Compuestos potenciadores de la actividad de glicosidasas mutantes

19 OFICINA ESPAÑOLA DE PATENTES Y MARCAS ESPAÑA 11 Número de publicación: 2 337 435 21 Número de solicitud: 200802988 51 Int. Cl.: C07D 498/04 (2006.01) C07D 513/04 (2006.01) C07D 487/04 (2006.01) A61K 31/4355 (2006.01) A61K 31/4365 (2006.01) A61K 31/437 (2006.01) 12 PATENTE DE INVENCIÓN CON EXAMEN PREVIO B2 22 Fecha de presentación: 22.10.2008 43 Fecha de publicación de la solicitud: 23.04.2010 Fecha de la concesión: 13.01.2011 45 Fecha de anuncio de la concesión: 25.01.2011 45 Fecha de publicación del folleto de la patente: 25.01.2011 73 Titular/es: Consejo Superior de Investigaciones Científicas (CSIC) (Titular al 25%) c/ Serrano, 117 28006 Madrid, ES Universidad de Sevilla (Titular al 25 %), International University of Health and Welfare (Titular al 25%) y Tottori University (Titular al 25%) 72 Inventor/es: García Moreno, María Isabel; Ohno, Kousaku; García Fernández , José Manuel; Suzuki, Yoshiyuki; Ortiz Mellet, Carmen y Aguilar Moncayo, Matilde 74 Agente: Pons Ariño, Ángel 54 Título: Compuestos potenciadores de la actividad de glicosidasas mutantes. 57 Resumen: Compuestos potenciadores de la actividad de glicosidasas mutantes, con actividad inhibidoras de enzimas glicosidasas y también se refiere a un procedimiento para la activación de β-glucosidasa mutante (β-glucocerebrosi- dasa) y β-galactosidasa mutante en pacientes que padecen trastornos de almacenamiento lisosómico mediante la administración de dichos compuestos inhibidores competitivos de las enzimas, caracterizados por una especificidad de unión muy alta y una relación favorable entre su concentración para actividad de chaperona farmacológica y su concentración para actividad inhibidora. Aviso: Se puede realizar consulta prevista por el art. 40.2.8 LP. ES 2 337 435 B2 Venta de fascículos: Oficina Española de Patentes y Marcas. Pº de la Castellana, 75 – 28071 Madrid 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 ES 2 337 435 B2 DESCRIPCIÓN Compuestos potenciadores de la actividad de glicosidasas mutantes. La presente invención se refiere a unos compuestos con actividad inhibidoras de enzimas glicosidasas y a un procedimiento para la activación de β-glucosidasa muíante (β-glucocerebrosidasa) y β-galactosidasa mutante en pacientes que padecen trastornos de almacenamiento lisosómico mediante la administración de dichos compuestos inhibidores competitivos de las enzimas, caracterizados por una especificidad de unión muy alta y una relación favorable entre su concentración para actividad de chaperona farmacológica y su concentración para actividad inhibidora. La invención también se refiere a estos compuestos, a su procedimiento de obtención y a composiciones terapéuticas que contienen dichos compuestos. Estado de la técnica anterior Los trastornos de almacenamiento lisosómico son un grupo de enfermedades resultantes del metabolismo anormal de varios sustratos que no se degradan y se acumulan en los lisosomas, conduciendo a una serie de fenotipos que incluyen megalovisceralia, patologías neurológicas, lesiones esqueléticas y muerte prematura (A. H. Futerman, G. van Meer, Nature Rev. Mol. Cell Biol. 2004, 554-565). Estas enfermedades son el resultado de mutaciones en los genes que codifican enzimas implicadas en el proceso de degradación. Las estrategias terapéuticas actuales incluyen la inhibición de la producción de sustrato usando inhibidores de las enzimas implicadas en su biosíntesis (US2005/0075305). El aumento de la enzima defectiva podría conseguirse clínicamente mediante reemplazamiento enzimático (R. J. Desnick, E. H. Schuchman, Nature Rev. Genet. 2002, 954-966). Para el trastorno de almacenamiento lisosómico más predominante, la enfermedad de Gaucher, esta terapia cuesta entre 100.000 y 750.000 dólares al año, y no es muy eficaz para los casos que muestran implicación del sistema nervioso central. El transplante de médula ósea puede revertir también la enfermedad, pero hasta ahora las estrategias de terapia génica no han tenido éxito. Algunas de estas mutaciones perniciosas se manifiestan mediante proteínas mutantes que retienen actividad catalítica pero que presentan defectos de plegamiento y experimentan degradación mediada por la maquinaria celular de control de calidad. El uso de compuestos funcionales que pueden servir de molde para un plegado apropiado de proteínas con tendencia a un plegado erróneo está bien documentado. Así, se sabe que algunos inhibidores enzimáticos son capaces de unirse al sitio activo y estabilizar el plegamiento apropiado de la forma catalítica de la enzima. Dichos compuestos pueden actuar como “chaperonas farmacológicas” para estabilizar la proteína mutante en una conformación apropiada para su transporte a los lisosomas, donde permanece estable debido a la alta concentración de sustrato y al entorno de bajo pH. La enfermedad de Gaucher es el trastorno de almacenamiento lisosómico más predominante, con una incidencia estimada de aproximadamente 1:60.000 en la población general y de 1:100 en la población de judíos asquenazíes (T. D. Butters, Curr. Opin. Chem. Biol. 2007, 11, 412-418). Es el resultado de mutaciones en la β-glucosidasa ácida (βglucocerebrosidasa), una glucoproteína lisosómica asociada a membrana de 497 restos que tienen como consecuencia la acumulación del correspondiente sustrato (glucosilceramida). Se han identificado más de 200 mutaciones puntuales diferentes en el gen que codifica la β-gluocerebrosidasa (E. Sidransky, Mol. Genet. Metab. 