Papel de S-adenosilhomocisteína hidrolasa en sarcoma

Papel de S- adenosilhomocisteína hidrolasa en sarcoma Asunción Espinosa Sánchez Facultad de farmacia Universidad de Sevilla 1 Universidad de Sevilla Facultad de Farmacia Trabajo Fin de Grado Grado en farmacia PAPEL DE S-ADENOSILHOMOCISTEÍNA HIDROLASA EN SARCOMA Asunción Espinosa Sánchez Convocatoria de Julio 2018 Tutor: Juan José Marín Departamento: Medicina Preventiva y Salud Pública Trabajo experimental Realizado en el laboratorio de Biología Molecular del Cáncer dirigido por 2 Resumen Los sarcomas son tumores en partes blandas o huesos procedentes del tejido conectivo. Tiene múltiples subtipos, de ahí la dificultad de su abordaje terapéutico. Este trabajo se centra en la implicación de S-adenosilhomocisteína hidrolasa (SAHH, EC 3.3.1.1, AHCY) en este tipo de tumor. Esta enzima se comporta como un inhibidor competitivo de las reacciones metiltransferasa dependientes de S-adenosil metionina. La metilación del ADN y modificación de las histonas puede provocar el silenciamiento epigenético de los genes supresores de tumores, evento temprano de tumorigénesis. En este estudio analizamos, en primer lugar, los niveles de SAHH en muestras tumorales de sarcoma y observamos que altos niveles de expresión de SAHH conducen a una disminución en la supervivencia. Además, existe una tendencia en la mejora de la supervivencia global cuando los pacientes con elevados niveles de expresión de SAHH son tratados con doxorrubicina como primera línea y, posteriormente, con trabectedina, a diferencia del tratamiento único con doxorrubicina. Asimismo, se comprobó la existencia de una correlación de Pearson positiva entre los niveles de expresión de SAHH y la citotoxicidad a camptotecina en las líneas celulares de sarcoma, donde el aumento en dichos niveles empeoraba la respuesta a este fármaco. Por último, el tratamiento conjunto de topotecán, derivado de camptotecina, y SAHA (Ácido hidroxámico suberoilanilida) provoca el incremento en la susceptibilidad a topotecán, con respecto al tratamiento exclusivo con dicho fármaco. Esto indica que SAHA puede actuar inhibiendo a SAHH dando lugar a la hipometilación del ADN que desencadena en mayor accesibilidad para la acción de topotecán. Palabras clave Sarcoma, SAHH, supervivencia, doxorrubicina y topotecán 3 Índice 1. Introducción ......................................................................................... 4 1.1 Sarcoma ............................................................................................................. 4 1.2 S-adenosilhomocisteína hidrolasa (SAHH)......................................................... 5 2. Objetivo .............................................................................................. 8 3. Materiales y métodos............................................................................. 9 3.1 Cultivo de líneas celulares de sarcoma .............................................................. 9 3.2 Extracción de ARN ............................................................................................ 11 3.3 Retrotranscripción ........................................................................................... 12 3.4 Q-PCR ............................................................................................................... 14 3.5 Ensayo IC50 ...................................................................................................... 15 3.6 Correlación SAHH ARNm – Antineoplásicos .................................................... 16 4. Resultados y discusión .......................................................................... 17 4.1 Niveles de ARNm SAHH.................................................................................... 17 4.2 Sensibilidad a diversos fármacos en líneas celulares de sarcoma ................... 24 4.3 Relación entre SAHH y otros genes ................................................................. 30 5. Conclusiones ...................................................................................... 