Cuantificación de hormonas vegetales y estudio metabolómico mediante cromatografia-espectrometría de masas de alta resolución. Aplicación a la interacción alfalfa-PGPR

DEPARTAMENTO DE QUÍMICA ORGÁNICA FACULTAD DE QUÍMICA UNIVERSIDAD DE SEVILLA Cuantificación de hormonas vegetales y estudio metabolómico mediante cromatografíaespectrometría de masas de alta resolución. Aplicación a la interacción alfalfa-PGPR Mª Rocío Valderrama Fernández Sevilla, 2023 DEPARTAMENTO DE QUÍMICA ORGÁNICA FACULTAD DE QUÍMICA UNIVERSIDAD DE SEVILLA Cuantificación de hormonas vegetales y estudio metabolómico mediante cromatografíaespectrometría de masas de alta resolución. Aplicación a la interacción alfalfa-PGPR Memoria presentada por la Licenciada Mª Rocío Valderrama Fernández para optar al grado de Doctora en Química. Sevilla, 2023 DEPARTAMENTO DE QUÍMICA ORGÁNICA FACULTAD DE QUÍMICA UNIVERSIDAD DE SEVILLA Vº Bº de los Directores de la Tesis Fdo. Dr. Miguel Ángel Rodríguez Carvajal. Profesor Titular del Departamento de Química Orgánica de la Facultad de Química de la Universidad de Sevilla. Fdo. Dra. Mª Eugenia Soria Díaz, Técnico Superior de apoyo a la Docencia y la Investigación en el Servicio General de Investigación de Espectrometría de Masas de la Universidad de Sevilla. Agradecimientos Deseo expresar mi agradecimiento: Al profesor Dr. Miguel Ángel Rodríguez Carvajal y a la Dra. Mª Eugenia Soria Díaz por su dirección, interés y dedicación en la realización de esta Tesis. Muchas gracias por vuestro apoyo incondicional. Al Profesor Dr. Antonio M. Gil Serrano, porque sin él no habría sido posible el comienzo y desarrollo de esta Tesis. Gracias por hacerme tan fácil cualquier adversidad que se haya presentado y por darme ánimos cuando más lo he necesitado. Al Profesor Dr. Fco. Javier Ollero Márquez del Dpto. de Microbiología de la Facultad de Biología, por proporcionarnos las plantas de alfalfa y los cultivos de bacterias. A Isamar y Pablo Buzón por realizar los cultivos de las plantas en el SGI Invernadero y la inoculación de las bacterias Per82 y ayudarme en todo lo posible con las dudas planteadas. Al Profesor Dr. José Antonio Monreal Hermoso del Dpto. Biología Vegetal y Ecología de la Facultad de Biología por ayudarme a comprender los resultados obtenidos y por su disposición a resolver cualquier duda siempre que lo he necesitado. Al Profesor Dr. Luis Valledor González, del Dpto. de Biología de Organismos y Sistemas de la Facultad de Biología de la Universidad de Oviedo, por facilitarme la realización de la estancia para comenzar a introducirnos en el mundo de la estadística. Muchas gracias a todos los miembros del grupo y en especial a las Dras. Cristina López Hidalgo y Laura Lamelas Penas por su cariño y por su eterna paciencia en esas explicaciones sobre estadística y Metabolómica No Dirigida. A la Junta de Andalucía (Proyecto I+D+i FEDER Andalucía 2014-2020: “Producción, aislamiento y caracterización de moléculas de señalización rizobianas inducibles para su utilización como inoculantes moleculares en plantas leguminosas y no leguminosas (INRIMO) (US-1380931)”, responsables: Miguel Ángel Rodríguez Carvajal y Francisco Javier Ollero Márquez), al Ministerio de Ciencia e Innovación (Proyecto Plan Estatal 2017-2020 Retos: “Identificación de Nuevas Señales Moleculares y de Genes Involucrados en la Simbiosis Rizobio-Leguminosa (PID2019-107634RB-I00)”, responsables Francisco Javier López Baena y José Índice i ÍNDICE 1. Introducción 3 1.1. La rizosfera y la biodiversidad microbiana 3 1.2. Acción de los microorganismos PGPR 7 1.3. Metabolismo de las plantas 9 1.3.1. Metabolitos primarios de las plantas 10 Aminoácidos 10 Ácidos orgánicos 10 1.3.2. Metabolitos secundarios de las plantas 13 Fitohormonas 13 Compuestos fenólicos 14 1.4. Alfalfa (Medicago sativa) 15 1.5. Objetivos de la Tesis 16 2. Validación del análisis de fitohormonas mediante UPLC-MS/MS en plantas de alfalfa 19 2.1. Cultivo de plantas de alfalfa 22 2.2. Procedimiento de extracción de las muestras 23 2.3. Análisis de fitohormonas mediante UPLC-MS/MS 25 2.3.1. Cromatografía líquida de ultra alto rendimiento 25 2.3.2. Ionización por electrospray 27 2.3.3. Espectrometría de masas en tándem MS/MS 29 2.3.4. Caracterización de patrones en el análisis UPLC-MS/MS 32 2.4. Análisis preliminar de fitohormonas en plantas de alfalfa mediante UPLC-MS/MS 37 2.5. Validación del método analítico para la determinación cuantitativa de SA y ABA en muestras de alfalfa mediante UPLC-MS/MS 40 2.5.1. Estudio del efecto matriz 41 2.5.2. Linealidad y rango dinámico lineal 46 2.5.3. Sensibilidad. Límites de detección y de cuantificación 50 2.5.4. Exactitud 53 2.6. Cuantificación de fitohormonas en plantas de alfalfa mediante UPLC-MS/MS 66 2.7. Discusión de resultados 68 Índice ii 3. Análisis de Metabolómica Dirigida 73 3.1. Instrumentación y condiciones experimentales 77 3.1.1. Fuentes de ionización 79 3.1.2. Analizador de masas 81 3.1.3. Flujo de iones 82 3.1.4. Modos de adquisición 83 3.2. Análisis de metabolitos mediante UHPLC-HRMS/MS 85 3.2.1. Fitohormonas 88 3.2.2. Ácidos orgánicos 90 3.2.3. Aminoácidos 92 3.2.4. Compuestos fenólicos 95 3.2.5. Flavonoides 99 3.2.6. Caracterización de patrones 107 3.3. Análisis de aminoácidos mediante UHPLC-HRMS/MS. Columna Amida 124 3.4. Análisis de ácidos orgánicos mediante UHPLC-HRMS/MS. Columna HSS T3 127 3.5. Análisis de azúcares mediante GC-HRMS 129 3.5.1. Caracterización de patrones 131 3.6. Análisis de plantas de alfalfa mediante estudios de Metabolómica Dirigida 135 3.6.1. Análisis Targeted Screening de metabolitos mediante UHPLC-HRMS/MS 137 3.6.2. Análisis Targeted Screening de aminoácidos mediante UHPLC-HRMS/MS. Columna Amida 142 3.6.3. Análisis Targeted Screening de ácidos orgánicos mediante UHPLC-HRMS/MS. Columna HSS T3 146 3.6.4. Análisis Targeted Screening de azúcares mediante GC-HRMS 150 3.7. Discusión de resultados 153 4. Análisis de Metabolómica No Dirigida 157 Modos de adquisición 159 Señales metabólicas 161 Anotación de metabolitos 161 Fragmentación in silico 163 4.1. Consideraciones en el estudio de Metabolómica No Dirigida 163 4.1.1. Diseño experimental 164 4.1.2. Análisis 164 Índice iii Aleatorización del análisis 165 Efectos de arrastre entre muestras (carryover). Uso de blancos 165 Disoluciones QC 166 4.1.3. Post-análisis: Tratamiento de resultados 167 4.2. Procesado de datos mediante técnicas estadísticas en estudios de Metabolómica No Dirigida 169 4.2.1. Preprocesado de datos 170 Imputación de valores perdidos 170 Consistencia 171 Balanceo de datos 172 Transformación de los datos 172 4.2.2. Métodos univariables 173 p-valor y q-valor 174 Pruebas post hoc 175 4.2.3. Métodos multivariables 176 Métodos de estadística multivariable 176 Análisis estadístico mediante el diagrama de Venn 178 4.3. Estudio de Metabolómica No Dirigida en plantas de alfalfa 178 4.3.1. Instrumentación y condiciones experimentales 179 4.3.2. Tratamiento de datos en bruto 180 4.3.3. Tratamiento estadístico 187 Preprocesado de datos 187 Análisis univariable 188 Análisis multivariable 190 5. Métodos experimentales 205 5.1. Cultivo de plantas de alfalfa 205 5.1.1. Condiciones de cultivo de las plantas 205 Desinfección y pregerminación de las semillas 205 Condiciones de cultivo de las plantas de alfalfa 205 5.1.2. Cepa microbiana empleada y condiciones de crecimiento 206 5.2. Procedimiento de extracción de las muestras 207 5.3. Análisis de fitohormonas mediante UPLC-MS/MS 207 5.3.1. Separación cromatográfica 207 Índice iv 5.3.2. Espectrómetro de masas 208 Infusión directa de patrones 208 Análisis UPLC-MS/MS 209 5.4. Análisis de Metabolómica Dirigida 209 5.4.1. Análisis de metabolitos mediante UHPLC-HRMS/MS 209 Separación cromatográfica 210 Espectrómetro de masas 211 5.4.2. Análisis de aminoácidos mediante UHPLC-HRMS/MS. Columna Amida 215 Separación cromatográfica 216 Espectrómetro de masas 217 5.4.3. Análisis de ácidos orgánicos mediante UHPLC-HRMS/MS. Columna HSS T3 219 Separación cromatográfica 219 Espectrómetro de masas 220 5.4.4. Análisis de azúcares mediante GC-HRMS 223 Derivatización de las muestras 223 Caracterización de patrones 223 Separación cromatográfica 224 Espectrómetro de masas 225 5.5. Análisis de Metabolómica No Dirigida mediante UHPLC-HRMS/MS 226 5.5.1. Separación cromatográfica 227 5.5.2. Espectrómetro de Masas 227 6. Conclusiones 233 7. Bibliografía 239 8. Anexo I. Tablas de datos de los patrones analizados 259 9. Anexo II. Tablas de resultados de las muestras analizadas 299 1. Introducción Introducción 3 1. INTRODUCCIÓN 1.1. LA RIZOSFERA Y LA BIODIVERSIDAD MICROBIANA La existencia de interacciones beneficiosas entre las bacterias presentes en el suelo y las plantas se conoce desde hace más de un siglo y está firmemente contrastada en diversos tipos de cultivos. Estas interacciones producen un beneficio para ambas partes ya que, al asociarse, las bacterias mejoran su crecimiento y desarrollo, a la vez que protegen a la planta frente a organismos patógenos del suelo. El ejemplo más conocido de asociación beneficiosa, puesto que fue el primer proceso de interacción planta-bacteria del que se tuvo conocimiento y el más ampliamente estudiado, es la simbiosis entre las bacterias fijadoras de nitrógeno (rizobios) y las plantas leguminosas.1 Actualmente se conocen otros microorganismos asociados a plantas, capaces de mejorar su crecimiento, denominados rizobacterias promotoras del crecimiento vegetal (PGPR, Plant Growth-Promoting Rhizobacteria). Se trata de bacterias de vida libre que colonizan la raíz y favorecen el crecimiento de las plantas, por ejemplo, mejorando su nutrición y/o alterando su balance hormonal o actuando como agentes de biocontrol.2 Las PGPR pueden utilizarse como fertilizadores del suelo gracias a su capacidad para movilizar nutrientes3 o como productores de hormonas vegetales que modifican la fisiología de las plantas4, 5 para atenuar el estrés al que está sometida la planta en condiciones de sequía, exceso de salinidad o en suelos degradados (estrés abiótico).6 Además, estas bacterias pueden actuar como agentes protectores frente a diversos patógenos,7, 8 bien indirectamente al competir con ellos por los nutrientes, o bien mediante la producción de compuestos de actividad aséptica, sintetizando enzimas que lisan la pared celular fúngica o induciendo respuestas sistémicas en las plantas huésped. Las plantas liberan una serie de señales químicas para interactuar con otros microorganismos. Estas interacciones se desarrollan en la rizosfera, la zona del suelo cercana a las raíces de la planta donde se desarrolla la vida microbiana, y es de crucial importancia para la salud y la nutrición de la misma. El sistema de raíces, que tradicionalmente se pensaba que proporcionaba anclaje y absorción de nutrientes y agua, es una fábrica química que media en numerosas interacciones subterráneas. Estas incluyen asociaciones mutualistas con microbios beneficiosos, como rizobios, micorrizas, endófitos y PGPR e interacciones parasitarias con otras plantas, Introducción 4 microbios patógenos y herbívoros invertebrados. Las plantas liberan enormes cantidades de productos químicos a través de sus raíces, a un costo significativo de carbono, para combatir los microorganismos patógenos y atraer a los beneficiosos. Las interacciones de la rizosfera se ven afectadas por muchas señales reguladoras diferentes, de las cuales solo se han identificado unas pocas. Las interacciones de la rizosfera no son impulsadas únicamente por las raíces, sino que están altamente integradas e influenciadas por los organismos residentes y los factores edáficos locales. Los mutualistas y parásitos que habitan en el suelo, tanto procariotas como eucariotas, participan activamente en la señalización con un huésped. En la Figura 1.1 se representa esquemáticamente la comunicación química que hay entre las raíces de las plantas y los organismos que existen en la rizosfera.9 En la figura se observa cómo las raíces de las plantas secretan una amplia gama de compuestos, entre los cuales los azúcares y los aminoácidos se dedican a atraer (quimiotaxis) a los microbios (1), los flavonoides actúan como moléculas de señalización para iniciar interacciones con micorrizas (hongos AM) (2), rizobios (3) y hongos patógenos (4), ácidos alifáticos (por ejemplo, el ácido málico) participan en el reclutamiento de PGPR específicas (Bacillus subtilis) (5), los nematodos secretan reguladores del crecimiento (citoquininas) que están involucrados en el establecimiento de sitios de alimentación en las raíces de las plantas (6). Los nematodos secretan otros compuestos (ácidos orgánicos, aminoácidos y azúcares) involucrados en la atracción de bacterias y en la detección de quórum bacteriano (7). Finalmente, las raíces también pueden secretar otros compuestos como ácidos grasos (8) y proteínas (9), entre otros (10), aunque sus funciones en la rizosfera aún se desconocen.9 Introducción 5 Figura 1.1. Representación esquemática de la comunicación química existente entre las raíces de las plantas y los organismos de la rizosfera. (Imagen tomada de Badri et al., 2009)9 Dependiendo de la especie vegetal, las plantas invierten entre el 10 y el 40% de sus metabolitos fotosintéticos en la rizosfera a través de la rizodeposición, donde el suelo rizosférico se fertiliza y se enriquece con nutrientes, aminoácidos y moléculas energéticas orgánicas como los carbohidratos. La fertilización de la rizosfera ejerce una influencia significativa y modifica el microbiota del suelo cerca de las raíces. Las plantas modulan los microorganismos rizosféricos a través de factores fisiológicos vegetales que gobiernan las interacciones plantamicroorganismos y por la composición de sus exudados. Los microorganismos rizosféricos obtienen nutrientes y moléculas energéticas en la rizosfera a partir de la rizodeposición y de las células de borde eliminadas por las raíces. En este sentido, cuanto mayor es el volumen radicular mayor es la deposición y eliminación de estas moléculas y, en consecuencia, la disponibilidad de energía y nutrientes para la Introducción 12 Figura 1.3. Representación esquemática de las interacciones entre el metabolismo del carbono y del nitrógeno.57 En azul se indica la vía de entrada del N. En amarillo, la entrada al metabolismo secundario. La enzima fosfoenolpiruvato carboxilasa (PEPC) es una enzima citosólica clave en el metabolismo del carbono y el nitrógeno, con un papel central en la fotosíntesis, la respiración, la síntesis de aminoácidos y el desarrollo y germinación de las semillas.58, 59 Esta enzima cataliza la β-carboxilación del fosfoenolpiruvato (PEP) para formar el oxaloacetato (OAA) y fosfato inorgánico, a través de la adición de bicarbonato. La PEPC es importante por su papel en la fotosíntesis en plantas C4 y en el metabolismo ácido de crasuláceas (CAM),58, 60 donde lleva a cabo la fijación inicial del CO2 atmosférico; también tiene funciones clave en plantas y tejidos C3, como en semillas, frutos, raíces, estomas, nódulos de leguminosas y otros.57, 59, 61 En la figura se muestra cómo las enzimas PEPC y piruvato quinasa citosólica (PK) tienen un papel fundamental generando los intermediarios necesarios para la asimilación de amonio a través de la vía GS/GOGAT (glutamina sintetasa/glutamina 2-oxoglutarato aminotransferasa), formándose glutamina (Gln) y glutamato (Glu). La formación de Glu puede proceder también a través de la vía GDH (glutamato deshidrogenasa), por reducción del 2-oxoglutarato (2-OG). También se indica la vía de transferencia del grupo amino del Glu al OAA para formar Asp (catalizado por la Introducción 13 aspartato aminotransferasa) y de ahí, la síntesis de otros aminoácidos, así como la síntesis de asparagina (Asn) por transferencia de un grupo amino de Gln a Asp (catalizado por la asparagina sintetasa).62 1.3.2. Metabolitos secundarios de las plantas Fitohormonas Las fitohormonas, también denominadas “hormonas vegetales”, son compuestos producidos por las plantas y se engloban dentro del metabolismo secundarios de las mismas. Son compuestos naturales de baja masa molecular de vital importancia para el funcionamiento normal de las plantas. Aunque las fitohormonas constituyen una parte minoritaria del metaboloma, poseen un interés particular debido a la relación que tienen en la regulación en las plantas de numerosos procesos como pueden ser la germinación, el crecimiento, la reproducción y la respuesta protectora frente al estrés.63-65 Las fitohormonas presentan estructuras muy diversas y se pueden clasificar en diferentes grupos según su estructura y su función biológica. Entre ellos, se encuentran: el ácido salicílico (SA), el ácido abscísico (ABA), jasmonatos, el etileno (Et), auxinas, citoquininas, giberelinas y brasinosteroides.66 Así, por ejemplo, mientras que las fitohormonas responsables del estrés incluyen compuestos como SA, ABA, jasmonatos y Et, las fitohormonas responsables del crecimiento incluyen compuestos como las auxinas, brasinosteroides, citoquininas, o giberelinas, entre otras.67, 68 No obstante, aunque cada hormona presenta funciones biológicas específicas, existen numerosas pruebas de la existencia de interacciones entre las rutas de señalización de fitohormonas en la regulación de procesos fisiológicos y de desarrollo de las plantas. Por lo tanto, una hormona suele intervenir en la regulación de múltiples procesos fisiológicos mediante efectos sinérgicos.69 Por otro lado, las fitohormonas desempeñan un papel fundamental en las interacciones con microbios patógenos y beneficiosos, así como en el crecimiento y desarrollo de las plantas,70 además de sintonizar las respuestas de las plantas al estrés biótico y abiótico. Están implicadas en diversas redes complejas, a través de las cuales modulan las respuestas a diferentes estímulos. Por ejemplo, la defensa de las Introducción 14 plantas frente al estrés está regulada principalmente por las fitohormonas SA, ABA, el ácido jasmónico (JA) y el Et.71 Otras fitohormonas, conocidas sobre todo por su papel en el crecimiento y el desarrollo de las plantas, han demostrado recientemente desempeñar un papel en las interacciones planta-patógeno como, por ejemplo, las auxinas, los brasinosteroides, las citoquininas y ABA.71-74 Compuestos fenólicos Los compuestos fenólicos son un grupo de