2004, 83, 6-15). Las mutaciones conducen a defectos significativos en el plegamiento de la proteína durante la traducción en el retículo endoplasmático, dando como resultado una reducción del transporte de la enzima al lisosoma. Otra patología, la deficiencia hereditaria de β-galactosidasa ácida lisosómica (β-galactosidosis), causa dos enfermedades clínicamente distintas en seres humanos, la gangliosidosis GM1 y la enfermedad de Morquio B (Y. Suzuki, J. Inherit. Metab. Dis. 2006, 29, 471-476). Ambas son el resultado de mutaciones en el gen GLB1 que conducen a un plegamiento proteico erróneo (S. Zhang, R. Bagshow, W. Hilson, Y. Oho, A. Hinek, J. T. R. Clarke, A. Hinek, J. W. Callahan, Biochem. J. 2000, 348, 621-632). El modo de herencia es recesivo autosómico. La gangliosidosis GM1 es una enfermedad neurosomática generalizada que aparece principalmente en la primera infancia, y raramente en la niñez o en adultos jóvenes. La enfermedad de Morquio B es una rara enfermedad ósea sin implicación del sistema nervioso central. En pacientes con estos fenotipos clínicos se acumulan glucoconjugados con restos de β-galactosa terminales en los tejidos y orina. El gangliósido GM1 y su derivado asiálico GA1 se acumulan en el cerebro en el caso de la gangliosidosis GM1. Tanto en pacientes con gangliosidosis GM1 como en pacientes que padecen la enfermedad de Morquio B se detectan altas cantidades de oligosacáridos derivados de sulfato de queratano o glucoproteínas en órganos viscerales y orina. Actualmente, sólo está disponible la terapia sintomática para pacientes con β-galactosidosis. Por otro lado, algunos alcaloides polihidroxilados naturales y sintéticos estructuraímente relacionados con los azúcares (glicomiméticos) que incorporan un nitrógeno endocíclico de tipo amina (hibridación sp3) exhiben una actividad inhibidora significativa frente a glicosidasas. Análogamente, se ha demostrado que los carbociclos estructuralmente relacionados con los azúcares que portan sustituyentes de tipo amina se comportan como inhibidores de glicosidasas (S. Ogawa, M. Kanto, Y. Suzuki, Mini-Rev. Med. Chem. 2007, 7, 679-691). En algunos casos, se ha demostrado que estos compuestos usados a concentraciones subinhibidoras actúan como chaperonas de β-glucocerebrosidasa mutante yβ-galactosidasa muíante (US 2006/0100241; WO2004/037373). Sin embargo, estos tipos de compuestos se comportan en general como inhibidores de glucosidasa de amplio espectro, inhibiendo simultáneamente varias glicosidasas, lo que representa un inconveniente serio para aplicaciones clínicas. La inhibición simultánea de βyα-glucosidasas es particularmente problemática. Por lo tanto, existe la necesidad de desarrollar moléculas estructuralmente relacionadas 2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 ES 2 337 435 B2 con los azúcares con una alta relación de actividad chaperona a inhibidora que, al mismo tiempo, exhiban una alta selectividad anomérica por las correspondientes enzimas β-glicosidasas. Descripción de la invención La presente invención proporciona compuestos bicíclicos estructuralmente relacionados con los azúcares que incorporan al menos un átomo de nitrógeno endocíclico con un carácter sustancialmente sp2(a partir de ahora, azazúcar sp2) y se comportan como inhibidores competitivos muy selectivos de las β-glucocerebrosidasa y β-galactosidasa ácida lisosómicas asociadas a la enfermedad de Gaucher y la β-galactosidosis, respectivamente. Estos compuestos potencian la actividad de dichas enzimas cuando se administran a concentraciones menores de las necesarias para inhibir la actividad enzimática intracelular, actuando por lo tanto como chaperonas farmacológicas. El efecto es particularmente significativo en ciertas enzimas mutantes, pero aparece también en células que contienen la enzima normal. En consecuencia, la presente invención también proporciona un procedimiento para activar β-glucosidasa o β-ga- lactosidasa y un procedimiento para tratar pacientes que padecen enfermedad de Gaucher o β-galactosidosis, mediante la utilización de los compuestos de la invención. Este procedimiento de la invención además de ser útil en células de mamífero, es también útil en células de otra procedencia, tales como, por ejemplo, células de insecto y células CHO cultivadas, usadas en la producción de enzimas recombinantes para terapia de reemplazamiento enzimático. De acuerdo con lo anterior, un primer aspecto de la presente invención se refiere a un compuesto de fórmula general (I) o cualquiera de sus sales: donde: R es un sustituyente, igual o diferente en cada uno de los casos, y que se selecciona de entre un átomo de H, un grupo hidroxilo (-OH) ó un grupo OR2; donde R2se selecciona de entre un grupo acilo, sustituido o no sustituido, un grupo alquilo (C1-C18), sustituido o no sustituido, un grupo arilo, sustituido o no sustituido, un grupo aralquilo, sustituido o no sustituido, un grupo amino (NH2), un grupo acetamido (NHAc), o un grupo NHR3, donde R3se selecciona de entre un grupo acilo, sustituido o no sustituido, un grupo alquilo (C1-C18), sustituido o no sustituido, un grupo arilo, sustituido o no sustituido, o un grupo aralquilo, sustituido o no sustituido. Preferiblemente R es igual en todos los casos y es OH; Y se selecciona de entre un átomo de O, un grupo NH ó un átomo de S; y X es el grupo -NR1; donde R1se selecciona de entre un átomo de H, un grupo alquilo (C1-C18), sustituido o no sustituido, un grupo arilo, sustituido o no sustituido o un grupo