Funciones emergentes de las proteasas lisosomales en la regulación de procesos tumorales.

1 TRABAJO FIN DE GRADO FACULTAD DE BIOLOGÍA GRADO EN BIOQUÍMICA Funciones emergentes de las proteasas lisosomales en la regulación de procesos tumorales MARÍA ACOSTA ARMAS Julio 2023 TUTOR: Jonathan Martínez Fábregas Departamento de Bioquímica Vegetal y Biología Molecular 2 RESUMEN Los lisosomas son unos orgánulos multifuncionales que regulan la homeostasis celular participando en numerosos procesos biológicos como la degradación y reciclaje de macromoléculas, la respuesta inmune, la reparación de la membrana plasmática, la adhesión/migración celular y la apoptosis. Los cambios y la disfunción lisosomal están involucrados en el desarrollo de numerosas enfermedades. Se ha demostrado el papel crítico que desempañan los lisosomas en el desarrollo y la progresión tumoral a través de los procesos biológicos mencionados anteriormente, destacando el papel de las proteasas lisosomales. Por lo tanto, comprender la estructura, composición y la química de los lisosomas y dilucidar la relación entre estos orgánulos y el desarrollo tumoral proporciona información relevante para el diagnóstico del cáncer, la predicción del pronóstico y generar nuevas dianas terapéuticas. Palabras clave: Lisosomas, enzimas lisosomales, catepsinas, autofagia, cáncer, progresión tumoral Abreviaturas v-ATPasa: H+-ATPasa vacuolar; ATP: adenosín trifosfato; SNAREs: receptores de proteínas de fijación soluble de N-etilmaleimida; LAMPs: proteínas asociada a lisosmas; RER: Retículo endoplasmático rugoso; TFEB: factor de transcripción EB; mTORC1: Diana mecanicista de las vías del complejo 1 de rapamicina; MITF: factor de transcripción asociado con microftalmia; TFE3: factor de trascripción E3; TFEC: factor de transcripción C; TFIIH: factor de transcripción II H; TLRs: receptores tipo Toll; PAMPs: patrones moleculares asociados a patógenos; ATG: genes relacionados con la autofagia; CMA: autofagia mediada por chaperonas; ULK1: quinasa tipo Unc-51; TNF: factor de necrosis tumoral; IL-1: interleucina-1; ADN: ácido desoxirribonucleico; MHC: complejo principal de histocompatibilidad; AEP: endopeptidasa de asparraguina; LSD: enfermedades de almacenamiento lisosomal; EA: enfermedad de Alzheimer; EP: enfermedad de Parkinson; FTD: demencia frontotemporal; ALP: vía autofagia-lisosoma; LES: lupus eritematoso sistémico; AR: artritis reumatoide; SjS: síndrome de Sjögren; ELA: esclerosis lateral amiotrófica; EM: esclerosis múltiple; ROS: especies reactivas del oxígeno; PI3K: fosfatidilinositol 3-quinasa; AMPK: quinasa activada por AMP; MEC: matriz extracelular; EMT: transición epitelio-mesénquima; LTc: linfocitos T citotóxicos; NK: células natural killer; CatB: catepsina B; IGF-I: factor de crecimiento similar a la insulina I; TGF-β: factor de crecimiento transformante-β; MTE: microambiente tumoral; TAMs: macrófagos asociados a tumor; FDA: administración de alimentos y medicamentos; CQ: cloriquina; HCQ: hidroxicloriquina. 3 ÍNDICE 1. ANTECEDENTES ………………………………………………………………………… 4 2. INTRODUCCIÓN ……………………………………………………………………….... 6 2.1. Descripción general de los lisosomas ……………………………………………….... 6 2.2. Los lisosomas como orgánulos multifuncionales…………………………………..… 9 2.2.1. Autofagia ………………………………………………………………………. 10 2.2.1.1. Regulación coordinada de la autofagia y la biogénesis lisosomal…….… 12 2.2.2. Inmunidad innata y adaptativa……………………………………….………… 13 2.3. Enzimas lisosomales………………………………………………………...………. 14 2.4. Disfunción del lisosoma en la enfermedad ………………………..………………… 15 2.4.1. Enfermedades de almacenamiento lisosomal……………..………………….… 15 2.4.2. Enfermedades autoinmunes …………………….……………………………… 16 2.4.3. Enfermedades neurodegenerativas ……………………………..……………… 17 3. OBJETIVO …………………………………………………………………………….… 18 4. METODOLOGÍA ……………………………………………………………………...… 19 5. RESULTADOS Y DISCUSIÓN ……………………………………………………….… 20 5.1. Función de los lisosomas en la biología del cáncer………………………………… 20 5.1.1. Papel de la autofagia en el cáncer ¿supresora o promotora de tumores? ……… 20 5.1.2. Papel de las proteasas lisosomales en procesos tumorales……………..…….… 22 5.1.3. Análisis bioinformático de correlación entre los niveles de expresión de catepsinas y distintos tipos de cáncer ………………………………………….……… 24 6. CONCLUSIÓN Y PERSPECTIVAS DE FUTURO ………………………...…………… 27 7. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS…………………………………………………… 28 4 1. ANTECEDENTES Los lisosomas, orgánulos subcelulares presentes en todas las células animales, son los responsables de la degradación y reciclaje del material extracelular que ha sido internalizado por endocitosis (Doherty & McMahon, 2009) y/o fagocitosis (Green et al., 2016) y de los componentes intracelulares que se han secuestrado por autofagia (Mizushima, 2007). Fueron descritos por primera vez en 1955 por Christian de Duve (De Duve et al., 1955), quién recibió el Premio Nobel de Medicina y Fisiología por su descubrimiento en 1974. Desde entonces, los lisosomas han sido objeto de numerosos estudios y descubrimientos importantes, lo que ha permitido una mejor comprensión de su papel en la célula (Figura 1). 