33 6. Bibliografía ........................................................................................ 34 4 1. Introducción 1.1 Sarcoma Los tumores se pueden clasificar en función de su lugar de origen (mama, pulmón, colorrectal, próstata…) o por el tejido o célula del que proceden. Según este último se pueden distinguir: carcinomas, sarcomas, leucemias, melanomas y tumores del sistema nervioso central. En este caso, nos centraremos en los sarcomas. Los sarcomas son tumores en partes blandas o huesos procedentes del tejido conectivo, por ello, pueden aparecer en cualquier parte del organismo. Este tipo de cáncer tiene múltiples subtipos, de ahí la dificultad de su abordaje terapéutico. El sarcoma de partes blandas se genera a partir de tejido de soporte, como el liposarcoma, mientras que los tumores de hueso se producen a partir de tejido óseo, como el osteosarcoma. Entre los más de 50 tipos de sarcomas, se ha comprobado que están definidos por su patología molecular y no por el órgano de origen como otros tipos de cáncer. La etiología de estos tumores es desconocida ya que la mayoría ocurren por mutaciones espontáneas, aunque hay un pequeño porcentaje que procede de alteraciones hereditarias. Actualmente, la solución más común es la cirugía, sin embargo, los tumores irresecables se tratan con radioterapia. En los pacientes con metástasis se emplea la quimioterapia sistémica mediante doxorrubicina como fármaco de primera línea (Moneo, 2009) o camptotecina. Figura 1. Tipos de sarcoma. Winslow T. (2015) Soft Tissue Sarcoma. [Imagen]. Recuperado de https://www.cancer.gov 5 1.2 S-adenosilhomocisteína hidrolasa (SAHH) S-adenosilhomocisteína hidrolasa (SAHH, EC 3.3.1.1, AHCY) se encuentra principalmente en hígado, páncreas y riñón. Esta enzima se compone de 2 cadenas alfa y 2 beta, unidas por puentes disulfuro. El gen que codifica a SAHH se encuentra situado en el cromosoma 20. La S-adenosil metionina (SAM) es un donante fundamental de grupos metilo en el organismo que mediante una reacción de transmetilación se convierte en S-adenosil homocisteina (SAH). Este último, se transforma en adenosina (Ado) y L-homocisteína (LHcy) gracias a una reacción de hidrólisis reversible catalizada por S-adenosil homocisteína hidrolasa (Travieso et al., 2006) (Figura 2). Esta enzima se comporta como un inhibidor competitivo de las reacciones de metiltransferasa dependientes de S-adenosil metionina (GIBSON et al., 1961). La deficiencia en esta enzima conduce a la aparición de coagulopatía grave, hepatopatía y miopatía. Se ha demostrado en otros estudios que la regulación negativa de S- adenosilhomocisteína hidrolasa, SAHH, da lugar a una acumulación de S-adenosil homocisteína, SAH, que produce la inhibición de las reacciones de transmetilación del ADN. Este acontecimiento provoca la modulación de la senescencia en células primarias (Leal et al., 2008b). La senescencia celular es un mecanismo de transducción de la señal que conlleva a la detención irreversible del ciclo celular. Los telómeros son regiones de ADN no codificantes que se encuentran en los extremos del cromosoma y su función es S-adenosil homocisteína Adenosina + L-Homocisteína S-adenosil metionina SAHH Figura 2. Reacción metiltransferasa dependiente de S-adenosil metionina donde interviene SAHH. 6 estabilizar al ADN de las células. Sin embargo, en cada división celular de células somáticas, los telómeros se acortan progresivamente. Cuando se alcanza la longitud crítica, las células detienen su crecimiento produciéndose la senescencia replicativa (Figura 3). En otros estudios, se midió la expresión de ARNm (ARN mensajero) y los niveles de proteínas de SAHH en tumores humanos de 206 pacientes, y se obtuvieron resultados, tales como, la pérdida del 50% de ARNm de SAHH de los tejidos de diferentes tipos de tumor en comparación con tejidos normales del mismo paciente (Leal et al., 2008a). También, se observó que en las líneas celulares de sarcoma con bajos niveles de SAHH y tratadas con doxorrubicina