aralquilo, sustituido o no sustituido. El término “alquilo” se refiere, en la presente invención, a cadenas alifáticas, lineales o ramificadas, que tienen de 1 a 18 átomos de carbono, por ejemplo, metilo, etilo, n-propilo, i-propilo, n-butilo, terc-butilo, sec-butilo, n-pentilo, n-hexilo, etc. Preferiblemente el grupo alquilo tiene entre 3 y 9 átomos de carbono. Más preferiblemente n-butilo, npentilo, n-hexilo, n-heptilo o n-octilo. Los grupos alquilo pueden estar opcionalmente sustituidos por uno o más sustituyentes tales como halógeno, hidroxilo, azida, ácido carboxílico o un grupo sustituido o no sustituido seleccionado de entre amino, amido, éster carboxílico, éter, tiol, acilamino o carboxamido. Cuando el grupo alquilo está sustituido, lo está preferentemente por un o varios grupos amina, amida o éter, que a su vez pueden estar o no sustituidos por grupos alquilo, amida, cicloalquilo o éteres y estos a su vez, pueden estar igualmente sustituidos o no. “Cicloalquilo” se refiere a un radical estable monocíclico o bicíclico de 3 a 10 miembros, que está saturado o parcialmente saturado, y que sólo consiste en átomos de carbono e hidrógeno, tal como ciclohexilo o adamantilo. 3 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 ES 2 337 435 B2 El término “arilo” se refiere, en la presente invención, a anillos aromáticos sencillos o múltiples, que tienen de entre 5 a 18 eslabones en los que se ha eliminado un protón del anillo. Preferentemente el grupo arilo tiene de 5 a 7 átomos de carbono. Los grupos arilo son por ejemplo, pero sin limitarse a fenilo, naftilo, difenilo, indenilo, fenantrilo o antracilo. Los radicales arilo pueden estar opcionalmente sustituidos por uno o más sustituyentes. El término “aralquilo” se refiere, en la presente invención, a una cadena alifática en el que al menos uno de los hidrógenos se ha sustituido por un grupo arilo, con las acepciones anteriores. Como por ejemplo, pero sin limitarse, un grupo bencilo o fenetilo. El término “acilo” se refiere, en la presente invención, a un derivado de ácido carboxílico por eliminación de un grupo hidroxilo. Los derivados de ácido carboxílico tienen como fórmula general R4-CO-, donde R4es un grupo alquilo con las acepciones anteriores y preferiblemente se refiere a grupos alquilo (C3-C14), lineal o ramificado. Como por ejemplo, pero sin limitarse a propionilo, butanoilo, hexanoilo, pivaloilo, octanoilo o miristoilo. Los compuestos miméticos de azúcar de la invención, según se representa en la fórmula general (I), incluyen biciclos condensados de seis miembros/cinco miembros que tienen un átomo de nitrógeno cabeza de puente que es parte de una funcionalidad amida cíclica o pseudoamida. Por “funcionalidad pseudoamida”, se define un grupo de fórmula general N-C(=X)Y, en la que X representa un heteroátomo que porta, dado el caso, sustituyentes de naturaleza variada, Y es un heteroátomo, que porta dado el caso sustituyentes de naturaleza variada. Son heteroátomos preferidos el nitrógeno (N), oxígeno (O) ó azufre (S). Ejemplos no limitantes de grupos pseudoamida, según la presente invención son urea, tiourea, isourea, isotiourea, guanidina o amidina. En adelante, se utilizará el término azaazúcares sp2para refererirse a los compuestos de la invención. Los átomos de carbono del núcleo bicíclico del azaazúcar sp2pueden estar sustituidos con hidroxilos para imitar estrechamente una estructura de azúcar o pueden estar desprovistos de hidroxilos. Son perfiles de hidroxilación preferidos aquellos que coinciden con los de D-glucosa y D-galactosa en las posiciones equivalentes a C-2, C-3 y C-4 en el monosacárido tras superimposición del anillo de seis miembros del biciclo con el anillo de piranosa del monosacárido, con el átomo de nitrógeno cabeza de puente en la posición del átomo de oxígeno del azúcar (de aquí en adelante, glucomiméticos y galactomiméticos, respectivamente). De forma interesante, los compuestos de la invención pueden portar un grupo hidroxilo en la posición equivalente a la posición anomérica. La presencia del átomo de nitrógeno vecino de tipo pseudoamida con carácter sustancialmente sp2favorece la orientación axial de este hidroxilo y proporciona una alta estabilidad al mimético de azúcar reductor. En consecuencia, las chaperonas farmacológicas preferidas según esta invención responden a las fórmulas Ia y Ib. Donde Y y X están definidos anteriormente. Otros compuestos adicionales a las fórmulas (Ia) y (Ib) incluyen aquellos en los que uno o más de los grupos hidroxilo están adiados, alquilados o reemplazados por un átomo de H o por otros grupos funcionales, preferiblemente por funcionalidades de nitrógeno, tal y como se recoge en la descripción de la fórmula general (I). Por tanto, otra realización preferida comprende los compuestos de fórmula general (Ia’) y (Ib’): Donde: R, X e Y están definidos anteriormente. 