metabolitos derivados de las rutas metabólicas secundarias de las plantas. Se caracterizan por tener algún anillo aromático unido a, al menos, un grupo hidroxilo. Los que poseen varios grupos hidroxilo de este tipo se denominan “polifenoles” y comprenden flavonoides, ácidos fenólicos, taninos, lignanos y cumarinas. Estos compuestos se encuentran naturalmente en frutas, verduras, cereales, raíces y hojas, entre otros productos vegetales y su carácter antioxidante parece ser beneficioso frente a enfermedades de estrés oxidativo.75 Estos compuestos son característicos de las plantas y forman, en general, los “metabolitos secundarios”, que resultan ser cruciales para muchos aspectos funcionales importantes de la vida vegetal incluyendo roles estructurales en diferentes tejidos protectores o de apoyo, participación en estrategias de defensa y propiedades de señalización, particularmente en las interacciones entre las plantas y su medioambiente.76 Presentan gran diversidad estructural, pudiéndose dividir en diez clases diferentes dependiendo de su estructura química básica: compuestos fenólicos simples, benzoquinonas, ácidos benzoicos, acetofenonas, ácidos fenilacéticos, ácidos cinámicos, fenilpropenos, cumarinas, cromonas, naftoquinonas, xantonas, estilbenos, antraquinonas, flavonoides, lignanos, neolignanos, taninos y ligninas.76 Los ácidos fenólicos se encuentran ampliamente distribuidos en la naturaleza y suelen estar presentes en las plantas en forma libre o unidos a azúcares y/o proteínas. Las principales clases de ácidos fenólicos observados en el reino vegetal son C6-C1 y C6-C3. Los ácidos fenólicos C6-C1 pueden presentar una estructura derivada del ácido hidroxibenzoico (ácido gálico, ácido protocatequico, Introducción 15 ácido vanílico, etc.), mientras que los C6-C3 son estructuras relacionadas con el ácido hidroxicinámico (ácido caféico, ácido p-cumárico, ácido ferúlico, ácido sinápico, etc.). La diferencia de estos compuestos es la variación de los grupos en las posiciones C3, C4 y C5.77 La presencia de compuestos fenólicos en las plantas se suele estudiar con frecuencia debido a sus beneficios potenciales para la salud y se han reconocido que los ácidos fenólicos tienen propiedades antibacterianas, antivirales, anticancerígenos, antiinflamatorios y actividades vasodilatadoras.77 1.4. ALFALFA (MEDICAGO SATIVA) La alfalfa (Medicago sativa) pertenece a la familia de las leguminosas, que son plantas de gran interés y fuentes muy importantes de proteínas en la alimentación humana y animal. Esta planta es conocida como “la reina de los forrajes” y es uno de los cultivos forrajeros más importantes. Se cultiva ampliamente en todo el mundo debido a su alto rendimiento, calidad y adaptabilidad a un entorno cambiante. La alfalfa con un alto rendimiento forrajero es uno de los factores más importantes en la cría de ganado.78 Las plantas forrajeras se introdujeron en gran medida en los sistemas agrícolas europeos a partir del período del Renacimiento, donde reemplazaron el barbecho y aumentaron así la producción de forraje y el nitrógeno disponible para los siguientes cultivos de cereales.79 El avance esperado hacia sistemas agrícolas y ganaderos más sostenibles implica un cultivo más amplio de leguminosas forrajeras perennes. La alfalfa es la principal leguminosa perenne en la mayoría de las regiones templadas, especialmente donde los sistemas agrícolas dependen en gran medida de la conservación del forraje. Las leguminosas perennes pueden ofrecer ventajas agronómicas y ambientales comparables e incluso mayores en términos de fertilidad del suelo, tasa de fijación de nitrógeno por año de cultivo y reducción de energía y emisiones de gases de efecto invernadero, como pueden ser: - La maximización de la producción de proteína alimenticia por unidad de área, cuando se cultiva en monocultivo. - Requerir menos aplicaciones de pesticidas y herbicidas, y mostrar una mejor protección del suelo contra la erosión. Introducción 16 - Pueden hacer un mejor uso del agua en áreas propensas a la sequía, a través de un rebrote más rápido al comienzo de la temporada de lluvias que las plantas anuales recién sembradas. - Es posible su cultivo en ambientes marginales. - Permiten el ahorro de costos para las operaciones de labranza y siembra. - Son adecuados para cultivos energéticamente eficientes, como las mezclas de leguminosas y gramíneas, en las que se produce una transferencia significativa de nitrógeno subterráneo de las leguminosas a las no leguminosas. - Tienen una notable flexibilidad de utilización (heno, ensilaje, pastoreo, gránulos con alto contenido de proteínas). - Tienen un buen potencial como cultivo de alimentación y energía de doble propósito. Aunque muchas leguminosas perennes pueden potencialmente cultivarse para forraje, las especies de gran interés real son relativamente pocas. La alfalfa se considera la principal, con un área de cultivo mundial estimada de alrededor de 30 millones de hectáreas ubicadas principalmente en América del Norte, Europa y América del Sur y su uso en expansión en Australia y China.79 1.5. OBJETIVOS DE LA TESIS El objetivo la Tesis ha sido el desarrollo de diferentes métodos de análisis haciendo uso de la espectrometría de masas acoplada a técnicas de separación cromatográfica, aplicando una extracción simple de las muestras, que nos permita realizar un estudio global de Metabolómica en matrices vegetales de diferente índole, en nuestro caso, plantas de alfalfa (Medicago sativa). La presente Tesis se compone de seis capítulos. En el primer capítulo se detalla la introducción. El segundo capítulo describe la toma y extracción de las muestras, la determinación de las fitohormonas SA, ABA y JA y la validación del método analítico utilizado para su cuantificación en las plantas de alfalfa mediante UPLC-MS/MS. El tercer capítulo desarrolla diferentes metodologías para el estudio de Metabolómica Dirigida de compuestos de diferente naturaleza. El cuarto capítulo describe el estudio de Metabolómica No Dirigida en las plantas de alfalfa mediante un enfoque descriptivo del análisis. Todos los métodos experimentales se encuentran detallados en el quinto capítulo. Finalmente, en el sexto capítulo, se recogen las conclusiones. 2. Validación y cuantificación Validación y cuantificación 19 2. VALIDACIÓN DEL ANÁLISIS DE FITOHORMONAS MEDIANTE UPLC-MS/MS EN PLANTAS DE ALFALFA Las hormonas vegetales o fitohormonas son compuestos naturales de baja masa molecular presentes en las matrices de origen vegetal y responsables de la respuesta biológica de las plantas. Nuestro interés por llevar a cabo un estudio de validación de un método analítico que nos permita determinar la concentración de ciertas hormonas vegetales se debe al papel tan importante que desarrollan estos compuestos en la regulación en numerosos procesos de las plantas como pueden ser la germinación, el crecimiento, la reproducción y la respuesta protectora frente al estrés y mecanismos de defensa de las plantas. Las hormonas vegetales que inicialmente se han analizado con este método son el ácido salicílico (SA), el ácido abscísico (ABA) y el ácido jasmónico (JA). El ácido salicílico es una fitohormona multifuncional y es importante principalmente por su participación en la resistencia a patógenos en plantas.80 El ácido abscísico es una hormona del estrés vital de las plantas a la hora de hacer frente a condiciones ambientales adversas, como puede ser el debido al estrés por sequía.78 Por su parte, el ácido jasmónico desempeña un papel crucial en el crecimiento y desarrollo de las plantas.81 La cromatografía líquida acoplada a la espectrometría de masas (LC-MS, Liquid Chromatography coupled to Mass Spectrometry) es una de las técnicas más empleadas actualmente para el análisis de sistemas complejos, ya que la capacidad de separación de mezclas del sistema de cromatografía de alta resolución se une a la gran sensibilidad, universalidad, selectividad y capacidad de identificación de la espectrometría de masas. Sin embargo, esta técnica presenta algunos puntos débiles. Entre ellos, la eficiencia de la formación o evaporación de las gotas generadas en la fuente de electrospray va a depender de la naturaleza del analito y del extracto biológico a analizar y, en consecuencia, puede afectar a la cantidad de iones cargados en fase gaseosa que finalmente llegan al detector. Este efecto se conoce como “efecto de supresión de iones” y es relativamente frecuente. En algunos casos, sin embargo, se puede observar un aumento de la señal; a este efecto se le conoce como “exaltación de iones”. En cualquier caso, esta alteración en la cantidad real iones puede provocar variaciones en la sensibilidad general e inestabilidad en la señal de los datos adquiridos mediante LC-MS, comprometiendo la interpretación de los datos obtenidos.82, 83 Validación y cuantificación 20 Hay diversas fuentes de supresión de iones, como pueden ser las producidas por el efecto matriz o la coelución de analitos. Además, el ensuciamiento de la fuente de iones, la inestabilidad del vacío y envejecimiento del multiplicador de iones también conducen a cambios graduales en la sensibilidad y la intensidad de la señal de referencia a lo largo del tiempo. Es por ello, que se han desarrollado diversos métodos para resolver el problema de la inestabilidad de la señal en los análisis de LC-MS. Entre ellos: la optimización de los procedimientos de extracción y/o purificación para la reducción del efecto matriz en las muestras o la utilización de patrones internos.82 Respecto al uso de patrones o estándares internos, estos deben tener una estructura similar a la del analito de interés, al menos idealmente; en este sentido, los más adecuados son los analitos marcados isotópicamente. Sin embargo, debido a la limitada disponibilidad de analitos análogos marcados isotópicamente, a menudo se suelen utilizar como patrones internos compuestos no marcados isotópicamente pero que presentan tiempos de retención cercanos a los analitos de interés. En este caso hay que asegurarse de que el compuesto elegido no se encuentra presente naturalmente en las muestras en estudio. Normalmente es necesario utilizar dos o más estándares internos cuando se determinan varios analitos simultáneamente en la misma muestra. Esto hace que se obtengan mejores resultados cuantitativos que cuando se usa un único estándar interno en el análisis. Es por todo ello que se han utilizado patrones internos para el análisis de fitohormonas mediante UPLC-MS/MS. En nuestro caso, se han utilizado tres patrones internos: el ácido salicílico-d4 (SA-d4), el ácido abscísico-d6 (ABA-d6) y el ácido dihidrojasmónico (DJA), los cuales se han usado para la cuantificación de SA, ABA y JA, respectivamente. Las estructuras de las fitohormonas, así como de los estándares internos se muestran en la Tabla 2.1. Validación y cuantificación 21 Estructura fitohormonas Estructura patrones internos Ácido salicílico (SA) Ácido salicílico-d4 (SA-d4) Ácido abscísico (ABA) Ácido abscísico-d6 (ABA-d6) Ácido jasmónico (JA) Ácido dihidrojasmónico (DJA) Tabla 2.1. Estructuras de las fitohormonas SA, ABA y JA y de los patrones internos SA-d4, ABA-d6 y DJA. El presente capítulo describe las etapas necesarias para la determinación cualitativa y cuantitativa mediante UPLC-MS/MS de las fitohormonas SA, ABA e, inicialmente JA, en plantas de alfalfa, así como el procedimiento de la validación del método analítico para la determinación de SA y ABA en plantas de alfalfa según la metodología propuesta. No se incluye JA en el procedimiento de validación al no encontrar cantidades significativas de esta fitohormona durante los estudios previos de las muestras. O OH COOH D D D D D D Validación y cuantificación 28 un aerosol con gotas altamente cargadas de 1-2 µm de diámetro (cono de Taylor). La generación de estas gotas puede facilitarse por la aplicación de un gas nebulizador cuya salida es coaxial al capilar. Las gotas altamente cargadas deben pasar a través de un gradiente de presión y potencial en su camino al analizador de masas, ya que la fuente de ionización se encuentra a presión atmosférica. Un esquema de la fuente de electrospray se muestra en la Figura 2.3. Figura 2.3. Esquema de una fuente ESI. (Imagen tomada de “Atmospheric Pressure Ionization Sources: Their Use and Applicability [White paper]”. Waters, 2017). Se han postulado dos mecanismos para la formación de los iones a partir de las gotas cargadas. El primero propone que las gotas se reducen de tamaño por la evaporación de disolvente (ayudado por calor o por un gas de desolvatación o “gas cortina”) y/o por rotura de estas debido al aumento de la densidad de carga en la gota al disminuir de tamaño (explosión de Coulomb). El resultado de sucesivas evaporaciones y roturas es una serie de iones de carga simple o múltiple. Validación y cuantificación 29 El segundo mecanismo propuesto (modelo de ion-evaporación), basado en los trabajos de Thompson e Iribarne89, 90 considera que el ion del analito es “expulsado” de la gota cuando esta es muy pequeña debido a fuerzas de repulsión entre la carga del ion y otras cargas dentro de la gota. La ionización por electrospray, al realizarse a presión atmosférica, es extremadamente suave, consiguiendo iones pseudomoleculares intactos y evitando la rotura de enlaces covalentes por muy débiles que sean. Por último, dado que la ionización por electrospray puede producir abundancia de iones con carga múltiple según la naturaleza del analito, la técnica permite determinar masas moleculares de moléculas muy grandes (iones de masas muy elevadas aparecen en el espectro a valores m/z mucho más bajos), como por ejemplo péptidos y proteínas. 2.3.3. Espectrometría de masas en tándem MS/MS Una vez que se han formado los iones en la fuente de ionización, estos deben ser separados y analizados de acuerdo con su relación m/z. En nuestro caso, el equipo que se ha usado para realizar los experimentos de espectrometría de masas (MS o MS1) y experimentos en tándem masas/masas (MS/MS o MS2) está constituido por varios componentes según se muestra en la Figura 2.4. Estos son: el sistema de introducción de muestra, la fuente de ionización, el primer analizador de masas (Q1), la cámara o celda de colisión (T-wave collision cell, de Waters), el segundo analizador de masas (Q2) y el detector. Validación y cuantificación 30 Figura 2.4. Esquema del analizador de masas del espectrómetro de masas Xevo TQ-S micro (Waters). En este sistema, las muestras se pueden introducir al espectrómetro de masas mediante infusión directa de los compuestos a través de un sistema de válvulas y jeringas o, como en nuestro caso, mediante un cromatógrafo UPLC. El analizador de masas consiste en dos analizadores de tipo cuadrupolo (Q1 y Q2) dispuestos en tándem. La celda de colisión opera como cámara de colisión de baja energía. El modo de trabajo MS/MS consiste en que, a partir de una mezcla de iones generados en la fuente de ionización ESI, el primer analizador de cuadrupolo Q1 permite seleccionar un determinado ion (ion precursor). El haz de iones generado es direccionado y acelerado a la celda de colisión que contiene un gas noble (Ar), donde la colisión con los átomos del gas provoca la disociación de los iones. Los iones generados de esta colisión (iones producto) son separados en el segundo analizador (Q2). Esta técnica se conoce con el nombre de disociación inducida por colisión (CID, Collision Induced Dissociation). Se han empleado dos modos de trabajo para la caracterización de los diferentes patrones: 1) Product Ion Scan (PIS) y 2) Multiple-Reaction Ion Monitoring (MRM). Validación y cuantificación 31 1) El modo de trabajo PIS se utiliza para caracterizar los espectros MS/MS de cada patrón individual. Una representación esquemática del experimento Product Ion Scan se muestra en la Figura 2.5. Figura 2.5. Representación esquemática del experimento PIS. 2) Una vez se tiene la información de los iones precursores y de los iones producto más intensos de cada compuesto, se aplica el método MRM, en el cual, en el primer cuadrupolo se selecciona el ion precursor y en el segundo cuadrupolo se selecciona un ion producto procedente de una o varias fragmentaciones características. Solo cuando se observe esa fragmentación particular, el equipo registrará la señal. Este modo de trabajo en el espectrómetro de masas hace que esta técnica sea muy sensible y selectiva. En la Figura 2.6 se puede observar una representación esquemática del experimento MRM. Figura 2.6. Representación esquemática del experimento MRM. Validación y cuantificación 32 2.3.4. Caracterización de patrones en el análisis UPLC-MS/MS La identificación y cuantificación de las fitohormonas requiere el análisis previo de los patrones de estructura conocida. Esto nos permite caracterizar cada patrón de manera que se obtiene información tanto de los iones precursores como de sus correspondientes iones producto. La caracterización de patrones se ha realizado en varias etapas: 1) Análisis de los compuestos mediante infusión directa y la adquisición de experimentos PIS para obtener los fragmentos característicos de cada analito de interés. 