Estudio de los mecanismos moleculares que median el efecto protector del glutatión reducido en el mantenimiento de la proteostasis celular

TESIS DOCTORAL Estudio de los mecanismos moleculares que median el efecto protector del glutatión reducido en el mantenimiento de la proteostasis celular Departamento de Fisiología Médica y Biofísica Universidad de Sevilla David Guerrero Gómez Dirigida por Dr. Antonio Miranda Vizuete El Dr. Antonio Miranda Vizuete, Científico Titular del Consejo Superior de Investigaciónes Científicas (CSIC), CERTIFICA: Que David Guerrero Gómez, Licenciado en Biología, ha realizado bajo su dirección el trabajo titulado “Estudio de los mecanismos moleculares que median el efecto protector del glutatión reducido en el mantenimiento de la proteostasis celular”, el cual reúne las condiciones de originalidad y calidad científica necesarias para optar al grado de Doctor por la Universidad de Sevilla. Y para que así conste, expide el presente certificado en Sevilla, a 15 de Diciembre de 2021. Fdo: Dr. Antonio Miranda Vizuete. i Índice general. Índice de figuras. .......................................................................................................... vii Índice de tablas. ............................................................................................................. xi Abreviaturas ................................................................................................................. xiii Resumen ........................................................................................................................ xv Publicaciones .............................................................................................................. xvii Capítulo I. Introducción ................................................................................................ 1 1.1. Proteostasis. ................................................................................................................ 3 1.2. Principales enfermedades neurodegenerativas relacionadas con la pérdida de proteostasis. ....................................................................................................................... 3 1.2.1. Enfermedad de Alzheimer. .................................................................................... 4 1.2.2. Enfermedad de Parkinson. .................................................................................... 6 1.2.3. Enfermedades de poliglutaminas. .......................................................................... 8 1.3. Procesos moduladores de la neurodegeneración. ......................................................... 9 1.3.1. Agregación de proteínas. .................................................................................... 10 1.3.2. Disfunción mitocondrial. ...................................................................................... 12 1.3.3. Estrés oxidativo. ................................................................................................. 14 1.3.3.1. Antioxidantes. .............................................................................................. 16 1.3.3.1.1. Antioxidantes no enzimáticos................................................................ 16 1.3.3.1.1.1. Vitaminas E y C. ........................................................................... 16 1.3.3.1.1.2. Glutatión (GSH). ........................................................................... 17 1.3.3.1.2. Antioxidantes enzimáticos. ................................................................... 18 1.3.3.1.2.1. Superóxido dismutasa. .................................................................. 18 1.3.3.1.2.2. Catalasas. .................................................................................... 18 1.3.3.1.2.3. Tiorredoxinas. ............................................................................... 19 1.3.3.1.2.4. Glutarredoxinas. ........................................................................... 21 1.3.3.1.2.5. Glutatión peroxidasas. .................................................................. 23 1.3.3.1.2.6. Peroxirredoxinas. .......................................................................... 23 1.4. Mecanismos de regulación de la proteostasis. ............................................................. 24 1.4.1. Plegamiento de proteínas. ................................................................................... 24 1.4.1.1. Asistentes de plegamiento. .......................................................................... 27 1.4.1.1.1. Proteína disulfuro isomerasa (PDI). ...................................................... 27 1.4.1.1.2. Chaperonas moleculares. ..................................................................... 29 1.4.2. FOXO. ................................................................................................................ 30 1.4.3. Respuesta a proteínas mal plegadas. .................................................................. 31 1.4.4. Sistema ubiquitina-proteasoma. .......................................................................... 32 ii 1.4.5. Autofagia. ........................................................................................................... 33 1.4.6. Mitofagia. ............................................................................................................ 35 1.5. Caenorhabdiditis elegans. .......................................................................................... 36 1.5.1. Ciclo de vida y reproducción. ............................................................................... 36 1.5.2. Anatomía. ........................................................................................................... 38 1.5.3. C. elegans como organismo modelo. ................................................................... 41 1.5.4. C. elegans como modelo de enfermedades neurodegenerativas. ......................... 42 1.5.4.1. Modelos de Ab. ........................................................................................... 42 1.5.4.2. Modelos de a-sinucleína. ............................................................................. 44 1.5.4.3. Modelos de poliglutaminas. .......................................................................... 45 1.5.5. Mantenimiento de la homeostasis redox de grupos tiólicos en C. elegans. ............ 47 1.5.6. Glutatión reductasa en C. elegans. ...................................................................... 49 Capítulo II. Justificación y Objetivos. ...................................................................... 53 Capítulo III. Resultados. .............................................................................................. 57 3.1. Efecto del silenciamiento del gen gsr-1 mediante ARN de interferencia en modelos de agregación de proteínas en C. elegans. ............................................................................. 59 3.2. Efecto de la inhibición de la síntesis, reducción y disponibilidad del glutatión reducido.. 63 3.3. Efecto de la mutación gsr-1(tm3574) en modelos de agregación de proteínas exógenas en C. elegans. .................................................................................................................. 65 3.3.1. Modelos de agregación por repeticiones de residuos de glutamina. ...................... 66 3.3.2. Modelos de agregación del péptido Ab. ............................................................... 70 3.3.3. Modelos de agregación de la proteína a-sinucleína. ............................................. 73 3.4. Efecto de la deficiencia de GSR-1 en la agregación de proteínas endógenas de C. elegans............................................................................................................................. 76 3.5. Mecanismo molecular del efecto protector de GSR-1 en la homeostasis proteica. ........ 79 3.5.1. Identificación de la ruta de control de la proteostasis afectada por la falta de GSR-1. .................................................................................................................................... 79 3.5.1.1. Ruta de estrés citoplasmático. ..................................................................... 79 3.5.1.2. Ruta de la insulina ....................................................................................... 80 3.5.1.3. Rutas de estrés de orgánulo ........................................................................ 82 3.5.1.3.1. Ruta de estrés de retículo endoplásmico. .............................................. 82 3.5.1.3.2. Ruta de estrés mitocondrial. ................................................................. 84 3.5.1.4. Ruta de degradación de proteínas................................................................ 85 3.5.1.4.1. Proteasoma ......................................................................................... 85 3.5.1.4.2. Autofagia. ............................................................................................ 86 3.5.1.4.3. Mitofagia .............................................................................................. 88 3.5.2. Estudio de la actividad autofágica en mutantes gsr-1. .......................................... 89 iii 3.5.3. Reproducción del impacto de la mutación gsr-1 en la agregación de proteínas mediante el bloqueo genético de la autofagia. ............................................................... 92 3.5.4. Efecto de la mutación gsr-1 en la saturación de la autofagia. ................................ 95 3.5.5. Estudio del flujo autofágico. ................................................................................. 99 3.6. Estudio de la regulación redox de TFEB/TFE3/HLH-30. ..............................................100 3.6.1. Función del residuo de cisteína conservado de TFEB/TFE3 ................................103 3.6.2. Función del residuo de cisteína conservado de HLH-30. .....................................106 3.6.3. Evaluación de la translocación nuclear de HLH-30. .............................................107 3.6.4. Estudio del papel fisiológico de la cisteína 284 de HLH-30. .................................110 3.6.5. Papel de la C284 de HLH-30 durante el desarrollo. .............................................111 Capítulo IV. Discusión ...............................................................................................117 4.1. La inhibición farmacológica de la disponibilidad de GSH fenocopia el efecto de la falta de GSR-1 en modelos de agregación. ...................................................................................120 4.2. La falta de GSR-1 tiene efecto sobre los mecanismos de regulación de la proteostasis. .............................................................................................................................122 4.3. La pérdida de regulación redox debida a la mutación gsr-1 impacta principalmente sobre la autofagia. .....................................................................................................................124 4.3.1. La mutación gsr-1 podría incrementar la agregación de proteínas por supersaturación. .............................................................................................................................127 4.4. La regulación redox de la cisteina 284 de HLH-30 no afecta a la inducción de la autofagia. ........................................................................................................................130 4.5. Implicación del GSH en neurodegeneración. ..............................................................133 Capítulo V. Conclusiones ..........................................................................................137 Capítulo VI. Materiales y Métodos ...........................................................................141 6.1. Estirpes.....................................................................................................................143 6.1.1. Estirpes de Caenorhabditis elegans. ...................................................................143 6.1.2. Estirpes de Escherichia coli. ...............................................................................149 6.1.3. Estirpes de Staphylococcus aureus. ...................................................................149 6.2. Medios de cultivo, tampones y soluciones. .................................................................150 6.2.1. Mantenimiento de C. elegans. ............................................................................150 iv 6.2.2. Medios de cultivo para E. coli. ............................................................................151 6.2.3. Medios de cultivo para S. aureus. .......................................................................151 6.3. Crecimiento y mantenimiento de organismos. ............................................................153 6.3.1. Estirpes bacterianas. ..........................................................................................153 6.3.1.1. Cultivo de E. coli. ........................................................................................153 6.3.1.2. Cultivo de Staphylococcus aureus. ..............................................................153 6.3.2. C. elegans. ........................................................................................................153 6.3.2.1. Crecimiento de C. elegans. .........................................................................153 6.3.2.2. Conservación de estirpes. ...........................................................................153 6.3.2.3. Limpieza de contaminación .........................................................................154 6.3.2.4. Sincronización de animales. ........................................................................155 6.3.2.5. Extracción de ADN genómico de C. elegans. ...............................................155 6.4. Inhibición de la ruta del glutatión. ...............................................................................155 6.5. Ensayos de ARN de interferencia. .............................................................................156 6.6. Microscopía...............................................................................................................157 6.7. Cuantificación de los fenotipos en estirpes poliQ. .......................................................157 6.7.1. Cuantificación de agregados poliQ::YFP. ............................................................157 6.7.2. Determinación de la respuesta mecanosensorial.................................................158 6.7.3. Arresto embrionario............................................................................................158 6.8. Cuantificación de los fenotipos en estirpes Ab. ...........................................................159 6.8.1. Parálisis. ............................................................................................................159 6.8.2. Evaluación del defecto en la expulsión de embriones. .........................................159 6.8.3. Evaluación del retraso en el desarrollo................................................................159 6.9. Cuantificación de los fenotipos en estirpes a-sinucleína. ............................................159 6.9.1. Cuantificación de agregados de a-sinucleína. .....................................................159 6.9.2. Neurodegeneración dopaminérgica. ...................................................................160 6.9.3. Parálisis. ............................................................................................................160 6.10. Cuantificación de fenotipos de estirpes que expresan proteínas metaestables. .........160 6.10.1. Parálisis de los animales unc-52(ts). .................................................................160 6.10.2. Arresto embrionario de animales let-60(ts). .......................................................161 6.11. Reporteros de proteostasis. .....................................................................................161 6.11.1. Reporteros de la ruta de la insulina: DAF-16 y SOD-3. ......................................161 6.11.2. Reportero de UPRRE: HSP-4. ...........................................................................161 6.11.3. Reportero de UPRmit: HSP-6.............................................................................162 6.11.4. Reporteros de HSR: HSF-1 y HSP-70...............................................................162 6.11.5. Reportero de proteasoma: UbG76V. .................................................................162 v 6.11.6. Mitofagia. .........................................................................................................162 6.11.7. Localización subcelular de HLH-30::GFP. .........................................................163 6.12. Cuantificación de la acumulación de SQST-1::GFP. .................................................164 6.13. Cuantificación de los focos mCherry::GFP::LGG-1. ..................................................165 6.14. Ensayo de longevidad. ............................................................................................165 6.15. Supervivencia a arsenito sódico. ..............................................................................166 6.16. Supervivencia a la infección por Staphylococcus aureus. ..........................................166 6.17. Cuantificación de la longitud de los mutantes eat-2. ..................................................167 6.18. Formación y recuperación de dauer. ........................................................................167 Capítulo VII. Bibliografía. ...........................................................................................169 xiii Abreviaturas A b : Amyloid beta. ADN: Ácido dexoiribonucleico. AICD: Dominio intracelular C-terminal del APP. AL: Autolisosoma. ANOVA: Test estadístico de análisis de varianza. AP: Autofagosoma. APOE: Apolipoproteína E. APP: Amyloid precursor protein. ARN: Ácido ribonucleico. ARNi: ARN de interferencia. ARNm: ARN mensajero. Asn: Asparagina. ATF6: Activating transciption factor-6. ATFS: Activatin transcription factor associated with stress. ATG: Autofagy-related protein. ATP: Adenosín trifosfato. ATXN: Proteína humana ataxina. C/Cys: Cisteína. C. elegans: Caenorhabditis elegans. CAT: Catalasa. CGC: Caenorhabditis genetics center. CRISPR: Clustered regularly interspaced short palindromic repeats. CTF: Fragmento C-terminal. DEM: Dietil maleato. DIC: Differential interference contrast. DRPLA: Atrofia dentatorubropálidoluisiana. EBSS: Earle´s balanced salt solution. E. coli: Escherichia coli. ERO: Especie reactiva de oxígeno. FAD: Flavín adenín dinucleótido. GCS: g-glutamilcisteína sintetasa. GFP: Green fluorescent protein. Gly: Glicina. GPx: Glutatión peroxidasa. GR: Glutatión reductasa. GS: Glutatión sintetasa. GSH: Glutatión reducido. GSSG: Glutatión oxidado. HD: Huntington disease. His: Histidina. HSF: Heat shock factor. HSP: Heat shock protein. HTT: Gen de la Huntingtina humana. Htt: Proteína Huntingtina humana. IRE1: Inositol-requiring protein-1. LB: Luria Bertani. NGM: Nematode Growth Medum. NADPH: Nicotinamida adenina dinuleótido fosfato. ORF: Open reading frame. PCR: Polimerase chain reaction. PDI: Proteína disulfuro isomerasa. PERK: Protein kinase RNA-like endoplasmic reticulum kinase. Phe: Fenilalanina. PoliQ: Poliglutamina. Pro: Prolina. Prot: Proteína. xiv Prx: Peroxirredoxina. Q: Glutamina. RE: Retículo endoplamático. S. aureus: Staphylococcus aureus. SBMA: Atrofia muscular espinal y bulbar. SCA: Ataxia espinocerebelosa. SeCys: Selenocisteína. Ser: Serina. SOD: Superóxido dismutasa. TGR: Tiorredoxina glutatión reductasa. Trx: Tiorredoxina. TrxR: Tiorredoxina reductasa. TSA: Tryptic soy agar. TSB: Tryptic soy broth. Txl: Tioredoxin like. Tyr: Tirosina. UPR: Unfolded protein response. UPS: Ubiquitin proteasome system. UTR: Untranslated region. Val: Valina. vs: versus. YFP: Yellow fluorescent protein. xv Resumen El mantenimiento de la proteostasis es crucial para la supervivencia de todos los organismos, ya que asegura la funcionalidad de las proteínas. Las células han desarrollado un sofisticado sistema de control de calidad que mantiene el correcto plegamiento de las proteínas, actuando sobre aquellas que pierden su conformación nativa, volviéndolas a plegar correctamente o degradándolas si fuera necesario. Sin embargo, los mecanismos de control de la proteostasis tienen una capacidad limitada, llegando a colapsar ante diferentes estreses y derivando en la acumulación de proteínas mal plegadas con tendencia a la agregación. En presencia de un estrés proteotóxico como resultado de la acumulación de agregados proteicos, el citosol y el retículo endoplasmático (RE) sufren un cambio en su estado redox, donde el citosol se vuelve más oxidado mientras que el RE cambia a un estado más reducido. En este trabajo hemos investigado cómo el estatus redox celular afecta a la agregación de proteínas. Hemos comprobado cómo la mutación por pérdida de función del gen gsr-1 que codifica la única glutatión reductasa (GSR- 1) del nematodo C. elegans, potencia los fenotipos relacionados con la agregación de proteínas en modelos de enfermedades neurodegenerativas humanas, así como en modelos de agregación de proteínas endógenas del nematodo. Además, la mutación gsr-1 impide la translocación nuclear del factor de transcripción HLH- 30/TFEB, inductor clave de la autofagia, provoca la acumulación e inactivación de la proteína p62/SQST-1::GFP necesaria para el transporte de los substratos destinados a ser degradados al autofagosoma y, por tanto, altera el flujo autofágico. En su conjunto, estos datos sugieren que la glutatión reductasa podría estar jugando un papel clave en la eliminación de agregados protéicos mediante autofagia. De hecho, el bloqueo de la autofagia en animales gsr-1 que expresan proteínas con tendencia a la agregación conlleva fuertes fenotipos deletéreos, lo que indica que la pérdida de homeostasis redox en estos animales incrementa el estres proteotóxico debido a una mayor saturación de proteínas agregadas. El estudio de la posible regulación redox de HLH-30 a través de la única cisteína que posee en su secuencia, demuestra que este residuo es fundamental para la oligomerización de este factor de transcripción, y que es necesario para una respuesta adecuada frente a la infección por patógenos y para el desarrollo larvario xvi de determinados mutantes. No obstante, éste único residuo de cisteína no es esencial para la translocación nuclear de HLH-30, ya que una variante endógena de HLH-30 con la cisteína mutada a un residuo de alanina sigue localizando en núcleo en condiciones de estrés. xvii Publicaciones • Mora-Lorca JA, Sáenz-Narciso B, Gaffney CJ, Naranjo-Galindo FJ, Pedrajas JR, Guerrero-Gómez D, Dobrzynska A, Askjaer P, Szewczyk NJ, Cabello J, Miranda-Vizuete A (2016) Glutathione reductase gsr-1 is an essential gene required for Caenorhabditis elegans early embryonic development. Free Radic. Biol. Med. 96: 446–461 • Parra-Millán R, Guerrero-Gómez D, Ayerbe-Algaba R, Pachón-Ibáñez ME, Miranda-Vizuete A, Pachón J & Smani Y (2018) Intracellular Trafficking and Persistence of Acinetobacter baumannii Requires Transcription Factor EB . mSphere 3: 1–14 • Guerrero-Gómez D, Mora-Lorca JA, Sáenz-Narciso B, Naranjo-Galindo FJ, Muñoz-Lobato F, Parrado-Fernández C, Goikolea J, Cedazo-Minguez Á, Link CD, Neri C, Sequedo MD, Vázquez-Manrique RP, Fernández-Suárez E, Goder V, Pané R, Cabiscol E, Askjaer P, Cabello J, Miranda-Vizuete A (2019) Loss of glutathione redox homeostasis impairs proteostasis by inhibiting autophagy-dependent protein degradation. Cell Death Differ. 