no fueron capaces de mantener la estimulación de p53, lo que hacía pensar que SAHH interfería en la actividad transcripcional de p53 (Leal et al., 2008a). Por tanto, se demostró que SAHH participa en la vía supresora de tumores p53 y en menor medida de pRb, disminuyendo también su actividad transcripcional (Leal et al., 2008a). La actividad de esta enzima desempeña, por tanto, un papel crítico en la regulación de la concentración intracelular de SAH, ya que provoca la acumulación de ésta provocando la inhibición de la metilación por un mecanismo de retroalimentación negativo (Figura 4). Figura 3. Senescencia celular. Tomada de Narita y Lowe, 2005. 7 La metilación es un mecanismo bioquímico que regula la expresión génica de muchos procesos fisiológicos (Radomski et al., 2002), por tanto, debe estar modulado ya que se han detectado alteraciones en la metilación en lesiones malignos. El silenciamiento epigenético de los genes supresores de tumores a través de la metilación del ADN y la modificación de las histonas podría ser un evento temprano de tumorigénesis (Hinshelwood et al., 2007). La hipótesis en este trabajo es conocer si sufren variaciones los niveles de SAHH en el tejido tumoral respecto al tejido no tumoral del mismo paciente. Debido a esto y a su importante función biológica, es posible que la regulación de la metilación por SAHH tenga repercusión en la eficacia de diversos fármacos. Figura 4. Implicación de SAHH (AHCY) en el ciclo de la metionina. Tomada de Basler et al., 2016. 8 2. Objetivo Este trabajo se centra en estudiar la implicación de S-adenosilhomocisteína hidrolasa (SAHH) en el sarcoma y la sensibilidad de determinados fármacos según el nivel de expresión de este gen.  Medir los niveles de expresión de SAHH en líneas celulares de sarcoma y en muestras tumorales de sarcoma de pacientes pertenecientes al estudio GEIS-20.  Correlacionar los niveles de expresión de SAHH con la supervivencia.  Búsqueda de correlación entre los niveles de expresión de SAHH y el IC50 de diversos fármacos para mejorar la respuesta a éstos. 15 Para analizar los datos obtenidos en el proceso, previamente se comprueba que los triplicados realizados coinciden. Posteriormente, se escogen los datos referidos a Ct, el cálculo del Ct siempre se realiza en la fase exponencial de la curva. Los resultados que se obtienen en la Q-PCR están basados en la detección y cuantificación de los fluorocromos a lo largo de la reacción. Esto permite saber la cantidad de fluorescencia emitida durante la fase exponencial de la reacción, donde el aumento del producto se correlaciona con la cantidad inicial de ARN en estudio (Walker, 2002). Por último, utilizando el programa informático Excel se obtienen los gráficos de barra de cada línea celular dependiendo de los niveles de ARNm de SAHH. 3.5 Ensayo IC50 La placa madre de los fármacos empleados se preparaba realizando diluciones 1:3 a partir de una concentración determinada. En el caso de doxorrubicina, la concentración superior con la que se trató fue de 10µM, mientras que en topotecán fue de 1µM. El ensayo se puede realizar cuando las placas tengan aproximadamente un 80% de confluencia en estadio de crecimiento exponencial. Primero se lavan con PBS y se tratan con una pequeña cantidad de tripsina. Cuando las células se han levantado de la placa, se añade medio de cultivo para bloquear la acción de la tripsina y se traspasa a un reservorio para proceder a la siembra en la placa de 96 pocillos. Se realizaron tres repeticiones de cada línea celular por cuatriplicado para que el resultado fuera significativo. A las 24 horas, se comprueba el crecimiento uniforme de las células en todos los pocillos y se procede al tratamiento con el fármaco, obteniendo una concentración final del fármaco determinada. Después de 4 días, se fija con glutaraldehído durante 30 minutos y se tiñe con cristal violeta (A=595nm) durante mínimo 30 minutos en agitación constante. Posteriormente, se deja secar al aire. Por último, se revela utilizando ácido acético mediante espectrofotometría dando valores de absorbancia que se pueden correlacionar con la concentración de fármaco. Así se puede obtener el IC50 mediante el empleo del programa informático Excel. 