Estudio de la mGluR-LTD y la morfología sináptica en el hipocampo del ratón Ts1Cje y análisis del proteoma sináptico. Efecto del tratamiento con rapamicina

DEPARTAMENTO DE FISIOLOGÍA MÉDICA Y BIOFÍSICA ESTUDIO DE LA mGluR-LTD Y LA MORFOLOGÍA SINÁPTICA EN EL HIPOCAMPO DEL RATÓN Ts1Cje Y ANÁLISIS DEL PROTEOMA SINÁPTICO. EFECTO DEL TRATAMIENTO CON RAPAMICINA. TESIS DOCTORAL JESÚS DAVID URBANO GÁMEZ SEVILLA, 2021 AGRADECIMIENTOS. Este trabajo ha implicado mucho tiempo y esfuerzo, ha sido un camino bastante largo y complicado. Aunque seré breve, para mí era imprescindible dejar en este texto un reflejo de mi gratitud a las personas que de una manera u otra han sido importantes en esta etapa y han contribuido a la consecución de esta Tesis Doctoral. Antes de todo, considero fundamental agradecer a Mariluz el haberme acogido en su laboratorio siendo aún estudiante de grado. Estoy enormemente agradecido por su paciencia, su apoyo y su implicación a lo largo de estos años. Siempre estaré en deuda por confiar en mí y ayudarme a avanzar en este mundo tan particular que es la ciencia, concretamente la ciencia en España. Con este trabajo finaliza una etapa que ha sido una auténtica montaña rusa, en la que he aprendido mucho en muchos aspectos. Por todo, muchas gracias Mariluz. Agradezco a mi padre, a mi madre y a mi hermano su apoyo incondicional, su cariño, su esfuerzo y su ayuda durante estos años. Ellos me han proporcionado la estabilidad y el sosiego en los momentos más críticos de esta etapa. Ya son 10 años los que llevo alejado de casa y no tenerlos en mi día a día es lo que más añoro estando en Sevilla. Ellos son mi referencia en todos sus significados y lo que más quiero, lo saben, pero es justo dejarlo por escrito. Aprovecho este párrafo también para dejar mi agradecimiento a mi familia: mis tíos/as, mis primos/as y mis abuelos/as, que me apoyaron en mis decisiones y siempre han sido un apoyo fundamental. Si bien no es el contexto en el que generalmente se aplica, la frase “Si he logrado ver más lejos es porque he subido a hombros de gigantes” siempre viene a mi mente al pensar en mi familia, ya que a ellos debo ser la persona que soy hoy. También quería dejar patente mi agradecimiento a las personas del departamento de Fisiología médica y biofísica que me han ayudado durante estos años, muy particularmente a quienes han sido mis compañeros de laboratorio, Juanjo, Itziar y Macarena, a los que me une ahora una gran amistad. A Juanjo, muchas gracias por tus sabias palabras, por tu apoyo y tu ayuda, has sido un compañero excelente, eres un amigo enorme. A Itziar, la mejor consejera y una gran amiga, se quedan en mi memoria nuestras charlas en el animalario y tus palabras de alivio, has sido la voz amiga que siempre sabe qué decir. Y a Macarena, la mejor compañera de laboratorio y amiga, no hay día que no la eche de menos en Sevilla. A ella le agradezco mucho, le debo más y mejor no digo nada, que después me lo reprocha. Gracias a mis amigos, a los de toda la vida, a Rocío, Fran y Fofo, ellos son la mejor descripción de lo que es la amistad, os agradezco todo el cariño y el apoyo que me dais, los grandes momentos que hemos compartido y las risas. Es un auténtico privilegio contar con vosotros y ojalá pudiésemos compartir más momentos del día a día. Por supuesto, quiero agradecer también a los miembros de mi Bar preferido, ellos son el mayor tesoro que me dio la carrera. A Juan Antonio, Álvaro, Marina, Manolo, Pepi, Ismael, Susana, Carmen y Andrea. Todos ellos son ya imprescindibles y me han dado muchos de los mejores momentos de estos años. Aunque las circunstancias nos han tenido alejados, el tiempo no hace mella en nuestra amistad. Gracias por las risas, por estar presentes siempre y por esta gran amistad que nos une. Aquí añado a mi querida Carmen Gordillo, a quien agradezco su cariño y bondad durante estos años. No me olvido tampoco de Estefanía, Laura, Melania y Rodri, compañeros de máster y amigos que siguen presentes. En especial, agradezco mucho a Estefanía la maravillosa amistad que hemos compartido estos años. En lo profesional, quiero agradecer a José Luis Nieto, Maksym Kopanitsa y Frank Hoffman su ayuda en mi toma de contacto con el mundo de la electrofisiología. No ha sido un camino fácil y estoy muy agradecido por su ayuda en un aspecto que considero fundamental, saber qué hay que saber. Quiero aprovechar estas líneas también para agradecer al Grupo de Microsistemas de la ETSI la oportunidad de trabajar con ellos. Ha supuesto un estímulo, por el que estoy enormemente agradecido, en un momento complicado de mi vida. Como punto anecdótico, pero no por ello menos sincero, agradezco a Javier Coronas, Javier Cansado y Pepe Colubi por su compañía en los largos días de laboratorio en los que la risa fue la mejor compañía. Con esto termino, se me habrán olvidado nombres y, sin duda, faltan palabras, pero creo que lo importante queda dicho. ÍNDICE Lista de abreviaturas y términos Pág. 1 Lista de figuras Pág. 6 Lista de tablas Pág. 7 1. Introducción. Pág. 8 1.1. El síndrome de Down. Pág. 9 1.2. El hipocampo. Pág. 13 1.2.1. Estructura del hipocampo. Pág. 15 1.2.1.1. Giro Dentado. Pág. 15 1.2.1.2. Cornu ammonis. Pág. 16 1.2.2. Plasticidad en el hipocampo. Pág. 16 1.2.2.1. Formas de plasticidad en el hipocampo. Pág. 17 1.3. Ratones modelo de SD. Pág. 20 1.3.1. Alteraciones de la plasticidad en los ratones Ts1Cje y Ts65Dn. Pág. 21 1.3.2. Alteraciones de la morfología sináptica en los ratones Ts1Cje y Ts65Dn. Pág. 23 1.4. LTD dependiente de receptores metabotrópicos de glutamato (mGluRLTD). Pág. 23 1.4.1. Papel fisiológico de la mGluR-LTD. Pág. 23 1.4.2. Mecanismos de la mGluR-LTD. Pág. 26 1.4.3. Participación de la síntesis de proteínas en la mGluR-LTD. Pág. 29 1.4.3.1. Ruta de señalización mTOR en la mGluR-LTD. Pág. 31 2. Hipótesis y objetivos. Pág. 34 3. Materiales y métodos. Pág. 38 3.1. Animales. Pág. 39 3.2. Fármacos y tratamientos. Pág. 40 3.3. Aislamiento de sinaptoneurosomas (SNs) de hipocampo. Pág. 40 3.4. Análisis proteómico mediante iTRAQ (Isobaric tags for relative and absolute quantitation). Pág. 42 3.5. Análisis de los datos proteómicos mediante PANTHER (Protein ANalysis THrough Evolutionary Relationships) e IPA (Ingenuity Pathway Analysis). Pág. 43 3.6. Preparación de extractos de proteína, electroforesis y Western blot. Pág. 44 3.7. Electrofisiología en rodajas agudas de hipocampo. Pág. 46 3.8. Tinción de Golgi. Pág. 48 4. Resultados. Pág. 52 4.1. Análisis proteómico de SNs de hipocampo de ratones control y Ts1Cje adultos, tratados y no con rapamicina. Pág. 53 4.2. Análisis de la mGluR-LTD Gp I en el ratón Ts1Cje. Pág. 68 4.3. Análisis de la densidad y morfología de espinas dendríticas en el hipocampo del ratón Ts1Cje y efecto de la rapamicina. Pág. 74 4.4. Análisis de la mGluR-LTD Gp I en el ratón Ts1Cje tratado prenatalmente con rapamicina. Pág. 78 4.5. Evaluación de los niveles de mTORC2 en el hipocampo de ratones Ts1Cje. Pág. 80 5. Discusión. Pág. 82 5.1. Alteraciones del proteoma sináptico en el hipocampo del ratón Ts1Cje adulto. Efecto de la rapamicina. Pág. 83 5.2. Alteraciones de la mGluR-LTD en el hipocampo del ratón Ts1Cje. Pág. 87 5.3. Alteraciones de la morfología de las espinas dendríticas en el hipocampo del ratón Ts1Cje. Pág. 90 5.4. Efecto del tratamiento prenatal con rapamicina. Pág. 93 6. Conclusiones. Pág. 98 7. Bibliografía. Pág. 102 ANEXO I. Puesta a punto y optimización del sistema de electrofisiología MEA. Pág. 126 I.I Puesta a punto y optimización del sistema MEA para su aplicación en rodajas agudas de hipocampo. Pág. 126 I.II Dispositivos MEA (matriz de microelectrodos). Pág. 126 I.III MEA plano vs. MEA 3D. Pág. 127 ANEXO II. Material suplementario. Pág. 130 ANEXO III. Publicación “Prenatal treatment with rapamycin restores enhanced hippocampal mGluR-LTD and mushroom spine size in a Down’s syndrome mouse model”. Pág. 131 ANEXO IV. Contribución en publicación “CPEB1 is overexpressed in neurons derived from Down syndrome IPSCs and in the hippocampus of the mouse model Ts1Cje”. Pág. 132 7 Lista de tablas. Tabla 1 Transmisión basal y plasticidad sináptica en el hipocampo en los ratones modelos de SD Ts65Dn y Ts1Cje. Pág. 25 Tabla 2 Características morfológicas de las sinapsis en el hipocampo de los ratones Ts65Dn y Ts1Cje. Pág. 26 Tabla 3 Mecanismos implicados en la mGluR-LTD. Pág. 28 Tabla 4 Proteínas afectadas en SNs de hipocampo de ratones Ts1Cje, comparando con SNs WT. Pág. 56 Tabla 5 Proteínas afectadas en SNs de hipocampo de ratones Ts1Cje tratados con rapamicina (Ts1Cje RAPA), comparando con SNs WT sin tratar. Pág. 59 Tabla 6 Proteínas afectadas en SNs de hipocampo de ratones WT tratados con rapamicina (WT RAPA), comparando con SNs WT sin tratar. Pág. 61 Tabla 7 Proteínas implicadas en rutas mitocondriales afectadas en SNs de hipocampo de ratones Ts1Cje. Pág. 69 Tabla 8 Proteínas implicadas en rutas de plasticidad sináptica afectadas en SNs de hipocampo de ratones Ts1Cje. Pág. 72 Tabla 9 Comparación de los porcentajes de filopodios, espinas stubby y mushroom en las dendritas secundarias de neuronas de la región apical del stratum radiatum en ratones WT y Ts1Cje sin tratar y tratados prenatalmente con rapamicina (RAPA). Pág. 76 1. INTRODUCCIÓN 9 1. Introducción. 1.1. El síndrome de Down. El síndrome de Down (SD) es la discapacidad intelectual de origen genético más frecuente. Se estima que, a nivel mundial, afecta a 1 de cada 1000 nacimientos (https://www.who.int/genomics/public/geneticdiseases/en/index1.html) aunque la incidencia puede considerarse mayor debido a que, en algunos casos, constituye causa de aborto espontáneo y además presenta una alta incidencia de aborto terapeútico en casos de diagnóstico prenatal (Mansfield et al., 1999; Antonarakis et al., 2004; Natoli et al., 2012). Este síndrome fue descrito a nivel clínico en 1866 por John Langdon Haydon Down (Down, 1866) que caracterizó rasgos fenotípicos comunes a un amplio grupo de individuos que manifestaban discapacidad intelectual congénita. En 1959, Jérôme Lejeune, Martha Gautier y Raymond Turpin determinaron el origen genético del SD al identificar en el cariotipo de estos individuos la presencia de 47 cromosomas, debido a la trisomía del cromosoma 21 (Lejeune et al., 1959). El cromosoma 21 humano (HSA21) tiene un tamaño aproximado de 46 millones de pares de bases, donde se estima la presencia de 236 genes codificantes, 424 genes no codificantes y 188 pseudogenes (Fig. 1) (https://www.ensembl.org/index.html). En su trabajo de 2003, Mao y colaboradores, identificaron niveles incrementados de expresión genética para genes del cromosoma 21 en muestras cerebrales fetales de individuos con trisomía del HSA21 (Mao et al., 2003). De forma interesante, este cromosoma presenta la particularidad de estar enriquecido en genes que codifican proteínas implicadas en la comunicación célula-célula, en la regulación génica, en la biosíntesis de proteínas y en proteínas del citoesqueleto (Fig. 2) (Kahlem, 2006; Antonarakis, 2017). Además, se han identificado diversos genes como RCAN1, APP, DSCAM, DYRK1A o BACE2 (Hattori et al., 2000; https://www.ensembl.org/index.html) que están asociados a procesos implicados en el neurodesarrollo y la función neuronal, por lo que su trisomía podría estar vinculada con los defectos cognitivos asociados al SD (Hattori et al., 2000; Kahlem, 2006; Asim et al., 2015). 10 Figura 1. Distribución de los genes y pseudogenes en el HSA21. Se muestra la distribución de genes que codifican proteínas (en rojo), así como de genes no codificantes (en azul) y pseudogenes (en gris). Tomado de https://www.ensembl.org/. Aunque la principal causa del SD es la trisomía total del HSA21, existen casos de trisomía parcial que manifiestan en mayor o menor grado las características del SD (Korbel et al., 2009; Karmiloff-Smith et al., 2016). Algunas formas de trisomía parcial son la translocación robertsoniana del brazo largo del HSA21 (produciéndose, en general, la fusión con otro cromosoma acrocéntrico, como el cromosoma 14), o la formación del denominado isocromosoma (Atkins y Bartsocas, 1974; Antonarakis et al., 1990; Petersen et al., 1991; Kolgeci et al., 2012; Kollurage y Kudagammana, 2018). El isocromosoma consiste en una alteración que ocurre durante la disyunción meiótica en la línea germinal, e implica que el cromosoma 21 se divida de manera asimétrica, generando un cromosoma que contiene los dos brazos largos del HSA21. También existen casos de duplicaciones de fragmentos pequeños del HSA21. Todas estas alteraciones en la carga cromosómica pueden darse también durante el proceso de división mitótica, originando mosaicismo (Atkins y Bartsocas, 1974; Bandyopadhyay et al., 2003). 11 Figura 2. Clasificación de los genes del HSA21 en base a su función. Se muestra, en valores porcentuales, la contribución de los genes presentes en el cromosoma 21 en diferentes funciones celulares. Tomado de Kahlem, 2006. El SD constituye factor de riesgo para diversas patologías severas y alteraciones congénitas como la enfermedad de Hirschsprung, la estenosis duodenal, la enfermedad de Alzheimer y diversas formas leucemia, de defectos cardíacos congénitos y de trastornos hematológicos (Fig. 3) (Laursen, 1976; Freeman et al., 1998; Antonarakis et al., 2004; Henry et al., 2007; Khan et al., 2011; Friedmacher y Puri, 2013; Benhaourech et al., 2016; Bergström et al., 2016). Además, los individuos con SD presentan una alta incidencia de otras manifestaciones clínicas como son: problemas auditivos, defectos en la visión, apnea y otros problemas respiratorios, alteraciones tiroideas e hipodontia (Merrick y Kaslowe, 2001; Schieve et al., 2009; Bull et al., 2011). La población con SD desarrolla leucemia con una frecuencia de 10 a 20 veces mayor que las personas sin este síndrome, siendo para los casos de leucemia megacariocítica (LM) hasta 300 veces más frecuente. Además, las personas con SD representan en torno al 10% de los casos de leucemia mieloide aguda (LMA) y el 2% de los casos de leucemia linfoblástica aguda en la infancia (LLAI) (Hasle et al., 2000; Khan et al., 2011). Existe además una alta 12 incidencia en la manifestación de defectos cardíacos. Alrededor del 50% de las personas nacidas con SD presentan cardiopatía congénita (la incidencia es variable dependiendo de la población de estudio). Las afecciones más frecuentes son el defecto en el relieve endocárdico, que aparece en un 40% de los casos, y consiste en una formación anómala de las paredes y válvulas que separan los ventrículos y las aurículas del corazón, así como la comunicación interventricular (observada en un 35% de los casos), en los que existe un orificio en el tabique interventricular que produce el tránsito entre ambos ventrículos (Freeman et al., 1998; Benhaourech et al., 2016; Bergström et al., 2016). Figura 3. Patologías asociadas al SD. Se muestra un resumen de las principales patologías que son frecuentes en el SD (Asim et al., 2015; Antonarakis et al., 2004). Por otra parte, entre las características fenotípicas asociadas a las personas con SD, destaca el déficit cognitivo, con defectos en aprendizaje y memoria, siendo una de las manifestaciones comunes en las personas con este síndrome (Carlesimo et al., 1997; Chapman y Hesketh, 2000; Antonarakis et al., 2004; Nelson et al., 2005). Además, estas personas presentan una alta incidencia de neuropatología de tipo Alzheimer tras superar los 30 años de edad (Wisniewski et al., 1985a; 1985b; Mann, 1988; Janicki y Dalton, 2000; Devenny et al., 2000; Krinsky-McHale et al., 2002; National Down Syndrome Society https://www.ndss.org/), y constituye el grupo de población más amplio que desarrolla demencia de tipo Alzheimer de inicio temprano (EOAD). Se estima que más del 70% de las personas con este síndrome padecerán demencia al superar la edad de 60 13 años (Lai y Williams 1989; Hartley et al., 2015; Ballard et al., 2016; McCarron et al., 2017). Las personas con SD presentan un volumen cerebral reducido en las regiones frontal y temporal del cerebro, en el hipocampo y en el cerebelo (Kesslak et al 1994; Raz et al., 1995; Pinter et al., 2001a; 2001b; Mullins et al., 2013). A nivel celular, durante las primeras etapas de la gestación, no se aprecian diferencias en la densidad celular en el cerebro; no obstante, a partir de la semana 23 de gestación se han descrito una reducción en el grosor de la corteza y alteraciones de la estructura y la densidad neuronal (Golden y Hyman, 1994). Durante la gestación, así como en las primeras etapas postnatales (hasta los 2 meses y medio), las neuronas piramidales corticales de las personas con SD presentan una ramificación y longitud dendríticas similares a los individuos sin este síndrome, y una morfología y densidad de espinas semejantes (Takashima et al., 1981). No obstante, durante la infancia comienzan a observarse alteraciones a nivel de la morfología dendrítica, consistentes en una densidad de espinas reducida, así como la existencia de espinas de un tamaño aumentado (Marín-Padilla, 1976; Takashima et al., 1981). Ya en la etapa adulta, se ha descrito una profunda reducción de la arborización dendrítica en las neuronas piramidales. De forma adicional a estas alteraciones dendríticas, se ha observado también una reducción en el número de espinas de las regiones medial y distal de las dendritas apicales de neuronas piramidales del hipocampo y la corteza. Esta reducción es más acentuada en aquellos casos de personas con SD que además manifiestan demencia de tipo Alzheimer (Ferrer y Gullota, 1990; BenavidesPiccione et al., 2004). Dado que el hipocampo constituye una estructura fundamental en el procesado de la memoria declarativa y el aprendizaje (Eichenbaum, 2004), el estudio de la función sináptica del hipocampo es de particular interés en el contexto del SD (Pennington et al., 2003). 1.2. El hipocampo. El hipocampo es una estructura cerebral localizada en la zona medial del lóbulo temporal en el humano, y que se ha vinculado a los procesos de aprendizaje y memoria (Scoville y Milner, 1957; Squire, 1992; Martin et al., 2000; Burgess et al., 2002; Eichenbaum, 2004; Hartley et al., 2007). La formación hipocampal se compone de giro dentado, cornu ammonis (CA), subiculum, presubiculum, parasubiculum y corteza entorrinal (Fig. 4). En la sección transversal a su eje se pueden apreciar las diferentes estructuras que forman parte del hipocampo y la clásica vía de señalización del 14 hipocampo conocida como “circuito trisináptico”. Si bien es la vía más estudiada, no es la única ruta de comunicación en esta estructura límbica (van Strien et al., 2009). Figura 4. Localización del hipocampo en el cerebro de roedores y humanos, y estructura observada en la sección transversal a su eje (en hipocampo de rata). Los números romanos indican las capas corticales. DG, giro dentado; or, stratum oriens; pyr, stratum pyramidale; luc, stratum lucidum; rad, stratum radiatum; slm, stratum lacunosum-moleculare; exp, hoja expuesta del giro dentado; encl, hoja adyacente del giro dentado; gl, granule cell layer; ml, molecular layer; Sub, subiculum; PrS, presubiculum; PaS, parasubiculum; MEA, corteza entorrinal medial; LEA, corteza entorrinal lateral; A35 y A36, áreas de Brodmann 35 y 36. Modificado de van Strien et al., 2009. El circuito trisináptico (Fig. 5) se define a partir de las eferencias corticales que provienen de la corteza entorrinal, y que proyectan sobre la región del giro dentando a través de la vía perforante. Desde el giro dentado, a través de la vía de las fibras musgosas, se establece conexión con la región CA3, la cual a su vez emite proyecciones hacia la región CA1, conocidas como colaterales de Schaffer. Finalmente, la región CA1 conecta de nuevo con la corteza entorrinal (Knierim, 2015). 