26: 1545–1565 • Martina JA*, Guerrero - Gómez D*, Gómez-Orte E, Antonio Bárcena J, Cabello J, Miranda-Vizuete A & Puertollano R (2021) A conserved cysteinebased redox mechanism sustains TFEB/HLH-30 activity under persistent stress. EMBO J. 40:e105793 * Igual contribución como primer autor. 1 Capítulo I. Introducción Introducción 3 1.1. Proteostasis. El proteoma se define como el conjunto de proteínas expresadas en un determinado tipo celular u organismo, el cual puede variar con el tiempo y el estado fisiológico. La homeostasis proteica o proteostasis es el proceso que regula la estabilidad del proteoma, asegurando la funcionalidad de las proteínas (Powers et al, 2009). Para mantener la proteostasis, las células han desarrollado un sofisticado sistema de control de calidad que asegura el correcto plegamiento de las proteínas y es capaz de actuar sobre aquellas que pierden su conformación nativa funcional, volviéndolas a plegar correctamente o degradándolas si fuera necesario. Este sistema de control está formado por chaperonas, factores de plegamiento (entre los que se incluyen enzimas implicadas en la oxidación e isomerización de enlaces peptídicos), componentes del tráfico y localización de las proteínas en los diferentes compartimentos celulares, así como mecanismos de degradación (Balchin et al, 2016). A pesar de la multitud de factores que controlan la proteostasis, ésta tiene una capacidad limitada y se encuentra particularmente afectada ante estreses crónicos. El colapso de la proteostasis puede verse asociado a estreses ambientales, mutaciones o el envejecimiento, resultando en la acumulación de proteínas mal plegadas, las cuales pueden derivar en la formación de agregados de proteínas (Dubnikov et al, 2017). Tales agregados proteicos son tóxicos para las células y están asociados con la manifestación de una serie de enfermedades englobadas dentro de las llamadas proteínopatías, entre las que se incluyen no solo enfermedades neurodegenerativas como el Alzheimer, Parkinson o Huntington sino otras no asociadas al sistema nervioso como cataratas o la miositis por cuerpos de inclusión (Dimachkie & Barohn, 2013; Shiels & Hejtmancik, 2019). Aunque todas estas patologías están estrechamente relacionadas con la proteotoxicidad, las diferencias entre cada una de ellas depende del tipo de proteína que agrega (Paulson, 1999; Hoppe & Cohen, 2020). 1.2. Principales enfermedades neurodegenerativas relacionadas con la pérdida de proteostasis. Las enfermedades neurodegenerativas son patologías relacionadas con el envejecimiento que se caracterizan por una muerte neuronal incontrolada la cual Introducción 10 Además, las enfermedades neurodegenerativas comparten otros procesos asociados con la progresiva disfunción y muerte neuronal, como deficiencias en los sistemas de degradación (proteasoma y autofagia), inducción de muerte celular programada (apoptosis), neuroinflamación debida a una respuesta inmune alterada o defectos en la vascularización cerebral (Gan et al, 2018; Sweeney et al, 2018; Jellinger, 2010). 1.3.1. Agregación de proteínas. Las proteínas son sintetizadas por los ribosomas en una cadena polipeptídica lineal que debe ser plegada en una estructura tridimensional para adquirir su conformación funcional. El plegamiento ocurre principalmente de forma espontánea debido a que las partes no polares de la cadena polipeptídica se ocultan del medio acuoso en el que se encuentran, pero también es llevado a cabo por diferentes moléculas que asisten a las proteínas para alcanzar su estructura biológica funcional. La estabilidad del plegamiento de las proteínas depende de factores locales como el pH, la homeostasis redox o la temperatura, pero también se ve afectado por fallos acumulativos en las proteínas debidos a mutaciones o polimorfismos. La pérdida del plegamiento convierte a las proteínas en estructuras débilmente estables con la capacidad de formar agregados, debido principalmente a interacciones entre regiones hidrofóbicas que quedan expuestas entre las proteínas mal plegadas (Chiti et al, 2003; Bouziane & Chouarfia, 2020). Aunque la mayoría de los agregados son amorfos, existen ciertos tipos de agregados mucho más estructurados, como los agregados de oligómeros o las fibrillas amiloides derivadas de éstos. Los amiloides se forman a partir de polipéptidos mal plegados que se congregan formando oligómeros amiloidogénicos con estructura de hoja plegada b en un proceso llamado nucleación primaria (Figura 1.2). Posteriormente, varios oligómeros se unen de forma antiparalela mediante puentes de hidrógeno hasta formar fibribrillas amiloides maduras, termodinámicamente estables. Estos agregados amiloides son estructuras que han sido relacionadas con el desarrollo de diferentes proteinopatías, como las cataratas, diabetes tipo ll y las enfermedades neurodegenerativas (Chuang et al, 2018; Ross & Poirier, 2004). Introducción 11 Figura 1.2. Ruta de formación de fibras amiloides. Modificado de Chuang et al. 2018. Como se mostró en apartados anteriores, la agregación de determinados tipos de proteínas es una de características en el desarrollo de enfermedades neurodegenerativas. Esto se ve reflejado en que la enfermedad de Alzheimer se asocia con la formación de placas seniles por la acumulación extracelular del péptido Ab y la aparición de ovillos neurofibrilares por la agregación intracelular de la proteína Tau; los pacientes de Parkinson presentan agregados de la proteína a-sinucleína, dando lugar a la aparición de cuerpos de Lewy; y las enfermedades de poliglutaminas son debidas a proteínas elongadas con repeticiones del aminoácido glutamina que les confiere la capacidad de formar agregados. Todas estas proteínas características de cada una de las enfermedades comparten la tendencia a formar fibrillas amiloides (Ross & Poirier, 2004). Existen numerosos estudios sobre factores que pueden influir en el proceso de agregación relacionado con la neurodegeneración. Entre estos factores se encuentran mutaciones que afectan a su estructura primaria de las proteínas, como en el caso de las enfermedades de poliglutaminas, donde existe una clara correlación entre la expansión en el número de repeticiones de glutaminas y la tendencia a la agregación de la proteína elongada. Otros estudios ven probable que la agregación pueda estar potenciada por el incremento de la concentración de proteínas propensas a la agregación, como resultado de alteraciones genéticas que aumentan su síntesis. Ejemplo de ello es que la enfermedad de Parkinson de origen familiar puede ser causada por la triplicación del locus PARK1/SNCA, aumentando la expresión de la Introducción 12 proteína a-sinucleína (Singleton et al, 2003), o el hecho de que individuos con síndrome de Down, los cuales llevan una copia extra del locus APP en el cromosoma 21, presenten una deposición más temprana de placas de Ab (Wisniewski et al, 1985). Además, se han localizado polimorfismos en promotores de los genes asociados a enfermedades neurodegenativas que incrementarían la transcripción y, por tanto, la cantidad de las proteínas asociadas a estas patologías, aumentando el riesgo de su desarrollo (Singleton et al, 2004). 1.3.2. Disfunción mitocondrial. Las mitocondrias son los principales orgánulos productores de energía en forma de ATP de la célula, mediante la fosforilación oxidativa. Sin embargo, como consecuencia de su alto metabolismo oxidativo, en particular debido a la actividad de los complejos l y lll de la cadena transportadora de electrones, las mitocondrias son también la mayor fuente de especies reactivas del oxígeno (EROs), cuyo exceso puede dar lugar a la aparición de estrés oxidativo (Murphy, 2009). Dentro de la mitocondria, las EROs pueden afectar a la producción de energía debido a que pueden alterar el ADN mitocondrial, el cual codifica proteínas esenciales para la cadena transportadora de electrones (Islam, 2017). Las neuronas son células con un alto metabolismo, consumiendo gran parte del ATP producido por las mitocondrias. Esta alta dependencia de la actividad mitocondrial es, en gran parte, la responsable de la relación entre la disfunción mitocondrial y el desarrollo de enfermedades neurodegenerativas. Multitud de estudios han demostrado que las enfermedades neurodegenerativas manifiestan eventos patológicos comunes relacionados con las mitocondrias, entre los que se incluyen disfunción mitocondrial, la aparición de estrés oxidativo y la muerte celular por apoptosis. De hecho, existen mutaciones características de ciertas enfermedades neurodegenerativas que han sido directamente relacionadas con la alteración de la función mitocondrial (Lin & Beal, 2006; Islam, 2017). En la enfermedad de Alzheimer, se ha observado que existe neurotoxicidad asociada a daño mitocondrial como consecuencia de la acumulación del péptido Ab. En esta enfermedad, la proteína APP (precursor de proteína amiloide) puede ser translocada y acumulada en la membrana de la mitocondria (Anandatheerthavarada et al, 2003) Introducción 13 donde, al ser procesada da lugar al péptido Ab, el cual interacciona con proteínas mitocondriales causando disrupción en el potencial de membrana y promoviendo la apoptosis vía liberación del citocromo c, un componente esencial de la cadena respiratoria cuya liberación al citosol desencadena la apoptosis (Lustbader et al, 2004). Además, se ha observado que el péptido Ab puede causar fragmentación mitocondrial (Wang et al, 2008). Esto es debido a que interfiere en la fusión mitocondrial, proceso que se da entre dos o más mitocondrias para intentar reducir el estrés mitocondrial inducido por proteínas dañadas o estrés oxidativo. Por otro lado, la acumulación de Ab causa una excesiva generación de EROS debido a su interacción con metales como el cobre, hierro y zinc (Deibel et al, 1996), lo que exacerba la disfunción mitocondrial y el desbalance redox en las neuronas, provocando daño neuronal. La proteína a-sinucleína, asociada con la enfermedad de Parkinson, juega un papel importante en neuronas dopaminérgicas, ya que participa en la síntesis, regulación, almacenamiento y liberación de dopamina (Burré, 2015). La a-sinucleína puede ser importada dentro de las mitocondrias y quedar unida a la membrana mitocondrial interna de las neuronas dopaminérgicas, donde su acumulación provoca disfunción mitocondrial, estrés oxidativo y neuropatologías derivadas de la inhibición del complejo l (Devi et al, 2008). Mutaciones relacionadas con la enfermedad de Parkinson también afectan a la integridad de la mitocondria. Ejemplo de ello son las mutaciones en los genes que codifican para las proteínas PINK1 y DJ1. PINK1 se acumula selectivamente en mitocondrias disfuncionales, suprimiendo la toxicidad que provoca la proteína a-sinucleína, a través de la inducción de la autofagia y, por tanto la deficiencia de PINK1 exacerba la neurotoxicidad que causan estos agregados de a-sinucleína (Oliveras-Salvá et al, 2014). Por su parte, la proteína DJ1 actúa como un antioxidante mitocondrial (Andres-Mateos et al, 2007; Guzman et al, 2010). Esta proteína posee un residuo de cisteína crítico (C106) que es oxidado en condiciones de estrés oxidativo, haciendo que DJ1 sea translocada al interior mitocondrial donde ejerce su efecto neuroprotector (Canet-Avilés et al, 2004). En pacientes de la enfermedad de Huntington, patología debida a la expansión de tripletes que codifican el aminoácido glutamina en la proteína Huntingtina (Htt), también se ha descrito disfunción mitocondrial. Así, esta enfermedad ha sido Introducción 14 asociada con un descenso en la síntesis de ATP y una menor actividad de los complejos ll y lll de la cadena respiratoria de electrones (Milakovic & Johnson, 2005). También, la expansión de la proteína Htt contribuye a la fragmentación mitocondrial mediante la desregulación de proteínas que intervienen en el proceso de fusión mitocondrial (Costa et al, 2010). Por otro lado, la proteína mutante Htt puede afectar negativamente a procesos de control de la proteostasis como la autofagia y mitofagia (Ochaba et al, 2014; Khalil et al, 2015). 1.3.3. Estrés oxidativo. Otro de los marcadores comunes en las enfermedades neurodegenerativas es un alto incremento del estrés oxidativo, el cual puede aparecer debido a factores como el envejecimiento o situaciones patológicas. El cerebro es el órgano metabólicamente más activo del cuerpo y es vulnerable al estrés oxidativo debido a varias razones: posee una alta demanda de oxígeno, consumiendo el 20% del total del oxígeno del cuerpo; metales como el hierro y el cobre se encuentran en altas concentraciones, los cuales contribuyen activamente a la formación de especies reactivas del oxígeno (EROs); además, las membranas celulares de las células del cerebro son ricas en ácidos grasos poliinsaturados, los cuales son sustratos de peroxidación lipídica (Wang & Michaelis, 2010). La aparición de estrés oxidativo es debida a la pérdida de homeostasis redox, como consecuencia de la excesiva producción de EROs, que superan la capacidad antioxidante de la célula. Los EROs fisiológicamente más relevantes son el radical hidroxilo (OH), el anión superóxido (O2–) y, sobre todo, el peróxido de hidrógeno (H2O2) (Figura 1.3). Los principales productores de EROs son las mitocondrias, a través de la cadena transportadora de electrones (Murphy, 2009), el retículo endoplasmático (RE), mediante el plegamiento oxidativo de las proteínas (Tu & Weissman, 2004), y los peroxisomas, debido a la oxidación de los ácidos grasos (Antonenkov et al, 2010). Los EROs son sustancias muy reactivas que tienen la capacidad de reaccionar con diferentes macromoléculas presentes en las células, de modo que pueden causar daño estructural en el ADN, alterar la conformación de las proteínas, o provocar daños en la membrana celular debido a la peroxidación lipídica. Estas modificaciones oxidativas de las macromoléculas pueden iniciar eventos que finalmente desembocan en daño neuronal (Sbodio et al, 2019). Introducción 15 Las proteínas constituyen las macromoléculas más susceptibles al daño oxidativo, debido a su elevada concentración celular, así como su alta capacidad de reaccionar con EROs. El H2O2 ha sido ampliamente reconocido como un segundo mensajero que modula rutas de señalización a través de modificaciones oxidativas postraduccionales reversibles en las proteínas (Holmström & Finkel, 2014). Son varios los residuos de aminoácidos que pueden sufrir modificaciones oxidativas, pero son las cisteínas, debido a su grupo tiol (-SH), los aminoácidos más sensibles al estado redox de la célula. Entre las modificaciones reversibles de residuos de cisteína se encuentran los puentes disulfuro, que pueden darse de forma intermolecular e intramolecular, dando lugar a cambios de conformación necesarios para la regulación de la función de las proteínas (Tu & Weissman, 2004). Sin embargo, altos niveles de H2O2 pueden causar modificaciones irreversibles en el estado de oxidación de las cisteínas (ácido sulfínico, SO2H y ácido sulfónico, SO3H), haciendo que las proteínas afectadas pierdan su plegamiento y sufran procesos de dimerización, oligomerización e incluso agregación (Holmström & Finkel, 2014; Wani et al, 2014; Pérez et al, 2009). Numerosas condiciones patológicas, o el deterioro normal de la homeostasis celular debido al envejecimiento, llevan a la pérdida del balance entre la producción y degradación de EROs. Para contrarrestar la excesiva acumulación de EROs y prevenir la aparición de estrés oxidativo, las células poseen diferentes sistemas antioxidantes. Cada antioxidante posee una función distinta, así, algunos son responsables de la detoxificación del anión superóxido, otros actúan exclusivamente sobre el H2O2 y otros ejercen su función antioxidante sobre macromoléculas como las proteínas (Figura 1.3). Introducción 16 Figura 1.3. Daño y protección frente a especies reactivas de oxígeno. Abreviaturas: SOD, superóxido dismutasa; Prx, peroxirredoxina; CAT, catalasa; GPx, glutatión peroxidasa; GR, glutatión reductasa; Grx, glutarredoxina; Prot, proteína; TrxR, tiorredoxina reductasa; Trx, tiorredoxina. Basado en Kupsco & Schlenk, 2015. 1.3.3.1. Antioxidantes. Un antioxidante es una sustancia que reduce o previene la oxidación de un sustrato oxidable. Los organismos han desarrollado complejos sistemas antioxidantes que pueden ser tanto enzimáticos como no enzimáticos, los cuales trabajan de forma conjunta para proteger al organismo frente al daño oxidativo. 1.3.3.1.1. Antioxidantes no enzimáticos. 1.3.3.1.1.1. Vitaminas E y C. Pequeñas moléculas como las vitaminas E y C forman una potente defensa antioxidante frente a altos niveles de EROs. La vitamina E es soluble en lípidos y tiene la capacidad de reaccionar más rápidamente con los radicales peróxidos de los ácidos grasos poliinsaturados, rompiendo la reacción en cadena de la peroxidación lipídica. Esto hace que la vitamina E tenga una función antioxidante esencial en membranas celulares y lipoproteínas (Singh et al, 2005). Introducción 17 Por su parte, la vitamina C o ácido ascórbico, actúa como potente antioxidante en ambientes acuosos, jugando un papel importante en la protección de los grupos tiol de las proteínas frente a la oxidación. La vitamina C puede actuar como cofactor de antioxidantes enzimáticos, pero también es un agente reductor por sí sólo con capacidad de detoxificar EROs como el peróxido de hidrógeno (Kojo, 2005). 1.3.3.1.1.2. Glutatión (GSH). El glutatión es sin duda el antioxidante no enzimático más importante debido a su multifuncionalidad y abundancia. Se trata de tripéptido sintetizado a partir de glutamato, cisteína y glicina por la acción consecutiva de dos enzimas dependientes de ATP. La primera enzima, g-glutamilcisteína sintetasa (GCS) forma un inusual enlace peptídico entre el grupo g-carboxil del glutamato y el grupo amino de la cisteína formando g-glutamilcisteína. En el segundo paso, la enzima glutatión sintetasa (GS) cataliza la adición de glicina a la g-glutamilcisteína formada en el paso anterior. Una vez sintetizado en el citoplasma, es distribuido al interior de orgánulos tales como la mitocondria, el núcleo o el retículo endoplasmático (Lu, 2013; Forman et al, 2009). El glutatión puede existir como dos formas, una forma tiol-reducida (GSH) y otra disulfuro-oxidada (GSSG, compuesta por dos moléculas de GSH unidas por puente disulfuro), siendo la forma reducida la más predominante bajo condiciones fisiológicas, suponiendo alrededor del 98% del glutatión total presente en la célula. El GSSG es formado cuando el GSH actúa como reductor biológico, y debe ser reciclado por la enzima glutatión reductasa (GSR), la cual cataliza la reducción del GSSG a expensas del poder reductor del NADPH (Forman et al, 2009; Ballatori et al, 2009). El GSH se encuentra predominantemente en su forma reducida, en una ratio GSH/GSSG de aproximadamente 100/1, excepto en el retículo endoplasmático, donde existe un ambiente más oxidante en comparación con el ambiente reductor del citoplasma, con una ratio GSH/GSSG en torno a 2/1 (Hwang et al, 1992). Este ambiente oxidante del retículo endoplasmático es fundamental para el correcto plegamiento y la ruta secretora de las proteínas que tiene lugar en su interior (Hwang et al, 1992). Introducción 18 La capacidad antioxidante del GSH viene dada por el grupo tiol de la cisteína, el cual tiene capacidad de donar un electrón. El GSH puede reaccionar directamente con O2- y OH para su eliminación, ser conjugado con compuestos xenobióticos por la acción de las enzimas glutatión transferasas para su detoxificación, actuar como cofactor de varias enzimas antioxidantes, así como regenerar las vitaminas C y E a sus formas activas (Aquilano et al, 2014; Singh et al, 2019; Townsend et al, 2003). Aparte de su importante papel como molécula antioxidante, el GSH participa en la regulación de la señalización redox, ya que puede unirse de forma reversible al grupo tiol de las cisteínas de las proteínas (Prot-SH), mediante un proceso llamado glutationilación, generando proteínas glutationiladas (Prot-SSG). Las glutarredoxinas son las enzimas responsables de llevar a cabo este proceso reversible, ya que catalizan tanto la formación como la reducción del enlace disulfuro entre los grupos tiol de las proteínas y el GSH. La glutationilación supone un importante mecanismo de regulación de la actividad de las proteínas, ya que tiene la capacidad de activar o inactivar a las proteínas, además de proteger de una oxidación irreversible a proteínas con residuos de cisteína sensibles a regulación redox (Xiong et al, 2011). 1.3.3.1.2. Antioxidantes enzimáticos. 1.3.3.1.2.1. Superóxido dismutasa. La superóxido dismutasa (SOD) es una de las más potentes enzimas antioxidantes celulares. Esta enzima está constituida por dos subunidades, cada una de las cuales posee un sitio activo con un ion metálico unido (cobre, zinc o manganeso) que permite la conversión de los aniones superóxido a H2O2. Así, a través de sucesivos ciclos de oxidación y reducción de los iones metálicos del sitio activo, la SOD es capaz de neutralizar los aniones superóxido. La SOD existe en varias isoformas, las cuales difieren en la naturaleza del metal del sitio activo y su localización subcelular. En humanos existen tres formas: la citosólica Cu/Zn-SOD (SOD1), la mitocondrial Mn- SOD (SOD2) y la forma extracelular Cu/Zn-SOD (SOD3) (Sheng et al, 2014; Sirangelo & Iannuzzi, 2017). 1.3.3.1.2.2. Catalasas. Las catalasas son las enzimas responsables de la conversión del H2O2 en agua y oxígeno, utilizando como cofactor hierro o manganeso en una reacción de dos pasos. Introducción 19 En un primer paso, la reacción con el H2O2 da lugar a un intermediario enzimático oxidado y la liberación de una molécula de agua. En el segundo paso, el intermediario es reducido mediante la donación de dos electrones por parte de una segunda molécula de H2O2, regenerándose la enzima libre, agua y oxígeno. Las catalasas se localizan principalmente en el interior de los peroxisomas, pero también se encuentran en el citoplasma y las mitocondrias (Nandi et al, 2019). 