16 3.6 Correlación SAHH ARNm – Antineoplásicos Se realizó el IC 50 de doxorrubicina y camptotecina, y se correlacionó con los niveles de ARNm de SAHH. Para ello, se emplearon dos métodos de correlación: Uno de ellos fue la regresión lineal entre los niveles de ARNm de SAHH y el IC 50 del fármaco. Posteriormente, se calculó el coeficiente de correlación de Pearson (r). El nivel de precisión en la predicción depende de R2 o coeficiente de determinación lo cual es el cuadrado de coeficiente de correlación. Existen dos tipos de correlación: 1. Correlación positiva: cuando r está entre 0 y +1. Los valores de X e Y tienden a moverse en la misma dirección. 2. Correlación negativa: cuando r está entre -1 y 0. Cuando uno aumenta el otro tiende a disminuir y viceversa. También se realizó un análisis estadístico tstudent, gracias al programa informático Graphpad prism, para todos los fármacos. Para ello, se debía clasificar en dos grupos, alta y baja expresión de ARNm de SAHH. Esta clasificación se obtuvo realizando la media aritmética de los niveles de ARNm de SAHH. 17 4. Resultados y discusión 4.1 Niveles de ARNm SAHH Para profundizar en el estudio de SAHH, se midieron, en primer lugar, los niveles de expresión de SAHH de líneas celulares de sarcoma de distintos orígenes. Para ello, se empleó la RT-Q-PCR (tabla 5). Se analizó el ARNm ya que es comparable con los resultados de otras bases de datos publicados. Se calculó la media aritmética de 2^ΔCt y se clasificaron las líneas en dos grupos, alta y baja expresión de ARNm de SAHH. Además, en esta tabla se puede observar que el subtipo de sarcoma de cada una de las líneas celulares no se correlaciona con el nivel de expresión de SAHH. En el gráfico 1, se ha realizado una comparativa para poder determinar claramente la diferencia entre los niveles de ARNm de SAHH de las líneas celulares de sarcoma analizadas. Líneas Origen del tumor 2^ΔCT SD AZ Tumor fibroso 0,0507 ± 0,067 Baja expresión de SAHH BG Fibrosarcoma mixoide 0,0461 ± 0,156 AW Liposarcoma 0,0363 ± 0,07 BC MPNST 0,0359 ± 0,086 CE Rabdomiosarcoma 0,0356 ± 0,113 AX Liposarcoma 0,0291 ± 0,08 93T449 Liposarcoma 0,028 ± 0,052 AA Leiomiosarcoma 0,027 ± 0,088 SAOS 2 Osteosarcoma 0,1018 ± 0,042 Alta expresión de SAHH A673 Sarcoma de Ewing 0,0855 ± 0,085 SKUT1 Leiomiosarcoma 0,0792 ± 0,162 SW872 Liposarcoma 0,0759 ± 0,096 CP0024 Leiomiosarcoma 0,0641 ± 0,074 Media 0,0535 Tabla 5. Valores de 2^ΔCt de las líneas celulares de sarcoma, desviación estándar y origen del tumor. Líneas celulares clasificadas en alta y baja expresión de SAHH según la media aritmética. 18 Una vez obtenidos los resultados de los niveles de expresión de SAHH en líneas tumorales, se procedió a estudiar si en sarcomas humanos primarios también se mostraban variaciones importantes en los niveles de expresión. Se realizó un estudio con pacientes incluidos en el ensayo GEIS-20 (Grupo Español De Investigación de Sarcoma). Es un ensayo en fase II aleatorizado, abierto, multicéntrico y prospectivo en pacientes tratados con doxorrubicina o doxorrubicina en primera línea y, posteriormente, trabectedina. Éstos padecían sarcoma de partes blandas avanzados no operables y/o metastásicos, donde el tipo de tumor más frecuente fue leiomiosarcoma (Tabla 6). El número de pacientes empleado en nuestro ensayo fue de 43 pacientes. Además, el hecho de utilizar tumores primarios permitía encontrar una correlación entre los niveles de ARNm de SAHH de los tumores extraídos de tales pacientes y la supervivencia libre de progresión (SLP). Los resultados que se obtuvieron de la Q-PCR fueron los que se reflejan en el gráfico 2. Como se puede observar, no hay grandes diferencias en los niveles de ARNm de SAHH entre los diferentes tumores analizados. Por ello, no se pudo realizar una curva 0 0,02 0,04 0,06 0,08 0,1 0,12 2^-ΔCt Líneas celulares Gráfico 1 . Nivel de SAHH ARNm de las líneas celulares de sarcoma. 