Biología molecular de la asimilación de amonio en cianobacterias

BIOLOGÍA MOLECULAR DE LA ASIMILACIÓN DE AMONIO EN CIANOBACTERIAS INTRODUCCIÓN Francisco. J. Florencia Instituto de Bioquímica Vegetal y Fotosíntesis. Universidad de Sevilla-CSIC. Las cianobacterias son microorganismos capaces de asimilar del medio externo diferentes formas de nitrogeno, como nitrato, nitrito, urea, amonio ó N2, que en el interior celular se convierten en amonio, que es incorporado a esqueletos carbonados a través de la acción secuencial de las enzimas glutamina sintetasa (GS) y glutamato sintasa (GOGAT), constituyendo el denominado ciclo GS-GOGAT, cuyo producto neto es una molécula de glutamato por ciclo. La cianobacteria unicelular Synechocystis 6803 presenta dos GS, denominadas GSI y GSIII, cuyos correspondientes genes son glnA y glnN, e igualmente presenta dos GOGATs denominadas GltS y GltB-GltD, que dependen como donador de electrones de ferredoxina y NADH respectivamente. Otras cianobacterias como la fijadora de dinitrógeno Anabaena 7120, presenta solamente una GS, y una sola GOGAT. La GS constituye el punto central de la regulación del metabolismo del nitrógeno en cianobacterias, de tal modo, que su control permite en última instancia modular el flujo de nitrógeno al .metabolismo celular. La expresión de los genes correspondientes, y su propia actividad se encuentran reguladas en función de distintos factores ambientales, fundamentalmente la fuente de nitrógeno y las condiciones fotosintéticas, mientras que la GOGAT no 147 Biotecnología y Aplicaciones de Microorganismos Pigmentados parece regularse por dichos factores. En este trabajo se presentan datos acerca de los elementos que participan en la asimilación del amonio y su regulación. ASIMILACIÓN DE NITRÓGENO EN CIANOBACTERIAS. Las cianobacterias son capaces de utilizar como fuente de nitrógeno nitrato, nitrito y amonio y determinadas especies también urea (Guerrero y Lara, 1987; Flores y Herrero, 1994). Además, las cianobacterias fijadoras, pueden utilizar también el dinitrógeno atmosférico. El amonio es además la fuente -preferida de nitrógeno lo que se traduce en una inhibición por amonio de la utilización de las otras fuentes alternativas. lsocitralo j IDH C02........,....._NADPH a-KG "tl~ ''t! t! "'"'"'~ N03" No 2• NH 4+ Gln NAR NIR GS GOGAT Glu Figura 1.- Vias de asimilación de nitrato y amonio en cianobacterias. Asimilación de nitrato La asimilación del nitrato como se muestra en la Figura 1 tiene lugar mediante un proceso _que comprende dos pasos: 1) transporte activo del nitrato al interior celular (Flores et al., 1983; Lara et al., 1987; Rodríguez et al., 1992), y 2) su posterior reducción hasta amonio mediante la acción secuencial de la nitrato reductasa y la nitrito reductasa (Manzano et al., 1976; Candau, 1979; Guerrero et al., 1981). En la cianobacteria unicelular 148 F. J. Florencia Synechococcus 7942, los genes estructurales para todas las proteínas implicadas en el transporte y reducción del nitrato hasta amonio, se encuentran formando una misma unidad transcripcional (Luque et al., 1992; Omata et al., 1993). Una estructura similar en la organización de estos genes existe también en Synechocystis 6803 (Kaneko et al., 1996). El nitrato y el nitrito se transportan activamente a través de un sistema multicomponente de 4 polipéptidos productos de los genes nrtA, nrtB, nrtC y nrtD (Omata et al., 1993). La nitrato y la nitrito reductasas son ambas dependientes de ferredoxina reducida (Manzano et al., 1976; Méndez et al., 1981) y están codificadas por los genes narB y nirA respectivamente (Andriesse et al., 1990, Luque et al., 1993; Suzuki et al., 1993). En todas las cianobacterias estudiadas el amonio ejerce un efecto doble sobre la asimilación de nitrato. Por una parte inhibe de forma inmediata el proceso de transporte de nitrato (Ohmori et al., 1977; Flores et al., 1980; Lara et al., 1987), y por otra, el amonio reprime la transcripción d~l operón nirAnrtABCDnarB (Suzuki et al., 1993; Luque et al., 1994). La