1.3.3.1.2.3. Tiorredoxinas. Otro de los sistemas antioxidantes más importantes de la célula son las tiorredoxinas (Trx), proteínas con actividad oxidorreductasa que están conservadas evolutivamente desde procariotas hasta mamíferos. Poseen una estructura terciaria característica que consiste, en la forma más básica, en tres a-hélices que rodean a un núcleo central con cuatro hebras de hoja plegada b. Los organismos superiores pueden poseer una a-hélice o una hoja plegada b adicional (Figura 1.4) (Collet & Messens, 2010; Lillig & Holmgren, 2007). El grupo de proteínas que comparten este tipo de plegamiento se engloban en la llamada “familia con plegamiento tiorredoxina”, cuyos principales componentes son las tiorredoxinas, glutarredoxinas y las proteínas disulfuro isomerasa, todas ellas involucradas en reacciones de intercambio tioldisulfuro. Miembros de esta familia son también la glutatión peroxidasa y las peroxirredoxinas, cuya principal función es la detoxificación de H2O2 (Hanschmann et al, 2013). Figura 1.4. Plegamiento tiorredoxina. Representación de las estructuras secundarias y tridimensional de Trx. La estructura consiste en 4 hélices a (rojo) y 5 hojas plegadas b (amarillo). El sitio conservado CXXC se localiza cerca del extremo N terminal de la hélice a2. Modificado de Collet & Messens, 2010. Las tiorredoxinas poseen un sitio activo conservado con dos cisteínas (Cys-Gly-Pro- Cys), cuyos grupos tiol (SH) son esenciales para la reducción de puentes disulfuro (S-S) de las proteínas en un proceso de dos pasos. Primero, la cisteína en posición N-terminal inicia un ataque nucleofílico al enlace disulfuro de la proteína sustrato, formándose un intermediario entre la tiorredoxina y la proteína. Posteriormente, la Introducción 26 un estadio intermedio y siguiente. El conjunto de las energías correspondientes a todas las conformaciones posibles se le conoce como “paisaje energético” (Dill & Chan, 1997), el cual tendría forma de embudo, donde el estado desnaturalizado se compone de un gran número de conformaciones con mayor energía, en la parte superior del embudo, mientras que las posibles conformaciones que puede adquirir la proteína se van reduciendo hasta llegar al estado nativo de menor energía en el fondo del embudo (Figura 1.7) (Dill & Chan, 1997; Balchin et al, 2016). Sin embargo, este descenso en la energía libre hasta un estado nativo termodinámicamente favorable es irregular, apareciendo barreras de energía cinética entre los intermediaros, principalmente en las proteínas de mayor tamaño (>100aa) (Brockwell & Radford, 2007; Dinner et al, 2000). Figura 1.7. Esquema de embudo de plegamiento. a) Representación tridimensional con barreras cinéticas y estrechamientos hacia el estado nativo. Modificado de Dill & Chan, 1997. b) Representación en dos dimensiones con barreras cinéticas dibujadas en los bordes. Modificada de Englander & Mayne, 2014. Estas barreras cinéticas constituyen un peligro de pérdida del plegamiento de los intermediarios, debido a la formación de interacciones inespecíficas. Para superar estas barreras, las proteínas son asistidas por componentes celulares como las chaperonas moleculares, que previenen la pérdida de plegamiento y rebajan la energía libre de las barreras cinéticas proporcionando una ruta más eficiente para que la proteína adquiera su conformación correcta (Figura 1.8) (Dobson, 2003; Balchin et al, 2016), así como por proteínas catalíticas que aceleran la transición de un intermediario a otro, como la proteína disulfuro isomerasa, con capacidad de generar puentes disulfuro que estabilizan a las proteínas, así como de modificar y Introducción 27 eliminar estos enlaces cuando se forman de manera incorrecta (Wilkinson & Gilbert, 2004). Figura 1.8. Esquema de formación de agregados. Durante el plegamiento, las proteínas adquieren varias conformaciones mientras descienden hasta el estado nativo termodinámicamente favorable (zona verde). Las barreras cinéticas retienen a los intermediaros de plegamiento y proteínas parcialmente plegadas. Las chaperonas moleculares asisten en el plegamiento rebajando la energía libre para superar las barreras y previniendo interacciones intermoleculares aberrantes (zona roja). Modificado de Balchin et al, 2016. 1.4.1.1. Asistentes de plegamiento. 1.4.1.1.1. Proteína disulfuro isomerasa (PDI). En situaciones fisiológicas, la conformación funcional de muchas proteínas es estabilizada mediante los puentes disulfuro. La formación de estos enlaces es poco habitual dentro del ambiente reductor del citoplasma. Por el contrario, son favorecidos en el ambiente oxidante que posee el retículo endoplasmático (RE), donde se da el plegamiento oxidativo de las proteínas, sobre todo en aquellas proteínas destinadas a la ruta secretora y de membrana (Kosuri et al, 2012; Linke & Jakob, 2003). El RE es un orgánulo fundamental responsable del plegamiento, modificaciones posttraduccionales, transporte y control de calidad de las proteínas recién sintetizadas. En el lumen de este orgánulo se da el plegamiento oxidativo de las proteínas, mediado por las PDI (Proteínas disulfuro isomerasas), un grupo de proteínas con dominios tiorredoxina, que fueron primeramente localizadas en el RE pero que posteriormente han sido detectadas también en el citoplasma, núcleo y en el espacio extracelular (Turano et al, 2002). Las PDI tienen dos funciones principales: actividad como chaperona y como oxidorreductasa (Ferrari & Söling, 1999). El dominio catalítico de las PDI posee un Introducción 28 sitio activo compuesto por dos cisteínas separadas por una glicina y una histidina (Cys-Gly-His-Cys) siendo los grupos tiol de las dos cisteínas donde recae la actividad oxidorreductasa. El estado redox de las dos cisteínas del sitio activo, así como las propiedades de sus sustratos, determinan si las PDI tienen actividad de oxidación (formación), reducción (romper) o isomerización (reestructuración) de puentes disulfuro (Wilkinson & Gilbert, 2004). Cuando la PDI media el plegamiento oxidativo de proteínas recién sintetizadas, dos cisteínas de la proteína diana se oxidan a disulfuro, mientras que el sitio activo de la PDI, que se encontraba oxidado, es reducido al estado ditiol. Al quedar reducida al formar el puente disulfuro a la proteína naciente, la PDI es rápidamente oxidada mediante oxidantes presentes en el RE tanto enzimáticos, principalmente por la oxidorreductasa Ero1, asociada a la membrana del RE, así como por oxidantes no enzimáticos, como el GSSG (Hudson et al, 2015). El plegamiento oxidativo de las proteínas no está exento de errores y se puede dar un plegamiento incorrecto de las proteínas. Los puentes disulfuro erróneos pueden ser corregidos mediante las actividades de isomerización o reducción de las PDI. En la reacción de reducción, la PDI debe encontrarse en estado reducido previamente. Esta reducción la llevan a cabo agentes reductores como el GSH, que donan electrones para reducir el disulfuro de la PDI a estado ditiol. A partir de la PDI reducida, en enlace disulfuro de la proteína mal plegada es reducido por la PDI al estado ditiol, mientras que la PDI queda oxidada nuevamente. Cuando el mal plegamiento de las proteínas requiere la isomerización del puente disulfuro, la PDI debe ser reducida para poder romper el puente disulfuro de la proteína y posteriormente, crear el enlace correcto mediante su actividad oxidativa (Wilkinson & Gilbert, 2004). Como se ha visto, el estado redox de la PDI viene determinado en gran medida por la ratio GSH/GSSG, donde en el RE es más oxidado que en el citoplasma, siendo éste un ambiente óptimo para la formación de puentes disulfuro en las proteínas. Como consecuencia, variaciones en la ratio GSH/GSSG afectan directamente en la capacidad de plegamiento de las proteínas por parte de la PDI (Hwang et al, 1992). Introducción 29 1.4.1.1.2. Chaperonas moleculares. Las chaperonas moleculares, también conocidas como HSPs (heat shock proteins), son proteínas que tienen un papel fundamental en el mantenimiento de la homeostasis celular tanto en situaciones normales, asistiendo al plegamiento de proteínas recién sintetizadas, como participando en la reparación, evitando la agregación de proteínas mal plegadas o potenciando la proteólisis en el caso de no poder solventar el mal plegamiento. Las chaperonas moleculares previenen interacciones impropias entre la cadena polipeptídica, pero no crean enlaces en las proteínas. Las proteínas mal plegadas presentan sus residuos hidrofóbicos al ambiente acuoso celular, lo que lleva a formar interacciones entre ellas y agregar. Las chaperonas moleculares son capaces de unirse a estos residuos hidrofóbicos, impidiendo que se produzcan interacciones inapropiadas, además de revertir el mal plegamiento de las proteínas para darles una nueva opción de plegamiento (Hinault et al, 2006; Mamipour et al, 2017). En las células eucariotas, las chaperonas se encuentran en el citoplasma, núcleo y orgánulos como la mitocondria o el RE. Se pueden clasificar dentro de cinco familias en función de su peso molecular, que incluyen las HSP100 (heat shock protein 100), HSP90, HSP70, HSP60 y las sHsps (small Hsps) (Mamipour et al, 2017). La expresión de chaperonas está principalmente controlada por un pequeño grupo de factores de transcripción llamados HSFs (heat shock factors), entre los cuales, HSF1 es el más conservado en eucariotas. HSF1 es mantenido en el citoplasma en un estado inactivo en ausencia de estrés por su asociación con las chaperonas HSP70 y HSP90 (Zou et al, 1998; Morimoto, 1998). Ante situaciones de estrés, como las altas temperaturas o el estrés oxidativo, que supondrían un incremento de proteínas mal plegadas, estas chaperonas se separan de HSF1 y se unen a las proteínas mal plegadas. De este modo, HSF1 quedaría libre para pasar al núcleo y transcribir genes de HSPs así como un amplio rango de componentes del mantenimiento de la proteostasis (Morimoto, 1998). Ya que la pérdida de homeostasis redox provoca daños en la estabilidad del proteoma, no es de extrañar que las chaperonas se encuentren reguladas a nivel transcripcional y traduccional bajo condiciones de estrés oxidativo. Se ha descrito Introducción 30 que HSF1 posee la capacidad de sensar el estrés oxidativo a través de dos residuos de cisteína que posee dentro del dominio de unión a ADN (Ahn & Thiele, 2003). Además, la chaperona HSP70 participa en la regulación de la degradación de proteínas vía proteasoma durante la adaptación al estrés oxidativo, proporcionando a la célula un incremento de la capacidad de degradar proteínas oxidadas (Grune et al, 2011). 1.4.2. FOXO. Los factores de transcripción FOXO son unos reguladores conservados evolutivamente desde invertebrados hasta mamíferos, que están involucrados en multitud de procesos fisiológicos y patológicos, incluyendo el envejecimiento, cáncer, estrés oxidativo o en enfermedades neurodegenerativas. Mientras que Caenorhabditis elegans y Drosophila poseen un solo factor FOXO, la familia FOXO en mamíferos está compuesta por cuatro miembros (FOXO 1, 3, 4 y 6), cuya principal diferencia radica en el tejido en el que son expresados (Webb et al, 2016). La actividad de FOXO está inhibida en presencia de insulina o IGF (insulin-like growth factor), que desencadenan una cascada de señalización que resulta en la fosforilación y retención de FOXO en el citoplasma. Ante la ausencia de insulina o IGF, o en respuesta a estímulos como la falta de alimento o el estrés oxidativo, FOXO es desfosforilado y trasloca dentro del núcleo donde activa genes relacionados con la resistencia a estrés (Kenyon, 2010). Entre los genes diana sobre los que actúa FOXO en su regulación, se encuentran aquellos relacionados con el envejecimiento y la longevidad, el mantenimiento de células madre, resistencia a estrés oxidativo, regulación del metabolismo, inflamación y reparación del ADN (Tothova et al, 2007; Paik et al, 2009; Ouyang et al, 2012; Tran et al, 2002). Otros estudios indican que FOXO está también involucrado en la expresión de genes relacionados con el control de la proteostasis, en concreto, parece estar regulando mecanismos de eliminación de proteínas como el proteasoma y la autofagia (Webb et al, 2016; Cohen et al, 2010, 2009). Introducción 31 1.4.3. Respuesta a proteínas mal plegadas. Como se describió anteriormente, el retículo endoplasmático es el mayor responsable del correcto plegamiento, modificaciones post-traduccionales y transporte de proteínas destinadas a otros orgánulos, membrana plasmática o compartimentos extracelulares. El RE es por tanto un componente clave para el mantenimiento de la proteostasis, integrando mecanismos que controlan la regulación de la síntesis, plegamiento, tráfico y degradación de las proteínas (Zhang et al, 2019). La acumulación de proteínas mal plegadas dentro del RE ocasiona la pérdida de la homeostasis dentro de este orgánulo y, por tanto, estrés. Esta situación desencadena la activación de la respuesta a proteínas mal plegadas del RE (UPRER, del inglés Unfolded Protein Response), cuyo objetivo es aliviar la situación de estrés (Ron & Walter, 2007). La UPR es un mecanismo adaptativo diseñado para lidiar con alteraciones en el plegamiento de proteínas dentro del RE y así restaurar la proteostasis. Este mecanismo es orquestado por tres proteínas transmembrana del RE que actúan como sensores de proteínas mal plegadas: PERK (del inglés, protein kinase RNA-like endoplasmic reticulum kinase), IRE1 (inositol-requiring protein-1) y ATF6 (activating transciption factor-6). En condiciones basales, estas tres proteínas transmembrana son mantenidas en un estado inactivo a través de su asociación con la proteína BiP (binding immunoglobulin protein) en el lúmen del RE. Cuando existe una moderada acumulación de proteínas mal plegadas, BiP se disocia de ellos y los tres sensores son activados. Como resultado se produce la inducción de la UPRER, que transmite la información desde el RE hasta el núcleo y el citosol, donde se desencadena un programa de señalización y transcripción de genes que reduce la traducción de proteínas, expande el tamaño del RE, incrementa la síntesis de chaperonas dentro del RE para asistir en el correcto plegamiento de proteínas, y dirige proteínas mal plegadas al citosol para ser degradadas (Ron & Walter, 2007). Sin embargo, cuando el estrés en el RE es crónico o irreversible, la UPRER promueve la muerte celular mediante apoptosis. Este hecho conecta el estrés dentro del RE con la neurodegeneración, donde ocurre una activación crónica de la UPRER, promoviendo la muerte neuronal vía apoptosis (Perri et al, 2016; Smith & Mallucci, 2016; Ghemrawi & Khair, 2021). Introducción 32 De igual modo que en el RE, la mitocondria también posee una respuesta a proteínas mal plegadas (UPRmit) (Zhao et al, 2002). Factores que causan disfunción mitocondrial como defectos en la fosforilación oxidativa, excesiva acumulación de EROs o un aumento de proteínas mal plegadas, inducen la activación de la UPRmit (Houtkooper et al, 2013; Haynes & Ron, 2010). Esta respuesta es regulada por el factor de transcripción ATFS1 (del inglés, activating transcription factor associated with stress), en cuya secuencia existe dominio tanto para su localización mitocondrial como nuclear (Melber & Haynes, 2018). En condiciones normales de crecimiento, ATFS1 es eficientemente transportado a la matriz mitocondrial donde es constitutivamente degradado. Ante situaciones de disfunción mitocondrial, como estrés oxidativo o presencia de proteínas mal plegadas, el transporte mitocondrial de ATFS1 es reducido, acumulándose en el citoplasma y translocándose al núcleo, donde induce la expresión de chaperonas mitocondriales, proteasas y enzimas de detoxificación de EROs que reestablecen la proteostasis mitocondrial (Zhao et al, 2002; Shpilka & Haynes, 2018; Friedman & Nunnari, 2014). 1.4.4. Sistema ubiquitina-proteasoma. La degradación de proteínas cumple un papel fundamental en el mantenimiento de la proteostasis celular, ya se es la responsable de eliminar proteínas mal plegadas que potencialmente pueden llegar a formar agregados. Para eliminar estas proteínas dañadas, la célula emplea el sistema ubiquitina-proteasoma (UPS, del inglés Ubiquitin Proteasome System). Este mecanismo consiste, por un lado, en el sistema ubiquitina, responsable del reconocimiento de la proteína candidata para la degradación y marcarla con ubiquitina, una pequeña molécula de 76 aminoácidos. El segundo componente de la UPS es el proteasoma, encargado de la degradación de la proteína marcada. El proteasoma es un complejo proteico formado por dos subunidades regulatorias (19S) y una subunidad catalítica (20S) (Peters et al, 1993). La subunidad 19S es la responsable del reconocimiento de las proteínas marcadas, su desubiquitinación y translocación hacia la subunidad 20S, responsable de degradar dichas proteínas dañadas mediante proteólisis (Budenholzer et al, 2017). En presencia de un bajo estrés oxidativo, la actividad del proteasoma se incrementa, ya que es el responsable de la eliminación de proteínas que sufren daño oxidativo. Un estrés oxidativo intenso, Introducción 33 puede inducir a la separación de las subunidades del proteasoma (19S y 20S), inhibiendo su actividad (Pajares et al, 2015). 1.4.5. Autofagia. La autofagia es un proceso catabólico de degradación y reciclaje de macromoléculas y orgánulos por parte de los lisosomas. Es un proceso conservado desde levaduras hasta mamíferos, el cual funciona como un mecanismo de supervivencia que mantiene la homeostasis celular bajo condiciones normales de crecimiento y permite la adaptación ante diferentes tipos de estreses, incluyendo falta de alimentos, infecciones o estrés oxidativo (Dikic & Elazar, 2018). Se han descrito tres tipos de autofagia: Microautofagia, en la que parte del contenido citoplasmático entra en el lisosoma directamente a través de una invaginación o deformación de la membrana del lisosoma (Marzella et al, 1981); Autofagia mediada por chaperonas, donde los sustratos a ser degradado son selectivamente marcados y reconocidos por chaperonas que los transportan directamente al lisosoma (Dice, 1990); Finalmente, la macroautofagia que es un mecanismo consistente en envolver los sustratos a degradar mediante una doble membrana sintetizada de novo, formándose una vesícula llamada autofagosoma la cual se fusiona con el lisosoma para degradar el contenido de su interior (Yang & Klionsky, 2009). La principal función del proceso de macroautofagia, a partir de ahora referido como autofagia, es proveer nutrientes para las funciones vitales de la célula durante diferentes estreses, considerándose un proceso no selectivo. Sin embargo, se ha demostrado que la autofagia puede eliminar de forma selectiva material perjudicial del citoplasma como orgánulos dañados o proteínas agregadas (Dikic & Elazar, 2018). La inducción de la autofagia tiene como consecuencia el reclutamiento de más de 30 proteínas relacionadas con la autofagia (ATGs, Autofagy-related proteins), la mayoría de ellas asociadas directamente con la biogénesis del autofagosoma. El mecanismo de autofagia se compone de varias fases: Iniciación, donde se comienza a formar una membrana a partir del RE, aunque actualmente se ha considerado que esta membrana puede surgir también de la membrana plasmática u otros orgánulos como Introducción 34 el aparato de Golgi o mitocondrias; Elongación, en la que la membrana inicial se expande formando una doble membrana (fagoforo) que rodea una porción del citoplasma; Maduración y fusión, donde la doble membrana madura y se cierra formando una vesícula llamada autofagosoma, la cual se fusiona con el lisosoma formándose un autolisosoma que degrada el contenido que portaba el autofagosoma (Figura 1.9) (Parzych & Klionsky, 2014; Dikic & Elazar, 2018; Hansen et al, 2018). Figura 1.9. Proceso de macroautofagia. Ilustración esquemática del proceso de macroautofagia, compuesto por las fases de iniciación del proceso, expansión del fagoforo, maduración hasta formar el autofagosoma y su fusión con el lisosoma, finalizando con la degradación del contenido del autolisosoma. Modificado de Hansen et al. 2018. El principal control de la inducción de la autofagia es llevado a cabo por la quinasa TOR (mTOR en mamíferos), un regulador clave para la homeostasis celular. mTOR se encuentra en forma de dos complejos de proteínas diferentes, mTORC1 y mTORC2. Aunque ambos complejos regulan el metabolismo celular, sólo mTORC1 está directamente ligado a la regulación de la autofagia (Abada & Elazar, 2014; Yang & Klionsky, 2009). mTORC1 sensa la disponibilidad de nutrientes, siendo activado en la superficie de la membrana de los lisosomas en respuesta a la presencia de aminoácidos. Mientras se encuentra activado, mTORC1 fosforila a los factores de transcripción TFEB y TFE3, lo que hace que se unan a las proteínas 14-3-3, reteniéndolos en el citoplasma (Roczniak-Ferguson et al, 2012). Bajo situaciones de falta de alimento, se produce una inactivación de mTORC1 que se traduce en la defosforilación de TFEB y TFE3, haciendo que se disocien de las proteínas 14-3-3, llevando a una rápida acumulación Introducción 35 en el núcleo de estos factores de transcripción, los cuales promueven la transcripción de genes implicados en la biogénesis de lisosomas y la inducción de la autofagia (Martina et al, 2016). Aunque TFEB y TFE3 se encuentran regulados por mTORC1 y la falta de nutrientes, numerosos estudios han demostrado que ambos factores de transcripción también responden a una amplia variedad de estreses, incluyendo el daño mitocondrial, la acumulación de proteínas mal plegadas en el RE, patógenos y estrés oxidativo. Muchos de estos estreses no causan una inactivación obvia de mTORC1, lo que sugiere que existe una regulación de TFEB y TFE3 independiente de mTORC1 (Martina & Puertollano, 2018). 1.4.6. Mitofagia. Como se describió en apartados anteriores, son varios los orgánulos de la célula que tienen la capacidad de producir EROs, siendo la mitocondria el mayor productor de ellos. En la mitocondria, el anión superóxido (O2-) es producido en la matriz mediante la reducción del O2 a través del complejo I de la cadena transportadora de electrones (Murphy, 2009). La defensa más importante de la mitocondria contra el O2- son las enzimas superóxido dismutasas (SODs) localizadas en la matriz mitocondrial. Las SODs generan H2O2 cuya acumulación puede inducir daño oxidativo en proteínas, DNA y lípidos (Kupsco & Schlenk, 2015). La detoxificación de H2O2 y sus derivados es llevado a cavo en la mitocondria por el sistema glutatión peroxidasa y por peroxirredoxinas, mientras que las modificaciones en las cisteínas (glutationilación y puentes disulfuro), son revertidas por el sistema glutatión y el sistema tiorredoxina (Hanschmann et al, 2013; Brigelius-Flohé & Maiorino, 2013). Ante defectos en los mecanismos de detoxificación que conllevan a la acumulación de EROs dentro de la mitocondria y, por tanto, daño oxidativo, se desencadena un mecanismo específico de autofagia encargado de la eliminación de mitocondrias defectivas conocido como mitofagia (Lemasters, 2005). De esta forma, las mitocondrias disfuncionales junto con sus EROs acumuladas son eliminadas para preservar la homeostasis celular (Pickles et al, 2018; Garza-Lombó et al, 2020). Diferentes estudios muestran que la alteración de la mitofagia está ligada a varias enfermedades, incluidos desórdenes neurodegenerativos como el Parkinson, Huntington y el Alzheimer (Shefa et al, 2019; Fang et al, 2019; Fivenson et al, 2017; Introducción 42 Timmons & Andrew Fire, 1998). Más reciente es el uso de la edición genética mediante la técnica CRISPR/Cas9, la cual permite generar modificaciones heredables dentro del genoma de C. elegans (Friedland et al, 2013). Gracias a esta técnica es posible la generación de pequeñas inserciones o deleciones de forma dirigida, o la integración de largos fragmentos de ADN dentro del genoma, incluyendo genes exógenos en una sola copia como, por ejemplo, aquellos genes que codifican para reporteros fluorescentes (Dickinson & Goldstein, 2016). Todas las características que presenta C. elegans, junto con la posibilidad de la aplicación de técnicas de manipulación genética establecidas y emergentes, son la clave del éxito y la continua relevancia de C. elegans como organismo modelo. 1.5.4. C. elegans como modelo de enfermedades neurodegenerativas. C. elegans ha sido ampliamente utilizado como modelo de estudio de estas patologías, principalmente mediante la expresión de proteínas humanas con capacidad de formar agregados en diferentes órganos del animal. 