Activación antígeno específica de neutrófilos en pacientes con dermatitis alérgica de contacto al níquel producida por la implantación de aparatología multibrackets.

1 2 3 ÍNDICE. 1. RESUMEN……………………………………………………………………..9 2. INTRODUCCIÓN………………………………………….…………….......13 2.1. REACCIONES DE HIPERSENSIBILIDAD…………………..………... 13 2.2. LOS GRÁNULOS ……………………………………………..………... 22 2.2.1. Mediadores lipídicos…………………………………..….………... 25 2.2.2. Síntesis y secreción de las nuevas proteínas por los neutrófilos…... 25 2.3. ESTALLIDO RESPIRATORIO………………………………………… 26 2.3.1. Concepto…………………………………………………………… 26 2.3.2. Características del estallido respiratorio...……………………...…...28 2.3.2.1. Inducción del estallido respiratorio………………………..28 2.4. NEUTRÓFILOS Y ASMA………………………………………………..29 2.4.1. Receptores de IgE en neutrófilos humanos…..……………...……....30 2.4.2. Número y activación de neutrófilos en sangre periférica……….…..31 2.4.3. Número de neutrófilos en las vías aéreas de pacientes asmáticos en condiciones basales…………………………………...……..31 2.4.3.1. Esputo inducido …………………………………………...32 2.4.3.2. Lavado bronquial ………………………………………....32 2.4.3.3. Lavado broncoalveolar…………………………………….32 2.4.3.4. Biopsias bronquiales……………………………………....33 2.4.4. Neutrófilos en las vías aéreas de los deportistas………………….....33 2.4.5. Número de neutrófilos en las vías aéreas de los asmáticos después de una provocación bronquial……………………………………….….…34 2.4.6. Test de provocación inhalatoria bronquial alérgeno específica…….34 2.4.7. Test de provocación bronquial segmentario alérgeno específico…..35 2.4.8. Otros tests de provocación bronquiales………………………….…35 2.4.9. Mediadores neutrofílicos en enfermos asmáticos…………………..36 2.4.9.1. Degranulación y secreción……………….……………….36 2.4.9.2. Metaloproteasas…………………………………………..39 2.4.9.3. Elastasa.…………………………………………………..41 2.4.9.4. Lactoferrina……………………………………………....43 2.4.9.5. Mieloperoxidasa……………………………………….....45 2.4.9.6. Proteína catiónica de los eosinófilos (ECP)……………...46 4 2.4.9.7. Moléculas de adhesión…………………………………….47 2.4.9.8. Actividad quimiotáctica de los neutrófilos………...……...49 2.4.9.9. Neutrófilos normo-hipodensos…………………….……...50 2.4.9.10. Mediadores lipídicos……………………………………..50 2.4.9.11. Radicales tóxicos de oxígeno…………………………….52 2.4.9.12. Síntesis y secreción de nuevas proteínas por los neutrófilos………………………………………………………….54 2.4.9.13. Procesos intracelulares…………………………………...55 2.4.9.14. El neutrófilo como célula reguladora de la respuesta Inmune………………………………...……………………………58 2.5. INMUNIDAD INNATA………………………………………………………61 2.5.1. RECEPTORES CELULARES PARA EL RECONOCIMIENTO DEL PATRÓN DE LA INMUNIDAD INNATA…………………………66 2.5.1.1. Receptores del Tipo Toll...……….………………………..67 2.5.1.2. Receptores citosólicos para PAMP Y DAMP……………..71 2.5.1.3. Receptores del tipo NOD………………………………….72 2.6. CONSECUENCIAS SISTÉMICAS Y PATOLÓGICAS DE LAS RESPUESTAS INFLAMATORIAS AGUDAS…………………………..……….76 2.7. NETs…………………………………………………………………………...78 2.7.1. Agentes inductores de NETs.……….……….………………………82 2.8. ANTÍGENOS LEUCOCITARIOS HUMANOS……………………………...86 2.9. MOLÉCULAS CD…………………………………………………………….90 2.9.1. Moléculas CD80 y CD86…………………………………………....91 2.9.2. Receptores TCR……………………...……………………………...94 3. HIPÓTESIS Y OBJETIVOS……………………………………………….....96 3.1. HIPÓTESIS…………………………………………………………...96 3.2. OBJETIVOS…………………………………………………………..96 4. MATERIALES Y MÉTODOS……………………………………………......98 4.1. PACIENTES Y CONTROLES ……………………………………....98 4.2. TESTS EPICUTÁNEOS……………………………………………...98 4.3. REACTIVOS………………………………………………………...100 4.4. AISLAMIENTO CELULAR………………………………………...100 4.4.1. Obtención de células granulocíticas……………………….100 4.4.2. Purificación de neutrófilos y eliminación de 5 Los eosinófilos residuales……………………………...….102 4.4.3. Obtención de células mononucleares (linfocitos y monocitos)……………………………………………… 104 4.4.4. Purificación de linfocitos…………………………………...105 4.4.5. Cuantificación del número de células y determinación de la viabilidad celular ……………………………………106 4.5. ANÁLISIS DE PROLIFERACIÓN CELULAR MEDIANTE MARCAJE CON CARBOXIFLUORESCEIN DIACETATO SUCCINIMIDIL ESTER (CFSE)……………………………………………………………………107 4.6. DETERMINACIÓN DE LA PRODUCCIÓN DE TXA2……………107 4.7. DETERMINACIÓN DE LOS NIVELES DE ROS.………...………109 4.8. DETERMINACIÓN DE LA LIBERACIÓN DE ECP………………110 4.9. ANÁLISIS DE LA LIBERACIÓN DE IL-8………………………...110 4.10. ANÁLISIS DE LA HISTAMINA LIBERADA……………………110 4.11. ANÁLISIS DE LA EXPRESIÓN DE HDC INTRACELULAR MEDIANTE CITOMETRÍA DE FLUJO……………110 4.12. DETERMINACIÓN DE LOS NETS ……………………................111 4.13. DETERMINACIÓN DE LA INTERLEUKINA 1………………..112 4.14. CUANTIFICACIÓN DE NLRP3…………………………………..112 4.15. INHIBIDORES……………………………………………………..112 5. RESULTADOS Y DISCUSIÓN……………………………………………..114 5.1. ACTIVACIÓN DE LOS NEUTRÓFILOS. ANÁLISIS DE LA LIBERACIÓN DE UN MEDIADOR DE LIBERACIÓN RÁPIDA COMO LA HISTAMINA Y OTRO DE LIBERACIÓN LENTA COMO LA PROTEÍNA CATIONICA DE LOS EOSINÓFILOS (ECP)…………………………..114 5.1.1. Histamina……………………………………………………114 5.1.2. ECP………………………………………………………….119 5.1.3. NETs..……………………………………………………….121 5.2. ACTIVACIÓN DEL FACTOR NF-B Y ALGUNOS DE SUS EFECTOS…………………………………………………………..123 6 5.2.1. Activación del NF-B………………………………………123 5.2.1.1. Vía clásica…………………………………………125 5.2.1.2. Vía alternativa……………………………………..126 5.2.2. ROS………………………………………………………….132 5.2.3. IL-8.…………………………………………………………134 5.2.4. COX-2.……………………………………………………...136 5.3. ACTIVACIÓN DEL INFLAMASOMA……………….……………139 5.3.1. Formación de NLRP3……………………………………….139 5.3.2. Liberación de IL1-B………………………………………...141 5.4. EL NEUTRÓFILO COMO CÉLULA PRESETADORA DE ANTÍGENO……………………………………………………….150 6. CONCLUSIONES…………………………………………………………….153 7. BIBLIOGRAFÍA……………………………………………………………...155 8. ANEXO I (Dictamen favorable del comité ético)………..………………….175 7 ÍNDICE DE ACRÓNIMOS. Ac: Anticuerpo. Ag: Antígeno. A23187: Ionóforo cálcico A23187. AP-1: Factor nuclear AP-1. BAL: Lavado bronco alveolar. CPA: Célula Presentadora de Antígeno. CR1: Receptor del Complemento 1. CR3: Receptor del Complemento 3. CsA: Ciclosporina. CTLA-4: Acrónimo del inglés Cytotoxic T-Lymphocyte Antigen 4 (Antígeno 4 del linfocito T citotóxico.) DAC: Dermatitis de Contacto. DAMP: Patrones moleculares asociados a la lesión (o al daño.) ECP: Proteína catiónica de los eosinófilos. EDN: Neurotoxina derivada del eosinófilo. FcRI: Receptor de IgE de alta afinidad tipo I. FcRII/CD23: Receptor de IgE de alta afinidad tipo II o CD23. FEV1: Volumen Espiratorio en el primer segundo. FMLP: N-formyl-met-leu-phe. GM-CSF: Factor Estimulador de Colonias de Granulocitos-Macrófagos (Granulocyte Macrophage-Colony Stimulating Factor) HLA: Sistema Mayor de Histocompatibilidad. H2O2: Peróxido de hidrógeno. IC: Inmunocomplejos circulantes. IFN: Interferón. IgE: Inmunoglobulina E. IgE receptor Mac-2/IgE-binding protein (BP) o Galectina3. IgG: Inmunoglobulina G. IgM: Inmunoglobulina M. IL-1: Interleukina-1. IL-1β: Interleukina-1 beta. IL-5: Interleukina-5. IL-6: Interleukina-6. IL-8: Interleukina-8. IRF3: Factor de respuesta al interferón 3. 8 LAD: Deficiencia de adhesión leucocitaria (Leucocyte Adhesion Deficiency.) LPS: lipopolisacárido. LTB4: Leucotrieno B4. LTC4: Leucotrieno C4. Lf: Lactoferrina. M-CSF: Factor Estimulador de Colonias de Macrófagos (Macrophage-Colony Stimulating Factor.) MHC: Sistema Mayor de Histocompatibilidad Humano. MIP 1: Proteína Inflamatoria 1 de Macrófago (Macrophage Inflammatory Protein 1) MD2: Proteína de diferenciación mieloide 2. MMP: Metaloproteinasas de la matriz. MPO: Mieloperoxidasa. NAD (P) H: Nitrato reductasa. NETs: Trampas extracelulares de neutrófilos. NF-AT: Factor nuclear AT. NF-B: Factor nuclear -B. NLR: NOD-like receptors. OCl: Hipoclorito. OH: Radical hidroxilo. O2: Anión superóxido. PB: Sangre periférica. PCR: Proteína C Reactiva. PKC: Protein-quinasa C. PAF: Factor activador de plaquetas (Platelet Activating Factor) PAMP: Patrones moleculares asociados a microorganismos patógenos. PMA: 12-O-tetradecanoíl forbol 13-acetato. PMNs: Polimorfonucleares. PPR: Receptores para el reconocimiento del patrón. TGF-1: Factor Transformador de crecimiento (Transforming Growth Factor.) TCR: Receptor del linfocito T. TLR: Receptor de tipo Toll. TNF-: Factor alfa de necrosis tumoral (Tumor Necrosis Factor alpha.) TXA2: Tromboxano A2. 9 1. RESUMEN. Son conocidas desde hace mucho tiempo las reacciones de hipersensibilidad como reacciones excesivas frente a un agente externo interviniendo en ellas los leucocitos como células principalmente implicadas de forma genérica. La patología de contacto o dermatitis de contacto (DAC), es un proceso en el cual se induce la liberación de mediadores de la inflamación y el acúmulo de células inflamatorias en el órgano de choque de forma descontrolada. Las reacciones de hipersensibilidad producidas por la implantación de aparatología multibrackets se pueden catalogar como dermatitis de contacto mediadas por la IgE. Debido a la naturaleza crónica de los procesos alérgicos, los leucocitos que persisten en los tejidos, especialmente eosinófilos y linfocitos, han sido los más estudiados. Sin embargo, existen fuertes evidencias experimentales de la participación de los neutrófilos en los procesos alérgicos. Los neutrófilos son células de defensa para el organismo pero también intervienen en la fisiología de los procesos alérgicos. Como células defensivas, el primer paso para la activación de los neutrófilos para producir la eliminación del elemento extraño, es la detección del estímulo. Los neutrófilos poseen receptores para un rango de mediadores en su membrana plasmática, de manera que se reconoce el elemento extraño y se procede a su destrucción. La digestión intracelular de estos elementos extraños generalmente supone el comienzo del estallido respiratorio con la liberación intrafagosomal de metabolitos tóxicos de oxígeno. Unido a esto la degranulación o liberación de gránulos contenidos en los neutrófilos (corpúsculos de almacenamiento que aíslan sus componentes de capacidad destructiva para que no afecten al propio neutrófilo) son responsables de las características clínicas de los procesos alérgicos. Para entender la fisiopatología de los neutrófilos en la dermatitis de contacto, tenemos que intentar cambiar el concepto de estas células que hasta ahora se tenía, que solo tenían la función de defendernos de las infecciones bacterianas, para cambiarlo hacia el de una célula que aparte de esa función posee otras funciones en la respuesta inflamatoria. Estas células pueden liberar diversos mediadores que pueden ejercer un profundo efecto en las vías aéreas de individuos asmáticos. Además en pacientes asmáticos con sintomatología, no solo existe un aumento del número de neutrófilos en sangre periférica, sino que estos muestran signos de estar activados. 16 bacterianas recurrentes (11). Así pues, el proceso de acumulación de neutrófilos en los tejidos con el propósito de ser un mecanismo de defensa, es esencial para la supervivencia. La acumulación de neutrófilos está tan controlada como las respuestas inflamatorias, resuelta de forma aguda, y desaparece con la supresión de los estímulos que la provoquen (Figura 3). De cualquier manera, si se suspende el control de los mecanismos y hay una respuesta excesiva, o la respuesta no se resuelve, el acúmulo y activación de los neutrófilos puede adelantar la destrucción y lesión de los tejidos en enfermedades inflamatorias (12-15). Figura 2. Activación de los neutrófilos y su posterior paso a los tejidos. Esto último es lo que puede acontecer en los procesos alérgicos, en los que la persistencia del estímulo, hace que no se resuelva espontáneamente el proceso. Hoy se reconoce a la patología de contacto, como un proceso en el cual se induce la liberación de mediadores y el acumulo de células inflamatorias en el órgano de choque. Varias células inflamatorias (macrófagos, linfocitos, mastocitos, basófilos, eosinófilos, Fi g ura 2 17 neutrófilos y plaquetas) han demostrado estar envueltas en este tipo de reacción, pero el papel desempeñado por cada una de ellas no está del todo claro. Figura 3. Procesos Fisiopatológicos En La Dermatitis De Contacto. Debido a la naturaleza crónica de los procesos alérgicos, los leucocitos que persisten en los tejidos, especialmente eosinófilos y linfocitos, han sido los más estudiados. Sin embargo, existen fuertes evidencias experimentales de la participación de los neutrófilos en los procesos alérgicos (16). Así se ha comprobado en éstos, un aumento de la actividad quimiotáctica y quimioquinética, expresión de marcadores de activación (entre los que destacan las moléculas de adhesión), alteración de la respuesta a diversos agentes reguladores, producción de leucotrienos, liberación de componentes de los diversos gránulos citoplasmáticos, secreción y generación de metabolitos de oxígeno (17- 29). A pesar de lo anterior, se están investigando los mecanismos por los cuales los neutrófilos pueden participar en la respuesta alérgica (30). La vida del neutrófilo desde célula madre pluripotencial hasta su desarrollo en los tejidos es aproximadamente de 12-14 días. Un adulto normal libera aproximadamente 18 1011 neutrófilos por día desde la médula hasta la circulación. Una parte de los neutrófilos maduros son controlados por algunos factores patofisiológicos desconocidos como puede ser la infección y el estrés y también algunos factores humorales (16). La regulación de la producción de neutrófilos se hace por un mecanismo de Feedback (retroalimentación) muy sensible, se piensa que la neutropenia estimula la liberación a nivel medular (16). Estudios realizados utilizando neutrófilos radiomarcados demuestran que tienen una vida media en la sangre de aproximadamente 4 horas; sin embargo es difícil determinar el tiempo que permanece marcada una población celular de diferentes edades y la vida media de algunos neutrófilos en la sangre (31). Una vez que el neutrófilo ha emigrado desde la sangre a los tejidos, su propósito primario es reconocer, fagocitar y destruir a los patógenos. La fagocitosis comprende dos etapas: reconocimiento e integración de microorganismos o partículas de sustancias en el fagosoma y la destrucción o neutralización y digestión posterior de los materiales. (32). En algunos casos, las células deben ser capaces de unirse directamente a sustancias como son LPS (Lipopolisacáridos de membranas celulares, preferentemente bacterianas) o a superficies de organismos extraños. De cualquier forma, la mayor parte de las partículas son opsonizadas por proteínas del plasma. Estas son específicas (inmunoglobulinas) o no específicas (complemento, fibronectina, proteína C reactiva). El neutrófilo reconoce a la proteína por medio de receptores específicos (Fc y receptores del complemento CR1 y CR3) (33). La digestión intracelular de los microorganismos generalmente supone el comienzo del estallido respiratorio con la liberación intrafagosomal de metabolitos tóxicos de oxígeno como hipohálidos (especialmente hipoclorito (OCl), anión superóxido (O2) radical hidroxilo (OH) y peróxido de hidrógeno (H2O2) (33). Los metabolitos del oxígeno también se pueden secretar a la matriz extracelular bajo ciertas condiciones (ej: durante la fagocitosis) ya que hay evidencia de acúmulo de dichas sustancias en tejidos dañados. Existen también mecanismos alternativos para la 19 destrucción de bacterias como son los péptidos bactericidas secretados de los gránulos a los fagosomas. Sin embargo algunos de ellos pueden contribuir al daño tisular si se libera fuera de la célula (33). La secreción de los gránulos contenidos en los neutrófilos al exterior de las células es usualmente debido a la degranulación y se piensa que está implicado en el proceso de exocitosis. Sin embargo, las células liberan también activamente otros materiales al exterior de la célula incluyendo mediadores lipídicos de la inflamación (33). Se ha dejado claro en los últimos años, que en los neutrófilos intervienen en la transcripción de los genes y síntesis de nuevas proteínas. Hay por lo tanto, una rica variedad de citocinas incluyendo IL-1 (Interleukina-1), IL-6, IL-8, TNF- (Tumor Necrosis Factor) y también antagonistas de receptores de la IL-1. Los mecanismos por los que se liberan las moléculas son en gran parte desconocidos, aunque ha sido descrito un proceso de transporte para LTB4 (16). La fagocitosis es un buen estímulo para la secreción de neutrófilos, pero a pesar de muchas observaciones, los mecanismos íntimos del proceso no se conocen en la actualidad. El primer paso para la activación de los neutrófilos es la detección de estímulo. Los neutrófilos poseen receptores para un gran rango de mediadores en su membrana plasmática, aunque no todos los receptores de los mediadores que activan a los neutrófilos han sido bien identificados. Hay mediadores que actúan sobre los neutrófilos, otros mediadores producidos por los neutrófilos que pueden actuar o no sobre ellos mismos y mediadores que priman al neutrófilo (16, 34). Los sucesos que ocurren en el neutrófilo cuando un mediador interacciona con su receptor son: (estímulo-receptor  acoplamiento) son de muy variada naturaleza e implican gran cantidad de pasos intermedios, muchos de ellos todavía no bien conocidos y que representa un campo apasionante de investigación (34). El secuestro o retención de los neutrófilos en la microcirculación inicia la interacción entre los leucocitos y las células endoteliales. La visualización directa de la 20 microcirculación (ej: mesenterio) nos muestra que en la circulación periférica el sitio de secuestro y migración del neutrófilo es la vénula post capilar donde se ha observado como comienzan a rodar sobre las paredes de los vasos de una forma lenta. En la actualidad se conoce que este proceso de rodamiento es mediado por moléculas de adhesión, las selectinas, sobre todo la L-selectina en los leucocitos y la P y E selectina en las células endoteliales. La circulación pulmonar es una excepción, los neutrófilos son secuestrados primariamente en los capilares, y su paso a través de estos capilares pulmonares de pequeño diámetro causa en ocasiones más una retención física que una autentica actividad adhesiva aumentada (35). Los procesos de rodamiento no necesariamente conducen a la migración de los neutrófilos. Si se va a efectuar la migración, la adherencia al endotelio necesita hacerse mucho más resistente. Esto es mediado por moléculas quimio-atrayentes, que estimulan a los neutrófilos para cambiar su molécula CD11/CD18 de su conformación no adhesiva a una adhesiva. A continuación, se desarrolla una adhesión firme a sus ligandos (ICAM- 1, ICAM-2) de las células endoteliales (2). El tránsito de los neutrófilos a través de las paredes de los vasos fue estudiado con detalles por Clark y Clark (1935) (2), lo cuales observaron la emigración de los neutrófilos a través del endotelio hacia los tejidos. Este proceso es rápido, dura solo algunos minutos. En posteriores estudios ultraestructurales sugirieron que de un neutrófilo adherente emerge un pseudópodo en una capa de la célula endotelial seguido por el resto del neutrófilo. Un hallazgo común es un neutrófilo localizado entre el endotelio y membrana basal, lo que sugiere que esta últimas una barrera adicional a la emigración. Los neutrófilos emigran entre las células endoteliales, a través de las uniones celulares. Esta ruta es considerada actualmente la más probable, pero queda por definir tal proceso por la naturaleza estática de los estudios ultraestructurales (36, 37). El proceso de quimiotaxis ha sido extensivamente estudiado in vitro, de cualquier manera, los mecanismos de migración in vivo tienen un significado diferente, por lo menos más complejo. Por ejemplo, las células endoteliales por sí mismas se sabe que contribuyen significativamente en los procesos de migración por expresión del ICAM-1. Además, recientes observaciones cuestionan la relevancia de la quimiotaxis (a cargo de un gradiente transendotelial de los mediadores solubles) en el acúmulo de neutrófilos in 21 vivo y sugiere que la haptotaxis (gradiente de unión a la superficie) es el mecanismo predominante. Esta idea (fue propuesta primero en 1980 y por Henson et al. en 1981) (5) ha sido presentada como resultado de experimentos que indican que las células endoteliales llevan unidos factores quimiotácticos que presentan a los neutrófilos. Estos se adhieren al endotelio y emigran a los tejidos en respuesta a los estímulos. Se produce la inflamación que es una respuesta protectora del huésped y en general no conduce al daño de los tejidos; ya que en los días siguientes la afluencia de los neutrófilos a los tejidos se va a resolver completamente la lesión inflamatoria (39). En otras situaciones, el daño a los tejidos es más severo y el acúmulo de neutrófilos se acompaña de cambios significativos en el endotelio, existiendo una evidencia morfológica del daño (destrucción celular). La capacidad del neutrófilo para destruir microorganismos y producir daño tisular depende de una serie complicada de sucesos que enumeramos: 1. Radicales tóxicos de Oxígeno. 