5 Fig.1 Línea de tiempo de los principales hallazgos sobre lisosomas. En esta figura se observan algunos de los acontecimientos más importantes en el desarrollo de la investigación sobre los lisosomas. Desde el descubrimiento y caracterización de los lisosomas por Christian de Duve en 1955, los científicos han realizado grandes contribuciones para desentrañar la estructura y la química de los lisosomas y vincularlos con procesos como la autofagia, la endocitosis, la vía mTOR y la muerte celular, sentando así las bases para utilizar los lisosomas como dianas terapéuticas. Estos estudios nos han permitido cambiar nuestra visión de los lisosomas, desde simples centros de reciclaje a complejos centros de señalización implicados en la regulación de múltiples procesos fisiológicos. Actualmente se sabe que estos orgánulos son multifuncionales ya que no solo son clave en la digestión celular, sino que también desempeñan un papel crucial en la respuesta inmune, la adhesión y migración celular, la reparación de la membrana plasmática, la muerte celular programada (apoptosis), la autofagia, la señalización celular y el control del metabolismo (Ballabio & Bonifacino, 2020). Estos procesos son fundamentales para mantener la homeostasis celular, pero cuando se alteran, pueden contribuir al desarrollo y la progresión de distintas enfermedades. En este sentido, estudios recientes han demostrado la importancia de los lisosomas en diversas patologías como enfermedades neurodegenerativas, trastornos autoinmunes, enfermedades metabólicas y cáncer (Zhang et al., 2021). La investigación sobre los lisosomas y su implicación en el cáncer ha avanzado significativamente en las últimas décadas. Los lisosomas desempeñan un papel esencial en varios procesos de la progresión tumoral como la invasión celular, la angiogénesis, la resistencia a la quimioterapia y la metástasis (Castro-Gomes et al., 2016; Zhang et al., 2021). 6 De hecho, se ha relacionado a los lisosomas con diferentes aspectos críticos de la biología de las células cancerosas: 1. Las células tumorales utilizan los lisosomas para obtener los nutrientes y la energía que necesitan para crecer y sobrevivir (Tonnessen-Murray et al., 2019). 2. La activación de la vía de la autofagia permite a las células tumorales desarrollar resistencia a la quimioterapia (Yoon et al., 2012). 3. La disfunción de los lisosomas puede impedir la apoptosis de las células tumorales, lo que contribuye a su crecimiento y supervivencia (Perera et al., 2019). 4. Las enzimas lisosomales contribuyen a la promoción de la invasión y metástasis al ser capaces de degradar la matriz extracelular, lo que permite que las células tumorales migren, invadan y metastaticen a través de los tejidos circundantes (Vidak et al., 2019). 5. La sobreexpresión de estas proteasas lisosomales se ha descrito en la mayoría de tumores en humanos y se correlaciona con una mayor agresividad y progresión del cáncer (Kos et al., 2022). La investigación sobre los lisosomas sigue siendo un área activa y vital en la Biología Celular y la Medicina, representando una diana terapéutica atractiva para el desarrollo de nuevas estrategias contra el cáncer y otras enfermedades en las que la disfunción de estos orgánulos interviene. 2. INTRODUCCIÓN 2.1. Descripción general de los lisosomas Los lisosomas son orgánulos esféricos de dimensiones variables rodeados por una membrana lipídica, que contienen en su interior abundantes enzimas hidrolíticas capaces de degradar tanto el material extracelular que la célula ha tomado por endocitosis (heterofagia) como estructuras intracelulares o macromoléculas dañadas o innecesarias (autofagia). Además de degradar moléculas estos orgánulos tienen funciones críticas en la señalización celular, el metabolismo, la reparación de membranas, la homeostasis y la respuesta inmunitaria (Settembre et al., 2013; Xu & Ren, 2015). Los lisosomas contienen un conjunto de proteínas específicas (Braulke & Bonifacino, 2009) entre los que destacan I) las hidrolasas ácidas que degradan los diferentes sustratos entre las que encontramos proteasas, lipasas, glucosidasas, etc, II) activadores enzimáticos y factores que ayudan en la degradación, así como III) proteínas transportadoras. Los lisosomas se caracterizan por tener un pH interno ácido, que oscila entre 4.5 – 5.0, valor en el que las enzimas 7 degradativas muestran su máxima actividad (hidrolasas ácidas). Este pH se mantiene gracias a bombas de protones dependientes de ATP que hay en sus membranas, acidificando su interior y favoreciendo la digestión de macromoléculas (Mindell, 2012). Los lisosomas se protegen de esta actividad destructora de las enzimas hidrolíticas y de la acidez con una capa de glúcidos que recubre la cara interna de su membrana (Ballabio & Bonifacino, 2020). Además, los lisosomas contienen en su membrana diversas bombas, canales iónicos y transportadores de membrana específicos que permiten el paso de iones y productos de la degradación, por lo tanto, garantizan que el material degradado en el interior de los lisosomas sea devuelto al citosol donde se puede reutilizar en la síntesis de nuevas biomoléculas. En la cara citosólica se encuentran I) complejos señalizadores y factores de transcripción que transducen las señales metabólicas, II) factores de unión, complejos adaptadores y motores de microtúbulos que favorecen la fusión y contacto con otros orgánulos y III) pequeñas GTPasas que controlan la activación y reclutamiento de