15 Figura 5. Circuito trisináptico del hipocampo. Las neuronas de la capa II de la corteza entorrinal medial y lateral proyectan sobre las regiones medial y externa, respectivamente, del árbol dendrítico de las células granulares del giro dentado, a través de la vía perforante. A su vez las células granulares se comunican a través de sus axones (fibras musgosas) con las dendritas apicales proximales de las neuronas piramidales de la región CA3. Las neuronas de la región CA3 emiten sus axones (las colaterales de Schaffer) sobre las dendritas apicales de las neuronas piramidales de la región CA1, que a su vez comunican con la corteza entorrinal. Las neuronas de la región CA3 también se comunican con las regiones CA3 y CA1 contralaterales a través de las fibras comisurales. Tomado de Neves et al., 2008. 1.2.1. Estructuras del hipocampo. 1.2.1.1. Giro dentado. El giro dentando está compuesto principalmente por neuronas granulares que reciben aferencias, en su mayoría, de las células estrelladas de la capa II de la corteza entorrinal, a través de la vía perforante del hipocampo. Estas neuronas, a su vez, emiten eferencias en el hilus, donde se encuentran las células musgosas, y sobre la región stratum lucidum de la CA3 (Amaral et al., 2007). Esta conexión forma parte, como ya se ha mencionado, de lo que se conoce como circuito trisináptico del hipocampo. Las células granulares están sometidas a regulación retrograda a través de las células musgosas y las interneuronas del hilus, que las estimulan e inhiben respectivamente (Wiera y Mozrzymas, 2015). El giro dentado alberga además uno de los dos nichos neurogénicos del cerebro en el adulto (Andersen et al., 2007). 16 1.2.1.2. Cornu ammonis. El cornu ammonis constituye el complejo celular que conecta el giro dentado con la corteza entorrinal en la progresión del circuito trisináptico. Se subdivide en 4 regiones: CA4, CA3, CA2 y CA1. Las regiones CA3, CA2 y CA1 se estructuran en capas. El stratum pyramidale comprende la capa somática de neuronas piramidales (que es el principal tipo neuronal de estas regiones del hipocampo), y presenta mayor compactación en la región CA1. Adyacente a la capa somática y en la zona basal de las neuronas piramidales se encuentra el stratum oriens, que abarca las dendritas basales de estas neuronas, y donde también se encuentran algunas interneuronas. En la región apical se diferencian dos capas: el stratum radiatum, adyacente a la capa somática (en CA2 y CA1), y el stratum lacunosummoleculare en la región más distal de la zona apical de las neuronas piramidales. Por otra parte, en la región CA3 se observa una capa más en la región apical, localizada entre el stratum pyramidale y el stratum radiatum, que se denomina stratum lucidum. Esta capa define la extensión de la región CA3 y corresponde a la zona de tránsito y comunicación de la vía de las fibras musgosas en CA3. En la sección perpendicular al eje del hipocampo, el límite de esta capa corresponde al giro de las fibras musgosas y la continuación de su comunicación de forma paralela al eje del hipocampo (Andersen et al., 2007). Por último, la región CA4 se conoce comúnmente como hilus y corresponde a la capa polimórfica del giro dentado situada en la región apical del haz de células granulares (Andersen et al., 2007). Contiene interneuronas y las células musgosas, y es la vía para las eferencias y aferencias de las células granulares del giro dentado con CA3 (Wiera y Mozrzymas, 2015). 1.2.2. Plasticidad en el hipocampo. La plasticidad sináptica hace referencia a los procesos de cambio de eficacia y/o morfología que ocurren a nivel de las sinapsis (Hebb, 1949; Pascual-Leone et al., 2005). Como ya se ha introducido previamente, el hipocampo constituye una estructura fundamental para la memoria y el aprendizaje (Burgess et al., 2002). Si bien aún se desconocen los mecanismos que subyacen a estos procesos, numerosos estudios apoyan la relación entre memoria/aprendizaje y plasticidad sináptica (Carew et al., 1981; Kandel y Schwartz, 1982; Martin et al., 2000; Kasai et al., 2010; Takeuchi et al., 2014). 23 En el modelo Ts1Cje, trabajos previos desarrollados por nuestro grupo de investigación han demostrado la existencia de una alteración en el proceso de traducción local sináptica asociado a la hiperfosforilación de mTOR (mammalian Target Of Rapamycin) que implica la hiperactivación de esta vía de señalización (Troca-Marín et al., 2011). Posteriormente, otros grupos de investigación también han observado hiperfosforilación de mTOR en muestras postmorten de tejido cerebral de personas con SD (Iyer et al., 2014; Perluigi et al., 2014). La traducción local es un proceso clave para la formación y la remodelación de las sinapsis, siendo la ruta de señalización mTOR una de las principales vías de regulación de la traducción local, como se discutirá más adelante. La alteración de la vía mTOR observada en el hipocampo del modelo Ts1Cje parece deberse a un mayor nivel de BDNF (Brain-Derived Neurotrophic Factor) y/o proBDNF en las regiones CA1 y giro dentado, que produciría un estado de “saturación” de los receptores TrkB (Troca-Marín et al., 2011; 2014). En relación con esta hiperactivación de mTOR, el modelo Ts1Cje presenta un déficit en la LTP dependiente de BDNF en el hipocampo, que se restaura al tratar con rapamicina, un fármaco inhibidor específico de mTOR (Andrade-Talavera et al., 2015). 1.3.2. Alteraciones de la morfología sináptica en los ratones Ts1Cje y Ts65Dn. En cuanto a la morfología neuronal del hipocampo del ratón Ts1Cje adulto, se ha descrito la existencia de una menor densidad de espinas dendríticas, así como un incremento en la proporción de espinas de mayor tamaño en la región del giro dentado (Belichenko et al., 2007). Esta alteración morfológica de las espinas en el giro dentado es un aspecto común en los modelos Ts1Cje y Ts65Dn (Belichenko et al., 2004; 2007). Además, en los ratones Ts65Dn, también hay un mayor número de espinas de gran tamaño en la región CA1 (Tabla 2) (Belichenko et al., 2004). 1.4. LTD dependiente de receptores metabotrópicos de glutamato (mGluR-LTD). 1.4.1. Papel fisiológico de la mGluR-LTD. La LTD es uno de los paradigmas principales de plasticidad en el hipocampo, y consiste en una disminución de la eficacia sináptica, así como una remodelación del terminal post-sináptico que puede suponer, en última instancia, la retracción y eliminación de espinas dendríticas (Nägerl et al., 2004; Zhou et al., 2004; Ramiro-Cortés e Israely, 2013). En las neuronas glutamatérgicas del hipocampo es de particular interés 24 la LTD dependiente de la activación de receptores metabotrópicos de glutamato del grupo I (mGluR1 y mGluR5), que puede ser inducida experimentalmente mediante la aplicación del agonista (S)-3,5-Dihidroxifenilglicina (DHPG) (Palmer et al., 1997; Fitzjohn et al., 1999; Huber et al., 2000; 2001). Esta forma de plasticidad participa en la regulación de la morfología de las espinas dendríticas y está asociada al proceso de retracción y eliminación de estas (Ramiro-Cortés e Israely, 2013; Oh et al., 2013), lo cual podría estar relacionado con el proceso de “poda” sináptica observado durante el neurodesarrollo (Yuste, 2010; Piochon et al., 2016). 25 Tabla 1. Transmisión basal y plasticidad sináptica en el hipocampo en los ratones modelos de SD Ts65Dn y Ts1Cje. Ts65Dn Age of mice REFERENCE Basal CA1 transmission glutamatergic: normal glutamatergic: normal GABAergic: normal GABAergic: increased (in s. radiatum and s. pyramidale, but not in s. oriens; not due to increased GABA release) GABAergic: increased (not due to increased GABA release; increased GABAB/GIRK currents in stratum lacunosum moleculare) GABAergic: increased (higher number of GABAergic neurons) 2 months 6-8 months P8-10 and P1921 P14-16 2-3 weeks 2-3 weeks Siarey et al., 1999 Scott-McKean and Costa, 2011 Mitra et al., 2012 Mitra et al., 2012 Best et al., 2007 ; 2012 Chakrabarti et al., 2010 CA1 Paired Pulse Facilitation (PPF) normal (IPSC) normal (EPSP) normal (EPSP) P14-16 2 months 6-9 months Mitra et al., 2012 Siarey et al., 1999 Scott-McKean et al., 2018 CA1 LTP decreased (HFS protocol) decreased (HFS protocol) decreased (4xHFS) normal (HFS protocol) or decreased (theta-burst protocol; restored with picrotoxin) 2 months 9 months 6-9 months 4-6 months Siarey et al., 1997 Siarey et al., 1997 Scott-McKean et al., 2018 Costa and Grybko, 2005 Martínez-Cué et al., 2013 CA1 LTD increased (LFS protocol) increased (NMDAR dependent) normal (mGluR dependent) 2 months 6-8 months 6-8 months Siarey et al., 1999 Scott-McKean and Costa, 2011 Scott-McKean and Costa, 2011 Basal DG transmission glutamatergic: normal NMDAR: normal GABAergic: increased (increased GABA release) 3-4 months 3-4 months 3-4 months Kleschevnikov et al., 2004 Kleschevnikov et al., 2004 Kleschevnikov et al., 2004; 2012 DG (NMDAR dependent) decreased (restored with picrotoxin) 3-4 months Kleschevnikov et al., 2004 Ts1Cje Age of mice REFERENCE Basal excitatory CA1 transmission glutamatergic: normal glutamatergic: decreased (restored with rapamycin) 2-3 months P21-30 Siarey et al., 2005 Andrade-Talavera et al., 2015 CA1 PPF absent (EPSP) (restored with rapamycin) P21-30 Andrade-Talavera et al., 2015 CA1 LTP decreased (HFS protocol) absent (BDNF-LTP) (restored with rapamycin) 2-3 months P21-30 Siarey et al., 2005 Andrade-Talavera et al., 2015 CA1 LTD Increased 2-3 months Siarey et al., 2005 DG LTP decreased (restored with picrotoxin) 3-4 month Belichenko et al., 2007 26 Tabla 2. Características morfológicas de las sinapsis en el hipocampo de los ratones Ts65Dn y Ts1Cje. Ts65Dn Age of mice REFERENCE CA1 spine density normal increased (CA1 basal dendrites) decreased (CA1 synaptic density) P21 6 months 16-23 months Belichenko et al., 2004 Belichenko et al., 2004 Kurt et al., 2004 DG spine density decreased decreased decreased (DG synaptic density) P21 6 months 16-23 months Belichenko et al., 2004 Belichenko et al., 2004 Kurt et al., 2004 CA1 spine morphology enlarged spines and short necks P21, 3 months and 6 months Belichenko et al., 2004 DG spine morphology enlarged spines and short necks P21, 3 months and 6 months Belichenko et al., 2004 Ts1Cje Age of mice REFERENCE CA1 spine density Normal 9-10 months Belichenko et al., 2007 DG spine density Decreased 9-10 months Belichenko et al., 2007 CA1 spine morphology - - - DG spine morphology enlarged spines and short necks 9-10 months Belichenko et al., 2007 1.4.2. Mecanismos de la mGluR-LTD Los mecanismos moleculares que subyacen a esta forma de plasticidad son variables durante el desarrollo (Tabla 3). Así, en estudios llevados a cabo en ratas de diferentes rangos de edad se ha observado no solo un cambio en los mecanismos involucrados en la mGluR-LTD, sino también una variación en la contribución relativa de los terminales prey postsinápticos a esta forma de plasticidad. En animales en estadio postnatal temprano (P8-P18) se ha observado una mGluRLTD independiente de traducción de proteínas y en la cual no se observan cambios en los niveles de AMPAR en la superficie de la sinapsis (Nosyreva y Huber, 2005). En este rango de edad, algunos autores observan una participación del terminal presináptico en la inducción de esta forma de plasticidad, cuya contribución tiende a reducirse con el desarrollo (Fitzjohn et al., 2001; Nosyreva y Huber, 2005). No obstante, en un trabajo realizado por Zhang y colaboradores, la mGluR-LTD se define como una actividad puramente postsináptica (Zhang et al., 2006). 27 En animales en la etapa juvenil (P21-P35) la mGluR-LTD es dependiente de traducción de proteínas, y es en este estadio donde parece haber una mayor contribución del terminal postsináptico (Huber et al., 2000). Además, existe una reducción de los AMPAR en superficie debido a su internalización, que está mediada por proteínas sintetizadas de novo mediante traducción local en la sinapsis (Nosyreva y Huber, 2005). Finalmente, en otro trabajo realizado con ratas adultas jóvenes (5-8 meses) y ratas adultas envejecidas (22-26 meses) también se observó una variación en esta forma de plasticidad que, en primera instancia, quedaría reflejada por un incremento de la mGluRLTD en los individuos envejecidos (Kumar y Foster, 2007). A nivel sináptico, se observó que en las ratas envejecidas (de manera similar a lo que sucede en la etapa postnatal temprana) adquiere relevancia la contribución del terminal presináptico a la LTD (Kumar y Foster, 2007). Otro aspecto diferencial se refiere a la mayor contribución de los receptores mGluR1 o mGluR5, dependiendo del rango de edad estudiado. En ratas envejecidas, la importancia de los receptores mGluR1 en la mGluR-LTD es mayor que en los individuos adultos jóvenes (Kumar y Foster 2007). De manera contraria, en los animales jóvenes, la inducción de la mGluR-LTD está principalmente asociada a la actividad de los mGluR5 (Fitzjohn et al., 1999). Por otra parte, aunque se ha observado que el tratamiento con DHPG también conlleva un incremento en la función asociada a NMDARs (Fitzjohn et al., 1996), en animales jóvenes no se ha observado participación ni de NMDARs ni de canales de Ca++ voltaje-dependientes de tipo L en esta forma de plasticidad. Sin embargo, en las ratas envejecidas, si bien no son imprescindibles, ambos contribuyen a la mGluRLTD (Kumar y Foster, 2007). En resumen (Tabla 3), los diversos trabajos antes mencionados permiten constatar la variabilidad de la mGluR-LTD durante el desarrollo, tanto en la contribución de los terminales prey postsinápticos, como en los mecanismos moleculares implicados, y su dependencia o no de síntesis de proteínas. Por tanto, resulta complejo definir mecanismos generales partícipes en la LTD inducida por los mGluR1/5 (mGluR Gp I). 28 29 Se ha descrito que los mGluR Gp I están asociados a proteínas G de la familia Gq (Kleppisch et al., 2001). Cuando se estimulan estos receptores, se produce la activación de la fosfolipasa C (PLC), que genera inositol-1,4,5-trifosfato (IP3) y diacilglicerol (DAG) a partir de fosfatidilinositol-4,5-bifosfato (PIP2). El DAG media la activación de la proteína quinasa C (PKC) que está implicada en la regulación de diversos procesos asociados a esta forma de plasticidad, como se describirá más adelante (Saugstad e Ingram, 2008). Por su parte, el IP3 induce un incremento en los niveles de Ca++ intracelular procedente de los reservorios intracelulares de calcio. Si bien existe cierta controversia en cuanto a la contribución del Ca++ en esta forma de plasticidad (Otani y Connor, 1998; Fitzjohn et al., 2001; Kumar y Foster, 2007; Ireland y Abraham, 2008; Holbro et al., 2009; Kasten et al., 2012; Chakroborty et al., 2012), es posible que su participación sea dependiente de la edad y esté asociada a cambios producidos durante el desarrollo (Kumar y Foster, 2007). En este sentido, es preciso considerar diversos trabajos en los que se ha descrito que las espinas dendríticas de mayor tamaño presentan retículo endoplasmático asociado que forma el denominado “aparato de la espina” (Spacek, 1985; Edwards, 1995; Spacek y Harris 1997; Holbro et al., 2009). El aparato de la espina es una especialización del retículo endoplasmático de estructura laminar, compuesto de sáculos aplanados que actúan como reservorios intracelulares de Ca++ y participan en la traducción local de proteínas (Spacek, 1985; Pierce et al., 2000; 2001; Yuste, 2010; Bell et al., 2019). Este tipo de espinas son las únicas susceptibles de sufrir mGluR-LTD en el hipocampo (Holbro et al., 2009). En este sentido, se ha descrito también que la activación de los mGluR provoca la retracción solo de las espinas de gran tamaño y que éste es un proceso dependiente de los receptores de IP3 (IP3R) (Oh et al., 2013). Todo esto sugiere que los reservorios intracelulares de Ca++ tienen un papel fundamental en esta forma de plasticidad. 1.4.3. Participación de la síntesis de proteínas en la mGluR-LTD. Dada la relevancia del proceso de traducción local en la mGluR-LTD en animales jóvenes (Tabla 3), ha sido de gran interés la caracterización de las rutas de señalización implicadas en esta forma de plasticidad (Fig. 7). 30 Figura 7. Rutas implicadas en la mGluR-LTD dependiente de la traducción local de proteínas. Tras la activación de los mGluRs se activa la PLC, que genera DAG e IP3 (Saugstad e Ingram, 2008). El DAG provoca la activación de PKC, proteína necesaria para el reclutamiento de FMRP a la sinapsis tras la activación de los mGluR (Antar et al., 2004). Además, la PKC puede participar en la activación de la vía MEK/ERK, que también contribuye a la regulación de la traducción local mediada por MNK1/2 y P90S6K (Roberson et al, 1999; Gallagher et al., 2004; Bhakar et al., 2012; Sanderson et al., 2016). El IP3, por su parte, contribuye a la activación de receptores IP3 de los reservorios intracelulares de calcio, provocando la movilización de Ca++ al terminal postsináptico (Gladding et al, 2009; Collingridge et al., 2010; Oh et al., 2013). Este incremento del nivel de Ca++ activa a la calmodulina (CaM), que participa en la regulación de la traducción de proteínas modulando a eEF2 (eukariotic Elongation Factor 2) (Collingridge et al., 2010). No obstante, la contribución del Ca++ en esta forma de plasticidad es controvertida, y variable durante el desarrollo (Fitzjohn et al., 2001; Kumar y Foster, 2007; Gladding et al, 2009; Holbro et al., 2009; Chakroborty et al., 2012). Por otra parte, la activación de los mGluRs induce la activación de PI3K, mediada por el complejo HOMER/PIKE-L (Ronesi y Huber, 2008; Bhakar et al., 2012). La PI3K participa en la activación de los complejos 1 y 2 de mTOR (mTORC1 y mTORC2). La vía mTORC1 está vinculada a la regulación de la traducción de proteínas mediada por P70S6K y eIF4E (Bhakar et al., 2012; Lipton y Sahin, 2014). mTORC1 también participa en la regulación de los procesos de autofagia, la síntesis de lípidos y la función mitocondrial (Lipton y Sahin, 2014; Bartolomé et al., 2017; Bordi et al., 2019). Por otro lado, mTORC2, participa en la regulación de la actina y el citoesqueleto, y regula la actividad de mTORC1 (Nakahata y Yasuda, 2018). En la regulación de la traducción local también tiene especial relevancia FMRP, que es fosforilada por P70S6K (activada a su vez por mTORC1) y desfosforilada por PP2A, que es activada a su vez por los mGluRs (Hou et al., 2006; Narayanan et al., 2007). La activación de los mGluR induce, además, una rápida ubiquitinación y degradación de FMRP, lo cual favorece la traducción de los ARNm asociados a esta proteína represora (Hou et al., 2006). Las proteínas sintetizadas tras la activación de los mGluR participan en diversos procesos como son la propia regulación de la maquinaria de traducción, y la endocitosis de los AMPAR, lo que contribuye en última instancia a la reducción de la eficacia sináptica (Nadif Kasri et al., 2011; Nakahata y Yasuda, 2018). Creado con BioRender.com. 31 La estimulación de los mGluR Gp I se ha relacionado con la regulación de la actividad de la proteína FMRP (Fragile X Mental Retardation Protein) (Huber et al., 2002; Antar et al., 2004; 2005; Hou et al., 2006; Westmark y Malter, 2007; Narayanan et al., 2007; 2008; Park et al., 2008). FMRP es un represor de la traducción de mensajeros dendríticos (Laggerbauer et al., 2001), cuyo silenciamiento está vinculado al síndrome del X Frágil (Pieretti et al., 1991; Sutcliffe et al., 1992), otra de las causas más frecuentes de discapacidad intelectual. En su forma fosforilada, FMRP interacciona con estructuras secundarias de determinados ARNm reprimiendo la traducción de dichos mensajeros (Li et al., 2001; Schaeffer et al., 2001; Ceman et al., 2003). Cuando se estimulan los mGluR Gp I, se produce la activación de la proteína fosfatasa 2A (PP2A), que desfosforila a FMRP y permite la traducción de los ARNm asociados (Narayanan et al., 2007). Además, tras la activación de los mGluR Gp I, se produce una rápida ubiquitinación de FMRP y su degradación por el proteasoma, lo cual podría favorecer un incremento del tiempo para la traducción de los ARNm diana de FMRP (Hou et al., 2006). También se ha descrito que la actividad de FMRP en la sinapsis depende de la activación de la PKC y de la liberación de Ca++ desde los reservorios intracelulares, inducida por la PLC (Antar et al 2004). Otra vía regulada por la actividad de los mGluR Gp I es la ruta MEK (MAPK/ERK kinase)/ERK (extracellular signal-regulated protein kinase) (Gallagher et al., 2004; Sanderson et al., 2016). La vía MEK/ERK participa en la regulación de la traducción local de proteínas en la sinapsis mediante la activación de P90S6K (ribosomal S6 kinase) y de MNK (MAP kinase-interacting kinase). P90S6K actúa sobre la subunidad S6 del ribosoma, y MNK regula a eIF4E (eukariotic translation Initation Factor 4E) siendo ambos procesos necesarios para la iniciación de la traducción de determinados ARNms (Klann y Dever, 2004; Bhakar et al., 2012). 