7800 (B) ca. 3100 (C) ca. 720 (D) ca. 775 ND (A) ca. 800 (B) ca. 430 (C) 17,0±0.5 (D) ca. 35 ND Eliades y col. 2004 Brackets Arcos NaCl 0,9% - - - 1000 - - - - - - 11000±900 - - Gürsoy y col. 2004c Brackets, bandas, arcos Saliva artificial (A) 10±3 (B) 15±5 (C) 25±6 (D) 31±10 - (A) 4.5±0.5 (B) 4,0±0,7 (C) 7,3±0.6 (D) 7,5±0.6 - (A) 67,7±9.6 (B) 64,3±8 (C) 115±12 (D) 140±9 - (A) 10±6 (B) 15±3 (C) 20±6 (D) 20±3 - Introducción / Introduction 44 Darabara y col. 2007d Brackets, arcos Ácido láctico 1M - - (A) 1,18 (B) 6,48 (C) 1,02 (D) 1,68 (E) 0 (F) 0 - - - (A) 43,9 (B) 44,7 (C ) 53,4 (D) 45,5 (E) 44,8 (F) 16,9 Kuhta y col. 2009 Brackets, bandas, arcos: stainless steel ( SS); NiTi; y termo NiTi (T- NiTi) Saliva artificial. pH 3,5 y pH 6,75. durante 28 días (NiTi total3.5) 15,123 (NiTi total6.75) 546 (T-NiTi total 3.5) 18,588 (T-NiTi total6.75) 516 (SS total3.5) 19,893 (SS total6.75) 708 - (NiTi3.5) 3,758 (NiTi6.75) 57.8 (T-NiTi3.5) 3,293 (T-NiTi6.75) 31.2 (SS3.5) 4,307 (SS6.75) 76.2 - (NiTi3,.5) 15,489 (NiTi6.75) 387 (T-NiTi3.5) 13,432 (T-NiTi6.75) 232 (SS3.5) 15,150 (SS6.75) 406 - (NiTi3.5) 5,430 (NiTi6.75) 167 (T-NiTi3.5) 4,553 (T-NiTi6.75) 119 (SS3.5) 5,611 (SS6.75) 194 - ND: No disponible; ca: valor tomado gráficamente * SS: Stainless steel a Expresado como microgramos/aparatología (inmerso en 15 ml medio, cantidades acumuladas en 8 días). TCA = disolución de ácidos tartarico, citrico y ascórbico, pH 2,2; LA= disolución de ácidos láctico y acético, pH:2,5 b Expresado como microgramos/aparatología (inmerso en 100 ml medio, cantidades acumuladas) c A: controles; B: Brackets nuevos y arcos reciclados; C: brackets reciclados y arcos nuevos; D: brackets y arcos reciclados. d A-F: Cobre NiTi arcos y seis diferentes brackets Introducción / Introduction 45 3.1.2. Estudios IN VIVO La humedad y las condiciones húmedas en el interior de la cavidad oral ofrecen un medio ideal para la biodegradación de metales, facilitando consecuentemente la liberación de iones que ocasionan efectos adversos. Ya se han indicado los inconvenientes de los ensayos in vitro de liberación de metales, en comparación con las condiciones de una situación clínica de rutina. Los métodos in vivo más relevantes clínicamente suponen la estimación de liberación del elemento metálico en cuestión (Ni, Cr, Co, etc) en fluidos biológicos, como saliva, suero y orina, inicialmente, aunque estas matrices han ido evolucionando. La saliva es la primera fuente de disolución del elemento metálico, y los resultados tienen asociación directa con la cantidad de metal liberado. Las concentraciones de metal en suero y orina, sin embargo, dependen de la tasa de excreción del elemento en cuestión, por ej. Ni, siendo un parámetro muy individualizado así#como específico de cada especie. Eliades y Athanasios (2002) indicaron que las ecuaciones para predecir el contenido total de metal en el organismo no tienen en cuenta la presencia de componentes multicompartimentales en el mismo, así#como tampoco la unión selectiva de los metales a cada órgano. Investigaciones in vivo han indicado una concentración en saliva de Ni y Fe mayor a las tres semanas tras la colocación de aparatología fija ortodóncica (Agaoglu y col., 2001). Sin embargo, otros autores indican que el hecho de que existan innumerables variaciones derivadas de la alta diversidad en el número de bandas y brackets de cada participante, hace que no existan diferencias estadísticamente significativas en las concentraciones de Ni (Gjerdet y col., 1991). En el mismo sentido, estudios de los contenidos de Ni y Cr en saliva no revelaron una concentración aumentada de dichos iones en un periodo que comprendía desde el primer día hasta un mes posterior a la colocación de aparatología fija en relación a las concentraciones previas a la inserción (Kerosuo y col., 1997). Según estos autores, los periodos que se adoptaron en la toma de muestras de saliva no excedían en un mes, intervalo 20 veces menor de un tratamiento Introducción / Introduction 52 Arcos trató con HNO3 (2ml, 0.5%) y se diluyó con agua Eliades y col. , 2003 Brackets de acero inoxidable Saliva Cr Fe Ni 27 17 10 11 14 6 ICP-OES 10-15 ml de saliva se secaron y mineralizaron utilizando agua regia en un sistema cerrado Fors y Pearsson, 2006 Arcos Brackets Bandas Saliva Ni 0,005-25,25 µg/g 0,004 µg/g GF-AAS Las muestras de saliva se diluyeron en H2O2; 0,7g de la saliva fueron acidificadas en HNO3 Menezes y col., 2007 Aparatología ortodóncica Orina Ni 19,89 17,67 AAS - Petoumeno y col., 2008 Aparatología ortodóncica Saliva Ni 28-78a 34a ICP-MS - Matos de Souza y col., 2008 Aparatología ortodóncica Saliva Cr Fe Ni 0,3-1,7 28-104 1,7-16 0,6 94 5,3 GF-AAS - Amini y col., 2008 Arcos de NiTi Células de mucosa oral Co Cr Ni 0,84 4,24 21,74a 0,44 3,46 12,26a GF-AAS Las muestras de mucosa se diluyeron en agua y fueron acidificadas en HNO3 a 60º , 10 min Matos de Souza y col., 2008 Brackets cementados Saliva Cr Fe Ni 0,29-1,72 28,31-103,58 1,69-16,01 - GF-ETAAS La muestra de saliva se preparó secándola en horno eléctrico a 150º ,15 min Introducción / Introduction 53 Petoumeno y col., 2009 Brackets Bandas Arcos Saliva Ni 56-78 34 ICP-MS Las muestras de saliva se secaron, fueron digeridas con 0,2 ml agua regia; posterior dilución con H2O2 Amini y col., 2012 Arcos de acero inoxidable Saliva Cr Ni 2,6 18,5 2,2 11,9 AAS 1ml de saliva se diluyó con 10 ml de H2O2 aLas diferencias entre los grupos fueron estadísticamente significativas AAS: Atomic absorption spectrometry; Espectrometria de absorción atómica GFAAS: Graphite furnace atomic absorption spectrometry; Espectrometria de absorción atómica horno de grafito ICP-OES: Inductively coupled plasma-optical emission spectroscopy, Espectroscopia de emisión atómica de plasma acoplado ICP-MS: Inductively coupled plasma-mass spectrometry, Espectrometría de Masas con Plasma Acoplado Inductivamente. Introducción / Introduction 54 4. IMPLICACIONES TOXICOLÓGICAS DERIVADAS DE LA LIBERACIÓN DE METALES A PARTIR DE APARATOLOGÍA ORTODÓNCICA !Las posibles implicaciones para la salud humana que se pueden derivar de la liberación de iones metálicos a partir de las aplicaciones ortodóncicas constituye un tema de enorme interés científico. En general, la mayoría de estudios in vivo que han evaluado la liberación de iones metálicos a partir de dichas aplicaciones en fluidos biológicos concluyen que las concentraciones alcanzadas son inferiores a la ingesta dietética diaria de algunos de los elementos (Kerosuo y col., 1997; Kocadereli y col., 2000; Agaoglu y col., 2001;), tales como la Ingesta Diaria Tolerable (IDT) establecida para el Ni de 2,8 µg/kg peso corporal /día (EFSA, 2015; http://www.efsa.europa.eu/en/search/doc/4002.pdf); o la Ingesta máxima estimada para el Co (0,039 mg/day) (EGVM, 2003; http://cot.food.gov.uk/sites/default/files/cot/vitmin2003.pdf); o el límite superior de ingesta tolerable (UL) establecido para el Cu de 5 mg/día o para el Cr trivalente de 1 mg/día, establecidos estos últimos por el Comité Científico de la Alimentación de la Unión Europea (SCF, 2003) y por la Autoridad Europea de Seguridad Alimentaria (EFSA, 2006; http://www.efsa.europa.eu/en/ndatopics/docs/ndatolerableuil.pdf). Sin embargo, no puede excluirse que concentraciones no tóxicas de estos elementos puedan ser suficientes para producir daños biológicos/toxicológicos en la mucosa oral. Wataha y Schmalz (2009) indican que la ingesta dietética diaria de un elemento no es una buena regla para evaluar la seguridad de un material, ya que por ejemplo no tiene en cuenta las concentraciones elevadas de elementos que pueden ocurrir alrededor del mismo. Además, la concentración que se requiere para que se produzca un efecto adverso local puede ser mucho más baja que las concentraciones para causar efectos sistémicos a través de la vía oral. De hecho, se ha comprobado que diversos cationes metálicos liberados a partir de estos Introducción / Introduction 55 materiales pueden causar alteraciones biológicas importantes (síntesis ADN, actividad fosfatasa alcalina, etc.) a concentraciones no citotóxicas (Geurtsen, 2002). Ocasionalmente, la respuesta del paciente a esta liberación de elementos metálicos va a diferir dependiendo de la naturaleza y cantidad de dicha liberación. Por ejemplo, las respuestas alérgicas clásicas se caracterizan porque no son dosis dependiente, es decir, bajas dosis pueden producir inflamación a través de una reacción tóxica que puede causarse por activación del sistema inmune (Schmalz y col., 2000). La liberación de componentes metálicos puede desencadenar una reacción alérgica (Leite y Nell, 2004), de forma que los tratamientos en ortodoncia dan lugar a reacciones de hipersensibilidad (Kalimo y col., 2004), aspecto último al que le dedicamos un apartado. Además, los efectos mutagénicos y carcinogénicos no están relacionados con la dosis del xenobiótico en general. ! 4.1. Aspectos toxicológicos de los iones metálicos liberados de aplicaciones ortodóncicas Los principales elementos implicados en los procesos de corrosión como ya se ha indicado son Ni, Cr y Fe a partir de aplicaciones de acero inoxidable, y Ti y Ni a partir de aleaciones NiTi. De entre ellos, Ni y Cr han recibido particular atención por sus propiedades alergénicas, especialmente Ni, y por sus efectos citotóxicos, mutagénicos y carcinogénicos, que se resumen a continuación. 4.1.1. Níquel El Ni es esencial para la actividad catalítica de algunas plantas y enzimas bacterianos, pero sin embargo, no se han demostrado sus funciones bioquímicas en el hombre, por lo que no es un elemento esencial para los humanos. El Ni está presente de forma natural en suelos, agua, plantas y animales. En sus compuestos tiene normalmente el estado de oxidación +2, pero puede existir en los siguientes estados: 0, +1, +3, y +4. Algunas de sus sales ingeridas por vía oral causan efectos tóxicos en riñón, médula, pulmones y sistema mieloide en animales de Introducción / Introduction 56 experimentación. Los porcentajes de este elemento en los materiales metálicos empleados en ortodoncia varían entre un 8% (acero inoxidable) y mas del 50% (NiTi aleaciones) (Railly y Price, 2003). Los humanos sensibilizados al Ni por contacto dérmico y que tienen dermatitis alérgica por contacto (estimándose que puede ser hasta un 15% de las mujeres, pero frecuentemente no diagnosticadas) desarrollan eczema en las manos por exposición oral o dérmica a sales del elemento. Se ha demostrado que ingestas orales tan bajas como 500 µg/día (aproximadamente 8 µg/kg p.c./día) agravan los eczemas en manos en sujetos sensibilizados a Ni (ver apartado Ni-sensibilización) La absorción de las sales de Ni es bastante elevada en estado de ayuno, pero se reduce de forma significativa en presencia de alimentos (leche, café, te, zumo de naranja). Los picos máximos plasmáticos se alcanzan de forma rápida en 1,5- 2,5 h (15-20 µg/L) y disminuyen en los próximos 3-4 días. Se une a la albúmina, histidina y α2-macroglobulina y se distribuye ampliamente en el organismo. Se excreta principalmente por orina, (51-82% de la dosis en 5 días), y en menor extensión por la bilis y el sudor. También se secreta en la leche humana, y se ha demostrado que atraviesa la barrera placentaria en animales de experimentación. El contenido total en el organismo humano se estima en 0,5 mg. Los niveles más elevados ocurren en pulmón, tiroides, adrenales, y riñón. En humanos no ocupacionalmente expuestos, la concentración de Ni en sangre total y suero se encuentra en el rango de 1-5 µg/L y en orina es inferior a 10 µg/L. La toxicidad aguda por vía oral de los compuestos de Ni depende de su solubilidad. Las sales solubles, cloruro y sulfato de Ni tiene valores de Dosis Letal 50 (DL50) en ratas equivalentes a 42-129 mg Ni/kg peso corporal (pc). En humanos, los efectos no carcinógenicos tras exposición oral al Ni incluyen efectos gastrointestinales (GI), hematológicos, neurológicos y sobre el sistema inmune (EFSA, 2015). La exposición a través de la piel o por vía inhalatoria puede conducir a una reacción de sensibilización al Ni. Mientras que la exposición oral Introducción / Introduction 57 al Ni no se conoce aún que conduzca a sensibilización, la absorción de Ni es capaz de inducir reacciones eczematosas en la piel de individuos sensibilizados al mismo (EFSA, 2015). En relación con los estudios de toxicidad subcrónica, la administración por sonda de 25 mg sulfato Ni (kg/día) equivalentes a 9,5 mg Ni/kg/día durante 120 días, produjo severas lesiones en las células germinales, observándose espermiogénesis. En diversos estudios de dosis repetidas en ratas con sales de Ni (carbonato, cloruro, sulfato), los principales efectos observados han sido: disminución del peso corporal, disminución de hemoglobina, elevación de glucosa en suero, proliferación de células linfoides y micronecrosis en intestino a las dosis más elevadas (EFSA, 2006). En ratas, la administración repetida por vía oral de sulfato de Ni condujo a una disminución en el peso del hígado, del timo, y alteraciones en el sistema mieloide. Otros estudios demuestran que la administración de cloruro de Ni conduce a la producción de efectos tóxicos en riñón, hígado y médula, mientras que el sulfato de níquel hexahidratado ha producido daños en pulmón de rata. Los estudios con animales de experimentación han demostrado que algunas sales de Ni (cloruro, sulfato) pueden producir alteraciones sobre la reproducción y desarrollo. El Panel de Contaminantes en la Cadena Alimentaria (CONTAM) de EFSA, ha identificado como efecto crítico para la caracterización del riesgo por exposición oral crónica al Ni, la toxicidad sobre la reproducción y el desarrollo, derivando recientemente la IDT de 2.8 µg Ni/kg peso corporal ya indicada (EFSA, 2015). En general, se considera necesario actualmente llevar a cabo estudios mecanísticos para evaluar la relevancia humana de estos efectos sobre la reproducción y desarrollo observados en animales de experimentación. En ausencia de datos adecuados dosis-respuesta para estos efectos, no es posible establecer un nivel de ingesta tolerable máximo (UL), según el Comité Científico de la Alimentación de la Unión Europea y la Autoridad Europea de Seguridad Alimentaria (EFSA) (EFSA, 2006; 2015). Introducción / Introduction 58 La genotoxicidad del Ni y sus compuestos también ha sido revisada por diferentes organismos, incluyendo la Agencia Internacional de Investigaciones sobre el Cáncer (IARC, http://www.iarc.fr), la Organización Mundial de la Salud (OMS, WHO), la ATSDR (Agency for Toxic Substances and Disease Registry, http://www.atsdr.cdc.gov/es/) y la Comisión Europea (EC, 2004). Los estudios in vitro han demostrado que diversas sales solubles de Ni (sulfato, cloruro) producen aberraciones cromosómicas en células cultivadas de mamífero. También se ha demostrado la inducción de aberraciones cromosómicas en cultivos de linfocitos humanos con sulfato de Ni y sulfuro de Ni, y en linfocitos periféricos humanos el sulfato de Ni indujo micronúcleos (MN). Diversas sales de Ni (sulfato, cloruro) inducen roturas en el ADN, uniones cruzadas ADN-proteínas persistentes, inhibición de la síntesis y reparación del ADN. Asimismo también se ha demostrado que algunos compuestos de Ni inducen la transformación celular. La interpretación de los resultados obtenidos en los estudios in vivo es más complicada. Algunas sales (sulfato, cloruro, nitrato) pueden inducir aberraciones cromosómicas en varias especies animales (rata, ratón), por diferentes vías (oral, intratraqueal o intraperitoneal (i.p.)). Los datos de los ensayos de MN son conflictivos, obteniéndose tanto resultados negativos como positivos. Algunos compuestos de Ni producen daño en el ADN, como roturas de las cadenas, uniones cruzadas ADN-proteínas, y el daño parece relacionado con procesos de inflamación y/o apoptosis celular. Los datos humanos sobre alteraciones cromosómicas son asimismo contradictorios. Los mecanismos de acción genotóxica de los compuestos de Ni no están aún dilucidados. Estudios in vivo e in vitro han demostrado que producen roturas de las cadenas simples bien directamente o indirectamente. Se barajan diferentes mecanismos, entre los que cabe citar el daño oxidativo por generación de especies reactivas de oxígeno (ERO), o bien la inhibición de la síntesis del ADN ó la inhibición de los mecanismos de reparación del ADN, como se ha demostrado esto último in vitro a concentraciones no citotóxicas, siendo necesario profundizar Introducción / Introduction 59 en dichos mecanismos (EFSA, 2006; 2015). La Comisión Europea (EC, 2004) ha clasificado en la categoría 3, Mutágenos, a las siguientes sales de Ni, sulfato, cloruro y nitrato. La carcinogenicidad del Ni y sus compuestos ha sido evaluada por diferentes organismos internacionales, incluyendo la IARC y la Unión Europea (EC, 2004). Dicha agencia, evaluó globalmente a los compuestos de Ni en el grupo 1, de Carcinógenos humanos, basándose en las evidencias suficientes de los estudios epidemiológicos (cáncer de pulmón y nasal tras exposición por vía inhalatoria) y las evidencias suficientes en animales de experimentación. De acuerdo con la IARC, existe suficiente evidencia en animales de experimentación de la carcinogenicidad de implantes de Ni metálico y de aleaciones de Ni conteniendo aproximadamente 66-67% Ni, 13-16% Cr y 7% de Fe. La Comisión Europea (Grupo de trabajo especializado en carcinogenicidad y mutagenicidad) concluyó que las siguientes sales de Ni: sulfato, cloruro, nitrato y carbonato se consideran carcinógenos humanos por inhalación (Categoría 1, frase R49: Puede causar cáncer por inhalación). No existen evidencias experimentales de producción de cáncer de los compuestos de Ni o Ni metálico tras exposición por vía oral, los datos disponibles hasta la actualidad son limitados. Existen algunas evidencias, de nuevo limitadas, que indican que los compuestos solubles de Ni pueden actuar como promotores, por vía oral (EFSA, 2006). En el caso de aparatotología ortodóncica, la exposición a través de aleaciones que contengan Ni no son carcinógenas, y se considera que no deben existir riesgos, y de hecho no existen informes de carcinogenicidad asociada al uso intraoral de materiales que lo contengan (Wataha, 2000; Setcos y col., 2006). Dedicamos un apartado especial a las reacciones de sensibilización inducidas por Ni registradas en la bibliografía científica. Introducción / Introduction 60 4.1.1.1. Ni y sensibilización Las sales de Ni son potentes sensibilizantes de la piel en humanos, que causan hipersensibilidad por contacto, relacionada directamente con la presencia del metal en el ambiente y causada por ingestión o contacto directo con la piel y/o mucosas (Volkman y col., 2007). Los iones Ni se unen a proteínas de la piel e inducen una respuesta inmunitaria celular retardada tipo IV, cuya prevalencia, características, etc. vemos a continuación. En individuos sensibilizados, no sólo la exposición dérmica, sino también la ingesta oral puede provocar eczema. Las dosis orales más bajas, administradas a sujetos sensibilizados que han provocado eczema han sido de 0,49 mg/día con un dieta alta en Ni (Nielsen y col., 1990), equivalentes a aproximadamente 8 µg Ni/kg p.c./día, y de 12 µg/kg p.c./día en el agua de bebida o con el estómago vacío. Las reacciones de hipersensibilidad al Ni en pacientes ortodóncicos han sido revisadas en la literatura científica (Bachman 1987; Hensten-Pettersen, 1989; Greppi y col., 1989; Kanerva y col., 1994; Lindsten y Kurol, 1997; Kerosuo y col., 1996; Janson y col., 1998; Noble y col., 2008). Respuesta Inmunológica De acuerdo con Coombs & Gell, existen cuatro tipos de reacciones alérgicas. Únicamente, dos de ellas son relevantes en el campo de la medicina dental y en la ortodoncia de forma más específica. La primera de ellas se trata de hipersensibilidad de tipo inmediata o, también denominada alergia de tipo humoral (Tipo I), la cual está desencadenada por Ig E específica y varios mediadores liberados predominantemente de los mastocitos. Este tipo de reacción se caracteriza por cursar con fiebre, asma bronquial y shock anafiláctico. El segundo tipo es la alergia mediada por células (Tipo IV), en ella se liberan linfoquinas procedentes de linfocitos T sensibilizados de forma específica (Schuster y col., 2004), y de este tipo es la dermatitis alérgica por contacto inducida por Ni. Se sugiere que los linfocitos T CD4+ y CD8+ están involucrados en la respuesta inmune al Ni (Noble y col., 2008). Las respuestas al Ni parecen Introducción / Introduction 61 incluir la activación de linfocitos T específicos, seguido de la proliferación e inducción de diversas citoquinas incluyendo interferon IF-λ, así como interleucinas, IL-2, Il-5, IL-10, etc., estimulando la proliferación del tejido, lo que puede favorecer la hiperplasia gingival (Minang y col., 2005). Epidemiología Se estima que entre el 4,5-28,5% de la población presenta hipersensibilidad al Ni, siendo mas común en las mujeres (de 2-6 veces superior en comparación con los hombres), debido a una mayor exposición ambiental con el metal por el contacto con detergentes, bisutería diversa como uso de pendientes, y otros objetos metálicos, tales como botones etc. La alergia al Ni es mas común en pacientes mas jóvenes (Volkman y col., 2007). Se estima una tasa del 20% en el caso de mujeres en edades comprendidas entre 16-35 años, siendo menor, del 2%, en hombres debido al menor uso de bisutería (Noble y col., 2008). En los hombres la exposición es de tipo ocupacional. La sensibilidad al Ni posee una prevalencia mayor en personas asmáticas (Gül y col., 2007). Los problemas de sensibilización y alergia al Ni son motivo de interés creciente en ortodoncia, y de controversia. La frecuencia de tratamientos de ortodoncia y el uso común del Ni en materiales de ortodoncia nos hace cuestionarnos si estos tratamientos pueden actuar incrementando o disminuyendo la hipersensibilidad al Ni en la población, especialmente tras constatarse un aumento de la prevalencia de los casos de hipersensibilidad por exposición a bisutería, piercing oral, etc., y otros materiales que contienen Ni. Muchas aplicaciones auxiliares y utensilios empleados en ortodoncia contienen Ni, pudiendo variar entre un 8% (aceros por ej.) a más del 50% (aleaciones de Ni-Ti). Incluso los supuestos arcos libres de Ni como MenzaniumR, NoniniumR contienen cantidades traza de Ni (Schuster y col., 2004). Aunque el acero inoxidable contiene un 8% de Ni, esta aleación se considera segura para su colocación en pacientes alérgicos al Ni debido a su estructura cristalina enrejada y Introducción / Introduction 68 Categoría Material Sustitutos libres de Ni y Modificaciones Intervenciones terapéuticas complejas Placas y tornillos de cirugía ortognática Aparatos de distracción osteogénica Placas y tornillos de material poliacrílico-poliglicólico reabsorbible No existen alternativas Tabla 4. Alternativas de tratamiento para aquellos pacientes con alergia al Ni (Eliades y Athanasios, 2002). Si el paciente tiene un historial previo de alergia, se deben evitar los tratamientos con Ni, y en su lugar se aconsejan como tratamientos alternativos el empleo de brackets cerámicos (alúmina policristalina, sapphire single-crystal sapphire, y Zr), de policarbonato, de Ti o de Au-plated. Ya hemos comentado que en relación con los arcos, el acero inoxidable es un material considerado como seguro a emplear en componentes intraorales en pacientes sensibilizados. Se debe eliminar el arco Ni-Ti, reemplazarlo por un arco de acero inoxidable (con un contenido menor en Ni) y preferiblemente por aleaciones Ti-Mo (TMA) los cuales no contienen Ni, o bien, por arcos de NiTi recubiertos de resina (Wataha y col., 1999). Si el paciente continuara manifestando la reacción alérgica, se deben eliminar todos los arcos, brackets de acero, tratar al paciente con antihistamínicos, anestésicos o corticoides tópicos. La administración de sustancias con corticoides para contrarrestar la hipersensibilidad afecta al proceso de movimiento ortodóncico, reduciendo la tasa de movimiento, por lo que la administración debe evitarse si los signos no son severos (Melsen, 1978; Bachmann, 1987; Greppi y col., 1989; Janson y col., 1998). 