2) Optimización del método MRM en función de los iones precursores y fragmentos previamente seleccionados tras aplicar el método PIS. 3) Elución cromatográfica de los compuestos para obtener los tiempos de retención, aplicando el método MRM optimizado. Infusión directa de patrones para obtener el espectro de masas La infusión directa de los patrones de las hormonas vegetales SA, ABA y JA y de los patrones internos SA-d4, ABA-d6 y DJA ha permitido obtener el ion pseudomolecular o precursor de cada compuesto. Para ello, se prepara una disolución de 1 µg/ml de cada patrón y se introduce en el espectrómetro de masas a través de la fuente de ionización (ESI) mediante un sistema de infusión directa al instrumento a un flujo de 10 µl/min. Los parámetros empleados se detallan en el apartado 5.3.2. Infusión directa de patrones para obtener el espectro MS/MS y optimización del método MRM Una vez que se tenemos información del espectro de masas del compuesto, es necesario romper la molécula para obtener los iones producto característicos de cada analito. Esto se realiza infusionando cada compuesto y rompiéndolo, utilizando CID en un experimento PIS. En este experimento, los iones generados en la fuente de ionización son transferidos hacia el analizador de masas. Una vez en el analizador, Validación y cuantificación 33 el primer cuadrupolo (Q1) filtra un ion precursor específico, denominado ion pseudomolecular [M+H]+ o [M-H]–, dependiendo del modo de ionización empleado. Estos iones son acelerados aplicando una diferencia de potencial hasta llegar a la celda de colisión, donde se generan los iones fragmento que, posteriormente, se detectan en el cuadrupolo Q2. En la Figura 2.7 se muestra, como ejemplo, el espectro MS/MS que se obtiene para una disolución patrón de 1 µg/ml de SA en MeOH:H2O:FA (50:50:0,1, v/v/v) trabajando en modo negativo. Figura 2.7. Espectro MS/MS del SA obtenido mediante ESI-MS/MS en modo de ionización negativo en el espectrómetro de masas Waters Xevo TQ-S micro a una energía de colisión (CE) de -30 eV. De esta manera, al fragmentar la molécula con un experimento PIS se obtiene información de los fragmentos característicos de cada compuesto. La creación del método MRM consiste en monitorizar dos transiciones MRM para cada compuesto. Cada transición requiere la siguiente información: ion precursor, ion fragmento, voltaje de cono y energía de colisión. En el espectro MS/MS obtenido se seleccionan los iones fragmento más intensos para crear el método MRM. Esto nos permite obtener la máxima sensibilidad de trabajo en el método optimizado. Una vez seleccionados los iones fragmento en el espectro MS/MS, se optimizan los parámetros de energía de colisión (CE, Collision Energy) y voltaje de cono para cada Validación y cuantificación 34 compuesto. Cada par ion precursor/ion producto (transición MRM) presenta sus propios parámetros característicos. En la Tabla 2.2 se muestran las transiciones MRM optimizadas para cada compuesto caracterizado. Normalmente, se usan dos transiciones MRM para cada analito. La transición mayoritaria (mayor intensidad relativa) se suele usar como cuantificadora y la de menor intensidad como confirmatoria. Fitohormona Transición MRM Voltaje de Cono (V) CE (eV) SA 137/65 (4) 137/93 (100) -30 -30 -25 -15 SA-d4 141/69 (3) 141/97 (100) -10 -10 -24 -15 ABA 263/153 (100) 263/204 (20) -30 -30 -10 -18 ABA-d6 269/159 (100) 269/207 (18) -22 -22 -8 -20 JA 209/59 (100) 209/109 (2) -30 -30 -12 -20 DJA 211/59 (100) 211/111 (3) -28 -28 -12 -20 Tabla 2.2. Parámetros optimizados para las fitohormonas patrón SA, ABA y JA y sus patrones internos, SA-d4, ABA-d6 y DJA. Entre paréntesis se indican las áreas relativas que presentan los iones fragmento seleccionados. Se indican el voltaje de cono (V) y la CE (eV) para cada transición seleccionada. De las dos transiciones MRM optimizadas para caracterizar el compuesto, se suele elegir la transición mayoritaria como transición cuantificadora y la segunda de mayor intensidad como confirmatoria. Al tratarse de compuestos que presentan un grupo carboxilo en su estructura (Tabla 2.1), la pérdida de un protón en la molécula resulta ser un proceso muy favorable, por lo que el análisis de estos compuestos se realiza utilizando polaridad negativa y los iones pseudomoleculares son fundamentalmente de tipo [M-H]–. Este mismo grupo funcional es responsable de algunas fragmentaciones, como puede ser la pérdida del grupo carboxilo generando fragmentos del tipo [M-H-CO2]–. En el caso del SA, dicha pérdida es muy favorable (Figura 2.8) observándose en el espectro MS/MS el ion a m/z 93.91-93 Por supuesto, cada fragmentación dependerá de Validación y cuantificación 35 la estructura concreta de cada compuesto y de si existen en dicha estructura enlaces más lábiles que den lugar a fragmentaciones más favorables. Figura 2.8. Esquema de fragmentación del SA. Análisis mediante cromatografía líquida de ultra alto rendimiento (UPLC) Una vez optimizado el método MRM, se puede aplicar a la detección de los distintos analitos separados mediante cromatografía UPLC y determinar así sus tiempos de retención. El perfil cromatográfico utilizado se detalla en el apartado 5.3.1. Se han preparado disoluciones de cada patrón de fitohormona individualmente y mezclas de estas a concentraciones comprendidas entre 100 y 1.000 ng/ml para cada compuesto, disueltos en MeOH:H2O:FA (10:90:0,1, v/v/v). La Tabla 2.3 recoge los tiempos de retención en minutos de las hormonas vegetales empleadas como patrones. O O OH O H OCO C O -CO m/z 65m/z 93m/z 137 -CO2 Validación y cuantificación 36 Fitohormona tR (min) SA 3,47 SA-d4 3,44 ABA 4,17 ABA-d6 4,16 JA 4,57 DJA 4,99 Tabla 2.3. Tiempos de retención (tR) de cada fitohormona y de los patrones internos. En la Figura 2.9 se muestra el cromatograma TIC (Total Ion Chromatogram) de una disolución mezcla de patrones de SA, ABA y JA de 100 ng/ml de concentración en MeOH:H2O:FA (10:90:0,1, v/v/v). La intensidad en el modo TIC es la suma de las respuestas del detector de todos los iones registrados en cada momento. Figura 2.9. Cromatograma de UPLC de una mezcla de patrones de fitohormonas SA, ABA y JA de 100 ng/ml de concentración, adquirido en modo MRM en polaridad negativa. En los cromatogramas se muestran el TIC (Total Ion Chromatogram) de cada analito. Validación y cuantificación 37 De forma análoga, se pueden representar cromatogramas de uno o varios valores de m/z característicos de cada compuesto. En ese caso, los cromatogramas se denominan “cromatogramas de iones extraídos” (XIC, Extracted Ion Chromatogram) (Figura 2.10). Figura 2.10. Cromatograma obtenido por el método MRM de la hormona vegetal ABA. Los picos cromatográficos a tR = 4,14 min corresponden a las transiciones MRM: A) 263/153 y B) 263/204. 2.4. ANÁLISIS PRELIMINAR DE FITOHORMONAS EN PLANTAS DE ALFALFA MEDIANTE UPLC-MS/MS En el análisis de fitohormonas mediante UPLC-MS/MS ha sido necesario determinar cualitativamente los analitos de interés, previo al análisis cuantitativo y posterior validación del método. Este paso previo es muy importante, dado que nos da información acerca de si se detecta o no el compuesto y en qué rango de concentración aproximado se encuentra para la posterior puesta a punto de la determinación cuantitativa. Para la determinación cualitativa, las muestras de alfalfa procedentes de la extracción se preparan para el análisis UPLC-MS/MS según se describe en los apartados 5.2 y 5.3. Brevemente, el extracto seco procedente de la extracción de plantas de alfalfa se resuspende, se microfiltra y se analiza mediante UPLC-MS/MS. Validación y cuantificación 44 Fitohormona 𝒃 𝑪 . 𝑬 . 𝒔 𝒃 𝑪 . 𝑬 . 𝒃 𝑨 . 𝑷 . 𝒔 𝒃 𝑨 . 𝑷 . 𝒕 𝒄𝒂𝒍 𝒕 𝒕𝒂𝒃 ( 𝟗𝟓 % ) SA Ensayo 1 1,119 0,004 1,144 0,011 2,203 2,262 Ensayo 2 1,119 0,004 1,126 0,015 0,445 2,306 ABA Ensayo 1 1,825 0,022 1,824 0,067 0,021 2,262 Ensayo 2 1,825 0,022 1,813 0,056 0,203 2,228 Tabla 2.4. Aplicación la prueba t de Student para comparar las pendientes de las curvas de C.E. y A.P. para el estudio del efecto matriz de las fitohormonas SA y ABA. En el estudio del efecto matriz, aplicando la prueba t de Student para la comparativa de pendientes, se obtiene que los valores de 𝑡 son menores que los valores de 𝑡(%) tanto para SA como para ABA en los dos ensayos realizados. Esto quiere decir, que no existe efecto matriz para ambas fitohormonas y, por tanto, podemos emplear el método C.E. en el análisis. Adicionalmente, en la Figura 2.12 y Figura 2.13 se representan las pendientes de las curvas de calibrado obtenidas mediante el método de C.E. y A.P. de los ensayos 1 y 2 de SA y ABA, respectivamente. En las gráficas se observa que las rectas de C.E. y A.P. presentan pendientes casi idénticas, por lo que, el efecto matriz no es significativo. Validación y cuantificación 45 Figura 2.12. Estudio del efecto matriz mediante el método de comparación de pendientes. En la gráfica se muestran las rectas de calibrado mediante C.E. y A.P. (restando la ordenada en el origen) para el SA (ensayos 1 y 2). Figura 2.13. Estudio del efecto matriz mediante el método de comparación de pendientes. En la gráfica se muestran las rectas de calibrado mediante C.E. y A.P. (restando la ordenada en el origen) para el ABA (ensayos 1 y 2). 0 50 100 150 200 250 0 50 100 150 200 Aanalito/API Concentración (ng/ml) CE AP Ensayo 1 AP Ensayo 2 0 5 10 15 20 25 30 35 40 0 5 10 15 20 Aanalito/API Concentración (ng/ml) AP Ensayo 1 AP Ensayo 2 CE Validación y cuantificación 46 El estudio del efecto matriz también se ha realizado según las consideraciones realizadas por Cocuron et al.107 Para determinar si existe efecto matriz utilizando el %ME, las muestras se han dopado con los estándares en un rango comprendido entre 5 y 1.000 ng/ml, manteniendo las concentraciones de los patrones internos en 50 ng/ml. En la Tabla 2.5 se presentan los resultados obtenidos del %ME para las fitohormonas SA y ABA. Fitohormona %ME ± sd SA 102 ± 4 ABA 101 ± 15 Tabla 2.5. Efecto matriz, %ME ± sd (desviación estándar) calculado para las fitohormonas SA y ABA. En el estudio del efecto matriz, aplicando las consideraciones de Cocuron et al.,107 se obtiene que los valores del %ME para SA y ABA se encuentran próximas al 100%, por tanto, se concluye que no existe efecto matriz para ambas fitohormonas. De ambos estudios se concluye que no existe efecto matriz en la medida de SA y ABA en las condiciones del ensayo y, por tanto, se puede trabajar utilizando el método de C.E. 2.5.2. Linealidad y rango dinámico lineal La linealidad de un método analítico representa el rango de concentraciones de analito sobre el cual el método da resultados proporcionales a la concentración del analito.104 En el estudio de la validación de un método analítico, la linealidad indica la dispersión de los datos alrededor de una recta de calibrado y viene dada por la siguiente expresión:108 𝐿𝑖𝑛𝑒𝑎𝑙𝑖𝑑𝑎𝑑 (%)=(1−𝑠 𝑏)·100 Validación y cuantificación 47 Donde 𝑏 es la pendiente de la recta de calibrado y 𝑠 la desviación estándar de la pendiente en dicha recta de calibrado. Para que una regresión sea lineal, este valor tiene que ser próximo al 100%. El rango dinámico lineal es el rango de concentraciones en el cual existe linealidad. El rango dinámico lineal se calcula según el procedimiento descrito por Huber.94, 104, 109 Este procedimiento es bastante eficiente a la hora de determinar el rango lineal apropiado del analito en la calibración. Para ello, se calcula el factor de respuesta (𝑅𝐹) obtenido dividiendo la respuesta del analito (en nuestro, caso el área relativa) por la concentración del analito en todo el rango de concentraciones. Se construye una gráfica en la cual, el eje de ordenadas corresponde al 𝑅𝐹 y el eje de abscisas corresponde a la concentración de analito. La línea que se obtiene debe tener una pendiente próxima a cero (horizontal) en el rango de concentraciones. Además, se calcula la mediana de los factores de respuesta, M, trazando una recta en la gráfica en este valor y dos rectas más con valores 0,95M y 1,05M. Los puntos experimentales que se encuentren entre esas dos líneas corresponden al intervalo lineal. Resultados obtenidos del estudio de linealidad y rango dinámico lineal Para el estudio de linealidad y rango dinámico lineal, se preparan diferentes disoluciones de estándares de SA y ABA comprendidas entre 5 y 1.000 ng/ml de concentración en una mezcla MeOH:H2O:FA (10:90:0,1, v/v/v), manteniendo la concentración de los patrones internos constante (50 ng/ml). Cada disolución se ha inyectado por triplicado (n = 3). En el caso del estudio del rango lineal, las gráficas (Figura 2.14 y Figura 2.15) muestran que los rangos lineales de trabajo tanto para SA como para ABA se encuentran comprendidos entre 5 y 1.000 ng/ml. Validación y cuantificación 48 Figura 2.14. Gráfica del estudio del rango lineal para el SA. Figura 2.15. Gráfica del estudio del rango lineal para el ABA. A continuación, en la Tabla 2.6 se presentan los resultados de la ecuación de la recta de calibrado, del coeficiente de regresión (r2), el % de linealidad y el intervalo lineal de trabajo para cada fitohormona. En esta tabla se puede observar 0,0254 0,0259 0,0264 0,0269 0,0274 0,0279 0,0284 0,0289 0 100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 RFi Concentración (ng/ml) Rango Lineal ABA RFi M 0,95M 1,05M Validación y cuantificación 49 cómo ambas hormonas vegetales presentan valores de linealidad cercanos a 100% y coeficientes de correlación muy próximos a la unidad. Fitohormona Ecuación de la recta de calibrado Coeficiente de regresión (r2) %linealidad Intervalo lineal (ng/ml) SA y = 0,0223x + 0,0575 0,9999 99,8 5 - 1000 ABA y = 0,0267x + 0,0440 0,9997 99,7 5 - 1000 Tabla 2.6. Resultados de la ecuación de la recta de calibrado, coeficiente de regresión (r2), %linealidad y rango lineal de trabajo en ng/ml (ppb) de disolución para las fitohormonas SA y ABA. Las rectas de calibrado que se obtienen para SA y ABA se muestran en la Figura 2.16 y Figura 2.17, respectivamente. Figura 2.16. Recta de calibrado CE del SA (5-1.000 ng/ml), utilizando el patrón interno SA-d4 (50 ng/ml). y = 0,0223x + 0,0575 R² = 0,9999 0 5 10 15 20 25 0 100 200 300 400 500 600 700 800 900 1.000 Area relativa Concentración (ng/ml) Validación y cuantificación 50 Figura 2.17. Recta de calibrado CE del ABA (5-1.000 ng/ml), utilizando el patrón interno ABA-d6 (50 ng/ml). 2.5.3. Sensibilidad. Límites de detección y de cuantificación La sensibilidad es el cambio en la respuesta analítica dividida por el correspondiente cambio en la concentración del analito. Si la calibración es lineal, la sensibilidad viene dado por la pendiente de la recta de calibrado a cualquier valor de la concentración del analito. Además de la sensibilidad, hay dos parámetros derivados de esta, más utilizados para su cálculo: el límite de detección (LOD, Limit of Detection) y el límite de determinación o cuantificación (LOQ, Limit of Quantitation).94 Hay diversos términos que han sido usados para definir el LOD y el LOQ. En general, el LOD se define como la mínima concentración de analito puede ser detectado en la muestra y que se distingue de la señal del cero (o del nivel de ruido del instrumento) con seguridad, pero no necesariamente cuantificado bajo las condiciones del análisis. El LOQ es la mínima concentración de analito que puede ser determinado en la muestra con un aceptable nivel de precisión y exactitud bajo las condiciones del análisis. Dependiendo de la entidad reguladora, como pueden ser la IUPAC, la AOAC, la ICH, etc., hay diversos modos de calcular el LOD y el LOQ.94, 110 En nuestro caso se van a seguir las consideraciones que realiza la ICH.98, 102 y = 0,0267x + 0,044 R² = 0,9997 0 5 10 15 20 25 30 0 100 200 300 400 500 600 700 800 900 1.000 Area relativa Concentración (ng/ml) Validación y cuantificación 51 En principio, ambos parámetros se pueden estimar teniendo en cuenta las siguientes expresiones, respectivamente:94 𝑌=𝑌+3𝑠 𝑌=𝑌+10𝑠 Donde 𝑌 y 𝑠 son, respectivamente, el valor medio de la señal del blanco y su correspondiente desviación estándar obtenidos de, al menos, diez medidas de muestras “blanco”, sin analito de interés. Alternativamente, cuando la señal del blanco no produce respuesta alguna, se miden 10 muestras de blancos independientes fortificadas con la mínima concentración aceptable de analito, por lo que, 𝑌=3𝑠, siendo 𝑠 la desviación estándar del conjunto de medidas. Sin embargo, es difícil manejar estas expresiones en unidades de respuesta y resulta más adecuado usar unidades de concentración. En ese caso, los valores de 𝑌 y 𝑌 se convierten en 𝑋 y 𝑋 cuando se usa una función de calibración del tipo 𝑌=𝑎+𝑏·𝑋, por lo que: 𝑋=𝑌−𝑎 𝑏 𝑋=𝑌−𝑎 𝑏 Y finalmente los valores de LOD y LOQ, considerando la intercepción con el eje de ordenadas igual a 0, es decir, 𝑎=0, vienen dados por las expresiones: Validación y cuantificación 52 𝑋=3𝑠 𝑏 𝑋=10𝑠 𝑏 Donde 𝑋 y 𝑋 son los límites de detección y de cuantificación en unidades de concentración, respectivamente, 𝑠 es la desviación estándar de la señal del blanco, 𝑎 es la ordenada en el origen y 𝑏 es la pendiente de la recta de calibrado. Este tipo de cálculo del LOD y LOQ se suele utilizar cuando, en el análisis de los blancos, dan lugar a desviaciones estándar distintas de cero. Sin embargo, cuando se utilizan regresiones de tipo lineal, como es nuestro caso, se suelen usar las siguientes expresiones:110 𝐿𝑂𝐷= 3𝑠 𝑏 𝐿𝑂𝑄=3𝑠 𝑏 Donde LOD y LOQ son el límite de detección y de cuantificación de un determinado analito, respectivamente, expresados en unidades de concentración, 𝑠 es la desviación estándar de la ordenada en el origen o de la respuesta y 𝑏 es la pendiente de la recta de calibrado. Validación y cuantificación 53 Resultados obtenidos del estudio de la sensibilidad. Límites de detección y de cuantificación En nuestro caso, dado que se está trabajando con regresiones de tipo lineal, los parámetros LOD y LOQ se calculan a partir de estas últimas expresiones. En la Tabla 2.7 se muestran los resultados obtenidos: Fitohormona LOD ng/ml LOQ ng/ml SA 2,43 8,08 ABA 3,50 11,67 Tabla 2.7. LOD y LOQ obtenidos para SA, ABA en ng/ml de disolución. De los resultados obtenidos se concluye que el LOD y el LOQ del SA son un poco menores que los de ABA. Sin embargo, ambos analitos presentan valores de LOD y LOQ muy cercanos. 