Nanopartículas de PLGA en terapia génica

1 UNIVERSIDAD DE SEVILLA Facultad de Farmacia NANOPARTÍCULAS DE PLGA EN TERAPIA GÉNICA Lidia Cordón Vega 2 UNIVERSIDAD DE SEVILLA FACULTAD DE FARMACIA Trabajo Fin de Grado Grado en Farmacia NANOPARTÍCULAS DE PLGA EN TERAPIA GÉNICA Lidia Cordón Vega Sevilla, 20 de julio de 2021 Departamento de Farmacia y Tecnología Farmacéutica Tutora: Matilde Durán Lobato Trabajo Bibliográfico 3 ÍNDICE DE CONTENIDOS 1.RESUMEN ...................................................................................................................... 4 2.INTRODUCCIÓN .... 5 3.OBJETIVOS ................................................................................................................... 7 4.MATERIALES Y MÉTODOS......................................................................................... 8 5.RESULTADOS Y DISCUSIÓN ....................................................................................... 9 5.1.COMPOSICIÓN DE LAS NANOPARTÍCULAS ....................................................... 10 5.1.1.MATERIAL GENÉTICO ........................................................................................ 11 5.1.2.MATERIAL BASE DE LAS NANOPARTÍCULAS: POLÍMERO DE PLGA ......... 12 5.1.2.1.CARACTERÍSTICAS FISICOQUÍMICAS DEL POLÍMERO PLGA ................. 13 5.1.2.1.1.PROPORCIÓN LÁCTICO/GLICÓLICO (L/G) ................................................ 13 5.1.2.1.2.PESO MOLECULAR Y GRUPO TERMINAL FUNCIONAL DEL POLÍMERO .............. 14 5.1.3.PEGILACIÓN (polietilenglicoles) ............................................................................ 14 5.1.4.EXCIPIENTES CATIÓNICOS................................................................................ 16 5.1.4.1.Quitosano .............................................................................................................. 16 5.1.4.2.Polietilenimina (PEI) ............................................................................................. 19 5.1.4.3.DOTAP (1,2-dioleico, 3-trimetilamoniopropano)................................................... 20 5.1.4.4.LIP (lipofectamina) ............................................................................................... 21 5.1.5.LIGANDOS APTÁMEROS ..................................................................................... 22 5.2.PROPIEDADES DE LAS NANOPARTÍCULAS ........................................................ 22 5.2.1.TAMAÑO, CARGA SUPERFICIAL Y MORFOLOGIA......................................... 22 5.2.2.EFICACIA DE ENCAPSULACIÓN ........................................................................ 25 5.2.3.INTEGRIDAD ESTRUCTURAL DEL MATERIAL GENÉTICO .......................... 25 6.MÉTODOS DE PRODUCCIÓN ................................................................................... 27 7.ENFERMEDADES ESTUDIADAS PARA SU TRATAMIENTO MEDIANTE PLGA NPs COMO TERAPIA GÉNICA ..................................................................................... 31 7.1.FIBROSIS QUÍSTICA................................................................................................ 31 4 7.2.LESIONES PULMONARES ...................................................................................... 31 7.3.INFLAMACIÓN CRÓNICA ...................................................................................... 32 7.4.ENFERMEDAD INFLAMATORIA INTESTINAL.................................................... 33 8.CONCLUSIONES .. 34 9.BIBLIOGRAFÍA ........................................................................................................... 35 5 1. RESUMEN En los últimos años, la terapia génica ha ido ganando cada vez más presencia en la clínica como tratamiento frente a un gran número de enfermedades, especialmente frente a aquellas que no cuentan con un tratamiento eficaz. El desarrollo de nanosistemas como vectores no virales para la administración de material genético (ADN o ARN) supuso un importante avance en este campo. Entre los nanosistemas investigados para este propósito, destacan las nanopartículas (NPs) poliméricas de ácido poli(láctico-co- glicólico) (PLGA) (PLGA NPs), debido a su biocompatibilidad y capacidad para el transporte y transferencia de material genético hacia las células, tejidos u órganos diana. Sin embargo, a pesar de sus ventajas, las PLGA NPs también presentan ciertas carencias como vectores no virales. Estos inconvenientes