Implicación de la disfunción glial en la evolución de la patología en pacientes de Alzheimer

DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA Y BIOLOGÍA MOLECULAR FACULTAD DE FARMACIA UNIVERSIDAD DE SEVILLA IMPLICACIÓN DE LA DISFUNCIÓN GLIAL EN LA EVOLUCIÓN DE LA PATOLOGÍA EN PACIENTES DE ALZHEIMER Memoria presentada para optar al grado de Doctor por la Universidad de Sevilla Clara Muñoz Castro Directores Dr. Javier Vitorica Ferrández Dra. Mª Luisa Vizuete Chacón Sevilla, 17 de noviembre de 2020 Código seguro de Verificación : GEISER-8598-9009-566a-4890-b4af-d14e-6f25-b44a | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-8598-9009-566a-4890-b4af-d14e-6f25-b44a 23/11/2020 10:13:34 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000059958 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-8598-9009-566a-4890-b4af-d14e-6f25-b44a Código seguro de Verificación : GEISER-8598-9009-566a-4890-b4af-d14e-6f25-b44a | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-8598-9009-566a-4890-b4af-d14e-6f25-b44a 23/11/2020 10:13:34 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000059958 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-8598-9009-566a-4890-b4af-d14e-6f25-b44a ÍNDICE Código seguro de Verificación : GEISER-8598-9009-566a-4890-b4af-d14e-6f25-b44a | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-8598-9009-566a-4890-b4af-d14e-6f25-b44a 23/11/2020 10:13:34 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000059958 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-8598-9009-566a-4890-b4af-d14e-6f25-b44a Código seguro de Verificación : GEISER-8598-9009-566a-4890-b4af-d14e-6f25-b44a | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-8598-9009-566a-4890-b4af-d14e-6f25-b44a 23/11/2020 10:13:34 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000059958 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-8598-9009-566a-4890-b4af-d14e-6f25-b44a Índice I A. INTRODUCCIÓN 1 1. Enfermedad de Alzheimer ................................................................................. 3 1.1. Antecedentes ..................................................................................................... 3 1.2. Tipos de Alzheimer .......................................................................................... 5 1.2.1. Alzheimer familiar ..................................................................................... 5 1.2.2. Alzheimer esporádico ................................................................................ 5 2. Rasgos neuropatológicos .................................................................................... 7 2.1. Pérdida sináptica, neuronal y patología neurítica .......................................... 9 2.1.1. Disminución de la densidad sináptica ....................................................... 9 2.1.2. Pérdida neuronal ..................................................................................... 10 2.1.3. Patología neurítica ................................................................................... 10 2.2. Patología amiloide ........................................................................................... 11 2.2.1. Agregación del péptido Aβ ....................................................................... 11 2.2.2. Acumulación patológica de Aβ ................................................................. 14 2.2.2.1. Procesamiento de APP y producción de Aβ ....................................... 14 A. Ruta no amiloidogénica .................................................................. 15 B. Ruta amiloidogénica ....................................................................... 15 2.2.2.2. Degradación y/o aclaramiento de Aβ ................................................. 16 2.2.3. Hipótesis de la cascada amiloide.............................................................. 17 2.3. Patología neurofibrilar y proteína Tau ........................................................... 19 2.3.1. Estructura y función de Tau .................................................................... 19 2.3.2. Fosforilación de Tau ................................................................................. 20 2.3.3. Ovillos neurofibrilares de Tau ................................................................. 20 3. Respuesta inmune en el SNC y en la EA ....................................................... 22 3.1. Células gliales presentes en el parénquima del SNC .................................... 23 3.1.1. Microglía ................................................................................................... 23 3.1.1.1. Funciones de la microglía ................................................................. 24 3.1.1.2. Microglía en la EA ............................................................................. 25 3.1.2. Astrocitos .................................................................................................. 27 3.1.2.1. Funciones de los astrocitos ................................................................ 28 3.1.2.2. Astrocitos en la EA ............................................................................ 30 3.2. Otros componentes celulares del sistema inmune residentes en el SNC ...... 32 3.2.1. Respuesta inmune innata ....................................................................... 33 3.2.1.1. Macrófagos asociados al SNC o macrófagos asociados a barrera ..... 34 3.2.1.1.1. Funciones de los macrófagos asociados al SNC ................. 35 3.2.1.1.2. Macrófagos asociados al SNC en la EA .............................. 35 3.2.1.2. Monocitos y células derivadas de monocitos (CDM) ......................... 36 Código seguro de Verificación : GEISER-8598-9009-566a-4890-b4af-d14e-6f25-b44a | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-8598-9009-566a-4890-b4af-d14e-6f25-b44a 23/11/2020 10:13:34 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000059958 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-8598-9009-566a-4890-b4af-d14e-6f25-b44a Índice II 3.2.1.2.1. Funciones de los monocitos y CDM .................................... 37 3.2.1.2.2. Monocitos y CDM en la EA ................................................. 37 3.2.1.3. Células dendríticas (CD) ................................................................... 39 3.2.1.3.1. Funciones de las CD............................................................ 39 3.2.1.3.2. CD en la EA ......................................................................... 40 3.2.1.4. Neutrófilos ......................................................................................... 41 3.2.2. Respuesta inmune adaptativa ................................................................ 41 3.2.2.1. Linfocitos B ....................................................................................... 42 3.2.2.2. Linfocitos T ....................................................................................... 42 3.2.2.2.1. Linfocitos T colaboradores o helper (Th) ............................. 43 3.2.2.2.2. Linfocitos T citotóxicos (Tc) ................................................ 43 3.2.2.3. Linfocitos en la EA ........................................................................... 43 B. ANTECEDENTES Y OBJETIVOS 45 C. MATERIALES Y MÉTODOS 51 1. Muestras humanas post mortem ..................................................................... 53 2. Animales de experimentación ......................................................................... 54 3. Cultivos celulares primarios ........................................................................... 55 3.1. Cultivos mixtos de microglía y astrocitos ....................................................... 55 3.1.1. Aislamiento de astrocitos ........................................................................ 55 3.2. Cultivos de neuronas ...................................................................................... 56 4. Aislamiento de proteínas solubles (S1) ......................................................... 56 5. Estudio del metabolismo de los astrocitos primarios mediante Seahorse................................................................................................................... 57 5.1. Procedimiento ................................................................................................. 59 6. Ensayos de supervivencia neuronal .............................................................. 59 6.1. Aislamiento de neurosinaptosomas (NS) ........................................................ 60 6.2. Obtención de medio condicionado por astrocitos ............................................ 60 6.3. Filtración de medio condicionado por astrocitos ............................................ 61 7. Inmunofluorescencia para células de cultivo .............................................. 61 7.1. Marcaje inmunofluorescente doble para células de cultivo ........................... 61 7.2. Obtención de imágenes mediante Microscopía Confocal ................................ 62 7.3. Procesamiento de imágenes y cuantificación de neuronas ............................ 62 Código seguro de Verificación : GEISER-8598-9009-566a-4890-b4af-d14e-6f25-b44a | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-8598-9009-566a-4890-b4af-d14e-6f25-b44a 23/11/2020 10:13:34 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000059958 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-8598-9009-566a-4890-b4af-d14e-6f25-b44a Índice III 8. Inmunohistoquímica ......................................................................................... 62 9. Aislamiento de células a partir del cerebro de modelos de EA ................ 64 9.1. Aislamiento de astrocitos ex vivo a partir del cerebro de ratones APP ......... 65 9.2. Aislamiento de microglía, CDM y linfocitos ex vivo del cerebro de modelos APP y TAU ............................................................................................................. 67 10. Aislamiento de ARN, ADN y proteínas ........................................................ 69 10.1. Procedimiento................................................................................................ 70 10.1.1. Aislamiento de ARN ............................................................................... 70 10.1.2. Aislamiento de ADN ............................................................................... 71 10.1.3. Aislamiento de proteínas ........................................................................ 72 11. Retrotranscripción .......................................................................................... 72 11.1. Procedimiento................................................................................................ 73 12. PCR en tiempo real ......................................................................................... 73 12.1. Cuantificación de la expresión génica mediante sondas Taqman ............... 74 12.1.1. Procedimiento ......................................................................................... 75 12.2. Cuantificación de la expresión génica mediante TaqMan® Array Cards .... 77 12.2.1. Procedimiento ......................................................................................... 78 12.3. Identificación del genotipo APOE ................................................................. 78 12.3.1. Procedimiento ......................................................................................... 79 13. Cuantificación de proteínas: Método de Lowry ........................................ 80 14. Western blot ...................................................................................................... 80 14.1. Procedimiento................................................................................................ 81 15. Dot blot .............................................................................................................. 83 15.1. Procedimiento................................................................................................ 83 16. Análisis de datos y clustering ........................................................................ 83 13. Análisis estadístico .......................................................................................... 84 D. RESULTADOS 85 1. Caracterización de la patología y la respuesta microglial en la corteza frontal de pacientes de Alzheimer ..................................................................... 87 1.1. Caracterización de la patología amiloide y neurofibrilar en la corteza frontal en relación con el hipocampo en la EA .................................................................. 87 1.2. Degeneración de neuronas parvalbúmina (PV) positivas en la corteza frontal y el hipocampo en la EA ......................................................................................... 90 1.3. Estudio de la respuesta microglial en la corteza frontal de pacientes de Alzheimer ............................................................................................................... 92 Código seguro de Verificación : GEISER-8598-9009-566a-4890-b4af-d14e-6f25-b44a | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-8598-9009-566a-4890-b4af-d14e-6f25-b44a 23/11/2020 10:13:34 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000059958 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-8598-9009-566a-4890-b4af-d14e-6f25-b44a Índice IV 2. Respuesta astroglial en la patología de Alzheimer ..................................... 95 2.1. Aumento de la reactividad astroglial en muestras post mortem de pacientes de Alzheimer .......................................................................................................... 95 2.1.1. Aumento de reactividad astroglial en muestras post mortem de hipocampo de pacientes de Alzheimer ............................................................... 95 2.1.2. Reactividad astroglial y genotipo APOE en muestras post mortem de hipocampo de pacientes de Alzheimer ............................................................... 98 2.1.3. Reactividad astroglial y neurodegeneración GABAérgica en muestras de hipocampo de pacientes de Alzheimer ............................................................... 98 2.1.4. Reactividad astroglial y patologías Aβ y Tau en muestras de hipocampo de pacientes de Alzheimer ................................................................................. 99 2.1.5. Aumento de reactividad astroglial en muestras post mortem de corteza frontal de pacientes de Alzheimer ................................................................... 100 2.2. Aumento de la respuesta del complemento en el hipocampo y la corteza frontal de pacientes de EA ................................................................................... 102 2.2.1. Aumento de la respuesta del complemento en muestras post mortem de hipocampo de pacientes de EA ......................................................................... 103 2.2.2. La respuesta del complemento en el hipocampo de pacientes de EA parece estar mediada principalmente por los astrocitos reactivos ................ 104 2.2.3. Respuesta del complemento y genotipo APOE en muestras post mortem de hipocampo de pacientes de Alzheimer ........................................................ 105 2.2.4. Respuesta del complemento y neurodegeneración GABAérgica en muestras post mortem de hipocampo de pacientes de Alzheimer ................... 105 2.2.5. Respuesta del complemento y patologías Aβ y Tau en muestras de hipocampo de pacientes de Alzheimer ............................................................. 106 2.2.6. Aumento de la respuesta del complemento en muestras post mortem de corteza frontal de pacientes de Alzheimer ....................................................... 106 2.3. Disminución del metabolismo de los astrocitos in vitro, en modelos y pacientes de EA .................................................................................................... 108 2.3.1. La disminución metabólica de los astrocitos in vitro podría reducir su capacidad neuroprotectora ............................................................................... 109 2.3.1.1. Disminución metabólica de los astrocitos in vitro en presencia de patología Aβ .................................................................................................. 109 2.3.1.2. Pérdida de neuroprotección de los astrocitos in vitro en presencia de patologías Aβ y Tau ...................................................................................... 112 2.3.1.2.1. Los astrocitos proporcionan factores prosupervivencia a las neuronas in vitro ............................................................................... 112 2.3.1.2.2. Las sustancias neuroprotectoras liberadas por los astrocitos tienen una masa molecular pequeña ............................................... 113 2.3.1.2.3. ¿Disminuyen los astrocitos su capacidad neuroprotectora en presencia de las patologías Aβ y Tau? ......................................... 115 Código seguro de Verificación : GEISER-8598-9009-566a-4890-b4af-d14e-6f25-b44a | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-8598-9009-566a-4890-b4af-d14e-6f25-b44a 23/11/2020 10:13:34 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000059958 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-8598-9009-566a-4890-b4af-d14e-6f25-b44a Índice V 2.3.1.2.4. Los astrocitos recuperan su fenotipo neuroprotector cuando el S1 de modelos APP y TAU se elimina del medio ......................... 116 2.3.1.2.5. Los astrocitos disminuyen su capacidad neuroprotectora en presencia de las patologías Aβ y Tau ............................................... 118 2.3.2. ¿Disminuye el metabolismo de los astrocitos en modelos de EA? ......... 119 2.3.3. Disminución del metabolismo de los astrocitos en el hipocampo de pacientes de EA ............................................................................................... 119 3. Infiltración de células inmunes en el parénquima cerebral de pacientes de Alzheimer ......................................................................................................... 126 3.1. En el parénquima cerebral de ratones transgénicos modelos de EA la infiltración de CDM es muy limitada .................................................................. 126 3.1.1. Aislamiento y caracterización de microglía, CDM y linfocitos de la corteza cerebral e hipocampo de distintos modelos murinos de EA................ 127 3.1.2. En los modelos APP y TAU se produce una entrada significativa de linfocitos, pero la infiltración de CDM es limitada .......................................... 128 3.2. Infiltración de CDM en muestras post mortem de hipocampo de pacientes de EA ......................................................................................................................... 129 3.2.1. Análisis de clúster de genes expresados por células microgliales y/o CDM ............................................................................................................ 129 3.2.2. Los marcadores clásicos de microglía activa permanecen prácticamente inalterados en la EA, mientras que la expresión de marcadores asociados a CDM? se incrementa significativamente ......................................................... 131 3.2.3. En pacientes Braak V-VI se produce un aumento significativo en la expresión de las quimioquinas CCL2 y CCL4, así como de su receptor CCR2 ................................................................................................................ 133 3.2.4. El cúster de CDM? no se expresa en células microgliales ..................... 134 3.2.5. En la EA los macrófagos asociados al SNC no parecen infiltrarse en el parénquima cerebral ........................................................................................ 139 3.3. ¿Existe relación entre la infiltración de CDM y otros aspectos de la patología de Alzheimer? ....................................................................................................... 141 3.4. La infiltración de CDM ocurre en múltiples áreas cerebrales en los pacientes de EA .................................................................................................................... 151 4. Caracterización de subpoblaciones o estados de astrocitos y microglía en pacientes de Alzheimer mediante inmunohistoquímica fluorescente múltiple .................................................................................................................. 155 4.1. Muestras humanas post mortem .................................................................. 155 4.2. Procedimiento de la inmunohistoquímica fluorescente múltiple ................. 156 4.3. Procesamiento de imágenes .......................................................................... 161 4.4. Preprocesamiento y análisis de datos ........................................................... 