2.5.4. Exactitud La exactitud expresa cuánto se aproxima el resultado de una medida al valor verdadero de la concentración o cantidad que se pretende medir. Según la guía EURACHEM,100 la exactitud se evalúa en función del estudio de dos parámetros: la precisión y la veracidad. En los siguientes apartados se hablará con más detalle del estudio de cada parámetro. Precisión. Estudio de la repetitividad, precisión intermedia y reproducibilidad De acuerdo con la guía ICH, el estudio de la precisión considera tres niveles: la repetitividad, la precisión intermedia y la reproducibilidad. Validación y cuantificación 60 Resultados obtenidos del estudio de la precisión. Estudio de la repetitividad y de la precisión intermedia El diseño experimental para el estudio de la precisión ha consistido en realizar el análisis tres días, a tres niveles de concentración y tres réplicas por nivel. Asimismo, la cadencia del estudio ha sido semanal. Este mismo diseño experimental es el que se ha utilizado posteriormente para los ensayos de recuperación. Para dicho estudio, se fortificaron las muestras de alfalfa a tres niveles de concentración diferentes para cada analito (bajo, medio y alto), cubriendo el rango completo de concentraciones. Las extracciones se realizaron por triplicado (n = 3) dentro del mismo día, en tres días diferentes (p = 3: días 1, 2 y 3), como recomienda la guía ICH.98, 102 Los tres niveles de concentración a los que fueron fortificados las muestras son los siguientes: 1) 100 ppb de SA y 20 ppb de ABA. 2) 200 ppb de SA y 40 ppb de ABA. 3) 500 ppb de SA y 100 ppb de ABA. Según las consideraciones realizadas en los apartados anteriores, los resultados obtenidos para el estudio de la repetitividad y la precisión intermedia se presentan en la Tabla 2.9 y Tabla 2.10. En cada tabla se muestran, para cada analito y a cada nivel de concentración de trabajo, los valores de las estimaciones de 𝐹 y 𝐹, Sr, SB, SIP, %RSDr, %RSDIP, ½%RSDH y el parámetro de Horrat calculados Validación y cuantificación 61 en función del %RSDIP y del %RSDr, así como los valores aceptados a ½%RSDAOAC según la AOAC Peer Verified Methods Program. Fitohormona: SA (N = 9) Día 1 SA 100 ng/ml Día 2 SA 200 ng/ml Día 3 SA 500 ng/ml Fcalc Fcrit Sr SB SIP %RSDr %RSDIP ½%RSDH Parámetro de Horrat (%RSDIP) Parámetro de Horrat (%RSDr) 4,374 5,143 7,340 7,784 10,699 2,277 3,319 11,314 0,147 0,101 0,016 5,143 12,649 0,000a 12,649 3,019 3,019 10,193 0,148 0,148 1,401 5,143 12,506 4,575 13,316 1,800 1,916 8,880 0,108 0,101 ½%RSDAOAC (SA: 100 -1000 ng/ml)b 6 – 8 6 – 8 6 – 8 a El valor calculado de SB2 ˂ 0, por tanto, SB = 0. b Valores de ½%RSDAOAC aceptados según la AOAC Peer Verified Methods Program. Tabla 2.9. Resultados obtenidos del análisis de la varianza ANOVA y del estudio de la precisión de SA. Validación y cuantificación 62 Fitohormona: ABA (N = 9) Día 1 ABA 20 ng/ml Día 2 ABA 40 ng/ml Día 3 ABA 100 ng/ml Fcalc Fcrit Sr SB SIP %RSDr %RSDIP ½%RSDH Parámetro de Horrat (%RSDIP) Parámetro de Horrat (%RSDr) 0,556 5,143 5,181 0,000a 5,181 9,469 9,469 14,415 0,328 0,328 1,097 5,143 6,662 1,195 6,769 9,851 10,009 12,987 0,385 0,379 1,191 5,143 7,046 1,778 7,267 6,404 6,605 11,314 0,292 0,283 ½%RSDAOAC (ABA: 10 – 100 ng/ml)b 8 - 11 8 - 11 6 - 8 a El valor calculado de SB2 ˂ 0, por tanto, SB = 0. b Valores de ½%RSDAOAC aceptados según la AOAC Peer Verified Methods Program. Tabla 2.10. Resultados obtenidos del análisis de la varianza ANOVA para el estudio de la precisión de ABA. Para ambos analitos, 𝐹 es menor que 𝐹 para cada nivel de concentración de trabajo. Por ello se puede concluir que se puede aceptar la hipótesis nula, H0, es decir: no existen diferencias significativas en las medidas de las concentraciones en los diferentes días de análisis para cada nivel de concentración. Además, la comparativa con los valores de ½%RSDH y ½%RSDAOAC, los valores de %RSDIP y %RSDr de SA y ABA se encuentran por debajo de estos valores para cada nivel de concentración estudiado. Análogamente, los parámetros de Horrat que se obtienen se encuentran por debajo de 1,3 tanto para SA como para ABA para cada nivel de concentración. Por tanto, se puede concluir que se obtienen valores adecuados a los tres niveles de concentración ensayados para las dos fitohormonas, según los Validación y cuantificación 63 requerimientos descritos y se puede considerar que el método es preciso respecto a la repetitividad y a la reproducibilidad intermedia. Veracidad. Ensayos de recuperación La veracidad de un ensayo analítico expresa el grado de acercamiento entre el valor medio obtenido en una serie de medidas y el valor real o valor de referencia aceptado. Es por ello, que normalmente el estudio de la veracidad se realiza con un material de referencia certificado o bien con un método previamente validado. Cuando no existen materiales de referencia certificados o bien no existe la posibilidad de aplicar ningún método de referencia, el estudio de la veracidad se suele realizar mediante ensayos de recuperación. Para realizar el estudio de la veracidad, se ha utilizado el mismo diseño experimental que el usado para el estudio de la precisión y se expresa en términos de porcentaje de recuperación, obtenido para cada estándar de validación considerado.116 Se han utilizado los tres niveles de concentración definidos en el estudio de la precisión (nivel de concentración bajo, medio y alto), se han realizado extracciones por triplicado y se han analizado en tres días diferentes. Los ensayos de recuperación consisten en añadir una cantidad de analito conocida a la muestra y ver la cantidad de analito que se recupera. La recuperación o porcentaje de recuperación se define según la siguiente expresión: 𝑅𝑒𝑐𝑢𝑝𝑒𝑟𝑎𝑐𝑖ó𝑛 (%)= 𝐶−𝐶 𝐶 ·100 Donde 𝐶 es la concentración medida de analito con nuestro método, 𝐶 es la concentración que tiene la muestra sin fortificar y 𝐶 es la concentración que hemos añadido. En el caso de ser una matriz preparada o comercial, la 𝐶 debe ser cero. Sin embargo, en nuestro caso al tratarse de una matriz vegetal, la 𝐶 vendrá dada por la concentración inicial o nativa que presenta cada analito en la matriz en estudio. Validación y cuantificación 64 Una vez que se calcula el porcentaje de recuperación, se compara con los porcentajes de recuperación aceptados en función de la concentración de analito según la AOAC Peer Verified Methods Program.99 Resultados obtenidos del estudio de la veracidad. Ensayos de recuperación Una vez preparadas las muestras con las concentraciones indicadas de SA y ABA, se realiza la extracción como se indica en el apartado 5.2. El cálculo de la concentración nativa, 𝐶, se realiza a partir del análisis de muestras de alfalfa sin fortificar. De acuerdo con el protocolo de la AOAC Peer Verified Methods Program, los porcentajes de recuperación aceptados para un rango desde 100 ng/ml hasta 10 µg/ml son del 80 al 110%, mientras que en rangos desde 10 hasta 100 ng/ml, los porcentajes de recuperación que se admiten son del 60 al 115%. Los porcentajes de recuperación obtenidos, así como las concentraciones medidas, fortificadas y nativa para cada analito se muestran en la Tabla 2.11. Validación y cuantificación 65 Fitohormona (N = 9) Cmedida ± sd (ng/ml) Cfortificada (ng/ml) Cnativa ± sd (ng/ml) Recuperación (%) SA 322,4 ± 8,9 418,9 ± 0,9 694,9 ± 8,6 100 200 500 236,2 ± 8,0 236,2 ± 8,0 236,2 ± 8,0 86 91 92 ABA 54,7 ± 2,2 67,6 ± 4,0 110,0 ± 4,4 20 40 100 39,7 ± 1,6 39,7 ± 1,6 39,7 ± 1,6 75 70 70 Rango de recuperación aceptado (%) según la AOAC Peer Verified Methods Program: 100 ng/ml – 10 µg/ml: 80 – 100% 10 ng/ml – 100 ng/ml: 60 – 115% Tabla 2.11. Recuperaciones (%) obtenidas de cada analito en estudio. El porcentaje de recuperación se ha calculado teniendo en cuenta tres réplicas biológicas, inyectadas por triplicado y analizadas en tres días diferentes (N = 9). Según los resultados obtenidos en el estudio de recuperación, se han obtenido buenos porcentajes de recuperación para cada nivel de concentración de trabajo, encontrándose dentro de los límites aceptados según los valores tabulados de la AOAC en función de la concentración de analito. Finalmente se concluye que el método de análisis propuesto para la determinación de SA y ABA en plantas de alfalfa mediante UPLC-MS/MS se encuentra adecuadamente validado según los resultados obtenidos en el estudio de los diferentes parámetros para la validación, tales como han sido el estudio del efecto matriz, linealidad, así como ensayos de precisión y veracidad. Una vez realizado el procedimiento de validación del método analítico propuesto, se procede a la cuantificación de los analitos de interés en las muestras de alfalfa. Validación y cuantificación 66 2.6. CUANTIFICACIÓN DE FITOHORMONAS EN PLANTAS DE ALFALFA MEDIANTE UPLC-MS/MS La cuantificación de las fitohormonas SA y ABA mediante UPLC-MS/MS en las plantas de alfalfa se ha realizado con el método validado propuesto. De cada muestra de alfalfa se han tenido en cuenta tres réplicas biológicas y se han realizado extracciones de cada una de ellas. Cada réplica se ha inyectado en el equipo por triplicado (n = 3). Los resultados obtenidos para las muestras de “Alfalfa Control” y para cada tratamiento, “Alfalfa Per82 Semilla” y “Alfalfa Per82 Foliar”, se recogen en las siguientes tablas. En la Tabla 2.12 se muestran las concentraciones obtenidas en ng/ml de disolución para cada hormona vegetal. En la Tabla 2.13 se muestran las concentraciones obtenidas en μg/g de extracto seco. Ambas concentraciones se han obtenido teniendo en cuenta la dilución realizada debido al uso de los patrones internos. Fitohormona N = 3 Alfalfa Control ng/ml ± sd Alfalfa Per82 Semilla ng/ml ± sd Alfalfa Per82 Foliar ng/ml ± sd SA 483 ± 17 234 ± 6 180 ± 4 ABA 77 ± 3 44,4 ± 0,4 40,5 ± 1,4 Tabla 2.12. Concentraciones en ng/ml de disolución de SA y ABA. Datos expresados como media ± sd (N = 3) aplicando el método de calibrado externo usando las áreas relativas a cada estándar deuterado. Fitohormona N = 3 Alfalfa Control µg/g ± sd Alfalfa Per82 Semilla µg/g ± sd Alfalfa Per82 Foliar µg/g ± sd SA 5,8 ± 0,2 2,80 ± 0,07 2,16 ± 0,05 ABA 0,93 ± 0,04 0,531 ± 0,005 0,49 ± 0,02 Tabla 2.13. Concentraciones en μg/g de extracto seco de SA y ABA. Datos expresados como media ± sd (N = 3) aplicando el método de calibrado externo usando las áreas relativas a cada estándar deuterado. Validación y cuantificación 67 Como se observa en las tablas, la concentración de SA es entre cinco y seis veces mayor en todos los casos que la concentración de ABA. Por otro lado, se observa que la concentración de SA en la muestra “Alfalfa Control” es mayor que en los tratamientos “Alfalfa Per82 Semilla” y “Alfalfa Per82 Foliar”. Esta tendencia también ocurre en el caso del ABA. En la Figura 2.18 y Figura 2.19 se muestra una comparativa de las concentraciones obtenidas en µg/g de extracto seco para SA y ABA en las muestras de alfalfa, respectivamente. Figura 2.18. Comparativa de las concentraciones de SA en las muestras de “Alfalfa Control” con los tratamientos “Alfalfa Per82 Semilla” y “Alfalfa Per82 Foliar”. 0,00 1,00 2,00 3,00 4,00 5,00 6,00 "Control" "Per82 Semilla" "Per82 Foliar" Concentración (µg/g) Muestra Alfalfa Validación y cuantificación 68 Figura 2.19. Comparativa de las concentraciones de ABA en las muestras de “Alfalfa Control” con los tratamientos “Alfalfa Per82 Semilla” y “Alfalfa Per82 Foliar”. 2.7. DISCUSIÓN DE RESULTADOS Tal como se ha indicado en el apartado 1.3.2, SA y JA tienen un papel fundamental en las respuestas al estrés biótico (producido por organismos vivos), participando el SA principalmente en las respuestas a bacterias y hongos biotróficos y el JA frente a insectos y hongos necrotróficos. Estas hormonas son antagonistas entre ellas, es decir: un aumento de SA produce una disminución de JA y viceversa.62 Sin embargo, en nuestro caso no ha sido posible determinar la concentración de JA al encontrarse siempre muy por debajo de los límites de cuantificación en los ensayos preliminares, por lo que la disminución de la concentración de SA en las plantas de alfalfa al aplicar la bacteria Per82 en semilla y foliar no parece afectar a la concentración de JA. Este hecho puede deberse a varias causas. Una de ellas, que la bacteria Per82 no produzca ningún marcador que haga aumentar la concentración de SA, es decir: que la planta no la identifique como patógena. Otra explicación es que la bacteria Per82 esté produciendo alguna molécula que mimetice una subida de JA pero sin aumentar su concentración real, lo que desencadenaría los procesos que, finalmente, provocan una bajada en la concentración de SA. En la bibliografía se han descrito casos de bacterias que secretan moléculas que mimetizan JA, como la coronatina;117 0,00 0,20 0,40 0,60 0,80 1,00 "Control" "Per82 Semilla" "Per82 Foliar" Concentración (µg/g) Muestra Alfalfa Validación y cuantificación 69 estas moléculas disparan las rutas de defensa del JA para disminuir la concentración de SA y, de esta forma, facilitar el ataque a la planta. Por otro lado, el ABA está fuertemente implicado en la respuesta al estrés abiótico, como por ejemplo en el caso de que la planta sufra sequía o un exceso de salinidad. Según estos resultados, la inoculación de Per82 disminuye el efecto del estrés abiótico en plantas de alfalfa. Claramente, la inoculación de la bacteria PGPR está afectando positivamente a la planta, especialmente la inoculación a través de las hojas. El dilucidar entre estas posibilidades o buscar explicaciones alternativas requiere futuros estudios, de mayor grado biológico, que van más allá de los objetivos de esta Tesis. Metabolómica Dirigida 76 multivariante, como por ejemplo el análisis de componentes principales (PCA, Principal Component Analysis), a partir de un número de réplicas adecuadas. En una segunda etapa, se puede realizar una primera identificación de los metabolitos de interés, empleando inicialmente bases de datos de masa exacta de metabolitos y, posteriormente, corroborando la identificación mediante experimentos MS/MS. Por último, una vez que se han identificado los metabolitos de interés, se podrían cuantificar mediante técnicas MRM. Figura 3.2. Flujo de trabajo general en el análisis de Metabolómica Dirigida y No Dirigida mediante UHPLC-HRMS. (Imagen tomada de Ghosson et al., 2018).122 En esta Tesis nos hemos centrado en los estudios de Metabolómica basados en espectrometría de masas. Dentro de estos estudios hemos distinguido entre dos tipos de análisis: los análisis de Metabolómica Dirigida, que se detallarán a continuación, y los análisis de Metabolómica No Dirigida que se expondrán en el Capítulo 4. Metabolómica Dirigida 77 3.1. INSTRUMENTACIÓN Y CONDICIONES EXPERIMENTALES En los análisis de Metabolómica Dirigida se han usado dos equipos, según si el espectrómetro de masas se encuentra conectado a un cromatógrafo líquido (UHPLC-HRMS/MS) o a un cromatógrafo gaseoso (GC-HRMS). En ambos casos, se ha utilizado espectrómetros de masas QExactive (ThermoFisher Scientific). Este instrumento es un equipo híbrido con geometría Q-Orbitrap, es decir: está compuesto por un analizador de cuadrupolo (Q) acoplado a un analizador de Orbitrap. Este tipo de geometría nos permite realizar experimentos en alta resolución, así como experimentos en tándem MS/MS, dado que el primero puede actuar para focalizar o filtrar los iones según el modo de detección en el que se esté operando. En las siguientes figuras se muestran los esquemas de un equipo QExactive acoplado a una fuente de ionización a presión atmósferica API (Figura 3.3) o a una fuente de ionización de impacto electrónico (Figura 3.4). En el caso de los análisis UHPLC-HRMS/MS, la fuente de ionización utilizada es una fuente de electrospray (HESI-II, Heated-Electrospray Ionization), mientras que en los análisis GC-HRMS, la fuente de ionización que se usa es de impacto electrónico (EI, Electron Impact). Tras la fuente, el equipo se compone principalmente de un analizador de cuadrupolo (Q), un analizador Orbitrap, una trampa de iones denominada C-Trap y una celda de colisión de alta energía inducida por disociación, HCD (Higher-Energy Collision-Induced Dissociation). Metabolómica Dirigida 78 Figura 3.3. Esquema general de un espectrómetro de masas QExactive (ThermoFisher Scientific) acoplado a una fuente API. (Imagen tomada de https://www.thermofisher.com/es/es/home.html). Figura 3.4. Esquema general del equipo QExactive GC (ThermoFisher Scientific) acoplado a una fuente EI. (Imagen tomada de “QExactive GC Mass Spectrometer. Operating Manual [White paper]”. ThermoFisher Scientific, 2015). Fuente de ionización HESI-II Analizador Orbitrap S-lens Analizador de Cuadrupolo C-Trap Celda de colisión HCD Metabolómica Dirigida 79 3.1.1. Fuentes de ionización La fuente HESI-II es una fuente de electrospray (apartado 2.3.2) que dispone, además, de una sonda que permite aplicar una temperatura extra o auxiliar, que hace que se pueda mejorar en gran medida la sensibilidad de los ensayos LC-MS al facilitar una mejor desolvatación de los iones y el rendimiento de la aguja. Además, al aplicar esta temperatura extra en la fuente de ionización, en muchas ocasiones se pueden observar roturas de los enlaces más lábiles de la molécula en la misma fuente de ionización. La fuente de impacto electrónico125 (EI) es altamente energética y se usa en el análisis de muestras volátiles, térmicamente estables y con una masa molecular relativamente baja (˂ 1.000 Da). Se compone de una cámara pequeña de un centímetro cúbico de volumen, en la cual las moléculas de analito interactúan con un haz de electrones fuertemente energético que han sido acelerados, generalmente a 70 eV. El haz de electrones se produce por calentamiento de un filamento de wolframiorenio. Entre el filamento y el centro de la fuente de ionización se encuentra la placa metálica con una rendija denominada apertura de electrones. Esta rendija limita el tamaño del haz de electrones y confina la ionización del analito a un pequeño volumen dentro de la fuente de ionización. Opuesto al filamento se encuentra el colector, que es una placa de metal con un potencial eléctrico positivo que atrae e intercepta el haz de electrones después de que estos pasen a través de la fuente. Un campo acelerador negativo hace que los iones formados en la fuente de ionización lleguen al analizador de masas.126 Un esquema de la fuente de ionización de EI se muestra en la Figura 3.5. Metabolómica Dirigida 80 Figura 3.5. Esquema de una fuente de impacto electrónico (EI). (Imagen tomada de Rockwood et al., 2018).127 La ionización se produce por la interacción entre las moléculas del analito en fase gaseosa y el haz de electrones de alta energía, que provoca que el analito pierda un electrón de su capa de valencia y se forme un ion con número impar de electrones, M+·, al cual se le denomina “ion molecular”. 𝑀+𝑒→𝑀·+2𝑒 La ionización mediante EI da lugar generalmente a un ion molecular positivo con una sola carga. El exceso de energía que queda después de la ionización puede ser disipado por fragmentación de enlaces covalentes en el ion molecular para perder un radical (por ejemplo, CH3·) o una especie neutra (por ejemplo, H2O o CH3OH), acompañada frecuentemente con un reordenamiento.126 𝑃é𝑟𝑑𝑖𝑑𝑎 𝑑𝑒 𝑟𝑎𝑑𝑖𝑐𝑎𝑙: 𝑀·→[𝑀−𝑅]+𝑅· Metabolómica Dirigida 81 𝑃é𝑟𝑑𝑖𝑑𝑎 𝑑𝑒 𝑒𝑠𝑝𝑒𝑐𝑖𝑒 𝑛𝑒𝑢𝑡𝑟𝑎: 𝑀·→[𝑀−𝑁]·+𝑁 Esta técnica de ionización se considera una técnica de ionización dura y suele observarse una alta fragmentación, muy útil en la determinación estructural de compuestos desconocidos. Además, el hecho de trabajar de forma normalizada a 70 eV ha permitido crear bases de datos a lo largo de los años, entre ellas, la base de datos NIST (National Institute of Standards and Technology), que contiene los espectros de masas de EI de más de 350.000 sustancias en su versión de 2020. 