Estudio del efecto del interferon b1a sobre la actividad de oxidorreducción en el tratamiento de la esclerosis múltiple remitente recidivante

! 1! ! ! ! ESTUDIO!DEL!EFECTO!DEL!INTERFERÓN!BETA!1!a!SOBRE! LA!ACTIVIDAD!DE!OXIDO!RREDUCCIÓN!EN!EL! TRATAMIENTO!DE!LA!ESCLEROSIS!MÚLTIPLE!REMITENTE! RECIDIVANTE.! ! BIOMARCADORES!DE!RESPUESTA!TERAPEUTICA.! ! ! ! ! ! ! Tesis!defendida!por! ! ! ! ! JUAN!LUIS!RUIZ!PEÑA! ! ! ! ! Para!optar!al!grado!de!doctor!en!Medicina!y!Cirugía.! ! ! ! ! ! ! DIRECTORES!DE!TESIS:!Miguel!Lucas!Lucas!y!Guillermo!Izquierdo!Ayuso! ! ! ! ! UNIVERSIDAD!DE!SEVILLA.! ! DEPARTAMENTO!DE!BIOQUIMICA,!BIOLOGIA!MOLECULAR!E! INMUNOLOGIA.! ! AÑO!2013.! ! ! 2! ! ! ! ! A!MIS!PADRES,!MI!MEMORIA.!! ! ! ! ! ! ! ! ! 3! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! a.!Índice!! ! ! ! 4! a.!Índice! b.!Acrónimos! c.!Resumen! I.!Esclerosis!Múltiple!! !1.!INTRODUCCIÓN! ! 2.!IMPORTANCIA!SOCIOECONÓMICA!DE!LA!ESCLEROSIS!MÚLTIPLE! ! 3.!INTERÉS!EPIDEMIOLÓGICO!DE!LA!ESCLEROSIS!MÚLTIPLE! ! 4.!GENETICA!DE!LA!ESCLEROSIS!MÚLTIPLE!! 5.!CARACTERÍSTICAS!ANATOMO!PATOLÓGICAS!DE!LA!EM.! ! ! 5.1.!Inflamación! ! ! 5.2.!Desmielinización! ! ! 5.3.!Daño!tisular!difuso! ! ! 5.4.!Remielinización! ! 6.!EVOLUCIÓN!Y!TRATAMIENTO!DE!LA!ESCLEROSIS!MÚLTIPLE!! ! ! 6.1.!Historia!natural! ! ! 6.2.!Modificadores!de!la!historia!natural! ! 7.!RESONANCIA!MAGNÉTICA!EN!LA!ESCLEROSIS!MÚLTIPLE.!! ! ! 7.1.!Relevancia!de!la!resonancia!magnética!convencional.!! !!!!!!7.2.!Espectroscopia!por!resonancia!magnética!de!protón!(ERMdH1).!! 7.2.1.!Aplicación!de!ERM!a!EM:!!Lesiones! 7.2.2.! Aplicación! de! ERM! a! EM:! !Sustancia! blanca! de! apariencia! normal! 7.2.3.!Aplicación!de!ERM!a!EM:!Sustancia!Gris! 7.2.4.!Conclusiones.!! ! ! 5! II.!Mecanismos!de!neurodegeneración! ! !1.!INTRODUCCIÓN.! 2.!DEGENERACIÓN!AXONAL!EN!LAS!LESIONES!INFLAMATORIAS!AGUDAS.! 2.1.!Activación!microglial! 2.2.!Linfocitos!T!CD8!+! 2.3.!Linfocitos!T!CD4!+! 2.4.!Folículos!de!células!B!meníngeos.!! 2.5.!Paradigma!para!la!patogénesis!de!células!Th17.!! 2.6.!Hipótesis!del!Daño!por!estrés!oxidativo! 2.7.!Hipótesis!del!!Daño!por!Glutamato.!! 2.8.!Vía!de!convergencia:!daño!mitocondrial.!!! 3.! DEGENERACIÓN! AXONAL! DURANTE! LAS! ETAPAS! PROGRESIVAS! INDEPENDIENTES!DE!INFLAMACIÓN!AGUDA.! 3.1.! La! desmielinización! crónica!produce! la!sobrerregulación!y! la! reorganización!de!los!canales!iónicos! 3.2.!Efecto!de!la!elevación!de!los!niveles!intracelulares!de!Ca2!+!en!la! función!mitocondrial! 3.3.!Transporte!axonal!en!la!EM.! 3.4.!Acumulación!de!hierro! 4.!CONCLUSIONES! III.!Medición!clínica!de!respuesta!terapéutica! 1.!INTRODUCCIÓN.!! 2.!EL!INTERFERÓN!ß!EN!EL!TRATAMIENTO!DE!LA!EM! 3.!DEFINICIONES!DE!RESPUESTA!A!IFN!Β.! 4.!CUANTIFICANDO!LA!RESPUESTA!AL!TRATAMIENTO!CON!IFNdΒ! ! 6! 5.!DESARROLLO!DE!SISTEMAS!DE!PUNTUACIÓN! 6.!CONCLUSIÓN.! IV.!Farmacogenómica!de!los!inmunomoduladores.!! 1.!INTRODUCCIÓN.!! 2.!FARMACOGENÓMICA.! 3.!CONCLUSIÓN! V.!Identificación!de!los!objetivos!de!estudio!en!esta!tesis.!! 1.!OBJETIVOS! 1.1.!OBJETIVOS!PRIMARIOS!! 1.2.!OBJETIVOS!SECUNDARIOS! 2.!TRABAJOS!REALIZADOS!PARA!CONTESTAR!A!LOS!OBJETIVOS! VI.!Metodología.!! 1.! METODOLOGIA! UTILIZADA! EN! EL! ESTUDIO! DEL! EFECTO! DEL! INTERFERÓN!ß!1!a!IM!SOBRE!MARCADORES!DE!DEGENERACIÓN!AXONAL!Y!DE! OXIDO!RREDUCCIÓN.! 1.1.!Diseño! 1.2.!Población!estudiada! 1.3.!Evaluacion!clínica!de!la!discapacidad.!! 1.4.!Mediciones!de!Resonancia!Magnética! 1.5.!Seguimiento.!! 1.6.!Análisis!estadístico! 2.! METODOLOGÍA! UTILIZADA! EN! EL! ESTUDIO! DE! VALIDACIÓN!DE!LOS! CRITERIOS!DE!OPTIMIZACIÓN!DEL!TRATAMIENTO!DE!LA!CMSWG.! 2.1.!Diseño! 2.2.!Población!estudiada! ! 7! 2.3.!Optem! 2.4.!Evaluacion!y!seguimiento!clínico.!! 2.5.!Análisis!estadístico! 3.!METODOLOGÍA!UTILIZADA!EN!EL!ESTUDIO!DE!FARMACOGENÓMICA.!!! !!!!!!3.1.!Diseño.!! ! ! 3.2.!Población!estudiada.! 3.2.1.!Tamaño!muestral.!! ! ! !!!!3.2.2.!Criterios!de!inclusión.!! !!!!!!3.3.!Evaluacion!y!seguimiento!clínico! ! ! 3.4.!Extracción!y!criodpreservación!de!ADN! ! ! 3.5.!Estudios!moleculares.!! ! ! 3.6.!Análisis!estadístico!de!la!respuesta!al!tratamiento.! ! ! 3.7.!Etapas.!! VII.!Resultados.!! 1.! RESULTADOS! OBTENIDOS! EN! EL! ESTUDIO! DEL! EFECTO! DEL! INTERFERÓN!ß!1!a!IM!SOBRE!MARCADORES!DE!DEGENERACIÓN!AXONAL!Y!DE! OXIDO!RREDUCCIÓN.!! 1.1.!Demografía!de!los!sujetos!y!características!clínicas!! 1.2.!Concentración!de!metabolitos.! 1.3.!Concentración!de!grupos!sulfidrilos!en!suero.! 1.4.!Correlación!entre!la!concentración!basal! de! metabolitos! y! ! los! parámetros!clínicos!basales.!! 1.5.!Correlaciones!del!nº!de!brotes.!! 1.6.!Correlaciones!de!la!progresión.!! 1.6.1.!Con!N!Acetil!Aspartato!(NAA).! ! 8! 1.6.2.!Con!colina.!! 1.6.3.!Con!Mio!inositol.!! 1.6.4.!Oxido!reducción.!! 1.7.!Implicación!práctica!de!estos!resultados.!!! 2.! RESULTADOS! OBTENIDOS! EN! EL! ESTUDIO! DE! VALIDACIÓN! DE! LOS! CRITERIOS!DE!OPTIMIZACIÓN!DEL!TRATAMIENTO!DE!LA!CMSWG.!! 2.1.!Demografía!de!los!sujetos!!y!características!clínicas! 2.2.!Sensibilidad!y!Especificidad! 2.3.!Tasa!de!brotes!durante!los!años!2d5! 2.4.!Progresión!durante!años!2d5! 2.5.!Implicación!práctica!de!estos!resultados.!!! 3.!RESULTADOS!OBTENIDOS!EN!EL!ESTUDIO!DE!FARMACOGENÓMICA.!! 3.1.!Demografía!de!los!sujetos!!y!características!clínicas! 3.2.! Correlación! entre! los! marcadores! genéticos! y! la! respuesta! terapéutica.!! 3.3!Implicación!práctica!de!estos!resultados.!!! VIII.!Discusión.!! Disminución!del!N!Acetil!Aspartato!en!pacientes!con!EM.!! N!Acetil!Aspartato!como!marcador!de!daño!axonal.!! Brotes!como!marcador!subrogado!de!discapacidad! Evaluación!de!la!eficacia!del!tratamiento.!! Correlación! entre! la! concentración! de! los! distintos! metabolitos! en! los! tejidos!y!los!parametros!clínicos.!! N!Acetil!Aspartato.! Colina.!! ! 9! Mio!Inositol!(mI).! El!daño!oxidativo!como!marcador!subrogado!de!discapacidad.!! Validez! de! la! utilizacion! del! grupo! no! respondedor! como! modelo! de! progresión.!! Resumen!clínico!patológico.! Validación!de!las!ROT!de!la!CMSWG.! Utilidad!medios!de!cuantificación.! Resumen!de!la!validación!del!método!de!respuesta!terapéutica.!! Utilidad!de!los!Estudios!Farmaco!genómico.!! Direcciones!futuras! IX.!Conclusiones.!! X.!Bibliografía.!! ! ! ! ! 16! ! También! desconocemos! la! influencia! de! los! polimorfismos! genéticos! en! las! diferentes!respuestas!al!interferón!beta!que!podrían!suponer!un!instrumento!de! gran!utilidad!en!la!decisión!de!tratamiento!de!estos!pacientes.!! ! Objetivos.H! ! 1.! Medir! el! efecto! a! largo! plazo! del! tratamiento! con! interferón! β1a! IM! en! la! acumulación! del! daño! axonal! en! pacientes! con! Esclerosis! Múltiple! Remitente! Recidivante!(EMRR)!usando!marcadores!de!oxidorreducción!y!Espectroscopia!por! Resonancia!Magnética!(ERM)! ! 2.! Validar! los! criterios! clínicos! de! optimización! de! tratamiento! de! la! Canadian! Multiple!Sclerosis!Working!Group!(CMSWG)!aplicándolos!a!una!población!española! de!pacientes!con!EMRR!tratados!inicialmente!con!interferón!β1a!IM! ! 3.!Identificar!un!conjunto!de!genes!ligados!a!las!diferencias!interindividuales!en!la! eficacia!a!la!terapia!con!Interferón!Beta.!! ! Metodología.H!! ! Para!responder!a!estas!preguntas!se!han!planteado!tres!estudios!diferentes:!! ! ! 17! 1.!Estudio!del!efecto!del!interferón!ß!1!a!IM!sobre!marcadores!de!degeneración! axonal!y!de!oxido!reducción.! ! 2.! Estudio! de! validación! de! los! criterios! de! optimización! del! tratamiento! de! la! CMSWG! ! 3.!Estudio!de!farmacogenómica!de!respuesta!al!Interferón!ß.!! ! Conclusiones.H!! ! 1.! Desde! los! primeros! estadios! de! la! enfermedad,! los! ratios! NAA:! Cr!en! SBAN! determinados!por!ERM!fueron!menores!en!los!pacientes!con!EM,!es!decir,!el!daño! axonal!es!un!fenomeno!precoz.!! ! 2.!La!discapacidad!de!los!pacientes!(medida!por!la!EDSS)!se!correlaciona!con!los! niveles!de!NAA,!un!marcador!de!la!pérdida!axonal.! ! 3.!No!hay!correlación!entre!la!discapacidad,!cuando!se!utiliza!el!MSFC,!y!el!NAA.! ! 4.!El!hecho!de!que!los!brotes!pudieran!ser!buenos!marcadores!subrrogados!de!la! discapacidad!clínica!en!EM!sugiere!que!los!pacientes!con!EM!tienen!probabilidades! de! obtener! beneficio! usando! IFNdβ! en! lo! que! se! refiere! a! la! progresión! de! la! discapacidad!y!apoya!el!uso!de!los!cambios!en!estos!marcadores!como!predictores! de!la!evolución!clínica!durante!los!años!siguientes.! ! ! 18! 5.!El!IFN!beta!1!a!IM!no!disminuyó!el!daño!axonal!en!pacientes!con!EMRR.!El!ratio! NAA!/!Cr!en!SBAN!!ha!seguido!disminuyendo!durante!el!período!de!observación! ! 6.!Existe!un!grupo!de!pacientes!que!podríamos!considerar!buenos!respondedores! ya!que,!aunque!globalmente!los!pacientes!pierden!NAA,!el!30%!!no!lo!pierden!o! incluso! lo! recuperan.! Este! porcentaje! es! similar! al! que! se! comenta! en! estudios! clínicos!respecto!a!la!respuesta!del!interferón.!! ! 7.!Los!niveles!de!oxidorreducción!inmediatos!a!la!introducción!de!la!medicación! inmuno! moduladora! pueden! jugar! un! papel! importante! en! la! discapacidad! desarrollada!durante!los!primeros!años!de!enfermedad!y!con!su!monitorización!se! podría!pronosticar!la!respuesta!al!tratamiento! ! 8.! Los! paciente! que! responden! al! tratamiento! en! las! primeras! etápas! de! la! enfermedad!disminuirán! el!estrés!oxidativo! con!lo! que!dará!tiempo! a!disminuir! tanto! el! daño! energético! como! el! daño! axonal! y! con! la! energía! exedente! se! pondrían!en!marcha!la!remielinización!y!se!evitaría!la!gliosis!tardía.!El!fracaso!de! los!tratamientos!en!la!fase!progresiva!sería!por!el!papel!menos!importante!de!la! inflamación!sino!el!mas!preminente!del!daño!difuso! ! 9.!Nuestros!datos! muestran! que!ROT,!utilizando! sólo! la! información!clínica,!son! capaces!de!predecir!si!los!pacientes!tendran!un!alto!nivel!de!actividad!tanto!por!la! tasa!de!brotes!como!!en!aumento!de!la!discapacidad!medida!por!la!EDSS,!con!una! alta!sensibilidad!y!especificidad.!Es!decir,!las!ROT!son!una!buena!herramienta!para! el!seguimiento!de!la!respuesta!a!la!DMD!en!pacientes!con!EM.!! ! 19! ! 10.!El!programa!desarrollado!por!nosotros!es!intuitivo,!no!requiere!mucho!tiempo! y!puede!ayudar!a!los!neurólogos!a!evaluar!a!los!pacientes!de!manera!objetiva!y! fácilmente.! ! 11.! Este! estudio! nos! sugiere! un! grupo! de! marcadores! que! podrían! estar! relacionados!con!la!respuesta!al!tratamiento!con!interferón!beta!en!pacientes!con! esclerosis!múltiple.!! ! 20! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! I.!Esclerosis!Múltiple!! ! ! 21! INTRODUCCIÓN! ! La! esclerosis! múltiple! (EM)! es! una! enfermedad! inflamatoria! y! auto! inmune! del! sistema! nervioso! central! (SNC),! ! que! se! manifiesta! en! el! 90%! de! los! casos! con! brotes!agudos!que!provocan!defectos!neurológicos,!generalmente!regresivos.!! ! La!edad!de!inicio!de!la!enfermedad!se!sitúa!entre!los!20!y!40!años.!La!prevalencia! de!la!EM!en!España!fluctúa!entre!40!y!70!casos!por!cada!100000!habitantes,!con! una! incidencia! de! 3d4! nuevos! casos! por! 100000! habitantes! y! año! (Fernández! y! cols.,!1994;!Bufill!y!cols.,!1995;!Uría!y!cols.,!1997;!Modrego!y!cols,!1997;!Benitod León!y!cols,!1998;!Pina!y!cols.,!1998;!Tola!y!cols.,!1999;!Malladad!Frenchin!y!cols.,! 2000;! Casquero! y! cols.,!2001;! Hernández!y!cols.,! 2002).! Estos! datos! sitúan! a! nuestro!país!en!una!franja!de!prevalencia!de!EM!moderadadalta.! ! Es!primariamente!desmielinizante!!pero!se!sigue!de!degeneración!axonal,!que!es!la! causa!de!la!discapacidad!progresiva!que!se!produce!en!las!fases!más!avanzadas!de! la!enfermedad.!Esta!degeneración!axonal!se!pone!ya!en!marcha!desde!el!comienzo! de!la!enfermedad!(Trapp!y!cols.,!1998).! ! El! origen! de! la! EM! sigue! en! estudio.! La! teoría! más! aceptada! defiende! la! combinación!de!factores!ambientales!y!genéticos.!No!obstante,!pese!a!la!enorme! cantidad!de!trabajos!realizados,!aún!no!se!ha!identificado!con!exactitud!la!sucesión! de!fenómenos!que!intervienen!en!el!desarrollo!y!perpetuación!de!la!enfermedad.! ! 22! 2.!IMPORTANCIA!SOCIOECONÓMICA!DE!LA!ESCLEROSIS!MÚLTIPLE! ! La!EM!es!una!de!las!primeras!causas!de!discapacidad!de!origen!no!traumático!en! adultos! jóvenes! y! supone! un! coste! económico! y! social! importantísimo,! en! los! países!desarrollados.!! ! En!una!población!cada!vez!más!longeva,!el!impacto!económico!que!representa!la! invalidez! temporal! o! permanente! de! personas! en! edad! biológica! de! trabajar! es! inmenso.!Si!esto!se!suma!a!la!necesidad!de!ayudas!sociodsanitarias!desde!edades! tempranas!y!a!los!gastos!de!atención!hospitalaria!y!tratamiento!crónico,!el!gasto! generado!es!cada!vez!mayor.!! ! En!España!el!coste!económico!medio!por!cada!paciente!oscila!entre!los!27.000!y! 45.000!euros!anuales!(Orlewska!y!cols.,!2005,!Casado!y!cols.,!2006,!Kobelt!y!cols.,! 