2. Componentes granulares. 3. Productos del metabolismo del ácido araquidónico. 4. Proteínas de nueva síntesis. 22 2.2. LOS GRÁNULOS. Los neutrófilos son miembros de una amplia familia de leucocitos denominados polimorfonucleares (PMNs) y se distinguen del resto por su composición granular. Esta característica es tan llamativa que han recibido el nombre de granulocitos. Los gránulos contienen proteasas fundamentales en las funciones fisiopatológicas del neutrófilo (16). En preparaciones convencionales de sangre total se vio que estos granulocitos no tenían los típicos gránulos de los basófilos (grandes, azulados y basofílicos) ni de los eosinófilos (grandes y rojo anaranjados, acidófilos y eosinofílicos), por lo que recibieron el nombre de neutrófilos. Sin embargo, se ha podido vislumbrar la existencia de dos tipos de gránulos en el citoplasma de éstas células, unos de color azul/lila (azurófilos) que aparecen tempranamente en la diferenciación de los neutrófilos en la médula ósea (gránulos primarios); y otros más pequeños de color rosado (eosinofílicos) que aparecen más tarde (gránulos secundarios). Los gránulos primarios reciben también el nombre de inespecíficos ya que contienen hidrolasas ácidas presentes en los lisosomas de otros tipos celulares (además de otros componentes típicos del neutrófilo) (16). Los gránulos secundarios son específicos del neutrófilo (Tabla 1). Gránulo Azurófilo Gránulo Específico Gránulo Terciario Enzimas microbicidas Mieloperoxidasa Lisozima Lisozima Proteinasas Neutras Elastasa Colagenasa Gelatinasa Catepsina G Proteinasa 3 Hidrolasas Acidas -Glicerofosfatasa -Glucoronidasa N-acetil-- glucosaminidasa -Manosidasa Catepsina B y D 23 Miscelaneas Proteínas catiónicas Lactoferrina Defensinas Proteínas transportadoras vit B12 Proteína incrementadora permeabilidad de bacterias Activador de Plasminógeno Factores bactericidas derivados de gránulos azurófilos Histaminas Receptores de FMLP, C3bi y laminina Citocromo b558 Tabla 1. Contenido de los Gránulos de los Neutrófilos. Además de estos dos tipos de gránulos, hay autores que defienden la existencia de otros tipos como los terciarios, que contienen sustancias tales como gelatinasa, citocromo b588 y ubiquinona pero no mieloperoxidasa ni lactoferrina, aunque se desconoce el momento de aparición en la diferenciación celular del neutrófilo (40,41). Estos gránulos han sido denominados, también, partículas C y en ocasiones vesículas secretoras. Sin embargo, hay estudios estructurales que no ponen de manifiesto la existencia de gránulos terciarios. Las fuentes de tal heterogeneidad en estos gránulos pueden ser (42): 1. La existencia de sub-poblaciones de neutrófilos 2. La presencia de gránulos en diferentes estadios de maduración 3. El tráfico/fusión intracelular asociado con la función del neutrófilo. Otros estudios han puesto de manifiesto la existencia de otros dos tipos de gránulos en los que hasta el momento no se ha podido encontrar proteasas y que reciben los nombres de calciosomas y fosfosomas (43,44) (Tabla 2). 24 Fosfosomas Calciosomas Factores microbicidas NADP oxidasa Receptores CD16*, CR1*, CD45* FMLP-R Mac-1(CD11b) Uroplasminogen activator-R Misceláneos Fosfatasa alcalina Calsequestrin Citocromo b558 Proteínas plasmáticas CD10, CD13 DAF* Tabla 2. Contenido de los gránulos de los Neutrófilos *: Especulativo. DAF: Decay accelerating Factor En los neutrófilos no estimulados, los gránulos actúan como lugares de almacenamiento que aíslan sus componentes con capacidad destructiva, para que no afecten al propio neutrófilo. Aparte de esta separación física, hay otros mecanismos para almacenar de forma segura las proteasas granulares son: 1. Almacenamiento como proenzimas inactivas. 2. Almacenamiento a pH que no es el adecuado para su actividad. 3. Almacenamiento como complejos enzima/inhibidor. Los neutrófilos pueden expresar en su superficie multitud de receptores que juegan importantes papeles en su capacidad para responder a las señales del medio ambiente. La función de los neutrófilos puede ser regulada por cambios en los niveles de expresión de estos receptores. La expresión puede verse incrementada por la síntesis de nuevos receptores o por translocación a la superficie a partir de compartimentos de almacenamiento; o puede estar disminuida por internalización o liberación de los receptores (45). 25 2.2.1. MEDIADORES LIPÍDICOS. Los Neutrófilos no contienen mediadores lipídicos preformados, pero pueden sintetizarlos, sobre todo PAF y LTB4. Así mismo pueden liberar prostaglandinas y tromboxanos (46). 2.2.2. SÍNTESIS Y SECRECIÓN DE NUEVAS PROTEÍNAS POR LOS NEUTRÓFILOS. Hace algunos años se pensaba que los Neutrófilos eran “células terminales”, en las que no se podían sintetizar ningún tipo de sustancia. Esto venía además avalado por el hecho de que estas células poseen poca cantidad de Ribosomas y de Ácido Ribonucleico (RNA). Pero se ha descubierto que son capaces de sintetizar una amplia variedad de proteínas, que pueden aumentar la actividad preexistente de los Neutrófilos o pueden aumentar la producción de células inflamatorias (16) (Tabla 3). ______________________________________________________________________ Fibronectina Moléculas HLA I Activador Plasminógeno FcR Elastasa TNF Heat-shock proteína Actina GM-CSF, M-CSF IL-1, IL-6, IL-8 MIP 1 TGF- Receptor del Complemento, tipo 1 y 3, cadena IFN- ______________________________________________________________________ Tabla 3. Ejemplo de proteínas sintetizadas por los Neutrófilos GM-CSF: Granulocyte Macrophage-Colony Stimulating Factor, M-CSF: Macrophage- Colony Stimulating Factor, TNF: Tumor Necrosis Factor, IL-1: Interleukin-1, IL-6: Interleukin-6, IL-8: Interleukin-8, MIP 1: Macrophage Inflammatory Protein 1, IFN- :Interferon, TGF-1: Transforming Growth Factor. 32 2.4.3.1. ESPUTO INDUCIDO. El número de neutrófilos en el esputo inducido es similar en los sujetos controles que en pacientes con asma leve-moderada en algunos casos (56) mientras que en otros es más elevada. Por otra parte, existe un aumento del número de neutrófilos en pacientes con cuadros agudos, y en el asma persistente comparada con controles (57), especialmente en pacientes con cifras bajas de eosinófilos (58) y una pobre respuesta a los corticoides inhalados. Existe una correlación positiva entre el número de neutrófilos en esputo con la concentración de agua oxigenada presente en el aire expirado de los pacientes asmáticos y con las variaciones del pico de flujo (59, 60) y una correlación negativa de los valores del FEV1 y el número de estas células presentes en pacientes con un proceso de asma bronquial (61,62). 2.4.3.2. LAVADO BRONQUIAL. El número de neutrófilos suele ser más alto en los pequeños volúmenes de los lavados bronquiales que en los grandes volúmenes de los lavados broncoalveolares (BAL) (63). Algunos autores no han encontrado diferencias entre pacientes asmáticos con asma leve y sujetos controles mientras otros si encuentran cantidades estadísticamente significativas más elevadas de estas células en pacientes con un asma media (64). También existe un aumento en el número de neutrófilos en el lavado bronquial de pacientes en status asmáticos intubados, al compararlo con sujetos intubados no asmáticos, así como con asmáticos no intubados y controles sanos (65). 2.4.3.3. LAVADO BRONCOALVEOLAR. Algunos autores no encuentran diferencias en el número de neutrófilos en el BAL de sujetos con asma bronquial leve con respecto a un grupo control, mientras que otros si detectan un aumento de estas células en pacientes asmáticos. Por otra parte, es más constante ese aumento en pacientes que sufren de un asma, persistente severa o con un cuadro agudo de las misma. En pacientes con asma nocturna, los neutrófilos aumentan significativamente a las 4: AM comparados con las 4: PM, no encontrándose diferencias en pacientes con asma sin empeoramiento nocturno (66). 33 Ocho de diez sujetos con asma por isocianatos presentan aumento de neutrófilos en el BAL (67). Aunque en el BAL de pacientes asmáticos sensibles a cedro rojo se encuentran la misma cantidad de neutrófilos que en sujetos normales, estos aumentan en los sujetos sintomáticos con respecto a los no sintomáticos (68). 2.4.3.4. BIOPSIAS BRONQUIALES. El número de neutrófilos es semejante en las biopsias de sujetos normales y de pacientes con asma leve en unos casos y más abundantes en otros, pero se incrementa de forma significativa en asmáticos con procesos severos. Las células presentan mayor cantidad de moléculas de adhesión en los enfermos asmáticos. En pacientes con asma leve se ha demostrado un aumento de neutrófilos en las biopsias realizadas en las épocas de exposición estacional alergénica (63). Comparando las vías aéreas de pacientes que murieron de asma, el número de neutrófilos se elevó en aquellos pacientes que murieron de forma brusca (pacientes que murieron dentro de las dos horas de haber comenzado el ataque de asma), comparados con pacientes que tuvieron una muerte más lenta en las que las células predominantes fueron los eosinófilos.. Por otra parte el número de neutrófilos también se vio aumentado en las glándulas submucosas en casos de asma y muertes por asma con relación a controles sanos (69,70). 2.4.4. NEUTRÓFILOS EN LAS VÍAS AÉREAS DE LOS DEPORTISTAS. Los síntomas respiratorios relacionados con el ejercicio son frecuentes en los atletas y una baja tolerancia al ejercicio es común en los pacientes asmáticos. Aunque los estudios de los cambios inducidos por el ejercicio en las células de las vías aéreas se iniciaron teniendo como modelo la broncoconstricción inducida por el ejercicio (BIE), posteriores hallazgos han podido demostrar como los cambios en las células de las vías aéreas de los atletas no se correlacionan con los síntomas respiratorios producidos por el ejercicio, la hiperreactividad bronquial o las alteraciones funcionales, como la hipoxemia inducida que desarrolla ante un ejercicio intenso. Se ha detectado un aumento de neutrófilos en biopsias bronquiales de esquiadores de campo a través. En 34 biopsias y lavados broncoalveolares de los mismos atletas anteriores y en esputos inducidos de nadadores de élite, corredores de maratón y jugadores de hockey hielo. Los corredores de maratón muestras un gran aumento de neutrófilos tras la realización del ejercicio. En la actualidad, no se conoce el/los procesos fisiopatológicos que conducen a estos hallazgos, aunque algunos autores indican una mayor presencia de asma bronquial entre los atletas (71-77). 2.4.5. NÚMERO DE NEUTRÓFILOS EN LAS VÍAS AÉREAS DE LOS ASMÁTICOS DESPUÉS DE UNA PROVOCACIÓN BRONQUIAL. Estudios iniciales se realizaron mediante test de provocación inhalatoria con antígeno, para posteriormente investigar los cambios producidos después de la exposición al alergeno. Más recientemente, se han utilizado tests de provocación segmentaria con el alergeno. En los pacientes alérgicos, la provocación con un alergeno induce una respuesta inmediata, que puede ser seguida en cierto número de pacientes, de una respuesta tardía (78,79). Esta respuesta tardía es un buen modelo para investigar los procesos inflamatorios en el asma. 2.4.6. TEST DE PROVOCACIÓN INHALATORIA BRONQUIAL ALERGENO ESPECÍFICA. Se ha demostrado un aumento de neutrófilos en biopsias bronquiales pero no en el BAL a las 24h pero no a las 6h o 72 h, después de que sujetos asmáticos fueran sometidos a una provocación inhalatoria alergeno específica con una respuesta bronquial tardía (78). Aunque los hallazgos en el BAL han sido confirmados en otros estudios también existen autores que demuestran el aumento de los neutrófilos en el BAL en pacientes con una respuesta tardía incluso a las 6h de haberse realizado el test de provocación (79). Tras provocación bronquial alérgeno-específica existe un aumento del número de neutrófilos en sangre periférica de la capacidad quimiotáctica del suero para los neutrófilos y del número de estas células en esputo inducido (78). 35 2.4.7. TEST DE PROVOCACIÓN BRONQUIAL SEGMENTARIO ALERGENO ESPECÍFICO. El inconveniente que tiene este modelo de provocación bronquial es que hay que introducir al menos dos veces el broncoscopio, por lo que esta maniobra por si misma origina una neutrofilia lo mismo en sujetos sanos que en enfermos asmáticos. Existen trabajos en los que se observa como si existe un aumento de neutrófilos tras provocación con alergeno en comparación con el control salino (78, 79). Las células que se obtienen de los BAL dan muestras de estar activadas, como se comprueba por la mayor expresión de moléculas de adhesión en su superficie celular y lo mismo ocurre en las células obtenidas en las biopsias bronquiales post-provocación (69). 2.4.8. OTROS TESTS DE PROVOCACIÓN BRONQUIALES. Cuando se investiga el efecto del ozono sobre las vías aéreas hay que considerar la cantidad así como el tiempo de exposición al mismo. Seis horas después de una exposición corta al ozono (0.2 ppm, 2 h), hay un incremento similar de neutrófilos en el lavado bronquial, pero no en el BAL, tanto en los controles como en los enfermos asmáticos, aunque el número de células en condiciones basales fue superior en los pacientes con asma (64). Si aumentamos el tiempo de exposición (0.2 ppm, 6 h) existe un aumento significativo de neutrófilos en el BAL de los pacientes expuestos al ozono en comparación con pacientes expuestos al aire y controles (8 h después de la exposición) (79). Seis horas después de la exposición al ozono (0.27 ppm durante 2 h), el porcentaje de neutrófilos aumentó en el esputo inducido en comparación con la exposición al aire en pacientes con asma media persistente. Este incremento se perdió después de 4 semanas de tratamiento con corticoides inhalados. El tratamiento con corticoides por su parte no inhibió la respuesta funcional al ozono (medida como tanto por ciento de descenso del FEV1) ni el score de síntomas. La hipernea isocápnica también demostró aumentar significativamente el número de neutrófilos en el BAL de pacientes asmáticos (79). Podemos ver un Resumen del conteo de neutrófilos en el asma bronquial con sus características en la Tabla 4, que ponemos a continuación: 36 TABLA 4: Número de neutrófilos en el asma bronquial.  Sangre periférica  Esputo inducido  Lavados bronquiales  Lavados Broncoalveolares  Biopsias  Test provocación bronquial antígeno específico 2.4.9. MEDIADORES NEUTROFÍLICOS EN ENFERMOS ASMÁTICOS. 2.4.9.1. DEGRANULACIÓN Y SECRECIÓN. Los neutrófilos se caracterizan histológicamente, y de ahí su pertenencia a la familia de los granulocitos, por poseer gránulos citoplasmáticos característicos. Durante las reacciones inflamatorias, la respuesta inmediata envuelve la interacción de los neutrófilos con los vasos microvasculares y emigración, con la consiguiente degranulación y secreción del contenido de los gránulos (la degranulación indica la liberación de los componentes de los gránulos dentro de los fagosomas y al medio exterior). Además de la secreción del contenido de estos gránulos, las células activas, también secretan otras proteínas, carbohidratos y lípidos procedentes de fuentes no granulares (80). Los procesos migratorios en ciertos momentos, probablemente, no tengan una gran importancia, puesto que es posible que la interacción de las células activadas con la pared microvascular pueda desembocar en una secreción sin migración. Esta circunstancia sería importante para el desarrollo de las lesiones en el tejido de las vías aéreas y contribuirían a que no necesariamente estas células tuvieran que hallarse en el tejido circundante (80). 37 El concepto primitivo de degranulación era que los neutrófilos liberaban su contenido mediante una lisis in situ. Hoy se conoce como este axioma está muy lejos de la realidad, puesto que estaba desarrollado a partir de estudios in vitro, en los cuales se utilizaban estímulos en absoluto fisiológicos como era la adición de citocalasinas (80). La degranulación envuelve la fusión de la membrana de los gránulos, bien para formar fagosomas o bien para unirse a otros ya existentes. Subsecuentemente conlleva a la activación de un receptor, y al desarrollo inmediato de un proceso de señaltransducción, es entonces cuando los gránulos son translocados hacia la parte interior de la membrana plasmática, a través de un mecanismo dependiente del citoesqueleto, seguido de la fusión y el restablecimiento de la estructura normal de dicha membrana. La integridad de las células se mantiene durante todo el proceso de expulsión del contenido de los gránulos al exterior (80). Los neutrófilos contienen diferentes clases de gránulos, nombrados por el orden de su aparición en las células progenitoras en la médula ósea: primario (o azurófilo), secundario (o secretorio o específico) y los gránulos que contienen gelatinasa. Pueden ser distinguidos por los distintos componentes que contienen. Los gránulos primarios contienen mieloperoxidasa, lisozima, hidrolasas y proteinasas. Los secundarios poseen lisozima, lactoferrina, colagenasa y una proteína unida a la vitamina B12. Los gránulos que contienen gelatinasa también poseen otros componentes como gelatinasa y colagenasa. Se han descrito unas nuevas estructuras denominadas vesículas secretorias, que entre otros elementos contienen albúmina y cierto tipo de receptores (80). La degranulación y secreción de las dos clases mayores de gránulos están reguladas separadamente. Por ejemplo, los ionóforos cálcicos inducen secreción de gránulos específicos, mientras que los ionóforos de cationes monovalentes causan liberación de los azurófilos. Los gránulos secundarios se fusionan más pronto, con diferentes estímulos y más rápidamente que los azurófilos. Esto puede tener consecuencias fisiológicamente importantes, puesto que se ha postulado como permitiría la acción de ciertas enzimas del fagosoma antes de que el pH intrafagosomal cayera lo suficiente como para inactivarlas, además suministraría a la membrana citoplasmática de nuevos receptores quimiotácticos y moléculas de adhesión para una capacidad migratoria y adhesiva óptimas (81-85). 