19 ROC, que es una representación gráfica de la sensibilidad frente a la especificidad de los valores para poder establecer un punto de inflexión y, así, clasificar los pacientes en altos o bajos niveles de expresión de ARNm de SAHH. Sin embargo, tres pacientes destacaban por contener altos niveles de expresión de SAHH (pacientes nº 33, 53 y 54), de los cuales el paciente 53 se consideró fuera de margen. Se clasificaron los niveles de expresión de SAHH según la media aritmética y la mediana. Posteriormente, se realizó el análisis empleando la metodología Kaplan meier entre la categorización de los niveles de SAHH y la supervivencia libre de progresión (SLP), para así estimar la probabilidad de supervivencia en un determinado periodo de tiempo. Como se observa en la figura 6, cuando los niveles de SAHH son altos, considerado con el número 1 en color verde, disminuye la supervivencia. Sin embargo, cuando los niveles del gen SAHH son bajos, considerado con el número 0 en color azul, la supervivencia se ve incrementada. No son resultados significativos, pero se puede observar cierta tendencia. Esto puede suceder debido a que los niveles de SAHH similares y al bajo número de casos. 0 0,02 0,04 0,06 0,08 0,1 0,12 17181920212223242526272829303132333435373840414243444546474849505153545556575860616264 2^-ΔCt Pacientes Gráfico 2. Niveles de expresión del gen SAHH de los pacientes incluidos en el GEIS-20 (Fragmento). 20 Pacientes (n=69) Género Hombre 53.6 (37) Mujer 46.4 (32) Edad (años) 51 [20-72] Histología Liposarcoma 18.8 (13) Sarcoma pleomórfico indiferenciado 17.4 (12) Haemangiopericitoma 4.3 (3) Leiomiosarcoma 31.9 (22) Sarcoma Sinovial 4.3 (3) Sarcoma Neurogénico 4.3 (3) Fibrosarcoma 7.2 (5) Sarcoma no clasificado 5.8 (4) Sarcoma Fibromixoide 1.5 (1) Angiosarcoma 1.5 (1) Condrosarcoma 1.5 (1) Otros 1.5 (1) Estadio Localmente avanzado 23.2 (16) Metastásico 76.8 (53) Tratamiento Doxorrubicina 75 mg/m2 3w x 6 ciclos 50.7 (35) Trabectedina 1.1 mg/m2 + Doxorrubicina/ 3w 60 mg/m2 3w x 6 ciclos Tabla 6. Características clínicas de los pacientes incluidos en GEIS-20. 21 Para comprobar estos datos se realizaron estudios en 2 bases de datos distintas: TCGA (n=245) y GSE21050 (n=310). Ambas bases de datos tenían distintos subtipos de sarcomas y un número de pacientes más elevado, pero la separación por subtipos daba, en general, muy bajo número de pacientes para ser significativo. En ambas bases de datos se analizó la supervivencia general de acuerdo a los distintos niveles de la expresión de SAHH. El análisis de los niveles de expresión de SAHH en la base de datos del TCGA, mostraba que los pacientes con mayores niveles del gen SAHH, tenían un riesgo más alto que los pacientes con expresión más baja (Figura 7A). La supervivencia de los pacientes con altos niveles de SAHH se veía disminuida y el número de pacientes con altos niveles de SAHH era reducido (Figura 7B). Esto está de acuerdo con lo obtenido en el estudio del GEIS-20. Figura 6. Relación entre la supervivencia acumulada y supervivencia libre de progresión (SLP) clasificando a los pacientes en alta (verde) y baja (azul) expresión del gen SAHH. 3A: Categorización de los niveles atendiendo a la media. 3B: Categorización de los niveles atendiendo a la mediana. 22 Similares datos se obtuvieron al analizar la segunda cohorte (GSE21050). Los pacientes con altos niveles de expresión de SAHH mostraban un significativo peor pronóstico, mayor riesgo (Figura 7C). Cuando se analizó la supervivencia general se producía lo mismo que en el caso anterior, los pacientes con altos niveles de SAHH eran un número más reducido y la supervivencia de éstos era menor (Figura 7D). Figura 7. Análisis de la supervivencia general según nivel de expresión de SAHH. 7A: Correlación entre los niveles de expresión de SAHH y el pronóstico de la enfermedad (TCGA). 7B: Supervivencia de los pacientes divididos según el nivel de expresión de SAHH (TCGA). 7C: Correlación entre los niveles de expresión de SAHH y el pronóstico de la enfermedad (GSE21050). 