pueden suplirse mediante el control de sus propiedades físico-químicas, así como mediante su combinación con otros materiales. El objetivo de este trabajo de revisión ha sido el estudio del estado actual de desarrollo de las PLGA NPs como vectores no virales, con especial atención en las estrategias para la optimización de sus propiedades, los materiales incorporados en su diseño y una breve discusión de las enfermedades para las que se propone la aplicación de esta estrategia terapéutica. De los resultados obtenidos del análisis bibliográfico, destacaron: i) la selección de la estructura específica del polímero; ii) el control de diversos parámetros en los métodos de producción; iii) el empleo de polietilenglicol (PEG) para evadir el sistema inmune y prolongar el tiempo de circulación de las NPs; y iv) la incorporación de materiales catiónicos para mejorar la asociación del material genético y el escape lisosomal. Además, resultados recientes de la evaluación preclínica de esta estrategia como tratamiento para enfermedades de especial relevancia actual pusieron de manifiesto el potencial de las PLGA NPs como vector no viral de amplia aplicación. Palabras clave: terapia génica, nanopartículas, PLGA, ADN, ARN 6 2. INTRODUCCIÓN La terapia génica es el proceso por el cual se tratan enfermedades mediante transferencia de material genético a células diana, bien para modificar genes defectuosos, reemplazarlos o regular su expresión. Para ello, el material genético a transferir deberá internalizarse en la célula de interés, para posteriormente insertarse en el genoma o permanecer en el citoplasma. Uno de los objetivos principales de la terapia génica es desarrollar vehículos adecuados que transporten de manera eficiente y específica el material genético estas localizaciones (Muñoz, 2014). Los vehículos disponibles actualmente se clasifican en sistemas virales y no virales. Aunque los sistemas virales se emplean en gran medida por su gran efectividad, presentan problemas de seguridad para uso humano, ya que pueden generar una importante respuesta inmune en el hospedador, así como oncogénesis, por lo que los sistemas no virales destacan como alternativa. (Kang et al. 2008) En comparación con los sistemas virales, los no virales ofrecen las ventajas de presentar baja toxicidad, la respuesta inmune que inducen es reducida, y permiten un transporte específico hacia los tejidos de interés, entre otras. Sin embargo, también presentan una limitada transferencia del material genético in vivo en comparación a los sistemas no virales (Jagani et al. 2012). Gran parte de los sistemas no virales se encuadrarían en el campo de la nanomedicina. La nanomedicina es el campo de la medicina que aprovecha las propiedades de los nanomateriales para superar las limitaciones de las formulaciones farmacéuticas tradicionales gracias a su pequeño tamaño, que les permite modular la interacción con las barreras biológicas del organismo, consiguiendo gracias a ello una transferencia de mayor eficacia (Soler et al. 2019). En este contexto, en el ámbito de la nanomedicina, las nanopartículas como sistemas no virales constituyen un gran campo de estudio. Las nanopartículas son sistemas coloidales dispersos que pueden adquirir diferentes tamaños, en un rango de 1-1000 nm. Presentan diferentes propiedades en función de la naturaleza de los materiales, lo que permite modular sus características en función de su composición, principalmente su tamaño de partícula y carga superficial (Soler et al. 2019). Gracias al tamaño nanométrico que ofrecen los sistemas de transferencia, los ácidos nucleicos asociados pueden atravesar barreras fisiológicas muy restrictivas, tales 7 como la barrera hematoencefálica (BHE), así como escapar del sistema fagocítico mononuclear, incrementando su viabilidad. En general, los sistemas de nanopartículas disponibles para el transporte de material genético se pueden diferenciar en dos grandes grupos: sistemas que encapsulan el material genético en su interior y sistemas que lo transportan asociado a su superficie. Estos últimos se usan en menor medida debido a que el material genético en general (ADN y ARN) es muy susceptible a la degradación enzimática y quedaría expuesto al no estar protegido en el interior del transportador (Díez, Miguéliz, Tros, 2009). Entre las nanopartículas para la encapsulación y transferencia de material genético, destacan las