2006).!Según!datos!del!Instituto!Nacional!de!Estadística,!la!población!española!en! enero!de!2012!era!de!47.190.493!habitantes.!Considerando!la!prevalencia!de!40d 70!casos!por!100000!habitantes,!estimamos!un!gasto!medio!superior!a!los!1000! millones!de!euros!anuales.! ! ! 23! 3.!INTERÉS!EPIDEMIOLÓGICO!DE!LA!ESCLEROSIS!MÚLTIPLE! ! Estudios! en! emigrantes! observaron! que! la! adolescencia! era! la! edad! crítica! para! retener! el! riesgo! de! la! región! de! procedencia.! Este! conocimiento,! junto! al! viejo! concepto!de!gradiente,norte.sur,!que!resume!la!idea!de!una!mayor!prevalencia!de! la!enfermedad!en!las!regiones!más!norteñas,!sirvió!en!su!momento!para!defender! la!teoría!de!un!factor!ambiental!como!el!causante!de!la!enfermedad.!Sin!embargo,! la!repetición!de!algunos!estudios!epidemiológicos!nos!ha!hecho!modificar!la!visión! de! la! distribución! de! la! EM! en! el! mundo.! Así,! aunque! seguimos! aceptando! parcialmente! el! concepto! de! un! gradiente! nortedsur,! se! ha! visto! que! existen! enormes!diferencias!entre!regiones!muy!próximas,!por!ejemplo!en!Enna!(Sicilia)!la! prevalencia!es!de!120/100000!habitantes!(Grimaldi!y!cols.,!2001)!y!en!Malta!es!de! 13/100000!(Dean!y!cols.,!1999).!Estas!diferencias!serían!inexplicables!desde!un! enfoque! puramente! ambiental,! y! es! en! este! punto! donde! cobra! importancia! el! factor!genético.!Hay!datos!suficientes!para!afirmar!que!existe!una!predisposición! genética!para!desarrollar!la!EM.! ! ! 24! 4.!GENETICA!DE!LA!ESCLEROSIS!MÚLTIPLE! ! Diferentes!estudios! de! agregación! familiar! han! confirmado! y! cuantificado! el! aumento!del!riesgo!a!padecer!la!enfermedad!en!parientes!de!individuos!afectados! (Sadovnick!y!cols.,!1998;!Robertson!y!cols.,!1996;!y!Carton!y!cols.,!1997).!! ! Estos! estudios! ponen! de! manifiesto! la! influencia! de! los! factores! genéticos! en! la! etiología!de!la!enfermedad.!El!20%!de!los!afectos!tienen!antecedentes!familiares!de! la! enfermedad! (Compston! y! cols.,!2002).!!El! riesgo! de! padecer! la! enfermedad! aumenta!con!la!proximidad!genética!de!forma!clara,!a!1!de!cada!500!en!las!formas! familiares,!1!de!cada!25!si!es!un!hermano!y!uno!de!cada!3!si!se!trata!de!gemelos! monocigóticos! (Willer! y! cols.,! 2003).! Por! el! contrario,! el! riesgo! para! hermanos! adoptados!de!padecer!la!EM,!es!el!mismo!que!el!de!la!población!general!(Ebers!y! cols.,!1994).!! ! El!hecho!de!que!existan!pacientes!que!padecen!la!enfermedad!pero!no!presentan! síntomas,!ha!dificultado!la!valoración!real!de!la!carga!genética!en!la!trasmisión!de! la!enfermedad!o!su!susceptibilidad!(Barakat!Shrem!y!cols.,!2003).! ! La! dificultad! de! saber! si! individuos! asintomáticos!con!lesiones!en!Resonancia! Magnética! (RM)! típicas! de! la! EM! deben! o! no! incluirse! como! afectados,! puede! contaminar!los!estudios!genéticos.!La!presencia!de!secreción!intratecal!de!bandas! oligoclonales! (BOC)! de! Inmuno! globulina! G!(Ig!G),! que! es! un! marcador! de! alta! sensibilidad! y! especificidad,! puede! aportar! una! mayor! seguridad! diagnóstica! (Villar!y!cols.,!2005).!! ! 25! ! Aunque!los! datos! de!agregación! familiar! y!los!estudios! de!concordancia!pueden! utilizarse! para! inferir! la! proporción! de! factores! genéticos! involucrados! en! cualquier! patología! compleja,! el! verdadero! reto! de! la! genómica! estructural! moderna!es!el!aislamiento!específico!y!caracterización!molecular!de!todos!y!cada! uno!de!estos!factores.!Esta!tarea,!sin!duda!formidable,!ocupará!buena!parte!de!la! investigación!genética!en!los!próximos!decenios.!! ! Los!primeros!esfuerzos!en!identificar!factores!genéticos!de!susceptibilidad!a!EM! establecieron!la!asociación!de!esta!patología!a!los!genes!del!complejo!mayor!de! susceptibilidad! HLAdA3! (Naito! y! cols.,! 1972),! dB7! (Jersild! y! cols.,! 1972)! y! dDR7! (Jersild!e!y!cols.,!1973).!Actualmente!estos!genes!son!conocidos!como!!HLAdA3,!!dA7! y! LDd7a! respectivamente! estando! todos! en! desequilibrio! de! unión! dentro! del! complejo! mayor! de! histocompatibilidad.! Estudios! más! detallados! en! esta! región! han! identificado! el! alelo! HLAdDRB1*1501! como! causativo! de! la! asociación! observada!(Oksenberg!y!cols.,!2004;!Yeo!y!cols.,!2007).!! ! El!modesto!riesgo!de!padecer!la!enfermedad!que!confiere!este!alelo!hace!suponer! la! existencia! de! otros! factores! genéticos! adicionales! de! susceptibilidad! a! EM.! El! modo! de! herencia! en! las! enfermedades! complejas! como! la! EM,! si! existe,! no! es! apreciable! y! además,! se! espera! que! desde! un! punto! de! vista! genético! sea! un! subconjunto!de!alelos!(de!baja!penetrancia)!combinados!entre!sí!(epistasis)!y/o! con! factores! medioambientales! (interacciones! gen! d! medio! ambiente)! los! que! confieran!el!riesgo!a!padecer!la!patología!(modelo!multifactorial!o!complejo).! ! ! 32! citotóxicos! antígeno! específicas!(Saxena!y!cols.,!2008,!Na!y!cols.,!2008),! y! autoanticuerpos!dirigidos!contra!antigenos!neuronales!o!gliales!(Linington!y!cols.,! 1988,! Mathey!y!cols.,!2007).! !Por! otra! parte,! las! vainas! de! mielina! son! particularmente!vulnerables!a!productos!liberados!por!los!macrófagos!activados!y! microglias!como!las!citocinas!citotóxicas,!excitotoxinas!o!productos!derivados!del! oxigeno!y!del!óxido!nítrico.!En!las!lesiones!altamente!inflamatorias!observadas!en! la!EMRR,!distintos!procesos!inmunes!podrían!contribuir!a!la!desmielinización!y!la! neurodegeneración!en!diferentes!tipos!de!pacientes!o!diferentes!subgrupos! de! enfermedad,!como!se!refleja!en!distintos!patrones!de!desmielinización!y!de!daño! lesional!(Lucchinetti!y!cols.,!2000).!Los!patrones!de!desmielinización!observados! con!mayor!frecuencia!son!los!asociados!a!anticuerpos!y!complemento!(patron!II),!y! el!daño!tisular!similar!a!la!hipoxia!(patron!III).!En!el!patron!III,!la!desmielinización! se!inicia!por!la!degeneración!de!las!espiculas!más!distales!de!los!!oligodendrocitos! y!la!apoptosis!de!los!oligodendrocitos,!como!también!se!ve!en!las!etapas!iniciales! de!las!lesiones!ictales!de!la!sustancia!blanca!(Lucchinetti!y!cols.,!2000,!Barnett!y! cols.,!2004),!y!los!astrocitos!muestran!una!pérdida!de!la!polaridad,!lo!que!produce! una! alteración! del!organización! estructural! de! la! limitante! glial! perivascular! (Sharma!y!cols.,!2010,!Matsuoka!y!cols.,!2011).! En!los!pacientes! con!EMRR,! la! desmielinización! activa!se! asocia!sólo!con! las! células! T! y! microglias! activadas! (patron!I)!(Lucchinetti!y!cols.,!2000).!! ! 5.3.!Daño!tisular!difuso.!! ! Además! de! las! lesiones! focales,! los!cerebros! de! los! pacientes!con! EM! también! mostraron! cambios! difusos,! como! una! inflamación! generalizada,! una! activación! ! 33! microglial,!una!gliosis!astrocitica!y!una!leve!desmielinización!y!daño!axonal!en!la! sustancia! blanca! de! apariencia! normal! (Kutzelnigg!y!cols.,!2005,! Allen!y!cols.,! 2001).!Una!pérdida!generalizada!de!volumen!tisular!también!se!ve!en!la!corteza!de! aspecto! normal!(Wegner!y!cols.,!2006).! Estos! cambios! conjuntamente! producen! una!extensa!atrofia!cerebral!con!dilatación!de!los!ventrículos.!! ! La! extensión! y!severidad! del! daño! difuso!de! la! sustancia! blanca! aumenta! con! duración!de!la!enfermedad!!y!es!más!pronunciada!en!la!fase!progresiva!de!la!EM.!! Sin!embargo,!axones!en!parte!conservados!se!encuentran!en!todas!las!lesiones!de! la! EM! y,! cuando! se! destruyen!los! axones,! las! fibras! de! pequeño! calibre!son! las! predominantemente!afectadas!(Evangelou!y!cols.,!2001,!Stys!2005).!El!daño!difuso! de!la!sustancia!blanca!muestra!una!correlación!moderada!(pero!significativa)!con! la!extensión!de!la!desmielinización!cortical!(Kutzelnigg!y!cols.,!2005).! ! 5.4.!Remielinización.!! ! La! restauración! de! la! mielina,! o! la! remielinización,! es!un!proceso! regenerativo! espontáneo!que! puede! ocurrir!con! notable!eficacia,! no! sólo!después! de!la! desmielinización! experimental! en! roedores! de! laboratorio,! sino! también! en! los! seres!humanos.!(Franklin!2002,!Patani!y!cols.,!2007,!Patrikios!y!cols.,!2006).!Ocurre! tanto! en!la! sustancia! blanca! como! en! la! sustancia! gris! y!a!las!áreas! totalmente! remielinizadas!se!les!denomina!"placas!fantasmas"!(Patrikios!et!al,!2006.;!Patani!et! al,!2007;!Albert!et!al,!2007).!Curiosamente!la!remielinización!se!ha!observado!no! sólo!en!la!fase!temprana!de!la!EM,!sino!también!en!pacientes!con!enfermedad!de! larga!evolución!(Patrikios!et!al.,!2006).! ! 34! ! La!remielinización!se!produce!cuando!las!células!progenitoras!de!oligodendrocitos! adultos!(OPC),!una!población!amplia!de!progenitores!multipotentes,!responden!a! una!lesión,!se!dividen!y!emigran,!y,!finalmente,!se!diferencian!en!oligodendrocitos! que!recubren!el!axón!desmielinizado!con!una!cubierta!de!mielina!nueva!(Franklin! y! cols.,! 2008,! Zawadzka!!y!cols.,!2010).!Hay!al!menos! dos! fuentes! conocidas! de! estos! oligodendrocitos:! la! primera! es! la! gran! reserva!de! OPC!que! expresan! el! proteoglicano!NG2!y!/!o!el!receptor!alfa!de!la!PDGF;!la!segunda!proviene!de!los! precursores!en!la!zona!subventricular!(adultos!SVZ)!(Menn!et!al,!2006;!Zhao!et!al,! 2008).!Las! OPC! también! se! han! aislado! también! de! la! sustancia! blanca! aparentemente!normal,!obtenida!en!el!curso!de!la!cirugía!para!la!epilepsia.!! ! Las!vainas!de! mielina!recién!hechas!son!más!delgada!de!lo!normal,! tienen!unos! internodos! más! cortos!y! la! variabilidad!en! la! longitud!nodal! (Perier! y! Gregoire,! 1965).!Estas!variaciones!en!el!espesor!de!la!mielina!y!la!distancia!internodal!en! estas!placas!!podrían!disminuir!la!eficacia!de!la!conducción!saltatoria!en!los!axones! mielinizados.! Sin! embargo,! en! modelos! animales,! la! velocidad! de! conducción! aumenta!durante!la!remielinización.! ! La!restauración!de!las!vainas!de!mielina!no!sólo!ayuda!a!proteger!los!axones,!sino! que!también!restablece!la!conducción!saltatoria!y!las!funciónes!perdidas.!Por!lo! tanto,!la!remielinización! puede! ser! considerado! como! un! proceso! beneficioso.! (Smith!y!cols.,!1979,!Jeffery!y!cols.,!1997,!Duncan!!y!cols.,!2009)!Sin!embargo,!una! advertencia!potencial! es! que!el! proceso!de! remielinización! podria!hacer!a! los! axones,!temporalmente,!más!vulnerables!a!la!degeneración!antes!de!que!se!consiga! ! 35! una! protección! mas! duradera! (Smith!2006).!El! problema! potencial!radica! en! el! hecho!de!que!la!remielinización!restaura!rápidamente!la!capacidad!de!los!axones! para! conducir! los! impulsos! a! altas! frecuencias! (Smith! y! cols.,! 1979),! pero!esta! capacidad!avanza!más!rápidamente!que!la!capacidad!del!axón!para!hacer!frente!a! las!demandas! de!energía! asociadas!con! la!eliminación! de!la!alta!carga! de!sodio.! Este!problema!puede!verse!agravado!por!el!aumento!de!canales!de!sodio,!que!se! produce!durante! la! maduración!nodal!y!provoca!que! muchos!nodos!puedan! ser! particularmente! propensos! a!la!acumulacion! de! sodio!(Patrikios! et! al.,! 2006,! Coman!y!cols.,!2006).!Además,!en!contraste!con!los!modelos!experimentales!en!los! que!los!nodos!pueden!estar!bien!organizados!en!una!o!dos!semanas,!en!las!lesiones! de!EM!los!nodos!inmaduros!parecen!persistir!durante!períodos!prolongados.!En! consecuencia,!el!aumento!del!riesgo!de!degeneración!durante!la!remielinización!en! los! pacientes! con! la! enfermedad! no! puede! ser! tan! temporal! como! en! modelos! experimentales.! ! La!eficiencia!de! la! remielinización!disminuye!con! el! aumento!de!la! edad!(Rist!y! cols.,!2008).!Esta!característica!de!la!remielinización!tiene!un!profundo!efecto!en!la! EM,!pues!a!menudo!la!enfermedad!dura!varias!décadas!y!se!refleja!tanto!en!los! hallazgos!histopatológicas! con! una! disminucion! en! la! remielinización! con! el! aumento!de!la!duracion!de!la!enfermedad!(Goldschmidt!y!cols.,!2009),!como!en!las! evidencias!clínicas!pues!la!progresión!de!la!enfermedad!es!edad!dependiente!y!no! se! ve! influenciada! por!el! curso!inicial! o! por! los! síntomas! de! la! enfermedad! (Confavreux!y!cols.,!2006).!Por!consiguiente,!a!medida!que!los!pacientes!envejecen,! sus! axones! desmielinizados! permanecerán! sin! nuevas! vainas! de! mielina! por! períodos! más! largos! y! serán! más! susceptibles! a! la! degeneración! duna! situación! ! 36! agravada! por!el!probable! incremento!de!la!vulnerabilidad! axonal! asociado! a! la! edad!(Irvine!y!cols.,!2006).!! ! 37! 6.!EVOLUCIÓN!Y!TRATAMIENTO!DE!LA!ESCLEROSIS!MÚLTIPLE!! ! 6.1.!Historia!natural! ! La!interacción!entre!discapacidad!y!brotes!define!el!curso!clínico!de!la!EM.!En!un! 90%!de!los!pacientes!con!EM!el!comienzo!de!la!enfermedad!se!caracteriza!por!la! presencia! de! brotes,! con! o! sin! secuela! posterior,! pero! sin! progresión! de! la! discapacidad!en!los!periodos!libres!de!recurrencias!(EM!remitente!d!recidivante).! Tras!un!número!variable!de!años!(15d20!años!de!evolución)!el!50!d!60%!de!los! pacientes!que!debutaron!con!brotes!presentan!una!progresión!de!la!discapacidad! de!forma!independiente!a!la!presencia!o!ausencia!de!brotes!