4.1.2. Cromo Las aplicaciones ortodóncicas pueden contener por término medio un 17-22% de Cr, y este elemento suscita gran interés por su potencial alergénico, así como por sus propiedades citotóxicas y mutagénicas, incluyendo carcinógenicas, Introducción / Introduction 69 en el caso de Cr hexavalente (VI). El Cr en una aleación, puede incrementar las propiedades de resistencia a la corrosión. Se añade a las aleaciones basadas en el Ni para mejorar sus habilidades con el fin de formar una película de óxido protectora en su superficie. Generalmente, la superficie de la aleación está formada por una capa de óxido de Cr. Se ha sugerido que un contenido del 16- 27% de Cr proporciona una óptima resistencia a la corrosión en las aleaciones de Ni (Brune, 1986). El Cromo (Cr) es un elemento ubicuo, presente en aguas, suelo y sistemas biológicos, que puede estar presente en diferentes estados de oxidación, desde Cro a Cr+6. Las tres formas más estables son 0, +3, +6, que se corresponden con las formas de metal y aleaciones, Cr trivalente (III) y Cr (VI), respectivamente. La forma más usual presente en la naturaleza son los compuestos de Cr (III), siendo muy diferentes sus efectos biológicos y tóxicos en comparación con las formas de Cr (VI), como los cromatos, de mayor importancia industrial. El Cr (III) está considerado como elemento esencial en animales y en la nutrición humana. Influye en el metabolismo de carbohidratos, lípidos y proteínas, a través de sus efectos sobre la insulina, aunque los mecanismos aún no están totalmente clarificados. Los estudios limitados existentes sobre la toxicidad subcrónica, crónica y efectos tóxicos sobre la reproducción de las sales de Cr (III), y los escasos datos humanos, no permiten obtener datos adecuados dosisrespuesta, por lo que no es posible establecer un nivel de ingesta tolerable máximo (EFSA, 2006). El grupo de Expertos en Vitaminas y Minerales de Reino unido (EGVM) ha considerado que una ingesta diaria de aproximadamente 0,15 mg de Cr (III)/kg peso corporal/día (10 mg/persona) se espera no produzca efectos adversos sobre la salud, exceptuando al compuesto picolinato de Cr, debido a que in vitro se ha demostrado que puede dañar el ADN por un mecanismo no totalmente dilucidado hasta la actualidad (EGVM, 2003). Los compuestos de Cr (VI) son más tóxicos que los compuestos trivalentes, siendo corrosivos y causando úlceras crónicas y otras alteraciones en la piel, Introducción / Introduction 70 independientes de la reacciones de hipersensibilidad (Goyer y Clarkson, 2001). Los efectos tóxicos del Cr en humanos se atribuyen a la forma hexavalente, y se ha especulado que los efectos biológicos de Cr (VI) están relacionados con la reducción a Cr(III) y la formación de complejos con macromoléculas intracelulares. La absorción de Cr (III) depende, entre otros factores, de las propiedades químicas del compuesto ingerido, del nivel de ingesta a través de la dieta y de la presencia de diversos componentes en la misma, por la existencia de interacciones. El Cr se une a proteínas plasmáticas, como transferrina, afectando a la unión del Fe con dicha proteína. El Cr (VI) es tomado selectivamente por los eritrocitos, reducido a Cr (III) por el glutation (GSH) y se une a la hemoglobina. Por tanto, el Cr se encuentra solo en plasma tras absorción gastrointestinal de Cr (III), y entre plasma y eritrocitos en el caso de Cr (VI). Sólo nos referimos a la toxicidad oral de los compuestos de Cr, que ha sido revisada por diferentes organismos internacionales (ATSDR, 2012; EGVM, 2003). La toxicidad aguda por vía oral de los compuestos de Cr varia en función del compuesto, oscilando las DL50 en rata y ratón de los compuestos solubles trivalentes entre 140 – 422 mg/kg (EGVM, 2002). Son muy escasos los estudios de toxicidad subcrónica publicados en la literatura científica. La administración de diferentes dosis de Cr2O3, a través de la dieta no produjo efectos tóxicos, ni carcinógenos, probablemente por la pobre absorción del compuesto. En otro experimento similar, sólo se detectó una ligera disminución del peso del hígado y bazo, con la dosis más elevada. Con respecto, al Cr y Reacciones Alérgicas, los compuestos de Cr pueden dar reacciones alérgicas en la piel tras exposición, y de forma independiente de la dosis. Las dermatitis alérgicas por contacto causadas por sales de cromatos fueron notificadas por primera vez en 1925, y es un fenómeno aún común. Los compuestos de Cr (VI) están considerados como los sensibilizantes de Cr más Introducción / Introduction 71 potentes. De acuerdo con los ensayos de maximización, pertenecen a la categoría de sensibilizantes de fuertes a extremos. Se acepta generalmente que el Cr metal no actúa como un hapteno y no es sensibilizante. Teóricamente, fluidos como el sudor y el plasma pueden transformar los compuestos metálicos de Cr en sales de cromato alergénicas. La saliva puede tener un efecto similar sobre los aparatos intraorales que contienen Cr. La alergia por contacto tiene alta incidencia en trabajadores de la construcción por la posible presencia de Cr (VI) soluble en algunos cementos; también en la industria del curtido de la piel, etc. A menudo no está claro si los cromatos o bien otros metales y sus sales son los agentes causales de reacciones alérgicas provocadas por aleaciones dentales. En muchos casos en los que la reacción alérgica se ha atribuido al Cr, el sensibilizante real ha sido el Ni. Se ha registrado un caso de dermatitis en las manos en un paciente alérgico al Cr, y negativo al Ni en el ensayo del parche cutáneo. En la Figura 6 se muestra la dermatitis vesicular en una chica de 15 años, tras la inserción de aplicaciones ortodóncicas. No se observó estomatitis, y el ensayo del parche fue positivo al cromato (Arenholt-Bindsley y col., 2009). Figura 6. Dermatitis vesicular tras colocación de aparatología ortodóncica (Arenholt-Bindslev y col., 2009). La genotoxicidad de un gran número de compuestos de Cr se ha ensayado in vitro e in vivo, estudios que se han sido revisados por diferentes organismos (EFSA, 2006; IARC). Al evaluar los resultados es necesario tener en cuenta varias Introducción / Introduction 72 propiedades de los compuestos en cuestión, como estado de oxidación, solubilidad, capacidad para atravesar membranas, estabilidad intracelular, y reactividad con componentes celulares, etc. Se ha demostrado que diversos compuestos de Cr (VI) son genotóxicos, y los compuestos de Cr (III) aunque son más reactivos con los ácidos nucleicos purificados produciendo uniones cruzadas ADN-proteínas, generalmente no producen mutaciones de genes, intercambio de cromátidas hermanas o transformaciones celulares en cultivos de células de mamíferos. No se ha observado la inducción de daño genético o de micronúcleos (MN) en animales de experimentación. Se ha demostrado que Cr (III) (cloruro) y Cr (VI) (dicromato potásico) dieron resultados positivos en el ensayo cometa realizado en linfocitos periféricos humanos aislados. Se sugiere que las especies reactivas de oxígeno (ERO), y peróxido de hidrógeno pueden estar involucradas en la formación de roturas de bandas del ADN por Cr (VI), pero no por Cr (III). En humanos, Medeiros y col., (2003) estudiaron los efectos de compuestos de Cr (III) en curtidores expuestos de forma crónica, y los de Cr (VI) en soldadores manuales de arcos metálicos de acero inoxidable, utilizando como marcadores la formación de uniones cruzadas ADN-proteínas (DPC) y la presencia de MN en linfocitos periféricos. Los resultados indicaron una relación causal entre exposición a compuestos de Cr en ambos casos y niveles de DPC en linfocitos, siendo mayor en el caso de los soldadores. En los curtidores también se observó un incremento de MN en linfocitos, siendo además su interpretación compleja. Un estudio ha revelado que el cloruro de Cr (III) disuelto en el agua de bebida, en ratones macho y hembra, durante 1 semana, produjo una disminución de la fertilidad de forma significativa, estimándose que las concentraciones de Cr (III) oscilaron aproximadamente entre 250-1250 mg/kg peso corporal/día. No existen estudios publicados acerca de la toxicidad sobre el desarrollo de los compuestos de Cr (III) por vía oral (EFSA, 2006). La carcinogenicidad del Cr (III) ha sido evaluada por la IARC, y tras una Introducción / Introduction 73 revisión de los diferentes estudios experimentales con animales (rata, ratón), y por diferentes vías, concluye que existen “evidencias limitadas en animales de experimentación de la carcinogenicidad de Cr2O3 y de dicromato sódico”, así como “evidencias inadecuadas de la carcinogenicidad de Cr metal, cromato de bario y los compuestos de Cr (III)”. En cuanto a los datos humanos, la IARC concluye que “Cr metálico y los compuestos de Cr(III) no son clasificables por su carcinogenicidad en humanos, grupo 3”. Las especies de Cr (VI) están ampliamente consideradas como agente responsable de un mayor riesgo de cáncer de pulmón en trabajadores del Cr (producción de dicromato, pigmentos de cromato, aleaciones de cromo), estando clasificadas en el grupo 1 (suficiente evidencia en humanos) (IARC, http://monographs.iarc.fr/ENG/Monographs/vol100C/mono100C-9.pdf), pero no existen datos adecuados en relación con los compuestos de Cr (III) (IARC), por lo que están clasificados en el grupo 3 (http://monographs.iarc.fr/ENG/Monographs/suppl7/Suppl7-51.pdf). 4.1.3. Cobre El Cu se puede liberar a partir de aplicaciones ortodóncicas (bandas) y su exceso está implicado en la formación de radicales OH. que puede iniciar reacciones de peroxidación lipídica no específicas (Gonçalves y col., 2014). Es un elemento traza esencial, siendo un componente imprescindible de muchos enzimas (cuproenzimas) y proteínas. Su papel es primariamente catalítico, ya que muchas metaloenzimas que lo contienen actúan como oxidasas, tales como citocromo-C-oxidasa y superoxido dismutasa (SOD), esencial en mecanismos de estrés oxidativo. Se requiere Cu para el crecimiento infantil, para los mecanismos de defensa, maduración de los glóbulos rojos y blancos, transporte de Fe, metabolismo de la glucosa y colesterol. También juega un papel adicional menos conocido en la angiogénesis, mielinización de los nervios y acción de endorfinas. Se ha estimado una ingesta segura y adecuada a través de la Introducción / Introduction 74 dieta, entre 1,5-3,0 mg/día. Aunque los niveles de Cu están sometidos a control homeostático, de forma que ante la ingestión de un exceso, se reduce su absorción y se incrementa su excreción, se han dado intoxicaciones tanto agudas como crónicas (EFSA, 2006) La intoxicación aguda por Cu en humanos es poco frecuente, y los síntomas incluyen salivación, dolor epigástrico, náuseas, vómitos y diarrea. Las intoxicaciones crónicas en humanos han sido poco estudiadas, existiendo datos que sugieren que la exposición crónica a Cu causa diarreas e irritación GI. Aunque se ha demostrado que induce lesiones en el ADN en hígado de pacientes con enfermedad de Wilson, no existen evidencias de que produzca cáncer; tampoco existen evidencias de que su exceso esté ligado a una mayor incidencia de enfermedades coronarias. Parece que juega un papel importante en enfermedades neurológicas, y se especula que la producción de radicales hidroxi puede contribuir a la neurodegeneración de la enfermedad de Alzheimer’s. La enfermedad de Wilson se caracteriza por la acumulación excesiva de Cu en hígado, cerebro, riñones y córneas, y ocurre por anomalías en la excreción biliar del elemento, observándose en sangre un descenso de la ceruloplasmina y elevación del Cu libre (Goyer y Clarkson, 2005). Es posible que las personas con déficit de glucosa-6-fosfato sean más vulnerables a los efectos hematológicos del Cu. En humanos, no existen evidencias que relacionen la ingesta oral de Cu y toxicidad sobre la reproducción (EFSA, 2006). El Cu posee también propiedades citotóxicas y puede inducir apoptosis (Geurtsen, 2000; Rana, 2008). 4.1.4. Cobalto El Co puede también producir alergias, asociado con Ni y cromato, de forma que se puede tratar de una sensibilización concomitante, ya que suele estar presente en los productos de Ni y Cr. En la mayoría de los casos, la alergia ocurre en asociación con sensibilidad al Ni en mujeres, y al Cr en hombres. Introducción / Introduction 75 Las sales de Co se absorben generalmente bien tras ingestión oral, y aproximadamente el 80% se excreta por orina. La administración oral crónica de altas dosis de Co para el tratamiento de anemias puede conducir a la producción de bocio, y un exceso del metal puede producir vómitos, diarrea, y cardiomiopatías. Es débil mutágeno y no existen evidencias de sus carcinogenicidad por diferentes vías de exposición (Goyer y Clarkson, 2001). Cobalto metal y sus iones son citotóxicos e inducen apoptosis, y a elevadas concentraciones necrosis con respuesta inflamatoria (Simonsen y col., 2012). Es conocido que es cardiotóxico en animales y en humanos. En el hombre, por ej., se han descrito casos de cardiomiopatías en fuertes consumidores de cerveza (años 60s) por contener cloruro de cobalto como aditivo, llegándose a alcanzar ingestas de 6.8 mg Co/día. Pocos son los datos de toxicidad que existen en humanos. Los casos reportados sugieren que unas ingestas agudas de 30 mg/día de Co pueden causar malestar GI, rash cutáneos y fiebre. Ingestas crónicas de Co entre 0.17 – 0.39 mg/kg (10,2 – 23,4 mg total en un adulto de 60 kg peso) pueden deprimir la absorción de yodo. Sus mecanismos de toxicidad aún no están dilucidados, y los datos son insuficientes para establecer una relación dosisrespuesta, por lo que no se existe aún un Nivel superior seguro de ingesta de este elemento (EGVM, 2003). 4.1.5. Hierro El Fe es un elemento esencial que tiene importantes funciones metabólicas, incluyendo el transporte y almacenamiento de O2 (hemoglobina y mioglobina), y participa en forma hemo en numerosas reacciones redox de citocromos. También hay que considerar los aspectos toxicológicos, que son importantes en términos de su deficiencia (anemia, disminución de la función inmune, etc.) existiendo diversos grupos vulnerables a dicha deficiencia, así como por intoxicaciones tras exposiciones agudas accidentales, y sobrecarga crónica debida a hemocromatosis idiopática o como consecuencia de un exceso de Fe en la dieta. Introducción / Introduction 76 Su disponibilidad está regulada por un complejo mecanismo para mantener la homeostasis. Por regla general, en el tubo digestivo se absorbe entre el 2-15% del Fe, mientras que la eliminación supone únicamente cerca del 0,01% al día (Goyer y Clarkson 2005). El Fe absorbido se une a la transferrina plasmática, que los transporta hacia sus depósitos en la hemoglobina, mioglobina, las enzimas que contienen Fe y las proteínas de depósito del Fe, como la ferritina y la hemosiderina. En condiciones normales, el exceso de Fe ingerido se excreta. La intoxicación aguda por Fe suele ser secundaria a la ingestión, accidental o intencionada, de medicamentos que lo contienen, observándose fundamentalmente efectos GI, hepáticos, pancreáticos y cardiovasculares. También se presentan efectos adversos GI (náuseas, dolor epigástrico, constipación) por consumo a corto plazo de suplementos de Fe no hemo (50-60 mg/día). Como se ha indicado, la sobrecarga de Fe con síntomas clínicos (disfunción hepática, incluyendo cirrosis hepática) puede tener tres causas principales: 1) aporte excesivo de Fe en la dieta o tratamiento médico con altas dosis de Fe (160- 1200 mg/día); 2) individuos con hemocromatosis hereditaria (homocigotos) incluso con niveles normales de Fe en la dieta y 3) transfusiones de sangre frecuentes en algunas anemias resistentes al tratamiento. Diversos estudios epidemiológicos han encontrado asociaciones entre alta ingesta y/o almacenamientos de Fe y riesgo incrementado de enfermedades crónicas, tales como enfermedades cardiovasculares, diabetes tipo II y cáncer del tracto GI, aunque los datos son contradictorios y no existen evidencias concluyentes sobre la relación causa-efecto. El panel de Productos dietéticos, Nutrición y Alergias de EFSA ha considerado que los datos disponibles son insuficientes para establecer una nivel máximo de ingesta tolerable para el Fe (EFSA, 2006). Los mecanismos exactos por los que el Fe induce estas alteraciones no están totalmente dilucidados, aunque la toxicidad última parece resultar de su papel Introducción / Introduction 77 catalítico en la generación de radicales libres a través de la reacción tipo Fenton, conduciendo al daño oxidativo de biomoléculas de todo tipo (Sochaski y col., 2002). En la relación Fe - estrés oxidativo, indicar que el ión Ferroso puede incrementarlo, porque las ERO pueden convertir aniones superóxido en radicales hidroxilos altamente reactivos a través de la conocida reacción de Fenton, catalizada por Fe (McCord and Turrens, 1994). Fe (II) + H2O2 → Fe(III) + . OH + OH- Los radicales hidroxilo son capaces de reaccionar de forma indiscriminada con macromoléculas celulares, originando degradación de proteínas, inactivación de enzimas, LPO, daño en el ADN y, en última instancia, muerte celular. De hecho, experimentalmente, se ha demostrado que la sobrecarga crónica de Fe induce un aumento de LPO de forma dosis-dependiente, aumentando de forma concomitante los aldehídos reactivos en plasma, modificándose las proteínas de los tejidos, y disminuyendo la actividad de la enzima glutatión peroxidasa (GPx) en ratón, demostrándose por tanto, la participación del estrés oxidativo como mecanismo de acción de las alteraciones patológicas crónicas producidas por el elemento (Sochaski y col., 2002). El exceso de Fe, al contribuir con una mayor LPO, produce consiguientemente afectación de la membrana de las mitocondrias, los microsomas y otros orgánulos celulares (Goyer y Clarkson, 2005). 