Medicamento celular como alternativa terapéuticaen la isquemiacrónica crítica de miembros inferiores en pacientes diabéticos sin posibilidades de revascularización

Universidad de Sevilla Departamento de Fisiología Médica y Biofísica MEDICAMENTO CELULAR COMO ALTERNATIVA TERAPÉUTICA EN LA ISQUEMIA CRÓNICA CRÍTICA DE MIEMBROS INFERIORES EN PACIENTES DIABÉTICOS SIN POSIBILIDADES DE REVASCULARIZACIÓN Memoria de Tesis Doctoral para optar al grado de Doctor Autora: Tutor: Directores: Natalia Escacena Dr. Antonio Castellano Dr. Bernat Soria Escoms Acosta Dr. Abdelkrim Hmadcha Sevilla, 2016 Dr. Bernat Soria Escoms, Director del Departamento de Células Troncales del Centro Andaluz de Biología Molecular y Medicina Regenerativa (CABIMER), y Dr. Abdelkrim Hmadcha, Investigador del Centro Andaluz de Biología Molecular y Medicina Regenerativa (CABIMER), CERTIFICAN QUE: El trabajo de investigación presentado por Doña Natalia Escacena Acosta titulado “Medicamento celular como alternativa terapéutica en la isquemia crónica crítica de miembros inferiores en pacientes diabéticos sin posibilidades de revascularización” ha sido realizado bajo su supervisión y dirección en el Departamento de Células Troncales de CABIMER, y reúne los requisitos de originalidad y calidad científica necesarios para ser defendido ante un tribunal con el fin de optar al grado de Doctor por la Universidad de Sevilla. Y para que así conste y a efectos oportunos, firman el presente informe en Sevilla a 30 de Septiembre de 2015. VºBº de los directores del trabajo. Dr. Bernat Soria Escoms Dr. Abdelkrim Hmadcha LISTADO DE PUBLICACIONES  Escacena N, Quesada-Hernández E, Capilla-González V, Soria B, Hmadcha A. Bottlenecks in the efficient use of advanced therapy medicinal products based on mesenchymal stromal cell. Stem Cells Int. vol. 2015 p. 895714.  Lachaud CC, Soria F, Escacena N, Quesada-Hernández E, Hmadcha A, Alió J, Soria B. Mesothelial cells: a cellular surrogate for tissue engineering of corneal endothelium. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2014 Aug; 55(9):5967-78.  Acosta L, Hmadcha A, Escacena N, Pérez-Camacho I, de la Cuesta A, Ruiz- Salmeron R, Gauthier BR, Soria B. Adipose mesenchymal stromal cells isolated from type 2 diabetic patients display reduced fibrinolytic activity. Diabetes. 2013 Dec;62(12):4266-9. FINANCIADO POR: El trabajo de investigación que dio como resultado esta memoria de tesis ha sido en parte financiado por fondos de investigación captados en convocatorias competitivas: - Proyecto de Excelencia de la Consejería de Innovación, Ciencia y Empresa de la Junta de Andalucía con referencia CTS-6505; Proyecto INNPACTO del Ministerio de Economía y Competitividad (MINECO) con referencia INP-2011-1615-900000, ambos cofinanciados con Fondos FEDER de la Comisión Europea. - Red de Terapia Celular (TerCel) con referencias RD06/0010/0025 y RD12/0019/0028 y proyectos FIS PI10/00964 y PI14/01015, ambos financiados por el Ministerio de Salud y Consumo y Fondos FEDER de la Comisión Europea. - Financiación específica para Ensayos Clínicos dentro del programa de Terapias Avanzadas del Ministerio de Sanidad, Igualdad y Bienestar Social, Instituto de Salud Carlos III con referencia TRA 120. - Proyecto BIOREG del Programa SUDOE de la Comisión Europea (Red de Medicina Regenerativa-SOE3/P1/E750) y ACTION COST de la Comisión Europea (Cooperación Europea en Ciencia y Tecnología-BM1305). El apoyo de la Fundación SED (FSED) y de la Fundación Andaluza de Investigación y Desarrollo (FAIS) permitió el acceso a los bancos de datos. - El Centro de Investigación en Red de Diabetes y Enfermedades Metabólicas Asociadas (CIBERDEM) es una iniciativa del Instituto de Salud Carlos III. Las actividades investigadoras del grupo al cual está adscrita la doctoranda se encuentran gestionadas por la Fundación Progreso y Salud, Consejería de Salud, Junta de Andalucía. I. INTRODUCCIÓN ....................................................................................... 1 1.1. DIABETES MELLITUS ....................................................................................................... 5 1.1.1. DEFINICIÓN, CLASIFICACIÓN Y DIAGNÓSTICO .................................................................................. 6 1.1.2. COMPLICACIONES ASOCIADAS A LA DIABETES ................................................................................. 9 1.1.3. COMPLICACIONES VASCULARES DE LA DIABETES.......................................................................... 10 1.2. ENFERMEDAD ARTERIAL PERIFÉRICA E ISQUEMIA CRÓNICA CRÍTICA EN MIEMBROS INFERIORES ....................................................................................................... 19 1.2.1. DEFINICIÓN Y CONCEPTO .................................................................................................................. 19 1.2.2. ISQUEMIA CRÓNICA CRÍTICA EN PACIENTES DIABÉTICOS ............................................................ 20 1.2.3. PREVALENCIA, INCIDENCIA Y PRONÓSTICO .................................................................................... 21 1.2.4. MANIFESTACIONES CLÍNICAS ........................................................................................................... 23 1.2.5. FACTORES DE RIESGO ........................................................................................................................ 24 1.2.6. DIAGNÓSTICO ...................................................................................................................................... 26 1.2.7. POSIBILIDADES ACTUALES DE TRATAMIENTO ............................................................................... 29 1.3. TERAPIA CELULAR COMO ALTERNATIVA TERAPÉUTICA ......................................... 31 1.3.1. TERAPIA CELULAR EN LA ISQUEMIA CRÓNICA CRÍTICA DEL MIEMBRO INFERIOR ................... 36 1.3.2. USO DE LAS MSCS COMO MEDICAMENTO CELULAR ...................................................................... 40 1.3.3. ANTECEDENTES PRECLÍNICOS .......................................................................................................... 46 1.3.4. ANTECEDENTES CLÍNICOS ................................................................................................................. 47 1.3.5 TERAPIA CELULAR EN LA ISQUEMIA CRÓNICA CRÍTICA: NUESTRA EXPERIENCIA ...................... 51 1.3.6. RIESGOS POTENCIALES EN EL USO CLÍNICO DE LAS MSCS ........................................................... 55 II. OBJETIVOS ............................................................................................ 61 III. PACIENTES Y METODOLOGÍA .......................................................... 65 3.1. CARACTERÍSTICAS DEL ESTUDIO ................................................................................. 67 3.2. MEDICAMENTO EN INVESTIGACIÓN ........................................................................... 72 3.3. EVALUACIÓN DE LA FACTIBILIDAD .............................................................................. 84 3.4. EVALUACIÓN DE LA SEGURIDAD .................................................................................. 84 3.5. EVALUACIÓN DE LA EFICACIA ...................................................................................... 86 3.5.1. EVALUACIÓN DE LA NEOVASCULARIZACIÓN MEDIANTE CUANTIFICACIÓN ANGIOGRÁFICA ... 86 3.5.2. VARIABLES SECUNDARIAS ................................................................................................................. 88 3.5.3. SEVERIDAD DE LA ENFERMEDAD ..................................................................................................... 90 3.6. INVESTIGACIÓN DE LA REACCIÓN ADVERSA .............................................................. 92 3.6.1. ANÁLISIS DE MUESTRAS BIOLÓGICAS .............................................................................................. 92 3.6.2. TÉCNICAS DE BIOLOGÍA CELULAR Y MOLECULAR ........................................................................ 92 3.7. ANÁLISIS ESTADÍSTICO ................................................................................................. 93 IV. RESULTADOS ....................................................................................... 95 4.1. CARACTERÍSTICAS DE LA POBLACIÓN ESTUDIADA ................................................... 97 4.2. PRODUCCIÓN DEL MEDICAMENTO CELULAR ........................................................... 100 4.3. FACTIBILIDAD DEL TRATAMIENTO CON ADMSCS AUTÓLOGAS .............................. 103 4.4. SEGURIDAD RELACIONADA CON EL TRATAMIENTO CON ADMSCS AUTÓLOGAS ... 103 4.5. RESULTADOS DE EFICACIA .......................................................................................... 106 4.5.1. EVALUACIÓN DE NEOVASCULARIZACIÓN ..................................................................................... 106 4.5.2. VARIABLES SECUNDARIAS .............................................................................................................. 112 4.5.3. SEVERIDAD DE LA ENFERMEDAD .................................................................................................. 117 4.6. INVESTIGACIÓN DE LA REACCIÓN ADVERSA ............................................................ 124 V. DISCUSIÓN ........................................................................................... 131 VI. PERSPECTIVAS FUTURAS ............................................................... 149 VII. CONCLUSIONES ................................................................................ 153 VIII. BIBLIOGRAFÍA ............................................................................... 157 ABREVIATURAS Y ACRÓNIMOS AA Acontecimiento Adverso AAG Acontecimiento Adverso Grave ADA Asociación Americana de Diabetes (American Diabetes Association) AdMSCs Células troncales mesenquimales de tejido adiposo (Adipose Mesenchymal stem cells) ADO Antidiabéticos orales AGEs Productos finales de la glicosilación avanzada (Advanced Glycation End Products) BM-MNCs Células mononucleadas de la médula ósea (Bone Marrow-mononuclear cells) BP Puntos de ramificación (branch points) CABIMER Centro Andaluz de Biología Molecular y Medicina Regenerativa CLI Isquemia crítica de miembros inferiores (Critical Limb isquemia) DM Diabetes Mellitus DM1 Diabetes Mellitus tipo 1 DM2 Diabetes Mellitus tipo 2 DSA Angiografía de substracción digital (Digital subtraction angiography) EAP Enfermedad arterial periférica ECs Células endoteliales (Endothelial cells) ECV Enfermedad cerebrovascular EPCs Células progenitoras endoteliales (Endothelial progenitor cells) ESCs Células troncales embrionarias (Embrionic Stem Cells) FBS Suero fetal bovino (Fetal bovine serum) FID Federación Internacional de Diabetes GNE Glicación no enzimática de proteínas HSCs Células troncales hematopoyéticas HTA Hipertensión arterial HDL Lipoproteínas de alta densidad (high density lipoproteins) iPSCs Células pluripotentes inducidas (induced pluripotent stem cells) ITB Índice tobillo-brazo LDL Lipoproteínas de baja densidad (low density lipoproteins) MO Médula ósea MSCs Células troncales mesenquimales (mesenchymal stem cells) OMS Organización Mundial de la Salud ON Óxido Nítrico PAI-1 Inhibidor del activador del plasminógeno-1 (plasminogen activator inhibitor-1) RI Resistencia a la insulina S Segmentos (segments) TNFα Factor tumoral de necrosis alfa (tumoral necrosis factor) tPA Activador del plasminógeno tisular (tissue plasminogen activator) TTA Área total del vaso (total tube area) TTL Longitud total del vaso (total tube length) tcpO2 Presión transcutánea de oxígeno (transcutaneous oxygen tension) UAPC Unidad de Apoyo de Producción Celular UCF-F Unidades formadoras de colonias de fibroblastos VEGF Factor de crecimiento endotelial vascular (vascular endothelial growth factor) I. INTRODUCCIÓN I N T R O D U C C I ÓN| 3 La diabetes mellitus (DM) es la enfermedad metabólica más común, y comprende una variedad de síndromes con distintas causas que afectan colectivamente a un 8.3% de la población mundial (1). Lleva asociada una serie de complicaciones (ceguera, enfermedad renal, enfermedad cardiovascular, trastornos tróficos en el pie), y está considerada como el principal factor de riesgo para la isquemia crónica crítica del miembro inferior (CLI; del inglés critical limb ischemia), la cual es una de las manifestaciones más severas de aterosclerosis en nuestro organismo. La CLI se define como el cuadro caracterizado por dolor crónico en reposo, úlceras o gangrena atribuibles a enfermedad arterial oclusiva comprobada (2), suponiendo el final del proceso de aterosclerosis y que puede conllevar la amputación del miembro e incluso la muerte si no se consigue una rápida y eficaz revascularización. En el paciente diabético, la isquemia de la pierna se desarrolla más precozmente y con mayor intensidad. Se estima que un 15% de los pacientes diabéticos desarrollarán CLI, y en la mayoría de los casos, conllevará la amputación. Las lesiones arteriales suelen afectar a los vasos más distales (3). Esta localización de las lesiones dificulta su revascularización, quirúrgica o endovascular. Por otro lado, también la presentación del cuadro en el paciente diabético es diferente, al conllevar un mayor componente de pérdida tisular y gangrena, y menor manifestación clínica de dolor debido a la neuropatía diabética frecuentemente asociada. Además, los pacientes diabéticos en concreto tienen disminuidos los mecanismos fisiológicos de angiogénesis y reendotelización, por lo que el curso de la enfermedad es más severo y acelerado. El objetivo principal del tratamiento actual de CLI es la revascularización, bien quirúrgica o endovascular (4). Sin embargo, en una gran proporción de estos pacientes, la extensión anatómica y la distribución de la enfermedad oclusiva arterial hacen que sean candidatos poco aptos a la revascularización, y que la enfermedad siga su inexorable curso hacia la amputación y la muerte. El tratamiento farmacológico como única alternativa para estos pacientes sin posibilidades de revascularización, no ha demostrado que afecte favorablemente el curso de CLI (5,6). De hecho, en la actualidad se recomienda habitualmente para 10 | I N T R O D U C C I Ó N pacientes. Este aumento en el periodo de vida de los pacientes ha traído como consecuencia la aparición de complicaciones crónicas desconocidas en el pasado, que continúan en la actualidad siendo un desafío y convirtiéndose en el principal problema para la supervivencia del diabético. A pesar de que la DM es considerada una enfermedad endocrina, las complicaciones crónicas se manifiestan a nivel vascular, pudiendo ser clasificadas en microvasculares (cuando predomina la afectación de los vasos pequeños como ocurre en la retina, riñones o sistema nervioso) o macrovasculares (cuando las alteraciones se producen en vasos de mediano y gran calibre, como en el caso de las enfermedades cardiovasculares, cerebrovasculares y en las arterias periféricas). El pie diabético engloba un conjunto de síndromes en los que la presencia de neuropatía, isquemia e infección producen lesiones tisulares o úlceras debido a pequeños traumatismos, produciendo una importante morbilidad que puede llegar incluso a amputaciones. Así mismo, podemos considerar un grupo de afecciones no vasculares dentro de las complicaciones crónicas que incluyen las afectaciones al cristalino y la progresión acelerada de cataratas, las alteraciones inmunológicas clásicas evidenciadas en la mayoría de los casos por infecciones urogenitales y mucocutáneas recurrentes, así como algunos cambios en la piel característicos de estos pacientes. 