162 Código seguro de Verificación : GEISER-8598-9009-566a-4890-b4af-d14e-6f25-b44a | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-8598-9009-566a-4890-b4af-d14e-6f25-b44a 23/11/2020 10:13:34 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000059958 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-8598-9009-566a-4890-b4af-d14e-6f25-b44a 6 A INTRODUCCIÓN EPHA1, SORL1), y la función del citoesqueleto y del transporte axonal (NME8, CELF1 y CASS4), entre otras (Sancesario y Bernardini, 2018; Pimenova et al., 2018; Kunkle et al., 2019). La mayoría de ellos se expresan preferencialmente en células implicadas en la respuesta inflamatoria del sistema nervioso central (SNC), como la microglía y los astrocitos (Srinivasan et al., 2016; Hansen et al., 2018; Kunkle et al, 2019). Los polimorfismos asociados a un mayor riesgo de EA esporádica se manifiestan en APOE (Apolipoproteína E) y TREM2 (del inglés, triggering receptor expressed on myeloid cells 2) (Robinson et al., 2017). El gen APOE se localiza en el cromosoma 19, y codifica una proteína implicada en el transporte de colesterol, principalmente en forma de HDL, que se secreta predominantemente por células gliales (Leyns y Holtzman, 2017; Perez-Nievas y Serrano-Pozo, 2018). Además de modular la homeostasis lipídica y proteica cerebral (Robinson et al., 2017), APOE interviene como chaperona en el metabolismo y aclaramiento de Aβ, dificultando su eliminación y/o estabilizando los depósitos fibrilares (Kim et al., 2014; Perez-Nievas y Serrano-Pozo, 2018; Kumar y Tsao, 2019). Se ha propuesto además que APOE participa en el proceso neuroinflamatorio (Yamazaki et al., 2019), en las alteraciones sinápticas (Yu et al., 2014), e incluso en la patología Tau y la neurodegeneración que se producen en la EA (Shi et al., 2017b; Yamazaki et al., 2019). Existen tres isoformas de APOE, ε2, ε3 (la más común) y ε4 (Yu et al., 2014), con diferentes efectos en la homeostasis de Aβ (Robinson et al., 2017). ε4 representa, tras la edad, el principal factor de riesgo asociado al Alzheimer esporádico (Robinson et al., 2017; Kumar y Tsao, 2019). Los individuos con una copia de este alelo (14% de la población) incrementan su riesgo tres veces y, los homocigotos, 8-15 veces, debido a una mayor patogenicidad y/o una menor eficiencia en las diferentes vías homeostáticas (Yamazaki et al., 2019; Fernandez et al., 2019). Contrariamente, el alelo ε2 parece tener un papel protector contra el desarrollo de la EA (Conejero-Goldberg et al., 2014; Reiman et al., 2020). TREM2 codifica un receptor transmembrana de superficie celular perteneciente a la superfamilia de las inmunoglobulinas, que en el SNC se expresa específicamente en microglía, participando en su activación, supervivencia y proliferación, así como en procesos de fagocitosis (Hickman y El Khoury, 2014; Ulland et al., 2017; Hansen et al., 2018). Distintas variantes de este gen, como R47H, se asocian a una pérdida de función microglial (Shi et al., 2018) y aumentan entre dos y cuatro veces el riesgo de padecer EA (Jonsson et al., 2013; Leyns y Holtzman, 2017; Hansen et al., 2018). • Factores ambientales La EA esporádica también se asocia a ciertos factores ambientales, considerados como factores de riesgo modificables. Entre ellos, se encuentran la obesidad, el estrés, la hipertensión, la inactividad física y mental, el bajo nivel educativo, la depresión, las enfermedades vasculares, el tabaco, los traumatismos cerebrales y la diabetes mellitus (Xu et al., 2015; Hane et al., 2017a; Robinson et al., 2017; Kivipelto et al., 2018; Serrano-Pozo y Growdon, 2019; Edwards et al., 2019). Código seguro de Verificación : GEISER-8598-9009-566a-4890-b4af-d14e-6f25-b44a | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-8598-9009-566a-4890-b4af-d14e-6f25-b44a 23/11/2020 10:13:34 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000059958 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-8598-9009-566a-4890-b4af-d14e-6f25-b44a 7 A INTRODUCCIÓN Existen múltiples evidencias que implican al sistema vascular cerebral en la EA (Govindpani et al., 2019; Serrano-Pozo y Growdon, 2019); de hecho, los pacientes de Alzheimer tienen su red neurovascular y capilar mucho más reducida, y desarrollan angiopatía amiloide cerebral o CAA (del inglés, cerebral amyloid angiopathy), caracterizada por la presencia de depósitos de Aβ en los vasos sanguíneos cerebrales (Zuroff et al., 2017) que parecen contribuir al declive cognitivo típico de la enfermedad (Greenberg et al., 2020). Todo ello ha llevado a establecer la hipótesis vascular de la EA (de la Torre, 2018). La diabetes mellitus también es un factor de riesgo para la EA (Salas y De Strooper, 2019), ya que la insulina modula la plasticidad sináptica, la memoria y el aprendizaje, y regula el metabolismo de Aβ y de Tau (Sato y Morishita, 2014). Además, en pacientes diabéticos son comunes los daños microvasculares (Domínguez et al., 2014). El género femenino tiene mayor riesgo que el masculino de padecer Alzheimer esporádico, lo que se atribuye a diferencias biológicas, ambientales, sociales y culturales entre ambos sexos (Nebel et al., 2018). Controlar los factores anteriormente expuestos, así como realizar actividades intelectuales y sociales, una actividad física regular y una dieta equilibrada pueden contribuir a reducir el riesgo de desarrollar Alzheimer esporádico (Kivipelto et al., 2018; Serrano-Pozo y Growdon, 2019). 2. RASGOS NEUROPATOLÓGICOS El cerebro de los pacientes de Alzheimer presenta rasgos anatomopatológicos muy característicos (Perl, 2010; Scheltens et al., 2016) (Figura A.2). Figura A.2. Rasgos neuropatológicos de la EA. A nivel macroscópico, la enfermedad se caracteriza por atrofia cerebral asociada a la pérdida de sinapsis y neuronas. A nivel microscópico, los cerebros de pacientes de Alzheimer se caracterizan por la deposición de placas de Aβ y ovillos neurofibrilares de la proteína Tau hiperfosforilada, así como pérdida sináptica, degeneración neuronal y patología neurítica. Además, se produce una importante respuesta microglial y astrocítica. Imagen tomada de Congdon y Sigurdsson, 2018. Enfermedad de AlzheimerSano Código seguro de Verificación : GEISER-8598-9009-566a-4890-b4af-d14e-6f25-b44a | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-8598-9009-566a-4890-b4af-d14e-6f25-b44a 23/11/2020 10:13:34 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000059958 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-8598-9009-566a-4890-b4af-d14e-6f25-b44a 8 A INTRODUCCIÓN A nivel macroscópico, se produce una importante atrofia cortical (que afecta principalmente al lóbulo temporal medial), adelgazamiento de las circunvoluciones y ensanchamiento de los surcos, engrosamiento de las meninges, dilatación de las cavidades ventriculares, disminución del bulbo olfatorio y pérdida de peso y volumen cerebral (Serrano-Pozo et al., 2011a) (Figura A.3). También es frecuente encontrar algún tipo de patología cerebrovascular. Actualmente, existen técnicas de neuroimagen de alta resolución que permiten visualizar la atrofia cerebral incluso en etapas prodrómicas, y que pueden ser de gran utilidad para el diagnóstico y estudio de la evolución de la enfermedad (Drago et al., 2011; Kälin et al., 2017; Coupé et al., 2019; Gupta et al., 2019). Figura A.3. Corte coronal de un hemicerebro humano sano (izquierda) y de un paciente de Alzheimer (derecha). El cerebro afectado por la EA posee un menor volumen y ventrículos más dilatados. Esta atrofia afecta fundamentalmente a los lóbulos temporales, frontales, parietales y occipitales. Las regiones donde residen las funciones de memoria (hipocampo) y lenguaje (áreas de Broca y de Wernicke) son las más afectadas. Imagen tomada de DeTure y Dickson, 2019. Por otro lado, las alteraciones microscópicas características de la EA son: (1) disminución de la densidad sináptica, degeneración neuronal y patología neurítica, (2) acumulación de proteínas extracelulares en forma de placas de péptido βamiloide, (3) ovillos neurofibrilares intraneuronales de la proteína Tau hiperfosforilada (NFT; del inglés, Neurofibrillary tangles) (Gomez-Isla et al., 2008; Perl, 2010) y (4) proceso neuroinflamatorio mediado por células gliales (Serrano-Pozo et al., 2011a; Heneka et al., 2015; Zhang y Jiang, 2015) (Figura A.2). Estas lesiones se manifiestan principalmente en áreas cerebrales implicadas en los mecanismos de memoria y aprendizaje, y en los procesos cognitivos focales. Las cortezas motora, visual y sensorial primarias sólo se alteran a veces y en estadios muy avanzados de la enfermedad (Thompson et al., 2003). Curiosamente, la propagación de los depósitos extracelulares de Aβ sigue un patrón de distribución anatómico contrario (en cierto grado) al de la patología Tau (Jucker y Walker, 2011). La patología Aβ comienza en el neocórtex, progresa hacia la allocorteza y, por último, se extiende a estructuras subcorticales (Jucker y Walker, 2011). Atendiendo a la localización de los ovillos neurofibrilares, los enfermos de Alzheimer se clasifican en seis estadios o etapas, que correlacionan altamente con el desarrollo de la enfermedad y se denominan estadios de Braak (Braak y Braak, 1991). De manera resumida, la patología Tau comienza en el locus coeruleus y la corteza entorrinal (Braak I-II), avanza hacia el hipocampo y la corteza asociativa (Braak III-IV), y afecta, en estadios posteriores, a las áreas sensoriales primarias (Braak V-VI) (Braak y Braak, 1991; Hane et al., 2017a; Gao et al., 2018) (Figura A.4). Código seguro de Verificación : GEISER-8598-9009-566a-4890-b4af-d14e-6f25-b44a | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-8598-9009-566a-4890-b4af-d14e-6f25-b44a 23/11/2020 10:13:34 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000059958 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-8598-9009-566a-4890-b4af-d14e-6f25-b44a 9 A INTRODUCCIÓN Figura A.4. La acumulación de Aβ y Tau sigue patrones característicos y predecibles en la progresión de la patología de Alzheimer. La deposición de placas de Aβ comienza en regiones isocorticales, progresa hacia zonas límbicas y, por último, se desarrolla en estructuras subcorticales. La patología Tau comienza en las regiones entorrinal y transentorrinal (Braak I y II); después se extiende al hipocampo (Braak III y IV) y, finalmente, a la isocorteza (Braak V y VI). La progresión de la agregación y deposición de Tau correlaciona altamente con el desarrollo de la enfermedad. Imagen modificada de Jucker y Walker, 2013. 2.1. Pérdida sináptica, neuronal y patología neurítica En la enfermedad de Alzheimer se produce una pérdida importante de sinapsis y neuronas (Forner et al., 2017; Hane et al., 2017a), que afecta principalmente al hipocampo y a la neocorteza, y es responsable del declive cognitivo típico de esta enfermedad (Duyckaerts et al., 2009). 2.1.1. Disminución de la densidad sináptica Estudios histológicos y bioquímicos han demostrado que en la corteza entorrinal e hipocampo de pacientes de EA, precediendo a la muerte neuronal, se produce una pérdida de un 25-35% de sinapsis (Gomez-Isla et al., 1996a; Price et al., 2001; Overk y Masliah, 2014; de Wilde et al., 2016). Dicho hallazgo es el que mejor correlaciona con los déficits cognitivos asociados a la patología (Forner et al., 2017; Colom-Cadena et al., 2020). Numerosos estudios tratan de esclarecer las relaciones moleculares entre Aβ, Tau y las alteraciones sinápticas (Forner et al., 2017). Aunque Aβ participa de manera fisiológica en el desarrollo de las sinapsis, niveles elevados de este péptido disminuyen la excitabilidad neuronal y provocan la internalización de receptores AMPA, lo que facilita la depresión a largo plazo (LTD) e inhibe la potenciación a largo plazo (LTP), y, en consecuencia, media la pérdida de sinapsis electrofisiológicamente activas (Shankar et al., 2007; Viola y Klein, 2015; Chen, 2018). Por su parte, Tau, además de estabilizar los microtúbulos y regular el Patología Aβ Patología Tau Tiempo Desarrollo de la enfermedad Fase preclínica DemenciaDeterioro cognitivo leve Fase A (isocortical) Fase B (límbica) Fase C (subcortical) Braak I-II (c. perirrinal) Braak III-IV (hipocampo) Braak V-VI (isocorteza) Código seguro de Verificación : GEISER-8598-9009-566a-4890-b4af-d14e-6f25-b44a | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-8598-9009-566a-4890-b4af-d14e-6f25-b44a 23/11/2020 10:13:34 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000059958 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-8598-9009-566a-4890-b4af-d14e-6f25-b44a 10 A INTRODUCCIÓN transporte axonal también interviene en la función sináptica; las formas patológicas de Tau median la internalización de los receptores NMDA potenciando la LTD (Spires-Jones y Hyman, 2014), y alteran el tráfico de mitocondrias y receptores hacia las sinapsis, así como la señalización por calcio (Forner et al., 2017). Las formas solubles de Aβ y/o Tau, pero no las fibrilares y/o agregadas, son las causantes de los fallos sinápticos (Crimins et al., 2013; Spires-Jones y Hyman, 2014; Hane et al., 2017a; Forner et al., 2017; Gao et al., 2018). También se ha propuesto que la microglía y los astrocitos, a través de una regulación positiva anormal del sistema del complemento, contribuyen a la pérdida de sinapsis y a la muerte neuronal (Castro-Gomez et al., 2019; Chew y Petretto, 2019). 2.1.2. Pérdida neuronal En la EA se produce una degeneración neuronal selectiva que afecta de manera progresiva a regiones y tipos celulares concretos (Duyckaerts et al., 2009; Jeong, 2017), fundamentalmente a la región CA1 del hipocampo (Price et al., 2001) y a la capa II de la corteza entorrinal (Gomez-Isla et al., 1996a; Price et al., 2001), pero también al bulbo y al núcleo olfatorio anterior (ter Laak et al., 1994), a la amígdala (Vereecken et al., 1994), al núcleo basal de Meynert (Vogels et al., 1990; Jeong, 2017), a la parte medial de la sustancia negra, a la parte rostral del locus coeruleus (Theofilas et al., 2017) y al núcleo del rafe serotoninérgico (Aletrino et al., 1992; Duyckaerts et al., 2009). La pérdida de sustancia gris afecta primero y de manera importante al hipocampo y a la corteza entorrinal. Más tarde, el déficit se extiende a la corteza temporal y frontal, y finalmente, a las cortezas sensomotora y visual (Thompson et al., 2003). En los mecanismos de muerte neuronal están implicados tanto Aβ como Tau (Duyckaerts et al., 2009; Spires‐Jones y Hyman, 2014), así como las especies reactivas de oxígeno, las alteraciones mitocondriales, la sobreactivación de receptores de glutamato y el incremento en la concentración citoplasmática de iones calcio (Jeong, 2017). 2.1.3. Patología neurítica Las neuritas distróficas asociadas a las placas seniles aparecen de manera temprana en la EA contribuyendo de manera significativa a la patología en los estadios preclínicos, antes de que se produzca la pérdida sináptica y neuronal (Masliah et al., 1991b; Dickson et al., 1999; Torres et al., 2012; Sanchez-Varo et al., 2012). Son prolongaciones neuronales engrosadas producidas por alteraciones del citoesqueleto que contienen numerosas vesículas donde se acumula, entre otros, APP, BACE1 (del inglés, β-site APP cleaving enzime 1) y γ-secretasa, y especies tóxicas solubles de Tau hiperfosforilado (Nixon y Yang, 2011; Sanchez-Varo et al., 2012; Torres et al., 2012). En la EA, las distrofias son abundantes en los sistemas fibrosos del hipocampo, la región CA1 y la corteza entorrinal (Sanchez-Varo et al., 2012). Código seguro de Verificación : GEISER-8598-9009-566a-4890-b4af-d14e-6f25-b44a | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-8598-9009-566a-4890-b4af-d14e-6f25-b44a 23/11/2020 10:13:34 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000059958 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-8598-9009-566a-4890-b4af-d14e-6f25-b44a 11 A INTRODUCCIÓN 2.2. Patología amiloide Una de las lesiones microscópicas más características del cerebro de pacientes de Alzheimer son las placas amiloides o seniles, ya descritas por Alois Alzheimer en 1907. Son agregados proteicos insolubles y extracelulares localizados en el parénquima cerebral y en la pared de los vasos sanguíneos, cuyo componente principal es el péptido Aβ (Kumar y Tsao, 2019). Este péptido, que deriva del procesamiento proteolítico de la proteína precursora del péptido β-amiloide (APP) (De Strooper, 2010; Hane et al., 2017a) (Subapartado 2.2.2.1.), se genera de forma fisiológica y circula a baja concentración en plasma y en líquido cefalorraquídeo (LCR) de individuos sanos. De hecho, existen depósitos de Aβ insoluble en el parénquima cerebral y en la pared de los vasos sanguíneos cerebrales de personas sanas con edad avanzada (Selkoe, 2004; Gomez-Isla et al., 2008; Rodrigue et al., 2012). Numerosas investigaciones tratan de aclarar el papel fisiológico de Aβ. Se ha propuesto que podría regular la liberación de vesículas en terminales presinápticas excitatorias (Abramov et al., 2009), y actuar como modulador postsináptico negativo (Palop y Mucke, 2010), ya que concentraciones picomolares de Aβ mejoran la plasticidad sináptica y la memoria (Puzzo et al., 2008; Morley et al., 2010). Además, se ha asignado a los monómeros de Aβ un papel neuroprotector (Giuffrida et al., 2009), propiedades antioxidantes, y funciones como regulador del transporte de colesterol y como factor transcripcional (Sikanyika et al., 2019). El péptido Aβ es una proteína desordenada de pequeño tamaño (4 kDa), constituida por 39‐43 aminoácidos (Macleod et al., 2015; Hane et al., 2017a). En condiciones fisiológicas, más del 90% de las especies de Aβ están en forma de Aβ40 (soluble), con 40 aminoácidos y Val40 en su extremo C-terminal, y menos del 10% como Aβ42, con los aminoácidos adicionales Ile41 y Ala42, que le confieren mayor hidrofobicidad y capacidad de agregación (Wolfe y Guenette, 2007; Hiltunen et al., 2009; De Strooper, 2010; Zhang et al., 2011a). Sin embargo, en pacientes de EA, aumenta la relación Aβ42/Aβ40 (Hane et al., 2017a; Hillen, 2019), siendo Aβ42 el componente mayoritario y más tóxico de las placas (Hane et al., 2017a; Kumar y Tsao, 2019). 2.2.1. Agregación del péptido Aβ Los mecanismos por los que se agregan las distintas formas de Aβ y se forman las placas extracelulares no están claramente definidos. Se postula que a partir de Aβ monomérico con estructura aleatoria, se producen de manera secuencial monómeros parcialmente plegados en forma de horquilla (Choi y Ganchi, 2018), seguido de la dimerización de dos monómeros (Hane et al., 2017a). Posteriormente, los dímeros se agregan para generar formas intermedias oligoméricas solubles, de entre 8 KDa (dímeros) y 100 KDa (Shankar et al., 2008; Sakono y Zako, 2010), que finalmente originan las fibras y las placas amiloides o seniles (Takahashi et al., 2017; Hane et al., 2017a; Kumar y Tsao, 2019). Por otra parte, también se contemplan las placas como entes dinámicos liberadores de formas oligoméricas solubles y tóxicas de Aβ (Martins et al., 2008; Koffie et al., 2009), que, al tener distintas estructuras y Código seguro de Verificación : GEISER-8598-9009-566a-4890-b4af-d14e-6f25-b44a | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-8598-9009-566a-4890-b4af-d14e-6f25-b44a 23/11/2020 10:13:34 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000059958 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-8598-9009-566a-4890-b4af-d14e-6f25-b44a 12 A INTRODUCCIÓN toxicidad, podrían explicar la gran diversidad de manifestaciones y síntomas de los pacientes de Alzheimer (Hane et al., 2017a). El término oligómero se refiere a una agrupación de proteínas solubles mal plegadas con tamaños de dímeros a protofibras (Choi y Gandhi, 2018). Se han descrito múltiples formas oligoméricas, con capacidad de difundir por el parénquima cerebral y provocar un efecto tóxico a nivel sináptico y neuronal (Haass y Selkoe, 2007; Viola y Klein, 2015; Choi y Gandhi, 2018). Numerosos trabajos han demostrado que el tamaño de los agregados de Aβ es un determinante crítico de su toxicidad (Ladiwala et al., 2012); así, por ejemplo, los trímeros tienen una toxicidad tres veces mayor que los monómeros, mientras que los tetrámeros tienen una toxicidad 13 veces mayor (Hane et al., 2017a). Entre los distintos mecanismos deletéreos, los oligómeros parecen inhibir la LTP en el hipocampo, interfiriendo en la señalización de los receptores NMDA o AMPA (Haass y Selkoe, 2007; Viola y Klein, 2015; Hane et al., 2017a). Además, alteran la membrana neuronal y glial (permeabilidad, canales iónicos y vías de señalización), lo que perturba la homeostasis del calcio y desencadena estrés oxidativo, cascadas inflamatorias, disfunción mitocondrial y modificación de la estructura del ácido desoxirribonucleico (ADN) (Haass y Selkoe, 2007; Viola y Klein, 2015; Hane et al., 2017a). Las placas amiloides están compuestas principalmente por péptidos de Aβ insolubles (Glenner y Wong, 1984; Masters et al., 1985), aunque también pueden contener proteoglicanos, moléculas inflamatorias, proteasas, iones metálicos, APOE, proteínas antioxidantes, colinesterasas y restos de neuronas y células gliales (Atwood et al., 2002). Se clasifican en dos grandes grupos según su morfología, composición, y presencia o ausencia de distrofias neuríticas asociadas (Figura A.5): • Placas neuríticas: depósitos extracelulares de Aβ de aspecto filamentoso, llamadas así porque suelen aparecer íntimamente asociadas a neuritas distróficas, y a células microgliales reactivas, mientras que la astroglía se localiza en la periferia (Dickson, 1997; Duyckaerts et al., 2009; Bouvier et al., 2016). Atendiendo a la morfología que presenten, se subdividen en dos tipos (Selkoe, 2001; Fiala, 2007; Perl, 2010): - Placas clásicas: se asocian normalmente a los vasos sanguíneos, y poseen un núcleo amiloide redondo y compacto formado por Aβ fibrilar y células microgliales, rodeado por un halo difuso de especies solubles de Aβ. - Placas primitivas: con forma esférica e inmunotinción homogénea, sin núcleo compacto central, que suelen aparecer en zonas cercanas a axones y sinapsis. • Placas difusas: también llamadas “pre-amiloides”, son depósitos extracelulares no fibrilares (no congofílicos) de Aβ. Poseen una estructura amorfa o difusa, con límites poco definidos y sin núcleo compacto apreciable. Apenas poseen células microgliales, astrocitos o neuritas distróficas (Selkoe, 2001) y su composición principal es Aβ42 (Perl, 2010). Código seguro de Verificación : GEISER-8598-9009-566a-4890-b4af-d14e-6f25-b44a | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-8598-9009-566a-4890-b4af-d14e-6f25-b44a 23/11/2020 10:13:34 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000059958 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-8598-9009-566a-4890-b4af-d14e-6f25-b44a 13 A INTRODUCCIÓN Figura A.5. Clasificación de las placas amiloides. Las placas neuríticas pueden ser de tipo fibrilar (o placas primitivas) (A1 y A2), o clásicas (B1 y B2) con núcleo denso compuesto principalmente por Aβ42 (B2) y un halo difuso. Las placas difusas (C) no provocan distrofias neuríticas (C1) y presentan una morfología indefinida (C2). (A1, B1, C1) Inmunohistoquímica doble para Aβ (azul) y fosfo-Tau (marrón); (A2, B2, C2) Inmunotinción simple para Aβ42. Imágenes cedidas por el grupo de la Dra. Antonia Gutiérrez. El péptido Aβ, además de formar placas y oligómeros solubles extracelulares, también aparece en el citosol y en diferentes compartimentos subcelulares de las neuronas (mitocondria, lisosomas y retículo endoplasmático) (Sun et al., 2015b), alterando su funcionalidad (Kuruva y Reddy, 2017). El Aβ puede acumularse intraneuronalmente por fallos en la liberación tras su síntesis (Takahashi et al., 2017), o por reinternalización a través de receptores extracelulares específicos (Bi et al., 2002; Zerbinatti et al., 2006). La acumulación de Aβ intracelular parece ser un acontecimiento temprano en la EA (Bayer y Wirths, 2010), ya que se manifiesta en células piramidales del hipocampo y de la corteza entorrinal de pacientes con defectos cognitivos leves, y sus niveles descienden con la formación de las placas (LaFerla et al., 2007). El Aβ dentro de la neurona podría alterar la función mitocondrial y del proteasoma, provocar una disfunción sináptica, potenciar la hiperfosforilación de Tau (LaFerla et al., 2007), originar déficits en la LTP (Billings et al., 2005) e incluso la muerte neuronal (Bayer y Wirths, 2010). Se han realizado numerosos ensayos clínicos de inmunización activa y pasiva con diferentes anticuerpos monoclonales contra Aβ (Briggs et al., 2016; Cummings et al., 2019), aunque hasta la fecha, ninguno ha mostrado adecuada seguridad y/o eficacia (Mullard, 2019). Placas neuríticas Placas difusas Código seguro de Verificación : GEISER-8598-9009-566a-4890-b4af-d14e-6f25-b44a | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-8598-9009-566a-4890-b4af-d14e-6f25-b44a 23/11/2020 10:13:34 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000059958 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-8598-9009-566a-4890-b4af-d14e-6f25-b44a 14 A INTRODUCCIÓN 2.2.2. Acumulación patológica de Aβ Aunque no se conoce en detalle el mecanismo de formación de las placas, la acumulación de Aβ (especialmente Aβ42) parece ser limitante en dicho proceso. Además, podrían participar formas oligoméricas y fibras de Aβ, así como algunos complejos como los formados por APOE-Aβ (Thal et al., 2006). Por lo tanto, resulta fundamental conocer en detalle los mecanismos de producción, degradación y aclaramiento de las distintas isoformas de Aβ, cuyo desequilibrio parece originar su acumulación defectuosa (Thal et al., 2006; Duyckaerts et al., 2009; Baranello et al., 2015; Hane et al., 2017a). 