(EM!secundariamente! progresiva).! !Un! 10%! de! los! pacientes! presenta! desde! el! inicio! un! incremento! progresivo! e! irreversible! de! la! discapacidad,! intercalando! o! no! brotes! (primariamente! progresiva! (PP)! o! progresiva! recurrente! (PR)! respectivamente)! (Lublin!y!Reingold,!1996).!! ! El! tiempo! medio! que! trascurre! desde! el! inicio! de! la! EM! hasta! la! pérdida! de! la! autonomía!para!deambular!se!sitúa!sobre!los!20!años!de!evolución!en!las!formas! RR!y!sobre!los!7!años!en!las!formas!PP!(Pittock!y!cols.,!2004;!Tremlett!y!cols.,!2005;! Tremlett!y!cols.,!2006).!No!obstante,!una!vez!se!inicia!la!progresión,!ésta!parece! que!avanza!a!velocidad!semejante!en!los!dos!grupos!de!pacientes!(Confavreux!y! Vukusic,!2006)!con!un!pobre!pronóstico!en!ambos!grupos.!La!acumulación!de!la! discapacidad!en! la! EM! es!un!proceso! de! dos! etapas,!que! comprende! una! fase! precoz!de!acumulación!de!discapacidad!hasta!un!nivel!de!discapacidad!moderada! (Kurtzke!1983)!(EDSS!3,0d4,0,!dependiendo!del!estudio),!en!el!que!la!secuela!tras! ! 38! un!brote!podría!participar!del!grado!de!discapacidad!y!una!fase!tardía!más!allá!de! este! punto! de! referencia!en! el! que! la! velocidad! de! progresión! podría! ser! independiente!de!la!presencia!de!brotes!superimpuestos!(Confavreux!y!cols.,!2000,! Leray!y!cols.,!2010,!Scalfari!y!cols.,!2010,!Confavreux!y!cols.,!2003)! ! ! ! De!entre!todos!los!factores!que!en!algún!momento!se!han!relacionado!de!forma! negativa!con!el!pronóstico!a!mediodlargo!plazo!de!la!EM,!parece!que!una!mayor! edad! al! inicio,! la! ausencia! de! recuperación! completa! tras! un! primer! brote! y! un! mayor!número!de!brotes!durante!los!dos!primeros!años!de!la!enfermedad!son!los! más!claros!(Riise!y!cols.,!1992;!Runmarker!y!Andersen,!1993,!Amato!y!Ponziani,! 2000,! Ebers,! 2005;! Rovaris! y! cols.,! 2006).! Estudios! recientes! defienden! la! importancia!de!la!edad!en!el!inicio!de!la!progresión!de!la!discapacidad.!Así,!parece! que!la!edad!en!la!que!formas!RR!se!tornan!en!SP!se!asemejaría!a!la!edad!de!inicio! de!las!formas!PP!(Confavreux!y!cols.,!2000).! ! Los!criterios!diagnósticos!actuales!permiten!establecer!o!aproximar!el!diagnóstico! ! 39! de!EM!de!forma!precoz,!tras!un!único!brote!de!la!enfermedad!(McDonald!y!cols.,! 2001;!Polman!y!cols.,!2005,!Polman!y!cols.,!2011).!Esto!nos!ha!permitido!estudiar! por! un! lado! el! riesgo! de! desarrollar! un! segundo! brote! (O’Riordan! y! cols.! 1998;! Tintoré!y!cols.,!2001;!Swanton!y!cols.,!2006;!Miller!y!cols.,!2005a!;!Miller!y!cols.,! 2005b;!Masjuan!y!cols.,!2006;!Korteweg!y!cols.,!2006)!y!adicionalmente!predecir!el! grado!de!discapacidad!futura!(Brex!y!cols.,!2002,!Tintoré!y!cols.,!2006)! ! 6.2.!Modificadores!de!la!historia!natural! ! Hasta!la!fecha!existen!varios!tratamientos!aprobados!por!la!Agencia!Europea!del! Medicamento! (EMEA)! que! han! demostrado! su! eficacia! en! la! EM:! El! IFNdβ1db! (Interferon! Beta! 1db! Study! Group,! 1995),! IFNdβ! 1da! subcutáneo! (PRISMS! study,! 1998),! IFNdβ! 1da! intramuscular! (Jacobs! y! cols.,! 1996)! y! acetato! de! glatirámero! (Johnson! y! cols.,! 1995)! como! tratamientos! de! primera! línea,! y! la! mitoxantrona! (Edan!y!cols.,!1997;!Hartung!y!cols.,!2002)!como!fármaco!de!rescate.!La!experiencia! a! largo! plazo! con! estos! farmacos! habla!de!su! seguridad,! combinado! con! una! eficacia,!en!términos!de!reducción!de!los!brotes,!de!alrededor!de!30%!(Paty!y!cols.,! 1993,! IFNB! Multiple! Sclerosis! Study! Group.,! 1993,! Jacobs! y! cols.,! 1996,! PRISMS! study,! 1998).! Estos! beneficios!han!de!ser! sopesado,! sin! embargo,! frente! a! la! necesidad!de!inyecciones!regulares.! ! En!junio! del!2006! la!EMEA!autorizó! el!uso! del!natalizumab!en! monoterapia,!un! anticuerpo!monoclonal!anti!VLAd4!(Polman!y!cols.,!2006)!como!fármaco!de!2ª!línea! en!pacientes!con!EM!RR!refractarios!a!inmumoduladores!o!con!formas!agresivas! de!la!enfermedad!y!posteriormente!en!Marzo!del!2011!se!autoriza!al!agonista!de! ! 40! los!receptores!de!esfingosina!Fingolimod!(Gilenya)!con!las!mismas!indicaciones.!El! Natalizumab,! un! anticuerpo! monoclonal! dirigido! contra!α4dintegrina,! impide! la! invasión!del!SNC!por!las!células!inmunes!y!reduce!la!frecuencia!de!los!brotes!y!la! formación!de!lesiónes!en!RM!en!pacientes!con!EMRR.!Sin!embargo,!el!riesgo!de! leucoencefalopatía! multifocal! progresiva! limita! su! uso.! El! fingolimod,! un! modulador!del!receptor!de!esfingosinad1dfosfato!oral!(Kappos!y!cols.,!2006)!,!ha! demostrado!una!eficacia!superior!en!comparación!con!el!placebo!y!con!dosis!baja! de!IFNdβ1a!en!los!estudios!de!fase!III,!con!una!profunda!supresión!de!la!actividad! inflamatoria!(tanto!en!términos!de!lesiones!de!RM!y!brotes)!y!los!efectos!sobre!la! atrofia!cerebral!y!la!progresion!de!la!discapacidad!(Kappos!y!cols.,!2010,!Cohen!!y! cols.,! 2010).! Debido! a! su!perfil! de! seguridad,! sin! embargo,! los! pacientes! que! reciben!la!primera!dosis!de!fingolimod!requieren!supervisión!y!también!durante!el! curso!del!tratamiento!(Visser!y!cols.,!2012,!Bourdette!!y!cols.,!2012).!Dos!nuevos! fármacos!orales,!la!teriflunomida!(O'Connor!y!cols.,!2006,!.!O'Connor!!y!cols.,!2011)! y!el!dimetil!fumarato!(Gold!y!cols.,!2012,!Fox!!y!cols.,!2012)!han!sido!recientemente! aprobado!en!los!EE.UU!(FDA)!para!el!tratamiento!de!pacientes!con!EMRR.! ! Aún!ignoramos!el!efecto!de!estos!tratamientos!sobre!la!discapacidad!a!largo!plazo,! pero! su! utilidad! en! la! fase! más! activa! de! la! enfermedad! está! refrendada! por! numerosos!trabajos.!En!los!próximos!años!dispondremos!de!una!gran!cantidad!de! moléculas,!con!mecanismos!de!acción!más!dirigidos,!actualmente!en!ensayo!(fase! de!seguimiento).!En!este!grupo!destacan!los!anticuerpos!monoclonales!que!actúan! en! la! sinapsis! inmunológica! contra! moléculas! específicas.! Aquí!destacan!entre! otros,! el! anticuerpo! anti! CD! 25! (Bielekova! y! cols.,! 2004),! anticuerpo! anti! CD52! (Paolillo!y!cols.,!1999).!! ! 41! ! Se! encuentran! en! experimentación! otros! con! enfoques! terapéuticos! completamente!diferentes,!como!el!transplante!de!progenitores!hematopoyéticos! (Saccardi!y!cols.,!2005),!trasplante!de!células!madres!mesenquimales!(Izquierdo!y! Fernández,! 2012).! Estos! fármacos! actúan! en! puntos! muy! dispares,! pero! con! un! objetivo! común:! frenar! los! mecanismos! inflamatorios! que! conducen! parcial! o! totalmente!a!la!desmielinización!y!daño!axonal.! ! La! neuroprotección! es! también! un! área! en! investigación.! Aunque! los! propios! inmunomoduladores!podrían!estar!provistos!de!esta!capacidad!(Biernacki!y!cols.,! 2005;! Ziemssen! y! cols.,! 2005),! cada! vez! se! proponen! moléculas! más! específicas! neutralizantes!de!las!sustancias!capaces!de!ocasionar!directamente!lesión!axonal,! como!los!inhibidores!del!óxido!nítrico!(Encinas!y!cols.,!2005)!bloqueadores!de!los! canales!de!calcio!(BranddSchieber!y!Werner,!2004)!y!diversos!antioxidantes!como! las!metalotioneínas!(Penkowa!y!cols.,!2003)!y!las!estatinas!(Endres,!2006).!! ! Aunque!como!se!ha!comentado!previamente,!la!remielinización!es!un!hecho!que! puede! suceder! espontáneamente,! también! se! investiga! en! este! campo! con! la! intención! de! poder! potenciarla.! Existen! diferentes! ensayos! clínicos! en! marcha! sobre!este!aspecto.!! ! ! ! 48! astrocitos!(Allen!y!McKeown,!1979;!Allen!et!al,!1981).!Por!otra!parte,!a!pesar!de! que!no!son!normalmente!visibles!en!la!RM!convencional!(Kidd!et!al,!1999;!Geurts! et!al,!2005a,!b;!Peterson!y!Trapp,!2005),!las!lesiones!corticales!son!en!realidad!muy! comúnes! y! se! ha! demostrado! que! la! demielinización! y! la! pérdida!axonal!se! producen!en!la!sustancia!gris!de!los!pacientes!con!EM!(Peterson!et!al,!2001;!Bo!et! al,!2003;!Geurts!et!al,!2005a;!Peterson!y!Trapp,!2005.).!! ! Los! resultados! de!una! variedad! de!técnicas! de! resonancia! magnética! no! convencionales!han!apoyado!la!idea!de!que!el!SBAN!de!los!pacientes!con!EM!es,!de! hecho,!anormal!(Filippi!et!al,!1999;.!Wolinsky!y!Narayana,!2002!;!Caramanos!et!al,! 2003).! Por! ejemplo,! los! estudios! utilizando!espectroscopia! de! resonancia! magnética!de!protones!(ERM)!han!proporcionado!pruebas!de!cambios!en!la!SBAN! estos!pacientes!(Matthews!et!al,!1998;.!Arnold,!1999;!Wolinsky!y!Narayana,!2002).! ! 7.2.3.!Aplicación!de!ERM!a!EM:!Sustancia!Gris!Cortical!(SGC)! ! En! pacientes! con! EMRR! precoces! (Chard! !y!cols.,!2002)!se! ha! descrito! una! reducción! estadisticamente! significativa! de! la! NAA,! Cho! y! GLX.! La! reducción! de! NAA! en! SGC! sugirió! una! disfunción! o! pérdida! neuronal! leve! pero!generalizada,! desde!el!principio!de!la!enfermedad!(Kapeller!y!cols.,!2001).!Los!déficits!de!NAA!en! la!SGC!fueron!encontrados!en!la!forma!progresiva!de!la!enfermedad,!la!cual,!sin! embargo,! no! se! correlacionó! significativamente! con! EDSS! lo! que! sugiere! que! el! proceso!patológico!en!la!EM! se!extiende!hacia!la!SGC,!en!particular! en!la! forma! progresiva!de!la!enfermedad!(Adalsteinsson!y!cols.,!2003).! ! ! 49! 7.2.4.!Conclusiones.!! ! La!ERM!ha!demostrado!poder!suplir!parte!de! las!deficiencias!de!la!RM!habitual! gracias! básicamente! a! dos! particularidades:! permite! demostrar! una! alteración! tisular!del!parénquima!cerebral!en!regiones!de!apariencia!normal!(Davie!y!cols.,! 1997,!Fu!y!cols.,!1998;!Leary!y!cols.,!1999;!Sarchielli!y!cols.,1999;!Casanova!y!cols.,! 2003)!y!nos!informa!cualitativamente!del!sustrato!patológico!que!acontece!en!la! región!(Barkhof!y!van!Walderveen,!1999;!Rovaris!y!Filippi,!2002).!! ! En!la!actualidad,!la!ERMd!H1!es!una!técnica!limitada!a!la!investigación,!y!aún!no!se! incluye!como!herramienta!en!la!práctica!diaria.!Sin!embargo,!hoy!día!que!parte!del! esfuerzo!se!centra!en!la!elaboración!de!tratamientos!neuroprotectores,!es!probable! que!estas!técnicas!sean!necesarias!en!la!monitorización!de!la!eficacia!de!los!nuevos! fármacos!(Schubert!y!cols.,!2002).! ! ! 50! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! II.!Mecanismos!de!neurodegeneración! ! ! 51! 1.!INTRODUCCIÓN.! ! Se!han!propuesto!varios!mecanismos!para!explicar!la!neurodegeneración!en!la!EM! progresiva.!!Diversos!estudios!no!han!podido!demostrar!una!correlación!entre!las! lesiones!en! la! sustancia! blanca!y! la! atrofia!cerebral! (Evangelou!y! cols.,! 2006,! Kutzelnigg!!y!cols.,!2005)!lo! que! sugiere! que!estas! lesiones! no! son! los! unicos! elementos!que!tiene!una!función!en!la!pérdida!del!volumen!tisular!que!se!produce! con!la!progresión!de!la!enfermedad.!! ! Sin!embargo,!una!vez!que!se!alcanza!un!cierto!umbral!de!daño!axonal!en!las!placas! o!en!la!sustancia!blanca!y!gris!de!aspecto!normal,!incluso!un!daño!axonal!leve!dará! lugar!al!deterioro!de!los!síntomas!neurológicos!del!paciente,!debido!al!agotamiento! de!los!mecanismos!compensatorios!(Bjartmar!y!cols.,!2003).!! ! Esto!se!agrava!con!el!fallo!progresivo!de!los!mecanismos!de!remielinización!que,! como!hemos!visto,!!ocurre!con!el!paso!del!tiempo!en!los!pacientes!con!EM.!En!la! mayoría! de! las! lesiones! de! la! EM,!en! particular!las! surgidas! en!los! estadios! progresivos,! la! remielinización! es!escasa,!a! pesar! de! la!presencia! de!axones!y! células!progenitoras!de!oligodendrocitos!en!al!menos!un!subgrupo!de!placas.!! ! ! 52! 2.!DEGENERACIÓN!AXONAL!EN!LAS!LESIONES!INFLAMATORIAS!AGUDAS.! ! Existen! dos!tipos!diferentes! de! inflamación! dentro! de!las!placas! activas:! la! respuesta! inicial,! consistente! principalmente! de!células! T! CD8! +! y! abundante!la! activación!microglial!y!una!secundaria!con!más!reclutamiento!de!células!T,!células! B!y!macrófagos!como!consecuencia!de!la!destrucción!de!la!mielina.! ! 2.1.!Activación!microglial! ! Las! microglias!!del! sistema! nervioso! central! son!vigilantes! dinámicas! de! la! integridad! del! parénquima! cerebral! y! reaccionan! rápidamente! a! las! amenazas! potenciales!mediante!la!encapsulación!de!los!focos!peligrosos,!la!eliminación!de!las! células!apoptóticas!y!ayuda!con!la!regeneración!de!tejidos!en!la!desmielinización! inducida!por!toxinas![Nimmerjahn!y!cols.,!2005,!Remington!y!cols.,!2007].!En!el! contexto! de! una! inflamación! no! autoinmune! asociado! a! patógenos,! la! microglía! protege!el!compartimento!neuronal![Trapp!y!cols.,!2007].!! ! En!la!EMRR,! así! como! en! la! EM! progresiva,! el! daño! tisular! activo!se! asocia! con!la!activacion!de!la!microglia!(Prineas!y!cols.,!2001).!La!microglia!activada!y!los! nódulos!microgliales!se!ven!invariablemente!en!la!sustancia!blanca!de!apariencia! normal!de!los!pacientes!con!EM!progresiva!(De!Groot,!y!cols.,!2001).!Sin!embargo,! la! activación! microglial! también! se! observa! en! muchas! otras! enfermedades! neuroinflamatorias!o!neurodegenerativas,!en!ausencia!de!cambios!patológicos!que! se!asemejen!a!los!de!la!EM,!tales!como!demieliniizacion!selectiva!primaria!(Czeh!y! cols.,! 