1.5.4.1. Modelos de A b . Como se describió anteriormente, una de las características de la enfermedad de Alzheimer es la presencia de placas insolubles del péptido Ab en el cerebro. En mamíferos, el péptido Ab es generado a partir del procesamiento de la proteína transmembrana APP mediante la acción secuencial de dos proteasas, la b-secretasa y la g-secretasa. En C. elegans, la proteína APL-1 comparte un 71% de similitud con el dominio transmembrana de la APP humana, sin embargo, carece de un domino Ab (Daigle & Li, 1993). Además, no existe un ortólogo claro de la b-secretasa humana en el nematodo (Link, 2006). Esto hace que los modelos de C. elegans para la recapitulación de la enfermedad de Alzheimer deban ser generados mediante la sobrexpresión de forma constitutiva o inducible del péptido Ab humano (Figura 1.12) y que la evaluación de la agregación se haga sin interferencia de un péptido Ab endógeno en el nematodo. El modelo original y más comúnmente usado expresa el péptido Ab humano bajo el control del promotor del gen unc-54 de C. elegans que codifica para una miosina muscular, de forma que el péptido Ab humano se expresa de forma constitutiva en Introducción 43 las células musculares del animal donde agrega en el citoplasma (Link, 1995). Este modelo muestra una parálisis progresiva dependiente de la edad a 20ºC, parálisis que ocurre más rápidamente y es más severa cuando los animales son crecidos a 25ºC. Este fenotipo permite correlacionar la parálisis de estos animales con la agregación del péptido Ab visualizada por marcaje con tioflavina S (Link, 1995).. Posteriormente se han desarrollado otros modelos más elaborados que recapitulan la enfermedad de Alzheimer en C. elegans, y aunque la mayoría de ellos expresan el péptido Ab humano en células musculares (Link, 1995; Yatin et al, 1999; Mccoll et al, 2012; Drake et al, 2003), también existen modelos que expresan el péptido Ab en neuronas y que han demostrado la formación de depósitos amiloides así como una neurodegeneración dependiente del envejecimiento (Treusch et al, 2011; Link, 2006; Wu et al, 2006; Gallrein et al, 2021). Figura 1.12. Lista de modelos de expresión del péptido A b . Se indica el genotipo, tejido de expresión y fenotipos observados. Modificado de Van Pelt & Truttmann, 2020. Introducción 44 1.5.4.2. Modelos de a -sinucleína. A nivel celular, la enfermedad de Parkinson es causada por la muerte selectiva de neuronas dopaminérgicas de la sustancia negra pars compacta, una región del ganglio basal crítica para la planificación de funciones motoras. Esta muerte neuronal es acompañada por la presencia de cuerpos de Lewy intracelulares, los cuales están constituidos principalmente por densos agregados de la proteína a-sinucleína (Poewe et al, 2017). C. elegans carece de ortólogo para el gen PARK1/SNCA, el cual codifica para la proteína a-sinucleína, por lo que convierte al nematodo en un modelo ideal ya que permite estudiar la sobrexpresión de a-sinucleína humana sin interferencia de la proteína endógena. Numerosos modelos de C. elegans para la enfermedad de Parkinson se han desarrollado expresando bien a-sinucleína o una proteína de fusión asinucleína::GFP bajo el control de promotores pan-neuronales (Kuwahara et al, 2008, 2012) o de neuronas dopaminérgicas (Figura 1.13). Ejemplo de ello es el promotor del transportador de dopamina dat-1, que permite la expresión de a-sinucleína humana y su asociación a neurodegeneración dopaminérgica (Karpinar et al, 2009; Lakso et al, 2003; Liu et al, 2011). También se han desarrollados modelos que expresan a-sinucleína fusionada a GFP o YFP en células musculares bajo el promotor del gen unc-54, lo que permite la cuantificación de agregados de a-sinucleína a lo largo del envejecimiento del animal, y que, además, han servido para realizar cribados genéticos basados en ARN de interferencia en busca de moduladores genéticos de la agregación de la proteína asinucleína (Hamamichi et al, 2008; Van Ham et al, 2008). Los trabajos con estos modelos permiten la identificación de nuevos genes que ofrecen protección frente a la toxicidad de a-sinucleína, así como el desarrollo de nuevos tratamientos. Introducción 45 Figura 1.13. Lista de modelos de expresión de la proteína a -sinucleína. Se indica el genotipo, tejido de expresión y fenotipos observados. Modificado de Van Pelt & Truttmann, 2020. 1.5.4.3. Modelos de poliglutaminas. La base molecular de las enfermedades de poliglutaminas subyace en la expansión patológica del aminoácido glutamina en distintas proteínas. Como se describió anteriormente (Introducción 1.2.3.), existen nueve enfermedades de poliglutaminas que se diferencian en la proteína afectada y el umbral de repeticiones de glutaminas que desencadena la enfermedad (Lieberman et al, 2019). De forma general, en individuos sanos, las repeticiones se encuentran entre 35-50 glutaminas, dependiendo de la proteína afectada. Sin embargo, las proteínas que dan lugar a estas patologías contienen más de 40 repeticiones, alcanzando sobre 100 glutaminas en algunas condiciones (Adegbuyiro et al, 2017; Todd & Lim, 2013). Introducción 46 Varios modelos de enfermedades de poliglutaminas han sido generados en C. elegans, los cuales han permitido ampliar el conocimiento sobre los procesos patológicos relacionados con la agregación de proteínas y alteración de la proteostasis que comparten esta familia de enfermedades neurodegenerativas. Ejemplo de ello es el modelo de Huntington, en el que varios grupos de animales transgénicos que expresan repeticiones de poliQ fusionadas a fragmentos de la huntingtina humana en neuronas, han permitido estudiar esta enfermedad (Faber et al, 1999; Bates et al, 2006; Faber et al, 2002; Lee et al, 2017). Sin embargo, la aproximación más popular en el uso de C. elegans como modelo para enfermedades de poliglutamina, es fusionar repeticiones puras de diferentes tamaños de poliQ con proteínas reporteras fluorescentes, como GFP o YFP (Figura 1.14) (Morley et al, 2002; Satyal et al, 2000). Estas proteínas formadas solamente por repeticiones de glutamina son suficientes para formar agregados en los diferentes tejidos de C. elegans donde son expresadas y, además, la fusión con proteínas fluorescentes permite la observación y cuantificación de estos agregados in situ. Al igual que en otros modelos de enfermedades neurodegenerativas, las proteínas poliQ han sido expresadas en diferentes tejidos del animal (Figura 1.14) y se ha comprobado que C. elegans permite recapitular la patología dependiente de longitud que presentan las enfermedades de poliglutaminas (Brignull et al, 2006a; Teixeira- Castro et al, 2011; Gidalevitz et al, 2006). Como ejemplo, la expresión de la proteína humana ataxina-3 (ATXN3) en neuronas de C. elegans ha sido utilizado como modelo para el estudio de patogenicidad de la enfermedad de Machado-Joseph (o ataxia espinocerebelar tipo 3). En este modelo, la expresión de ATXN3 con diferente número de repeticiones de glutamina, da lugar a un consistente patrón de agregación que afecta a las neuronas de los cordones dorsal y ventral del animal (Teixeira-Castro et al, 2011). Introducción 47 Figura 1.14. Lista de modelos de expresión de proteínas poliQ. Se indica el genotipo, tejido de expresión y fenotipos observados. Los modelos generales de enfermedades de poliglutaminas se indican como poliQ; los modelos para las enfermedades de Huntington y Machado Joseph se engloban dentro de HD y MJD, respectivamente. Modificado de Van Pelt & Truttmann, 2020. 1.5.5. Mantenimiento de la homeostasis redox de grupos tiólicos en C. elegans. La oxidación reversible del grupo tiol de las cisteínas supone una forma de regulación redox que controla un amplio rango de funciones de las proteínas, incluyendo la regulación de su actividad, estabilización de su estructura, formación de complejos de activación y control de su distribución (Kemp et al, 2008). Cambios en el estado redox de los grupos tiol pueden alterar tanto la conformación como la función de las proteínas, ya que la oxidación de las cisteínas conlleva modificaciones postraduccionales, tanto reversibles (formación de puentes disulfuro o glutationilación) como irreversibles (SO2H o SO3H) (Moldogazieva et al, 2018). La abundancia de los residuos de cisteína en las proteínas incrementa con la Introducción 48 complejidad de los organismos, desde aproximadamente un 0,5% de cisteínas en arqueas hasta unos 2,25% en mamíferos. En C. elegans, el porcentaje de cisteínas que presenta su proteoma es del 1,97%, similar al de humanos (Miseta & Csutora, 2000). Por otro lado, análisis de los genes que codifican los principales sistemas que mantienen la homeostasis redox de los grupos tiol, muestran que existe gran similitud entre las proteínas humanas y de C. elegans (Johnston & Ebert, 2012), haciendo de este nematodo un modelo útil para el estudio de los mecanismos de regulación del estado redox de los grupos tiol del proteoma. El mantenimiento de los grupos tiol de las proteínas en su estado reducido, tanto en el citoplasma como en las mitocondrias, es llevado a cabo por los sistemas tiorredoxina y glutatión. En C. elegans, el sistema tiorredoxina está compuesto por varias tiorredoxinas (entre ellas, TRX-1 a TRX-5, DNJ-27, PNG-1, TXL-1) y dos tiorredoxinas reductasas (TRXR-1, citoplasmática y TRXR-2, mitocondrial) responsables de la reducción de las tiorredoxinas oxidadas a sus formas reducidas utilizando NADPH como cofactor (Feleciano et al, 2016; Johnston & Ebert, 2012). Por otro lado, el sistema glutatión está formado en C. elegans por cinco glutarredoxinas (GLRX-3, GLRX-5, GLRX-10, GLRX-21 y GLRX-22) (Johnston & Ebert, 2012), el tripéptido glutatión (GSH), responsable de la reducción no enzimática de las glutarredoxinas, quedando éste oxidado (GSSG) y una única glutatión reductasa (GSR-1), la cual convierte el glutatión oxidado (GSSG) a su forma reducida (GSH) utilizando como cofactor NADPH (Lüersen et al, 2013). En mamíferos, la deficiencia en la síntesis de GSH debida a mutaciones en los genes que codifican para las enzimas g-glutamilcisteína sintetasa y glutatión sintetasa, conlleva letalidad embrionaria (Shi et al, 2000). Sin embargo, la falta de glutatión reductasa es completamente viable (Rogers et al, 2004). Una posible explicación de este hecho puede ser por la existencia de redundancia funcional entre los sistemas glutatión y tiorredoxina. Por otro lado, mutaciones del sistema tiorredoxina citosólico y mitocondrial dan lugar a letalidad embrionaria en mamíferos (Matsui et al, 1996; Jakupoglu et al, 2005; Conrad et al, 2004; Nonn et al, 2003), aunque utilizando mutantes condicionales que permiten el funcionamiento normal del sistema tiorredoxina durante el desarrollo embrionario pero que bloquean esta ruta una vez ha finalizado esta fase, no existe problema de viabilidad (Mandal et al, 2010; Introducción 49 Suvorova et al, 2009), sugiriendo que en ausencia del sistema tiorredoxina, es el sistema glutatión el responsable del mantenimiento de la homeostasis redox. Esta idea es apoyada por el hecho de que la eliminación de la tiorredoxina reductasa citosólica (TrxR1) y la glutatión reductasa (GR) en hepatocitos de ratón cause letalidad, pero que el suplemento de metionina como precursor para la síntesis de novo de GSH mediante la ruta de transsulfuración permite la supervivencia de estas células (Eriksson et al, 2015). A diferencia de mamíferos, el sistema tiorredoxina en C. elegans no es esencial en ninguna fase de sudesarrollo, ya que mutaciones nulas en los genes de las dos tiorredoxinas reductasas que posee el nematodo (trxr-1 y trxr-2) permiten la viabilidad y el desarrollo hasta el estadio adulto sin que suponga ninguna diferencia con los animales silvestres (Stenvall et al, 2011; Cacho-Valadez et al, 2012). Por el contrario, la mutación del gen gsr-1, que codifica para la única glutatión reductasa en C. elegans (Lüersen et al, 2013), causa letalidad embrionaria (Mora-Lorca et al, 2016). 1.5.6. Glutatión reductasa en C. elegans. El locus gsr-1, que codifica para la única glutatión reductasa en C. elegans, está organizado en 5 exones y 4 intrones. Este gen expresa dos variantes de ARN mensajero (ARNm), gsr-1a y gsr-1b1, cuya traducción da lugar a dos isoformas de la enzima glutatión reductasa, GSR-1a y GSR-1b, presentando la primera de ellas 14 amino ácidos adicionales en posición N-terminal, que constituyen una secuencia de localización mitocondrial de la isoforma GSR-1a, mientras que la isoforma GSR-1b es la forma citoplásmica (Figura 1.15). Se han descrito otras dos variantes del ARNm, gsr-1b2 y gsr-1b3, que sólo se diferencian en la secuencia de la región 5´-UTR pero que también generan la isoforma GSR-1b (http://www.wormbase.org/). En un trabajo previo a esta tesis doctoral, nuestro grupo investigó la función de la enzima GSR-1 usando la cepa de C. elegans con la mutación gsr-1(tm3574), la cual consiste en una deleción de 383 pares de bases que elimina la mayor parte del dominio NADPH y parte del dominio FAD, generando una enzima GSR-1 incapaz de unirse al NADPH que es el donador de electrones para la actividad enzimática GSR- 1. Introducción 50 Figura 1.15. Representación del ARNm de gsr-1 y la proteína GSR-1. a) Esquema de las dos principales variantes del ARNm del gen gsr-1. Los rectángulos representan los exones y las líneas los intrones. Los rectángulos blancos indican las 5´-UTR y 3´-UTR respectivamente, y las cajas grises indican el ORF. La región de la delección en el mutante gsr-1(tm3574) se indica mediante una línea. b) Organización de las isoformas de las proteínas GSR-1a y GSR-1b, así como de la proteína truncada DGSR-1 como resultado de la traducción del alelo gsr-1(tm3574). Los números indican los aminoácidos que limitan cada domino. Basado en la organización descrita para el ortólogo humano GSR (Krauth-Siegel et al, 1982) y modificado de (Mora-Lorca et al, 2016). Los animales gsr-1(tm3574) presentan letalidad embrionaria (Figura 1.16), por lo que este alelo fue mantenido en heterocigosis mediante una versión del balanceador qC1 que expresa GFP o RFP (Edgley et al, 2006). En la segregación de estos animales balanceados, aparecen individuos homocigotos para la mutación gsr-1(tm3574), los cuales poseen un desarrollo embrionario y postembrionario normal, alcanzando el estadio adulto de forma indistinguible de los animales silvestres. Esto es debido a la contribución materna (m+), ya sea de ARNm de gsr-1 y/o de proteína GSR-1, que permite a los mutantes zigóticamente homocigotos (z-) superar la letalidad embrionaria y desarrollarse completamente [individuos denominados gsr-1(m+,z-)]. Sin embargo, estos individuos no aportan carga materna a su descendencia [individuos denominados gsr-1(m-,z-)], la cual presenta letalidad embrionaria temprana (Mora-Lorca et al, 2016). Introducción 51 Figura 1.16. Comparación del desarrollo embrionario de animales wt y gsr-1(m-z-). Los animales con la mutación gsr-1(tm3574) en homocigosis presentan letalidad embrionaria en la fase de pregástrula (Mora-Lorca et al, 2016). Imágenes realizadas con DIC. Se ha descrito que el silenciamiento del gen gsr-1 mediante ARNi en C. elegans disminuye la vida media, sensibiliza al prooxidante juglona y al generador de anión superoxido paraquat y afecta negativamente al proceso de muda de los animales en ausencia de la enzima tiorredoxina reductasa (Stenvall et al, 2011). Estos mismos fenotipos fueron encontrados en los animales gsr-1(m+,z-), indicando que la carga materna es suficiente para alcanzar el estadio adulto en condiciones de crecimiento favorables, pero que es insuficiente para ofrecer protección frente a condiciones de estrés. Además, los animales gsr-1(m+,z-) mostraron un claro fenotipo de fragmentación mitocondrial, una reducción en el potencial de membrana mitocondrial y una fuerte inducción de la UPRmit, lo que indica que la falta de GSR-1 causa en C. elegans estrés y disfunción mitocondrial (Mora-Lorca et al, 2016). Durante la caracterización del gen gsr-1 comprobamos que el fenotipo de arresto embrionario del los embriones gsr-1(m-,z-) pudo ser rescatado expresando la enzima GSR-1 mediante los transgenes vzEx105 [Pgsr-1::gsr-1::3´-UTRgsr-1; Punc- 122::gfp] y vzEx93 [Pgsr-1::gsr-1::gfp; rol-6(su1006)] (este último expresando la proteína GSR-1 fusionada a GFP), lo que indica que el fenotipo de letalidad es debido a la falta de gsr-1 y no a una mutación cercana generada por el protocolo de mutagénesis indiscriminada usado para aislar la deleción gsr-1(tm3574). Interesante fue el hecho de que el rescate de la letalidad embrionaria ocurrió cuando los mutantes gsr-1(m+,z-) expresaron la enzima GSR-1 citoplasmática (isoforma GSR-1b, mediante los transgenes vzEx145 [Pgsr-1::gsr-1(Δ1st exon)::gfp] o vzEx147 [Pgsr- 1::gsr-1(1st ATG->CCT)::gfp]) pero no la mitocondrial (isoforma GSR-1a, con el transgen vzEx158 [Pgsr-1::gsr-1(2nd ATG->GGT)::gfp]), implicando que la actividad glutatión reductasa en el citoplasma, pero no en la mitocondria, es esencial para la viabilidad de C. elegans. Además, descartamos que la no esencialidad de GSR-1 en la mitocondria fuese debida a redundancia entre los sistemas glutatión y tiorredoxina Resultados 59 3.1. Efecto del silenciamiento del gen gsr-1 mediante ARN de interferencia en modelos de agregación de proteínas en C. elegans. En un trabajo previo del grupo se llevó a cabo un ensayo de ARN de interferencia de todos los genes de la familia de las tiorredoxinas, glutarredoxinas y peroxirredoxinas en dos estirpes transgénicas de C. elegans, que sobreexpresan el péptido b-amiloide (Ab) y la proteína a-sinucleína (a-SYN), respectivamente, en células musculares (Tabla 3.1). El objetivo de este ensayo era determinar si el mantenimiento de la homeostasis redox podía tener un papel protector en el desarrollo y progresión de enfermedades que cursan con agregación patológica de proteínas como el Alzheimer o el Parkinson, usando para ello el nematodo C. elegans como modelo preclínico. Para el modelo de la enfermedad de Alzheimer se utilizó la estirpe CL647 que porta el transgén dvIs27 [Pmyo-3::A b 1-42::let-851 3´-UTR] y que expresa el péptido Ab humano en las células musculares de forma inducible por temperatura, causando en los animales un fenotipo de parálisis cuando éstos pasan de una temperatura de crecimiento de 16ºC a 23ºC (Drake et al, 2003). En el caso del modelo de la enfermedad de Parkinson, se empleó la estirpe UA50 que porta el transgén baIn13 [Punc-54:: a -syn::gfp], que expresa en células musculares la proteína a-sinucleína humana fusionada a GFP (a-SYN::GFP), la cual agrega conforme el animal envejece (Hamamichi et al, 2008). En el primer modelo se cuantifica la parálisis de los animales y en el segundo la formación de agregados fluorescentes en las células musculares. Como resultado de este estudio se concluyó que, entre todos los genes ensayados, el silenciamiento de solamente dos genes, dnj-27 y gsr-1, tuvo efecto en ambos modelos provocando una parálisis más temprana en animales expresando Ab y una mayor agregación de la proteína a-SYN::GFP (Tabla 1). El papel del gen dnj-27 (que codifica una proteína del retículo endoplásmico con cuatro dominios tiorredoxina) en la proteostasis celular ha sido previamente descrita por otros miembros de nuestro grupo (Muñoz-Lobato et al, 2014). Resultados 60 Tabla 3.1. Efecto del silenciamiento por ARNi de los genes de las familias tiorredoxina, glutarredoxina y peroxirredoxina sobre los fenotipos de parálisis y agregación de las estirpes CL647 (que expresa el péptido A b ) y UA50 (que expresa la proteína a -SYN), respectivamente. Aquellos casos en los que el ARNi del gen no produjo ningún efecto están representados con un guión. a No se pudo ensayar porque el tratamiento con ARNi produjo un fenotipo de letalidad o de arresto embrionario (Muñoz-Lobato et al, 2014). En la presente tesis nos enfocamos en la caracterización molecular del efecto protector del gen gsr-1 frente a la agregación de proteínas y en el mantenimiento de la proteostasis. El gen gsr-1 codifica para la única glutatión reductasa presente en C. elegans, la cual obtiene poder reductor del NADPH que usa para convertir el glutatión oxidado (GSSG) en glutatión reducido (GSH). El GSH, tal y como se detalla en el apartado de la introducción, es el antioxidante enzimático más importante de la célula debido a su abundancia y multifuncionalidad, siendo capaz de reaccionar directamente con EROs, detoxificar compuestos xenobióticos, actuar como cofactor de enzimas antioxidantes o participar en la señalización redox mediante glutationilación (Aquilano et al, 2014; Deponte, 2013). Resultados 61 Como primer paso, y para ampliar los resultados obtenidos previamente en los modelos de Alzheimer y Parkinson, realizamos ensayos de ARNi del gen gsr-1 en un modelo de enfermedades por repetición de residuos de glutamina (poliQ) que constituyen la base molecular de enfermedades neurodegenerativas como el Huntington o las Ataxia de Friedreich y Machado-Joseph, entre otras (Lieberman et al, 2019). Para ello usamos la estirpe AM141 que porta el transgén rmIs133 [Punc- 54::Q40::yfp] y que expresa en células musculares un polipéptido de 40 repeticiones de glutamina fusionado a YFP en su extremo C-terminal, de modo que permiten la visualización y cuantificación de agregados poliQ mediante microscopía de fluorescencia (Morley et al, 2002). El silenciamiento del gen gsr-1 en animales que expresan Q40::YFP supuso un incremento en el número de agregados con respecto a la agregación que presentaron los individuos crecidos con el ARNi control (Figura 3.1a). Además, tras dos generaciones en ARNi de gsr-1, la estirpe que expresaba Q40::YFP mostró un fenotipo de arresto larvario, fenotipo que fue exacerbado a las cuatro generaciones. Este efecto en el desarrollo del ARNi de gsr-1 no se observó en animales que expresaban el polipéptido de 35 repeticiones de glutamina fusionado a YFP (Q35::YFP) a partir del transgén rmIs132 [Punc-54::Q35::yfp] y que se usa como control de agregación ya que 35 repeticiones de glutamina se consideran como el umbral de agregación de este modelo y que coincide con el umbral de patogenicidad para la enfermedad de Huntington (Morley et al 2002) (Figura 3.1b). Resultados 62 Figura 3.1. Efecto del silenciamiento por ARNi de gsr-1 en animales que expresan Q35::YFP y Q40::YFP en células musculares. a) El ARNi de gsr-1 incrementa el número de agregados de Q40::YFP. Los datos corresponden con la media de dos experimentos independientes (n=12 por ensayo y condición) realizados a día 3 tras la puesta sincronizada. La barra de error indica el error estándar de la media (SEM). ***p<0.001, usando t-test de dos colas. b) El silenciamiento por ARNi de gsr-1 provoca un retraso en el desarrollo de los animales que expresan Q40::YFP, evidente tras dos generaciones, siendo más penetrante a la cuarta generación. n= número total de animales ensayados en tres experimentos independientes Dado que en el modelo de poliQ observamos no sólo un incremento de la agregación, sino también un claro efecto en el desarrollo del animal tras varias generaciones en ARNi de gsr-1, quisimos volver a evaluar este fenotipo de desarrollo en ensayos de ARNi en los animales que expresan Ab y a-SYN. En el primer caso usamos una estirpe CL2006 que porta el transgén dvIs2 [Punc-54::A b 3-42::unc-54 3´-UTR] y que expresa Ab de forma constitutiva en células musculares (Link, 1995), a diferencia del modelo descrito anteriormente, que expresaba Ab de forma inducible por temperatura a partir del transgén dvIs27. En este modelo, los animales dvIs2 muestran un fenotipo de parálisis progresiva dependiente de temperatura, siendo ésta más rápida a 20ºC que a 16ºC. Pese a que los animales que expresan Ab sometidos a ARNi de gsr-1 presentaron un claro incremento de la parálisis a 16ºC en comparación con aquellos individuos crecidos en ARNi control (Figura 3.2a), el ARNi de gsr-1 no provocó ningún efecto en el desarrollo de los mismos (Figura 3.2b). Figura 3.2. Efecto del silenciamiento por ARNi de gsr-1 en animales que expresan el péptido A b humano en células musculares. a) La parálisis de los animales dvIs2 se incrementa ante el silenciamiento por ARNi de gsr-1 a la temperatura permisiva de 16ºC. Los datos corresponden con la media de dos experimentos independientes (n=25 por ensayo y condición). La barra de error indica el error estándar de la media (SEM). ****p<0.0001, mediante el test log-rank (Mantel-Cox). b) El silenciamiento por ARNi de gsr-1 no provoca ningún retraso en el desarrollo de los animales que expresan el péptido Ab. n= número total de animales ensayados en tres experimentos independientes. Resultados 63 Por último, empleamos un modelo adicional de la enfermedad de Parkinson mediante la estirpe NL5901 que porta el transgén pkIs2386 [Punc-54:: a -syn::yfp] y que expresa la proteína a-SYN fusionada a YFP en células musculares (Van Ham et al, 2008). En este caso se observó un incremento significativo de la agregación de a-SYN::YFP causado por el silenciamiento de gsr-1 (Figura 3.3a) pero tampoco observamos ningún efecto en el desarrollo (Figura 3.3b), de forma similar a lo que describimos para los animales que expresan Ab. Figura 3.3. Efecto del silenciamiento por ARNi de gsr-1 en animales que expresan la proteína a - sinucleína en células musculares. a) El ARNi de gsr-1 incrementa el número de agregados de a- SYN::YFP. Los datos corresponden con la media de dos experimentos independientes (n=12 por ensayo y condición). La barra de error indica el error estándar de la media (SEM). **p<0.01, usando t-test de dos colas. b) El silenciamiento por ARNi de gsr-1 no provoca ningún retraso en el desarrollo de los animales que expresan la proteína a-SYN::YFP. n= número total de animales ensayados en tres experimentos independientes. En su conjunto, estos resultados en los que se observó que el silenciamiento del gen gsr-1 supuso un aumento en la agregación o parálisis de los modelos estudiados, así como en algunos casos, un retraso en el desarrollo, sugieren que la disminución de la expresión de gsr-1 tiene un efecto deletéreo en el mantenimiento de la proteostasis celular en distintos modelos de agregación de proteínas. 