estas moléculas (Figura 2). Fig.2  Estructura de un lisosoma. En esta figura se puede observar las características de un lisosoma: son orgánulos rodeados por una membrana lipídica que contiene enzimas hidrolíticas en su parte luminal y una serie de proteínas transportadoras y bombas de protones, que garantizan el transporte de solutos a través de su membrana y el mantenimiento de un pH acido, respectivamente. (Modificada con BioRender de Ballabio and Bonifacino, 2020). Los lisosomas están altamente regulados, son dinámicos y heterogéneos en cuanto a contenido, morfología y localización en la célula (Johnson et al., 2016; Li et al., 2016; Saric et al., 2016). Los lisosomas más cercanos al núcleo poseen mayor acidez que los periféricos y estos últimos mediante su asociación con mTORC1 participan en la regulación de la disponibilidad de nutrientes y en la reparación de membranas (Perera & Zoncu, 2016). 8 En función de las necesidades de la célula y de su entorno, el número y tamaño de los lisosomas puede variar (Lawrence & Zoncu, 2019). Esto fue inicialmente caracterizado en 2012, cuando por primera vez se describió el eje mTORC1/TFEB y su papel como regulador de biogénesis de lisosomas y autofagia. En condiciones nutricionales favorables, mTORC1 se encuentra en la superficie del lisosoma, activo y promoviendo proliferación celular. Por el contrario, en condiciones de déficit nutricional, −p.e. ausencia de aminoácidos− mTORC1 se disocia del lisosoma y se inactiva, lo que promueve la activación de TFEB, un factor transcripcional de la familia MIT. Una vez activo, TFEB se transporta al núcleo donde activa la transcripción de genes lisosomales y autofágicos. Así, en momentos de escasez de alimentos las células aumentan el número de lisosomas para descomponer el interior celular y obtener energía (Settembre et al., 2012). Para la generación de nuevos lisosomas, su regeneración o aumento de tamaño se necesita coordinación entre el tráfico vesicular y la síntesis proteica (Saftig & Klumperman, 2009). La biogénesis lisosomal está genéticamente muy controlada y coordinada. Todos los genes que codifican proteínas lisosomales, incluidos los transportadores de membrana y las hidrolasas ácidas y muchos genes autofágicos comparten un motivo común en su promotor conocido como CLEAR, cuya secuencia canónica es 5’-GTCACGTGAC-3’ al que se unen factores de transcripción como TFEB, TFE3, TFEC, MITF y TFIIH (Palmieri et al., 2009; Franco-Juárez et al., 2022). La red de rutas de señalización implicadas en la regulación de la expresión de proteínas lisosomales y de la actividad lisosomal ha seguido expandiéndose gracias a trabajos más recientes (Martínez-Fábregas et al., 2022). Estos trabajos están revelando una compleja red de regulación lisosomal, que nos permite entender el papel central que el lisosoma desempeña no solo en procesos fisiológicos, sino también en el desarrollo de múltiples enfermedades. Los lisosomas obtienen sus proteínas mediante trasporte vesicular. Las enzimas lisosomales se sintetizan en los ribosomas del Retículo Endoplásmico Rugoso (RER), a cuya luz se incorporan para ser transportadas hacia el aparato de Golgi, donde se seleccionan en la cara trans por medio de un receptor de manosa-6-fosfato (Ghosh et al., 2003). Después de sucesivas modificaciones en el RER y el aparato de Golgi, las enzimas lisosomales se empaquetan en vesículas recubiertas de clatrina, que se expulsan desde la cara trans del aparato de Golgi. En primer lugar, se añade N-acetil-glucosamina fosfato a residuos específicos de manosa, luego se 9 produce la eliminación del grupo N-acetil-glucosamina, dejando residuos de manosa-6-fosfato (Korfeld, 1987). Las vesículas recubiertas de clatrina que se emiten desde la cara trans del aparato de Golgi se denominan lisosomas primarios, estos son de pequeño tamaño y solo contienen enzimas digestivas. Después, estas vesículas pierden la cubierta de clatrina y pueden fusionarse con otros lisosomas primarios, fagosomas (fagolisosomas), endosomas (endolisosomas) o incluso con lisosomas secundarios. Los lisosomas secundarios son de mayor tamaño y poseen contenido heterogéneo (enzimas, sustratos y productos de hidrolisis), y se forman por maduración de endosomas tardíos. El proceso de formación de nuevos lisosomas en las células se conoce como biogénesis lisosómica. Se trata de un proceso complejo en donde se fusionan endosomas tardíos, que contienen material captado en la superficie celular, con vesículas de transporte que brotan de la red trans-Golgi, cuya regulación genética está muy controlada. Una vez formados, los lisosomas desempeñan numerosas funciones celulares, entre las que se incluyen la degradación y reciclaje de moléculas, la regulación de la señalización intracelular y la respuesta a situaciones de estrés. Para la preservación de la homeostasis celular y el correcto funcionamiento de los sistemas biológicos, la regulación de la actividad lisosomal es fundamental (Luzio et al., 2007). 