4 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 ES 2 337 435 B2 Cuando Y es oxígeno el compuesto de la invención es de fórmula general (Ic): Cuando Y es un átomo de nitrógeno, el compuesto de la invención es de fórmula general (Id): Cuando Y es un átomo de azufre, el compuesto de la invención es de fórmula general (Ie): Adicionalmente la invención proporciona un procedimiento para la síntesis química del núcleo bicíclico de los compuestos anteriormente mencionados a partir de carbohidratos comerciales fácilmente disponibles y está particularmente bien adaptada para generar diversidad molecular, permitiendo sintetizar compuestos con patrones de sustitución de complementariedad estructural con D-glucosa y D-galactosa. Además, puede introducirse una batería de sustituyentes en diferentes posiciones a lo largo de la ruta sintética, que es de gran importancia para optimizar la actividad biológica y las propiedades farmacodinámicas. Así, otro aspecto de la presente invención se refiere al procedimiento de obtención de los compuestos de fórmula general (I) que comprende: (i) la introducción de un grupo amino en posición C-5 del azúcar correspondiente en forma de furanosa; (ii) el cierre de un anillo de 5 miembros entre las posiciones C-5 y C-6 mediante un segmento de tipo pseudoamida; y (iii) la transposición del anillo de furanosa a un ciclo de piperidina fusionado con el anillo de pseudoamida cíclico de cinco miembros anteriormente construido. 5 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 ES 2 337 435 B2 Las características del procedimiento de preparación de la invención quedarán más claramente reflejadas en los ejemplos que se proporcionan más adelante. Otro aspecto de la presente invención se refiere al uso de los compuestos de fórmula general (I) para la elaboración de una composición farmacéutica. Otro aspecto más de la presente invención se refiere al uso del compuesto de fórmula general (I) para la elaboración de una composición farmacéutica para el tratamiento de una enfermedad relacionada con β-glucosidasa y/o βgalactosidasa mutadas humanas. Preferiblemente las enfermedades son la enfermedad de Gaucher, la gangliosidosis GM1 o la enfermedad de Morquio B. Otro aspecto de la presente invención se refiere a un procedimiento de potenciación de la biodisponibilidad de chaperonas químicas usando composiciones terapéuticas que contienen un vehículo farmacológicamente aceptable, preferiblemente una ciclodextrina comercial tal como α-, β- o γ-ciclodextrina (αCD, βCD o γCD), una β-ciclodextri- na metilada (TRIMEB, DIMEB o RAMEB), una β-ciclodextrina hidroxipropilada (HP-βCD) o una βCD sulfobutilada (Captisol®), o una ciclodextrina modificada químicamente tal como un derivado de ciclodextrina que porta oligosacáridos biorreconocibles. La presente invención implica el uso de los compuestos bicíclicos que imitan D-glucosa (glucomiméticos) de tipo azazúcar sp2, que portan sustituyentes hidrófobos, como chaperonas químicas para potenciar la actividad residual en un medio de cultivo de fibroblastos para varias mutaciones que causan enfermedad de Gaucher. Esta estrategia terapéutica pudo aplicarse a la gangliosidosis GM1 usando compuestos que imitan D-galactosa (galactomiméticos) de tipo azazúcar sp2que portan sustituyentes hidrófobos. Por tanto, puede usarse un procedimiento de esta invención para tratar un paciente que tiene enfermedad de Gaucher o un paciente que padece β-galactosidosis. Según los procedimientos de la invención, se administra al paciente una cantidad activante eficaz de β-glucocerebrosidasa o β-galactosidasa de un azazúcar sp2adecuado o de una composición terapéutica de un azazúcar sp2adecuada. En particular, la presente invención implica que el compuesto que imita el azúcar de tipo azazúcar sp2mencionado tiene, además de una alta relación de actividad chaperona frente a actividad inhibidora, una muy alta selectividad hacia la enzima diana. Esto representa una mejora significativa en comparación, por ejemplo, con el uso de azazúcares de tipo convencional en los que un átomo de nitrógeno con hibridación sp3reemplaza al oxígeno endocíclico de un azúcar, como por ejemplo la 1-desoxinojirimicina, que se comportan en general como inhibidores de glicosidasas de amplio espectro. Significativamente, los compuestos glicomiméticos de tipo azazúcar sp2de la invención exhiben una selectividad β-anomérica muy alta cuando se comparan con la actividad inhibidora hacia α- y β-glucosidasas o α- y βgalactosidasas lisosómicas humanas. La presente invención proporciona también composiciones farmacéuticas. Dichas composiciones comprenden una cantidad terapéuticamente eficaz de compuesto glicomimético de tipo azazúcar sp2y un vehículo farmacéuticamente aceptable. El término “vehículo” designa un diluyente, coadyuvante, excipiente o portador con el que se administra el agente terapéutico. Se conocen diversos sistemas de administración y pueden usarse para administrar un compuesto de la invención, por ejemplo, liposomas, micropartículas o microcápsulas. En una realización específica, el sistema de administración es un ciclomaltooligosacárido (ciclodextrina, CD). Los inventores descubrieron que el uso de CD nativas o CD modificadas químicamente permite enmascarar el resto hidrófobo del inhibidor, aumentando así su solubilidad en medios acuosos. Los complejos de inclusión resultantes mantienen o incluso potencian las actividades inhibidoras y chaperona del agente activo. Por tanto, otro aspecto de la presente invención ser refiere a una composición farmacéutica que comprende al menos uno de los compuestos de fórmula general (I) y un vehículo farmacéuticamente aceptable, tal y como se ha definido anteriormente. Además, otro aspecto de la presente invención se refiere a un procedimiento in vitro para potenciar la actividad de una enzima glicosidasa, que comprende poner en contacto la proteína con una cantidad eficaz de un compuesto de fórmula general (I). A lo largo de la descripción y las reivindicaciones la palabra “comprende” y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Los siguientes ejemplos se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la