2.2.2.1. Procesamiento de APP y producción de Aβ APP es una glicoproteína integral de membrana de tipo I, muy conservada evolutivamente, que contiene un largo ectodominio globular (N-terminal) en el espacio extracelular, un único segmento transmembrana y un pequeño dominio citosólico (C-terminal) (Nguyen, 2015). Su gen se localiza en el cromosoma 21 (Kumar y Tsao, 2019), y está constituido por 18 exones que originan 10 isoformas alternativas de entre 563 y 770 aminoácidos (Evin y Weidemann, 2002; Hane et al., 2017a). La isoforma APP695 se expresa predominantemente en neuronas (Haass et al., 1991) y, por tanto, es la mayoritaria en el SNC (Giri et al., 2016; Müller et al., 2017b). Además de ser precursora del péptido Aβ, la proteína APP posee otras funciones fisiológicas menos conocidas (Müller et al., 2017b; Hane et al., 2017a): participa en procesos de adhesión y señalización celular (Wolfe y Guenette, 2007), transporte de metales, unión a matriz extracelular, crecimiento de neuritas y del cono axónico neuronal, migración neuronal, homeostasis del calcio, LTP y señalización intracelular (Hoe y Rebeck, 2008; Hiltunen et al., 2009; Müller et al., 2017b). También se le han asignado propiedades neuroprotectoras, antioxidantes y tróficas (Rajendran y Annaert, 2012; Nguyen, 2015; Tatarnikova et al., 2015; Andreeva et al., 2017; Hane et al., 2017a). Se han descrito 62 mutaciones en el gen APP relacionadas con las formas familiares de la EA (Mutations. Alzforum, 2020), que pueden aumentar los niveles de Aβ42, disminuir los de Aβ40, aumentar la patogenicidad de Aβ, su capacidad de agregación y de formación de fibras (Macleod et al., 2015; Musiek y Holtzman, 2015; Tatarnikova et al., 2015). Curiosamente, la mutación A673T en APP reduce la producción de Aβ y su agregación, proporcionando protección contra el declive cognitivo asociado a la edad (Karran y De Strooper, 2016; Selkoe y Hardy, 2016). La proteína APP sufre diversas escisiones proteolíticas tanto a través de las vías canónicas (rutas amiloidogénica y no amiloidogénica) como de las no canónicas (Andrew et al., 2016), en las que están implicadas diversas enzimas como las caspasas, meprina, δ-secretasa y η-secretasa. A continuación, se describen las 2 rutas clásicas para el procesamiento post-traduccional de APP (Zhang et al., 2011a; Rajendran y Annaert, 2012; Hane et al., 2017a; Kumar y Tsao, 2019) (Figura A.6). Código seguro de Verificación : GEISER-8598-9009-566a-4890-b4af-d14e-6f25-b44a | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-8598-9009-566a-4890-b4af-d14e-6f25-b44a 23/11/2020 10:13:34 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000059958 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-8598-9009-566a-4890-b4af-d14e-6f25-b44a 15 A INTRODUCCIÓN A. Ruta no amiloidogénica Es la ruta principal en la mayoría de las células, ocurre mayoritariamente en la membrana plasmática y no produce Aβ, ya que implica una proteólisis en el interior de la región que contiene dicho péptido. En primer lugar, se produce la fragmentación de APP entre los aminoácidos 16 y 17 por acción de la α-secretasa, enzima anclada a la membrana perteneciente a la familia de las desintegrinas y metaloproteasas (ADAM; del inglés, A desintegrin and metalloprotease), liberándose un fragmento soluble denominado sAPPα, al que se le atribuyen propiedades neurotróficas y neuroprotectoras (De Strooper, 2010; Jeong, 2017). Además, se genera un fragmento C-terminal (APP-CTF) de 83 aminoácidos, que permanece anclado a la membrana, al que se le conoce como C83. C83 es sustrato del complejo γ-secretasa, que lo escinde en el interior de la membrana entre los aminoácidos 711 y 713, originando los péptidos p3 (Aβ 17-40 y Aβ 17-42) que se liberan al espacio extracelular o vesicular, y un dominio AICD citosólico (p7), al que se le han atribuido propiedades neurotóxicas, funciones en la homeostasis del calcio y en la regulación de la transcripción génica (De Strooper, 2010; Zhang et al., 2011a; Jeong, 2017; Wilkins y Swerdlow, 2017). Figura A.6. Procesamiento de la Proteína Precursora Amiloide (APP). Esquema explicativo de las rutas amiloidogénica y no amiloidogénica. En la vía no amiloidogénica, el metabolismo del APP se produce mediante la actividad secuencial de la α-secretasa y γ-secretasa, que generan sAPPα, p3 y AICD. En la vía amiloidogénica, el procesamiento del APP se lleva a cabo por la acción β-secretasa de BACE-1, primero, y por la γ-secretasa, después, generándose los fragmentos sAPPβ, AICD y el péptido Aβ. Este último se acumula en el medio extracelular, se agrega y forma las placas seniles características de la EA. Modificado de Muñoz-Castro et al., 2020. B. Ruta amiloidogénica Esta ruta alternativa de procesamiento de APP es minoritaria en la mayoría de las células, excepto en las neuronas, y produce péptidos Aβ. Aunque la vía está activa de forma fisiológica durante el envejecimiento normal, se potencia en la EA. A diferencia de la ruta no amiloidogénica, ocurre principalmente en endosomas (Zhou et al., 2018). α-secretasa C83 sAPPα γ-secretasa AICD p3 Vía no amiloidogénica Vía amiloidogénica BACE-1 γ-secretasa C99 sAPPβ APP AICD Aβ Oligómeros de Aβ Placas de Aβ Mutaciones en PSEN1 y PSEN2 Mutaciones en APP Código seguro de Verificación : GEISER-8598-9009-566a-4890-b4af-d14e-6f25-b44a | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-8598-9009-566a-4890-b4af-d14e-6f25-b44a 23/11/2020 10:13:34 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000059958 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-8598-9009-566a-4890-b4af-d14e-6f25-b44a 22 A INTRODUCCIÓN 3. RESPUESTA INMUNE EN EL SNC Y EN LA EA La limitada capacidad regenerativa del SNC hace que, incluso sus pequeñas alteraciones, puedan provocar una disfunción severa, enfermedad o muerte. Para proteger al SNC de los factores que alteren su homeostasis, existen estrategias inmunes especializadas que lo separan de la periferia (Kierdorf et al., 2019). Históricamente, el SNC se ha considerado un órgano inmunoprivilegiado, por carecer de sistema linfático y estar aislado en condiciones fisiológicas de la circulación periférica por la BHE (Niederkorn, 2006; Galea et al., 2007). Sin embargo, esta teoría ha sido cuestionada al descubrirse, primero en ratones y luego en humanos, un sistema especializado de drenaje linfático en la duramadre (Aspelund et al., 2015; Absinta et al., 2017). Además, existen claras evidencias de la capacidad de la BHE para responder a factores solubles y proteínas del plasma, así como para comunicarse con células del sistema inmune periférico (Zenaro et al., 2017). Por lo tanto, el cerebro no se considera actualmente un órgano inmunoprivilegiado. A pesar de este desafío a la teoría del privilegio inmune, está claro que el SNC de vertebrados superiores muestra una separación inmune de la periferia. Existen estructuras anatómicas altamente especializadas, como las meninges, el espacio perivascular y el plexo coroideo, que, en conjunto, limitan el acceso de células y moléculas inmunes periféricas al SNC, aunque también actúan como sitio de entrada de patógenos, presentación o drenaje de antígenos, infiltración de células inmunes y depósito de agregados proteicos patológicos (Erickson y Banks, 2018; Kierdorf et al., 2019). En el parénquima cerebral, las únicas células inmunes residentes son las microgliales, que, por tanto, desempeñan funciones importantes en la protección del SNC (Kierdorf y Prinz, 2017; Li y Barres, 2018). Sin embargo, los macrófagos asociados al SNC, las células dendríticas (CD) y otras células inmunes periféricas vigilan constantemente la interfaz entre la sangre y el cerebro o el LCR (Brezovakova et al.,2018). Tanto en la EA, como en otras enfermedades neurodegenerativas, se produce una activación compleja del sistema inmune innato del SNC, conocida como neuroinflamación. Dicha respuesta conlleva importantes cambios celulares y moleculares (Zhang y Jiang, 2015), y está coordinada principalmente por la microglía y los astrocitos (Liu et al., 2014; Heneka et al., 2015; Hane et al., 2017a), aunque también por células endoteliales y otras células del sistema inmune. En conjunto, todas estas células liberan en respuesta a un daño en el SNC distintos mediadores moleculares (Liu et al., 2014; Da Mesquita et al., 2016; Domingues et al., 2017) con propiedades proinflamatorias, fagocíticas, citotóxicas y reguladoras de linfocitos T (Ubogu et al., 2006), con el fin de recuperar las condiciones fisiológicas del parénquima cerebral. Sin embargo, la continua presencia del agente desencadenante de la respuesta inmunológica, como por ejemplo los depósitos de Aβ (Butovsky et al., 2005; Sastre et al., 2006), puede provocar un proceso neuroinflamatorio crónico, caracterizado por un aumento creciente de estrés oxidativo, infiltración de leucocitos a través de la BHE y degeneración tisular (Sochocka et al., 2016; Schwartz y Código seguro de Verificación : GEISER-8598-9009-566a-4890-b4af-d14e-6f25-b44a | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-8598-9009-566a-4890-b4af-d14e-6f25-b44a 23/11/2020 10:13:34 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000059958 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-8598-9009-566a-4890-b4af-d14e-6f25-b44a 23 A INTRODUCCIÓN Figura A.9. Microglía dibujada por Pío del Río- Hortega. Imagen tomada de Tremblay et al., 2015. Deczkowska, 2016), que finalmente contribuyen a la progresión de diversas patologías neurodegenerativas (Ubogu et al., 2006; Heneka et al., 2015; Ransohoff, 2016). En este sentido, la neuroinflamación se considera un componente patológico temprano y continuo en la patología del Alzheimer (Zhang y Jiang, 2015; Hane et al., 2017a; Chen, 2018; Gutierrez y Vitorica, 2018). El papel importante de la neuroinflamación en la patogénesis de la EA está avalado por diversos estudios GWAS realizados en miles de pacientes, que han identificado numerosos polimorfismos en genes involucrados en la respuesta inmune cerebral asociados a la forma esporádica de la enfermedad, como TREM2, APOE, CR1, CD33, MS4A, ABCA7, BIN1, EPHA1, CLU, HLA-DRB5/HLA-DRB1, INPP5D, CELF1, MEF2C, ADAMTS1, ABI3, PLCG2 MAF y ZCWPW1 (Dansokho y Heneka, 2018; Sancesario y Bernardini, 2018; Pimenova et al., 2018; Kunkle et al., 2019). 3.1. Células gliales presentes en el parénquima del SNC Los astrocitos y la microglía son los principales mediadores de la neuroinflamación. A pesar de que existen numerosos estudios que tratan de esclarecer la contribución de la neuroinflamación en la patogénesis de la EA (Heneka et al. 2015; Navarro et al., 2018; Perez-Nievas y Serrano-Pozo, 2018), el papel desempeñado por estas células no ha sido desvelado completamente. Es sabido que en el cerebro de pacientes de Alzheimer y de modelos murinos de la enfermedad, se desencadena una respuesta inflamatoria, mediada por Aβ y/o Tau hiperfosforilado, que implica la activación de microglía y de astrocitos, y que, en principio, trata de frenar la patología, al menos en los estadios iniciales (Jimenez et al., 2008; Heneka et al. 2015; Leyns et al., 2017; Sarlus y Heneka, 2017). Sin embargo, también se ha descrito la pérdida de la función protectora y homeostática de estas células, que, como consecuencia, podrían mediar un efecto neurotóxico (Navarro et al., 2018; Perez-Nievas y Serrano-Pozo, 2018). Por lo tanto, en la EA, microglía y astrocitos podrían tener un efecto perjudicial, por una ganancia de función tóxica y/o por una pérdida de efecto neuroprotector. 3.1.1. Microglía La microglía son células mieloides residentes del SNC, responsables principales de la respuesta inmune en el parénquima cerebral (Fani Maleki y Rivest, 2019; Geirsdottir et al., 2019; Greenhalgh et al., 2020). Fueron identificadas como una nueva entidad celular por Pío del Río-Hortega en 1919 (Figura A.9) (Río- Hortega, 1919a; Río-Hortega, 1919b; Río-Hortega, 1919c; revisado en Tremblay et al., 2015). Aunque existen células microgliales en todo el SNC (Greenhalgh et al., 2020), su distribución regional es heterogénea y más abundante en la sustancia blanca que en la gris (Mittelbronn et al., 2001). Representan entre un 0.5 y un 16.6% del total de las células del cerebro humano (Mittelbronn et al., 2001). Código seguro de Verificación : GEISER-8598-9009-566a-4890-b4af-d14e-6f25-b44a | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-8598-9009-566a-4890-b4af-d14e-6f25-b44a 23/11/2020 10:13:34 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000059958 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-8598-9009-566a-4890-b4af-d14e-6f25-b44a 24 A INTRODUCCIÓN Las células microgliales se originan durante la embriogénesis, a partir de células progenitoras eritropoyéticas del saco vitelino que migran al SNC (Ginhoux et al., 2010; Fani Maleki y Rivest; 2019; Geirsdottir et al., 2019). En ratones se ha demostrado que, en condiciones fisiológicas, la única fuente de recambio microglial proviene de la autorenovación de las propias células, sin que estén implicados los progenitores hematopoyéticos (Ajami et al., 2007; Askew et al., 2017; Fani Maleki y Rivest; 2019; Geirsdottir et al., 2019). De hecho, tras la depleción microglial, las células remanentes repueblan rápidamente el nicho (Bruttger et al., 2015; Najafi et al., 2018), y adquieren una especialización funcional determinada por el ambiente específico del parénquima cerebral. Por tanto, la microglía es epigenética y transcripcionalmente diferente de otros macrófagos residentes, así como de monocitos derivados de la medula ósea (Holtman et al., 2017; Bennett et al., 2018; Van Hove et al., 2019). 3.1.1.1. Funciones de la microglía En un cerebro sano, la microglía realiza funciones esenciales para el correcto desarrollo y sustento de la homeostasis cerebral (Colonna y Butovsky, 2017). Está involucrada en la vigilancia y mantenimiento del microambiente del SNC, y en la modulación de la plasticidad sináptica, participando en la poda de sinapsis redundantes (Rajendran y Paolicelli, 2018). Además, elimina células muertas, agregados proteicos, microorganismos y otras sustancias o antígenos que puedan dañar al SNC (Colonna y Butovsky, 2017; Li y Barres, 2018; Sankowski et al., 2019; Geirsdottir et al., 2019). En condiciones homeostáticas, la microglía tiene forma ramificada y prolongaciones altamente dinámicas (Figura A.10A) que le permiten examinar continuamente su entorno (Fani Maleki y Rivest, 2019). Ante cualquier alteración o situación patológica, la microglía se activa e inicia rápidamente una respuesta inmune con el fin de neutralizar al agente causante del daño, aunque dicha activación también puede contribuir a la progresión del daño o enfermedad (Saresella et al. 2016; Colonna y Butovsky, 2017; Greenhalgh et al., 2020). Por tanto, las células microgliales pueden modular un amplio espectro de respuestas celulares (Colonna y Butovsky, 2017), así como realizar un “efecto llamada” para reclutar células del sistema inmune periférico (Patir et al., 2019; Sankowski et al., 2019). Tradicionalmente, se ha descrito que la microglía, tras su activación, pierde ramificaciones y evoluciona a una estructura ameboide (Figura A.10B) (Kettenmann et al., 2011). Sin embargo, la morfología microglial es muy dinámica y, aunque es probable que los cambios morfológicos reflejen distintos estados funcionales, todavía no se han establecido las bases moleculares in vivo (Greenhalgh et al., 2020). Por tanto, no se puede atribuir una función a la microglía en base a su morfología, a excepción de la actividad fagocítica, asociada a fagosomas con estructura típica (Beccari et al., 2018). El envejecimiento origina una respuesta hiperreactiva microglial (Gomez-Nicola y Perry, 2015), caracterizada por cambios morfológicos y moleculares y una disfunción progresiva de sus funciones (Grabert et al., 2016; Colonna y Butovsky, 2017; Salter y Stevens, 2017). Código seguro de Verificación : GEISER-8598-9009-566a-4890-b4af-d14e-6f25-b44a | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-8598-9009-566a-4890-b4af-d14e-6f25-b44a 23/11/2020 10:13:34 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000059958 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-8598-9009-566a-4890-b4af-d14e-6f25-b44a 25 A INTRODUCCIÓN 3.1.1.2. Microglía en la EA En los últimos años ha aumentado el interés de la comunidad científica sobre el papel de la microglía en la EA debido a que, como hemos comentado, (1) son células muy dinámicas, capaces de responder rápidamente al daño (Davalos et al., 2005; Nimmerjahn et al., 2005), (2) son esenciales para el desarrollo del circuito neuronal, participando en la eliminación de sinapsis mediada por el complemento (Schafer et al., 2012; Thion y Garel, 2018) y (3) derivan del saco vitelino embrionario, lo que sugiere una divergencia temprana del sistema sanguíneo y una adaptación funcional al entorno cerebral (Ginhoux et al., 2010; Fani Maleki y Rivest; 2019; Geirsdottir et al., 2019). Además, se han identificado mediante estudios GWAS numerosos polimorfismos en genes involucrados en la función microglial que se consideran factores de riesgo de la EA esporádica (Dansokho y Heneka, 2018; Gutierrez y Vitorica, 2018; Navarro et al., 2018; Pimenova et al., 2018). Entre ellos, destacan mutaciones con pérdida de función en TREM2 y en el receptor de superficie CD33, que dismunuyen la captación y el aclaramiento de Aβ por las células microgliales (Pimenova et al., 2018; Robinson et al., 2017). Figura A.10. Microglía en la enfermedad de Alzheimer. Inmunohistoquímica fluorescente para IBA1 (verde, población microglial total), CD68 (cian, microglía activa fagocítica), Aβ (rojo) y PHF1 (azul) en la corteza temporal de (A) individuo control y (B) paciente de Alzheimer. Barra de escala: (A, B) 20 µm, (A1, B1) 10 µm. Imagen realizada durante una estancia predoctoral en el laboratorio de los doctores Alberto Serrano-Pozo y Bradley T. Hyman. En la EA, los depósitos amiloides están rodeados por las prolongaciones microgliales (Malm et al., 2005; Meyer-Luehmann et al., 2008), que podrían actuar como barrera física protectora frente a la toxicidad de la placa, promoviendo su compactación, y evitando su expansión y toxicidad (Yuan et al., 2016; Hansen et al., 2018). Es más, la fagocitosis activa de Aβ oligomérico por la microglia (Frautschy et al. 1992; Mandrekar et al., 2009), junto con la actividad proteolítica de las enzimas que secreta (Yang et al., 2011), reducen la polimerización del Aβ e impiden el crecimiento de la placa (Simard et al., 2006; Bolmont et al., 2008; Serrano-Pozo et al., 2013b). Pero, además, este proceso forma parte de la reacción inflamatoria que ocurre en la EA, caracterizada por la activación microglial que se inicia alrededor de las placas y que se expande con el avance de la patología por todo el parénquima cerebral (Jimenez et al., 2008, Jimenez et al., 2011). Por tanto, aunque la activación microglial podría ayudar a restringir la patología Aβ a edades tempranas, en los A B A1 B1 Código seguro de Verificación : GEISER-8598-9009-566a-4890-b4af-d14e-6f25-b44a | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-8598-9009-566a-4890-b4af-d14e-6f25-b44a 23/11/2020 10:13:34 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000059958 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-8598-9009-566a-4890-b4af-d14e-6f25-b44a 26 A INTRODUCCIÓN estadios avanzados de la enfermedad, la microglía podría perder eficacia o incluso volverse perjudicial, contribuyendo así a la progresión de la patología (Gutierrez y Vitorica, 2018). Respecto a la patología neurofibrilar, algunos estudios indican que la microglía favorece la propagación de depósitos de Tau (Hopp et al., 2018), mientras que otros sugieren que es capaz de fagocitar y degradar estos depósitos (Luo et al., 2015; Bolós et al., 2016) o, incluso, que la progresión de la patología Tau es independiente de la respuesta microglial (Zhu et al., 2020). Se ha descrito que la patología Tau puede activar a la microglía, y la consecuente producción de citoquinas inflamatorias (Bhaskar et al., 2010; Maphis et al., 2015). Además, ciertas formas solubles de Tau fosforilado parecen mediar la degeneración microglial (Streit et al., 2009; Sanchez-Mejias et al., 2016). La microglía en respuesta a los daños típicos de la EA, puede manifestar diferentes estados funcionales, caracterizados por distinta morfología, tasa de proliferación, actividad fagocítica, capacidad de presentación de antígenos y liberación de factores proinflamatorios (Bachiller et al., 2018). Se han descrito diversos fenotipos microgliales asociados al estado de salud, envejecimiento y patologías del SNC (Stratoulias et al., 2019; Li et al., 2019a; Patir et al., 2019; Böttcher et al., 2019; Geirsdottir et al., 2019). Además, los diferentes fenotipos microgliales, determinados por factores intrínsecos y extrínsecos (Sala Frigerio et al., 2019), pueden reprogramarse en nuevos microambientes (Holtman et al., 2017; Bennett et al., 2018; Van Hove et al., 2019) y tener funciones neurotóxicas o neuroprotectoras (Fani Maleki y Rivest, 2019). Por tanto, la función microglial depende muy probablemente del contexto patológico en que se encuentre (Colonna y Butovsky, 2017). Además, es posible que las diversas funciones microgliales se realicen por subpoblaciones microgliales especializadas (Sankowski et al., 2019). En los últimos años, se ha identificado a nivel transcripcional el perfil genético microglial en el envejecimiento (Mrdjen et al., 2018; Olah et al., 2018) y en distintos procesos neurodegenerativos, como en modelos amiloidogénicos de EA (Srinivasan et al., 2016; Keren-Shaul et al., 2017; Krasemann et al., 2017; Mrdjen et al. 2018; Mathys et al., 2017), modelos con taupatías (Friedman et al., 2018; Leyns y Holtzman, 2017), esclerosis lateral amiotrófica (Spiller et al., 2018) y esclerosis múltiple (Krasemann et al. 2017). En general, estos estudios concluyen que la activación microglial que se produce tras diversos daños y/o patologías conlleva la disminución de la expresión de genes homeostáticos (CX3CR1, P2RY12, P2RY13, TMEM119, y CD33) y la activación del programa genético DAM (del inglés, diseaseassociated microglia) (Keren- Shaul et al., 2017), caracterizado por la inducción de genes como CSF1, CLEC7A e IGF-I, así como de otros asociados con el riesgo de desarrollar EA (TREM2, APOE, TYROPB) (Lambert et al., 2013), o relacionados con rutas implicadas en fagocitosis/degradación lisosomal, respuesta inmune y endocitosis (Brown y George-Hyslop, 2017). Más recientemente, nuevas aproximaciones metodológicas han permitido caracterizar el perfil genético de la microglía humana en la EA (Mathys et al., 2019; Srinivasan et al., 2020; Zhou et al., 2020; Nguyen et al., 2020). Estos estudios Código seguro de Verificación : GEISER-8598-9009-566a-4890-b4af-d14e-6f25-b44a | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-8598-9009-566a-4890-b4af-d14e-6f25-b44a 23/11/2020 10:13:34 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000059958 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-8598-9009-566a-4890-b4af-d14e-6f25-b44a 27 A INTRODUCCIÓN también definen una firma microglial alterada en la patología, aunque con importantes diferencias con respecto a la microglía DAM descrita en los modelos animales de EA y en humanos con otras enfermedades neurológicas. Estos resultados ponen de manifiesto las importantes limitaciones derivadas del uso de modelos animales, que manifiestan una exacerbada activación microglial (Jimenez et al., 2008; Jimenez et al., 2011; Keren-Shaul et al., 2017) y no reproducen de forma adecuada la patología de Alzheimer. En este sentido, se ha descrito que, en cerebros de personas con EA, existen células de “microglía senescente” caracterizadas por una morfología distrófica, la pérdida o fragmentación de sus prolongaciones (citorrexis) y la incapacidad de realizar correctamente sus funciones (Streit y Xue, 2009; Streit WJ et al., 2009; Smith y Dragunow, 2014). Apoyan esta idea distintos artículos que postulan que la función y supervivencia microglial parecen estar comprometidas en pacientes de EA (Konno et al. 2014; Tada et al. 2016; Smith y Dragunow, 2014), a diferencia de lo que ocurre en modelos murinos de la patología. De hecho, en nuestro laboratorio se ha identificado en el hipocampo de pacientes de Alzheimer un proceso de degeneración microglial, mediado por la acumulación de formas tóxicas de Tau fosforilado (Sánchez-Mejías et al., 2016). Esta respuesta microglial es distinta del fenotipo hiperreactivo citotóxico mediado por Aβ y por otras formas de Tau, y podría estar asociada con el desarrollo de la EA (Navarro et al., 2018; Gutierrez y Vitorica, 2018; Sánchez-Mejías et al., 2016; Hansen et al., 2018; Romero-Molina et al, 2018). Por tanto, puede que no haya microglía “buena” o “mala”, sino simplemente funciones microgliales disfuncionales como consecuencia de la patología (Brown y George- Hyslop, 2017). Aunque los métodos transcriptómicos resultan esenciales para caracterizar el perfil funcional de la microglía (Grubman et al., 2019; Li et al., 2019a; Patir et al., 2019; Sankowski et al., 2019), las pruebas realizadas “in vivo” son escasas y no concluyentes. Este hecho, sumado a las importantes diferencias observadas con modelos animales (Friedman et al., 2018; Geirsdottir et al., 2019; Navarro et al., 2018; Sanchez-Mejias et al., 2016), hace que sigan existiendo múltiples cuestiones acerca de la heterogeneidad funcional y regional de la microglía en el cerebro humano, tanto en condiciones fisiológicas como en la EA (Sankowski et al., 2019). En definitiva, la implicación de la microglía en el desarrollo de la patología de Alzheimer parece ser dual y bastante compleja (Zhang y Jiang, 2015). La existencia de múltiples estados de activación microglial podría explicar los diversos papeles de la microglía en el desarrollo y progresión de la patología del Alzheimer (Hansen et al., 2018). En cualquier caso, la microglía parece contribuir a la patología en la EA avanzada, ya sea desempeñando un papel neurotóxico, o como consecuencia de una insuficiente capacidad protectora (Gutierrez y Vitorica, 2018; Navarro et al., 2018). 