2.2. Los lisosomas como orgánulos multifuncionales Los lisosomas, además de desempeñar un papel crucial en el catabolismo celular pueden actuar como centros señalizadores en las células (Lawrence & Zoncu, 2019). Se encuentran en una posición única para interactuar con otros orgánulos celulares y responder a diferentes estímulos ambientales, contribuyendo así al mantenimiento de la homeostasis y el correcto funcionamiento celular (Perera & Zoncu, 2016; Ballabio & Bonifacino, 2020). Hoy en día, se sabe que los lisosomas están involucrados en muchos procesos biológicos tanto en condiciones fisiológicas como patológicas (Ballabio & Bonifacino, 2020; Yang & Wang, 2021; Zhang et al., 2021). Fisiológicamente los lisosomas desempeñan un papel central en el control de los procesos biológicos, entre los que destacan la regulación del metabolismo celular por la integración de señales procedentes de distintos compartimentos, la respuesta inmune, la reparación de membranas, la migración y adhesión celular y la regulación de eventos transcripcionales y traduccionales (Inpanathan & Botelho, 2019; Martínez-Fábregas et al., 2022). El papel central que ejercen estos orgánulos en la regulación de los procesos biológicos 16 hidrolasas lisosomales, proteínas de membrana lisosomal, proteínas implicadas en el tráfico y proteínas no lisosomales (Bonam et al., 2019; Trivedi, 2020). En las LSD los sustratos no se degradan y se acumulan en los lisosomas, causando estrés y disfunción de las células, tejidos y órganos. Esto puede afectar al desarrollo del sistema nerviosos central y el sistema inmune provocando síntomas severos e incluso la muerte (Ballabio & Gieselmann, 2009; Ren & Wang, 2020). Hasta la fecha, se han descubierto más de 70 tipos de LSD. A pesar de que la incidencia de cada tipo sea muy baja, los trastornos de almacenamiento lisosomal como grupo, es una de las enfermedades genéticas más comunes. Dependiendo del sustrato que se acumule en el interior de los lisosomas se distinguen distintos tipos de esta enfermedad. Por ejemplo, la enfermedad de Pompe, una mutación en el gen GAA que codifica para la enzima α-glucosidasa lisosomal provoca la acumulación generalizada de glucógeno tipo II que afecta principalmente a los músculos esqueléticos y respiratorios (Dasouki et al., 2014). Por otro lado, una mutación en el gen GBA, que codifica para la enzima glucocerebrosidasa lisosomal provoca la enfermedad de Gaucher, que presenta la organomegalia y la citopenia como características clínicas (Stirnemann et al., 2017). De manera similar, una mutación en la isoforma A o B del gen HEX que codifica para la hexosamidasa causa la enfermedad de Tay-Sachs o Sandhoff (Dersh et al., 2016). Análogamente, defectos en las proteínas de la membrana lisosomal como LAMP2 y NPC1 causan las enfermedades de Danon y Niemann-Pick tipo C, respectivamente (Seranova et al., 2017). Muchas enfermedades de almacenamiento lisosomal están relacionadas con fenotipos neurodegenerativos. Algunas mutaciones que causan LSD se consideran factores de riesgo para el desarrollo de trastornos neurodegenerativos de aparición tardía como la enfermedad de Alzheimer (EA), la enfermedad de Parkinson (EP), la enfermedad de Huntington y la demencia frontotemporal (FTD) (Perera & Zoncu, 2016). 2.4.2. Enfermedades autoinmunes En las enfermedades autoinmunes, el sistema inmune ataca erróneamente a sus propias células y tejidos, dando lugar a disfunciones en varios sistemas y órganos. Los lisosomas desempeñan un papel fundamental en las vías centrales del sistema inmunitario, incluidos el procesamiento y presentación de antígenos, la señalización de la muerte celular, el procesamiento de citoquinas, la activación de señalización mediada por el receptor Toll-like (TLR), etc. Se ha visto que los lisosomas desempeñan un papel multifacético en este tipo de 17 trastornos al demostrar que la autofagia, la expresión de enzimas lisosomales y el pH luminal de las células inmunes están alterados en los pacientes que padecen este tipo de trastornos (Bonam et al., 2018). En la autofagia, los autofagosomas formados se deben fusionar con los lisosomas para procesar antígenos, eliminar restos apoptóticos nocivos, reciclar moléculas y producir energía. Si se producen alteraciones en este procesamiento se pueden ver afectadas las funciones inmunitarias de las células, como el control de la liberación de citoquinas, la anergia de las células autoinmunes, la muerte celular programada y la autofagia (Wang et al., 2017; Bonam et al., 2019). Los lisosomas pueden estar implicados en la patogénesis y la progresión de distintas enfermedades autoinmunes como el lupus eritematoso sistémico (LES), la artritis reumatoide (AR), el síndrome de Sjögren (SjS), la enfermedad de Crohn, la esclerosis lateral amiotrófica (ELA) y la esclerosis múltiple (EM) (Zhang et al., 2021). a. El lupus eritematoso sistémico es un trastorno autoinmune caracterizado por la producción de autoanticuerpos, inflamación aberrante y daño multiorgánico. La autofagia activada respalda la supervivencia, el desarrollo y la diferenciación de las células B y las células T (Zhang et al., 2021). En el LES la autofagia se encuentra desregulada (Gros et al., 2012), demostrándose la correlación entre los genes ATG, implicados en la autofagia, y la susceptibilidad al LES (Qi et al., 2019). b. En la artritis reumatoide se ha observado que los lisosomas en las células inflamatorias, como los fibroblastos sinoviales y los macrófagos, están hiperactivos. Esto puede contribuir a la degradación excesiva del cartílago y la inflamación crónica en las articulaciones afectadas. Una autofagia excesiva puede exacerbar la autoinmunidad en la AR (Matsuzawa-Ishimoto et al., 2018). 