nanopartículas constituidas por polímero de ácido poli (D, L-láctico-co- glicólico) (PLGA). El PLGA es un material sintético hidrofóbico ampliamente usado en biomedicina como componente de nanopartículas, ya que su biocompatibilidad y biodegradabilidad ha quedado demostrada en uso clínico humano por parte de la FDA. Además, protege al material genético de la digestión enzimática por parte de las nucleasas e incrementa su vida media in vivo (Ding, Zhu, 2018). El tiempo de degradación de PLGA puede variar desde días hasta años en función del peso molecular, la acidez del polímero según la proporción de los ácidos lácticos y glicólicos, y la estructura de la nanopartícula. Gracias a ello, las PLGA NPs ofrecen una liberación controlada de fármacos, incluido el material genético (Farokhzad et al, 2006). Esta liberación prolongada se traduce en una expresión sostenida de genes (Ribeiro et al, 2007), la cual cobra gran importancia como tratamiento de ciertas enfermedades. Los polímeros de PLGA se pueden emplear como único material de síntesis de nanopartículas, pero la eficiencia de transferencia las mismas es menor que cuando se formulan en conjunto con otros materiales lipídicos (DOTAP) o poliméricos (quitosano, polietilenimina). Esto se debe a que la inclusión de estos materiales modifica características críticas de las nanopartículas y, en consecuencia, su modo de actuación en el organismo. Gracias a ello, se consiguen importantes ventajas que serán mencionadas con posterioridad. 8 3. OBJETIVOS El objetivo principal que se persigue en este trabajo de fin de grado es realizar un análisis del estado de la técnica de las nanopartículas de PLGA (PLGA NPs) destinadas a la terapia génica, con especial énfasis en los aspectos que han posibilitado su desarrollo y posibles estrategias de mejora para el futuro. Para ello, se establecen los siguientes objetivos parciales: 1. Identificar qué tipo de material génico se emplea en las PLGA NPs destinadas a terapia génica 2. Identificar los componentes de las nanopartículas y las funciones que se les atribuyen 3. Analizar la estructura de las nanopartículas 4. Comparar los diferentes métodos de producción de las mismas 5. Identificar las enfermedades en las que se emplean estos nanosistemas 9 4. MATERIALES Y MÉTODOS El presente trabajo se ha llevado a cabo realizando una extensa revisión bibliográfica empleando principalmente la base de datos Scopus. Se ha accedido a la misma a través de los recursos electrónicos de la página web de la Universidad de Sevilla. En esta búsqueda se emplearon las palabras clave: ‘’PLGA AND nano* AND (RNA OR DNA)’’. La búsqueda se limitó a artículos experimentales, sin limitación temporal ni de idioma. Del total de los artículos resultantes, se descartaron aquellos en los que, tras su lectura, se observó que no aludían a la encapsulación de material genético. Finalmente, se dedicó especial atención a aquellos trabajos que incluían experimentos in vivo. Esta búsqueda se llevó a cabo entre febrero y abril de 2021. 16 Figura 5. Resumen esquemático de la obtención de NPs de PLGA/PEG que encapsulan anti-miR. El resultado es una NP esférica compuesta del polímero PLGA que encapsula en su interior el material genético, Anti-miR, en este caso. Se recubre finalmente con PEG para modificar la carga neta de la NP (Devulapally, et al. 2015). Devulapally et al. mostraron como NPs de PLGA/ PEG que encapsulan Anti-miR, tras su administración en células MDA-MB-231 se localizaron inicialmente en regiones periplásmicas dentro de las células y posteriormente en el citoplasma. Sin embargo, no se acumularon apenas en el núcleo. Finalmente, comprobaron si el material genético estaba verdaderamente protegido de las nucleasas en estas formulaciones. Para ello, se incubaron las NPs con sérum de ratón y se hicieron medidas a diferentes tiempos para ver analizar la estabilidad del material genético. Los resultados obtenidos fueron favorables ya que se comprobó cómo el ARN en este caso se mantuvo protegido. Como conclusión, se observó que el PEG contribuyó a la protección del ARN, no es tóxico y por tanto un excipiente adecuado para su uso en PLGA NPs. 5.1.4. EXCIPIENTES CATIÓNICOS Son moléculas de carga positiva capaces de modificar la carga superficial negativa de las PLGA NPs mediante la formación de un complejo por interacciones electrostáticas, solucionando el inconveniente del limitado transporte