1.1.3. COMPLICACIONES VASCULARES DE LA DIABETES Si bien las complicaciones microvasculares y del pie diabético afectan a la calidad de vida del paciente además de elevar considerablemente los costes del sistema sanitario, las complicaciones macrovasculares constituyen la causa principal de morbilidad y mortalidad en los pacientes con DM en todo el mundo (23). Las lesiones microvasculares (retina, sistema nervioso y riñón) suelen preceder a las de los vasos de mediano y gran calibre, siendo diferentes en cierta medida según qué zona se encuentre afectada. En la microangiopatía predomina la lesión INTRODUCCIÓN | 11 en el endotelio, la íntima y la capa muscular media, mientras que en la macroangiopatía la lesión principal se sitúa preferentemente en la capa muscular media. Existe cierta dificultad a la hora de distinguir ambos procesos con respecto a las modificaciones estructurales y funcionales derivadas de la arteriosclerosis o el envejecimiento natural que sufre el sistema arterial. Igualmente, existen diferencias en la evolución de ambos procesos, consiguiéndose una disminución de las complicaciones microvasculares mediante un control glucémico estricto (24), mientras que la macroangiopatía diabética sigue su avance en términos de cronicidad, progresión e irreversibilidad a pesar de tratamientos farmacológicos establecidos. Realmente, ambos procesos son consecuencia de la hiperglucemia crónica, asumiéndose por tanto, que son equivalentes en cuanto a su fisiopatología (Figura 3). Figura 3. Hiperglucemia como factor común fisiopatológico en las complicaciones macrovasculares y microvasculares de la DM. Numerosos estudios han relacionado las complicaciones de la diabetes con la intensidad y duración de la hiperglucemia (25). Los resultados de dos trabajos multicéntricos, el DCCT (Diabetes Control and Complications Trial) para la DM tipo 12 | INTRODUCCIÓN 1 en 1993 y el UKPDS (United Kingdom Prospective Diabetes Study) para la DM tipo 2 en 1998, donde se comparaban los efectos de pacientes con un control glucémico estricto con los de pacientes con un control estándar, establecieron que la reducción de los niveles de glucosa en sangre (en términos de reducción de hbA1c) disminuían la incidencia de complicaciones microvasculares, sobre todo en retina y riñón. Sin embargo, estos estudios no arrojaron resultados concluyentes en relación a las complicaciones macrovasculares que siguen representando el 80% de las causas de mortalidad asociada a la diabetes (24,26–28). En este sentido, la mayoría de los diabéticos tipo 2 fallece como consecuencia de la aterosclerosis, fenómeno fisiopatológico inicial de la macroangiopatía diabética. La aterosclerosis es una enfermedad sistémica referida al engrosamiento y endurecimiento de las arterias. Actualmente, se considera un proceso inflamatorio crónico, que afecta a las arterias de mediano y gran calibre de diferentes lechos vasculares y que se caracteriza por el engrosamiento de la capa íntima y media con pérdida de la elasticidad (29). Aparece por el concurso de tres factores principales: disfunción endotelial, inflamación y trombosis. Su lesión básica es la placa de ateroma compuesta fundamentalmente de lípidos, tejido fibroso y células inflamatorias, y pasa por diferentes fases (30). Generalmente se complica mediante la fisura, la erosión o la rotura de la placa y la formación de un trombo en su superficie, lo que facilita su crecimiento y la aparición de isquemia o necrosis (Figura 4). Figura 4. Progresión de la aterosclerosis. La placa, compuesta por grasa, colesterol, calcio y otras sustancias se va depositando en las arterias endureciéndose con el tiempo y estrechando el vaso, con lo cual se limita el flujo de sangre rica en oxígeno a las distintas partes del cuerpo. Fuente: Imagen modificada de Pepine CJ. y colaboradores (31). I N T R O D U C C I Ó N | 13 La DM es un reconocido factor de riesgo para el desarrollo de la aterosclerosis y por tanto, de enfermedades cardiovasculares. Los pacientes diabéticos tienen de 2 a 4 veces mayor riesgo de desarrollar enfermedad cardiovascular. Así mismo, los diabéticos tipo 2 tienen el mismo riesgo de sufrir un ataque cardíaco que aquellos individuos sin diabetes que ya han tenido un ataque cardíaco previo (32). La DM favorece a la aterosclerosis por distintos mecanismos: un perfil lipídico desfavorable (elevación de los triglicéridos, descenso del HDL, partículas de baja densidad pequeñas y densas (LDL)), presencia de LDL modificadas, hiperinsulinismo, hipercoagulabilidad y aumento de marcadores inflamatorios. Podemos por tanto considerar a la DM como una enfermedad vascular con riesgo trombótico elevado. Para llegar a comprender la fisiopatología subyacente del daño vascular en el paciente diabético y por qué la aterosclerosis se da de manera más temprana y acelerada en ellos, es necesario tener en cuenta varios aspectos fundamentales como son: los mecanismos inductores que causan la disfunción endotelial; las alteraciones en la coagulación y la inflamación asociada al proceso. A) Disfunción endotelial: mecanismos inductores El endotelio está actualmente considerado como un órgano endocrino, autocrino y paracrino que controla la homeostasis del tono muscular, permeabilidad, coagulación, fibrinólisis, proliferación celular y la respuesta inflamatoria. En presencia de factores de riesgo cardiovascular, como la DM, hiperlipemia, estrés oxidativo o hipertensión, las células endoteliales sufren un cambio fenotípico hacia un perfil inflamatorio generándose lo que se conoce como disfunción endotelial (33). Como consecuencia, se genera un desequilibrio entre la síntesis, liberación o efecto de los factores endoteliales capaces de relajar el músculo liso vascular, entre ellos el óxido nítrico (NO), prostaciclina (PGI2), o factor hiperpolarizante, y las sustancias vasoconstrictoras como la angiotensina-II y la endotelina-1 que pueden sintetizarse en las células de este tejido. Este desajuste se manifiesta con una reducción en la respuesta vasodilatadora dependiente del endotelio, o con una mayor respuesta vasoconstrictora. Además, el deterioro endotelial puede facilitar 14 | I N T R O D U C C I Ó N la interacción de las plaquetas y leucocitos con la pared vascular, así como el crecimiento y migración de las células musculares lisas. Como hemos mencionado anteriormente, el proceso se inicia por un estado mantenido de hiperglucemia debido a un defecto en la producción de insulina por las células pancreáticas β; una deficiente acción insulínica o por ambas causas. Bioquímicamente, el exceso de glucosa intracelular puede generar disfunción endotelial por varios mecanismos: - Glicación no enzimática de proteínas (GNE), con formación de productos finales de la glicosilación avanzada (AGEs)(34). La GNE ocurre de manera fisiológica, pero en el caso de la DM se encuentra patológicamente acelerada. Los AGE intervienen en el desarrollo de las complicaciones asociadas a la diabetes provocando modificaciones fisicoquímicas en diversas biomoléculas, y por tanto, alterando funcional y estructuralmente las moléculas glicosiladas. Además, alteran varios procesos biológicos debido a la unión de moléculas modificadas al receptor de los AGEs e incrementan la producción de radicales libres aumentando por tanto el estrés oxidativo (35). - Vía del poliol-sorbitol-aldosa-reductasa (36): una vía alternativa de metabolización de la glucosa es la de la aldosa reductasa, que genera sorbitol. Éste es metabolizado posteriormente a fructosa aumentándose al mismo tiempo la oxidación de la nicotinamida adenina dinucleótido fosfato (NADPH), reduciéndose la disponibilidad de NO. Tiene lugar un desequilibrio que cursa con hipoxia celular y alteración de la funcionalidad de la célula endotelial. - Diacilglicerol-proteinquinasa C (37): la activación de la proteinquinasa C (PKC) conduce a una alteración de las funciones endoteliales y de sustancias vasoactivas, potenciándose, por el contrario, la secreción de sustancias vasoconstrictoras como la endotelina y la angiotensina II. - Auto-oxidación (38): el metabolismo de la glucosa puede inducir modificaciones oxidativas de los lípidos y proteínas, entre ellas las LDL. Las LDL oxidadas se acumulan formando células espumosas, atrayendo INTRODUCCIÓN | 15 monocitos circulantes y provocando citotoxicidad en las células endoteliales. Investigaciones recientes refieren una posible relación entre estas vías y la generación de especies reactivas de oxígeno (ERO) que conducen a un estrés oxidativo (EO) crónico en pacientes diabéticos (39). El término “estrés oxidativo” hace referencia al desequilibrio a corto o largo plazo de moléculas antioxidantes y pro-oxidantes, lo que provoca una disrupción de los mecanismos de señalización y control celular, favoreciéndose los procesos de pro-oxidación y obstaculizándose los mecanismos antioxidantes (40). Se ha considerado que, en respuesta a la hiperglucemia crónica, las mitocondrias de las células endoteliales generan un exceso de ERO, en concreto de aniones superóxido (· O2 -), contribuyendo así a la formación de las complicaciones en la DM. Este aumento en la generación de · O2 - se considera un proceso clave en la activación de las vías anteriormente descritas (Figura 5). Diversos estudios han demostrado que los pacientes con DM2 tienen aumentado el daño oxidativo inducido por mayor producción de ERO en la circulación y a su vez tienen reducidos los mecanismos de defensa antioxidantes (41,42). Figura 5: El estrés oxidativo como causa común del daño vascular. Se ha sugerido que la diversidad de eventos asociados a las complicaciones micro y macroangiopáticas puede tener su origen en la superproducción mitocondrial de aniones superóxido (· O2 -), debido a la hiperglucemia, hecho que relacionaría las 4 vías anteriormente descritas. Gluc: Glucosa. PKC: proteinquinasa C. AGE: productos finales de la glicosilación avanzada. ERO: especies reactivas de oxígeno. 16 | I N T R O D U C C I Ó N Al igual que la hiperglucemia, la hiperinsulinemia y/o la resistencia a la insulina (RI) inducen disfunción endotelial y aterosclerosis (43). La hiperinsulinemia compensatoria que secunda a la RI estimula diversos fenómenos proliferativos y proaterogénicos en las células endoteliales y del músculo liso vascular. Estos efectos incluyen un aumento de la producción del inhibidor del activador de plasminógeno tipo 1 (PAI-1), endotelina, citocinas proinflamatorias y un aumento de la expresión de las moléculas de adhesión (44). B) Alteraciones de la coagulación Se han encontrado múltiples alteraciones de la homeostasia en pacientes con DM, las cuales favorecen el estado protrombótico que presentan estos enfermos. Los trastornos en la función de las plaquetas conllevan una hiperreactividad de éstas así como un aumento en su actividad procoagulante. Dichos factores se encuentran asociados con complicaciones micro y macrovasculares. Así mismo, existen alteraciones en el mecanismo de la coagulación que permiten el establecimiento de un estado de hipercoagulabilidad, el cual contribuye al desarrollo de manifestaciones trombóticas. A este respecto, existen investigaciones que documentan un aumento en el fibrinógeno, de los factores de coagulación VII y VIII, así como de los marcadores de activación de este sistema. De igual forma, los trastornos en la fibrinólisis detectados en los pacientes diabéticos no solo predisponen al desarrollo de eventos trombóticos, sino que también favorecen la formación y progresión de las lesiones aterotrombóticas. Ha sido documentado la existencia de un desequilibrio entre activadores del plasminógeno (tisular) e inhibidores como el PAI-1. La excesiva inhibición de la fibrinólisis aumenta el riesgo de coagulación anormal y trombosis. Como consecuencia, en la DM tiene lugar un aumento del fibrinógeno, de PAI-1, de la molécula de adhesión de células vasculares (VCAM-1), de las glicoproteínas adhesivas IIb/IIIa de la superficie plaquetaria y de la producción de tromboxano A- 2. Igualmente, existe un incremento de la agregabilidad y adhesión plaquetaria, y de la glicosilación de proteínas de las plaquetas; y, simultáneamente, una disminución de los niveles de antitrombina III, de las proteínas C y S, de la I N T R O D U C C I Ó N | 17 prostaciclina y de la disponibilidad de NO plaquetario, creándose un estado procoagulante en el paciente diabético. C) Inflamación Actualmente, la aterosclerosis es considerada una enfermedad dinámica y progresiva, resultado de la combinación entre inflamación y disfunción endotelial (45–47). El tejido adiposo juega un papel central en el mantenimiento de un estado inflamatorio crónico, puesto que es el responsable de la secreción de una variedad de biomoléculas biológicamente activas como la Interleukina-6 (IL-6), el factor de necrosis tumoral alfa (TNFα), la leptina y la adiponectina, que son determinantes en la regulación del proceso aterogénico y la RI (48–50). La sobrecarga celular y la activación de la señalización celular mitógena (factor c- Jun NH(2)-terminal quinasa (JNK) y factor nuclear kappa (NF-κB)) tienen lugar cuando aumenta el tejido adiposo como consecuencia de la obesidad. Dichas vías de inflamación aumentan la producción de citoquinas proinflamatorias por el adipocito, que pueden activar las células musculares lisas y endoteliales vasculares con disfunción vascular. De esta manera, los productos del adipocito pueden promover directamente la disfunción vascular y la aterogenia. Todas estas acciones proaterogénicas y protrombóticas explican la alta prevalencia de la aterosclerosis y sus consecuencias en los pacientes diabéticos. Bajo este contexto, las manifestaciones clínicas de la aterosclerosis dependerán del lecho vascular afectado, siendo las más representativas la cardiopatía isquémica, la enfermedad cerebrovascular (ECV) o la enfermedad arterial periférica (EAP). La presencia de aterosclerosis en un territorio vascular se asocia con frecuencia con la afectación de otros territorios por lo que es común que varias manifestaciones se presenten de manera simultánea, como han dejado patente varios estudios poblacionales tales como el Edimburgh Artery Study, el CAPRIE (51), el REACH o Malmö entre otros. Igualmente, los factores de riesgo son los mismos para los distintos territorios vasculares. Los pacientes diabéticos manifiestan la aterosclerosis de manera más temprana y acelerada que los pacientes no 18 | INTRODUCCIÓN diabéticos (52), con un mayor nivel de afectación en los territorios involucrados y con una mayor incidencia (Tabla 2). Tabla 2: Características diferenciales entre la enfermedad aterosclerótica del diabético y no diabético Fuente: Adaptado de Levin, 1991 La aterosclerosis está considerada un proceso sistémico, el cual afecta a los vasos de todo el organismo en mayor o menor medida, incluyendo los coronarios, cerebrales, viscerales y de las extremidades. A pesar de que la EAP engloba todos los territorios no coronarios, frecuentemente se utiliza este término para referirse a la arteriopatía de los miembros inferiores. En la presente tesis nos referiremos únicamente a la enfermedad arterial de los miembros inferiores. I N T R O D U C C I Ó N | 19 1.2. ENFERMEDAD ARTERIAL PERIFÉRICA E ISQUEMIA CRÓNICA CRÍTICA EN MIEMBROS INFERIORES 1.2.1. DEFINICIÓN Y CONCEPTO Según Meijer y colaboradores (53), la EAP es la manifestación más prevalente de la aterosclerosis. A nivel de los miembros inferiores, el estrechamiento arterial causa un desequilibrio entre el suplemento y la demanda de oxígeno produciendo cambios en la micro y macrocirculación. Abarca un espectro clínico que comprende desde pacientes asintomáticos hasta la forma más severa como es la isquemia crítica (CLI, del inglés critical limb ischemia), que podría resultar en amputación y pérdida del miembro. Por lo tanto, la CLI se considera la “etapa final” de la EAP. La CLI implica cronicidad, considerándose un problema persistente e incesante que perjudica gravemente el estado funcional del paciente y su calidad de vida, y se asocia con un aumento de la mortalidad y morbilidad cardiovascular. El concepto de CLI surgió de manera tardía en la historia de la EAP. En la década de los 50s, con la cirugía vascular emergente, la inicial clasificación de la EAP realizada por Fontaine, donde los estados III y IV se corresponden con la CLI, fue basada únicamente en síntomas clínicos. Posteriormente, se publicó en 1986 la clasificación de Rutherford la cual incluía criterios hemodinámicos (54). Desde entonces, diversos autores han propuesto diferentes definiciones, teniendo en cuenta una variedad de medidas hemodinámicas en combinación con hallazgos clínicos, ya que el diagnóstico basado en las manifestaciones clínicas habituales de la CLI (es decir, heridas crónicas que no cicatrizan, dolor en reposo, gangrena) también podrían ser causados por otras enfermedades no vasculares. La Trans Atlantic Inter-Society Consensus (TASC II) ha definido la CLI como el cuadro caracterizado por dolor crónico en reposo, úlceras o gangrena atribuible a enfermedad arterial oclusiva comprobada (2,55). Para el diagnóstico del síndrome de isquemia crónica crítica del miembro inferior, el grupo de trabajo europeo de isquemia crítica de la pierna definió la necesidad de concurrir criterios clínicos y objetivos para precisar el cuadro, describiéndola como la presencia de dolor en reposo de origen isquémico persistente que requiere analgesia durante más de 2 semanas, o ulceración o gangrena del pie o 26 | I N T R O D U C C I Ó N La homocisteína induce efectos vasculares adversos tales como daño endotelial, proliferación de las células musculares lisas y oxidación de las LDL. Existe además una correlación positiva entre la concentración de homocisteína y las de LDL. Esta situación podría contribuir a la amplificación del daño vascular en los pacientes diabéticos hiperhomocisteinémicos. Sin embargo, su asociación con EAP también se ha