3.1.2. Astrocitos Los astrocitos constituyen entre el 19 - 40% de las células gliales del SNC humano (von Bartheld et al., 2016), donde son mediadores importantes de la respuesta neuroinflamatoria. Fueron descritos por primera vez por Michael von Lenhossék, quien acuñó esta nomenclatura en base a su forma estrellada (van Código seguro de Verificación : GEISER-8598-9009-566a-4890-b4af-d14e-6f25-b44a | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-8598-9009-566a-4890-b4af-d14e-6f25-b44a 23/11/2020 10:13:34 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000059958 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-8598-9009-566a-4890-b4af-d14e-6f25-b44a 28 A INTRODUCCIÓN Lenhossék, 1895). Al igual que las neuronas y los oligodendrocitos, los astrocitos derivan del neuroectodermo (Zhang y Jiang, 2015). Aunque morfológicamente son muy heterogéneos, se caracterizan por presentar una estructura estrellada con múltiples prolongaciones que conectan con vasos sanguíneos, neuronas, oligodendrocitos, microglía y otros astrocitos (Sofroniew y Vinters, 2010; Vasile et al., 2017; Farhy-Tselnicker y Allen, 2018). Tradicionalmente se clasifican en astrocitos protoplasmáticos, característicos de la sustancia gris y con ramificaciones finas y abundantes, y astrocitos fibrosos, típicos de la sustancia blanca y con procesos más alargados (Zhang y Jiang, 2015; Cai et al., 2017; Perez-Nievas y Serrano-Pozo, 2018). En los últimos años diversos estudios transcriptómicos han permitido identificar dos fenotipos diferentes de astrocitos reactivos en función del estímulo que lo genere. La neuroinflamación genera un fenotipo neurotóxico, proinflamatorio y destructor de sinapsis dependiente de microglía (Zamanian et al., 2012), que se ha caracterizado en el SNC de pacientes con diversas enfermedades neurodegenerativas, incluida la EA (Liddelow et al., 2017). Por el contrario, los astrocitos inducidos por isquemia son independientes de microglía, y expresan altos niveles de factores neurotróficos promotores de la supervivencia y el crecimiento neuronal, y trombospondinas, que favorecen la reparación de sinapsis (Zamanian et al., 2012; Liddelow et al., 2017). Sin embargo, esta clasificación es probablemente una simplificación de la realidad, ya que la heterogeneidad morfológica, funcional y molecular de los astrocitos es mucho más compleja (Perez-Nievas y Serrano-Pozo, 2018), como se ha descrito recientemente tanto en modelos animales (John Lin et al., 2017; Batiuk et al., 2020) como en humanos (Vasile et al., 2017; Grubman et al., 2019; Zhou et al., 2020). 3.1.2.1. Funciones de los astrocitos Los astrocitos desarrollan múltiples funciones indispensables para el correcto mantenimiento de la homeostasis del SNC (Vasile et al., 2017; Liddelow y Barres, 2017; Perez-Nievas y Serrano-Pozo, 2018). Por un lado, proporcionan soporte metabólico y estructural a las neuronas (Liu et al., 2017a; Li et al., 2019b) liberando sustancias antioxidantes (Chen et al., 2020b), factores tróficos (VEGF, GDNF, bFGF), neurotransmisores (ATP, glutamato, GABA) y neuromoduladores (D-serina, ácido quinurénico) (Minter et al., 2016; Rodríguez-Arellano et al., 2016). Además, mantienen el pH y el equilibrio hidro-salino del parénquima cerebral (Covelo y Areque, 2016; Rodríguez-Arellano et al., 2016; Zulfiqar et al., 2019). Los astrocitos también ejercen un rol esencial en la formación, maduración, función y eliminación de las sinapsis (Chung et al., 2015; Vasile et al., 2017). De hecho, en el neurodesarrollo, a pesar de que la neurogénesis precede a la astrogénesis, las sinapsis comienzan a formarse cuando aparecen los astrocitos (Farhy-Tselnicker y Allen, 2018). En las sinapsis tripartitas, la comunicación entre astrocitos y neuronas tiene gran importancia funcional. Además, un solo astrocito puede contactar con cientos o incluso miles de sinapsis (Yamazaki y Kanekiyo, 2017; Allen y Eroglu, 2017), coordinando a la vez múltiples redes neuronales (Perez-Nievas y Serrano-Pozo, 2018). También participan en la eliminación de sinapsis, ya sea de Código seguro de Verificación : GEISER-8598-9009-566a-4890-b4af-d14e-6f25-b44a | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-8598-9009-566a-4890-b4af-d14e-6f25-b44a 23/11/2020 10:13:34 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000059958 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-8598-9009-566a-4890-b4af-d14e-6f25-b44a 29 A INTRODUCCIÓN forma directa o indirecta (en este caso mediando, a través del complemento, la poda o pruning de sinapsis y axones innecesarios por parte de la microglía) (Chung et al., 2015). Por todo ello, participan en mecanismos de plasticidad sináptica (Vasile et al., 2017), entre los que se incluyen los procesos de aprendizaje y memoria (Chung et al., 2015). Además, como las neuronas regulan el transcriptoma de los astrocitos (Hasel et al., 2017), la función cerebral depende de manera general de la actividad coordinada de las redes astrocitos-neuronas (Covelo y Araque, 2018). Los pies astrocitarios, junto con las células del endotelio capilar y los pericitos vasculares, rodean la membrana basal de los vasos sanguíneos cerebrales, participando en la formación, integridad y mantenimiento de la BHE (Broux et al., 2015; Li et al., 2019b). En este sentido, los astrocitos proporcionan soporte bioquímico a las células endoteliales (Liu et al., 2014), regulan el paso selectivo de sustancias al SNC (Ota et al., 2013) y contribuyen activamente a la captación de glucosa sanguínea para dar soporte energético a las neuronas a través del lactato (Zulfiqar et al., 2019). También participan, junto con los pericitos, en la coordinación del flujo sanguíneo con la actividad neuronal (Mishra et al., 2016). Los astrocitos, además, controlan el flujo de agua entre el cerebro y la circulación sanguínea a través de canales acuosos, conocidos como acuaporinas (AQP), principalmente AQP-4 y también AQP-1 (Perez-Nievas y Serrano-Pozo, 2018). La AQP-4 participa en el “drenaje glinfático”, responsable del aclaramiento paravascular de metabolitos y solutos tóxicos (Iliff y Nedergaard, 2013). Además, los astrocitos desempeñan un papel fundamental en la homeostasis energética en el SNC. Actualmente, la hipótesis de la lanzadera de lactato astrocitoneurona es el modelo más aceptado sobre el metabolismo cerebral de la glucosa. Esta hipótesis postula que la glucosa captada por los astrocitos se almacena en forma de glucógeno o se metaboliza a piruvato mediante la glucólisis. El piruvato, a su vez, se reduce a lactato y se transporta a las neuronas a través de los transportadores de ácidos monocarboxílicos. En las neuronas, el lactato vuelve a convertirse en piruvato y se emplea en el ciclo de Krebs para producir energía (Deitmer et al., 2019). A pesar de que existen múltiples evidencias sobre el uso del lactato astrocitario como soporte neuronal, esta hipótesis está sometida a debate (Yellen, 2018; Dienel, 2019), ya que probablemente corresponda a una de las múltiples vías para cubrir los requerimientos energéticos del SNC (Eraso-Pichot et al., 2018; Deitmer et al., 2019). De hecho, aproximadamente el 20% de la energía total cerebral procede en condiciones fisiológicas de la β-oxidación (Ebert et al., 2003), que en el SNC está mediada principalmente por los astrocitos (Eraso-Pichot et al., 2018). Por tanto, los astrocitos son esenciales para mantener la homeostasis lipídica cerebral (Farmer et al., 2019; Konttinen et al., 2019). Aunque las rutas de degradación de ácidos grasos y aminoácidos, y el metabolismo mitocondrial no están totalmente caracterizados en los astrocitos (McAvoy y Kawamata, 2019), parecen ser esenciales para el soporte neuronal (Bélanger y Magistretti, 2009; Bélanger et al., 2011; Liu et al., 2017a; Valori et al., 2019; Konttinen et al., 2019). Los astrocitos también son indispensables en la respuesta inmune del SNC, ya que eliminan residuos y toxinas del LCR, liberan factores quimiotácticos, aclaran Código seguro de Verificación : GEISER-8598-9009-566a-4890-b4af-d14e-6f25-b44a | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-8598-9009-566a-4890-b4af-d14e-6f25-b44a 23/11/2020 10:13:34 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000059958 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-8598-9009-566a-4890-b4af-d14e-6f25-b44a 30 A INTRODUCCIÓN restos celulares y participan en la reparación y cicatrización del SNC tras daños traumáticos (Liu et al., 2014; Colombo y Farina, 2016; Liddelow y Barres, 2017). Ante cualquier insulto en el SNC, se produce una activación de los astrocitos, conocida como astrogliosis, caracterizada por diversos cambios moleculares, morfológicos y funcionales (Liddelow y Barres, 2017; Perez-Nievas y Serrano-Pozo, 2018). Entre ellos, destaca el aumento de la proteína ácida fibrilar glial (GFAP; del inglés, glial fibrillary acidic protein) y de vimentina (VIM), que participan en el acortamiento y engrosamiento de las prolongaciones astrocitarias y en el aumento del tamaño del soma (Wilhelmsson et al., 2004; Liddelow y Barres, 2017). Además, los astrocitos activos intervienen en la respuesta inflamatoria liberando factores neurotróficos, inflamatorios y citotoxinas (Li et al., 2019b) que pueden ejercer un efecto tanto beneficioso como perjudicial en las células de su entorno (Liddelow et al., 2017; Dossi et al., 2018; Li et al., 2019b). En este sentido, se ha postulado que la alteración de las funciones fisiológicas de los astrocitos podría desencadenar o empeorar la disfunción neuronal que se produce en distintos procesos neurodegenerativos (Zhang y Jiang, 2015; Dossi et al., 2018). 3.1.2.2. Astrocitos en la EA En los cerebros de pacientes de EA se produce una reactividad astrocitaria generalizada (Verkhratsky et al., 2010; Fu y Jhamandas, 2014) o “astrogliosis”, que se manifiesta en los primeros estadios de la enfermedad y progresa significativamente con la patología amiloidea y neurofibrilar (Verkhratsky et al., 2010; Heneka et al., 2015; Rodríguez-Arellano et al., 2016; Garwood et al., 2017). La activación astroglial se manifiesta alrededor de las placas amiloides y se desencadena por distintas formas de Aβ (Zhang et al., 2010; Carrero et al., 2012; Medeiros y LaFerla, 2013; Zhang y Jiang, 2015; Habib et al., 2020). Se ha propuesto que, en fases iniciales de la enfermedad, los astrocitos reactivos podrían actuar como una barrera física alrededor de las placas limitando su crecimiento y protegiendo a las neuronas cercanas de las especies oligoméricas tóxicas de Aβ (Perez-Nievas y Serrano-Pozo, 2018). También intervienen en procesos de captación, aclaramiento y degradación de Aβ (Verkhratsky et al., 2010; Zhang y Jiang, 2015) ya que expresan enzimas degradadoras de Aβ, como ECE2, IDE, NEP y las metaloproteinasas MMP- 2, -3, -6 y -9 (Verkhratsky et al., 2010; Zhang y Jiang, 2015; Ries y Sastre, 2016; Acosta et al., 2017). Sin embargo, con la progresión de la EA, se produce una alteración en los mecanismos de aclaramiento de Aβ, probablemente debido a una disfunción de los astrocitos (Farris et al., 2007; Tarasoff-Conway et al., 2015), lo que empeora la patología (Li et al., 2019b). Además, en la EA los astrocitos reactivos presentan predominantemente un fenotipo dependiente de microglía, neurotóxico y proinflamatorio (Liddelow et al., 2017), secretando, junto con la microglia activa, citoquinas inflamatorias, como TNFα, IL1β, IL6, IL8, IL10, TFGβ, IFNγ e IFNβ (Morales et al., 2014; Zhang y Jiang, 2015) y especies reactivas de oxígeno (Li et al., 2019b), que podrían inducir la producción de Aβ en los propios astrocitos (Verkhratsky et al., 2010; Zhang y Jiang, 2015; ; Acosta et al., 2017; Perez-Nievas y Serrano-Pozo, 2018; Li et al., 2019b). Código seguro de Verificación : GEISER-8598-9009-566a-4890-b4af-d14e-6f25-b44a | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-8598-9009-566a-4890-b4af-d14e-6f25-b44a 23/11/2020 10:13:34 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000059958 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-8598-9009-566a-4890-b4af-d14e-6f25-b44a 31 A INTRODUCCIÓN La atrofia y/o disfunción astrocitaria en fases avanzadas de la EA implica la reducción del soporte homeostático astroglial y una regulación anormal de calcio y glutamato (Li et al., 2019b), lo que tiene graves consecuencias en la supervivencia neuronal y en el mantenimiento de las sinapsis (Verkhratsky et al., 2010; Rodríguez- Arellano et al., 2016; Verkhratsky et al., 2016; Acosta et al., 2017; Perez-Nievas y Serrano-Pozo, 2018). Por otro lado, el cambio morfológico asociado a la activación astroglial afecta a los pies de los astrocitos, pudiendo alterar la unidad neurovascular (Perez-Nievas y Serrano-Pozo, 2018) y la integridad de la BHE (Liu et al., 2014), provocando las alteraciones cerebrovasculares típicas de la EA (Verkhratsky et al., 2010; Avila-Muñoz y Arias, 2014; Verkhratsky et al., 2016; Acosta et al., 2017). Como consecuencia, aumenta la deposición de Aβ y disminuye su aclaramiento a través de la BHE, contribuyendo a la CAA (Ries y Sastre, 2016; Cai et al., 2017; Hubbard et al., 2018), que agrava la patología vascular de los enfermos de Alzheimer (Verkhratsky et al., 2016). Figura A.11. Papel de los astrocitos en la EA. En condiciones fisiológicas, los astrocitos proporcionan soporte metabólico y estructural a las neuronas, manteniendo la homeostasis cerebral. Proporcionan lactato como fuente de energía, regulan las sinapsis, forman parte de la unidad neurovascular, captan el exceso de glutamato extracelular y participan en el aclaramiento de Aβ. Sin embargo, conforme la EA progresa, podrían producirse, a través de una cascada de eventos patológicos, alteraciones metabólicas en los astrocitos, como una reducción del metabolismo de glucosa, que conducen a una situación de estrés oxidativo y astrogliosis. Los astrocitos reactivos producen citoquinas proinflamatorias, que, junto a la microglía, participan en la respuesta neuroinflamatoria típica de la EA. Además, se produce una disminución en las funciones protectoras y homeostáticas de los astrocitos, así como una alteración de la integridad de la BHE y el flujo cerebral. Disminuye la producción astrocítica de antioxidantes, como el glutatión (GSH), contribuyendo al estrés oxidativo. También se afecta la recaptación de glutamato y el aclaramiento de Aβ, que se produce de forma paralela a un aumento en la producción de este péptido por parte de los astrocitos. Todo esto contribuye a un aumento en la patología amiloide, tanto en el parénquima como en la vasculatura (CAA), y disfunción sináptica, contribuyendo a la demencia. Imagen creada con BioRender.com. Homeostasis del SNC Soporte metabólico y estructural Regulación sináptica Aclaramiento de Aβ PROGRESIÓN DE LA EA Soporte metabólico Recaptación de glutamato Producción de antioxidantes Aclaramiento de Aβ Neuroinflamación Estrés oxidativo Producción de Aβ Alteración metabólica Reactividad astroglial Código seguro de Verificación : GEISER-8598-9009-566a-4890-b4af-d14e-6f25-b44a | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-8598-9009-566a-4890-b4af-d14e-6f25-b44a 23/11/2020 10:13:34 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000059958 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-8598-9009-566a-4890-b4af-d14e-6f25-b44a 38 A INTRODUCCIÓN monocitos periféricos sanguíneos (Thome et al., 2018). Puesto que las CDM inflamatorias participanen mecanismos de fagocitosis, probablemente medien la eliminación de Aβ desempeñando un papel beneficioso en la EA (El Khoury et al., 2007; Naert y Rivest, 2013; Zenaro et al., 2017). En este sentido, se ha descrito en modelos de EA que las CDM son más eficientes que la microglía eliminando depósitos cerebrales de Aβ (Thériault et al., 2015). Sin embargo, recientemente se ha publicado que estas células podrían originar déficits sinápticos y cognitivos, presentando un papel perjudicial en la patología de Alzheimer (Hohsfield et al., 2020). Otros autores afirman que, en modelos animales, las células mieloides asociadas a placas derivan exclusivamente de la microglía, sin que contribuyan los monocitos periféricos (Shukla et al., 2019; Reed-Geaghan et al., 2020). Este hecho, sumado a artículos previos que cuestionan la capacidad de los monocitos infiltrados para fagocitar Aβ (Varvel et al., 2015; Prokop et al., 2015), ha aumentado la controversia sobre el tema. Por otra parte, se ha propuesto que los monocitos circulantes también parecen participar en la EA debido a su capacidad para transportar microagregados de Aβ desde la microvasculatura cerebral hacia la circulación sanguínea (Figura A.13, Michaud et al., 2013; Kierdorf et al., 2019). Figura A.13. Monocitos y CDM en la EA. La existencia de una microglia disfuncional alrededor de las placas de Aβ, junto a la disfunción cerebrovascular que sufren la mayoría de los pacientes de EA y que compromete la integridad de la BHE, podrían promover la entrada de monocitos clásicos (Ly6chigh) al parénquima cerebral. Estos monocitos, una vez infiltrados, pueden exacerbar o aliviar la progresión de la enfermedad. Los monocitos circulantes (Ly6clow) son capaces de internalizar Aβ y trasportarlo desde la microvasculatura del cerebro a la circulación sanguínea. Imagen tomada de Fani Maleki y Rivest, 2019. En resumen, aunque los monocitos y las CDM son poblaciones inmunes periféricas muy estudiadas en la EA (Salani et al., 2019), sigue existiendo gran controversia sobre su posible infiltración en el parénquima cerebral y sobre su función en la patología. Código seguro de Verificación : GEISER-8598-9009-566a-4890-b4af-d14e-6f25-b44a | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-8598-9009-566a-4890-b4af-d14e-6f25-b44a 23/11/2020 10:13:34 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000059958 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-8598-9009-566a-4890-b4af-d14e-6f25-b44a 39 A INTRODUCCIÓN 3.2.1.3. Células dendríticas (CD) Las células dendríticas (CD) son fagocitos mononucleares que coordinan la respuesta innata y adaptativa, actuando como células presentadoras de antígenos a través del Complejo Mayor de Histocompatibilidad I y II (MHC I y II; del inglés, major histocompatibility complex) (Pérez, 2019). Proceden de precursores de células madre hematopoyéticas distintos de los que originan monocitos y macrófagos (Guilliams et al., 2014). Además, en condiciones inflamatorias los monocitos también pueden originar CD (Ginhoux y Jung, 2014, Ludewig et al., 2016, van Uden et al., 2019). Las CD cuando reconocen al antígeno, se activan y migran en busca de linfocitos T, iniciando así la respuesta inmune contra el patógeno (Ludewig et al., 2016; Villani et al., 2017; Chong et al., 2018). Además de las CD, los monocitos, CDMs y microglía también pueden expresar MHC II y actuar como células presentadoras de antígenos. Sin embargo, las CD tienen mayor capacidad para presentar antígenos y migrar a nodos linfáticos en busca de linfocitos T naive (Ludewig et al., 2016). Las CD tienen además función fagocítica (Villani et al., 2017; Chong et al., 2018). 3.2.1.3.1. Funciones de las CD Las CD son heterogéneas y se clasifican en múltiples subtipos con funciones únicas. En la sangre, podemos encontrar CD convencionales (CDc) y CD plasmacitoides (CDp). Las CDc, identificadas por CD11c y HLA-DR (van Uden et al., 2019), presentan antígenos a las células T CD4 + y CD8+ (Villani et al., 2017). Se dividen en dos subtipos, CDc tipo 1 (CDc1), caracterizadas por expresar CD141, y CDc tipo 2 (CDc2), positivas para CD1c. Los CDc1 tienen alta capacidad intrínseca para realizar presentaciones cruzadas de antígenos a través de MHC I a las células T CD8+ y promover las respuestas de linfocitos T colaboradores o helper (Th) tipo 1 (Th1) y de células natural killer a través de IL-12. Sin embargo, las CDc2 humanas pueden secretar niveles más elevados de IL-12 por lo que también pueden realizar presentaciones cruzadas. Su activación se asocia con respuestas de linfocitos Th1, Th2, Th17, T CD8+ y T reguladores (Treg). Además, las CDc2 igual que los monocitos presentan un amplio rango de PRRs (Collin y Bigley, 2018; van Uden et al., 2019). Por otra parte, las CDp se encuentran de forma normal en los tejidos linfoides y en la sangre, no expresan CD11c, pero sí HLA-DR y CD123. Durante la inflamación, las CDp se dirigen hacia los tejidos periféricos, producen IFN tipo I y promueven la activación de las células inmunes tipo B (Reizis, 2019; van Uden et al., 2019), y la generación de células plasmáticas en respuesta a infecciones virales (Ludewig et al., 2016). Se ha demostrado que las CDp maduras inducen la diferenciación de las células T CD4 naive a linfocitos Treg. Por lo tanto, las CDp pueden inducir respuestas inmunogénicas de células T o mostrar funciones tolerogénicas favoreciendo la deleción de linfocitos T CD8+, la anergia de células T CD4+ y la diferenciación de Treg (Swiecki y Colonna, 2015; Ludewig et al., 2016). Código seguro de Verificación : GEISER-8598-9009-566a-4890-b4af-d14e-6f25-b44a | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-8598-9009-566a-4890-b4af-d14e-6f25-b44a 23/11/2020 10:13:34 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000059958 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-8598-9009-566a-4890-b4af-d14e-6f25-b44a 40 A INTRODUCCIÓN A pesar de esta clasificación clásica, mediante la utilización de secuenciación de ácido ribonucleico (ARN) de célula única, se han identificado seis poblaciones de CD en sangre humana, revelando un nuevo subconjunto dentro de las CDc1 y redefiniendo las CDp (Villani et al., 2017). Por lo tanto, aún no está claro cuántos subtipos de CD existen, cómo están relacionados entre sí y cómo difieren de otros fagocitos mononucleares. En condiciones fisiológicas, las CD están ubicadas estratégicamente en regiones en contacto con el LCR, como ventrículos y plexo coroideo, además de en las meninges (Mrdjen et al., 2018). Sin embargo, existen discrepancias sobre la existencia de CD en el parénquima del SNC humano (Brezovakova et al., 2018). La identificación de estas células en el parénquima ha estado limitada por varios factores, como la consideración de que el cerebro era un órgano inmunoprivilegiado, la caracterización incompleta de las CD, y la similitud en la expresión de marcadores de diferentes células inmunes. En este sentido se ha descrito que la microglía en condiciones inflamatorias puede expresar marcadores de superficie de las CD, como CD11c y MHC II (Kamphuis et al., 2016; Dando et al., 2016). 