3.2. Efecto de la inhibición de la síntesis, reducción y disponibilidad del glutatión reducido. Tras comprobar que el silenciamiento de gsr-1 provoca un empeoramiento de los fenotipos derivados de la agregación de proteínas, nos propusimos fenocopiar dichos Resultados 64 resultados con diferentes compuestos que afectan a la disponibilidad del GSH en C. elegans. Para ello, empleamos la butionina sulfoximina (BSO, un inhibidor de la gglutamil cisteil sintetasa que cataliza la primera reacción en la síntesis del GSH) (Ford et al, 1996); 1,3-Bis(2-cloroetil)-1-nitrosourea (BCNU, un inhibidor de la glutatión reductasa) (Frischer & Ahmad, 1977) y dietilmaleato (DEM, un compuesto que alquila e inactiva al GSH) (Boyland & Chasseaud, 1967). Decidimos tratar con estos fármacos animales que expresan Q35::YFP y Q40::YFP en células musculares y comprobar si existía algún fenotipo deletéreo desde su desarrollo embrionario hasta la etapa adulta. Tras partir de una puesta sincronizada de huevos, observamos que ninguno de los tratamientos utilizados causó efecto alguno en los animales que expresaban Q35::YFP, los cuales alcanzaron la edad adulta sin mostrar ninguna alteración en su desarrollo (Figura 3.4). Sin embargo, los animales Q40::YFP sufrieron arresto en el desarrollo larvario al estar expuestos a cada uno de los tres inhibidores (Figura 3.4), consistente con el umbral de patogenicidad descrito para este modelo de 35 residuos de poliglutamina (Morley et al 2002). Este fenotipo de parada en el desarrollo larvario tuvo diferente grado de penetrancia en cada uno de los tratamientos, siendo el más destacable el fenotipo de los animales tratados con DEM, en el que todos los animales interrumpieron su desarrollo en los primeros estadíos larvarios L1-L2. Figura 3.4. Efecto de la inhibición de los genes que afectan a la disponibilidad de GSH en animales que expresan proteínas Q35::YFP y Q40::YFP en células musculares. La inhibición química de (a) la síntesis de GSH mediante BSO, (b) la reducción de GSSG mediante BCNU y (c) la depleción de GSH mediante DEM provoca arresto larvario en animales que expresan Q40::YFP pero no Q35::YFP. n= número total de animales ensayados en tres experimentos independientes. Resultados 65 Estos experimentos demuestran que la disminución de los niveles de GSH mediante el uso de inhibidores específicos de la síntesis, reducción y disponibilidad del glutatión aumenta los fenotipos asociados a la agregación de proteínas y refuerzan los datos obtenidos previamente con el silenciamiento por ARNi de gsr-1. 3.3. Efecto de la mutación gsr-1(tm3574) en modelos de agregación de proteínas exógenas en C. elegans. Una vez demostrada (farmacológicamente y por silenciamiento del gen gsr-1) la relación entre una menor disponibilidad de GSH y la alteración de la proteostasis celular, el siguiente objetivo que nos propusimos fue confirmar dichos resultados mediante la utilización de animales mutantes para el gen gsr-1. Para ello, usamos el alelo gsr-1(tm3574), que consiste en una deleción de 383pb que elimina parte del tercer exón, el tercer intrón y parte del cuarto exón del gen gsr-1 (Figura 1.14). Este alelo codifica una proteína GSR-1 que carece de la mayor parte del dominio de unión a NADPH y parte del segundo dominio FAD y que carece de actividad enzimática glutatión reductasa in vitro (Mora-Lorca et al, 2016). Por tanto, gsr-1(tm3574) es un alelo de pérdida de función. Los mutantes gsr-1(tm3574) homocigotos tienen un fenotipo de letalidad embrionaria con un 100% de penetrancia, por lo que esta mutación se mantiene en heterocigosis mediante el balanceador qC1 que lleva incorporado GFP o RFP (Mora-Lorca et al, 2016; Edgley et al, 2006). Así, un 25% de la descendencia de los animales balanceados dará lugar a individuos con la mutación gsr-1(tm3574) en homocigosis (z-) que, gracias al aporte materno (m+) bien de ARN mensajero de gsr-1, bien de la propia proteína GSR-1 o ambos, consiguen alcanzar la edad adulta sin aparente fenotipo visible [individuos denominados gsr-1(m+,z-)]. No obstante, los animales adultos gsr-1(m+,z-) no aportan la carga materna a la siguiente generación, de forma que su descendencia [individuos denominados gsr-1(m-,z-)] presenta arresto embrionario. Por tanto, la viabilidad durante una generación de los animales gsr-1(m+,z-) posibilita la evaluación del efecto de la mutación gsr-1 en homocigosis sobre los diferentes modelos de agregación que nos propusimos ensayar y así, validar los resultados previos obtenidos mediante ARNi y tratamientos farmacológicos. Resultados 66 3.3.1. Modelos de agregación por repeticiones de residuos de glutamina. Como se comentó anteriormente, las enfermedades de poliglutamina se caracterizan por la agregación de proteínas que presentan repeticiones del aminoácido glutamina, siendo su patogenicidad dependiente de la longitud de dichas repeticiones (Brignull et al, 2006b). Para el estudio del efecto de la deficiencia de gsr-1 en modelos de enfermedades de poliglutamina, generamos animales gsr-1(m+,z-) en fondos genéticos que expresaban Q35::YFP y Q40::YFP en células musculares (a partir de los transgénes rmIs132 [Punc-54::Q35::yfp] y rmIs133 [Punc-54::Q40::yfp]) y realizamos la cuantificación de los agregados fluorescentes a lo largo del envejecimiento de los nematodos a los días 3, 4 y 7 desde la puesta sincronizada de huevos. Como resultado obtuvimos que, mientras que los animales Q35::yfp o gsr-1(m+,z-); Q35::yfp mostraron una baja agregación, sí que existió mayor número de agregados en animales Q40::yfp durante el envejecimiento. Además, este fenotipo de los individuos Q40::yfp fue potenciado en el mutante gsr-1(m+,z-) ya que el número de agregados fue significativamente más elevado que en los individuos control Q40::yfp durante los primeros días, con tendencia a equilibrarse dicha diferencia en la agregación en los animales más envejecidos (Figura 3.5). Figura 3.5. Efecto de la mutación gsr-1 en animales que expresan Q35::YFP y Q40::YFP en células musculares. La mutación gsr-1(m+,z-) incrementa el número de agregados Q40::YFP pero no en animales Q35::YFP. Los datos corresponden a la media de tres experimentos independientes (n=10 por ensayo y estirpe). La barra de error indica el error estándar de la media (SEM). **p<0.01, ****p<0.0001, usando ttest de dos colas. Las fotografías de fluorescencia muestran ejemplos representativos de los genotipos que expresan Q40::YFP en células musculares a día tres tras la puesta sincronizada (barra de escala 100µm). Resultados 67 A continuación, nos propusimos estudiar si el efecto protector de GSR-1 está limitado a las células musculares o se presenta también otros órganos, por lo que decidimos analizar la agregación de las proteínas poliQ, pero esta vez siendo expresadas en las neuronas de los animales gsr-1(m+,z-). Para ello, usamos un modelo de C. elegans para la enfermedad de Machado-Joseph en el que se expresa la proteína humana ataxina-3 (ATXN3) fusionada a YFP en todas las neuronas del nematodo (Teixeira- Castro et al, 2011). Al igual que en el caso de la expresión de poliQ en células musculares, comparamos el número de agregados en animales control que expresan la proteína ATXN3::Q75::YFP (75 repeticiones de glutamina en este modelo están por debajo del umbral de patogenicidad), con animales que expresan la proteína patógenica ATXN3::Q130::YFP desde los transgenes rmIs237 [Prgef-1::AT3v1- 1::Q75::yfp] y rmIs263 [Prgef-1::AT3v1-1::Q130::yfp]), respectivamente. La cuantificación de los agregados se realizó en el segmento del cordón nervioso ventral que va desde el final de la faringe hasta la vulva. Como muestra la figura 3.6a, apenas se observaron agregados en los animales que expresan ATXN3::Q75::YFP y ATXN3::Q130::YFP a lo largo del envejecimiento, fenotipo similar al observado en los animales gsr-1(m+,z-) que expresan ATXN3::Q75::YFP. Por el contrario, y al igual que ocurría con la expresión de poliQ en células musculares, donde la falta de GSR- 1 potenció la agregación de la proteína fluorescente Q40::YFP, la mutación gsr-1 causó un robusto incremento de la agregación de la proteína ATXN3::Q130::YFP en neuronas. De forma complementaria decidimos realizar ensayos de inhibición farmacológica para fenocopiar el efecto de la mutación de gsr-1 en este modelo poliQ neuronal. Debido a que el empleo de DEM en animales que expresan Q40::YFP en células musculares mostró el fenotipo más severo, con un arresto total en los primeros estadio del desarrollo larvario L1 y L2, decidimos que éste sería el tratamiento a utilizar en este tipo de ensayos. Sin embargo, sorprendentemente, mientras que la expresión en células musculares de la proteína Q40::YFP causó un efecto deletéreo en el desarrollo de los animales en presencia de 2,5mM DEM, sin que tuviera ningún efecto en los animales que expresan Q35::YFP, en el modelo de poliQ expresado de forma pan-neuronal encontramos afectado el desarrollo larvario en animales que expresan la proteína control ATXN3::Q75::YFP, pero ningún efecto en los animales que expresaron la proteína patogénica ATXN3::Q130::YFP (Figura 3.6b). Resultados 74 aumento de los agregados de la proteína a-SYN::YFP en células musculares, no observamos ningún fenotipo en el tratamiento con DEM en este modelo (Figura 3.12b). Esta la falta de sensibilidad ante la exposición a DEM puede ser debida al poco efecto que tiene la agregación de a-SYN en la motilidad del animal (Van Ham et al, 2010), lo que sugiere que la agregación de a-SYN no causa una toxicidad severa como para afectar al desarrollo, a diferencia de los modelos de poliglutamina o Ab. Figura 3.12. Efecto de la mutación gsr-1 y el tratamiento con dietil maleato (DEM) en animales que expresan la proteína a -sinucleína humana en células musculares. a) La mutación gsr-1(m+,z-) causa un aumento en el número de agregados de a-SYN::YFP en células musculares. La cuantificación de los agregados se llevó a cabo en la región entre los dos bulbos faríngeos. Los datos corresponden con la media de tres experimentos independientes (n=12 por ensayo y estirpe). La barra de error indica el error estándar de la media (SEM). ****p<0.0001, usando t-test de dos colas. Las fotografías de fluorescencia muestran una representación de cada genotipo a día 5 tras la puesta sincronizada de huevos (barra de escala 10µm). b) Los animales que expresan la proteína a-SYN::YFP humana en células musculares no sufren ningún efecto en su desarrollo ante la exposición a DEM. Los datos representan la media de tres experimentos independientes. n=número total de animales ensayados en tres experimentos independientes. Tras este resultado, y continuando con la metodología de evaluar agregación en diferentes tipos celulares de mutantes gsr-1, usamos el transgén baIn11 [Pdat-1:: a - synuclein; Pdat-1::gfp], el cual expresa a-SYN en las seis neuronas dopaminérgicas de la cabeza de C. elegans (4 CEP y 2 ADE) (Sulston et al, 1975), con el objetivo de evaluar la posible neurodegeneración dopaminérgica ante la falta de GSR-1. El transgén baIn11 permite la observación de las seis neuronas dopaminérgicas mediante GFP expresada bajo el control del promotor del transportador de la dopamina dat-1 (Jayanthi et al, 1998). La expresión de la proteína a-SYN provoca la muerte progresiva de las neuronas dopaminérgicas, que se manifiesta por la pérdida Resultados 75 de fluorescencia, de manera que es posible cuantificar el daño causado por la expresión de la proteína a-SYN cuantificando la integridad del marcaje fluorescente en dendritas, axones y cuerpos neuronales. En este caso, la expresión de a-SYN en los animales gsr-1(m+,z-) provocó una mayor neurodegeneración dopaminérgica a lo largo del envejecimiento en comparación con los individuos control que expresan la proteína a-SYN en fondo silvestre, confirmando el impacto negativo de la falta de GSR-1 en este otro modelo de agregación (Figura 3.13a). Al igual que en el caso de la expresión de a-SYN en células musculares, el tratamiento con DEM no afectó al desarrollo en el modelo de neuronas dopaminérgicas (Figura 3.13b). El hecho que la función dopaminérgica no es esencial para el desarrollo de C. elegans (Sanyal et al, 2004) podría explicar la resistencia al tratamiento con DEM en este modelo. Figura 3.13. Efecto de la mutación gsr-1 en animales que expresan la proteína a -sinucleína humana en neuronas dopaminérgicas. La mutación gsr-1(m+,z-) acelera la neurodegeneración de neuronas dopaminérgicas durante el envejecimiento en animales que expresan la proteína a-SYN humana. Los datos corresponden con la media de tres experimentos independientes (n=30 por ensayo y estirpe). La barra de error indica el error estándar de la media (SEM). *p<0.1, **p<0.01, usando t-test de dos colas. b) Los animales que expresan la proteína a-SYN humana en neuronas dopaminérgicas no sufren ningún efecto en su desarrollo ante la exposición a DEM. Los datos representan la media de tres experimentos independientes. n=número total de animales ensayados en tres experimentos independientes. En su conjunto, los datos obtenidos en el modelo de agregación de a-sinucleína, junto con los anteriormente comentados en los modelos de Ab y proteínas de poliQ, corroboran el papel protector de la glutatión reductasa y del correcto balance de GSH en el mantenimiento de la proteostasis celular. Resultados 76 3.4. Efecto de la deficiencia de GSR-1 en la agregación de proteínas endógenas de C. elegans. Los modelos descritos hasta el momento expresan en el nematodo proteínas exógenas tendentes a la agregación, bien artificiales como las fusiones de poliglutaminas con proteínas fluorescentes, bien presentes en células humanas como Ab y a-sinucleína, pero no en células de C. elegans. Para comprobar si el efecto protector de GSR-1 ante la agregación de estas proteínas humanas descrito anteriormente se extiende también al caso de proteínas endógenas de C. elegans que forman agregados, usamos los mutantes termosensibles unc- 52(e669su250) y let-60(ga89), los cuales presentan fenotipos asociados a estrés proteotóxico en función de la temperatura de crecimiento del nematodo (Gidalevitz et al, 2006). El gen unc-52 de C. elegans codifica para varias proteínas homólogas a perlecan, un proteoglicano de heparán sulfato de la membrana basal de mamíferos (Rogalski et al, 1995). Los animales que portan la mutación termosensible unc-52(e669su250) presentan una parálisis de prácticamente todo el cuerpo, permitiendo sólo el movimiento de la cabeza. Este fenotipo es progresivo a lo largo del envejecimiento del animal y es dependiente de la temperatura, de modo que la parálisis es mucho más temprana cuando los animales son crecidos a 25ºC mientras que, a la temperatura permisiva de 16ºC, la parálisis se ve considerablemente retrasada (Gidalevitz et al, 2006). La introducción de la mutación gsr-1(m+,z-) en los animales unc-52(e669su250) causó un fuerte incremento de la parálisis cuando los animales fueron crecidos a la temperatura permisiva de 16ºC (Figura 3.14a). Este resultado indica que la falta de GSR-1 provoca una pérdida de la proteostasis celular, que se traduce en la desestabilización de la proteína metaestable UNC-52, similar a la que ocurre cuando los animales unc-52(e669su250) son crecidos a 25ºC. Además, el tratamiento con DEM a 16ºC causó una parada completa en el desarrollo larvario de animales unc-52(e669su250) en el estadio L1-L2, fenocopiando el efecto negativo de la mutación gsr-1(m+,z-) (Figura 3.14b), mismo resultado que se observó en los modelos de poliQ (Figura 3.4a) y Ab (Figura 3.9b) expresados en células musculares. Resultados 77 Figura 3.14. Efecto de la mutación gsr-1 y el tratamiento con dietil maleato (DEM) en C. elegans que expresan la proteína mestaestable UNC-52. a) La mutación gsr-1(m+,z-) incrementa el fenotipo de parálisis de animales unc-52(e699su250) cuando son crecidos a la temperatura permisiva de 16ºC. Los datos corresponden con la media de tres experimentos independientes (n=50 por ensayo y estirpe). La barra de error indica el error estándar de la media (SEM). ****p<0.0001, mediante el test log-rank (Mantel- Cox). b) El tratamiento con 2mM de DEM causa un completo arresto larvario en los estadios L1-L2 en mutantes unc-52(e699su250) crecidos a la temperatura permisiva de 16ºC. Los datos representan la media de tres experimentos independientes. n=número total de animales ensayados en tres experimentos independientes. De igual manera, la mutación let-60(ga89) causa un fenotipo de letalidad embrionaria con un 100% de penetrancia a la temperatura restrictiva de 25ºC, mientras que el desarrollo embrionario de estos animales es normal a 16ºC (Gidalevitz et al, 2006). Debido a que los animales gsr-1(m+,z-) presentan el mismo fenotipo de letalidad embrionaria de su descendencia que los mutantes let-60(ga89) a 25ºC, no podíamos realizan los ensayos fenotípicos con los animales con la mutación gsr-1(m+,z-) en homocigosis y que expresasen la proteína LET-60 metaestable. Por esta razón, decidimos generar un doble mutante en el que la mutación let-60 en homozigosis se combina con la mutación gsr-1 en heterozigosis mediante el balanceador qC1::rfp. Sin embargo, cuando generamos el doble mutante let-60(ga89); gsr-1/qC1::rfp, encontramos que estos animales también presentaban una letalidad embrionaria del 100%, lo cual nos impedía mantener esta estirpe (Figura 3.15a). Esta letalidad embrionaria la encontramos hasta en cuatro intentos independientes de generar este doble mutante, lo que sugería que el balanceador qC1::rfp podía tener algún efecto sobre la mutación let-60(ga89). Por esta razón, decidimos generar el doble mutante manteniendo la mutación gsr-1 balanceada con otra versión del balanceador qC1 que lleva como marcador GFP en lugar de RFP. Así, con esta versión del balanceador conseguimos generar el doble mutante let-60(ga89); gsr-1/ qC1::gfp viable, pero fue Resultados 78 interesante encontrar que a la temperatura permisiva de 16ºC, estos animales no segregaron ningún individuo let-60(ga89); gsr-1(m+,z-), confirmando que existe un interacción letal que impide obtener animales que expresen esta proteína metaestable LET-60 en un fondo genético gsr-1 incluso a temperatura permisiva (Figura 3.15b). Además, este resultado fue apoyado por el fenotipo de arresto larvario que presentaron los mutantes let-60(ga89) expuestos a DEM (Figura 3.15c). Figura 3.15. Efecto de la mutación gsr-1 y el tratamiento con dietil maleato (DEM) en C. elegans que expresan la proteína mestaestable LET-60. a, b) La mutación gsr-1 incrementa el fenotipo de arresto embrionario en los animales let-60(ga89) cuando son crecidos a la temperatura permisiva de 16ºC. (a) Los individuos let-60(ga89); gsr-1/qC1::rfp únicamente producen embriones arrestados mientras que (b) los individuos let-60(ga89); gsr-1/qC1::gfp generan únicamente animales balanceados y embriones arrestados qC1::gfp homocigotos pero no individuos viables gsr-1(m+,z-); let-60(ga89). Los datos corresponden con la media de tres experimentos independientes (n ³ 100 animales/embriones por ensayo y estirpe). La barra de error indica el error estándar de la media (SEM). ****p<0.0001, usando t-test de dos colas. c) El tratamiento con 3mM de DEM causa un fenotipo de arresto embrionario en animales que expresan LET- 60 metaestable. Los datos representan la media de tres experimentos independientes. n= número total de animales ensayados en tres experimentos independientes. Los ensayos de expresión de proteínas endógenas metastables de C. elegans, nos permiten concluir que el papel protector de la glutatión reductasa y un correcto mantenimiento de los niveles de GSH son críticos para el mantenimiento de la proteostasis en este organismo y refuerzan su posicionamiento como un mecanismo de protección esencial frente al estrés proteotóxico, que ocurre independientemente de la naturaleza de la proteína que agrega (endógena o exógena) y del tipo celular donde dicha agregación se produce. Resultados 79 3.5. Mecanismo molecular del efecto protector de GSR-1 en la homeostasis proteica. La proteostasis es un mecanismo por el cual las células responden rápidamente a su ambiente intracelular y extracelular para mantener las proteínas en su estado óptimo de actividad. Se encuentra controlada por numerosos mecanismos que promueven el correcto plegamiento de las proteínas, previenen o corrigen la pérdida de conformación y la agregación, e incluso dirigen proteínas hacia su degradación (Powers & Balch, 2013). Con todos los resultados obtenidos mediante ARNi, tratamiento con DEM y con mutantes gsr-1(m+,z-) en varios modelos de agregación de proteínas, resulta evidente que la mutación gsr-1 tiene un impacto importante sobre la proteostasis celular en C. elegans. Por tanto, como siguiente paso, nos planteamos identificar el mecanismo molecular por el cual la glutatión reductasa, y por tanto un correcto mantenimiento del estado redox del glutatión, regula la proteostasis celular. Para resolver esta cuestión, decidimos generar mutantes gsr-1(m+,z-) que expresasen diferentes reporteros de regulación de la proteostasis, y así evaluar la posible alteración que causase la mutación gsr-1 en la inducción de cada uno de los reporteros, tanto en situaciones basales como en distintas situaciones de estrés. De esta forma comprobaríamos si la mutación gsr-1 estaría causando una respuesta inadecuada de alguno de los mecanismos que controlan la proteostasis o evitando su inducción ante un estímulo determinado. 3.5.1. Identificación de la ruta de control de la proteostasis afectada por la falta de GSR-1. 3.5.1.1. Ruta de estrés citoplasmático. Una ruta importante de regulación de la proteostasis es la llevada a cabo a través de la HSR (heat shock response) y la activación del factor de transcripción HSF1 (heat shock factor 1), que tiene como consecuencia la protección celular frente al daño proteotóxico en el citoplasma (Tatum et al, 2015). HSF1 regula la transcripción de una familia de genes que codifican HSPs (heat shock proteins), las cuales actúan como chaperonas moleculares para mantener la conformación de las proteínas durante estrés (Guisbert et al, 2013). Resultados 80 Para continuar investigando el posible mecanismo de regulación de la proteostasis afectado por la ausencia GSH, cuantificamos la inducción del factor de transcripción HSF-1 de C. elegans fusionado a GFP cuya expresión está mediada por el transgén drSi13[Phsf-1::hsf-1::gfp::unc-54 3´-UTR] (Morton & Lamitina, 2013). Además, empleamos el reportero transcripcional rmIs223[Phsp-70::gfp; rol-6(su1006)] que expresa la proteína GFP bajo el control del promotor del gen hsp-70, regulado por HSF-1 (Morley & Morimoto, 2004). Cuantificamos la inducción de ambos reporteros tanto en condiciones basales como ante un estrés, que en este caso fue la exposición a 35ºC durante una hora. No existió ninguna variación significativa en la inducción de los dos marcadores en animales gsr-1(m+,z-) bajo ninguna de las condiciones ensayadas (Figura 3.16), lo cual sugiere que la falta de GSR-1 no altera el mecanismo de regulación de la proteostasis mediante la HSR. Figura 3.16. Efecto de la mutación gsr-1 en la inducción de los reporteros HSF-1::GFP y Phsp- 70::gfp. La inducción de los reporteros HSF-1::GFP (a) y Phsp-70::gfp (b) no se ve alterada en animales gsr-1(m+,z-) tanto en condiciones normales de crecimiento (20ºC) como ante un choque térmico por exposición a 35ºC. Los datos corresponden con la media de dos experimentos independientes (n=30 por ensayo y estirpe). La barra de error indica el error estándar de la media (SEM). 