1.4.3.1. Ruta de señalización mTOR en la mGluR-LTD. Existen evidencias de la participación de mTOR en la mGluR-LTD que, generalmente, se han asociado al papel de mTORC1 en la regulación de la traducción de proteínas sinápticas (Hou y Klann, 2004; Ronesi y Huber, 2008; Narayanan et al 2007; 2008; O’Riordan et al., 2014; Zhu et al., 2017; Zhu et al., 2018). mTOR es una quinasa de serina/treonina implicada en el control de la homeostasis mediante la regulación de los procesos de transcripción y de traducción de proteínas, la 32 autofagia y el mantenimiento y biogénesis de orgánulos (Lipton y Sahin, 2014). mTOR actúa formando parte de dos complejos, mTORC1 y mTORC2 (Fig. 7). Ambos complejos presentan componentes comunes, como son el propio mTOR, mLST8 (mammalian lethal with sec13 protein) y DEPTOR (inhibitory DEP domain containing mTOR-interacting protein). Por otra parte, son componentes exclusivos del complejo mTORC1, RAPTOR (Regulator-Associated Protein of mTOR) y PRAS40 (Proline-Rich Akt Substrate of 40 kDa). Otra proteína relevante es FKBP12 (12 kDa FK506 Binding Protein), que se asocia a mTORC1 e influye en su actividad (Hoeffer et al., 2008; Lipton y Sahin, 2014). FKBP12, además, es responsable de la acción inhibitoria de la rapamicina sobre mTORC1, ya que el complejo rapamicina-FKBP12 interacciona con mTOR, inhibiéndolo (Brown et al., 1994; Lipton y Sahin, 2014; Li et al., 2014). Por su parte el complejo mTORC2 contiene de manera exclusiva a RICTOR (Rapamycin-Insensitive Companion of mTOR), a mSIN1 (mammalian stress-activated MAP kinase-interacting protein 1) y a PROTOR 1 y 2 (proteins observed with RICTOR 1 y 2) (Lipton y Sahin, 2014). Si bien se ha considerado de forma general que la rapamicina inhibe únicamente mTORC1, existen estudios que demuestran que la rapamicina puede actuar inhibiendo tanto a mTORC1 como a mTORC2, dependiendo de la concentración del fármaco y la duración del tratamiento, así como de los niveles de las FKBPs (Li et al., 2014; Lipton y Sahin, 2014; Schreiber et al., 2015; Zhu et al., 2018). Así, se ha sugerido que la rapamicina a altas concentraciones se uniría directamente a mTOR en el sitio de unión del complejo FKBP12-rapamicina, afectando a mTORC1 y mTORC2 (Lipton y Sahin, 2014). Está descrito que los mGluR5, a través del complejo formado con la proteína Homer y la GTPasa PIKE-L, activan a la proteína PI3K (fosfatidilinositol-3 quinasa), que produce PIP3 (fosfatidilinositol-3,4,5-trifosfato) a partir de PIP2 (Fig. 7). El PIP3 junto a PDK1/2 (Phosphoinositide-Dependent Kinase) provoca la movilización de la quinasa Akt (protein kinase B) a la membrana y su consecuente activación. Akt activa a mTORC1 mediante fosforilación directa o bien mediante la inhibición de los complejos TSC1 y TSC2 (Tumor Supresor Complex 1 y 2). La supresión de los complejos TSC1 y TSC2 permite actuar a RHEB (Ras Homolog Enriched in Brain), que es un activador de mTORC1 (Bhakar et al., 2012). 39 3. Materiales y métodos. 3.1. Animales. En este trabajo se utilizaron los ratones modelo de SD Ts1Cje (Sago et al., 1998). Estos ratones fueron adquiridos a Jackson Laboratories (USA) y se mantuvieron mediante un sistema de cruzamiento de ratones macho Ts1Cje y hembras híbridas B6C3F1 (adquiridas a Charles River), tal y como se recomienda por el proveedor, con objeto de mejorar la viabilidad de la estirpe. Para los experimentos se emplearon ratones silvestres (WT) y Ts1Cje hermanos de camada, con edades comprendidas entre P21 y P30 (día post-natal 21 y 30) o adultos (>2 meses). El cuidado, tratamiento y sacrificio de los ratones se ajustó a lo determinado por las leyes nacionales e internacionales de protección animal. Todos los procedimientos llevados a cabos fueron previamente aprobados por el Comité de Experimentación Animal de la Universidad de Sevilla y por la Consejería de Agricultura, Pesca y Desarrollo Rural de la Junta de Andalucía (número de referencia 24/05/2016/097). Para el genotipado de los ratones mediante PCR, se utilizó ADN aislado a partir de biopsias de cola. Las reacciones se llevaron a cabo en en un volumen final de 25 µl, en tubos de plástico que contenían: 2,5 µl de buffer comercial 10x (Biotools), 2 mM MgCl2, 200 µM de cada dNTP, 0,4 µM de cada uno de los oligonucleótidos indicados abajo y 0,04 unidades de Taq polimerasa (Biotools). Los oligonucleótidos empleados fueron los siguientes: Neo-fw: 5'- CTT GGG TGG AGA GGC TAT TC Neo-rev: 5'- AGG TGA GAT GAC AGA GAT C Tcrd-fw: 5'- CAA ATG TTG CTT GTC TGG TG Tcrd-rev: 5'- GTC AGT CGA GTG CAC AGT TT Neo-fw y Neo-rev amplifican una banda de 280 pares de bases (pb) perteneciente al gen de resistencia a neomicina, que solo está presente en los ratones trisómicos. Tcrdfw y Tcrd-rv amplifican una banda de 200 pb, tanto en los ratones silvestres como en los trisómicos, por lo que sirve como control positivo. El programa de PCR para el genotipado constó de un paso de desnaturalización inicial a 94˚C durante 2 min, seguido de 35 ciclos de desnaturalización a 94˚C durante 45 s, annealing a 58˚C durante 45 s y 40 polimerización a 72˚C durante 45 s. Los productos obtenidos en las reacciones de PCR se separaron mediante electroforesis en gel de agarosa al 2%. Los animales adultos fueron sacrificados mediante dislocación cervical. Los animales P18-P30, utilizados para experimentos de electrofisiología y tinción de Golgi, fueron anestesiados mediante inyección intraperitoneal de tribromoetanol (Sigma, Ref. T48402) al 2% en solución salina (NaCl 0,9%), a una dosis de 300 mg/kg, y decapitados posteriormente. 3.2. Fármacos y tratamientos. El DHPG ((S)-3,5-Dihidroxifenilglicina; Sigma-Aldrich, Ref. D-3689) se preparó en agua a una concentración 10 mM y se conservó a -20°C hasta uso. Este stock 10 mM se diluyó en ACSF hasta una concentración final de 100 µM para los tratamientos de rodajas de hipocampo. Para la preparación del inyectable de rapamicina destinado al tratamiento de hembras gestantes, la rapamicina (Selleckchem, Ref.S1039) fue disuelta en suero salino (NaCl 0,9%) con etanol al 1%, polietilenglicol 400 al 0,25% y Tween® 80 al 0,25% (Tsai et al., 2013), a una concentración final de 0,1 mg/ml. La rapamicina se administró a una dosis de 1 mg/kg mediante inyección intraperitoneal única a las hembras gestantes entre los días E15 y E17 (días de gestación 15 y 17). Para el inyectable de rapamicina destinado al tratamiento de ratones adultos, la rapamicina fue disuelta en suero salino (NaCl 0,9%) con etanol al 4%, Tween®80 al 5% y polietilenglicol 400 al 5% (Kwon et al., 2003), a una concentración final de 1mg/ml. Se administró a una dosis de 10 mg/kg mediante inyección intraperitoneal durante 5 días (una inyección al día) antes de llevar a cabo el aislamiento de sinaptoneurosomas de hipocampo. 3.3. Aislamiento de sinaptoneurosomas (SNs) de hipocampo. Para aislar SNs de hipocampo de ratones silvestres y Ts1Cje, se siguió el protocolo publicado previamente por nuestro laboratorio (Troca-Marín et al., 2010; Fig. 8). Para ello se extrajo el cerebro de ratones adultos (ratones de 2-4 meses, 3 ratones por grupo experimental) y se procedió al aislamiento de los hipocampos en PBS (“phosphate buffered saline”; PanReac, Ref. A9177) a 4°C. Los hipocampos fueron recolectados en HS (“Hepes solution”). Esta solución consiste en: Hepes 10 mM (Sigma, Ref. H4034), 41 pH7,4; sacarosa 320 mM (Sigma, Ref. S0389); MgSO4 1 mM (Sigma, Ref. M7506); leupeptina 10 μM (Sigma, Ref. L2884); aprotinina 2 μg/ml (Sigma, Ref. A1153) y pepstatina 1 μM (Sigma, Ref. P5318). Seguidamente, los hipocampos se homogenizaron usando un homogenizador Dounce de teflón, a 650 revoluciones por minuto (rpm) y 4°C. Figura 8. Protocolo de aislamiento de SNs. Se muestra un esquema de los principales pasos del protocolo de aislamiento de SNs utilizado en este trabajo. Tomado de Troca-Marín et al., 2010. El homogenado se centrifugó a 1.000g durante 10 min a 4°C. El pellet obtenido se resuspendió en HS y se realizó un nuevo ciclo de homogenización a 200 rpm y 4°C. La suspensión resultante se diluyó en OWS (Optiprep™ working solution) en una proporción 1:10. El OWS consiste en: Optiprep™ (Sigma, Ref. D1556) 50%, Hepes 10 mM, sacarosa 65 mM, Mg SO4 1 mM, leupeptina 10 μM, aprotinina 2 μg/ml y pepstatina 1 μM. Esta suspensión diluida en OWS constituyó la capa inferior de un gradiente de Optiprep™ con variaciones de concentración de Optiprep™ del 9 al 35% (Optiprep™ 42 9%, 12,5%, 15%, 25%, 35%) preparada en OGB (Optiprep™ gradient buffer). El OGB consiste en: Hepes 10 mM, sacarosa 300 mM, MgSO4 1 mM, leupeptina 10 μM, aprotinina 2 μg/ml y pepstatina 1 μM. Este gradiente se centrifugó a 16.500 g durante 30 min a 4°C, se recolectó la fracción O1 (capa de material localizado entre las fases de Optiprep™ 9% y 12,5%) y se realizó un lavado de este material con OGB, centrifugando a 20.000 g durante 10 min a 4°C. El pellet obtenido fue resuspendido en HS y rehomogeneizado con un homogenizador Dounce de vidrio, manualmente. La suspensión obtenida se añadió como última capa de un gradiente de Percoll® con variaciones de concentración de Percoll® del 10 al 25% (Percoll® (Sigma Ref. P1644) 10%, 14%, 16%, 20%, 25% en HS) y se centrifugó a 32.400 g durante 20 min a 4°C. A continuación, se recolectó la fracción 1P4 (capa de material localizado entre las fases de Percoll® 16% y 20%), que es la fracción enriquecida en SNs. Esta fracción 1P4 fue resuspendida en HS y sometida a otra centrifugación a 20.000 g durante 10 min a 4°C. Seguidamente, el pellet obtenido se lavó dos veces con SB (“synaptoneurosome buffer”, consistente en Hepes 10 mM; CaCl2 2,2 mM (Sigma Ref. 223506); NaH2PO4 0,5 mM (Sigma Ref. 71505); KH2PO4 0,4 mM (Sigma Ref. P5379); NaHCO3 4 mM (Sigma Ref. S5761); NaCl 80 mM (Sigma Ref. S7653); leupeptina 10 μM, aprotinina 2 μg/ml y pepstatina 1 μM), centrifugándose a 20.000 g durante 10 min a 4°C. Los pellets obtenidos se conservaron a -80ºC hasta su análisis proteómico. 3.4. Análisis proteómico mediante iTRAQ (Isobaric tags for relative and absolute quantitation). La extracción de proteínas de las muestras, el marcado mediante iTRAQ y el análisis de espectrometría de masas en tándem fue realizado por el Servicio de Proteómica del Instituto de Biomedicina de Sevilla (IBiS). Las proteínas de las muestras de SNs se extrajeron mediante una solución de lisis compuesta por dodecilsulfato sódico (SDS), inhibidores de proteasas (Sigma, Ref. P8340), inhibidores de fosfatasas (phosphatase inhibitor cocktail I y cocktail II, Sigma, Ref. P2850 y P5726, respectivamente) y Benzonase® (Sigma, Ref. E8263). Tras 1 hora de incubación, las muestras se centrifugaron a 14.000 rpm en una microcentrífuga durante 15 min a 4ºC, y a continuación se determinó la cantidad de proteína presente en el sobrenadante. El marcaje mediante iTRAQ (AB ScieX, Ref. 4390811) se realizó siguiendo las indicaciones del fabricante, omitiendo el proceso de precipitación de 43 proteínas para conservar aquellas presentes de manera minoritaria en las muestras. Para cada condición experimental se marcaron 50 µg de proteínas por duplicado (8-plex). Los datos obtenidos por espectrometría de masas fueron analizados mediante el software Proteome Discover 1.4 (ThermoFisher Scientific) ajustando que el valor False Discovery Rate (FDR) fuese menor de 0,01, tanto para las proteínas como para los péptidos identificados. 3.5. Análisis de los datos proteómicos mediante PANTHER (Protein ANalysis THrough Evolutionary Relationships) e IPA (Ingenuity Pathway Analysis). Para verificar que las preparaciones de SNs utilizadas en los experimentos de iTRAQ estaban enriquecidas en proteínas sinápticas, se llevó a cabo un análisis utilizando la herramienta informática PANTHER, versión 16.0 (Mi et al., 2021). Concretamente, se llevó a cabo un test de sobre-representación, seleccionando el genomio completo de Mus musculus (21.988 proteínas) y el conjunto de datos anotados “PANTHER GO-Slim Cellular Component”, aplicando una corrección de Bonferroni para comparaciones múltiples. Esta herramienta está disponible “on line”: http://www.pantherdb.org. Los datos cuantitativos obtenidos mediante el software Proteome Discover se analizaron mediante la herramienta informática IPA (Qiagen, Fall release September 2019), con objeto de determinar las vías de señalización afectadas en las diferentes condiciones experimentales analizadas. El umbral para la selección de proteínas que se consideraban con expresión alterada se estableció en base a las variaciones observadas en los replicados de las muestras silvestres sin tratamiento, ajustándolo a los límites del rango que contenía más del 80% de los datos. Aplicando dicho criterio, se consideró que las proteínas con una expresión superior a 1,2 veces el valor de referencia o inferior a 0,8 estaban afectadas. Como base de datos de referencia para el análisis mediante IPA se empleó la “Ingenuity Knowledge Base” (marcando la opción “solo genes”). Solo se consideraron las moléculas e interacciones observadas previamente de manera experimental en tejidos y/o células (astrocitos o neuronas) del sistema nervioso del ratón, la rata o el humano. El software IPA genera una lista de rutas canónicas afectadas de manera significativa basado en dos parámetros, el p-value y el z-score. El p-value, calculado con el test exacto de Fisher con cola a la derecha, es una medida de la probabilidad de que 44 una vía concreta esté enriquecida en el grupo de proteínas desreguladas debido al azar. Para aumentar la exigencia del análisis, se consideraron solo aquellas vías con un p-value inferior o igual a 0,005. Por otra parte, la herramienta IPA predice si las rutas identificadas como alteradas estarían activadas o inhibidas en base a los cambios en los niveles de expresión de las proteínas desreguladas. Estas predicciones se establecen mediante el algoritmo Z-score de IPA. Un valor positivo del Z-score indica que el análisis predice una activación de la vía correspondiente y un valor negativo para este parámetro indica inhibición. Las rutas canónicas que no son seleccionables para el análisis de actividad en la versión usada de IPA se indican como N/A. 3.6. Preparación de extractos de proteína, electroforesis y Western blot. Se realizaron Western blots (WB) a partir de rodajas de hipocampo (P21-P30) o de hipocampo total de ratones adultos. En el caso de ratones P21-P30, se extrajo el cerebro, que se depositó en líquido cefalorraquídeo artificial (ACSF) con sustitución parcial de sodio por sacarosa (ACSFs) (véase apartado 3.7 para su composición), con suministro de carbógeno (CO2 5%; O2 Resto; H2O <5ppm), y seguidamente se procedió a la obtención de secciones horizontales de 350 µm mediante un vibratomo (Vibratome 3000, Sectioning System). Las rodajas se depositaron en una cámara de incubación durante 30 min a 33-34°C en ACSF con suministro de carbógeno. Tras este periodo de incubación, las rodajas permanecieron durante al menos 2 horas en ACSF a temperatura ambiente (RT; 22-25°C). Seguidamente un grupo de rodajas fueron tratadas con DHPG 100µM durante 5 min y otras permanecieron el mismo tiempo sin recibir tratamiento. Ambos grupos de rodajas se congelaron tras 60 min. desde el inicio del tratamiento. En el caso de ratones adultos, se extrajo el cerebro y se aislaron los hipocampos, que se sometieron a congelación rápida con hielo seco. A continuación, se añadió tampón de lisis a las muestras y se homogeneizaron a 200 rpm durante 1 min mediante un homogenizador Dounce de teflón. El tampón de lisis consistió en: Tris 50 mM (pH 7,4); Triton® X-100 0,5%; NaCl 150 mM; EDTA 1 mM; SDS 0,6%; Phosphatase inhibitor cocktail 2 (Sigma Ref. P5726) 1%; Phosphatase inhibitor cocktail 3 (Sigma Ref. P0044) 1%; Protease inhibitor cocktail (Sigma Ref. P8340) 1%. Seguidamente, se centrifugó el 45 homogenado a 14,500 rpm durante 15 min a RT, y se recolectó el sobrenadante, al que se añadió Laemmli Buffer (SDS 2%; sacarosa 42,5 g/l; azul bromofenol 0,85 g/l; Tris 12,75 mM pH 6,8; EDTA 5,1 mM pH 7,4; ditiotreitol (DTT) 150 mM). Las muestras se incubaron a 100°C durante 10 min para su desnaturalización. Seguidamente, se llevó a cabo la electroforesis de las muestras en geles de poliacrilamida comerciales (SDSPAGE; MiniPROTEAN® TGX Stain-Free™ de BioRad, Ref. 4568086) y la transferencia a membranas de PVDF (Trans-Blot® Turbo™ Transfer Pack de BioRad, Ref. 1704156) mediante el sistema Trans-Blot® Turbo™ (BioRad). Una vez transferidas las proteínas a las membranas, estas se lavaron con TBS-T (NaCl 8g/l; Tris 50 mM pH 7,5 y Tween® 20 al 0,1%) y se incubaron durante 1 h a RT en una solución de leche desnatada en polvo al 1% en TBS-T, con objeto de bloquear y prevenir uniones inespecíficas de los anticuerpos. Una vez transcurrido el tiempo de bloqueo, se llevó a cabo la incubación durante 20-24 h a 4-8°C con el anticuerpo primario correspondiente diluido en TBS-T con albumina de suero bovino (BSA) al 2%. Se usaron los anticuerpos primarios anti-LC3B (Cell Signaling; Ref. #2775, RRID: AB_915950), anti-TOM20 (Novus; Ref. NBP1-81556, RRID: AB_11003249) y anti-RICTOR (Cell Signaling; Ref. #2114, RRID: AB_2179963) a las concentraciones correspondientes (1:1000 para LC3B y TOM20, y 1:1500 para RICTOR). Tras la incubación con el anticuerpo primario se realizaron lavados con TBS-T y se prosiguió con la incubación de la membrana con el anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa de rábano (antirabbit HRP, PROMEGA, Ref.W401B) diluido en solución de bloqueo a la concentración correspondiente (1:5000 para LC3B y para RICTOR, y 1:2000 para TOM20). Mediante el sustrato WesternBright Quantum HRP Substrate (Advansta, Ref. K-12042-D-10) se reveló el marcaje de las membranas, y se midió la quimioluminiscencia resultante mediante el sistema ChemiDoc XRS (BioRad). Los datos obtenidos mediante la cuantificación de las señales quimioluminiscentes se normalizaron por la cantidad de proteína total presente en el gel antes de su transferencia a membrana, detectables gracias el sistema de formación de compuestos trihalo característico de los geles TGX (BioRad). De este modo, las señales correspondientes se cuantificaron mediante el sistema ChemiDoc XRS. 46 Para el análisis estadístico de los resultados obtenidos mediante WB se aplicó el test t-Student comparando los genotipos entre sí, o los tratamientos con sus respectivos controles. 