presente invención. Ejemplos Los inventores ensayaron una serie de inhibidores de tipo azazúcar sp2novedosos sintetizados químicamente frente a un panel de glicosidasas comercialmente disponibles de origen vegetal, de microorganismos y animal. Se evaluaron 6 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 ES 2 337 435 B2 algunos compuestos de la invención en la inhibición in vitro de β-glucocerebrosidasa y β-galactosidasa humanas y la potenciación intracelular ex vivo de enzimas mutantes con fibroblastos de Gaucher y de gangliosidosis GM1. Ejemplo 1 1.1. Materiales y procedimientos Los compuestos glicomiméticos de tipo azazúcar sp2de la invención, de fórmula general (I), incluyen biciclos condensados de seis miembros/cinco miembros que tienen un átomo de nitrógeno cabeza de puente que es parte de una funcionalidad amida cíclica o pseudoamida. Las chaperonas farmacológicas preferidas en el contexto de esta invención responden a las fórmulas Ia (glucomiméticos) e Ib (galactomiméticos). Para la obtención de los compuestos que tienen la fórmula Ia, cuando Y es oxígeno y X es NR1(véase la fórmula VI) se siguió la siguiente síntesis: el monosacárido de partida es D-glucosa o un derivado de D-glucosa comercialmente disponible. La introducción de un grupo nitrogenado en posición C-5 puede conseguirse entonces vía la correspondiente 5-azida-5-desoxi-1,2-O-isopropiliden-α-D-glucofuranosa (II). Para la preparación de este intermedio sintético puede usarse el procedimiento reseñado por K. Dax y col. (J. Carbohydr. Chem. 1990, 9, 479-499), partiendo de D- glucufuranurono-6,3-lactona comercial. Se encontró ventajosa una estrategia sintética que implica intermedios de tipo urea de fórmula general (IV). Las ureas pueden prepararse, por ejemplo, mediante reacción de 5-amino-5-desoxi- 1,2-O-isopropiliden-α-D-glucofuranosa (III), que puede obtenerse mediante la reducción de II como se ha reseñado (V. M. Díaz Pérez y col., J. Org. Chem. 2000, 65, 136-143), por reacción de acoplamiento con el isocianato apropiado de fórmula general R1NCO. Las ureas IV pueden transformarse en las isoureas cíclicas V correspondientes mediante tratamiento con un anhídrido de ácido sulfónico o un cloruro de sulfonilo tales como anhídrido trifluorometanosulfónico, anhídrido metanosulfónico o cloruro de p-toluenosulfonilo. La hidrólisis catalizada por ácido del grupo protector acetal en los compuestos V proporciona los compuestos VI (esquema 1). 7 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 ES 2 337 435 B2 Esquema 1 Para la preparación de compuestos que tienen la fórmula Ia en la que Y es un átomo de S y X representa NR1(véase la fórmula IX), puede seguirse la secuencia de reacción representada en el Esquema 2. La reacción de la amina III con isotiocianatos R1NCS proporciona aductos de tiourea VII. El tratamiento de VII con un derivado reactivo sulfonante, como se describe anteriormente para la preparación de isoureas cíclicas V, proporciona los precusores de isotiourea cíclicos VIII correspondientes, que después de desacetilación catalizada por ácido proporcionan los glucomiméticos bicíclicos IX. Esquema 2 Para la preparación de los compuestos que tienen la fórmula Ia, en la que Y representa NH y X representa NR1 (véase la fórmula XIII), puede seguirse la secuencia de reacción representada en el esquema 3. El precursor de tiourea cíclica X puede obtenerse a partir del derivado de azida II siguiendo la metodología reseñada anteriormente (V. M. Díaz Pérez y col., J. Org. Chem.2000, 65, 136-143). La reacción de X con un reactivo alquilante, tal como yoduro de metilo, proporciona la correspondiente sal de S-alquilisotiouronio XI. El desplazamiento nucleófilo del grupo alquiltio por una amina de fórmula general R1NH2proporciona guanidinas cíclicas de fórmula general XII. El glucomimético de azazúcar sp2bicíclico XIII puede obtenerse mediante hidrólisis catalizada por ácido del grupo protector acetal seguido de tratamiento con una base tal como, por ejemplo, hidróxido de sodio. Los compuestos de fórmula general XIII pueden almacenarse y usarse en el contexto de la presente invención como base libre o en forma de una sal de guanidinio tal como, por ejemplo, el cloruro de guanidinio correspondiente. 8 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 ES 2 337 435 B2 Esquema 3 En otra realización preferida adicional, el monosacárido de partida es D-galactosa o un derivado de D-galactosa comercialmente disponible. En este caso, el compuesto final responde a la fórmula general Ib. Para la preparación de galactomiméticos Ib en los que Y representa O ó S y X representa NR1(véanse las fórmulas XV y XVI, respectivamente), puede seguirse una estrategia sintética idéntica a la descrita anteriormente para la preparación de los glucomiméticos VI y IX análogos, usando 5-amino-5-desoxi-1,2-O-isopropiliden-α-D-galactofuranosa XIV como aminoazúcar precursor (esquema 4). El compuesto XIV puede obtenerse a partir de D-galactosa comercial mediante metodologías conocidas tales como, por ejemplo, las reseñadas por P. Díaz Pérez y col. en Eur. J. Org. Chem. 2005, 2903-2913. Esquema 4 Para la preparación del galactomimético Ib en el que Y representa NH y X representa NR1(véase la formula XVIII), puede seguirse una estrategia sintética idéntica a la descrita anteriormente para la preparación del glucomimético XII análogo, partiendo de la tiourea cíclica XVII (esquema 5). El compuesto XVII puede obtenerse a partir de d-galactosa comercial vía el derivado