de las PLGA NPs de carga negativa (Du et al, 2015). El complejo excipientes catiónicos-material genético-PLGA con carga positiva interacciona con los proteoglicanos con carga neta negativa de la superficie de las 17 membranas celulares, para luego traspasar las barreras fisiológicas por endocitosis. Otra propiedad relevante es que debido a la carga positiva de los excipientes catiónicos se producen interacciones electrostáticas con las cargas negativas del material genético, procedentes de los grupos fosfatos, contribuyendo a la encapsulación del mismo (Chumakova et al, 2008). Por ultimo y no menos importante, estos materiales aportan las características idóneas para que tenga lugar el escape del endosoma y la posterior liberación del material genético en el citosol. Este efecto tiene lugar mediante la desestructuración de la membrana del endosoma ante alteraciones de pH que modifican la densidad de carga de las NPs. Por otra parte, entre las desventajas destaca que la carga positiva que aportan a las nanopartículas induce mayor respuesta inmune (Kumar et al. 2012) y, por tanto, reducen su tiempo de vida media en el organismo. 5.1.4.1. Quitosano Es un polímero biodegradable obtenido de la deacetilación de la quitina (polisacárido hidrofílico) que modifica la superficie de las NPs poliméricas y condensa el material genético. Con todo ello, forma complejos estables por carga electrostática útiles para la transferencia génica por su capacidad para proteger los ácidos nucleicos de las nucleasas y prevenir su eliminación de la sangre, aumentando su vida media (Bolhassani et al, 2014). Figura 6. Imagen obtenida por microscopia electrónica de NPs de PLGA/ ARNsi/ quitosano. (Jagani et al, 2013) Al igual que el resto de los polímeros, el complejo formado entre el material genético y el quitosano se introduce en las células mediante endocitosis. Posteriormente se disocia 18 el complejo en el endosoma y el material genético se libera en el citosol, que finalmente, se transloca al núcleo en el caso del ADN. La eficiencia de la transferencia genética depende de las fracciones acetiladas que presente, el grado de polimerización, la arquitectura de la cadena y las modificaciones químicas. Además, se ha comprobado que la transferencia genética es más eficiente cuando el pH es menor que 7, dado que los grupos aminos del quitosano se protonan y la interacción entre el complejo y las cargas negativas de la superficie de las células se ve favorecida (Bolhassani et al, 2014). El principal inconveniente que presenta el uso del quitosano es su baja tasa de transferencia genética en comparación con otros compuestos de carga catiónica. Para mejorar este aspecto puede aumentarse la solubilidad del quitosano mediante modificación química, ya que este en su estructura original es insoluble a pH fisiológico. Alternativamente, pueden incorporarse ligandos (Bolhassani et al, 2014). La incorporación de quitosano en las PLGA NPs influye igualmente en las propiedades físicoquímicas de las NPs. En estudios previos (Jagani et al, 2013) donde se estudiaron complejos de PLGA/ARNsi/quitosano se comprobó que las características fisicoquímicas de las NPs varían en función de la concentración de PLGA y de quitosano. De este modo, variando la concentración de PLGA y manteniendo las concentraciones de quitosano constantes, se llega a la conclusión de que, a mayor concentración de PLGA, mayores son el tamaño y el potencial zeta de las NPs y menor es la polidispersión. Concentración PLGA (mg/ml) Tamaño medio de partícula (nm) PDI Potencial Zeta (mV) 1 260.38 ± 12.40 0.079 ± 0.01 33.2 ± 0.72 2 272.78 ± 16.23 0.062 ± 0.01 34.9 ± 1.92 3 286.19 ± 26.62 0.076 ± 0.03 35.6 ± 0.86 4 294.26 ± 30.31 0.063 ± 0.01 33.1 ± 1.22 5 313.65 ± 19.61 0.059 ± 0.01 34.6 ± 1.81 Tabla 1. Efecto que ejerce el cambio de las concentraciones de PLGA en los parámetros fisicoquímicos manteniendo constante la concentración de quitosano y demás componentes de las NPs (Jagani et al, 2013). 19 Del mismo modo, modificando las concentraciones de quitosano frente a concentraciones constantes de PLGA, se obtuvo la Tabla 2, llegando a la conclusión de que, a mayor concentración de quitosano, mayor es el tamaño de las NPs, mayor es la polidispersión e igualmente mayor es el potencial zeta. Concentración de quitosano (mg/ml) Tamaño medio de partícula (nm) PDI Potencial Zeta (mV) 0.2 248.86 ± 22.20 0.103 ± 0.01 34.6 ± 0.91 0.4 276.66 ± 24.16 0.083 ± 0.01 36.2 ± 0.52 0.6 296.79 ± 34.32 0.146 ± 0.03 39.6 ± 1.11 0.8 322.86 ± 54.63 0.173 ± 0.01 42.9 ± 0.91 1.0 353.39 ± 25.16 0.19 ± 0.01 44.6 ± 0.91 1.5 401.33 ± 40.16 0.206 ± 0.01 45.7 ± 0.72 Tabla 2. Influencia de la concentración de quitosano en parámetros fisicoquímicos como tamaño medio, PDI y potencial zeta de las NPs. (Jagani et al, 2013). 