definido como inconsistente. - Insuficiencia renal crónica: los pacientes con insuficiencia renal crónica presentan mayor prevalencia de EAP. Actualmente, ya se reconoce como un factor de riesgo de la EAP. - Marcadores inflamatorios: se han publicado numerosos estudios que demuestran la relación entre la inflamación y la EAP. Por ejemplo, en hombres aparentemente sanos de la cohorte del estudio PHS (Physician´s Health Study), se demostró que el riesgo relativo de desarrollar EAP aumentaba de forma significativa con la elevación de la proteína C reactiva (71). - Hiperviscosidad sanguínea y estados de hipercoagulabilidad e hiperfibrinogenemia: en pacientes con EAP se ha descrito un hematocrito elevado, posiblemente relacionado con el tabaquismo. Además, algunos estudios han demostrado que las concentraciones elevadas de fibrinógeno condicionan una alteración de la microcirculación que se asocia con la clínica más importante de EAP. 1.2.6. DIAGNÓSTICO Debido a que la EAP presenta una elevada prevalencia, y con frecuencia cursa como asintomática, las principales guías de práctica clínicas recomiendan realizar un cribado diagnóstico a pacientes de alto riesgo (55,64), que la ACC/AHA (American College of Cardiology/American Heart Association) y la TASC II considera a: aquellos pacientes mayores de 70 años; aquellos entre 50 y 69 años con historia de tabaquismo o DM; edad entre 40 y 49 años con DM y al menos otro factor de riesgo de arteriosclerosis; síntomas compatibles con claudicación al esfuerzo o I N T R O D U C C I Ó N | 27 dolor isquémico en reposo; pulsos anormales en las extremidades inferiores; enfermedad arteriosclerótica en otros territorios (p. ej., enfermedad arterial coronaria, carotídea o renal), y/o pacientes con un score de Framingham entre el 10% y el 20%. Para establecer el diagnóstico de la EAP disponemos fundamentalmente de la anamnesis y la exploración física, el índice tobillo-brazo (ITB), otros métodos diagnósticos no invasivos (determinaciones de la presión segmentarias, registros del volumen del pulso, estudios de ecografía-Doppler y pruebas de esfuerzo) y la angiografía vascular mediante tomografía computarizada (TC), resonancia magnética (RM) o arteriografía convencional. La exploración física es una herramienta útil en el diagnóstico de la EAP. Los síntomas clásicos de EAP son bien conocidos y cuando se presentan son casi patognomónicos. Sin embargo, aunque su especificidad y su valor predictivo positivo son muy altos, su sensibilidad es baja. Los tres criterios de la exploración física, que conducen al diagnóstico, son: - Inspección: la observación del aspecto de la extremidad puede dar información de la existencia de isquemia y de la gravedad. La inspección permite apreciar trayectos arteriales hiperpulsátiles, se puede apreciar palidez o aspecto sonrosado de la piel, atrofia muscular, ausencia de vello. En estadios muy avanzados pueden aparecer lesiones ulcerosas, necróticas o incluso gangrena. - Palpación: siempre debe incluirse en la exploración vascular de la EAP. Se deben palpar la arteria femoral común, la poplítea, la tibial posterior y la pedia. Además, con el dorso de la mano se debe valorar la temperatura cutánea. - Auscultación: La auscultación en busca de soplos es posible en todas las arterias palpables de mediano y gran calibre. Fundamentalmente se realiza en las arterias aorta abdominal, femoral y poplítea. Permite localizar la lesión y diferenciar entre estenosis y oclusión. 28 | I N T R O D U C C I Ó N En el programa PARTNERS (72) se demostró que, si para el diagnóstico de la enfermedad nos basamos exclusivamente en la presencia de signos de claudicación intermitente, únicamente detectaríamos a un 10-15% de los pacientes con EAP, mientras que explorando también los pulsos arteriales se detectaría a alrededor del 50% de los pacientes. Por tanto, esto significa que con la anamnesis y la exploración física queda sin diagnosticar cerca de la mitad de los pacientes. Por ello se recomienda realizar algún test no invasivo adicional a los pacientes considerados de riesgo aterotrombótico. Existen varios métodos no invasivos para valorar la presencia y severidad de la EAP, como: - Índice tobillo-brazo (ITB): es un procedimiento preciso, simple, barato, cuya sensibilidad y especificidad han sido ampliamente demostradas. (Se explicará con más detalle en la sección Pacientes y Metodología). Sin embargo, en arteriopatía diabética o causas que produzcan calcificación importante de la pared arterial pueden obtenerse índices por encima de 1.2, no considerándose diagnóstico en estos casos. - Ecografía Doppler: aporta información sobre la localización de la obstrucción, la morfología de las lesiones e información hemodinámica sobre la presencia o ausencia de flujo, así como las características del mismo. Entre los métodos invasivos encontramos: - Arteriografía (angiografía por sustracción digital, DSA del inglés digital substraction angiography) es el gold estándar para el diagnóstico anatómico final de la afección. Permite conocer la extensión, topografía de las lesiones, y desarrollo de vasos colaterales en la oclusión arterial. - Angiorresonancia magnética (angio-RM): aplica las técnicas de tomografía por RM de alto campo y alta resolución. Las imágenes que se obtienen son parecidas a las de la arteriografía. I N T R O D U C C I Ó N | 29 - Angiotomografía axial computarizada (angio-TAC): Se opacifican las arterias con una inyección intravenosa de contraste iodado. La imagen puede ser rotada tridimensionalmente. 1.2.7. POSIBILIDADES ACTUALES DE TRATAMIENTO Como ya hemos comentado anteriormente, la CLI es la suma de una serie de síntomas que se presentan cuando se produce una disminución progresiva del flujo sanguíneo en la extremidad, la cual puede afectar a su función y a su supervivencia. Cuando dichos síntomas tienen lugar en reposo, o se presentan alteraciones funcionales y/o tróficas, la isquemia se transforma en crítica. En este contexto, el restablecimiento del flujo distal es el único tratamiento posible para aliviar los síntomas. Actualmente, el tratamiento que recibe un paciente con la patología descrita dependerá de la severidad del cuadro que presente. De esta forma, podemos dividirlo en dos grandes bloques: tratamiento médico y tratamiento quirúrgico. A) Tratamiento médico Debido a que los pacientes con esta patología tienen un pronóstico a largo plazo muy negativo, con un aumento de la mortalidad al cabo de 10 años 15 veces superior al de los pacientes sin EAP (73), la primera indicación es minimizar al máximo los factores de riesgo insistiendo en cambiar los hábitos de vida (abandono del hábito tabáquico, dieta saludable, ejercicio físico). Así mismo, la prescripción de un tratamiento farmacológico persigue la prevención de eventos cardiovasculares secundarios (antiagregantes como el ácido acetilsalicílico, fármacos tienopiridínicos como el Clopidogrel; estatinas; inhibidores de la enzima convertidora de la angiotensina (ECA)), así como mejorar la distancia en el perímetro de marcha (pentoxifilina, estatinas, Cilostazol). Sin embargo, como ya hemos comentado anteriormente, no hay evidencias que un tratamiento farmacológico tenga efecto sobre la patología descrita (5). 30 | I N T R O D U C C I Ó N B) Tratamiento quirúrgico o endovascular La revascularización quirúrgica y/o endovascular es a menudo el tratamiento de elección para estos pacientes, aun tratándose de un procedimiento invasivo y que conlleva una alta tasa de complicaciones (heridas quirúrgicas, infecciones, hematomas, trombosis). Dependiendo de la localización y extensión del segmento arterial afectado, hay que llevar a cabo una reconstrucción por angioplastia, stents, by-pass con injerto y otros dispositivos. De hecho, no siempre el problema isquémico queda resuelto definitivamente. Las recurrencias ateroscleróticas, las hiperplasias de la íntima y media vascular, o las trombosis postquirúrgicas obligan a una reintervención arterial a corto o largo plazo en el 30-50% de los pacientes operados (74). A pesar del dramático impacto social, las opciones de tratamiento para este tipo de pacientes son limitadas. No todos los pacientes con esta patología son candidatos para este tipo de intervenciones debido fundamentalmente a la localización distal de las obstrucciones o debido a la presencia de comorbilidades que los sitúa en mayor riesgo de muerte. No existe tratamiento etiológico de la aterosclerosis. Los objetivos terapéuticos tanto en la EAP como en la CLI son aliviar la sintomatología, particularmente el dolor, la mejora de la reología de la sangre y la microcirculación, la curación de las úlceras isquémicas, aumentar la actividad del paciente, mejorar su calidad de vida y evitar la pérdida del miembro afectado. Las diversas opciones del tratamiento farmacológico tienen su indicación de forma aislada en los estadios iniciales de la enfermedad, o bien asociadas a la cirugía revascularizadora en la fase de isquemia crítica. La terapia médica es limitada a una terapia antitrombótica (75). No existe suficiente nivel de evidencia que demuestre que tales fármacos afecten favorablemente el curso de la CLI (5). Por tanto, nuevas alternativas de revascularización son necesarias para estos pacientes sin opciones, para reducir el número de amputaciones y el impacto que éstas tienen en su calidad y esperanza de vida. INTRODUCCIÓN | 31 1.3. TERAPIA CELULAR COMO ALTERNATIVA TERAPÉUTICA En la actualidad, el tratamiento de las enfermedades está basado en el uso de medicamentos de formulación química tales como antibióticos, agentes químicos, drogas, fármacos y terapias sustitutivas. De acuerdo con la Ley de garantías y uso racional de los medicamentos, un medicamento de uso humano es toda sustancia o combinación de sustancias con propiedades para el tratamiento o prevención de enfermedades en seres humanos mediante una acción farmacológica, inmunológica o metabólica. ¿Qué ocurre si dicha acción la ejercen células de nuestro propio organismo? Recientes investigaciones han demostrado que el sistema más efectivo de reparación del cuerpo humano está representado por células troncales. Por definición, las células madre o troncales son capaces de dividirse y hacer copias de sí mismas indefinidamente (autorenovación). A su vez, bajo ciertas condiciones fisiológicas dan lugar a distintos tipos celulares (diferenciación) (76,77). Estas características las hacen imprescindibles tanto para sustituir a las células del cuerpo que han envejecido y se han perdido así como para la construcción del cuerpo en sí mismo durante el desarrollo (Figura 7). Figura 7: Características de las células troncales. La capacidad de auto-renovarse y de diferenciarse hacia células especializadas son las dos características principales de una célula troncal. 32 | I N T R O D U C C I Ó N Utilizar las reservas endógenas de células troncales como agentes terapéuticos es lo que propone la Terapia Celular actual. De este modo, la aplicación de células como una sustancia activa farmacológica busca restaurar el funcionamiento de los tejidos u órganos dañados a través de la protección de la integridad celular o por la reposición de las células dañadas. Esto puede realizarse bien por diferenciación celular (las células precursoras se diferencian a células más maduras, con la forma celular definitiva del tejido a regenerar) o bien mediante cultivo o expansión celular de la población celular de interés en el laboratorio. Las células troncales constituyen una importante fuente para ser utilizadas en Terapia Celular, pudiendo ser trasplantadas directamente en el sitio de la lesión o reclutadas mediante la estimulación de la síntesis de moléculas quimiotácticas. Enfermedades cardiovasculares (78), enfermedades inmunológicas (79), la diabetes y sus complicaciones (80–83), desórdenes neurodegenerativos (84), enfermedades inflamatorias como la enfermedad de Crohn (85), cáncer (86), etc…pueden verse beneficiadas por la Terapia Celular. Debido a la novedad, complejidad y especificidad técnica de las terapias basadas en el uso de células somáticas vivas, así como las que usan material genético recombinante e ingeniería de tejidos, el concepto de medicamento ha experimentado una importante modificación, al ser incluidos en lo que globalmente se denomina Terapias Avanzadas. Esta nueva clase de medicamentos ha supuesto igualmente una revolución en las agencias reguladoras, dándose casos de ensayos clínicos con células troncales que comenzaron aplicándose como procedimiento quirúrgico. Actualmente, los AMPs (Advanced Medicinal Products en inglés) se encuentran bajo una regulación específica, la cual se encuentra dirigida por el Comité de Terapias Avanzadas (CAT) de la Agencia Europea del medicamento (EMA, del inglés European Medicines Agency). De este modo, según las normativas implantadas por las agencias y autoridades sanitarias como la AEMPS (Agencia Española del Medicamento y Productos Sanitarios) y la EMA, el uso de células somáticas para terapia celular se consideran medicamentos de Terapias Avanzadas (Reglamento (CE) No. 1394/2007 del Parlamento Europeo y del Consejo de 13 de noviembre de 2007 sobre I N T R O D U C C I Ó N | 33 medicamentos de terapia avanzada y la Directiva 2001/83/CE del Parlamento Europeo) (87). Un medicamento de terapia celular presenta características que lo diferencian claramente de los fármacos convencionales obtenidos por síntesis química y que abarca desde el momento en que comienza su investigación hasta su utilización clínica y aspectos regulatorios. Estas diferencias hacen que muchos de los conceptos que tenemos sobre los fármacos de síntesis química no sean extrapolables a los medicamentos de terapias avanzadas y exige que sean considerados, a todos los niveles, como una clase muy diferente de medicamentos. Los medicamentos de terapia celular son los únicos en los que el componente activo son células vivas, y por lo tanto, las células son el producto, y no lo que éstas producen. Es complicado definir sus características farmacológicas dado que producen una cantidad variable y a menudo desconocida de moléculas bioactivas. Por tanto, la definición de la composición de un producto celular, sus mecanismos de acción, farmacocinética, toxicidad y eficacia representan desafíos nunca antes previstos en la farmacología convencional (87). En cualquier caso, los medicamentos de terapia celular tienen que seguir el mismo desarrollo que cualquier otro medicamento, que consta de varias fases (88)(Figura 8). 34 | INTRODUCCIÓN Figura 8: Esquema del desarrollo de un medicamento celular. Se muestran las principales fases del proceso (pre-clínica, clínica y comercialización), el tipo de evaluación clínica y de seguridad que se lleva a cabo en cada etapa, las normas y/o prácticas que deben cumplirse en cada fase, las agencias reguladoras y sus autorizaciones en cada parte del proceso así como la legislación asociada en las distintas etapas por la que pasa un medicamento celular. Así pues, las células troncales representan una nueva alternativa para la reparación y regeneración de tejidos, y una fuente prometedora para nuevas terapias. Sin embargo, aparte del trasplante de células madre hematopoyéticas (HSCs; del inglés hematopoietic stem cells), todos los demás tratamientos con células troncales están actualmente considerados como experimentales. Existen varios tipos de células troncales que están siendo usadas en investigación y en medicina regenerativa hoy día (83,89). El descubrimiento de las células troncales embrionarias (ESCs) hace unas décadas (90–92), hizo que se crearan esperanzas por considerarlas una fuente potencial de células inestimable. Las ESCs son células pluripotentes que derivan de la masa celular interna del blastocisto INTRODUCCIÓN | 35 durante la gastrulación y, aunque todavía existe cierto desconocimiento sobre los mecanismos que regulan su diferenciación hacia otro tipo de células y su estabilidad a lo largo del tiempo, investigadores y científicos están explorando formas de diferenciar ESCs en estirpes de gran interés médico y biológico (sistema nervioso, páncreas, corazón) puesto que todos ellos se regeneran pobremente en un intento de repararse después de un grave daño o de una enfermedad degenerativa. Otra alternativa que ha levantado mucha expectación y se baraja como una de las posibles vías de terapia celular es la reprogramación de células troncales adultas mediante las células pluripotentes inducidas (iPSCs, del inglés induced pluripotent stem cells). Ésta consiste en manipular una célula adulta y reprogramarla para que pierda su identidad y entre en un estado pluripotente, similar al de las células embrionarias sin necesidad de recurrir a óvulos ni embriones. Yamanaka y colaboradores (93) en el 2006 lo demostró mediante la introducción de cuatro genes en el ADN celular (Figura 9). Desde entonces, diversas investigaciones han obtenido los mismos resultados con la utilización de dos o tres genes o introduciendo en las células solamente las proteínas codificadas por los genes elegidos. Figura 9: Diagrama simplificado de la reprogramación de una célula adulta (fibroblasto) a célula pluripotente inducida (iPS). Sin embargo, los científicos se encuentran con una serie de adversidades que limitan, por ahora, la aplicación clínica de las ESCs y las iPS. La formación de tumores en los modelos animales utilizados; los problemas de histocompatibilidad; el uso de oocitos y embriones deben ser investigadas en profundidad antes de poder ser usadas para generar células troncales de interés en Terapia Celular y Medicina Regenerativa. 