4.2. Citotoxicidad de aparatología ortodóncica Los ensayos de citotoxicidad constituyen la primera etapa para estudiar la biocompatibilidad de material ortodóncico y reducir así el empleo de animales de laboratorio (Assad y col., 1994). Está bien documentado que algunas aleaciones de materiales empleados en ortodoncia son citotóxicas in vitro, y que el daño puede correlacionarse con la liberación de elementos a partir de estos materiales. Sin embargo, las correlaciones entre liberación de iones metálicos y citotoxicidad son Introducción / Introduction 84 Collins y col. (1997) aplicaron una modificación del ensayo cometa, utilizando enzimas específicas de la lesión, para la monitorización de la población humana en relación al daño oxidativo del ADN. Realizaron el ensayo cometa basado en el de Singh y col. (1988), que fue descrito por Gedik y col., (1992) y Collins y col., (1993), con la inclusión de la digestión con enzimas, endonucleasas del ADN, Endonucleasa III (Endo III) y Formamidopirimidina glicosilasa ((FPG), que informan del daño oxidativo en bases primidinicas y puricas, respectivamente (Collins, 2014). El ensayo del cometa se denomina así por la forma característica cuando al ADN sale de la célula y del cuerpo celular, y permite detectar alteraciones como rotura de bandas, incompleta escisión de sitios de reparación etc., Las Figuras siguientes (Faccioni y col., 2003) muestran una comparación entre una célula normal, una célula cometa típica, y una célula en apoptosis. Fig. 7 Fig. 8 Fig. 9 Figuras 7-9. Micrografías fluorescentes de células de la mucosa oral del ensayo cometa. Fig. 7, célula sin daño en el ADN; Fig. 8, típica célula cometa con ADN dañado; Fig. 9, célula apoptótica (Faccioni y col., 2003). Hoy día se reconoce que existen cuatro áreas principales de investigaciones en las cuales el cometa se aplica: ensayos de genotoxicidad in vitro and in vivo, biomonitorización humana, ecogenotoxicología e investigación básica de mecanismos de daño en el ADN y mecanismos de reparación (Collins, Introducción / Introduction 85 2004; Azqueta y col., 2011; Azqueta y Collins, 2013). Hasta donde se ha podido constatar en la literatura científica, el primer trabajo que evidenció la genotoxicidad de iones derivados de las aleaciones en ortodoncia sobre células humanas ha sido realizado por Faccioni y col. (2003). Investigaron: 1) la concentración de metales en células de la mucosa oral, 2) la biocompatibilidad, estudiando la viabilidad celular y apoptosis y 3) posible daño al ADN en las células bucales por liberación de estos metales, mediante el ensayo del cometa. Entre las ventajas de utilizar las células bucales podemos citar: el método es el menos invasivo disponible para medir daño en el ADN in vivo, y estas células representarían una diana adecuada para efectos genotóxicos tempranos inducidos por agentes carcinógenos que penetran en el organismo por vía inhalatoria y por ingestión. En el estudio, se consideraron 30 individuos control y 55 pacientes con aplicaciones fijas consistentes en 4-8 bandas y 20 brackets cementados. Los materiales fueron American Iron and Steel Institute (AISI) tipo 304 para las bandas, y tipo 316 para brackets (Omrco). Los arcos fueron de aleación Ni-Ti (Ni 50,8%); Acero inoxidable (Tru-Chrome, Ni 8,6%) o aleación de Cr-Co-Ni (Elgiloy, Ni 15%, Cr 20% Co 42%, Mo 7%). Las células epiteliales de la mucosa bucal se tomaron siguiendo el método de Besarati Nia y col. (2000). Se realizó un contaje de las células, y su viabilidad se determinó empleando la técnica de exclusión de azul tripan, y dos alícuotas de las células de la mucosa bucal de cada paciente para realizar el ensayo cometa versión alcalina (Speit y Hartmann, 1999). Se evaluó el daño al ADN determinando el porcentaje de ADN en la cola (% ADN), la longitud de la cola (µm) y el momento de la cola, definido como el producto de la longitud del cometa y la cantidad de ADN en la misma. El contenido metálico se determinó mediante ICP-MS. La biocompatibilidad de los materiales se evaluó a través de las frecuencias de células en apoptosis, células con cometas y viabilidad celular. La viabilidad celular fue inferior en los pacientes con ortodoncia, existiendo correlaciones negativas significativas con los niveles de los metales. Ello indicó que las aleaciones de Ni y Co liberaron iones metálicos Introducción / Introduction 86 en cantidades suficientes para inducir daños citotóxicos evidentes. Ambos metales indujeron daños en el ADN, existiendo correlaciones positivas entre: contenidos de Co en las células bucales y la longitud de las colas de los cometa, y entre el nº de cometas y células en apoptosis. Determinaron correlación positiva entre iones de Ni y nº de células cometa, existiendo correlación negativa entre niveles de Ni y viabilidad celular. Este estudio corroboró los potenciales efectos tóxicos de Ni y Co, que pueden producir rotura del ADN en células de la mucosa oral. Normalmente, las células pueden reparar estas lesiones, pero la pérdida de su capacidad de reparación o deficiencias enzimáticas en los procesos de reparación puede iniciar los efectos adversos. Algunas críticas recibidas para este trabajo y los puntos que debían clarificarse estuvieron relacionadas con: 1) Las poblaciones de células no estaban caracterizadas y era posible que más de un tipo de células epiteliales con diferentes potenciales de apoptosis estuvieran agrupadas en los ensayos; 2) El análisis estadístico de los contenidos celulares de Ni y Co y la significación de las interacciones no quedó establecida. Por todo ello se aconseja seguir con los estudios para establecer de forma inequívoca la importancia crítica de estos hallazgos. Posteriormente han sido varios los ensayos llevados a cabo, especialmente en aplicaciones ortodóncicas clásicas, como brackets etc., siendo necesario hacer una revisión actual del tema para evaluar la posible relación existente entre liberación de elementos metálicos y producción de genotoxicidad in vivo, y por otro lado, existe la necesidad de investigar diferentes aplicaciones ortodóncicas de uso más actual. Ensayo de Micronúcleos (MN): El ensayo de micronúcleos (MN) se basa en la frecuencia de micronúcleos, estructuras que se originan a partir de fragmentos de cromosoma o de cromosomas completos que no están incluidos en el núcleo principal durante la división nuclear (Fenech y col., 1999). Así, los MN surgen a partir de la fractura Introducción / Introduction 87 de ADN, conduciendo a un cromosoma acéntrico, así como a partir de un cromosoma/cromatina que se encuentre rezagado en anafase. La formación de MN está considerada un biomarcador efectivo de enfermedades y procesos asociados con la inducción del daño de ADN. Westpahlen y col. (2008) han investigado la genotoxicidad de algunas aplicaciones ortodóncicas fijas, empleando la combinación de los ensayos de Micronúcleos (MN) y del cometa sobre condiciones alcalinas en células bucales. El procedimiento de obtención de las muestras fue similar al de Faccioni y col. (2003), mediante cepillado de la parte interna del labio superior pero con un cepillo citológico, siguiendo las recomendaciones de Holland y col. (2008), después de lavado de la boca varias veces con agua tibia para eliminar las células muertas exfoliadas. El ensayo de MN fue llevado a cabo mediante el protocolo estandarizado de Holland y col. (2008), mediante teñido de las células y observación al microscopio. El daño primario al ADN, evaluado por el ensayo cometa fue bajo al principio, ó tras 10 días del tratamiento, no existiendo diferencias significativas en ambos periodos, demostrándose que no se induce daño genético. Sin embargo, se produjo un incremento significativo de la frecuencia de MN 30 días después de comenzar el tratamiento. La diferencia en los resultados obtenidos por ambos ensayos se basa en que miden indicadores genéticos específicos, generalmente el ensayo cometa detecta más daño en el ADN que el ensayo de MN. Los resultados positivos en el ensayo cometa no siempre se corresponden con resultados positivos en el ensayo de MN. En este estudio el ensayo de MN se mostró más sensible. Se recomienda la combinación de ambos ensayos porque: permite la detección de daño primario en el ADN (ensayo cometa), reparable, en un corto periodo de tiempo, mientras que el ensayo de MN detecta daños cromosómicos en un estadio posterior. A partir de estos trabajos pioneros, se han sucedido diversas investigaciones in vivo sobre células de la mucosa oral, sobre el potencial genotóxico de las aplicaciones ortodóncicas, cuyos resultados son contradictorios. Introducción / Introduction 88 Son estudios no estandarizados entre si, variables en el número de pacientes, con materiales diferentes, y con tiempos de medida del potencial genotóxico diverso (inicio, final tratamiento, etc.). Por ello sería muy conveniente hacer una revisión sobre el estado actual del tema, y realizar estudios experimentales in vivo que nos permitan avanzar en el conocimiento de esta temática. Introducción / Introduction 89 5. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS Agaoglu G, Arun T, Izgu B, Yarat A. Nickel and chromium levels in the saliva and serum of patients with fixed orthodontic appliances. Angle Orthod 2001; 71:375-379. Amini F, Borzabadi Farahani A, Jafari A, Rabbani M. 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JUSTIFICACIÓN Y OBJETIVOS / SIGNIFICANT AND PURPOSES Justificación y Objetivos/Significance and Purposes 100 A la vista de los antecedentes bibliográficos expuestos anteriormente, se constata la necesidad de actualizar de forma global y sistemática las últimas contribuciones al avance del conocimiento sobre la biocompatibilidad de los materiales ortodóncicos considerando las últimas aportaciones que se hayan publicado sobre la liberación de los elementos metálicos a partir de los mismos y sus principales efectos tóxicos, haciendo especial hincapié en los estudios de citotoxicidad y genotoxicidad realizados con este tipo de materiales en células de la mucosa oral, habida cuenta del potencial citotóxico y genotóxico de muchos de ellos. En este sentido, se plantearon revisiones bibliográficas que implican una puesta al día de los efectos citotóxicos y genotóxicos que pueden presentarse potencialmente tras la liberación de diversos cationes metálicos, como Ni, Cr, Co, Fe, Cu, revisando los aspectos toxicológicos más relevantes de los mismos; incluyendo una revisión sistemática enfocada sobre una de las matrices objeto de este estudio, células de mucosa oral, que incluya específicamente los efectos agudos celulares y sobre el ADN inducidos por contacto directo con las aplicaciones ortodóncicas. Al constatarse la escasez de métodos adecuados que permitan valorar in vivo la liberación de elementos metálicos mediante diversas técnicas espectroscópicas, y que los aplicados hasta la actualidad carecían de validación, se decidió desarrollar, optimizar y validar métodos que permitieran cuantificar de forma simultánea, exacta y reproducible los elementos que potencialmente pueden liberarse de aplicaciones ortodoncias fijas, en células de mucosa oral de pacientes mediante la técnica de Emisión de Plasma acoplado inductivamente- Espectrometría de Masas (ICP-MS). Por otro lado, se ha considerado necesario investigar la utilidad del pelo como nueva matriz para cuantificar y valorar la exposición a metales procedentes de lixiviados a partir de aparatología ortodóncica de forma crónica, identificando así los riesgos tóxicos a largo plazo, Justificación y Objetivos/Significance and Purposes 101 empleando la técnica de Espectrometría de Absorción atómica (AAS). Debido a la implantación cada vez mayor del uso de mini-implantes en ortodoncia, nos resultó interesante identificar y valorar la posible contribución que puede suponer su empleo en la liberación de metales iónicos en la mucosa oral de pacientes, así como investigar sus posibles efectos genotóxicos in vivo, utilizando para ello el ensayo cometa, siendo estas investigaciones pioneras en el caso de mini-implantes. Por todo ello, los objetivos específicos propuestos en la presente Tesis Doctoral han sido: 1. Realizar una revisión de actualización de la bibliografía científica sobre los efectos tóxicos, en particular citotóxicos, y genotóxicos inducidos por aparatología ortodóncica in vitro, e in vivo. Además, se revisará de forma sistemática la literatura científica relativa a las células de la mucosa oral, una de las matrices objeto de estudio. 2. Desarrollar y validar métodos analíticos-toxicológicos, incluyendo ensayos de robustez, que permitan la cuantificación simultánea de la liberación de elementos metálicos diversos, como Co, Cr, Cu, Ni, Ti, V y Zr a partir de aparatología ortodóncica in vivo, en células de mucosa oral de pacientes tratados, por Espectroscopia de Plasma inducido acoplado a Espectrometría de Masas ( ICP-MS). 3. Investigar la idoneidad del pelo como matriz no invasiva que permita evaluar la potencial acumulación de metales in vivo en pacientes tratados con aplicaciones ortodoncias fijas, en comparación con una población control. Estudiar la posible interrelación entre dichos elementos metálicos liberados, y valorar si las posibles diferencias de los contenidos de cationes metálicos cuantificados en ambas poblaciones pueden estar Justificación y Objetivos/Significance and Purposes 102 ligadas bien a factores humanos (edad, sexo), y/o factores ligados a los tratamientos (tiempo de tratamiento, maloclusión, extracción). 4. Evaluar in vivo la contribución que puede suponer el empleo de microtornillos en la liberación de metales en células de mucosa oral de pacientes sometidos a un tratamiento ortodóncico. Investigar posibles interrelaciones de los contenidos metálicos entre sí, y su relación con el tipo de tratamiento. 5. Poner a punto y optimizar el ensayo del cometa in vivo en células de mucosa oral humana y su aplicación para valorar daños genotóxicos derivados de las aplicaciones ortodoncicas fijas y mini-implantes en pacientes sometidos a dichos tratamientos. Esta Tesis Doctoral esta estructurada como una recopilación de artículos científicos. Los tratamientos ortodóncicos y la obtención de muestras se ha llevado a cabo en las instalaciones de la Clínica Universitaria de la Facultad de Odontología de la Universidad de Sevilla. Los estudios han contado con la aprobación del Comité Ético de la Universidad de Sevilla, y con el consentimiento escrito firmado por todos los pacientes. El trabajo experimental se ha realizado en el Área de Toxicología de la Facultad de Farmacia de la Universidad de Sevilla, haciendo uso así mismo de las instalaciones de los Servicios de Biología, Microscopía y de Radioisótopos del Centro de Investigación, Tecnología e Innovación de la Universidad de Sevilla (CITIUS). Asimismo, las investigaciones sobre la determinación de metales en pelo se han llevado a cabo en los laboratorios del área de Toxicología del Departamento de Medicina Legal, Toxicología y Antropología Física de la Universidad de Granada, gracias a la colaboración de la Dra. Molina-Villalba, y muy especialmente al trabajo y Justificación y Objetivos/Significance and Purposes 103 supervisión del Profesor Dr. Fernando Gil Hernández, Catedrático de Toxicología de la Universidad de Granada. Siguiendo la normativa de la Universidad de Sevilla, el resumen, la justificación y objetivos, y las conclusiones se redactan tanto en castellano como en inglés para optar a la “Mención Internacional en el Título de Doctor”. Justificación y Objetivos/Significance and Purposes 104 Taking into account the scientific literature previously described, there is a need to up to date thoroughly the most recent contributions on the biocompatibility of orthodontic materials considering the last reports regarding the release of metallic elements from them and their main toxic effects, with special focus on their cytotoxicity and genotoxicity on buccal mucosa cells, as they are known to be cytotoxic and genotoxic. In this sense, different bibliographic reviews were considered: on one hand the actualization of the cytotoxic and genotoxic effects than can potentially appear after the exposure to different metallic ions, such as Ni, Cr, Co, Fe, Cu released from orthodontic appliances, reviewing their most relevant toxicological aspects and, on the other hand, a systematic review focused on one of the matrices studied, oral mucosa cells. Once it was realized that appropriate methods to evaluate in vivo the release of metallic elements by different spectroscopic techniques were scarce, and that those already applied were not validated we decided to develop, optimize and validate methods that would allow to quantify in a simultaneous, exact and reproducible way, the elements that can be potentially released from fixed orthodontic appliances, in oral mucosa cells of patients by Inductively Couple Plasma-Mass Spectrometry (ICP-MS). Moreover, we considered also valuable to investigate the applicability of scalp hair as a new matrix to quantify and evaluate the exposure to metals from lixiviates of orthodontic appliances, identifying potential toxic risks after long exposures, using Atomic Absorption Spectrometry (AAS). Due to the growing use of mini-implants in the orthodontic practice, we considered interesting to identify and evaluate the contribution of their use in the release of metallic ions in the oral mucosa cells of orthodontic patients, as well as Justificación y Objetivos/Significance and Purposes 105 to investigate their potential genotoxic effects in vivo, using the Comet assay, an issue not previously studied. Therefore, the specific objectives of this PhD thesis were: 1. To perform a review in order to up to date the scientific bibliography regarding to the toxic effects, particularly citotoxicity and genotoxicity, induced by orthodontic appliances both, in vivo an in vitro. Furthermore, a systematic review of the scientific literature regarding oral mucosa cells, one of the matrices studied, will be performed. 2. To develop and validate analytic-toxicological methods, including robustness assays, that allow to quantify simultaneously the release of different metallic elements such as Co, Cr, Cu, Ni, Ti, V and Zr from orthodontic appliances in vivo, in oral mucosa cells of orthodontic patients, by Inductively Coupled Plasma- Mass Spectrometry (ICPMS). 3. To investigate the suitability of scalp hair as non invasive matrix to assess the potential accumulation of metals in vivo in orthodontic patients, in comparison to a control population. To study the potential correlation among the released metallic elements and evaluate whether the differences found in the content of metallic cations quantified in both populations could be linked to human factors (age, sex) and/or factors related to the treatment (time, malocclusion, extraction). 4. To evaluate in vivo the contribution of the use of mini-implants to the release of metals in oral mucosa cells of orthodontic patients. Also, to Justificación y Objetivos/Significance and Purposes 106 investigate potential interrelations between metallic elements and their relation with the treatment. 5. To improve and optimize the in vivo Comet assay in human oral mucosa cells and their application to evaluate the genotoxic damage due to the use of fixed orthodontic appliances and mini-implants in patients with such treatments. This PhD thesis is structured as a compendium of scientific articles. The orthodontic treatments and the sampling took place in the facilities of the University Clinic of the School of Dentistry of the University of Sevilla. The studies had the approval of the Ethical Committee of the University of Sevilla, and the written consent of all participants was obtained. The experimental work has been performed in the Area of Toxicology of the Faculty of Pharmacy (University of Sevilla) as well as in the Services of Biology, Microscopy and Radioisotopes from Centro de Investigación, Tecnología e Innovación from the University of Sevilla (CITIUS). Moreover, the studies regarding the determination of metals from hair were performed in the laboratory of the Area of Toxicology of the Department of Legal Medicine, Toxicology and Physic Anthropology of the University of Granada, thanks to the collaboration with Dr. Molina-Villalba and particularly to the efforts and supervision of Dr. Fernando Gil Hernández, full Professor of Toxicology of the University of Granada. Following the regulations from the University of Sevilla, the summary, significance and purposes, and conclusions are written both in Spanish and in English to aim for a PhD with international mention. IV. RESULTADOS Y DISCUSIÓN / RESULTS AND DISCUSSION the recovery ranges (%) could oscillate between 40 and 120%, 60 and 115%, and 60 and 110%, for 1 ng/mL, 10 ng/mL and 50 ng/mL, respectively. The recoveries obtained oscillated between 101 and 108% for Ti, and between 92 and 104% for Zr. In the case of V the recoveries oscillated between 98 and 111%. All the recovery data fulfill the rule previously mentioned, and the method can be considered bias-free. In summary, this procedure has been successfully assessed for trueness, intermediate precision and repeatability. 3.3.2. Robustness study Robustness, considered in the sense of internal validation, deals with the effect of experimental variables, called factors, inherent in the analytical procedure (e.g., temperature, digestion conditions, pH, etc.) on the analytical result. A robustness study examines the alteration of these factors, as expected in a transfer between laboratories, so it is of the utmost importance in the uncertainty budget. The strategy for carrying out our robustness study is based on a landmark procedure suggested by Youden [35], according to the practical guide of González and Herrador [31]. Three influential factors in the sample preparation procedure were identified: (X 1 )heating time employed; (X 2 ) volume of the deionized water used to dilute the samples, and (X 3 ) volume of PlasmaPure 65% HNO 3 employed. The levels are coded according to the rule: high value¼þ1(X 1 ¼70 min; X 2 ¼10.1 mL; X 3 ¼200 mL), and low level¼ 1(X 1 ¼60 min; X 2 ¼10.0 mL; X 3 ¼100 mL). The effect of every factor is estimated as the difference of the mean result obtained at the level þ1 from that obtained at the level 1. Once effects have been estimated, to determine whether variations have a significant effect on the results, a significance t-test is used [39], and the t-values (X k ) are compared with the 95% confidence level two-tailed tabulated value with the degrees of freedom coming from the precision study for each concentration. In the present study, the experiments were carried out using validation standards spiked with 25 ng/mL of each metal considered (Ti, V and Zr), and each factor was analyzed by quintuplicate in two different days. So, for 9 degrees of freedom, the t-values obtained for X 1 ,X 2 and X 3 factors are shown in Table 4. In all cases, t(X k )ot tab (2.262), and therefore the procedure can be considered as robust against the three factors considered (at the levels fixed in the study) for Ti, V and Zr determination. 3.4. Evaluation of titanium, vanadium and zirconium in patients with and without fixed orthodontic appliances The cellular contents of the three elements from 40 patients, 20 of the control group and 20 of the orthodontic group, according to the proposed and validated method, were measured. The median values obtained for titanium concentration were 3.80 and 2.50 ng/ g in orthodontic and control groups, respectively. Moreover, the mean value in control group (5.1473.90 ng/g) was similar to that found in orthodontic patients (5.2373.50 ng/g) and no significant differences were detected. Patients using NiTi arches showed slightly increased Ti values in comparison to patients wearing stainless steel arches, but no significant differences were found. Only traces of Zirconium were detected in the orthodontic group (0.5470.30 ng/g) and control group (0.32, lesser than the detection limit), and no significant differences were found between them. Vanadium was not detected in either the orthodontic group or the control group. These results are consistent with the minor presence of this metal in the composition of the orthodontic materials employed in this study (0.18–0.19% only in the case of bands), but the method would be suitable for monitoring emergent materials, such as Gum metal [6]. In comparison to other in vivo studies, our results are in agreement with the previous study by Natarajan et al. [29],in which the presence of Ni and Cr ions in the experimental group were not significantly higher than those in the control group. By contrast, Faccioni et al. [28] reported 3.4-fold and 2.8-fold increases in Ni and Co concentrations in oral mucosa cells of orthodontic patients. Fernández-Miñano et al. [30] reported that buccal cells that had been in contact with stainless steel showed higher concentrations of Ti 47 and Mn 55 than the control cells. Amini et al. [1], only found Ni contents significantly higher in mucosa cells of orthodontic patients compared with their nonappliance controls, and they did not report differences in chromium (Cr) and cobalt (Co) cell contents. Hafez et al. [27] reported that fixed orthodontic appliances for 6 months increased the Ni and Cr contents of the buccal mucosa cells. All these findings indicated that to ensure the safety of patients, further research would be needed to determine the long-term significance of metals release. Consequently, the development and validation of methods which permit their quantification in oral mucosa cells, which seemed advantageous because they are in direct contact with the appliances, is of great interest. 