2.4.3 Enfermedades neurodegenerativas Muchos trastornos neurodegenerativos se caracterizan por la agregación de proteínas y orgánulos anormales. Para la supervivencia de las neuronas es esencial eliminar estos agregados neurotóxicos que se acumulan en el cerebro mediante la vía autofagia-lisosoma (ALP) (Boland et al., 2018). Varias enfermedades neurodegenerativas como la enfermedad de Alzheimer (EA), la enfermedad de Parkinson (EP) y la enfermedad de Huntington (EH) están relacionadas con la eliminación defectuosa por ALP y/o el aumento de la agregación anormal de proteínas características de cada enfermedad (Nixon, 2013; Martini-Stoica et al., 2016; Lie & Nixon, 18 2019; Zhang et al., 2021). Actualmente es difícil esclarecer si ALP defectuosa puede ser la causa o la consecuencia de los trastornos neurodegenerativos. Esta situación se puede agravar con la interacción de ALP disfuncional con agregados neurotóxicos, orgánulos dañados, especies reactivas de oxígeno y un aporte energético insuficiente (Darios & Stevanin, 2020). El lisosoma juega un papel importante en el mantenimiento de la salud neuronal, especialmente dada la capacidad regenerativa limitada y el estado postmitótico de este tipo celular, actuando, así como nexo de una gran variedad de trastornos asociados con la disfunción neurológica. La presenilina-1 (PS-1) está involucrada en la maduración de la v-ATPasa, necesaria para la acidificación del interior del lisosoma y activación de las hidrolasas ácidas. Una mutación en PS-1 altera la autofagia promoviendo el desarrollo de la EA (Lee et al., 2010; Zhang et al., 2021). La EP se caracteriza por el depósito y agregación de α-sinucleína, con la formación de cuerpos de Lewy. Esta proteína aberrante se elimina mediante la autofagia mediada por chaperonas (CMA) para mantener la homeostasis neuronal. Una mutación en LRRK2 bloquea la entrada de esta proteína al lisosoma para su degradación resultando en una autofagia disfuncional y participando en la patología de esta enfermedad (Xilouri et al., 2009; Boecker, 2023). A pesar de haber una gran investigación en esta área, aún no queda claro por qué los sistemas de control de calidad que mantienen la homeostasis neuronal fallan en ciertas ocasiones y no pueden protegen al cerebro de la agregación proteica conduciendo así al desarrollo de enfermedades neurodegenerativas. 3. OBJETIVO Dada la alta prevalencia del cáncer y el papel de los lisosomas en el desarrollo de este, el objetivo principal de este trabajo es llevar a cabo una revisión bibliográfica que describa la función del lisosoma, en especial de las enzimas lisosomales, e intentar recopilar toda la información existente hoy en día referente a su grado de implicación en los procesos tumorales. Todo ello de acuerdo con los siguientes objetivos específicos: - Describir la estructura, función, características y tipos de lisosomas - Estudiar el papel de los lisosomas en la regulación del sistema inmune - Estudiar los mecanismos por los que se altera la homeostasis de los lisosomas en la enfermedad 19 - Analizar el rol que desempeñan las enzimas lisosomales en la progresión tumoral - Examinar la correlación entre los niveles de expresión de distintas proteasas lisosomales y el pronóstico de distintos tipos de cáncer - Sintetizar la información anterior y evaluar la importancia de las enzimas lisosomales en el avance del proceso tumoral con perspectivas de futuro 4. METODOLOGÍA Para la realización de este trabajo se ha llevado a cabo una revisión bibliográfica de la literatura disponible sobre los lisosomas, su función fisiológica y patológica y su relación con la progresión tumoral. Para ello, se han utilizado distintas bases de datos como PubMed, Medline, Scieloo, además de consultar revistas científicas, como Nature, Frontiers, FEBS Press y libros de texto como Introducción a la Biología Celular de la editorial Panamericana (quinta edición, 2021), Biología celular Biomédica de la editorial Elsevier (2015) y Molecular biology of the cell de la editorial Garland Science (2015). De igual modo se han visitado las páginas webs oficiales de la Sociedad Española de Oncología Médica (www.seom.org) y de la Asociación Española Contra el Cáncer (www.contraelcancer.es). La búsqueda se ha realizado principalmente en inglés para acceder a un mayor número de publicaciones, usando palabras clave y frases como “Lysosomes”, “Role of lysosomes”, “Lysosomes in the inmune system”, “Implications of lysosomes in cancer”, “Tumor progression”, “Lysosomal enzymes”, “Cathepsins”, utilizando operadores booleanos “And” y “Or” para ampliar el campo de búsqueda. Así mismo, para hacer la búsqueda más extensiva se ha realizado también en castellano. Para ello se han seleccionado artículos recientes, donde se tuvo en cuenta la lectura del “abstract” y las conclusiones, así como el prestigio de los autores o el lugar de publicación. La búsqueda se realizó entre el 17 de marzo y el 1 de Julio de 2023, utilizando un total de 152 artículos para llevar a cabo este trabajo. A continuación, para realizar el análisis bioinformático de correlación con perfiles de expresión génica se utilizó el servidor web GEPIA2 (gepia2.cancer-pku.cn). Además, para demostrar la correlación obtenida, se obtuvieron imágenes al microscopio de la expresión de las proteasas lisosomales en distintos tipos de cáncer del Human Protein Atlas (www.proteinatlas.org). 