3.7. Electrofisiología en rodajas agudas de hipocampo. Tras la puesta a punto de la técnica de electrofisiología mediante MEAs descrita en el Anexo I, se estableció el protocolo para el estudio de la mGluR-LTD Gp I que se describe a continuación. Se emplearon ratones WT y Ts1Cje con edades comprendidas entre P21 y P30, y los experimentos se realizaron a ciegas para el genotipo. Los ratones se anestesiaron y decapitaron, y se extrajo el cerebro rápidamente (menos de 1 min). El cerebro se lavó en ACSFs a 4-8°C, con suministro constante de carbógeno. La composición del ACSFs es: KCl 2,5 mM (Sigma, Ref. P9541); NaH2PO4 (2H2O) 1,25 mM (Sigma, Ref. P71505); NaHCO3 26 mM (Sigma, Ref. S5761); glucosa 25 mM (Sigma, Ref. G5400); CaCl2 (2H2O) 0,5 mM (Sigma, Ref. 223506); MgSO4 (7H2O) 4 mM (Sigma, Ref. 63138); sacarosa 185 mM (Sigma, Ref. P84097). Este lavado con ACSFs se realizó durante menos de 30 segundos y, seguidamente, el cerebro se dispuso en la plataforma de corte sobre una capa de etilcianoacrilato. Una vez colocado en la cámara de corte del vibratomo (Vibratome 3000, Sectioning System), el cerebro se sumergió en ACSFs y se inició el procedimiento de corte, controlando la temperatura entre 2-8°C, con suministro constante de carbógeno. Se obtuvieron cortes horizontales de 350 µm de los cuales se aislaron los hipocampos, conservando parte de corteza entorrinal adyacente a la región CA1. Los cortes fueron transferidos a una cámara de incubación con ACSF (NaCl 126 mM; KCl 3 mM; MgSO4 (7H2O) 1,3 mM; CaCl2 (2H2O) 2 mM; NaH2PO4 (2H2O) 1,25 mM; NaHCO3 24 mM; glucosa 10 mM) a 34°C con suministro constante de carbógeno durante 30 minutos. Tras los 30 minutos de recuperación, las rodajas se mantuvieron a RT durante al menos 2 horas y se sometieron a registro en MEA 3D (Anexo I). La rodaja a registrar se dispuso en la cámara del MEA 3D sobre los electrodos (Fig. 9) con la ayuda de un pincel, se retiró el ACSF de la cámara y se colocó una rejilla sobre la rodaja. A continuación, se añadió ACSF hasta mantener la rodaja sumergida, y se inició el sistema de perfusión de ACSF a RT y suministro constante de carbógeno, con un flujo de 2 ml/minuto. Antes de iniciar el protocolo de estimulación y registro, las rodajas se mantuvieron 10 minutos en la cámara del MEA para su estabilización. 47 Las rodajas fueron estimuladas mediante pulso bifásico (fase negativa-fase positiva, pulso cuadrado y 100 ms por fase) con una amplitud de -/+1.750 mV para comprobar la viabilidad y respuesta de la rodaja. Se seleccionaron las rodajas que mostraron una respuesta de amplitud superior a los 100 µV. Para cada rodaja se determinó la curva input/output, sometiéndola a voltajes con amplitudes ascendentes desde -/+750 mV a -/+4.000 mV, aplicando 3 estímulos para cada amplitud con un intervalo entre estímulos de 1 minuto. El nivel de respuesta basal se ajustó al 60% de la pendiente de la respuesta máxima obtenida al máximo voltaje aplicado, y se estimuló a una frecuencia de 0,0167 Hz (1 estímulo por minuto). Tras obtener un nivel de respuesta basal estable, se aplicó el tratamiento con DHPG a una concentración 100 µM durante 5 minutos, suministrado a un flujo de 2 ml/min, con objeto de producir la mGluR-LTD Gp1. Durante la aplicación del fármaco se mantuvo el protocolo de estimulación y registro, y se prolongó 1 hora tras finalizar el tratamiento (Fig. 10). Los registros fueron adquiridos a una frecuencia de 10.000 Hz. Figura 9. Rodaja de hipocampo en el dispositivo MEA y actividad eléctrica detectada en respuesta a estímulo. (A) Rodaja de hipocampo dispuesta sobre la matriz de electrodos del dispositivo MEA (barra de escala: 200 µm). (B) Actividad eléctrica detectada en cada electrodo del dispositivo MEA en respuesta a un estímulo en electrodo 53 (los electrodos 27, 63 y 64 están apagados). (C) Actividad eléctrica detectada en uno de los electrodos (electrodo 43) en la región stratum radiatum de la CA1 del hipocampo en respuesta a estímulo. El parámetro utilizado para medir la eficacia sináptica fue la pendiente de la curva inicial del fEPSP (field Excitatory Post-Synaptic Potential), tomándose el segmento comprendido entre el 10% y el 90% de la amplitud. 48 Los resultados de los experimentos de electrofisiología se presentan como la media +/- SEM normalizada respecto a la pendiente de la respuesta basal (100%). Para el análisis estadístico se realizó el test t-Student comparando los grupos experimentales. En las comparaciones se muestra el valor medio normalizado para cada condición en el minuto 60 tras el inicio del tratamiento con DHPG. Figura 10. Efecto del DHPG sobre el fEPSP en la región stratum radiatum de la CA1 del hipocampo. Se muestran 8 fEPSPs consecutivos en el tiempo: 5 fEPSP de línea base y 3 fEPSP post-DHPG. En la figura se observa la depresión aguda en la respuesta eléctrica de la rodaja en la región stratum radiatum de la CA1 tras la aplicación de DHPG 100 µM. La progresión de los fEPSPs se muestra con código de colores (orden cronológico de amarillo a rojo). 3.8. Tinción de Golgi. Para la tinción de Golgi, los ratones (P18) se anestesiaron y decapitaron, y se extrajo el cerebro. Se separaron ambos hemisferios cerebrales y se descartó el cerebelo. Para la tinción se empleó el kit FD Rapid Golgi stain (FD NeuroTechnologies INC., Ref. PK401A) y se siguieron las indicaciones del fabricante. Tras el proceso de tinción los cerebros fueron seccionados en criostato (Leica CM1950) generando cortes coronales de 100 µm. Los cortes se depositaron sobre portaobjetos Menzel-Gläse Superfrost PLUS (ThermoScientific, Ref. J1800AMNZ) y se cubrieron con una fina capa de gelatina (PanReac, Ref. 251336) al 0,5% disuelta en agua destilada y etanol 98% a partes iguales. Para el montaje de los cubreobjetos se empleó ProLong Gold antifade reagent (Invitrogen, Ref. P36931). 55 Figura 13. Test de sobre-representación PANTHER de las proteínas identificadas por iTRAQ en muestras de SNs de hipocampo sometidas a análisis proteómico. Se muestran los componentes celulares sobre-representados en los SNs. El enriquecimiento se indica como número de veces, comparando con el genoma completo de ratón. Para mayor claridad, solo se han incluido en la figura las subclases más específicas del conjunto de datos anotados “PANTHER Go-Slim Cellular Component”. El análisis completo se muestra en la Tabla S4 del Archivo Suplementario 1). Al establecer un cutoff de 1,2 veces (véase Materiales y Métodos), 116 proteínas resultaron estar desreguladas (108 al alza y 8 a la baja) en los SNs Ts1Cje, comparando con los SNs WT (Tabla 4). En los SNs del grupo Ts1Cje tratados con rapamicina (Ts1Cje RAPA), 88 proteínas resultaron estar afectadas (58 al alza y 30 a la baja) (Tabla 5), comparando con los SNs WT. Finalmente, en el grupo de SNs WT tratados con rapamicina (WT RAPA), 130 proteínas aparecían desreguladas (104 al alza y 26 a la baja), comparando con los SNs WT (Tabla 6). 56 Tabla 4. Proteínas afectadas en SNs de hipocampo de ratones Ts1Cje, comparando con SNs WT. Cambio de expresión (veces) ID Símbolo Gen 1.344 P51830 ADCY9 adenylate cyclase 9 -1.266 Q3TBU7 AGFG2 ArfGAP with FG repeats 2 -1.213 E9Q414 APOB apolipoprotein B 1.246 P12023 APP amyloid beta precursor protein 1.334 E9PYT0 ARHGAP5 Rho GTPase activating protein 5 1.337 Q8VDN2 ATP1A1 ATPase Na+/K+ transporting subunit alpha 1 1.667 Q6PIE5 ATP1A2 ATPase Na+/K+ transporting subunit alpha 2 1.639 Q6PIC6 ATP1A3 ATPase Na+/K+ transporting subunit alpha 3 1.415 P14094 ATP1B1 ATPase Na+/K+ transporting subunit beta 1 1.595 P14231 ATP1B2 ATPase Na+/K+ transporting subunit beta 2 1.251 O55143 ATP2A2 ATPase sarcoplasmic/endoplasmic reticulum Ca2+ transporting 2 1.329 G5E829 ATP2B1 ATPase plasma membrane Ca2+ transporting 1 1.268 F8WHB1 ATP2B2 ATPase plasma membrane Ca2+ transporting 2 1.536 Q06185 Atp5k ATP synthase, H+ transporting, mitochondrial F1F0 complex, subunit E 1.925 P56135 ATP5MF ATP synthase membrane subunit f 1.523 Q9DCX2 ATP5PD ATP synthase peripheral stalk subunit d 1.907 P97450 ATP5PF ATP synthase peripheral stalk subunit F6 1.300 P51863 ATP6V0D1 ATPase H+ transporting V0 subunit d1 1.314 P97445 CACNA1A calcium voltage-gated channel subunit alpha1 A 1.474 Q5SUF8 CACNA1G calcium voltage-gated channel subunit alpha1 G 1.262 O08532 CACNA2D1 calcium voltage-gated channel auxiliary subunit alpha2delta 1 1.529 Q9JKC6 CEND1 cell cycle exit and neuronal differentiation 1 1.299 B1ATV0 CLCN5 chloride voltage-gated channel 5 1.225 Q60936 COQ8A coenzyme Q8A 1.818 P19783 COX4I1 cytochrome c oxidase subunit 4I1 1.889 P12787 COX5A cytochrome c oxidase subunit 5A 2.119 Q9CPQ1 Cox6c cytochrome c oxidase subunit 6C -1.630 F6XLV1 CROCC2 ciliary rootlet coiled-coil, rootletin family member 2 1.241 E0CXB9 CTNNA2 catenin alpha 2 1.728 Q9D0M3 CYC1 cytochrome c1 1.976 P62897 CYCS cytochrome c, somatic -1.487 A2A8E2 CZIB CXXC motif containing zinc binding protein 1.330 O08749 DLD dihydrolipoamide dehydrogenase -1.334 Q9QYJ0 DNAJA2 DnaJ heat shock protein family (Hsp40) member A2 1.406 F8VPQ1 DOCK3 dedicator of cytokinesis 3 -1.226 Q9Z2I2 FKBP1B FKBP prolyl isomerase 1B 1.257 P45878 FKBP2 FKBP prolyl isomerase 2 -1.252 Q9WV18 GABBR1 gamma-aminobutyric acid type B receptor subunit 1 1.335 Q9CR59 GADD45GIP1 GADD45G interacting protein 1 -1.403 Q9QUH0 GLRX glutaredoxin 57 1.267 E9PVN6 Gm20498 predicted gene 20498 -1.440 Q9CQI3 GMFB glia maturation factor beta 1.207 E9QKR0 GNB2 G protein subunit beta 2 -1.212 P63213 GNG2 G protein subunit gamma 2 1.549 Q64521 GPD2 glycerol-3-phosphate dehydrogenase 2 1.481 P23819 GRIA2 glutamate ionotropic receptor AMPA type subunit 2 -1.251 Q9Z2W8 GRIA4 glutamate ionotropic receptor AMPA type subunit 4 1.758 A2AI21 GRIN1 glutamate ionotropic receptor NMDA type subunit 1 1.371 Q01097 GRIN2B glutamate ionotropic receptor NMDA type subunit 2B 1.200 Q3UVX5 GRM5 glutamate metabotropic receptor 5 1.245 P38060 HMGCL 3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA lyase 1.267 Q9JHR7 IDE insulin degrading enzyme 2.076 Q8CAQ8 IMMT inner membrane mitochondrial protein 1.259 Q9ERG0 LIMA1 LIM domain and actin binding 1 -1.211 Q8JZS0 LIN7A lin-7 homolog A, crumbs cell polarity complex component 1.265 A9DA50 LINGO1 leucine rich repeat and Ig domain containing 1 1.246 Q3UYG8 MACROD2 mono-ADP ribosylhydrolase 2 1.235 Q8BW75 MAOB monoamine oxidase B -1.254 P26645 Marcks myristoylated alanine rich protein kinase C substrate 1.202 Q99KE1 ME2 malic enzyme 2 1.206 P34884 MIF macrophage migration inhibitory factor 1.696 Q9D2P8 MOBP myelin-associated oligodendrocyte basic protein 1.506 Q3UY21 MOG myelin oligodendrocyte glycoprotein 1.590 P03930 mt-Atp8 ATP synthase F0 subunit 8 2.804 P00405 MT-CO2 cytochrome c oxidase subunit II -1.289 Q9Z2D1 MTMR2 myotubularin related protein 2 1.337 Q9CQ75 NDUFA2 NADH:ubiquinone oxidoreductase subunit A2 1.331 Q62425 NDUFA4 NDUFA4 mitochondrial complex associated 1.546 Q9DCJ5 NDUFA8 NADH:ubiquinone oxidoreductase subunit A8 1.359 A2AQ17 NDUFAF1 NADH:ubiquinone oxidoreductase complex assembly factor 1 1.265 A2APY7 NDUFAF5 NADH:ubiquinone oxidoreductase complex assembly factor 5 1.813 Q91VD9 NDUFS1 NADH:ubiquinone oxidoreductase core subunit S1 1.713 Q9DCT2 NDUFS3 NADH:ubiquinone oxidoreductase core subunit S3 1.368 P52503 NDUFS6 NADH:ubiquinone oxidoreductase subunit S6 1.487 Q9D6J6 NDUFV2 NADH:ubiquinone oxidoreductase core subunit V2 1.313 A2AGI2 NLGN3 neuroligin 3 1.260 P97300 Nptn neuroplastin 1.232 Q9CWD8 NUBPL nucleotide binding protein like 1.306 Q8CFX3 PCDH1 protocadherin 1 1.238 E9Q1A0 PDE4DIP phosphodiesterase 4D interacting protein -1.296 Q9JJV2 PFN2 profilin 2 58 2.173 P67778 PHB prohibitin 1.752 P60202 PLP1 proteolipid protein 1 1.226 Q99NF7 PPM1B protein phosphatase, Mg2+/Mn2+ dependent 1B -1.228 Q61171 PRDX2 peroxiredoxin 2 -1.307 Q9QUK9 PRSS3 serine protease 3 1.222 E9PZ00 PSAP prosaposin 1.215 Q9CZT8 RAB3B RAB3B, member of RAS oncogene family 1.300 P61226 RAP2B RAP2B, member of RAS oncogene family 1.251 E9Q401 RYR2 ryanodine receptor 2 -1.361 A0A0A0MQ90 S100A13 S100 calcium binding protein A13 1.375 Q91V61 SFXN3 sideroflexin 3 1.860 Q8BH59 SLC25A12 solute carrier family 25 member 12 1.591 P48962 SLC25A4 solute carrier family 25 member 4 1.214 Q9CQS4 SLC25A46 solute carrier family 25 member 46 1.329 P10852 SLC3A2 solute carrier family 3 member 2 -1.211 A3KGU7 SPTAN1 spectrin alpha, non-erythrocytic 1 1.204 P05480 SRC SRC proto-oncogene, non-receptor tyrosine kinase 1.209 Q99JB2 STOML2 stomatin like 2 1.236 P61264 STX1B syntaxin 1B 1.222 P63046 SULT4A1 sulfotransferase family 4A member 1 -1.209 Q9CUU3 SYCP2 synaptonemal complex protein 2 1.374 D3Z4L9 TNFAIP2 TNF alpha induced protein 2 1.630 D3Z2H9 Tpm3-rs7 tropomyosin 3, related sequence 7 1.249 Q91W90 TXNDC5 thioredoxin domain containing 5 -1.276 A0A0A6YXY0 TXNDC9 thioredoxin domain containing 9 1.223 O70481 UBR1 ubiquitin protein ligase E3 component nrecognin 1 -1.281 P61961 UFM1 ubiquitin fold modifier 1 1.928 Q9CQB4 UQCRB ubiquinol-cytochrome c reductase binding protein 1.687 Q9CZ13 UQCRC1 ubiquinol-cytochrome c reductase core protein 1 3.192 Q9CR68 UQCRFS1 ubiquinol-cytochrome c reductase, Rieske ironsulfur polypeptide 1 2.522 Q9CQ69 UQCRQ ubiquinol-cytochrome c reductase complex III subunit VII 1.762 Q60932 VDAC1 voltage dependent anion channel 1 2.043 Q60930 VDAC2 voltage dependent anion channel 2 -1.341 O09053 WRN Werner syndrome RecQ like helicase -1.240 Q810J8 ZFYVE1 zinc finger FYVE-type containing 1 59 Tabla 5. Proteínas afectadas en SNs de hipocampo de ratones Ts1Cje tratados con rapamicina (Ts1Cje RAPA), comparando con SNs WT sin tratar. Cambio de expresión (veces) ID Símbolo Gen 1.242 Q9CQR4 ACOT13 acyl-CoA thioesterase 13 1.281 P10518 ALAD aminolevulinate dehydratase 1.311 E9PYT0 ARHGAP5 Rho GTPase activating protein 5 -1.226 Q9ES28 ARHGEF7 Rho guanine nucleotide exchange factor 7 -1.207 Q91ZU0 ASB7 ankyrin repeat and SOCS box containing 7 1.350 Q8C0M9 ASRGL1 asparaginase like 1 -1.461 Q9D3D9 ATP5F1D ATP synthase F1 subunit delta 1.265 P56135 ATP5MF ATP synthase membrane subunit f 1.253 P51863 ATP6V0D1 ATPase H+ transporting V0 subunit d1 1.308 Q9Z0S1 BPNT1 3'(2'), 5'-bisphosphate nucleotidase 1 1.239 P00920 CA2 carbonic anhydrase 2 -1.222 A0A0A6YY67 CAMSAP2 calmodulin regulated spectrin associated protein family member 2 -1.206 D3YYT0 CDH2 cadherin 2 -1.267 O55229 CHKB choline kinase beta 1.928 P62897 CYCS cytochrome c, somatic -1.256 A2A8E2 CZIB CXXC motif containing zinc binding protein 1.225 E9QMK9 DGLUCY D-glutamate cyclase -1.245 Q6PGC1 DHX29 DExH-box helicase 29 1.311 O08749 DLD dihydrolipoamide dehydrogenase -1.341 Q9QYJ0 DNAJA2 DnaJ heat shock protein family (Hsp40) member A2 1.360 Q91WT4 DNAJC17 DnaJ heat shock protein family (Hsp40) member C17 1.484 P63168 DYNLL1 dynein light chain LC8-type 1 1.493 D6RIN4 DYNLL2 dynein light chain LC8-type 2 -1.203 Q8BGB7 ENOPH1 enolase-phosphatase 1 -1.206 Q05816 FABP5 fatty acid binding protein 5 1.229 A2RT62 FBXL16 F-box and leucine rich repeat protein 16 1.213 Q61578 FDXR ferredoxin reductase -1.293 Q9Z2I2 FKBP1B FKBP prolyl isomerase 1B 1.321 P45878 FKBP2 FKBP prolyl isomerase 2 1.341 Q8BFQ8 GATD1 glutamine amidotransferase like class 1 domain containing 1 -1.210 Q6DFZ1 GBF1 golgi brefeldin A resistant guanine nucleotide exchange factor 1 1.387 Q80Y14 GLRX5 glutaredoxin 5 -1.357 V9GXQ2 Gm17087 predicted gene 17087 1.207 E9PVN6 Gm20498 predicted gene 20498 -1.216 A2A9H6 Gm884 predicted gene 884 1.205 P62874 GNB1 G protein subunit beta 1 -1.319 P63213 GNG2 G protein subunit gamma 2 1.258 Q3ULJ0 GPD1L glycerol-3-phosphate dehydrogenase 1 like 1.203 Q68EF4 GRM4 glutamate metabotropic receptor 4 60 1.254 Q9D114 HDDC3 HD domain containing 3 1.439 Q8BGZ1 HPCAL4 hippocalcin like 4 1.281 P54071 IDH2 isocitrate dehydrogenase (NADP(+)) 2, mitochondrial 1.664 Q9QXM1 JMY junction mediating and regulatory protein, p53 cofactor -1.336 Q8CD76 KLC1 kinesin light chain 1 1.478 Q9CPR6 Krt88 keratin 88 1.453 Q9ERG0 LIMA1 LIM domain and actin binding 1 -1.268 Q8JZS0 LIN7A lin-7 homolog A, crumbs cell polarity complex component 1.373 Q3TMX5 MANF mesencephalic astrocyte derived neurotrophic factor 1.213 Q99KE1 ME2 malic enzyme 2 1.268 Q8BMF3 ME3 malic enzyme 3 1.323 P34884 MIF macrophage migration inhibitory factor 1.269 Q9D1P0 MRPL13 mitochondrial ribosomal protein L13 -1.292 Q9Z2D1 MTMR2 myotubularin related protein 2 1.220 P09405 NCL nucleolin -1.241 Q8BTG7 NDRG4 NDRG family member 4 1.317 A2AQ17 NDUFAF1 NADH:ubiquinone oxidoreductase complex assembly factor 1 1.257 Q9CWD8 NUBPL nucleotide binding protein like 1.275 E9Q1A0 PDE4DIP phosphodiesterase 4D interacting protein 1.214 P62962 PFN1 profilin 1 1.287 O35954 PITPNM1 phosphatidylinositol transfer protein membrane associated 1 1.581 A3KGF7 PLCB2 phospholipase C beta 2 1.237 P63330 PPP2CA protein phosphatase 2 catalytic subunit alpha 1.416 E9PZ00 PSAP prosaposin 1.304 Q9CZT8 RAB3B RAB3B, member RAS oncogene family 1.304 A2AC13 RAC3 Rac family small GTPase 3 -1.245 Q99N57 RAF1 Raf-1 proto-oncogene, serine/threonine kinase 1.237 Q6QI06 RICTOR RPTOR independent companion of MTOR complex 2 1.257 P62830 RPL23 ribosomal protein L23 1.287 Q924D0 RTN4IP1 reticulon 4 interacting protein 1 1.220 P70275 SEMA3E semaphorin 3E 1.233 P28661 SEPT4 septin 4 -1.230 E9Q4B1 SPERT spermatid associated -1.206 Q9CUU3 SYCP2 synaptonemal complex protein 2 1.238 A2A690 TANC2 tetratricopeptide repeat, ankyrin repeat and coiled-coil containing 2 -1.271 P01831 THY1 Thy-1 cell surface antigen 1.525 D3Z4L9 TNFAIP2 TNF alpha induced protein 2 1.462 D3Z2H9 Tpm3-rs7 tropomyosin 3, related sequence 7 -1.226 Q9D6E4 TTC9B tetratricopeptide repeat domain 9B -1.240 P68372 TUBB4B tubulin beta 4B class IVb 1.273 Q91W90 TXNDC5 thioredoxin domain containing 5 -1.279 P61079 UBE2D3 ubiquitin conjugating enzyme E2 D3 1.232 O70481 UBR1 ubiquitin protein ligase E3 component nrecognin 1 61 1.204 Q4FE56 USP9X ubiquitin specific peptidase 9 X-linked 1.227 Q8CCB4 VPS53 VPS53 subunit of GARP complex 1.288 Q5SXA9 WWC1 WW and C2 domain containing 1 -1.202 F8VQ87 XRN1 5'-3' exoribonuclease 1 -1.207 P62960 YBX1 Y-box binding protein 1 -1.308 Q810J8 ZFYVE1 zinc finger FYVE-type containing 1 Tabla 6. Proteínas afectadas en SNs de hipocampo de ratones WT tratados con rapamicina (WT RAPA), comparando con SNs WT sin tratar. Cambio de expresión (veces) ID Símbolo Gen 1.240 P61922 ABAT 4-aminobutyrate aminotransferase 1.267 Q6PE15 ABHD10 abhydrolase domain containing 10 1.323 Q9CQR4 ACOT13 acyl-CoA thioesterase 13 1.210 P51830 ADCY9 adenylate cyclase 9 1.381 P10518 