3.2.1.3.2. CD en la EA A dia de hoy es tema de debate la posible presencia de CD en el parénquima cerebral de pacientes de EA (Brezovakova et al., 2018). El descenso de CDc en sangre periférica de enfermos de Alzheimer (Ciaramella et al., 2016) ha planteado la posibilidad de su posible reclutamiento al cerebro (Brezovakova et al., 2018). Las CD podrían entrar en contacto con los péptidos de Aβ excretados a través de la BHE, madurar y migrar a los ganglios linfáticos cervicales para activar a los linfocitos T naive (Ludewig et al., 2016). En modelos transgénicos de EA, cuando las CD periféricas se infiltran en el parénquima cerebral participan en la eliminación de placas amiloides (Butovsky et al., 2007). Sin embargo, estudios in vitro demuestran que en presencia de Aβ42 las CD adquieren un fenotipo inflamatorio y una menor capacidad para presentar antígenos (Ciaramella et al., 2009; Ciaramella et al., 2010). Además, la función neurotrófica de las CD está alterada en pacientes de EA, pudiendo contribuir a la neurotoxicidad que ocurre en la patología (Ciaramella et al., 2013). También existe controversia sobre el origen de estas células. Por una parte, se ha demostrado que las células microgliales pueden expresar marcadores de superficie característicos de CD. También es posible que en situaciones patológicas los monocitos se infiltren en el SNC y originen CD derivadas de monocitos. Además, las CD del plexo coroideo, ventrículos y meninges podrían migrar al parénquima cerebral en condiciones patológicas, como la EA. Tambien podría producirse una entrada directa de CD a través del sistema linfático (Ludewig et al., 2016). En resumen, aunque se ha descrito la presencia de células presentadoras de antígenos con fenotipo similar a las CD en el parénquima cerebral de enfermos de Alzheimer (Serrano-Pozo et al., 2013a; Ludewig et al., 2016), a día de hoy sigue sin aclararse su origen, que podría ser microglial y/o periférico, y su función. Código seguro de Verificación : GEISER-8598-9009-566a-4890-b4af-d14e-6f25-b44a | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-8598-9009-566a-4890-b4af-d14e-6f25-b44a 23/11/2020 10:13:34 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000059958 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-8598-9009-566a-4890-b4af-d14e-6f25-b44a 41 A INTRODUCCIÓN 3.2.1.4. Neutrófilos Los neutrófilos son células circulantes de vida relativamente corta y acción muy rápida, capaces de fagocitar y producir enzimas líticas y agentes reactivos. Una peculiaridad de los neutrófilos es su función antibacteriana extracelular, mediada por la liberación de su contenido a los tejidos infectados (NET, del inglés, Neutrophil Extracellular Traps) (Pérez, 2019). Los neutrófilos son células altamente reactivas que liberan ROS, enzimas, NETs y citoquinas, y, por lo tanto, ante una situación inflamatoria crónica pueden causar un importante daño tisular, aunque su número sea reducido. De hecho, la simple adhesión a la pared de un vaso es suficiente para inducir lesiones endoteliales (Zarbock y Ley, 2008; DiStasi y Ley, 2009; Zenaro et al., 2017). Se ha descrito por varios investigadores la presencia de neutrófilos en el cerebro de EA (Savage et al., 1994; Zenaro et al., 2015; Katayama, 2020). Además, se ha propuesto que, en los cerebros de pacientes y modelos de EA, los neutrófilos se adhieren intravascularmente y migran hacia áreas del parénquima con depósitos de Aβ, lo que sugiere que el Aβ determina el reclutamiento y el posicionamiento de los neutrófilos en el cerebro de EA (Savage et al., 1994; Baik et al., 2014; Zenaro et al., 2015; Zenaro et al., 2017). Los neutrófilos extravasados producen NET e IL-17 que pueden dañar la BHE y las células neurales (Zenaro et al., 2015; Zenaro et al., 2017). En los modelos animales de EA, la infiltración de los neutrófilos se inicia antes del declive cognitivo y alcanza niveles máximos cuando aparece la pérdida de memoria, lo que sugiere su posible contribución en el fallo cognitivo, que, además, se restaura tras la depleción de los mismos (Zenaro et al., 2015). 3.2.2. Respuesta inmune adaptativa La inmunidad adquirida es adaptativa (dependiente de la naturaleza del agresor) y específica (se basa en el reconocimiento específico de la estructura molecular del patógeno). El resultado final es la inmunización, cuyo fin es proporcionar una protección rápida y eficaz frente a un patógeno reconocido tras una primera agresión. Esta especificidad puede permanecer indefinidamente en virtud de un fenómeno conocido como memoria inmunitaria, según el cual la inmunidad específica frente a un patógeno permanece latente hasta que vuelva a ocurrir la exposición. Gracias a su capacidad para reconocer antígenos específicos, los linfocitos son las células especializadas en la respuesta inmune adaptativa. Procedentes de los precursores hematopoyéticos de la médula ósea, los linfocitos se diferencian en dos subpoblaciones que maduran en los órganos linfoides primarios: los linfocitos B, en la médula ósea, y los linfocitos T, en el timo (Pérez, 2019). La inmunidad innata activa los mecanismos que generan inmunidad adaptativa, por lo que ambas son interdependientes. La estimulación de los linfocitos comienza con la presentación del antígeno a los receptores de los linfocitos naive, lo que induce su transformación linfoblástica y la consecuente proliferación celular con Código seguro de Verificación : GEISER-8598-9009-566a-4890-b4af-d14e-6f25-b44a | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-8598-9009-566a-4890-b4af-d14e-6f25-b44a 23/11/2020 10:13:34 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000059958 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-8598-9009-566a-4890-b4af-d14e-6f25-b44a 42 A INTRODUCCIÓN especificidad antigénica. Tras la estimulación, los linfocitos pueden asumir el rol de célula efectora, y producir una respuesta celular en el caso de los linfocitos T, humoral por parte de los linfocitos B, o el rol de célula de memoria (Pérez, 2019). Las células de memoria permanecen en estado latente en espera de una nueva exposición al antígeno, garantizando la memoria inmunológica y aumentando la eficacia del sistema inmune (Kielian, 2006). Las principales moléculas que participan en la inmunidad adquirida son las inmunoglobulinas que actúan reconociendo específicamente a los patógenos. Además, el complemento y las citoquinas también están involucrados en los mecanismos de la inmunidad adquirida (Pérez, 2019). 3.2.2.1. Linfocitos B Son los mediadores de la respuesta inmune adaptativa humoral. Se generan en la medula ósea como linfocitos B inmaduros (inactivos), y sufren una serie de diferenciaciones hasta convertirse en formas activas. Para que un linfocito B se active es necesario que entre en contacto con un antígeno, lo que desencadena una serie de vías de señalización que concluyen con la producción de anticuerpos específicos contra ese antígeno (Monserrat-Sanz et al., 2017b). Una vez activadas, las células B proliferan y se diferencian con la misma especificidad antigénica, lo que se conoce como selección clonal (Pérez, 2019). Tras este proceso, se producen linfocitos B productores de IgM (inmunoglobulina M), responsables de la respuesta inmune primaria, y linfocitos B de memoria, que tras una segunda exposición al antígeno activan la producción de anticuerpos IgG de alta afinidad (respuesta inmune secundaria) (Fettke et al., 2014). Estas células B diferenciadas encargadas de la síntesis de inmunoglobulinas se denominan células plasmáticas (Pérez, 2019). Además de su función principal como productores de anticuerpos específicos, los linfocitos B pueden actuar como células presentadores de antígeno para iniciar la respuesta inmune de los linfocitos T a través de los receptores transmembrana BCR (del inglés, B cell receptors). Otra función de los linfocitos B es la modulación de la respuesta de linfocitos T y células dendríticas mediante la producción de citoquinas inmunomoduladoras (Kristensen, 2016). 3.2.2.2. Linfocitos T Son los encargados de desarrollar la respuesta inmune adaptativa celular. Estas células se producen en los órganos linfoides como células T inactivas, y al igual que los linfocitos B, se activan y diferencian cuando entran en contacto con el antígeno. Para interaccionar con el resto de las células, los linfocitos T presentan receptores de membrana TCR (del inglés, T cell receptor) que forman un complejo con el correceptor CD3 (Monserrat-Sanz et al., 2017b). Las células T se clasifican en linfocitos T colaboradores o helper (Th) y linfocitos T citotóxicos (Tc), en base a su función, receptores de superficie y a las citoquinas que producen (Pérez, 2019). Los primeros expresan el correceptor CD4, Código seguro de Verificación : GEISER-8598-9009-566a-4890-b4af-d14e-6f25-b44a | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-8598-9009-566a-4890-b4af-d14e-6f25-b44a 23/11/2020 10:13:34 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000059958 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-8598-9009-566a-4890-b4af-d14e-6f25-b44a 43 A INTRODUCCIÓN mientas que los linfocitos Tc son CD8+. Estas proteínas transmembranas de la familia de las IgR, se expresan en la superficie celular, y median la interacción entre los receptores TCR y el MHC que desencadena la respuesta inmune mediada por linfocitos T (Overgaard et al., 2015). 3.2.2.2.1. Linfocitos T colaboradores o helper (Th) Colaboran, mediante la liberación de citoquinas, con los linfocitos B, otros linfocitos T, y otras células inmunes para que se desarrolle correctamente la respuesta inmune adaptativa. Los linfocitos Th son CD4+, reconocen el MHC de clase II y generalmente responden a antígenos extracelulares. Según su perfil de citoquinas y función se clasifican en varios subtipos: Th1, Th2, Th9, Th17, Th22, Tfh y Treg (Pérez, 2019; Ní Chasaide y Lynch, 2020). Los linfocitos proinflamatorios y citotóxicos Th1, producen Interferón-γ (IFN-γ), Interleuquina-12 (IL-12) y Factor de Necrosis Tumoral-α (TNF- α), y los Th17 producen IL-17, IL-6 y TNF-α, entre otras citoquinas. En sentido opuesto, los linfocitos Th2, que expresan mayoritariamente IL-4, se consideran antiinflamatorios y protectores, ya que suprimen la respuesta mediada por los linfocitos Th1. Los linfocitos Treg son FOXp3+, y liberan citoquinas regeneradoras como TGF-β (del inglés, Transforming growth factor-β) e IL-10, y son capaces de suprimir la respuesta inflamatoria-citotóxica (Allegra et al., 2019; Feng et al., 2015). 3.2.2.2.2. Linfocitos T citotóxicos (Tc) Estos linfocitos son CD8+ y reconocen el MHC de clase I (Pérez, 2019). Los linfocitos Tc participan en la citotoxicidad celular, mediante la producción y liberación de proteínas citotóxicas como IFN-γ, perforinas y granzimas, con el fin de eliminar al patógeno causante de la respuesta inflamatoria. Una vez eliminado el patógeno la mayoría de los linfocitos Tc mueren, aunque una pequeña proporción se conserva como “linfocitos Tc de memoria” y pueden llegar a mantenerse a lo largo de toda la vida del individuo (Gray et al., 2014). 3.2.2.3. Linfocitos en la EA En condiciones fisiológicas, los linfocitos son relativamente escasos en el SNC, a pesar de que su alta capacidad para secretar factores moduladores los coloca en una buena posición para influir en las células residentes del SNC (Greenhalgh et al., 2020). En tejido post mortem de individuos con EA, así como en modelos de esta patología, existen linfocitos T CD4+ y CD8+, tanto en el endotelio vascular como en el parénquima cerebral (Ferretti et al., 2016; Unger et al., 2018; Merlini et al., 2018), principalmente en las áreas más afectadas como el hipocampo y otras estructuras límbicas (Zenaro et al., 2017; Pietronigro et al., 2019). Además, los pacientes con MCI y fases iniciales de EA tienen en LCR un mayor número de linfocitos T CD4+ y CD8+ activos que los controles, lo que sugiere que estas células migran de la sangre al cerebro durante la patología (Lueg et al., 2015). Se han propuesto distintos mecanismos implicados en la entrada de los linfocitos en el cerebro de pacientes de Alzheimer. Una posibilidad es que el aumento Código seguro de Verificación : GEISER-8598-9009-566a-4890-b4af-d14e-6f25-b44a | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-8598-9009-566a-4890-b4af-d14e-6f25-b44a 23/11/2020 10:13:34 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000059958 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-8598-9009-566a-4890-b4af-d14e-6f25-b44a 44 A INTRODUCCIÓN en la producción de ciertas quimioquinas (CCL3, CXCL10, CCR5) (McManus et al., 2014; Ní Chasaide y Lynch, 2020) por parte de la microglía, astrocitos o células endoteliales origine un gradiente quimiotáctico que los atraiga (Zenaro et al., 2017; Li et al., 2019b). TGF-β también podría ser determinante, ya que interviene en la activación endotelial y la deposición de Aβ (Yang et al., 2013). Se ha descrito que la amiloidosis cerebral promueve la migración de linfocitos T al cerebro y la expresión de moléculas de adhesión en los vasos (Ferretti et al., 2016). También se ha propuesto que la inflamación periférica favorece la entrada de linfocitos T activados al cerebro (McManus et al., 2014). Por último, hay que considerar que los enfermos de EA pueden presentar alteraciones en la BHE. Existen numerosos estudios en modelos animales que tratan de esclarecer la función de los linfocitos en la EA. A día de hoy, no existe nada concluyente al respecto, y, mientras algunos autores atribuyen a estas células un rol perjudicial (Browne et al., 2013; McManus et al., 2014; Späni et al., 2015), otros sugieren que son beneficiosos (Marsh et al., 2016; Dansokho et al., 2016). Código seguro de Verificación : GEISER-8598-9009-566a-4890-b4af-d14e-6f25-b44a | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-8598-9009-566a-4890-b4af-d14e-6f25-b44a 23/11/2020 10:13:34 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000059958 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-8598-9009-566a-4890-b4af-d14e-6f25-b44a B. ANTECEDENTES Y OBJETIVOS Código seguro de Verificación : GEISER-8598-9009-566a-4890-b4af-d14e-6f25-b44a | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-8598-9009-566a-4890-b4af-d14e-6f25-b44a 23/11/2020 10:13:34 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000059958 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-8598-9009-566a-4890-b4af-d14e-6f25-b44a Código seguro de Verificación : GEISER-8598-9009-566a-4890-b4af-d14e-6f25-b44a | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-8598-9009-566a-4890-b4af-d14e-6f25-b44a 23/11/2020 10:13:34 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000059958 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-8598-9009-566a-4890-b4af-d14e-6f25-b44a 47 B ANTECEDENTES Y OBJETIVOS El impacto sociosanitario que supone la EA exige una terapia eficaz urgente para evitar en los próximos años un problema más grave de salud mundial. Hasta la fecha, la mayoría de las terapias utilizadas en los ensayos clínicos se han dirigido contra las patologías amiloide y Tau, pero han resultado ineficaces (Muñoz-Castro et al., 2020). En los últimos años está cobrando importancia la hipótesis de que la respuesta inmune mediada por las células gliales (microglía y astrocitos) desempeña un papel fundamental en el desarrollo de la enfermedad (Heneka et al., 2015). Nuestro laboratorio lleva más de una década caracterizando las alteraciones moleculares en el hipocampo y corteza frontal de distintos modelos transgénicos con sobreexpresión de Aβ y/o Tau, y, más recientemente, de pacientes de Alzheimer, con el fin de identificar biomarcadores y dianas terapéuticas de interés. Actualmente, nuestro objetivo principal es descifrar el papel de la respuesta inmune y, en concreto, de las células de la microglía y la astroglía durante la progresión de la enfermedad. En este sentido, es clave entender los diferentes fenotipos y perfiles funcionales (neuroprotector, neurotóxico y/o degenerativo) de dichas células gliales. En la EA la microglía activa se ha asociado clásicamente a la producción de factores inflamatorios y neurotóxicos (Heneka et al., 2015), que podrían contribuir al daño neuronal y al deterioro cognitivo (Holmes et al., 2009; Navarro et al., 2018). Esta idea deriva de los resultados obtenidos en modelos transgénicos, muchos de ellos descritos por nuestro laboratorio (Jimenez et al., 2008; Moreno-Gonzalez et al., 2009; Baglietto-Vargas et al., 2017; Gutierrez y Vitorica, 2018). Sin embargo, nuestros resultados en el hipocampo de pacientes de Alzheimer demuestran una respuesta microglial leve y tardía (Navarro et al., 2018), junto a una importante degeneración microglial, promovida posiblemente por formas solubles de Tau hiperfosforilada (Sanchez-Mejias et al., 2016). De forma similar, en el modelo ThyTau22, con importante acumulación de formas solubles de Tau hiperfosforilada, no se produce activación, pero si degeneración microglial (Romero-Molina et al., 2018). Estos resultados reflejan que existen importantes diferencias en la respuesta microglial entre modelos animales y pacientes de Alzheimer (Navarro et al., 2018), y nos llevan a hipotetizar que también se produzcan diferencias entre las distintas regiones cerebrales humanas, con distintos perfiles de acumulación de Aβ y Tau (Jucker y Walker, 2011). Los astrocitos por su parte desempeñan importantes funciones neuroprotectoras en condiciones no patológicas (Vasile et al., 2017; Liddelow y Barres, 2017; Perez-Nievas y Serrano-Pozo, 2018), aunque se desconoce su papel específico en el desarrollo de la EA. Se ha demostrado que los astrocitos se activan alrededor de las placas de Aβ (Zhang et al., 2010; Medeiros y LaFerla, 2013; Zhang y Jiang, 2015), pero no se han detallado sus patrones de expresión génica, ni cómo los factores que secretan contribuyen al desarrollo de la patología. Basándonos en estudios previos del laboratorio en modelos animales de EA (Sanchez-Mico, 2019), en este proyecto postulamos que, en el entorno patológico de la EA, los astrocitos reactivos median una respuesta exacerbada del complemento y alteran su metabolismo, lo que probablemente implique la pérdida de su capacidad neuroprotectora. La modulación de la respuesta inflamatoria hacia un efecto Código seguro de Verificación : GEISER-8598-9009-566a-4890-b4af-d14e-6f25-b44a | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-8598-9009-566a-4890-b4af-d14e-6f25-b44a 23/11/2020 10:13:34 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000059958 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-8598-9009-566a-4890-b4af-d14e-6f25-b44a 54 C MATERIALES Y MÉTODOS perteneciente al IDIBELL-Hospital Universitario de Bellvitge, de Barcelona; del Banco de Tejidos Neurológicos BioBanc del Hospital clínico-IDIBAPS, en Barcelona; y del Banco de Cerebros de la Región de Murcia del Hospital Clínico Universitario Virgen de la Arrixaca, en Murcia. Este proyecto ha sido aprobado por el Portal de Ética de la Investigación Biomédica de Andalucía (PEIBA) de la Consejería de Salud, así como por los propios Comités Éticos de los respectivos Bancos de Tejidos y el Comité Ético de Investigación de los Hospitales Universitarios Virgen Macarena- Virgen del Rocío. El tejido, una vez extraído, se mantiene a -80ºC hasta su uso, para evitar la degradación de proteínas y ARN. Las muestras de la necropsia se dividen aún congeladas en secciones de 70-90 mg para la extracción de proteínas, ARN y ADN (Apartado C.10). 2. Animales de experimentación En el presente trabajo, hemos utilizado ratones de entre 2 y 18 meses de edad, de las líneas transgénicas APP751SL (APP) y TAU P301S (TAU). Como controles, hemos usado los correspondientes ratones no transgénicos (WT, del inglés wild type) con el mismo fondo genético (C57BL/6J) y edad. En cada diseño experimental, las muestras de diferentes genotipos y edades se procesan de forma simultánea. Además, se han utilizado ratones no trangénicos con fondo genético CD1 en etapas embrionarias y neonatales para la generación de cultivos celulares primarios (Apartado C.3). Los ratones APP sobreexpresan el gen APP751 humano con las mutaciones Swedish (KM670/671NL) y London (V717I) de Alzheimer familiar, bajo el control del promotor Thy-1. Estos ratones han sido suministrados por Sanofi-Aventis (Paris, Francia). Los ratones TAU (Línea PS19) expresan la forma humana de Tau con 4 repeticiones y un inserto N-terminal (4R/1N), con la mutación P301S, bajo el control del promotor de la proteína priónica (Prnp) (Yoshiyama et al., 2007). Este modelo procede de Jackson Laboratory (Bar Harbor, Maine). Los animales se crían y mantienen, hasta su uso, en los animalarios del Centro de Producción y Experimentación Animal de la Universidad de Sevilla y del Servicio de Producción y Experimentación Animal del Instituto de Biomedicina de Sevilla. Se mantienen a temperatura media de 21ºC con un fotoperiodo de 14 horas de luz y 10 de oscuridad. Todos los animales, durante la permanencia en el animalario, disponen de libre acceso al agua y una dieta estándar. Todos los experimentos se han realizado de acuerdo con las directrices del Parlamento Europeo y del Consejo (Directiva 2010/63/UE), siguiendo la normativa española (Real Decreto 53/2013), para la protección de animales utilizados en experimentación. Además, los experimentos han sido aprobados por el Comité Ético de Uso de Animales para la Investigación de la Universidad de Sevilla. El número de animales empleados, así como el estrés y sufrimiento de éstos durante la Código seguro de Verificación : GEISER-8598-9009-566a-4890-b4af-d14e-6f25-b44a | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-8598-9009-566a-4890-b4af-d14e-6f25-b44a 23/11/2020 10:13:34 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000059958 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-8598-9009-566a-4890-b4af-d14e-6f25-b44a 55 C MATERIALES Y MÉTODOS manipulación y experimentación, se ha reducido al máximo, de acuerdo con la regla de las 3R (reemplazar, reducir y refinar). 