4. Conclusions In summary, we have developed and validated a method for titanium, vanadium and zirconium determination in oral mucosa cells from orthodontic patients in comparison to control patients, using a digestion procedure and quantification by ICP-MS. The procedure has been successfully assessed for trueness and precision, and can be considered as robust against the three factors considered in the digestion procedure, such as the heating time employed, the volume of the deionized water used to dilute the samples and volume of PlasmaPure 65% HNO 3 employed. The proposed method could be suitable for monitoring of these metals in buccal mucosa cells of orthodontic patients, as routine method to test the biocompatibility of fixed orthodontic appliances, and for in vivo studies focused in the discharge of metals from this kind of appliances. Acknowledgment The authors wish to thank the Junta de Andalucía (PAIDI CTS-358) for the financial support for the present study. We also thank the X- ray laboratory of CITIUS (University of Seville) for the microfluorescence analysis. References [1] F. Amini, A. Borzabadi Farahani, A. Jafari, M. Rabbani, Orthod. Craniofacial Res. 11 (2008) 51–56. [2] G.F. Andreasen, T.B. Hilleman, J. Am. Dent. 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Microchemical Journal 114, : 73-79, 2011 Development and validation of an inductively coupled plasma mass spectrometry (ICP-MS) method for the determination of cobalt, chromium, copper and nickel in oral mucosa cells Ana Martín-Cameán a, ⁎, Angeles Jos b , Ana Calleja c ,FernandoGil d , Alejandro Iglesias-Linares a , Enrique Solano a , Ana M. Cameán b a Stomatology Department, School of Dentistry, University of Seville, Spain b Area of Toxicology, Faculty of Pharmacy, University of Seville, Spain c Investigation, Technology and Innovation Center, University of Seville, Spain d Department of Legal Medicine and Toxicology, School of Medicine, University of Granada, Spain abstractarticle info Article history: Received 10 November 2013 Accepted 9 December 2013 Available online 17 December 2013 Keywords: Metals Oral mucosa cells ICP-MS Orthodontic appliances The oral cavity is an ideal environment for the corrosion of fixed orthodontic appliances, leading to the release of metal ions that, eventually, could derive in adverse effects. Therefore, it is necessary to evaluate the biocompatibility of these materials for patient's safety. In vivo, oral mucosa cells are a valuable sample for this aim, however, analytical methods to quantify the liberation of metal ions are very scarce. Thus, the purpose of this work is to optimize and validate a sample preparation procedure to determine cobalt (Co), chromium (Cr), copper (Cu), and nickel (Ni) in oral mucosa cells in patients with and without orthodontic appliances, based on the extraction and digestion of the samples and quantification of the elements by inductively coupled plasma mass spectrometry (ICP-MS). The method has been suitably validated: the regression equation was calculated from standards prepared in the same matrix without oral mucosa cells and the linear range was 2.0–100.0 ng mL −1 for all elements. Limits of detection were 0.10, 0.38, 0.49 and 0.67 ng mL −1 and limits of quantification were 0.20, 1.13, 0.98, and 1.81 ng mL −1 for Co, Cr, Cu, and Ni, respectively. The recovery percentages (%) obtained ranged between 104 and 109 for Co, 103–107 for Cr, 106–113 for Cu and 84–110 for Ni. Intermediate precision (RSD%) data obtained were also adequate. The present method proved to be robust for the three factors considered: heating time, volume of deionized water, and volume of PlasmaPure 65% HNO 3 used to dilute the samples. Thus, the proposed method passed in a satisfactory way the validation standards considered and could be used to evaluate in vivo the metal ion release in oral mucosa cells from orthodontic patients. © 2013 Elsevier B.V. All rights reserved. 1. Introduction Orthodontic appliances are commonly used in dentistry to correct teeth and jaws that are positioned improperly. These intraoral fixed orthodontic appliances include brackets, bands, and archwires that are made of alloys containing nickel (Ni), cobalt (Co), and chromium (Cr) in different percentages, and also iron and copper. The different types of orthodontic archwires contain 15% to 54% Ni, 20% to 30% Cr and 40% to 60% Co [1,2]. It is well known that all metals and alloys are subject to corrosion, being electrochemical breakdown the most common type. In this context, orthodontic alloys emit electrogalvanic currents with saliva as the medium, leading to a release of metal ions on the mouth's mucosa [3]. Therefore, resistance to corrosion in the mouth is a fundamental aspect of biocompatibility. Several factors might affect, such as the manufacturing process, type of alloy, surface characteristics of the piece, environment in which the piece is inserted, and use of the alloy (aging) [4]. Moreover, the oral environment is particularly ideal for biodegradation of metals because of its ionic, thermal, microbiologic, and enzymatic properties [5,6]. One of the roles of Ni in the alloys is to increase the strength, ductility, and resistance to general, crevice and erosion corrosion. Cr ions provide an electrochemically formed passive film that offers protection against aggressive ions in the oral environment and also prevents corrosion. However, it has been reported that the major corrosion products are Fe, Cr, and Ni for stainless steel, and Ti and Ni for nickel–titanium alloys [7]. The general belief that there is no frank concern regarding the corrosion by-products released in orthodontic patients is not actually supported. Metals are not biodegradable, and their sustained leakage might produce irreversible toxic effects from their accumulation in the tissues [8]. Moreover, it has been reported that metal ions are taken up by the adjacent oral tissues [1,7,9]. Microchemical Journal 114 (2014) 73–79 ⁎Corresponding author at: Stomatology Department, School of Dentistry, University of Seville, C/Avicena sn, C.P. 41009 Seville, Spain. Tel.: +34 954 556762; fax: +34 954 556422. E-mail address: [email protected] (A. Martín-Cameán). 0026-265X/$ –see front matter © 2013 Elsevier B.V. All rights reserved. http://dx.doi.org/10.1016/j.microc.2013.12.009 Contents lists available at ScienceDirect Microchemical Journal journal homepage: www.elsevier.com/locate/microc Nickel toxic effects are well known although it is considered an essential trace element. It is one of the most common causes of allergic contact dermatitis [10,11]. Ni compounds are classified as human carcinogens (group 1) by the International Agency for Research on Cancer [12]. Chromium and Co ions can also cause hypersensivity and dermatitis. These metals can induce cytotoxicity and genotoxicity [12–14]. Copper has been reported to be more cytotoxic than Ni [15].Also, some heavy metals used in the fabrication of archwires, such as Fe, Cu, and Co undergo redox cycling, therefore directly producing free radicals, whereas Ni produces free radicals indirectly [16]. Actually, orthodontic archwires containing Cu induce oxidative stress in vitro, although copper–nickel–titanium and rhodium–coated nickel–titanium showed relatively lower toxicity compared with conventional nickel–titanium [2]. Various studies have evaluated the release of metal ions from orthodontic appliances in biologic fluids, and most have concluded that they do not reach toxic concentrations. However, it cannot be excluded that even nontoxic concentrations might be sufficient to produce biologic changes in the oral mucosa [17]. Taking all these into account the monitoring of the release of metal ions from orthodontic appliances is of interest. In this regard, there are different available techniques including atomic absorption spectroscopy (AAS), inductively coupled plasma atomic emission spectrometry (ICP-AES), or inductively coupled plasma mass spectrometry (ICPMS). Nowadays, by application of ICP-MS the fast and accurate routine multi-element determination in biological samples and other matrices has become possible due to improved sensitivity and robustness [18,19]. Hair, serum, blood and urine are the conventional biological samples used for metal content determination. However, other samples such as saliva or mucosa cells have been reported to be useful to determine the metal release from orthodontic appliances. Thus, different authors have indicated an increase in the salivary concentration of Ni [20] and Cr following the insertion of fixed orthodontic appliances [6,21–23].However, the disadvantage of saliva in comparison to oral mucosa cells is related to its flow, which is influenced by many factors. Saliva flow does not influence all substance concentrations to the same degree, so it can still be a useful matrix for non-flow-dependent chemicals [24]. Moreover, saliva will provide information at the moment of sampling only [8]. Regarding metal content determination in oral mucosa cells, reports are also very scarce [1,7,8,17,25] and results are contradictory. It is important to highlight that, to the extent of our knowledge, no previous validation data are available on this matrix, including robustness assays, apart from the study of our research group on the validation of an ICPMS method to determine titanium, vanadium and zirconium in oral mucosa cells from orthodontic patients [26]. The aim of the present study was to optimize and validate a rapid, sensitive and robust sample preparation procedure to determine simultaneously Co, Cr, Cu, and Ni in oral mucosa cells in patients with and without orthodontic appliances, based on the extraction and digestion of the samples and quantification of the elements by Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometry (ICP-MS). A suitable and practical procedure for assessing the trueness and precision of the proposed method has been applied by using validation standards, according to González et al. [27]. The present procedure has been intended for evaluating the in vivo potential release of these metals to oral mucosa cells from fixed orthodontic appliances. 2. Materials and methods 2.1. Reagents and materials High purity deionized water (N18 MΩ·cm) obtained by a Milli-Q water purification system (Millipore, Bedford, MA, USA) was used throughout. All transfer pipettes, centrifuge tubes, plastic bottles, autosampler vials and glassware material were cleaned by soaking in 20% v/v HNO 3 analytical reagent grade for 4 h, rinsing three times with Milli-Q water, according to EPA method 200.8 (United States Environment Protection Agency, version 5.4, 1994), and drying in a laminar flow hood. Blank solution consisted of 1% v/v HNO 3 , prepared by diluting 65% PlasmaPure nitric acid (SCP Science, Courtaboeuf, France) with the appropriate volume of Milli-Q water. A tuning solution containing 10 ng mL −1 cerium (Ce), cobalt (Co), lithium (Li), thallium (Tl) and yttrium (Y) in 1% HNO 3 was prepared from single-element 10,000 μgmL −1 stock standards (AccuStandard, Inc., New Haven, CT, USA), and was used to optimize ICP-MS parameters before each analytical run. Rhodium 1 μgmL −1 , prepared from a 100 μgmL −1 stock solution (AccuStandard, Inc., New Haven, CT, USA) was used as an internal standard solution throughout the whole analysis. A standard solution containing 1 μgmL −1 of Co, Cr, Cu and Ni was prepared in 100 mL Pyrex glass volumetric flask by dilution of 10 μg mL multi-element standard solution for ICP-MS (AccuStandard, Inc., New Haven, CT, USA) with the suitable amount of blank solution. The standard solution of 1 μgmL −1 was subsequently diluted with the suitable amount of blank solution to obtain working solutions (100 ng mL −1 or 50 ng mL −1 ) in order to spike the digestion extracts and prepare the validation standards of 1, 2, 3, 5, 10, 25, 50, and 100 ng mL −1 . 2.2. Instrumentation All ICP-MS measurements of metal contents were carried out in an Agilent 7500c ICP-MS (Agilent Technologies, Japan), provided with and Octupole Reaction System and an Integrated Autosampler (Agilent Technologies, Japan). Sample introduction was performed with a Babington PEEK (poly-eter-eter-ketone) nebulizer combined with a double-pass spray chamber (Agilent Technologies, Japan). The spray chamber was water-cooled at 2 °C to ensure temperature stability and to reduce water vapor present in the nebulizer gas flow. The ICP torch consists of a three-cylinder assembly, with injector diameter 2.5 mm. Shield torch was used throughout the whole analysis. All instrument parameters were optimized daily while aspirating the tuning solution. Typical ICP-MS operating parameters are summarized in Table 1. These parameters were optimized to obtain the highest signal-to- background ratio for 7 Li, 59 Co, 89 Y, 140 Ce and 205 Tl,aswellasminimizing the oxides ( 140 Ce 16 O + / 140 Ce + ), hydrides ( 140 CeH + / 140 Ce + )and doubly-charged ( 140 Ce ++ / 140 Ce + )signals.The 140 Ce 16 O + / 140 Ce + signal was minimized to 0.8%. Table 1 Typical ICP-MS instrument parameters. Parameter Setting RF a power (W) 1500 RF matching (V) 1.80 Sampling depth (mm) 4.6 Carrier gas (L min −1 )1.15 Spray chamber temperature (°C) 2 Nebulizer pump (revolutions per second, rps) 0.1 Extract (V) 3.8 Einzel 1,3 (V) −100 Einzel 2 (V): 22 Cell entrance (V) −50 Cell exit (V) −47 Plate bias (V) −44 QP b bias (V) −4.5 OctP c RF (V) 190 OctP bias (V) −7.0 a RF: Radiofrequency. b QP: Quadrupole. c OctP: Octupole. 74 A. Martín-Cameán et al. / Microchemical Journal 114 (2014) 73–79 2.3. Sample collection and preparation Forty subjects were included in this study. Twenty patients required fixed orthodontic treatment (orthodontic group or test group), and 20 subjects served as the control group who were not undergoing orthodontic treatment. The inclusion criteria for subject selection in both groups included non-smokers; no oral diseases, no systemic diseases, no oral restorations or prosthetic; clinically healthy oral mucosa; no previous orthodontic treatment; no occupational exposure to metals, and not receiving any medication or supplements. Subjects were initially screened with a questionnaire to check whether they fit the criteria of the study. Afterwards they were clinically assessed for normal oral mucosa [8]. The duration of the orthodontic treatment of patients was 13–15 months. The aims and the method of cell collection were explained to all subjects, and written consentto participate was obtained. Treatment was started after the institutional ethical committee of the University of Seville approved the protocol. The fixed of appliances consisted of an average of 4–8 bands or tubes and 20 bonded brackets. The material used was stainless steel alloys SAF2205, AISI316L and AISI303 for the brackets, tubes and bands, (DM Ceosa; Madrid, Spain). The ligatures were made of stainless steel alloy AISI304. The archwires used in this study were nickel–titanium alloys (DM Ceosa, Madrid, Spain) or stainless steel (DM Ceosa, Madrid, Spain). The materials used in this study were analyzed by Micro-Xray fluorescence (μXRF) [26]. The source of Cr and Ni comes from all the materials employed in the orthodontic treatment: stainless steel ligatures, bands, brackets, tubes, and arches (TMA, nickel–titanium and stainless steel). Similarly, Cu proceeds from the orthodontic appliances with the exception of nickel–titanium arches. Finally, the potential release of Co is from stainless steel arches. The participants were asked to rinse their mouth with tepid water for 1 min to remove exfoliated dead cells. Epithelial cells of buccal mucosa from each patient were collected, using a soft rubber interdental brush without any metal content, as stated by the manufacturer (Sunstar Iberia S.L., San Just Desvern, Spain), and following the method of Besarati Nia et al. [28], by gentle brushing of the internal part of the oral mucosa in contact with the orthodontic appliances. After reviewing the scientific literature several sampling instruments were found to be of common use, such as wooden tongue depressors [8], metal spatula [17] or interdental brushes [7,28]. Preliminary analysis was carried out in our laboratory in order to assess the suitability of the different sampling tools for the intended determinations. Noticeable metal background was found in the case of mini toothbrush and interdental brush with metallic parts (data not shown). Once the samples were collected, the amount of cell suspension containing approximately 1000 cells was calculated and then they were digested and measured following the method of Natarajan et al. [17] with some modifications regarding the water and nitric acid volumes employed, the heating time (60 min instead of 30 min), and the use of an internal standard. Briefly, each interdental brush was introduced into a previously cleaned (4 h in 20% v/v HNO 3 ) 50 mL centrifuge tube, together with 10 mL of deionized water and 100 μL of PlasmaPure 65% HNO 3 . Then, samples were heated in a water bath at 80 °C for 60 min. Afterwards, samples were cooled lightly and sonicated in an ultrasonic bath for 5 min. Finally, samples were cooled down to room temperature, and the acid solution was separated from the brush. Acid solutions were stored in clean 20-mL polypropylene vials at 4 °C until analysis. 5 mL of the sample volume was required for the analysis. The amounts of metals assayed in the cells were quantitatively assessed by ICP-MS. The addition of the internal standard ( 103 Rh) was performed on-line. The same procedure was applied to the clean interdental brushes without sample in order to obtain the methodological blank. Extraction efficiencies were performed in triplicate by spiking the matrix, clean interdental brush without oral mucosa cell submitted to the same extraction procedure, with the multi-element standard solution at three concentration levels: 5, 10 and 50 ng mL −1 for each element. Besides, a robustness study was carried out by spiking the matrix with a standard solution of 25 ng mL −1 of each analyte. 2.4. Statistical criteria calculations for method validation The study of intermediate precision and trueness was performed by applying a one-factor ANOVA (GraphPad InStat software Inc., La Jolla, USA) between days. Three validation standards covering the optimal working range (1.0–100.0 ng mL −1 ) were used. Each validation standard was measured in quintuplicate in two different days. From the ANOVA results, as explained in the “Results and discussion”section, both the intermediate precision and the recovery were obtained. The values have been compared with tabulated reference values. The robustness study was carried out using an intermediate validation standard (25 ng mL −1 of each metal) according to the Youden procedure [29].Theinfluential factors (the heating time employed, the volumeofthedeionizedwaterusedtodilutethesamples,andthevolume of PlasmaPure 65% HNO 3 employed) were tested according to the Student t-test as indicated below. Data of metal content from oral mucosa cell of patients (control and orthodontic patients) are expressed as mean ± standard deviation, and median and range of values obtained were also reported. Data distribution was always found non-normal, and accordingly, nonparametric methods were applied. Dunn test was used for comparing the individual treatments. Statistical significance was inferred at pb0.05 (GraphPad InStat software Inc., La Jolla, USA). 3. Results and discussion 3.1. General aspects In order to develop the ICP-MS method for the detection of Co, Cr, Cu and Ni in oral mucosa cells, commercially available calibration standards solutions of the four elements were prepared by diluting the appropriate volume of a 10 μgmL −1 mixed-element working standard with blank solution, to final concentrations of 1, 2, 3, 5, 10, 25, 50 and 100 ng mL −1 of each element. These calibration standards were used to assess the linear calibration range of the instrument. It was found that, at least between 1.0 and 100 ng mL −1 range, the response of the ICP-MS was linear. The internal standard Rh solution (1 μgmL −1 ), was added online to every blank, validation standard and sample. Selected isotopes were 59 Co, 53 Cr, 65 Cu and 60 Ni. Three-points-per- mass peak pattern was chosen, and measurements were carried out in three replicates. Integration times per point, and per mass, were 0.2 s and 0.6 s, respectively, for the four elements. Integration time for internal standard was 0.01 s per point and 0.03 per mass. 3.2. Method validation 3.2.1. Linear range The response as a function of concentration of each metal was measured by at least 5-point calibration curve with a dynamic range of two orders of magnitude (1.0–100.0 ng mL −1 ). In all cases, the ratios CPS analyte/CPS internal standard (being CPS counts per second) were recorded as signal. Response linearity was established according to Huber [30] by plotting the called response factors (signal response/analyte concentration) against their respective concentrations. Responses were obtained from eight spiked interdental brush with working standards of Co, Cr, Cu and Ni, introduced in clean 50 mL centrifuge tubes and submitted to the digestion and ICP-MS proposed procedure in triplicate. The Huber plots obtained for the metals assayed are shown in Fig. 1. The target line has zero slope and the intercept is just the median of the response factors obtained. Two parallel horizontal lines are drawn in the graph at 0.95 and 1.05 times the median value of the response factors in a fashion similar to the action limits of control charts. For all elements, the adequate linear range of the method found was 2.0– 75A. Martín-Cameán et al. / Microchemical Journal 114 (2014) 73–79 100.0 ng mL −1 . These values are similar to those found by Natarajan et al. [17] when they analyzed Ni and Cr concentrations on oral mucosa cells in a range of 1 to 40 ng mL −1 of both elements, using ICP-MS. 3.2.2. Goodness of the fit Taking into account the previous section, the linear calibration function was obtained by preparing seven calibration standards in the digestion extracts resulting from the interdental brush introduced in clean 50 mL centrifuge tubes (in triplicate) from 2.0 to 100 ng mL −1 of each element assayed, and recording the signal response according to the proposed digestion and ICP-MS procedure. Here, interdental brush treated with 10 mL of deionized water and 100 μL of PlasmaPure 65% HNO 3 are taken as blank samples and the analytes (Co, Cr, Cu and Ni) are spiked in order to obtain similar conditions for future samples. So, these calibration standards can be also considered as validation standards (VS). The calibration lines have correlation coefficients of 0.9964, 0.9996, 0.9997 and 0.9997 for Co, Cr, Cu and Ni, respectively (Fig. 2). The corresponding ANOVA of the regression lines indicates a lack-of fit F ratio of 14.11, 1.56, 1.05, and 0.12, against a critical F value of 19.4 (Fig. 2). Consequently, there is not lack-of fit and the calibration functions can be considered as linear. 