inhibición de la ruta GS-GOGAT con inhibidores de la GS (MSX) o de la GOGAT (azaserina y DON) suprime ambos efectos del amonio (Flores et al., 1980; Suzuki et al., 1993), sugiriendo que no es el amonio per se, sino productos de su metabolización a través de la ruta GSGOGAT, los que ejercerían ese efecto represor. En las cianobacterias fijadoras de dinitrógeno, al contrario de Jo descrito para el caso de las especies no fijadoras, se requiere la presencia de nitrato o nitrito como inductor de la expresión de la nitrato y la nitrito reductasas, así como del sistema de transporte de nitrato (Herrero et al., 1981). La ru~ GS-GOGAT tomo se presenta en la Figura 1, el amonio se incorpora al esqueleto carbonado a través de la actuación secuencial de dos enzimas, la glutamina sintetasa y la glutamato sintasa, y que se conoce con el nombre de ciclo GS-GOGAT, el rendimiento neto de este ciclo es la formación de una molecula de glutamato, requiriendose 2-oxoglutarato, amonio, ATP y 149 Biotecnología y Aplicaciones de Microorganismos Pigmentados poder reductor en forma de ferredoxina reducida. Dicha ruta por tanto requiere del concurso no solo de dichas dos enzimas, sino además del aporte de esquelet<;>s carbonados que lleva acabo la isocitrato deshidrogenasa. Esta ruta es pues un punto central de regulación de la asimilación del nitrógeno en cianobacterias y a ella vamos a dedicar el resto de este trabajo. El aporte de esqueletos carbonados. Ciclo de los ácidos tricarbmo1icos Las cianobacterias, presentan un ciclo incompleto de los ácidos tricarboxílicos (Pearce et al., 1969; Stanier y Cohen-Bazire, 1977). Esta circunstancia incapacita a la generalidad de las cianobacterias para crecer en la oscuridad a expensas de los sustratos normalmente oxidados a través de este ciclo en otros organismos. La carencia del complejo de la 2- oxoglutarato deshidrogenasa es la responsable de la ausencia de un ciclo de Krebs completo en cianobacterias (Pearce et al., 1969, Kaneko et al., 1996). Alternativamente, la degradación de compuestos orgánicos, azúcares fundamentalmente, se lleva a cabo en cianobacterias a través de la ruta oxidativa de las pentosas-fosfato (Smith, 1982). Las enzimas del ciclo de los ácidos tricarboxílicos que si están presentes en estos organismos, tienen por consiguiente un papel biosintético en la formación de aminoácidos (Stanier y Cohen-Bazire, 1977). La operatividad de esta ruta metabólica requiere la función anaplerótica de la fosfoenolpiruvato carboxilasa, la cual es esencial en la síntesis de precursores de aminoácidos pertenecientes a la familia del aspartato y el glutamato y de tetrapirroles (Smith, 1982). Estos dos aminoácidos, sintetizados a partir de oxalacetato y 2-oxoglutarato respectivamente, son los donadores primarios de grupos a-amino en las reacciones de transaminación. El aporte de 2-oxoglutarato, esqueleto carbonado necesario para la síntesis de glutamato por la ruta GS-GOGAT, relaciona directamente la asimilación de nitrógeno con el metabolismo del carbono y mas concretamente con los cetoácidos provenientes del ciclo de los ácidos tricarboxílicos. 150 F. J. Florencia Mediante experimentos de incorporación de 14C en los intermediarios del ciclo de los ácidos tricarboxílicos se ha comprobado que el marcaje de citrato y 2-oxoglutarato es superior que el observado en malato y oxalacetato (Lawrie et al., 1976). Este flujo preferencial de carbono por la rama del ciclo cuyo producto final es el 2-oxoglutarato, es consistente con el hecho de que la síntesis de glutamato y glutamina a partir de este cetoácido y a través de la rota GS-GOGAT constituye la reacción aminante primaria y el núcleo central en la asimilación y distribución del nitrógeno en cianobacterias. En la Figura 2 se muestra la estrecha relación existente entre la ruta de los ácidos tricarboxílicos y la ruta GS-GOGAT de asimilación de amonio en cianobacterias. co Q co 2 Ciclo reductívo de la$ plriosas fosfato A t PEP }--.. ATP Pir ........... Ala A~c~.k(PJH,[FedrecJI ~a Asp........,_ OAA tr~ /- N.AD(PJH .