ALAD aminolevulinate dehydratase 1.245 Q9CZS1 ALDH1B1 aldehyde dehydrogenase 1 family member B1 1.252 P47738 ALDH2 aldehyde dehydrogenase 2 family member -1.311 E9Q414 APOB apolipoprotein B -1.321 Q9ES28 ARHGEF7 Rho guanine nucleotide exchange factor 7 -1.204 Q91ZU0 ASB7 ankyrin repeat and SOCS box containing 7 1.205 Q8C0M9 ASRGL1 asparaginase like 1 -1.233 Q9D906 ATG7 autophagy related 7 1.203 P56480 ATP5F1B ATP synthase F1 subunit beta -1.209 Q9D3D9 ATP5F1D ATP synthase F1 subunit delta 1.239 P97450 ATP5PF ATP synthase peripheral stalk subunit F6 1.254 P51863 ATP6V0D1 ATPase H+ transporting V0 subunit d1 -1.218 Q9Z1G3 ATP6V1C1 ATPase H+ transporting V1 subunit C1 1.286 Q9Z0S1 BPNT1 3'(2'), 5'-bisphosphate nucleotidase 1 -1.311 Q2MH31 C9orf24 chromosome 9 open reading frame 24 1.291 P00920 CA2 carbonic anhydrase 2 1.216 Q8K1Z0 COQ9 coenzyme Q9 -1.351 P63040 CPLX1 complexin 1 1.312 Q9CZU6 CS citrate synthase 1.814 P62897 CYCS cytochrome c, somatic 1.220 Q99LB2 DHRS4 dehydrogenase/reductase 4 -1.244 Q6PGC1 DHX29 DExH-box helicase 29 1.477 O08749 DLD dihydrolipoamide dehydrogenase -1.310 Q9QYJ0 DNAJA2 DnaJ heat shock protein family (Hsp40) member A2 1.260 Q91WT4 DNAJC17 DnaJ heat shock protein family (Hsp40) member C17 1.309 P63168 DYNLL1 dynein light chain LC8-type 1 1.388 D6RIN4 DYNLL2 dynein light chain LC8-type 2 62 -1.262 Q05816 FABP5 fatty acid binding protein 5 1.222 Q8R0F8 FAHD1 fumarylacetoacetate hydrolase domain containing 1 -1.308 Q9D9R9 Fam186a family with sequence similarity 186, member A 1.314 Q80UW2 FBXO2 F-box protein 2 -1.238 Q8CIB5 FERMT2 fermitin family member 2 -1.284 Q9Z2I2 FKBP1B FKBP prolyl isomerase 1B 1.353 P45878 FKBP2 FKBP prolyl isomerase 2 1.368 Q9WV18 GABBR1 gamma-aminobutyric acid type B receptor subunit 1 1.317 P56476 GABRR2 gamma-aminobutyric acid type A receptor rho2 subunit 1.329 Q8BFQ8 GATD1 glutamine amidotransferase like class 1 domain containing 1 -1.206 Q6DFZ1 GBF1 golgi brefeldin A resistant guanine nucleotide exchange factor 1 -1.249 Q01514 GBP3 guanylate binding protein 3 -1.232 Q9QUH0 GLRX glutaredoxin 1.282 Q80Y14 GLRX5 glutaredoxin 5 -1.332 V9GXQ2 Gm17087 predicted gene 17087 -1.251 W4VSN7 Gm3550 ribosomal protein L29 pseudogene -1.242 A2A9H6 Gm884 predicted gene 884 -1.258 Q9CQI3 GMFB glia maturation factor beta -1.404 P63213 GNG2 G protein subunit gamma 2 1.254 P05202 GOT2 glutamic-oxaloacetic transaminase 2 1.234 Q3ULJ0 GPD1L glycerol-3-phosphate dehydrogenase 1 like -1.300 Q8BUV3 GPHN gephyrin -1.222 P39087 GRIK2 glutamate ionotropic receptor kainate type subunit 2 1.503 B1AS29 GRIK3 glutamate ionotropic receptor kainate type subunit 3 1.221 Q68EF4 GRM4 glutamate metabotropic receptor 4 1.320 Q80WM4 HAPLN4 hyaluronan and proteoglycan link protein 4 1.255 Q6PAV2 HERC4 HECT and RLD domain containing E3 ubiquitin protein ligase 4 -1.270 Q8CGP4 Hist1h2aa histone cluster 1, H2aa 1.361 P38060 HMGCL 3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA lyase -1.202 Q5EBP8 Hnrnpa1 heterogeneous nuclear ribonucleoprotein A1 1.635 Q8BGZ1 HPCAL4 hippocalcin like 4 1.205 Q8BIJ6 IARS2 isoleucyl-tRNA synthetase 2, mitochondrial 1.286 P54071 IDH2 isocitrate dehydrogenase (NADP(+)) 2, mitochondrial 1.221 Q9D6R2 IDH3A isocitrate dehydrogenase 3 (NAD(+)) alpha -1.339 Q8CD76 KLC1 kinesin light chain 1 1.301 Q9CPR6 Krt88 keratin 88 -1.217 Q8BN59 LARP6 La ribonucleoprotein domain family member 6 -1.260 Q8JZS0 LIN7A lin-7 homolog A, crumbs cell polarity complex component 1.217 Q3TMX5 MANF mesencephalic astrocyte derived neurotrophic factor 63 -1.311 D3YYK8 Mapre2 microtubule-associated protein, RP/EB family, member 2 1.276 Q99KE1 ME2 malic enzyme 2 1.223 Q8BMF3 ME3 malic enzyme 3 1.338 P34884 MIF macrophage migration inhibitory factor 1.213 Q3UW66 MPST mercaptopyruvate sulfurtransferase 1.240 Q9D1P0 MRPL13 mitochondrial ribosomal protein L13 -1.213 Q9Z2D1 MTMR2 myotubularin related protein 2 -1.241 Q3UHD3 MTUS2 microtubule associated scaffold protein 2 1.210 P09405 NCL nucleolin 1.277 Q62433 NDRG1 N-myc downstream regulated 1 -1.263 Q8BTG7 NDRG4 NDRG family member 4 1.244 Q8CEC5 NKIRAS1 NFKB inhibitor interacting Ras like 1 -1.303 Q99K48 NONO non-POU domain containing octamer binding 1.244 A2A9Q2 NRDC nardilysin convertase 1.210 Q3UHB1 NT5DC3 5'-nucleotidase domain containing 3 1.323 E9Q1A0 PDE4DIP phosphodiesterase 4D interacting protein 1.219 Q9D051 PDHB pyruvate dehydrogenase E1 beta subunit 1.495 A3KGF7 PLCB2 phospholipase C beta 2 1.227 Q543K9 PNP purine nucleoside phosphorylase -1.369 Q8K1L5 PPP1R11 protein phosphatase 1 regulatory inhibitor subunit 11 1.278 P63330 PPP2CA protein phosphatase 2 catalytic subunit alpha 1.381 P20108 PRDX3 peroxiredoxin 3 -1.202 P16054 PRKCE protein kinase C epsilon 1.225 Q9QUK9 PRSS3 serine protease 3 1.306 E9PZ00 PSAP prosaposin 1.235 Q9CZT8 RAB3B RAB3B, member RAS oncogene family -1.286 Q99N57 RAF1 Raf-1 proto-oncogene, serine/threonine kinase 1.234 Q91ZZ2 RAPGEF1 Rap guanine nucleotide exchange factor 1 -1.230 D9HP81 RIMS2 regulating synaptic membrane exocytosis 2 -1.508 P70335 ROCK1 Rho associated coiled-coil containing protein kinase 1 -1.314 P62281 RPS11 ribosomal protein S11 -1.201 Q9ES97 RTN3 reticulon 3 1.394 Q924D0 RTN4IP1 reticulon 4 interacting protein 1 -1.226 O08576 RUNDC3A RUN domain containing 3A -1.216 Q99J08 SEC14L2 SEC14 like lipid binding 2 1.237 A2AQE2 SECISBP2L SECIS binding protein 2 like 1.376 P28661 SEPT4 septin 4 -1.230 Q8BJU0 SGTA small glutamine rich tetratricopeptide repeat containing alpha 1.222 Q9CZN7 SHMT2 serine hydroxymethyltransferase 2 1.267 P09671 SOD2 superoxide dismutase 2 -1.238 Q52KF3 SPIRE1 spire type actin nucleation factor 1 1.279 P63046 SULT4A1 sulfotransferase family 4A member 1 -1.235 Q9CUU3 SYCP2 synaptonemal complex protein 2 1.208 Q920N7 SYT12 synaptotagmin 12 -1.286 Q3UH45 TECPR2 tectonin beta-propeller repeat containing 2 -1.209 P01831 THY1 Thy-1 cell surface antigen 64 1.207 P62075 TIMM13 translocase of inner mitochondrial membrane 13 1.586 D3Z2H9 Tpm3-rs7 tropomyosin 3, related sequence 7 -1.216 Q7TMM9 TUBB2A tubulin beta 2A class IIa -1.268 P68372 TUBB4B tubulin beta 4B class IVb -1.200 Q9CQM5 TXNDC17 thioredoxin domain containing 17 1.416 Q91W90 TXNDC5 thioredoxin domain containing 5 -1.312 P61079 UBE2D3 ubiquitin conjugating enzyme E2 D3 1.210 O70481 UBR1 ubiquitin protein ligase E3 component nrecognin 1 -1.290 Q8K0T7 UNC13C unc-13 homolog C 1.209 Q4FE56 USP9X ubiquitin specific peptidase 9 X-linked -1.235 Q6PEV3 WIPF2 WAS/WASL interacting protein family member 2 -1.203 P0C7L0 WIPF3 WAS/WASL interacting protein family member 3 1.262 Q5SXA9 WWC1 WW and C2 domain containing 1 -1.295 Q810J8 ZFYVE1 zinc finger FYVE-type containing 1 Al representar los datos mediante diagrama de Venn (Fig. 14), se pudo observar que existían 58 proteínas afectadas de forma similar en SNs WT RAPA y Ts1Cje RAPA (Tabla S5, Archivo Suplementario 2), lo que sugería que la alteración de los niveles de esas proteínas estaba vinculado al tratamiento con rapamicina, independientemente del genotipo. Figura 14. Diagrama de Venn de las proteínas desreguladas en SNs de hipocampo de ratones Ts1Cje y ratones Ts1Cje y WT tratados con rapamicina. Se muestra el número de proteínas solapantes entre los diferentes grupos experimentales. 71 72 73 74 Como resultado de este tratamiento, se observó una drástica reducción del fEPSP tras los 5 min de tratamiento con DHPG (Fig. 18), siendo de mayor magnitud en el caso Ts1Cje que en los ratones silvestres (Ts1Cje: 21,96% +/-4,16%; WT: 38,69% +/-3,95% de la línea base). Por otra parte, se observó el establecimiento de una LTD, al menos durante 1 hora tras el inicio del tratamiento, que fue mayor en los ratones Ts1Cje que en los ratones silvestres (Ts1Cje: 59,12% +/-4,92%; WT: 82,12% +/-8,31% de la línea base, a los 60 min tras la aplicación de DHPG). De estos resultados se puede concluir que la mGluR-LTD en la región CA1 del hipocampo está incrementada en los ratones Ts1Cje. Figura 18. mGluR-LTD en rodajas de hipocampo WT y Ts1Cje. (A) Curso temporal de los efectos del DHPG sobre los potenciales post-sinápticos excitatorios de campo (fEPSP) en ratones WT y Ts1Cje. En la parte superior se muestran registros representativos de un fEPSP antes (1,2) y después (1’, 2’) de la aplicación del DHPG en ratones WT (1, 1’) y en ratones Ts1Cje (2, 2’). (B) Cuantificación de los efectos mostrados en el panel A. Las barras de error representan el error estándar de la media (SEM). Se indica el número de rodajas analizadas para cada condición, en la barra correspondiente (WT: 8 rodajas obtenidas de 4 ratones; Ts1Cje: 7 rodajas obtenidas de 3 ratones). P = 0,039 (t-test de Student). 4.3. Análisis de la densidad y morfología de espinas dendríticas en el hipocampo del ratón Ts1Cje y efecto de la rapamicina. Estudios previos demuestran una relación entre la mGluR-LTD y la contracción y eliminación de espinas dendríticas (Zhou et al., 2004; Ramiro-Cortés and Israely, 2013). A B 75 Por otra parte, se han descrito alteraciones de las espinas dendríticas en distintos modelos murinos de SD, incluido el ratón Ts1Cje, así como en muestras post-mortem de personas con SD (Benavides-Piccione et al., 2004; Belichenko et al., 2004; 2007). Por ello, mediante tinción de Golgi, se decidió verificar la densidad de las espinas dendríticas en el hipocampo del ratón Ts1Cje, así como evaluar el efecto de la rapamicina, administrada prenatalmente, en la densidad de espinas dendríticas. Como se indicó en el apartado Materiales y Métodos, se administró una única inyección intraperitoneal de rapamicina a hembras gestantes entre los días E15 y E17, y se analizaron las dendritas secundarias de neuronas piramidales de la región stratum radiatum de la CA1 del hipocampo de su progenie a día P18. Como control se utilizaron ratones WT y Ts1Cje P18 nacidos de hembras que no habían sido tratadas con rapamicina. Al analizar los resultados de la tinción de Golgi, se observó una reducción de la densidad de espinas dendríticas en el ratón Ts1Cje respecto al silvestre (Ts1Cje: 0,523 +/- 0,035 espinas/µm, n = 26; WT: 0,640 +/- 0,031 espinas/µm, n = 50; P = 0,015, t-test de Student). Sin embargo, en ratones Ts1Cje tratados prenatalmente con rapamicina no se observaron cambios estadísticamente significativos que permitieran determinar un efecto de la rapamicina sobre este aspecto de la morfología de las neuronas, ni en ratones trisómicos ni en silvestres (Ts1Cje RAPA: 0,572 +/- 0,021 espinas/µm, n = 31; WT RAPA: 0,666 +/- 0,029 espinas/µm, n = 27). Considerando la relación, ya descrita, entre el tamaño de las espinas y la susceptibilidad a la LTD dependiente de mGluR, que asocia espinas de gran tamaño que contienen retículo endoplásmico con esta forma específica de plasticidad (Holbro et al., 2009), se decidió analizar las características morfológicas de las espinas presentes en las dendritas secundarias de la región stratum radiatum de la CA1 del hipocampo. Para ello se llevó a cabo una caracterización cualitativa de la morfología estableciendo tres tipos de espina en base a su forma: “mushroom”, “stubby” y filopodios. Las espinas mushroom son de mediana longitud, presentan una cabeza de mayor tamaño que su cuello, y constituyen el grupo de las espinas maduras. Las espinas “stubby” son de longitud corta-mediana, con una cabeza de un tamaño similar al cuello. Estas espinas presentan actividad eléctrica y morfología intermedia entre “mushroom” y filopodio. Por último, los filopodios son espinas inmaduras, por lo general de mayor longitud que los 76 otros dos tipos, y más delgadas, con un diámetro uniforme en su recorrido no pudiéndose definir una cabeza de la espina en este caso. Como se muestra en la Tabla 9, no se observaron diferencias significativas en la proporción de los distintos tipos de espinas entre el ratón Ts1Cje y el silvestre. Sin embargo, en los ratones tratados prenatalmente con rapamicina se observó una tendencia hacia un incremento en la proporción de espinas inmaduras (filopodios) para ambos genotipos (Tabla 9), con un valor P = 0,0629 al comparar WT vs. WT RAPA, y P = 0,0672 en la comparación de Ts1Cje vs. Ts1Cje RAPA (test Z-score con dos colas). Tabla 9. Comparación de los porcentajes de filopodios, espinas stubby y mushroom en las dendritas secundarias de neuronas de la región apical del stratum radiatum en ratones WT y Ts1Cje sin tratar y tratados prenatalmente con rapamicina (RAPA). El número de ratones usados por condición fue 2, excepto en el caso WT RAPA (un único animal). El número total (n) de espinas analizadas en cada grupo experimental se indica entre paréntesis. Morfología de las espinas WT (n = 248) Ts1Cje (n = 151) WT RAPA (n = 143) Ts1Cje RAPA (n= 635) Filopodios 14.9 13.2 22.4 19.7 Stubby 27.8 29.8 25.2 26.5 Mushroom 57.3 57.0 52.4 53.9 Puesto que las espinas susceptibles de sufrir mGluR-LTD se caracterizan por tener mayor diámetro (Holbro et al., 2009), se llevó a cabo una determinación del diámetro de la cabeza de las espinas de tipo “mushroom”. Al representar la distribución por tamaño, se observaron evidentes variaciones entre espinas Ts1Cje y silvestres. Como se muestra en la Fig. 19, la proporción de espinas “mushroom” de diámetro 0,5-0,7 m era menor en el ratón Ts1Cje que en el ratón WT (Ts1Cje: 9,3%; WT: 22,5%; P = 0,011, Z-test para la comparación de proporciones entre dos poblaciones), mientras que en el rango 0,7-0,9 m, el ratón Ts1Cje presentaba un porcentaje de espinas mayor que el WT (Ts1Cje: 52,3%; WT: 38,7%; P = 0,045, Z-test). 77 De manera interesante, se observó que en ratones Ts1Cje tratados prenatalmente con rapamicina (Ts1Cje RAPA), la distribución de espinas tipo “mushroom” atendiendo al criterio de diámetro de la cabeza de la espina era similar a la distribución WT (Fig. 19), y de hecho, al comparar los porcentajes de espinas “mushroom” de diámetro 0,5-0,7 m y 0,7-0,9 m entre ratones Ts1Cje RAPA y Ts1Cje, se obtuvieron valores estadísticamente significativos (diámetro 0,5-0,7 m: Ts1Cje RAPA = 28,4%; Ts1Cje = 9,3%; P = 0,001, Z-test; diámetro 0,7-0,9 m: Ts1Cje RAPA = 33,9%; Ts1Cje = 52,3%; P = 0,002, Z-test). Estos resultados sugieren que el tratamiento prenatal con rapamicina restaura la morfología de este tipo de espinas dendríticas en los ratones Ts1Cje. Figura 19. Distribución del porcentaje de espinas “mushroom” agrupadas por diámetro de la cabeza en ratones WT y Ts1Cje sin tratar, o tratados prenatalmente con rapamicina (RAPA). (A) Imágenes representativas de la tinción de Golgi para cada grupo experimental; se muestra una amplificación de una espina de tipo “mushroom”. (B) Distribución de las espinas 78 “mushroom” agrupadas por diámetro de la cabeza. El centro del primer y último bin en el histograma se fijó automáticamente por el programa estadístico empleado (GraphPad Prism), y se estableció una anchura de bin de 0,2 m. Se indican con asteriscos las diferencias estadísticamente significativas. 4.4. Análisis de la mGluR-LTD Gp I en el ratón Ts1Cje tratado prenatalmente con rapamicina. Puesto que el tratamiento prenatal con rapamicina normalizó la distribución de tamaños de espinas “mushroom” en los ratones Ts1Cje, se procedió a evaluar el efecto de dicho tratamiento en la mGluR-LTD Gp I. Para ello se administró intraperitonealmente una única inyección de rapamicina a hembras gestantes (véase Materiales y Métodos) y se caracterizó la actividad electrofisiológica de la región stratum radiatum de la CA1 en las crías a P21-P30. Como se observa en la Fig. 20 este tratamiento redujo la LTD exagerada del ratón Ts1Cje, pasando a mostrar valores próximos al WT (91,55% +/-5,23% de la línea base, a los 60 min de la aplicación de DHPG). Figura 20. mGluR-LTD en rodajas de hipocampo de ratón Ts1Cje tratado prenatalmente con rapamicina. (A) Curso temporal de los efectos del DHPG sobre los potenciales postsinápticos excitatorios de campo (fEPSP) en ratones Ts1Cje tratados con rapamicina (Ts1Cje RAPA) y Ts1Cje control (mismos datos que la Fig. 16). En la parte superior se muestran registros representativos de un fEPSP antes (1,2) y después (1’, 2’) de la aplicación del DHPG en ratones A B 79 Ts1Cje (1, 1’; mismos datos que la Fig. 16) y en ratones Ts1Cje RAPA (2, 2’). (B) Cuantificación de los efectos mostrados en el panel A. Las barras de error representan el error estándar de la media (SEM). Se indica el número de rodajas analizadas para cada condición, en la barra correspondiente (Ts1Cje: 7 rodajas obtenidas de 3 ratones; Ts1Cje RAPA: 7 rodajas obtenidas de 4 ratones). P < 0,001 (t-test de Student). En el caso de ratones WT tratados prenatalmente con rapamicina de forma similar, se observó que la mGluR-LTD quedaba abolida (Fig. 20), mostrando un valor 110,35% +/-4,32% de la línea base a los 60 min de la aplicación de DHPG. Figura 21. mGluR-LTD en rodajas de hipocampo de ratón silvestre tratado prenatalmente con rapamicina. (A) Curso temporal de los efectos del DHPG sobre los fEPSP en ratones silvestres tratados con rapamicina (WT RAPA) y silvestres controles (WT; mismos datos que la Fig. 16). En la parte superior se muestran registros representativos de un fEPSP antes (1,2) y después (1’, 2’) de la aplicación del DHPG en ratones silvestres (1, 1’; mismos datos que la Fig. 16) y en ratones silvestres tratados con rapamicina (2, 2’). (B) Cuantificación de los efectos mostrados en el panel A. Las barras de error representan el error estándar de la media (SEM). Se indica el número de rodajas analizadas para cada condición, en la barra correspondiente (WT: 8 rodajas obtenidas de 4 ratones; WT RAPA: 6 rodajas obtenidas de 3 ratones). P < 0,05 (t-test de Student). De forma interesante, al comparar los resultados obtenidos en los cuatro grupos experimentales (Fig. 22) se observó que la rapamicina no tenía un efecto importante sobre la depresión del fEPSP observada justo tras la aplicación de DHPG (medido a los 5 min de su aplicación) en los ratones trisómicos. Por tanto, se pudo concluir que, aunque la rapamicina tiene un efecto restaurador sobre la mGluR-LTD en los ratones Ts1Cje A B 80 (medida a los 60 min de la aplicación de DHPG), no recupera la depresión inicial exagerada del fEPSP. Figura 22. Efecto del DHPG en el fEPSP tras 5 minutos de aplicación del tratamiento. Valores de la pendiente de la curva inicial del fEPSP medidos a los 5 minutos del inicio del tratamiento con DHPG, normalizados con respecto al valor medio de la línea base (100%), para los ratones WT (32,94%), Ts1Cje (23,87%), silvestres tratados con rapamicina (53,95%) y ratones Ts1Cje tratados con rapamicina (32,94%). Las barras de error representan el error estándar de la media (SEM). P < 0,05 (t-test de Student). 