20 5. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 5.1. Función de los lisosomas en la biología del cáncer En las últimas décadas la investigación sobre los lisosomas y su implicación en el cáncer ha aumentado significativamente. Se sabe que la función y mal funcionamiento de los lisosomas juega un papel importante en el desarrollo del cáncer (Tang et al., 2020), aunque aún quedan por descubrir muchos de los mecanismos por los cuales están involucrados en la tumorigénesis (Sui et al., 2013; Zhang et al., 2021). Las células tumorales se caracterizan por una alta inestabilidad genómica, alta tasa de mutaciones, capacidad de proliferar continuamente, evitar la muerte celular (Perera et al., 2019), inducir la angiogénesis, invadir, hacer metástasis, evitar la supervisión inmunológica y ser resistentes a la quimioterapia y radioterapia. Para ello dependen en gran medida de una función lisosomal eficaz, que mantenga la homeostasis energética (Tonnessen-Murray et al., 2019), genere componentes básicos para el crecimiento celular y la señalización mitogénica, prepare los tejidos para la angiogénesis, la formación de metástasis (Vidak et al., 2019) y active programas transcripcionales (Castro-Gomes et al., 2016; Davidson et al., 2017). Por consiguiente, la progresión y la transformación del cáncer se caracteriza por grandes cambios de volumen, composición y localización de los lisosomas. Según el contexto, estos cambios pueden ser positivos o negativos, aunque la mayoría contribuyen a la progresión tumoral (Kallunki et al., 2013). Muchas características del cáncer son causa o consecuencia de la función o disfunción lisosomal (Hanahan & Weinberg, 2011; Davidson et al., 2017). Por ello, identificar y comprender los factores y mecanismos que regulan el estado funcional y la distribución espacial de los lisosomas es fundamental para dilucidar la relación entre estos orgánulos y la progresión tumoral. Esta relación proporciona información importante para el diagnóstico y pronóstico de esta enfermedad y para poder generar nuevas dianas terapéuticas (Tang et al., 2020). 5.1.1. Papel de la autofagia en el cáncer ¿supresora o promotora de tumores? La autofagia es una herramienta esencial para mantener la homeostasis celular (Chun & Kim, 2018). En las células cancerosas el papel de la autofagia sigue siendo controvertido ya que puede tener efectos promotores de tumores −favoreciendo el crecimiento del tumor, la resistencia a terapias, la metástasis− y antitumorales −facilitando la eliminación de células cancerígenas (Yun & Lee, 2018)−. Dependiendo del tipo de tumor y la etapa en la que se 21 encuentre puede tener un efecto u otro, por lo que es necesario conocer cómo se desregula la autofagia en los distintos tipos de cáncer para saber que función desempeña. En todas las células existe un nivel basal de autofagia que funciona como mecanismo de supresión de tumores al eliminar proteínas celulares dañadas y sustancias que pueden ser tóxicas para la célula como las especies reactivas del oxígeno (ROS), protegiendo a las células de la alteración en la homeostasis, daños en el ADN e inestabilidad genética, los cuales son clave en la producción de mutaciones oncogénicas para su transformación en células malignas (Galluzzi et al., 2015; Poillet-Perez, 2015; Hewitt & Korolchuk, 2017; Pérez-Montoyo, 2020; Nam, 2021). En las células cancerosas el papel de la autofagia es controvertido, ya que puede tener efectos protumorales y antitumorales. En tumores ya establecidos, la autofagia es fundamental para la supervivencia celular en condiciones de estrés microambiental (Nam, 2021). Cuando las células cancerosas se encuentran en condiciones estresantes −p.e. aumento de la demanda energética, la privación de nutrientes, la hipoxia, la ausencia de factores de crecimiento−la autofagia aparece como una respuesta celular adaptativa que permite que las células cancerosas sobrevivan, desempeñando un papel protumoral. Para ello se regula rápidamente manteniendo la homeostasis celular, garantizando que su tasa de crecimiento sea adecuada a las condiciones metabólicas y promoviendo una degradación aumentada de proteínas y orgánulos excesivos o innecesarios (Sui et al., 2013; Pérez-Montoyo, 2020). Por lo tanto, la autofagia contribuye a la supervivencia de las células tumorales al mejorar la tolerancia al estrés y proporcionar nutrientes para satisfacer las demandas metabólicas de los tumores (Yun & Lee, 2018). Aunque aún no se conocen por completo los mecanismos por los que la autofagia media sus efectos en las células tumorales, se ha visto que las vías de señalización de la fosfatidilinositol 3-quinasa/ Diana mecanicista de rapamicina (PI3K/mTOR) y la proteína quinasa activada por AMP (AMPK) regulan al alza o a la baja la autofagia (Klionsky et al., 2021). mTOR puede ser inhibido por AMPK y p53 y activado por la señal de factores de crecimiento a través de la vía PI3K/Akt. Cuando mTOR se encuentra activo fosforila a ULK1/2 (un complejo de proteínas de autofagia), inhibiendo así la autofagia. Por otro lado, la AMPK suprime la señalización de mTORC1 y estimula la autofagia al fosforilar a TSC1/2. Se ha comprobado que varios genes supresores de tumores como p53, PTEN, TSC1/2 pueden estimular la autofagia y que genes asociados a tumores como p21 y AKT pueden inhibirla (Sui et al., 2013), estableciendo así una clara correlación entre una adecuada regulación de la autofagia y el cáncer. 