3. Cultivos celulares primarios En todos los casos, las células se incuban a 37ºC, en una atmósfera humidificada con un 5% de CO2, y su manipulación se lleva a cabo bajo condiciones de esterilidad, utilizando una campana de flujo laminar y material estéril. 3.1. Cultivos mixtos de microglía y astrocitos Los cultivos primarios de microglía y astrocitos se realizan tal y como se describe en Jimenez et al. (2008) a partir de la disgregación mecánica y química de la corteza y el hipocampo de ratones CD1 neonatales (P1-P3). Tras la decapitación de los ratones, extraemos el cerebro y retiramos las meninges. Separamos cortezas e hipocampos del resto del cerebro y se mantienen en PBS (Biowest) frío con antibióticos (100 U/ml de penicilina y 100 µg/ml de estreptomicina (Biowest)). Homogenizamos el tejido suavemente con tijeras de cirugía en Tripsina-EDTA 1x (Biowest) en PBS, empleando 500 µl por cada dos cerebros, e incubamos a 37ºC durante 5 minutos. Este proceso se repite hasta que el tejido queda completamente homogeneizado. Posteriormente, añadimos medio completo con suero fetal bovino inactivado (SFB; Biowest), para inhibir la tripsina, y la suspensión de células obtenida se pasa por un filtro de nylon con diámetro de poro de 40 µm (Fisher Scientific). Sembramos las células en placas de 24 pocillos, a una densidad de 500.000 células por pocillo (área por pocillo: 1,77cm2; Nunc). Estas placas de cultivo son tratadas previamente con poli-D-lisina (Sigma-Aldrich) a 100 µg/ml, durante un mínimo de 2 horas a 37ºC, y lavadas con agua destilada. Las células se mantienen en medio completo de mixtos, compuesto por DMEM-F12 (Biowest), suplementado con SFB 10%, aminoácidos no esenciales 1x (Biowest), 10 µg/ml de gentamicina (Biowest), 2mM de L-Glutamina (Biowest), 100 U/ml de penicilina y 100 µg/ml de estreptomicina. A los 2 días, retiramos la mitad del medio y reponemos con medio nuevo. Cada 4 días, renovamos el medio completamente. 3.1.1. Aislamiento de astrocitos La obtención de cultivos enriquecidos en astrocitos se realiza entre los días 20 y 25 del cultivo mixto. En primer lugar, retiramos el medio de cultivo, que se encuentra condicionado por los factores liberados por las células, aunque lo reservamos para volver a añadir a la placa enriquecida en microglía al final. Lavamos la placa con PBS estéril para retirar restos de suero y añadimos medio de aislamiento, compuesto por Tripsina 0,25%-EDTA 1 mM (Biowest) y DMEM-F12 en una proporción 1:3. Las células se incuban durante 10-45 min a 37ºC, tiempo en el que los astrocitos se despegan de la placa de cultivo, mientras que la microglía mantiene su adherencia a la misma. Una vez los astrocitos se han despegado, añadimos medio de cultivo completo para inactivar la tripsina y recogemos el sobrenadante, donde se encuentran los astrocitos. La placa original, en la que queda principalmente microglía, se lava con PBS y se le añade el medio condicionado Código seguro de Verificación : GEISER-8598-9009-566a-4890-b4af-d14e-6f25-b44a | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-8598-9009-566a-4890-b4af-d14e-6f25-b44a 23/11/2020 10:13:34 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000059958 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-8598-9009-566a-4890-b4af-d14e-6f25-b44a 56 C MATERIALES Y MÉTODOS retirado previamente mezclado con medio de cultivo nuevo en proporción 1:1. Por otro lado, los astrocitos se centrifugan a 800 x g durante 5 minutos, se suspenden en medio completo y se cultivan a una densidad de 500.000 células/pocillo en placas de 24 pocillos, previamente tratadas con poli-D-lisina. 3.2. Cultivos de neuronas Los cultivos primarios de neuronas se realizan según se describe en García- Junco-Clemente et al. (2010). Estas células se obtienen a partir del hipocampo de fetos de ratones CD1, cuando la madre se encuentra en el día 17 de gestación (T17). Tras la extracción de las crías y su decapitación, obtenemos el cerebro, retiramos las meninges y aislamos el hipocampo, manteniéndose en medio de disociación frío compuesto de Hanks’ Balanced Salt solution (HBSS; Biowest), glucosa 10mM (Sigma-Aldrich) y HEPES 10mM (Sigma-Aldrich). Una vez extraídos los hipocampos, se incuban durante 3 minutos, a 37ºC y agitación suave en una solución de papaína 41 U/ml (Worthington) con L-cisteína 0.06% (p/v) (Sigma-Aldrich) en medio de disociación. Posteriormente, lavamos 3 veces con Inhibidor de Tripsina 1mg/ml (Sigma-Aldrich) en medio de disociación, e incubamos con dicho inhibidor durante 4 minutos, a 37ºC y agitación suave. A continuación, disgregamos mecánicamente el tejido en presencia de medio compuesto por DMEM-F12 suplementado con glutamina 2 mM, piruvato de sodio 1%, glucosa 20 mM y suero de caballo inactivado 10% (HS; Biowest). Finalmente, las células se siembran en placas de 24 pocillos, en las que se han depositado lamelas de 12 mm de diametro tratadas con poli-D-lisina, en las condiciones previamente indicadas, a una densidad de 50.000 células por pocillo. Tras dos horas, sustituimos el medio por medio de neuronas, compuesto por Neurobasal (Gibco), B27 2% (Gibco), Glutamax 2 mM (Gibco), 50 U/ml de penicilina y 50 µg/ml de estreptomicina. Cada 2-3 días, retiramos la décima parte del medio y añadimos el equivalente a una cuarta parte del total de medio de neuronas nuevo. 4. Aislamiento de proteínas solubles (S1) Este método nos permite separar la fracción soluble de proteínas extracelulares y citosólicas mediante ultracentrifugación diferencial en medio acuoso y en ausencia de detergentes. Para ello, los ratones se anestesian con una dosis letal de tiopental (Braun, 90-120mg/Kg peso ratón) y se perfunden transcardialmente con PBS estéril frío durante 5 minutos a un flujo continuo de 10 ml/minuto, utilizando una bomba de perfusión (DINKO Mod. D-25V). Tras este paso, se procede a decapitar a los animales y a extraer la corteza, que puede utilizarse directamente o congelarse, como etapa intermedia, a -80ºC. Disgregamos el tejido cortical en tampón isotónico Tris-salino [NaCl 140 mM en Tris-HCl 20 mM (PanReac AppliChem), pH 7,4], al que se añade un cocktail de inhibidores de proteasas (Roche) y fosfatasas (Sigma- Aldrich). La disgregación se realiza usando tijeras apropiadas hasta que el tejido queda totalmente fraccionado. A continuación, la suspensión de tejido resultante se pasa a un homogeneizador Dounce (Wheaton) y se somete a 15 pases con el pistilo de menor diámetro (paso de luz: 0,089-0,14 mm) y 15 pases con el de mayor diámetro (paso de luz: 0,025-0,076 mm). El homogenado se centrifuga a 100.000 x g durante 1 Código seguro de Verificación : GEISER-8598-9009-566a-4890-b4af-d14e-6f25-b44a | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-8598-9009-566a-4890-b4af-d14e-6f25-b44a 23/11/2020 10:13:34 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000059958 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-8598-9009-566a-4890-b4af-d14e-6f25-b44a 57 C MATERIALES Y MÉTODOS hora a 4ºC (Optima Max, Beckman Coulter). El sobrenadante obtenido de esta ultracentrifugación corresponde a la fracción proteica soluble o S1, mientras que en el precipitado quedan los restos de membranas, agregados proteicos y proteínas insolubles (P1). Las proteínas de la fracción S1 se cuantifican mediante el método de micro-Lowry (Apartado C.13), y se conservan a -80ºC hasta su uso. 5. Estudio del metabolismo de los astrocitos primarios mediante Seahorse El fenotipo energético de los astrocitos primarios se determina empleando el analizador de flujo extracelular Seahorse XFp (Agilent), que permite medir la velocidad de consumo de oxígeno (OCR, del inglés oxygen consumption rate) y la velocidad de acidificación extracelular (ECAR, del inglés extracellular acidification rate) de células vivas en tiempo real. Por tanto, podemos estudiar la respiración mitocondrial, ligada al consumo de oxígeno, y la glucólisis en condiciones basales, ya que la acidificación del medio depende de la producción de lactato por esta vía. Además, hemos analizado la OCR y la ECAR tras la inyección de diferentes compuestos para modular el metabolismo. En concreto, en este trabajo hemos empleado de forma secuencial cuatro inhibidores mitocondriales: oligomicina, carbonilcianuro-p-trifluorometoxifenilhidrazona (FCCP; del inglés, carbonyl cyanide-4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone), rotenona y antimicina A (Figura C.1). Figura C.1. Esquema de los complejos de la cadena de transporte de electrones. La oligomicina inhibe a la ATP sintasa o complejo V, el FCCP desacopla el consumo de oxígeno de la producción de ATP, y la rotenona y antimicina A inhiben a los complejos I y III, respectivamente. Imagen tomada de Agilent Technologies. Tras medir las condiciones metabólicas basales, añadimos oligomicina, que inhibe la ATP sintasa y, como consecuencia disminuye la cadena de transporte de electrones y la OCR. La disminución en la OCR respecto al nivel basal correlaciona con la respiración mitocondrial asociada a la producción de ATP en condiciones normales. En ausencia de trabajo o consumo de ATP (relación ATP/ADP elevada), la respiración mitocondrial está controlada por la entrada pasiva de H+ a través de la membrana mitocondrial interna o proton leak. En esta situación, la velocidad de respiración se adecuará a la pérdida de gradiente, de modo que se mantenga la fuerza protón motriz necesaria para el funcionamiento de los procesos Código seguro de Verificación : GEISER-8598-9009-566a-4890-b4af-d14e-6f25-b44a | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-8598-9009-566a-4890-b4af-d14e-6f25-b44a 23/11/2020 10:13:34 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000059958 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-8598-9009-566a-4890-b4af-d14e-6f25-b44a 58 C MATERIALES Y MÉTODOS biológicos dependientes de dicha fuerza. Posteriormente, se añade FCCP, que disipa el gradiente de protones, disminuyendo el potencial de la membrana interna mitocondrial y, como consecuencia, desacopla la cadena de transporte de electrones de la síntesis de ATP. El tratamiento con FCCP conlleva la aceleración de la cadena respiratoria hasta su capacidad máxima, incrementando el consumo de oxígeno del complejo IV a su máximo nivel. Por último, se adiciona una mezcla de rotenona y antimicina A. La rotenona inhibe la transferencia de electrones desde el complejo I mitocondrial a la ubiquinona, mediante el bloqueo del sitio de unión de la ubiquinona. La antimicina A interrumpe el flujo de electrones mediante la inhibición del complejo III mitocondrial. La combinación de ambos inhibe la respiración mitocondrial y permite el cálculo del consumo de oxígeno asociado a la respiración no mitocondrial (Figuras C.1 y C.2). Como se ha indicado previamente, de forma paralela a la medida de OCR, el equipo mide la ECAR. En condiciones basales, este dato proporciona información sobre la glucólisis basal. Además, al inhibir la respiración con oligomicina y FCCP, se produce una respuesta compensatoria en glucólisis, lo que refleja el flujo glucolítico máximo. Figura C.2. Parámetros claves de la respiración mitocondrial obtenidos en el analizador Seahorse XFp a partir de la OCR, en condiciones basales, y tras el tratamiento con oligomicina, FCCP y rotenona/antimicina A. La respiración basal (Basal Respiration) refleja la demanda energética de la célula en condiciones basales. La respiración asociada a la producción de ATP (ATP Production) es la fracción de respiración basal que se emplea para producir ATP en condiciones basales. El proton leak o flujo de protones es la respiración basal no acoplada a la producción de ATP. La capacidad máxima respiratoria (Maximal Respiration) muestra la máxima OCR que la célula puede alcanzar. La medida de Spare Capacity es un indicador de la capacidad de la célula para responder a la demanda energética. La respiración no mitocondrial (Non-mitochondrial Oxygen Consumption) se refiere al consumo de oxígeno que persiste a pesar de la inhibición mitocondrial. Imagen tomada de Agilent Technologies. Código seguro de Verificación : GEISER-8598-9009-566a-4890-b4af-d14e-6f25-b44a | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-8598-9009-566a-4890-b4af-d14e-6f25-b44a 23/11/2020 10:13:34 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000059958 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-8598-9009-566a-4890-b4af-d14e-6f25-b44a 59 C MATERIALES Y MÉTODOS 5.1. Procedimiento Una vez aislados y contados los astrocitos como se indica en el apartado C.3.1.1, se cultivan 35.000 células/pocillo en una placa específica (Seahorse XFp Cell Culture Miniplates, Agilent), previamente tratada con poli-D lisina. Estas placas poseen 8 pocillos de 3.81 mm de radio. Solo cultivamos células en seis de ellos, dejando dos pocillos únicamente con medio de cultivo completo, que usaremos como blancos para el análisis posterior. La placa se mantiene 1 hora a temperatura ambiente, para garantizar que las células se adhieran de forma homogénea por todo el pocillo. Posteriormente, incubamos durante 24 horas a 37ºC en una atmósfera humidificada con un 5% de CO2. Al día siguiente, realizamos el tratamiento de los astrocitos con 0,1 µg/µl de S1 procedente de animales APP de 12 meses en medio de neuronas sin B27. Este tratamiento se mantiene durante 24 o 48 horas, en función del experimento, reponiendo la mitad del medio con la misma dosis de S1 a las 24 horas. Tras el tratamiento de los astrocitos, se sigue el protocolo comercial proporcionado por Agilent. Para ello empleamos los medios de cultivo, reactivos y materiales proporcionados por esta casa comercial. De forma breve, el medio de tratamiento se sustituye, tras varios lavados, por medio seahorse [medio Seahorse XF DMEM, suplementado con Glucosa 17,5 mM, Piruvato 0,5 mM, L-Glutamina 4,5 mM y HEPES 5 mM, pH 7,4]. Este medio, formulado en base al medio de cultivos común DMEM, se caracteriza por carecer de bicarbonato y rojo fenol. Los astrocitos se incuban en una estufa a 37ºC durante 1 hora. En este periodo, cargamos los reactivos en el cartucho de Seahorse, previamente hidratado e incubado a 37ºC con la solución calibradora. En este trabajo, tratamos los astrocitos con una dosis de 2 µM de oligomicina, 2 µM de FCCP y 0,5 µM de rotenona y antimicina A (preparadas a partir del Seahorse XFp Cell Mito Stress Test Kit). Introducimos el cartucho en el analizador Seahorse XFp para su calibración. A continuación, introducimos la placa con los astrocitos en el analizador para obtener las correspondientes medidas de OCR y ECAR en cada uno de los pocillos. Una vez finalizadas las medidas, recogemos las células en dodecisulfato sódico (SDS; PanReac AppliChem) al 4% en PBS, y cuantificamos sus proteínas mediante Western blot (Apartado C.14), utilizadas para normalizar los valores de OCR y ECAR obtenidos. 6. Ensayos de supervivencia neuronal En este trabajo de Tesis doctoral se han realizado diferentes ensayos de supervivencia neuronal. Por una parte, hemos estudiado la vulnerabilidad específica de las neuronas parvalbúmina (PV) positivas tras el tratamiento con neurosinaptosomas (NS) procedentes de animales WT, APP y TAU. Además, hemos estudiado la interacción astrocito-neurona utilizando diversas variantes de medio condicionado por astrocitos. Las condiciones específicas se detallan en cada experimento. Código seguro de Verificación : GEISER-8598-9009-566a-4890-b4af-d14e-6f25-b44a | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-8598-9009-566a-4890-b4af-d14e-6f25-b44a 23/11/2020 10:13:34 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000059958 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-8598-9009-566a-4890-b4af-d14e-6f25-b44a 60 C MATERIALES Y MÉTODOS En torno al día 18 del cultivo de neuronas (Apartado C.3.2), añadimos 200 µl del correspondiente medio (en función del experimento), previamente calentado a 37ºC, por cada 50.000 células. En todos los experimentos hemos empleado medio de neuronas con B27 como control de viabilidad, y medio de neuronas sin B27 como control de muerte. Una vez adicionado el medio, mantenemos el cultivo a 37ºC durante 24 o 48 horas, en una atmósfera con un 5% de CO2. Transcurrido el tiempo de tratamiento, las células se fijan con paraformaldehído (PFA) 4% (Scharlau) durante 20 min a temperatura ambiente. Se realizan 3 lavados con PBS en agitación suave y se mantienen a 4ºC, en presencia de etanol al 70% en PBS, hasta su posterior estudio mediante inmunofluorescencia (Apartado C.7). 6.1. Aislamiento de neurosinaptosomas (NS) Los neurosinaptosomas (NS) son terminales aislados, con elementos pre y postsinápticos, que se individualizan de los terminales axonales cuando el tejido se homogeniza. En este trabajo, hemos aislado neurosinaptosomas de ratones sin patología (WT), con patología Aβ (APP) y con patología Tau (TAU), para utilizarlos como control o como fuentes de Aβ y Tau hiperfosforilado. Para la obtención de dichos NS hemos adaptado el protocolo usado por Puighermanal et al. (2016) para preparar neurosinaptosomas estriatales a partir de ratones adultos. Tras sacrificar al animal mediante dislocación cervical, extraemos el cerebro y diseccionamos la corteza. Por cada hemicorteza, añadimos 1 ml de Tampón de neurosinaptosomas [CaCl2 2,5 mM (Sigma), NaCl 124 mM, KCl 3,2 mM, KH2PO4 1,06 mM (Merck), NaHCO3 26 mM (Merck), MgCl2 1,3 mM (Sigma), D(+)Glucosa 10 mM y HEPES 20 mM, pH=7,4]. Homogeneizamos el tejido, sometiéndolo a 10 pases con un homogeneizador Dounce’s con el pistilo de menor diámetro (paso de luz: 0,089- 0,14 mm) y, posteriormente, otros 10 pases con el de mayor diámetro (paso de luz: 0,025-0,076 mm). El homogenado se filtra de forma secuencial a través de 3 filtros de Nylon con un tamaño de poro de 100 µm (Millipore) y, después, a través de una membrana de filtro Mitex de un tamaño de poro de 10 µm (Millipore). A continuación, centrifugamos durante un minuto a 4.000 x g y el sobrenadante se somete a otra centrifugación de 14.000 x g, durante 4 min. El pellet obtenido se suspende en un volumen final de 300 µl con Tampón de neurosinaptosomas y se mantiene a 4ºC hasta su uso, anterior a 24 horas, para el tratamiento de las neuronas primarias en medio de neuronas (3:1.000). 6.2. Obtención de medio condicionado por astrocitos En este trabajo de Tesis doctoral hemos utilizado diversas variantes de medio condicionado por astrocitos. En primer lugar, se aíslan los astrocitos (Apartado C.3.1.1) y se dejan estabilizar 24 horas, tras las que lavamos los astrocitos con PBS, para eliminar restos de medio, y añadimos medio de neuronas nuevo a una razón de 250 µl por cada 500.000 células. En función del experimento, este medio contendrá o no B27, así como fracciones S1 de diferentes modelos de EA (Apartado C.4). Las condiciones específicas de medio y tiempo utilizadas se indican en cada experimento. Una vez recogido el medio, se centrifuga a 0,5 x g durante 10 minutos para eliminar posibles células y congelamos el sobrenadante a -20ºC hasta su uso. Código seguro de Verificación : GEISER-8598-9009-566a-4890-b4af-d14e-6f25-b44a | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-8598-9009-566a-4890-b4af-d14e-6f25-b44a 23/11/2020 10:13:34 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000059958 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-8598-9009-566a-4890-b4af-d14e-6f25-b44a 61 C MATERIALES Y MÉTODOS 6.3. Filtración de medio condicionado por astrocitos Para ello añadimos el medio condicionado por los astrocitos al concentrador 5 K MWCO (Agilent Technologies), centrifugamos 3 veces a 5.000 x g durante 10 minutos obteniendo un filtrado, que contiene las moléculas con masa molecular inferior a 5.000 Da, y un retenido, con las moléculas mayores de 5 KDa. A ambos, se les adiciona medio de neuronas sin B27 hasta igualar el volumen de partida y mantener así la concentración original. Estos medios, denominados en este trabajo medio condicionado con moléculas de masa inferior a 5.000 Da (MC < 5.000 Da) y medio condicionado con moléculas de masa superior a 5.000 Da (MC > 5.000 Da), se utilizan para realizar ensayos de supervivencia neuronal, en las condiciones anteriormente descritas. 7. Inmunofluorescencia para células de cultivo Las técnicas inmunocitoquímicas permiten detectar la presencia de moléculas de interés en las células de estudio, gracias a la especificidad de la unión antígenoanticuerpo. En este trabajo hemos realizado estudios de visualización y contaje de células en neuronas primarias en cultivo. Las células, una vez fijadas tras los diferentes tratamientos (Apartado C.6), se procesan siempre en paralelo, con el fin de minimizar la variabilidad en el inmunomarcaje. Además, también de manera paralela, se realizan controles negativos omitiendo la incubación con anticuerpos primarios para demostrar la especificidad de los anticuerpos empleados. En ningún caso, los controles negativos producen inmunotinción, por lo que no existen uniones inespecíficas de anticuerpos secundarios en las muestras estudiadas. 7.1. Marcaje inmunofluorescente doble para células de cultivo Este protocolo se lleva a cabo sobre las neuronas, ya fijadas, obtenidas en los diferentes ensayos de supervivencia descritos en el Apartado C.6. Todos los lavados de este procedimiento se realizan durante 10 minutos en agitación suave. Sin embargo, las diferentes incubaciones (permeabilización, bloqueo y anticuerpos) se realizan en estático. En primer lugar, realizamos 3 lavados con PBS para eliminar los restos de etanol. Posteriormente, llevamos a cabo la permeabilización de las membranas celulares, para que los anticuerpos puedan acceder al interior celular, mediante la incubación con PBT [0,1% Tritón X-100 (Sigma) (v/v) en PBS] durante 1 hora a temperatura ambiente. Realizamos una incubación con la solución de bloqueo (5% albúmina de suero bovina (BSA; Fisher Scientific) en PBT), durante 3 horas a temperatura ambiente. Tras el bloqueo, incubamos, a la concentración adecuada, con los anticuerpos primarios correspondientes (NeuN y, en función del ensayo, MAP2 o PV) (Tabla C.2), en presencia de BSA 1% en PBT durante toda la noche a 4ºC. Al día siguiente, realizamos 3 lavados con PBT e incubamos con los anticuerpos secundarios (Tabla C.2), también en presencia de BSA 1% en PBT, durante 1 hora a temperatura ambiente. A partir de este momento, todos los pasos se realizan en oscuridad, ya que los anticuerpos secundarios llevan acoplados fluorocromos, que son sensibles a la luz. Después, realizamos 3 lavados con PBT, para evitar uniones inespecíficas, un lavado de 5 min con PBS y otro con H2O milliQ, para eliminar las posibles sales que puedan quedar. Por último, montamos en un portaobjetos con el Código seguro de Verificación : GEISER-8598-9009-566a-4890-b4af-d14e-6f25-b44a | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-8598-9009-566a-4890-b4af-d14e-6f25-b44a 23/11/2020 10:13:34 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000059958 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-8598-9009-566a-4890-b4af-d14e-6f25-b44a 62 C MATERIALES Y MÉTODOS medio de montaje Dako Fluorescent Mounting Medium (Dako). Las muestras se conservan a 4ºC y en oscuridad hasta su visualización. 