conocido 3-O-benzoil-1,2-O-isopropiliden-α-D-galactofuranosa (H. Wang y J. Ning, J. Org. Chem., 2003, 68, 2521-2524) mediante una secuencia de reacción que implica: (i) trifenilmetilación en el grupo hidroxilo primario, (ii) introducción de un grupo azida en C-5 mediante doble inversión de la configuración en este centro, (iii) retirada catalizada por ácido del grupo trifenilmetilo, (iv) introducción de un segundo grupo azida en C-6, (v) retirada catalizada por base del grupo benzoílo seguido de reducción simultánea de los dos grupos azida, dando 5,6-diamino-5,6-didesoxi-1,2-O-isopropiliden-α-D-galactofuranosa, y (vi) tiocarbonilación de la diamina a la tiourea cíclica diana XVII. Todas las transformaciones mencionadas son estándar. Como ejemplo, pueden aplicarse los procedimientos reseñados en P. Díaz Pérez y col. en Eur. J. Org. Chem. 2005, 2903-2913 y V. M. Díaz Pérez y col., J. Org. Chem. 2000, 65, 136-143. Esquema 5 En los esquemas 1-5, el sustituyente R1en las fórmulas tiene el significado indicado anteriormente para Ia e Ib. 9 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 ES 2 337 435 B2 TABLA 1 Actividad inhibidora de algunos de los inhibidores sobre β-glucosidasa y β-galactosidasa humanas en fibroblastos Ejemplo 4 Potenciación in vitro de la actividad de β-glucosidasa mutante por azazúcares sp2 La actividad β-glucosidasa en Usados obtenidos a partir de fibroblastos de Gaucher con diferentes mutaciones se incrementó al aumentar la concentración de inhibidor en un cierto intervalo. Se recoge el resumen de los datos seleccionados para algunos de los inhibidores en la Tabla 2. Tanto los glucomiméticos como los galactomiméticos de la invención son activos como chaperonas farmacológicas frente a mutantes N370S/N370S, F213I/F213I y N188S/G193W en este ensayo, con potenciaciones de actividad relativa que van hasta 3,4 veces en el caso más favorable. Los resultados anteriores apoyan el concepto terapéutico de los solicitantes de que los inhibidores de tipo azazúcar sp2potentes pueden servir como chaperonas farmacológicas eficaces para potenciar la actividad enzimática mutante de pacientes con enfermedad de Gaucher. (Tabla pasa a página siguiente) 16 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 ES 2 337 435 B2 TABLA 2 Potenciaciones de actividad sobre la actividad β-glucosidasa en fibroblastos de Gaucher (lisados) inducidos en presencia de algunas chaperonas farmacológicas de la invención 3 µM (arriba) y 30 µM (abajo) para diferentes mutaciones. SP indica sin potenciación Ejemplo 5 Potenciación intracelular de la actividad de β-glucosidasa en fibroblastos de pacientes con Gaucher por azazúcares sp2 Se investigó ex vivo la actividad de potenciación intracelular de los inhibidores de tipo azazúcar sp2de la invención con fibroblastos procedentes de pacientes con Gaucher con fenotipos N370S/N370S, F213I/F213I, N188S/G193W, N370S/84GG, L444P/RecNcil y F213I/L444P. Se recogen en la Tabla 3 los datos seleccionados para algunos glucomiméticos (compuestos 3, 6 y 14), que se encontró que eran mucho más activos que los galactomiméticos en este ensayo. Los compuestos 3 y 6 a baja concentración (3 µM) potenciaban la actividad de fibroblastos de tipo silvestre (control) en un 23,6 y un 6,5%, respectivamente. Concentraciones mayores de 30 µM anulaban el efecto de potenciación en el control. En contraposición, aumentar la concentración de 3 a 30 mM causaba generalmente una mayor potenciación de la actividad en el caso de β-glucosidasas mutantes, apoyando una alta relación de actividad chaperona frente a inhibidora para esta familia de derivados. Los glucomiméticos de azazúcar sp2de la invención demostraron un impacto significativo sobre la potenciación de la actividad enzimática intracelular en fibroblastos de Gaucher. La actividad enzimática residual en los mutantes aumentaba hasta 3,5 veces en el caso más favorable. La magnitud de la potenciación dependía del fenotipo y de la estructura del compuesto. El compuesto 3, que tiene una isourea cíclica en la estructura, era particularmente eficaz frente 17 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 ES 2 337 435 B2 a mutaciones N370S/N370S y F213I/F213I, con elevaciones de actividad residual de 2,7 y 3,5 veces, respectivamente, a una concentración 30 µM. El compuesto 6, que tiene una isourea cíclica en la estructura, era particularmente eficaz frente a las mutaciones N370S/N370S, F213I/F213I y L444P/RecNcil, con elevaciones de actividad residual de 2,7, 3,5 y 1,3 veces, respectivamente, a una concentración 30 µM. El compuesto 6, que tiene una isotiourea cíclica en la estructura, era el más eficaz de la serie frente a la mutación N370S/84GG (potenciación de actividad residual elevada en 1,8 veces a una concentración 30 µM), mientras que el compuesto 14, que tiene una guanidina cíclica en la estructura, era el más eficaz frente a las mutaciones N188S/G193W y F213I/L444P (potenciaciones de la actividad residual elevada en 2,2 veces a una concentración 30 µM en ambos casos). Se cree que la biodisponibilidad de estos compuestos mejora significativamente por la naturaleza anfifílica de las moléculas, lo que posiblemente facilita su paso a través de las membranas celular y del RE, aumentando así la concentración intracelular de estos compuestos. TABLA 3 Potenciaciones de la actividad sobre la actividad de β-glucosidasa en fibroblastos de Gaucher intactos inducidas en presencia de ciertas chaperonas farmacológicas de la invención a 3 µM (arriba) y 30 µM (abajo) para