3.5.1.2. Ruta de la insulina DAF-16 es un factor de transcripción que integra la señalización por la ruta de la insulina y que es activado ante diferentes estreses. En condiciones basales DAF-16 se encuentra fosforilado e inactivo en el citoplasma y cuando los animales se exponen a distintos tipos de estreses, DAF-16 se desfosforila y transloca al núcleo para transcribir una batería de genes importantes para la resistencia a estrés. Así, la localización nuclear de DAF-16 puede verse inducida ante estrés térmico, anoxia, ayuno, estrés oxidativo o la exposición a patógenos (Senchuk et al, 2018). Para Resultados 81 comprobar la posible relación entre GSH y DAF-16, generamos mutantes gsr-1(m+,z- ) expresando el reportero DAF-16::GFP desde el transgén zIs356[Pdaf-16::daf- 16::gfp; rol-6 (su1006)] (Henderson & Johnson, 2001) y cuantificamos la localización subcelular del reportero en animales mantenidos tanto en condiciones normales de crecimiento a 20ºC, como sometidos a un estrés térmico de 35ºC o ayuno durante 1 hora. Como muestra la figura 3.17, no existió ninguna diferencia en la localización de DAF-16::GFP en animales gsr-1(m+,z-) en comparación con los individuos control en condiciones basales de crecimiento, permaneciendo el reportero en el citoplasma celular. Al provocar la inducción del reportero mediante estrés térmico a 35ºC o ayuno, DAF-16::GFP pasó al núcleo celular de igual forma tanto en animales control como mutantes gsr-1(m+,z-), indicando que el GSH no altera la inducción de DAF-16 ante un estrés proteotóxico. Figura 3.17. Efecto de la mutación gsr-1 en la inducción del reportero DAF-16::GFP. La mutación gsr- 1(m+,z-) no afecta la localización subcelular del reportero DAF- 16::GFP cuando los animales son crecidos en condiciones normales a 20ºC ni altera la inducción del reportero ante el estrés térmico de 35ºC o el ayuno durante 1 hora. Los datos corresponden a la media de dos experimentos independientes (n = 30 animales por estirpe y ensayo). A continuación, quisimos investigar si la la mutación gsr-1 afectaba a la respuesta a estrés oxidativo mediada por la ruta de la insulina. Para ello generamos animales gsr- 1(m+,z-) que expresaban GFP bajo el control del promotor del gen sod-3 desde el transgén muIs84 [Psod-3::gfp; rol-6(su1006)] (Libina et al, 2003). La superóxido dismutasa SOD-3 es una proteína ortóloga a SOD2 de humanos, responsable de la detoxificación de aniones superóxidos, cuya expresión en C. elegans está regulada por DAF-16 (Furuyama et al, 2000; Honda & Honda, 1999). Para activar la respuesta de este reportero transcripcional, recurrimos al tratamiento con juglona, compuesto que genera anión superóxido y que ha sido ampliamente Resultados 82 utilizado para generar estrés oxidativo en C. elegans (Link & Johnson, 2002). En condiciones basales, los animales gsr-1(m+,z-) mostraron una expresión GFP significativamente superior a la observada en los individuos control. Sin embargo, el estrés oxidativo provocado por el tratamiento con juglona, supuso un incremento de la expresión de GFP prácticamente similar tanto en mutantes gsr-1(m+,z-) como en los animales control (Figura 3.18), indicando que la mutación gsr-1(m+,z-) no afecta a la respuesta por parte de este reportero ante estrés oxidativo. Estos resultados sugieren que la inducción del reportero de sod-3 en los mutantes gsr-1(m+,z-) en condiciones basales es más una consecuencia del desbalance redox debido a la mutación gsr-1 que a un efecto directo sobre la homeostasis proteica, ya que la respuesta del reportero al tratamiento con juglona es similar tanto en mutantes gsr- 1(m+,z-) como controles, lo que descartaría que el efecto de la mutación gsr-1(m+,z- ) en la proteostasis celular sea debido a una alteración en el mecanismo de respuesta a estrés oxidativo mediado por la ruta de la insulina. Figura 3.18. Efecto de la mutación gsr-1 en la inducción del reportero fluorescente de sod- 3. La mutación gsr-1(m+,z-) provoca una inducción del reportero de sod-3 en condiciones normales de crecimiento. Por el contrario, la falta de GSR-1 no supone una diferencia en los niveles de GFP ante el tratamiento con 50µM de juglona. Los datos corresponden con la media de dos experimentos independientes (n=30 por ensayo y estirpe). La barra de error indica el error estándar de la media (SEM). ***p<0.001, usando t-test de dos colas. 3.5.1.3. Rutas de estrés de orgánulo 3.5.1.3.1. Ruta de estrés de retículo endoplásmico. Otro de los mecanismos que regula la proteostasis celular se encuentra relacionado con la activación de la respuesta frente a estrés en el retículo endoplasmático (RE). Un incremento de la demanda de proteínas que deben ser plegadas correctamente en el lumen del RE como, por ejemplo, ante un aumento de la función secretora o la exposición a un compuesto tóxico, provoca la acumulación de proteínas no procesadas en el RE. Esta situación conlleva a un estrés en este orgánulo, el cual activa una respuesta llamada UPRRE (unfolded protein response o respuesta a Resultados 83 proteínas mal plegadas) (Ron & Walter, 2007). La activación de esta respuesta da lugar a la inducción de proteínas reguladoras, entre las cuales se encuentran miembros de la familia de las HSPs (heat shock proteins) de retículo, encargadas de restablecer la homeostasis en el ER (Prahlad & Morimoto, 2009). Para comprobar si en mutantes gsr-1(m+,z-) existe una alteración de la respuesta a estrés proteotóxico a nivel de RE, empleamos una estirpe que porta el transgén zcIs4[Phsp-4::gfp] y que expresa la GFP bajo el control del promotor del gen hsp-4 (Calfon et al, 2002). HSP- 4 es el ortólogo en C. elegans de la chaperona BiP de mamífero, responsable de la inducción de la UPRRE, ya que detecta y se une a proteínas mal plegadas en el RE, desencadenando la activación de este mecanismo protector. El transgén zcIs4[Phsp- 4::gfp] funciona como un reportero transcripcional, el cual permite la cuantificación mediante fluorescencia debida a la expresión de GFP, una vez que la UPRRE es inducida. Cuando expresamos el reportero Phsp-4::gfp en animales gsr-1(m+,z-) observamos que la falta de GSR-1 no causó inducción del marcador en condiciones basales. Por el contrario, cuando provocamos estrés en el RE mediante el tratamiento con tunicamicina, fármaco que inhibe la glicosilación y causa la activación de la UPRRE (Glover-Cutter et al, 2013), los animales gsr-1(m+,z-) tratados con tunicamicina sí mostraron una ligera menor inducción del reportero HSP-4::GFP (Figura 3.19), indicando un cierto efecto de la mutación gsr-1 en la respuesta al estrés de RE. Figura 3.19. Efecto de la mutación gsr-1 en la inducción del reportero Phsp-4::gfp. La mutación gsr-1(m+,z-) no causa ningún efecto sobre la inducción de Phsp-4::gfp en condiciones normales de crecimiento. La activación de la UPRER mediante el tratamiento con tunicamicina (30µg/mL) provoca una menor inducción en el reportero en animales gsr-1(m+,z-). Los datos corresponden con la media de dos experimentos independientes (n=30 por ensayo y estirpe). La barra de error indica el error estándar de la media (SEM). *p<0.1, usando t-test de dos colas. Resultados 90 Durante la embriogénesis de C. elegans, una variedad de sustratos son degradados por autofagia. Entre estos sustratos se encuentra SQST-1, homologo de la proteína p62/SQSTM1 en mamíferos, el cual es expresado muy débilmente y con una localización difusa en el citoplasma en embriones y larvas de animales silvestres (Zhang et al, 2015) . El bloqueo de la autofagia conlleva la formación de un gran número de agregados de SQST-1 en células intestinales de embriones y larvas, de forma que su cuantificación puede ser utilizada para la monitorización de la función autofágica (Zhang et al, 2015). Así, para respaldar los resultados obtenidos con el reportero HLH-30::GFP, decidimos evaluar la efectividad de la autofagia ante la falta de GSR-1 mediante la utilización del reportero SQST-1::GFP expresado por desde el transgén bpIs151[Psqst-1::sqst-1::gfp; unc-76(+)] (Tian et al, 2010). Como se muestra en la gráfica de la Figura 3.24, los embriones gsr-1(m+,z-) no mostraron acumulación de SQST-1::GFP cuando sus progenitores fueron crecidos en presencia de comida, indicando que la autofagia basal ocurre de forma normal. Por el contrario, los embriones gsr-1(m+,z-) que provenían de progenitores que habían sido sometidos a ayuno durante 24 horas, mostraron una gran inducción de SQST-1::GFP, comparados con embriones procedentes de progenitores silvestres igualmente sometidos a ayuno (Figura 3.24), lo que confirma que la inducción de la autofagia frente al estrés por falta de alimento está comprometido en mutantes gsr-1(m+,z-). Resultados 91 Figura 3.24. Efecto de la mutación gsr-1(m+,z-) en la acumulación de SQST-1::GFP en embriones de C. elegans. La mutación gsr-1(m+,z-) incrementa la acumulación SQST-1::GFP en embriones cuyos progenitores han estado sometidos a ayuno durante 24 horas. Los datos corresponden con la media de tres experimentos independientes (n=50 embriones por ensayo y estirpe). La barra de error indica el error estándar de la media (SEM). ****p<0.0001, usando t-test de dos colas. Las imágenes, realizadas en campo claro y fluorescencia, muestran ejemplos representativos de los embriones expresando SQST-1::GFP generados por progenitores expuestos a ayuno por 24 horas (barra de escala 20µm). Nota: en la imagen de los embriones sqst-1::gfp; gsr-1(m+,z-) aparecen también animales con el balanceador qC1::rfp (identificados por fluorescencia anaranjada). Esto es debido a que la población de embriones procede de progenitores balanceados, por lo que la muestra visualizada contiene tanto embriones con el balanceador, como embriones gsr-1(m+,z-) sin balanceador. No obstante, la cuantificación se realizó únicamente con aquellos embriones que no portaban el balanceador. Durante la autofagia, una porción del citoplasma es envuelto por una doble membrana dando lugar al autofagosoma (AP). A continuación, el autofagosoma se fusiona con el lisosoma, formándose el autolisosoma (AL), y es cuando tiene lugar la degradación de su contenido por las hidrolasas lisosomales (Parzych & Klionsky, 2014). En este proceso, la proteína LC3/LGG-1 facilita el crecimiento del autofagosoma a la vez que es incorporada en su membrana (Chapin et al, 2015). En nematodos se ha descrito que el silenciamiento del gen lgg-1 mediante ARNi causa una reducción en el nivel de la autofagia (Samokhvalov et al, 2008; Zhang et al, 2009). Para demostrar si GSR-1 también regula la autofagia en ausencia de estrés, decidimos comprobar si existía acumulación de SQST-1::GFP en animales gsr- 1(m+,z-) ante una disminución de la capacidad autofágica basal debida a la reducción de la expresión de lgg-1. Los resultados obtenidos indican que el silenciamiento del gen lgg-1 causó un fuerte incremento de la acumulación de SQST-1::GFP en las larvas L1 de los animales gsr-1(m+,z-), en comparación con los individuos control (Figura 3.25). Resultados 92 Figura 3.25. Acumulación del reportero SQST-1::GFP en mutantes gsr1(m+,z-) sometidos a ARNi de lgg-1. La mutación gsr-1(m+,z-) incrementa la acumulación de SQST-1::GFP en larvas crecidas en ARNi de lgg-1. Los datos corresponden con la media de tres experimentos independientes (n=50 embriones por ensayo y estirpe). La barra de error indica el error estándar de la media (SEM). **p<0.01, usando t-test de dos colas. Las imágenes, realizadas en DIC y fluorescencia, muestran ejemplos representativos de larvas expresando SQST-1::GFP (barra de escala 50µm). Nota: en la imagen de las larvas sqst-1::gfp; gsr- 1(m+,z-) aparecen también animales con el balanceador qC1::rfp (identificados por faringe con fluorescencia anaranjada). Debido a la dificultad técnica de seleccionar únicamente larvas L1 no balanceadas gsr-1(m+,z-), las larvas fueron recogidas al azar para su visualización al microscopio, de forma que se seleccionaron larvas con y sin el balanceador, no obstante, la cuantificación se realizó únicamente con aquellas larvas que no portaban el balanceador. Ambos resultados con el reportero SQST-1::GFP indican que la mutación gsr-1 no causa un bloqueo total de la autofagia, ya que en los individuos gsr-1(m+,z-) no se observa agregación de este reportero cuando son crecidos en condiciones sin estrés o cuando la autofagia basal no está comprometida. Sin embargo, en animales gsr- 1(m+,z-) la inducción de la autofagia es mucho menos eficiente en condiciones de ayuno o cuando ésta se compromete por silenciamiento de lgg-1. 3.5.3. Reproducción del impacto de la mutación gsr-1 en la agregación de proteínas mediante el bloqueo genético de la autofagia. Nuestros datos sugieren una deficiencia del mecanismo de autofagia en los mutantes gsr-1(m+,z-), que explicaría por qué en estos animales se potencian los fenotipos deletéreos en los modelos de proteostasis. Esto nos hizo plantearnos si el bloqueo de la autofagia reproduciría el empeoramiento de los fenotipos asociados a la agregación de proteínas en dichos modelos, de igual modo que ocurre en mutantes gsr-1(m+,z-). Aunque ya existen estudios previos que describen el efecto de la inhibición de la autofagia en los fenotipos derivados de la expresión de Ab, a-SYN y poliQ, estos fueron realizados mediante ensayos con ARNi (Jia et al, 2007; Hamamichi et al, 2008; Florez-McClure et al, 2007) pero no con mutantes de dicha ruta degradativa. Además, no hemos encontrado evidencia del papel de la autofagia sobre los fenotipos de los mutantes unc-52 y let-60. Decidimos por tanto investigar la implicación de la autofagia en los modelos de proteostasis mediante el bloqueo de la autofagia de forma genética empleando animales con la mutación atg-3(bp412), la cual impide la elongación de los autofagosomas (Tian et al, 2010). Resultados 93 En primer lugar, expresamos el péptido Ab en células musculares de animales atg- 3(bp412) mediante el transgén dvIs2 [Punc-54::A b 3-42::unc-54 3´-UTR], que como se describió anteriormente, causa un fenotipo de parálisis a 20ºC. El bloqueo de la autofagia provocó un incremento de la parálisis a la temperatura permisiva de 16ºC en los individuos que expresaron Ab (Figura 3.26a). De forma similar, evaluamos el efecto de la mutación atg-3(bp412) en animales que portan el transgén baIn12[Punc-54::a-synuclein::gfp] y que sufren parálisis a lo largo del envejecimiento por expresión de a-SYN::GFP en células musculares de C. elegans (Hamamichi et al, 2008). Comprobamos que la mutación atg-3(bp412) también causa una parálisis mucho más temprana en los animales baIn12 (Figura 3.26b). Además, también cuantificamos una mayor agregación de Q40::YFP en células musculares, expresado desde el transgén rmIs133 [Punc-54:Q40::yfp], en los mutantes atg-3(bp412) (Figura 3.26c). Figura 3.26. Efecto de la mutación atg-3(bp412) en C. elegans que expresan A b , a -SYN::GFP y Q40::YFP en células musculares. La mutación atg-3(bp412) incrementa el fenotipo de parálisis en animales que expresan el péptido Ab (a) y a-sinucleina::GFP (b) en células musculares. Los datos corresponden a la media de tres experimentos independientes (n=25 por ensayo y estirpe). La barra de error indica el error estándar de la media (SEM). ****p<0.0001, mediante el test log-rank (Mantel-Cox). c) La mutación atg-3(bp412) causa un aumento del número de agregados de Q40::YFP, cuantificados a día 3 tras la puesta sincronizada. Los datos corresponden con la media de tres experimentos independientes (n=18 por ensayo y estirpe). La barra de error indica el error estándar de la media (SEM). ***p<0.001, usando t-test de dos colas. Con todos estos resultados pudimos confirmar la relación de la autofagia con los fenotipos de agregación de proteínas en los modelos humanizados de Alzheimer, Parkinson y enfermedades de poliglutaminas descritas anteriormente. Además, comprobamos como el bloqueo de la autofagia en estos tres modelos reprodujo el Resultados 94 empeoramiento de los fenotipos asociados a la agregación de proteínas de igual forma que hemos visto ante la falta de GSR-1. Como ya comentamos anteriormente, no se ha descrito que exista implicación de la autofagia sobre los fenotipos de los mutantes termosensibles unc-52(e669su250) o let-60(ga89), por lo que decidimos bloquear la autofagia en estos animales mediante la mutación atg-3(bp412) y comprobar su efecto a temperatura permisiva. Al igual que en los mutantes gsr-1(m+,z-), la mutación atg-3(bp412) incrementó la parálisis de los animales unc-52(e669su250) crecidos a temperatura permisiva de 16ºC (Figura 3.27a). Además, bloqueando parcialmente la autofagia mediante ARNi de lgg- 1, obtuvimos resultados similares, con un incremento significativo de la parálisis de los mutantes unc-52(e669su250) con respecto al ARNi control (Figura 3.27b). Figura 3.27. Efecto de la mutación atg-3(bp412) y el silenciamiento por ARNi de lgg-1 en C. elegans que expresan la proteína mestaestable UNC-52. (a) La mutación atg-3(bp412) incrementa el fenotipo de parálisis de animales unc-52(e699su250) cuando son crecidos a la temperatura permisiva de 16ºC. Los datos corresponden con la media de tres experimentos independientes (n=50 por ensayo y estirpe). La barra de error indica el error estándar de la media (SEM). ****p<0.0001, mediante el test log-rank (Mantel- Cox). b) El silenciamiento mediante ARNi de lgg-1 causa una parálisis más temprana en los animales unc- 52(e699su250) crecidos a 16ºC. Los datos corresponden con la media de tres experimentos independientes (n=50 por ensayo y estirpe). La barra de error indica el error estándar de la media (SEM). ****p<0.0001, mediante el test log-rank (Mantel-Cox). Por otro lado, debido a que las mutaciones atg-3(bp412) y let-60(ga89) se encuentran localizadas muy cerca entre sí en el cromosoma IV, lo que dificulta la obtención de este doble mutante, decidimos emplear ARNi de atg-3 y lgg-1 para comprobar el efecto de la deficiencia en la autofagia en el fenotipo de arresto embrionario de los animales let-60. Sin embargo, a diferencia que con los mutantes unc-52, los ensayos Resultados 95 con ARNi no mostraron un incremento significativo de la letalidad embrionaria de los animales let-60 (Figura 3.28). Figura 3.28. Efecto del silenciamiento mediante ARNi de atg-3 y lgg-1 en C. elegans que expresan la proteína mestaestable LET-60. El ARNi de atg-3 (a) y lgg-1 (b) no incrementa el fenotipo de arresto embrionario en los animales let-60(ga89) cuando son crecidos a la temperatura permisiva de 16ºC. Los datos corresponden con la media de tres experimentos independientes (n ³ 100 animales/embriones por ensayo y estirpe). La barra de error indica el error estándar de la media (SEM). En su conjunto, nuestros datos indican que UNC-52, al igual las proteínas Ab, a-SYN y poliQ::YFP, también es degradada por autofagia y que el bloqueo de este mecanismo degradativo reproduce el empeoramiento de su fenotipo asociado de parálisis de igual forma que lo hace la mutación gsr-1(m+,z-). En cuanto a los animales que expresan LET-60, es posible que el ARNi no tenga un efecto sobre el fenotipo de letalidad embrionaria de estos animales, de igual modo que el ARNi en los animales que expresan UNC-52 no provoca una parálisis tan severa como la que provoca la mutación atg-3(bp412) (Figura 27b). Por lo tanto, con los ensayos de ARNi no podemos descartar que, al igual que en los modelos anteriores, exista una interacción entre el bloqueo de la autofagia mediante la mutación atg-3(bp412) y el el arresto embrionario de los animales let-60(ga89). 