42 | INTRODUCCIÓN Sin embargo, la mayoría de los marcadores enumerados se encuentran igualmente en células fibroblásticas de cualquier tejido (120) y aunque moléculas como CD146 (121), STRO-1 y CD271 (122) han sido utilizadas para marcar estas células, hoy día sigue sin existir un consenso universal en el perfil de marcadores de expresión en superficie para las MSCs. Los efectos terapéuticos de las MSCs parecen basarse en sus propiedades paracrinas, inmunomoduladoras y en su capacidad de diferenciación (Figura 13). Figura 13. Propiedades de las MSCs. Las MSCs se caracterizan por secretar diversas moléculas bioactivas, poseen capacidad inmunorreguladora y han demostrado su capacidad de diferenciación a distintos tipos celulares. Aunque inicialmente se pensaba que la supervivencia de las MSCs, su injerto permanente y su diferenciación en células residentes del tejido dañado era necesario para obtener los efectos beneficiosos de dichas células, varias investigaciones y la experiencia clínica muestran que una de las principales funciones de las MSCs, si no la más importante, es secretar diversas moléculas bioactivas relacionadas con el microambiente en el que se encuentran inmersas. Las MSCs secretan una amplia variedad de citoquinas pro y anti-inflamatorias, quimoquinas, factores de crecimiento y prostaglandinas bajo condiciones de “descanso” e inflamatorias (123). Estas moléculas se encuentran asociadas con las diversas propiedades de las MSCs, como la inmunomodulación, antiapoptosis, I N T R O D U C C I Ó N | 43 angiogénesis, soporte del crecimiento y diferenciación de células madre y progenitoras, antifibrosis y quimioatracción. Otra característica de las MSCs es que poseen capacidad inmunorreguladora, y provocan efectos inmunosupresores en cierto número de ocasiones. Se les considera inmunoprivilegiadas por tener una baja expresión de MHC-HLA clase I, mientras que son constitutivamente negativas para HLA-clase II; así mismo, no expresan moléculas co-estimuladoras como CD80 (B7-1), CD86 (B7-2), CD40 y CD40L (124). Sin embargo, las MSCs comparten con el epitelio del timo marcadores de expresión de superficie como VCAM-1, ICAM-2, LFA-3, que son cruciales para la interacción con células T (124,125). Además, interfieren en diferentes vías de la respuesta inmune por medio de interacciones directas célulacélula y por la secreción de factores como indoleamina-2,3-dioxigenasa (IDO), TNFα, IL-6, IL-10, prostaglandina-E2, HGF, HLA-G5. Las MSCs permanecen en un estado quiescente mostrando propiedades antiapoptóticas y contribuyendo a la homeostasis. Sin embargo, en un ambiente inflamatorio como el creado por las citoquinas IFN-γ, TNFα, IL-1α e IL-1β, comienzan a ejercer sus habilidades de inmunomodulación a través de la polarización, inhibiendo la proliferación de células efectoras y su producción de citoquinas. In vitro, se ha observado que las MSCs inhiben la proliferación de células T, células B, células NK (natural killer) y células dendríticas (DC), produciendo lo que se conoce como bloqueo de la división celular. Por otra parte, las MSCs pueden detener una variedad de funciones celulares inmunes, como la secreción de citoquinas y la citotoxicidad de las células T y NK; la maduración de las células B y la secreción de anticuerpos; la maduración y activación de las células DC; así como la presentación de antígenos. Asimismo, las MSCs muestran otro papel en el contexto inmune/inflamatorio: cuando un tejido sufre una lesión o daño, las MSCs entran en la circulación sanguínea atraídas por citoquinas proinflamatorias de las áreas dañadas. Por esta razón, es por la que llaman a las MSCs “guardianas de la inflamación” (126). En este proceso interviene el citoesqueleto, moléculas de la matriz extracelular, contactos intercelulares, ligandos de adhesión y receptores entre otros (127). Aunque los mecanismos precisos por los que las MSCs migran a los sitios específicos y cruzan 44 | I N T R O D U C C I Ó N la barrera celular endotelial son prácticamente desconocidos, es lógico pensar que quimoquinas y sus receptores estén implicados. MSCs derivadas de distintos tejidos han demostrado su capacidad de diferenciación endotelial (128). Dicha diferenciación puede ser estimulada por factores de crecimiento como el VEGF y fuerza de rozamiento. Además, existe una compleja interacción “cross-talk” entre las MSCs y las células endoteliales (ECs). Las MSCs aumentan la proliferación y migración de las ECs, promoviendo los eventos tempranos de la angiogénesis y disminuyendo la permeabilidad de la monocapa de ECs. En co-cultivos directos de MSCs y ECs, las MSCs incrementaron la persistencia de vasos sanguíneos preexistentes en una manera dosis-tiempo dependientes. Dichos vasos permanecieron estables durante 10 días (129). Así mismo, se ha demostrado que el medio condicionado de MSCs también estimula la proliferación de ECs locales (130). Igualmente, además del contacto directo que manifiestan estas células, se ha especulado con una posible transferencia de mitocondrias o componentes vesiculares que contienen mRNA, microRNA y proteínas (131). Debido a las diversas propiedades y características de las que disponen estas células, las MSCs se presentan como potenciales candidatas para su utilización en terapia celular. En cuanto a las fuentes de obtención de MSCs, éstas han sido aisladas de una gran variedad de tejidos como MO, sangre periférica, cordón umbilical, tejido adiposo, placenta, pulmones, pulpa dental, membrana amniótica, tejido fetal entre otros. Posiblemente se encuentren en todos los órganos y tejidos post-natales (132), colaborando en la reparación y soporte de los tejidos, contribuyendo de esta forma a la homeostasis tisular. Aunque se desconoce su origen exacto, existen numerosas evidencias que apuntan a que las células progenitoras mesenquimales se encuentran localizadas en una zona perivascular (133) en un estado quiescente, asegurando así el mantenimiento de la homeostasis. Como hemos comentado anteriormente, la biología de las MSCs ha creado confusiones y controversias en torno a su nomenclatura, definición, aislamiento y criterios de caracterización, así como su relevancia in vivo y en cuanto a su INTRODUCCIÓN | 45 regulación ética e institucional de su uso clínico. En un intento por estandarizar estos estudios, la ISCT en 2006 estableció unos criterios mínimos. Estos estándares sin embargo, no han sido ampliamente aceptados y los criterios de aislamiento e identificación continúan variando, haciendo difícil la comparación entre estudios. MSCs de distintos orígenes, aunque disponen de un fenotipo similar, exhiben un alto grado de variabilidad relacionado con sus propiedades biológicas de diferenciación, autorenovación y secreción de factores entre otros (87). Diversas investigaciones reportan que éstas varían en cuanto a número según el método de aislamiento y obtención; se encuentran diferencias en sus capacidades proliferativas; diferente potencial de diferenciación; fenotipo alterado. Así mismo, existen suficientes evidencias para creer que las MSCs derivadas de pacientes con edad avanzada tienen limitada su eficacia terapéutica y algunos estudios sugieren que la diferencia entre los resultados preclínicos y clínicos se deben a la edad del donante. En la Tabla 5 se resumen las características biológicas de las MSCs y las diferencias encontradas en varios estudios que corroboran la diversidad existente en este tipo celular según su fuente de origen. Tabla 5: Diferencias principales entre las MSCs derivadas de médula ósea, tejido adiposo y cordón umbilical. BM-MSCs: Células troncales mesenquimales derivadas de médula ósea; AD-MSCs: células troncales mesenquimales derivadas de tejido adiposo; UCB-MSCs: células troncales mesenquimales derivadas de sangre de cordón umbilical. 46 | I N T R O D U C C I Ó N 1.3.3. ANTECEDENTES PRECLÍNICOS La administración de MSCs autólogas, alogénicas y xenogénicas derivadas de diversas fuentes tales como MO, sangre de cordón umbilical, membrana fetal y tejido adiposo han demostrado ser beneficiosas en modelos de ratón y rata con isquemia en sus miembros inferiores (14). A este respecto, existen estudios que apoyan que las MSCs ejercen propiedades angiogénicas debido a efectos autocrinos y paracrinos, y cuya intensidad parece depender de la fuente de obtención de dichas células. En un estudio comparativo de MSCs procedentes de la MO y MSCs derivadas de tejido adiposo, éstas últimas secretaron mayor cantidad de VEGF, factor de crecimiento de hepatocitos (HGF) y TGF-β (14). Así mismo, el medio condicionado de MSCs derivadas de tejido adiposo contiene niveles más altos de metaloproteasas (MMP3 y MMP9) y mostraron un aumento de la formación de tubos in vitro que las MSCs derivadas de MO (134). Además del trasplante de MSCs no modificadas, el efecto de MSCs expuestas a distintas condiciones y estímulos también ha sido investigado (135–139). Por ejemplo, bajo condiciones de hipoxia, como la generada en la isquemia, las MSCs producen más VEGF que en condiciones de normoxia, y el trasplante de estas células en el miembro isquémico de ratón conduce a un aumento de la densidad capilar. Un factor crítico es la dosis celular empleada así como la ruta de administración. En los estudios preclínicos consultados predomina el millón de MSCs como la dosis más utilizada, siendo la ruta intramuscular la más común (140). Así mismo, el momento de la administración celular en relación a la inducción de la isquemia y el número de zona/s de infusión también varía en los diferentes estudios publicados. Cabe destacar el trabajo realizado por Moon y colaboradores (140) donde la infusión celular se realiza a los 7 días después de la inducción de la isquemia, aspecto que lo diferencia de otras investigaciones donde la infusión celular se llevó a cabo antes de las 24 horas de la inducción de la patología. Prácticamente todos los estudios preclínicos han usado imágenes obtenidas mediante láser Doppler para evaluar la perfusión del miembro tratado, así como I N T R O D U C C I Ó N | 47 ensayos funcionales e histológicos para evidenciar la capacidad angiogénica de las MSCs. Aun así, no hay que olvidar que, aunque en modelos animales los resultados son prometedores, hay que ser cuidadoso en la interpretación de los resultados ya que los modelos no siempre reproducen con suficiente fidelidad la etiopatogenia y mecanismos de la enfermedad humana. 1.3.4. ANTECEDENTES CLÍNICOS La eficacia y los datos toxicológicos obtenidos de los ensayos e investigaciones preclínicas proporcionan una plataforma para el inicio de ensayos clínicos en seres humanos con células troncales, y por consiguiente, con MSCs. En el año 2002 se publicaron los resultados del estudio TACT (Therapeutic Angiogenesis using Cell Transplantion), por Tateishi-Yuyama y colaboradores (111). Dicho estudio demostró que la inyección intramuscular de la fracción mononucleada de células de MO (BM-MNCs) autólogas en las áreas afectadas en pacientes con isquemia unilateral de la pierna (25 pacientes) y 22 pacientes en los que se randomizó el tratamiento aplicado a cada pierna, mejoró significativamente el ITB, la ptcO2 y el dolor en reposo en todos los miembros que recibieron terapia celular derivada de MO. Los pacientes con una diabetes no controlada fueron excluidos. Desde entonces, se han llevado a cabo diversos estudios en los que la utilización de células procedentes de la MO han demostrado su eficacia con respecto a la mejora de la función endotelial de arterias en los territorios en los que se administran (141) y mejorías en la clínica del dolor isquémico así como en la cicatrización de úlceras por isquemia (142) (Tabla 6). 48 | INTRODUCCIÓN Tabla 6: Ensayos clínicos controlados y randomizados con células troncales para CLI BM-MNCs: células mononucleadas de médula ósea; IM: intramuscular; ITB: índice tobillo-brazo; tcpO2: presión transcutánea de oxígeno; PB-MNC: células mononucleadas de sangre periférica; G-CSF: factor estimulante de colonias de granulocitos; IA: intraarterial; ALDH: aldehído deshidrogenasa. N: número de pacientes. En 2006, Kim y colaboradores (143) utilizaron MSCs derivadas de cordón umbilical (UC-MSCs) alogénicas en 4 pacientes con enfermedad de Buerger. Tras su administración intramuscular, estas células mejoraron el tiempo de I N T R O D U C C I Ó N | 49 recuperación de las úlceras, aumentaron la perfusión en el miembro y aliviaron los síntomas del dolor en reposo. Lu y colaboradores (144) en 2011 compararon el efecto terapéutico de la administración intramuscular autóloga de BM-MSCs con BM-MNCs en 20 pacientes diabéticos con EAP severa. Los autores concluyeron que la tasa de curación de las úlceras fue significativamente superior en el grupo que fue tratado con BM-MSCs. Igualmente, las úlceras del grupo tratado con BM-MSCs sanaron 4 semanas antes que las tratadas con BM-MNCs. No se experimentó ningún tipo de reacción adversa en ninguno de los tipos celulares utilizados en este estudio. En 2012, Lee y colaboradores demostraron la factibilidad y seguridad del trasplante de AD-MSCs autólogas en pacientes con enfermedad de Buerger y pie diabético(145). En ese mismo año, Lasala y colaboradores publicaron los resultados de un ensayo clínico en fase II (#NCT00721006, www.clinicaltrials.gov), en el que se evaluaba la eficacia y seguridad de la administración intramuscular autóloga de una combinación de células troncales (MSCs y EPCs) en 26 pacientes con CLI bilateral. Actualmente, y según la búsqueda realizada en los registros de los Institutos Nacionales de Salud (NIH del inglés National Institutes of Health) en la base de datos de los ensayos clínicos registrados en ClinicalTrials.gov (www.clinicaltrials.gov) existen más de 500 ensayos clínicos relacionados con MSCs. En 2012, Wang y colaboradores reportaron 206, doblándose este número en la actualidad (146). Este abrumador crecimiento por parte de la comunidad científica apoya el remarcable potencial que acreditan estas células en el tratamiento de diversas enfermedades, posibilitando así su traslación de la investigación básica a la clínica. La mayoría de estos ensayos se encuentran todavía en sus fases iniciales (fase I, I/II, o II), los cuales incluyen estudios de seguridad y/o efectividad en un número limitado de pacientes. Esto nos demuestra que el uso terapéutico de las MSCs se encuentra cada vez más cerca, aunque aún hay esperar los resultados de dichos ensayos clínicos. En cuanto al uso de las MSCs como terapia celular en la CLI, se encuentran registrados 17 ensayos clínicos en todo el mundo, siendo Europa actualmente el 50 | INTRODUCCIÓN continente que se encuentra a la cabeza con 6 de ellos. De esos 17, sólo 6 se encuentran dirigidos a la población diabética, ya sea DM1, DM2 o ambas (Figura 14.A), tal y como muestran los criterios de inclusión de dichos ensayos. En relación al tejido fuente de obtención de las células para la terapia, 8 de los ensayos utilizan MSCs derivadas de la MO, 6 AdMSCs, 1 MSCs endometriales y 1 UCMSCs (Figura 14.B). Figura 14. A) Inclusión de población diabética en los ensayos registrados para la patología de CLI. B) Tejido fuente para la obtención de MSCs en los ensayos registrados para la CLI. (n=17). ND: No datos. UCMSCs: células mesenquimales procedentes de cordón umbilical. ERC: células endometriales. Fuente: www.clinicaltrials.gov. Aunque el uso de las MSCs para el tratamiento de CLI es un concepto terapéutico relativamente nuevo, existen numerosos datos disponibles de estudios preclínicos y recientes ensayos clínicos que avalan los efectos terapéuticos de las MSCs, así como su uso seguro y factibilidad. Por esta razón, la utilización de MSCs está tomando gran importancia a la hora de utilizar terapia celular para la regeneración vascular en patologías isquémicas. Por otra parte, el efecto antiinflamatorio, inmunomodulador y el carácter multipotencial de estas células han demostrado ser capaces de resolver casos puntuales para los que hasta ahora no se tenía una oferta terapéutica mejor. I N T R O D U C C I Ó N | 51 1.3.5 TERAPIA CELULAR EN LA ISQUEMIA CRÓNICA CRÍTICA: NUESTRA EXPERIENCIA Numerosos estudios han demostrado ampliamente que tanto la DM1 como la DM2 se asocian con una función dañada así como una reducción en el número de células progenitoras derivadas de la MO (147,148). Diversas investigaciones han concluido que factores de estrés metabólico, diferentes de la hiperglucemia, son también relevantes a este respecto. Las LDL oxidadas, las ERO y la incrementada concentración de ácidos grasos que tiene lugar en el paciente diabético afectan a la migración, proliferación y senescencia de las células progenitoras derivadas de la MO (147,149–151). Así mismo, se ha establecido que un aumento en la HbA1c se encuentra inversamente correlacionado con la proliferación, adhesión e incorporación en estructuras vasculares de las EPCs (148,152). En el año 2007, momento del diseño del ensayo en el que se basa esta memoria, existían muy pocos estudios realizados en población diabética con la patología que describimos en esta tesis. Debido a que la prevalencia de la EAP y por tanto de la CLI se encuentra incrementada en pacientes con DM, es lógico asumir que este grupo poblacional es candidato potencial a las terapias anteriormente sugeridas. Sin embargo, en la mayoría de los estudios publicados consultados en su momento, la exclusión de dichos pacientes en las diferentes investigaciones por las razones listadas anteriormente resultó ser bastante común. Bajo este contexto, y debido a la experiencia acreditada por nuestro grupo de investigación en relación con la DM y sus complicaciones asociadas, nuestro grupo de trabajo diseñó un ensayo piloto en 2008 (# NCT00872326 www.clinicaltrials.gov) el cual se basó en la extracción de células mononucleadas autólogas procedentes de la MO de pacientes diabéticos con CLI sin opciones de revascularización. La población celular fue concentrada en el laboratorio e infundida intraarterialmente en el área isquémica afectada, tal y como plantearon en 1999 Isner y Asahara (153) (Figura 15). De esta forma, se pretendía dar solución a alguno de los problemas planteados anteriormente comentados y que tienen lugar en los pacientes diabéticos, como son el reducido número de progenitores derivados de la MO y su reducida actividad migratoria. 