3.1.2. Analizador de masas El Orbitrap es un analizador de masas de alta resolución desarrollado y patentado por Alexander Makarov128 a finales de los años 90. Este analizador deriva de las trampas de Kingdon129 y Knight,130 que utilizaban dos electrodos, uno tubular externo y un filamento interno coaxial, para atrapar iones en el campo electrostático formado entre ellos. Este analizador consiste (Figura 3.6) en un electrodo exterior con forma de barril y un electrodo interior coaxial con forma de huso que forma un campo electrostático. Ambos electrodos están conectados a fuentes de voltaje independientes. El electrodo exterior se divide en dos partes: una de ellas se utiliza para la excitación de los iones y la otra para su detección. El espacio comprendido entre el electrodo interno y el externo forma la cámara de medida. Esta cámara se encuentra conectada a una bomba de vacío que permite alcanzar presiones de vacío de aproximadamente 10–8 mmHg e incluso menores. Los iones son inyectados tangencialmente entre los electrodos y quedan atrapados girando alrededor del electrodo interno o central. Al mismo tiempo, los iones también oscilan a lo largo del eje de este electrodo. Así los iones con una relación m/z específica se mueven en anillos que oscilan alrededor del huso central; la frecuencia de estas oscilaciones armónicas es independiente de la velocidad del ion e inversamente proporcional a la raíz cuadrada de la relación m/z. La frecuencia de las oscilaciones axiales de cada molécula girando alrededor del electrodo central induce una corriente en el electrodo externo. Los iones que originan la corriente pueden llegar a ser un número muy elevado y sus valores de m/z se obtienen aplicando la Transformada de Fourier a las frecuencias observadas, para posteriormente convertirlos en espectros de masas.131 Metabolómica Dirigida 82 Figura 3.6. Esquema de un analizador de masas Orbitrap. (Imagen tomada de Savaryn et al., 2016).132 3.1.3. Flujo de iones Los iones originados en la fuente de ionización por la aplicación de un alto voltaje se focalizan en la entrada del espectrómetro de masas mediante unas lentes, denominadas S-lens, hacia un electrodo denominado “flatapolo”, donde se eliminan las gotas de disolvente restantes a la vez que se frenan los iones provenientes de la fuente de ionización. A continuación, los iones pasan por un cuadrupolo, en el que puede realizarse, o no, un cribado que dejaría pasar únicamente a aquellos iones que se encuentren en un determinado rango de m/z. El cuadrupolo está conectado a una la trampa lineal (C-Trap), que se encarga de retener y dirigir los iones hacia uno de los dos sistemas contiguos: o bien a la celda de colisión HCD, para obtener los iones fragmento, o bien al analizador de masas Orbitrap, para analizar las relaciones m/z de los iones, tanto precursores como fragmentos. El diseño del equipo posibilita el movimiento de los iones en forma de paquetes entre estas tres partes, C-Trap, HCD y Orbitrap, en función del análisis que se estén llevando a cabo. Metabolómica Dirigida 83 3.1.4. Modos de adquisición El analizador de masas Q-Orbitrap nos permite aplicar varios modos de adquisición a lo largo de todo el proceso cromatográfico: En primer lugar, es posible realizar un barrido completo en alta resolución de los iones generados en la fuente (método Full Scan). El tiempo de duración de un experimento Full Scan depende de la resolución que se quiere obtener, siendo del orden de milisegundos. En el caso del espectrómetro de masas QExactive, se puede llegar a trabajar con una resolución, R de hasta 140.000 a m/z 200 FWHM (Full Width at Half Maximum, es decir: la anchura a media altura de un pico a m/z 200 sería ∆m = 0,0014). En nuestro caso la resolución de trabajo es de 70.000 a m/z 200 FWHM, por lo que, en este caso FWHM a m/z 200 sería ∆m = 0,0028, lo que nos permite llegar a un consenso de sensibilidad y resolución. En la Figura 3.7 se muestra una representación esquemática de la resolución, R definida como FWHM. Figura 3.7. Representación esquemática de la resolución, R definida como FWHM (Full Width at Half Maximum). Como ejemplo, en la Figura 3.8 se muestra la separación de dos compuestos isóbaricos (misma masa molecular, pero distinta fórmula molecular), como son L-leucina (Leu) y trans-4-hidroxi-L-prolina (Hyp), que presentan fórmula molecular C6H13NO2 y C5H9NO3, respectivamente y misma masa molecular nominal. Sin embargo, cuando se trabaja a una resolución, R de 70.000 a m/z 200 FWHM, el m/z 0 50 100 Abundancia Relativa ∆m m Metabolómica Dirigida 84 espectrómetro de masas es capaz de separar y distinguir los iones pseudomoleculares correspondientes a estos compuestos (Hyp, m/z 132,06552 y Leu, m/z 132,10191). Figura 3.8. Espectro de masas de los compuestos isobáricos Leu y Hyp adquirido con una resolución R = 70.000 (m/z 200 FWHM). Se observa como, al trabajar a esta resolución, el espectrómetro de masas es capaz de separar los iones pseudomoleculares [M+H]+ de ambos compuestos. Por otro lado, al tratarse de un espectrómetro de masas en tándem y gracias a la celda de colisión HCD, es posible realizar experimentos MS/MS mediante CID: - Los métodos DIA (Data Independent Adquisition) realizan un primer experimento Full Scan y, posteriormente, todos los iones precursores pasan a la celda de colisión para ser fragmentados sin realizar ningún cribado en función de la intensidad de dichos iones. Al no existir selección de ion precursor, y dado que la cámara HCD solo puede ser ocupada por un determinado número de iones, el instrumento se centra en un determinado rango de masas previamente seleccionado para adquirir los datos MS/MS de todos los iones detectados en ese rango. Este ciclo normalmente es inferior a un segundo. En el equipo QExactive, el método DIA se denomina AIF (All Ion Fragmentation). Los métodos AIF a menudo inducen a fragmentaciones adicionales de fragmentos ya formados, por lo que la abundancia relativa de los fragmentos obtenidos puede ser baja, en comparación con las que se logran mediante el aislamiento y posterior fragmentación de precursores específicos.133, 134 132,03 132,05 132,07 132,09 132,11 132,13 132,15 m/z 0 100 Abundancia Relativa Leu C 6 H 13 NO 2 [M+H] + m/z 132,10191 Hyp C 5 H 9 NO 3 [M+H] + m/z 132,06552 Metabolómica Dirigida 85 - Los métodos DDA (Data Dependent Adquisition) tienen en cuenta la intensidad de la señal de los iones precursores en el experimento Full Scan para posteriormente realizar la fragmentación de cada ion precursor seleccionado. Este método realiza, en primer lugar, un experimento Full Scan tras el cual, el equipo selecciona un número determinado de iones precursores más intensos y son estos iones los que a continuación son fragmentados en la celda de colisión en ciclos posteriores. Estos métodos son más selectivos que los métodos DIA. En los métodos DDA (TopN), N es el número de iones precursores a fragmentar y se selecciona en función de la velocidad de escaneo del analizador de masas: normalmente los Orbitrap son analizadores que proporcionan alta resolución a costa de la velocidad de análisis del equipo. Por este motivo, en el caso concreto del QExactive, se trabaja con un método Top5, en el cual se fragmentan los cinco precusores más intensos de cada experimento Full Scan. En los experimentos realizados en alta resolución se suele trabajar aceptando una tolerancia o error m/z ∆(ppm) como máximo de ± 5 ppm. El error m/z ∆(ppm) se calcula según la siguiente expresión: 𝑝𝑝𝑚=𝑚𝑧 ⁄𝑒𝑥𝑝𝑒𝑟𝑖𝑚𝑒𝑛𝑡𝑎𝑙−𝑚𝑧 ⁄𝑡𝑒ó𝑟𝑖𝑐𝑎 𝑚𝑧 ⁄𝑡𝑒ó𝑟𝑖𝑐𝑎 × 10 Para abordar el estudio de Metabolómica Dirigida de los diferentes metabolitos en las muestras de alfalfa, se han empleado experimentos MS/MS, DDA (Top5) y/o DIA (AIF) en el caso de los análisis UHPLC-HRMS/MS, mientras que se han empleado experimentos Full Scan en el caso de los análisis GC-HRMS, debido a la alta fragmentación obtenida en el caso de trabajar con fuentes de ionización de EI. 3.2. ANÁLISIS DE METABOLITOS MEDIANTE UHPLC-HRMS/MS El procedimiento de extracción de las muestras se detalla en el apartado 5.2. Brevemente, el procedimiento de extracción consiste en cortar e inmediatamente congelar las plantas en nitrógeno líquido, triturarlas y liofilizarlas. A continuación, Metabolómica Dirigida 92 Los ácidos orgánicos, al tratarse de moléculas que presentan una masa molecular muy baja, normalmente presentan una fragmentación muy pobre en sus espectros MS/MS, llegando en algunos casos incluso a no observarse, como ocurre, por ejemplo, en el caso de los ácidos benzoico y trans-cinámico. Por otro lado, dependiendo de la estructura y grupos funcionales que presenta cada molécula, en los espectros MS/MS se pueden observar pérdidas de moléculas neutras, tales como NH3, H2O o CO2. Así, en los espectros MS/MS de estos compuestos se pueden observar los iones fragmento correspondientes [M-H-NH3]–, [M-H-H2O]– o [M-H-CO2]–. Por ejemplo, en el espectro MS/MS del Asp aparecen los iones fragmento m/z 115,00368, m/z 88,04040 y m/z 71,01385, asignados como [M-H-NH3]–, [M-H-CO2]– y [M-H-NH3-CO2]–, respectivamente. En el caso del ácido L-málico, en el espectro MS/MS, aparecen los iones fragmento m/z 115,00368 (pico base), m/z 89,02442 (minoritario) y m/z 71,01385, correspondientes a [M-H-H2O]–, [M-H-CO2]– y [M-H-H2O-CO2]–, respectivamente. Por otro lado, en el caso de los compuestos que presentan un grupo fosfato en su estructura, como ocurre en los ácidos 3-fosfoglicérico y fosfoenolpirúvico, es normal observar en el espectro MS/MS el ion fragmento m/z 78,95905 correspondiente a [PO3]–. 3.2.3. Aminoácidos Los aminoácidos que se han estudiado mediante esta metodología se muestran en la Tabla 3.1 y sus estructuras se recogen en la Tabla 3.5. Las estructuras de Asp y Glu se han incluido en la Tabla 3.4. Metabolómica Dirigida 93 COMPUESTO ESTRUCTURA COMPUESTO ESTRUCTURA 3,4-Dihidroxi-L-fenilalanina L-Fenilalanina L-Alanina L-Glicina L-Arginina L-Glutamina L-Asparagina L-Histidina L-Cisteína L-Isoleucina L-Cistina L-Leucina Tabla 3.5. Estructura de los aminoácidos estudiados mediante UHPLC-HRMS/MS. H2N S S H2N OH O OH O Metabolómica Dirigida 94 COMPUESTO ESTRUCTURA COMPUESTO ESTRUCTURA L-Lisina trans-4-Hidroxi-L-prolina L-Metionina L-Treonina L-Prolina L-Triptófano L-Serina L-Valina L-Tirosina Tabla 3.5 (continuación). Estructura de los aminoácidos estudiados mediante UHPLC-HRMS/MS. Los espectros MS/MS, en el análisis de aminoácidos mediante UHPLC-HRMS/MS trabajando en polaridad negativa, suelen presentar iones procedentes de pérdidas de moléculas neutras, tales como NH3, H2O o CO2. Así, por ejemplo, en el caso de la Gln, en el espectro MS/MS aparecen los iones fragmento m/z 128,03532, m/z 127,05136 (pico base), m/z 109,04074, m/z 101,07204 y m/z 84,04549 correspondientes a [M-H-NH3]–, [M-H-H2O]–, [M-H-2H2O]–, [M-H-CO2]– y [M-H-NH3-CO2]–, respectivamente. Metabolómica Dirigida 95 3.2.4. Compuestos fenólicos En este apartado se va a realizar el estudio de compuestos fenólicos en general, dejando el estudio de flavonoides en el apartado 3.2.5. Los compuestos estudiados en esta Tesis se detallan en la Tabla 3.1 y sus estructuras en la Tabla 3.6. COMPUESTO ESTRUCTURA COMPUESTO ESTRUCTURA 3-Hidroxitirosol Ácido caféico Ácido 2,4- dihidroxibenzóico Ácido caftárico Ácido 3-O- metilgálico Ácido cicórico Ácido 4- hidroxibenzóico Ácido clorogénico (Ácido 3-O- cafeoilquínico) Tabla 3.6. Estructura de los compuestos fenólicos estudiados. Metabolómica Dirigida 96 COMPUESTO ESTRUCTURA COMPUESTO ESTRUCTURA Ácido 4-O- cafeoilquínico Ácido dihidrocaféico Ácido elágico Ácido homovanílico Ácido ferúlico Ácido isovanílico Ácido florético Ácido p-cumárico Ácido gálico Ácido protocatéquico Ácido gentísico Ácido sinápico Tabla 3.6 (continuación). Estructura de los compuestos fenólicos estudiados. O HO O OH O HO OH O Metabolómica Dirigida 97 COMPUESTO ESTRUCTURA COMPUESTO ESTRUCTURA Ácido siríngico Oleuropeína Ácido vanílico Pinoresinol Brevifolina Resveratrol Catecol (2-hidroxifenol) Umbeliferona Coumestrol Vanillina Galato de etilo Tabla 3.6 (continuación). Estructura de los compuestos fenólicos estudiados. Metabolómica Dirigida 98 En el caso de los compuestos fenólicos es frecuente encontrar en sus espectros MS/MS pérdidas correspondientes a moléculas neutras tales como CO2, H2O y/o CO. Como ejemplo, en la Figura 3.9 se muestra el espectro MS/MS del ácido caféico. En su espectro aparece mayoritariamente el ion fragmento m/z 135,04524 (pico base) correspondiente a la pérdida de CO2, además del ion fragmento m/z 107,05030 correspondiente a la pérdida de CO de este último ion. Figura 3.9. Espectro MS/MS del ácido caféico obtenido en el análisis UHPLC-HRMS/MS con el método DDA (Top5) con ionización en modo negativo. 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160 170 180 190 200 m/z 0 50 100 Abundancia Relativa 135,04524 179,03513 107,05030 89,03973 [M-H] - [M-H-CO 2 ] - [M-H-CO 2 -CO] - [C 7 H 5 ] - Metabolómica Dirigida 99 3.2.5. Flavonoides Los flavonoides son polifenoles de baja masa molecular presentes en los vegetales, que comparten un esqueleto común compuesto por dos anillos de benceno (A y B) unidos a través de una cadena de tres átomos. Esta clase de compuestos se pueden clasificar en función de su variación estructural en la cadena central C3. Así, la mayoría de los flavonoides presentan en esta cadena central un heterociclo de pirano, que se designa como anillo C. Los átomos de carbono en los anillos C y A se numeran del 2 al 8 y los del anillo B desde el 2' al 6' (Figura 3.10).136 Figura 3.10. Estructura básica de las principales clases de flavonoides. Las posiciones preferentes de O- y C-glicosidación se indican mediante flechas. Los sustituyentes R1-R6 se han especificado para cada subclase de compuestos en las tablas correspondientes. O R4 R5 O R3 R2 R1 C C O Flavona R2 O R3 R4 R1 Chalcona A C B 5 6 7 8 2 3 4 2' 3' 4' 5' 6' O O R2 R1 Isoflavona R3 R4 R5 R6 O O R3 R4 R5 O R2 R1 Flavanona O R3 R4 R5 O R2 R1 Flavanonol OH O R4 R5 R6 O R2 R1 O Flavonol R3 OH O R2 O R3 R4 R1 Dihidrochalcona O R3 R4 R5 R2 R1 Flavanol (Flavan-3-ol) OH Metabolómica Dirigida 100 Los flavonoides se pueden encontrar en su forma libre (aglicones) o asociados con carbohidratos (glicósidos), como metilderivados,136 como sulfatos y, a veces, como dímeros137 o polímeros.138 Los glicósidos pueden ser de dos tipos: O- glicósidos o C-glicósidos (Figura 3.10). En esta Tesis se pretende identificar los flavonoides pertenecientes a las subclases de flavonoides: flavonas, flavonoles, isoflavonas, flavanonas, flavanonoles, chalconas, dihidrochalconas, auronas, catequinas (flavanoles) y procianidinas. El listado de los flavonoides estudiados se recoge en la Tabla 3.1 y las estructuras correspondientes en las tablas Tabla 3.7 a Tabla 3.11. CLASE NOMBRE R1 R2 R3 R4 R5 Flavona Apigenina OH OH H H OH Apigenina-7-O-Glc OH OGlc H H OH Crisina OH OH H H H Diosmetina OH OH H OH OCH3 Gnafalina A (5,7-Dihidroxi-3,8- d imetoxiflavona) OH OH OCH3 H H Isovitexina (Apigenin a - 6 - C - Glc) OH OH H H OH Luteolina OH OH H OH OH Luteolina-4'-O-Glc OH OH H OH OGlc Luteolina-7-O-Glc OH OGlc H O H OH Vitexina (Apigenina - 8 - C - Glc) OH OH Glc H OH Glc = Glucósido Tabla 3.7. Posiciones de los sustituyentes de las estructuras básicas de las clases de las flavonas. Metabolómica Dirigida 101 CLASE NOMBRE R1 R2 R3 R4 R5 R6 Flavonol Fisetina H OH H O H OH H Galangina OH OH H H H H Hiperósido (Quercetina - 3 - O - Gal ) OH OH H OH OH H Isorhamnetina OH OH H OCH 3 OH H Isorhamnetina-3-O-Rut OH OH H OCH 3 OH H Kaempferol OH OH H H OH H Kaempferol-3-O-Glc OH OH H H OH H Kaempferol-3-O-GlcA OH OH H H OH H Miricetina O H OH H OH OH O H Morina OH OH OH H OH H Quercetina OH OH H OH OH H Quercetina-3-O-Glc OH OH H OH O H H Quercetina-3-O-GlcA OH OH H OH OH H Quercetina-4'-O-Glc OH OH H O H OGlc H Quercitrina (Quercetina - 3 - O - Rha ) OH OH H OH OH H Rutina (Quercetina - 3 - O - Rut) OH OH H OH OH H Glc = Glucósido; Rut = Rutinósido (α-L-Rhap-(16)-β-D-Glcp-(1); GlcA = Glucurónido; Rha = Rhamnósido; Gal = Galactósido. Tabla 3.8. Posiciones de los sustituyentes de las estructuras básicas de las clases de los flavonoles estudiados. O R4 R5 R6 O R2 R1 R3 OH Metabolómica Dirigida 108 fragmentos MS/MS característicos. La información obtenida permite identificar unívocamente un determinado compuesto. En las siguientes tablas (Tabla 3.12 a Tabla 3.20) se muestran los compuestos caracterizados según el procedimiento descrito en el párrafo anterior. En cada tabla se indica el nombre de cada compuesto patrón, fórmula molecular, m/z del ion pseudomolecular medido experimentalmente [M-H]–, el error m/z ∆(ppm) con respecto a la m/z del ion pseudomolecular teórico y el tiempo de retención. Normalmente, la tolerancia permitida entre la m/z teórica con respecto a la m/z experimental suele ser menor o igual a ± 5 ppm. Asimismo, en el Anexo I se detalla la información experimental completa de cada compuesto caracterizado. En ellas se recoge el nombre del compuesto, fórmula molecular, m/z del ion pseudomolecular teórico y experimental, el error m/z ∆(ppm), fórmulas moleculares de los iones fragmento obtenidos en los espectros MS/MS, m/z de cada ion fragmento teórico y obtenido experimentalmente, el error m/z ∆(ppm) de los fragmentos y el tiempo de retención de cada patrón caracterizado. En la Tabla 3.12 se muestran las fitohormonas que se han caracterizado según el procedimiento descrito en el párrafo anterior. Metabolómica Dirigida 109 Fitohormona Fórmula molecular [M-H] – m/z exp. Error m/z ∆(ppm) tR (min) Ácido abscísico C15H20O4 263,12888 -0,03 6,58 Ácido jasmónico C12H18O3 209,11827 -0,22 7,19 Ácido salicílico C7H6O3 137,02428 -1,03 5,82 ACC C4H7NO2 100,04034 -0,58 0,51 Ácido indolacético C10H9NO2 174,05583 -1,26 5,47 Ácido indoláctico C11H11NO3 204,06636 -1,25 5,17 Ácido indolbutírico C12H13NO2 202,08734 -0,05 6,96 Ácido indolpirúvico C11H9NO3 202,05098 0,07 6,27 Ácido indolpropiónico C11H11NO2 188,07156 -0,73 6,35 