38 Los neutrófilos contienen y pueden secretar varias potentes proteasas, incluyendo a elastasa de los neutrófilos, catepsinas, y colagenasa. Están contenidas en los gránulos y se liberan como parte del proceso de degranulación. Es posible que alguna(s) de esta(s) enzima(s), puedan permanecer pegadas a la membrana celular (86) y posibiliten la digestión de proteínas específicas o substratos de células a las cuales los neutrófilos se adhieren. La importancia de estas proteasas radica en su abundancia, su razonable alto pH (por ejemplo extracelular) y su amplio espectro de acción. Debido a que la elastina es tan resistente a la digestión, el hecho de que la elastasa sea la proteasa más abundante en los gránulos azurófilos, no indica que sea específica de ella, sino que es capaz de digerirla, al igual que a otros constituyentes del tejido conectivo (86). Las proteasas de los neutrófilos se les ha indicado tener un papel crítico en la penetración de los tejidos por estas y quizás por otras células, al abrir huecos en las barreras y/o creando nuevos quimioatrayentes a partir de la fragmentación de proteínas del tejido conectivo (87). En ese caso, puede generarse un daño significativo en los tejidos, particularmente en presencia de un exceso de oxidantes. Los neutrófilos primados y estimulados, que permanecen adheridos a las células endoteliales o epiteliales durante largos periodos de tiempo son muy destructivos (88,89). Algunos de estos procesos son mediados por la elastasa, incluso en presencia de todas las antiproteasas del suero, presumiblemente debido a que son excluidas de sus lugares de adhesión. Más efectivo que la citotoxicidad franca, es el hecho de que los enzimas proteolíticos, desencadenan en los tejidos circundantes la desunión de sus células, debido a la destrucción mediante la proteólisis de las moléculas de adhesión matrizcélulas (integrinas y sus proteínas de unión). Una vez más este proceso se ve aumentado en presencia de oxidantes (90). Las proteasas pueden actuar en algunas circunstancias como moléculas de comunicación celular, por ejemplo favoreciendo la función de los mediadores. El mejor ejemplo es la interacción específica de la trombina con su receptor en las plaquetas o en las células endoteliales. Sin embargo, la catepsina G neutrofílica, también se ha demostrado ser un eficiente mediador en las interacciones neutrófilos-plaquetas (91-93), así como las proteasas son agentes que priman de forma efectiva de los macrófagos (94). La habilidad de la elastasa y la catepsina G neutrofílicas de estimular la secreción de moco de las vías aéreas, también es otro ejemplo de cómo estas sustancias pueden 39 ejercer funciones per se en el órgano de choque, que no se corresponden estrictamente con el mecanismo inflamatorio directo (95). El interés actual sobre las proteínas catiónicas derivadas del eosinófilo, ha potenciado la investigación sobre el papel de estas sustancias derivadas del neutrófilo. Los gránulos azurófilos poseen varias proteínas altamente catiónicas, como son: defensinas, catepsina G, proteína catiónica antimicrobial de 37 kDa (CAP37) y proteína inductora bactericida/permeabilidad (BPI). La elastasa está cargada positivamente y parece que algunas de sus funciones las realiza mediante estas propiedades. Las importancia de la carga positiva de ciertas proteínas neutrofílicas, no está del todo dilucidada, aunque parece que contribuyen a las funciones intrafagosomales así como a las extracelulares. Por otro lado, los policationes tienen múltiples efectos en diferentes células y tejidos, incluyendo alteraciones en las funciones de las vías aéreas de animales de experimentación, que parecen estar debidas exclusivamente a su carga (96). 2.4.9.2. METALOPROTEASAS. Las metaloproteasas comprenden una familia de más de 20 diferentes proteasas con la habilidad de romper componentes de la matriz extracelular, aumentar el tráfico celular y activar diferentes proteínas (97). Pueden actuar produciendo lesión tisular, pero su habilidad para degradar colágeno tanto intacto como desnaturalizado, elastina y otros componentes de la matriz extracelular ha sugerido que estas enzimas tienen un papel preponderante en la reparación de las heridas (98). Más recientemente, se ha indicado como las metaloproteasas son capaces de aumentar la migración celular a través de los tejidos hacia los lugares de lesión a través de la degradación de los componentes de la matriz extracelular (99). La Matrix-Metaloproteinasa-9 (MMP-9) es quizás la metaloproteasa mejor estudiada en el asma. Es una gelatinasa entre cuyos substratos se incluyen colágeno IV, elastina, fibronectina y el plasminógeno. La MMP-9 se ha encontrado elevada tanto en los lavados broncoalveolares como en el esputo de los enfermos asmáticos. Se ha correlacionado con la extensión de los infiltrados celulares (100-102), con la gravedad del asma y aunque la MMP-9 puede ser sintetizada por diversas células (macrófagos, 40 eosinófilos, células epiteliales y fibroblastos) su presencia en los casos citados es debida en su práctica totalidad a los neutrófilos. Aumentos del mRNA de la MMP-9 y MMP-9 como tal proteína se han podido comprobar en las paredes bronquiales de pacientes asmáticos (103). Un aumento estadísticamente significativo de MMP-9 se ha demostrado en el lavado broncoalveolar y en cortes histológicos de la membrana basal subepitelial (MBS) de pacientes con asma bronquial severo (104). El número de neutrófilos y macrófagos, pero no el de eosinófilos, estaba estadísticamente elevado en los pacientes con presencia de MMP-9 en su MBS. Las células portadoras de MMP-9 eran los neutrófilos. Sin embargo, la presencia de MMP-9 se correlacionó fuertemente con la presencia de eosinófilos en el BAL y no con los neutrófilos, esta correlación sugiere que la presencia de MMP-9 en la MBS puede promover el movimiento de los eosinófilos hacia el lumen, contribuyendo así al empeoramiento de la función pulmonar. La MMP-9 en la MBS permite a los eosinófilos migrar más fácilmente a través de la MBS y del epitelio hacia el lumen. Por contra, el papel de los neutrófilos sería el de iniciar la respuesta, aclarar el camino a los eosinófilos para que se dirijan al lumen y permanecer en el tejido para reparar el daño liberando MMP-9 y Transforming Growth Factor-. La función pulmonar estaba significativamente más baja en los pacientes con MMP-9 positiva (105). La MMP-9 se encuentra elevada y activada en el BAL de pacientes con estatus asmático (103). Tras provocación bronquial alérgeno-específica se observa un aumento significativo de MMP-9 en pacientes asmáticos sensibles a esos alergenos, no observándose ningún cambio en sujetos sanos. La cantidad de MMP-9 después de la provocación se correlaciona significativamente con los cambios en el FEV1 y con los porcentajes de neutrófilos (104). Por otra parte, los neutrófilos son las células que aportan la MMP-9 en las provocaciones bronquiales alérgeno-específica. Uno de los factores que habría que tener en cuenta con respecto a esta metaloproteasa, es que la IL-8 libera directamente MMP-9 a partir de los neutrófilos (106), por lo que no se puede descartar un mecanismo autocrino en la producción de MMP-9 por parte de dichas células. 41 Se ha reportado que la inhibición o la falta de las metaloproteinasas, especialmente de la MMP-9, previene la aparición de asma en un modelo murino de asma bronquial (105,107). La MMP-2 también puede estar implicada en el remodelamiento bronquial ya que su presencia se requiere para la proliferación de la musculatura lisa in vitro (108) y se ha descrito su presencia en el esputo de los enfermos asmáticos. La MMP-8 degrada al colágeno tipo I, II, III, VII, VIII y X y a la gelatina. Inactiva a inhibidores de las proteinasas como son la 1-antitripsina, 1-antiquimotripsina y la 2-macroglobulina (109). La MMP-8 se encuentra elevada en el BAL y en las biopsias de pacientes asmáticos, la cantidad de MMP-8 es inversamente proporcional a los valores del FEV1 (109). Su presencia indica el inicio de lesión irreversible más que inflamación per se. Las células que portan preferentemente MMP-8 en estas lesiones son los neutrófilos. Otras metaloproteasas tienen dos dominios funcionales -a disintegrin and a metalloproteinase domainpor eso se les ha denominado ADAM (107). Se han descubierto hasta la actualidad unos 35 miembros de las mismas. Su identificación primaria se realizó en base a sus acciones en la fusión del esperma con el óvulo. Sus funciones principales se desarrollan en la adhesión celular, señales celulares, fusión celular y proteólisis. Uno de los mecanismos más interesantes de estas proteasas es la de separar de la superficie celular a diversos factores y citoquinas que causan incremento de la inflamación y un cambio de respuesta conducente a un predominio de Th2 (108). Entre las ADAM presente en los neutrófilos (ADAM-8, ADAM-9, ADAM-10, ADAM- 17), la ADAM-17 parece ser la responsable de muchas de estas acciones como es la liberación de TNF- al medio. Recientemente, se ha descrito una asociación genética de la ADAM-33 con la aparición de asma, hiperreactividad bronquial y cifras de IgE total y específica (109). 2.4.9.3. ELASTASA. La elastasa desarrolla diversas funciones que pueden estar implicadas en la fisiopatología del asma bronquial como son: daño epitelial, aumento de la permeabilidad vascular, hipersecreción de moco bronquial, metaplasia de las glándulas mucosas bronquiales, reducción del aclaramiento mucociliar, broncoconstricción e 48 neutrófilos, sino que su menor o mayor expresión puede desencadenar inmunodeficiencia o activación celular (132). En enfermos asmáticos, se ha demostrado un aumento de expresión del CD35 en la superficie celular de neutrófilos, con respecto a una población sana de referencia, un aumento tras provocación bronquial con antígeno, histamina y ejercicio (132). Así mismo, después de la estimulación in vitro de estas células con un factor activador de los neutrófilos (el factor quimiotáctico fMLP), existía un aumento en la expresión del CD11b. La modulación de estas moléculas en los enfermos alérgicos, no sólo mediaría la fagocitosis de partículas opsonizadas, sino que estarían envueltas en la adhesión celular, lo que permitiría su unión a las células endoteliales vasculares y posterior migración hacia el órgano de choque (piel, mucosa nasal, vías aéreas, etc.) (131). En los enfermos asmáticos más inestables, tomados como aquellos que tienen una variabilidad en su pico de flujo del más del 10%, existe un aumento de adhesión de los neutrófilos de sangre periférica a la E-selectina que no llega a ser significativo, aunque si lo es la adhesión al ICAM-1 (131, 133-135). Nosotros hemos investigado las modificaciones de las moléculas de adhesión y otros receptores de membrana (136-140): CD11a (cadena variable L de las 2 integrinas), CD11b, CD11c (cadena variable X de las 2 integrinas), CD18, CD62L (L-selectina), ICAM-1 (CD54), CD32 (receptor II de las inmunoglobulinas G: FcRII) y CD16 (receptor III de las inmunoglobulinas G: FcRIII) que se producen en los neutrófilos de pacientes atópicos. Cuando estimulamos con un alergeno al cual el pacientes es sensible, existe una disminución del CD62L en la superficie de los neutrófilos cuantificados lo mismo en % de células positivas, como en la disminución de la Intensidad Media de Fluorescencia (IMF). Los hallazgos en el CD62L no se existen en controles sanos ni en pacientes alérgicos estimulados con un antígeno que no son sensibles. Cuando estimulamos los neutrófilos de pacientes alérgicos con anticuerpos anti-IgE observamos, como existe un aumento del CD16 y una disminución del CD62L con respecto al % de células positivas. Con respecto al IMF, se produce un aumento de expresión del CD11b y CD18, mientras que se vuelve a producir una disminución del 49 CD62L, todo ello dependiente de la dosis de anti-IgE que se deposita en el cultivo (136- 140). Observamos como el efecto de la anti-IgE era más potente que el del antígeno, ya que el número de receptores de IgE estimulados era superior al emplear el citado anticuerpo. Al mismo tiempo que el descenso del CD62L en la superficie celular existe un aumento del CD62L soluble en el sobrenadante del cultivo. Por otra parte, la inmunoterapia inhibe de forma significativa la cantidad de CD62L liberada de la superficie celular, por lo que actuaría frenando el paso de estas células del torrente circulatorio hacia el foco de respuesta alérgica (137). Como los resultados con el CD62 eran constantes, en cualquiera de los métodos empleados para su estudio, proseguimos nuestro estudio con este marcador observando como los antihistamínicos (loratadina, terfenadina y cetirizina), así como el cromoglicato disódico eran incapaces de revertir los efectos de la anti-IgE. Por contra, la budesonida y la dexametasona si inhibieron la disminución de CD62L (137). La pérdida de L-selectina por acción de la anti-IgE, es dependiente de, fosfolipasa A2, protein quinasa C y del fosfatidilinositol trifosfato quinasa. De otra parte, tiene poca dependencia de la tirosina quinasa y de la serina-treonina quinasa. Es totalmente independiente de las fosfatidilinositol y foafatidilcolina fosfolipasas C (137). 2.4.9.8. ACTIVIDAD QUIMIOTÁCTICA DE LOS NEUTRÓFILOS. La actividad quimiotáctica de los neutrófilos inducida por PAF está aumentada en los pacientes con asma bronquial con respecto a una población sana de referencia (141), y está relacionada inversamente con la producción por los neutrófilos de un derivado del ácido araquidónico 5-HETE, no existen diferencias si estimulamos la quimiotaxis de los neutrófilos con histamina, sustancia P, VIP y somatostatina (141). La teofilina inhibe la quimiotaxis de los neutrófilos de pacientes asmáticos estimulada con LPS opsonizado con suero. Por otra parte podemos medir la actividad quimiotáctica que genera el suero o las diferentes secreciones sobre los neutrófilos, así la actividad quimiotáctica del suero esta 50 aumentada en los enfermos asmáticos con respecto a una población control (142), aumenta en enfermos asmáticos tras provocación con ejercicio (143, 144), nebulización de agua destilada y antígeno. No existe ninguna actividad quimiotáctica de los neutrófilos aumentada del suero si efectuamos una provocación con metabisulfito (145). La inmunoterapia inhibe la actividad quimiotáctica sérica de los neutrófilos incluso en la época de síntomas (146). 2.4.9.9. NEUTRÓFILOS NORMO-HIPODENSOS. Ha sido descrito que al utilizar medios de diferentes densidades para la separación de neutrófilos, se optiene enriquecimiento de neutrófilos en las diferentes fases en función de la patología (147). Teniendo encuenta las diferentes fases que se obtienen: fracción 1 (densidad>1085), fracción 2 (1081<densidad1085), fracción 3 (1077<densidad1081) y fracción 4 (densidad1077). El porcentaje de neutrófilos de la fracción 2 en los enfermos con rinitis y asma alérgicos fue inferior que en los controles sanos de referencia. Por el contrario, el porcentaje de neutrófilos en las porciones 3 y 4 puede encontrarse aumentado significativamente en los enfermos alérgicos frente a los controles sanos. Se encuentra pues, en los enfermos alérgicos, un mayor número de neutrófilos hipodensos. Si comparamos la quimiotaxis de los neutrófilos, se puede comprobar como las células que poseen menor densidad presentan una mayor capacidad quimiotáctica (147). 2.4.9.10. MEDIADORES LIPÍDICOS. Los neutrófilos no contienen mediadores lipídicos preformados, pero pueden sintetizarlos, sobre todo PAF y LTB4. Aunque en ciertos momentos ha habido cierto debate, hoy está demostrado como están células son capaces de sintetizar prostaglandinas y tromboxanos a través de la enzima ciclooxigenasa (COX) (148-156). Si estimulamos los neutrófilos con el ionóforo cálcico A23187, observamos como unos autores no encuentran diferencias en la liberación del LTB4 entre los pacientes asmáticos y la población normal de referencia (148). Aunque otros autores si encuentran estas diferencias estadísticamente significativas (149). La posible explicación a estos 51 hallazgos es que por un lado los primeros lo analizaron en pacientes sin sintomatología y con inmunoterapia, mientras que los segundos lo hicieron en pacientes sin inmunoterapia y además observaron que no se producían estas diferencias en los pacientes cuando no tienen sintomatología clínica y sí que hay diferencias cuando tienen los síntomas (fuera y dentro de la estación polínica) (149). Con respecto a otro metabolito de la 5-lipoxigenasa existen resultados conflictivos en trabajos realizados por los mismos autores, mientras que refieren en un trabajo que el 5- HETE libre está más alto en los asmáticos que en los controles sanos; en otro refieren que es el 5-HETE y en otro que el 5-HETE libre, el esterificado y el total están más altos en los controles sanos que en los pacientes asmáticos (148, 153-154). Estos autores explican que las diferencias entre el primero y el último pueden referirse a que en el primer caso los pacientes estaban sintomáticos, mientras que en el último estaban con sintomatología. Por otra parte, si encuentran una esterificación superior del 5-HETE en los pacientes asmáticos que en los controles sanos. Los niveles séricos de lyso-PAF fueron superiores en pacientes con polinosis que en un grupo control sano (156). La acetil-transferasa del lyso-PAF (Acetil-CoA) presenta una actividad en neutrófilos no estimulados de pacientes alérgicos que en controles sanos. Tras estimulación con el ionóforo cálcico A23187, la Vmax fue superior en los enfermos que en los controles, mientras que no hubo diferencias entre estos últimos con asmáticos sensibles a la aspirina (156). La media del cociente Vmax estimulada/Vmax no estimulada para la acetiltransferasa de los enfermos atópicos fue significativamente más baja que la de los controles, sugiriendo que la acetiltransferasa de los enfermos alérgicos es menos sensible a la estimulación con el A23187. No hubo diferencias entre estos y los enfermos sensibles a la aspirina. La Vmax estimulada se correlaciono significativamente con la Vmax no estimulada en los dos tipos de pacientes y no en los controles sanos. Todo ello sugiere un papel preponderante del PAF en la patogenia del asma bronquial (151). La Ciclooxigenasa (COX), es la enzima que metaboliza los pasos desde el ácido araquidónico hacia la formación de prostaglandinas y tromboxanos. Existen dos isoformas de COX: el tipo I (COX-1), es constitutiva y está presente en muchas células, 52 mientras que la del tipo II (COX-2) está ausente de forma habitual en condiciones basales, pero puede ser inducida en ciertas células por mitógenos, citoquinas y otros factores. Varios tipos celulares humanos normales (incluidos los neutrófilos), pueden expresar la forma inducible y los eicosanoides derivados de su actuación, tras estímulos adecuados (153). Los neutrófilos de pacientes asmáticos son capaces de sintetizar, tras provocación in vitro con PAF, TXB2; 9, 11-PGF2; PGF2; PGD2 y PGE2, aunque no se realiza su comparación con una población normal de referencia (157). Mediante citometría de flujo, hemos podido comprobar que a los 20 minutos de estimulación con un anticuerpo anti-IgE se produce la aparición de COX-2 intracelularmente en neutrófilos de pacientes alérgicos. También aparece este enzima si estimulamos con antígenos de pacientes que sufren sintomatología, mientras que no lo hacen las células de sujetos sanos y pacientes alérgicos no sensibles a ese alergeno. Con una concentración de 25g/ml de anti-IgE nos encontramos, mediante inmunoblotting, mayor presencia de COX-2 que con otros estímulos como el PMA (a 100nM) o el LPS (100 g/ml). Tras estimulación con anti IgE, nos encontramos en el sobrenadante un aumento de Tromboxano B2 y tras estímulo con antígeno específico un aumento de prostaglandina PGE2 (manuscrito en preparación). 