3.2.3. Detection and quantitation limits The limit of detection (LOD) and the limit of quantification (LOQ) were determined, by measuring 10 independent interdental brush blanks. Limit of detection was estimated using the expression Y LOD = Y blank +3S blank, where Y blank and S blank are the average value of the blank signal and its correspondingstandard deviation. Limit of detection values were then converted into concentration by using the calibration function. The procedure for evaluating LOQ was equivalent to that of LOD, but using the factor 10 instead of 3 for calculations. The LODs obtained for the four elements were 0.10 ng mL −1 for Co, 0.38 ng mL −1 for Cr, 0.49 ng mL −1 for Cu, and 0.67 ng mL −1 for Ni. Similarly, the LOQs were 0.20, 1.13, 0.98, and 1.81 ng mL −1 for Co, Cr, Cu and Ni, respectively. To the extent of our best knowledge, no data of these parameters have been previously reported in the determination of trace metals in oral mucosa cells using this technique (ICP-MS). Similar and higher detection limits (1 ng mL −1 ) were found by Amini et al. [7] which analyzed Ni, Cr and Co in oral mucosa cells using atomic absorption spectrometry with graphite furnace (AAS-GF). 3.3. Accuracy study 3.3.1. Intermediate precision and trueness studies According to the International Conference on Harmonisation guidelines [31], precision may be considered at three levels: repeatability, intermediate precision, and reproducibility. Repeatability expresses the precision evaluated under the same experimental conditions over a short time interval, and it is termed intra-assay or within-run. Intermediate precision applies to within-laboratory variations: different days, different analysts or equipments and is sometimes called between-run or inter-assay precision [27]. On the other hand, the trueness of an analytical procedure expresses the closeness of agreement between the mean value obtained from a series of measurements and the value, which is accepted either a conventional value or an accepted reference value like validation standards [27]. Fig. 1. Huber plots for assessing linear range. Fig. 2. Linear calibration functions for the proposed procedure for the metals assayed. 76 A. Martín-Cameán et al. / Microchemical Journal 114 (2014) 73–79 Repeatability and intermediate precision were calculated analyzing five replicates of interdental brush spiked at three validation standards of the four metals considered (low, medium and high) covering the dynamic working range (2.0–100.0 ng mL −1 ) on the same day and in two different days, respectively. Considering two different days, as the main source of variation, an analysis of variance (ANOVA) was performed for each concentration, obtaining estimations of within-condition variance (S 2w ), also known as repeatability (S 2r ), and between-condition variance (S 2B ). Also, the intra-laboratory reproducibility or intermediate precision, can be estimated as the sum S 2IP =S 2r +S 2B [27,32]. All these parameters are shown in Table 2. From these data, the corresponding relative standard deviations, RSD R , were calculated and compared with the acceptable RSD percentages obtained from the AOAC Peer Verified Methods (PVM) program [27,30]. As a quick rule [27], the RSD IP results should be compared with one-half the corresponding RSD values tabulated. Our results for Co, Cr, Cu and Ni, at the concentration levels considered, were lower or the same order than the one-half %RSD AOAC tabulated for each element (Table 2). The assessment of trueness can be performed according the same ANOVA results. Trueness can be expressed as the bias or recovery obtained for each validation standard assayed [33]. The recovery term has a more intuitive meaning and it has been tested in this work. The total recovery for any validation standard is defined as the ratio between the observed estimation of the validation standards concentration, and the “true”value T, expressed as percentage or as fraction. The recoveries (%) computed for the three validation standards considered for each element are shown in Table 2. We checked them for suitability by comparison with the published acceptable recovery ranges as a function of the analyte concentration by the AOAC Peer Verified Methods program [27,30]. In our case, the recoveries obtained oscillated between 104 and 109% for Co, 103–107% for Cr, 106–113% for Cr, and 84–110% for Ni. All the recovery data fulfill the rule previously mentioned, and the method can be considered bias-free. In summary, this procedure has been successfully assessed for trueness, intermediate precision and repeatability. 3.3.2. Robustness study Robustness, considered in the sense of internal validation, deals with the effect of experimental variables, called factors, inherent in the analytical procedure (e.g., temperature, digestion conditions, pH, etc.) on the analytical result. A robustness study examines the alteration of these factors, as expected in a transfer between laboratories, so it is of the utmost importance in the uncertainty budget. The strategy for carrying out our robustness study is based on a landmark procedure suggested by Youden [29], according to the practical guide of González and Herrador [32]. Three influential factors in the sample preparation procedure were identified: (X 1 ) heating time employed; (X 2 ) volume of the deionized water used to dilute the samples, and (X 3 )volumeof PlasmaPure 65% HNO 3 employed. The levels are coded according to the rule: high value = +1 (X 1 =70min;X 2 = 10.1 mL; X 3 = 200 μL), and low level = −1(X 1 =60min;X 2 =10.0mL;X 3 =100μL). The effect of every factor is estimated as the difference of the mean result obtained at the level +1 from that obtained at the level −1. Once effects have been estimated, to determine whether variations have a significant effect on the results, a significance t-test is used [34], and the t-values (X k ) are compared with the 95% confidence level two-tailed tabulated value with the degrees of freedom coming from the precision study for each concentration. In the present study, the experiments were carried out using validation standards spiked with 25 ng mL −1 of each metal considered (Co, Cr, Cu, and Ni), and each factor was analyzed by quintuplicate in two different days. So, for 9° of freedom, the t-values obtained for X 1 ,X 2 and X 3 factors are shown in Table 3. In all cases, t(X k )bt tab (2.262), and therefore the procedure can be considered as robust against the three factors considered (at the levels fixed in the study) for determination of the metals considered. 3.4. Evaluation of cobalt, chromium, copper and nickel in patients with and without fixed orthodontic appliances The measured cellular contents of Co, Cr, Cu and Ni from 40 patients, 20 of the control group and 20 of the orthodontic group, according to the proposed and validated method, are shown in Table 4. In all cases, the mean ion metal values showed significant increases in the orthodontic group in comparison with the control group. The mean values of metal concentrations in the oral mucosa cell of orthodontic patients were increased approximately 13.5-fold, 9.5-fold, 2.0 fold, and 6.3-fold for Co, Cr, Cu and Ni, respectively. Although previous studies have evaluated metal ions in the saliva, few studies have estimated the ion content in oral mucosa cell quantitatively. In comparison to these scarce in vivo studies, our results are in agreement with the results reported by Faccioni et al. [1], which found 3.4-fold and 2.8-fold increases in Ni and Co concentrations in oral mucosa cells of orthodontic patients after 2–4 months of treatment. By contrast, Natarajan et al. [17] studied the release of Ni and Cr ions from fixed orthodontic appliances (n = 20 patients) at two times: at debonding and 30 days after debonding, and the Ni and Cr concentrations were not significantly different from normal patients, although the Cr ion concentration was higher in the experimental group at 30 days after debonding. Amini et al. [7], found Ni Table 2 Estimations of within-condition (repeatability), between-condition, intermediate precision (intra laboratory reproducibility) and recoveries of cobalt, chromium, copper and nickel assayed at three validation standards, in two different days. Co (ng mL −1 ) Cr (ng mL −1 ) Cu (ng mL −1 )Ni(ngmL −1 ) 5 10 50 5 10 50 5 10 50 5 10 50 S w 0.34 0.36 1.32 0.28 0.37 1.14 0.32 0.66 0.99 0.51 0.43 0.81 S B 0.02 0.68 3.78 0.10 0.72 3.11 0.25 0.36 3.91 0.06 0.51 2.14 S IP 0.28 0.49 2.43 0.24 0.52 2.02 0.30 0.58 2.40 0.75 0.46 1.40 RSD IP (%) 5.10 4.50 4.70 4.40 4.70 3.90 5.20 5.20 4.50 7.50 4.10 2.70 1/2 RSD AOAC (%) a 11–15 11 7.5–11 11–15 11 7.5–11 11–15 11 7.5–11 11–15 11 7.5–11 Recovery (%) 108 ± 1 (40–120) b 109 ± 1 (60–115) b 104 ± 1 (60–115) b 107 ± 1 (40–120) b 107 ± 1 (60–115) b 103 ± 1 (60–115) b 113 ± 0.1 (40–120) b 111 ± 1 (60–115) b 106 ± 1 (60–115) b 84 ± 1 (40–120) b 110 ± 1 (60–115) b 103 ± 1 (60–115) b a RSD values obtained from the AOAC Peer Verified Methods program according to the concentration level of analyte [27]. b Acceptable recovery percentages according to the concentration level of analyte [27]. Table 3 Significance t-values (X k ) obtained in the robustness study for the elements assayed. X 1 X 2 X 3 Co 0.468 0.218 0.093 Cr 1.571 0.388 0.360 Cu 0.153 0.085 0.017 Ni 1.760 1.407 0.822 Critical t-value = 2. 262. X 1 : heating time employed. X 2 : volume of the deionized water used to dilute the samples. X 3 : volume of PlasmaPure 65% HNO 3 . 77A. Martín-Cameán et al. / Microchemical Journal 114 (2014) 73–79 contents significantly higher in the mucosa cells of orthodontic patients compared with their non-appliance controls, but they did not report differences in Co and Cr cell contents. Fernández-Miñano et al. [25] only detected more Cr and Fe in mucosa cells of patients in the nickel-free group (n = 5) in comparison to control group (n = 15). Hafez et al. [8] reported that fixed orthodontic appliances for 6 months increased the Ni and Cr contents of the buccal mucosa cells. Reports on the Cu release from orthodontic appliances in oral mucosa cells have been not found in the scientific literature. However, Staffolani et al. [35] observed in vitro that Cu was released from orthodontic appliances dipped in both inorganic and organic acid solutions. In our study, none of the orthodontics patients presented clinical symptoms, and the increases in metal concentrations were lower when compared with their respective Tolerable daily intake (TDI) in the case of Co (1.4 μgkg −1 body weight [36], Cu (5 mg day −1 )[37] and Ni (12 μgkg −1 body weight) [38], or with the Tolerable Upper Intake level (UL) established for Cr (1 mg day −1 ) by the Scientific Committee of Food of the European Commission [37]. All these results indicated that to ensure the safety of patients, further research would be needed to determine the longterm significance of metal release. Consequently, the development and validation of methods which permit their quantification in oral mucosa cells, an advantageous sample as they are in direct contact with the appliances, are of great interest. 4. Conclusions An ICP-MS method with a previous digestion procedure has been optimized and validated for the simultaneous determination and quantification of Co, Cr, Cu and Ni in oral mucosa cells from orthodontic patients in comparison to control patients. The procedure has been successfully assessed for trueness and precision, and can be considered as robust against the three factors considered in the digestion process. This method would allow to acquire more information about the in vivo corrosive potential of intraoral appliances. Acknowledgment The authors wish to thank the Junta de Andalucía (PAIDI CTS-358) for the financial support of the present study. References [1] F. Faccioni, P. Franceschetti, M. Cerpelloni, M.E. Fracasso, In vivo study on metal release from fixed orthodontic appliances and DNA damage in oral mucosa cell, Am. J. Orthod. Dentofac. Orthop. 124 (2003) 687–693. [2] S. Spalj, M.M. Zrinski, V.T. Spalj, Z.I. 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Martín-Cameán et al. / Microchemical Journal 114 (2014) 73–79 [31] ICH Harmonised Tripartite Guideline, Validation of analytical procedures: text and methodology, ICH Working Group, November 2005, (http://www.ich.org/LOB/ media/MEDIA417.pdf. Last access: 2/11/2013). [32] A.G. González, M.A. Herrador, A practical guide to analytical method validation, including measurement uncertainty and accuracy profiles, Trends Anal. Chem. 26 (2007) 227–238. [33] AOAC Peer Verified Methods Program, Manual on Policies and Procedures, AOAC Inter, 1998. (http://www.aoac.org/vmeth/PVM.pdf [Last access: 2/11/2013]). [34] Y. Vander Heyden, K. Luypaert, C. Hartmann, D.L. Massart, J. Hoogmartens De Beer, Ruggedness tests on the high-performance liquid chromatography assay of the United States Pharmacopeia XXII for tetracycline hydrochloride. A comparison of experimental designs and statistical interpretations, Anal. Chim. Acta. 312 (1995) 245–262. [35] N. Staffolani, F. Damiani, C. Lilli, M. Guerra, N.J. 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Martín-Cameán et al. / Microchemical Journal 114 (2014) 73–79 764 e n v i r o n m e n t a l t o x i c o l o g y a n d p h a r m a c o l o g y 3 7 ( 2 0 1 4 ) 759–771 Table 2 – Metal levels in human hair samples and their relation with the sex. Metals (␮g/g) Control group (n = 56) Orthodontic group (n = 70) Male (n = 24) Female (n = 32) Male (n = 24) Female (n = 46) Mean ± SD (median) Range Mean ± SD (median) Range Mean ± SD (median) Range Mean ± SD (median) Range Cr 0.34 ± 0.09 (0.33) 0.10–0.47 0.39 ± 0.07*(0.37) 0.21–0.52 0.39 ± 0.35 (0.33) 0.04–1.86 0.32 ± 0.14#(0.33) 0.05–0.65 Cu 28.70 ± 24.32 (19.36) 5.72–101.64 45.60 ± 29.50*(42.24) 4.84–127.00 22.81 ± 29.08 (14.96) 4.84–158.40 59.05 ± 67.58*(40.70) 6.16–339.68 Fe 21.39 ± 11.73 (19.14) 3.08–40.26 30.55 ± 18.82*(27.83) 2.20–87.12 22.23 ± 13.95 (24.86) 1.76–69.67 26.58 ± 15.51 (25.41) 1.76–80.08 Mn 0.23 ± 0.29 (0.13) 0.01–1.27 0.44 ± 0.41*(0.33) 0.04–1.81 0.45 ± 0.89 (0.14) 0.01–4.24 0.82 ± 0.77***,#(0.65) 0.02–3.29 Ni 0.22 ± 0.18 (0.16) 0.01–0.77 0.63 ± 0.38*** (0.55) 0.13–1.81 0.30 ± 0.51 (0.13) 0.02–2.05 0.54 ± 0.47*** (0.43) 0.05–2.40 ∗p < 0.05 significant level observed between male and female. ∗∗∗ p < 0.001 significant level observed between male and female. #p < 0.05 significant level between control and orthodontic group. Table 3 – Metal levels found in human hair and their relation with age. Metals (␮g/g) Control group (n = 56) Orthodontic group (n = 70) <20 years old (n = 23) >20 years old (n = 33) <20 years old (n = 42) >20 years old (n = 28) Mean ± SD (median) Range Mean ± SD (median) Range Mean ± SD (median) Range Mean ± SD (median) Range Cr 0.38 ± 0.11 (0.37) 0.10–0.52 0.35 ± 0.06 (0.35) 0.25–0.49 0.32 ± 0.15 (0.34) 0.04–0.65 0.40 ± 0.37 (0.33) 0.05–1.86 Cu 45.02 ± 34.04 (36.52) 10.12–127.00 34.36 ± 23.83 (30.36) 4.84–113.08 44.68 ± 48.47 (28.60) 6.16–292.16 43.23 ± 72.25 (16.28) 4.84–339.68 Fe 29.49 ± 18.16 (28.16) 5.06–87.12 25.08 ± 16.03 (23.10) 2.20–65.12 24.61 ± 15.09 (24.64) 1.76–80.08 25.67 ± 14.38 (25.98) 1.76–69.67 Mn 0.28 ± 0.24 (0.27) 0.02–1.06 0.41 ± 0.44 (0.22) 0.01–1.80 0.81 ± 0.95#(0.47) 0.01–4.24 0.51 ± 0.50 (0.33) 0.08–2.12 Ni 0.38 ± 0.24 (0.35) 0.01–0.95 0.53 ± 0.44 (0.43) 0.02–1.81 0.49 ± 0.45 (0.38) 0.04–2.05 0.42 ± 0.59 (0.26) 0.02–2.40 #The significant level observed was p < 0.05 when control and orthodontic groups were compared. e n v i r o n m e n t a l t o x i c o l o g y a n d p h a r m a c o l o g y 3 7 ( 2 0 1 4 ) 759–771 765 Fig. 2 – Interrelation between elements determined en human hair: (a) Mn/Cu; (b) Ni/Cu and (c) Fe/Ni. different matrices, such as saliva (Eliades et al., 2003; Fors and Persson, 2006; Petumenou et al., 2009; Sahoo et al., 2011), and more recently, mucosa cells (Martin-Cameán et al., 2014). The determination of trace elements in human hair has attracted the attention of investigators for at least 50 years, and it is considered one of the best choices to study environmental and occupational exposure (Wolowiec et al., 2013). However, regarding orthodontic patients, only Mikulewicz et al. (2011) have performed a preliminary study evaluating the exposure to metals released from fixed orthodontic appliances in the patients’ hair. The elemental composition of hair (unlike blood or urine) reflects long-term exposure to these metals, since hair is an indicator of past changes in metabolism and environmental exposure (Chojnacka et al., 2005). Hair content depends on age, sex (Senofonte et al., 2000; Chojnacka et al., 2006a), dietary and living habits (Miekeley et al., 1998; Chojnacka et al., 2006b), and exposure (associated with urbanization and industrialization) (Ashraf and Jaffar, 1997; Gil et al., 2011), etc. Moreover, it is significant to take into account the geographical location of the population (Amaral et al., 2008). All these factors can explain the variability in the reference values reported in the scientific literature. In this work, we have determined for the first time Cr, Cu, Fe, Mn and Ni contents in hair of a wide population in our country, after undergoing orthodontic treatment, and significant increases of Mn content in patients were found in comparison to control group. Moreover, differences related to sex and age have been firstly reported not only in the control group but also in the orthodontic group. Metal levels found in our study population presented high variation (Table 1), similarly to those reported in the scientific literature. Table 6 presents ranges reported by various authors, because internationally accepted reference ranges for the content of these metals have not been established. Recently, Mikulewicz et al. (2013) have performed a systematic review of reference values of elements in human hair and indicated that more work is this field is required. The reason of the lack of reference values is the absence of clear guidance on the methodology for the selection of the population, sampling, their preparation and digestion, as well as analysis. In comparison to Mikulewicz et al. (2011), higher Cr and Fe contents have been found, whereas Mn and Ni values were similar; Cu was not determined previously. In our study, a significant increase of Mn was found in orthodontic patients, whereas no differences between exposed and non-exposed groups were reported by Mikulewicz et al. (2011), may be due to the small number of participants included. Literature reports focus mainly on the release of Ni and Cr from orthodontic appliances Chromium can cause hypersensivity and dermatitis, and induce cytotoxicity and genotoxicity (International Agency for Research on Cancer, IARC, 1990; Burrows, 1986). In relation to other values reported, our Cr values are very similar to those found by Grabeklis et al. (2011) for a non exposed-population, and slightly lower than those from workers of a chemical plant. Cr values reported by Chojnacka et al. (2005) in urban population from Poland, or by Afridi et al. (2006) for a non-exposed population were higher, whereas those reported by Dongarrà et al. (2012) were lower than ours. These differences could be related to the geological characteristics of the study areas, although, at the moment, the 766 e n v i r o n m e n t a l t o x i c o l o g y a n d p h a r m a c o l o g y 3 7 ( 2 0 1 4 ) 759–771 Table 4 – Forward stepwise multiple linear regression analysis of metal ion concentration detected in the patient’ hair. Metal ion adjR2F p-Value Predictor B p-Value Partial correlation Cr 0.001 1.015 0.394 Treatment time −.033 .303 −.150 Maloclussion −.008 .886 −.021 Extraction treatment −.127 .144 −.212 Cu −0.030 0.291 0.832 Treatment time −2.729 .577 −.067 Maloclussion −5.770 .564 −.070 Extraction treatment .901 .949 .008 Fe 0.022 0.431 0.731 Treatment time −1.544 .338 −.127 Maloclussion 2.108 .485 .093 Extraction treatment 1.895 .648 .061 Mn −0.023 0.587 0.626 Treatment time .051 .611 .072 Maloclussion .059 .739 .047 Extraction treatment −.225 .374 −.125 Ni 0.026 1.543 0.213 Treatment time −.025 .589 −.071 Maloclussion .134 .177 .177 Extraction treatment .251 .063 .242 Table 5 – Coefficients ˛hair and ˇhair in orthodontic and control groups (whole population) for all metals, and in the case of differences in metal content in relation to sex (Cr, Mn) and age (Mn). Metals Whole population In relation to sex In relation to age ˛hair ˇhair (␮g/g) Female Male <20 years old >20 years old ˛hair ˇhair (␮g/g) ˛hair ˇhair (␮g/g) ˛hair ˇhair (␮g/g) ˛hair ˇhair (␮g/g) Cr 0.972 −0.0123 0.827 −0.0666 1.175 0.0587 Cu 1.116 4.5400 Fe 0.917 −2.2670 Mn 1.944 0.3411 1.889 0.3878 1.859 0.2060 2.872 0.5252 1.243 0.0992 Ni 0.979 −0.0066 supposed association between metal profiles and geographic area should be taken with caution (Dongarrà et al., 2012). In contrast, hair levels found by Gil et al. (2011) in workers exposed to the metal were 