7.2. Obtención de imágenes mediante Microscopía Confocal Las imágenes de fluorescencia se han obtenido con el microscopio confocal ZEISS LSM 7 DUO, del Servicio de Microscopía del Centro de Investigación Tecnológica e Innovación de la Universidad de Sevilla (CITIUS). Se trata de un microscopio óptico confocal que tiene acoplado un láser como fuente de iluminación, así como un sistema electrónico que permite la obtención de imágenes digitales. Hemos utilizado el software ZEN 2011 para la adquisición de imágenes. 7.3. Procesamiento de imágenes y cuantificación de neuronas Por último, las imágenes digitales se han procesado mediante el programa informático ImageJ. La cuantificación del número de neuronas totales se realiza mediante el estudio de MAP2 y NeuN, mientras que para la cuantificación del número de neuronas PV+ empleamos PV y NeuN. MAP2 es una proteína de citoesqueleto asociada a microtúbulos que participa en el crecimiento de los procesos neuronales y la plasticidad sináptica (D'Andrea et al., 2017), por lo que permite visualizar la neurona completa, con todas sus ramificaciones (neuropilo). NeuN es una proteína del núcleo neuronal (Gusel'nikova y Korzhevskiy, 2015). De tal forma que, con este marcaje es posible visualizar y cuantificar de forma específica las neuronas del cultivo tratado, pudiendo evaluar la supervivencia neuronal mediante la comparación del número de neuronas existente tras los tratamientos realizados. Así pues, para la cuantificación del número de neuronas totales (NeuN+ y MAP2+) se utiliza la herramienta “Cell Counter” de ImageJ. De forma similar, hemos cuantificado el número de neuronas GABAérgicas PV+ con respecto a la población neuronal total, reconocida mediante NeuN. 8. Inmunohistoquímica Las condiciones empleadas en la Inmunohistoquímica fluorescente múltiple se detallan en el apartado D.4 de los Resultados. Esta técnica se ha puesto a punto y se ha empleado posteriormente en el laboratorio de los doctores Alberto Serrano- Pozo y Bradley Hyman, en el Massachusetts General Hospital (Harvard Medical School, Estados Unidos) durante una estancia predoctoral. Por otra parte, en colaboración con el laboratorio de la Dra. Antonia Gutierrez (Universidad de Málaga), se han realizado estudios inmunohistoquímicos del tejido hipocampal y cortical de muestras post mortem de controles y pacientes de Alzheimer, tal y como se describe en Sanchez-Mejias et al. (2016). De forma rutinaria, las muestras de los diferentes estadios Braak se procesan de forma paralela para minimizar la variabilidad, y la especificidad de la tinción se comprueba omitiendo el anticuerpo primario. De forma breve, una vez desparafinadas e hidratadas las muestras, realizamos una mejora o aumento de la exposición del antígeno mediante el pretratamiento con calor (80ºC) en tampón citrato sódico (50 mM, pH=6; Panreac) Código seguro de Verificación : GEISER-8598-9009-566a-4890-b4af-d14e-6f25-b44a | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-8598-9009-566a-4890-b4af-d14e-6f25-b44a 23/11/2020 10:13:34 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000059958 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-8598-9009-566a-4890-b4af-d14e-6f25-b44a 63 C MATERIALES Y MÉTODOS durante 20 minutos. A continuación, en caso de utilizar el método de la peroxidasa para el revelado de la inmunorreacción (inmunoperoxidasa), las secciones se tratan con una solución de H2O2 (Panreac) al 3% y metanol (Panreac) al 10% en PBS durante 20 minutos para inactivar a la peroxidasa endógena y evitar tinción de fondo no deseada. Posteriormente, bloqueamos la avidina, la biotina y las proteínas de unión a biotina que se encuentran en el tejido de manera endógena, mediante el kit de bloqueo de avidina-biotina (Vector Labs) durante 30 minutos en cada solución. Para evitar reacciones inespecíficas, bloqueamos con suero normal de cabra (Sigma- Aldrich) o de caballo (Sigma-Aldrich), en función del anticuerpo empleado, al 5% en PBS durante 1 hora. Tras el bloqueo, incubamos con el anticuerpo primario en PBS con 0,2% Tritón X-100 (Sigma-Aldrich) y 0,1% azida sódica (Panreac), en las condiciones detalladas en la Tabla C.2. Anticuerpo Diana Especie huésped Dilución, Tiempo y Temperatura de incubación Clon/Referencia (Proveedor) Anticuerpos primarios CD163 Receptor CD163 Ratón 1:200, 72 h, 22ºC 10D6 (Leica biosystems) CD45 Receptor CD45 o PTPRC Conejo 1:1000, 48 h, 22ºC ab10558 (Abcam) IBA1 IBA1 o AIF1, proteína de unión a calcio Conejo 1:1.000, 24 h, 22ºC 019‐19741 (Wako Chemicals) Map2 Proteína asociada a microtúbulos Conejo 1:1.000, 24 h, 4ºC Ab5622 (Millipore) MRC1 Receptor MRC1 Conejo 1:1000, 48 h, 22ºC HPA004114 (Sigma-Aldrich) NeuN Núcleo neuronas maduras Ratón 1:1.000, 24 h, 4ºC A60 (Chemicon) OC Aβ fibrilar Conejo 1:5.000, 24 h, 22ºC AB2286 (Millipore) PV Parvalbúmina Conejo 1:1.000, 24 h, 4ºC PV27 (Swant) Anticuerpos secundarios Anti-IgG conejo biotinilado Anticuerpo primario producido en conejo Cabra 1:500, 70 min, 22ºC Vector Lab Anti-IgG ratón biotinilado Anticuerpo primario producido en ratón Cabra 1:500, 70 min, 22ºC Vector Lab Anti-IgG conejo AF546 Anticuerpo primario producido en conejo Burro Cabra 1:500, 1 h, 22ºC 1:1.000, 1 h, 22ºC NanoProbes Molecular Probes Anti-IgG ratón AF488 Anticuerpo primario producido en ratón Burro Burro 1:500, 1 h, 22ºC 1:1.000, 1 h, 22ºC NanoProbes Molecular Probes Tabla C.2. Relación de anticuerpos empleados en los estudios de inmunocitoquímica e inmunohistoquímica. Se indica el antígeno diana reconocido por dichos anticuerpos, la especie del huésped en la que se han producido, la dilución empleada en este trabajo y la casa comercial o proveedor. Código seguro de Verificación : GEISER-8598-9009-566a-4890-b4af-d14e-6f25-b44a | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-8598-9009-566a-4890-b4af-d14e-6f25-b44a 23/11/2020 10:13:34 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000059958 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-8598-9009-566a-4890-b4af-d14e-6f25-b44a 70 C MATERIALES Y MÉTODOS es limpiada con RNAase ZAP™ (Sigma-Aldrich) de forma previa, para evitar el contacto del operador con el TRIsure™. 10.1. Procedimiento El proceso comienza añadiendo 1 ml del reactivo TRIsure™ por cada 50-100 mg de tejido o 0,5 ml de TRIsure™ por cada 106 células aproximadamente, ya sean procedentes de cultivo o del aislamiento por separación celular mediante FACS. En el caso de los tejidos, es necesario un paso adicional de homogeneización de la muestra con un homogeneizador (Polytron; Heidoph), durante 15 segundos a la máxima potencia. A continuación, en ambos casos, el homogeneizado se deja incubar 10 minutos a temperatura ambiente, para permitir una disociación completa de los complejos núcleo-proteicos. Posteriormente, añadimos 0,2 ml de cloroformo (Sigma-Aldrich) por cada ml inicial de TRIsure™ añadido. Agitamos vigorosamente e incubamos a temperatura ambiente durante otros 10 minutos. A continuación, centrifugamos a 12.000 x g a 4ºC durante 15 minutos, obteniéndose una solución trifásica. La fase superior acuosa corresponde al ARN, mientras que las proteínas, lípidos y ADN se encuentran en la interfase y fase inferior orgánica. Por tanto, a partir de esta solución trifásica, podemos aislar el ARN (Subapartado 10.1.1), el ADN genómico (ADNg) (Subapartado 10.1.2) y las proteínas (Subapartado 10.1.3), aunque estas últimas se encuentran desnaturalizadas. 10.1.1. Aislamiento de ARN Para aislar el ARN, extraemos la fase superior acuosa cuidadosamente y procedemos de forma diferente en función del tipo de muestra. En general, una vez extraída la fase acuosa, añadimos 0,5 ml de isopropanol (Sigma-Aldrich) por cada ml inicial de TRIsure™ y 0,4 µl de glicógeno (Thermo Scientific), que ayudará a la precipitación del ARN, manteniéndolo a -20ºC durante toda la noche. Al día siguiente, incubamos a temperatura ambiente durante 10 minutos, y centrifugamos a 12.000 x g, durante 15 minutos a 4ºC. El pellet de ARN obtenido se lava con 1 ml de etanol (Scharlau) preparado al 75% (v/v) con agua tratada con DEPC. Volvemos a centrifugar a 12.000 x g, durante 15 minutos a 4ºC y el pellet obtenido se deja secar y se resuspende en agua tratada con DEPC. Por otra parte, las muestras humanas no han sido obtenidas en las condiciones idóneas para obtener un ARN de alta integridad. Las necropsias no son inmediatas, como puede ocurrir con muestras de células o de modelos. Además, las muestras, una vez obtenidas, son congeladas y almacenadas en los Bancos de Tejidos durante varios años. En consecuencia, para las muestras humanas decidimos emplear el protocolo comercial del RNeasy Mini Kit (Quiagen), que garantiza mejores resultados en cuanto a purificación e integridad del ARN. De forma breve, una vez extraída la fase acuosa, añadimos 0,7 mL de etanol (Scharlau) al 75% en agua tratada con DEPC, incubándolo a -20ºC durante 6-12 horas, para proporcionar las condiciones ideales de unión. Tras lo cual, transferimos la muestra a una columna, donde quedará retenido el ARN. Realizamos diferentes lavados para Código seguro de Verificación : GEISER-8598-9009-566a-4890-b4af-d14e-6f25-b44a | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-8598-9009-566a-4890-b4af-d14e-6f25-b44a 23/11/2020 10:13:34 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000059958 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-8598-9009-566a-4890-b4af-d14e-6f25-b44a 71 C MATERIALES Y MÉTODOS eliminar cualquier tipo de contaminación y finalmente el ARN se eluye en 50 µl de agua tratada con DEPC. En ambos casos, el ARN purificado se cuantifica en un espectrofotómetro (NanoDrop; Thermo Scientific), aprovechando la capacidad de las bases nitrogenadas de absorber a una longitud de onda de 260 nm. Además, es conveniente determinar la razón de absorbancia a 260 nm/280 nm (longitud de onda a la que absorben los aminoácidos aromáticos), lo que nos permite conocer el nivel de contaminación de proteínas presentes en la muestra de ARN purificado. Una razón de 2.1 indica que la muestra de ARN no presenta prácticamente contaminación de proteínas. Para comprobar la integridad del ARN purificado utilizamos Agilent RNA 6000 Nano Kit (Agilent Technologies) como soporte electroforético y Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies) como instrumento de detección y análisis. Este sistema permite llevar a cabo una electroforesis en gel mediante el uso de un chip, sobre el cual se carga la matriz del gel, el fluoróforo que permitirá llevar a cabo la visualización del ARN y la muestra correspondiente. Tras la electroforesis, el sistema de análisis recoge la fluorescencia emitida por la muestra, previamente estimulada con láser, creando un electroferograma (fluorescencia/tiempo). El electroferograma permite conocer la calidad del ARN proporcionando el RIN (Número de Integridad del ARN; del inglés, RNA Integrity Number), mediante el uso de un software específico. El RIN establece una clasificación numérica de la calidad del ARN que comprende valores del 1 al 10, siendo 1 el RIN de un ARN totalmente degradado y 10 el RIN de un ARN perfectamente conservado. Tras llevar a cabo el análisis de integridad de ARN de nuestras muestras humanas hemos obtenido un RIN medio de 5,66±1,06, indicando una calidad media del ARN utilizado en este trabajo. Una vez se ha purificado, cuantificado y comprobado su integridad, el ARN es almacenado a –80ºC hasta su posterior utilización. 10.1.2. Aislamiento de ADN A partir de la solución trifásica anterior, utilizamos la fase intermedia y la fase orgánica inferior para extraer ADN y proteínas totales. En primer lugar, se lleva a cabo la precipitación del ADN genómico (ADNg). Para ello, añadimos 300 µl de etanol al 100%, por cada ml inicial de TRIsure™ e invertimos el tubo varias veces para mezclarlo. Después, incubamos la muestra durante 5 minutos a temperatura ambiente, para permitir que el ADN precipite. Centrifugamos a 2.000 x g durante 5 minutos a 4°C y el sobrenadante (donde están las proteínas) se lleva a un tubo nuevo (Subapartado C.10.1.3). Por su parte, el pellet de ADN obtenido se lava con 1 ml de citrato de sodio 0,1M (Sigma-Aldrich) en 10% de etanol. Agitamos durante 30 minutos a temperatura ambiente y centrifugamos a 2.000 x g durante 5 minutos a 4°C. Tras lo cual, volvemos a lavar en las mismas condiciones. Posteriormente, añadimos 1,5 ml de etanol al 75%, agitamos durante 20 minutos y centrifugamos a 2.000 x g durante 5 minutos a 4°C. El pellet obtenido se deja secar y se resuspende en hidróxido de sodio 8 mM Código seguro de Verificación : GEISER-8598-9009-566a-4890-b4af-d14e-6f25-b44a | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-8598-9009-566a-4890-b4af-d14e-6f25-b44a 23/11/2020 10:13:34 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000059958 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-8598-9009-566a-4890-b4af-d14e-6f25-b44a 72 C MATERIALES Y MÉTODOS (Acros OrganicsTM), EDTA 1 µM (Sigma-Aldrich), pH=7,5. Se mantiene en agitación durante 12-18 horas, garantizando la disolución del ADNg, y centrifugamos a 12.000 x g durante 10 minutos a 4°C, para eliminar los restos de material insoluble que puedan permanecer. El sobrenadante, con el ADNg, se pasa a un tubo nuevo y se mantiene a -25ºC hasta su uso (Apartado C.12.3). 10.1.3. Aislamiento de proteínas Para precipitar las proteínas, al sobrenadante aislado en el apartado anterior añadimos 1,5 ml de isopropanol. Tras invertir varias veces el tubo, se deja en agitación durante unos 20 minutos a temperatura ambiente y centrifugamos 10 minutos a 12.000 x g a 4ºC. Lavamos el precipitado con 2 ml de guanidina (Sigma- Aldrich) 0,3 M en 95% (v/v) de etanol, agitamos fuertemente y lo mantenemos en agitación durante 20 minutos a temperatura ambiente, para después centrifugar a 7.500 x g durante 5 minutos a 4ºC. Este proceso de lavado se repite dos veces más, y, luego, realizamos un último lavado similar, pero empleando etanol absoluto, con el fin de eliminar los restos de guanidina. Finalmente, dejamos secar el precipitado unos 10 minutos, hasta que se evapora todo el alcohol. Para solubilizar las proteínas, resuspendemos el precipitado, una vez seco, en urea 8M (PanReac AppliChem) y SDS 4%, tamponado con 40mM Tris (PanReac AppliChem)-HCl (PanReac AppliChem) pH=7,5, e incubamos toda la noche en agitación a temperatura ambiente. Al día siguiente, se procede a su cuantificación por el método de Lowry (Apartado C.13). Las proteínas solubilizadas y cuantificadas se congelan en diferentes alícuotas a -80ºC hasta su uso. Estas proteínas se encuentran desnaturalizadas, por lo que solamente se utilizaran para estudios en western blot (WB) (Apartado C.14). 11. Retrotranscripción La retrotranscripción o transcripción inversa es el proceso por el cual obtenemos ADN complementario (ADNc) a partir de ARN mensajero (ARNm). El ADNc es una biomolécula mucho más estable que el ARN, por lo que nos permite un manejo más cómodo y seguro de la muestra. Este ADNc se consigue a partir de un molde de ARN en presencia de cebadores aleatorios y desoxirribonucleótidos, mediante la actividad de la enzima transcriptasa inversa que, en las condiciones óptimas, sintetiza una hebra de ADN complementaria y genera un híbrido ARNADN, el cual, por degradación del ARN, quedará como ADN monocatenario. Posteriormente, se forma una doble hélice de ADN, mucho más estable que el ARN de partida. 11.1. Procedimiento Para realizar la retrotranscripción, partimos de 4 μg de ARN resuspendido en agua con DEPC (Apartado C.10.1.1). Este ARN se somete a 65ºC durante 10 minutos para su desnaturalización en un termociclador (MasterCycler Gradient, Eppendorf). Transcurrido este tiempo, llevamos la muestra inmediatamente a 4ºC para evitar la renaturalización del ARN. Código seguro de Verificación : GEISER-8598-9009-566a-4890-b4af-d14e-6f25-b44a | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-8598-9009-566a-4890-b4af-d14e-6f25-b44a 23/11/2020 10:13:34 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000059958 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-8598-9009-566a-4890-b4af-d14e-6f25-b44a 73 C MATERIALES Y MÉTODOS Preparamos una mezcla de reacción, mediante la combinación de los componentes del “High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit” (Applied Biosystem), que contiene los reactivos necesarios para llevar a cabo la transcripción inversa (Tabla C.6). Una vez preparada, la mezcla de reacción se combina con la muestra de ARN en proporción 1:1, de manera que cada reactivo queda a una concentración final 1X y la enzima retrotranscriptasa a 2,5 U/µl. Por último, introducimos la muestra en el termociclador e incubamos durante 10 minutos a 25ºC, para permitir la hibridación de los cebadores con sus secuencias complementarias, seguido de 2 horas a 37ºC, para que tenga lugar la reacción de retrotranscripción y, en definitiva, sintetice el ADNc a partir del ARNm. Dicho ADNc obtenido se conserva a –25ºC hasta su utilización. Reactivos Volumen de la mezcla de reacción Concentración final Cebadores aleatorios (10X) 20% 2X Tampón de Retrotranscripción (10X) 20% 2X Mezcla de Desoxirribonucleótidos (dNTP) (25X) 8% 2X Enzima Transcriptasa Inversa (50 U/μl) 10% 5 U/μl H2O tratada con DEPC 42% - Tabla C.6. Relación de los reactivos suministrados por Applied Biosystems. Se indica el porcentaje del volumen total que supone cada uno de ellos en la mezcla de reacción y la concentración final de los mismos para la reacción de retrotranscripción. Con el fin de comprobar que la cantidad de ADNc obtenida tras la reacción de retrotranscripción es la misma en todas las muestras, llevamos a cabo la amplificación de uno o varios genes housekeeping (GAPDH, 18S, β-ACTINA, CYC1, RPL13, UBE2D2, HPRT1, UBC). En general, hemos obtenido una expresión similar, con poca variabilidad, de cada gen housekeeping en todas las muestras, independientemente de su origen. En cualquier caso, su expresión se ha empleado rutinariamente como control interno en todos los experimentos con la finalidad de normalizar posibles cambios en la cantidad de ADNc de partida en las reacciones de PCR (Apartados C.12.1 y C.12.2). 12. PCR en tiempo real La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es una técnica muy utilizada en biología molecular debido a sus numerosas aplicaciones, ya que permite amplificar de forma exponencial, cientos o millones de veces, secuencias específicas de ADN, presentando una elevada sensibilidad. Se denomina RT-PCR cuando se parte de ADNc, obtenido a partir de ARN mensajero (ARNm) mediante retrotranscripción (Apartado C.11). A diferencia de otras técnicas convencionales de PCR, donde se requiere una técnica adicional para observar los resultados, las PCR en tiempo real son PCR cuantitativas (qPCR). El análisis de las muestras se produce durante el mismo proceso de amplificación, monitorizando una señal fluorescente asociada al producto de PCR. En este sentido, la RT-qPCR es una técnica muy útil para la cuantificación de cantidades pequeñas de ARN, con elevada precisión y sin la necesidad de una acción posterior. Código seguro de Verificación : GEISER-8598-9009-566a-4890-b4af-d14e-6f25-b44a | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-8598-9009-566a-4890-b4af-d14e-6f25-b44a 23/11/2020 10:13:34 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000059958 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-8598-9009-566a-4890-b4af-d14e-6f25-b44a 74 C MATERIALES Y MÉTODOS Para ello, se utilizan termocicladores que son capaces de amplificar y detectar la fluorescencia simultáneamente, como el termociclador de tiempo-real ABIPrism 7900 (Applied Biosystems) y el equipo ViiA™ 7 Real-Time PCR System (Applied Biosystems™), utilizados en el presente trabajo. Estos sistemas combinan un termociclador, un detector de fluorescencia y un software específico de amplificación. 12.1. Cuantificación de la expresión génica mediante sondas Taqman En este trabajo, para cuantificar la expresión de ARNm se han utilizado sondas de hidrólisis o sondas Taqman. Las sondas Taqman son sondas de hibridación específicas que permiten la detección exclusiva de una determinada secuencia. Se tratan de oligonucleótidos de 20-24 bases de longitud, que se unen de forma complementaria a una secuencia interna dentro del fragmento de ADN a amplificar. Estas sondas están marcadas en el extremo 5’ con un fluoróforo donador (reporter), como FAM, y en el extremo 3’ con un aceptor o sustancia absorbente (quencher), normalmente TAMRA, que absorbe la fluorescencia liberada por el donador (Figura C.4). De esta forma, el espectro de emisión del primero ha de solapar con el espectro de absorción del segundo. Mientras que la sonda está intacta, no se detecta fluorescencia ya que la energía se transfiere vía Transmisión de Energía de Resonancia (FRET; del inglés, Fluorescent Resonance Energy Transfer) del fluoróforo de baja longitud de onda en un extremo (reporter) al fluoróforo de alta longitud en el otro extremo (quencher), apantallando la fluorescencia de baja longitud de onda. Durante la fase de elongación, la sonda que ha hibridado con su secuencia complementaria va a estar unida a una cadena simple de ADN, y flanqueada por cebadores específicos de la secuencia estudio. Cuando la Taq-polimerasa alcanza la sonda, su actividad exonucleasa 5’-3’ libera al fluoróforo donador, que comienza a emitir fluorescencia al estar separado del quencher. Esta fluorescencia es captada por el detector y su intensidad, por tanto, es proporcional a la presencia de secuencias diana en la muestra analizada. Figura C.4. Representación esquemática del funcionamiento de una sonda Taqman. Los cebadores y la sonda se unen a su secuencia diana. Aunque el fluoróforo es excitado, el quencher absorbe la energía evitando que se detecte la fluorescencia. A partir del cebador, la ADN polimerasa copia la secuencia complementaria hasta llegar a la sonda. Entonces, esta es hidrolizada por el extremo 5´, liberando al fluoróforo y permitiendo que el aumento de fluorescencia, que antes estaba siendo apantallado, sea detectado. Finalmente, la enzima hidroliza el resto de la sonda, completando la copia de la secuencia diana. Código seguro de Verificación : GEISER-8598-9009-566a-4890-b4af-d14e-6f25-b44a | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-8598-9009-566a-4890-b4af-d14e-6f25-b44a 23/11/2020 10:13:34 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000059958 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-8598-9009-566a-4890-b4af-d14e-6f25-b44a 75 C MATERIALES Y MÉTODOS Las reacciones de RT-PCR en tiempo real se caracterizan por el momento en el proceso de amplificación en el que la señal fluorescente se registra como estadísticamente significativa, distinguiéndose del ruido de fondo o señal background. A mayor número de copias iniciales, antes se detectará un aumento significativo en la fluorescencia (Bustin, 2000; Ginzinger, 2002; Bustin, 2002). Este punto se define como ciclo threshold (Ct) y siempre ocurre durante la fase exponencial de amplificación. De esta forma la cuantificación no se afecta porque alguno de los componentes de la reacción se vuelva limitante, y los replicados muestran resultados uniformes y reproducibles. La señal registrada se normaliza con la fluorescencia de referencia o calibradores para permitir correcciones en las fluctuaciones de fluorescencia provocadas por cambios en la concentración o el volumen, y se obtiene un valor de Ct para cada muestra. 