Triptofol C10H11NO 160,07672 -0,45 5,61 Kinetina C10H9N5O 214,07335 -0,39 4,12 trans-Zeatina C10H13N5O 218,10448 -1,18 3,21 trans-Zeatina ribósido C15H21N5O5 350,14676 -0,67 4,27 Ácido giberélico (GA3) C19H22O6 345,13412 -0,69 5,31 Giberelina A12 C20H28O4 331,19141 -0,23 9,57 Giberelina A19 C20H26O6 361,16553 -0,37 7,41 Giberelina A20 C19H24O5 331,15497 -0,39 6,94 Giberelina A44 C20H26O5 345,17047 -0,80 7,24 Giberelina A53 C20H28O5 347,18619 -0,60 8,29 Tabla 3.12. Datos más significativos obtenidos en la caracterización mediante UHPLC-HRMS/MS de las fitohormonas estudiadas. Como ejemplo, en la Figura 3.13 se muestran los cromatogramas XIC de una disolución mezcla de patrones de giberelinas de 1 µg/ml de concentración seleccionando en cada caso la m/z teórica del ion pseudomolecular en masa exacta dentro de un error m/z ∆(ppm) ≤ ± 5. En este cromatograma se puede observar cómo los diferentes patrones de giberelinas se separan a lo largo de todo el perfil cromatográfico. Además, al trabajar en alta resolución, es posible distinguir compuestos que presentan la misma masa molecular en baja resolución, por ejemplo, en el caso de las parejas de giberelinas GA3 y GA44, y GA12 y GA20. Esto es una gran ventaja con respecto a los analizadores de baja resolución, los cuales pueden presentar grandes problemas a la hora de identificar moléculas isobáricas y que coeluyan. Metabolómica Dirigida 110 Figura 3.13. Cromatograma XIC del experimento Full Scan de una mezcla de patrones de GAs obtenido mediante UHPLC-HRMS/MS con el método DDA (Top5) con ionización en modo negativo: A) GA3, m/z 345,13436, tR = 5,21 min; B) GA44, m/z 345,17075, tR = 7,15 min; C) GA12, m/z 331,19148, tR = 9,49 min y D) GA20, m/z 331,15510, tR = 6,83 min. Un ejemplo de la obtención de estos parámetros se muestra en la Figura 3.14. Al inyectar la disolución patrón, en este caso IAA, utilizando el método DDA (Top5) se obtiene simultáneamente la siguiente información: A) Cromatograma XIC del patrón caracterizado, obtenido seleccionando la m/z teórica del ion pseudomolecular (m/z 174,05605), lo que permite obtener el tiempo de retención al que aparece el compuesto (5,92 min). B) Espectro de masas en alta resolución. En el caso del IAA, además del ion pseudomolecular [M-H]–, se observa el ion fragmento [M-H-CO2]– (m/z 130,06622) resultado de la fragmentación en fuente de la molécula, y el ion [2M-H]– correspondiente al dímero145 (m/z 349,11938). C) Espectro MS/MS en alta resolución de los iones fragmento característicos [M-H-CO2]– (m/z 130,06622) y [C9H6N]– (m/z 128,05057). Tanto el ion precursor como los iones fragmento presentan un error m/z ∆(ppm) ≤ ± 5 ppm.146 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 Tiempo (min) 0 20 40 60 80 100 0 20 40 60 80 100 0 20 40 60 80 100 Abundancia Relativa 0 20 40 60 80 100 5,21 GA 3 7,15 GA 44 9,49 GA 12 6,83 GA 20 A B C D Metabolómica Dirigida 111 Figura 3.14. A) Cromatograma XIC del experimento Full Scan de una disolución patrón de IAA obtenido mediante UHPLC-HRMS/MS con el método DDA (Top5) con ionización en modo negativo. B) Espectro de masas obtenido a tR = 5,92 min. C) Espectro MS/MS obtenido a partir del ion pseudomolecular [M-H]– (m/z 174,05605). Tanto el ion precursor como los iones fragmento presentan un error m/z ∆(ppm) ≤ ± 5 ppm. 50 150 250 350 450 550 650 750 m/z 0 50 100 Abundancia Relativa 174,05583 130,06604 349,11902 [M-H]- [M-H-CO2]- [2M-H]- B 4,2 7,8 Tiempo (min) 0 100 Abundancia Relativa 5,92 IAA A 50 70 90 110 130 150 170 190 m/z 0 50 100 Abundancia Relativa 130,06627 128,05066 174,05611 [M-H]- [M-H-CO2]- [C9H6N]- C Metabolómica Dirigida 112 En la Tabla 3.13 se muestran los ácidos orgánicos que se han caracterizado según el procedimiento descrito en el párrafo anterior. Ácido orgánico Fórmula molecular [M-H] – m/z exp. Error m/z ∆(ppm) tR (min) Ácido 3-fosfoglicérico C3H7O7P 184,98550 -0,85 0,64 Ácido α-cetoglutárico C5H6O5 145,01408 -1,12 0,60 Ácido ascórbico C6H8O6 175,02464 -0,96 0,53 Ácido L-aspártico C4H7NO4 132,03009 -1,07 0,49 Ácido benzoico C7H6O2 121,02949 -0,13 5,65 Ácido cítrico C6H8O7 191,01962 -0,54 0,76 Ácido fosfoenolpirúvico C3H5O6P 166,97495 -0,91 0,63 Ácido L-glutámico C5H9NO4 146,04576 -0,82 0,50 Ácido L-láctico C3H6O3 89,02438 -0,47 0,71 Ácido L-málico C4H6O5 133,01414 -0,76 0,54 Ácido oxálico C2H2O4 88,98798 -0,63 0,51 Ácido pirúvico C3H4O3 87,00868 -0,98 0,58 Ácido quínico C7H12O6 191,05612 0,05 0,53 Ácido succínico C4H6O4 117,01920 -1,10 0,92 Ácido trans-cinámico C9H8O2 147,04514 -0,12 6,76 Tabla 3.13. Datos más significativos obtenidos en la caracterización mediante UHPLC-HRMS/MS de los ácidos orgánicos estudiados. En la Figura 3.15 se muestra un cromatograma XIC de una disolución de patrones de ácidos orgánicos de 1 µg/ml de concentración. En esta figura se incluyen los cromatogramas XIC de los ácidos orgánicos A) ácido L-aspártico (Asp), B) ácido L-glutámico (Glu) y C) ácido pirúvico, obtenidos de seleccionar el m/z teórico de cada compuesto, obteniéndose un error m/z ∆(ppm) ≤ ± 5 ppm, con respecto al m/z experimental. Metabolómica Dirigida 113 Figura 3.15. Cromatograma XIC del experimento Full Scan de una mezcla de patrones de ácidos orgánicos obtenido mediante UHPLC-HRMS/MS con el método DDA (Top5) con ionización en modo negativo: A) ácido L-aspártico (Asp), m/z 132,03023, tR = 0,50 min; B) ácido L-glutámico (Glu), m/z 146,04588, tR = 0,50 min y C) ácido pirúvico, m/z 87,00877, tR = 0,58 min. Como ejemplo, en la Figura 3.16 se muestra el espectro MS/MS del ácido succínico, en el cual se puede observar el ion precursor [M-H]– obtenido experimentalmente a m/z 117,01942, y los iones fragmento [M-H-H2O]– y [M-H-CO2]– a m/z 99,00889 y 73,02956, respectivamente. 0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 4,0 4,5 5,0 Tiempo (min) 0 20 40 60 80 100 0 20 40 60 80 100 Abundancia Relativa 0 20 40 60 80 100 0,50 0,50 0,58 Asp Glu Ácido pirúvico A B C Metabolómica Dirigida 114 Figura 3.16. Espectro MS/MS del ácido succínico obtenido mediante UHPLC-HRMS/MS con el método instrumental DDA (Top5), trabajando en polaridad negativa. En la Tabla 3.14 se recogen los datos obtenidos en la caracterización de los los aminoácidos estudiados. 50 55 60 65 70 75 80 85 90 95 100 105 110 115 120 125 130 135 m/z 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 Abundancia Relativa 73,02956 117,01942 99,00889 [M-H-CO 2 ] - [M-H-H 2 O] - [M-H] - Metabolómica Dirigida 115 Aminoácido Fórmula molecular [M-H] – m/z exp. Error m/z ∆(ppm) tR (min) 3,4-Dihidroxi-L-fenilalanina (DOPA) C9H11NO4 196,06142 -0,58 0,54 L-Ácido aspártico (Asp) C4H7NO4 132,03009 -1,07 0,49 L-Ácido glutámico (Glu) C5H9NO4 146,04576 -0,82 0,50 L-Alanina (Ala) C3H7NO2 88,04029 -1,26 0,49 L-Arginina (Arg) C6H14N4O2 173,10422 -1,05 0,46 L-Asparagina (Asn) C4H8N2O3 131,04610 -0,91 0,49 L-Cisteína (Cys) C3H7NO2S 120,01230 -1,45 0,51 L-Cistina (Cys-Cys) C6H12N2O4S2 239,01653 -0,19 0,48 L-Fenilalanina (Phe) C9H11NO2 164,07162 -0,47 2,03 L-Glicina (Gly) C2H5NO2 74,02467 -1,06 0,48 L-Glutamina (Gln) C5H10N2O3 145,06174 -0,89 0,49 L-Histidina (His) C6H9N3O2 154,06209 -0,73 0,46 L-Isoleucina (Ile) C6H13NO2 130,08719 -1,25 1,10 L-Leucina (Leu) C6H13NO2 130,08719 -1,25 1,10 L-Lisina (Lys) C6H14N2O2 145,09810 -1,05 0,44 L-Metionina (Met) C5H11NO2S 148,04370 -0,48 0,67 L-Prolina (Pro) C5H9NO2 114,05583 -1,93 0,52 L-Serina (Ser) C3H7NO3 104,03526 -0,51 0,49 L-Tirosina (Tyr) C9H11NO3 180,06653 -0,49 0,90 trans-4-Hidroxi- L-prolina (Hyp) C5H9NO3 130,05083 -1,07 0,49 L-Treonina (Thr) C4H9NO3 118,05087 -0,86 0,49 L-Triptófano (Trp) C11H12N2O2 203,08255 -0,25 3,24 L-Valina (Val) C5H11NO2 116,07156 -1,19 0,56 Tabla 3.14. Datos más significativos obtenidos en la caracterización mediante UHPLC-HRMS/MS de los aminoácidos estudiados. Como ejemplo, en la Figura 3.17 se muestra el cromatograma XIC correspondiente a los aminoácidos Ala, Arg y Ser obtenidos de seleccionar la m/z teórica del ion pseudomolecular a 88,04040, 173,10440 y 104,03532, respectivamente. El error m/z ∆(ppm) es menor o igual a ± 5 ppm. Metabolómica Dirigida 116 Figura 3.17. Cromatograma XIC del experimento Full Scan de una disolución mezcla de patrones de aminoácidos de 1 µg/ml en MeOH:H2O:FA (50:50:0,1 v/v/v) obtenido mediante UHPLC-HRMS/MS con el método DDA (Top5), con ionización en modo negativo. Los cromatogramas XIC corresponden: A) Ala (m/z 88,04040, tR = 0,49 min), B) Arg (m/z 173,10440, tR = 0,46 min) y C) Ser (m/z 104,03532, tR = 0,48 min). En la Tabla 3.15 se muestran los compuestos fenólicos caracterizados. 0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 4,0 4,5 5,0 Tiempo (min) 0 20 40 60 80 100 0 20 40 60 80 100 Abundancia Relativa 0 20 40 60 80 100 0,49 0,46 0,48 Arg Ala Ser A B C Metabolómica Dirigida 117 Compuesto fenólico Fórmula molecular [M-H] – m/z exp. Error m/z ∆(ppm) tR (min) 3-Hidroxitirosol C8H10O3 153,05557 -0,96 2,69 Ácido 2,4-dihidroxibenzóico C7H6O4 153,01913 -1,28 3,83 Ácido 3-O-metilgálico C8H8O5 183,02977 -0,71 3,16 Ácido 4-hidroxibenzóico C7H6O3 137,02420 -1,58 3,38 Ácido 4-O-cafeoilquínico C16H18O9 353,08783 0,06 4,07 Ácido caféico C9H8O4 179,03484 -0,80 4,05 Ácido caftárico C13H12O9 311,04068 -0,58 2,82 Ácido cicórico C22H18O12 473,07248 -0,15 4,91 Ácido clorogénico (Ácido 3-O-cafeoilquínico) C16H18O9 353,08755 -0,72 3,89 Ácido dihidrocaféico C9H10O4 181,05054 -0,51 3,89 Ácido elágico C14H6O8 300,99881 -0,60 5,71 Ácido ferúlico C10H10O4 193,05042 -1,12 5,17 Ácido florético C9H10O3 165,05558 -0,82 4,67 Ácido gálico C7H6O5 169,01408 -0,98 1,07 Ácido gentísico C7H6O4 153,01915 -1,18 3,29 Ácido homovanílico C9H10O4 181,05051 -0,69 4,36 Ácido isovanílico C8H8O4 167,03481 -1,06 4,31 Ácido p-cumárico C9H8O3 163,03992 -0,92 4,84 Ácido protocatéquico C7H6O4 153,01915 -1,18 2,20 Ácido sinápico C11H12O5 223,06108 -0,52 5,23 Ácido siríngico C9H10O5 197,04544 -0,54 4,42 Ácido vanílico C8H8O4 167,03477 -1,24 4,07 Brevifolina C10H12O4 195,06615 -0,69 7,31 Catecol (2-hidroxifenol) C6H6O2 109,02934 -1,54 2,82 Coumestrol C15H8O5 267,02972 -0,65 7,40 Galato de etilo C9H10O5 197,04533 -1,10 4,86 Oleuropeína C25H32O13 539,17700 -0,01 6,28 Pinoresinol C20H22O6 357,13397 -1,09 6,48 Resveratrol C8H10O3 227,07127 -0,42 6,46 Umbeliferona C9H6O3 161,02422 -1,25 4,88 Vanillina C8H8O3 151,03990 -1,10 4,52 Tabla 3.15. Datos más significativos obtenidos en la caracterización mediante UHPLC-HRMS/MS de los compuestos fenólicos estudiados. Metabolómica Dirigida 124 3.3. ANÁLISIS DE AMINOÁCIDOS MEDIANTE UHPLC-HRMS/MS. COLUMNA AMIDA Hasta el momento, en el análisis general UHPLC-HRMS/MS se ha empleado la cromatografía de fase reversa (RPC, Reversed Phase Chromatography). La RPC es el modo de cromatografía en el cual la fase móvil es polar y la fase estacionaria es hidrofóbica o no polar. Sin embargo, en ocasiones, para el análisis de especies altamente polares, la RPC no es adecuada tanto para la elución y en consecuencia separación de los diferentes compuestos. La cromatografía líquida de ultra alto rendimiento de interacción hidrofílica (HILIC-UHPLC) permite realizar el análisis cromatográfico de metabolitos altamente polares, como es el caso de los aminoácidos, proporcionando información complementaria a la RPC. En nuestro caso, se ha usado la columna Waters Acquity UPLC BEH Amide (2,1 × 100 mm, 1,7 µm de tamaño de partícula), la cual se compone de una fase amida (relleno trifuncional con grupo amida), que permite la separación mediante HILIC-UHPLC. Los aminoácidos que se han estudiado en estas condiciones se detallan en la Tabla 3.1. Las condiciones cromatográficas y los parámetros del espectrómetro de masas se detallan en el apartado 5.4.2. Al tratarse de una columna polar, se comienza con un eluyente poco polar (ACN:H2O (85:15, v/v), 15% FA, 10 mM de formiato amónico (eluyente A)) y se aumenta gradualmente su polaridad aumentando la proporción de H2O, 0,15% FA, 10 mM de formiato amónico (eluyente B). La caracterización de patrones de aminoácidos es análoga a la descrita en el apartado 3.2.6. Se preparan disoluciones individuales y mezcla de todos los patrones de aminoácidos de 1 µg/ml de concentración en ACN:H2O:FA (85:15:0,15, v/v/v), 10 mM de formiato amónico. Cada disolución patrón se inyecta en el equipo y se analiza mediante UHPLC-HRMS/MS empleando el experimento DDA (Top5), operando en modo positivo. De este modo se obtienen los tiempos de retención, masas exactas del ion pseudomolecular y masas exactas de los iones fragmento y fórmulas moleculares. En la Tabla 3.21 se recogen los aminoácidos caracterizados en condiciones cromatográficas HILIC-UHPLC. En la tabla se indica el nombre de cada aminoácido, fórmula molecular, m/z del ion pseudomolecular medido experimentalmente [M+H]+, el error m/z ∆(ppm) con respecto a la m/z del ion Metabolómica Dirigida 125 pseudomolecular teórico y el tiempo de retención. La tolerancia permitida entre la m/z teórica con respecto a la m/z experimental es menor o igual a ± 5 ppm. En el Anexo I se detalla la información experimental completa de cada aminoácido patrón caracterizado en estas condiciones. Aminoácido Fórmula molecular [M+H]+ m/z exp. Error m/z ∆(ppm) tR (min) 3,4-Dihidroxi-L-fenilalanina (DOPA) C9H11NO4 198,07576 -1,62 4,80 L-Ácido aspártico (Asp) C4H7NO4 134,04456 -1,67 9,95 L-Ácido glutámico (Glu) C5H9NO4 148,06004 -2,61 8,76 L-Alanina (Ala) C3H7NO2 90,05482 -1,59 5,05 L-Arginina (Arg) C6H14N4O2 175,11870 -1,44 10,47 L-Asparagina (Asn) C4H8N2O3 133,06053 -1,79 8,28 L-Cisteína (Cys) C3H7NO2S 122,02676 -2,24 3,89 L-Cistina (Cys-Cys) C6H12N2O4S2 241,03070 -1,74 12,09 L-Fenilalanina (Phe) C9H11NO2 166,08598 -1,67 2,13 L-Glicina (Gly) C2H5NO2 76,03920 -1,32 6,28 L-Glutamina (Gln) C5H10N2O3 147,07613 -2,00 7,79 L-Histidina (His) C6H9N3O2 156,07649 -1,65 10,23 L-Isoleucina (Ile) C6H13NO2 132,10162 -2,17 2,43 L-Leucina (Leu) C6H13NO2 132,10161 -2,28 2,20 L-Lisina (Lys) C6H14N2O2 147,11249 -2,12 10,86 L-Metionina (Met) C5H11NO2S 150,05803 -2,00 2,72 L-Prolina (Pro) C5H9NO2 116,07029 -2,76 3,30 L-Serina (Ser) C3H7NO3 106,04975 -1,12 7,93 L-Tirosina (Tyr) C9H11NO3 182,08101 -0,88 3,30 trans-4-Hidroxi- L-prolina (Hyp) C5H9NO3 132,06526 -1,95 5,13 L-Treonina (Thr) C4H9NO3 120,06532 -1,64 5,82 L-Triptófano (Trp) C11H12N2O2 205,09679 -1,77 2,11 L-Valina (Val) C5H11NO2 118,08596 -2,54 3,14 Tabla 3.21. Fórmula molecular, m/z del ion pseudomolecular obtenido experimentalmente, error m/z ∆(ppm) y tiempos de retención (tR) de cada aminoácido patrón. Condiciones cromatográficas columna Amida. Como ejemplo, en la Figura 3.20 se muestra un cromatograma XIC de una mezcla de patrones aminoácidos de 1 µg/ml de concentración disueltos en ACN:H2O:FA (85:15:0,15, v/v/v), 10mM de formiato amónico. Metabolómica Dirigida 126 Figura 3.20. Cromatograma XIC del experimento Full Scan de una mezcla de patrones de aminoácidos obtenido mediante UHPLC-HRMS/MS con el método DDA (Top5), con ionización en modo positivo y condiciones cromatográficas columna Amida: A) Leu e Ile a m/z = 132,10191, tR = 2,22 y 2,45 min, respectivamente; B) Asn a m/z = 133,06077, tR = 8,33 min y C) Gly a m/z = 76,03930, tR = 6,34 min. El error m/z ∆(ppm) ≤ ± 5 ppm. En la anterior figura se puede observar que, al usar condiciones cromatográficas HILIC-UHPLC, se obtiene una mejora considerable de la separación cromatográfica en el análisis de compuestos altamente polares, con tiempos de retención distribuidos entre 2 y 12 min. 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 Tiempo (min) 0 20 40 60 80 100 0 20 40 60 80 100 Abundancia Relativa 0 20 40 60 80 100 Ile 2,45 Leu 2,22 Asn 8,33 Gly 6,34 A B C Metabolómica Dirigida 127 3.4. ANÁLISIS DE ÁCIDOS ORGÁNICOS MEDIANTE UHPLC-HRMS/MS. COLUMNA HSS T3 Al igual que ocurre en el caso de los aminoácidos, la separación cromatográfica de los ácidos orgánicos ha requerido la optimización de un método cromatográfico que permita separar correctamente estos compuestos. En el caso de la elución de ácidos orgánicos se ha utilizado una columna Waters Acquity UPLC HSS T3 (2,1 × 100 mm, 1,8 µm de tamaño de partícula). Esta columna tiene una mayor capacidad a la hora de retener compuestos muy polares y permite trabajar en condiciones RPC con 100% de agua. Las condiciones cromatográficas y los parámetros del espectrómetro de masas se detallan en el apartado 5.4.3. El modo de ionización de trabajo es el negativo debido a que, al tratarse de compuestos de carácter ácido, se ve muy favorecida la pérdida de un protón del ácido carboxílico. La caracterización de patrones de ácidos orgánicos se realiza de forma análoga a como se ha descrito apartado 3.2.6. Para ello se preparan disoluciones individuales y mezcla de todos los patrones de ácidos orgánicos de 10 µg/ml de concentración en agua. Cada disolución patrón se inyecta en el equipo y se analiza mediante UHPLC-HRMS/MS empleando el experimento DDA (Top5), operando en modo negativo. En la Tabla 3.22 se muestran los ácidos orgánicos que se han caracterizado en estas condiciones cromatográficas. En la tabla se indica el nombre de cada compuesto patrón, fórmula molecular, m/z del ion pseudomolecular medido experimentalmente [M-H]–, el error m/z ∆(ppm) con respecto a la m/z del ion pseudomolecular teórico y el tiempo de retención. En el Anexo I se detalla la información experimental completa. No se han incluido en este estudio los ácidos benzoico y trans-cinámico, ya que estos sí son retenidos cuando se aplica el método UHPLC-HRMS/MS general (Tabla 3.13). Metabolómica Dirigida 128 Ácido Orgánico Fórmula molecular [M-H] – m/z exp. Error m/z ∆(ppm) tR (min) Ácido 3-fosfoglicérico C3H7O7P 184,98547 -1,00 0,60 Ácido α-cetoglutárico C5H6O5 145,01408 -1,15 1,15 Ácido ascórbico C6H8O6 175,02463 -1,04 1,05 Ácido L-aspártico C4H7NO4 132,03009 -1,06 0,55 Ácido cítrico C6H8O7 191,01965 -0,40 1,75 Ácido fosfoenolpirúvico C3H5O6P 166,97495 -0,93 0,65 Ácido L-glutámico C5H9NO4 146,04581 -0,50 0,58 Ácido L-láctico C3H6O3 89,02437 -0,58 1,11 Ácido L-málico C4H6O5 133,01410 -1,13 0,90 Ácido oxálico C2H2O4 88,98799 -0,43 0,60 Ácido pirúvico C3H4O3 87,00871 -0,75 0,85 Ácido succínico C4H6O4 117,01918 -1,28 2,19 Tabla 3.22. Fórmula molecular, m/z del ion pseudomolecular obtenido experimentalmente, error m/z ∆(ppm) y tiempos de retención (tR) de los patrones de ácidos orgánicos caracterizados usando las condiciones cromatográficas basadas en el uso de una columna HSS T3 (Waters). En