diferentes mutaciones. SP indica sin potenciación Ejemplo 6 Potenciación intracelular de la actividad de β-galactosidasa en fibroblastos de pacientes con gangliosidosis GM1 por azazúcares sp2 Los azazúcares sp2inhibidores de la invención que tienen un perfil de hidroxilación de complementariedad estructural con D-galactosa (galactomiméticos; por ejemplo, los compuestos 15-23) potencian la actividad β-galactosidasa en fibroblastos de células de control así como en fibroblastos de pacientes con gangliosidosis GM1. Como ejemplo, la Tabla 4 recoge los datos correspondientes del compuesto 17, que tiene una funcionalidad isourea cíclica en su estructura. La actividad intracelular β-galactosidasa en el control se elevó un 46% usando una concentración 50 µM de 17. La actividad β-galactosidasa intracelular en fibroblastos de gangliosidosis GM1 se elevó un 17% usando una concentración 50 µM de 17. 18 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 ES 2 337 435 B2 TABLA 4 Potenciaciones de la actividad sobre la actividad β-galactosidasa en fibroblastos silvestres (control) y de gangliosidosis GM1 intactos inducidas por la presencia del compuesto 17 a diferentes concentraciones Ejemplo 7 Potenciación in vitro y ex vivo de la actividad de β-glucosidasa mutante por complejos de inclusión de azazúcares sp2:βCD Los inhibidores azazúcares sp2de la invención formaban fácilmente complejos de inclusión con βCD en agua a diferentes proporciones relativas, como se observa a partir de los experimentos de RMN. Los complejos resultantes permitieron aumentar la solubilidad del inhibidor en agua sin observar efectos perjudiciales sobre la actividad inhibidora frente a las glucosidasas humanas. Se elevó la actividad enzimática en fibroblastos de Gaucher, tanto en lisados como en células intactas, aumentando la concentración de complejos de inclusión de azazúcares sp2:βCD. Se recogen en la Tabla 5 datos seleccionados de algunos complejos. Los solicitantes encontraron esta formulación particularmente apropiada para compuestos que tienen una baja solubilidad acuosa, tal como es el caso del compuesto 6. Al usar proporciones relativas 1:1 de 6 y βCD a una concentración de 30 µM, se consiguieron aumentos de hasta 3 veces de la actividad residual de la β-glucosidasa mutante para el fenotipo N370S/N370S. TABLA 5 Potenciaciones de la actividad β-glucosidasa en fibroblastos de Gaucher (lisados) o células intactas inducidas en presencia de algunos complejos de sp2-azazúcares:βCD para diferentes mutaciones. SP indica sin potenciación 19 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 ES 2 337 435 B2 REIVINDICACIONES 1. Compuesto de fórmula general (I), o cualquiera de sus sales, donde: R es un sustituyente, igual o diferente, y que se selecciona de entre un átomo de H, un grupo hidroxilo (-OH) o un grupo OR2; donde R2es un grupo seleccionado de entre acilo, sustituido o no sustituido, alquilo (C1-C18), sustituido o no sustituido, arilo, sustituido o no sustituido, aralquilo, sustituido o no sustituido, amino (NH2), acetamido (NHAc), o un NHR3; donde R3es un grupo seleccionado de entre acilo, sustituido o no sustituido, alquilo (C1-C18), sustituido o no sustituido, arilo, sustituido o no sustituido o aralquilo, sustituido o no sustituido. Y se selecciona de entre un O, NH ó S; y X es el grupo -NR1. Donde R1se selecciona del entre un grupo alquilo (C1-C18), sustituido o no sustituido, un grupo arilo (C5-C18), sustituido o no sustituido, o un grupo aralquilo, sustituido o no sustituido. 2. Compuesto según la reivindicación 1, donde Y es un átomo de oxígeno. 3. Compuesto según la reivindicación 1 donde Y es NH. 4. Compuesto según la reivindicación 1, donde Y es un átomo de azufre. 5. Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, de fórmula general (Ia’): 6. Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, de fórmula general (Ib’): 20 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 ES 2 337 435 B2 7. Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, donde R es OH. 8. Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, donde R1es un grupo alquilo (C3-C9). 9. Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, donde R1es un grupo arilo (C5-C7). 10. Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, donde dicho compuesto es una sal de un clorhidrato. 11. Compuesto según la reivindicación 1, de fórmula: a. (5R,6R,7S,8R,8aR)-5,6,7,8-Tetrahidroxi-3-fenilimino-2-oxaindolizidina b. (5R,6R,7S,8R,8aR)-5,6,7,8-Tetrahidroxi-3-butilimino-2-oxaindolizidina c. (5R,6S,7R,8R,8aR)-5,6,7,8-Tetrahidroxi-2-oxa-3-octilimino-indolizidina. d. (5R,6R,7S,8R,8aR)-5,6,7,8-Tetrahidroxi-3-fenilimino-2-tiaindolizidina. e. (5R,6R,7S,8R,8aR)-3-Butilimino-5,6,7,8-tetrahidroxi-2-tiaindolizidina f. (5R,6R,7S,8R,8aR)-Tetrahidroxi-3-octilimino-2-tiaindolizidina g. (5R,6R,7S,8R,8aR)-3-[2’-N,N-Bis-(2-hexanamidoetil)aminoetil)-imino]-5,6,7,8-tetrahidroxi-2-tiaindolizi- dina h. Clorhidrato de (5R,6R,7S,8R,8aR)-3-(8-aminooctil)imino-5,6,7,8-tetrahidroxi-2-tiaindolizidina i. (5R,6R,7S,8R,8aR)-3-(4-Adamantano-1-ilcarboxamidobutil)imino-5,6,7,8-tetrahidroxi-2-tiaindolizidina. j. (5R,6R,7S,8R,8aR)-3-(11-Azida-3,6,9-trioxaundecil)imino-5,6,7,8-tetrahidroxi-2-tiaindolizidina k. (5R,6R,7S,8R,8aR)-3-(11-Adamantano-1-ilcarboxamido-3,6,9-trioxaundecil)imino-5,6,7,8-tetrahidroxi-2- tiaindolizidina. l. Clorhidrato de (5R,6R,7S,8R,8aR)-2-aza-3-bencilimino-5,6,7,8-tetrahidroxindolizidina. m. Clorhidrato de (5R,6R,7S,8R,8aR)-2-aza-3-butilimino-5,6,7,8-tetrahidroxindolizidina. n. Clorhidrato de (5R,6R,7S,8R,8aR)-2-aza-5,6,7,8-tetrahidroxi-3-octiliminoindolizidina. o. (5R,6R,7S,8S,8aR)-5,6,7,8-Tetrahidroxi-3-fenilimino-2-oxaindolizidina. p. (5R,6R,7S,8S,8aR)-3-Butilimino-5,6,7,8-tetrahidroxi-2-oxaindolizidina. q. (5R,6R,7S,8S,8aR)-5,6,7,8-Tetrahidroxi-3-octilimino-2-oxaindolizidina. r. (5R,6R,7S,8S,8aR)-5,6,7,8-Tetrahidroxi-S-fenilimino-2-tiaindolizidina. s. (5R,6R,7S,8S,8aR)-3-Butilimino-5,6,7,8-tetrahidroxi-2-tiaindolizidina. t. (5R,6R,7S,8S,8aR)-5,6,7,8-Tetrahidroxi-3-octilimino-2-tiaindolizidina. u. Clorhidrato de (5R,6R,7S,8S,8aR)-2-aza-3-bencilimino-5,6,7,8-tetrahidroxindolizidina. v. Clorhidrato de (5R,6R,7S,8S,8aR)-2-aza-3-butilimino-5,6,7,8-tetrahidroxindolizidina; o w. Clorhidrato de (5R,6R,7S,8S,8aR)-2-aza-5,6,7,8-tetrahidroxi-3-octiliminoindolizidina. 