2011).! Por! lo! tanto,! la! activación! microglial! podría! contribuir!a! la! ! 53! neurodegeneración!en! la! EM,! pero! se! requieren! mecanismos! adicionales! para! desencadenar!los!patrones!de!daño!tisular!que!son!específicos!de!la!EM.!En!la!EM,! la! microglía! y! los! macrófagos! se! convierten! en! un! fenotipo! celular! fuertemente! prodinflamatorio!y!pueden!potenciar!el!daño!neuronal!mediante!la!liberación!de! citoquinas! proinflamatorias! (es! decir,! el! TNFdα,! ILd1β,! ILd6)! y! moléculas! proinflamatorias!tales!como!el!óxido!nítrico,!proteolítica!enzimas!y!los!radicales! libres! [Ransohoff! y! cols.,! 2009,! Vogt! y! cols.,! 2009,! Hohlfeld! y! cols.,! 1997].! Este! estallido!oxidativo!de!la!microglia!activada!parece!tener!un!papel!importante!en!la! inducción!de!desmielinización!y!daño!axonal!progresivo!en!las!lesiones!de!EM.!Por! otra! parte,! la! microglia! también! podría! tener!funciones!neuroprotectores!en! función! de!los!factores! desencadenantes!de! la! activación,! y! podría! estimular! la! remielinización! través! de! la! eliminación! del! tejido! dañado!y! la! secreción!de! moléculas!neurotróficas!(Czeh!y!cols.,!2011).! ! 2.2.!Linfocitos!T!CD8!+! ! Se! han!encontrado!Linfocitos! T! CD8! +! clonalmente! expandidos! dentro! de!las! lesiones! de! EM,! así! como! en! el! líquido! cefalorraquídeo!de!los!pacientes! con! esclerosis! múltiple! [Babbe! y! cols.,! 2000,! Jacobseny!cols.,!2002].! Sin! embargo,! la! importancia!de!estas!células!T!CD8!+!en!la!patogénesis!de!la!EM!es!controvertida! ya!que!existe!la!evidencia!de!que!por!una!parte!tienen!una!función!supresora!que! inhibe!a!los!linfocitos!T!CD4!+!autorreactivos!patologicos![Hu!y!cols.,!2004,!Lu!y! cols.,!2007,!Jiang!y!cols.,!2003]!y!por!otra!juegan!un!papel!en!el!daño!axonal!pues!se! ha!visto!una!correlación!significativa!entre!el!grado!de!daño!axonal!y!el!número!de! linfocitos!T!CD8!+![Kuhlmann!y!cols.,!2002,!Bitsch!y!cols.,!2000].!De!acuerdo!con! ! 54! esto!último,!se!encontraron!Linfocitos!T!CD8!+!que!inducian!la!muerte!neuronal!en! cultivos! de!neuronas! y! en! cortes! de! hipocampo! [Meuth! y! cols.,! 2009,! Medana! y! cols.,!2000].!Además,!se!han!descrito!la!transección!de!neuritas!por!células!T!CD8!+! [Medana!y!cols.,!2001],!un!proceso!que!también!puede!contribuir!a!la!patología!en! la!enfermedad!humana.!! ! 2.3.!Linfocitos!T!CD4!+! ! Las!evidencias!actuales!siguen!favoreciendo!a!los!linfocitos!T!CD4!+!reactivas!como! el! componente! más! importante! en! la! inducción! de! una! respuesta! autoinmune! contra!la!vaina!de!mielina.!Sin!embargo,!la!contribución!de!los!linfocitos!T!CD4!+!a! la!neurodegeneración!es!cuestión!de!debate.!Surgen!dudas!dertivadas!del!hecho!de! que!los!linfocitos!T!CD4!+!parecen!ser!bastante!raros!en!las!lesiones!de!pacientes! con!EM!d!al!menos!en!las!etapas!tardías!de!la!enfermedad!d!y!que!los!tratamientos! con!anticuerpos! dirigidos! contra!las! células! T!y! su! diferenciación! no! mostraron! eficacia!terapéutica!en!los!pacientes!con!EM![Segal!y!cols.,!2008].!Sin!embargo,!el! riesgo!genético!de!la!EM!y!la!EAE!es!conferido!por!alelos!de!MHC!clase!II!y!por! otros!genes!implicados!en!la!expresión!fenotipica!de!linfocitos!T,!tanto!en!humanos! como!en!el!modelo!murino!de!la!enfermedad![Oksenberg!y!cols.,!2004,!Mangalam!y! cols.,! 2009].! Recientes!avances! en! la! visualización! de! tejidos,! han! permitido! investigar!in!vivo! y!en! microambientes!organotípicos! las!interacciones!entre!las! neuronas! y! las! células! inmunes.! Estos!han! revelado! que!los! linfocitos! T! CD4! +! encefalitogénicos!poseen! marcadas! capacidades! migratorias! dentro! del! parénquima!del!SNC!e!interactúan!directamente!con!el!soma!y!las!dendritas!de!las! neuronas,!lo!que!conduce!parcialmente!a!la!muerte!celular![Nitsch!y!cols.,!2004].! ! 55! ! 2.4.!Folículos!de!células!B!meníngeos.!! ! Teniendo!en!cuenta!la!presencia!de!bandas!oligoclonales!y!el!aumento!de!IgG!que! caracteriza!el!LCR!de!los!pacientes!con!esclerosis!múltiple!(Kabat!y!cols.,!1948)!y!la! eficacia!de!los!anticuerpos!antidCD20,!tales!como!rituximab,!en!la!disminución!de!la! tasa!de!brotes!(Hauser!y!cols.,!2008),!se!reconoce!que!los!linfocitos!B!y!las!células! plasmáticas! podrían! desempeñar! un! importante! papel!en! la! patología! de! la! EM.! Estructuras!similares!a!folículo!linfoides!ectópicos!se!han!descrito!en!las!meninges! de!los!pacientes!EMSP!(Serafini!y!cols.,!2004).!Estas!estructuras!contienen!células! B! sugestivas! de! centros! germinales,! así! como! células! plasmáticas,! células! T! y! células!dendríticas.! Curiosamente,! en! la!corteza!subpial!cerca! de!los!folículos! meníngeos! hay! un! gradiente! de! empeoramiento! neuronal! y! de! pérdida! axonal,!! sugiriendo! que!puede! haber! un! elemento! citotóxico! humoral! parcialmente! responsable! de! la! desmielinización! cortical!observado!en! la! patología!de!la! sustancia!gris!(Magliozzi!y!cols.,!2007,!Androdias!y!cols.,!2010,!Magliozzi!y!cols.,! 2010).!! ! Mientras!que!la!formación!y!la!persistencia!de!los!folículos!linfoides!sugieren!la! presencia! de!antígenos!para! producir!la! inflamación! existente! y! la! ! respuesta! humoral,!la!identidad!del!antígeno!o!agente!infeccioso!que!está!impulsando!este! proceso!nos!es!desconocida.!Los!datos!epidemiológicos!y!una!mayor!reactividad! inmune!especifica!al!EBV!en!pacientes!con!EM!sugieren!que!este!virus!podria!jugar! un!papel!en!el!estimulo!del!sistema!inmune!(Willis!y!cols.,!2009,!Thacker!y!cols.,! 2006,!Lassmann!y!cols.,!2011,!Lunemann!y!cols.,!2006,!Lunemann!y!cols.,!2008).!! ! 56! ! Además,! parece! que! hay! una! conectividad!significativa! entre!las!poblaciones!de! células!inmunes!presentes!en!el!LCR!y!en!el!SNC!–!específicamente,!ciertas!células! B! expandidas! clonalmente! han! sido!identificados!en! el! parénquima! cerebral,! folículos!meníngeos!y!LCR!(Lovato!y!cols.,!2011)!y!además,!estas!células!B!son!las! responsables!de!la!producción!intratecal!de!inmunoglobulinas!(Obermeier!y!cols.,! 2011).! Sin! embargo,! las! bandas!oligoclonales!persisten!con! tratamiento! con! los! anticuerpos!monoclonal!antidCD20!a!pesar!del!agotamiento!de!las!células!B!en!el! suero!y!en!el!LCR,!lo! que! indica! que!las!células!plasmáticas!maduras! no!se! ven! afectados!por!estos!tratamientos!antidcélulas!B!(Piccio!y!cols.,!2010).! ! 2.5.!Paradigma!para!la!patogénesis!de!células!Th17.!! ! En! la! actualidad! se! tiene! la! hipótesis! de! que! las! células!Th17! prodinflamatorias! estan!también!involucrados!en!la!iniciación!de!la!patogénesis!de!la!enfermedad,! pues!las!células!Th17!acceden!precozmente!en!el!SNC!(Steinman!y!cols.,!2007).!! ! Las!células!inmunes!podrian!entrar!en!el!sistema!nervioso!central,!para!vigilar,!a! través! del!plexo! coroideo.! Investigaciones!utilizando! un! modelo! de! encefalitis! alérgica!experimental!(EAE)!describen!una!entrada!de!células!Th17!a!través!del! plexo!coroideo!en!el!inicio!de!la!enfermedad!a!través!del!eje!CCR6!d!CCL20!(con! CCR6!expresado! en! células!Th17!y!CCL20!expresadas!en! el!epitelio! del! plexo! coroideo)!(Reboldi!y!cols.,!2009).!Si!este!modelo!fuera!aplicable!a!la!enfermedad! humana,! podriamos! especular! que! en! el! contexto! de! una!regulación! inmune! defectuosa!las!células!Th17!autorreactivas!activadas! periféricamente! se! podrian! ! 57! unir!a!moléculas!de!adhesión!y!receptores!de!quimioquinas!expresadas!en!el!plexo! coroideo!y!migrar!a!través!de!la!BHE!al!LCR!de!los!ventrículos.!! ! Una!vez!dentro!de!los!ventrículos,!las!células!podrian!penetrar!en!el!parénquima! periventricular!o!continuar!circulando!hasta!que!acceden!a!la!corteza!pia!y!subpial.! Las! citocinas!ILd17! e! ILd22! liberadas! por! las! células!Th17! aumentan! la! permeabilidad!de!la!BHE!e!inician!una!cascada!de!penetración!de!celulas!inmunes! por! las! células!Th17!autodreactivos! (Kebir! y! cols.,! 2007),! así! como! Th1! (IFNdγ! secretora),!células!T!γδ,!células!CD8!+!citotóxica,!células!B!y!células!plasmáticas! secretoras! de! inmunoglobulina,! que! luego! podrían! formar! infiltrados! perivasculares.! ! Por!lo!tanto,!podemos!plantear!un!modelo!de!dos!etapas!de!la!enfermedad!para!la! EM,!que! puede! ser! similar! a!la!diabetes!en! ratones!NOD,! en! el! que!periinsulitis! precede!a!la!invasión!inflamatoria!de!la!ínsula!(Toyoda!y!cols.,!1998).!En!primer! lugar,! las! células! Th17!autorreactivas!podria! ser! atraidas! y! migrar! a! través! del! plexo! coroideo!para! acceder! al!LCR! y! el! SNC!periventriculares! y! subdpial.! En! segundo!lugar,!las!células!Th17,!que!han!invadido!el!SNC,!aumentan!permeabilidad! de! la! BHE!por! la! liberación! de!citoquinas!y!inician! una! cascada!patológica!de! inflamación!que!se!correlaciona!con!una!exacerbación!clínica.! ! 2.6.!Hipótesis!del!Daño!por!estrés!oxidativo! ! Durante!el!ataque!inflamatorio!agudo!en!la!EM,!las!células!T!activadas!inician!la! cascada!prodinflamatoria! en! respuesta! a!encontrarse! con!un! antígeno.! Esta! ! 64! puede!conducir!a!daños!de!los!axones,!causada!por!un!aumento!de!la!afluencia!de! Ca2!+!(Ouardouz!et!al,!2009a,!b).!El!aumento!en!el!Ca2!+!intracelular!activa!varias! enzimas,! incluyendo! las! fosfolipasas,! endonucleasas! y! proteasas,! que! dañan! el! ADN,!alteran!el!citoesqueleto,!y!alteran!los!lípidos!de!membrana![Gunter!y!cols.,! 2004].! Los! niveles! elevados!de! Ca2!intracelulares! también! alteran! la! dinámica! mitocondrial,!promoviendo!la!entrada!de!Ca2!+!a!la!matriz,!abriendo!los!poro!de! transición!de!permeabilidad,!y!liberando!citocromo!C!en!el!citosol.!En!el!segundo! tipo!de!receptores!se!asocian!con!la!activación!de!la!caspasad3,!fragmentación!de! ADN,! la! muerte! celular! apoptótica,! y! la! desmielinización! (Domercq! y! col,! 2005;! Karadottir!y!Attwell!,!2007,!Salter!y!Fern,!2005;!Xu!et!al,!2008).! ! 2.8.!Vía!de!convergencia:!daño!mitocondrial.!!! ! Es!importante!tener!en!cuenta!que,!si! bien!los!mecanismos!propuestos!de!daño! axonal!del!NO!y!del!glutamato!son!vias!separadas!y!distintas,!ambas!convergen!en! una!vía!común!que!es!la!disfunción!mitocondrial.!! ! Esta!convergencia!no!es!exclusiva!de!los!ataques!inflamatorios!agudos!de!la!EM,! sino!que!está!presente!en!las!etapas!progresivas!independientes!de!la!inflamación! aguda,! haciendo! hincapié! en! la! importancia! de! las! mitocondrias! en! el! mantenimiento!de!la!integridad!axonal!y!la!supervivencia.! ! La! evidencia! de! daño! mitocondrial! en!las! lesiones! de! EM!se! identificó! originalmente!a!partir!de!los!análisis!bioquímicos!de!la!deteriorada!actividad!de!la! NADH! deshidrogenasa! y! aumento! de! la! actividad! del! complejo! IV! en! las! ! 65! mitocondrias!de!las!lesiones!(Lu!y!cols.,!2000)!y!de!perfiles!de!expresión!génica!de! tejido! de! la! corteza! motora!(Dutta!y!cols.,!2006).! Posteriores!estudios! inmunohistoquímicos! de!las! proteínas!de! la! cadena! respiratoria!revelaron!un! profundo!daño!mitocondrial,!posiblemente!reflejando!mayor!daño!oxidativo!en!las! áreas!de!daño!tisular!precoz!dentro!de!las!lesiones!activas!de!EM!(Mahad!y!cols.,! 2008).!Además!se!ven!dentro!de!los!axones!en!las!placas!inactivas!un!aumento!en! el!contenido!mitocondrial!d!que!podría!ser!atribuible!al!incremento!en!el!número! de! mitocondriales! o! al! volúmen! de! una! mitocondria! en! particular! –!y!en!la! actividad!de!las!enzimas!(Mahad!y!cols.,!2009,!Witte!y!cols.,!2009).!Este!aumento! de! la! actividad! mitocondrial!se!normaliza! en! parte! en! las! fibras! remielinizadas! (Zambonin!y!cols.,!2011).!Así,!cuando!las!lesiones!están!inactivas,!el!aumento!de!la! demanda! de! energía! de!los! axones! desmielinizados! produce! un! aumento! compensatorio! en! el! contenido! mitocondrial! y! en! la! función! respiratoria!de! los! axones;!sin!embargo,!este!aumento!de!la!demanda!de!energía!es!en!parte!invertido! cuando! se! produce! la! remielinización.! Estos! datos! indican! que!el! daño! tisular! activo!en!la!EM!está!asociada!con!la!lesión!mitocondrial.!! ! ! 66! 3.! DEGENERACIÓN!AXONAL!DURANTE! LAS! ETAPAS!PROGRESIVAS! INDEPENDIENTES!DE!INFLAMACIÓN!AGUDA.! ! 3.1.! La! desmielinización! crónica!produce! la! sobrerregulación! y! la! reorganización!de!los!canales!iónicos! ! En!las!etapas!progresivas!de!la!EM,!hay!menos!ataques!inflamatorios!agudos!en!el! SNC,! lo! que! sugiere! que!otros! mecanismos! están! implicados! en! la! degeneración! axonal.! En! esta! etapa! de! la! enfermedad,! los! medicamentos! antidinflamatorios! comúnmente!utilizados,!tales!como! el! interferón! beta! y! acetato! de! glatiramero,! tener! un! efecto! mínimo! en! el! retraso! o!la! inhibición! de!los! síntomas! neurodegenerativos!de!la!EM.! ! Uno!de!los!principales!cambios!estructurales!durante!la!fase!progresiva!de!la!EM!es! la! pérdida! de! la! mielina.! En!un!axón! normal! mielinizado,! los! canales! de! sodio! dependientes!de!voltaje!están!concentrados!en!los!nodos!de!Ranvier,!y!la!vaina!de! mielina!aísla!el!axón!internodal!de!modo!que!la!corriente!"salta"!de!nodo!a!nodo.! La!pérdida!de!la!mielina!afecta!en!gran!medida!la!eficacia!de!la!propagación!del! acción!potencial.! En! respuesta! a! la! desmielinización,! los! canales! de! sodio! se! redistribuyen!a!lo!largo!del!axón!y!su!síntesis!esta!aumentada,!incluyendo!tanto!los! subtipos!Nav1.6!y!Nav1.2! [Craner!y!cols.,!2004].! El!subtipo! Nav1.6,! que! normalmente!se!expresa!en!los!nodos!de!Ranvier,!tiende!a!producir!corrientes!más! grandes! y! más! persistentes! en! comparación! con! el!subtipo! de!Nav1.2,! que! se! expresa!predominantemente!en!los!axones!premielinazados.! ! ! 