7D: Supervivencia de los pacientes divididos según el nivel de expresión de SAHH (GSE21050). 23 Como los resultados anteriores revelaban que había una relación entre los niveles del gen SAHH y la supervivencia global de los pacientes con sarcoma, se propuso un análisis estadístico t-student entre los niveles de ARNm de SAHH y la supervivencia global de los pacientes teniendo en cuenta el tratamiento que habían recibido éstos. En los pacientes tratados solo con doxorrubicina en la cohorte del grupo GEIS 20, no se obtuvo una correlación de Pearson significativa (Figura 8A). Sin embargo, en la figura 8B se puede observar una tendencia positiva en los pacientes tratados con doxorrubicina y trabectedina. Esto quiere decir que los pacientes con niveles elevados de SAHH tenían una mayor supervivencia global cuando eran tratados con trabectedina. Dicho resultado se puede explicar teniendo en cuenta el mecanismo de acción que viene reflejado en la ficha técnica de este fármaco ya que provoca la alteración de la transcripción y reparación del ADN. Por lo tanto, actúa retardando la fase S (síntesis de ADN) y deteniendo el ciclo celular en G2/M, induciendo apoptosis. Estos datos sugieren que los tumores con altos niveles de SAHH indican un peor pronóstico de supervivencia en pacientes de sarcoma, sobre todo si han sido tratados con doxorrubicina como único tratamiento. Por lo tanto, la siguiente etapa consistió en buscar una manera de sensibilizar estos tumores para que fueran susceptibles a doxorrubicina. Figura 8. Correlación entre la supervivencia global y la expresión de SAHH de los pacientes según el tratamiento. 8A: Pacientes tratados exclusivamente con doxorrubicina. 8B: Pacientes tratados con doxorrubicina y trabectedina. 24 4.2 Sensibilidad a diversos fármacos en líneas celulares de sarcoma Se realizó el ensayo IC50 con doxorrubicina para las 13 líneas celulares de sarcoma. Para ello, se hicieron al menos dos experimentos distintos realizados en triplicados independientes. Posteriormente, se calculó la media aritmética de ambos experimentos y la desviación estándar. Un ejemplo de una curva dosis respuesta puede observarse en la figura 9. El IC50 de doxorrubicina de las líneas celulares de sarcoma van desde 25 nM hasta 411 nM (tabla 7). Esto concuerda con el IC50 de este fármaco obtenido en otros artículos como Perez, 2017. El IC50 de camptotecina tiene valores desde 13,54 nM hasta 100 nM. Posteriormente, se realizó un análisis estadístico t-student empleando la división de las líneas celulares de sarcoma por alta y baja expresión de SAHH y el IC50 de doxorrubicina y camptotecina respectivamente (Tabla 8). Figura 9 . Curva dosis – respuesta de la línea 93T449 31 Otro de los genes relacionado con SAHH es NME1 que regula la apoptosis y el ciclo celular. Este gen también denominado NM23 es el nucleósido difosfato quinasa 1. Se piensa que es un gen supresor de metástasis ya que se ha comprobado la reducción de los niveles de ARNm de NME1 en células metastásicas. El papel principal de NME1 es la síntesis de nucleósidos trifosfatos distintos de ATP (Carotenuto et al., 2013). Como se puede observar en la figura 12B, existe una correlación positiva entre los niveles de NME1 y SAHH en pacientes con sarcoma donde la metástasis está confirmada. Es decir, SAHH podría actuar como gen supresor de metástasis en algún subtipo de sarcoma, pero no se ha podido comprobar en este trabajo. 32 Figura 12. Relación de SAHH con otros genes en pacientes con sarcoma y metástasis confirmada (Base de datos TCGA). 12A: Correlación entre los niveles de expresión de SAHH y TRIM 28. 12B: Correlación entre los niveles de expresión de SAHH y NME1. 33 5. Conclusiones  Altos niveles de expresión de SAHH conducen a una disminución en la supervivencia en pacientes con sarcoma.  Hay una tendencia en la mejora de la supervivencia global cuando los pacientes con elevados niveles de expresión de SAHH son tratados con doxorrubicina como primera línea y, posteriormente, con trabectedina, a diferencia del tratamiento único con doxorrubicina.  