la Figura 3.21 se muestra el cromatograma XIC correspondiente a una mezcla de ácidos orgánicos de 10 µg/ml en agua. En el cromatograma XIC se observan los picos cromatográficos correspondientes al ácido 3-fosfoglicérico (A), ácido cítrico (B), ácido láctico (C) y ácido succínico (D). Estos cromatogramas se obtienen al seleccionar la m/z del ion pseudomolecular teórico para cada compuesto (error m/z ∆(ppm) ≤ ± 5 ppm). Con este método se observa una mejora de la separación cromatográfica de los diferentes analitos. Metabolómica Dirigida 129 Figura 3.21. Cromatograma XIC del experimento Full Scan de una mezcla de patrones de ácidos orgánicos obtenido mediante UHPLC-HRMS/MS con el método DDA (Top5), con ionización en modo negativo y condiciones cromatográficas columna HSS T3: A) ácido 3-fosfoglicérico a m/z 184,98566, tR = 0,60 min; B) ácido cítrico a m/z 191,01973, tR = 1,75 min; C) ácido láctico a m/z 89,02442, tR = 1,11 min y D) ácido succínico a m/z 117,01933, tR = 2,19 min. 3.5. ANÁLISIS DE AZÚCARES MEDIANTE GC-HRMS El análisis de azúcares se ha realizado mediante cromatografía de gases acoplado a espectrometría de masas de alta resolución (GC-HRMS). Empleando esta técnica se consigue identificar los distintos compuestos que presentan las plantas de alfalfa, así como su correcta identificación por comparación con los tiempos de retención y los espectros de masas obtenidos usando patrones. Para la correcta identificación de los azúcares, ha sido necesario el empleo del tiempo de retención relativo (tRR) en base al patrón interno utilizado myo-inositol-d6. La combinación GC-MS supone una de las técnicas más fiables para el análisis de compuestos orgánicos de bajo peso molecular. Normalmente el análisis mediante GC-MS requiere uno o más procedimientos de derivatización previos al análisis de las muestras. Estos procedimientos de derivatización pueden consistir en una o más etapas y se realizan para bloquear todos los protones activos y grupos 0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 4,0 4,5 5,0 Tiempo (min) 0 100 0 100 0 100 Abundancia Relativa 0 100 Ácido 3-fosfoglicérico Ácido cítrico Ácido láctico Ácido succínico 0,60 1,75 1,11 2,19 A B C D Metabolómica Dirigida 130 lábiles presentes en esta clase de compuestos. Es decir, cuando se trabaja en GC es necesario que las especies sean volátiles y térmicamente estables. Sin embargo, hay ocasiones que esto no ocurre por lo que es necesario recurrir a la derivatización de ciertos grupos funcionales para hacer que estas especies lo sean, sobre todo cuando se trabaja con compuestos de carácter polar, como es nuestro caso. Debido a experiencias previas, el análisis de azúcares libres se ha decidido llevarlo a cabo mediante GC-HRMS en lugar de UHPLC-HRMS/MS dado a la mejor separación cromatográfica los azúcares sujetos a estudio. En esta Tesis, el análisis de Metabolómica Dirigida mediante GC-HRMS se ha llevado a cabo empleando una derivatización de las muestras que consiste en la formación de los derivados O-metiloxima (aldoximas y cetoximas) y posterior formación de los trimetilsililderivados.148 Este método es rápido y permite en dos pasos de reacción obtener los derivados volátiles necesarios para el análisis por GC-HRMS. En el caso de azúcares, el análisis mediante GC-HRMS permite determinar cualitativamente azúcares libres, disacáridos e incluso trisacáridos. Las moléculas mayores que los trisacáridos no se pueden analizar con esta metodología debido a que no son volátiles en las condiciones del análisis, incluso siendo derivatizadas. Las condiciones experimentales de la rampa de temperatura empleada y de los parámetros del espectrómetro de masas en el análisis GC-HRMS, se han detallado en el apartado 5.4.4. Los azúcares estudiados mediante GC-HRMS se engloban en la Tabla 3.23. Metabolómica Dirigida 131 Compuesto Abreviatura Ácido D-galacturónico GalA Ácido D-glucurónico GlcA D-Arabinosa Ara D-Fructosa Fru D-Galactosa Gal D-Glucosa Glc D-Manosa Man D-Ribosa Rib D-Sacarosa Suc D-Xilosa Xil L-Fucosa Fuc L-Rhamnosa Rha Myo-Inositol-d6 (patrón interno) Ino-d6 N-Acetil-D-glucosamina GlcNAc Tabla 3.23. Azúcares estudiados mediante GC-HRMS. 3.5.1. Caracterización de patrones La caracterización de patrones mediante GC-HRMS se realiza según se ha descrito en el apartado 5.4.4. Para ello se preparan disoluciones individuales y mezcla de los patrones de 100 µg/ml y una disolución de patrón interno myo-inositol-d6 en agua de 100 µg/ml. Se añade a un vial una alícuota de cada disolución patrón (20 µg) y una alícuota del patrón interno (2 µg) y se liofiliza. La mezcla liofilizada se derivatiza según el procedimiento descrito por Cerdán-Calero et al.148 En la primera etapa del procedimiento de derivatización se forman los derivados O-metiloxima (MEOX) en el caso de compuestos que presentan grupos funcionales de tipo aldehído o cetona. Posteriormente, en la segunda etapa, se forman los O-trimetilsililderivados y N-trimetilsililderivados en los compuestos que presenten grupos hidroxilo y amina libres, dando lugar a los O-metiloxima per-N,O- Metabolómica Dirigida 132 trimetilsililderivados (MEOX-TMS) o solo a per-N,O-trimetilsilil derivados, si el compuesto no contiene un grupo aldehído o cetona. La preparación de los MEOX-TMS derivados tiene la ventaja de que permite la identificación simultánea de azúcares neutros, aminoazúcares y ácidos urónicos. Como ejemplo, en la Figura 3.22 se resume la formación de los MEOX-TMS derivados formados en el procedimiento de derivatización para la D-glucosa. En la figura se muestra la formación de los MEOX-TMS derivados del isómero mayoritario (-OMe del grupo oxima en posición trans). Figura 3.22. Formación de los MEOX-TMS derivados en el procedimiento de derivatización de la D-glucosa. Los espectros de masas de los azúcares suelen presentar picos característicos procedentes de la fragmentación de la molécula. En los espectros de masas suele observarse el ion fragmento a m/z 73,04680 correspondiente a [C3H9Si]+. Por ejemplo, en el caso de las aldohexosas es común observar los iones fragmento a m/z 147,06559, 205,10746 y 217,10746 correspondientes a [C5H15OSi2]+, [C8H21O2Si2]+ y [C9H21O2Si2]+, respectivamente, siendo frecuente observar el primero como pico base del espectro de masas, como ocurre en el caso de Glc, Gal, Man o GlcNAc. Sin embargo, en el caso la fructosa (cetohexosa) el ion fragmento mayoritario es el ion a m/z 217,10746. En el caso de desoxialdosas como la fucosa y rhamnosa, el ion fragmento mayoritario corresponde a m/z 117,07302 correspondiente a [C5H13OSi]+. OH HO OH OH OH N OTMS TMSO OTMS OTMS OTMS N MEOX-TMS derivado OO 2. MSTFA CHO OH HO OH OH OH D-Glucosa 1. MEOX (20 mg/ml en Py) 40 ºC, 200 rpm, 1h 40 ºC, 200 rpm, 1h Metabolómica Dirigida 133 Por otro lado, en el caso de los ácidos urónicos es frecuente observar en sus espectros de masas el ion fragmento mayoritario a m/z 333,13682 correspondiente a [C13H29O4Si3]+. En el caso de azúcares no reductores como la sacarosa se suelen obtener los TMS-derivados en lugar de los MEOX-TMS derivados. En el caso de la sacarosa el pico base de su espectro de masas es el ion fragmento a m/z 361,16812 correspondiente a [C15H33O4Si3]+. En la Tabla 3.24 se muestran los datos de tiempo de retención, tiempo de retención relativo respecto al patrón interno myo-inositol-d6, m/z del ion fragmento mayoritario obtenido experimentalmente del compuesto derivatizado y áreas relativas de los picos cromatográficos obtenidos para cada patrón estudiado. En todos los casos, la tolerancia permitida entre la m/z teórica con respecto a la m/z experimental ha sido menor o igual a ± 5 ppm. Asimismo, en el Anexo I se detalla la información experimental completa de cada compuesto caracterizado. En dicha tabla se recoge el nombre del compuesto, m/z del ion fragmento mayoritario teórico y experimental, error m/z ∆(ppm), el tiempo de retención de cada patrón caracterizado (min) y tiempo de retención relativo en base al patrón interno myo-inositol-d6 y áreas relativas de los picos cromatográficos obtenidos para los MEOX-TMS derivados y TMS derivados de los patrones de azúcares en estudio. 7. Bibliografía Bibliografía 239 7. BIBLIOGRAFÍA 1. H. 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Fitohormonas Compuesto Fórmula Molecular [M-H]– m/z teórico [M-H]– m/z exp. tR (min) Fragmentos Fórmula Molecular m/z teórico m/z exp. Ácido abscísico C15H20O4 263,12888 263,12888 6,58 C7H6O2 C8H8O2 C9H13O2 C13H16O2 C 14 H 19 O 2 122,03733 136,05298 153,09210 204,11558 219,13905 122,03741 136,05301 153,09222 204,11581 219,13905 Ácido jasmónico C 12 H 18 O 3 209,11832 209,11827 7,19 C 2 H 3 O 2 59,01385 59,01370 Ácido salicílico C7H6O3 137,02442 137,02428 5,82 C5H5 C 6 H 5 O 65,03967 93,03459 65,03965 93,03468 ACC C4H7NO2 100,04040 100,04034 0,51 C3H4N C 4 H 4 NO 54,03492 82,02984 54,03485 82,02985 Ácido indolacético C10H9NO2 174,05605 174,05583 5,47 C9H6N C 9 H 8 N 128,05057 130,06622 128,05066 130,06627 Anexo I 259 Compuesto Fórmula Molecular [M-H]– m/z teórico [M-H]– m/z exp. tR (min) Fragmentos Fórmula Molecular m/z teórico m/z exp. Ácido indoláctico C11H11NO3 204,06662 204,06636 5,17 C8H6N C9H8N C10H8N C10H8NO C 11 H 8 NO 2 116,05057 130,06622 142,06622 158,06114 186,05605 116,05063 130,06624 142,06627 158,06119 186,05612 Ácido indolbutírico C12H13NO2 202,08735 202,08734 6,96 C8H6N C 11 H 12 N 116,05057 158,09752 116,05047 158,09741 Ácido indolpirúvico C11H9NO3 202,05097 202,05098 6,27 C3NO C8H5N C9H4NO C9H5NO2 C 10 H 8 NO 2 65,99854 115,04275 142,02984 159,03258 174,05605 65,99844 115,04281 142,02995 159,03238 174,05611 Ácido indolpropiónico C11H11NO2 188,07170 188,07156 6,35 C2H3O2 C8H6N C10H8N C 10 H 10 N 59,01385 116,05057 142,06622 144,08187 59,01390 116,05064 142,06624 144,08197 Triptofol C10H11NO 160,07679 160,07672 5,61 C8H6N C8H4NO C 10 H 8 N 116,05057 130,02984 142,06622 116,05051 130,06609 142,06606 Kinetina C10H9N5O 214,07343 214,07335 4,12 C4H3N4 C5H2N5 C5H3N5 C5H4N5 C 10 H 6 N 5 107,03632 132,03157 133,03939 134,04722 196,06287 107,03638 132,03163 133,03944 134,04729 196,06294 Anexo I 260 Compuesto Fórmula Molecular [M-H]– m/z teórico [M-H]– m/z exp. tR (min) Fragmentos Fórmula Molecular m/z teórico m/z exp. trans-Zeatina C10H13N5O 218,10473 218,10448 3,21 C4H3N4 C5H2N5 C5H3N5 C5H4N5 C 10 H 10 N 5 107,03632 132,03157 133,03939 134,04722 200,09417 107,03638 132,03162 133,03944 134,04729 200,09435 trans-Zeatina ribósido C15H21N5O5 350,14699 350,14676 4,27 C4H3N4 C5H4N5 C10H10N5 C10H12N5O C 10 H 12 N 5 O 4 107,03632 134,04722 200,09417 218,10473 266,08948 107,03639 134,04730 200,09465 218,10478 266,08987 Ácido giberélico (GA3) C19H22O6 345,13436 345,13412 5,31 C4H7O C5H7O C11H11 C17H17 C 17 H 19 O 71,05024 83,05024 143,08662 221,13357 239,14414 71,05025 83,05032 143,08667 221,13370 239,14435 Giberelina A12 C20H28O4 331,19148 331,19141 9,57 C14H17O C16H19O C19H25O C19H27O2 C 20 H 25 O 3 201,12849 227,14414 269,19109 287,20165 313,18092 201,12881 227,14404 269,19131 287,20215 313,18149 Giberelina A19 C20H26O6 361,16566 361,16553 7,41 C5H7O C9H9O C15H17O2 C18H25O2 C 19 H 25 O 4 83,05024 133,06589 229,12340 273,18600 317,17583 83,05033 133,06598 229,12364 273,18634 317,17596 Anexo I 261 Tabla IV. Compuestos fenólicos Compuesto Fórmula Molecular [M-H]– m/z teórico [M-H]– m/z exp. tR (min) Fragmentos Fórmula Molecular m/z teórico m/z exp. 3-Hidroxitirosol C8H10O3 153,05572 153,05557 2,69 C5H5O C6H5O C6H7O C6H4O2 C 7 H 7 O 2 81,03459 93,03459 95,05024 108,02168 123,04515 81,03465 93,03458 95,05027 108,02171 123,04526 Ácido 2,4-dihidroxibenzóico C7H6O4 153,01933 153,01913 3,83 C5H5 C4H3O C 6 H 5 O 2 65,03967 67,01894 109,02950 65,03971 67,01897 109,02951 Ácido 3-O-metilgálico C8H8O5 183,02990 183,02977 3,16 C5H3O2 C6H4O3 C7H7O3 C 7 H 4 O 5 95,01385 124,01659 139,04007 168,00642 95,01397 124,01662 139,03981 168,00655 Ácido 4-hidroxibenzóico C7H6O3 137,02442 137,02420 3,38 C5H5 C 6 H 5 O 65,03967 93,03459 65,03971 93,03462 Ácido 4-O-cafeoilquínico C16H18O9 353,08781 353,08783 4,07 C6H5O C8H7O2 C7H9O5 C9H7O4 C 7 H 11 O 6 93,03459 135,04515 173,04555 179,03498 191,05611 93,03461 135,04527 173,04561 179,03514 191,05632 Ácido caféico C9H8O4 179,03498 179,03484 4,05 C7H5 C7H7O C8H6O2 C 8 H 7 O 2 89,03967 107,05024 134,03733 135,04515 89,03974 107,05027 134,03746 135,04523 Anexo I 268 Compuesto Fórmula Molecular [M-H]– m/z teórico [M-H]– m/z exp. tR (min) Fragmentos Fórmula Molecular m/z teórico m/z exp. Ácido caftárico C13H12O9 311,04086 311,04068 2,82 C2HO3 C3H3O3 C8H7O2 C4H5O6 C 9 H 7 O 4 72,99312 87,00877 135,04515 149,00916 179,03498 72,99307 87,00873 135,04511 149,00902 179,03495 Ácido cicórico C22H18O12 473,07255 473,07248 4,91 C3H3O3 C8H7O2 C4H5O6 C9H7O4 C 11 H 7 O 5 87,00877 135,04515 149,00916 179,03498 219,02990 87,00880 135,04523 149,00914 179,03506 219,03040 Ácido clorogénico (Ácido 3-O-cafeoilquínico) C16H18O9 353,08781 353,08755 3,89 C2H3O2 C4H5O2 C6H5O C6H7O3 C 7 H 11 O 6 59,01385 85,02950 93,03459 127,04007 191,05611 59,01387 85,02954 93,03460 127,04011 191,05630 Ácido dihidrocaféico C9H10O4 181,05063 181,05054 3,89 C2H3O2 C6H5O2 C8H7O C7H5O2 C 8 H 9 O 2 59,01385 109,02950 119,05024 121,02950 137,06080 59,01388 109,02963 119,05027 121,02967 137,06088 Ácido elágico C14H6O8 300,99899 300,99881 5,71 C8H5O C9H5O2 C10H5O3 C11H5O4 C 14 H 4 O 7 117,03459 145,02950 173,02442 201,01933 283,99625 117,03465 145,02960 173,02452 201,01958 283,99673 Anexo I 269 Compuesto Fórmula Molecular [M-H]– m/z teórico [M-H]– m/z exp. tR (min) Fragmentos Fórmula Molecular m/z teórico m/z exp. Ácido ferúlico C10H10O4 193,05063 193,05042 5,17 C7H6O C8H6O2 C9H9O2 C 9 H 6 O 4 106,04241 134,03733 149,06080 178,02716 106,04244 134,03743 149,06085 178,02730 Ácido florético C9H10O3 165,05572 165,05558 4,67 C2H3O2 C6H5O C 8 H 9 O 59,01385 93,03459 121,02950 59,01381 93,03448 121,06574 Ácido gálico C7H6O5 169,01425 169,01408 1,07 C4H5O C5H3O C5H5O C5H5O2 C 6 H 5 O 3 69,03459 79,01894 81,03459 97,02950 125,02442 69,03461 79,01897 81,03461 97,02950 125,02443 Ácido gentísico C7H6O4 153,01933 153,01915 3,29 C5H5O C6H4O2 C 6 H 5 O 2 81,03459 108,02168 109,029 5 0 81,03461 108,02174 109,02953 Ácido homovanílico C9H10O4 181,05063 181,05051 4,36 C2H3O2 C7H6O2 C 8 H 9 O 2 59,01385 122,03733 137,06080 59,01393 122,03739 137,06084 Ácido isovanílico C8H8O4 167,03498 167,03481 4,31 C6H4O2 C7H7O2 C 7 H 4 O 4 108,02168 123,04520 152,01151 108,02174 123,04523 152,01155 Ácido p-cumárico C9H8O3 163,04007 163,03992 4,84 C5H5 C6H5O C 8 H 7 O 65,03967 93,03459 119,05024 65,03967 93,03456 119,05020 Anexo I 270 Compuesto Fórmula Molecular [M-H]– m/z teórico [M-H]– m/z exp. tR (min) Fragmentos Fórmula Molecular m/z teórico m/z exp. Ácido protocatéquico C7H6O4 153,01933 153,01915 2,20 C4HO C5H5O C6H3O C6H4O2 C 6 H 5 O 2 65,00329 81,03459 91,01894 108,02168 109,029 5 0 65,00327 81,03458 91,01893 108,02173 109,02951 Ácido sinápico C11H12O5 223,06120 223,06108 5,23 C6H5O C7H5O2 C8H5O3 C9H5O5 C 10 H 8 O 5 93,03459 121,02950 149,02442 193,01425 208,03772 93,03458 121,02953 149,02443 193,01433 208,03789 Ácido siríngico C9H10O5 197,04555 197,04544 4,42 C5H3O2 C6H3O3 C7H6O3 C7H3O5 C 8 H 6 O 5 95,01385 123,00877 138,03224 166,99860 182,02207 95,01390 123,00883 138,03229 166,99863 182,02225 Ácido vanílico C8H8O4 167,03498 167,03477 4,07 C6H3O C6H4O2 C7H7O2 C 7 H 4 O 4 91,01894 108,02168 123,04520 152,01151 91,01901 108,02174 123,04515 152,01155 Brevifolina C10H12O4 195,06628 195,06615 7,31 C6H5O2 C7H5O3 C8H9O3 C8H5O4 C 9 H 8 O 4 109,02950 137,02442 153,05572 165,01933 180,04281 109,02935 137,02425 153,05559 165,01912 180,04272 Anexo I 271 Compuesto Fórmula Molecular [M-H]– m/z teórico [M-H]– m/z exp. tR (min) Fragmentos Fórmula Molecular m/z teórico m/z exp. Catecol (2-hidroxifenol) C6H6O2 109,02950 109,02934 2,82 C4HO C5H5O C6H3O C 6 H 4 O 2 65,00329 81,03459 91,01894 108,02168 65, 00324 81,03457 91,01888 108,02173 Coumestrol C15H8O5 267,02990 267,02972 7,40 C6H3O C7H3O3 C12H7O C13H7O3 C 14 H 7 O 4 91,01894 135,00877 167,05024 211,04007 239,03498 91,01895 135,00879 167,05022 211,04013 239,03510 Galato de etilo C9H10O5 197,04555 197,04533 4,86 C5H2O C6H4O3 C6H5O3 C 7 H 5 O 5 78,01111 124,01659 125,02442 169,01425 78,01109 124,01662 125,02446 169,01407 Oleuropeína C25H32O13 539,17701 539,17700 6,28 C2H3O2 C3HO2 C3H3O2 C6H7O C 5 H 3 O 3 59,01385 68,99820 71,01385 95,05024 111,00877 59,01389 68,99823 71,01387 95,05026 111,00878 Pinoresinol C20H22O6 357,13436 357,13397 6,48 C6H5O C6H4O2 C7H5O2 C7H4O3 C 8 H 7 O 3 93,03459 108,02168 121,02950 136,01659 151,04007 93,03446 108,02157 121,02935 136,01639 151,03992 Anexo I 272 Compuesto Fórmula Molecular [M-H]– m/z teórico [M-H]– m/z exp. tR (min) Fragmentos Fórmula Molecular m/z teórico m/z exp. Resveratrol C8H10O3 153,05572 227,07127 6,46 C9H7 C8H5O C10H7O C13H11O C 12 H 9 O 2 115,05532 117,03459 143,05024 183,08154 185,06080 115,05530 117,03458 143,05026 183,08154 185,06085 Umbeliferona C9H6O3 161,02442 161,02422 4,88 C4HO C6H5 C7H5 C8H5O C 8 H 5 O 2 65,00329 77,03967 89,03967 117,03459 133,02950 65,00333 77,03972 89,03974 117,03466 133,02957 Vanillina C8H8O3 151,04007 151,03990 4,52 C6H4O C6H4O2 C 7 H 4 O 3 92,02676 108,02168 136,01659 92,02683 108,02177 136,01665 Anexo I 273 Tabla V. Flavonoides (flavonas) Compuesto Fórmula Molecular [M-H]– m/z teórico [M-H]– m/z exp. tR (min) Fragmentos Fórmula Molecular m/z teórico m/z exp. Apigenina C15H10O5 269,04555 269,04526 7,27 C4HO C6H3O2 C8H5O C8H5O3 C 7 H 3 O 4 65,00329 107,01385 117,03459 149,02442 151 , 00368 65,00330 107,01384 117,03458 149,02434 151,00363 Apigenina-7-O-Glc C21H20O10 431,09837 431,09818 6,01 C5H3 C6H3O2 C8H5O C13H7O3 C 15 H 8 O 5 63,02402 107,01385 117,03459 211,04007 268 , 03772 63,02397 107,01397 117,03458 211,04044 268,03796 Crisina C15H10O4 253,05063 253,05037 8,35 C5H3 C4HO C6H3O2 C8H7O C 10 H 7 O 63,02402 65,00329 107,01385 119,05024 143 , 05024 63,02403 65,00327 107,01382 119,05013 143,05013 Diosmetina C16H12O6 299,05611 299,05563 7,42 C5H3 C4HO C6H3O2 C7H3O4 C 15 H 8 O 6 63,02402 65,00329 107,01385 151,00368 284 , 03264 63,02401 65,00327 107,01382 151,00356 284,03253 Gnafalina A (5,7-dihidroxi-3,8-dimetoxiflavona) C17H14O6 313,07176 313,07202 8,43 C10H5O C12H7O3 C14H7O5 C15H7O6 C 16 H 10 O 6 141,03459 199,04007 255,02990 283,02481 298 , 04829 141,03477 199,04039 255,03029 283,02521 298,04868 Anexo I 274 Compuesto