4.5. Evaluación de los niveles de mTORC2 en el hipocampo de ratones Ts1Cje. Dada la relevancia del complejo mTORC2 en la mGluR-LTD Gp I (Zhu et al., 2018), se decidió evaluar los niveles basales de este complejo en el hipocampo de ratones Ts1Cje, así como el efecto de la aplicación de DHPG. Para ello se cuantificaron los niveles de RICTOR (Rapamycin-insensitive companion of mammalian target of rapamycin), una proteína exclusiva del complejo mTORC2, mediante WB en rodajas de hipocampo WT o Ts1Cje (P21-P30), tratadas o no con DHPG 100µM durante 5 min. En este último caso, la expresión de RICTOR se evaluó tras 60 min desde la aplicación del DHPG. Los resultados obtenidos (Fig. 23) permitieron concluir que los niveles basales de RICTOR estaban reducidos en el ratón Ts1Cje respecto al silvestre, pero se incrementaban al tratar con DHPG, mientras que ocurría lo contrario en el WT, es decir, A 87 disponibilidad de receptores de glutamato en el terminal postsináptico (Siman et al., 1985), incluyendo los NMDAR (Wechsler y Teichberg, 1998), y se ha vinculado al inicio de la LTP en neuronas de hipocampo (Lynch y Baudry, 1984). Considerando esto, los niveles reducidos de fodrina observados en los SNs del ratón Ts1Cje podrían estar asociados a un estado basal potenciado de la sinapsis, y a la mayor presencia de NMDARs en los SNs de este ratón modelo. Además, dada su vinculación con la regulación del citoesqueleto, también podría estar implicada en las alteraciones de la morfología de las espinas descritas en esta Tesis Doctoral. En los siguientes apartados se abordarán los resultados proteómicos en el contexto del incremento de la mGluR-LTD y la alteración de la morfología de espinas en el hipocampo del ratón Ts1Cje. 5.2. Alteraciones de la mGluR-LTD en el hipocampo del ratón Ts1Cje. Los resultados mostrados en este trabajo ponen de evidencia un incremento de la LTD inducida mediante DHPG en la sinapsis de las fibras colaterales de Schaffer con las neuronas piramidales de la región CA1 del hipocampo del ratón Ts1Cje. Si bien esta forma de plasticidad no parece estar alterada en el modelo más ampliamente estudiado de SD, el ratón Ts65Dn (Scott-Mckean y Costa, 2011), existen diferencias importantes a nivel genómico entre dicho modelo y el ratón Ts1Cje que podrían explicar esta aparente contradicción. Así, los ratones Ts65Dn presentan en trisomía una región adicional del MMU16 que no es ortóloga al HSA21, por lo que dicho modelo contiene genes adicionales en trisomía que no están relacionados con el SD (Duchon et al., 2011). Por otra parte, el estudio de Scott-Mckean y Costa (Scott-Mckean y Costa, 2011) utiliza animales en un rango de edad (6-8 meses) muy diferente al empleado en este trabajo (P2130). Puesto que los mecanismos moleculares y celulares de la mGluR-LTD parecen estar muy regulados durante el desarrollo (Tabla 3) (Moult et al., 2008), esta diferencia de edad podría ser especialmente importante a la hora de explicar las discrepancias observadas. Considerando la relación establecida entre la LTD y algunos test de comportamiento como son el reconocimiento espacial de objetos y el reconocimiento de objetos nuevos (Goh et al, 2013; Lüscher and Huber, 2010), la alteración de la mGluRLTD Gp I en el hipocampo del ratón Ts1Cje que hemos demostrado podría ser relevante 88 en relación a lo observado en un estudio previo de nuestro laboratorio, en el que se detectó un déficit en el reconocimiento de objetos nuevos en los ratones Ts1Cje (Dra. Itziar Benito, datos sin publicar). En cuanto a los mecanismos moleculares que podrían ser responsables del fenotipo observado, como se indicó en la Introducción, FMRP es especialmente importante para la mGluR-LTD. Así, en ratones knockout del gen FMR1, que codifica FMRP y sirven como modelo del síndrome del X Frágil, se ha descrito previamente un incremento de la mGluR-LTD (Huber et al., 2002) similar al encontrado en el hipocampo Ts1Cje en esta Tesis Doctoral. Paradójicamente nuestro grupo detectó un ligero aumento en los niveles de proteína FMRP en dendritas de neuronas de hipocampo en cultivo (analizado por inmunofluorescencia) y en muestras de hipocampo (analizadas mediante WB) de los ratones Ts1Cje (resultados obtenidos por el Dr. Juan José Casañas). Por tanto, el mecanismo implicado en este caso debe ser diferente. En ese sentido, resulta especialmente relevante el aumento de los niveles del receptor mGluR5 (indicado como GRM5 en la Tabla 4), que está directamente asociado a esta forma de plasticidad, y cuya expresión también se ha observado incrementada en la corteza cerebral de personas con síndrome de Down (Oka y Takashima 1999). El análisis proteómico también predice un incremento en la vía de señalización por calcio que (aunque con cierta controversia) ha sido asociada a la actividad de los mGluR Gp I (Chakroborty et al., 2012; Kumar y Foster, 2007; Holbro et al., 2009). En este contexto es de particular interés el aumento de los niveles del receptor de rianodina 2 (RyR2) observado en SNs Ts1Cje. Los RyR2 son canales de calcio particularmente abundantes en el aparato de la espina (Sharp et al., 1993), una especialización del retículo endoplásmico (ER) formada por discos membranosos apilados, con un papel importante en traducción local y señalización por calcio (Jedlicka et al., 2008; Segal y Korkotian, 2014). Se ha descrito que la inhibición de RyR2 produce que el tratamiento con DHPG induzca potenciación de la sinapsis en lugar de depresión (Chakroborty et al., 2012), lo cual sugiere un importante papel de estos receptores en la depresión asociada a la activación de los mGluR Gp I, así como la participación de los reservorios intracelulares de calcio en esta forma de plasticidad. En relación a los niveles elevados de RYR2 observados en el análisis proteómico, se ha descrito que el BDNF induce la expresión de RYR2 en el hipocampo y que este receptor es necesario para el agrandamiento de las espinas dendríticas inducido por BDNF (Adasme et al., 2011). Como se ha mencionado 89 previamente, nuestro grupo describió niveles elevados de BDNF en el hipocampo del ratón Ts1Cje (Troca-Marín et al., 2011), lo que podría estar relacionado con el incremento de los niveles de RYR2 y con la alteración en el tamaño de las espinas observados en el ratón Ts1Cje. Otra proteína que puede resultar de interés en relación con los RYR2 es FKBP1B. Esta proteína presenta niveles reducidos en los SNs del ratón Ts1Cje. Se ha descrito que FKBP1B, también llamado FKBP12.6 o calstabina2, interacciona con los RYR2 en estado cerrado y los estabiliza, por lo que actúa como bloqueador de estos canales, inhibiendo la liberación del Ca++ al citosol (Liu et al., 2012; Gant et al., 2011). Niveles reducidos de FKBP1B podrían, por tanto, favorecer la liberación de Ca++ al citosol, contribuyendo al incremento de la mGluR-LTD. Además, la ausencia de FKBP1B se ha asociado con un aumento de la expresión de mTOR y RYR2 en el hipocampo (Gant et al., 2011). Resulta interesante que la rapamicina se una a FKBP1B y lo desplace de los RYR2 incrementando la liberación de Ca++ desde el aparato de la espina (Gant et al., 2011). En este sentido, los niveles reducidos de FKBP1B podrían estar asociados a los niveles elevados de RYR2 observados en los SNs del ratón Ts1Cje. De manera peculiar, rapamicina normaliza los niveles de RYR2, aunque mantiene reducidos los niveles de FKBP1B. En la mGluR-LTD Gp I, la depresión de la respuesta sináptica está asociada a una reducción de receptores AMPA en la sinapsis. No obstante, en algunas áreas del cerebro esta depresión está asociada al intercambio de los receptores de AMPA de alta conductancia al calcio, que no contienen la subunidad GluA2, por receptores de AMPA que contienen la subunidad GluA2, lo que confiere una conductancia al calcio reducida (Pick and Ziff, 2018). En este sentido, resulta interesante el incremento de GluA2 identificado en el análisis proteómico de SNs Ts1Cje (Tabla 4). Además, se ha demostrado un papel de RyR2 en el tráfico de la subunidad GluA2 desde el ER a la membrana sináptica, en un proceso dependiente de calcio (Pick et al., 2017). De igual modo, RAP2B también se ha descrito que participa en la endocitosis de los AMPAR a través de JNK (Zhu et al., 2002; Zhu et al., 2005), y contribuye a la depresión sináptica (Zhang et al., 2018). Ambas, RYR2 y RAP2B, presentan niveles elevados en los SNs del ratón Ts1Cje y se normalizan al ser tratados con rapamicina. 90 No obstante, conviene tener en cuenta que el análisis proteómico realizado en este trabajo de Tesis Doctoral se llevó a cabo a partir de SNs procedentes de animales adultos, mientras que los estudios electrofisiológicos se realizaron en rodajas de hipocampo de animales P21-P30, por lo que las correlaciones indicadas deben tomarse con la debida precaución. 5.3. Alteraciones de la morfología de las espinas dendríticas en el hipocampo del ratón Ts1Cje. En el análisis de la morfología de las espinas dendríticas se observó una distribución anómala del tamaño de las espinas de tipo “mushroom” en el hipocampo Ts1Cje, consistente en una mayor proporción de espinas de diámetro comprendido entre 0,7 y 0,9 µm. Se ha descrito una correlación entre espinas de mayor tamaño y la presencia de ER y aparato de la espina (Spacek, 1985; Edwards, 1995; Spacek y Harris 1997; Holbro et al., 2009), y de hecho se ha demostrado que las espinas susceptibles de sufrir mGluR-LTD en la región CA1 del hipocampo constituyen una subpoblación de espinas con cabeza grande que contiene ER y aparato de la espina, mientras que las espinas sin ER son refractarias a la mGluR-LTD (Holbro et al., 2009). Por tanto, resulta tentador proponer que el desequilibrio observado en el hipocampo Ts1Cje hacia espinas de mayor tamaño esté vinculado al incremento de la mGluR-LTD. Si esta hipótesis fuera cierta, los niveles aumentados observados en el análisis proteómico de RyR2 y SERCA2, que son proteínas asociadas al ER y al aparato de la espina (Sharp et al., 1993; Majewska et al., 2000; Sabatini et al., 2002; Segal y Korkotian, 2014), así como de otras proteínas implicadas en la señalización por calcio (GluA2, GluA4, GluN1, GluN2B y Ca++ ATPasas) y de otros receptores glutamatérgicos relevantes para la mGluR-LTD, como mGluR5, podrían ser una consecuencia de la mayor proporción de espinas tipo “mushroom” de gran tamaño, que contienen ER y aparato de la espina (Fig. 24). En relación a este incremento de las espinas de mayor tamaño, resulta interesante la desregulación del BDNF descrita en el ratón Ts1Cje por nuestro grupo (Troca-Marín et al., 2011). Como se ha mencionado previamente en relación a los RYR2, el BDNF produce agrandamiento de la espina dendrítica en un proceso dependiente de traducción de proteínas (Tanaka et al., 2008; Adasme et al., 2011). Por tanto, la sobreexpresión de BDNF descrita en el ratón Ts1Cje podría estar relacionada con el incremento en el tamaño 91 de las espinas que se describe en esta Tesis Doctoral. En este sentido, resultan también interesantes los niveles desregulados de proteínas como PFN2, Marcks o DOCK3 observados en los SNs de hipocampo del ratón Ts1Cje. Profilina-II (PFN2) se expresa fundamentalmente en el cerebro (Witke et al., 2001). Esta proteína juega un papel en la polimerización de actina y en la estabilización de los filamentos de actina (Ethell y Pasquale, 2005). En neuronas de hipocampo, la acumulación de Profilina-II es inducida por la activación de los NMDAR y produce la estabilización de la morfología de la espina madura (Ackermann y Matus, 2003). El mantenimiento de esta acumulación de profilinaII es dependiente del incremento de Ca++ a nivel postsináptico. En la amígdala, se ha descrito que los niveles elevados de profilina-II están asociados a espinas con densidades postsinápticas más grandes (Lamprecht et al., 2006). En este sentido, y considerando la relación de los niveles de profilina con el estado madurativo de la espina, los niveles elevados de PFN2 observados en los SNs de hipocampo del ratón Ts1Cje, podrían estar asociados al incremento en la proporción de espinas de mayor tamaño observado en este ratón. En este mismo sentido, los niveles reducidos de Marcks observados en el análisis proteómico también podrían estar vinculados a la alteración de la morfología de la espina. Esta proteína actúa como un represor de la polimerización de la actina y su acción es revertida cuando es fosforilada por PKC y CaM (Arbuzova et al., 2002), por lo que su reducción favorecería la polimerización de la actina y, en consecuencia, el incremento del tamaño de la espina (Bramham, 2008). De forma similar, los niveles elevados de DOCK3 (también denominado MOCA o Presenilin Binding Protein) que se han observado en los SNs del ratón Ts1Cje, podrían estar asociados a este fenotipo de la espina dendrítica. DOCK3, entre otras funciones, activa Rac1 (Namekata et al., 2004) que contribuye a la polimerización de la actina (Bosco et al., 2009) y regula la morfología dendrítica y de la espina (Nakayama et al., 2000; Wiens et al., 2005; Ethell y Pasquale 2005; Bai et al., 2015). De forma interesante, el tratamiento con rapamicinca normaliza los niveles de PFN2, Marcks y DOCK3 en los SNs del ratón Ts1Cje y restaura la alteración morfológica de las espinas dendríticas. Finalmente, otra proteína de interés es la catenina alfa 2 (CTNNA2). La mutación de CTNNA2 induce la alteración de las espinas dendríticas en neuronas de hipocampo (Togashi et al., 2002) y se ha descrito que la sobreexpresión de esta proteína provoca un incremento en el tamaño de la cabeza de la espina (Abe et al., 2004), por lo que el 92 incremento de los niveles de CTNNA2 observado en SNs Ts1Cje (Tabla 4) podría ser relevante para el fenotipo dendrítico. En cualquier caso, como ya se ha indicado, los datos proteómicos corresponden a animales de diferente edad que los utilizados en el análisis morfológico de espinas. Además, los tratamientos de rapamicina llevados a cabo para cada experimento son diferentes. Por otra parte, en la región CA1 del hipocampo Ts1Cje también se observó una disminución de la densidad de espinas dendríticas. Un estudio realizado por Belichenko y colaboradores (Belinchenko et al., 2007) mostró que, si bien la densidad de espinas estaba disminuida en este modelo de SD en la región del giro dentado, no se observaban diferencias con el ratón silvestre en la región CA1. No obstante, el rango de edad incluido en dicho estudio fue de 9 a 10 meses. Estudios preliminares realizados en el contexto de esta Tesis Doctoral utilizando ratones de 2,5 meses (datos no mostrados) tampoco mostraron diferencias de densidad de espinas en la CA1 de ratones Ts1Cje, comparando con los silvestres. Por tanto, el fenotipo de reducción de densidad de espinas observado a P18 sería transitorio. Está bien establecido que, durante el desarrollo postnatal, se da un proceso conocido como poda sináptica, que consiste en una eliminación masiva de espinas sinápticas. Durante esta etapa del desarrollo se produce un balance entre los procesos de espinogénesis y eliminación de espinas que podría estar relacionado con la consolidación de las sinapsis maduras (Yuste, 2010). En los roedores, este proceso de poda sináptica se produce en los primeros meses de vida (Yuste, 2010; Nimchinsky et al., 2002; Jawaid et al., 2018; Afroz et al., 2016). Considerando la diferencia observada en la densidad de espinas según la edad de estudio y el rango de edad asociado al proceso de poda sináptico en roedores, resulta tentador asociar el decremento de la densidad de espinas en el hipocampo Ts1Cje a una posible alteración del proceso de poda sináptica que, aunque aparentemente no implica alteraciones a nivel de número de espinas en el individuo adulto, podría afectar a la selección de dichas espinas. 93 5.4. Efecto del tratamiento prenatal con rapamicina. En este trabajo hemos demostrado que el tratamiento prenatal con rapamicina restaura la mGluR-LTD (Fig. 20) y normaliza la distribución por tamaño de las espinas tipo “mushroom” en el ratón Ts1Cje (Fig. 19). Estos dos fenotipos podrían estar relacionados, ya que la subpoblación de espinas “mushroom” de mayor diámetro (entre 0,7 y 0,9 µm, cuyo porcentaje se encuentra incrementado en el hipocampo Ts1Cje) podría corresponder a la población de espinas que contribuyen a la depresión inducida por DHPG. El efecto corrector de la rapamicina sobre la morfología de las espinas podría deberse tanto a la inhibición de mTORC1 como a la inhibición de mTORC2. Como ya se ha indicado, mTORC1 participa en la regulación de la autofagia, proceso que se ha vinculado a la morfología y fisiología sinápticas y a la eliminación de espinas (Shehata et al 2012; Tang et al., 2014). Por otra parte, mTORC2 regula el citoesqueleto y está directamente relacionado con la modulación de la estructura de la sinapsis (Costa-Mattioli y Monteggia, 2013). En esta línea es interesante considerar que, en muestras de hipocampo total (ratones de edad p-21-30), se detectaron niveles basales reducidos de RICTOR en el ratón Ts1Cje (Fig. 23). Como ya se ha indicado RICTOR es un componente exclusivo de mTORC2 y regula además a la proteína Tiam1, que también está vinculada al remodelado del citoesqueleto (Costa-Mattioli y Monteggia, 2013). En este contexto también resulta interesante mencionar que el gen Tiam1 se localiza en el HSA21 y está en trisomía en el ratón Ts1Cje. Por otra parte, los niveles de RICTOR parecen estar sometidos a regulación por activación de receptores mGluR1/5. Así, el tratamiento con DHPG de rodajas de hipocampo silvestres produjo una reducción de los niveles de RICTOR, mientras que se observó lo contrario, es decir, un incremento, en el caso Ts1Cje (Fig. 23). Esto sugiere una alteración importante de la regulación de mTORC2 en el modelo Ts1Cje. Experimentos futuros permitirán establecer si el tratamiento prenatal con rapamicina tiene un efecto restaurador sobre dicha regulación. Por otra parte, a pesar de que el tratamiento prenatal con rapamicina normaliza la mGluR-LTD en el hipocampo Ts1Cje, es importante destacar que no recupera la depresión inicial exagerada del fEPSP inducida tras el tratamiento de DHPG (Fig. 22). Algunos autores responsabilizan a los receptores mGluR1 de esta depresión aguda inicial (Hou y Klann, 2004) y también se ha relacionado con el sistema endocannabinoide (Rouach y Nicoll, 2003). Así, la inhibición selectiva de los receptores mGluR1 implica la reducción de la depresión aguda tras el tratamiento con DHPG, mientras que los mGluR5 94 parecen contribuir de manera exclusiva a la fase tardía de la mGluR-LTD Gp I (Hou y Klann, 2004). Por otra parte, la activación de los mGluRs se ha vinculado al sistema endocannabinoide por la producción de 2-AG (2-arachidonoylglycerol) mediada por PLCβ (Phospholipase Cβ) y DGLα (diacylglycerol lipase). De manera general, se considera que la señalización endocannabinoide es retrograda, ya que el 2-AG se une a los receptores cannabinoides en el terminal presináptico y regula la liberación de neurotransmisor. No obstante, algunos estudios sugieren que el sistema endocannabinoide también ejerce modulación a nivel postsináptico mediante la activación de receptores TRPV1 (vanilloid receptor type 1) y CB1R (cannabinoid type-1 receptor) presentes en el terminal postsináptico, así como en los astrocitos, que modulan la actividad de los terminales prey postsinápticos (Castillo et al., 2012). Aunque CB1R es el principal receptor al que se asocia esta actividad endocannabinoide (Castillo et al., 2012), la depresión aguda producida tras el tratamiento con DHPG no es dependiente de su activación, lo que sugiere la participación de otro receptor presente en la sinapsis excitatoria (Rouach y Nicoll, 2003). Las predicciones IPA en base a los resultados proteómicos indican una mayor actividad del sistema de señalización endocannabinoide en SNs Ts1Cje (Tabla 8 y Tabla S7, Archivo suplementario 2), lo que podría explicar la depresión aguda inicial exagerada del fEPSP en el hipocampo Ts1Cje. 95 96 Figura 24. Alteraciones de la morfología sináptica y a nivel de proteínas en la sinapsis del hipocampo del ratón Ts1Cje y efecto del tratamiento con rapamicina. El ratón Ts1Cje presenta una alteración en la morfología de las espinas dendríticas en la CA1 del hipocampo, con un desplazamiento de la curva de distribución hacia espinas de mayor tamaño (parte inferior de la figura). En el hipocampo, las espinas de mayor tamaño presentan aparato de la espina y son las únicas susceptibles de mGluR-LTD (Spacek, 1985; Edwards, 1995; Spacek y Harris 1997; Holbro et al., 2009). En el análisis proteómico se han observado alteradas proteínas implicadas en la regulación de la mGluR-LTD. El ratón Ts1Cje presenta niveles elevados de mGluR5, implicado en la mGluR-LTD. También presenta un incremento en los niveles de RYR2 y de SERCA2, proteínas implicadas en la regulación del Ca++, que se localizan en el retículo endoplasmático/aparato de la espina (Sharp et al., 1993; Majewska et al., 2000; Sabatini et al., 2002; Segal y Korkotian, 2014). Otras proteínas implicadas en plasticidad y en la regulación del calcio son las subunidades de los NMDAR, GRIN1 (NR1) y GRIN2B (NR2B) que favorecen la entrada de Ca++ al terminal postsináptico (Pérez-Otaño y Ehlers, 2004). De manera contraria, el incremento en los niveles de GRIA2, PMCA1 y PMCA2; así como el decremento en los niveles de GRIA4 contribuyen en la reducción de los niveles de Ca++ intracelular (Jonas y Burnashev 1995; Burette et al., 2010; Kenyon et al., 2010). También se observan desreguladas MTMR2 y RAP2B, que son proteínas implicadas en la endocitosis de los AMPAR (Zhu et al., 2002; Zhu et al., 2005; Lee et al., 2010); y SULT4A1, LIN7A, SPTAN1, SRC, DOCK3 y STX1B que participan en la regulación de los NMDAR (Köhr y Seeburg, 1996; Wechsler y Teichberg, 1998; Jo et al., 1999; Setou et al 2000; Ali y Salter, 2001; Benquet et al 2002; Namekata et al., 2013; Bai et al., 2013; Niere y Raab-Graham, 2017; Culotta et al., 2020). Otras proteínas desreguladas afectan a la polimerización de la actina y la morfología de la espina dendrítica, como son Marcks, PFN2 y CTNNA2 (Arbuzova et al., 2002; Togashi et al., 2002; Ackermann y Matus, 2003; Abe et al., 2004; Ethell y Pasquale, 2005). 