67! La! reorganización!de! los! canales! de!sodio! voltaje!dependientes! y! la!regulación! positiva! de! la!expresión! de! los! canales!en! los! axones! de! mielina! produce! unas! necesidades! de! energía!alteradas.! La! demanda! de! ATP! excede!la! capacidad! de! producción!de!las!mitocondrias!existentes!y!las!ATPasa!Na!+!/!K!+!cruciales!para!el! mantenimiento!de!los!gradientes!iónicos!comienzan!a!fallar.!Un!exceso!de!iones!Na! +!se!acumula!intracelularmente,!y,!finalmente,!se!invierte!el!intercambiador!Na!+!/! Ca2!+!de!que!normalmente!introduce!Na!+!y!saca!Ca2!+!de!la!célula![Dutta!y!cols.,! 2006,!Stys!y!cols.,!1992].!Una!prolongada!elevación!de!los!niveles!de!Ca2!+!en!el! axoplasma! puede! provocar! posteriormente! una! multitud! de! eventos! que! finalmente!ocasiona!la!disfunción!mitocondrial!y!daño!axonal.! ! 3.2.!Efecto!de!la!elevación!de!los!niveles!intracelulares!de!Ca2!+!en!la!función! mitocondrial! ! La!mitocondria!es!la!planta!de!energía!de!la!célula,!el!sitio!en!el!que!se!llevan!a!cabo! la! respiración! aeróbica! y! la! síntesis! de! ATP.! Tiene!una!doble! membrana!que!la! dividide!en!dos!compartimentos!principales,!la!matriz!y!el!espacio!intermembrana.! La! membrana! mitocondrial! externa! que! encierra! el!orgánulo!contiene!un! gran! número!de!canales!(porinas),!que!permiten!la!libre!difusión!de!las!moléculas!5.000! Daltons!o!menos.!Las!proteínas!más!grandes!pueden!entrar!en!la!mitocondria!a! través!de!translocasas!de!la!membrana!externa,!lo!que!las!introduce!en!el!espacio! intermembrana.! El! espacio! intermembrana! se! encuentra! entre! las! membranas! mitocondriales!externa!e!interna;!el!citocromo!C,!una!proteína!prodapoptótica,!se! encuentra!aquí.! La! membrana! mitocondrial! interna! separa!el! espacio! intermembrana!de!la!matriz,!y!contiene!una!amplia!gama!de!proteínas,!incluyendo! ! 68! la! cadena!de! transporte! de! electrones,! la! ATP! sintetasa,! la!translocasa!de! la! membrana!interna,!y!el!poro!de!transición!de!permeabilidad!(PTP).!La!cadena!de! transporte!de!electrones!y!la!ATP!sintetasa!están!involucrados!en!la!fosforilación! oxidativa,! que! genera! el! potencial! de! membrana! mitocondrial,! el! gradiente! de! protones,!y!por!supuesto,!el!ATP!que!es!necesario!para!la!supervivencia!celular.!! ! Durante!la! fosforilación! oxidativa! y! la! síntesis! de! ATP,! los! electrones! son! transferidos!a!lo!largo!de!la!cadena!transportadora!de!electrones!localizada!en!la! membrana!mitocondrial!interna,!que!está!acoplado!con!el!movimiento!de!iones!H!+! desde! la! matriz! a! través! de! la! membrana! hasta! el! espacio! intermembrana.! Este! movimiento!iónico!genera!un!potencial!transmembrana!a!través!de!la!membrana! interna!(~!d200!mV),!y!es!este!gradiente!de!voltaje!que!se!utiliza!posteriormente! para!sintetizar!ATP.!! ! Más!allá!de!la!síntesis!de!ATP,!este!potencial!transmembrana!también!impulsa!los! iones!cargados!positivamente,!tales!como!Ca2!+!a!la!matriz!(mediante!la!apertura! de!canales!Ca2! +! voltaje! dependientes).! En! consecuencia,! las! mitocondrias! acumulan!Ca2+!!cada!vez!que!los!niveles!citoplásmico!locales!se!elevan!por!encima! de!un!punto!de!ajuste!crítico,!y!luego!lo!liberan!lentamente!cuando!se!restauran!los! niveles!citoplasmáticos![Krieger!y!cols.,!2002].! ! La!acumulación!de!iones!Ca2! +! dentro! de!la! matriz! mitocondrial!depende! de! la! concentración! citoplasmática! de! Ca2! +,! así! como! la! afinidad! de! dos! transportadores!mitocondriales!uno!que!introduce!y!otro!que!extrae!iones!Ca2!+! de! la! matriz.! Como!los!iones!Ca2! +!tienen! una! mayor! afinidad! por! el!que! los! ! 69! introduce!hacia! el! interior,! el! Ca2! +!tiende! a!ser! transportados!a! la! matriz! mitocondrial!cuando!sus!niveles!citoplásmicos!son!elevados![Gunter!y!cols.,!2012].! ! La!acumulación!de!Ca2!+!en!la!matriz!mitocondrial!es!fisiológicamente!importante! en! la! estimulación! de! la! fosforilación! oxidativa.! Tres! importantes! enzimas! metabólicas!se!activan!por!el!Ca2!+,!incluyendo!la!piruvato!deshidrogenasa,!alfad cetoglutarato,!y!la!isocitrato!deshidrogenasa![Gunter!y!cols.,!2012].!Sin!embargo,! unos!niveles!elevados!de!Ca2!+!prolongados!también!pueden!inducir!la!apertura! del!PTP,! que! conduce! a!una! cascada! de! eventos,! incluyendo! la! hinchazón! de! la! matriz,! la! ruptura! de! la! membrana! mitocondrial! externa,! y! la! liberación! del! citocromo!C,!lo!que!provoca!la!vía!de!prodapoptótica.! ! Las!características!claves!de!la!patología!de!las!lesiones!de!EM!se!pueden!explicar! como!resultado!de!esta!lesión!mitocondrial.!! ! En!los!axones!desmielinizados,!donde!estan!alteradas!la!expresión!y!la!actividad!de! varios!tipos!de!canales!de!Na!+!y!Ca2!+!(Bechtold!y!cols.,!2006,!Black!y!cols.,!2006,! Friese!y!cols.,!2007),!la!reducción!de!la!producción!local!de!energía!debido!al!daño! mitocondrial!podría!precipitar!la!desaparición!axonal.!Los!axones!de!calibre!fino!se! afectan! mas! que! los!gruesos,! ya! que! contienen,! en! comparación! a! los! axones! gruesos,!menor!número!de!mitocondrias!en!relación!con!la!superficie!del!axolema! (Trapp!y!cols.,!2009).!! ! En!los! oligodendrocitos,! el! daño! mitocondrial! produce! ! la! liberación! del! factor! inductor!de!apoptosis,!su!translocación!en!el!núcleo,!y!la!activación!de!la!polidADPd ! 70! ribosa! polimerasa! (PARP),! un! mecanismo! demostrado! in! vivo! en! un! modelo! experimental!de!destrucción!de!oligodendrocitos!y!desmielinización!inducida!por! cuprizone!(Veto! y! cols.,! 2010).! Además,! in! vitro! (es! decir,! en! ausencia! de! astrocitos),! las! células! progenitoras! de! oligodendrocitos! son! más! resistentes! al! daño! mitocondrial! que!los! oligodendrocitos! maduros,! pero!su! capacidad! de! diferenciarse!y!formar!vainas!de!mielina!esta!disminuida!(Ziabreva!y!cols.,!2010).! Esta! observación!podría!explicar! el! fracaso! de! la! remielinización! en! las!placas! crónicas,! a! pesar! de! la!presencia! de!celulas! progenitoras! de! oligodendrocitos! (Chang!y!cols.,!2002).!! ! Se! han! encontrado! en!pacientes!con! EM! progresiva! neuronas!corticales!con! deficiencia! en! la! !respiración,! y! tales!neuronas!presentan! altos! niveles!de! deleciones! del! ADN! mitocondrial!(Campbell!y!cols.,!2011).! La! acumulación! de! deleciones!del!ADN!mitocondrial!en!la!EM!progresiva!podría!explicar!en!parte!el! aumento! de! la! susceptibilidad! del! tejido! cerebral!a! la! neurodegeneración!en! pacientes!con!EMPP!o!EMSP! ! 3.3.!Transporte!axonal!en!la!EM.! ! El!transporte!axonal!es!necesario!para!la!función!normal!y!la!supervivencia!de!las! neuronas,!transmitiendo!las!proteínas!recién!sintetizadas!desde!el!cuerpo!celular!a! los! sitios!a! lo! largo! del!axón,! y! la! entrega! de! complejos! de! señalización! trófico! desde!los!terminales!sinápticos!al!cuerpo!de!la!célula!de!nuevo.!Parece!probable! que!la!disfunción!mitocondrial!en!la!EM!(y!por!lo!tanto!el!déficit!en!la!producción! ! 71! de!ATP)!dé!lugar!a!anormalidades!en!el!transporte!axonal,!lo!que!a!su!vez!podría! contribuir!a!la!degeneración!axonal.! ! 3.4.!Acumulación!de!hierro! ! El! hierro! se! acumula! en! el! cerebro! humano! envejecido!(Hallgren!y!cols.,!1958),! donde!se!almacena!en!su!mayor!parte!en!los!oligodendrocitos!y!es!detoxificado! mediante!su!unión!a!ferritina!(Hulet!y!cols.,!1999).!La!carga!de!hierro!en!el!cerebro! aumenta!durante!la!edad!adulta!y!alcanza!una!meseta!entre!40!y!50!años!de!edad! (Hallgren!y!cols.,!1958).! La! acumulación! intracitoplasmática! de!Fe2! +!en! los! oligodendrocitos!podría!explicar!en!parte!la!alta!susceptibilidad!de!estas!células!a! la! degeneración!bajo! las! condiciones! de! estrés!oxidativo! inducido!por! la! inflamación! y!la!disfunction! mitocondrial!(Zhang!y!cols.,!2005).! Es! importante! destacar! que!la! destrucción!de! oligodendrocitos!libera! este!Fe2! +! acumulado! al! espacio! extracelular,! donde! podría! amplificar! aún! más! el! daño! oxidativo!en! los! axones!y! otras! células.! En!las! lesiones! de! EM,! el! Fe2! +!es! absorbido! por!los! macrófagos!activados!y!microglia!(Craelius!y!cols.,!1982,!Bagnato!y!cols.,!2011).!Sin! embargo,! el! Fe2! +! que! contiene! la! microglia! en! el! cerebro! humano! ! finalmente,! produce!fragmentación!y!degeneración!celular!(Lopes!y!cols.,!2008),!que!conduce!a! una!segunda!oleada!de!liberación!de!Fe2!+.! ! La!acumulación!de!Fe2!+!en!el!espacio!extracelular!y!su!absorción!por!las!células! de!las!lesiones!podría!aumentar!la!susceptibilidad!de!los!tejidos!circundantes!a!la! desmielinización! y! la! neurodegeneración!producida!por!los!radicales! libres.! Debido!a!que!esta!acumulación!es!un!proceso!dependiente!de!la!edad,!es!probable! ! 72! que!sea!más!pronunciada!en!los!pacientes!con!EM!progresiva!que!en!los!que!están! en!la!fase!de!brotes.! ! ! 73! 4.!CONCLUSIONES! Ninguno!de!los!mecanismos!patogénicos!proporciona!una!explicación!consistente! para!todo! el! espectro!de!la!patología! de! la! EM!y!para!todas! las! alteraciones! patológicas!asociadas!con!la!conversión!de!EMRR!a!EMSP.!! ! En!la! ausencia!de! un! mecanismo! definitivo! de! la! enfermedad,! las! evidencias! actuales!indican!que!diversas!vías!interconectadas!contribuyen!a!la!patogénesis!de! la!EM.!En!todas!las!formas!y!etapas!de!la!enfermedad,!la!inflamación!parece!llevar!a! la!desmielinización!y!neurodegeneración.!En!la!etapa!progresiva,!la!inflamación!se! queda,!al!menos!en!parte,!atrapada!dentro!del!SNC!detrás!de!la!BHE.!El!daño!tisular! puede!ser!efectuada!por!la!activación!microglial!y!la!actividad!de!los!macrófagos,! junto!con!el!daño!oxidativo!y!del!glutamato!y!lesión!mitocondrial!posterior.!En!las! etapas!progresivas!de!la!EM,!el!daño!oxidativo!ya!existente!podría!ser!amplificado! por!la! liberación! del!hierro!intracelular,! que! se! ha! acumulado! en!los! oligodendrocitos!con! la! edad.! Posiblemente! el! daño! oxidativo!crónico!y! la! desmielinización!crónica!pueden!conducir!a!un!desequilibrio!iónico!en!los!axones!y! las! neuronas,! lo! que! puede! amplificar! la! neurodegeneración.! Por! último,! la! acumulación!de!daños!en!los!tejidos!dará!lugar!a!un!agotamiento!de!la!capacidad! de!reserva!funcional!del!cerebro,!lo!que!podría!acelerar!el!deterioro!clínico!a!pesar! del!lento!daño!tisular!en!la!fase!progresiva.! ! Por!lo!tanto,!se!precisan!de!nuevas!evidencias!que!demuestren!el!papel!del!daño! oxidativo! en! la! acumulación! de! discapacidad,! relacionandolo! con! el! sustrato! anatomo!patológico.!! ! 80! por!los!hallazgos!objetivos!en!un!examen!neurológico!(Poser!!y!cols.,!1983).!Los! cambios!en!los!patrones!de!las!lesiones!cerebrales!visibles!en!la!RM!reflejan!los! cambios! en! la! patología! subyacente! de! la! enfermedad,! lo! que! proporciona! la! justificación!del!uso!de!las!lesiones!(generalmente!cuantificada!como!el!número!de! lesiones!que!captan!gadolinio![Gd]!en!las!imágenes!potenciadas!en!T1!o!nuevas! lesiones!en!en!T2)!como!medidas!de!actividad!de!la!enfermedad!(Barkhof!y!cols.,! 1997).!! ! Una! revisión! de! estudios! confirma! la! amplia! heterogeneidad! en!la! definición! de! "respondedor"!y!"no!respondedor",!y!en!los!marcos!de!tiempo!durante!el!cual!se! evalúan!estas! eventualidades.! En! muchos! estudios,! la! definición! de! la! falta! de! respuesta!al!tratamiento!con!IFNdβ!se!ha!basado!en!un!aumento!de!1!punto!en!la! EDSS!confirmada!a!los!6!meses.!(Durelli!y!cols.,!2008,!Cadavid!y!cols.,!2011,!Río!y! cols.,! 2008,! Prosperini! y! cols.,! 2009,! Sormani! y! cols.,! 2013,! Tomassini!!y!cols.,! 2006).!Sin!embargo,!este!cambio!en!el!estatus!de!discapacidad!se!mide!a!menudo! independientemente!de!la!duración!del!seguimiento!clínico,!que!varía!mucho!entre! los!estudios!(entre!1!d!6!años)!(Durelli!y!cols.,!2008,!Cadavid!y!cols.,!2011,!Río!y! cols.,! 2008,! Prosperini! y! cols.,! 2009,! Sormani! y! cols.,! 2013,! Tomassini!!y!cols.,! 2006).!El!tiempo!de!seguimieto!es!un!componente!crucial!en!la!definición!de!falta! de! respuesta,! ya! que!1! punto!de! progresión! de!EDSS!tiene! significados! muy! diferentes!clínicas,!si!es!en!un!periodo!de!1!o!de!2!años.!Los!parámetros!que!se!han! utilizado!para!definir!los!no!respondedores!en!los!estudios!a!largo!plazo!(15!a!16! años!de!seguimiento)!incluyen!el!cambio!neto!en!la!EDSS,!