22 Se ha visto que la deleción de genes que participan en la autofagia puede acelerar la aparición de lesiones tumorales (Yun & Lee, 2018). Se ha demostrado en varios experimentos que la supresión del gen beclin1, que codifica para una proteína que interviene en la formación del fagóforo, provoca una mayor incidencia de cáncer de mama (Liang et al., 1999; Niklaus et al., 2021). Este papel antitumoral de la autofagia se ve reforzado con la certeza de que la autofagia mediada por chaperonas evita la transformación celular maligna al promover la degradación de oncoproteínas y estimular la respuesta inmunooncogénica (Gomes et al., 2017; Arias & Cuervo, 2020). Aunque se ha visto que en algunos tipos de cáncer como el glioblastoma este tipo de autofagia tiene funciones controvertidas (Lo Dico et al., 2021). Actualmente la relación entre la autofagia y la resistencia a la quimioterapia es un tema muy activo en la investigación oncológica. La autofagia en las células tumorales puede tener efectos tanto protectores como promotores en la respuesta a la quimioterapia, y su papel puede variar dependiendo del tipo de cáncer y el agente quimioterapéutico utilizado (Smith & Macleod, 2019). Algunos estudios han sugerido que la activación de la autofagia puede potenciar el efecto citotóxico de los fármacos o dar como resultado resistencia a la quimioterapia al permitir que las células tumorales sobrevivan y se recuperen del estrés inducido por los agentes quimioterapéuticos. En este último caso, la autofagia estaría actuando como un mecanismo de supervivencia que contrarresta los efectos de los fármacos citotóxicos (Niklaus et al., 2021). Por otro lado, existen evidencias que sugieren que la inhibición de la autofagia puede aumentar la eficacia de la quimioterapia en ciertos casos. Al bloquear la autofagia, se impide la capacidad de las células tumorales de adaptarse al estrés, lo que aumenta su sensibilidad a los agentes quimioterapéuticos, mejorando así su efecto (Li et al., 2017). Teniendo en cuenta los efectos opuestos de la autofagia, es esencial una caracterización detallada de los distintos tipos de tumores y el papel que desempeña la autofagia en ellos a la hora de usar inhibidores o inductores de la autofagia como terapia para el tratamiento de esta enfermedad. 5.1.2. Papel de las proteasas lisosomales en procesos tumorales En los últimos años se ha puesto de manifiesto la importancia de las proteasas lisosomales en la progresión tumoral. Los lisosomas liberan enzimas como las catepsinas que remodelan la matriz extracelular (MEC) degradando las fibras de colágeno y las integrinas facilitando la invasión tumoral y la metástasis (Pišlar et al., 2018; Jakoš et al., 2019; Tang et al., 2020; Kos, 2022). Las proteasas lisosomales, además de participar en cambios en la morfología celular, 23 señalización, migración, invasión y metástasis que favorecen la progresión tumoral, pueden potenciar los mecanismos que dan lugar a la regresión del cáncer, como la apoptosis de las células tumorales o las respuestas inmunitarias antitumorales (Kos et al., 2022). Las proteasas lisosomales pueden degradar directamente las proteínas de la MEC o indirectamente al procesar factores dentro de la cascada proteolítica promoviendo así la invasión tumoral, migración celular y metástasis (Brix et al., 2008; Khaket et al., 2019). Se ha visto que las catepsinas extracelulares modulan las interacciones de la MEC con el receptor de la integrina alterando las propiedades adhesivas y migratorias de las células cancerosas (Kos et al., 2009). Además, este tipo de proteasas lisosomales pueden modular el tráfico y reclutamiento de células a través del procesamiento proteolítico de quimiocinas (Repnik et al., 2015) e influir en las vías de señalización modificando factores de crecimiento y eliminando ectodominios de receptores de membrana (Jakoš et al., 2019). Por ello, el aumento de la expresión y/o actividad de las peptidasas lisosomales crea condiciones favorables para la invasión tumoral y la metástasis. Una de las proteasas lisosomales más estudiadas es la catepsina B (CatB), que promueve la progresión tumoral directa e indirectamente degradando proteínas de la matriz extracelular como la laminina, la fibronectina, los tipos de colágeno I y IV y los proteoglicanos y activando a otras peptidasas que degradan la MEC (Kos et al., 2022). Además, esta catepsina activa a TLR3 favoreciendo la migración celular (Garcia-Cattaneo et al., 2012). CatB está involucrada en la proliferación celular a través de la regulación de la producción y señalización de activadores como el factor de crecimiento similar a la insulina I (IGF-I) y el factor de crecimiento transformante-β (TGF-β). El TGF-β tiene propiedades promotoras y supresoras de tumores (Massagué, 2008) y además es un regulador clave de la transición epitelio-mesénquima (EMT), evento crítico en el desarrollo de tumores. Por otro lado, el IGF-I regula y mantiene las propiedades invasivas y metastásicas