58 | I N T R O D U C C I Ó N como el adiposo, sangre de cordón umbilical, pulpa dental, líquido sinovial y fluido amniótico entre otras. Todos estos tejidos varían en sus componentes celulares, señales y factores secretados, resultando en diferentes nichos fisiológicos. Aunque las MSCs aisladas y cultivadas de la mayoría de los tejidos comparten similares características inmunofenotípicas, han sido encontradas ciertas diferencias entre MSCs de distinto origen de acuerdo con datos obtenidos de experimentos ex vivo. d) Procedimiento expansión: Las MSCs son típicamente cultivadas en Dulbecco´s Modified Eagle Medium (DMEM) o alpha-MEM con la adición de suero fetal bovino (FBS, del inglés fetal bovine serum) como fuente de factores de crecimiento, citoquinas y mitógenos (184). Es por ello por lo que se debe valorar los aspectos de bioseguridad de los componentes del medio de expansión utilizado para el cultivo en laboratorio de MSCs. Para la aplicación clínica, la utilización de FBS puede conllevar ciertas dificultades. El uso de proteínas bovinas se asocia con el riesgo de transmisión de zoonosis y reacciones inmunológicas potenciales en el receptor, teniendo como consecuencia un rechazo de las células, especialmente tras tratamientos repetitivos (185,186). Existe una variabilidad entre los diferentes lotes de FBS y su procedencia, lo cual podría repercutir en el grado de proliferación y obstaculizar la reproducibilidad y consistencia del proceso de producción. Además, hay que tener en cuenta el riesgo de contaminación del FBS con micoplasma, virus y especialmente la encefalopatía espongiforme bovina. Aunque actualmente el uso de FBS está permitido bajo estrictos controles de calidad y seguridad, las agencias reguladoras cada vez más, abogan por una fuente alternativa cuando sea posible. Nuestro grupo ha desarrollado al respecto un medio químicamente definido, el cual se encuentra pendiente de patente. I N T R O D U C C I Ó N | 59 Teniendo en cuenta todo lo anteriormente descrito y a pesar de resultados prometedores, la terapia de regeneración celular aplicada a CLI mantiene importantes interrogantes en cuanto a efectividad y seguridad. Aunque las AdMSCs muestran una serie de propiedades únicas (liberación de factores, inmunomodulación, capacidad antiinflamatoria entre otros), en el momento actual se desconoce si en la población diabética la administración de AdMSCs autólogas es eficaz para promover la vasculogénesis en el miembro isquémico ya que existen muy pocos ensayos clínicos publicados relacionados. A este respecto, el diseño de un medicamento celular basado en AdMSCs para CLI supone todo un reto. Este trabajo de tesis tratará de describir los resultados alcanzados tras la utilización de un medicamento celular en pacientes diabéticos con la patología mencionada bajo el marco de un ensayo clínico en fase I-II. ………………………………………………… II. OBJETIVOS O B J E T I V O S | 63 Objetivo principal El objetivo principal de esta tesis y “end-point” primario del Ensayo Clínico con código de protocolo CeTMAd/ICPD/2008 y Nº de EudraCT: 2008-001837-88 es evaluar la seguridad y factibilidad del tratamiento regenerativo con células estromales mesenquimales autólogas derivadas de tejido adiposo subcutáneo y administradas por vía intraarterial en pacientes diabéticos con isquemia en miembros inferiores y sin posibilidades de revascularización ni alternativas terapéuticas dentro del marco de un ensayo clínico fase I-II. Objetivos secundarios - Selección y establecimiento de criterios de la población de estudio. - Obtención del medicamento celular: aislamiento, expansión, caracterización, dosis celular y envasado del producto celular bajo condiciones GMP. - Valoración de la idoneidad de las AdMSCs autólogas como agentes terapéuticos para esta patología. - Obtención de datos sobre la efectividad del tratamiento propuesto que nos permitan diseñar futuros Ensayos Clínicos para las complicaciones asociadas a la diabetes. III. PACIENTES Y METODOLOGÍA P A C I E N T E S Y M E T O D O L O G Í A | 67 3.1. CARACTERÍSTICAS DEL ESTUDIO 3.1.1. TIPO Y DISEÑO DEL ESTUDIO En esta memoria de tesis se describen los resultados del Ensayo Clínico registrado con código de protocolo CeTMAd/ICPD/2008 y Nº de EudraCT: 2008-001837-88, con el título “Uso de las células troncales mesenquimales de tejido adiposo (CeTMAd) como terapia de regeneración celular en el síndrome de isquemia crónica crítica de miembros inferiores en pacientes diabéticos”, así como las bases moleculares y celulares de una reacción adversa acontecida durante el desarrollo de dicho Ensayo. En este segundo aspecto, también han sido utilizadas células procedentes del Ensayo Clínico NCT01745744 (www.clinicaltrials.gov) “Estudio de la aplicación de Terapia de regeneración celular con células troncales mesenquimales derivadas de tejido adiposo en pacientes no diabéticos con isquemia crónica en miembros inferiores”. El protocolo fue aprobado por la Agencia Española del Medicamento y Productos Sanitarios (AEMPS) en 2009 y fue presentado y aprobado por el Comité Ético de Investigación clínica (CEIC) del Hospital Universitario Virgen Macarena de Sevilla. Ha sido financiado por el Instituto Carlos III (ISCIII) dentro de la convocatoria Acción Estratégica de Salud; Subprograma Estatal de Generación de Conocimiento, Proyectos de Investigación en Salud. Se realizó en el marco de colaboración de los siguientes entes públicos: FPSCABIMER, el Hospital Universitario Virgen Macarena de Sevilla y Hospital San Lázaro de Sevilla. Se trata de un estudio en fase I-II, prospectivo, multicéntrico, abierto, aleatorizado y controlado con grupos paralelos para 2 niveles de dosis, con el objetivo de valorar la seguridad y factibilidad de la infusión de células troncales mesenquimales administradas por vía intraarterial, en pacientes diabéticos con isquemia crónica crítica de miembros inferiores y sin posibilidades de revascularización ni alternativas terapéuticas. 74 | P A C I E N T E S Y M E T O D O L O G Í A Marzo de 2012 y Abril de 2015 para la continuación de los Ensayos Clínicos que se llevan a cabo en la misma desde 2008. En la actualidad, la UPC-CABIMER cuenta con un modelo optimizado de producción de MSCs obtenidas de tejido graso abdominal, destinadas a ser infundidas en pacientes con diferentes patologías que han sido reclutados en los Ensayos Clínicos en los que lleva participando desde 2008. Esta producción celular se realiza bajo una estricta calidad, sometiendo a controles continuos tanto el producto intermedio y final, como al personal, equipos, instalaciones, materiales y reactivos, condiciones imprescindibles que proporcionan la seguridad de cada uno de los pacientes tratados. Las instalaciones de la UAPC-CABIMER / GMP-CABIMER cuenta con dos áreas diferenciadas: -La primera de ellas, denominada área no clasificada, compuesta por el laboratorio de Control de Calidad, Almacén externo, Sala de citometría de flujo, Sala de microscopía y Sala de ultracongelación y criogenización. -La segunda, área clasificada (Laboratorio GMP), comprende más de 56 metros cuadrados y contempla las dos Salas de Producción Celular (salas de fabricación del medicamento), Sala de Envasado, dos Vestuarios y un Almacén. Todas las áreas cuentan con el equipamiento necesario para la producción de medicamentos estériles bajo normativa GMP. La UAPC-CABIMER está llevando a cabo 4 ensayos autorizados: 1. Uso de las células troncales mesenquimales de tejido adiposo (CeTMAd) como terapia de regeneración celular en el síndrome de isquemia crónica crítica de miembros inferiores en pacientes diabéticos. (Código protocolo: CeTMAd/ICPD/2008 - Número de EudraCT: 2008-001837-88) 2. Ensayo clínico multicéntrico fase I/II aleatorizado y controlado con placebo, para la evaluación de seguridad y factibilidad de la terapia con dos dosis distintas de células troncales mesenquimales autólogas de tejido adiposo (CeTMAd) en pacientes con esclerosis múltiple secundariamente progresiva, que P A C I E N T E S Y M E T O D O L O G Í A | 75 no responden adecuadamente a los tratamientos registrados. (Código protocolo: CMM/EM/2008 - Número de EudraCT: 2008-004015-35) 3. Ensayo clínico fase I/II multicéntrico, abierto y aleatorizado para el estudio del uso de las células troncales mesenquimales de tejido adiposo (CeTMAd) como terapia de regeneración celular en el síndrome de isquemia crónica crítica de miembros inferiores en pacientes no diabéticos. (Código protocolo: CeTMAd/ICC/2009 - Número de EudraCT: 2009-013554-32) 4. Ensayo clínico fase I/II multicéntrico, abierto, aleatorizado y controlado para el estudio del uso de las células madre como terapia celular en isquemia crítica del miembro inferior en pacientes diabéticos tipo 2 insulinizados: estudio de las necesidades de insulina. (Código protocolo: CeTMMoTa/ICPDI/2010- Número de EudraCT: 2010-019774-33). Por otro lado, en la actualidad, también se está llevando a cabo la implantación y desarrollo de nuevas técnicas y protocolos para poner en marcha nuevos Ensayos Clínicos. Concretamente, se está trabajando en el desarrollo de nuevos protocolos de producción de diferentes tipos celulares como productos procedentes de biopsias de piel entre otros y células madre hematopoyéticas y progenitores endoteliales. 3.2.5. EXTRACCIÓN DE LA MUESTRA BIOLÓGICA Antes de proceder a la extracción de la muestra, se comprobó que se disponía del consentimiento informado para realizar la toma de la muestra, previamente firmado por el paciente. La extracción de la muestra biológica se realizó según las especificaciones marcadas en el protocolo. En quirófano reglado del Hospital Virgen Macarena de Sevilla se procedió al lavado de la zona abdominal, región periumbilical. Posteriormente, se pintó con líquido antiséptico (povidona yodada). A continuación, se infiltró la zona con anestésico local, tipo mepivacaina al 3%, sin vasoconstrictor, utilizando aguja gold, nº 27g biselada. Se reseccionaron 4x2 centímetros de tejido adiposo, incluyendo piel, en zonas arriba mencionadas, ya 76 | P A C I E N T E S Y M E T O D O L O G Í A fuera en una única o varias piezas, de modo que la muestra total fue > 30 gramos. Se introdujo la/s muestra/s en recipientes estériles, con suero fisiológico y se cerró el panículo adiposo con puntos de Dexon y piel con puntos de seda con aguja TB 15. 3.2.6. TRANSPORTE Y RECEPCIÓN DE LA MUESTRA BIOLÓGICA La fase de transporte de la muestra se realizó de manera inmediata en el momento de su obtención desde el Hospital a la UAPC de CABIMER, por personal de transporte autorizado. Asimismo, el proceso de transporte de la muestra fue previamente validado según procedimiento interno de la UAPC de CABIMER. La recepción de la muestra fue realizada por personal formado y autorizado de la UAPC de CABIMER, el cual verificó la integridad del envío, del envase y de la documentación anexa recibida, así como la trazabilidad de la muestra. 3.2.7. PROCESAMIENTO DE LA MUESTRA BIOLÓGICA DE TEJIDO ADIPOSO Y OBTENCIÓN DE CÉLULAS ESTROMALES (ADMSCS) La muestra recibida del hospital se introdujo en el área estéril de la UAPC de CABIMER. Todo el proceso de preparación de las muestras a partir de este momento se realizó en condiciones GMP, siguiendo el protocolo de Fabricación (P- FAB) correspondiente de la UAPC de CABIMER. En un primer paso, se realiza una disgregación mecánica: la muestra de tejido adiposo se coloca en una placa de Petri con la ayuda de pinzas estériles desechables. Se seleccionan los fragmentos de tejido que contengan menos vasos sanguíneos y tejido conjuntivo con ayuda de bisturí estéril y pinzas. Para limpiar la muestra, se utilizó solución salina (PBS; Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO, USA), y se repitió el lavado las veces que fueron necesarias hasta obtener una muestra limpia. Los fragmentos de tejido seleccionados se pasaron a un tubo Falcon de 50 ml. A continuación se realizó una pesada de la muestra en una balanza de precisión, previamente calibrada mediante procedimiento interno. Posteriormente, se dividió la muestra en los tubos Falcon necesarios (aproximadamente de 5 a 10 gramos de P A C I E N T E S Y M E T O D O L O G Í A | 77 muestra en cada tubo). Seguidamente, se pasó la muestra a tubos IKA para la disgregación de la muestra mediante el equipo Ika Ultra Turrax Tube Drive (IKA- Werke, Staufen, Alemania). Posteriormente, se sometió a la muestra a una digestión del tejido adiposo por colagenasa (Roche, Indianapolis, IN). Para ello, se preparó el medio de digestión en una proporción 1:1 (v/p) de DMEM (Dulbecco´s Modified Eagle´s Medium bajo en glucosa; Sigma Aldrich) y Colagenasa A (Roche). Se pasó la muestra dividida a tubos tipo Falcon y se añadió 1 ml de medio de digestión por cada 0.5 gramos de muestra de tejido adiposo homogeneizado. Posteriormente, se limpiaron los tubos IKA Ultra Turrax Drive (IKA-Werke) con medio de digestión. Se colocaron los tubos en un agitador el cual fue introducido en incubador de CO2 a 37ºC, durante 2 horas y 30 minutos. Para inactivar la acción de la colagenasa, una vez transcurrido el tiempo de incubación, se añadió medio de expansión, formado por DMEM bajo en glucosa, 2% Glutamax 200 mM, 10% suero fetal bovino (FBS), 1% penicilinaestreptomicina y 1% L-glutamina (todos de Sigma-Aldrich) en una proporción 1:1 respecto al medio de digestión. A continuación, se realizó una centrifugación a 1000 rpm, 10 minutos a 20ºC. Posteriormente a la centrifugación, se procedió a la filtración para la obtención de las células estromales. Esto se llevó a cabo retirando la fase superior y filtrando la fase semisólida por un filtro cell strainer de 100 μm con ayuda de PBS estéril. Se retiró el sobrenadante y se pasó el pellet celular de la centrifugación al tubo donde se había filtrado la fase semisólida. A continuación, se centrifugó a 1000 rpm, 10 minutos a 20ºC. Se retiró el sobrenadante y se resuspendió el pellet celular. La identificación y contaje de células estromales viables se realizó en cámara de Neubauer con líquido de Türck (Sigma-Aldrich) y con trypan blue (Sigma Aldrich) para identificar las células estromales viables. Posteriormente, se sembraron en flasks a una concentración entre 120.000-160.000 cél/cm2 y se incubaron a 37ºC, en una atmósfera de 5% CO2 y 95% de humedad relativa. 