---~~~=~------. ~ _ID_H ...A:...co2 Fedred2 Fedox Melato N.ADPI'r .- ~ 1 ~ Glu...,._Arg,Pro 'f GOOA "~~te . Fumararo -- -Tetraprroles r FADH 2 [?) Gln Glu ~ Stlcdnato ..,8 + ""-"' NH4 Figura 2. Esquema de las principales rutas metabólicas de asimilación de carbono y su interacción con el nitrógeno en cianobacterias. 151 Biotecnología y Aplicaciones de Microorganismos Pigmentados LOS ENZIMAS Y GENES Isocitrato deshidrogenasa La isocitrato deshidrogenasa, como enzima implicada directamente en la producción de 2-oxoglutarato, representa en cianobacterias la etapa final de una de las ramas del ciclo incompleto de los ácidos tricarboxílicos. El 2-oxoglutarato producido tras la descarboxilación oxidativa del isocitrato es el esqueleto carbonado necesario para la asimilación del amonio por la ruta GS-GOGAT. Los datos existentes en la literatura acerca de las enzimas del ciclo de los ácidos tricarboxílicos en cianobacterias son muy escasos, y se limitan en su mayoría a determinaciones de actividades enzimáticas (Pearce et al., 1969; Neuer y Bothe, 1982), no habiéndose realizado hasta el momento estudios exhaustivos de la mayoría de estas enzimas. La isocitrato deshidrogenasa ha sido quizás la enzima mas estudiada de la ruta al ser la etapa final de la misma. En todas las cianobacterias en las que se ha estudiado se ha descrito la existencia de una única enzima con actividad isocitrato deshidrogenasa, estrictamente dependiente de NADP y de cationesdivalentes (Mg2+ o Mn2 +) para su funcionalidad (Friga y Farkas, 1981; Papen et al., 1983). La NADP-isocitrato deshidrogenasa ha sido purificada y caracterizada por nuestro grupo a partir de las cianobacterias Synechocystis sp. PCC 6803 y Anabaena sp. PCC 7120 (Muro-Pastor y Florencia, 1992, 1994). La enzima está compuesta por dos subunidades identicas (Mr = 57,000) y muestra cinética y parámetros moleculares similares a los de la NADP-IDH de E. coli. El gen correspondiente icd ha sido igualmente clonado en ambas cianobacterias, complementando una estirpe de E. coli carente de dicho gen (Muro-Pastor y Florencia, 1994, Muro-Pastor et al., 1996). La secuencia deducida de aminoácidos muestra una alta homología con la correspondiente de E. coli y son entre ambas cianobacterias 78% idénticas. El intento de obtener mutantes de dicho gen, no fue posible en ambas cianoabcterias, indicando que es un gen esencial para el crecimiento de las mismas, especialmente en el caso de la cianobacteria fijadora de dinitrógeno, mutantes con bajos niveles de 152 F. J. Florencia actividad IDH, mostraban una incapacidad para poder crecer utilizando el dinitrógeno como única fuente de dinitrógeno (Muro-Pastor y Florencia, 1994, Muro-Pastor et al., 1996), lo que sugiere un requerimiento esencial de esta enzima en el heterocisto, donde presenta niveles más elevados que en las células vegetativas, probablemente como productora de NADPH, necesario para la reducción de ferredoxina, que en última instancia actua como donador de electrones para la nitrogenasa. Glutamato sintasa Hasta bien reciente se pensaba en la existencia de una sola enzima monomérica dependiente de ferredoxina conteniendo un centro sulfoférrico (3Fe-4S) y una molécula de FMN (Marqués et al., 1992, Navarro et al., 1995), pero en algunas cianobacterias se han podido detectar dos enzimas con actividad glutamato sintasa, una dependiente de ferredoxina, (Fd-GOGAT) que está codificada por el gen gltS y una segunda enzima dependiente de NADH, (NADH-GOGAT) formada por dos subunidades distintas y codificada por los genes gltD y gltB. Hasta el momento solo se han purificado las Fd-GOGAT de las cianobacterias Synechococcus sp. PCC 6301, y Synechocystis sp. PCC 6803, esta enzima tiene un Mr.::: 170.000, y requiere ferredoxina como donador de electrones (Marqués et al., 1992; Navarro et al., 1995; Schmitz et al., 1996). Synechocystis 6803 es una de las cianobacterias que contienen ambas GOGATs, se han construido mutantes carentes bien de la Fd-GOGAT ó bien de la NADH-GOGAT, y