5.1.4.2.Polietilenimina (PEI) PEI y sus derivados son polímeros que presentan una alta densidad de carga positiva en solución acuosa. Son conocidos también como floculantes, porque interactúan muy fácilmente con moléculas cargadas negativamente como el ADN in vivo y lo protege de las nucleasas y otras enzimas tisulares. La PEI se encuentra disponible de forma lineal o ramificada y en una amplia variedad de pesos moleculares, y es considerada uno de los polímeros catiónicos más eficientes en transferencia de genes que (David-Naim et al 2017). La alta eficiencia que presenta este polímero se atribuye a la presencia de una alta densidad de aminas y capacidad tamponadora, ya que la PEI a pH fisiológico se encuentra parcialmente protonada y aún más protonada a pH endosómico, causando la desestabilización del endosoma y como consecuencia un escape más rápido del endosoma (efecto de esponja de protones) (Basarkar, Singh, 2008). 20 Su inclusión en las PLGA NPs influye en el potencial zeta de las mismas, el cuál es indicativo de la estabilidad de la partícula y su capacidad de interacción con las membranas celulares, como anteriormente se ha comentado. Si bien el potencial zeta de los complejos PEI/ADN es muy positivo, el potencial de los complejos PEI/PLGA/ADN continua siendo positivo debido a la presencia de PEI sobre la superficie del polímero de PLGA tal y como se muestra en la Tabla 3(Chumakova et al, 2008). Partícula Potencial-Zeta (mV) PLGA -14.78 ± 2.54 PEI/ADN +20.33 ± 4.52 PLGA/PEI/ADN +13.40 ± 2.596 Tabla 3. Modificación del potencial zeta en las PLGA NPs en función de los excipientes empleados en su composición. El inconveniente que lleva asociado su uso es su alta citotoxicidad in vitro e in vivo, debido a su naturaleza policatiónica, y a que no es biodegradable, por lo que su uso en clínica se ve restringido, si bien esta toxicidad se ve incrementada cuando se emplea como único componente. Por el contrario, cuando se incluye PEI en PLGA NPs, esta toxicidad disminuye notablemente (Jeon et al, 2012). 5.1.4.3.DOTAP (1,2-dioleico, 3-trimetilamoniopropano) Se trata de un lípido catiónico que, al incluirlo en la matriz de PLGA, ha demostrado potenciar la transferencia genética in vitro (Te Boekhorst et al. 2008). Al ser un lípido catiónico tiene la capacidad de aportar carga neta positiva a la superficie de las NPs, lo que permite la interacción con las células de membrana que están cargadas negativamente. El ADN, al presentar carga neta negativa, cuando se interpone con lípidos catiónicos como DOTAP, se une mediante interacciones electrostáticas a la nanopartícula de PLGA que contiene el lípido, la que en última instancia presenta carga neta positiva debido a su presencia. Esta carga neta neta resultante del complejo ADN-nanopartícula catiónica se ve influenciada por la ratio de ADN/ nanopartícula catiónica. 21 En estudios previos se prepararon complejos de ADN/ nanopartículas con carga neta negativa y otros con carga neta positiva para evaluar el efecto que tiene la carga de la superficie del complejo ADN-nanopartícula en la permeación a través de la piel in vitro y la respuesta inmune in vivo (Kumar et al, 2012). Al igual que se comentó anteriormente en relación con el quitosano, sobre la relación entre la concentración de PLGA y el tamaño de la NP, cuando se emplea como constituyente de las NPs un componente catiónico, DOTAP en este caso, se ve incrementado el tamaño y el potencial zeta de las NPs (Figura 7). Figura 7. Relación entre la concentración de DOTAP empleado en la síntesis de NPs y el tamaño y carga que adquieren las mismas. (Kumar et al, 2012) La Figura 7 muestra un estudio en el que se emplearon PLGA y DOTAP como componentes de las NPs. En este caso, cuando se alcanza una concentración de DOTAP de 1 mg/ml cesa el crecimiento de las NPs, es decir, se estabiliza su tamaño. Para poder unir cantidades suficientes de ADNp a la superficie se requirió una concentración mínima de 20 mg/ml de DOTAP. 