del fenotipo maligno. Asimismo, la CatB regula las quinasas involucradas en la señalización de Ras/proteína quinasa activada por mitógeno (MAPK)/quinasa regulada por señal extracelular (ERK) y la señalización mediada por la ruta PI3K/Akt, vías esenciales para la progresión tumoral. Además, CatB escinde el inhibidor del ciclo celular p27Kip1 promoviendo la proliferación de células cancerosas (Kos et al., 2022). Las células inmunitarias especializadas como los linfocitos T citotóxicos (LTc) y las células natural killer (NK) contienen lisosomas secretores (Blott & Griffiths, 2002), que regulan la exocitosis lisosómica de los gránulos citotóxicos. Estos gránulos líticos contienen captesinas de 24 cisteína, que junto a las granzimas y perforinas desencadenan la apoptosis en las células diana (Perišić Nanut et al., 2017). Las catepsinas desempeñan un papel crucial en el microambiente tumoral (TME) (Mitrović et al., 2017) ya que además de encontrarse en los lisosomas de las células cancerosas se encuentran en los macrófagos asociados a tumores (TAMs), desempeñando un papel esencial en la regulación de la respuesta inmune y contribuyendo a la invasión de las células tumorales modulando el destino final del tumor (Zhang et al., 2021). 5.1.3. Análisis bioinformático de correlación entre los niveles de expresión de catepsinas y distintos tipos de cáncer En los últimos años, los avances en tecnología de secuenciación de alto rendimiento han permitido la generación de grandes conjuntos de datos de expresión génica, que contienen información sobre los niveles de expresión de proteasas lisosomales en muestras tumorales. Estos datos se pueden analizar utilizando distintos programas bioinformáticos y servidores web, lo que permite identificar patrones de expresión diferencial de catepsinas entre tejidos sanos y tumores, así como entre distintos tipos de cáncer. El análisis bioinformático de correlación entre los niveles de expresión génica de distintas catepsinas en los diferentes tipos de cáncer se ha convertido en una herramienta fundamental para comprender la importancia de estas proteasas lisosomales en la progresión tumoral. Como se ha visto las catepsinas son unas proteasas lisosomales que desempeñan un papel crucial en la degradación y remodelación de la matriz extracelular, lo que contribuye a la invasión y metástasis del cáncer. Aunque trabajos recientes han comenzado a demostrar que estas catepsinas desempeñan papeles cruciales en la biología del cáncer a través de su actividad extralisosomal, las dianas moleculares y los procesos biológicos que regulan aún son desconocidos. La sobreexpresión de catepsinas se ha asociado con una peor prognosis en varios tipos de cáncer, lo que resalta la necesidad de investigar su contribución en la progresión tumoral y su potencial como diana terapéutica. Para ello, el análisis bioinformático de correlación de expresión génica permite identificar qué catepsinas están sobreexpresadas o subexpresadas en diferentes tipos de cáncer brindando información clave sobre la implicación de estas enzimas lisosomales en eventos críticos para el desarrollo y la progresión tumoral. Además, este análisis puede revelar asociaciones entre la expresión de catepsinas y características clínicas de los 25 pacientes, como la supervivencia y la respuesta al tratamiento, lo que tiene implicaciones tanto en el pronóstico como en el desarrollo de terapias dirigidas. A continuación, se muestran las imágenes obtenidas al realizar el análisis bioinformático de correlación de la expresión génica de algunas catepsinas utilizando el servidor web GEPIA2 (gepia2.cancer-pku.cn) junto con imágenes al microscopio de la expresión de estas proteasas lisosomales en distintos tipos de cáncer obtenidas del Human Protein Atlas (www.proteinatlas.org). Fig.4  Expresión diferencial de catepsina V (CatV) en adenocarcinoma de colón (COAD). En esta figura se puede observar en primer lugar (panel izquierdo) un boxplot en el que se compara la expresión de CatV en pacientes con adenocarcinoma de colón (naranja) y personas sanas (azul). En segundo lugar (panel central), se observa un gráfico de supervivencia en el que una alta expresión de CatV (naranja) se correlaciona con una disminución en la supervivencia del paciente, lo que se traduce en un peor pronóstico. Por último (panel derecho), encontramos una imagen al microscopio que muestra la expresión de CatV en un paciente que padece adenocarcinoma de colón. Fig.5  Expresión diferencial de catepsina A (CatA) en carcinoma hepatocelular de hígado (LIHC). En esta figura se puede observar en primer lugar (panel izquierdo) un boxplot en el que se compara la expresión de CatA en pacientes con carcinoma hepatocelular de hígado (naranja) y personas sanas (azul). En segundo lugar (panel central), se puede observar un gráfico de supervivencia en el que una alta expresión de CatA se correlaciona con una reducción en la supervivencia del paciente, lo que se traduce en un peor pronóstico. Por último (panel derecho), encontramos una imagen al microscopio que muestra la expresión de CatA en un paciente que padece carcinoma hepatocelular de hígado. 32 Settembre, C., Di Malta, C., Polito, V. A., Garcia Arencibia, M., Vetrini, F., Erdin, S., Erdin, S. 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