2.4.9.11. RADICALES TÓXICOS DE OXÍGENO. Los Neutrófilos son conocidos como la mayor fuente de anión superóxido (radical superóxido O2-), H2O2 y ácido hipocloroso (HOCl). Está bien establecido, que los oxidantes pueden actuar conjuntamente con las proteasas neutrofílicas aumentando el grado de daño tisular, al inactivar la participación de las antiproteasas (por ejemplo, mediante la oxidación de la metionina de la 1-antitripsina) y/o quizás la alteración de la estructura de proteína, que hace a las moléculas más susceptibles para el ataque proteolítico (158, 159). Los neutrófilos de pacientes atópicos producen más superóxido en ausencia de estímulo que los neutrófilos de sujetos no atópicos. Por este motivo, se podría pensar que existe una alteración de base en los enfermos atópicos, pero esto no es así puesto que cuando estimulamos con el ionóforo cálcico A23187 y con el quimioatrayente fMLP sigue 53 siendo significativa la diferencia en la producción de radicales tóxicos de oxígeno en los pacientes atópicos con respecto a la población normal de referencia. Los mismos hallazgos lo encuentran otros autores cuando estimulan también con fMLP (158-161). También se produce más radicales tóxicos de oxígeno en los neutrófilos de los enfermos asmáticos que en los controles si estimulamos con PMA (160) y con zimosan opsonizado (115). Esta producción de O2- es inversamente proporcional a los valores del FEV1(162), a la hiperreactividad bronquial producida por metacolina (PC20-metacolina) y a la producida por histamina (PC20-histamina) (158). Aún más, en pacientes que presentan un empeoramiento clínico (determinado por la presencia de ataques asmáticos), la producción de O2- es superior a la que se produce en enfermos asmáticos estables (158). Por otra parte, no existen diferencias en la producción de radicales tóxicos de Oxígeno entre pacientes atópicos y controles sanos si se estimulan los neutrófilos con PAF y LTB4 solamente (115,163). Pero estos dos productos priman la producción de O2- tras estimulación de neutrófilos con fMLP, más en los pacientes alérgicos que en los controles sanos. La dexametasona y la azelastina inhiben de forma más intensa esta producción en los controles sanos que en los pacientes alérgicos, lo que hablaría en favor de una mayor "resistencia" al efecto de estos medicamentos en los procesos atópicos, bien por una mayor y más persistente presencia del PAF y el LTB4 en los enfermos alérgicos o bien por una alteración intrínseca en los mismos (162,164). De acuerdo con esta última teoría están los hallazgos de otros autores (156,165) que en pacientes asmáticos que no toman teofilina lo mismo que en los que la toman tienen mayor producción de O2- por los neutrófilos, que los de controles sanos, tras estimulación in vitro con fMLP. Los neutrófilos de lavados broncoalveolares de enfermos asmáticos producen más cantidad de radicales tóxicos de oxígenos que los de un grupo control sano de referencia. Las plaquetas inhiben la formación de O2- a partir de neutrófilos de controles sanos, sin embargo esto no sucedió en un paciente con asma bronquial intenso y con un aumento en su número de plaquetas, lo que sugería en opinión de los autores una anormal relación entre plaquetas y neutrófilos en algún tipo de asma (164). 54 Nosotros hemos comprobado como la provocación in vitro de neutrófilos de pacientes alérgicos, con el antígeno responsable del cuadro clínico, conduce a un aumento del estallido respiratorio de dichas células. Este estallido depende directamente de la concentración del antígeno y del tiempo en que actúe el mismo. La activación es específica ya que no se produce cuando añadimos un antígeno al cual el paciente no es sensible y si empleamos células de controles sanos (166). Tras la estimulación con el antígeno, hemos observado como los dos componentes citoplasmáticos de la NADPH oxidasa, p47 y p67, se incorporan a la membrana celular para formar la NDPH oxidasa* de forma activa (manuscrito en preparación). En nuestro modelo, la estimulación del estallido respiratorio antígeno-específica en pacientes alérgicos, se ve inhibida si añadimos antihistamínicos (loratadina, terfenadina, cetirizina y cariebastina), nedocromil sódico y corticoides (budesonida y dexametasona) (manuscrito en preparación). Tras estimulación con anti-IgE, comprobamos como existe una mayor producción del estallido respiratorio en los pacientes asmáticos con respecto a los controles sanos. Entre los pacientes asmáticos, aquellos que reciben inmunoterapia, presentan un descenso de estallido respiratorio a niveles comparables a los de los sujetos sanos (167). 2.4.9.12. SÍNTESIS Y SECRECIÓN DE NUEVAS PROTEÍNAS POR LOS NEUTRÓFILOS. Hace algunos años se pensaba que los neutrófilos eran “células terminales”, en las que no se podían sintetizar ningún tipo de sustancia. Esto venía además avalado por el hecho de que estas células poseen poca cantidad de ribosomas y de ácido ribonucleico (RNA). Pero se ha descubierto como son capaces de sintetizar una amplia variedad de proteínas, que pueden aumentar la actividad preexistente de los neutrófilos o pueden aumentar la producción de células inflamatorias (168). Los neutrófilos de los apacientes asmáticos presentan mayor cantidad de receptor de la IL-9 que una población sana de referencia. Los neutrófilos son capaces también de sintetizar y liberar al medio el receptor de esta citoquina. Cuando se estimulan con IL-9, los neutrófilos liberan IL-8 (169). 55 Lo mismo los neutrófilos de sangre periférica que los hallados en las biopsias de enfermos asmáticos expresan más Transforming Growth Factor, que los de una población sana de referencia. Las células periféricas de los pacientes liberan más TGF- que la de los controles (170). La Interleukina-8 (IL-8) es un potente quimioatrayente y activador de los neutrófilos. En los pulmones, la IL-8 parece ser el primer quimioatrayente para estas células. Aunque la IL-8 puede ser producida por varios tipos celulares, también puede ser sintetizada por los neutrófilos en respuesta a varios mediadores inflamatorios. De esa manera, la producción de IL-8 por los neutrófilos puede contribuir a un reclutamiento adicional de neutrófilos e, importantemente, puede aumentar o prolongar la activación de los neutrófilos de una forma autocrina (171). En esputos inducidos, existe un aumento de IL-8 en pacientes con asma con relación a una población control: También hay un aumento de IL-8 en lavados broncoalveolares y en el aspirado traqueal de pacientes asmáticos. Tras estímulo antígeno específico, existe una mayor liberación lo mismo nasal que bronquial de IL-8 (172). Mediante un estímulo IgE-dependiente, no sólo hemos comprobado que se produce IL-8 de los neutrófilos de pacientes atópicos, sino que se estimula su síntesis observado con un aumento de la expresión del mRNA. Todo ello se lleva a cabo, por un mecanismo dependiente del eje Ca2+-calmodulina-calcineurina y con la estimulación del factor nuclear B (NF-B). Los antihistamínicos (loratadina>terfenadina>cetirizina) y los corticoides (budesonida y dexametasona) y la inmunoterapia son capaces de inhibir la producción de IL-8 liberada de neutrófilos de pacientes alérgicos mediante un estímulo IgE-dependiente (manuscrito en preparación). 2.4.9.13. PROCESOS INTRACELULARES. Según algunos autores, la estimulación de neutrófilos con PAF y LTB4 no origina diferencias significativas en el aumento de Ca2+ intracelular en los neutrófilos de enfermos alérgicos con respecto a los de los controles sanos (115). Sin embargo nosotros, pudimos comprobar cómo existía un aumento del Ca2+ intracelular cuando 56 estimulábamos con antígeno y además, al estimular con anti-IgE, el aumento del Ca2+ intracelular era superior en las células de los pacientes alérgicos que en las de los sujetos sanos (173). En nuestro modelo celular, la inhibición del influjo de Ca2+ a los neutrófilos de pacientes alérgicos inhibía la liberación de IL-8, la producción de RNA mensajero y la activación del NF-B. Por lo que el Ca2+ no sólo interviene en la liberación de IL-8, sino también en su síntesis (173). La calmodulina es una enzima, que está envuelta en muchos mecanismos del desarrollo de la respuesta celular en general, activando la función de varias quinasas (CaM quinasa I y II, quinasa de las cadenas ligeras de la miosina), fosfatasas (calcineurina), canales iónicos (bomba Ca2+ de la membrana plasmática) y otros enzimas citosólicos, tales como fosfodiesterasa, adenil ciclasa y óxido nítrico sintetasa. Por ese motivo, no es sorprendente que los inhibidores de la calmodulina, típicamente inhiban procesos de activación celular, como el estallido respiratorio, el aumento de expresión del Mac-1, la liberación de granos secundarios, la migración celular, la motilidad celular, y en nuestro caso, la liberación IgE-dependiente de la IL-8 (174). Por otra parte, la calcineurina es otra enzima con una función primordial en la cascada de transducción de señales que conlleva la activación celular, siendo un factor regulador de factores de transcripción tales como NF-AT, NF-B y AP-1, que están envueltos en la expresión de un importante número de genes, como pueden ser el de la IL-2, TNF-, etc. (75). La presencia de calcineurina en los neutrófilos se había adivinado por mecanismos indirectos, nosotros demostramos por primera vez la actividad de esta enzima en neutrófilos humanos (76) y como era regulada por Ca2+ y por radicales de oxígeno (ROS). La ciclosporina (CsA), es una droga inmunosupresora que se une específicamente a la inmunofilina e interfiere en la activación de la calcineurina, nosotros hemos presentado evidencias de que la CsA inhibe, en una manera dosisdependiente, la inducción de IL-8, la expresión de mRNA para la IL-8 y la formación de complejos de NF-B. Existen estudios experimentales en humanos y en animales de utilización de la ciclosporina (oral e inhalada) y el tacrolimus en el asma bronquial con resultados prometedores. 57 La producción de IL-8 por los neutrófilos depende en muchos casos de la activación del NF-B y en otros no. De acuerdo con los primeros, la activación IgE-dependiente de los neutrófilos de pacientes alérgicos, conduce a una activación que tiene su máxima expresión a las tres horas del estímulo y que está formada por complejos de NF-B que contienen las subunidades p65 y p50 del mismo. Aunque anteriormente no habíamos podido detectar actividad NFAT en los neutrófilos (177), posteriormente hemos comprobado como existen mRNA de cuatro de las cinco isoformas del NFAT: NFAT1 (o NFATp), NFAT2 (o NFATc), NFAT4 y NFAT5 en estas células. De todas ellas, sólo la NFAT2 se transloca al núcleo cuando estimulamos con el alergeno o con anti IgE. Esta estimulación es también específica puesto que sólo los alergenos a los cuales son sensibles los pacientes la producen siendo ineficaces loa alergenos que no producen síntomas en los pacientes asmáticos o en sujetos sanos. Todo ello indicaría que este factor nuclear se activa por un mecanismo IgE dependiente. Existen evidencias que el NFAT2 juega un papel importante en la inducción de citoquinas Th2. Por ejemplo un ratón mutante con déficit en NFAT2 es incapaz de secretar IL-4. Nuestros hallazgos coinciden con estos conceptos, puesto que un mecanismo IgE dependiente estimularía la producción de citoquinas Th2 como la IL-4, que también se encuentra y se libera de los neutrófilos. Todo ello contribuiría a una perpetuación del proceso alérgico a partir de la regulación proveniente de los neutrófilos (177). En otro apartado de este capítulo, hemos indicado que en la respuesta IgE mediada en neutrófilos intervienen factores como la fosfolipasa A2, la fosfatidilinositol trifosfato quinasa y la proteína quinasa C (PKC). Se han descrito varias isoformas de la PKC y se han clasificado en tres grupos basados en su estructura y en los cofactores que regulan. Las mejores caracterizadas son las que se describieron primeramente y que son las PKC convencionales (cPKC), entre las que se incluyen: PKC-, PKC-I, PKCII y PKC-, que necesitan para su activación de la fosfatidilserina y que se activan por Ca2+ y diacilglicerol (178). 64 de ADN CpG no metiladas que se encuentran en las bacterias; las características de las proteínas que se encuentran en los microbios, como la iniciación por N- formilmetionina, que es típica de las proteínas bacterianas; y lípidos y glúcidos complejos que sintetizan los microbios, pero no las células de los mamíferos, como el lipopolisacárido (LPS) en las bacterias gram negativas, el ácido lipoteicoico en las bacterias gram positivas y los oligosacáridos ricos en manosa que se encuentran en los microbios, pero no en las glucoproteínas de los mamíferos (182-184). En realidad, solo hay un número limitado de diferencias fundamentales entre las moléculas microbianas y las moléculas que los organismos superiores producen. De este modo, el sistema inmunitario innato ha evolucionado para reconocer solo un número limitado de moléculas, la mayoría exclusivas de los microbios (184), mientras que el sistema inmunitario adaptativo es capaz de reconocer una serie mucho mayor de sustancias extrañas, sean o no productos de los microbios. El sistema inmunitario innato reconoce productos microbianos que son a menudo esenciales para la supervivencia de los microbios. Esta característica del reconocimiento inmunitario innato es importante, porque asegura que los microbios no puedan deshacerse de las dianas de la inmunidad innata con el fin de intentar evitar ser reconocidos por el anfitrión (184). Un ejemplo de una diana de la inmunidad innata que es esencial para los microbios es el ARN vírico bicatenario, que desempeña una función fundamental en la replicación de ciertos virus (184). De forma análoga, el LPS y el ácido lipoteicoico son componentes estructurales de las paredes bacterianas que los receptores inmunitarios innatos reconocen; ambos son necesarios para la supervivencia de las bacterias y no pueden eliminarse. Por el contrario, los microbios pueden mutar o perder muchos de los antígenos que el sistema inmunitario adaptativo reconoce, lo que posibilita que los microbios evadan las defensas del anfitrión sin afectar a su propia supervivencia (184). El sistema inmunitario innato también reconoce moléculas endógenas que producen o liberan células dañadas o que se están muriendo. Estas sustancias se llaman patrones moleculares asociados a la lesión (o al daño) (DAMP, del inglés damage-associated molecular patterns) (183-184). Los DAMP pueden producirse como resultado del daño celular causado por infecciones, pero también pueden indicar una lesión estéril de las 65 células causada por alguna otra razón, como toxinas químicas, quemaduras, traumatismos o reducción del riego sanguíneo. Las células que mueren por apoptosis no suelen liberar DAMP. En algunos casos, se estimula a las células sanas del sistema inmunitario para que produzcan y liberen DAMP, lo que aumenta la respuesta inmunitaria innata a las infecciones (184). El sistema inmunitario innato usa varios tipos de receptores celulares, presentes en diferentes localizaciones en las células, y moléculas solubles en la sangre y las secreciones mucosas, que reconocen PAMP y DAMP (183-184). Las moléculas de reconocimiento celulares del sistema inmunitario innato las expresan los fagocitos (macrófagos primarios y neutrófilos), las células dendríticas, las células epiteliales que componen la interfaz de barrera entre el cuerpo y el ambiente externo, y muchos otros tipos de células que ocupan los tejidos y los órganos. Estos receptores celulares de microorganismos patógenos y de moléculas asociadas a la lesión se llaman receptores para el reconocimiento del patrón (PPRs: Pattern reconigtion receptor) (185). Se expresan en la membrana plasmática o las membranas endosómicas de varios tipos celulares, y también en el citoplasma de estas células. Estas diversas localizaciones de los receptores aseguran que el sistema inmunitario innato pueda responder a microbios presentes fuera de las células o dentro de diferentes compartimentos celulares (185). Cuando estas moléculas de reconocimiento del patrón celulares se unen a PAMP y DAMP, activan la transducción de señales que promueven las funciones antimicrobianas y proinflamatoria de las células en las que se expresan. Además, hay muchas proteínas en la sangre y los líquidos extra celulares que reconocen PAMP. Estas moléculas solubles facilitan la eliminación de los microbios de la sangre y de los líquidos extracelulares, lo que aumenta su captación por las células o activa los mecanismos extracelulares microbicidas (185). Los receptores del sistema inmunitario innato están codificados en línea germinal, mientras que los receptores de la inmunidad adaptativa los genera la recombinación somática de los genes de receptores en los precursores de los linfocitos maduros (186). Como resultado de ello, el repertorio de especificidades de los receptores del sistema 66 inmunitario innato es pequeño comparado con el de los linfocitos B y T del sistema inmunitario adaptativo. Se calcula que el sistema inmunitario innato puede reconocer unos 103 patrones moleculares. Por el contrario, el sistema inmunitario adaptativo es capaz de reconocer 107 o más antígenos distintos (186). Además, mientras que el sistema inmunitario adaptativo puede distinguir entre antígenos de diferentes microbios de la misma clase, e incluso diferentes antígenos de un microbio, la inmunidad innata puede distinguir solo clases de microbios o solo células dañadas de células sanas, pero ninguna especie en particular de microbios ni tipos celulares (186). El sistema inmunitario innato no reacciona contra células y tejidos normales y sanos. Esta característica es, por supuesto, esencial para la salud del organismo. Está determinada, en parte, por la especificidad de los mecanismos inmunitarios innatos frente a los PAMP y DAMP, y, en parte, por las proteínas reguladoras expresadas por las células normales que impiden la activación de varios componentes de la inmunidad innata (186). Los receptores de reconocimiento de patrones (PPRs: Pattern reconigtion receptor). Hay dos tipos diferenciados: celulares expresados en las membranas o en el citoplasma de las células; y el reconocimiento soluble, las moléculas efectoras de la inmunidad innata, que se encuentran en la sangre y los líquidos extracelulares. 