Se ha observado la existencia de una correlación de Pearson positiva entre los niveles de expresión de SAHH y la resistencia a camptotecina. Cuando aumentan dichos niveles, empeora la respuesta a este fármaco.  Por último, el tratamiento conjunto de topotecán, derivado de camptotecina, y SAHA, inhibidor de la metilación, provoca el incremento en la sensibilidad a topotecán. 34 6. Bibliografía Basler G, Nikoloski Z, Larhlimi A, Barabási AL, Liu YY. Control of fluxes in metabolic networks. Genome Res 2016;26:956–68. doi:10.1101/gr.202648.115. Carotenuto M, Pedone E, Diana D, De Antonellis P, Džeroski S, Marino N, et al. Neuroblastoma tumorigenesis is regulated through the Nm23-H1/h-Prune C-terminal interaction. Sci Rep 2013;3:1–11. doi:10.1038/srep01351. Czerwińska P, Mazurek S, Wiznerowicz M. The complexity of TRIM28 contribution to cancer. J Biomed Sci 2017;24:1–14. doi:10.1186/s12929-017-0374-4. Elmore LW, Rehder CW, Di X, McChesney PA, Jackson-Cook CK, Gewirtz DA, et al. Adriamycin-induced senescence in breast tumor cells involves functional p53 and telomere dysfunction. J Biol Chem 2002;277:35509–15. doi:10.1074/jbc.M205477200. GIBSON KD, WILSON JD, UDENFRIEND S. The enzymatic conversion of phospholipid ethanolamine to phospholipid choline in rat liver. J Biol Chem 1961;236:673–9. Travieso Y, Mustelier P, Martínez Z, Posada A. Aspectos relevantes de la S- adenosilhomocisteína hidrolasa relacionados con el metabolismo de la S- adenosilhomocisteína. Rev Cuba Investig Biomed 2006;25(2). Hinshelwood RA, Huschtscha LI, Melki J, Stirzaker C, Abdipranoto A, Vissel B, et al. Concordant Epigenetic Silencing of Transforming Growth Factor- Signaling Pathway Genes Occurs Early in Breast Carcinogenesis. Cancer Res 2007;67:11517–27. doi:10.1158/0008-5472.CAN-07-1284. HYCAMTIN®. Ficha Técnica del medicamento. Agencia Española del Medicamento y Productos Sanitarios (AEMPS). https://www.aemps.gob.es/cima/ Kirschbaum M, Frankel P, Popplewell L, Zain J, Delioukina M, Pullarkat V, et al. Phase II study of vorinostat for treatment of relapsed or refractory indolent non-hodgkin’s lymphoma and mantle cell lymphoma. J Clin Oncol 2011;29:1198–203. doi:10.1200/JCO.2010.32.1398. 35 Leal JF, Ferrer I, Blanco-Aparicio C, Hernández-Losa J, Ramón y Cajal S, Carnero A, et al. S-adenosylhomocysteine hydrolase downregulation contributes to tumorigenesis. Carcinogenesis 2008;29:2089–95. doi:10.1093/carcin/bgn198. Leal JFM, Fominaya J, Cascón A, Guijarro M V., Blanco-Aparicio C, Lleonart M, et al. Cellular senescence bypass screen identifies new putative tumor suppressor genes. Oncogene 2008;27:1961–70. doi:10.1038/sj.onc.1210846. Moneo MV. Generación de herramientas celulares para validación preclínica de compuestos anti –tumorales. [Tesis doctoral]. Madrid: Facultad de Ciencias, Universidad Autónoma de Madrid; 2009. Narita M, Lowe SW. Senescence comes of age. Nat Med 2005; 11:920. Perez M. Xenoinjertos de tumores derivados de pacientes como modelos para la búsqueda de biomarcadores de sensibilidad a fármacos. [Tesis doctoral]. Sevilla: Instituto de Biomedicina de Sevilla, Universidad de Sevilla; 2017. Radomski N, Barreto G, Kaufmann C, Yokoska J, Mizumoto K, Dreyer C. Interaction of S- adenosylhomocysteine hydrolase of Xenopus laevis with mRNA(guanine- 7)methyltransferase: Implication on its nuclear compartmentalisation and on cap methylation of hnRNA. Biochim Biophys Acta - Mol Cell Res 2002;1590:93–102. doi:10.1016/S0167-4889(02)00205-7. Sharma A, Vatapalli R, Abdelfatah E, McMahon KW, Kerner Z, Guzzetta AA, et al. Hypomethylating agents synergize with irinotecan to improve response to chemotherapy in colorectal cancer cells. PLoS One 2017;12:1–15. doi:10.1371/journal.pone.0176139. ZOLINZA®. Ficha técnica del medicamento. Food and Drug Administration (FDA) (EMA). https://www.fda.gov/ Walker NJ. A Technique Whose Time Has Come. Science (80- ) 2002;296:557 LP-559. Yondelis®. Ficha técnica del medicamento. Agencia Europea de Medicamentos (EMA). http://www.ema.europa.eu