78 | P A C I E N T E S Y M E T O D O L O G Í A 3.2.8. MANTENIMIENTO Y EXPANSIÓN CELULAR Pasadas aproximadamente 24 horas de la primera siembra, se retiró el medio con pipetas serológicas para descartar las células que no se habían adherido y aquellas que por cualquier circunstancia no eran viables, se realizó un lavado del cultivo con PBS, y se añadió medio fresco. Esta operación se realizó cada 2-3 días. 3.2.9. PASES CELULARES Se realizaron hasta conseguir un determinado porcentaje de confluencia en el cultivo celular (≥ 80%). Se retiró el medio de los flasks/factorías (NUNC) y se realizó un lavado con PBS. A continuación, se añadió suficiente tripsina (Gibco BRL, Grand Island, NY, USA) para que la superficie del flask/factoría quedara totalmente cubierta y se dejó actuar durante 5 minutos a 37ºC. Se observaron las células al microscopio para comprobar que las células se habían despegado de la superficie del flask/factoría y se neutralizó el efecto de la tripsina añadiendo medio de expansión. Posteriormente, se llevó a cabo una centrifugación a 1000 rpm, 10 minutos, 20ºC. Se retiró el sobrenadante con pipeta serológica y se realizó un contaje celular con Trypan Blue para calcular el número de células viables obtenidas. Se resembraron las células a una concentración entre 3500 y 5000 células/cm2, y se incubaron a 37ºC, 5% CO2, 95 % Hr. Se realizaron los pases que fueron necesarios para obtener la dosis fijada por el promotor del ensayo, siempre que no se sobrepasasen los 7 pases. 3.2.10. BANCO CELULAR MAESTRO (BCM) El BCM se define como el conjunto de células esencialmente idénticas a las del tejido de origen y que se encuentran en una fase de producción lo más cercana a Pase 0 “in vitro” desde la preparación inicial. Esto nos permitiría reproducir el proceso nuevamente si fuese necesario. La obtención de una muestra para su almacenamiento en el BCM se realizó una vez obtenido el cultivo primario. Para ello, cuando se obtuvieron un número de células P A C I E N T E S Y M E T O D O L O G Í A | 79 suficientes para poder continuar con la expansión de las células restantes entre el Pase 0 y el 3, se congeló un vial con 106 células en nitrógeno líquido a -196ºC, siguiendo el protocolo normalizado de trabajo (PNT) correspondiente de la UAPC de CABIMER. 3.2.11. ENVASADO DEL PRODUCTO FINAL Y OBTENCIÓN DE LA MUESTRA DE RETENCIÓN Se realizó el mismo procedimiento que un pase celular. Se centrifugaron las células a 1000 rpm, 10 minutos a 20ºC y se realizó por triplicado el contaje celular. Se separaron 106 células como muestra de retención que se congelaron en nitrógeno líquido siguiendo el PNT correspondiente de la UAPC de CABIMER. Se calcularon y separaron en un tubo Falcon el número de células requerido para la dosis a infundir. El sobrante de las células se desechó. Se centrifugó a 1000 rpm, 10 minutos a 20ºC. Se retiró el sobrenadante con pipeta serológica y se resuspendió el pellet en medio de envasado, formado por Ringer Lactado, 2,5% de glucosa al 5% y 1% de albúmina humana (todos de Grifols, Barcelona, España). Se cargaron la/s jeringa/s con tapón luer lock mediante aguja de 120 mm de largo. Se cerraron las jeringas en condiciones de esterilidad. Una vez cerradas, se introdujeron en una bolsa estéril que se pasó por la esclusa presurizable (SAS) de salida a la Sala de Recogida de Lote envasado de la UAPC de CABIMER. En dicha sala, se introdujeron estas bolsas en otras bolsas de autoclave y se sellaron para su posterior envío al hospital. 3.2.12. CONTROLES DE CALIDAD DURANTE EL PROCESO DE FABRICACIÓN Se establecieron controles de calidad (CC) a lo largo de todo el proceso aséptico de fabricación del M.E.I. para comprobar que el cultivo de AdMSCs era de una pureza establecida (fenotipo y diferenciación celular), era estable genéticamente (cariotipo) así como para verificar la inexistencia de contaminación (detección de micoplasmas, endotoxinas y análisis de esterilidad) (187). 80 | P A C I E N T E S Y M E T O D O L O G Í A a) Fenotipo celular Se realizó fuera del área estéril. Una alícuota con suspensión celular (2,5 x 105-5 x 105) se facilitó desde el interior de la sala de producción. En el laboratorio de Control de Calidad, se enumeraron los tubos de citometría (11 en total). Se les añadió 100 μl de suspensión celular a cada tubo (concentración celular por tubo de 2 x 104 – 5 x 104). Se añadieron 5 μl de anticuerpo (Beckton- Dickinson, San Diego, CA, USA) a los tubos correspondientes según el siguiente orden: Tubo 1- Isotipo FITC IgG1, κ Tubo 7- CD34 PE Tubo 2- Isotipo FITC IgG2a, κ Tubo 8- CD45 FITC Tubo 3- Isotipo PE IgG1, κ Tubo 9- CD73 PE Tubo 4- CD13 PE Tubo 10- CD90 FITC Tubo 5- CD29 FITC Tubo 11- HLA II FITC Tubo 6- CD31 FITC Se incubaron durante 20 minutos en oscuridad a 4ºC. A continuación se añadió 3 ml de PBS a cada tubo y se centrifugaron a 1000 rpm, durante 10 minutos. Se descartó el sobrenadante y se resuspendieron en 300 μl de PBS. Se analizaron en la siguiente hora en el citómetro de flujo FACS Calibur (BD). Los criterios fenotípicos fijados por las UAPC de CABIMER de los resultados son: Marcadores positivos (≥ 80%): CD13, CD29, CD73, CD90 Marcadores negativos (≤ 10%): CD31, CD34, CD45, HLA II b) Diferenciación celular Las AdMSCs se caracterizan, entre otras cosas, por diferenciarse al linaje mesodérmico. En la UAPC de CABIMER, el control en proceso de diferenciación se realizó diferenciando el cultivo celular a adipocitos y osteocitos. Para ello, se separaron de la suspensión celular un total de entre 15x104 y 20x104 células en medio de expansión por placa Petri de 35mm. PACIENTES Y METODOLOGÍA| 81 b.1) diferenciación osteogénica: en la sala de producción estéril se sembró la suspensión celular anteriormente mencionada en placas Petri de 35 mm (se realizó por duplicado). Se incubaron a 37ºC, 5% CO2, 95% Hr. Se cultivaron con el medio de diferenciación Osteogenic Differentiation Medium (Lonza, España) y se siguieron las instrucciones del fabricante. Análisis de la diferenciación osteogénica: Se utilizó una solución de trabajo de Alizarin Red (Sigma-Aldrich) (Alizarin Red al 2% en agua destilada). Se ajustó el pH a 4,2. Se añadieron 2-3 ml de solución de trabajo. Se dejó reposar 20 minutos. Se observaron al microscopio. La matriz extracelular quedó teñida de naranja-rojo. b.2) diferenciación adipocítica: para la diferenciación in vitro de las MSCs al linaje adipogénico, las células fueron cultivadas en medio de diferenciación Adipogenic Differentiation Medium (Lonza, España) y en las condiciones de cultivo recomendadas por el fabricante. Las células se cultivaron a una densidad de 160.000 cél/cm2 en placas de 35 mm durante 14 días, cambiando el medio cada 2- 3 días por medio fresco de diferenciación. Análisis de la diferenciación adipogénica: Se utilizó el colorante liposoluble Oil Red O (Sigma-Aldrich) para la detección de triglicéridos, ácidos grasos y lipoproteínas intracelulares. Este colorante da una tinción rojiza. Protocolo de tinción: - Retirar medio de diferenciación. Lavar las células con PBS - Fijar con paraformaldehído al 4% durante 20 minutos - Lavar con PBS - Preparación de solución stock de Oil Red O al 5% - Preparación de solución de trabajo (6 ml de solución stock + 4 ml de agua destilada). Dejar reposar y filtrar. - Añadir 2-3 ml de la solución de trabajo y mirar al microscopio. Las gotas lipídicas de los adipocitos quedan teñidas de rojo. 82 | P A C I E N T E S Y M E T O D O L O G Í A c) Cariotipo celular El estudio se lleva a cabo en células con división activa, es decir en metafase. Mediante el estudio del cariotipo es posible detectar anomalías en el número o la forma de los cromosomas. Este control lo realizó un servicio externo, previamente contratado y homologado por la UAPC de CABIMER. En el interior del área estéril, se prepararon 3 flasks de 25 cm2 sembrados con la concentración celular requerida por el centro de análisis con medio de expansión, realizándose cambios de medio de 2-3 veces por semana hasta su envío al centro de diagnóstico. d) Esterilidad La esterilidad se define como la ausencia de organismos vivos. Este ensayo busca determinar contaminantes microbianos como bacterias, hongos y levaduras en el medio de cultivo utilizado en la expansión celular de nuestro M.E.I. Se realizó de acuerdo a la Farmacopea Europea (20601) por el método de inoculación directa en aislador según queda establecido en las NCF. Se realizó en condiciones asépticas, pero procurando que las precauciones para evitar la contaminación no afecten a los microorganismos cuya presencia deban ponerse de manifiesto en el ensayo. Las muestras (sobrenadante del cultivo celular) se inocularon en medios de crecimiento que contenían inhibidores de antibióticos como la penasa. Se utilizó medio de tioglicolato para detectar anaerobios y aerobios facultativos y medio de triptona soja para los aerobios estrictos y hongos. Condiciones de incubación: Medio Temperatura Tiempo Tioglicolato 35ºC 14 días Triptona soja 22ºC 14 días P A C I E N T E S Y M E T O D O L O G Í A | 83 e) Endotoxinas Sirve para detectar pirógenos endotóxicos de bacterias gran negativas. Estos agentes microbianos juegan un papel fundamental ya que pueden ser adquiridos por el producto en cualquier fase de su producción alterando la calidad del fármaco final. El ensayo se realizó por la técnica de gelificación: ensayo límite (Farmacopea Europea 20614). El límite de endotoxinas de los principios activos administrados por vía parenteral, es igual a K/M, donde K= dosis pirógena umbral de endotoxina por kg de masa corporal por hora. Según Farmacopea K= 5 EU/kg x h (EU=Unidad de Endotoxina) y M= dosis máxima recomendada de producto por kg de masa corporal por hora. Como valor extremo para un volumen de 40 ml y peso de paciente de 40 kg sería 1ml/kg x h. El límite de endotoxina establecido es de 5 EU/ml. f) Micoplasma La contaminación de micoplasmas en cultivos celulares puede inducir efectos citogéneticos, disminución en las concentraciones de nutrientes, alteración de la morfología celular, modulación de la respuesta inmune e incluso interrupción del metabolismo celular. Se realizó de acuerdo a la Farmacopea Europea (20607) mediante amplificación de ácido nucleico (PCR) con el kit comercial Venor GeM (Minerva Biolabs GmbH, Alemania). El ensayo está validado según la farmacopea frente al método de referencia: detección de micoplasma por el método de cultivo (187). 3.2.13. PARÁMETROS DE INFUSIÓN DEL PRODUCTO CELULAR Tras comprobar y asegurar que el M.E.I. cumplía con todos los criterios establecidos de medicamento celular, éste fue recepcionado en el centro hospitalario para su infusión en los pacientes incluidos en el ensayo aleatorizados en los grupos experimentales. La infusión se realizó en quirófano reglado del 90 | PACIENTES Y METODOLOGÍA c) Escala visual analógica de dolor (EVA) Se evaluaron los cambios producidos en la intensidad del dolor por parte del paciente durante el estudio mediante la escala EVA. Dicha escala consistió en que el paciente marcó en un escala de 0 a 10 la intensidad del dolor, siendo 0 considerado como “no dolor” y el 10 como “dolor insoportable”. d) Perímetro gemelar El perímetro gemelar de los pacientes que participaron en el estudio fue medido en cada visita para observar los posibles cambios producidos a lo largo del estudio atribuible al aumento de la circulación colateral del miembro diana. 3.5.3. SEVERIDAD DE LA ENFERMEDAD a) Clasificación Rutherford-Becker (RB) Se evaluó la severidad de la isquemia del miembro diana, comparando los valores basales con los obtenidos a lo largo del estudio. Los pacientes fueron categorizados según la Clasificación de Rutherford-Becker (54)(Tabla 12). Tabla 12: Clasificación de Fontaine-Rutherford-Becker. CI: claudicación intermitente P A C I E N T E S Y M E T O D O L O G Í A | 91 En 1997 Rutherford modificó la Clasificación de Fontaine existente, añadiendo una serie de criterios objetivos, clasificando a los pacientes en 4 grados (desde grado 0 a grado III) y en 7 categorías. En la Tabla 10 se muestra la clasificación de RB la cual tiene su correspondencia con la escala de Fontaine. b) Índice Tobillo-Brazo (ITB) Se evaluaron los cambios producidos durante el estudio en los valores del ITB para todos los pacientes. El índice, en los casos en que pudo ser cuantificado, se calculó mediante la siguiente fórmula: Los valores de ITB fueron presentados como sigue: ITB bajo: se consideró a los valores menores de 0,9 ITB normal: los valores comprendidos entre 0,91 y 1,2 ITB anormal: los valores mayores de 1,2 c) Presión transcutánea de oxígeno (TcpO2) Las mediciones se realizaron en posición supina del paciente usando un monitor de oxígeno (TCM400 Radiometer, Copenhagen, Dinamarca). Interpretación de los valores de la TcpO2: Valores bajos < 20 mmHg Valores medios: entre 20-40 mmHg Valores normales: >40 mmHg Presión arterial sistólica (PAS) de la arteria pedia o tibial inferior ITB= -------------------------------------------------------------------------------------------- Presión sistólica de la arteria braquial 92 | P A C I E N T E S Y M E T O D O L O G Í A 3.6. INVESTIGACIÓN DE LA REACCIÓN ADVERSA 3.6.1. ANÁLISIS DE MUESTRAS BIOLÓGICAS Muestras sanguíneas. Se utilizaron muestras de suero humanas de pacientes diabéticos y no diabéticos con CLI, así como de voluntarios sanos. Fue requerido el consentimiento informado de todos los sujetos. 3.6.2. TÉCNICAS DE BIOLOGÍA CELULAR Y MOLECULAR a) MSCs de tejido adiposo. Las AdMSCs fueron aisladas mediante biopsias abdominales de pacientes diabéticos y no diabéticos con CLI incluidos en dos ensayos clínicos independientes (EudraCT: 2008-001387-88 and EudraCT: 2009- 013554-32). Las células mesenquimales control fueron adquiridas de la ATCC (American Type Culture Collection). Fueron cultivadas en medio basal de MSCs (MSCBM, Lonza, Barcelona, España) complementado con factores de crecimiento (GS: MSCGM SingleQuots, Lonza), 100 unidades/ml de penicilina-estreptomicina e incubadas a 37ºC, 20% O2 y 5% CO2. Inicialmente, las células se sembraron a una densidad de 5 x 104 cél/cm2. A las 24 horas se reemplazó el medio basal por un medio libre de factores de crecimiento (serum/GS free MSCBM Lonza) y 24 horas después con medio basal suplementado con factores de crecimiento (Control), suero humano sano (SS), suero humano diabético (SD) o suero humano no diabético (SND). Los sobrenadantes fueron recogidos para realizar análisis ELISA. La extracción de ARN se realizó en células que habían permanecido 24 horas después de la adición de suero. b) Transcripción inversa. Se realizó a partir de 2 μg de ARN total de cada muestra, utilizándose para la síntesis del ADNc la enzima MMLV (Promega Biotech, Alcobendas, España) según las instrucciones del fabricante. c) PCR (reacción en cadena de la polimerasa) cuantitativa (QT-PCR). La q-PCR se realizó en el termociclador 7500 Real Time PCR System (Applied Biosystems) utilizando SensiFAST SYBR Lo-ROX Mix (Bioline Reagents Ltd). Los cebadores P A C I E N T E S Y M E T O D O L O G Í A | 93 utilizados para tPA y PAI-1 se diseñaron usando el software Primer3 (http://frodo.wi.mit.edu/primer3/) y fueron obtenidos bajo pedido. Como controles endógenos se utilizaron PPIA y RPLP (Tataabiocenter). d) Evaluación de los niveles de secreción de tPA y PAI-1. Los niveles totales de tPA (libre y complejo) y de PAI-1 (formando complejo activo con tPA y latente inactivo) secretados en el medio de los distintos grupos experimentales (SS, SD y SND) fueron cuantificados usando placas de ELISA pre-tratadas (Bender MedSystems, Viena, Austria) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. e) Gel de fibrina. Se prepararon según se ha descrito en bibliografía (166). Se añadió 1 ml de medio libre de factores de crecimiento o con SS, SD, SND. Los geles fueron fijados con formalina y teñidos con tinción hematoxilina-eosina. f) Dímero-D. Se detectó usando el kit Blue D-Dimer (Teco, Neufahrn, Alemania) en el medio recogido de los geles de fibrina a las 24 horas. 3.7. ANÁLISIS ESTADÍSTICO 3.7.1. DATOS DEMOGRÁFICOS Y BASALES Se realizó un análisis descriptivo de todas las variables demográficas recogidas así como de los datos clínicos previos al inicio del tratamiento. Las variables cualitativas se expresaron mediante frecuencias absolutas y porcentajes, mientras que las variables cuantitativas se presentaron a través de las media, mediana, desviación típica, máximo, mínimo y número de observaciones. 3.7.2. ANÁLISIS DE LA SEGURIDAD Se calcularon el número y porcentaje de pacientes que abandonaron el estudio debido a acontecimientos adversos, los pacientes que han experimentado al menos un acontecimiento adverso, los acontecimientos adversos más frecuentes y los pacientes que han experimentado al menos un acontecimiento adverso grave. 