2.5.1. RECEPTORES CELULARES PARA EL RECONOCIMIENTO DEL PATRÓN DE LA INMUNIDAD INNATA. La mayoría de los tipos celulares expresan receptores para el reconocimiento del patrón y, por tanto, son capaces de participar en las respuestas inmunitarias innatas (182-186). Los fagocitos, incluidos los neutrófilos y los macrófagos, y las células dendríticas expresan la mayor variedad y cantidad de estos receptores, lo que les mantiene a la altura de su papel fundamental en la detección de microbios y células dañadas y en su ingestión para destruidos (como hacen los neutrófilos y los macrófagos) o en su capacidad de reaccionar frente a ellos de forma que induzcan la inflamación y la consiguiente inmunidad adaptativa (que es una función importante de las células dendríticas) (182-186). Los receptores para el reconocimiento del patrón están ligados a vías intracelulares de 67 transducción de señales que activan varias respuestas celulares, como la producción de moléculas que promueven la inflamación y defienden contra los microbios (182-186). Organizaremos nuestra exposición alrededor de varias clases: 2.5.1.1. RECEPTORES DEL TIPO TOLL. Los receptores del tipo Toll (TLR), una familia de receptores para el reconocimiento del patrón conservada a lo largo de la evolución que expresan muchos tipos celulares, reconocen productos de una amplia variedad de microbios (183). El gen toll se identificó originalmente como un gen de Drosophila melanogaster implicado en el establecimiento del eje dorsoventral durante la embriogenia de la mosca de la fruta, pero después se descubrió que la proteína Toll también mediaba las respuestas antimicrobianas en estos organismos. Este descubrimiento llevó a la identificación de homólogos a Toll en los mamíferos, que se denominaron receptores del tipo Toll. Hay nueve TLR funcionales diferentes en los seres humanos, llamados TLR1 a TLR9 (183). Los TLR son glucoproteínas integrales de membrana del tipo 1 que contienen repeticiones ricas en leucina flanqueadas por estructuras características ricas en cisteína en sus regiones extracelulares, que participan en la unión al ligando, y un dominio de homología a Toll/receptor para la IL-l (TIR) en sus colas citoplásmicas, que es esencial para la producción de señales. Los dominios TIR también se encuentran en las colas citoplásmicas de los receptores para las citocinas IL-l e IL-18, y vías de transmisión de señales análogas están conectadas a los TLR, la IL-l y la IL-18 (183). Los TLR de los mamíferos participan en respuestas a una amplia variedad de moléculas que expresan los microbios, pero no a las células sanas de los mamíferos. Los ligandos que diferentes TLR reconocen tienen estructuras diversas y comprenden productos de todas las clases de microorganismos (183). Ejemplos de productos bacterianos que se unen al TLR son el LPS y el ácido lipoteicoico, constituyentes de las paredes celulares de las bacterias gram negativas y de las bacterias gram positivas, respectivamente, y la flagelina, el componente proteínico de los flagelos de las bacterias móviles. Ejemplos de ligandos para TLR producidos por 68 los virus son los ARN bicatenarios, que componen los genomas de algunos virus y se generan durante el ciclo vital de la mayoría de los virus ARN, pero que no producen las células eucariotas, y los ARN unicatenarios, que se distinguen de los transcriptos de ARN unicatenario citoplásmicos celulares por su localización dentro de los endosornas y por su elevado contenido en guanosina y uridina. Los polisacáridos con manosa micóticos (mananos) también son ligandos para el TLR (183). Los TLR también participan en respuesta a moléculas endógenas cuya expresión o localización indica un daño celular (183). Ejemplos de moléculas del anfitrión que se unen a los TLR son las proteínas del choque térmico (HSP), que son chaperonas inducidas en respuesta a varios inductores de estrés celular, y la caja del grupo de movilidad alta 1 (HMGB1), una proteína abundante ligadora de ADN implicada en la transcripción y reparación del ADN. Las HSP y la HMGBl suelen ser intracelulares, pero pueden hacerse extra celulares cuando las liberan células dañadas o muertas. Debido a su localización extracelular, activan la producción de señales por TLR2 y TLR4 en las células dendríticas, los macrófagos y otros tipos celulares (183). La base estructural de las especificidades de los TLR reside en múltiples módulos extracelulares ricos en leucina de estos receptores, que se unen directamente a los PAMP o a moléculas adaptadoras que se unen a los PAMP (183). Hay entre 16 y 28 repeticiones ricas en leucina en los TLR y cada uno de estos módulos está compuesto de 20 a 30 aminoácidos que incluyen estructuras LxxLxLxxN conservadas (donde L es leucina, x es cualquier aminoácido y N es asparragina) y aminoácidos que varían entre diferentes TLR. Los aminoácidos variables que se unen al ligando de los módulos están en la superficie convexa formada por las hélices a y los giros o asas β (183, 184). Estas repeticiones contribuyen a la capacidad de algunos TLR de unirse a moléculas hidrófobas, como el LPS bacteriano. La unión del ligando a los dominios ricos en leucina produce interacciones físicas entre las moléculas de TLR y la formación de dímeros de TLR. El repertorio de especificidades del sistema TLR se amplía por la capacidad de los TLR de heterodimerizar entre sí. Por ejemplo, los dímeros de TLR2 y TLR6 son necesarios para las respuestas frente al peptidoglucano (183, 184). 69 En las especificidades del TLR también influyen varias moléculas accesorias diferentes a los TLR. Esto se define mejor en la respuesta del TLR4 al LPS. El LPS se une en primer lugar a una proteína soluble ligadora de LPS presente en la sangre o el líquido extracelular, y este complejo sirve para facilitar el transporte del LPS a la superficie de la célula respondedora (187). Una proteína extracelular llamada MD2 (proteína de diferenciación mieloide 2) se une al componente lipídico A del LPS, formando un complejo que interactúa después con TLR4 e inicia señales. Otra proteína llamada CD14 también es necesaria para la producción eficiente de señales a partir del LPS (187). La mayoría de las células expresan CD14 (excepto las células endoteliales) en forma de proteína soluble o como proteína de membrana ligada al glucofosfatidilinositol. El CD14 y la MD2 también pueden asociarse a otros TLR (187). De este modo, diferentes combinaciones de moléculas accesorias en los complejos TLR pueden servir para ampliar el abanico de productos microbianos que pueden inducir respuestas inmunitarias innatas. Los TLR se encuentran en la superficie celular y en las membranas intracelulares y, por ello, son capaces de reconocer microbios en diferentes localizaciones celulares (187). Los TLR1, 2, 4, 5 y. 6 se expresan en la membrana plasmática, donde reconocen varios PAMP en el ambiente extracelular. Algunos de los estímulos microbianos más potentes para las respuestas inmunitarias innatas se unen a estos TLR de la membrana plasmática, como el LPS y el ácido lipoteicoico bacterianos, que reconocen TLR2 y 4, respectivamente. Por el contrario, los TLR3, 7, 8 Y9 se expresan, sobre todo, dentro de las células en el retículo endoplásmico y las membranas endosómicas, donde detectan varios ligandos diferentes de ácidos nucleicos (183). Algunos de estos ácidos nucleicos los expresan de forma mucho más abundante los microbios que los mamíferos, como el ARN bicatenario, que producen los virus ARN y se une al TLR3, y las secuencias CpG sin metilar comunes en el ADN de los procariotas, que se unen al TLR9. El ARN unicatenario, que se une al TLR8, y el ADN unicatenario y bicatenario, que se une al TLR9, no se expresan solo en los microbios, pero la relativa especificidad de estos TLR por los productos microbianos está ligada a su localización endosómica (183, 187). 70 No hay normalmente ARN ni ADN del anfitrión en los endosomas, pero el ARN y el ADN microbianos pueden acabar en los endosomas de los neutrófilos, los macrófagos o las células dendríticas cuando estos fagocitan microbios (187). Además, el ADN del anfitrión procedente de las células que han muerto por una infección u otras causas puede acabar en los endosomas de los fagocitos. En otras palabras, los TLR3, 7, 8 y 9 pueden distinguir lo propio sano de lo ajeno o enfermo en función, en parte, de la localización celular de los ácidos nucleicos a los que se unen. Es necesaria una proteína en el retículo endoplasmático llamada UNC-93B para la localización endosórnica y la función adecuada de TLR3, 7, 8 y 9 (183). El reconocimiento por el TLR de ligandos microbianos da lugar a la activación de varias vías de transmisión de señales y, finalmente, a factores de transcripción que inducen la expresión de genes cuyos productos son importantes para las respuestas inflamatoria y antivírica (183). Las vías de transmisión de señales las inicia la unión del ligando al TLR situado en la superficie celular o en el retículo endoplásmico o los endosomas, lo que lleva a la dimerización de las proteínas TLR. Se piensa que la dimerización del TLR inducida por el ligando acerca los dominios TIR de las colas citoplásmicas de cada proteína (183). A esto le sigue el reclutamiento de proteínas adaptadoras que contienen el dominio TIR, lo que facilita el reclutamiento y la activación de varias proteínas quinasas y lleva a la activación de diferentes factores de transcripción. Los principales factores de transcripción activados por las vías de transmisión de señales de los TLR son el factor nuclear κB (NF-κB), la proteína de activación 1 (AP-l), el factor de respuesta al interferón 3 (IRF3) e IRF7 (183). NF-κB y AP-l estimulan la expresión de genes que codifican muchas de las moléculas requeridas para la respuesta inflamatoria (p. ej. TNF e IL-1), las quimioquinas (p. ej. CCL2 y CXCL8) y las moléculas de adhesión (p. ej. Selectina E). IRF3 e IRF7 promueven la producción de interferones del tipo I (IFN-α e IFN-β), importantes para las respuestas inmunitarias innatas antivíricas (187). Diferentes TLR utilizan diferentes combinaciones de adaptadores e intermediarios de la transmisión de señales, lo que constituye la base de los efectos anterógrados comunes y únicos del TLR. Por ejemplo, el TLR de la superficie celular que se conecta con el adaptador MyD88 lleva a la activación de NF-κB, y la señal producida por el TLR que usa el adaptador llamado TRIF (adaptador que contiene el dominio TIR inductor de 71 IFN-β) lleva a la activación de IRF3. Todos los TLR, excepto TLR3, envían las señales a través de MyD88 y son, por lo tanto, capaces de activar NF-κB y de inducir una respuesta inflamatoria. TLR3 transmite señales a través de TRIF y, por tanto, activa IRF3 e induce la expresión de interferones del tipo 1.TLR4 transmite señales a través de MyD88 y TRIF, y es capaz de inducir los dos tipos de respuestas. Los TLR7 y 9 endosómicos, que se expresan mucho en las células dendríticas plasmocitoides, envían señales a través de una vía dependiente de MyD88 e independiente de TRIF que activa NF-κB e IRF4. Por tanto, TLR7 y TLR9, como TLR4, inducen respuestas inflamatorias y antivíricas (187). 2.5.1.2. RECEPTORES CITOSÓLICOS PARA PAMP Y DAMP. Además de los TLR unidos a la membrana, que perciben microorganismos patógenos fuera de las células o en los endosornas, el sistema inmunitario innato ha evolucionado para equipar a las células con receptores para el reconocimiento del patrón que detectan la infección o el daño celular en el citoplasma (185). Las dos principales clases de estos receptores citoplásmicos son los receptores del tipo NOD y los receptores del tipo RIG. Estos receptores citoplásmicos, como los TLR, están ligados a la transducción de señales por vías que promueven la inflamación o la producción de interferón del tipo 1(185). La capacidad del sistema inmunitario innato de detectar la infección en el citoplasma es importante, porque parte de los ciclos vitales normales de algunos microbios, como la traducción de los genes víricos y el ensamblaje de partículas víricas, tiene lugar en el citoplasma. Algunas bacterias y parásitos tienen mecanismos para escaparse de las vesículas fagocíticas hacia el citoplasma. Los microbios pueden producir toxinas que crean poros en la membrana plasmática del anfitrión, incluidas las membranas endosómicas, a través de los cuales pueden entrar moléculas microbianas en el citoplasma (182-187). Estos poros pueden también dar lugar a cambios en la concentración de moléculas endógenas en el citoplasma, que son signos fiables de infección y daño, y que detectan los receptores citoplásmicos. 72 2.5.1.3. RECEPTORES DEL TIPO NOD. Los receptores del tipo NOD (NLR, del inglés NOD-like receptors) son una familia de más de 20 proteínas citosólicas diferentes, algunas de las cuales detectan la presencia en el citoplasma de PAMP y DAMP Y reclutan otras proteínas para formar complejos transmisores de señales que promueven la inflamación (188). Esta familia de proteínas se llama así por NOD (proteína con el dominio de oligomerización que se une a nucleótidos, del inglés nucleotide oligomerization domain-containing protein). Las proteínas NLR típicas contienen al menos tres dominios diferentes con estructuras y funciones distintas. Entre ellos están un dominio rico en repeticiones de leucina que percibe la presencia del ligando, similar a las repeticiones ricas en leucina de los TLR; un dominio NACHT (proteína inhibidora de la apoptosis neuronal [NAIP], CllTA, HET-E y TP1), que permite al NLR unirse a otro y formar oligómeros; y un dominio efector, que recluta otras proteínas para formar complejos transmisores de señales (188). Hay tres subfamilias de NLR, cuyos miembros usan diferentes dominios efectores para iniciar las señales, llamados dominios CARD, Pirina y BIR. Los NLR se encuentran en una amplia variedad de tipos celulares, aunque algunos NLR se distribuyen en tejidos concretos. Algunos de los NLR mejor estudiados se encuentran en las células inmunitarias e inflamatorias y en la barrera epitelial (188). NOD1 y NOD2, miembros de la subfamilia NOD de NLR que contienen el dominio CARD, se expresan en el citoplasma de varios tipos celulares como las células epiteliales mucosas y los fagocitos, y responden a peptidoglicanos de la pared bacteriana. NOD2 se expresa en cantidades particularmente altas en las células de Paneth intestinales, donde estimula la expresión de sustancias antimicrobianas llamadas defensinas en respuesta a microorganismo s patógenos. NOD1 reconoce sustancias derivadas, sobre todo, de bacterias gram negativas, mientras que NOD2 reconoce una molécula diferente llamada dipéptido muramilo procedente de microorganismos gram negativos y gram positivos (188). Estos péptidos los liberan las bacterias intracelulares o extracelulares; en el último caso, su presencia en el citoplasma requiere mecanismos especializados de transporte de péptidos a las células del anfitrión. Estos mecanismos son sistemas de secreción de los 73 tipos III y IV, que han evolucionado en las bacterias patógenas como un medio de llevar toxinas a las células del anfitrión (188). Cuando los oligómeros de NOD reconocen sus ligandos peptídicos, incluidas toxinas bacterianas, se produce un cambio estructural tridimensional que permite a los dominios CARD efectores de las proteínas NOD reclutar múltiples copias de la quinasa RIP2, lo que forma un complejo transmisor de señales que se ha denominado señalosoma de NOD. Las quinasas RIP2 en estos complejos activan NF-B, que promueve la expresión de genes inflamatorios, como el TLR que transmite señales a través de MyD88, expuesto antes. NOD1 y NOD2 parecen importantes en las respuestas inmunitarias innatas a las bacterias patógenas del tubo digestivo, como Helicobacter pylori y Listeria monocytogenes (188). Hay un gran interés en la observación de que ciertos polimorfismos de NOD2 aumentan el riesgo de una enfermedad inflamatoria del intestino llamada enfermedad de Crohn, probablemente debido a una respuesta innata defectuosa a microorganismos comensales y patógenos en el intestino (188). Además, mutaciones de NOD2 que aumentan las señales producidas por NOD conducen a una enfermedad inflamatoria sistémica llamada síndrome de Blau (188). La subfamilia NLRP de NLR responde a PAMP y DAMP citoplásmicos, formando complejos transmisores de señales llamados inflamasomas, que generan formas activas de la citosina inflamatoria IL-1 (188). Hay 14 NLRP (familia NLR, proteínas que contienen el dominio pirina, del inglés pyrin domain-Containing proteins), la mayoría de las cuales comparten un dominio efector Pirina, llamado así por la raíz griega pyro, que significa calor, porque se identificó por primera vez en un gen mutado que se asocia a una enfermedad febril hereditaria. Se ha estudiado muy bien a los inflamasomas que contienen solo tres de estos NLRP, sobre todo IPAF/NLRC4, NLRP3 y NLRPl (188). Cuando estos NLRP se activan por la presencia de productos microbianos o cambios en la cantidad de moléculas endógenas o iones en el citoplasma, se unen a otras proteínas a través de interacciones homotípicas entre dominios estructurales compartidos, lo que 80 contenido también se puede liberar hacia el exterior, lo que permite la eliminación de microorganismos extracelulares, pero con la posibilidad de generar daño del tejido. Nathan, en 2006, señala que los neutrófilos, a través de la liberación de sustancias hacia el medio externo, deciden el destino de los microorganismos mediante dos vías generales, lo que él denomina «quitando» y «dando» (199). En la primera, el neutrófilo retiene los factores esenciales que los agentes microbianos requieren para su supervivencia, como el hierro; para esto, los neutrófilos secretan la lactoferrina, proteína que lo enlaza y almacena (197). En la segunda vía, los neutrófilos liberan de manera progresiva sustancias preformadas y sintetizadas de novo contenidas en sus gránulos, como lipocalina, lisozima, LL37 y diversas metaloproteinasas (MP8, MMP9 y MMP25). Estas últimas degradan laminina, colágena, proteoglicanos y fibronectina, por lo que son importantes para que los neutrófilos se abran paso hacia el sitio de la inflamación. También son liberados aquellos que contienen α-defensinas, catepsina G, elastasa y proteasa 3, entre otros (197). Aunado a los mecanismos descritos anteriormente, Brinkmann, et al., en 2004, describieron uno nuevo desplegado por los neutrófilos para la contención de los microorganismos, que implica, además, la muerte del propio neutrófilo; en este fenómeno biológico, el núcleo de estas células pierde su forma lobulada característica, la eucromatina y la heterocromatina se homogenizan, hay ruptura de su membrana nuclear y disolución de los gránulos citoplásmicos, permitiendo que los componentes celulares y nucleares se mezclen para, finalmente, producir ruptura de la membrana celular y poder ser liberados al medio extracelular. A estos complejos o redes liberados se les llamó trampas extracelulares (extracellular traps [ET]) y, por ser liberados por los neutrófilos, se denominaron específicamente NETs (200). Debido a que se consideró que la consecuencia final de este proceso es la muerte del neutrófilo, varios autores hacen referencia a este mecanismo de muerte como «netosis» (197). Es importante señalar que las características morfológicas y los procesos bioquímicos que presentan las células que mueren por netosis son diferentes y distinguibles de aquellos presentados por células necróticas o apoptóticas. En la netosis no hay exposición de fosfatidilserina, activación de caspasas, ni fragmentación de ADN, como 81 ocurre en la apoptosis, y, aunque sí hay ruptura de la envoltura nuclear, esta ocurre al inicio del proceso y no en etapas tardías, como se presenta en la necrosis. Es interesante destacar que se ha descrito que cuando el inductor de la formación de las NETs es phorbol myristate acetate (PMA), los neutrófilos inicialmente presentan autofagia, pero si esta es inhibida, también lo es la liberación de NETs, y los neutrófilos mueren por apoptosis, lo que sugiere que las vías de señalización de diferentes mecanismos de muerte están conectadas (201). Recientemente se han descrito de manera más detallada las primeras etapas del proceso de formación de las NETs (primeros 5-60 min), en particular en respuesta al estímulo con Staphylococcus aureus. Los autores señalan que lo primero que ocurre es la desintegración de la membrana nuclear, tanto la interna como la externa, y la formación de vesículas con membrana íntegra que contienen ADN, las cuales se encuentran inicialmente en el citoplasma. Posteriormente son liberadas al espacio extracelular y, una vez fuera, las vesículas se rompen y el ADN es liberado, lo que le permite atrapar a los microorganismos presentes en ese microambiente. En dicho trabajo se observó, además, que en las fases tempranas de este proceso no hay lisis ni ruptura de la membrana plasmática de los neutrófilos y que la liberación de dichas vesículas ocurre de manera independiente del estallido respiratorio (202). Diversos estudios han mostrado que la formación de NETs no es exclusiva de los humanos, ya que se ha encontrado evidencia de su formación en otros vertebrados como ratones, pollos, conejos, caballos, bovinos, gatos y peces (197). Las NETs, como se ha mencionado, son una barrera física que estaría evitando tanto la diseminación de los microorganismos como el daño al tejido, ya que limita el radio de acción de las moléculas tóxicas, participando así en la regulación de diversas infecciones y del proceso inflamatorio. La estructura fibrosa de las NETs es necesaria para ejercer el secuestro, y en algunos casos además la muerte de los microorganismos al favorecer una alta concentración local de moléculas antimicrobianas (197). El esqueleto de ADN da una superficie cargada negativamente en la cual están embebidas moléculas que estarían mediando la unión con los microorganismos, 82 posiblemente por interacciones electrostáticas entre los componentes catiónicos de las NET y las superficies aniónicas de estos (197). De manera relevante las NETs son abundantes en los sitios de inflamación; in vivo se han detectado en disentería experimental, apendicitis humana, malaria y mastitis bovina, entre otras; y, han sido implicadas, además, en enfermedades tan diversas como las autoinmunes (lupus), en infertilidad y en preclampsia, aunque en algunos casos no está claro el papel que tiene su inducción y formación (197). Por otro lado, Yost, et al. (203), en 2009, utilizando neutrófilos de neonatos estimulados 1 h con lipopolisacárido (LPS), factor activador de plaquetas, PMA o algunas bacterias, concluyeron que estos no eran capaces de generar NETs y plantearon la posibilidad de que esto contribuya a la predisposición de los neonatos a cierto tipo de infecciones en etapas tempranas de la vida. Este grupo ubica esta incapacidad como una nueva deficiencia del sistema inmune de los neonatos, y han establecido que no se debe a una deficiencia en la activación de la NADPH oxidasa, como ocurre en los pacientes con enfermedad granulomatosa crónica. Contrariamente a lo anterior, Marcos, et al. (204), en 2010, describieron que los neutrófilos de los neonatos sí pueden generar NETs y que, al igual que en adultos, tienen propiedades microbicidas, pero que, al menos cuando el estímulo es vía TLR2/TLR4, el tiempo en el que responden es mayor. Estos autores señalan que, mientras los adultos responden desde la primera hora de cultivo en presencia del inductor, los neutrófilos de neonatos inician la formación de redes a las 2 h e igualan la cantidad de NETs formadas por los adultos a las 3 h aproximadamente. Lo que quedaría por establecer es si este retraso en la generación de NETs tiene implicaciones en la respuesta temprana a infecciones en los neonatos. 