10-fold higher than our results. In the literature, initially most papers have been dedicated mainly to the detection of Cu and Zn in human hair because they are the most abundant elements present (Sturaro et al., 1994). The mean Cu results obtained in this study were similar to those found by Miekeley et al. (1998) in a population from Brazil. In contrast, the values reported by other authors (Ward and Cambell, 1986; Ward et al., 1987; Sturaro et al., 1994; Nowak, 1998; Chojnacka et al., 2005; Dongarrà et al., 2012) were lower than ours. Similarly to Dongarrà et al. (2012) which measured in children’s hair nineteen elements, copper was one of the most abundant elements found in our study. The second mayoritary element was Fe, whose levels were within the wide ranges reported by Kamakura (1983), Ward and Cambell (1986), Ward et al. (1987), and Senofonte et al. (2000). Therefore, our Fe levels found do not exceed those previously reported for non-exposed populations. Both predominant elements are generally accepted as essentials, with potential for toxicity. Copper is a component of all living cells and is associated with many oxidative processes, but in cases of Wilson’s disease the low level of ceruloplasmin results in excessive accumulation. Iron takes part in oxygen transport and utilization, although chronic iron toxicity or Fe overload in adults is a common problem. There is epidemiologic evidence for a relationship between Fe levels and cardiovascular disease, and it may contribute to lipid peroxidation in an early step in the formation of atherosclerotic lesions (Goyer and Clarkson, 2001). Nickel is a toxic metal, widely used in various industrial processes and the level of exposure is frequently related to the degree of urbanization of the assayed population (Jergovic et al., 2010). One of the roles of Ni in the alloys employed in orthodontic appliances is to increase the strength, ductility, and resistance to general, crevice and erosion corrosion. However, it has been reported that the major corrosion products are Fe, Cr, and Ni for stainless steel and Ti and Ni for nickel–titanium alloys (Amini et al., 2008). Among stainless steel and nickel–titanium corrosion products, Ni and Cr have received the most attention because of their reported adverse effects. Nickel is a known allergen, and adverse reactions related to Ni-containing orthodontic devices such as archwires, brackets, and soldered stainless steel face-bows have been reported (Dunlap et al., 1989; Greppi et al., 1989). Moreover it has carcinogenic and mutagenic effects (IARC, 1990). According to Sturaro et al. (1994) the analysis of Ni in hair was a good indicator of long-term exposure, and they studied the exposure to Ni of steel mill workers and found that the content of Ni in hair in the control group was 5.25 mg/kg and increased significantly in workers with the time of employment. Mikulewicz et al. (2011) reported in hair of control group Ni values of 0.364 ± 0.248, and higher but not significant values in orthodontic patients (0.507 ± 0.372), although these authors indicated that the release of Ni from orthodontic appliances can constitute a significant resource of exposure of this e n v i r o n m e n t a l t o x i c o l o g y a n d p h a r m a c o l o g y 3 7 ( 2 0 1 4 ) 759–771 767 Table 6 – Values in scalp hair of metal compounds selected in this study and reported in the literature. Reference values n Cr Cu Fe Mn Ni Notes Present study (␮g/g) 56 0.36 ± 0.08 39.07 ± 28.37 27.24 ± 17.06 0.36 ± 0.37 0.47 ± 0.37 Control group 70 0.35 ± 0.26 43.61 ± 57.28 24.97 ± 15.00 0.70 ± 0.83 0.46 ± 0.50 Orthodontic group (mean ± SD) Mikulewicz et al. (2011) (␮g/g) 18 0.129 ± 0.131 11.74 ± 8.07 0.485 ± 0.491 0.364 ± 0.248 Control group 28 0.133 ± 0.088 12.22 ± 9.91 0.574 ± 0.620 0.507 ± 0.372 Orthodontic group Husain et al. (1980) (␮g/g) 102 2.45 ± 1.30 1.25 ± 0.72 Control (male) Kamakura (1983) (␮g/g) 1899 0.20–0.77 6.0–69.1 5.5–87.4 0.06–4.51 0.17–3.00 Control males/females No environmental or occupational exposure to metals Ward and Cambell (1986) 32 0.56–1.92 3.42–8.12 18.4–52.8 0.57–1.68 1.62–4.58 Patients on maintenance with lithium carbonate Ward et al. (1987) 36 0.20–1.02 7.2–19.4 12.9–96.4 0.20–4.30 0.55–3.59 Control males/females Leotsinidis and Kondakis (1990) (␮g/g) 75 0.61/0.56 0.82/1.16 Control males/females Kono et al. (1990) 237 0.52 ± 0.28 Control 0.66 ± 0.27 Workers Gammelgaard and Veien (1990) (␮g/g) 16 0.149 Non-exposed 64 0.340 Hypersensitive people (median value) Sturaro et al. (1994) (␮g/g) 132 22 ± 10 (males) 24 ± 10 (females) 0.6 ± 0.5 (males) 0.7 ± 0.5 (females) 1.6 ± 2.6 (males) 2.8 ± 5.2 (females) Control males/females no subjected to any chemical treatment Bencko (1995) (␮g/g) 62/102 0.124 0.286 Control Leung and Huang (1997) (␮g/mL) 12–17 0.08 ± 0.11 2.34 ± 2.30 0.61 ± 0.26 Healthy people (30–50 years old) Bermejo-Barrera et al. (1998) (␮g/g) 25 0.03 ± 1.20 Healthy people (range) Miekeley et al. (1998) (␮g/g) 1091 <0.30 44.1 ± 3.5 20.8 ± 2.2 5.0 ± 0.5 0.7 ± 0.1 Rio Janeiro city (Brazil) Nowak (1998) (␮g/g) 266 0.60 ± 1.13 7.96 ± 9.12 45.7 ± 37.7 2.41 ± 2.24 0.75 ± 1.15 Non-industrialized region from Poland (Mean ± SD) Luse et al. (2000) (␮g/g) 46 1.83 ± 0.18 5.78 ± 1.60 Control Welders Rodushkin and Axelssom (2000) (␮g/g) 114 0.167 ± 0.118 9.6 ± 4.4 0.560 ± 0.550 0.430 ± 0.400 Urban population from Sweden (Mean ± SD) Senofonte et al. (2000) (␮g/g) 160–412 0.08–4.56 (n = 160) 7.2–82.7 (n = 412) 5.9–36.8 (n = 408) 0.04–0.77 (n = 378) 0.07–3.40 (n = 263) School children (boys) (5th-95th values) Schamberger (2003) (␮g/mL) 50 0.06 ± 0.17 0.62 ± 1.70 0.47 ± 0.31 Control Goullé et al. (2005) (␮g/g) 45 0.20 0.067 0.23 Healthy people (median values) Chojnacka et al. (2005) (␮g/g) 83 0.57 ± 1.04 12.35 ± 12.05 15.00 ± 16.07 0.60 ± 0.59 0.84 ± 1.13 Urban population from Poland Afridi et al. (2006) (␮g/g) 75 3.82 ± 0.67 5.25 ± 1.46 Non-exposed 56 5.86 ± 2.21 3.43 ± 1.16 Workers steel Moreda-Pi ˜ neiro et al. (2007) (␮g/g) 10 5.95 ± 4.30 Non-exposed Rodrigues et al. (2008) (␮g/g) 280 1.3 ± 2.4 (0.05–6.7) Healthy Brazilian adults (range) Chojnacka et al. (2010) 117 0.91–1.53 8.51–34.97 16.9–29.6 0.459–1.046 0.508–1.534 Poland - Urban area (Percentile 10 and 90) Grabeklis et al. (2011) (␮g/g) 262 0.369 ± 0.017 0.487 ± 0.043 0.934 ± 0.065 1.34 ± 0.18 0.360 ± 0.028 0.459 ± 0.057 Non exposed Workers exposed chemical plant 768 e n v i r o n m e n t a l t o x i c o l o g y a n d p h a r m a c o l o g y 3 7 ( 2 0 1 4 ) 759–771 Table 6 – (Continued) Reference values n Cr Cu Fe Mn Ni Notes Gil et al. (2011) (␮g/g) 178 3.43 ± 7.93 0.99 2.35 ± 4.66 1.19 3.29 ± 16.59 0.71 Mean ± SD values for workers Median values for workers Dongarrà et al. (2012) 336 Urban area (n = 131) 0.075 Industrial area (n = 58) 0.139 Rural area (n = 47) 0.260 Urban area 20.0 Industrial area 11.7 Rural area 17.0 Urban area 0.268 Industrial area 0.350 Rural area 0.400 Urban area 0.420 Industrial area 0.400 Rural area 0.740 Median values of Children (11–13 years old) from Sicily Vanaelst et al. (2012) 218 10.1–46.6 3.66–17.27 P10–P90 Belgian school girls Vanaelst et al. (2013) 140 18 7 Median values of school girls element. By contrast, in our study, similar contents were obtained in control (0.47 ± 0.37) and orthodontic patients (0.46 ± 0.50). Consequently, our results are not consistent with this hypothesis, and since our values are similar to others found in the scientific literature for non-exposed populations (Kono et al., 1990; Rodushkin and Axelssom, 2000; Schamberger, 2003; Grabeklis et al., 2011; Dongarrà et al., 2012) the values obtained cannot be considered of health concern. Manganese is a transitional and essential metal, and is a cofactor for a number of enzymatic reactions, particularly those involved in phosphorylation, cholesterol, and fatty acids synthesis. Mn is present in all living organisms. There is current interest in the toxicology of manganese because of potential exposure from the use of Mn-containing fuel additives, and because its industrial use has also expanded in recent years (as a ferroalloy in the iron industry and as a component of alloys used in welding) (Goyer and Clarkson, 2001). There are few reported cases of Mn toxicity from oral ingestion, because homeostatic mechanisms are involved for excreting its excess. The oral absorption of Mn is increased by Fe deficiency, which may contribute to variations in individual susceptibility (Goyer and Clarkson, 2001). In our study, Mn is the only element whose contents in human hair were significantly increased in orthodontic patients (0.70 ± 0.83 ␮g/g), in comparison to control group (0.36 ± 0.37 ␮g/g). This result is consistent with Mikulewicz et al. (2011) which also found an increase (18%) of this metal in orthodontic patients, although not statistically significant. Danaei et al. (2011) demonstrated in vitro Mn release from orthodontic brackets kept in different mouthwashes. Also, in vitro Mikulewicz et al. (2011) found 68 ␮g/L of Mn from orthodontic appliances composed of different alloys incubated in artificial saliva, although these authors suggested that the only possible risk of exposure would be nickel. Our results obtained in the control group are in agreement with data reported by Dongarrà et al. (2012) in children living in urban or industrial areas in Sicily. Moreover, the mean values for the orthodontic group were similar to those reported by several studies in the literature for urban or control populations (Sturaro et al., 1994; Chojnacka et al., 2005; Grabeklis et al., 2011), and were much lower than values found for workers exposed to the element (Luse et al., 2000; Gil et al., 2011). Thus, these values cannot be considered of health concern. Metal hair content also varies according to sex and age (Sturaro et al., 1994; Leung and Huang, 1997). Higher metal levels in hair were found for females in comparison to males in the present study. Other reports have also confirmed that sex is an important covariate influencing trace-element content of human scalp-hair with females showing higher values (Moon et al., 1986; Leotsinidis and Kondakis, 1990; Sturaro et al., 1994; Senofonte et al., 2000; Gil et al., 2011). In addition, other clinical variables potentially associated with observed metallic concentrations were explored for the first time in literature. Nevertheless, as shown in Table 4, all selected predictors could just explain a slight influence on the overall concentration of these metallic ions. We have considered two different age groups, whose choice allowed the estimation of the concentration of these elements in two different moments of human life: childhood and adult age. In general the results obtained suggest that the metals concentrations are not dependent on age, with e n v i r o n m e n t a l t o x i c o l o g y a n d p h a r m a c o l o g y 3 7 ( 2 0 1 4 ) 759–771 769 the exception of Mn levels, which decreased with aging in the orthodontic group. Sturaro et al. (1994) considered the influence of color, age and sex on the content of several metals in human hair, and found that Cu concentrations decreased with increased age. Moreover, Mn increased in blond and decreased in brown hair with aging, independently of sex. Senofonte et al. (2000) found significant differences of the element content in hair among the three age groups considered in children (3–6, 7–10 and 11–13 years). Some elements showed a tendency to increase with age (Cu in female, Co, Zn), whereas there was little variations in others (Fe, Mn). Chojnacka et al. (2006a) found that the levels of Mn, Ni, Ti, Se, Hg, Cd, As and Co were not a function of age. The studies on inter-element interactions in hair are scarce. Rodushkin and Axelssom (2000) reported synergistic interactions between several elements, although the authors found no significant correlations for essential elements (Zn, Cu, Se) and potentially toxic (Cd, Pb, As and Tl). Later, Chojnacka et al. (2005) studied inter-element interactions in human hair sampled from a population group living in urbanized and industrialized region of Poland. They found strong positive correlations between Ca, Mg, Mn and Sr, and all these elements were negatively correlated with another group (Pt, W). A correlation Fe–Mn has been also reported, and according to Chojnacka et al. (2006b) these correlations resulted either from the common occurrence of elements or synergistic effects between them. In the case of orthodontic patients, Mikulewicz et al. (2011) reported statistically significant correlation only between Fe and Cr (synergism). In our study, the positive correlations found between Cu/Mn, Cu/Ni an Fe/Ni showing a mutual dependence of these metals in hair, probably are due to similar chemical nature: Fe and Ni lie in the same VIIIb group in periodic table of elements, Cu belongs to Ib group, and Mn to VII group. 5. Conclusions Our data altogether indicate that hair mineral analysis is a good method to investigate the release of the elements from fixed orthodontic appliances, and to evaluate the bioavailability of toxic metals. Moreover this matrix may be used as additional and/or alternative samples to saliva or mucosa cells in order to know long-term exposure to metals from orthodontic treatments. In patients, differences in the content of metals in hair were only significantly increased for Mn when compared to the control group, but their levels were of the same magnitude to other control populations, and consequently, no risks linked to the treatment have been found. It has been demonstrated higher accumulation of metals in hair of females, and in general the metals concentrations are not dependent on age, with the exception of Mn levels, which decreased with aging in the orthodontic group compared to the control group. The positive correlations found between Cu/Mn, Cu/Ni and Fe/Ni showing a mutual dependence of these metals in hair, probably are due to similar chemical nature. This study provides values that may be useful for future comparative purposes with other studies focused on hair mineral analysis in patients undergoing fixed appliances treatment, and it would be worthwhile carrying out further studies on larger control and experimental groups and collecting more information about the potential health effects derived from their accumulation. Conflict of interest The authors declare that there are no conflicts of interest. Transparency document The Transparency document associated with this article can be found in the online version. Acknowledgement The authors wish to thank the Junta de Andalucía (PAIDI CTS-358) for the financial support for the present study. The present article constitutes part of the doctoral thesis of Martín-Cameán A at the University of Seville, Spain. r e f e r e n c e s Afridi, H.I., Kazi, T.G., Jamali, M.K., Kazi, G.H., Arain, M.B., Jalbani, N., Shar, G.Q., Sarfaraz, R.A., 2006. Evaluation of toxic metals in biological samples (scalp hair, blood and urine) of steel mill workers by electrothermal atomic absorption spectrometry. Toxicol. Ind. Health 22, 381–393. Amaral, A.F.S., Arruda, M., Cabral, S., Rodrigues, A.S., 2008. Essential and non-essential trace metals in scalp hair of men chronically exposed to volcanogenic metals in the Azores, Portugal. Environ. Int. 34, 1104–1108. Amini, F., Borzabadi Farahani, A., Jafari, A., Rabbani, M., 2008. In vivo study of metal content of oral mucosa cells in patients with and without fixed orthodontic appliances. Orthod. Craniofac. Res. 11, 51–56. 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Cameán IN VIVO DETERMINATION OF ALUMINUM, COBALT, CHROMIUM, COPPER, NICKEL, TITANIUM AND VANADIUM IN ORAL MUCOSA CELLS FROM ORTHODONTIC PATIENTS WITH MINI-IMPLANTS BY INDUCTIVELY COUPLED PLASMA-MASS SPECTROMETRY (ICP-MS) Journal of Trace Elements in Medicine and Biology (en segunda revisión) 2015 Elsevier Editorial System(tm) for Journal of Trace Elements in Medicine and Biology Manuscript Draft Manuscript Number: Title: In vivo determination of Aluminium, Cobalt, Chromium, Copper, Nickel, Titanium and Vanadium in oral mucosa cells from orthodontic patients with mini-implants by Inductively coupled plasma-mass spectrometry (ICP-MS) Article Type: Original Paper Section/Category: Toxicology Keywords: In vivo, metals, oral mucosa cells, orthodontic, miniscrew Corresponding Author: Prof. Ana M Cameán, Corresponding Author's Institution: First Author: Ana Martín-Cameán Order of Authors: Ana Martín-Cameán ; Angeles Jos; Maria Puerto; Ana Calleja; Alejandro Iglesias- Linares; Enrique Solano; Ana M Cameán Abstract: Miniscrews are used as orthodontic anchorage devices in the dentistry clinical practice but the in vivo metallic release from these structures has been not previously investigated. The aim of this study was to determine the content of Al, Co, Cr, Cu, Ni,Ti and V in oral mucosa cells of control subjects, patients under orthodontic treatment and with both, orthodontic treatment and miniscrew, in order to know the contribution of these mini-implants to the total metallic content. ICP-MS measurements revealed the following ascending order: Cr < Ni < Ti < Cu < Al, and Co and V were practically undetected. Significant differences in comparison to the control group were found for Cu in the orthodontic group, and for Ni in both, orthodontic and orthodontic+miniscrew groups. Potential correlations among metallic elements and with some clinical factors were also explored. These findings suggest that miniscrews do not increase significantly the metal release. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 25 tests in in vivo studies (Table 4) that have been applied to orthodontic brackets and wires (Faccioni et al., 2003; Westphalen et al., 2008; Fernández-Miñano et al., 2011; Hafez et al., 2011; Natarajan et al., 2011; Martin-Camean et al., 2014d). The MN assay produces a highly reliable, rapid and broadspectrum determination of DNA damage at the chromosome level with limited costs and minimal time required to complete the test (Hvhannisyan et al., 2010; Natarajan et al., 2011). Contradictory results from genotoxic tests have been reported in the scientific literature. These results depend on several factors: the specific appliance studied (mainly wires, bands, or brackets), appliance composition, appliance manufacturer, sample size (the number of orthodontic patients ranged from 15 to 55), time of treatment analysis (i.e., day of debonding, or shorter periods of 10 or 30 days, or 9 months), and genetic assays used (e.g., the comet assay or MN frequency). Furthermore, some studies compared the experimental group to an untreated group, while others evaluated genotoxic effects longitudinally in the same patients (Heravi et al., 2013). The first in vivo study was performed by Faccioni et al (2003), who conducted the alkaline comet assay in 55 orthodontic patients after they received 2-4 years of conventional orthodontic treatment (e.g., bands, bonded brackets and archwires of different compositions). They reported genotoxic damage and found positive correlations between the concentrations of released Co and Ni and the number of comets as well as correlations between Co levels and comet tails. In contrast, Westphalen et al. (2008) found that 10 days after the placement of the orthodontic appliances, the comet assay results indicated these appliances (made of an SS alloy) did not induce any genetic damage. These differences may be explained by the analysed samples, the larger number of patients using the appliances for a much longer period (1.5-3 years), and the composition of the orthodontic appliances. In contrast, there was a significant increase in MN frequency 30 days after the beginning of the treatment. This investigation is an example of the benefits of combining two tests with supplementary characteristics (MN and comet assays) to obtain a better understanding of the potential genotoxic effects of orthodontic appliances. These discrepancies could be explained 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 26 because the researchers measured different specific genetic endpoints. Although the comet assay generally detects more DNA damage than the MN assay, the latter test was shown to be more sensitive in this study. Furthermore, the assays were applied at different time points, 10 d or 30 d for comet assay or MN, respectively, according to the type of DNA damage that was detected (i.e., primary and reparable effects in a short period of time for the comet assay and chromosomal damage at later stages). According to Fernández-Miñano et al. (2011), genotoxicity induced in buccal cells could be related to the composition of orthodontic appliances. They used the comet assay to examine the effect of three different alloys (stainless steel, titanium and Ni-free) before the orthodontic treatment was applied and 30 days later. They concluded that the orthodontic apparatus made with Ti was not genotoxic for oral mucosa cells, whereas the SS alloy and Ni-free allow induced DNA damage in buccal mucosa cells. Significant release of Ti and Mn ions was detected in patients treated with SS tubes and brackets, and more Cr and Fe were detected in the Ni-free group. In contrast, Hafez et al. (2011) conducted a prospective longitudinal in vivo study with sixty patients over a 6- month period in which they observed that SS brackets with SS archwires produced the least biological damage, whereas titanium brackets with nickel-titanium archwires produced the greatest cytotoxicity and genotoxicity (according to the comet assay). The cellular ion content in buccal cell samples also varied over time. The Ni and Cr content increased progressively at 3 and 6 months compared to the content measure before treatment, which disagrees with previous studies that showed only a significant initial increase in metal content that decreases or stabilizes over time. Despite the bioaccumulation of these metal ions, Hafez et al., (2011) also reported damage to the DNA in mucosa cells at 3 months of treatment and not at 6 months. This result might imply recovery from the initial placement and the development tolerance or DNA repair. Therefore, regarding the treatment time points that were considered, the results are contradictory, with some authors indicating a recovery and others indicating increased damage. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 27 Moreover, Natarajan et al., (2011) showed that the higher MN frequency induced by orthodontic appliances in oral mucosa cells reverted to normal values after only 30 days, and there was no correlation between the concentrations of released Ni and Cr ions and genotoxic damage. These results disagree with the previous studies mentioned above (Faccioni et al., 2003; Fernández- Miñano et al., 2011). In contrast with these results, Heravi et al., (2013) reported no significant differences in the frequency of MN cells before or 9 months after the appliance was placed. This result was confirmed in a study performed by Angelieri et al (2011) using the MN test. They found a lack of clastogenic and/or aneugenic effects from orthodontic appliances before, during, and after the therapy. Fixed orthodontic treatment includes metallic components as well as orthodontic composites, and because the bonding agents are generally left in close contact with oral tissue over long periods of time, their biocompatibility is also a concern for orthodontic treatment. Thus, genotoxic studies have been conducted for the first time to evaluate the effects of three different light-cured orthodontic composites over a 6-month period. The researchers used the frequency of MN formation and nuclear alterations, such as karyorrhexis (KR), karyolysis (KL), and binucleated cells (BN) to evaluate biocompatibility (Toy et al., 2014). During the 6 months of orthodontic treatment, the composites did not show significant differences in MN rates within the same cell type. In contrast, morphological signs of cytotoxicity were observed, including an increase in the number of BNs for all the composite groups and a significant increase in the KL frequency between the beginning and the end of the study for both bonding composites. Similarly, the same authors employed these assays to evaluate the genotoxic effects of a banding procedure with 5 different orthodontic cements in oral buccal epithelium cells over a 1-month period (Öztürk et al., 2012). MN analysis revealed a significant increase in chromosomal damage between the beginning and 1 month time points for all of the tested orthodontic cements, and they also showed morphological changes. Further research is needed to confirm all these results and to assess the long-term biocompatibility and biological effects of these materials (i.e., composites for band cementation). 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 28 Recently, a study was carried out in our laboratory on human buccal cells by introducing some modifications to the comet assay. Our results revealed that conventional orthodontic appliances and the additional employment of miniscrews induced genetic damage compared to a control group (n=20), and the genotoxic effects of orthodontic miniscrews were similar to patients wearing traditional fixed orthodontic appliances even though applying miniscrews involves a more invasive procedure and closer contact with buccal cells (Martin-Camean et al., 2014d). The scarce research in this field, the importance of this subject for the health status of orthodontic patients and the wide use of miniscrews for distal or mesial movement of teeth, anterior retraction or protraction of teeth, intrusion or extrusion, indicate the need for further studies, with larger samples, and longterm follow-up analysis, about the use of miniscrews with different compositions. 4. Conclusions and future prospects Experimental data show that the biocompatibility of orthodontic appliances depends on their composition and their corrosion behaviour, which can be improved by performing different techniques to reduce their deterioration. Due to the diversity in the composition of the materials and the manufacturing techniques applied to orthodontic materials, along with the variety of treatment lengths and intraoral conditions in orthodontics and the potential effects of these treatments on corrosion, safety evaluations of orthodontic materials on a case-by-case are required. Because a biocompatibility assessment is mandatory prior to their clinical use, the number of in vivo toxicity studies is small in the scientific literature compared to in vitro studies. However, in vivo studies provide valuable information on the effects of orthodontic materials in real clinical exposure scenarios. Therefore, further clinical studies (including studies of metal ion release, cytotoxicity, and genotoxicity), considering larger populations and longer treatment periods, and employing standardized methods, are necessary. Moreover, it is advisable to employ several genetic assays to evaluate genotoxicity. Additionally, in vivo monitoring studies of metal ions (such as Ni and Cr) are needed to investigate cause-effect relationships are required. These additional studies would allow 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 29 researchers to draw clear conclusions while also taking the contradictory results available now into account. Considering that metal ions can induce oxidative stress, further research is needed to determine whether the oxidative stress mechanism is involved in the toxic effects observed in the modified version of the comet assay that identifies oxidative genetic damage. Finally, it has been observed that most of the experimental studies have been performed with traditional orthodontic appliances (e.g., arches or bandwires), but other appliances that are more invasive, but widely used and relatively new (e.g., miniscrews), novel procedures and novel adhesion materials are also worthy of investigation. Acknowledgements: This work was supported by the Junta de Andalucía (Plan Andaluz Investigación, code CTS-358). Conflict of interest The authors declare that there are no conflicts of interest. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 30 References Ağaoğlu, G., Arun, T., Izgu, B., Yarat, A., 2001. Nickel and chromium levels in the saliva and serum of patients with fixed orthodontic appliances. Angle Orthod. 71, 375-379. Amini, F., Farahani, A., Jafari, A., Rabbani, M., 2008. 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In vitro mutagenicity and in vivo genotoxicity studies performed in oral mucosa cells exposed to orthodontic appliances: experimental models and conditions, assays performed, metal ions investigated and main results reported. Table 1. In vitro studies on the release of metals from orthodontic appliances: Experimental model and conditions, metal ions and concentrations released, and main results reported References Orthodontic appliances Experimental model Solutions and incubation times, days Metal ions investigated Detection mode Median or mean concentration of metal ions (µg/L or ug/g) ) Main results Suarez et al., 2010 Stainless steel (SS), Nickel-titanium (NiTi) and copper-nickel- titanium (CuNiTi) lingual orthodontic archwires Saline solution Samples were taken at 7, 14, and 30 days after immersion. Ni AAS After 30 d accumulated Ni release (ng/mm2)) oscillated between 0.001303 (SS D-Rect, the lowest) and 0.00362 (SS 0.016, the highest) SS archwires released the highest amount of Ni. The amount of Ni released for all archwires is below the levels known to cause cell damage Bhaskar and Subba Reddy, 2010 Bands, SS wires and space maintainers Artificial saliva 37ºC. Samples were analyzed on 1,7,14,21, and 28 d Cr, Ni AAS Nickel released ranging from 4.95 to 7.78 ppm, and C between 1.70 to 4.54 ppm The peak of Ni and Cr released was on 7th day, and then the rate of release diminished Sfondrini et al., 2010 3 kinds of brackets: new conventional SS, recycled SS, and Nifree brackets Artificial saliva at various acidities (pH4.2; 6.5 and 7.6) After 15 min, 1 hour, and 24, 48 and 120 hours samples were analyzed Ni GFAAS and ICPOES Recycled brackets: 74.2 µg/g New SS brackets: 7.14 µg/g. Ni-free brackets: 0.03 µg/g Reconditioned brackets released the most Ni, and the highest Ni release was performed at pH 4.2 and lower a t pH 6.5 and 7.6.In general, Ni release increased with the immersion time for all brackets Ortiz et al., 2011 Stainless steel, nickelfree, and Titanium orthodontic alloys, tubes and brackets Buccal tubes and 20 brackets were submerged in Minimal essential medium (MEM) supplemented with 0.5% fetal bovine serum 10 samples of the 3 different metallic materials submerged in MEM were taken after 30 days of incubation Ti ICP-MS High concentrations of Ti, Cr, Mn, Co Ni, Mo Fe, Cu and Zn were detected. The nickel-free alloy released lower amounts of ions to the medium. Table 1 Danaei et al., 2011 SS brackets kept in 3 different mouthwashes: Oral B, chlorhexidine, and Persica Immersion in 3 mouthwashes Immersion in the corresponding mouthwashes and deionized water , 37ºC for 45 d Cr, Cu, Fe, Mn, Ni ICP-OES Cr, cu, Fe, Mn, Ni The highest metals release was found with chlorhexidine compared with the other 2 mouthwashes Espinar et al., 2011 NiTi archwires treated by oxidation for obtaining Ni-free surfaces Artificial saliva pH 7.4, 37ºC, for 30 days. Samples were taken at 1, 5 h, and at 1,2,5, and 15 days Ni GFAAS --- The concentration of ion Ni initially increased very sharply and later reached a saturation level. The film of Titanium oxide reduced Ni release Liu et al., 2011 Two kinds of commercial equiatomic NiTi archwires and half of the NiTi wires were exposed to continuous bending stress Artificial saliva 8 groups (2 materials, 2 pH values (pH 2 and 5.3) and 2 loading conditions were investigated at 37ºC. NiTi wires were immersed and sampled at 1,3,7, and 14 days Ni ICP-MS Under bending conditions Ni release rate ranged from 4.3 to 36.8 µg/cm2 after 1 day of immersion Bending stress induced greater Ni ion release compared with unstressed specimens in artificial saliva at both pH 2 and 5.3 Krishnan et al., 2011 Six groups of Β titanium arch wires uncoated and PVC- coated Artificial saliva and high fluoride ion concentration mouth rinse Immersion cycle of 5 min three times a day., and also immersion in a commercial artificial saliva solution Ti, Mo ICP-AES ---No data Mo release in negligible amounts, from wires immersed in fluoride mounthwash. Reimann et al., 2012 New brackets and 4 types of recycled brackets (flame, acid bath, commercial unit Big Jane, and commercially recycled) Artificial saliva Static immersion for one week Ni ICP-MS 0.15 µg/day -0.18 µg/d depending on the treatment No significant differences were observed in Ni release with the new brackets, those recycled by direct flaming and in acid bath Gil et al., 2012 NiTi archwires heat treated at 500 and 600ºC for different Artificial saliva Archwires were immersed in artificial saliva at pH 7.4 and 37ºC Ni GFAAS The Ni ion releases increased very fast initially , and after periods of time for 30 days, and Ni was measured at hours 1 and 5, and at days 1, 2, 5 and 15. reached a saturation level, The release of Ni was higher in the original archwires than in the reused ones, due to the formation of Ni-rich precipitates Milheiro et al., 2012 5 different multistranded wires: 4 of them were stainless steel and 1 Ni-free Distilled water of lactic acid One group of wires were submersed in distilled water and another in lactic acid 90%, and each main group was divided into there subgroups: a) not exposed to cyclic loading; b) wires exposed to 1000 cyclic loading cycles , and c) exposed to 10000 cyclic loading. After 24 h, the wires were removed and samples were measured Ni ICP-MS Non-loaded wires in water: 0.2-4.8 ppb; in lactic acid: 12.1- 263.5 ppb. Wires 1000x cycles: in water: 1.1-9.3 ppb; in lactic acid: 14.8-263.4 ppb Wires 10000x cycles in water: 1.7-9 ppb; in lactic acid: 13.7-239.5 ppb All wires released considerable amounts of Ni. Acidity has more impact in comparison to mechanical loading Mikulewicz et al., 2012 Wires, brackets, bands and metal ligatures of stainless steel Artificial saliva containing 0.40 g/L NaCl Incubation for 30 days at 120 rpm, 36.6ºC Al, Mg,, Si, P, S, K, Ca, Ti, V, Mn, Fe, Co, Cu, Zn, Ni and Cr ICP-MS Mg: 1,699; Al:559, Si:4.491; P:31,753; S:1,446,700; K 231,917; Ca:228,100; Ti 394: V:8; Mn:68; Fe 2,382; Co 4; Cu:121; Zn:91; Ni 573; Cr 101 Experimental group contained 39 times more Ni than de control solution. A correlation between Ni and Cr concentrations in saliva was found Zhang et al., 2014 Composite arch-wires (CoAW) Artificial saliva (AS), chloric solution (0.9% NaCl), fluorinated artificial saliva (0.1% NaF) and protein-containing artificial saliva (0.1% BSA) 4 different solutions Cu ICP-OES Cu release (µg/mm2) in simple artificial saliva:0.20; in chloric solution:0.56: in florinated –AS 0.40; in protein-containing AS:0.19 The CoAW samples were most susceptible to corrosion in the chlorine solution (greatest Cu release) and most resistant in the protein- containing artificial saliva Sheibaninia 2014 NiTi orthodontic wires 4 groups: 2 immersed in artificial saliva at pH 7.4, and 2 groups immersed in artificial saliva+ascorbic acid to achieve pH 4.5. Each group was subdivided en wires not exposed to thermocycling and wires exposed to 500 thermocycling rounds Solutions were incubated for 48 h at 37ºC. Thermocycling process was performed between 5-55ºC for 500 cycles Ni GFAAS Mean Ni released per group: I (no treatment:)): 2.81 µg/L II (thermocycling): 6.11 III (pH 4.5): 3.99 IV (pH 4.5 and thermocycling): 9.74 Maximum Ni was released under acidic pH in the thermocycling group Gonçalves et al., 2014 Stainless steel metallic orthodontic bands: Non-soldered bands (NSB) and silver soldered bands (SSB) Bands were immersed in RPMI 1640 tissue-culture medium with 10%serum Immersion for 24 h at 37ºC under agitation Ag, Cd, Cu, Cr, Fe, NI, Zn FAAS, GFAAS NSB: Cr (ND); Fe (0.1 mg/L; Ni (0.05 mg/L) SSB: Cr (0.059 mg/L); Fe (0.619); Ni (0.629); Cu (20.35); Ag (1.381); Zn (5.276); Cd (0.004) Ag, Cd, Cr, Cu and Zn were detected in SSB medium samples, and Fe and Ni were detected in both the SSB and NSB samples Mikulewicz et al., 2014a Wires, brackets and bands made of stainless steel, and elastic ligatures of a polymer Thermostatic glass reactor with artificial saliva Artificial saliva (0.5 mL/min) during 28 days Ni, Cr, Cd, Cu, Fe, Mn, Mo, Si ICP-OES Total mass released during 4 weeks. Cu:31.3 µg Cr: 5.47 µg Ni:18.7 µg The estimated doses of Cr, Cu and Ni released during the treatment were far below the toxic dose to humans. * AAS: Atomic absorption spectrometry FAAS: flame atomic absorption spectrometry GFAAS : graphite furnace atomic absorption spectrometry ICP-MS: Inductively coupled plasma-mass spectrometry ICP-OES: Inductively coupled plasma-optical emission spectroscopy PVC-coated: cathodic arc physical vapor deposition Table 2. In vivo studies on the release of metals from orthodontic appliances: Experimental conditions, biological matrix, metal ions and concentrations released, and main results reported. References Orthodontic appliances and time treatment (sample collection) n Matrix analyzed Metal ions investigated Detection mode Median or mean metal concentrations (µg/L or ug/g) ) Main results Freitas et al., 2011 Sample collection: before placement of appliances, and 10 min, 24 h, and 7, 30, 60 days after placement 60 children: 30 control and 30 treated Saliva Ag, Cd, Cu, Zn GFAAS In the treated group, at 10 min after placement, the highest mean was for copper (70.60 µg/L), and the lowest for Zn (0.07 µg/L). Great amounts of these ions ere released, with the highest concentrations immediately after placement of appliances Mikulewicz et al., 2011c Orthodontic appliances without specification 28 patients and 18 control subjects Hair Cr, Fe, Mn, Ni ICO-OES Control (µg/g dry hair mass) Cr: 0.1298; Fe:11.74; Mn:0.4850; Ni:0.3642 Patients (µg/g dry hair mass) Cr:0.1331; Fe:12.22; Mn:0.5739; Ni:0.5073 No significant differences in the content of metals in hair between exposed and non-exposed groups. The highest difference between groups was found for Ni (39%) and Mn (18%). Amini et al., 2012 Stainless steel (SS) arches from different branches 28 patients and 28 control subjects Saliva Cr, Ni AAS Control: Cr: 2.6; Ni: 11.9 Patients Cr: 11.9; Ni:18.5 A statistical significant difference was found for Ni between both groups Ousehal and Lazrak, 2012 Sample collection: before appliance placement, just after placement, and 8 weeks after placement. 16 orthodontic patients Saliva Ni Significant increase in Ni levels just after NiTi archwire insertion. However, the difference was nonsignificant 8 weeks Table 2 later Amini et al., 2013 SS brackets, bands and NiTi archwires Sample collection at 4 times: Before treatment (T1); 3 months before induction stress (T2); 15 min after stress (T3) and 30 min after stress (T4) 30 orthodontic patients Saliva Cr, Ni GFAAS Cr: 11.9 µg/L to 14.1 µg/L Ni: 4. to 5.1 µg/L Significant increase in Ni release into saliva at the stress induction, but Cr content was no significantly altered Martin-Cameán et al., 2014a SS alloys for brackets, tubes, bands and ligatures; NiTi and SS archwires 20 orthodontic patients and 20 controls Oral mucosa cells Ti, V, Zr ICP-MS Mean values for control group: Ti : 5.14 ng/g; Zr:<LOD Orthodontic patients: Ti: 5.23 ng/g; Zr: 0.54 ng/g No significant differences were found in Ti concentrations in both groups Martin-Cameán et al., 2014b SS alloys for brackets, tubes, bands and ligatures; NiTi and SS archwires 20 orthodontic patients and 20 controls Oral mucosa cells Co, Cr, Cu, Ni ICP-MS Control group (median). Co: 0.6; Cr:2.3; Cu:4.9; Ni:4.3 Orthodontic group (median): Co:11.6; Cr:17.5; Cu:8.5; Ni:24.9 Significant higher values of all metals considered were detected in orthodontic patients in comparison to control group Martin-Cameán et al., 2014c SS alloy for brackets, tubes bands and ligatures NiTi alloy or SS archwires Treatment: At least 24 consecutive months 70 orthodontic patients and 56 controls Hair Cr, Cu, Fe, Mn, Ni FAAS GFAAS Median values for control group (µg/g dry hair mass ): Cr:0.36;Cu:33; Fe:25.3; Mn:0.23; Ni:0.36 Median values for orthodontic group, Cr:0.33; Cu:24; Fe:24.86; Mn:0.42; Ni:0.33: Only significant increased Mn levels in orthodontic patients was detected Mikulewicz et al., 2014b SS alloy for experimental plates, simulating orthodontic appliances. Sample collection: in the case of hair at 0, 3 and 6 months of treatment. Invasive samples at the end of experiment.(6 months) 12 pigs in the control group and 12 pigs received plates on the inner buccal side Non invasive samples: Pig hair Invasive samples: kidneys, liver, lungs, aorta, oral mucosa from pigs Cd, Co, Cr, Cu, Fe, Mn, Mo, Ni, Si, Zn ICP-OES The highest differences in the content were found in aorta (Ni level was 4.8 times higher in the experimental group vs control), in the cheek (Ni 3.5 times higher) and in the hair after 3 moths (Cr 3.4 times higher). Metals released have passed into selected tissues of pigs Mikulewicz et al. 2015 SS alloy for brackets and ligatures NiTi for wires Sample collection: before and on 4th, 8th and 12th months of the treatment 47 orthodontic patients Human hair Cr, Fe, Ni ICP-OES Mean values before treatment (mg/kg) Cr:0.0201; Fe:13.2; Ni:0.275 After 1 year treatment Cr:0.158; Fe:14.2; Ni:0.422 Only the content of Cr was statistically significantly higher during the treatment than before the beginning of therapy. After 1 year of treatment, an average accumulation of 8.94 µg Cr, 7.4 µg Ni and 131 µg Fe was found, FAAS: Flame-atomic absorption spectrometry GFAAS: Graphite furnace atomic absorption spectrometry ICP-OES: Inductively coupled plasma-optical emission spectroscopy LOD: Limit of detection Table 4. In vitro mutagenicity and in vivo genotoxicity studies performed in oral mucosa cells exposed to orthodontic appliances: experimental models and conditions, assays performed, metal ions investigated and main results reported. References Experimental models Assays performed Orthodontic appliances and experimental exposure conditions: solutions and incubation times (in vitro ) and time treatment (in vivo) Metal ions investigated Metal concentrations found in cell lines (in vitro) or in buccal mucosa cells (in vivo studies) Main results Wever et al., 1997 Salmonella typhimuriun strains (TA1535, TA 100, TA 1537, TA 98) with and without S9 Chinese hamster fibroblast cell line V79 Mutagenicity: Ames test Chromosomal aberration test (CA) Ni-Ti alloy for wires 100-12.5% extracts diluted in minimal essential medium (MEM , at 24, 48 and 72 h Not specified None No mutagenic effects were found with and without metabolic activation No significant increases in CA was observed Tomakidi et al., 2000 Comet Assay Immortalized human gingival keratinocytes (IHGK) Ni-free wire; 3 tupes of brackets: an UK-1 bond, Ni-free and Nicontaining brackets; and also 1 Titanium expansion screw Solutions: Lactic acid: NaCl (0.1M) 50:50, and test materials were treated at 37ºC for several incubation times: 1,3,7, and 14 d Cr, Fe, Ni measured by AAS For all materials, the release of Fe, the most abundant corrosion product, ranged between 0.90 µg/cm2 (Ni-free) to 123 µg/cm2 (in brackets). Cr values ranged between 0.02-35 µg/cm2 Values of Ni ranged from 0.02 (Ni-free) to 18 (brackets) µg/cm2 Metal ions were released in this decreased order: Fe> Cr>Ni. None of the test eluates had any genotoxic effects (tail moment) Table 4 Faccioni et al., 2003 55 orthodontic patients and 30 control subjects Alkaline comet assay Bands (type 304), bonded brackets (type 316) and archwires of Ni-Ti alloy, stainless steel (SS) or Cr-Co-Ni alloy Co, Ni by ICPMS Co and Ni were significantly higher in orthodontic patients (2.8-fold and 3.4 fold) in comparison to control subjetcs Higher frequencies of cells with comets and apoptosis were found in the patient group. Positive correlations between Co and Ni-- number of comets were found, and Co levels and comet tails Montanaro et al., 2005 Mutagenicity : Ames test Sister chromatid exchanges (SCE) CA Ni-free stainless steel (P558) and the conventional stainless steel AISI 316 L None The Ames test showed that the extracts of both materials are not mutagenic Both materials did not cause increases in the average number of SCE an in CA Westphalen et al., 2008 20 orthodontic patients Micronucleus (MN) and Comet assays SS alloy Samples were obtained: 1) before and 30d after placement of the orthodontic appliances for MN assay, and 