3.5.4. Efecto de la mutación gsr-1 en la saturación de la autofagia. Una posible consecuencia de la pérdida de homeostasis redox en los mutantes gsr- 1(m+,z-) podría ser el incremento de la concentración celular de proteínas oxidadas, la cuales son susceptibles de formar agregados. Este posible incremento de proteínas oxidadas contribuiría por tanto a aumentar la carga de proteínas a ser degradadas por autofagia en todos los modelos de proteostasis ensayados, la cual ya está de por si comprometida en los animales gsr-1(m+,z-), lo que podría llevar al colapso de este mecanismo degradativo. Resultados 96 Para comprobar esta hipótesis, decidimos introducir la mutación gsr-1 en animales cuya autofagia estuviese bloqueada mediante la mutación atg-3(bp412). En estos dobles mutantes atg-3(bp412); gsr-1(m+,z-) expresamos los diferentes modelos de agregación de proteínas con el objetivo de encontrar un efecto sinérgico de ambas mutaciones sobre los fenotipos relacionados con la pérdida de proteostasis por agregación proteica. Es decir, con estos ensayos aislaríamos el efecto del GSH sobre la autofagia (ya que está inactivada por la mutación atg-3) y nos centraríamos exclusivamente en su efecto sobre el incremento en la agregación. Primero intentamos expresar en los animales atg-3; gsr-1(m+,z-) el péptido Ab en células musculares a partir de los transgénes dvIs2 y dvIs14. Sin embargo, no fuimos capaces de aislar triples mutantes en ninguno de los dos casos, lo que podría sugerir una fuerte interacción deletérea entre ambas mutaciones en presencia de proteínas agregantes. En consonancia, aunque los animales atg-3; gsr-1(m+,z-) que expresaron a-SYN::GFP en células musculares fueron viables, se encontraban muy enfermos y un gran porcentaje de los animales presentaron eclosión interna de los embriones, lo que impidió la cuantificación de la agregación de esta proteína. Por el contrario, los animales atg-3; gsr-1(m+,z-) que expresaron Q40::YFP en células musculares mostraron el mismo nivel de agregación de Q40::YFP que los mutantes gsr-1(m+,z-) (Figura 3.29a), no observándose un efecto sinérgico entre ambas mutaciones en cuanto a número de agregados. Sin embargo, observamos que los animales atg-3; gsr-1/qC1::rfp presentaban un mayor arresto embrionario cuando expresaban Q40::YFP (Figura 3.29b). Finalmente, los dobles mutantes atg-3(bp412); gsr-1(m+,z-) que expresaron la proteína metaestable UNC-52, mostraron una parálisis similar a la observada en los animales gsr-1(m+,z-) y atg-3(bp412) (Figura 3.29c). Resultados 97 Figura 3.29. Fenotipos de los animales atg-3; gsr-1(m+,z-) expresando Q40::YFP y UNC-52. a) Las mutaciones atg-3 y gsr-1(m+,z-) aumentan la agregación de Q40::YFP en células musculares pero no hay un efecto sinérgico de ambas mutaciones. Los datos corresponden con la media de tres experimentos independientes (n=18 por ensayo y estirpe). La barra de error indica el error estándar de la media (SEM). ***p<0.001, ****p<0.0001, usando t-test de dos colas. b) Incremento de arresto embrionario en mutantes atg-3 y gsr-1(m+,z-) que expresan Q40::YFP en células musculares. Los datos corresponden con la media de tres experimentos independientes (n³150 por ensayo y estirpe). La barra de error indica el error estándar de la media (SEM). ***p<0.001, ****p<0.0001, usando t-test de dos colas. c) El doble mutante atg-3; gsr-1(m+,z-) no muestran mayor parálisis que los individuos atg-3 y gsr-1(m+,z-) cuando expresan UNC-52 a la temperatura permisiva de 16ºC. Los datos corresponden con la media de tres experimentos independientes (n=50 por ensayo y estirpe). La barra de error indica el error estándar de la media (SEM). ****p<0.0001, mediante el test log-rank (Mantel-Cox). Con todos estos ensayos comprobamos que la pérdida de proteostasis celular debida a la mutación gsr-1 puede llegar a comprometer la viabilidad de animales con la autofagia bloqueada, aunque no afecta de igual manera a todos los modelos de agregación. Otra estrategia que ideamos para corroborar si la mutación gsr-1 estaría incrementando la cantidad de proteínas a ser degradadas por autofagia, consistió en expresar de manera conjunta la proteína SQST-1::GFP, sustrato específicamente degradado por autofagia, junto con la proteína metaestable LET-60 o UNC-52 en un fondo gsr-1(m+,z-), con lo que aumentaría la carga de agregados a ser eliminados por autofagia. Aunque se ha descrito que SQST-1::GFP podría acumularse ante la presencia de otros agregados proteicos (Zhang et al, 2015), en nuestros ensayos no se observó agregación de SQST-1, ni ante la expresión de LET-60, ni de UNC-52 (datos no mostrados). Sin embargo, los animales let-60 que expresaron SQST-1::GFP Resultados 98 presentaron un incremento significativo en la letalidad embrionaria a la temperatura permisiva de 16ºC (Figura 3.30a). Además, no fue posible generar animales let-60 con la mutación gsr-1/qC1::gfp y que expresasen SQST-1::GFP, lo que indica una posible interacción letal. Por otro lado, la expresión conjunta de las proteínas SQST-1::GFP y UNC-52 en un fondo gsr-1(m+,z-), causó una parálisis mucho más temprana en comparación con la de los controles unc-52; gsr-1(m+ z-) y unc-52; sqst-1::gfp, respectivamente (Figura 3.30b). Figura 3.30. Fenotipos de animales que expresan de forma conjunta SQST-1::GFP y proteínas metaestables LET-60 y UNC-52. a) La expresión de la proteína SQST-1::GFP incrementa el fenotipo de arresto embrionario de los animales let-60(ga89). Los datos corresponden con la media de tres experimentos independientes (n³100 por ensayo y estirpe). La barra de error indica el error estándar de la media (SEM). *p<0.1, usando t-test de dos colas. b) La expresión conjunta de las proteínas SQST-1::GFP y UNC-52 provoca una mayor parálisis en animales gsr-1(m+,z-) a la temperatura permisiva de 16ºC. Los datos corresponden con la media de tres experimentos independientes (n=50 por ensayo y estirpe). La barra de error indica el error estándar de la media (SEM). ****p<0.0001, mediante el test log-rank (Mantel- Cox). En su conjunto, estos datos sugieren que existe una priorización por la degradación de SQST-1::GFP mediante autofagia, ya que no observamos agregación de este reportero ante la expresión conjunta las proteínas metaestables LET-60 o UNC-52. Sin embargo, la degradación de estas dos proteínas endógenas sí que se vio alterada por la expresión de SQST-1::GFP en un mutante gsr-1, generando un fuerte fenotipo de proteotoxicidad. Todos estos datos en su conjunto confirman que la autofagia en animales gsr-1(m+,z-) no es eficiente y que un aumento de la cantidad de proteínas aggregantes colapsa la vía de degradación autofágica. Resultados 99 3.5.5. Estudio del flujo autofágico. Para una mayor comprensión de cómo la falta de GSR-1 impacta en la autofagia, decidimos comprobar si el flujo autofágico en animales gsr-1(m+,z-) se encontraba alterado. Como se describió anteriormente, LGG-1 interviene en la expansión de los autofagosomas (APs) y queda incorporado a su membrana. Posteriormente los APs se fusionan con lisosomas dando lugar a la formación de autolisosomas (ALs). Para monitorizar el flujo autofágico en animales gsr-1(m+,z-), empleamos el reportero sqIs11[Plgg-1::mCherry::gfp::lgg-1; rol-6(su1006)] (Chang et al, 2017). Mediante este reportero es posible cuantificar tanto el número de APs como de ALs. Los APs son visualizados como puntos amarillos por la combinación de la fluorescencia de mCherry (rojo) y GFP (verde). La fusión de los APs con lisosomas crea un ambiente ácido que apaga la fluorescencia verde de la GFP, por lo que los ALs formados emiten sólo fluorescencia roja por parte de mCherry. Usando este reportero y cuantificando la cantidad de APs y ALs presentes en la faringe de los animales, encontramos que el flujo autofágico fue afectado por la mutación gsr-1, ya que se aumentó de forma significativa el número de APs, y se produjo una disminución del número de ALs (Figura 3.31). Figura 3.31. Efecto de la mutación gsr-1 en el flujo autofágico de C. elegans. Fotografías de fluorescencia representativas de la faringe expresando el reportero sqIs11[Plgg-1::mCherry::gfp::lgg-1; rol- 6(su1006)]. Las imágenes fueron tomadas en el primer dia de adulto (barra de escala 20µm). Los autofagosomas (AP) están marcados en amarillo y los autolisosomas (AL) marcados en rojo. La gráfica muestra la cuantificación de AP y AL, los datos son la media de tres experimentos independientes (n=12 animales por ensayo y estirpe). La barra de error indica el error estándar de la media (SEM). ***p<0.001, ****p<0.0001 usando ANOVA con múltiple comparación de Tukey con respecto a AP y AL del control. Resultados 106 3.6.2. Función del residuo de cisteína conservado de HLH-30. A la vista de los resultados in vitro con cultivos celulares sobre la importancia de los residuos C212 y C322 de TFEB y TFE3, respectivamente, en la formación de oligómeros y su función como estabilizadores de ambos factores de transcripción ante estreses prolongados, decidimos utilizar C. elegans para explorar la función fisiológica de la cisteína en el contexto in vivo de un organismo completo. Para determinar si HLH-30 también forma oligómeros y si éstos son dependientes de la única cisteína que posee esta proteína en posición 284 (C284), primeramente expresamos la proteína silvestre y otra versión con la cisteína mutada a alanina, ambas fusionadas a tres copias del epitopo FLAG [HLH-30(WT)-FLAG y HLH- 30(C284A)-FLAG, respectivamente], en células ARPE-19 de mamífero. Como se muestra en la figura 3.37, HLH-30 formó oligómeros, los cuales fueron totalmente dependientes de la C284 de igual forma que ocurre con TFEB y TFE3. Figura 3.37. Análisis por Western blot en condiciones no reductoras de lisados de células ARPE-19 sobrexpresando las proteínas de C. elegans HLH-30 silvestre o HLH-30(C284A) marcadas con el epitopo FLAG. La mutación de la cisteína 284 impide la formación de dímeros y oligómeros de HLH-30. Los asteriscos indican las bandas correspondientes a dímeros (*) y oligómeros (**).GAPDH empleado como control de carga. Martina et al, 2021. Para corroborar la capacidad de HLH-30 para formar oligómeros en el nematodo, generamos por CRISPR animales que expresan la proteína, tanto silvestre como con la cisteína mutada a alanina, desde el locus endógeno hlh-30 de C. elegans, y fusionada a un triple epitopo FLAG y a GFP (HLH-30::FLAG::GFP y HLH- 30(C284A)::FLAG::GFP). Estos animales fueron crecidos en condiciones normales o sometidos a ayuno, estrés que induce la translocación nuclear de HLH-30. En condiciones normales de crecimiento, el HLH-30 endógeno permaneció en forma mayormente monomérica, mientras que en los animales sometidos a ayuno, Resultados 107 aparecieron además las formas diméricas y oligoméricas, las cuales requieren del residuo C284 para su formación (Figura 3.38). Figura 3.38. Análisis por Western blot en condiciones no reductoras de lisados de C. elegans expresando las proteínas HLH-30::FLAG::GFP o HLH-30(C284A)::FLAG::GFP. En los animales sometidos a ayuno se produce oligomerización de HLH-30, la cual es dependiente de la cisteína 284. Los asteriscos indican las bandas correspondientes a dímeros (*) y oligómeros (**). GAPDH empleado como control de carga. (Martina et al, 2021). Estos resultados con HLH-30, junto con los anteriormente descritos en TFEB/TFE3, indican que la formación de oligómeros dependiente del único residuo de cisteína en estos factores de transcripción es un mecanismo conservado a lo largo de la evolución en metazoos. 3.6.3. Evaluación de la translocación nuclear de HLH-30. A continuación decidimos evaluar si la C284 es necesaria para la activación de HLH- 30. Para ello, animales que expresan una sola copia del reportero HLH- 30::FLAG::GFP o HLH-30(C284A)::FLAG::GFP fueron sometidos a diferentes estreses que inducen la translocación nuclear de HLH-30 . Clasificamos la localización subcelular del reportero dentro de tres categorías diferentes: 1) citoplasmática, con fluorescencia difusa en todo el animal; 2) nuclear débil, donde se observó localización nuclear en algunas células de la parte posterior del animal, pero no en la zona de la cabeza; y 3) nuclear fuerte, con una entrada nuclear robusta desde la zona de la cabeza hasta la parte posterior del animal (Figura 3.39). Resultados 108 Figura 3.39. Imágenes representativas de microscopía DIC y fluorescencia de la localización subcelular del reportero HLH-30::FLAG::GFP en C. elegans. En la distribución citoplasmática el reportero se encuentra difuso a lo largo de todo el cuerpo del animal; Nuclear débil es considerada cuando existe marcaje de GFP en núcleos de algunas células de la parte posterior de los animales pero no en células de la zona de la cabeza; Nuclear fuerte cuando el marcaje de GFP en núcleos celulares aparece a largo de todo el cuerpo del animal, incluyendo la zona de la cabeza. Las puntas de flecha indican la localización nuclear de HLH-30::FLAG::GFP. Las barras de escala son 200µm en las imágenes de DIC y 50µm en las de fluorescencia, amplificadas de los recuadros mostrados en las imágenes de DIC. Para observar la activación de HLH-30::FLAG::GFP y la posible implicación de la C284 en este proceso, sometimos a los animales a varios estreses como falta de alimento, choque térmico a 30ºC, infección por Staphylococcus aureus (S. aureus), estrés oxidativo por exposición a arsenito sódico (NaAsO2), depleción de GSH por DEM y exposición a levamisol, un agonista del receptor nicotínico de acetilcolina utilizado para paralizar C. elegans para su visualización al microscopio. El tratamiento con levamisol causó una localización nuclear instantánea del reportero HLH- 30::FLAG::GFP y se usó únicamente en el momento en el que los animales fueron montados para la visualización al microscopio. Para el resto de tratamientos se usó Resultados 109 azida sódica para paralizar a los animales (la cual no causa localización nuclear del reportero) y todos ellos provocaron una robusta entrada de HLH-30::FLAG::GFP en el núcleo tras una hora de incubación, la cual fue mantenida al cabo de 3 horas, a excepción de la exposición a DEM, donde el reportero retornó a una localización mayoritariamente citoplasmática (Figura 3.40). Este dato apoya los resultados previos que muestran que la homeostasis del glutatión es clave para la translocación nuclear de HLH-30 ante determinados estreses (Figura 3.22). Por otro lado, el reportero HLH-30(C284A)::FLAG::GFP muestran un patrón similar de localización nuclear al del reportero silvestre en todos estreses ensayados. Este resultado indica que, al igual que lo observado con TFEB/ TFE3 en células de mamífero, la C284 no es requerida para la translocación nuclear de HLH-30 en C. elegans. Figura 3.40. Cuantificación de la distribución subcelular de los reporteros HLH-30::FLAG::GFP y HLH-30(C284)::FLAG::GFP tras el tratamiento de C. elegans con varios estímulos. La translocación al núcleo del reportero HLH-30::FLAG::GFP en presencia de diferentes estreses no varía por la mutación C284A. La localización nuclear es mantenida en todos los tratamientos a excepción de cuando los animales son expuestos a 3 mM DEM, donde la mayor parte del reportero vuelva a presentar una localización citoplasmática a las tres horas de exposición al tratamiento. Los datos corresponden con la media de tres experimentos independientes (n=50 por ensayo y estirpe). Resultados 110 3.6.4. Estudio del papel fisiológico de la cisteína 284 de HLH-30. HLH-30 interviene en la regulación de varios procesos fisiológicos en C. elegans como son la longevidad, formación de dauer o resistencia a estrés oxidativo y patógenos (Lapierre et al, 2013; Lin et al, 2018; Chen et al, 2017b; Visvikis et al, 2014). Decidimos entonces investigar si la C284 era esencial para la función de HLH- 30 ante situaciones de estrés. Para ello, generamos por CRISPR la estirpe hlh- 30(syb1623 [Cys284Ala]), que expresa la forma mutada de HLH-30(C284A) desde el locus endógeno. Esta estirpe nos permitía evaluar la funcionalidad de HLH- 30(C284A) por comparación con fenotipos que presentan los animales silvestres y aquellos con la deleción hlh-30(tm1978) que es un alelo nulo de hlh-30 (Grove et al, 2009). En primer lugar, ya que HLH-30 ha sido descrito como un factor fundamental para la longevidad de C. elegans (Lapierre et al, 2013), decidimos evaluar si los animales que expresan HLH-30(C284A) presentan alteración de este fenotipo. Sin embargo, la mutación C284 no causó reducción en la longevidad en comparación con los animales silvestres (Figura 3.41a), fenotipo muy patente en el mutante nulo hlh- 30(tm1978). A continuación, ensayamos si la supervivencia a estrés oxidativo era dependiente de la C284, para lo cual tratamos a los animales con NaAsO2 7.5 mM. La figura 3.41b muestra que la resistencia a este tratamiento depende de HLH-30 ya que mutantes nulos hlh-30(tm1978) mueren aproximadamente a las 16 horas mientras que el silvestre y el animal hlh-30(C284A) sobrevivieron de forma similar, lo que nos permite concluir que la C284 no parece ser esencial para la supervivencia a NaAsO2. Finalmente, ya que HLH-30 interviene en la resistencia de C. elegans a patógenos (Visvikis et al, 2014), evaluamos la supervivencia de los animales que expresan HLH- 30(C284A) a la infección por Staphylococcus aureus. En este caso, al contrario de lo que encontramos en los ensayos de longevidad y tratamiento con NaAsO2, la C284 si fue necesaria para una resistencia completa de los animales a la infección por este patógeno (Figura 3.41c). Resultados 111 Figura 3.41. Evaluación del papel fisiológico del residuo de cisteína 284 de HLH-30. Ensayos in vivo de C. elegans expresando HLH-30(C284A). a) Los animales mutantes hlh-30(tm1978) son menos longevos en comparación con los silvestres y este fenotipo no es dependiente de la C284. El ensayo fue llevado a cabo a 25ºC. La gráfica representa una curva de supervivencia Kaplan-Meier de dos experimentos independientes (n=100 por ensayo y estirpe). **p<0.01, y ****p<0.0001 mediante el test logrank (Mantel-Cox) comparado con la estirpe wt como control. b) La supervivencia a 7.5mM de NaAsO2 no es dependiente de la C284. Los datos son la media de tres experimentos independientes (n=120 por ensayo y estirpe). ****p<0.0001, usando ANOVA con múltiple comparación de Tukey con respecto a la estirpe control wt. La barra de error indica el error estándar de la media (SEM). c) La supervivencia a la infección por S. aureus es parcialmente dependiente de la C284. Los datos corresponden a la media de tres experimentos independientes (n=100 por ensayo y estirpe). ****p<0.0001, usando ANOVA con múltiple comparación de Tukey con respecto a la estirpe control wt. La barra de error indica el error estándar de la media (SEM). 3.6.5. Papel de la C284 de HLH-30 durante el desarrollo. Los ensayos de longevidad y supervivencia a NaAsO2 y S. aureus fueron llevados a cabo con animales adultos, es decir, con un desarrollo completo en el que ya han tenido lugar todas las divisiones celulares en la línea somática (individuos postmitóticos). Para una mejor caracterización de la función de la C284 de HLH-30, decidimos estudiar si este residuo también jugaba un papel importante durante el desarrollo. Se ha descrito que en determinados mutantes que afectan al desarrollo de C. elegans a través de rutas de señalización diferentes, se induce la translocación nuclear de HLH-30. Ejemplo de ello son la inhibición de la ruta de la insulina/IGF-1 mediante la mutación del receptor de insulina daf-2 (Kenyon et al, 1993), la restricción calórica provocada por la mutación de eat-2 (Raizen et al, 1995), la inhibición del desarrollo de la línea germinal por la mutación en glp-1 (Arantes-Oliveira et al, 2002) o la disfunción mitocondrial debida a la mutación clk-1 (Ewbank et al, 1997), mutantes que todos ellos inducen una translocación al núcleo de HLH-30 de alrededor del 50% (Lapierre et al, 2013). Esto indica que estas mutaciones suponen un estímulo para la activación de HLH-30, lo cual nos proporciona un escenario idóneo para explorar el papel fisiológico de la C284 de HLH-30 durante el desarrollo del animal. Con este objetivo, decidimos estudiar el efecto de la C284 en la translocación nuclear de HLH- Resultados 112 30 durante el desarrollo larvario, y para ello, elegimos los fondos genéticos eat-2 y daf-2, ya que presentan fenotipos más fácilmente evaluables. Los mutantes eat-2(ad1116) se encuentran bajo restricción calórica permanente debido a que presentan una disminución en la frecuencia del bombeo faríngeo, lo que hace que la ingesta de alimento esté ralentizada (Raizen et al, 1995). Este estrés provoca la translocación nuclear de HLH-30 (Lapierre et al, 2013). Para evaluar si la C284 tiene efecto sobre la activación de este factor en respuesta a restricción calórica durante el desarrollo, primero estudiamos la translocación nuclear del reportero endógeno HLH-30::FLAG::GFP en animales mutantes eat-2(ad1116) (Raizen et al, 1995). Al igual que lo ya descrito en estudios previos, el reportero mostró una entrada nuclear de alrededor del 50%, la cual fue independiente de la C284 (Figura 3.42a). Como consecuencia de la menor ingesta de alimento, los mutantes eat-2 presentan menor tamaño y una apariencia mucho más clara (debido a la menor acumulación de grasa) que los animales silvestres, fenotipos que han sido asociados con una reducción en la señalización de mTOR (Bar et al, 2016). Con el objetivo de detectar algún fenotipo asociado a la expresión de HLH-30 en animales eat-2 que nos sirviese para el estudio del papel de la C284, generamos los dobles mutantes eat-2(ad1116); hlh-30(tm1978) y eat-2(ad1116); hlh-30(C284A). En estos animales observamos que la deleción del gen hlh-30 causó una disminución en el tamaño de los mutantes eat- 2(ad1116), fenotipo que también fue observado, aunque no de forma tan robusta, cuando la proteína HLH-30(C284A) es expresada en mutantes eat-2(ad1116) (Figura 3.42b). Estos resultados demuestran que la restricción calórica durante el desarrollo larvario activa HLH-30 de forma independiente de la C284, pero este residuo es requerido para una respuesta eficiente a este estrés. Resultados 113 Figura 3.42. Cuantificación de la distribución subcelular de los reporteros HLH-30::FLAG::GFP y HLH-30(C284)::FLAG::GFP y de los fenotipos de retraso en el desarrollo larvario en mutantes eat- 2(ad1116). a) La mutación eat-2(ad1116) induce la translocación al núcleo del reportero HLH- 30::FLAG::GFP, siendo ésta independiente de la mutación C284A. Los datos corresponden con la media de tres experimentos independientes (n=50 por ensayo y estirpe). b) El desarrollo de los animales eat- 2(ad1116) se ve afectado por la mutación hlh-30 y este fenotipo depende parcialmente de la C284. Los datos corresponden a la media de tres experimentos independientes (n=20 por ensayo y estirpe) La barra de error indica el error estándar de la media (SEM). ****p<0.0001, usando ANOVA con múltiple comparación de Tukey. Las imágenes de DIC muestran ejemplos representativos de cada genotipo. La barra de escala es 200µm. En respuesta a condiciones ambientales adversas, como son la alta densidad de población, la limitación de alimento o una temperatura elevada, C. elegans arresta de forma reversible en un estadio alternativo de resistencia llamado dauer (Cassada & Russell, 1975). Animales con la mutación en el receptor de la insulina daf-2 forman dauers de forma constitutiva en función de la temperatura, fenotipo que ha sido relacionado la función autofágica (Meléndez et al, 2003). Al igual que en los ensayos con el mutante eat-2(ad1116), confirmamos que en los mutantes daf-2(e1370) (Kenyon et al, 1993) existe entrada constitutiva del reportero endógeno HLH-30::FLAG::GFP, y observamos que dicha translocación no es dependiente de la C284 (Figura 3.43a). Se ha descrito que la mutación hlh-30(tm1978) incrementa la formación de dauer en animales mutantes daf-2(e1370) cuando son crecidos a 22.5ºC (Lin et al, 2018). Este fenotipo nos pareció útil para evaluar si la mutación en la C284 de HLH-30 tenía algún efecto en la formación de dauer en mutantes daf-2(e1370), por lo que, para explorar esta posibilidad, generamos los dobles mutantes daf-2(e1370); hlh-30(tm1978) y daf- Resultados 114 2(e1370); hlh-30(C284A). Como se observa en la Figura 3.43b, la formación de dauer de los mutantes daf-2(e1370) fue potenciada no solo por la deleción de hlh-30, sino también por la expresión de la proteína HLH-30(C284A). De forma adicional, decidimos investigar si HLH-30 es también requerido para la recuperación del estadio de dauer una vez que las condiciones ambientales vuelven a ser óptimas. Sorprendentemente, encontramos que HLH-30 es completamente esencial para la salida de dauer en animales daf-2(e1370), ya que las dauer daf- 2(e1370); hlh-30(tm1978) fueron incapaces de recuperarse tras 7 días de incubación a 20ºC en presencia de alimento (Figura 3.41c). Además, el residuo C284 también parece ser importante en este fenotipo, ya que las dauer daf-2(e1370) que expresaron la proteína HLH-30(C284A) tuvieron una recuperación considerablemente más lenta que las dauer daf-2(e1370) control (Figura 3.43c). Con todos estos resultados en su conjunto podemos concluir que, al igual que ante el estrés que supone la restricción calórica, la C284 no es esencial para la translocación nuclear de HLH-30 durante el desarrollo de los animales daf-2. Sin embargo, sí hemos demostrado que este residuo es requerido para una respuesta eficiente en la formación y recuperación del estadio de resistencia dauer. Resultados 115 Figura 3.43. Cuantificación de la distribución subcelular de los reporteros HLH-30::FLAG::GFP y HLH-30(C284)::FLAG::GFP y de los fenotipos relacionados con la formación y recuperación de dauer en animales mutantes daf-2(e1370). a) La mutación daf-2(e1370) induce la translocación al núcleo del reportero HLH-30::FLAG::GFP, siendo ésta independiente de la mutación C284A. Los datos corresponden con la media de tres experimentos independientes (n=50 por ensayo y estirpe). b) La mutación daf-2(e1370) provoca entrada en dauer a 22.5ºC, fenotipo potenciado por la mutación hlh- 30(tm1978) y hlh-30(C284A). Los datos corresponden a la media de tres experimentos independientes (n=20 por ensayo y estirpe). La barra de error indica el error estándar de la media (SEM). ****p<0.0001 y ****p<0.001 usando ANOVA con múltiple comparación de Tukey. c) La mutación hlh-30(1978) impide la recuperación de dauer de los mutantes daf-2(e1370), mientras que la mutación de la C284 retrasa dicha recuperación. Los datos corresponden a la media de tres experimentos independientes (n=20 por ensayo y estirpe) La barra de error indica el error estándar de la media (SEM). ****p<0.0001 usando ANOVA con múltiple comparación de Tukey con respecto al control daf-2(e1370). Discusión 122 El impacto sobre el desarrollo provocado por el DEM difiere del efecto que provoca la mutación gsr-1 en los modelos de agregación ensayados. Mientras que en los animales gsr-1(m+,z-) se potencian los fenotipos relacionados con la agregación de las proteínas expresadas (número de agregados, parálisis o letalidad embrionaria), el tratamiento con DEM afecta al desarrollo larvario. El DEM es un agente alquilante que ha sido tradicionalmente usado como depletor de GSH pero que recientes estudios han mostrado que también oxida grupos tiol de proteínas (Urban et al, 2017). Por tanto, es