2.7.1. AGENTES INDUCTORES DE LAS NETs. Se ha evidenciado que la producción de NETs in vitro puede presentarse entre 5 min y 4 h después del estímulo. In vivo se han detectado en diferentes sitios anatómicos, los 83 cuales se han relacionado con distintas enfermedades; así, se han detectado en la circulación sanguínea, el riñón, los pulmones y la piel, entre otros sitios (197). Dentro de los inductores de NETs tenemos agentes químicos y biológicos (197). Entre los primeros están el PMA, la IL-8, el H2O2, el factor activador de plaquetas y el óxido nítrico, el cual, según se ha descrito claramente, in vitro media la generación de radicales libres en los neutrófilos induciendo así la liberación de NETs; este efecto se inhibe si se adiciona N-acetilcisteína. Además, la adición de interferón α/γ (IFN-α/γ) y C5a o factor estimulante de granulocitos macrófagos (GM-CSF) y C5a también es capaz de activar e inducir la producción de NETs. Por otro lado, también se ha demostrado que la adición de partículas de látex puede inducir la generación de redes en los neutrófilos (197). Con respecto a los agentes biológicos, la lista de inductores de NETs se incrementa rápidamente. A la fecha, se han descrito como inductores de NETs las plaquetas activadas, diversas bacterias (Staphylococcus aureus, Salmonella typhimurium, Shigella flexneri, Streptococcus pyogenes, Escherichia coli, Pseudomona aeruginosa, Mannheimia haemolytica, Mycobacterium tuberculosis), hongos (Candida albicans, Aspergillus fumigatus), parásitos (Plasmodium falciparum, Leishmania amazonensis, Eimeria bovis) y recientemente virus (virus de la leucemia felina) (197). En algunos casos y de manera muy interesante, ciertas moléculas purificadas de algunos microorganismos han probado inducir por sí solas, y de manera eficaz, la producción de NETs, como el LPS de Escherichia coli, la LPG de Leishmania amazonenesis, la proteína M1 de Streptococcus pyogenes y la leucotoxina de Mannheimia Haemolytica. Como se mencionó anteriormente, estas ET son inducidas tras la activación de los neutrófilos, y se ha descrito ampliamente que depende en muchos casos de la generación de especies reactivas de oxígeno (ROS), ya que el uso de inhibidores de la NADPH oxidasa bloquea su formación (197). Además, los pacientes con enfermedad granulomatosa crónica, enfermedad caracterizada por la presencia de neutrófilos marcadamente deficientes en su capacidad 84 para destruir algunas especies bacterianas debido a la carencia de la NADPH oxidasa, no son capaces de formar NETs (197). En 2009, Bianchi, et al. observaron que, al corregir la alteración con terapia génica de un paciente con enfermedad granulomatosa crónica, se logra restaurar su capacidad de producción de ROS y, por consiguiente, de generar NETs (112). Adicionalmente, y como se ha mencionado previamente, al evaluar la capacidad de formación de NETs, se ha encontrado que, aunque la producción de ROS es necesaria, no es suficiente para la inducción (205). Se ha analizado con gran detalle que el componente mayoritario de las NETs es el ADN, el cual forma las fibras sobre las cuales se encuentran «pegadas» diferentes moléculas contenidas en el citoplasma o en los gránulos de los neutrófilos, por lo que el uso de DNAsa las desintegra (197). La mayoría de los trabajos señalan que el ADN que se encuentra en las NETs es de origen nuclear, pero Yousefi, et al., en 2009, demostraron que las NETs producidas por los neutrófilos en respuesta al estímulo inicial con GM-CSF y posteriormente con el componente C5a del complemento o activándolos a través de TLR-4 pueden contener ADN mitocondrial y no nuclear, lo que no implica la muerte del neutrófilo; incluso han señalado que los neutrófilos que emiten este tipo de NETs sobreviven más tiempo en comparación con los neutrófilos no activados (206). Este trabajo es similar a lo encontrado para eosinófilos, los cuales liberan ADN mitocondrial para combatir patógenos. Lo anterior implica interesantemente que el origen del ADN liberado puede variar dependiendo del estímulo que se reciba. En su descripción original, Brinkmann et al. mencionan, además del ADN, la presencia de histonas (H1, H2A, H2B, H3 y H4), elastasa, catepsina G, mieloperoxidasa, lactoferrina y gelatinasa, y descartan la presencia de anexina I, actina, α-tubulina y citocromo C, entre otros (200). Urban, et al., en 2009, haciendo un estudio proteómico en las NETs, identificaron 24 proteínas asociadas a ellas. Los análisis cuantitativos de estas proteínas y por microscopia electrónica de alta resolución mostraron que las NETs son estructuras 85 formadas por ADN, histonas modificadas y proteínas contenidas originalmente en gránulos o en el citoplasma de los neutrófilos (207-208). Cabe mencionar que las histonas H2A, H2B, H3 y H4 son las proteínas más abundantes en las NETs, ya que representan el 70% del total de proteínas asociadas a estas estructuras, siendo la H2A y la H2B las que se encuentran en mayor proporción (40). Con respecto a sus efectos sobre los microorganismos, se sabe que las histonas, así como péptidos derivados de ellas, tienen actividades antimicrobianas. La elastasa del neutrófilo es la segunda proteína en abundancia presente en las NETs, después de las histonas. Representa el 5.84% del total de proteínas presentes y tiene actividad proteolítica (es una serina proteasa). La elastasa de los neutrófilos es una molécula efectora clave de la respuesta inmune innata, ya que presenta una potente actividad antimicrobiana; sin embargo, puede participar en la remodelación del tejido y en la respuesta inflamatoria local (197). Entre sus principales funciones se encuentra la digestión del tejido conectivo, así como de componentes de la matriz extracelular, incluyendo varios tipos de colágena, fibronectina, proteoglicanos y heparina, entre otros. Induce también la secreción de citocinas, glicosaminoglicanos y mucina, además de actuar como un modulador de la inflamación (197). La elastasa actúa además catalizando precursores de citocinas y receptores, involucrándose en el control de la bioactividad de éstas y en su biodisponibilidad (209). Papayannopoulos, et al. (210), en 2010, describieron que durante la formación de las NETs la elastasa escapa de sus gránulos y se transloca al núcleo, donde degrada histonas específicas, favoreciendo la descondensación de la cromatina, lo cual se ve favorecido en un evento posterior, gracias a la mieloperoxidasa (197). El mismo grupo de trabajo ha señalado la importancia de la mieloperoxidasa en la formación de las ET, ya que los neutrófilos de pacientes carentes de esta enzima no tienen la capacidad de hacer NETs. 86 En resumen, las proteínas presentes en las NETs y la conjunción de todas estas con las fibras de ADN limitan la diseminación de diversos microorganismos. Sin embargo, muchos de estos componentes son nocivos además para las células propias ubicadas en la periferia de estas estructuras, de ahí que la degradación de las NETs sea muy importante para mantener la homeostasis tisular. 2.8. ANTÍGENOS LEUCOCITARIOS HUMANOS. Las funciones más importantes de los linfocitos T son la defensa frente a microorganismos intracelulares y la activación de otras células tales como macrófagos y linfocitos B. Una característica esencial para estas funciones es la especificidad limitada de los linfocitos T por los antígenos mostrados por las células del huésped infectadas, las células dendríticas, los macrófagos y los linfocitos B (211-214). La tarea de mostrar los antígenos de los microorganismos asociados a células para su reconocimiento por las células T es realizada por proteínas especializadas codificadas por genes situados en un locus denominado complejo principal de histocompatibilidad (MHC). El MHC fue descubierto como un locus extendido que contenía genes altamente polimórficos que determinaban el resultado de los trasplantes titulares entre individuos. Actualmente sabemos que la función fisiológica de las moléculas MHC es la presentación de péptidos a las células T (213-214). Así, las moléculas MHC son parte integral de los ligandos que reconocen la mayoría de las células T, ya que los receptores de antígenos de las células T realmente son específicos para los complejos de antígenos peptídicos extraños y moléculas del MHC propias (213-214) (Figura 4). . TCR MHC II Péptido APC Linfocito T TCR MHC II Péptido APC Linfocito T Figura 4. Reconocimiento de un complejo péptido-MHC por una célula T. Este esquema muestra una molécula del MHC que está unida a un péptido y que lo presenta, y receptor de célula T que los reconoce. 87 Hay dos tipos diferentes de productos de los genes del MHC; las moléculas de clase I y las moléculas de clase II, que presentan conjuntos diferentes de antígenos proteicos (antígenos extracelulares que han sufrido endocitosis y antígenos intracelulares citosólicos) y presentan péptidos a los diferentes subgrupos de células T, los linfocitos T colaboradores T CD4+ y los linfocitos T citolíticos CD8+ respectivamente (214,214). Las moléculas del MHC humano reciben el nombre de antígenos leucocitarios humanos (HLA). Se han definido al menos seis loci genéticos polimórficos diferentes, agrupados en una sola área del genoma, en el cromosoma 6. Se llamaron así debido a que se expresan en leucocitos humanos. Los primeros tres genes definidos se bautizaron como HLA-A, HLA-B y HLA-C y se agrupan como genes de clase I del MHC. El primer gen que se identificó localizado en una región adyacente al locus HLA y su proteína codificada se denominó molécula relacionada con el HLAD o HLA-DR (213-214). Se localizaron otros dos loci adyacentes que recibieron el nombre de HLA-DQ y HLA-DP y se agrupan como genes de clase II del MHC (Figura 5). Las moléculas de clase I están constituidas por dos cadenas polipeptídicas unidas sin enlaces covalentes: una cadena  codificada por el MHC (o cadena pesada) de 44 a 47 KDa, y una subunidad no codificada por el MHC de 12 KDa denominada microblobulina 2 (Figura 6). Todas las células nucleadas pueden presentar péptidos asociados a moléculas de clase I, derivados de antígenos citosólicos, a linfocitos T CD8+ debido a que todas las células nucleares expresan moléculas MHC de clase I (213- 214). ACBDRDP DQ Locus de la clase I del MHC Locus de la clase II del MHC ACBDRDP DQ Locus de la clase I del MHC Locus de la clase II del MHC Figura 5. Mapa esquemático de los loci del MHC humano 88 La molécula de clase II es un heterodímero constituido por una cadena, una cadena de 32 a 34 KDa y una cadena  de 29 a 32 KDa. Un polipéptido no polimórfico denominado cadena invariante (Ii) se asocia a las moléculas de clase II recién sintetizadas. El Ii desempeña papeles importantes en el tráfico de moléculas de clase II y en la determinación del sitio de la célula en el que se unen los péptidos a las moléculas de clase II. A diferencia con lo que sucede en las moléculas de clase I, las dos cadenas de las moléculas de clase II están codificadas por genes polimórficos del MHC. Totalmente ensamblada requiere la presencia de la cadena, la cadena  y un péptido antigénico unido, y la expresión estable en la superficie celular requiere la presencia de los tres componentes del heterotrímero (213-214) (Figura 7). Las dos propiedades que permiten a una célula comportarse como una CPA para los linfocitos T CD4+ restringidos por en MHC de clase II son la capacidad para procesar antígenos internalizados por endocitosis (de origen extracelular) y la expresión de productos génicos del MHC de clase II. Solo poblaciones celulares especializadas expresan habitualmente las moléculas de clase II del MHC. Las CPA mejor definidas para los linfocitos T colaboradores son las células dendríticas, los macrófagos y los Hendidura de unión al péptido 12 1 2 Región transmembrana Hendidura de unión al péptido 12 1 2 Región transmembrana Hendidura de unión al péptido 1 2 Región transmembrana 2 1 Hendidura de unión al péptido 1 2 Región transmembrana 2 1 Figura 7. Estructura de una molécula de clase II del MHC Figura 6. Estructura de una molécula de clase I del MHC. 89 linfocitos T; estos tipos celulares se denominan CPA profesionales. Son el nexo de unión entre la inmunidad innata y la adaptativa (213-214) (Figura 8). Los neutrófilos son células efectoras de la respuesta inmune innata. Se ha observado que estimulados por IFN- , GM-CSF o IL-3 in vitro para expresar HLA-DR adquieren las funciones de célula accesoria en la activación de células T antígeno-mediadas, participando por tanto en la inmunidad adaptativa (214). CÉLULA DENDRÍTICA LINFOCITO B MACRÓFAGO CÉLULA DENDRÍTICA LINFOCITO B MACRÓFAGO Figura 8. Células presentadoras de antígenos profesionales. Son células que exponen en su superficie fragmentos peptídicos de antígenos proteicos asociados a moléculas de clase II del MHC. 96 3. HIPÓTESIS Y OBJETIVOS. 3.1 HIPÓTESIS. Este trabajo, sigue la línea de investigación que el Servicio de Inmunología y Alergia del Hospital Universitario Virgen Macarena realiza sobre la participación directa del neutrófilo en la respuesta inmuno-inflamatoria, estudiando las posibles modificaciones sobre aspectos funcionales de los neutrófilos de enfermos con distintos tipos de hipersensibilidad y su comportamiento tras estímulos específicos. Previamente nuestro grupo ha demostrado como el Neutrófilo puede ser un elemento esencial en la respuesta de Hipersensibilidad de tipo I, mediado por IgE. La implantación de Aparatología Multibrackets es una técnica fundamental para el hacer clínico de un Especialista en Ortodoncia. Este tipo de aparatos tienen Níquel en proporciones apreciables en su composición. El sulfato de Níquel es la principal causa de Dermatitis de Contacto en el ser humano y tras la implantación de Aparatología Multibrackets origina lesiones compatibles con el desarrollo de una Dermatitis de Contacto importante por el desarrollo de una hipersensibilidad tardía de tipo IV. Es conocido el hecho que en la Dermatitis de Contacto se desarrolla una “información generalizada” y no sólo local del Sistema Inmune. Siendo el Neutrófilo una célula con un papel prominente en el inicio y desarrollo de la respuesta IgE, nos preguntamos si puede desarrollar el mismo papel en una hiperrespuesta de tipo IV inducida por la implantación de Aparotología Multibrackets. 3.2. OBJETIVOS. OBJETIVO GENERAL: Inducir una respuesta en el neutrófilo por el antígeno (Sulfato de Níquel) que produce el cuadro clínico y comprobar si esta es específica al no producirse por otros antígenos no responsables del cuadro clínico. OBJETIVOS ESPECÍFICOS: 1. Analizar la liberación de un mediador de liberación rápida como la histamina y otro de liberación lenta como la proteína cationica de los eosinófilos (ECP.) 2. Comprobar si el tercer elemento de actuación de los neutrófilos como es la formación de las trampas extracelulares o NETs, se realizaba en estos pacientes. 97 3. Comprobar los efectos de la activación del Factor NF-B en comparación con los controles. 3.1. Analizar la activación del Factor NF-B por sus dos vías: Vía Clásica: Mediante el análisis de producción de p65. Vía Alternativa: Mediante la determinación de p52. 3.1.1. ROS. Activación de Radicales Tóxicos de Oxígeno. 3.1.2. IL-8. Interleukina 8. 3.1.3. COX-2. Enzima Ciclooxigenasa 2. PGE2. Prostaglandina E2. TXA2. Tromboxano A2. 4. Activación del Inflamasoma como modelo fisiopatológico productor de múltiples efectos del Sistema Inmune Inflamatorio humano. A través de dos de sus elementos definitorios como son 4.1. Formación de NLRP3 (pyrin domain-Containing protein 3). 4.2. Liberación de IL-1β. Interleukina 1 beta. 5. Y por último vamos a investigar la posibilidad de que el Neutrófilo pueda ejercer funciones de Célula Presentadora de Antígenos, como sucede en la respuesta mediada por IgE. 98 4. MATERIALES Y MÉTODOS. 4.1. PACIENTES Y CONTROLES. El estudio incluye a 15 pacientes con tratamiento de ortodoncia con sospecha de alergia al sulfato de níquel (en adelante llamados sensibles). 15 pacientes en tratamiento de ortodoncia sin sospecha de alergia al sulfato de níquel (en adelante llamados no sensibles) y 15 voluntarios sanos sin historia de eczema de contacto (en adelante llamados sanos). 4.2. TESTS EPICUTÁNEOS. Las pruebas epicutáneas son un procedimiento diagnóstico estandarizado de exposición a sustancias susceptibles de provocar dermatitis de contacto. El primero en describirlo fue Josef Jadassohn en 1895. Las pruebas epicutáneas miden la hipersensibilidad celular (hipersensibilidad retardada o reacción tipo IV de la clasificación de Gell y Coombs). Este tipo de hipersensibilidad esta provocado por la activación de Linfocitos T al interaccionar con el determinante antigénico en la membrana de las células presentadoras del antígeno (Figura 13). Las pruebas epicutáneas quieren reproducir la reacción de forma limitada local y temporalmente con las sustancias que se sospecha que producen la dermatitis. 99 Figura 13: Activación del linfocito T citotóxico por el hapteno que se une al carrier (proteína de la piel.) MATERIAL NECESARIO - Parches dispuestos en dos tiras de 5 cámaras adheridas a una tela adhesiva hipoalergénica; entre los más utilizados y son los que empleamos nosotros se encuentran: FINN CHAMBER: cámara para pruebas epicutáneas que ofrece, debido a su diseño, una oclusión completa de la prueba. Es una cámara de aluminio de un diámetro interior de 8 mm que cubre una superficie de 50 mm2 y que tiene una capacidad de unos 20 microlitros. Las cámaras vienen montadas en cinta adhesiva Scanpor en tiras de 10 (2x5), 5 (1x5), y llevan un papel protector que puede quitarse fácilmente. INTERPRETACION DE LOS PATCH TEST: • Si no aparece eritema ni lesiones: Negativo • Si aparece eritema dudoso: Dudoso (+/-) • Si aparece eritema con prurito: Positivo leve (+) • Si aparece vesículas, eritema, pápula, o infiltración: Positivo (++) • Si la reacción es muy exagerada con vesículas: Muy positiva (+++) Figura 14: Tests epicutáneos. Los Tests Epicutáneos se realizaron con la aplicación de FinnChambers con una batería estándar de contactantes (220) suministrado por Bial-Aristegui (Bilbao, España). Los tests se leyeron a las 48, 72 y 96 horas usando una puntuación de acuerdo con el International Contact Dermatitis Research Group (ICDRG) scoring system. Los pacientes escogidos eran monosensibles al sulfato de níquel (Figura 14). 