5.1.4.4.LIP (lipofectamina) Se trata de un material en el que se alternan lípidos catiónicos y de carga neutra, que ofrecen un gran nivel de transfección de genes en comparación con las PLGA NPs que encapsulan el mismo ADNp. La LIP cambia la carga negativa de la superficie de las NPs 22 y esta adquiere una carga neta positiva, lo que incrementa la cantidad de material genético que asociado, además de la capacidad de permeación celular mediante el mecanismo de fusión de membrana. Además, se han conseguido mejores niveles de expresión génica al añadir LIP a la formulación de las NPs. En concreto, Kohen et al. mostraron como en estudios celulares, las PLGA NPs sin LIP presentaron una gran cantidad de ADNp fuera del núcleo, mientras que la inclusión de LIP en las mismas facilitó la salida de ADNp del endosoma y la entrada del mismo al núcleo (Kohen et al, 2000). Figura 8. Ejemplo de NPs de PLGA y DOTAP y su estructura, donde se encapsula material genético en el interior de la nanopartícula (Zhao et al, 2019). 5.1.5. LIGANDOS APTÁMEROS Los aptámeros son oligonucleótidos de ADN o ARN que, mediante interacciones intramoleculares, dan lugar a una configuración terciaria capaz de unirse a las NPs de PLGA en su superficie. Como consecuencia, las NPs decoradas con aptámeros pueden conducirse hacia el órgano, tejido o célula de interés con alta afinidad y especificidad, gracias a las interacciones específicas del aptámero con su célula diana. El motivo por el que se usan estos oligonucleótidos preferentemente en comparación con otras proteínas o anticuerpos con función de targeting es que carecen de inmunogenicidad y son muy estables en un amplio rango de pH, temperatura y ante la presencia de disolventes orgánicos (Farokhzad et al. 2006). 23 5.2. PROPIEDADES DE LAS NANOPARTÍCULAS 5.2.1. TAMAÑO, CARGA SUPERFICIAL Y MORFOLOGIA Las nanopartículas se caracterizan en función del tamaño de partícula, el índice de polidispersión y el potencial zeta (Menon et al, 2014), los cuáles determinan su comportamiento en el organismo. El tamaño ideal de las PLGA NPs destinadas a terapia génica se encuadra dentro del margen de 100-150 nm (Mullick et al. 2016). Los parámetros a controlar en la producción de las NPs, que influyen en el tamaño de partícula a obtener incluyen: • Concentración del polímero. La concentración de polímero utilizado en la producción de las PLGA NPs afecta de forma notable el tamaño a obtener, de modo a menor concentración del polímero menor es el tamaño de las NPs obtenidas. Esto puede observarse en la Figura 9, donde se compara el tamaño de las PLGA NPs obtenidas en función de la concentración de PLGA empleada en su preparación (Kumar et al, 2012). Figura 9. Relación entre la concentración de PLGA empleada en la producción de las NPs y el tamaño obtenido (Kumar et al, 2012). • Encapsulación del fármaco, en este caso, material genético. A mayor cantidad de material encapsulado, mayor tamaño de nanopartícula se obtiene. Dado que tanto una encapsulación alta como un tamaño de partícula pequeño son características deseables, debe establecerse un equilibrio entre ambos parámetros a la hora de diseñar las NPs. 24 • Miscibilidad acuosa del disolvente. La elección de un disolvente miscible o no con el agua viene determinada por el método de obtención que se va a aplicar. En el caso de la nanoprecipitación, que será comentada en secciones posteriores, donde se emplea un disolvente miscible con el agua, a mayor miscibilidad menor será el tamaño de partícula obtenido. En este caso, la acetona suele ser el solvente de elección. Por el contrario, en el caso de la emulsión-evaporación de solvente, que igualmente será comentada en secciones posteriores, debe emplearse un solvente no miscible con el agua. En este caso, el diclorometano suele ser el solvente de elección, y las NPs resultantes suelen presentar tamaños mayores que las obtenidas por nanoprecipitación. En relación con el potencial zeta, las PLGA NPs presentan un potencial zeta negativo debido a los grupos ácidos de la estructura del polímero. Esta carga potencial, tal como se ha comentado anteriormente, supone ciertas limitaciones para el comportamiento de las NPs. Por ello, se han desarrollado estrategias para su modificación, principalmente la inclusión de materiales de carga catiónica o neutra, que serán comentados en secciones posteriores. (Chumakova et al. 2008). En cuanto a la morfología de estas NPs, los métodos que se utilizan para su producción conducen a la obtención de nanopartículas esféricas tal y como se muestran en la figura 10 y figura 11. Figura 10. Imagen de PLGA NPs esféricas obtenidas por microscopía electrónica (SEM) (Chumakova et al. 2008). 