12. Procedimiento de obtención de los compuestos de fórmula general (I) que comprende: a. introducir un grupo amino en la posición C-5 del correspondiente azúcar en forma de furanosa; b. cerrar un anillo de cinco miembros entre las posiciones C-5 y C-6 mediante un segmento de tipo pseudoamida del compuesto obtenido en el paso (a); y c. transposición del anillo de furano a un ciclo de piperidina fusionado con el anillo de pseudoamida cíclico de cinco miembros obtenido en el paso (b). 21 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 ES 2 337 435 B2 13. Uso del compuesto de fórmula general (I) para la elaboración de una composición farmacéutica. 14. Uso del compuesto de fórmula general (I) para la elaboración de una composición farmacéutica para el tratamiento de una enfermedad relacionada con β-glucosidasa y/o β-galactosidasa mutadas humanas. 15. Uso del compuesto según la reivindicación 14, donde las enfermedades son enfermedad de Gaucher, gangliosidosis GM1 o enfermedad de Morquio B. 16. Composición farmacéutica que comprende al menos uno de los compuestos de fórmula general (I). 17. Composición farmacéutica según la reivindicación 16, que además comprende otro componente activo y/o un vehículo farmacéuticamente aceptable. 18. Composición farmacéutica según la reivindicación 17, donde el vehículo es una ciclodextrina o cualquiera de sus derivados. 19. Composición farmacéutica según la reivindicación 18, donde el vehículo es β-ciclodextrina. 20. Procedimiento in vitro para potenciar la actividad de una enzima glicosidasa, que comprende poner en contacto la proteína con una cantidad eficaz de un compuesto de fórmula general (I). 22 OFICINA ESPAÑOLA DE PATENTES Y MARCAS ESPAÑA 11 ES 2 337 435 21 Nº de solicitud: 200802988 22 Fecha de presentación de la solicitud: 22.10.2008 32 Fecha de prioridad: INFORME SOBRE EL ESTADO DE LA TÉCNICA 51 Int. Cl.: Ver hoja adicional DOCUMENTOS RELEVANTES Categoría 56 Documentos citados Reivindicaciones afectadas Categoría de los documentos citados X: de particular relevancia Y: de particular relevancia combinado con otro/s de la misma categoría A: refleja el estado de la técnica O: referido a divulgación no escrita P: publicado entre la fecha de prioridad y la de presentación de la solicitud E: documento anterior, pero publicado después de la fecha de presentación de la solicitud El presente informe ha sido realizado  5para todas las reivindicaciones para las reivindicaciones nº: Fecha de realización del informe Examinador Página 08.02.2010 H. Aylagas Cancio 1/4 X GARCIA MORENO, M.I.: "Synthesis and evaluation of isourea-type 1,2,5-20 glycomimetics related to the indolizidine and trehazolin glycosidase inhibitor families". J. Org. Chem, 2003, vol. 68, páginas 8890-8901, página 8893, esquemas 1 y 3, página 8896, tab. 1. X GARCIA MORENO, M.I.: "Castanospermine-trehazolin hybrids: a new 1,2,5-20 family of glycomimetics with tuneable glycosidase inhibitory properties". Chem. Comm. 2002, no8, páginas 848-849, página 1, y compuesto 11. X US 5131946 A (FRANKE ET AL) 21.07.1992, columnas 9-12, tabla. 1,2,4,9 X EP 440319 A1 (SCHERING AKTIENGESELLSCHAFT) 07.08.1991, 1,4,9 reivindicación 5. X ARYA. V. et al.: "Synthesis of new heterocycles: part XVI- 1,4,9 Synthesis of thiazolo (3,4 alfa) pyridines, pyrido (1,3)thiazines & related heterocycles". Indian Journal of Chemistry, 1976, vol. 14B, páginas 770-772, página 770, fórmula II. INFORME DEL ESTADO DE LA TÉCNICA Nº de solicitud: 200802988 CLASIFICACIÓN DEL OBJETO DE LA SOLICITUD Informe del Estado de la Técnica (hoja adicional) Página 2/4 C07D 498/04 (2006.01) C07D 513/04 (2006.01) C07D 487/04 (2006.01) A61K 31/4355 (2006.01) A61K 31/4365 (2006.01) A61K 31/437 (2006.01) Documentación mínima buscada (sistema de clasificación seguido de los símbolos de clasificación) C07D, A61K Bases de datos electrónicas consultadas durante la búsqueda (nombre de la base de datos y, si es posible, términos de búsqueda utilizados) INVENES, EPODOC, WPI, EMBASE, MEDLINE, NPL, BIOSIS, XPESP, REGISTRY, HCAPLUS OPINIÓN ESCRITA Nº de solicitud: 200802988 Fecha de Realización de la Opinión Escrita: 08.02.2010 Declaración Novedad (Art. 6.1 LP 11/1986) Reivindicaciones 3 SÍ Reivindicaciones 1,2,4-20. NO Actividad inventiva Reivindicaciones 3 SÍ (Art. 8.1 LP 11/1986) Reivindicaciones 1,2,4-20. NO Se considera que la solicitud cumple con el requisito de aplicación industrial. Este requisito fue evaluado durante la fase de examen formal y técnico de la solicitud (Artículo 31.2 Ley 11/1986). Base de la Opinión: La presente opinión se ha realizado sobre la base de la solicitud de patente tal y como ha sido publicada. Informe sobre el Estado de la Técnica (Opinión escrita) Página 3/4