2) before and 10 d after treatment for the comet assay None None The MN assay showed increase in MN cells 30 d after the treatment The comet assay results reveal that the treatment did not induce any genetic damage Fernández-Miñano et al., 2011 15 orthodontic patients and 15 control subjects Comet assay Tubes and brackets of stainless steel, titanium and nickel-free Samples were taken before the treatment Co, Cr, Fe, Mn, Mo, Ni, Ti by ICP-MS Co, Mo and Ni were not detected Cells in contact with stainless steel alloy displayed the highest Mn and Ti concentrations Cells in contact with the Ni-free ally presented highest Fe and Cr ions Stainless steel and nickel-free materials induced a higher DNA damage than the Ti alloy Natarajan et al., 2011 20 orthodontic patients and 20 untreated subjects MN assay Samples were collected at debonding and 30 d after debonding Cr, Ni by ICP-MS Cr and Ni ion contents were no significantly different between experimental an control groups MN frequency was higher in the treated group at debonding, whereas no significant differences 30 d after debonding were found. Hafez et al., 2011 28 orthodontic patients and 18 control subjects Comet assay Buccal mucosa cells Collection samples: before treatment, and 3 and 6 months after appliance placement Cr, Ni by GF-AAS Cr and Ni increased after 6 months of treatment.. Fixed orthodontic appliances induced DNA damage, but these changes were not evident at 6 months. When compared with the control group, the changes were significantly only for cellular Cr content and DNA damage at 3 months, Angelieri et al., 2011a 23 patients MN assay The fixed appliances consisted of an average of 4 to 8 bands and 20 bonded brackets. The arch wires used were a NiTi alloy during the treatment or SS at the end of the orthodontic therapy. Cells were collected before, during orthodontic therapy (170 days after beginning the treatment), and after therapy (ie, at least 6 months after the insertion of SS arches) None MN frequencies were not significantly different before, during, and even after orthodontic therapy Angelieri et al., 2011b Chinese hamster ovary (CHO) cells Comet assay Four different commercial orthodontic brackets wit similar chemical composition Brackets submersed in acetic acid and NaCl 0.1 M for different times: 1, 3, 7, 14, 21, 35 and 70 days. Cells were added to eluates maintained for 30 min at 37ºC. None None The corrosion eluates did not induce genetic damage Öztürk et al., 2012 55 patients MN assay Patients were divided in 5 groups, according to the orthodontic cement assayed 1 month period None None A significant increase in chromosomal damage in all groups was reported. Band cementation with conventional glass ionomer cement showed the least genotoxic effects Heravi et al., 2013 25 orthodontic patients MN assay Stainless steel brackets and Ni-Ti or stainless steel archwires Samples were taken before the appliance placement and 9 months later None None No significant differences were found in the MN counts before and 9 months after therapy. Toy et al., 2014 30 orthodontic patients MN assay Brackets and molar tubes were bonded with three different lightcured bonding composites Samples were taken before and at 1,3,6 months after treatment None None MN rates did not significantly differ within the dame cell type, so, genotoxic effects were absent Martin-Cameán et al., 2014d 20 controls, 20 orthodontic patients and 20 orthodontic+miniimplants Comet assay None None Gonçalves et al., 2014 Comet assay Modified comet assay: FPG and Endo III enzymes* CBMN-Cyt assay* HepG2* cells and Human oral keratinocyte (HOK) cell line Ss metallic orthodontic bands: Nonsoldered bands (NSB) and silver soldered bands (SSB) HOK cells: 24 h Ag, Cd, Cu, Cr, Fe, Ni, Zn by AAS Ag, Cd, Cr, Cu and Zn were detected in SSB medium samples, and Fe and Ni were detected in both the SSB and NSB medium samples - NSB and SSB induced genotoxicity in comet assay, and stronger effects were found in the SSB group. - Both groups induced similar increases in oxidative DNA lesions - Nucleoplasmic bridges, biomarkers of DNA misrepair and/or telomere end fusions were elevated in the SSB group. AAS: Atomic absorption spectrometry CBMN-CYt: cytokinesis-bloc micronucleus cytome assay FPG: Formamido pyrimidine glycosylase protein; Endo III: Endonuclease III HepG-2: human hepatocellular carcinoma cell line ICP-MS: Inductively coupled plasma-mass spectrometry Resultados y Discusión / Results and Discussion CAPÍTULO 7 / CHAPTER 7 Ana Martín-Cameán, Angeles Jos, Ana M. Cameán, Enrique Solano, Alejandro Iglesias-Linares GENOTOXIC, CYTOTOXIC EFFECTS AND GENE EXPRESSION CHANGES INDUCED BY ORTHODONTIC FIXED APPLIANCES OVER ORAL MUCOSA CELLS: A SYSTEMATIC REVIEW. Dental Materials (en revisión) 2015 Genotoxic,* cytotoxic* effects*and* gene* expression* changes*induced*by* orthodontic* fixed*appliances*over*oral*mucosa*cells:**A*systematic*review* ! Martín(Cameán!A1*,!!Jos!A2,!!Cameán!AM2,!Solano!E1,!Iglesias(Linares!A3! 1Stomatology!department,!School!of!Dentistry,!University!of!Seville,!Seville.!Spain! 2!Area!of!Toxicology,!Faculty!of!Pharmacy,!University!of!Seville.!Seville,!Spain!! 3!Stomatology!IV,!School!of!Dentistry,!Complutense!University!of!Madrid.!Madrid.! Spain! ! ! ! ! ! ! ! *Corresponding*author* Alejandro!Iglesias(Linares! Complutense!University!of!Madrid,!Department!of!Stomatology!IV,!Madrid! C.P.!28040! Madrid.!Spain!! E!mail!address:[email protected]! Tel:!+34!636705246! ! * * ABSTRACT! Genotoxic,* cytotoxic* effects* and* gene* expression* changes* induced* by* orthodontic* fixed*appliances*over*oral*mucosa*cells:**A*systematic*review* ! Background:!Accumulated!chronic!or!severe!acute!DNA!and!cellular!damage!over!oral! mucosal!cells!constitutes!one!of!the!main!initiating!factors!contributing!to!a!wide!range! of!malignant!lesions!to!occur!in!the!oral!cavity.!Eventually,!oral!mucosa!remains!to!be! persistently!disrupted!by!intraoral!appliances!used!in!dentistry.!Specifically,!the!types! of!fixed!appliances!used!in!orthodontics!exert!a!maintained!and!localized!aggression!to! the! oral! mucosa! for! a! substantial! period! of! time.! Nevertheless,! to! date,! notable! controversy!is!found!in!literature!regarding!the!effect!of!such!sustained!damage!to!the! oral! mucosal! cells! at! genotoxic! and! cytotoxic! level.! The! present! systematic! review! aimed!to!investigate!the!effects!of!these!interventions!and!is!reported!in!accordance! with!Preferred!Reporting!Items! for!Systematic!Reviews!and!Meta(Analyses!(PRISMA)! guidelines.! Material! and! Methods:! Electronic! [CENTRAL,MedLine;SCOPUS;! EMBASE,! Cochrane!Library,!ISI!Web!of!Science,!PASCAL,!OVID!HealthSTAR,!and!EBM]!and!manual! searches! [OpenGrey;! Google! Scholar]! up! to! 29th! April,! 2015! were! conducted! for! publications! of! RCTs/quassiRCTs! analyzing! the! genotoxic/cytotoxic! effects! of! these! types!of!oral!appliances!in!humans.!A!primary!outcome!(cellular!and!DNA!damage)!and! a!number!of!secondary!outcomes!were!examined.!Two!reviewers!performed!the!study! selection! and! the! risk! of! bias! assessment! [Cochrane! Collaboration’s! tool]! and! meta( analysis! was! conducted! when! possible! on! homogenous! groups.! Results:! From! the! initial!electronic!search!(27902),!17!articles!were!retrieved!and!6!studies![low!risk!of! bias(LRB)]!finally!met!the!eligibility!criteria![PICOS].!Despite!substantial!heterogeneity! in!the!methods!and!sampling,!in!most!comparisons!made,!significant!differences!were! observed! by! most! of! the! studies! (5! out! of! 6)! regarding! a! critically! acute! detectable! geno!and!cytotoxic!effects!after!appliance!using,!in!the!short!(at!1!and!3!months)!and! long! term! (24(48! months)! evaluation.! Nevertheless,! some! of! the! studies! evaluating! post(removable!effects!(2! out! of!3)!conclude!that!this! effects!at!the!DNA!or! cellular! level! were! not! statistically! significant! different! to! controls! after! removing! the! oral! aggresion! Conclusions:! Acute! DNA! and! cellular! damage! over! oral! mucosa! cells! are! found! induced! by! direct! contact! of! orthodontic! appliances! as! reported! by! sound! selected!scientific!literature!(LRB).Nevertheless,!despite!no!further!detection!of!these! effects!is!described!by!a!few!studies!after!removing!the!appliances,!additional!rigorous! randomized!clinical!trials!are!needed!to!explore!to!what!extent!no!acquired!damage!is! observed!in!the!oral!mucosa.!! ! ! ! ! Keywords:*Systamatic*Review,*Metaanalysis,*orthodontic*appliance,*DNA*damage,* Genotoxicity,*Cytotoxicity,*oral*mucosa,*metal*release* ! ! 1.*Introduction* ! Dental! materials! ought! to! guarantee! absolute! safety,! biocompatibility! and! health! compatibility! in! the! short! and! long! term! use![1].! These! qualities! are! of! dramatic! importance!in!the!oral!cavity!medium!where!a!hostile!chemical!microenvironment!and! high!standards!of!mechanical!resistance!requirements!are!usually!found![2].!Eventually,! oral! mucosa! remains! to! be! persistently! disrupted! by! intraoral! appliances! used! in! dentistry.! Specifically,! the! types! of! fixed! appliances! used! in! orthodontics! exert! a! maintained!and!localized!aggression!to!the!oral!mucosa!for!a!substantial!period!of!time! [3].! To! this! respect,! accumulated! chronic! or! severe! acute! DNA! and! cellular! damage! over!oral!mucosal!cells!constitutes!one!of!the!main!initiating!factors!contributing!to!a! wide!range!of!malignant!lesions!to!occur!in!the!oral!cavity![4].!Not!only!this!but!also! chemical/mechanical! corrosion! and! metallic! ions! releasing! [Nickel,! Chromium,! Titanium,! Cobalt! among! many! others],! is! a! well(documented! intraoral! event! that! occurs!in!this!type!of!appliances![5].!Various!studies!have!evaluated!the!discharge!of! metal! ions! from! orthodontic! appliances! in! biologic! fluids,! and! most! have! concluded! that!they!do!not!reach!toxic!concentrations![6,7].!However,!it!cannot!be!excluded!that! even!nontoxic!concentrations! might!be!sufficient!to!produce!biologic!changes!in! the! oral!mucosa.!Despite!the!low!release!of!ions!from!metal!appliances,!these!can!be!taken! up!by!the!adjacent!oral!tissues![8(10]!over!the!long!period!of!orthodontic!treatment! and! may! possibly! lead! to! genome! alteration! in! the! oral! tissues! of! patients! wearing! them.! Metals! are! not! biodegradable,! and! their! sustained! release! might! produce! irreversible!toxic!effects!from!their!accumulation!in!the!tissues![11].!To!this!regard,!it´s! been!suggested!that!direct!metallic!ion!exposure!to!Cobalt!or!Nickel!is!associated!with! several!types!of!cancer!in!other!mucosa![12].!! Nevertheless,!notable!controversy!is!found!to!date!in!literature!regarding!the!effect!of! such!sustained!damage!to!the!oral!mucosal!cells!at!genotoxic!and!cytotoxic!level.!The! present! review! aimed! to! systematically! make! a! critical! and! analytical! report! of! the! available!scientific!evidence!about!the!genotoxic!and!cytotoxic!effects!derived!from!of! the! short! and! long! term! metallic! exposure! over! oral! mucosa! cells! reporting! in! accordance!with!Preferred!Reporting!Items!for!Systematic!Reviews!and!Meta(Analyses! (PRISMA)!guidelines![13].! ! 2.*Materials*and*Methods* Protocol+and+Registration+ This!systematic!review!was!conducted!is!reported!according!to!the!Preferred!Reporting! Items! for! Systematic! Reviews! and! Meta(Analyses! (PRISMA)! statement! [13]! and! following! the! Cochrane! Collaboration! [14]! and! the! Centre! for! Reviews! and! Dissemination! guidance! [15].! Neither! a! review! protocol! was! available! nor! was! the! review!registered.! ! Information+resources+and+search+strategy+(Figure+1.+Appendix+Table1)+ The! databases! explored! were! the! CENTRAL,! MEDLINE! Database! (Entrez! PubMed,! www.ncbi.nim.nih.gov),! SCOPUS! (www.scopus.com),! EMBASE! and! The! Cochrane! Library!(www.thecochranelibrary.com),!ISI!Web!of!Science,!PASCAL,!OVID!HealthSTAR,! and! EBM! (Evidence(Based! Medicine)! Reviews! comprising! of! the! Cochrane! Central! Register! of! Controlled! Trials,! Cochrane! Database! of! Systematic! Reviews! (CDSR)! and! Database!of!Abstracts!of!Reviews!of!Effects!(DARE).!We!included!all!articles!published! up!to!29!April!2015.!!No!restrictions!regarding!language!or!publication!year!was!set.!In! addition,!the!OpenGrey!database!in!EAGLE!(European!Association!for!Grey!Literature! Exploitation)!and!Google!Scholar!was!searched!for!grey!literature.!Other!sources!and! journals!highly!likely!to!contain!studies!relevant!to!the!reviewed!topic!were!manually! searched!also!up!to!2!May!2015.!The!present!research!was!based!on!the!MesH!terms! and!combinations!compiled!in!AppendixTable!1!for!every!database!and!all!duplicates! were!electronically!removed.!When!additional!information!was!needed,!efforts!were! made!to!contact!the!authors.! + Eligibility+/+Criteria+for+Studies+to+be+Considered+(PICOS)!+ ! •!Participants:!patients!undergoing!orthodontic!treatment!with!fixed!appliances.!!!! +•!Interventions:!Assessment!of!DNA!damage,!genotoxicity!and!cytotoxicity!on!oral! mucosal!cells.! ! •! Comparators/Control:! internal! or! external! control! group! with! no! orthodontic! treatment,!or!placebo.!!!! •!Outcomes:!! (1)+Primary+outcomes:!quantification!of!DNA!damage,!genotoxicity!and!cytotoxicity!in! cells!obtained!from!oral!mucosa.!! (2)+ Secondary+ outcomes:! additional! quantification! of! oral! mucosa!cells´! damage! by! including! ion! concentration! or! changes! in! gene! expression! by! PCR,! array! or! other! biomolecular!techniques.!! •! Studies:! Controlled! randomized! and! quasi+randomized! clinical! trials! (RCTs! and! q( RCTs).! Other!types!of!article!that!did!not!match!the!targets!of!this!review!were!not!included! in! the! final! selection.! Studies! regarding! removable! orthodontic! appliances,! acrylic( based!materials,!descriptive!studies,!case!reports,!case!series,!opinion!articles,!reviews,! animal!and!in!vitro!studies!were!excluded.! ! Data+Collection+and+Analysis+ Study+selection+ Two! reviewers! independently! selected! eligible! studies! by! reviewing! the! list! of! titles/abstracts! according! to! the! inclusion/exclusion! criteria.! From! eligible! titles/abstracts!the!full!articles!were!retrieved!and!the!same!reviewer!independently! reviewed!the!full!articles!to!establish!eligibility.!Any!discrepancies!between!reviewers! for! inclusion! of! articles! were! addressed! through! discussion! until! consensus! was! reached.! Studies! excluded! at! this! stage! were! identified! and! reasons! for! exclusion! recorded.! ! Data+collection+process+ Based!on!Cochrane!recommendations!a!pre(piloted!standardized!extraction!form!was! used.! Eligible! studies’! data! were! extracted! and! recorded! by! the! first! reviewer.! The! second!reviewer!crosschecked!the!accuracy!and!validity!of!all!data!extracted.!In!this! fluids,!few!studies!have!quantitatively!determined!the!ion!concentrations!found!in!oral! mucosal!cells![8,21].!Quantification!of!metallic!ions!concentration!in!oral!mucosa!cell! population!where!found!to!be!alterated!in!most!of!the!studies!included!in!the!present! review,!despite!no!statistical!significant!correlation!is!observed!in!all!of!them!between! cellular!ion!content!and!genotoxic/cytotoxic!effects![8,20].!!! ! The!aims!of!this!systematic!review!have!been!to!gather!the!data!available!regarding! the! biological! effects! of! exposure! to! metallic! appliances! in! the! orthodontic! context.! The!results!of!it,!however,!must!be!taken!cautiously.!There!is!somehow!heterogeneity! of! quality! level! among! the! studies! make! comparisons! between! them! somehow! difficult,! but! illustrates! the! general! lack! of! high! quality! results! on! every! one! of! the! different!studies!compiled.!Besides,!in!order!to!assess!the!quality!level!of!the!papers! included!different!scales!and!methods!have!been!described!in!the!literature.!Among! them!the!Newcastle(Otawa!scale!(NOS)!has!been!used,!and!although!this!is!a!widely! used!scale,!its!use!is!not!yet!validated.!Some!authors![41]!have!expressed!their!concern! that!NOS!may!provide!a!quality!score!that!has!unknown!validity!or!that!includes!quality! items!that!are!even!invalid!and!therefore!may!produce!arbitrary!results.!On!the!other! hand,! in! their! 2007! review,! Sanderson! et! al.[42],! after! identifying! and! analyzing! the! existing! tools! in! literature! for! assessing! quality,!concluded! that! there! was! a! need! to! agree! on! critical! elements! for! assessing! susceptibility! to! bias! in! observational! epidemiology! and! to! develop! appropriate! evaluation! tools.! Until! that! consensus! is! reached! the! present! review! followed! current! accepted! guidelines! by! using! the! Cochrane! risk! of! bias! tool! and! the! RevMan! 5.2! software! for! data! analysis! as! recommended!by!the!the!Preferred!Reporting!Items!for!Systematic!Reviews!and!Meta( Analyses! (PRISMA)! statement! and! following! the! Cochrane! Collaboration! and! the! Centre!for!Reviews!and!Dissemination!guidance![13,14].! ! To!our!knowledge!this!is!the!first!systematic!critical!and!analytical!report!compiling!all! the!available!sound!scientific!literature!regarding!the!genotoxic!and!cytotoxic!effects!of! the!short!and!long!term!exposure!to!a!metallic!irritant!appliance!to!the!oral!mucosa! cells.!! ! 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Figure*captions* * Figure*1.!Flow!diagram!of!the!screening!process!for!study!selection! * Figure* 2.!(Supplemental+Appendix).!Summ!up!assessment!for!the!overall!risk!of!bias.! Other! bias:! represents! any! other! apparent! bias! in! the! trial! design! or! conduct! other! than!the!already(assessed!biases!in!the!tool![i.e.,!selection,!performance!and!detection,! attrition,!and!reporting!biases]! * Figure*3.!(Supplemental+Appendix).!The!individual!domain!risk!of!bias!for!each!study.! Colour!nomenclature:!green!+!Low!risk!of!bias,!yellow!?!Unclear!risk!of!bias,!red!(!High! risk! of! bias.! §:assessed! using! the! Cochrane! Tool! for! Assessing! Risk! of! Bias! in! Randomized!Clinical!Studies.! ! Figure* 4.! (Supplemental+ Appendix).! Meta(analysis! comparisons! for! the! long! term! exposure!to!metallic!ions.!Galbraith!Graph!and!analysis.!! ! Figure* 5.! (Supplemental+ Appendix).! Meta(analysis! comparisons! for! the! long! term! exposure!to!metallic!ions.!Funnel!plot!assessment!and!cumulative!effect! * Figure* 6.! (Supplemental+ Appendix).! Meta(analysis! comparisons! for! the! long! term! exposure!to!metallic!ions.!Publication!bias! * Figure* 7.! (Supplemental+ Appendix).! Meta(analysis! comparisons! for! the! long! term! exposure!to!metallic!ions.!Random!effects!model! ! #1# ("orthodontic# subjects"[tiab]# OR# "orthodontic# treatment"[tiab]# OR# orthodontic# appliances[mh]# OR# "orthodontic# therapy"[tiab]# OR# "orthodontic# appliances"[tiab]# OR# orthodontic#device*[tiab]#OR#orthodontic#patient*[tiab]#OR#fixed#appliance*[tiab])# # 2##(corrosion[mh]#OR#metals[mh:noexp]#OR#ions[mh:noexp]#OR#metal#release*[tiab]#OR#metal# content*[tiab]# OR# metal# level*[tiab]# OR# metal# concentration*[tiab]# OR# metal# ion*[tiab]# OR# trace#metal*#OR#ion#release*[tiab]#OR#ion#content*[tiab]#OR#corrosion[tiab])# 3##(genotox*[tiab]#OR#mutag*[tiab]#OR#toxicity#OR#DNA#damage#OR#cytotoxicity#OR#damage# OR#tissue#OR#fragmentation#OR#reactivity#OR#biocompatibility)# 4##(oral#mucosa#OR#mucosa#OR#lips#OR#jugal#mucosa#OR#gingiv*)# 5##(in#vitro#OR#animal[filter])# #(#1#AND##2#AND##3#AND##4#NOT##5)# # # # ("orthodontic#subjects"[tiab]#OR#"orthodontic#treatment"[tiab]#OR#orthodontic#appliances[mh]# OR#"orthodontic#therapy"[tiab]#OR#"orthodontic#appliances"[tiab]#OR#orthodontic#device*[tiab]# OR# orthodontic# patient*[tiab]# OR# fixed# appliance*[tiab])# AND# (corrosion[mh]# OR# metals[mh:noexp]# OR# ions[mh:noexp]# OR# metal# release*[tiab]# OR# metal# content*[tiab]# OR# metal#level*[tiab]#OR#metal#concentration*[tiab]#OR#metal#ion*[tiab]#OR#trace#metal*#OR#ion# release*[tiab]#OR#ion#content*[tiab]#OR#corrosion[tiab])#AND#(genotox*[tiab]#OR#mutag*[tiab]# OR# toxicity# OR# DNA# damage# OR# cytotoxicity# OR# damage# OR# tissue# OR# fragmentation# OR# reactivity# OR# biocompatibility)# AND# (oral# mucosa# OR# mucosa# OR# lips# OR# jugal# mucosa# OR# gingiv*)#NOT#(in#vitro#OR#animal[filter])# Discusión General/General Discussion Tal y como se ha expuesto previamente en la Introducción, los estudios sobre biocompatibilidad de los materiales ortodóncicos, que incluyan tanto estudios de liberación de iones metálicos constituyentes de los mismos a lo largo del tratamiento, como evaluación de los efectos potenciales in vivo, son de interés creciente. En las revisiones llevadas a cabo, se ha realizado una puesta al día de la literatura científica sobre la liberación in vitro e in vivo de iones metálicos componentes de la aparatología ortodóncica y sus efectos tóxicos, con especial interés en los estudios de citotoxicidad y genotoxicidad llevados a cabo hasta la fecha actual. Los estudios in vitro indican que dada la diversidad en la composición de los materiales y las técnicas de fabricación de los mismos, es necesario una evaluación de su seguridad caso por caso. Entre las lagunas detectadas destaca que el número de estudios de toxicidad in vivo, tanto de liberación de iones como de citotoxicidad y genotoxicidad, es escaso (en comparación con in vitro) siendo prioritario el emprenderlos, ya que proporcionan una información más adecuada de los efectos de los materiales de ortodoncia en un escenario real. En los estudios in vivo de liberación de iones metálicos no se ha constatado la aplicación de métodos validados de determinación, y dados los resultados contradictorios existentes, deben llevarse a cabo estudios de monitorización (especialmente de Ni y Cr) que permitan investigar las relaciones causa-efecto de interés, así como investigaciones encaminadas a conocer los mecanismos involucrados en los efectos tóxicos observados (por ej., efectos sobre el ADN por mecanismos de estrés oxidativo). Además, se ha observado que la mayoría de los estudios experimentales se han llevado a cabo con aparatología ortodóncica tradicional, pero sería prioritario el avance del conocimiento en nuevos materiales, o nuevos procedimientos, o investigar nuevas matrices, sobre todo las que permitan una evaluación a largo plazo de la potencial acumulación de [Document text truncated for crawler view.]