(Bermel!!y!cols.,!2013)! así!como!el!tiempo!en!llegar!a!una!puntuación!de!EDSS!≥!6!o!la!conversión!a!EM! secundaria! progresiva! (Goodin!!y!cols.,!2012).!En!otros! estudios,! la! falta! de! ! 81! respuesta!ha!sido!definida!como!la!combinación!de!la!progresión!de!EDSS!y!/!o! brotes!(Durelli!y!cols.,!2008,!Río!y!cols.,!2008,!Tomassini!!y!cols.,!2006)!o!como!el! cambio!en!la!tasa!de!brotes!en!comparación!con!la!frecuencia!de!brotes!antes!del! tratamiento! (Romeo! y! cols.,! 2013,! Mezei! y! cols.,! 2012,! Waubant! y! cols.,! 2003,! Portaccio! y! cols.,! 2006,! Fromont!y!cols.,!2008).!Por! otra! parte,! la! ausencia! o! presencia!de!lesiones!activas!en!la!RM!durante!el!tratamiento!se!ha!incluido!en!las! definiciones! de!la! respuesta! y! la!falta! de! respuesta! al! tratamiento,! debido! a! la! interpretación!común!de!la!actividad!en!RM!como!expresión!de!la!progresión!de!la! enfermedad!(Romeo!y!cols.,!2013).!Por!último,!incluso!cambiar!una!droga!por!otra! se! ha! considerado! como! criterio! de!falta! de! respuesta! (Sormani! y! cols.,! 2013,! Romeo!y!cols.,!2012).!!Un!estudio!reciente,!!que!se!centró!en!estudios!de!cambio!de! tratamiento! en! malos! respondedores! a! los! tratamientos! de! la! EM! (Freedman!y! cols.,! 2009),! destacó! la!variedad! de! definiciones! de! la! respuesta! al! tratamiento! subóptimo! en! base! a!resultados! de! la! RM,! recaídas! y! la! progresión! de!la! discapacidad.! ! Resumiendo,! las! definiciones! de!respuesta! a!IFNdβ! se! basan! esencialmente! en! medidas!de!progresión!de!la!discapacidad,!los!brotes!y!la!actividad!de!resonancia! magnética,!aunque!aún!falta!una!definición!común.!Una!definición!normalizada!de! la!respuesta!al!tratamiento!es!de!suma!importancia!para!permitir!la!comparación! de!diferentes!estudios! y!validación!de! los! marcadores! de! la! respuesta.! Hasta! la! fecha,!dos!han!sido!los!intentos!para!diseñar!una!definición!homogénea!y!basada! en!la!evidencia!de!la!respuesta!a!la!terapia!con!IFNdβ:!Una!por!parte!del!Grupo!de! Trabajo!Canadiense!de!Esclerosis!Múltiple!(CMSWG)!y!otra!por!parte!de!Rio!y!cols.! ! 82! 4.!CUANTIFICANDO!LA!RESPUESTA!AL!TRATAMIENTO!CON!IFNHΒ! ! Se! ha! demostrado! que! tanto! los! brotes! como! las! lesiones!activas!en! RM! representan!buenos!marcadores!subrogados!de!la!discapacidad!clínica!en!la!EM.! De!hecho,!un!análisis!publicado!en!2011!(Sormani!y!cols.,!2011)!demostró!que,!de! acuerdo!con! los! criterios!Prentice!para!la! validación!de!marcadores! subrogados! (Prentice,!1989),!tanto!las!lesiones!activas!en!la!resonancia!magnética!al!año!como! los!brotes!representaron!de!forma!independiente!más!del!60%!del!efectos!del!IFNd β!en!el!empeoramiento!de!la!EDSS!a!los!2!años.!Y!lo!que!es!más!importante,!cuando! se! utilizaron!en! combinación! las! lesiones! activas! al! año! y! los! brotes! como! marcadores,! el!efecto! del! IFNdβ! en! la!progresión! a! los! 2! años! parecían! estar! completamente! mediado! por! la! reducción! del! número! de! lesiones! activas!en! resonancia! magnética!y!los! brotes! durante! el! primer! año! de! tratamiento.! En! general,! la! dificultad! de! encontrar!resultados! homogéneos! cuando! se! utilizan! diferentes!marcadores!de!la!respuesta!de!manera!aislada!junto!con!la!observación! de!que!se!pueden!predecir!los!efectos!de!IFNdβ!a!nivel!individual!combinando!los! efectos! de! la! actividad! lesional!al! año! y! los! brotes,!sugiere!que! los! beneficios! inducidos!por!el!IFNdβ!en!la!progresión!de!la!discapacidad!en!pacientes!con!EM! pueden! ser! identificados! mejor! (y! más! rápidamente)! por!el! uso! de!las! cuantificaciones!compuestos!!tanto!clínicas!como!de!RM.!! ! ! 83! 5.!DESARROLLO!DE!SISTEMAS!DE!PUNTUACIÓN! ! El!uso!combinado!de!los!parámetros!de!actividad!de!la!enfermedad!para!predecir! la! respuesta! al! tratamiento! fueron! la! base! de! las! Recomendaciones! de! Optimización! de! Tratamiento! (ROT)! publicados!por! el! Grupo!de! Trabajo! canadiense!EM! (CMSWG)! (Freedman!y!cols.,!2009,! Freedman! y! cols.,! 2013)! y! posteriormente! probado! en!los! pacientes! del! ensayo!PRIMS! (Freedman! y! cols.,! 2008).!El!CMSWG!describe!un!modelo,!derivado!de!un!consenso!de!expertos,!que! se!basa!en!los!diferentes!niveles!de!progresión!de!la!discapacidad,!los!brotes!y!la! actividad!en!RM!durante!el!tratamiento,!que!se!pueden!clasificar!como!"notable",! "preocupante"! y! "acciones! concretas".! En!una! revisión!posterior!de! las! recomendaciones!(Freedman!y!cols.,!2013),!el!CMSWG!propone!que!un!cambio!en! el!tratamiento!puede!ser!considerada!en!cualquier!paciente!con!EMRR!si!hay!un! alto!nivel!de!preocupación!en!todo!un!dominio!(brotes,!la!progresión!o!la!RM),!un! nivel!medio!de!preocupación!en!cualquiera!de!los!dos!dominios,!o!un!bajo!nivel!de! preocupación!en!los!tres!ámbitos.!Cuando!se!aplicó!a!los!datos!del!estudio!PRIMS! (usando! sólo! brotes! y!progresión! de! la! discapacidad)! demostró! ser! capaz! de! identificar!un! grupo! de! malos! respondedores,! el! 89%! de! los! cuales!tenía! un! continuo!avance!en!términos!de!brotes!y!de!progresión.!! ! 84! ! ! ! ! ! ! ! ! 85! Basandose! en!un! estudio! publicado! en!2008!(Río! y! cols.,! 2008),! Río! y!cols,! propusieron!una!versión!cuantitativa!de!medición!de!la!respuesta!terapeútica.!El! sistema!de!puntuación!implicaba!la!evaluación!del!paciente!al!año!del!inicio!del! tratamiento!de!la!presencia!de!brotes,!progresión!de!la!discapacidad!(entendido! como!el!aumento!de!1!punto!de!la!EDSS!confirmado!a!los!6!meses)!y!las!lesiones!de! MRI!activos!(es!decir,!más!de!dos!lesiones!nuevas!en!T2!o!lesiones!captantes!de! Gd).!Encontró!que!los!pacientes!que!fueron!positivos!para!al!menos!dos!de!los!tres! criterios!analizados!después!del!primer!año!de!tratamiento!con!IFNdβ!tenían!una! mayor! probabilidad! de! experimentar! progresión! de! la! discapacidad! o!de!tener! brotes!durante!el!seguimiento,!siendo!firmes!candidatos!a!cambiar!el!tratamiento.! La! presencia!aislada! de! brotes,! aumento! de! la! discapacidad! o! actividad! en! resonancia! magnética! después! de!1! año!de! tratamiento! no! predijo! significativamente! el! riesgo! de! nueva!actividad! clínica!o!progresión! de! la! enfermedad!en!los!siguientes!2!años.!Se!ha!propuesto!una!versión!simplificada!de! la!Río!Score!(llamado!Río!Score!Modificado).!La!Río!Score!Modificada!agrupa!a!los! pacientes!en! tres!grupos! de! riesgo.! El!ejercicio! de! validación!establecia!una! probabilidad!de!progresión!de!la!discapacidad!del!24%!en!el!grupo!de!bajo!riesgo,! el!33%!en!el!grupo!de!riesgo!medio!y!65%!en!el!grupo!de!alto!riesgo.!Los!pacientes! clasificados!como!de!riesgo!medio!por!la!Río!Score!Modificada!son!los!más!difíciles! de!clasificar!en!cuanto!a!la!respuesta!al!tratamiento!y!la!planificación.!Un!estudio! ha!demostrado!que! la! evaluación!adicional!con!resonancia! magnética! y! la! visita! clínica!a!los!6!meses!tras!el!primer!año!del!tratamiento!podría!permitir!una!mejor! clasificación!de!los!pacientes!(Freedman!y!cols.,!2008).! ! 86! ! ! 87! 6.!CONCLUSIÓN.! ! El! uso! de! los! sistemas! de! puntuación! en! EM! d! aunque! susceptibles! de! mejora! a! través! de!la! integración!de!nuevos! y! más! específicos! componentes! de! la! enfermedad!dnos!proporcionan!una!buena!discriminación!entre!los!respondedores! y!no!respondedores!al!tratamiento!con!IFNdβ.!! ! Sin!embargo,!los!sistemas!de!calificación!propuestos,!requieren!mayor!validación! en! cohortes! de! pacientes! con!EMRR! en! tratamiento! IFNdβ,! obtenidos! preferiblemente!de!bases!de!datos!de!la!práctica!clínica!diaria,!ya!que!la!estrecha! vigilancia!realizado!en!los!ensayos!clínicos!puede!sobreestimar!la!sensibilidad!de! los!resultados!cuando!se!traduce!en!la!práctica!clínica.! ! ! ! ! 88! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! IV.!Farmacogenómica!de!los!inmunomoduladores.!! ! 89! 1.!INTRODUCCIÓN! ! Los!mecanismos!que!subyacen!a!la!heterogeneidad!en!la!respuesta!al!tratamiento! no!se!conocen! ! aunque! los! factores! genéticos! probablemente! jueguen!un! papel! importante.! Dada! la! naturaleza! compleja! de! la! Esclerosis! Múltiple,! la! influencia! genética! es!casi! seguro! el! resultado! de!la! contribución! de! múltiples! genes.!El! aumento!en!el!número!de!terapias!disponibles,!combinado!con!el!riesgo!potencial! de!fracaso!del!tratamiento!y!/!o!reacciones!adversas!graves,!hace!de!las!terapias! individualizada!una!necesidad!para!la!EM.!La!identificación!de!los!pacientes!que! pueden!beneficiarse! de!una! terapia! en! particular!es,! por! lo! tanto,! de! gran! importancia.! ! Un!enfoque!farmacogenómico!implica!la!aplicación!de!tecnología!genomica,!tales! como!perfiles! de! expresión!génica,!polimorfismo! de!un!solo!nucleótido!(SNP),!y! proteómica,!en!la!predicción!de!la!respuesta!al!tratamiento!de!un!paciente!y!las! posibles!reacciones!adversas!a!los!fármacos!individuales.!El!objetivo!general!de!la! farmacogenómica,!por!lo!tanto,!es!facilitar!la!individualización!del!tratamiento!del! paciente!(Wolf!y!cols.,!2000).!! ! La! mayoría! de! estudios! de! perfiles! de!transcripción!relacionados! con! el! tratamiento!de!la!EM!han!investigado!los!cambios!inducidos!por!el!IFN!in!vitro!o!ex! vivo! (Comabella! !y!cols.,!2007).!Sólo! un! número! limitado! de! estudios! han! investigado! los! cambios! en! los! perfiles!de! expresión! génica! de!pacientes! que! muestran! una! respuesta! al! ! tratamiento! diferente.!(Baranzini!y!cols.,!2005,! Stürzebecher!y!cols.,!2003,!Singh!y!cols.,!2007,!van!Baarsen!y!cols.,!2008,!Villoslada!! ! 96! 2009).! Curiosamente,! los! SNPs!intragenico!incluyó!algunos! que! implican! la! participación!del!sistema!glutamatérgico!en!la!respuesta!al!tratamiento!con!IFNdβ.! ! 97! 3.!CONCLUSIÓN.!! ! La! farmacogenómica! tienen!un! gran! potencial! para!facilitar! el! desarrollo! de! terapias!adaptadas!individualmente,!y!ha!demostrado!ser!una!herramienta!útil!en! diferentes!tipos!de!enfermedades.!En!la!EM,!la!farmacogenómica!está!todavía!en! las! primeras! etapas! de! desarrollo,! y! numerosos! desafíos! deben!ser! superados! antes!de!disponer!tratamientos!individualizados!para!los!pacientes.!En!particular,! los!criterios!para!definir!respondedor!al!tratamiento!que!deben!ser!sólidamente! establecidos.!! ! También! habrá! que! considerar! el! probable! aumento! de! los! efectos! adversos! no! previstos!en!tanto!que!surgen!nuevos!tratamientos!y!se!usan!terapias!combinadas! durante! largos! períodos! de! tiempo.! La! identificación! de! los! polimorfismos! genéticos!asociados!con!estos!efectos!adversos!ayudará!a!predecir!qué!pacientes! tienen!un!alto!riesgo!de!sufrir!este!tipo!de!reacciones.! ! ! 98! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! V.!Identificación!de!los!objetivos!de!estudio!en!esta!tesis.!! ! 99! Existen! ciertos! puntos! de! interés! pendientes! de! resolver! y! cuya! profundización! podría!contribuir!en!la!mejora!que!tenemos!hoy!día!de!la!EM.!Como!hemos!dicho! anteriormente! no! existen! marcadores! clínicos! o! biológicos! fiables! que! nos! pronostiquen!la!eficacia!o!no!de!un!tratamiento!y!hay!una!necesidad!imperante!de! identificarlos.!! ! Así!mismo,! tenemos!necesidad!de! métodos!sencillos!y! fiables!que!nos! indiquen,! usando!solo!datos!clínicos,!si!un!paciente!dudoso!es!buen!respondedor!o!no.!! ! Desconocemos!que!influencia!podrían!tener!tanto!las!variaciones!en!el!ambiente! de! oxidorreducción! como! la! variación! de! los! niveles! intra! cerebrales! in! vivo! de! ciertas!sustancias!como!el!N!Acetil!Aspartato,!la!colina!o!el!mioinositol!tras!el!inicio! de!un!tratamiento!en!la!respuesta!a!largo!plazo!de!este!tratamiento!así.!! ! Desconocemos! la! influencia! de! los! polimorfismos! genéticos! en! las! diferentes! respuestas!al!interferón!beta.!! ! ! 100! 1.!OBJETIVOS! ! 1.1.!OBJETIVOS!PRIMARIOS!! ! 1.! Medir! el! efecto! a! largo! plazo! del! tratamiento! con! interferón! β1a! IM! en! la! acumulación! del! daño! axonal! en! pacientes! con! EMRR! usando! marcadores! de! oxidorreducción!y!ERM! ! 2.! Validar! los! criterios! clínicos! de! optimización! de! tratamiento! de! la! Canadian! Multiple! Sclerosis! Working! Group!aplicándolos!a!una!población!española!de! pacientes!con!EMRR!tratados!inicialmente!con!interferón!β1a!IM! ! 3.!Identificar!un!conjunto!de!genes!ligados!a!las!diferencias!interindividuales!en!la! eficacia!a!la!terapia!con!Interferón!Beta.!! ! ! 101! 1.2.!OBJETIVOS!SECUNDARIOS! ! 1.!Determinar!la!correlación!existente!entre!el!daño!axonal!en!la!sustancia!blanca! aparentemente! normal! y! las! escalas! de! discapacidad! medidas! por! la! Escala! Funcional! Compuesta! (Multiple! Sclerosis! Functional! Composite! scale,! MSFC)! y! Expanded!Disability!Scale!Score!(EDSS).! ! 2.!Desarrollar!un!programa!informático!que!nos!permita!aplicar!de!manera!sencilla! y!automática!los!criterios!de!optimización!de!tratamiento!de!la!CMSWG.!! ! 