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Se evaluaron variaciones del protocolo de procesamiento de rodajas y del protocolo de estimulación en el hipocampo considerando dos aspectos fundamentalmente: la viabilidad de la rodaja y la adherencia a la superficie del MEA. En este trabajo previo se observó que la viabilidad de las rodajas era superior al aplicar el protocolo descrito como “protocolo de corte protegido”, en el que se hace sustitución parcial de sodio por sacarosa en la composición del ACSF empleado durante el procedimiento de corte. Del mismo modo, se estableció el procedimiento de colocación de las rodajas que garantizase la mejor adherencia a la superficie del MEA y se determinó el protocolo de estimulación basal que son los aplicados en el presente trabajo y que se describen en el apartado de Materiales y Métodos. Como parte del trabajo desarrollado en esta tesis, se continuó con el procedimiento de optimización del registro en MEA evaluando dos tipos de dispositivo, el MEA plano y el MEA 3D. I.II Dispositivos MEA (matriz de microelectrodos). El MEA plano (MultiChannel Systems; Ref. 60MEA200/30iR-Ti) consta de 59 electrodos planos con un diámetro de 30µm y un electrodo de referencia correspondiente a la posición 15 (columna 1, fila 5) distribuidos en una matriz de 8x8 con 200µm de espacio entre los electrodos. Las pistas y los electrodos presentan aislamiento de SiN y el material de la base es cristal. El MEA 3D (MultiChannel Systems; Ref. 60-3DMEA200/12/50iR-gr) consta de 59 electrodos cónicos de TiN con un diámetro de 12 µm (100µm en la base) y una altura de 50 µm, que se distribuyen en una matriz de 8x8 con una distancia entre electrodos de 127 200 µm. Al igual que los MEAs planos, los 3D presentan un electrodo de referencia interna situado en la posición 15 (columna 1, fila 5) de la matriz. El material de aislamiento de las pistas y electrodos es SiN y el material base del MEA3D es cristal. I.III MEA plano vs. MEA 3D. Se evaluaron experimentos realizados con MEAs planos (Fig. 25) y MEAs 3D (Fig. 26) atendiendo a 2 parámetros. En primer lugar, se evaluó el porcentaje de rodajas que mostraban una respuesta de amplitud superior o igual a 100 µV al estimular con - /+1750 mV a nivel de la sinapsis de las colaterales de Schaffer con las dendritas de la región stratum radiatum de la CA1, con el propósito de determinar la capacidad de registro del sistema y el posible efecto de la distancia de contacto del tejido con los electrodos. Con el mismo propósito, se estudió también la distribución de las amplitudes de respuesta en los casos en los que se observaban respuestas superiores o iguales a los 100 µV al aplicar el mismo estímulo. Figura 25. MEA plano. Se muestra la matriz de electrodos del modelo plano (izquierda) y una magnificación de los electrodos planos (derecha). Tomado de https://www.multichannelsystems.com/. Para el primer parámetro analizado se obtuvo que, en el caso del MEA plano, para un total de 122 rodajas de hipocampo en las que se pudo evaluar de manera cuantitativa la amplitud de respuesta al estimular con -/+1750 mV, un 27,87% mostraron una respuesta igual o superior a los 100 µV. En esas rodajas las amplitudes se distribuyeron en un rango entre 100 y 600 µV. Se estudió la distribución de las amplitudes de respuesta, agrupando en rangos de 100 µV, y se obtuvo que más del 50% de las rodajas evaluadas 128 con respuesta superior a 100 µV presentaban una amplitud comprendida en el rango de 100 a 199 µV (100-199 µV: 61,76%; 200-299 µV: 23,53%; 300-399 µV: 8,82%; 400499 µV: 2,94%; 500-599 µV: 0%; 600-699: 2,94%; 700-799 µV: 0%). Figura 26. MEA 3D. Se muestra la matriz de electrodos del modelo 3D (izquierda) y una magnificación de los electrodos 3D (derecha). Tomado de https://www.multichannelsystems.com/. En el caso del MEA 3D, para un total de 319 rodajas de hipocampo evaluadas, en un 50,47% de los casos se obtuvo una respuesta igual o superior a los 100 µV al estimular con -/+1750 mV. Al evaluar la distribución de amplitudes se obtuvo un rango que comprendía respuestas de amplitudes desde los 100 a los 700 µV (100-199 µV: 45,43%; 200-299 µV: 26,09%; 300-399 µV: 13,66%; 400-499 µV: 6,21%; 500-599 µV: 3,73%; 600-699: 3,11%; 700-799 µV: 1,86%). Para evaluar la estabilidad de la rodaja en los MEAs se contabilizó la proporción de registros completos. Se consideraron registros completos aquellos registros de al menos 2 horas de duración en los que la respuesta no desapareció ni decayó de manera progresiva, y se conservó estable dentro de los parámetros experimentales de cada caso concreto. En el caso del MEA plano, de un total de 265 rodajas en las que se pudo evaluar la estabilidad de la respuesta, solo para el 5,28% de las rodajas se obtuvo registro completo que además cumpliese con la condición de haber generado una respuesta de amplitud superior o igual a 100 µV al estimular con -/+1750 mV a nivel de la sinapsis de las colaterales de Schaffer con las dendritas de la región stratum radiatum de la CA1. Para Page 4 of 16 Urbano‑Gámezetal. Mol Brain (2021) 14:84 Western blot Western blots were performed as previously described [21]. Adult (4–5 month-old) male mice were used. Briefly, total hippocampal protein extracts were prepared for each individual by mechanical tissue homogenization in extraction buffer containing: 50mM Tris (Sigma, Ref. 93352) buffer (pH 7.4), 0.5% Triton X-100 (Sigma, Ref. T8787), 150mM NaCl (Sigma-Aldrich, Ref. S7653), 1mM EDTA (Sigma, Ref. E5134), 3% SDS (Sigma, Ref. 05030), protease (Sigma, Ref. P8340) and phosphatase inhibitor cocktails (Sigma, Ref. P5726 and P0044). Protein extracts were resolved by SDS-PAGE on MiniPROTEAN® TGX Stain-Free™ precast gels (BioRad, Ref. 1704156). Proteins were transferred to polyvinylidene difluoride (PVDF) membranes (Trans-blot® Turbo™ Transfer Pack, Ref. 1704156). Membranes were incubated with blocking solution (1% non fat dry milk in TBS-T buffer; TBS-T buffer is 20mM Tris buffer [pH 7.5], 150mM NaCl, and 0.1% Tween®20) for 1h at RT, then incubated overnight at 4°C with the appropriate primary antibody (dilution 1:1,000). After washing with TBS-T, the membranes were incubated with the HPR-conjugated secondary antibodies diluted in blocking solution (dilution 1:20,000 for FMRP immunoblot, 1:5,000 for LC3B immunoblot, and 1:2,000 for TOMM20) for 1h at RT. HRPconjugated secondary antibodies were detected with the WesternBright Quantum HRP Substrate (Advansta, Ref. K-12042-D10) and chemiluminiscence measured on a ChemiDoc XRS (BioRad) imager. Immunocytochemistry Hippocampal cultures fromP0 WT or Ts1Cje littermates were established as previously described [22]. Briefly, hippocampi from 5 WT and 5 Ts1Cje mice were dissected in HBSS medium (Gibco, Ref. 14175-095) and mechanically dissociated in DB1 culture medium (Biowest, Ref. L0104) after treatment with 0.2% trypsin (Gibco, Ref. 15090-046) for 10min. Cells were cultured in Neurobasal A (Gibco, Ref. 100888-022) supplemented with B27 (Gibco, Ref. 17504-044), Glutamax (Gibco, Ref. 35050-061) and penicillin/streptomycin (Gibco, Ref. 15140-122). To inhibit glial growth, 0.3 mM 5-fluoro-2ʹ-deoxyuridine (SigmaAldrich, Ref. 856657) and 0.8 mM uridine (SigmaAldrich, Ref. U3003) were added after 48h in culture. After 14days invitro (DIV), cells were fixed with 4% paraformaldehyde (PFA, Sigma-Aldrich, Ref. P6148) in phosphate-buffered saline (PBS, Panreac Applichem, Ref. A9177) and subjected to dual immunocytochemistry using antibodies against FMRP (1:250 dilution) and MAP2 (1:1,000 dilution). Thus, after fixation, cells were washed 3 times with PBS and incubated with blocking solution (0.1% Triton X-100, and 10% fetal bovine serum in PBS) for 1h at RT. Then, primary antibodies, diluted in blocking solution, were applied overnight at 4°C. After washing 3 times with PBS for 10min, cells were incubated with the corresponding secondary antibodies (dilution 1:1,000) for 1h at RT, then washed in PBS. Confocal microscopy images were acquired and processed as previously described [21]. The mean pixel intensity for the corresponding immunofluorescent FMRP signal in dendrites was determined (in arbitrary units, a.u.) using a Matlab (Mathworks) routine previously established [3]. Electrophysiological recordings Hippocampal slices were prepared from P21–P30 WT and Ts1Cje mice. Since we intended to correlate electrophysiological and behavioural results, and previous behavioural experiments performed in the laboratory gave a high variability when using females, only male mice were used, for the sake of reproducibility. Mice were anesthetized and brains were removed in an ice-cold artificial cerebrospinal fluid with partial substitution of Na with sucrose (ACSFs) with constant flux of carbogen (5% CO2; rest O2; H2O < 5ppm). ACSFs composition was: 2.5 mM KCl (Sigma, Ref. P9541); 1.25 mM NaH2PO4 (2H2O) (Sigma, Ref. P71505); 26mM NaHCO3 (Sigma, Ref. S5761); 25mM glucose (Sigma, Ref. G5400); 0.5mM CaCl2 (2H2O) (Sigma, Ref. 223506); 4 mM MgSO4 (7H2O) (Sigma, Ref. 63138); 185mM sucrose (Sigma, Ref. P84097). Brains were positioned in the cutting chamber over a thin film of ethyl cyanoacrylate and were submerged in cold ACSFs. 350 µm horizontal slices were obtained using a vibratome (Vibratome 3000, Sectioning System) and both hippocampi were isolated in each slice preserving entorhinal cortex adjacent to the hippocampal formation. Slices were incubated in ACSF (126mM NaCl; 3mM KCl; 1.3mM MgSO4 (7H2O); 2mM CaCl2 (2H2O); 1.25mM NaH2PO4 (2H2O); 24mM NaHCO3; 10mM glucose) for 30 min at 34 °C. Then, slices were incubated for at least 2h in ACSF at room temperature (RT; 22–25°C) before recording, keeping constant the flux of carbogen. Slices were transferred to a 3D-MEA chamber (MultiChannel Systems, Ref. 60-3DMEA200/12/50iR-gr) and stayed at least 10min before stimulation with a 2ml/ min flux rate of ACSF. All the registers were performed at RT. The experimenter was blind to the genotype and treatment of the animals during experimentation and data analysis. The 3D-MEA devices have 59 conical TiN electrodes with 12µm diameter (100µm in the base of the electrode) and 50µm high, distributed in an 8 × 8 matrix with an internal reference electrode at the position 15 (column 1, row 5). The inter-electrode distance is 200µm. The isolation material used for these devices’ circuitry is SiN and the base is made out of glass. Page 5 of 16 Urbano‑Gámezetal. Mol Brain (2021) 14:84 Slices were stimulated at the Schaffer collateral pathway in the CA1 region of hippocampus using a biphasic square pulse (negative phase-positive phase; 100ms per phase) at 0.0167Hz (1 stimulus per minute). Slices showing field excitatory postsynaptic potential (fEPSP) amplitude lower than 100 µV for test stimulation (−/+ 1750mV) in the CA1 region were discarded. Input/ output (I/O) curve was performed reaching the limits of the system (750–4000mV; 3 stimuli per amplitude) and baseline was established at 60% of the highest response obtained at the maximum voltage applied. After baseline stabilization, 100 µM (S)-3,5-Dihydroxyphenylglycine (DHPG; Sigma-Aldrich, Ref. D-3689) in ACSF was bath applied at a flow rate of 2ml/min for 5min. DHPG-long term depression (DHPG-LTD) was recorded for 1h after treatment. In order to determine the synaptic efficacy, the slope of the initial fEPSP curve was measured in the segment comprised between the 10–90% of the curve amplitude. Recordings were acquired at 10,000Hz. Electrophysiological results are presented as the mean ± SEM (standard error of the mean) normalized to the baseline slope mean. For statistical analysis, a Student’s t-test was performed for compared experimental groups. Normalized slope at the minute 60 after DHPG treatment initiation was used for comparisons. Golgi staining andspine morphology analysis WT and Ts1Cje P18 mice were anesthetized and both hemispheres were separated, and the cerebellum was removed. A FD Rapid Golgi stain kit (FD NeuroTechnologies INC, Ref. PK401A) was used following the manufacturer guidelines. After the staining process, 100µm coronal slices were prepared using a cryostat (Leica CM1950). Slices were deposited over Menzel-Gläser Superfrost PLUS microscope slides (ThermoScientific, Ref. J1800AMNZ) and covered with a thin gelatine coat (Gelatine Gold; Panreac DC, Ref. 251336). Secondary dendrites images were acquired from the hippocampal CA1 stratum radiatum region, at a 1,600 × 1,200 pixel resolution, using an Olympus BX61 microscope (CellSens software). For spine morphology analysis, image acquisition was made using an UPlanSApo60x/1.35 oil objective, with a 10× ocular and an additional 2× magnification. For spine density analysis, images were acquired using an UPlanApo40x/0.85 air objective, with a 10× ocular, and an additional 2× magnification. To determine dendritic spine density, spines were manually counted, and the branch longitude was measured using ImageJ software. For spine morphology analysis, spines perimeters were manually defined, and the head diameter was measured using ImageJ software. The experimenter was blind to sample genotype and treatment during experiment and data analysis. Statistical analysis Predetermined sample calculation was not performed. Sample size was determined based on published studies in the field or in animal availability. The quantitative data are presented as the means and SEM. No test for outliers was performed. All data points were included. The GraphPad Prism software (version 5.00) was used. D’Agostino and Pearson omnibus normality test was first performed, in order to applyeither a Student’s t-test or a Mann–Whitney rank sum test for mean comparisons. p values are indicated through the text and figure legends. Results Proteomic analysis ofhippocampal SNs fromTs1Cje mice In a previous work we found that Ts1Cje mice showed impaired BDNF-LTP, which was restored by the mTOR inhibitor rapamycin [7]. In order to identify synaptic differences that could account for plasticity and memory deficits in Ts1Cje mice we performed a proteomic analysis of hippocampal SNs isolated from WT and Ts1Cje mice. Protein samples were subjected iTRAQ proteomics. Thus, from each SNs sample, duplicates were labeled, and the relative amount of each detected protein was referenced to one of the WT samples (Additional file1: TableS1). 1,890 proteins were identified by at least two unique peptides (Additional file 1: Table S2). Proteins not detected in all the samples (4 proteins) as well as technical replicates with CV% > 30% (19 proteins) were removed. The geometric mean of the relative protein amount was calculated (Additional file1: TableS3) and used in the subsequent analysis by IPA software. To verify that the detected proteins were mainly synaptic, the list of proteins in Additional file1: TableS3 was subjected to a PANTHER overrepresentation test [20]. The PANTHER Go-Slim Cellular Component annotation dataset was selected. Thus, sets of related proteins overrepresented into the SNs, compared with the complete mouse genome, were identified. A high enrichment in preand post-synaptic proteins was evidenced (Fig.1 and Additional file1: TableS4), confirming the quality of the SNs preparations. From the 1,867 proteins initially included in the IPA, 12 resulted to be unmapped, and from the 1,855 mapped identities, IPA considered 1,824 of them as “analysis-ready”. Considering a 1.2-fold cutoff (see “Materials and methods”), 116 proteins were found to be deregulated (108 upand 8 down-regulated) in Ts1Cje SNs compared to WT SNs (Additional file2: TableS5). Attending to the Fischer p-value, IPA revealed that, the mitochondrial dysfunction canonical pathway, and the partially overlapping oxidative phosphorylation and Page 6 of 16 Urbano‑Gámezetal. Mol Brain (2021) 14:84 sirtuin signaling pathways were among the most significantly enriched in the set of proteins affected in Ts1Cje SNs (Fig. 2, Table 1 and Additional file 2: Table S6). Accordingly, mitochondrial alterations have been described in DS and DS mouse models [23–25]. In fact, it has been recently shown that reduced autophagy/ mitophagy due to mTOR hyperactivation produces damaged mitochondria accumulation in DS fibroblasts [26]. In agreement with these data, the levels of the B-II isoform of Microtubule-associated protein 1A/1Blight chain 3 (LC3B-II), a marker of autophagy, are also reduced in Ts1Cje hippocampus (Fig.3A). Moreover, the levels of TOM20 (Translocase of Outer Mitochondrial membrane 20), a marker of mitochondrial mass, were increased in the Ts1Cje hippocampus (Fig.3B). Most important for the objectives of this work, we found that some key synaptic plasticity related pathways, including calcium signaling, CREB signaling, the endocannabinoid neuronal synapse pathway, the glutamate receptor signaling, and the synaptic LTD, were also significantly affected in Ts1Cje SNs (Fig.2, Table2 and Additional file2: TableS6). In fact, the Z-score analysis of the data predicted increased activity of these pathways in Ts1Cje SNs (Additional file2: TableS7). 