posible que el DEM cause una sobrecarga de proteínas endógenas oxidadas que añadirían estrés proteotóxico al ya de por sí provocado por la expresión de proteínas en los modelos de agregación empleados, llegando a impedir el desarrollo del animal. Otra posible explicación radica en las características propias de los mutantes gsr-1(m+,z-) usados en los ensayos, ya que el aporte materno podría enmascarar o disminuir el efecto deletéreo de la mutación en comparación con el tratamiento más potente del DEM. 4.2. La falta de GSR-1 tiene efecto sobre los mecanismos de regulación de la proteostasis. El mantenimiento de la proteostasis está regulado por diferentes mecanismos moleculares. Algunos de estos mecanismos interaccionan directamente con las proteínas para regular su síntesis, plegamiento, tráfico o degradación, mientras que otros actúan como reguladores de la proteostasis respondiendo a diferentes estreses proteotóxicos (Powers & Balch, 2013; Hoppe & Cohen, 2020; Balchin et al, 2016; Lindquist & Kelly, 2011). En este trabajo hemos querido investigar si el impacto de la pérdida de regulación redox del glutatión sobre la agregación de proteínas está relacionado con una deficiencia en la respuesta de alguno de los mecanismos de control de la proteostasis. Para ello, hemos utilizado diferentes reporteros involucrados en la regulación de la proteostasis, y así comprobar si la falta de GSR-1 (y por tanto de un aporte adecuado de GSH) causa una respuesta inadecuada o la deficiencia en la inducción ante un determinado estímulo. Hemos encontrado que el reportero de sod-3 se encuentra inducido ante la falta de GSR-1 en animales crecidos en condiciones normales (Figura 3.18). Este dato es Discusión 123 indicativo de que los animales gsr-1(m+,z-) se encuentran bajo estrés oxidativo crónico, ambiente que favorece la formación de agregados proteicos. Sin embargo, la inducción de este reportero no se ve alterada por el tratamiento con juglona, por lo que la mutación gsr-1 no parece mediar la respuesta a estrés oxidativo agudo (Figura 3.18). Por otro lado, la mutación gsr-1 sí afecta a la UPRRE. En situaciones basales, el RE se encuentra más oxidado que el citosol para dar lugar al plegamiento oxidativo de las proteínas, llevado a cabo por oxidorreductasas como las PDI (Perri et al, 2016). Ante estreses como el proteotóxico o el oxidativo, el RE se vuelve más reducido para favorecer la reducción e isomerización de enlaces aberrantes que se forman en las proteínas dentro de este orgánulo. Se ha demostrado que en células de mamífero, el GSH mantiene a las oxidorreductasas en su forma reducida para poder reparar la oxidación inadecuada de las proteínas (Jessop & Bulleid, 2004), lo que sugeriría que la falta de GSR-1 limitaría la capacidad de reparación de proteínas mal plegadas por parte de estas oxidorreductasas en el RE. En nuestros ensayos, el estrés oxidativo crónico en el que se encuentran los animales gsr-1(m+,z-) no parece desencadenar una respuesta de la UPRRE (Figura 3.19), por lo que, al menos en este orgánulo, la mutación gsr-1 no se encuentra provocando un estrés proteotóxico. Sin embargo, al inducir estrés proteotóxico en el RE mediante el tratamiento con tunicamicina, la respuesta de este mecanismo parece ser más deficiente en los animales gsr-1(m+,z- ) (Figura 3.19). El hecho de que ésta menor inducción de la UPRRE, aunque significativa, no sea muy dramática, nos ha llevado a descartar la idea de que el RE esté jugando un papel crucial en la agregación de proteínas ante la falta de GSR-1. Los animales gsr-1(m+,z-) también han mostrado tener la UPRmit inducida en condiciones basales. Como se ha comentado, en C. elegans, gsr-1 es un gen esencial que codifica dos isoformas diferentes de GSR-1, una localizada en el citosplasma y otra en la mitocondria. Mientras que la actividad de la GSR-1 citoplásmica es absolutamente requerida para el desarrollo embrionario, la proteína mitocondrial es dispensable bajo condiciones basales de crecimiento (Mora-Lorca et al, 2016). Sin embargo, los animales gsr-1(m+,z-) presentan fenotipos asociados a disfunción mitocondrial como fragmentación mitocondrial, inducción de la UPRmit y disminución de contenido de ADN mitocondrial (Mora-Lorca et al, 2016). En este Discusión 124 trabajo hemos confirmado cómo la mutación gsr-1 induce la UPRmit en condiciones basales. No obstante, la respuesta de este mecanismo protector no parece requerir la función de GSR-1 frente al estrés oxidativo provocado por el tratamiento con paraquat (Figura 3.20). Esta inducción de la UPRmit en animales gsr-1(m+,z-) en condiciones normales de crecimiento indica que, a diferencia que el RE, en la mitocondria sí se genera un estrés proteotóxico ante la no disponibilidad de GSH, pero que la respuesta en este orgánulo por parte de la UPR ante condiciones estresantes, al igual que en el RE, no es deficiente. El GSH es generado en el citoplasma y transportado al interior de la mitocondria, donde protege frente a ROS, compuestos xenobióticos y la oxidación de grupos tiol de las proteínas (Murphy, 2012). Es posible que sólo la falta de la isoforma de la GSR-1 mitocondrial, y consecuente pérdida de reciclaje de la forma GSSG en este orgánulo, sea la responsable de generar estrés mitocondrial. Para resolver esta cuestión y, tras concluir los ensayos incluidos en esta tesis doctoral, hemos comprobado cómo la mutación sólo de la isoforma mitocondrial GSR-1a, no induce la UPRmit. Estos datos, junto con los descritos anteriormente, que muestran que la falta de la isoforma mitocondrial GSR-1a no incrementa la agregación de los modelos Q40::YFP y UNC-52, descartarían que la no disponibilidad de GSH únicamente en la mitocondria, sea la responsable de la alteración de la proteostasis en el citoplasma de los animales gsr-1(m+,z-). 4.3. La pérdida de regulación redox debida a la mutación gsr-1 impacta principalmente sobre la autofagia. Sin duda, el fenotipo más interesante que hemos encontrado en la búsqueda de un mecanismo protector de la proteostasis alterado, ha sido comprobar cómo la activación del reportero HLH-30::GFP se ve afectada en los animales gsr-1(m+,z-). El factor de transcripción HLH-30, ortólogo a los factores de transcripción TFEB y TFE3 de mamíferos, es un regulador de la autofagia que se encuentra fosforilado e inactivo en el citoplasma en condiciones basales. En presencia de distintos tipos de estreses, HLH-30/TFEB transloca al núcleo para inducir una serie de genes relacionados con la autofagia y la función lisosomal (O’Rourke & Ruvkun, 2013; Martina et al, 2012; Lapierre et al, 2013). Discusión 125 El estrés oxidativo es uno de los estreses que desencadenan la respuesta autofágica a través de la activación de TFEB/HLH-30 (Martina & Puertollano, 2018; Lin et al, 2018). El hecho de que la inducción del reportero de sod-3 en animales gsr-1(m+,z-) (Figura 3.18) y por tanto, el indicio de que estos mutantes presentan estrés oxidativo crónico, haría suponer que en estos animales, el reportero HLH-30::GFP se acumulase en el núcleo como consecuencia de la respuesta autofágica a dicho estrés. Sin embargo, HLH-30::GFP se encuentra inactivo y con una distribución difusa en el citoplasma en mutantes gsr-1(m+,z-) (Figura 3.22), por lo que la falta de GSH (al menos la generada por la falta de GSR-1) no supone un estrés suficiente para inducir una respuesta autofágica. En mamíferos, los factores de transcripción TFEB y TFE3 se encuentran regulados por la quinasa mTOR (Roczniak-Ferguson et al, 2012). En ausencia de nutrientes, mTOR se inactiva y deja de fosforilar a TFEB y TFE3 que son activados, translocando al núcleo donde inducen la transcripción de genes necesarios para el proceso autofágico. Estos factores también son activados por otros estreses de forma independiente a la inactivación de mTOR (Martina & Puertollano, 2018). En nuestros ensayos, cuando los animales se enfrentan a un estrés térmico, el reportero HLH- 30::GFP transloca al núcleo tanto en animales silvestres como mutantes gsr-1(m+,z- ) (Figura 3.22). Sin embargo, la mutación gsr-1 impide la translocación nuclear de HLH-30::GFP cuando los animales son sometidos a estrés por ayuno (Figura 3.22). Dado que la falta de nutrientes conlleva a la inactivación de la quinasa TOR y consecuente acumulación nuclear de TFEB, nuestros datos sugieren que la falta de GSH en los animales gsr-1(m+,z-) podría estar impidiendo la translocación nuclear de HLH-30::GFP, debido a una deficiente regulación vía LET-363 (el homólogo en C. elegans de mTOR). Si al igual que ocurre en mamíferos, en C. elegans la inducción de este factor puede ocurrir de forma independiente a la inactivación de mTOR, esto podría explicar el hecho de que en animales gsr-1(m+,z-) sometidos a estrés térmico ocurra la translocación nuclear de HLH-30::GFP. El reportero SQST-1::GFP, proteína homóloga de p62/SQSM1 en mamíferos, ha sido ampliamente empleada para la monitorización de la autofagia en C. elegans, acumulándose en embriones y larvas cuando la autofagia es bloqueada (Zhang et al, 2015). En mamífero, p62/SQSM1 media la degradación de proteínas Discusión 126 poliubiquitinadas sirviendo como enlace entre éstas y la proteína LC3, ortólogo de LGG-1 en C. elegans, la cual se encuentra enriquecida en la membrana de los autofagosomas, interviniendo en su expansión y terminación (Bjørkøy et al, 2005; Tian et al, 2010; Palmisano & Meléndez, 2016; Zhang et al, 2009). Se ha descrito que la acumulación del reportero SQST-1::GFP en mutantes hipomórficos de autofagia puede ser revertida por la inducción de la autofagia mediante el ayuno o la inactivación de LET-363 (Guo et al, 2014; Lin et al, 2013; Zhang et al, 2015; Tian et al, 2010). En los animales gsr-1(m+,z-) crecidos en ausencia de estrés, no se observa agregación de SQST-1::GFP, lo que indica que la mutación gsr-1 no se encuentra bloqueando la autofagia en condiciones basales. Al someter a estos animales a ayuno, observamos cómo los embriones gsr-1(m+,z-) acumulan gran cantidad de agregados de esta proteína (Figura 3.24). Este resultado hace llamativo el hecho de que sea la falta de alimento la condición que provoque una fuerte agregación de SQST-1::GFP en los embriones gsr-1(m+,z-), cuando es precisamente la inducción de la autofagia por ayuno el estímulo que revierte su acumulación. La inducción de la autofagia por ayuno viene dada por la necesidad a aporte de nutrientes a las células (Yorimitsu & Klionsky, 2005; Parzych & Klionsky, 2014). En esta situación, la quinasa LET-363/TOR queda inactivada permitiendo la translocación nuclear de HLH-30 (Lapierre et al, 2013). Sin embargo, en los animales gsr-1(m+,z-) no observamos entrada en núcleo del reportero HLH-30::GFP por ayuno (Figura 3.22), lo que sugeriría, como se comentó anteriormente, que la falta de GSH está alterando la respuesta autofágica vía señalización LET-363/mTOR. Este escenario podría ser la explicación a la acumulación de SQST-1::GFP en embriones gsr-1(m+,z-), en los cuales, una falta de respuesta autofágica ante el estímulo del ayuno, conllevaría su acumulación. Reduciendo la actividad de la autofagia mediante ARNi de lgg-1, la mutación gsr-1 potencia la acumulación de SQST-1::GFP en larvas (Figura 3.25). Este efecto sinérgico entre la mutación gsr-1 y la autofagia nos deja dos posibilidades no excluyentes. Una de ellas es que, como sugieren los ensayos anteriores, la falta de GSR-1 esté impactando directamente sobre la autofagia. En situaciones basales, este efecto inhibitorio de la mutación gsr-1(m+,z-) sobre la autofagia no es suficiente para que estos animales muestren acumulación de SQST-1::GFP. Sin embargo, el Discusión 127 efecto conjunto con el ARNi de lgg-1, pondría de manifiesto una autofagia alterada y como consecuencia la acumulación de agregados SQST-1::GFP. Otra posibilidad puede ser que la acumulación de SQST-1::GFP sea potenciada por la pérdida de regulación redox provocada por la mutación gsr-1, la cual genera la oxidación de proteínas celulares, incrementando asíla formación de agregados. De hecho, se ha descrito que la acumulación el reportero SQST-1::GFP puede incrementar debida a su unión a orgánulos dañados o agregados proteicos (Zhang et al, 2015). De este modo, al reducir la capacidad de degradación vía autofagia mediante ARNi de lgg-1, se incrementaría la concentración de proteínas oxidadas por la falta de GSH y la consecuente la acumulación de SQST-1::GFP. 4.3.1. La mutación gsr-1 podría incrementar la agregación de proteínas por supersaturación. Los datos generados en este trabajo apuntan a que la la mutación gsr-1 altera la función autofágica. Por otro lado, los animales gsr-1(m+,z-) presentan estrés oxidativo crónico, caracterizado por una mayor inducción del reportero de sod-3 (Figura 3.18) además de, como indican resultados previos del grupo, una mayor sensibilidad a compuestos generadores de EROs como son la juglona y el paraquat (Mora-Lorca et al, 2016). Este ambiente oxidante podría estar alterando la proteostasis celular de los animales gsr-1(m+,z-), por lo que no podríamos asignar los fenotipos potenciados que se muestran en los modelos de agregación únicamente al impacto de la mutación gsr-1 sobre la autofagia. El bloqueo de la autofagia mediante la mutación atg-3 en diversos modelos de agregación de proteínas nos ha confirmado que las proteínas Q40::YFP, Ab, a-SYN y UNC-52, son degradadas vía autofagia, ya que los fenotipos asociados a la expresión de estas proteínas ha sido potenciado en los animales atg-3 (Figura 3.26). Esto podría añadir un argumento adicional por el que la mutación gsr-1 esté afectando a la autofagia, ya que en estos modelos el efecto del bloqueo de la autofagia mediante la mutación atg-3 es similar al que ocurre por la mutación gsr-1. No obstante, nuestros resultados empleando el reportero SQST-1::GFP (Figuras 3.24 y 3.25) nos indican que la falta de GSR-1 está haciendo menos eficiente la autofagia, pero no provocando su bloqueo completamente. Discusión 128 La generación de dobles mutantes atg-3; gsr-1(m+,z-) nos ha permitido aislar el posible efecto de la mutación gsr-1 sobre la autofagia y así evaluar únicamente su efecto sobre la agregación de proteínas. La sobreexpresión de las proteínas poliQ, Ab y a-SYN en animales atg-3; gsr-1(m+,z-) provoca efectos deletéreos graves, demostrando que la pérdida de homeostasis redox debida a la mutación gsr-1 conlleva un claro aumento de estrés proteotóxico. En este escenario, al bloqueo de la autofagia se le sumaría el ambiente oxidante que impactaría negativamente sobre las proteínas tanto sobreexpresadas como endógenas, lo cual incrementaría la carga de proteínas mal plegadas, creando un nivel de proteotoxicidad superior con respecto al generado cuando únicamente se inactiva la autofagia. El fenotipo que presentan los animales atg-3; gsr-1(m+,z-) que sobreexpresan las proteínas poliQ, Ab y a-SYN puede ser explicado por un efecto conocido como supersaturación (Hofrichter et al, 1976), en el que proteínas pueden convertirse en metaestables cuando su concentración en la célula excede un valor crítico, llegando a perder su solubilidad (Ciryam et al, 2015). Este fenómeno ha sido descrito que ocurre, entre otras, con las proteínas poliQ, Ab y a-SYN, y conlleva a la agregación y coagregación de diferentes proteínas, siendo potenciado durante el estrés y el envejecimiento, cuando los mecanismos de control de la homeostasis proteica son menos eficientes (Kundra et al, 2017; Baldwin et al, 2011; Ciryam et al, 2013, 2015). Por lo tanto, el efecto de la mutación atg-3 sobre los modelos de poliQ, Ab y a-SYN, donde se potencian los fenotipos relacionados con su agregación (Figura 3.26), podría explicarse por una supersaturación de estas proteínas. En esta situación, el bloqueo de la autofagia por la mutación atg-3 permitiría la acumulación de estas proteínas sobreexpresadas, llegando a la supersaturación y, por consiguiente, la pérdida de su solubilidad y agregación. Esto podría explicar también que la mutación gsr-1 provocase un efecto similar a la mutación atg-3. No obstante, hay que destacar que las proteínas poliQ, Ab y a-SYN no presentan ninguna cisteína en su secuencia, por lo que su agregación no puede estar mediada directamente por la formación de puentes disulfuro. La función autofágica deficiente en los animales gsr-1(m+,z-) causaría la acumulación de estas proteínas, reproduciendo los fenotipos debidos al bloqueo de la autofagia mediante atg-3, pero también, el ambiente oxidante debido a la la mutación gsr-1 llevaría a la oxidación de proteínas endógenas, que causaría una Discusión 129 cascada que culminaría con la agregación de otras proteínas (Dobson, 2003; Gidalevitz et al, 2006; Balch et al, 2008). Por otro lado, los animales atg-3; gsr-1(m+,z-) con la mutación unc-52 no presentan un fenotipo deletéreo sumatorio a diferencia de los modelos anteriores (Figura 3.29c). Esto puede ser debido a que la proteína metaestable UNC-52 se expresa de forma endógena desde el propio locus del gen unc-52, a diferencia de las proteínas poliQ, Ab y a-SYN, que son sobreexpresadas mediante transgenes. Este hecho no provocaría una saturación tan elevada de la proteína UNC-52, mostrando estos animales un fenotipo de parálisis similar al de los animales dobles mutantes controles unc-52; atg-3 y unc-52; gsr-1(m+,z-). Con esta idea hemos generado animales unc- 52 que expresan el sustrato de autofagia SQST-1::GFP, y así comprobar el efecto de la supersaturación en una proteína no sobreexpresada y endógena de C. elegans. Debido a que no hemos observado acumulación de SQST-1::GFP en ninguno de los estadios del desarrollo del animal, asumimos que la autofagia prioriza la degradación de esta proteína, lo que favorecería la acumulación de la proteína UNC-52 y la consecuente parálisis en los animales unc-52; sqst-1::gfp (Figura 3.30c). La aparición de esta parálisis es mucho más temprana en un triple mutante unc-52; sqst-1::gfp; gsr-1(m+,z-), indicando que en estos animales la agregación de UNC-52 es mucho más rápida y severa. Este fenotipo podría deberse, al igual que lo discutido en resultados anteriores, a una mayor agregación de esta proteína gracias al ambiente oxidante de los animales gsr-1(m+,z-), además de a la saturación del proceso autofágico, debida a la degradación constante de SQST-1::GFP en una autofagia poco eficiente por la mutación gsr-1, lo que impediría la eliminación de UNC-52. De hecho, el estudio del flujo autofágico de los animales unc-52; gsr-1(m+,z-) muestra que éste es deficiente (Figura 3.32), indicando que la degradación vía autofagia de los animales gsr-1(m+,z-) se encuentra alterada. La cuantificación de los autofagosomas y autolisomas nos ha permitido confirmar que el flujo autofágico se encuentra alterado en los animales gsr-1(m+,z-), los cuales presentan una disminución significativa de la cantidad de autolisosomas (Figura 3.31 y 3.32). Este efecto sobre el flujo autofágico podría ser debido a una alteración de la regulación de HLH-30 provocada por la mutación gsr-1. HLH-30/TFEB regula positivamente la expresión de genes relacionados con la autofagia, en concreto, Discusión 130 induce la biogénesis de autofagosomas y lisosomas, además de regular la fusión de ambos y el flujo autofágico (Palmieri et al, 2011; Settembre et al, 2011; Lapierre et al, 2013). La pérdida de homeostasis redox en los animales gsr-1(m+,z-), la cual afecta a la inducción de HLH-30, al menos ante ayuno, podría conllevar una menor expresión de los genes regulados por este factor de transcripción, afectando a varios niveles del mecanismo de autofagia. En concreto, debido a la disminución en el número de autolisosomas y acumulación de autofagosomas, la mutación gsr-1 parece estar afectando a la biogénesis de lisosomas y/o a la fusión de éstos con los autofagosomas. En este sentido, sería interesante y muy informativo realizar estudios de la expresión de los genes regulados por HLH-30 en un fondo gsr-1. 4.4. La regulación redox de la cisteina 284 de HLH-30 no afecta a la inducción de la autofagia. El impacto de la mutación gsr-1 sobre la autofagia parece recaer en la regulación redox del factor de transcripción HLH-30, cuya translocación nuclear ante la inducción por ayuno fue impedida por la falta de GSR-1 (Figura 3.22). La existencia de una sola cisteína en la secuencia de esta proteína en posición 284 (C284), y dado que modificaciones postraduccionales en residuos de cisteína afectan de forma directa a la regulación de una amplia variedad de factores de transcripción (Holmström & Finkel, 2014), nos ha llevado a investigar el papel de la cisteína 284 en la función de HLH-30. Primero hemos comprobado como la activación del reportero endógeno HLH- 30::GFP es independiente de la C284 (Figura 3.38), al igual que en sus ortólogos de mamíferos TFEB/ TFE3, cuya translocación nuclear es independiente de las C212 y C322, respectivamente. Sin embargo, la única cisteína presente en su secuencia es fundamental para la oligomerización de estos factores (Figuras 3.34 y 3.35), lo que parece que les confiere una mayor estabilidad y resistencia a la degradación ante estreses prolongados. La supervivencia a S. aureus de C. elegans es dependiente del único residuo C284 de HLH-30 (Figura 3.39c). Aunque la mutación en este residuo no conlleva la muerte tan prematura de los mutantes nulos hlh-30(tm1978), sí existe una menor resistencia Discusión 131 a la infección (Figura 3.39c), quizás debida a que la falta de oligomerización de HLH- 30 hace menos eficiente el mecanismo de inducción de la autofagia. La oligomerización de HLH-30 no parece ser necesaria durante el envejecimiento, ya que la mutación del resido C284 por alanina no modifica la longevidad (Figura 3.39a). Por otro lado, la C284 tampoco es esencial para la resistencia a NaAsO2 (Figura 3.39b). Ambos ensayos, longevidad y resistencia a arsenito, se han realizado en individuos adultos, por tanto, post-mitóticos, por lo que es posible que la regulación de HLH-30 vía la C284 tuviese mayor impacto durante el desarrollo. Para valorar esta idea empleamos mutantes que muestran fenotipos de desarrollo como mutantes eat-2, los cuales presentan un menor tamaño debido a que se encuentran sometidos a restricción calórica crónica y mutantes daf-2, que forman dauer cuando son crecidos a temperaturas no permisivas. Encontramos que la inactivación de hlh-30 en los mutantes eat-2 afecta al desarrollo larvario, dando lugar a animales con la mitad del tamaño que los individuos silvestres, fenotipo parcialmente dependiente de la C284 de HLH-30 (Figura 3.40b). De forma similar, eliminando HLH-30 en animales daf-2 crecidos a 22,5ºC se induce la formación de dauer y la mutación hlh-30(C284A) reproduce este fenotipo (Figura 3.41b). El papel de HLH-30 en la transcripción génica ha sido descrito mediante una respuesta coordinada con el factor de transcripción DAF-16/FOXO, importante regulador de la respuesta a estrés en C. elegans (Lin et al, 2018). Ante un estimulo dañino o ante una baja señalización por insulina como en los mutantes daf-2, ambos factores de transcripción interactúan y translocan al núcleo formando un complejo de alto peso molecular. Sin embargo, mientras DAF-16 induce la transcripción de genes que potencian la formación de dauer, HLH-30 lo hace de genes que previenen dauer (Lin et al, 2018). De este modo, suprimiendo la actividad de HLH-30 se potencia la formación de dauer en mutantes daf-2. Este mismo razonamiento es aplicable a la salida del estadio de dauer una vez los animales son expuestos a temperatura permisiva, donde la falta de actividad de HLH-30 impide que los mutantes daf-2 continúen con el desarrollo, efecto que parece ser parcialmente dependiente de la C284 (Figura 3.41c). Es posible que la mutación en este residuo conservado de cisteína y, por tanto, la falta de oligomerización, conlleve a una menor eficiencia en la regulación transcripcional por parte de HLH-30.