94 | P A C I E N T E S Y M E T O D O L O G Í A 3.7.3. ANÁLISIS DE EFICACIA Los parámetros cuantitativos obtenidos del análisis de imagen con “MetaMorph Image System v.7.7.0” se compararon entre el día 1 (día de administración de la terapia celular), el mes 6, y el mes 12, mediante el test t-test para muestras pareadas si la variable cumplía los requisitos de normalidad y mediante el test de Wilcoxon para muestras pareadas en otro caso. Las variables secundarias de eficacia, como son ITB, tamaño de la úlcera, TcpO2, grado Rutherford-Becker y perímetro gemelar se analizaron del mismo modo que la variable principal de eficacia, comparando sus valores basales con los obtenidos en los meses 6 y 12. 3.7.4. REACCIÓN ADVERSA Los datos fueron representados como valores medios ± error estándar (SEM), y se analizaron mediante el test one-way and two-way ANOVA. El test de Tukey fue usado para las comparativas. Los valores de P ≤0.05 fueron considerados estadísticamente significativos. IV. RESULTADOS RESULTADOS| 97 4.1. CARACTERÍSTICAS DE LA POBLACIÓN ESTUDIADA De acuerdo con los criterios de inclusión del ensayo, la población del estudio se compuso inicialmente de 35 pacientes diabéticos (DM1 y DM2) con CLI de al menos un miembro inferior y sin posibilidades de revascularización. En el transcurso del ensayo se dieron 5 interrupciones prematuras al presentar los pacientes algunos de los criterios de exclusión que tuvieron como consecuencia su retirada del ensayo. Por tanto, se consideraron evaluables los 30 pacientes que finalizaron el estudio, de los que 10 formaban el grupo experimental 1 (infusión celular de 0,5 x 106 células/kg peso paciente); 10 pertenecían al grupo experimental 2 (infusión celular de 1 x 106 células/Kg peso paciente) y 10 representaban al grupo control (siguieron con su tratamiento convencional). La aleatorización de los grupos de tratamiento se detalla en la Figura 19. Figura 19: Diagrama ilustrativo de la randomización, seguimiento y análisis de los pacientes incluidos en el ensayo. IAM: infarto agudo de miocardio. 98 | R E S U L T A D O S La edad media de los 30 pacientes incluidos en el estudio fue de 66,3±10,5 (edades comprendidas entre 43 y 84 años). De los 30 casos analizados, 24 eran hombres (80%) y 6 mujeres (20%) con un cociente de varones-mujeres de 4:1. La mayoría de los pacientes presentaron DM2 (96,6%), excepto un paciente que presentó DM1 (P22). 21 pacientes (70%) se encontraban insulinizados, 17 de ellos (56,6%) en combinación con antidiabéticos orales (ADO). 9 pacientes (30%) recibían como único tratamiento para la diabetes ADO. De los pacientes incluidos en el estudio, el 86,6% presentó enfermedad macrovascular asociada importante, concretamente: 10 pacientes (33,3%) habían sufrido un accidente cerebrovascular (ACV) y 16 (53,3%) tenían un historial de cardiopatía isquémica. Asimismo, varios pacientes presentaban complicaciones microvasculares severas: retinopatía en 14 pacientes (46,6%), nefropatía diabética en 8 pacientes (26,6%) y neuropatía diabética en 15 pacientes (50%). En relación a los factores de riesgo que predisponen a la isquemia crónica crítica de los miembros inferiores, además de la diabetes, 25 casos (83,3%) presentaban HTA y 25 casos dislipemia. En cuanto al hábito tabáquico, la mitad de los pacientes del estudio han sido fumadores (15 casos, 50%) y 5 pacientes (16,6%) seguían fumando en el momento del estudio. El 100% de los pacientes incluidos en el ensayo presentaban un cuadro severo de la patología: 20 pacientes (66,6%) fueron clasificados con grado II en la Escala de RB (dolor en reposo) y 10 (33,3%) con grado III (pérdida tisular en mayor o menor medida). El grupo control fue el que más pacientes en grado II registró (80% vs. 60%). En cuanto a las úlceras, 10 pacientes en total (33,3%) las presentaron al inicio del ensayo. 24 pacientes (80%) presentaban afectación de ambas extremidades por la patología, mientras que el 19,9% tenían sólo una extremidad afectada (13,3% extremidad derecha; 6,6% extremidad izquierda). 10 pacientes (33,3%) habían sufrido una angioplastia (ATP) y/o implantación de stent en el miembro RESULTADOS| 99 considerado diana para la terapia celular, mientras que 6 tenían un by-pass (Tabla 13). Tabla 13: Características basales de la población del estudio ADO: antidiabéticos orales; ACV: accidente cerebrovascular; IRC: insuficiencia renal crónica; HTA: hipertensión arterial; MD: miembro diana; ATP: angioplastia transluminal percutánea 106 | RESULTADOS 4.4.3. AAS RELACIONADOS CON EL MEDICAMENTO EN INVESTIGACIÓN Se registraron 2 reacciones adversas, que a juicio clínico y del promotor, podrían relacionarse con la naturaleza del medicamento celular y el procedimiento/forma de la infusión del producto utilizado en la terapia celular. Dos pacientes (P02 y P09) desarrollaron microtrombosis distal en las 24 horas siguientes a la infusión celular. Ambos requirieron terapia antitrombótica para su estabilización y posteriormente, fueron dados de alta (ver apartado 4.6). Uno de ellos (P02) fue excluido del ensayo posteriormente por causas no relacionadas ni con el tratamiento celular ni con la reacción experimentada según fue determinado a juicio clínico y del promotor. 4.5. RESULTADOS DE EFICACIA Todos los análisis de eficacia fueron exploratorios, ya que inicialmente el ensayo no fue diseñado para detectar diferencias entre los grupos de tratamiento en los parámetros de eficacia. 4.5.1. EVALUACIÓN DE NEOVASCULARIZACIÓN Se evaluaron los cambios producidos en el grado de angiogénesis y/o vasculogénesis en el miembro diana. a) Análisis cualitativo: Dos expertos independientes analizaron las angiografías y valoraron cualitativamente la vascularización de los pacientes según grados 0, +1, +2 y +3. (Figura 25). Figura 25: Imágenes representativas de las angiografías en el momento basal y a los 6 y 12 meses posteriores a la infusión celular. RESULTADOS| 107 Si bien ninguno de los pacientes presentó el grado 3 de vascularización, en el 20% de los pacientes de cada grupo experimental se observó un aumento de la vascularización en el miembro infundido después de los 6 meses de recibir el medicamento celular. Dichos pacientes mantuvieron ese nivel de vascularización al año de seguimiento. Además, el 10% del grupo experimental 1 y el 20% del grupo experimental 2 experimentaron un aumento de la vascularización observable a los 12 meses de ser infundidos con las células. Ningún paciente sufrió una disminución de la graduación según la escala de vascularización comentada (Tabla 15). Tabla 15: Valoración cualitativa de las angiografías 0: nula o mínima ramificación; +1: débil ramificación que no sobrepasa 1/3 de la distancia entre la arteria infrapoplitea principal y la superficie del miembro; +2: ramificación arterial que abarca el tercio medio de la distancia entre la arteria infrapoplitea principal y la superficie del miembro; +3: rica ramificación arterial desde la arteria principal infrapoplítea que se extiende hasta la superficie del miembro. ND: no datos. +: aumento. 108 | R E S U L T A D O S Un 30% de los pacientes del grupo experimental 1 y un 50% de los pacientes del grupo experimental 2 no presentaron cambios en su circulación colateral observable cualitativamente en las angiografías. En un 40% de los pacientes del grupo experimental 1 no se recibió la imagen de la angiografía en alguno de los periodos de post-infusión y no pudo ser valorado. En el grupo 2, esto ocurrió en el 10% de los pacientes. b) Análisis cuantitativo: Se cuantificó el árbol vascular en las angiografías recibidas con el programa informático Metamorph® Image System Meta Series Software v.7.7.0 Formation application module. En el Grupo Experimental 1 se cuantificaron todas las imágenes recibidas pertenecientes al momento de la infusión celular (periodo basal), el 70% de las imágenes recogidas en el periodo de los 6 meses después de la infusión celular y el 80% de las imágenes que corresponden al periodo de los 12 meses. En el grupo experimental 2 se cuantificaron el 90% de los casos en el periodo de los 6 meses y el 80% de las imágenes recibidas en el periodo de los 12 meses. El resto de las imágenes no cumplieron los criterios para la cuantificación. En función de las imágenes recibidas y bajo las características descritas en el apartado de Pacientes y Metodología, la cuantificación del árbol vascular mediante Metamorph® nos permitió observar un aumento en los parámetros elegidos del 30% de los pacientes incluidos en el Grupo Experimental 1. Dicha mejora se mantuvo en el tiempo, observándose tanto a los 6 como a los 12 meses posteriores a la infusión celular recibida. En concreto, los pacientes P06 y P08 mostraron una mejora significativa con respecto a su estado basal, resultados concordantes con la mejora clínica experimentada por dichos pacientes (Figura 26). En el Grupo Experimental 2 la cuantificación del árbol vascular mediante Metamorph® nos permitió observar un aumento en los parámetros elegidos en el 40% de los pacientes. Concretamente, en los pacientes P29, y P31, dicho incremento fue observable desde los 6 meses de la infusión celular y moderadamente mantenido a los 12 meses. En el caso de los pacientes P20 y P34, R E S U L T A D O S | 109 el aumento del árbol vascular fue observable a los 12 meses del tratamiento celular (Figura 26). De forma general, la cuantificación mostró que la neovascularización tuvo lugar en varios pacientes tratados con el producto celular. El 35% mostró una mejora en la vascularización con un incremento en las variables de extensión vascular (TTL/TTA) y/o en las de densidad vascular (BP y S), por el contrario, el 45% mostró una disminución en alguna de las variables (Figura 26). TT L (m m ) Basal 6 meses 12 meses 0.0 0.5 1.0 1.5 ** TTA (m m 2) Basal 6 meses 12 meses 0.0 0.5 1.0 1.5 * Pu ntos d e ram ificación Basal 6 meses 12 meses 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 *** Segm entos Basal 6 meses 12 meses 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 ** Figura 26: Cuantificación de la neovascularización. Los datos angiográficos de extensión vascular (longitud total del vaso (TTL) y área total del vaso (TTA)) y de densidad vascular (puntos de ramificación (BP) y segmentos (S)) fueron cuantificados en la región vascular infrapoplítea y comparados con la situación basal (azul), a los 6 meses de la infusión celular (rojo) y a los 12 meses (verde). Se observó un incremento significativo de cada variable, lo cual expresa la aparición de neovascularización inducida por la infusión de AdMSCs autólogas. Análisis estadístico usando paired ttest (sig. Two-tailed).*p≤0.05; **p≤0.01; p≤0.001. A los 6 meses de seguimiento, tuvo lugar un aumento estadísticamente significativo en el 15% de los pacientes en las variables utilizadas para medir la extensión vascular (TTL y TTA). En el 25% se observó una disminución probablemente como consecuencia de la evolución de la enfermedad. A los 12 meses, el aumento lo experimentaron el 30%, mientras que sólo el 25% de los 110 | R E S U L T A D O S pacientes mostraron una disminución de la vascularización en las variables de extensión vascular. Con respecto a las variables que midieron la densidad vascular, la cuantificación resultó en un aumento en el 15% y en el 20% de los pacientes en las variables de puntos de ramificación (BP) y de segmentos (S) respectivamente frente al 25% y 30% donde se observó una disminución de dichos parámetros. A los 12 meses, el incremento tuvo lugar en el 25% de los pacientes en la variable de BP y en el 30% en la de S. Disminuyó en el 20% tanto en BP como en S. No se obtuvieron resultados estadísticamente significativos al comparar las dos dosis de tratamiento. Por tanto, podemos concluir que a lo largo del estudio, el 35% de los pacientes experimentó un aumento de la neovascularización en el miembro infundido atribuible a la terapia celular recibida. Dicho aumento fue mantenido en el tiempo, ya que fue observado tanto a los 6 meses como a los 12 meses después de la infusión celular. Por el contrario, en un 45% de los pacientes disminuyó la vascularización según los datos arrojados por la cuantificación. Dicha disminución puede ser debida a la progresión evolutiva de la enfermedad que presentan. En la Tabla 16 se muestran los resultados obtenidos de la cuantificación expresada con flechas ascendentes las cuales implican un aumento, o con flechas descendentes las cuales se refieren a una disminución de los parámetros. Dicha cuantificación fue comparada con los parámetros basales que presentaban los pacientes al comienzo del ensayo. R E S U L T A D O S | 111 Tabla 16: Resumen de los resultados obtenidos mediante cuantificación con MetaMorph TTL: total tube length (longitud de los vasos arteriales); TTA: total tube area (área que suponen los vasos arteriales); BP: branch point (puntos de ramificación); S: Segmentos; n.s: no estadísticamente significativo; ↑: aumento; ↓: disminución ↑/↓: p≤0.05 ↑↑/↓↓↓: p≤0.01 ↑↑↑/↓↓↓: p≤0.001 TTL TTA BP S Pacientes Basal/6 m Basal/12 m Basal/6 m Basal/12 m Basal/6 m Basal/12 m Basal/6 m Basal/12 m Grupo experimental 1 P01 n.s ↓↓↓ n.s ↓↓↓ n.s n.s n.s n.s P03 No imagen n.s No imagen n.s No imagen n.s No imagen n.s P06 ↑↑↑ ↑↑↑ ↑↑↑ ↑↑↑ ↑↑↑ ↑↑↑ ↑↑↑ ↑↑↑ P08 n.s ↑↑↑ n.s ↑↑↑ n.s ↑↑↑ n.s ↑↑↑ P09 No imagen ↓ No imagen ↓ No imagen ↓ No imagen ↓ P10 n.s n.s n.s n.s n.s n.s n.s n.s P12 No imagen n.s No imagen n.s No imagen n.s No imagen n.s P13 ↓ n.s ↓ n.s ↓ n.s ↓ n.s P15 ↓↓↓ No imagen ↓↓↓ No imagen ↓↓↓ No imagen ↓↓↓ No imagen P16 n.s No imagen n.s No imagen n.s No imagen ↓ No imagen Grupo experimental 2 P18 n.s n.s n.s n.s n.s n.s ↑ n.s P20 ↓↓ ↑ ↓↓ ↑ ↓↓ ↑ ↓↓ ↑↑ P23 n.s No imagen n.s No imagen n.s No imagen n.s No imagen P24 ↓↓↓ ↓ ↓↓↓ ↑↑ ↑↑↑ ↓↓ ↓↓↓ ↓↓ P25 No imagen No imagen No imagen No imagen No imagen No imagen No imagen No imagen P27 No imagen ↓ No imagen n.s No imagen ↓↓↓ No imagen ↓↓↓ P29 ↑↑↑ ↑↑↑ ↑↑↑ ↑↑↑ ↑↑↑ ↑↑↑ ↑↑↑ ↑↑↑ P31 ↑ ↑ ↑ ↑ ↑ ↑ ↑ ↑ P34 ↓↓ ↑↑ ↓↓ ↑↑ ↓↓↓ n.s ↓↓↓ n.s P35 ↓↓↓ ↓↓↓ ↓↓↓ ↓↓↓ ↓↓↓ ↓↓↓ ↓↓↓ ↓↓↓ 112 | RESULTADOS 4.5.2. VARIABLES SECUNDARIAS Se evaluaron los cambios producidos en los índices de amputación, la cicatrización de las úlceras, escala visual analógica del dolor (EVA) y perímetro gemelar. a) Amputaciones 5 pacientes presentaron amputaciones previas al estudio. Durante el año de seguimiento, ningún paciente sufrió una amputación mayor ni en el miembro diana ni en el contralateral. Sin embargo, 5 pacientes experimentaron amputaciones menores a nivel digital, 3 de los cuales presentaban grado III en la Escala de RB. 1 paciente presentó la amputación en el miembro contralateral (P12), mientras que 4 de ellos la presentaron en el miembro diana (P09, P13, P29, P33). La Tabla 17 resume el número de pacientes así como el porcentaje de amputaciones sufridas a lo largo del estudio (6 y 12 meses) en los tres grupos de aleatorización. Tabla 17: Amputaciones ocurridas a lo largo del ensayo en el miembro considerado diana. N: número de pacientes El paciente P09, el cual sufrió una reacción adversa que se comenta en el apartado 4.6, cursó con fenómenos de trombofilia asociados que se objetivaron después de la infusión celular, y de los que el paciente era portador con anterioridad. Esto dio como resultado lesiones necróticas en los dedos 3º, 4º y 5º y en la base del 1º dedo y en la cabeza de metatarsiano. A los 3 meses de la infusión celular fueron amputados por presentar necrosis seca. R E S U L T A D O S | 113 El paciente P13 sufrió una amputación menor (1º dedo del pie izquierdo) tras meses de gangrena húmeda un mes después de la infusión celular. A los 9 meses de la infusión, presentó embolización de gérmenes en el curso de infección del pie, por lo que sufrió otra amputación en un dedo del pie izquierdo. El paciente P29 sufrió 4 amputaciones menores en total, teniendo lugar la primera de ellas antes de la infusión celular. A los 4 días de la infusión, requirió ingreso hospitalario por infección en la herida de la amputación, apareciendo lesiones cutáneas nuevas. A los 3 meses de la infusión, presentó amputación del 4º dedo. A los 6 meses presenta amputación de otros dos dedos (2º y 3º). A los 9 meses de la infusión, ya le han sido amputados todos los dedos del miembro diana, aunque presentó excelente tejido de granulación. El paciente P33, aleatorizado en el grupo control, sufrió amputaciones en ambos miembros, así como diversas úlceras (un total de 4) a lo largo del estudio. 4 dedos del miembro considerado diana fueron amputados. b) Cicatrización de úlceras Respecto a la evolución de la cicatrización de las úlceras, 10 pacientes (33,3%) presentaron úlceras no cicatrizadas en el miembro diana al inicio del estudio. 