100 4.3. REACTIVOS Las sales metálicas que se usaron para los experimentos in vitro fueron, sulfato de níquel (NiSO4), cloruro de cobalto (CoCl2) (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA). Todos los demás reactivos se indicarán en su apartado correspondiente. Todos los reactivos utilizados en este trabajo tenían una cantidad de endotoxinas ≤ 0.001 ng/ml tras realizarles el Coatest Limulus lysate assay (Chromogenix, Mölndal, Sweden). Este ensayo permite determinar las endotoxinas bacterianas. Estas endotoxinas se pueden conocer a través de una reacción enzimática a través de la p-nitroanilina (pNA) y calcular espectrométricamente a través de una longitud de onda de 405 nm. Después de efectuar una curva de calibración podemos determinar la concentración que existe en nuestra muestra (Figura 15). Figura 15: Curva de calibración para la realización del test Coatest Limulus lysate assay (Chromogenix, Mölndal, Sweden). 4.4. AISLAMIENTO CELULAR. 4.4.1. Obtención de células granulocíticas. Para la separación de los granulocitos seguimos el método de Böyum (221). Los neutrófilos humanos son purificados tras la extracción por venipuntura al vacío de 3 tubos heparinizados HD con 10 ml de sangre venosa periférica (Figura 16). 101 A esta sangre heparinizada le agregamos una solución de Dextrano T-500 al 10% en PBS y lo mezclamos cuidadosamente durante 2 minutos mediante agitación de 90º y se deja sedimentar unos 45-60 minutos a temperatura ambiente. Transcurrido este tiempo, extraemos con cuidado el sobrenadante de color amarillento con una pipeta “Pasteur” y se vierte cuidadosamente sobre un tubo de ensayo que contiene Ficoll-Hypaque, en proporción 1:2 de Ficoll: sangre, haciendo resbalar el sobrenadante sobre la pared del tubo para evitar que se mezclen y pueda quedar sobre el Ficoll. A continuación centrifugamos a 2000 r.p.m. durante 20 minutos a 4ºC. Después de esta centrifugación, nos encontramos con diferentes fracciones (de arriba abajo): plasma, anillo linfocitario (donde se encuentran los linfocitos y monocitos), Ficoll, y abajo un precipitado rojizo donde se encuentran los granulocitos y hematíes. Primero se extrae el anillo de linfocitos y monocitos, esta interfase se desecha, y después el resto de sobrenadante, quedando sólo el botón de granulocitos y eritrocitos. Figura 16. Método de Boyum. Obtención de células granulocíticas. Al pellet rojizo, le realizamos un choque hemolítico hipotónico para romper los hematíes: resuspendemos el precipitado añadiendo 5 ml de agua destilada y desionizada (H2Odd), y a continuación añadimos rápidamente (en menos de 30 segundos) 5 ml de NaCl al 1,8% que devuelve la solución a una concentración isotónica. La suspensión 102 celular se centrifuga a 1200 r.p.m. durante 5 minutos a 4ºC. Los precipitados resultantes se someten a dos procesos de lavado por resuspensión en 10 ml de PBS y centrifugación a 1200 r.p.m. durante 5 minutos a 4ºC. Finalmente, descartando el sobrenadante, el pellet celular conseguido, que corresponde a granulocitos humanos, se resuspende en PBS sin glucosa, Ca++ ni Mg++, para evitar la activación celular. 4.4.2. Purificación de neutrófilos, eliminación de eosinófilos residuales. Aunque por el método anteriormente descrito se obtienen mayoritariamente células polimorfonucleares (neutrófilos), aparece también una contaminación residual de otras células granulocíticas, como son los eosinófilos. Para obtener una población de neutrófilos purificados se usa el sistema de separación celular magnética. Los eosinófilos pueden identificarse en base a su carácter de granulocitos CD9 positivo. Por tanto, la preparación de neutrófilos se incuba con anticuerpos anti-CD9 de ratón a una concentración de 4 g/ml dirigidos contra el CD9 humano durante 30 minutos a 4ºC. Posteriormente las células se lavan con PBS y se incuban con anticuerpo anti-IgG de cabra anti-ratón acoplados a microesferas magnéticas durante 30 minutos a una concentración de 50 l/10 millones de células. Esta suspensión celular se somete a un segundo lavado con PBS. Neutrófilos y eosinófilos son separados tras su paso por una columna imantada, los eosinófilos con bolas anti-CD9 son fijados a las paredes de la columna, mientras los neutrófilos se desplazan al fondo de la misma (Figura 17, 18 y 19). La suspensión celular de neutrófilos puros la pasamos a otro tubo con una pipeta Pasteur. 103 Figura 17. Este método permite la separación de varias tipos celulares en función de los antígenos de superficie de las mismas (moléculas CD). Figura 18. Las células se separan mediante la incubación con magnética nanopartículas recubiertas con anticuerpos contra un antígeno de superficie en particular. Esto hace que las células que expresan este antígeno se unan a las nanopartículas magnéticas. 104 Figura 19: A continuación la solución de células se transfiere a una columna colocada en un campo magnético fuerte. En este paso, las células unidas a las nanopartículas (que expresa el antígeno) se quedan en la columna, mientras que otras células (que no expresan el antígeno) quedan en la solución. 4.4.3. Obtención de células mononucleares (linfocitos y monocitos). Para la separación de células mononucleares seguimos el método de Böyum (221) .Se diluyen 30 ml de sangre de los sujetos en estudio, obtenida por venipuntura al vacío en tubos heparinizados HD, con 30 ml de tampón PBS (dilución 1:1). La sangre diluida se distribuye, con pipeta “Pasteur”, en tubos de fondo cónico sobre una solución de Ficoll- Hypaque a una proporción 1:2 (3 ml de ficoll y 6 ml de sangre). La dilución debe añadirse cuidadosamente para evitar que no se mezcle con el Ficoll-Hypaque. Las muestras se centrifugan a 2.500 r.p.m. durante 20 min, a 4ºC, obteniéndose las fracciones que se muestran en la Figura 20. El anillo formado en la interfase del gradiente, que contiene las células mononucleares (linfocitos y monocitos) se recoge con pipeta “Pasteur” y se coloca en tubos limpios. Seguidamente se añade PBS hasta completar un volumen de 10 ml y se centrifugan a 1.700 r.p.m. a 4ºC, durante 10 min. Al precipitado resultante se le da un choque hipoosmótico para lisar los glóbulos rojos contaminantes, con el siguiente procedimiento: se resuspende en 5 ml de H2Odd durante 15-20 segundos y, a continuación, se añaden 5 ml de NaCl al 1.8%. De esta forma se restaura la isoosmolaridad (0.9%). Se vuelve a centrifugar a 1.200 r.p.m. a 4ºC, durante 10 minutos. Después el precipitado se lava dos veces por 105 resuspensión en 10 ml de tampón PBS y centrifugación a 1.200 r.p.m. durante 10 minutos, a 4ºC. Las células mononucleares ya obtenidas se resuspenden en medio de cultivo. Figura 20. Separación de células mononucleares. 4.4.4. Purificación de linfocitos. Las células mononucleares anteriormente obtenidas se resuspenden en medio de cultivo y se incuban a 37ºC durante 1 h en placas de cultivo de plástico (placas de Petri). Seguidamente, se aspira el medio de cultivo con los linfocitos, que se mantienen en suspensión a diferencia de los monocitos que se adhieren al fondo de la placa (Figura 21). Figura 21. Adherencia de monocitos al plástico de la placa de Petri. 112 4.13. DETERMINACIÓN DE LA INTERLEUKINA-1 Neutrófilos (107 células/ml; 1 ml) se incubaron en RPMI y tratadas con los agonistas según se indica durante 24 horas a 37ºC y 5% de CO2. Posteriormente se determinó la cantidad en el sobrenadante celular mediante una técnica de ELISA (QUANTIKINE. R&D Systems Minneapolis, MN, USA) 4.14. CUANTIFICACIÓN DE NLRP3. Los neutrófilos se resuspendieron a una concentración de 5x 106 células/ml en RPMI- 1640 medium (LifeTechnologies, Gaithersburg, MD, USA) suplementado con 2% FBS (Gibco BRL, USA), 100 IU/ml penicilina y 100 mg/ml estreptomicina a 37ºC. 106 neutrófilos después de 1 h de incubación con los agonistas, se resuspendieron in RIPA lisis buffer (100mM Tris-HCl pH 7.4, 300mM NaCl, 10% NP40 y 10% sodium deoxycholate) suplementado con una mezcla de inhibidores de proteasas (Roche, Welwyn Garden City, UK) y 200mM dithiothreitol. El lisado se centrifugó y el NLRP3 se cuantificó empleando un método de ELISA (MYBIOSURCE San Diego, CA, USA). 4.15. INHIBIDORES. Para evaluar el procesamiento postraslacional de la IL-1β se utilizó el inhibidor de caspase-1 z-VAD-fmk (Invivogen) (Sigma-Aldrich) a una concentración de 100 μM/ml Para los experimentos para la inhibición de la señal de TCR se utilizó el un anticuerpo monoclonal anti-TCR (Endogen, Bonn, Alemania), a una concentración de 10μg/ml. Hemos empleado un inhibidor de la fosforilación del IB (BAY 11-7082. SISMA) a una concentración de 10 µM para explorar la participación del NF-B. Los mecanismos dependientes del TLR4 en neutrófilos se inhibieron utilizando el Viral Inhibitor Peptide (VIPER) (Novus Biologicals, Littleton, CO, USA). Las células se trataron con 30 µM 2 horas antes de añadir el antígeno al cultivo. 113 Los neutrófilos exhiben un alto contenido en serina proteasas como elastasa, PR3 y Catapepsina 1en sus gránulos que son capaces de inducir por un mecanismo Caspasa-1 independiente la liberación de la IL-1β a través de su actuación sobre la pro- IL-1β. Para ello empleamos Elafin (Anaspec, Fremont, CA, USA), un inhibidor de elastase/PR3 a una concentración de 10 μg/ml Para la catepsina 1 un inhibidor de la misma (CatG I. EMD Biosciences, San Diego, CA, USA) a una concentración de 10 μM. 114 5. RESULTADOS Y DISCUSIÓN. Estudios epidemiológicos han demostrado que el níquel es alergeno de contacto más prevalente en la población general en los países industrializados (222). Los materiales metálicos que se usan para el tratamiento ortodóncico pueden producir o empeorar dermatitis de contacto ya existente en los pacientes (222). Hasta ahora muchos de los posibles mecanismos implicados en la fisiopatología de DAC, permanecen siendo desconocidos (222). El grupo del HUVM es pionero en la investigación del papel del neutrófilo en la reacción alérgica IgE-dependiente (16). A partir de estos estudios hemos querido investigar si también puede tener un papel en la respuesta inmunológica dependiente de células conocido como tipo IV, en la clasificación de Gell y Coombs (3). Los neutrófilos desarrollan sus funciones a través de 3 mecanismos fundamentales, liberación de mediadores, fagocitosis y la liberación de trampas extracelulares (16). En este caso la fagocitosis no tiene lugar, por lo que investigaremos las otras posibilidades. 5.1. Activación de los neutrófilos. Análisis de la liberación de un mediador de liberación rápida como la histamina y otro de liberación lenta como la proteína cationica de los eosinófilos (ECP). Inicialmente, hemos intentado demostrar si los neutrófilos se activaban en respuesta al antígeno y se inducia la liberación de 2 mediadores que el grupo del HUVM previamente había identificado como producidos por neutrófilos en respuesta a alérgenos, la histamina y la proteína catiónica de eosinófilos (ECP) (129-130, 223). 5.1.1. HISTAMINA. Como podemos ver en la Figura 26, los neutrófilos de pacientes con DAC son capaces de liberar al medio de cultivo histamina tras provocación in vitro con el antígeno. En la curva tiempo-respuesta hemos podido comprobar que la máxima liberación se produce a los 30 minutos de introducir el estímulo en el medio de cultivo y en la curva dosis- 115 respuesta pudimos observar que la máxima liberación se produce con una concentración de antígeno de 20 μg/ml. g/ml antígeno 0 1 5 10 20 30 40 60 % histamina liberada Figura 26: Liberación de histamina. Curvas dosis-efecto y tiempo-respuesta. En el eje de las y se expresa el % de histamina sobre el total de histamina contenida en los neutrófilos. Tiempo (min) 0 10 20 30 40 50 60 % histamina liberada Fi g ura 26 116 También podemos observar como la respuesta es específica (Figura 27). En los pacientes sólo produce liberación de histamina con el antígeno responsable y no otro antígeno al cual el paciente no es sensible (p<0.001). No se produce ninguna liberación de histamina en sujetos sanos ni en sujetos con brackets no sensibles a ningún antígeno. En todos los grupos se libera histamina cuando se estimulan los neutrófilos con una sustancia que produce una activación inespecífica como es el LPS. Cuando se estimulan con este último producto la liberación de los neutrófilos de pacientes con DAC, liberan más histamina que los neutrófilos de los otros dos grupos (p<0.01). % histamina liberada % histamina liberada Fi g ura 27 117 Figura 27: Especificidad de la respuesta de la liberación de histamina (Ver texto). La histamina interviene en la fisiopatología de la DAC de muy diversas formas. La histamina aumenta la producción de IL-6 e IL-8 en queratinocitos humanos (224) Produce vasodilatación y un aumento de la permeabilidad vascular (225). Con producción de IL-6 e IL-8 por las células endoteliales. La histamina media la quimiotaxis de mastocitos y eosinófilos, siendo el mayor responsable de la acumulación de mastocitos en los tejidos en los procesos alérgicos. Regula la aparición de moléculas de adhesión en eosinófilos (224-225). La histamina estimula a los linfocitos para que produzcan IL-16, que a su vez desarrolla un importante papel en la inmunidad mediada por células, como es la reacción de hipersensibilidad retardada (226-227). Produce proliferación y quimiotaxis de células T. Estimula la quimiotaxis de las células dendríticas y la liberación de IL-6 por estas. Estimula la liberación de IL-8 por los neutrófilos e induce el reclutamiento de estas células a través de la pared vascular (Figura 28) (228). Comparación de respuesta a LPS en pacientes sensibles con no sensibles y sanos % histamina liberada 118 Figura 28: Modo de acción de la Histamina. En un modelo murino de DAC con presencia de histamin-decarboxilasa (HDC +/+) se presenta una mayor inflamación y un mayor acumulo de neutrófilos que en ratones deficientes de HDC (HDC -/-, un ratón que es deficiente en histamina), tras activar la piel con un antígeno (229). En nuestro caso, la presencia de HDC es superior en neutrófilos de pacientes que en sujetos no sensibilizados o en sujetos sanos, lo que sugiere que estas células están “primadas” o con un gran grado de actividad basal (Figura 29). Figura 29: Presencia de Histamina en una lesión de Dermatitis de Contacto. (DAC) Figura 28 Figura 29 119 5.1.2. ECP. Como podemos ver en la Figura 30 los neutrófilos de pacientes con DAC son capaces de liberar al medio ECP tras provocación in vitro con el antígeno. En la curva tiemporespuesta hemos podido comprobar que la máxima liberación se produce a las 18 horas de poner el estímulo y en la curva dosis-respuesta pudimos observar que la máxima liberación se produce con una concentración de antígeno de 20 μM/ml. También podemos observar como la respuesta es específica. En los pacientes sólo produce liberación de ECP con el antígeno responsable y no otro antígeno al cual el paciente no es sensible. No se produce ninguna liberación de ECP en sujetos sanos ni en sujetos con brackets no sensibles a ningún antígeno (p<0.001). En todos los grupos se libera ECP cuando se estimulan los neutrófilos con una sustancia que produce una activación inespecífica como es el LPS. Cuando se estimulan con este último producto la liberación de los neutrófilos de pacientes con DAC, liberan más ECP que los neutrófilos de los otros dos grupos (0<0,001). La ECP realiza diferentes funciones sobre diversos aspectos del sistema inmuneinflamatorio, una de sus principales funciones es la citotoxicidad demostrada hacia bacterias, virus, helmintos y células humanas normales. Produce liberación de histamina por los basófilos. Produce un aumento de regulación de receptores y moléculas de adhesión en células epiteliales. Tiene acción profibrótica y produce adhesión de los monocitos a células endoteliales (230). La técnica de ventana cutánea fue utilizada para estudiar la morfología celular en la dermis superior y el exudado tras la estimulación in vivo con níquel en pacientes que habían demostrado DAC a este metal. La morfología de las células en el exudado de los pacientes expuestos al níquel demostró, aparte de del acumulo de linfocitos, un predominio de granulocitos polimorfonucleares a lo largo de todo el periodo del estudio. Se descubrió que los eosinófilos eran escasos pero si había grandes cantidades de ECP en ese exudado (230). El grupo del HUVM ha demostrado que el neutrófilo es capaz de sintetizar y liberar ECP, tras un estímulo alergeno específico, por lo que probablemente la ECP encontrada 120 en el exudado proviniera de los neutrófilos (129-130). De acuerdo con esos hallazgos, nosotros hemos demostrado aquí la liberación de ECP en neutrófilos con DAC tras provocación in vitro de Ni. A partir de estos dos experimentos previos optamos a utilizar siempre la dosis de antígeno de 20 μg/ml, para todos los experimentos posteriores. El tiempo de cada experimento se indica en el apartado de Material y Métodos en cada caso. % ECP liberada % ECP liberada g/ml antígeno 0 1 5 10 20 30 50 Figura 30 121 Figura 30: Los neutrófilos de pacientes con DAC son capaces de liberar al medio ECP tras provocación in vitro con el antígeno. Curva dosis-efecto y tiemporespuesta. Especificidad de la respuesta. 