ambos son viables en las diferentes condiciones cte cultivo, indicando que ambas son perfectamente funcionales, no obstante un doble mutante carente de actividad GOGAT no era viable, aún cuando esta cianobacteria contiene una actividad NADP-glutamato deshidrogenasa (Navarro et al., 1995). El análisis filogenético de las secuencias deducidas de aminoácidos de los genes gltS y gltB de Synechocystis 6803 con otras secuencias de glutamato sintasas, claramente indican que los genes de cianobacterias han debido ser los precursores de los que actualmente poseen las plantas y algas, a través de la cianobacteria que dió origen al cloroplasto, en el caso de plantas ambos genes están actualmente transferidos al núcleo 153 Biotecnología y Aplicaciones de Microorganismos Pigmentados como queda reflejado en la Figura 3, donde se muestra que existen tres grupos claramente diferenciados de glutamato sintasas, según la dependencia de donador de electrones, las Fd, las NADH, y las NADPH dependiente, estas últimas son típicas de bacterias como E. coli. Plectonema boryanum SVnechocyst is lHH!.a Phaseolus vulgarls* Saccharomyces cerevlsiae• Azospirllium brasilense gltD Rhodobacter capsulatus Pseudomonas aeruginosa Thlobacilius ferrooxldans Escherichia coli Pyrococcus sp. KOD1 Antlthamnion sp. Porphyra purpurea Spinacea oleracea Zea mays gftS Plectonema boryanum SVnechocystis !!.§!!.a Escherichla col! Pseudomonas aeruglnosa Azospirillum brasllense Rhodobact er capsulat us Plectonema boryanum gltB SVnechogysti!; .!H!.Q.a Phaseolus vulgaris Saccharomyces cerevlslae Methanococcus jannaschíi Figura 3. Arbol filogenético de las glutarnato sintasas. Las distintas secuencias han sido obtenidas de las bases de datos GenBank!EMBL 154 F J. Florencia Glutamina sintetasa La glutamina sintetasa es una de las enzimas claves del metabolismo celular ya que en eUa se une el metabolismo del nitrógeno y el del carbono, por tanto su función es crítica en el funcionamiento del metabolismo celular y está en general sujeta a una regulación muy fina. Existen tres tipos distintos de glutamina sintetasas. La mayoría de los procariotas contiene una GS, formada por doce subunidades idénticas, (Mr 50,000) que están formando dos anillos hexagonales, a esta GS se le denomina GSL En eucariotas existe una GS, denominada GSII, y es una enzima octamérica con subunidades de Mr .:: 40000. En algunos procariotas, como las familias de las Rizobiaceas y ciertas especies de Actinomyces presentan tanto la GSI como la GSII (Merrick y Edwards, 1995). Un tercer tipo de GS denominada GSIII, compuesta de 6 subunidades idénticas, se identificó recientemente en bacterias anaerobias estrictas, como Bacteroides fragilis, que se encuentran en el rumen de mamíferos (Southern et al., 1986). Los tres tipos de GS señalados son bastante diferente en su secuencia de aminoácidos, no obstante 5 dominios relacionados con el sitio activo de la enzima se conservan en todas ellas (Reyes y Florencia, 1994a). En cianobacterias existe una típica GSI procariótica, codificada por el gen glnA, que ha sido purificada y caracterizada en diversas especies como Anabaena 7120, Synechococcus, Calothrix, Phormidium y Synechocystis. Todas ellas presentan una GSI similar en tamaño y composición de subunidades. El gen glnA de diversas cianobacterias ha sido clonado y secuenciado, mostrando en todos los casos una alta identidad, de hecho mayor del 76%, indicando una alta conservación entre ellas (Reyes y Florencia, 1994a). En la cianobacteria Synechocystis 6803, se ha obtenido un mutante carente de GSI que sin embargo no requería glutamina para su crecimiento, un estudio exhaustivo de dicho mutante reveló la existencia de una segunda glutamina sintetasa en esta cianobacteria. La secuenciación del gen correspondiente glnN demostró que el producto de dicho gen era una GS tipo III, homologa a la de Bacteroidesfragilis (44% 155 Biotecnología y Aplicaciones de Microorganismos Pigmentados Flores, E., M.G. 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