5 de ellas fueron consecuencia de heridas quirúrgicas tras amputaciones sufridas previas a la inclusión en el ensayo. Según la Clasificación de la Universidad de Texas para úlceras diabéticas, un paciente presentaba grado C2, dos pacientes grado B2, uno grado B1, cuatro presentaron grado B2 y dos grado A1. Al finalizar el estudio, la escala de Texas reflejó la completa curación de las lesiones tróficas en 6 casos (A0), excepto para los pacientes P12, P29 y P33 que presentaron úlceras superficiales (A1) en los dos primeros casos, y una úlcera infectada de proporciones considerables (9x14 cms) en el caso del paciente P33 (grupo control). La cicatrización de las úlceras en los dos grupos de tratamiento con células fue más rápida en la mayoría de los casos respecto al grupo control, cuya evolución ocurrió de una manera más lenta y discreta (Figura 27). 114 | RESULTADOS Figura 27: Cicatrización de úlceras. (A). Evolución del área de la úlcera en mm2 en el momento basal, 6 meses y 12 meses del seguimiento de los tres grupos de tratamiento.(B). Imagen representativa de la cicatrización de una úlcera en el momento basal y a los 45 días tras el tratamiento celular, observándose buen tejido de granulación. c) Escala analógica visual del dolor (EVA) El dolor en los pacientes afectados por isquemia arterial periférica es un síntoma principal por el que se acude a la consulta médica y a través del cual se realiza el diagnóstico. En general, el dolor se redujo en un 60% (18 pacientes) de los pacientes del estudio. Un 53,3% (16 pacientes) pertenecían a los grupos de tratamiento celular. R E S U L T A D O S | 115 10 pacientes (33,3%) (P01, P06, P08, P13, P15, P16, P18, P25, P27, P31) se presentaron asintomáticos en cuanto al dolor al final del estudio, siendo todos ellos de los grupos de tratamiento celular. El 90% de los pacientes pertenecientes al grupo control refirió más dolor que al inicio del estudio. En el 20% de los casos (6 pacientes) tuvo lugar un aumento de la escala con respecto al periodo basal, siendo un 16,6% (5 pacientes) pertenecientes al grupo control. En un 23,3% no se obtuvieron las medidas de la escala EVA a nivel basal y/o a los 12 meses del seguimiento debido a la no objetivación por parte del paciente. La comparativa entre los diferentes grupos arrojó una diferencia estadísticamente significativa tanto entre el grupo experimental 1 con respecto al grupo control (p≤0.001) como entre el grupo experimental 2 y el grupo control (p≤0.01) (Figura 28). Tiem po (m eses) Escala de dolor (E VA ) 0 6 12 0 2 4 6 8 10 C o n tro l G ru po e x p 1 G ru po e x p 2 ** *** Figura 28: Escala visual analógica de dolor (EVA). Comparativa entre los grupos de tratamiento celular y el grupo control. ** p≤0.01 *** p≤0.001 Si bien una reducción en la escala de dolor puede parecer un dato positivo, no hay que olvidar que la mayoría de estos pacientes sufren neuropatía asociada con la DM, por lo que este dato clínico debe ser interpretado con precaución. 122 | R E S U L T A D O S b) Índice tobillo-brazo (ITB) Si bien el ITB puede ser un buen indicativo de la evolución de la patología durante el seguimiento de los pacientes, en nuestro estudio no pudo ser determinado en la mayoría de los casos. Únicamente en 11 de los 30 pacientes incluidos en el ensayo se obtuvieron las medidas en el momento basal, a los 6 y 12 meses. De éstas, sólo en 2 pacientes se obtuvo un registro válido; en el resto no fue valorable (Figura 34). Se considera un ITB normal entre 1.0 y 1.2, y la EAP es diagnosticada cuando el ITB es < 0.9. Sin embargo, individuos de edad avanzada y DM de larga duración pueden padecer calcificación en las arterias pedias, lo cual causa una elevación artefactual del ITB. De hecho, en nuestro estudio, varios pacientes exhiben valores considerados normales incluso en el momento basal, aunque por su historial clínicos y pruebas complementarias han sido diagnosticados con CLI. En los casos en que se pudo realizar la medida el 56,67% presentó valores por debajo de 0,9 en alguna visita, y el 30% superior a 1,2. Tiem po (m eses) Ín d ice T obillo-brazo (ITB ) 0 6 12 0 6 12 0 6 12 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 C ontrol G rupo exp 1 G rupo exp 2 Figura 34: Medidas de ITB obtenidas en el momento basal, a los 6 y 12 meses del tratamiento. Se considera patológico un ITB <0.9, mientras que un ITB entre 1.0 y 1.2 se considera normal. Varios pacientes del estudio aparecen con valores considerados normales incluso al comienzo del ensayo. Esto se debe a una calcificación que presentan en las arterias, las cuales provocan falsos valores. R E S U L T A D O S | 123 c) Presión transcutánea de oxígeno (tcpO2) La medición de la tcpO2 analiza la microcirculación y la perfusión de los tejidos después de la difusión del oxígeno desde los vasos. Se tomaron como valores normales aquellos mayores de 40 mmHg, valores medios entre 20-40 mmHg y los valores con mayor riesgo de amputación los menores de 20 mmHg. La media de los valores que presentaron al inicio del ensayo el grupo control y los grupos experimentales (1 y 2) fueron de 34,5 ± 16,56 mmHg; 32,4 ± 16,81 mmHg y 30 ± 12,88 mmHg respectivamente. Al finalizar el seguimiento (12 meses), los valores recogidos fueron 24,9 ±16,21 mmHg; 28,3 ± 16,5 mmHg y 42,67 ± 16,1 mmHg, siendo el grupo experimental 2 el único que experimentó un aumento estadísticamente significativo (p<0.05) (Figura 35). Tiem po (m eses) TcP O 2(m m Hg) 0 12 0 12 0 12 0 20 40 60 C o n tro l G ru po ex p 1 G ru po ex p 2 *p=0.0284 Figura 35: Evolución de los pacientes en la presión transcutánea de oxígeno (tcpO2) a lo largo del ensayo. Evolución estadísticamente significativa del grupo experimental 2 vs. Control (*p<0.05) El grupo experimental 2 presentó a la finalización del ensayo mayor número de pacientes con valores considerados normales respecto al grupo control y el grupo experimental 1 (60% vs. 20%). Así mismo, también se observó en este grupo menor porcentaje de pacientes con valores considerados con mayor riesgo de amputación (10% vs. 50% vs. 40%). Estos resultados pueden ser atribuibles a una respuesta positiva del organismo del paciente al tratamiento celular de mayor dosis (Figura 36). 124 | R E S U L T A D O S Tiem po (m eses) Tc P O 2(m m Hg) 0 6 12 0 6 12 0 6 12 0 20 40 60 80 C ontrol Grupo exp 1 Grupo exp 2 Figura 36: Evolución en la tcpO2 en los distintos grupos de tratamiento durante el seguimiento del ensayo. Valores por debajo de los 20 mmHg se consideran de mayor riesgo para sufrir una amputación. Valores por encima de los 40 mmHg son considerados normales. 4.6. INVESTIGACIÓN DE LA REACCIÓN ADVERSA Durante el transcurso del estudio se registraron dos reacciones adversas en dos pacientes aleatorizados en el grupo experimental 1 (P02 y P09) los cuales fueron comunicados a la agencia en las 24 horas siguientes. A juicio clínico y del promotor, podrían relacionarse con la infusión del producto utilizado en la terapia celular. El paciente P02 fue excluido del ensayo con posterioridad por causas no relacionadas con el tratamiento celular ni con la reacción adversa. El paciente P09 continuó en el estudio y completó todas las visitas del seguimiento. El ensayo fue interrumpido para evaluar las causas subyacentes de las reacciones adversas y su posible relación con el producto celular utilizado. 4.6.1. DESCRIPCIÓN DE LAS REACCIONES La trombosis aparece por una reducción de flujo de sangre, por lesiones en la pared vascular y por un aumento de la tendencia a la coagulación sanguínea (por ejemplo cuando aumenta la concentración de factores de coagulación o se altera el equilibrio normal entre coagulación y dilución de los coágulos a causa de determinados medicamentos). Los dos pacientes refirieron opresión a nivel infrapoplíteo y reacción vasomotora de origen neurógeno en el tercio distal del miembro diana, acompañado de discreto dolor en las diez horas posteriores a la infusión celular. Se les realizó Eco R E S U L T A D O S | 125 Doppler para comprobar la permeabilidad arterial, demostrándose la indemnidad de los vasos arteriales de mediano calibre. Los pacientes fueron tratados con terapia antitrombótica y fueron dados de alta a las 72 horas de desaparecer totalmente la sintomatología. 4.6.2. EVALUACIÓN DE LA CAPACIDAD FIBRINOLÍTICA DEL PRODUCTO CELULAR La formación de un trombo debido a condiciones patológicas como la DM y la CLI supone una barrera contra agentes externos. La red de fibrina que se produce debe ser degradada por la población celular endógena mediante la capacidad fibrinolítica que poseen (166), para facilitar la migración celular hacia las áreas lesionadas. Bajo este contexto, y debido a las dos reacciones adversas acontecidas, nuestro grupo consideró la hipótesis de una posible desregulación entre los procesos de formación de la fibrina y su subsecuente solubilización por parte de las MSCs utilizadas en el estudio. Los fenómenos de trombofilia asociados que se objetivaron después de la infusión celular, y de los que los pacientes eran portadores con anterioridad, (ambos pacientes cursaban con hiperfibrinogenemia), nos llevó a evaluar si el ambiente protrombótico generado por la DM puede influir en alguna de las propiedades fibrinolíticas de las AdMSCs utilizadas para la terapia. Al tratarse de un tratamiento autólogo, esta opción era posible. Se analizaron mediante qPCR y ELISA los factores clave de la cascada fibrinolítica (niveles de t-PA y PAI-1) estimulando las AdMSCs bajo distintas condiciones, con el fin de evaluar si las AdMSCs derivadas de pacientes diabéticos como las usadas en el ensayo en el que se basa esta tesis manifestaban alguna desregulación en su capacidad fibrinolítica, ya que se ha descrito que el exceso o déficit de alguno de los factores del sistema de fibrinólisis-antifibrinólisis puede inducir trombosis (Figura 37). 126 | RESULTADOS Figura 37. Esquema ilustrativo de la implicación de algunos de los factores que participan en la fibrinólisis y trombosis. A.t-PA: activador tisular del plasminógeno; PAI-1: inhibidor del activador de plasminógeno-1; PDF: productos de degradación del fibrinógeno. B. El exceso o déficit de alguno de los factores del sistema de fibrinólisis-antifibrinolisis puede inducir hemorragia o trombosis (Fuente: Imagen modificada de Vaughan, 1995) Para ello, se cultivaron AdMSCs control (AdMSCs-C), AdMSCs de pacientes diabéticos (AdMSCs-D) y no diabéticos (AdMSCs-ND) en presencia de suero comercial (control), suero humano sano (Sh-S), diabético (Sh-D) y no diabético (Sh-ND). En condiciones control, mediante el análisis por qPCR las tres poblaciones celulares obtuvieron similares niveles de expresión de tPA, obteniéndose una disminución significativa (p ≤ 0,05) en las AdMSCs-ND con respecto a las AdMSCs- C a nivel de proteína secretada (Figura 36). Al estimularlas con suero humano (Sh-S, -D y –ND), los niveles tanto transcripcionales como de proteína secretada de tPA resultaron significativamente más bajos en AdMSC-D (p≤0,01) con respecto a las AdMSCs-C, sugiriendo que la adición de suero, independientemente de su origen inhibe la expresión de tPA en estas células (Figura 38). A B R E S U L T A D O S | 127 C on tro l E x p resión rela tiv a A RN m tP A M S C s-C M S C s-D M SC s-N D 0 2 4 6 S h -S M S C s-C M S C s-D M S C s-N D 0 2 4 6 S h -D M SC s-C M S C s-D M S C s-N D 0 2 4 6 S h -N D M S C s-C M S C s-D M S C s-N D 0 2 4 6 tP A (n g/m L ) M S C s-C M S C s-D M SC s-N D 0 1 2 3 4 M S C s-C M S C s-D M S C s-N D 0 1 2 3 4 M S C s-C M S C s-D M S C s-N D 0 1 2 3 4 M SC s-C M S C s-D M S C s-N D 0 1 2 3 4 ** ** ** ** ** ** ** ** ** ** ** Figura 38. Detección de la expresión de tPA a nivel de ARNm (fila superior) y proteína (fila inferior) en AdMSCs procedentes de línea comercial (AdMSCs-C), paciente diabético con CLI (AdMSCs-D) y paciente no diabético con CLI (AdMSCs-ND) después de cultivarlas con suero comercial (Control), suero humano sano (Sh-S), suero humano diabético con CLI (Sh-D) y suero humano no diabético con CLI (Sh-ND). La expresión relativa de ARNm indica el ratio entre el gen específico y el gen de referencia (housekeeping). Los valores son normalizados respecto a la expresión de AdMSCs no estimuladas, arbitrariamente establecidos como 1. Datos representados como media±error estándar (SEM). N=4. *p≤0.05; **p≤0.01. Igualmente, se evaluaron los niveles de PAI-1. Se ha demostrado que un exceso de este inhibidor del sistema fibrinolítico promueve la deposición patológica de fibrina favoreciéndose los eventos trombóticos. Los niveles transcripcionales de PAI-1 fueron significativamente más altos en las AdMSCs-D en todas las condiciones de cultivo con respecto a las AdMSCs-ND. Las AdMSCs-C presentaron un patrón de expresión similar a las AdMSCs-D. Sin embargo, respecto a la cantidad de proteína liberada, las AdMSCs-D secretaron la mayor cantidad de PAI- 1, llegando a los 400 ng/mL en presencia de Sh-D, mientras que las AdMSCs-C y las AdMSCs-ND, independientemente de las condiciones de cultivo, liberaron entre 150 y 200 ng/mL de proteína. En presencia del suero control AdMSCs-C y las AdMSCs-D secretaron niveles similares de PAI-1, mientras que las AdMSCs-ND lo hicieron en menor cantidad (Figura 39). 128 | R E S U L T A D O S C on tro l E xpresió n relativa A RN m PA I-1 M S C s-C M S C s-D M S C s-N D 0 2 4 6 8 10 S h -S M S C s-C M S C s-D M S C s-N D 0 2 4 6 8 10 S h -D M S C s-C M S C s-D M S C s-N D 0 2 4 6 8 10 S h -N D M S C s-C M S C s-D M S C s-N D 0 2 4 6 8 10 PA I-1 (n g/m L) M S C s-C M S C s-D M S C s-N D 0 100 200 300 400 500 M S C s-C M S C s-D M S C s-N D 0 100 200 300 400 500 M S C s-C M S C s-D M S C s-N D 0 100 200 300 400 500 M S C s-C M S C s-D M S C s-N D 0 100 200 300 400 500 * ** * ** ** * ** ** ** ** ** Figura 39: Detección de la expresión de PAI-1 a nivel de ARNm (fila superior) y proteína (fila inferior) en AdMSCs procedentes de línea comercial (AdMSCs-C), paciente diabético con CLI (AdMSCs-D) y paciente no diabético con CLI (AdMSCs-ND) después de cultivarlas con suero comercial (Control), suero humano sano (Sh-S), suero humano diabético con CLI (Sh-D) y suero humano no diabético con CLI (Sh-ND). La expresión relativa de ARNm indica el ratio entre el gen específico y el gen de referencia (housekeeping). Los valores son normalizados respecto a la expresión de AdMSCs no estimuladas, arbitrariamente establecidos como 1. Datos representados como media±error estándar (SEM). N=4. *p≤0.05; **p≤0.01. Para mimetizar una situación fibrinolítica ex vivo, las AdMSCs fueron cultivadas en geles de fibrina con suero control y en la presencia de los distintos sueros sanguíneos humanos (Sh-S, -D y –ND). La degradación del gel de fibrina se encontró desregulada (disminuida) en las AdMSCs-D, independientemente del suero sanguíneo humano adicionado (Figura 40), tal y como se observa por la lisis del gel alrededor de las células. Este efecto tuvo lugar independientemente de las condiciones de cultivo establecidas. RESULTADOS| 129 Figura 40. Degradación de gel de fibrina. Tinción eosina-hematoxilina (A). Degradación de gel de la fibrina por parte de las células control (AdMSCs-C). (B). Degradación del gel de la fibrina en AdMSC-D. Las células diabéticas tienen atenuada su capacidad fibrinolítica. Barra de escala: 50μm. Para validar esta observación, se cuantificó la producción de Dímero-D (DD) por parte de las AdMSCs cultivadas en los geles de fibrina. El DD se produce tras la acción de degradación de la plasmina sobre la fibrina durante la fibrinólisis. Por tanto, es posible encontrar valores elevados de DD ante un aumento de la capacidad fibrinolítica. La cuantificación del DD dio como resultados valores disminuidos respecto al control, lo que se relaciona con un mayor riesgo protrombótico (Figura 41). C ontro l Dím ero-D (ng/m L) M S C s-C M S C s-D M S C s-N D 0 5000 10000 15000 20000 25000 S h -S M S C s-C M S C s-D M S C s-N D 0 5000 10000 15000 20000 25000 S h -D M S C s-C M S C s-D M S C s-N D 0 5000 10000 15000 20000 25000 S h -N D M S C s-C M S C s-D M S C s-N D 0 5000 10000 15000 20000 25000 ** ** ** ** *** ** ** Figura 41. Cuantificación de Dímero-D en AdMSCs procedentes de línea comercial (AdMSCs-C), paciente diabético con CLI (AdMSCs-D) y paciente no diabético con CLI (AdMSCs-ND) después de cultivarlas con suero comercial (Control), suero humano sano (Sh-S), suero humano diabético con CLI (Sh-D) y suero humano no diabético con CLI (Sh-ND). Los valores son normalizados respecto a la expresión de AdMSCs no estimuladas, arbitrariamente establecidos como 1. Datos representados como media±error estándar (SEM). N=4. *p≤0.05; **p≤0.01. 130 | R E S U L T A D O S En resumen, los resultados anteriormente descritos mostraron que los factores fibrinolíticos de las AdMSCs-D se encuentran desregulados, con niveles aumentados de PAI-1 y disminuidos de t-PA, tanto a nivel de transcripción como de proteína. Así mismo, la cuantificación de DD también resultó disminuida. Como consecuencia, la eficacia de la fibrinólisis disminuye, favoreciéndose de esta forma la trombosis. V. DISCUSIÓN