3.!Evaluar!si!los!criterios!de!optimización!de!tratamiento!de!la!CMSWG!(basados!en! la!progresión!de!la!discapacidad!y!tasa!de!brotes)!tras!un!año!de!tratamiento!con! Interferón! β1a! IM! pueden! predecir! la! situación! clínica! tras! varios! años! de! tratamiento.!! ! 4.! Genotipado! masivo.! Rastreo! completo! del! genoma! empleando! el! microarray! 250K! NspI! de! Affymetrix! en! 150! pacientes! con! Esclerosis! Múltiple! Remitente! Recidivante!tratados!con!inmuno!moduladores!(250.000.000!genotipos)! ! 5.!Filtrado,!depuración!y!construcción!de!los!mapas!genotípicos!y!haplotípicos!de! la!población!en!estudio!para!el!desarrollo!de!estudios!univariantes.! ! ! 102! 2.!TRABAJOS!REALIZADOS!PARA!CONTESTAR!A!LOS!OBJETIVOS! ! ! 1., Magnetic, Resonance, Spectroscopy, of, normal, appearing, white, matter, in, early, relapsing.remitting,MS.,Disability.spectroscopy,correlations.!Ruiz!dPeña!JL,!Piñero!P,! Sellers! G,! Argente! J,! Casado! A,! Foronda! J,! Uclés! A,! Izquierdo! G.! BMC! Neurology! 2004!Jun!10:!4!(1):!8.! ! 2., Axonal, degeneration, in, ms:, early, magnetic, resonance, spectroscopy, could, be, a, long.term, disability, biomarker.!Ruiz! d!Peña!JL!MD,! Piñero! P! MD,! Izquierdo! G.! ECTRIMS!Meeting.!Copenhagen,!2!al!5!de!Octubre!del!2013.!! ! 3.,Optimization,of,treatment,with,interferon,beta,in,multiple,sclerosis.,Usefulness,of, automatic, system, application, criteria.!RuizdPeña! JL,! Duque! P,! Izquierdo! G.! BMC! Neurology!2008!Mar!6;8:3.! ! 4.,Análisis,farmacogenómico,de,la,respuesta,a,interferón,beta,en,el,tratamiento,de,la, esclerosis, múltiple.! Juan! Luis! RuizdPeña,! Antonio! GonzálezdPérez,! María! Isabel! GarcíadSánchez,!María!Eugenia!Sáez,!Macarena!Rus,!Miguel!Lucas,!Antonio!Alcina,! Fuencisla!Matesanz!y!Guillermo!Izquierdo.!SEN,!Barcelona!19!al!23!de!Noviembre! del!2013.!! ! ! 103! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! VI.!Metodología.!! ! ! 104! 1.!METODOLOGIA!UTILIZADA!EN!EL!ESTUDIO!DEL!EFECTO!DEL!INTERFERÓN! ß! 1! a! IM! SOBRE! MARCADORES! DE! DEGENERACIÓN! AXONAL! Y! DE! OXIDO! RREDUCCIÓN.! ! 1.1.!Diseño! ! Estudio! multicéntrico,! con! un! primer! analisis! transversal!y!con! un! seguimiento! prospectivo!a!12!años,! realizando! un! analisis! longitudinal! en! el! segundo.! La! metodologia!es!similar!en!ambos.!! ! 1.2.!Población!estudiada! ! Un!total!de!31!pacientes!(9!varones!y!22!mujeres)!con!diagnóstico!de!EM!según!!los! criterios! de! Poser!y! que!habían!tenido! al! menos! dos! brotes!en! los! dos! años! anteriores,!se! incluyeron! en! el!estudio.!Los! pacientes!procedían! de!cuatro! hospitales!en!Andalucía!(Hospital!Universitario!Virgen!Macarena,!Sevilla,!Hospital! Puerta!del!Mar,!Cádiz,!Hospital!San!Cecilio,!de! Granada,!y! el! Hospital!Ciudad!de! Jaén,!Jaén).!! ! Estos! pacientes! habían!sido! recientemente! diagnosticados!de!EMRR!!según! criterios! de! Lublin! y! tenía! una!EDSS!entre!0! a! 5,5! como! criterio! de! inclusión.! Ninguno! de! los!pacientes! había! sido! tratado! previamente! con!un! agente! inmunosupresor! o! un! agente! inmunomodulador! o! corticosteroides!en! el! mes! anterior.! ! ! 105! El!estudio!fue!aprobado!por!los!comités!de!ética!de!los!hospitales!participantes!y!el! consentimiento!informado!se!obtuvo!en!todos!los!pacientes.! ! Al!comienzo!del!estudio!se!llevaron!a!cabo!RM!y!ERM!también!en!10!sujetos!sanos,! emparejados!por!edad!de!control!sin!enfermedad!sistémica!o!neurológica!conocida! por!el!mismo!neuroradiólogo!utilizando!el!mismo!equipo!de!resonancia!magnética! y!siguiendo!el!mismo!protocolo!también.! ! 1.3.!Evaluacion!clínica!de!la!discapacidad.!! ! Antes!de!realizarse!las!RM!los!pacientes!fueron!examinados!para!determinar!su! discapacidad! en! las! escalas!EDSS,! Neurological! Rating! Scale! (NRS),! Ambulation! Index! (AI),! test! de! 25!pies! (TWT),! prueba!nueve!agujeros! (9! HPT)! y! PASAT! a! intervalo!de!3!s.!!El!promedio!de!los!dos!ensayos!del!TWT!y!la!media!de!los!cuatro! ensayos!de!la!9HPT!se!calcularon!y,!junto!con!PASAT!se!obtuvo!la!Escala!Funcional! Compuesta! (MSFC)! cuyas! las! puntuaciones!fueron! utilizados! en!los! análisis! posteriores.! Todos! los!neurólogos!estaban! capacitados! para! utilizar!la! escala!de! Kurtzke,!escala!AI,!NRS,!y!la!escala!MSFC,!pero!fueron!redentrenados!para!utilizar! estas!escalas!por!la!misma!persona!y!en!el!mismo!día.! ! 1.4.!Mediciones!de!Resonancia!Magnética! ! La! ERM! y! los! exámenes! convencionales! de! resonancia! magnética! del! cerebro! fueron!obtenidas!en!una!sola!sesión!para!cada!paciente!con!el!mismo!escáner!1.5T! (Signa!Horizon,!GE,!Mass).!! ! 112! ! Los!datos!fueron!procesados!utilizando!la!versión!11.0.0!del!paquete!estadístico! SPSS,!y!se!llevó!a!cabo!un!análisis!estadístico!descriptivo!y!analítico.! ! La!media,!la!desviación!estándar,!la!mediana!y!los!cuartiles!superiores!e!inferiores! fueron!utilizados!para!la!descripción!de!las!variables!numéricas.!Se!llevó!a!cabo! una! comparación! entre! el! grupo! de! "! cambio! de! tratamiento! "! y! el! grupo! "no! cambio! de! tratamiento"! en! relación!a! la! recaída!y!los! datos! de! progresión,! utilizando!el!análisis!univariante!de!la!varianza.! ! La!sensibilidad!del!algoritmo!se!calculó!como!el!número!de!pacientes!considerados! como! C! (necesidad! de! cambio)! en! el! programa! del! total! de!los! pacientes! considerados!como!no!respondedores!después!de!considerar!la!evolución!real.!La! especificidad!del!algoritmo!se!calculó!como!el!número!de!pacientes!que!responden! al!tratamiento!en!relación!con!los!pacientes!considerados!como!N!(sin!necesidad! de!un!cambio!según!el!algoritmo).! ! ! 113! 3.!METODOLOGÍA!UTILIZADA!EN!EL!ESTUDIO!DE!FARMACOGENÓMICA.!! ! 3.1.!Diseño.!! ! Se!usó!una!aproximación!tipo!GWAS!para!identificar!diferentes!single!nucleotide! polimorphism!ligados!a!la!diferente!respuesta!de!los!pacientes!frente!a!interferón! beta.!!! ! 3.2.!Población!estudiada.! ! Se!llevó!a!cabo!la!recolección!de!casos!no!relacionados!de!pacientes!afectos!de!EM.! Igualmente!se!diseñó!una!base!datos!que!integró!los!datos!clínicos!disponibles!de! cada!paciente!con!sus!genotipos!en!cada!locus.! ! 3.2.1.!Tamaño!muestral.!! Se!recogió!información!de!respuesta!al!tratamiento!con!interferón!de!un!total!de! 149! individuos! de! los! 286! pacientes! incluidos! previamente! en! un! GWAS! de! esclerosis!múltiple.!Esto!es!así!pues!era!necesaria!la!recogida!de!número!suficiente! de! pacientes! EM,! con! objeto! de! efectuar! ensayos! intra! cohorte! y! correlaciones! fenotipodgenotipo.! ! 3.2.2.!Criterios!de!inclusión.!! Los! pacientes! cumplían! criterios! de! EM! clínicamente! definida! por! criterios! de! Poser,!1983!y/o!Mc!Donald,!2010!y!estaban!como!primer!tratamiento!con!algunos! de! los! interferones! actualmente! aprobados! por! el! SAS! desde! hacía! al! menos! 12! ! 114! meses.!! ! Se!obtuvo!un!consentimiento!informado!de!cada!paciente!incluido!en!la!cohorte!de! acuerdo!con!la!hoja!de!información!y!los!modelos!establecidos.!! ! 3.3.!Evaluación!y!seguimiento!clínico.! ! Estos! pacientes!fueron! objeto! de!un!seguimiento! prospectivo,!siendo!evaluados! cuatro!veces!al!año!durante!al!menos!12!meses!obteniendose!datos!de!la!actividad! de! la! enfermedad,! determinando! el! número! y! gravedad! de! los! brotes! y! su! discapacidad!usando! la! escala!EDSS!de!Kurtzke.! Las! Recomendaciones! de! Optimizacion!de!Tratamiento,!recogidas!en!el!software!Optem®,!!se!aplicaron!de! forma!retroactiva!a!nuestros!pacientes.!Los!pacientes!fueron!evaluados!según!los! brotes,!la!tasa!de!progresión!y!RM,!en!caso!de!tenerla,!y!fueron!asignados!a!dos! grupos! de! acuerdo! con!las! ROT.!Los!niveles! de! preocupación!fueron! "! no! respondedores!"!y!!"!respondedores".! ! 3.4.!Extracción!y!crioHpreservación!de!ADN! ! Detalles,sobre,las,intervenciones,en,los,pacientes:!! 1.! Información! al! paciente! seleccionado! acerca! de! las! características! del! proyecto!y!sus!riesgos!y!beneficios.!! 2.! Obtención! de! consentimiento! informado! escrito! de! todos! los! pacientes! incluidos!en!el!estudio.!El!consentimiento!informado!contiene!el!código!de!barras! correspondiente!al!paciente!y!sus!datos!personales.!Este!documento!fue!retenido!y! ! 115! archivado!en!el!centro!de!investigación!clínica.!! 3.!Una!vez!que!el!paciente!otorgó!su!consentimiento!informado,!se!obtuvieron! 15!ml!de!sangre!periférica!mediante!venopunción!periférica.!Esta!intervención!la! realizó!personal!cualificado!del!Hospital!Universitario!Virgen!Macarena.!Los!viales! para!esta!extracción!eran!predcodificados.!Es!decir,!incluían!un!código!de!barras! coincidente! con! el! código! de! la! hoja! de! recogida! de! datos! de! cada! paciente.! Mediante!este!sistema!de!predcodificación!el!personal!del!laboratorio!nunca!tenía! acceso!a!los!datos!personales!de!los!pacientes!incluidos!en!el!estudio.!Por!tanto,!se! garantizaba!que!las!muestras!obtenidas!estaban!anonimizadas!antes!de!su!envío!al! laboratorio.!! 4.! Las!muestras!sanguíneas!de!los!pacientes!se!almacenaron!a!–20ºC!hasta!un! máximo!de!30!días.!Se!efectuaron!envíos!periódicos!del!material!sanguíneo!a!las! instalaciones!de!los!laboratorios!para!su!procesado.!! 5.!Se! efectuó! una! recogida! de! los! datos! clínicos! y! epidemiológicos! más! relevantes!de!cada!paciente.!! 6.! Las! muestras! sanguíneas! obtenidas! fueron!procesadas!en!los!laboratorios! para! la! obtención! de! ADN! de! alto! peso! molecular! empleando! la! tecnología! magnapure!y!fueron!criopreservadas!a!–20ºC.!Los!datos!clínicos!adscritos!de!cada! muestra!fueron!procesados!y!organizados!en!bases!de!datos!relacionales!para!su! utilización!en!el!rastreo!de!genes!candidatos!de!la!patología!en!estudio.!! 7.! Tras! la! finalización! del! estudio,! todas! las! muestras! excedentes! pasaron! a! ser! custodiadas! por! el! Biobanco! Hospitalario! Virgen! Macarena.! El! Biobanco! Hospitalario! Virgen! Macarena! está! integrado! dentrode! la! Red! Nacional! de! Biobancos!(Subprograma!RETICS,!RED!DE!BIOBANCOSdISCIII)!y!es!miembro!activo! del!grupo!de!trabajo!para!el!desarrollo!del!Biobanco!del!Sistema!Sanitario!Público! ! 116! de!Andalucía.! ! 3.5.!Estudios!moleculares.!! ! Tecnologías!de!investigación!de!genómica!estructural!empleadas:!Ensayos!de!DNA! arrays!empleando!la!nanotecnología!Affymetrix.! ! El!uso!de!esta!plataforma!tecnológica!permite!el!rastreo!de!264,000!marcadores! genéticos! de! un! solo! polimorfismo! (SNPs)! en! un! paciente! determinado.! Dichos! marcadores!se!encuentran!distribuidos!de!forma!aleatoria!a!lo!largo!de!genoma! con! una! distancia! intermedia! de! 16! Kb,! optimizando! así! su! uso! para! estudios! genéticos!casodcontrol!y!estudios!de!ligamiento!genético.!Por!otro!lado,!dado!que!la! tecnología! de! genotipado! es! perfectamente! cuantitativa,! permite! el! estudio! de! dosis!génica!de!una!forma!locusd!específica.!Esto!se!ha!revelado!de!especial!interés! en!dos!ámbitos!distintos,!por!un!lado!al!posibilitar!el!estudio!de!amplificaciones! génicas!en!tejidos!tumorales,!y!desde!el!punto!de!vista!puramente!estructural,!al! posibilitar!el!estudio!de!marcadores!de!copia!variable!(CNVs).!El!protocolo!que!se! siguió!requirió!de!un!total!de!4!días!por!paciente,!y!fue!necesario!partir!de!una! muestra! de! ADN! de! alto! peso! molecular! y! gran! pureza,! con! un! cociente! OD260//OD280! de! 1,8d1,9.! Se! tomaron! 250! ng! de! cada! muestra! de! ADN! y! se! digirieron! parcialmente! con! una! enzima! de! restricción! denominada! Nsp! I.! Ésta! cortó!específicamente!en!los!sitios!“PurinadCATGdPirimidina”,!con!lo!que!se!redujo! inicialmente!la!complejidad!del!genoma!y!dejando!un!extremo!de!cadena!simple! colgante!en!cada!extremo.!Una!vez!terminado!el!tiempo!de!digestión,!se!realizó!una! reacción! de! ligación! con! un! adaptador! universal! que! es! compatible! con! los! ! 117! extremos!de!cadena!simple!del!paso!anterior.!Hecho!esto,!se!realizó!una!reacción! de! PCR,! usando! un! oligonucleótido! compatible! con! dicho! adaptador.! Así,! obtuvimos!una!amplificación!de!los!fragmentos!que!se!hibridaron!en!el!microarray.! Previo!a!éste!paso,!los!fragmentos!de!PCR!se!purificaron!y!se!redujeron!de!tamaño! usando!la!enzima!DNAsa!I.!Además,!se!les!incorporó!una!molécula!de!biotina!en!su! extremo.!Así,! se! hibridaron!los! productos! digeridos!y!marcados! durante! toda! la! noche.!Posteriormente,!se!lavaron!de!forma!automática!los!chips!y!se!procedió!al! revelado! de! los! mismos.! Durante! el! escaneado! de! los! microarrays,! el! software! detecta!y!cuantifica!la!intensidad!de!luz!en!cada!punto!del!microchip!e!interpreta!si! para!cada!SNP!que!se!interroga,!el!paciente!es!homocigoto!para!cada!uno!de!los! alelos,!o!heterocigoto.! ! 3.6.!Análisis!estadístico!de!la!respuesta!al!tratamiento.! ! Todos! los! análisis! se! efectuaron! en! el! paquete! estadístico! SPSS.! Se! evaluó!la! asociación! entre! los! marcadores! y! la! respuesta! mediante! modelos! de! regresión! logística!usando!el!comando!