5.1.3. NETs. A continuación comprobamos si el tercer elemento de actuación de los neutrófilos como es la formación de las trampas extracelulares o NETs, se realizaba en estos pacientes. Como podemos ver en la Figura 31 los neutrófilos de pacientes con DAC son capaces de liberar al medio NETs tras provocación in vitro con el antígeno. También podemos observar como la respuesta es específica. En los pacientes sólo produce liberación de NETs con el antígeno responsable y no otro antígeno al cual el paciente no es sensible. No se produce ninguna liberación de NETs en sujetos sanos ni en sujetos con brackets no sensibles a ningún antígeno. % ECP liberada % ECP liberada Tiempo (h) 0 3 6 12 24 48 128 Figura 35: Acciones de NF- B. Como podemos ver en la Figura 36 los neutrófilos de pacientes con DAC son capaces de activar al NF-B tras provocación in vitro con el antígeno lo mismo el p65 como el p52, o sea se activa ambas vías, la clásica y la alternativa. También podemos observar como la respuesta es específica. En los pacientes sólo produce activación del NF-B con el antígeno responsable y no otro antígeno al cual el paciente no es sensible. No se produce ninguna activación del NF-B en sujetos sanos ni en sujetos con brackets no sensibles a ningún antígeno. En todos los grupos se activa el NF-B cuando se estimulan los neutrófilos con una sustancia que produce una activación inespecífica como es el LPS. Cuando se estimulan con este último producto a los neutrófilos de pacientes con DAC, se estimula más NF-B que los neutrófilos de los otros dos grupos (p<0.0001). Figura 35 129 Figura 36: Activación del NF–B de neutrófilos de pacientes con DAC tras provocación in vitro tanto del p65 como del p52. Analizando el efecto de los inhibidores de NF-B, observamos que los mismos efectos que ocurren sobre p65 y p52, ocurren sobre la fosforilación de IB y el NRF. Aunque en este último caso observamos que al activar con LPS se produce más cantidad de NRF Niveles de p65 (unidades relativas) Niveles de p52 (unidades relativas) Fi g ura 36 130 en sujetos no sensibles y sujetos sanos que en los pacientes sensibles (Figura 37). Todo ello nos lleva a deducir que en los pacientes existe una menor inhibición de la formación de NF-B activo que en los otros dos grupos estudiados. Figura 37: En los pacientes existe una menor inhibición a la formación de NF-B activo en los otros dos grupos estudiados. Las sustancias liberadas ejercen sus propias acciones que no necesariamente tienen que estar entre las indicadas y no solamente desarrollan esa actividad que hemos indicado, por lo que el efecto de la acción de NF-B es muy amplio. Debido a que el NF-B controla varios genes involucrados en la inflamación, no es de extrañar que NF-B se encuentre activado crónicamente en enfermedades inflamatorias, tales como la enfermedad inflamatoria intestinal, la artritis, sepsis, gastritis, asma y arteriosclerosis entre otros (235, 236). Hay varios trabajos recientes que remarcan la importancia de la conexión entre el NF-B, la inflamación y el cáncer, dando mayor importancia a una posible terapia reguladora del mismo. Esta posibilidad es tan importante que hay una gran polémica en los EEUU sobre la patente del uso de Niveles de NFR fosforilado (unidades relativas) Figura 37 131 moduladores del NF-B en patología humana, que ha incluso llevado a varios juicios a las empresas Ariad y Lilly en el citado país (235, 236). Previamente hemos observado como en el neutrófilo era capaz de activarse el NF-κB tanto por vía clásica como por vía alternativa por un mecanismo IgE-dependiente. Por lo tanto, demostramos aquí que el antígeno es capaz de estimular específicamente la activación del NF-B tanto por vía clásica como por vía alternativa. Que nosotros sepamos es la primera vez que se demuestra esta doble activación en la DAC. Por otra parte cuando estimulamos los neutrófilos con LPS, vemos como la cantidad de p65 y p52 es más elevada en los pacientes que en los sujetos que no tienen sintomatología y en sujetos sanos (Figura 38). Al contrario, si analizamos la cantidad de IB-α fosforilado y NRF, vemos como del primero existe mayor cantidad y del segundo menor en los pacientes sensibles con respecto a los otros dos grupos. Esto último podría significar que en los pacientes con DAC existe una mayor actividad de NF-B tal y como ocurre en otras patologías (235, 236), que se ve acompañada de una mayor actividad de los factores de represión del mismo. Figura 38: Cuando estimulamos los neutrófilos con LPS, vemos como la cantidad de p65 y p52 es más elevada en los pacientes que en los sujetos que no tienen sintomatología y en sujetos sanos. Figura 38 132 La participación de NF-κB está por lo tanto demostrada en la DAC, aunque como ocurre con la producción de la IL-1β, se ha indicado que no es específica sino inespecíficamente a través del TLR4. Como veremos posteriormente, esto no se ajusta en a la realidad. La activación del NF-B conlleva a un proceso necesario en liberación de factores proinflamatorios que pueden explicar muchos de los hallazgos fisiopatológicos de esta entidad. A continuación veremos la importancia del NF-B en la fisiopatología de DAC, observando algunos de nuestros hallazgos influenciados por él. 5.2.2. ROS Como podemos ver en la Figura 39 los neutrófilos de pacientes con DAC son capaces de producir ROS tras provocación in vitro con el antígeno. También podemos observar como la respuesta es específica. En los pacientes sólo se produce ROS el antígeno responsable y no otro antígeno al cual el paciente no es sensible. No se produce ROS en sujetos sanos ni en sujetos con brackets no sensibles a ningún antígeno (p<0.0001). Figura 39: Los neutrófilos de pacientes con DAC son capaces de producir ROS tras provocación in vitro con el antígeno. Luminiscencia (unidades arbitrarias x 106) Figura 39 133 En todos los grupos se produce ROS cuando se estimulan los neutrófilos con una sustancia que produce una activación inespecífica como es el LPS (Figura 40). Cuando se estimulan con este último producto, la liberación de ROS de los neutrófilos de pacientes con DAC es mayor que la de los otros dos grupos (p<0.001). Figura 40: La activación es inespecífica. Desde hace bastante tiempo, la producción de ROS se ha considerado un producto del metabolismo endógeno del oxígeno con capacidad lesiva, y como respuesta a muy diversos estímulos con una actividad perjudicial para el organismo (237). La producción de ROS se ha implicado en la patogénesis de muy diversas patologías y otros procesos como cáncer, envejecimiento, diabetes, ateroesclerosis, inflamación crónica, daño isquemia/perfusión, infección virásica y bacteriana, etc (237). Pero esta idea clásica parece requerir una revisión sustancial, pues se sabe en la actualidad que concentraciones muy bajas de ROS actuan como un segundo mensajero, esencial para el desarrollo de una respuesta celular a muchos estímulos fisiológicos (237) Se entiende hoy que las ROS son mediadores fundamentales para las señales intracelulares (237). Las ROS son productos del metabolismo celular normal y bajo condiciones fisiológicas participan en el mantenimiento de la homeostasis celular “redox” (237). Una gran cantidad de trabajos científicos han destacado la importancia de los ROS como segundo mensajero en numerosos procesos celulares como la Luminiscencia (unidades arbitrarias x 10 6 ) Figura 40 134 proliferación celular, la expresión genética, adhesión, diferenciación, senescencia y apoptosis celular entre otros. La sobre producción de ROS conduce a una condición denominada estrés oxidativo (237). Por otra parte las ROS actúan como inductores importantes de mediadores proinflamatorios (237). Los antígenos de contacto inducen señales de peligro celular mediante la activación de los ROS. Este proceso es crucial dentro de la DAC ya que la sensibilización se previene totalmente con el pretratamiento con anti-oxidantes (237). La activación-producción de las ROS induce un bucle en la respuesta inflamatoria que se produce en la DAC, estimulando a su vez a NF-B e inflamasoma. 5.2.3. IL-8. Como podemos ver en la Figura 41, los neutrófilos de pacientes con DAC son capaces de liberar al medio IL-8 tras provocación in vitro con el antígeno. También podemos observar como la respuesta es específica. En los pacientes sólo produce liberación de IL-8 con el antígeno responsable y no otro antígeno al cual el paciente no es sensible. No se produce ninguna liberación de IL-8 en sujetos sanos ni en sujetos con brackets no sensibles a ningún antígeno (p<0.0001). Expresión de IL-8 (pg/ml) Figura 41 135 Figura 41: Los neutrófilos de pacientes con DAC son capaces de liberar al medio IL-8 tras provocación in vitro con el antígeno. En todos los grupos se libera IL-8 cuando se estimulan los neutrófilos con una sustancia que produce una activación inespecífica como es el LPS (Figura 42) Cuando se estimulan con este último producto la liberación de los neutrófilos de pacientes con DAC, liberan más IL-8 que los neutrófilos de los otros dos grupos (p<0.001). Figura 42: La activación es inespecífica. La IL-8 tiene un efecto esencial y primordial que es su capacidad quimiotáctica sobre basófilos, eosinófilos, monocitos, linfocitos y especialmente para neutrófilos, considerándose como puede actuar de una forma autocrina para potenciar el efecto de estas células. Por ejemplo para desencadenar la degranulación y por consiguiente liberación de β-glucoronidasa, elastasa, MPO, PAF, LTB4 y ROS. Sobre los basófilos origina la liberación de histamina y leucotrienos (238-242). Expresión de IL-8 (pg/ml) Figura 42 136 En pacientes con DAC, se ha demostrado un aumento de IL-8 y TNF-α. En la DAC, es constante como el TNF-α, aumenta su expresión en la piel tras el contacto con el antígeno o que aumente sus niveles en sangre periférica (238-241). Previamente se ha descrito que el níquel estimula la producción de ROS por neutrófilos humanos in vitro, pero además la síntesis y liberación de IL-8 en estas células (242) ,por lo que se puede pensar que nuestro trabajo sólo ratifica los hallazgos anteriores, pero existen grandes diferencias con nuestros resultados. Tal y como describe Freitas et al. (242), los neutrófilos se obtuvieron sólo de donantes sanos y no con dermatitis de contacto sensibles al níquel. La activación in vitro de los neutrófilos se realizó con concentraciones altísimas de Ni (500-1000 μM). Los mismos autores indican que los neutrófilos entran en apoptosis e incluso, aunque con menor intensidad, en necrosis con una concentración de Ni de 250 μM. Parece evidente que con unas concentraciones tan altas de Ni, la producción de ROS y de IL-8 sea debida a un mecanismo citolítico-citotóxico de los neutrófilos independientemente de su condición como antígeno. Todo lo contrario a nuestro estudio, que se ha efectuado en pacientes que los brackets han producido DAC, en pacientes en los que la incorporación de los brackets no ha originado DAC y en sujetos sanos. La concentración de níquel utilizado en nuestros experimentos fue baja (25 μM) en comparación con los de Freitas et al. Nuestros datos indican que la estimulación con los antígenos específicos es un estímulo efectivo para la activación de los neutrófilos de pacientes alérgicos. Este mecanismo es altamente específico, ya que antígenos diferentes a los que producen síntomas clínicos no provocan activación de los neutrófilos y son inefectivos en neutrófilos de sujetos sanos. En concordancia con nuestros resultados, concentraciones similares de Ni a las empleadas en nuestro estudio no indujeron la producción de ROS en sujetos sanos (243-245). 5.2.4. COX-2 Como podemos ver en la Figura 43 los neutrófilos de pacientes con DAC son capaces de liberar al medio PGE2 y TXA2 tras provocación in vitro con el antígeno. También podemos observar como la respuesta es específica. En los pacientes sólo se produce 137 liberación de PGE2 y TXA2 con el antígeno responsable del cuadro clínico y no con otro antígeno al cual el paciente no es sensible. No se produce ninguna liberación de PGE2 y TXA2 en sujetos sanos ni en sujetos con brackets no sensibles a ningún antígeno (p<0.001). Figura 43: Los neutrófilos de pacientes con DAC son capaces de liberar al medio PGE2 y TXA2 tras provocación in vitro con el antígeno. También podemos observar como la respuesta es específica. Liberacion de PGE2(pg/ml) Liberacion de TXA 2 (pg/ml) Figura 43 144 B, de caspasa-1 y de TLR4, mientras que no se afecta si añadimos un inhibidor del TCR (Figuras 51 y 52). Figura 51: En sujetos no sensibles y sujetos sanos, tras estimulación inespecífica con LPS, se cancela la producción de IL-1β si se pone un inhibidor de NF-B, de caspasa-1 y de TLR4. Figura 52: En sujetos no sensibles y sujetos sanos, tras estimulación inespecífica con LPS, no se afecta si añadimos un inhibidor del TCR. Liberacion de IL-1(pg/ml) Liberacion de IL-1(pg/ml) Figura 52 Figura 51 145 Nosotros demostramos aquí como el antígeno es capaz de activar el factor NF-κB por una parte y por otra parte el NLRP3. Ambos son responsables de la liberación de IL-1β. Esta liberación se efectúa a través de la caspasa-1, puesto que si preincubamos los neutrófilos con un inhibidor de dicha proteasa, no tiene lugar la liberación de IL-1β. Con lo cual ponemos en evidencia que el antígeno activa el inflamasoma para producir la IL-1β. Se ha indicado que la producción de IL-1β es inespecífica a través de la activación del receptor TLR4 u otros mecanismos inespecíficos, lo cual resumimos en la Figura 53. Figura 53: Resumen de los procesos para la producción de IL-. Figura 53 146 En nuestro caso, esa producción se realiza de forma específica por los siguientes motivos: 1. Se produce en los pacientes con sensibilidad al níquel y no se produce en pacientes no sensibles, ni en sujetos sanos. En estos dos últimos casos si se produce cuando estimulamos con LPS, que activa a los neutrófilos de forma inespecífica, para demostrar que los neutrófilos son funcionales. 2. En los pacientes sensibles no se anula la respuesta cuando incubamos con inhibidores del TLR4, pero si lo hace cuando incubamos con un anticuerpo inhibidor del TCR. En estos pacientes, si estimulamos con LPS, si se anula la respuesta si cultivamos con inhibidores del TLR4 y no cuando culivamos con anticuerpos inhibidores del TCR. 3. No se produce cuando estimulamos a los neutrófilos de pacientes sensibles a níquel con otro antígeno diferente al que produce el cuadro clínico. Si se produjera inespecíficamente esa activación, como se propone, no se explicaría que solo los pacientes que son sensibles a un antígeno específico tienen unos tests cutáneos positivos mientras que son negativos en sujetos no sensibilizados. Tenemos que tener en cuenta que todos los estudios previos que se han realizado -en los que se indica dermatitis de contacto por Niestán realizados sobre sujetos sanos, o con células derivadas de colecciones humanas (por ejemplo células dendríticas, células de Langerhans, etc.) o en modelos murinos. Ningún experimento ha sido realizado con células de pacientes con dermatitis alérgica de contacto, tal y como lo hemos realizado nosotros. 4. Además, se han utilizado concentraciones todavía más alta de Ni que en los trabajos de Freitas et al., hasta 1500 μM, por lo que estos estudios han llevado, a nuestro parecer, a una idea totalmente errónea de la fisiopatología de la dermatitis alérgica de contacto, que difiere en su totalidad con la que nosotros proponemos en este trabajo. Por otra parte hemos demostrado, por primera vez, que la liberación de IL-1β se produce por la activación de dos vías (Figura 54): 147 1. Caspasa-1 dependiente (canónica o activación del inflamasoma) al estimularse la producción de NRLP3 y Caspasa-1; y por otro lado inhibirse su producción por un inhibidor de la Caspasa-1 y de NF-B. 2. Caspasa-1 independiente (no canónica o inflamasoma independiente) al inhibirse su producción si añadimos al cultivo inhibidores de la elastasa/PR3 y Catepsina- 1. Figura 54: Vías de activación de la liberación de IL-1, Caspasa 1 dependiente y Caspasa 1 independiente. La trascendencia de la IL-1 sobre la fisiopatología de la DAC es tan importante que la sensibilización a un antígeno puede ser inhibida si administramos un anticuerpo bloqueante de la misma antes de exponer la piel a dicho antígeno (250). La IL-1β interviene en gran número de procesos que desarrollan y perpetúan las lesiones en la DAC y que resumimos en la siguiente Figura 55: Fi g ura 54 148 Figura 55. Procesos en los que interviene la IL-1 y que desarrollan y perpetúan las lesiones en la DAC. La IL-1, está aumentada en la DAC. En ratones en ausencia de activación del inflamasoma disminuye la sintomatología de este proceso. La activación del inflamasoma a través de NLRP3 en muchos casos parece ser más importante en la fase de sensibilización en la DAC que en la fase tardía de la misma (Figura 56) (251). Figura 55 149 Figura 56. Imagen histológica en ratones: en ausencia de activación del inflamasoma disminuye la sintomatología de la DAC a las 5 y 24 horas. La activación del inflamasoma a través de NLRP3 en muchos casos parece ser más importante en la fase de sensibilización en la DAC que en la fase tardía de la misma. Según algunos autores la vía no canónica de la liberación de la IL-1, a través de proteasas, tiene una importancia marginal. Estos datos difieren de los nuestros, pero hay que considerar que los hallazgos de esos autores están realizados en modelo murino, lo que puede explicar las diferencias con nuestro trabajo (252). La IL-8 es la mejor conocida de las α-quimioquinas con propiedades quimiotácticas predominantemente para neutrófilos. La IL-8 es un hallazgo constante en los procesos inflamatorios de la piel y está envuelta en la patogenia de la DAC (Figura 57) (253). Fi g ura 56 150 Figura 57: La IL-8 es un hallazgo constante en los procesos inflamatorios de la piel y está envuelta en la patogenia de la DAC. 5.4. EL NEUTROFILO COMO CELULA PRESENTADORA DE ANTÍGENO. Como podemos ver en la Figura 58 los neutrófilos de pacientes con DAC son capaces de activar la proliferación de los linfocitos tras provocación in vitro con el antígeno. También podemos observar como la respuesta es específica. En los pacientes sólo se produce activación de la respuesta proliferativa de los linfocitos con el antígeno responsable y no con otro antígeno al cual el paciente no es sensible. No se produce ninguna activación de los linfocitos en sujetos sanos ni en sujetos con brackets no sensibles a ningún antígeno. En todos los grupos se induce la proliferación de linfocitos cuando se estimulan los neutrófilos con una sustancia que produce una activación inespecífica como es el LPS. Cuando se estimulan con LPS los neutrófilos de Fi g ura 57 151 pacientes con DAC, se induce una mayor proliferación de los linfocitos que con los neutrófilos de los otros dos grupos. Solo en los neutrófilos de pacientes sensibles cuando se estimulan con el antígeno responsable del cuadro clínico se inhibe la proliferación de los linfocitos si ponemos un inhibidor de HLA-DP. Esto no sucede en ninguno de los tres grupos si se estimula la proliferación celular linfocitaria con LPS (Figura 59). Figura 58. Los neutrófilos de pacientes con DAC son capaces de activar la proliferación de los linfocitos tras provocación in vitro con el antígeno en una respuesta específica. CSFE-FITC COUNT NO ESTIMULADAS NÍQUEL ANTÍGENO NO SENSIBLE LPS Fi g ura 58 152 Figura 59. Sólo en los pacientes cuando se estimulan con el antígeno responsable del cuadro clínico se cancela la proliferación de los linfocitos si ponemos un inhibidor del HLA-DP. Esto no sucede en ninguno de los tres grupos si se estimula la proliferación celular linfocitaria con LPS. Investigaciones previas de nuestro grupo han mostrado que el neutrófilo puede actuar como célula presentadora de alérgenos en una reacción IgE mediada (manuscrito en preparación). En este caso los neutrófilos pueden actuar como una célula presentadora de antígenos en la DAC. Que nosotros conozcamos no existe ningúna investigación que haya demostrado las afirmaciones que se presentan en este trabajo de investigación. CSFE-FITC COUNT INHIBIDOR HLA-DP+ANTÍGENO SIN ESTIMULAR INHIBIDOR HLA-DP+LPS Fi g ura 59 153 6. CONCLUSIONES. PRIMERA: En pacientes con DAC sometidos a aparatología fija multibrackets se ha logrado inducir una respuesta in vitro en el neutrófilo con el antígeno que produce el cuadro clínico, en este caso el sulfato de níquel y hemos comprobado que esta es específica al no inducirse mediante otros antígenos no responsables del cuadro clínico. Todo ello demostrado en los siguientes pasos: SEGUNDA: En primer lugar, hemos obtenido la liberación de un mediador de liberación rápida como es la histamina y otro de liberación lenta como es la proteína catiónica de eosinófilos (ECP). Demostrando que esta activación es específica y dándonos la posibilidad de obtener las condiciones in vitro idóneas para realizar la activación de estas células. TERCERA: También comprobamos como el tercer elemento de actuación de los neutrófilos, como es la formación de las trampas extracelulares o NETs, se realizaba en estos pacientes, obteniendo una respuesta positiva. CUARTA: Un elemento trascendental para la transducción de señales en todas las células del organismo es el análisis de la activación de NF-B. Para ello, hemos utilizado el análisis de la activación de NF-B tanto por la vía clásica, como por la vía alternativa. Hemos podido comprobar que ambas vías se activan in vitro en neutrófilos de pacientes con respuesta de contacto al sulfato de níquel. QUINTA: Pero no solo hemos analizado la transducción de señales dependiente de NF- B, sino también las consecuencias metabólicas que produce esta activación. Así, hemos podido comprobar que esta activción conduce a una liberación específica de ROS, IL-8 y COX-2. Por la importancia de estos mediadores, hemos podido comprobar la complejidad del mecanismo de acción de los neutrófilos en estos procesos patológicos. SEXTA: También hemos podido comprobar la activación del inflamasoma como modelo fisiopatológico productor de múltiples efectos en el sistema inmune inflamatorio humano. Esto lo hemos estudiado a través de dos de sus elementos definitorios como son, la formación de NLRP3 y la Liberación de IL-1β. Todo ello es de trascendental importancia porque hemos identificado que esta activación se realiza