25 Figura 11. Imagen de PLGA NPs que encapsulan ADN obtenida por microscopía electrónica de transmisión (Kong et al. 2011). 5.2.2. EFICACIA DE ENCAPSULACIÓN La eficacia de la encapsulación (EE%) es un parámetro que cuantifica la cantidad de material genético encapsulado en las NPs con respecto a la cantidad total de material genético inicialmente empleado en su elaboración (Menon et al. 2014). Conseguir una buena eficiencia de encapsulación es crítico para así llevar hasta la diana terapéutica la máxima cantidad de fármaco posible. Para ello se ha investigado cómo mejorar este parámetro y cómo varía en función de los excipientes que se emplean en la formulación de las NPs. El estudio llevado a cabo por Cohen et al., en el que las nanopartículas de PLGA encapsulan ADNp, se demostró que al añadir calcio a la superficie externa se consigue una eficacia de encapsulación del 70% mientras que, en su ausencia, la eficacia solo es del 28% (Cohen et al, 2000). Esto es debido a que el calcio, al presentar carga positiva, establece interacciones electrostáticas con las cargas negativas de los grupos fosfatos del material genético. Esta observación resalta que la eficacia de encapsulación difiere según los excipientes empleados, principalmente debido a la modificación de la carga negativa de las PLGA NPs, mejorando la capacidad para asociar ácidos nucleicos. Tal y como se ha comprobado, a mayor carga positiva presente en las NPs debido al uso de excipientes catiónicos, mayor será la capacidad de encapsulación. 32 debido a la facilidad de modificar su superficie y a que evitaban una acción sistémica. En 2019, se emplearon específicamente como tratamiento de la lesión pulmonar aguda. (Menon et al. 2014). Se estableció la hipótesis de que al aumentar la expresión controlada de los receptores de eritropoyetina pulmonares (EpoR) se protegerían a los pulmones de sufrir lesiones. Por ello, se diseñaron PLGA NPs para transportar EpoR ADNc hasta los pulmones por vía inhalatoria. Fueron obtenidas por el método DESE. Los resultados de la administración de estas NPs en un modelo de daño pulmonar en ratas, 21 días después tras su aplicación, fueron un aumento de la expresión de EpoR pulmonar y, en consecuencia, la disminución del daño pulmonar. Además, dicho aumento de EpoR activó la vía convencional de señalización de EpoR, disminuyendo la hiperoxia que induce a apoptosis, así como el daño por estrés oxidativo del ADN, proteínas y lípidos, mejorando el edema tisular y manteniendo la morfología alveolar. En conclusión, esta propuesta de PLGA NPs para la expresión de EpoR se podría considerar una estrategia prometedora para tratar lesiones pulmonares (Ravikumar et al. 2016). 7.3. INFLAMACIÓN CRÓNICA La inflamación aparece como un acto de defensa del organismo frente a situaciones adversas como un daño tisular, una infección o una respuesta autoinmune, con el fin de eliminar los estímulos que causan daños al organismo. Si no se logra controlar la inflamación aguda, puede dar paso a situaciones de inflamación crónica (Aldayel et al. 2016). La inflamación crónica cursa con la fabricación y liberación constante de mediadores de la inflamación, como son TNF-alfa, IL-1, IL-2. De todos los mediadores implicados, el TNF-alfa juega un papel clave en el proceso, por lo que el uso anticuerpos anti-TNFalfa se ha mostrado eficaz como tratamiento frente procesos de inflamación crónica. Basándose en ello, se diseñaron PLGA NPs encapsulando TNFalfa ARNsi por el método habitual de la doble emulsión, empleando PEG como agente emulsificante, y consiguiendo así la obtención de NPs pegiladas (Aldayel et al. 2016). Debe destacarse que, en este caso, el PEG se desprende de las NPs ante valores de pH bajos, en concreto 33 aquellas zonas del organismo que presentan inflamación crónica. Como consecuencia, el TNF-alfa ARNsi encapsulado en las NPs es transportado con rapidez al lugar que sufre la inflamación crónica evadiendo la opsonización de las nanopartículas por parte del sistema inmune. Estudios realizados en pie de conejo inflamado mostraron esta acumulación selectiva de PLGA NPs con TNFalfa-ARNsi en la zona inflamada y la disminución de mediadores proinflamatorios en la misma, siendo esto un resultado de gran interés para el desarrollo de estrategias basadas en la actividad del TNF-alfa en procesos de inflamación crónica (Aldayel et al. 2016). 