0 2 4 6 8 10 12 Fold enrichment Fig. 1 PANTHER overrepresentation test of proteins identified by iTRAQ in WT and Ts1Cje SNs. The cellular components overrepresented in SNs, compared to the complete mouse genome, are shown. For sake of clarity, only the most specific subclasses of the PANTHER Go‑Slim Cellular Component annotation data set are included in the figure. Complete analysis is reported in Additional file 1: Table S4. The fold enrichment for each cellular component is indicated EndocannabinoidNeuronal SynapsePathway CalciumSignaling Synaptic Long Term Depression CREB Signaling in Neurons SynaptogenesisSignaling Pathway OpioidSignaling Pathway GNRH Signaling Role of NFAT in Cardiac Hypertrophy G Beta Gamma Signaling MitochondrialDysfunction Sirtuin SignalingPathway OxidativePhosphorylation Fig. 2 Canonical IPA pathways affected in Ts1Cje SNs. The most significant canonical pathways identified by IPA among the altered proteins in Ts1Cje SNs are shown. Overlapping pathways sharing at least 7 proteins are connected by solid lines Page 7 of 16 Urbano‑Gámezetal. Mol Brain (2021) 14:84 Table 1 Proteins involved in mitochondrial pathways affected in Ts1Cje SNs Symbol Entrez gene name ID Ts1Cje Pathway APP Amyloid beta precursor protein P12023 1.246 Mitochondrial dysfunction Sirtuin signaling ATP5MF ATP synthase membrane subunit f P56135 1.925 Mitochondrial dysfunction Oxidative phosphorylation ATP5PD ATP synthase peripheral stalk subunit d Q9DCX2 1.523 Mitochondrial dysfunction Oxidative phosphorylation ATP5PF ATP synthase peripheral stalk subunit F6 P97450 1.907 Mitochondrial dysfunction Oxidative phosphorylation Sirtuin signaling COX4I1 Cytochrome c oxidase subunit 4I1 P19783 1.818 Mitochondrial dysfunction Oxidative phosphorylation COX5A Cytochrome c oxidase subunit 5A P12787 1.889 Mitochondrial dysfunction Oxidative phosphorylation Cox6c Cytochrome c oxidase subunit 6C Q9CPQ1 2.119 Mitochondrial dysfunction Oxidative phosphorylation CYC1 Cytochrome c1 Q9D0M3 1.728 Mitochondrial dysfunction Oxidative phosphorylation Sirtuin signaling CYCS Cytochrome c. somatic P62897 1.976 Mitochondrial dysfunction Oxidative phosphorylation GPD2 Glycerol‑3‑phosphate dehydrogenase 2 Q64521 1.549 Mitochondrial dysfunction MAOB Monoamine oxidase B Q8BW75 1.235 Mitochondrial dysfunction MT‑CO2 Cytochrome c oxidase subunit II P00405 2.804 Mitochondrial dysfunction Oxidative phosphorylation NDUFA2 NADH:ubiquinone oxidoreductase subunit A2 Q9CQ75 1.337 Mitochondrial dysfunction Oxidative phosphorylation Sirtuin signaling NDUFA4 NDUFA4 mitochondrial complex associated Q62425 1.331 Mitochondrial dysfunction Oxidative phosphorylation Sirtuin signaling NDUFA8 NADH:ubiquinone oxidoreductase subunit A8 Q9DCJ5 1.546 Mitochondrial dysfunction Oxidative phosphorylation Sirtuin signaling NDUFAF1 NADH:ubiquinone oxidoreductase complex assembly factor 1 A2AQ17 1.359 Mitochondrial dysfunction Sirtuin signaling NDUFS1 NADH:ubiquinone oxidoreductase core subunit S1 Q91VD9 1.813 Mitochondrial dysfunction Oxidative phosphorylation Sirtuin signaling NDUFS3 NADH:ubiquinone oxidoreductase core subunit S3 Q9DCT2 1.713 Mitochondrial dysfunction Oxidative phosphorylation Sirtuin signaling NDUFS6 NADH:ubiquinone oxidoreductase subunit S6 P52503 1.368 Mitochondrial dysfunction Oxidative phosphorylation Sirtuin signaling NDUFV2 NADH:ubiquinone oxidoreductase core subunit V2 Q9D6J6 1.487 Mitochondrial dysfunction Oxidative phosphorylation Sirtuin signaling SLC25A4 Solute carrier family 25 member 4 P48962 1.591 Sirtuin signaling UQCRB Ubiquinol‑cytochrome c reductase binding protein Q9CQB4 1.928 Mitochondrial dysfunction Oxidative phosphorylation UQCRC1 Ubiquinol‑cytochrome c reductase core protein 1 Q9CZ13 1.687 Mitochondrial dysfunction Oxidative phosphorylation UQCRFS1 Ubiquinol‑cytochrome c reductase. Rieske iron‑sulfur polypeptide 1 Q9CR68 3.192 Mitochondrial dysfunction Oxidative phosphorylation Sirtuin signaling Page 8 of 16 Urbano‑Gámezetal. Mol Brain (2021) 14:84 Fig. 3 Quantification of LC3B‑II and TOM20 proteins in WT and Ts1Cje hippocampus. Hippocampal proteins from WT and Ts1Cje mice pairs were analyzed in Western blot with anti‑LC3B or anti‑TOM20 antibody. A LC3B western blot showing WT and Ts1Cje littermate pairs analyzed and total protein loaded. The ratio LC3B‑II/LC3B‑I is shown as the mean ± SEM (WT: 0.8714 ± 0.04154; Ts1Cje: 0.6500 ± 0.06802; p = 0.0152, Student’s t‑test, n = 7 for WT and n = 6 for Ts1Cje). B TOM20 western blot showing WT and Ts1Cje littermate pairs analyzed and total protein loaded. The signals were normalized to the corresponding total protein loaded and the mean ± SEM values are shown (WT: 1.024 ± 0.08799; Ts1Cje: 1.412 ± 0.1452; p = 0.0414, Student’s t‑test, n = 7 animals per genotype) Table 1 (continued) The relative amounts (fold change, compared to WT SNs) of these proteins in Ts1Cje SNs are shown Symbol Entrez gene name ID Ts1Cje Pathway UQCRQ Ubiquinol‑cytochrome c reductase complex III subunit VII Q9CQ69 2.522 Mitochondrial dysfunction Oxidative phosphorylation VDAC1 Voltage dependent anion channel 1 Q60932 1.762 Mitochondrial dysfunction Sirtuin signaling VDAC2 Voltage dependent anion channel 2 Q60930 2.043 Mitochondrial dysfunction Sirtuin signaling WRN Werner syndrome RecQ like helicase O09053 − 1.341 Sirtuin signaling Page 9 of 16 Urbano‑Gámezetal. Mol Brain (2021) 14:84 mGluR‑LTD isenhanced intheCA1 region ofTs1Cje hippocampus As mentioned above, the IPA analysis suggested that LTD is increased in the Ts1Cje hippocampus. It is well known that mTOR is involved in this type of plasticity [10, 12] and, remarkably, mTOR is hyperactivated in Ts1Cje hippocampus [3]. These data stimulated us to evaluate mGluR-LTD in Ts1Cje mice. mGluR-LTD is experimentally induced in hippocampal slices by a brief (5min) exposure to DHPG, a specific agonist of mGluR1/5 receptors [8]. As expected, an LTD of evoked excitatory synaptic responses was evident in Table 2 Proteins involved in synaptic plasticity pathways affected in Ts1Cje SNs The relative amounts (fold change, compared to WT SNs) of these proteins in Ts1Cje SNs are shown Symbol Entrez gene name ID Ts1Cje Pathway ADCY9 Adenylate cyclase 9 P51830 1.344 CREB signaling Endocannabinoid neuronal synapse ATP2A2 ATPase sarcoplasmic/endoplasmic reticulum Ca2+ transporting 2 O55143 1.251 Calcium signaling ATP2B1 ATPase plasma membrane Ca2+ transporting 1 G5E829 1.329 Calcium signaling ATP2B2 ATPase plasma membrane Ca2+ transporting 2 F8WHB1 1.268 Calcium signaling CACNA1A Calcium voltage‑gated channel subunit alpha1 A P97445 1.314 Calcium signaling CREB signaling Endocannabinoid neuronal synapse Synaptic LTD CACNA1G Calcium voltage‑gated channel subunit alpha1 G Q5SUF8 1.474 Calcium signaling CREB signaling Endocannabinoid neuronal synapse Synaptic LTD CACNA2D1 Calcium voltage‑gated channel auxiliary subunit alpha2delta 1 O08532 1.262 Calcium signaling CREB signaling Endocannabinoid neuronal synapse Synaptic LTD GNB2 G protein subunit beta 2 E9QKR0 1.207 CREB signaling GNG2 G protein subunit gamma 2 P63213 − 1.212 CREB signaling Endocannabinoid neuronal synapse Glutamate receptor signaling GRIA2 Glutamate ionotropic receptor AMPA type subunit 2 P23819 1.481 Calcium signaling CREB signaling Endocannabinoid neuronal synapse Glutamate receptor signaling Synaptic LTD GRIA4 Glutamate ionotropic receptor AMPA type subunit 4 Q9Z2W8 − 1.251 Calcium signaling CREB signaling Endocannabinoid neuronal synapse Glutamate receptor signaling Synaptic LTD GRIN1 Glutamate ionotropic receptor NMDA type subunit 1 A2AI21 1.758 Calcium signaling CREB signaling Endocannabinoid neuronal synapse Glutamate receptor signaling GRIN2B Glutamate ionotropic receptor NMDA type subunit 2B Q01097 1.371 Calcium signaling CREB signaling Endocannabinoid neuronal synapse Glutamate receptor signaling GRM5 Glutamate metabotropic receptor 5 Q3UVX5 1.200 CREB signaling Endocannabinoid neuronal synapse Glutamate receptor signaling Synaptic LTD RAP2B RAP2B. member of RAS oncogene family P61226 1.300 Calcium signaling CREB signaling Synaptic LTD RYR2 Ryanodine receptor 2 E9Q401 1.251 Calcium signaling Synaptic LTD Page 10 of 16 Urbano‑Gámezetal. Mol Brain (2021) 14:84 0 20 40 60 80 100 120 01020304050607080 DHPG 1 2 1’ 2’ 0 20 40 60 80 100 87 * WT Ts1Cje 0,4 mV 10 ms 1 1’ 2 2’ Time (min) Normalized fEPSP slope (%) NormalizedfEPSP slope(%) WT Ts1Cje a b Fig. 4 mGluR‑LTD in WT and Ts1Cje hippocampal slices. A Time course of DHPG effects on field excitatory postsynaptic potentials (fEPSP) in WT and Ts1Cje mice. Upper insets: representative traces of a fEPSP before (1, 2) and after (1ʹ, 2ʹ) DHPG application in WT (1, 1ʹ) and Ts1Cje (2, 2ʹ) mice. The mean fEPSP slopes before DHPG perfusion between WT and Ts1Cje mice were not different. B Quantification of the effects depicted in A. The error bars represent the SEM. The number of slices for each condition is indicated in the corresponding bar (WT: 8 slices from 4 mice; Ts1Cje: 7 slices from 3 mice). p = 0.039 Student’s t‑test Page 11 of 16 Urbano‑Gámezetal. Mol Brain (2021) 14:84 WT slices after DHPG exposure (Fig.4, 82.12 ± 8.31% of baseline, n = 8 slices from 4 mice). Remarkably, an enhanced mGluR-LTD was elicited in Ts1Cje hippocampal slices (Fig.4, 59.12 ± 4.92% of baseline, n = 7 slices from 3 mice). In conclusion, we found that mGluR-LTD was exaggerated in the Ts1Cje CA1 hippocampal region. Enhanced mGluR-LTD is a hallmark of FMR1 knockout mice [27]. As already mentioned, FMRP (the FMR1 encoded protein) is a repressor of local synthesis of proteins necessary for mGluR-LTD [28–30]. Thus, we evaluated the amounts of FMRP in Ts1Cje hippocampus by Western blot and, strikingly, we found a slight, yet significant, increase of FMRP (Fig.5). To evaluate more precisely the amount FMRP in the dendritic compartment, we performed double immunocytochemistry in primary cultures of hippocampal neurons at DIV 14 and measured the fluorescence level of FMRP labeling in MAP2positive neurites (i.e., dendrites). As shown in Fig. 5, dendritic FMRP labeling was 1.6-fold higher in Ts1Cje neurons than in those from the WT. Hence, we must WT Ts1Cje 0.9 1.0 1.1 1.2 1.3 1.4 1.5 )dlof(nietorpPRMF *** total protein FMRP WT Ts1Cje WT Ts1C je 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 orpPRMFtein level (a.u.) *** FMRPMAP2 WT Ts1Cje a cd b Fig. 5 Quantification of FMRP protein in WT and Ts1Cje hippocampus. A Hippocampal proteins from WT and Ts1Cje mice pairs were analyzed by Western blots with an anti‑FMRP antibody. The signals were normalized to the corresponding total protein loaded and the mean ± SEM values are shown (WT: 1.115 ± 0.0239; Ts1Cje: 1.278 ± 0.0162; p = 0.0006, Mann Whitney test, n = 7 animals per genotype). B Representative Western blot showing two WT and four Ts1Cje littermate pairs (some lanes corresponding to non‑littermate animals have been removed, but both WT and Ts1Cje panels correspond to the same Western blot experiment). C Quantification of the relative amount of FMRP protein in dendrites of WT and Ts1Cje hippocampal neurons at DIV14. The mean pixel intensity ± SEM for FMRP immunofluorescence in dendrites is shown in arbitrary units (a.u.) (p = 0.0006, t test, n = 10 images per genotype; each image typically contained one neuron). D Representative gray scale confocal images from the experiment in C, showing FMRP and MAP2 labeling in WT and Ts1Cje neurons. Scale bar = 20 μm. Note that dendritic branching and length are reduced in Ts1Cje neurons, compared to WT controls (unpublished observations) Page 12 of 16 Urbano‑Gámezetal. Mol Brain (2021) 14:84 conclude that despite the higher levels of FMRP, mGluRLTD was abnormally enhanced in Ts1Cje hippocampus. Prenatal treatment withrapamycin normalizes size distribution ofmushroom type dendritic spines inthestratum radiatum ofTs1Cje mice It has been proposed that LTD is a physiological correlate of spine shrinkage [13, 31, 32]. Since dendritic spine alterations have been described in DS and DS mouse models including Ts1Cje [33–35], we decided to evaluate the effect of prenatal treatment with rapamycin on dendritic spine density in postnatal Ts1Cje mice using a rapid Golgi stain method (see “Materials and methods”). We observed a reduced spine density in secondary dendrites of CA1 stratum radiatum of untreated Ts1Cje animals, compared to WT controls (WT: 0.640 ± 0.031spines/μm, n = 50; Ts1Cje: 0.523 ± 0.035spines/μm, n = 26; t-Student test p-value = 0.015). However, prenatal treatment with rapamycin produced no significant effect on spine density in either group (WT RAPA: 0.666 ± 0.029spines/μm, n = 27; Ts1Cje RAPA: 0.572 ± 0.021spines/μm, n = 31). It has been shown that the CA1 spines susceptible to undergo mGluR-LTD are large-head mushroom spines that contain endoplasmic reticulum (ER) and often harbor a spine apparatus, whereas spines without ER are refractory to this plasticity [36]. Thus, we decided to assess the proportion of filopodia, stubby and mushroom shape spines but we found no significant differences in the proportion of the different morphology categories among the experimental groups (Table 3). Howewer, we found that the proportion of 0.5–0.7μm mushroom spines was significantly reduced in Ts1Cje animals, compared to WT, and recovered in Ts1Cje RAPA mice, whereas the percentage of 0.7–0.9μm mushroom spines was significantly increased in Ts1Cje mice and restored in Ts1Cje RAPA animals (Fig.6 and Additional file3: TableS8). Thus, prenatal treatment with rapamycin normalizes the size distribution of mushroom type dendritic spines in Ts1Cje stratum radiatum neurons. Table 3 Dendritic spine morphology comparison The percentages of filopodia, stubby and mushroom spines present in secondary dendrites of apical stratum radiatum CA1 neurons in WT, Ts1Cje, and prenatally rapamycin‑treated WT and Ts1Cje mice are indicated. Number of mice used per condition was 2, except for WT RAPA (a single animal). Total number of spines (n) is also indicated for each experimental group Spine morphology WT (n = 248) Ts1Cje (n = 151) WT RAPA (n = 143) Ts1Cje RAPA (n = 635) Filopodium 14.9 13.2 22.4 19.7 Stubby 27.8 29.8 25.2 26.5 Mushroom 57.3 57.0 52.4 53.9 Spine percentage Diameter size (m) ** ** WT WT RAPA Ts1Cje Ts1Cje RAPA WT Ts1Cje WT RAPA Ts1Cje RAPA 4 m 1 m µ a b Fig. 6 Frequency distribution of mushroom spines clustered by diameter size in CA1 stratum radiatum of untreated animals (WT and Ts1Cje) or mice treated with rapamycin prenatally (WT RAPA and Ts1Cje RAPA). A Representative images of Golgi staining for WT, Ts1Cje, WT RAPA and Ts1Cje RAPA mice; a typical mushroom spine is also shown. B Distribution of mushroom spines clustered by diameter size. Frequencies are shown as percentages. Center of the first and last bins in the histogram were automatically fixed (using GraphPad Prism software), and bin wide was set to 0.2 μm. The Z‑score for two population proportions was calculated between WT vs. Ts1Cje, WT vs. WT RAPA and Ts1Cje vs. Ts1Cje RAPA for each histogram interval. Statistically significant p‑values were obtained when comparing WT vs. Ts1Cje, and Ts1Cje vs. Ts1Cje RAPA, (as indicated with asterisks) in the following cases: 0.5 to 0.7 μm interval (bin center 0.6 μm): WT vs. Ts1Cje p‑value = 0.011, Ts1Cje vs. Ts1Cje RAPA p‑value < 0.001; 0.7 to 0.9 μm interval (bin center 0.8 μm): WT vs. Ts1Cje p‑value = 0.045, Ts1Cje vs. Ts1Cje RAPA p‑value = 0.002 Page 13 of 16 Urbano‑Gámezetal. Mol Brain (2021) 14:84 Prenatal treatment withrapamycin reduces mGluR‑LTD inTs1Cje hippocampus In order to determine if the normalization of mushroom spine size distribution observed in Ts1Cje treated prenatally with rapamycin (Fig.6) correlated with an effect on mGluR-LTD, we evaluated this plasticity in hippocampal slices of postnatal Ts1Cje mice treated prenatally with rapamycin (see “Materials and methods”). Remarkably, as shown in Fig.7, mGluR-LTD was reduced in Ts1Cje RAPA mice (91.55 ± 5.23% of baseline, n = 7 slices from 4 mice) compared to Ts1Cje, and showed values similar to those of WT. Discussion We have previously shown that the mTOR pathway is hyperactivated in Ts1Cje hippocampus [3]. Afterwards, other groups reported mTOR hyperactivation in postmortem DS brain [4, 5]. We have also found that rapamycin restored both BDNF-LTP and the persistence of LTM in the Barnes maze [7]. We have here presented the characterization of the Ts1Cje hippocampal synaptic proteome, and we have identified several affected pathways that could account for plasticity and/or memory deficits of Ts1Cje mice. Two main functions were predicted to be altered in Ts1Cje hippocampus: mitochondrial function and synaptic plasticity (including LTD). Mitochondrial dysfunction and increased oxidative stress have been previously found in the Ts1Cje brain [37]. In fact, altered mitochondrial function has long been associated with DS [23–25]. It has been recently found damaged mitochondria linked to increased oxidative stress, reduced mitophagy and reduced autophagy, together with mTOR hyperactivation in fibroblasts from DS patients [26]. The role of mTORC1 as regulator of both general autophagy and mitophagy induction after oxidative phosphorylation uncoupling is well established [38]. Accordingly, pharmacological inhibition of mTOR using AZD8055, which inhibits both mTORC1 and mTORC2 [39], restored autophagy and mitophagy in DS fibroblasts [26]. As mentioned before, we previously demonstrated hyperactivation of mTOR in the Ts1Cje hippocampus [3]. Accordingly, we have here observed that autophagy is reduced, which could be related to the mitochondrial dysfunction that we detected in the proteomic analysis of Ts1Cje SNs, and to the increased levels of the mitochondrial mass marker TOM20 we measured in Ts1Cje adult hippocampus (Fig.3). Regarding synaptic plasticity, we found that mGluRLTD is enhanced in Ts1Cje hippocampus. Many forms of synaptic plasticity have been characterized in the Ts1Cje and other DS mouse models [7, 35, 40]. mGluR-LTD has been previously studied in the Ts65Dn model but, in contrast to our results, a normal hippocampal mGluR-LTD, compared to WT, was found [41]. Nevertheless, there are important differences between the Ts65Dn and Ts1Cje models that could explain this apparent contradiction. Thus, additional DS non-related trisomic genes exist in Ts65Dn [42]. The fact that 6–8month-old mice were used in the Scott-McKean and Costa study while we used P21–30 mice could also explain the different results since the mechanisms of mGluR-LTD seem to be developmentally regulated [43]. 0 20 40 60 80 100*** 77 0 20 40 60 80 100 120 01020304050607080 Ts1Cje Ts1Cje RAPA DHPG 1 2 1’ 2’ 0,4 mV 10 ms 1 1’ 2 2’ Time (min) Normalized fEPSP slope (%) Normalized fEPSPslope (%) Ts1Cje Ts1Cje RAP A Ts1Cje Ts1Cje RAPA a b Fig. 7 mGluR‑LTD in hippocampal slices of Ts1Cje mice treated with rapamycin prenatally. A Time course of DHPG effects on field excitatory postsynaptic potentials (fEPSP) in Ts1Cje mice treated with rapamycin prenatally (Ts1Cje RAPA) and control Ts1Cje mice (same data as in Fig. 4). Upper insets: representative traces of a fEPSP before (1, 2) and after (1ʹ, 2ʹ) DHPG application in Ts1Cje (1, 1ʹ; same data as in Fig. 4) and Ts1Cje RAPA (2, 2ʹ) mice. The mean fEPSP slopes before DHPG perfusion between Ts1Cje and Ts1Cje RAPA mice were not different. B Quantification of the effects depicted in A. The error bars represent the SEM. The number of slices for each condition is indicated in the corresponding bar (Ts1Cje: 7 slices from 3 mice; Ts1Cje RAPA: 7 slices from 4 mice). p < 0.001 Student’s t‑test