“logistic”!de!plink!y!asumiendo!un!modelo!aditivo.!Se! utilizaron! modelos! sin! ajustar! y! también! modelos! ajustados! en! los! que! se! introducen! como! covariables! la! edad! de! aparición! de! los! primeros! síntomas,! el! sexo,!y!el!tipo!de!EM!(Remitente!Recurrente,!Progresiva!Secundaria,!y!de!síntomas! aislados).!! ! Se! decidió! hacer! uso! de! la! información! obtenida! en! un! análisis!univariante!de! asociación!previamente!realizado!en!el!que!se!compararon!286!casos!de!esclerosis! múltiple! con! 767! controles! poblacionales.! Para! ello! se! seleccionaron! como! ! 118! candidatos! para! un! primer! análisis! aquellos! marcadores! que! resultaron! estar! asociados!a!la!enfermedad!con!un!valor!de!p!por!debajo!de!0.001.!En!un!segundo! análisis!se!utilizaron!todos!los!marcadores!(con!independencia!de!que!estén!o!no! asociados!a!la!enfermedad)!con!idéntica!metodología.!! ! Se! realizó!un!“Manhattan!plot”!con!los!resultados!no!ajustados!del!test!de! respuesta!a!interferón!para!todos!los!marcadores!por!cromosomas.!!! ! 3.7.!Etapas.!! ! El!proyecto!se!!dividió!en!3!fases:!! Fase!I:!reclutamiento!de!casos!! Fase!II:!Genotipación!de!casos!empleando!Affymetrix!! Fase!III:!Análisis!de!datos:!estudios!univariantes!(Plink)!! ! 119! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! VII.!Resultados.!! ! 120! 1.!RESULTADOS!OBTENIDOS!EN!EL!ESTUDIO!DEL!EFECTO!DEL!INTERFERÓN!ß! 1! a! IM!SOBRE!MARCADORES!DE!DEGENERACIÓN! AXONAL! Y! DE! OXIDO! RREDUCCIÓN.!! ! 1.1.!Demografía!de!los!sujetos!y!características!clínicas!! ! El!grupo!en!estudio!estaba!formado!por!31!pacientes!(9!varones!y!22!mujeres)!con! el!diagnostico!de!esclerosis!múltiple!clínicamente!definida!remitente!recurrente.! Las!caracteristicas!clínicas!se!pueden!apreciar!en!la!tabla.!! ! El!grupo!de!control!sano!se!componía!de!10!pacientes!(5!hombres!y!5!mujeres)!con! una!edad!media!de!42,5!años!±!24!años!(mediana!42,!rango!14d74).! ! ! 121! 1.2.!Concentración!de!metabolitos.! ! Como! dijimos! anteriormente,! RM! y! ERM!se! obtuvieron! para! cada!paciente! en! intervalos!de!12!meses!durante!dos!años.!!Hubo!una!variación!estadisticamente! significativa!en!la!variación!de!los!valores!de!las!ratios!NAA!/!Cr!en!los!pacientes! con!esclerosis!múltiple.!A!pesar!de!ello!los!valores!medios!fueron!casi!idénticos,!lo! que!indica!una!clara!distribución!Gaussiana.!! ! ! ! La!media!de!la!ratio!NAA!/!Cr!en!10!controles!sanos!fue!de!1,73!con!una!desviación! estándar!de!0,24,!los!valores!variaron!desde!1,47!hasta!2,1.!La!ratio!!Ch!/!Cr!!fue!de! ! 128! ! ! Hay!una!tendencia!entre!la!perdida!de!sulfidrilos!durante!el!primer!año!y!el! índice!de!progresión!de!estos!12!años!(r!=!0.6,!p!=!0.056).!! ! ! 129! ! ! 1.6.2.!Con!colina.!! ! Se! obtuvo! una! correlación! estadísticamente! significativa! entre! el! índice! de! progresión!(!y!entre!cada!EDSS!desde!el!mes!72!hasta!los!144!meses)!y!la!perdida! de!colina!tras!los!dos!años!iniciales!de!tratamiento!(r!=!d!0.77,!p!=!0.013).!! ! ! 130! ! ! Esta!es!inversamente!proporcional,!es!decir,!a!mas!colina!se!gana!en!los!dos!años! menos!índice!de!progresión!tienen!los!pacientes.!Otra!forma!de!ver!esto!es!un!box! Plot!en!la!cual!al!aplicar!la!prueba!de!la!T!student!es!estadísticamente!significativa.!! ! ! 131! ! ! Al!igual!que!ocurría!con!el!NAA,!esta!perdida!de!colina!se!relaciona!de!manera! inversamente!proporcional!con!la!perdida!de!grupos!sulfidrilos!en!los!primeros! 12!meses!tras!la!introducción!del!tratamiento!(r!=!d!0.9,!p!=!0.001),!es!decir,!los! pacientes!que!incrementen!los!niveles!de!colina!(y!por!lo!tanto!progresaran!menos,! según! acabamos! de! ver)! son! los! que! más! disminuya! los! grupos! sulfidrilos! el! tratamiento!!durante!estos!12!meses,!cosa!que!también!se!ve!con!un!Box!Plot.!! ! ! 132! ! ! ! ! ! 133! ! Es!evidente!que!tanto!los!resultados!del!NAA!como!de!la!colina!son!homogéneos!y! es! que! ambos! están! relacionados! estadísticamente! (r! =! 0.9,! p! =! 0.001).! Los! pacientes!que!aumentan!el!NAA!en!los!dos!años!post!tratamiento!también!son!los! que!incrementan!los!niveles!de!colina.!! ! ! ! 134! ! Por!el!contrario!existe!una!relación!inversa!entre!la!perdida!de!colina!en!los!dos! años!de!tratamiento!y!la!perdida!de!inositol!durante!el!segundo!año!(r!=!d!0.7,!p!=! 0.038).!Los!pacientes!que!pierden!mas!colina!son!los!que!mas!inositol!van!a!ganar! en!el!segundo!año.!! ! ! ! 135! ! La!perdida!de!colina!durante!el!primer!año!de!tratamiento!también!se!correlaciona! de!manera!significativa!con!el!índice!de!progresión!(r!=!d!0.67,!p!=!0.017)!y!con!las! EDSS!desde!los!meses!48!al!144.! ! ! !Al!igual!que!sucedió!con!la!perdida!de!colina!en!los!dos!años!de!tratamiento!esta! también!se!relaciona!con!la!perdida!de!NAA!en!los!dos!años!de!tratamiento!(r!=!0.8,! p!=!0.005).!! ! 1.6.3.!Con!Mio!inositol.!! ! ! 136! De!la!perdida!de!inositol!durante!el!segundo!año!ya!hemos!visto!ciertos!aspectos! importantes:!se!relaciona!de!manera!directa!con!el!numero!de!brotes!durante!el! primer!año!de!tratamiento!y!de!manera!inversa!con!la!perdida!de!colina!durante! los!dos!años!de!tratamiento.!! ! Desde!el!punto!de!vista!de!la!progresión!se!relaciona!con!el!índice!de!progresión!(r! =! 0.8,! p! =! 0.016)! en! base! a! relacionarse! con! las! EDSS! en! los! últimos! estadios! observados!(EDSS!84!m,!EDSS!108!m,!EDSS!132!m!y!EDSS!144!m)!aumentando!su! significación!a!medida!que!incrementamos!el!tiempo!de!observación.!! ! ! ! 137! ! Es!decir,!los!pacientes!que!incrementen!los!niveles!de!inositol!durante!el!segundo! año! de! tratamiento! son! los! que! mas! progresarán! y! mayores! niveles! de! discapacidad!alcanzarán.!! ! 1.6.4.!Oxido!reducción.!! ! También!se!obtuvo,!aparte!de!lo!ya!comentado!de!la!perdida!de!grupos!sulfidrilos! en! el! primer! año! de! tratamiento,! una! correlación! estadísticamente! significativa! entre! la! perdida! de! grupos! sulfidrilos! durante! el! primer! trimestre! de! tratamiento!y!diferentes!niveles!de!discapacidad!a!corto!plazo;!EDSS!24!m!(r!=! 0.6,!p!=!0.017),!EDSS!36!m!(r!=!0.6,!p!=!0.032),!EDSS!48!m!(r!=!0.7,!p!=!0.003),!EDSS! 60!m!(r!=!0.7,!p!=!0.005),!EDSS!72!m!(r!=!0.6,!p!=!0.024),!EDSS!84!m!(r!=!0.6,!p!=! 0.014),!EDSS!96!m!(r!=!0.6,!p!=!0.014).!A!partir!de!ahí!la!significación!disminuye! solo! siendo! significativa! a! los! 120! meses! (r! =! 0.6,! p! =! 0.047)! posiblemente! de! ! 144! 3.!RESULTADOS!OBTENIDOS!EN!EL!ESTUDIO!DE!FARMACOGENÓMICA.!! ! 3.1.!Demografía!de!los!sujetos!!y!características!clínicas! ! Se!seleccionaron!a!149!pacientes!con!Esclerosis!Múltiple!Clínicamente!Definida!en! tratamiento!con!Interferón!como!farmaco!de!primera!elección.!Sus!características! demograficas!se!exponen!a!continuación.!! ! ! No!Respondedor! Respondedor! Todos! ! No.! %! No.! %! No.! %! Sexo! ! ! ! ! ! ! !Femenino! 62! 72.9%! 41! 64.1%! 103! 69.1%! !Masculino! 23! 27.1%! 23! 35.9%! 46! 30.9%! Tipo!EM! ! ! ! ! ! ! !!RR! 65! 76.5%! 57! 89.1%! 122! 81.9%! !!SP! 20! 23.5%! 7! 10.9%! 27! 18.1%! Hª!Familiar! ! ! ! ! ! ! !No! 75! 88.2%! 51! 79.7%! 126! 84.6%! !Si! 10! 11.8%! 13! 20.3%! 23! 15.4%! Interferón! ! ! ! ! ! ! !!Avonex! 26! 30.6%! 16! 25%! 42! 28.2%! !!Betaferón! 33! 38.8%! 23! 36%! 56! 37.6%! !!Rebif! 26! 30.6%! 25! 39%! 51! 34.2%! Total! 85! 100.0%! 64! 100.0%! 149! 100.0%! !Características!de!la!muestra!(variables!categóricas)! ! ! N! Media! SD! Min! Max! Edad!debut! ! ! ! ! ! !!respondedores! 85! 27,7! 8,7! 11! 46! !!no!respondedores! 64! 31,6! 9,0! 16! 56! Edad! ! ! ! ! ! !!respondedores! 85! 41,0! 9,4! 25! 64! !!no!respondedores! 64! 42,8! 11,1! 23! 72! Índice!de!Link! ! ! ! ! ! !!respondedores! 63! 1,16! 0,65! 0,39! 3,00! !!no!respondedores! 45! 1,08! 0,72! 0,35! 4,06! !Características!de!la!muestra!(variables!continuas)! ! ! 145! 3.2.!Correlación!entre!los!marcadores!genéticos!y!la!respuesta!terapéutica.!! ! Dentro! de! los! 367! marcadores! seleccionados! tan! solo! 13! ! resultaron! estar! asociados!a!respuesta!terapéutica!utilizando!un!umbral!de!significación!estadística! de! p<0.05! en! el! análisis! crudo.! En! el! análisis! ajustado! solo! nueve! de! estos! marcadores!conservaron!la!significación!estadística,!que!también!alcanzaron!otros! cinco! marcadores! no! asociados! en! el! análisis! crudo.! La! tabla! 1! muestra! los! marcadores!asociados!en!alguno!de!los!dos!análisis.!! ! Si!ampliamos!el!análisis!a!cualquier!marcador!sin!exigir!que!este!asociado!con!EM! el! número! de! marcadores! seleccionables! aumenta! significativamente.! Por! este! motivo! elevamos! el! umbral! de! significación! estadística! hasta! 0.0005! y! aun! así! detectamos!un!total!de!34!marcadores!asociados!en!el!análisis!crudo!y!27!en!el! ajustado!(15!de!ellos!comunes).!La!tabla!2!muestra!estos!resultados.! ! La!figura!1!muestra!en!un!“Manhattan!Plot”!los!resultados!no!ajustados!del!test!de! respuesta!a!IFN!para!todos!los!marcadores!por!cromosomas.! ! ! 146! ! ! ! ! ! 147! ! ! ! ! 148! ! ! ! 149! ! ! ! 150! ! 3.3!Implicación!práctica!de!estos!resultados.!!! ! El! análisis! y! caracterización! de! biomarcadores! permitirá! la! elaboración! de! herramientas! predictoras! más! sofisticadas! y! más! precisas! y! programas! de! prevención!específicos!para!los!individuos!en!riesgo.! ! ! ! ! ! 151! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! VIII.!Discusión.!! ! ! 152! En!un!futuro!nos!enfrentaremos!a!una!serie!de!desafíos!para!conseguir!un!enfoque! personalizado! del! tratamiento! basandose! en! metodos! cuantitativos.! En! primer! lugar! precisaremos! de! un! conocimiento! exacto! de! la! fisiopatología! de! la! enfermedad,!sobre!todo!de!la!progresión,!origen!de!la!discapacidad!permanente!de! esta!enfermedad.!En!segundo!lugar!necesitaremos!definiciones!estandarizadas! y! validadas! de!la!respuesta! a! los! tratamientos,!que!deberan! ser! reconocidas! y! aceptadas!por!la!comunidad!internacional.!En!tercer!lugar,!se!necesitaran!nuevos! estudios! para!aclarar! el!valor! de! los! nuevos! biomarcadores!y!que! puedan! ser! integrados! junto!con! otras! variables!paraclínicos!y! clínicos!en! un! método! cuantitativo!de!predicción.!Finalmente!se!deberá!tener!en!cuenta!la!aplicabilidad!a! la! práctica! clínica,! a! fin! de! generar! sistemas! de! puntuación! que! sean! lo! suficientemente!simple!para!ser!implementado!en!cualquier!entorno!clínico.!A!lo! largo!de!este!trabajo!hemos!intentado!dar!algo!de!luz!en!estos!aspectos.!! ! Disminución!del!N!Acetil!Aspartato!en!pacientes!con!EM.!! ! En! nuestro! estudio! hemos! observado,! que! desde! estadios! muy! precoces,! el! coeficiente!NAA!:!Cr!medido!mediante!espectroscopia!por!resonancia!magnética!en! la!sustancia!blanca!de!apariencia!normal!es!inferior!en!el!grupo!de!pacientes!con! EM!que!en!los!sujetos!sanos.!!Muchos!estudios!han!mostrado!ya!la!disminución!de! los! niveles!de! NAA! en! comparación! con! los! controles!sanos! (AbouldEnein! et!al,! 2010;!Chard!et!al,!2002;!De!Stefano!et!al,!1998,!2001,!2002;!Fu!et!al,!1998;!Leary!et! al,!1999;!Lee! et!al,!2000).!Los!niveles!reducidos!de! NAA!en!la!ERM!ya!han!sido! confirmados! también! por! histopatología! como! secundaria! a!la! pérdida! axonal! (Bitsch!y!cols.,!1999,!Bjartmar!y!cols.,!2001).!La!disminución!de!los!niveles!de!NAA! ! 153! en!la!sustancia!blanca! de!apariencia!normal!ya!están!presentes!en!las! primeras! etapas!de!la!enfermedad!y!progresa!con!el!tiempo!(De!Stefano!et!al,!2001).! ! N!Acetil!Aspartato!como!marcador!de!daño!axonal.!! ! En!nuestro!estudio!hemos!obtenido!una!relación!estadisticamente!significativa,!si! bien!inversa,!entre!el!NAA!:!Cr!en!la!SBAN!y!la!discapacidad!medida!en!la!escala! EDSS.!(r=!d!0,38,!p!<0,03).!Ya!desde!los!primeros!estudios!realizados!con!ERM!en! lesiones! cronicas! (hipointensas! en! T1)! se! observó! una!correlación! inversa! significativa!entre!el!NAA!de!las!lesiones!y!la!discapacidad!(r!=!d0.364,!0.05>!P>! 0,02),!siendo!confirmado!posteriormente!por!otros!grupos!(De!Stefano!et!al.!1998,! Davie!et!al.!1997,…)! ! Curiosamente!los!niveles!de!NAA!encontrados!en!la!sustancia!gris!cortical!en!las! formas! progresivas! de! la! enfermedad! no! se! correlacionó! significativamente! con! EDSS!(Adalsteinsson!!y!cols.,!2003)!y!además!los!niveles!de!metabolitos!en!la!etapa! muy!precoces!de!la!enfermedad!parecen!depender!de!la!actividad!lesional.!Todo! esto!sería!porque!las!alteraciones!de!los!metabolitos!observadas!en!la!SGC!en!las! fases!precoces!de!la!enfermedad!pueden!ser!secundarios!al!proceso!inflamatorio,! en!lugar!de!a!la!disfunción!neuronal!"primaria",!es!decir,!que!el!proceso!patológico! en!la!EM!se!extiende!desde!la!sustancia!Blanca!a!la!SGC,!en!particular!en!la!forma! progresiva!de!la!enfermedad!(Au!Duong!y!cols.,!2007).!! ! También! se! han! encontrado! correlaciones! significativas! entre! la! disminución! de! NAA!en!las!regiones!frontal!y!el!rendimiento!de!la!función!ejecutiva!(Staffen y cols.,