7.4. ENFERMEDAD INFLAMATORIA INTESTINAL La enfermedad inflamatoria intestinal (Intestinal Bowel Disease, IBD) es una patología que cursa con la inflamación crónica e inespecífica del tracto gastrointestinal debido a un desequilibrio en la mucosa intestinal. En ella se incluye tanto la colitis ulcerosa (UC) como la enfermedad de Crohn (CD). A pesar de todos los fármacos que están en investigación, la única cura completa de la colitis ulcerosa es la extirpación del colon (Bao et al. 2021). Se ha demostrado la relación de esta enfermedad con el gen SNX10, que interviene en numerosos procesos fisiológicos, ya que en ratones que presentan inhibido dicho gen, la evolución de la enfermedad se ve inhibida igualmente (Bao et al. 2021). Por ello, una estrategia terapéutica interesante sería conseguir la deleción del mismo. Por otra parte, sería conveniente un tratamiento vía oral, lo que conlleva tener en cuenta la gran susceptibilidad de los ácidos nucleicos frente a nucleasas, debido a lo cual pocos tratamientos basados en terapia génica emplean esta ruta de administración. Estas limitaciones pueden solventarse con NPs. En concreto, Bao et al. propusieron PLGA NPs para la encapsulación de ARN SNX10, con intención proteger el material genético de la degradación enzimática y posibilitar su transfección. Tras testarlas en un modelo animal de la enfermedad, en ratones, consiguieron disminuir los síntomas, concluyendo que las NPs diseñadas podrían ser una opción prometedora para el tratamiento de la IBD (Bao et al. 2021). 34 8. CONCLUSIONES Tras el análisis bibliográfico presentado, se llegó a las siguientes conclusiones: -Los vectores no virales son los más empleados actualmente en terapia génica debido a que los vectores virales presentan mayor toxicidad. -Entre los sistemas no virales, destacan las PLGA NPs por estar constituidas por un material biocompatible y biodegradable aprobado por la FDA, además de por sus propiedades ventajosas para transfectar material genético. -Las propiedades físicoquímicas de estas NPs pueden modularse para conseguir las características deseadas, mediante la selección de la estructura química específica del polímero, el método de producción, y la modificación de varios parámetros en el mismo. -Además, la inclusión de otros materiales que modifiquen las propiedades de estas nanopartículas permite mejorar varios aspectos de especial relevancia para la liberación y transfección del material encapsulado. -Entre estas modificaciones, el empleo de PEG o pegilación permite modificar la superficie de las NPs, que pasa a adquirir carga neutra y carácter hidrofílico, con el fin de escapar al SI y permanecer más tiempo en el organismo. -Por otro lado, la inclusión de excipientes catiónicos, tales como quitosano, DOTAP y LIP, permiten aumentar la encapsulación del material genético y facilitar la entrada de las NPs en las células y el escape de los lisosomas. -Finalmente, la unión de aptámeros en la superficie de estas NPs permite un transporte específico de las mismas hasta las células diana. -Por todo ello, en los últimos años se han propuesto estrategias de tratamiento basadas en terapia génica con PLGA NPs frente a diversas enfermedades de especial relevancia y sin tratamiento eficaz disponible a día de hoy. Como conclusión final, la terapia génica con PLGA NPs supone una estrategia prometedora para el tratamiento de enfermedades con necesidad de alternativas terapéuticas, y un campo de investigación en activo y de creciente interés del que pueden esperarse importantes avances. 35 9. BIBLIOGRAFÍA • Aldayel AM, Naguib YW, O’Mary HL, Li X, Niu M, Ruwona TB, et al. Acid- Sensitive Sheddable PEGylated PLGA Nanoparticles Increase the Delivery of TNF-α siRNA in Chronic Inflammation Sites. Mol Ther - Nucleic Acids. 2016;5(May):340. • Ali A, Alanazi AM, Jabeen M, Chauhan A, Azam M. Therapeutic potential of functionalized siRNA nanoparticles on regression of liver cancer in experimental mice. Scientific reports. 2019; 9:15825. • Bao WL, Wu Q, Hu B, Sun D, Zhao S, Shen X, et al. Oral nanoparticles of snx10- shrna plasmids ameliorate mouse colitis. Int J Nanomedicine. 2021; 16:345–7. • Basarkar A, Singh J. 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