Fórmula Molecular [M-H]– m/z teórico [M-H]– m/z exp. tR (min) Fragmentos Fórmula Molecular m/z teórico m/z exp. Isovitexina C21H20O10 431,09837 431,09775 5,55 C6H5 C8H5O C16H11O5 C17H11O6 C 18 H 13 O 7 77,03967 117,03459 283,06120 311,05611 341 , 06668 77,03969 117,03458 283,06125 311,05612 341,06641 Luteolina C15H10O6 285,04046 285,04010 6,90 C4HO C6H3O2 C8H5O2 C7H3O4 C 10 H 7 O 3 65,00329 107,01385 133,02950 151,00368 175 , 04007 65,00327 107,0138 133,0295 151,00334 175,03986 Luteolina-4'-O-Glc C21H20O11 447,09328 447,09290 6,11 C4HO C6H3O2 C8H5O2 C7H3O4 C 15 H 9 O 6 65,00329 107,01385 133,02950 151,00368 285 , 04046 65,00327 107,01379 133,02950 151,00362 285,04059 Luteolina-7-O-Glc C21H20O11 447,09328 447,09265 5,59 C5H3 C4HO C6H3O2 C8H5O2 C 15 H 9 O 6 63,02402 65,00329 107,01385 133,02950 285 , 04046 63,02402 65,00330 107,01384 133,02950 285,04053 Vitexina C21H20O10 431,09837 431,09818 5,36 C6H5 C8H5O C16H11O5 C17H11O6 C 18 H 13 O 7 77,03967 117,03459 283,06120 311,05611 341 , 06668 77,03969 117,03458 283,06122 311,05618 341,06628 Glc = Glucósido Anexo I 275 Tabla VI. Flavonoides (flavonoles) Compuesto Fórmula Molecular [M-H]– m/z teórico [M-H]– m/z exp. tR (min) Fragmentos Fórmula Molecular m/z teórico m/z exp. Fisetina C15H10O6 285,04046 285,04001 6,20 C6H3O C6H5O C7H5O2 C7H3O3 C 8 H 3 O 4 91,01894 93,03459 121,02950 135,00877 163,00368 91,01888 93,03448 121,0294 135,00868 163,00359 Galangina C15H10O5 269,04555 269,04517 8,57 C4HO C6H4O2 C10H7O C12H9O C 13 H 7 O 3 65,00329 108,02168 143,05024 169,06589 211,04007 65,00322 108,02154 143,04996 169,06593 211,03996 Hiperósido (Quercetina-3-O-Gal) C21H20O12 463,08820 463,08850 5,60 C13H7O4 C13H7O5 C14H7O5 C14H7O6 C 15 H 8 O 7 227,03498 243,02990 255,02990 271,02481 300,02755 227,0351 243,02998 255,03006 271,02521 300,02777 Isorhamnetina (3’-metilquercetina) C16H12O7 315,05103 315,05090 7,38 C6H3O2 C13H7O5 C14H7O5 C14H7O6 C 15 H 8 O 7 107,01385 243,02990 255,02990 271,02481 300,02755 107,01393 243,02937 255,03000 271,02548 300,02774 Isorhamnetina-3-O-Ru C28H32O16 623,16176 623,16052 6,18 C13H7O5 C14H7O5 C14H7O6 C15H7O7 C 16 H 11 O 7 243,02990 255,02990 271,02481 299,01973 315,05103 243,02959 255,02972 271,02475 299,01968 315,05096 Anexo I 276 Compuesto Fórmula Molecular [M-H]– m/z teórico [M-H]– m/z exp. tR (min) Fragmentos Fórmula Molecular m/z teórico m/z exp. Kaempferol C15H10O6 285,04046 285,04007 7,20 C4HO C6H5O C8H5O C10H7O2 C 11 H 7 O 3 65,00329 93,03459 117,03459 159,04515 187,04007 65,00324 93,03449 117,03451 159,04503 187,03990 Kaempferol-3-O-Glc C21H20O11 447,09328 447,09311 6,10 C12H7O2 C13H7O3 C13H7O4 C14H7O5 C 15 H 8 O 6 183,04515 211,04007 227,03498 255,02990 284,03264 183,04506 211,03998 227,03500 255,02985 284,03256 Kaempferol-3-O-GlcA C21H18O12 461,07255 461,07178 6,06 C2H3O2 C3H3O2 C11H7O3 C13H9O4 C 15 H 9 O 6 59,01385 71,01385 187,04007 229,05063 285,04046 59,01383 71,01384 187,03992 229,05054 285,04034 Miricetina C15H10O8 317,03029 317,02960 5,99 C4HO C6H5O2 C7H5O3 C7H3O4 C 8 H 3 O 5 65,00329 109,02950 137,02442 151,00368 178,99860 65,00326 109,02938 137,02429 151,00359 178,99854 Morina C15H10O7 301,03538 301,03491 6,27 C4HO C4H3O2 C6H5O3 C8H5O3 C 7 H 3 O 4 65,00329 83,01385 125,02442 149,02442 151,00368 65,00327 83,01383 125,02431 149,02426 151,00357 Anexo I 277 Compuesto Fórmula Molecular [M-H]– m/z teórico [M-H]– m/z exp. tR (min) Fragmentos Fórmula Molecular m/z teórico m/z exp. Isoflavonas Daidzeína C15H10O4 253,05063 253,05042 6,48 C6H3O C8H4O2 C13H7O2 C14H8O2 C 14 H 7 O 3 91,01894 132,02168 195,04515 208,05298 223,04007 91,01892 132,02164 195,04509 208,05292 223,03998 Daidzina C21H20O9 415,10346 415,10300 5,43 C6H3O C8H4O2 C13H7O2 C14H7O3 C 15 H 8 O 4 91,01894 132,02168 195,04515 223,04007 252,04281 91,01888 132,02158 195,04500 223,03993 252,04269 Genisteína C15H10O5 269,04555 269,04532 6,95 C5H3 C4HO C6H3O2 C8H5O2 C 10 H 7 O 2 63,02402 65,00329 107,01385 133,02950 159,04515 63,02404 65,00329 107,01383 133,02950 159,04509 Genistina C21H20O10 431,09837 431,09680 5,31 C8H4O2 C13H7O2 C13H7O3 C14H7O4 C 15 H 8 O 5 132,02168 195,04515 211,04007 239,03498 268,03772 132,02164 195,04564 211,04027 239,03470 268,03784 Gliciteína C16H12O5 283,06120 283,06097 6,70 C12H8O2 C13H8O2 C13H7O3 C14H8O4 C 15 H 8 O 5 184,05298 196,05298 211,04007 240,04281 268,03772 184,05295 196,05305 211,03995 240,04285 268,03781 Anexo I 284 Compuesto Fórmula Molecular [M-H]– m/z teórico [M-H]– m/z exp. tR (min) Fragmentos Fórmula Molecular m/z teórico m/z exp. Glicitina C22H22O10 445,11402 445,11389 5,03 C11H7O C13H7O3 C14H7O3 C14H7O4 C 16 H 10 O 5 155,05024 211,04007 223,04007 239,03498 282,05337 155, 05021 211,03998 223,03994 239,03491 282,05322 Anexo I 285 Tabla IX. Flavonoides (catequinas y procianidinas) Compuesto Fórmula Molecular [M-H]– m/z teórico [M-H]– m/z exp. tR (min) Fragmentos Fórmula Molecular m/z teórico m/z exp. Catequinas L-(-)-Catequina C15H14O6 289,07176 289,07138 3,60 C6H5O2 C7H7O2 C7H5O3 C12H11O3 C 14 H 13 O 4 109,02950 123,04515 137,02442 203,07137 245,08193 109,02937 123,04508 137,02428 203,07130 245,08168 L-(-)-Epicatequina C15H14O6 289,07176 289,07135 4,36 C6H5O2 C7H7O2 C7H5O3 C12H11O3 C 14 H 13 O 4 109,02950 123,04515 137,02442 203,07137 245,08193 109,02941 123,04511 137,02437 203,07161 245,08197 (-)-Epicatequina-3-O-galato C22H18O10 441,08272 441,08243 4,90 C6H5O2 C6H5O3 C7H5O5 C14H13O4 C 15 H 13 O 6 109,02950 125,02442 169,01425 245,08193 289,07176 109,02941 125,02435 169,01422 245,08162 289,07172 (-)-Epigalocatequina C15H14O7 305,06668 305,06628 3,52 C6H5O2 C6H5O3 C7H5O3 C8H7O4 C 12 H 11 O 4 109,02950 125,02442 137,02442 167,03498 219,06628 109,02940 125,02434 137,02429 167,03497 219,06619 Anexo I 286 Compuesto Fórmula Molecular [M-H]– m/z teórico [M-H]– m/z exp. tR (min) Fragmentos Fórmula Molecular m/z teórico m/z exp. (-)-Galocatequina C15H14O7 305,06668 305,06703 1,90 C6H5O2 C6H5O3 C7H5O3 C8H7O4 C 12 H 11 O 4 109,02950 125,02442 137,02442 167,03498 219,06628 109,02950 125,02444 137,02443 167,03503 219,06642 Procianidinas Procianidina B1 C30H26O12 577,13515 577,13501 3,28 C6H5O2 C6H5O3 C9H5O3 C15H13O6 C 22 H 15 O 8 109,02952 125,02442 161,02442 289,07214 407,07724 109,02952 125,02443 161,02450 289,07214 407,07754 Procianidina B2 C30H26O12 577,13515 577,13495 3,86 C6H5O2 C6H5O3 C9H5O3 C15H13O6 C 22 H 15 O 8 109,02952 125,02442 161,02442 289,07214 407,07724 109,02954 125,02446 161,02456 289,07216 407,07762 Anexo I 287 Tabla X. Aminoácidos (columna Amida) Compuesto Fórmula Molecular [M-H]+ m/z teórico [M-H]+ m/z exp. tR (min) Fragmentos Fórmula Molecular m/z teórico m/z exp. DOPA C9H11NO4 198,07608 198,07576 4,8 C7H7O C8H7O2 C7H7O3 C8H10NO2 C 9 H 9 O 4 107,04914 135,04406 139,03897 152,07061 181,04954 107, 04915 135,04405 139,03896 152,07066 181,04958 Asp C4H7NO4 134,04478 134,04456 9,95 C2H4NO2 C3H6NO2 C 4 H 6 NO 3 74,02365 88,03930 116,03422 74,02370 88,03936 116,03430 Glu C5H9NO4 148,06043 148,06004 8,76 C3H6N C4H6NO C4H8NO2 C 5 H 8 NO 3 56,04948 84,04439 102,05496 130,04987 56,04963 84,04446 102,05500 130 , 04993 Ala C 3 H 7 NO 2 90,05496 90,05482 5,05 - - - Arg C6H14N4O2 175,11895 175,11870 10,47 CH6N3 C4H8N C5H10NO2 C5H12N3O C 6 H 12 N 3 O 2 60,05562 70,06513 116,07061 130,09749 158,09240 60,05576 70,06519 116,07070 130,09769 158,09250 Asn C4H8N2O3 133,06077 133,06053 8,28 C2H4NO2 C3H7N2O C3H6NO2 C 4 H 6 NO 3 74,02365 87,05529 88,03930 116,03422 74,02370 87,05534 88,03931 116,03425 Anexo I 288 Compuesto Fórmula Molecular [M-H]+ m/z teórico [M-H]+ m/z exp. tR (min) Fragmentos Fórmula Molecular m/z teórico m/z exp. Cys C3H7NO2S 122,02703 122,02676 3,89 C2H3S C2H6NS C3H3OS C 2 H 7 N 3 O 2 58,99500 76,02155 86,98991 105,00048 58, 99513 76,02157 86,98990 105,00054 Cys-Cys C6H12N2O4S2 241,03112 241,03070 12,09 C2H4NO2 C3H6NO2S C3H8NO2S C3H6NO2S2 C 5 H 11 N 2 O 2 S 2 74,02365 120,01138 122,02703 151,98345 195,02565 74,02367 120,01144 122,02705 151,98349 195,02550 Phe C9H11NO2 166,08626 166,08598 2,13 C7H9 C8H7 C7H7O C8H10N C 9 H 7 O 93,06988 103,05423 107,04914 120,08078 131,04914 93,06986 103,05419 107,04910 120,08081 131,04915 Gly C 2 H 5 NO 2 76,03930 76,03920 6,28 - - - Gln C5H10N2O3 147,07642 147,07613 7,79 C4H6NO C4H9N2O C4H8NO2 C 5 H 8 NO 3 84,04439 101,07094 102,05496 130,04987 84,04446 101,07093 102,05502 130,04999 His C6H9N3O2 156,07675 156,07649 10,23 C4H7N2 C5H7N2 C 5 H 8 N 3 83,06037 95,06037 110,07127 83,06041 95,06040 110,07138 Ile C6H13NO2 132,10191 132,10162 2,43 C5H9 C 5 H 12 N 69,06988 86,09643 69,06989 86,09646 Leu C 6 H 13 NO 2 132,10191 132,10161 2,20 C 5 H 12 N 86,09642 86,09644 Anexo I 289 Compuesto Fórmula Molecular [M-H]+ m/z teórico [M-H]+ m/z exp. tR (min) Fragmentos Fórmula Molecular m/z teórico m/z exp. Lys C6H14N2O2 147,11280 147,11249 10,86 C5H10N C 6 H 12 NO 2 84,08078 130,08626 84,08085 130,08635 Met C5H11NO2S 150,05833 150,05803 2,72 C4H10NS C 5 H 9 O 2 S 104,05285 133,03178 104,05288 133,03181 Pro C 5 H 9 NO 2 116,07061 116,07029 3,30 C 4 H 8 N 70,06513 70,06518 Ser C3H7NO3 106,04987 106,04975 7,93 C2H6NO C3H4NO C 3 H 6 NO 2 60,04439 70,02874 88,03930 60,04453 70,02874 88,03933 Tyr C9H11NO3 182,08117 182,08101 3,30 C8H7O C7H7O2 C8H10NO C9H7O2 C 9 H 9 O 3 119,04914 123,04406 136,07569 147,04406 165,05462 119,04925 123,04412 136,07567 147,04393 165,05455 Hyp C5H9NO3 132,06552 132,06526 5,13 C3H8N C4H6N C4H8NO C 5 H 8 NO 2 58,06513 68,04948 86,06004 114,05496 58,06520 68,04953 86,06007 114,05507 Thr C4H9NO3 120,06552 120,06532 5,82 C3H6N C3H8NO C4H6NO C 4 H 8 NO 2 56,04948 74,06004 84,04439 102,05495 56,04966 74,06007 84,04443 102,05501 Trp C11H12N2O2 205,09715 205,09679 2,11 C8H8N C9H10N C9H8NO C10H11N2 C 11 H 10 NO 2 118,06513 132,08078 146,06004 159,09167 188,07061 118,06512 132,08076 146,06009 159,09166 188,07071 Anexo I 290 Compuesto Fórmula Molecular [M-H]+ m/z teórico [M-H]+ m/z exp. tR (min) Fragmentos Fórmula Molecular m/z teórico m/z exp. Val C5H11NO2 118,08626 118,08596 3,14 C4H7 C 4 H 10 N 55,05423 72,08078 55,05444 72,08083 Anexo I 291 Tabla XI. Ácidos orgánicos (columna HSS T3) Compuesto Fórmula Molecular [M-H]– m/z teórico [M-H]– m/z exp. tR (min) Fragmentos Fórmula Molecular m/z teórico m/z exp. Ácido 3-fosfoglicérico C3H7PO7 184,98566 184,98547 0,60 PO3 H 2 P O 4 78,95905 96,96962 78,95909 96,96964 Ácido α-cetoglutárico C5H6O5 145,01425 145,01408 1,15 C3H5O C3H5O2 C 4 H 5 O 3 57,03459 73,02950 101,02442 57,03459 73,02950 101,02445 Ácido ascórbico C6H8O6 175,02481 175,02463 1,05 C2H3O2 C3H3O3 C 4 H 3 O 4 59,01385 87,00877 115,00368 59,01930 87,00882 115,00375 Ácido L-aspártico C4H7NO4 132,03023 132,03009 0,55 C3H3O2 C3H6NO2 C4H4NO3 C 4 H 3 O 4 71,01385 88,04040 114,01967 115,00368 71,01392 88,04050 114,01984 115,00376 Ácido cítrico C6H8O7 191,01973 191,01965 1,75 C4H5O2 C3H3O3 C5H3O3 C5H5O4 C 6 H 5 O 6 85,02950 87,00877 111,00877 129,01933 173,00916 85,02957 87,00879 111,00881 129,01941 173,00919 Ácido fosfoenolpirúvico C 3 H 5 P O 6 166,97510 166,97495 0,65 P O 3 78,95905 78,95909 Ácido L-glutámico C5H9NO4 146,04588 146,04581 0,58 C4H8NO2 C 5 H 6 NO 3 102,05605 128,03532 102,05612 128,03540 Ácido L-láctico C3H6O3 89,02442 89,02437 1,11 C3H3O2 C 3 H 3 O 3 71,01385 87,00877 71,01391 87,00918 Anexo I 292 Compuesto Fórmula Molecular [M-H]– m/z teórico [M-H]– m/z exp. tR (min) Fragmentos Fórmula Molecular m/z teórico m/z exp. Ácido L-málico C4H6O5 133,01425 133,01410 0,90 C3H3O2 C3H5O3 C 4 H 3 O 4 71,01385 89,02442 115,00368 71,01388 89,02448 115,00369 Ácido oxálico C 2 H 2 O 4 88,98803 88,98799 0,60 CHO 3 60,99312 60,99318 Ácido pirúvico C 3 H 4 O 3 87,00877 87,00871 0,85 C 2 H 3 O 2 59,01385 59,01397 Ácido succínico C4H6O4 117,01933 117,01918 2,19 C3H5O2 C 4 H 3 O 3 73,02950 99,00877 73,02956 99,00886 Anexo I 293 Anexo II 300 65,00321 107,01390 151,00334 284,03214 -1,20 0,47 -2,24 - 1,78 Luteolina 6,88 285,04037 -0,30 65,00312 107,01391 133,02959 151,00377 175,04004 -2,61 0,55 0,65 0,59 - 0,18 Naringenina 6,84 271,06116 -0,16 65,00323 83,01397 107,01376 119,05022 151,00380 -0,97 1,44 -0,88 -0,20 0,79 Anexo II 301 Tabla II. Muestra “Alfalfa Per82 Semilla” Metabolito tR (min) [M-H]– m/z exp. ∆(ppm) Fragmentos m/z exp. ∆(ppm) Ácido 2,4-dihidroxibenzoico 4,03 153,01923 -0,68 65,03959 67,01890 109,02951 -1,25 -0,63 0,10 Ácido benzoico 5,45 121,02934 - 1,30 - - Ácido cafeico 4,06 179,03487 -0,65 89,03983 107,05031 134,03741 135,04533 1,83 0,64 0,63 1,36 Ácido p-cumárico 4,85 163,03996 -0,67 65,03969 93,03459 119,05022 0,28 0,02 - 0,13 SA 5,85 137,02422 -1,49 65,03970 93,03457 0,40 - 0,23 Apigenina 7,35 269,04556 0,05 65,00321 107,01397 117,03463 149,02444 151,00371 -1,20 1,12 0,34 0,16 0,18 Apigenina-7-O-Glc 6,02 431,09787 -1,16 63,02391 107,01389 117,03463 211,04016 268,03793 -1,80 0,33 0,34 0,43 0,80 Daidzeína 6,69 253,05043 -0,79 91,01898 132,02168 - - - 0,46 0,02 - - - Diosmetina 7,40 299,05597 -0,47 63,02388 65,00318 107,01411 151,00374 284,03287 -2,16 -1,67 2,40 0,39 0,80 Luteolina 6,89 285,04044 -0,08 65,00320 107,01389 133,02954 151,00348 175,04027 -1,44 0,40 0,31 -1,33 1,13 Anexo II 302 Naringenina 6,85 271,06110 -0,38 65,00321 83,01389 107,01392 119,05030 151,00365 -1,20 0,43 0,62 0,51 - 0,22 Anexo II 303 Tabla III. Muestra “Alfalfa Per82 Foliar” Metabolito tR (min) [M-H]– m/z exp. ∆(ppm) Fragmentos m/z exp. ∆(ppm) Ácido 2,4-dihidroxibenzóico 4,05 153,01921 -0,78 65,03960 67,01891 109,02950 -1,01 -0,51 - 0,04 Ácido benzoico 5,46 121,02932 - 1,49 - - Ácido cafeico 4,08 179,03487 -0,64 - 107,05032 134,03731 135,04517 - 0,78 -0,17 0,12 Ácido p-cumárico 4,85 163,03996 -0,67 65,03957 93,03455 119,05024 -1,60 -0,39 0,13 SA 5,85 137,02423 -1,38 65,03971 93,03461 0,63 0,18 Apigenina 7,34 269,04553 -0,07 65,00321 107,01389 117,03462 149,02441 151,00363 -1,20 0,40 0,28 -0,04 - 0,32 Apigenina-7-O-Glc 6,03 431,09796 -0,95 63,0239 107,01388 117,03462 211,03992 268,03784 -1,86 0,26 0,28 -0,73 0,45 Daidzeína 6,69 253,05037 -1,03 91,01897 132,0219 - - - 0,38 1,64 - - - Diosmetina 7,40 299,05600 -0,37 63,02395 65,00328 107,01400 151,00374 284,03299 -1,13 -0,14 1,40 0,39 1,23 Luteolina 6,90 285,04034 -0,41 65,0032 107,01371 133,02963 151,00372 175,04013 -1,44 -1,31 1,00 0,29 0,35 Anexo II 304 Naringenina 6,84 271,06107 -0,50 65,0032 83,01394 107,01392 119,05019 151,00375 -1,32 1,07 0,62 -0,39 0,49 Anexo II 305 Tabla IV. Muestra “Alfalfa Control” – Columna Amida Metabolito tR (min) [M-H]+ m/z exp. ∆(ppm) Fragmentos m/z exp. ∆(ppm) Asp 9,99 134,04449 -2,13 74,02362 88,03925 116,03413 -0,40 -0,62 - 0,81 Glu 8,85 148,06000 -2,92 56,04960 84,04434 102,05489 130,04982 2,19 -0,57 -0,73 - 0,38 Ala 5,10 90,05474 - 2,43 - - Arg 10,51 175,11845 -2,83 60,05567 70,06512 116,07055 130,09746 158,09235 0,80 -0,08 -0,53 -0,25 - 0,34 Asn 8,34 133,06044 -2,48 74,02361 87,05524 88,03922 116,03419 -0,50 -0,61 -0,96 - 0,28 Phe 2,12 166,08582 -2,68 93,06983 103,05415 107,04904 120,08080 131,04913 -0,52 -0,82 -0,92 0,19 - 0,05 Gly 6,37 76,03907 - 3,02 - - Gln 7,88 147,07603 -2,62 84,04436 101,07098 102,05492 130,04988 -0,39 0,36 -0,43 0,08 His 10,3 156,07640 -2,24 83,06030 95,06032 110,07127 -0,81 -0,55 0,03 Ile 2,44 132,10158 -2,52 69,06982 86,09635 -0,81 - 0,91 Leu 2,21 132,10158 - 2,48 86,09635 - 0,86 Lys 10,89 147,11244 -2,43 84,08070 130,08618 -1,00 - 0,60 Met 2,75 150,05783 -3,33 104,05280 133,03180 -0,52 0,14 Anexo II 306 Pro 3,31 116,07018 - 3,68 70,06512 - 0,08 Ser 8,01 106,04962 -2,34 60,04448 70,02872 88,03928 1,42 -0,22 - 0,27 Tyr 3,33 182,08083 -1,89 119,04910 123,04396 136,07570 147,04402 165,05462 -0,38 -0,81 0,07 -0,26 - 0,15 Hyp 5,18 132,06522 -2,30 58,06521 68,04945 86,05999 114,05495 1,42 -0,39 -0,58 - 0,05 Thr 5,89 120,06527 -2,09 56,04961 74,06000 84,04440 102,05490 2,25 -0,57 0,16 - 0,48 Trp 2,12 205,09668 -2,29 118,06506 132,08080 146,06006 159,09160 188,07062 -0,56 0,12 0,13 -0,45 0,04 Val 3,15 118,08591 -2,92 55,05436 72,08075 2,42 - 0,42 Anexo II 307 Tabla V. Muestra “Alfalfa Per82 Semilla” – Columna Amida Metabolito tR (min) [M-H]+ m/z exp. ∆(ppm) Fragmentos m/z exp. ∆(ppm) Asp 10,01 134,04456 -1,67 74,02364 88,03930 116,03407 0,09 -0,01 - 1,33 Glu 8,81 148,06003 -2,71 56,04962 84,04440 102,05492 130,04988 2,53 0,16 -0,35 0,08 Ala 5,16 90,05479 - 1,84 - - Arg 10,57 175,11853 -2,40 60,05569 70,06516 116,07059 130,09747 158,09242 1,24 0,47 -0,20 -0,13 0,14 Asn 8,38 133,06041 -2,71 74,02361 87,05525 88,03924 116,03423 -0,60 -0,44 -0,70 0,05 Phe 2,16 166,08592 -2,03 93,06989 103,05412 107,04907 120,08077 131,04909 0,06 -1,04 -0,63 -0,06 - 0,40 Gly 6,44 76,03907 - 3,02 - - Gln 7,97 147,07600 -2,83 84,04436 101,07083 102,05484 130,04987 -0,39 -1,08 -1,17 - 0,03 His 10,37 156,07645 -1,94 83,06030 95,06031 110,07130 -0,81 -0,63 0,31 Ile 2,47 132,10164 -2,05 69,06985 86,09643 -0,37 - 0,02 Leu 2,23 132,10159 - 2,40 86,09641 - 0,09 Lys 10,94 147,11246 -2,33 84,08075 130,08629 -0,36 0,22 Met 2,79 150,05783 -3,33 104,05280 133,03178 -0,45 0,03 Anexo II 308 Pro 3,35 116,07025 - 3,09 70,06513 0,03 Ser 8,09 106,04964 -2,13 60,04448 70,02870 88,03927 1,42 -0,55 - 0,36 Tyr 3,38 182,08073 -2,39 119,04916 123,04399 136,07574 147,04407 165,05467 0,14 -0,56 0,40 0,05 0,32 Hyp 5,24 132,06525 -2,07 58,06523 68,04945 86,05998 114,05500 1,75 -0,39 -0,67 0,35 Thr 5,94 120,06525 -2,28 56,04961 74,06001 84,04426 102,05492 2,39 -0,47 -1,57 - 0,33 Trp 2,14 205,09685 -1,47 118,06504 132,08072 146,06003 159,09158 188,07056 -0,76 -0,46 -0,08 -0,55 - 0,28 Val 3,17 118,08595 -2,67 55,05439 72,08079 2,84 0,11 Anexo II 309 Tabla VI. Muestra “Alfalfa Per82 Foliar” – Columna Amida Metabolito tR (min) [M-H]+ m/z exp. ∆(ppm) Fragmentos m/z exp. ∆(ppm) Asp 9,98 134,04451 -2,02 74,02363 88,03927 116,03419 -0,29 -0,36 - 0,28 Glu 8,81 148,06 -2,92 56,04958 84,04437 102,05489 130,04984 1,78 -0,21 -0,65 - 0,27 Ala 5,16 90,05473 - 2,60 - - Arg 10,56 175,11852 -2,48 60,05567 70,06514 116,07055 130,09746 158,09236 0,86 0,14 -0,53 -0,25 - 0,24 Asn 8,39 133,06041 -2,71 74,02362 87,05525 88,03918 116,03418 -0,40 -0,44 -1,40 - 0,35 Phe 2,15 166,08586 -2,40 93,06983 103,05415 107,04911 120,08080 131,04912 -0,52 -0,82 -0,28 0,19 - 0,17 Gly 6,46 76,03907 - 3,02 - - Gln 7,96 147,07599 -2,93 84,04436 101,07082 102,05499 130,04988 -0,39 -1,15 0,25 0,08 His 10,40 156,07637 -2,43 83,06030 95,06031 110,07128 -0,90 -0,63 0,10 Ile 2,46 132,10167 -1,82 69,06982 86,09639 -0,92 - 0,47 Leu 2,24 132,10158 - 2,52 86,09637 - 0,53 Lys 10,95 147,11246 -2,33 84,08072 130,08624 -0,73 - 0,13 Met 2,77 150,05783 -3,33 104,05277 133,03177 -0,74 - 0,08