12.1.1. Procedimiento Para llevar a cabo la RT-PCR, preparamos la mezcla de reacción (Vf=20 µl) que contiene 10 µl de iTaqTM Universal Probes Supermix (Bio-Rad) (2X), 1 µl de Taqman™ Gene Expression Assay (Applied Biosystem) (20X), 8 µl de agua milliQ y 1 µl de ADNc. La iTaq está compuesta por la enzima Taq polimerasa, los dNTPs y el medio adecuado para que ocurra la reacción. El vial comercial Taqman™ Gene Expression Assay, contiene los cebadores específicos del gen que se pretende cuantificar y una sonda Taqman MGB, marcada con FAM™ en el extremo 5’ y el quencher, además de una unión al surco menor (MGB, del inglés minor groove binder), en el 3’. Esta MGB aumenta la temperatura de fusión (Tm, del inglés melting temperature) de la sonda y estabiliza el híbrido sonda-diana. La concentración dentro del vial es de 18 µM para cada primer y 5 µM para la sonda. Las sondas suministradas por Applied Biosystems han pasado previamente controles de calidad que garantizan la especificidad por la secuencia diana y la eficiencia de amplificación. Las sondas Taqman utilizadas para cuantificar la expresión de ARNm de los diferentes marcadores analizados en este trabajo se encuentran detalladas en la Tabla C.7. Una vez preparada esta mezcla de reacción en cada pocillo, introducimos la placa de 96 pocillos en el ABI PRISM Sequence Detection Systems 7900, donde se llevará a cabo la amplificación, siguiendo el programa detallado en la Tabla C.8. El análisis de los resultados se realiza con el programa ABI Prism 7900 SDS Software, obteniéndose un valor de Ct para cada muestra. Para la cuantificación de los niveles de ADNc, hemos utilizado el método de comparación de Ct (Ramos et al., 2006), usando un housekeeping (GAPDH, normalmente), como gen de referencia. Los valores de Ct son calculados con el software proporcionado por Applied Biosystems (SDS 1.7). Según este método, la cantidad de ADNc (unidades de expresión de la diana estudiada), normalizada con el housekeeping viene dada por la siguiente ecuación: 2-∆∆Ct (Livak y Schmittgen, 2001). Código seguro de Verificación : GEISER-8598-9009-566a-4890-b4af-d14e-6f25-b44a | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-8598-9009-566a-4890-b4af-d14e-6f25-b44a 23/11/2020 10:13:34 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000059958 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-8598-9009-566a-4890-b4af-d14e-6f25-b44a 76 C MATERIALES Y MÉTODOS Tabla C.7. Relación de sondas Taqman utilizadas para humanos y ratón en el análisis de expresión de ARNm mediante RT-PCR. Condiciones de la RT-PCR Fase Previa Ciclo (40 repeticiones) Activación de la Taq Desnaturalización inicial Desnaturalización Hibridación y Elongación 2 min - 50ºC 10 min - 95ºC 15 s - 95ºC 1 min - 60ºC Tabla C.8. Condiciones de tiempo y temperatura de la RT-PCR en tiempo real para la cuantificación de expresión génica según el protocolo proporcionado por Applied Biosystems. Como los amplicones son pequeños, se combina la fase de hibridación y elongación, usando una temperatura de 60ºC. Sonda (Humano) Referencia Sonda (Humano) Referencia ALDH1L1 Hs01003842_m1 MKI67 Hs01032443_m1 AQP-4 Hs00242342_m1 MSR1 Hs00234007_m1 β-actina Hs99999903_m1 MRC1 Hs00267207_m1 CCL2 Hs00234140_m1 NPY Hs00173470_m1 CCL3 Hs00234142_m1 PDGFRB Hs01019589_m1 CCL4 Hs99999148_m1 PECAM1 Hs01065279_m1 CCL5 Hs00982282_m1 PFKM Hs01075411_m1 CCR1 Hs00174298_m1 PGM1 Hs01071897_m1 CCR2 Hs00704702_s1 PILRA Hs00603661_g1 CCR5 Hs00152917_m1 PKM Hs00761782_s1 CD11b Hs00355885_m1 PU.1 Hs02786711_m1 CD11c Hs00174217_m1 PV Hs00161045_m1 CD163 Hs00174705_m1 PYGB Hs00765686_m1 CD3e Hs01062241_m1 P2RX4 Hs00602442_m1 CD45 Hs04189704_m1 P2RY12 Hs01881698_m1 CD68 Hs02836816_g1 RPL13 Hs00744303_s1 CD74 Hs00269961_m1 SELE Hs00174057_m1 CLEC7A Hs01902549_s1 SST Hs00356144_m1 CPT1A Hs00912671_m1 S100β Hs00902901_m1 CSF1 Hs00174164_m1 TMEM119 Hs01938722_u1 CSF1R Hs00911250_m1 TNFα Hs00174128_m1 CX3CR1 Hs01922583_s1 TREM2 Hs00219132_m1 CYC1 Hs00357717_m1 UBE2D2 Hs00366152_m1 C1S Hs00156159_m1 VIM Hs00185584_m1 C1R Hs00354278_m1 18S Hs03003631_g1 C3 Hs00163811_m1 C4a-b Hs00246758_m1 Sonda (Ratón) Referencia FN1 Hs00365052_m1 Aldh1l1 Mm03048957_m1 GAPDH Hs03929097_g1 Aqp-4 Mm00802131_m1 GFAP Hs00909236_m1 Ccr2 Mm00438270_m1 HMGCR Hs00168352_m1 Cd3 Mm01179194_m1 IBA1 Hs00610419_g1 Cx3cr1 Mm02620111_s1 IDH2 Hs00953879_m1 Gapdh Mm99999915_g1 IDH3a Hs00194253_m1 Gfap Mm01253033_m1 IFITM3 Hs03057129_s1 Iba1 Mm00479862_g1 IL1β Hs01555410_m1 Ly6c Mm00841873_m1 IL6 Hs00985639_m1 Tmem119 Mm00525305_m1 LGALS3 Hs00173587_m1 Trem2 Mm04209424_g1 Código seguro de Verificación : GEISER-8598-9009-566a-4890-b4af-d14e-6f25-b44a | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-8598-9009-566a-4890-b4af-d14e-6f25-b44a 23/11/2020 10:13:34 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000059958 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-8598-9009-566a-4890-b4af-d14e-6f25-b44a 77 C MATERIALES Y MÉTODOS Además, en las muestras humanas, con el fin de comprobar que no se producen alteraciones en los niveles de expresión de GAPDH como consecuencia de la patología, género u algún otro factor (Preece y Cairns, 2003), hemos llevado a cabo la amplificación de otros cinco genes housekeeping (β-actina, 18S, UBE2D2, CYC1 y RPL13). Observamos una adecuada correlación entre ellos y con GAPDH, lo cual es indicativo de que las ligeras variaciones en los niveles de expresión de estos genes entre diferentes muestras es consecuencia de pequeños cambios en la cantidad total de ADNc, validándose como buenos genes de referencia (Gutala y Reddy, 2004; Rydbirk et al., 2016). 12.2. Cuantificación de la expresión génica mediante TaqMan® Array Cards Para cuantificar la expresión de varios genes específicos de monocitos o CDM, microglía y macrófagos asociados al SNC en muestras de tejido humano post mortem, hemos utilizado TaqMan® Array Cards, de Thermo Fisher Scientific, también llamadas TLDAs (Taqman Array Microfluidic Cards). Estas permiten realizar RTPCR en tiempo real de varias sondas Taqman simultáneamente, presentando, por tanto, una mayor capacidad para cuantificar la expresión de múltiples genes en varias muestras de manera paralela, sencilla y rápida. Además, minimiza la manipulación y, por tanto, el error que puede llevar asociado. Custom Taqman® Array Cards Sonda Referencia Sonda Referencia GAPDH Hs02786624_g1 HLA-dr Hs04192463_mH MRC-I Hs00267207_m1 LILRB2 Hs00275975_m1 Siglec1 Hs00224991_m1 CXCL16 Hs00222859_m1 CD163 Hs00174705_m1 Nur77 Hs00374226_m1 IFITM2 Hs00829485_sH HPRT1 Hs99999909_m1 IFITM3 Hs03057129_s1 Trem2 Hs00219132_m1 F13A1 Hs01114178_m1 MEF2a Hs01050409_m1 TAGLN2 Hs00761239_s1 SMAD3 Hs00969210_m1 FTH1 Hs01694011_s1 AXL Hs01064444_m1 NPC2 Hs00197565_m1 SALL1 Hs01548765_m1 18S Hs03003631_g1 CST-7 Hs00175361_m1 HLA-dqa1 Hs03007426_mH UBC Hs00824723_m1 Tabla C.9. Relación de las 24 sondas Taqman para muestras humanas incluidas en las Taqman® Array Cards prediseñadas. Se incluyen genes específicos de microglía, monocitos o CDM y macrófagos asociados al SNC, así como 4 genes housekeeping. En este trabajo, hemos utilizado Custom TaqMan® Array Cards, diseñadas con 24 sondas de interés previamente seleccionadas, correspondiendo 4 de ellas a genes control o housekeeping (Tabla C.9). La tarjeta presenta 8 puertos de entrada en los que se depositan las diferentes muestras (8 muestras/placa). Cada uno de estos puertos de entrada se conecta con 48 pocillos donde se encuentran las sondas Taqman®. Puesto que las tarjetas utilizadas presentan 384 pocillos, cada una de ellas permite detectar la expresión de 24 genes distintos por duplicado para 8 muestras (Figura C.5). Código seguro de Verificación : GEISER-8598-9009-566a-4890-b4af-d14e-6f25-b44a | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-8598-9009-566a-4890-b4af-d14e-6f25-b44a 23/11/2020 10:13:34 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000059958 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-8598-9009-566a-4890-b4af-d14e-6f25-b44a 78 C MATERIALES Y MÉTODOS Figura C.5. Esquema de una TaqMan® Array Card (Formato 24). Se trata de una placa con 384 pocillos prediseñada para medir la expresión de 24 genes, en 8 muestras diferentes, por duplicado. La muestra se añade en su respectivo puerto de carga y, mediante centrifugación, se distribuye de forma homogénea por los 48 pocillos correspondientes. 12.2.1. Procedimiento En cada puerto de carga (Figura C.5), introducimos 100 ul de una mezcla compuesta por 50 μl de una mastermix comercial Taqman® (Thermo Scientific), 25μl de agua miliQ y 25 μl de ADNc, a una concentración final de 10 ng/μl. Posteriormente, centrifugamos la placa verticalmente a 1.200 rpm durante 2 minutos en una centrífuga Sorvall ST40R (Thermo Scientific), para que toda la muestra se distribuya de forma homogénea, quedando 1 µl de muestra por pocillo. A continuación, sellamos la placa y cortamos los puertos de carga. Finalmente, introducimos la placa en el equipo ViiA™ 7 Real-Time PCR System (Applied Biosystems™). Mediante el software ViiA7 RUO, seleccionamos el programa de amplificación (Tabla C.8). Este equipo amplifica el ADNc y detecta la intensidad de fluorescencia, proporcionando un valor de Ct, de igual forma que una RT-PCR en tiempo real convencional basada en el uso de sondas Taqman (Apartado C.12.1). En las TaqMan® Array Cards, hemos utilizado cuatro genes housekeeping (GAPDH, 18S, HPRT1 y UBC), a partir de los cuales obtuvimos la media geométrica, mediante la raíz cuarta del producto de los valores de Ct obtenidos para cada uno de estos genes. De forma similar que en la RT-PCR en tiempo real, para cuantificar los niveles de ADNc hemos utilizado el método de comparación de Ct. En este caso, la cantidad de ADNc o unidades de expresión se normaliza con la media geométrica de los housekeeping y viene dada por: 2-ΔΔCt (Livak y Schmittgen, 2001). 12.3. Identificación del genotipo APOE Para la identificación del genotipo APOE, hemos empleado ensayos de identificación de genotipo de polimorfismo de nucleótido único (SNP; del inglés, single-nucleotide polymorphism) Taqman®. Estos ensayos se emplean para amplificar y detectar determinados alelos en el ADNg. Cada ensayo contiene dos cebadores (directo e inverso) preoptimizados y sin marcar, y dos sondas Taqman, con Muestras Puertos de carga 24 Sondas Taqman preseleccionadas Código seguro de Verificación : GEISER-8598-9009-566a-4890-b4af-d14e-6f25-b44a | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-8598-9009-566a-4890-b4af-d14e-6f25-b44a 23/11/2020 10:13:34 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000059958 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-8598-9009-566a-4890-b4af-d14e-6f25-b44a 79 C MATERIALES Y MÉTODOS las caracteristicas previamente descritas (Apartado C.12.1). Cada una de las sondas reconoce de forma específica a uno de los polimorfismos. Una de ellas está marcada con FAM y otra con VIC, permitiendo así la discriminación alélica. El funcionamiento de los ensayos de identificación de genotipo SNP Taqman® es similar al de cuantificación de la expresión génica (Apartado C.12.1). De forma breve, los cebadores y las sondas se unen, en caso de estar presente, a su secuencia diana. La ADN polimerasa amplifica la secuencia complementaria y, cuando llega a la sonda, hidroliza el extremo 5’, liberando al fluoróforo y emitiendo una señal que es captada por el detector. De forma que, únicamente detectaremos fluorescencia para FAM y/o VIC si la respectiva sonda se ha unido a su secuencia diana específica. En consecuencia, si únicamente observamos una curva de amplificación para el fluróforo FAM o VIC, el individuo será homocigoto para el correspondiente alelo. Sin embargo, si amplifican ambas señales, el individuo es heterocigoto. 12.3.1. Procedimiento Preparamos la mezcla de reacción (Vf=10 µl) que contiene 5 µl de TaqmanTM Genotyping Master Mix (Applied Biosystems) (2X), 0,2 µl de Taqman™ SNP Genotyping Assay (Applied Biosystem) (50X), 4 µl de agua milliQ y 1 µl de ADNg. Para realizar la discriminación entre los alelos ε2, ε3 y ε4, hemos identificado los polimorfismos del gen APOE rs429358 y rs7412 (Tabla C.10). SNP Taqman™ SNP Genotyping Assay Amplicón [VIC/FAM] Alelo ε2 ε3 ε4 rs429358 C_3084793_20 GCTGGGCGCGGACATGGAGGACGTG[C/T] GCGGCCGCCTGGTGCAGTACCGCGG T T C rs7412 C_904973_10 CCGCGATGCCGATGACCTGCAGAAG[C/T] GCCTGGCAGTGTACCAGGCCGGGGC T C C Tabla C.10. Polimorfismos del gen APOE detectados en este trabajo. Se indican los ensayos TaqmanTM empleados y la región amplificada (delimitada por los cebadores). En el amplicón observamos en rojo los posibles nucleótidos del polimorfismo, que son detectados de forma específica por diferentes sondas, marcadas respectivamente con VIC o FAM. También se indica el nucleótido presente en los alelos ε2, ε3 y ε4 para cada SNP. Una vez preparada la mezcla de reacción en cada pocillo, introducimos la placa de 96 pocillos en el ABI PRISM Sequence Detection Systems 7900, donde se llevará a cabo la amplificación, siguiendo el programa detallado en la Tabla C.11. El análisis de los resultados para la discriminación alélica se realiza con el programa ABI Prism 7900 SDS Software. Condiciones de la PCR para la identificación del genotipo APOE Fase Previa Ciclo (50 repeticiones) Activación de la Taq Desnaturalización inicial Desnaturalización Hibridación y Elongación rs429358 2 min - 50ºC 10 min - 95ºC 15 s - 95ºC 1 min - 64ºC rs7412 2 min - 50ºC 10 min - 95ºC 15 s - 95ºC 1 min - 61ºC Tabla C.11. Condiciones de tiempo y temperatura de la PCR en tiempo real para la identificación de los polimorfismos del gen APOE rs429358 y rs7412. Código seguro de Verificación : GEISER-8598-9009-566a-4890-b4af-d14e-6f25-b44a | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-8598-9009-566a-4890-b4af-d14e-6f25-b44a 23/11/2020 10:13:34 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000059958 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-8598-9009-566a-4890-b4af-d14e-6f25-b44a Código seguro de Verificación : GEISER-8598-9009-566a-4890-b4af-d14e-6f25-b44a | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-8598-9009-566a-4890-b4af-d14e-6f25-b44a 23/11/2020 10:13:34 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000059958 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-8598-9009-566a-4890-b4af-d14e-6f25-b44a 87 D RESULTADOS 1. CARACTERIZACIÓN DE LA PATOLOGÍA Y LA RESPUESTA MICROGLIAL EN LA CORTEZA FRONTAL DE PACIENTES DE ALZHEIMER Estudios previos del laboratorio han caracterizado la respuesta microglial en el hipocampo de pacientes de Alzheimer. A diferencia de la importante activación microglial descrita en modelos transgénicos de Aβ (Jimenez et al., 2008; Moreno- Gonzalez et al., 2009; Heneka et al., 2015; Baglietto-Vargas et al., 2017; Gutierrez y Vitorica, 2018) y en el modelo Tau P301S (Romero-Molina et al., 2018), en el hipocampo de pacientes de EA existe una activación microglial muy limitada que se localiza exclusivamente rodeando a las placas amiloides. Además, se produce un proceso de degeneración microglial, con un patrón regional definido, que está mediado por formas tóxicas fosforiladas de Tau (Sanchez-Mejias et al., 2016). Por otra parte, como hemos mencionado previamente, en la EA existe gran heterogeneidad regional en la acumulación de las proteínas Aβ y Tau (Braak y Braak, 1991; Jucker y Walker, 2011; Jucker y Walker, 2013). Así pues, en el hipocampo la patología neurofibrilar precede a la acumulación de Aβ, mientras que en la corteza frontal la patología amiloide es anterior a la neurofibrilar. Teniendo en cuenta estos antecedentes, en este proyecto analizamos las principales características patológicas y la respuesta microglial en la corteza frontal de individuos en diferentes estadios de la EA, y comparamos los resultados con los previamente obtenidos en el hipocampo. 1.1. Caracterización de la patología amiloide y neurofibrilar en la corteza frontal en relación con el hipocampo en la EA La patología Aβ aumenta con la progresión de la EA tanto en áreas corticales como hipocampales. Sin embargo, mientras que el aumento en la carga de Aβ monomérico es significativo en el hipocampo sólo en el estadio Braak V-VI, en la corteza frontal se manifiesta desde el estadio Braak III-IV. De hecho, existe una diferencia significativa entre ambas áreas cerebrales de estos individuos (corteza frontal, mediana=9,903; rango intercuartílico de 2,848 a 20,75; hipocampo, mediana=4,024, rango intercuartílico de 0 a 6,945). Además, en pacientes Braak V- VI la acumulación de este péptido es significativamente mayor en corteza frontal (mediana=18,17, rango intercuartílico de 10,71 a 44,03) que en hipocampo (mediana=5,097, rango intercuartílico de 1,841 a 9,023) (Figura D.1 C). En la figura D.1 D se observa que, los pacientes de EA con al menos un alelo ε4 poseen en la corteza frontal niveles más elevados de Aβ monomérico que los homocigóticos para ε3. Además, hemos realizado una caracterización preliminar de la patología Tau (Figura D.2), comprobando que, tanto en hipocampo como en corteza frontal de pacientes de EA, se produce un aumento de formas agregadas y fosforiladas de Tau. Futuros experimentos determinarán diferencias entre ambas regiones cerebrales. Código seguro de Verificación : GEISER-8598-9009-566a-4890-b4af-d14e-6f25-b44a | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-8598-9009-566a-4890-b4af-d14e-6f25-b44a 23/11/2020 10:13:34 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000059958 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-8598-9009-566a-4890-b4af-d14e-6f25-b44a 88 D RESULTADOS Figura D.1. En la corteza frontal de pacientes de Alzheimer se produce una acumulación mayor y más temprana de Aβ que en el hipocampo. (A) Análisis mediante western blot de la cantidad de Aβ en muestras de hipocampo y corteza frontal pertenecientes a los mismos individuos Braak II y Braak V-VI. (B) Cantidad de Aβ monomérico con la progresión de la patología de Alzheimer en muestras de corteza frontal. (C) Cuantificación mediante western blot de la carga de Aβ monomérico con la progresión de la patología en hipocampo (Braak 0, n=8; Braak II, n=21; Braak III-IV, n=9; Braak V-VI, n=30), y corteza frontal (Braak 0, n=10; Braak II, n=14; Braak III-IV, n=12; Braak V-VI, n=27). Las muestras de hipocampo han sido cuantificadas por la Dra. Victoria Navarro Garrido. Se indican los valores individuales de cada muestra, así como la mediana y los rangos intercuartílicos de los grupos representados. Los grupos de muestras de hipocampo y corteza frontal se analizan de forma independiente mediante la prueba de Kruskal-Wallis, seguida de un test de Dunn (p<0.0001, en ambos casos). La significancia entre las muestras de hipocampo y corteza frontal para un mismo estadio Braak se analizan mediante la prueba U de Mann-Whitney (*p<0,5; **p<0,01; ****p<0,0001). (D) Cuantificación de los niveles de Aβ monomérico en la corteza frontal de individuos Braak II (ε3, n=8; ε4, n=4) y V-VI (ε3, n=18; ε4, n=7). Los individuos agrupados como ε3 son homocigóticos para este alelo y los ε4 son homo o heterocigóticos para el alelo ε4. Se indican los valores individuales de cada muestra, así como la mediana y los rangos intercuartílicos de los grupos representados. La significancia entre diferentes genotipos se ha analizado mediante la prueba de U de Mann-Whitney (**p<0,01; ****p<0,0001). Abreviaturas: H=hipocampo, CF= corteza frontal. **** A monomérico H CF H CF H CF H CF 0 20 40 60 80 100 Unidades relativas ** * Braak 0 Braak II Braak III-IV Braak V-VI * BraakV-VIBraakII BraakV-VIBraakII 82E1 Hipocampo Corteza frontal 4.5- BraakIIBraak0 BraakV-VIBraakIII-IV 4.5- Corteza frontal A monomérico "Prueba de Mann-Whitney" Unidades relativas Braak II Braak V-VI 0 20 40 60 80 100 3 4 *** D A B C Código seguro de Verificación : GEISER-8598-9009-566a-4890-b4af-d14e-6f25-b44a | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-8598-9009-566a-4890-b4af-d14e-6f25-b44a 23/11/2020 10:13:34 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000059958 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-8598-9009-566a-4890-b4af-d14e-6f25-b44a 89 D RESULTADOS Figura D.2. Aumento de la patología Tau con la progresión de la EA en hipocampo y corteza frontal. Análisis mediante western blot de la cantidad de Tau total medido con el anticuerpo TAU46 y formas fosforiladas de Tau detectadas por el anticuerpo AT8 y AT180 en muestras de hipocampo y corteza frontal de los mismos individuos Braak II y Braak V-VI. 50- 80- 40- BraakV-VIBraakII BraakV-VIBraakII TAU46 Hipocampo Corteza frontal 50- 80- 40- BraakV-VIBraakII BraakV-VIBraakII AT8 Hipocampo Corteza frontal 50- 80- 40- BraakV-VIBraakII BraakV-VIBraakII AT180 Hipocampo Corteza frontal Código seguro de Verificación : GEISER-8598-9009-566a-4890-b4af-d14e-6f25-b44a | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-8598-9009-566a-4890-b4af-d14e-6f25-b44a 23/11/2020 10:13:34 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000059958 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-8598-9009-566a-4890-b4af-d14e-6f25-b44a 90 D RESULTADOS 1.2. Degeneración de neuronas parvalbúmina (PV) positivas en la corteza frontal y el hipocampo en la EA Otro rasgo neuropatológico típico de la EA es la neurodegeneración GABAérgica hipocampal, que afecta principalmente a las neuronas parvalbúmina (PV) positivas. En la corteza frontal, nuestros resultados muestran que la expresión de PV es mayor que en el hipocampo en todos los estadios Braak, y que dicha expresión también disminuye significativamente en pacientes de EA (Figura D.3). Figura D.3. Degeneración de neuronas GABAérgicas PV+ en el hipocampo y corteza frontal de pacientes de Alzheimer. Expresión relativa de PV, analizada mediante RT-PCR en tiempo real, con la progresión de la patología en hipocampo (Braak 0, n=8; Braak II, n=21; Braak III-IV, n=9; Braak V-VI, n=28), y corteza frontal (Braak 0, n=10; Braak II, n=13; Braak III-IV, n=12; Braak V-VI, n=11). Se indican los valores individuales de cada muestra, así como la mediana y los rangos intercuartílicos de los grupos representados. Los grupos de muestras de hipocampo y corteza frontal se analizan de forma independiente mediante la prueba de Kruskal-Wallis, seguida de un test de Dunn (hipocampo, p=0,0009; corteza frontal, p=0,0169). La significancia entre las muestras de hipocampo y corteza frontal se analizan mediante la prueba de Friedman para muestras relacionadas (p<0,0005) (*p<0,5; ***p<0,001). Para estudiar si esta neurodegeneración podría estar causada o mediada por las patologías amiloide y/o neurofibrilar, presentes en ambas regiones cerebrales, realizamos un ensayo de supervivencia neuronal en presencia de neurosinaptosomas (NS) aislados de los modelos APP y TAU, que contienen diferentes formas de Aβ y Tau, respectivamente (Figura D.4 A). A pesar de que los cultivos de neuronas primarias presentan una gran variabilidad, nuestros resultados muestran que, en presencia de patología Tau, se produce una degeneración selectiva y muy significativa de neuronas PV+, sin que se afecte el número total de neuronas. Por otra parte, no observamos diferencias en el número de neuronas PV+ tratadas con NS de modelos APP (Figura D.4). Por tanto, la patología Tau podría ser responsable, al menos en parte, de la severa degeneración de estas neuronas GABAérgicas que se produce en la EA. PV 0 II III-IV V-VI 0 II III-IV V-VI 0 2 4 6 8 Unidades relativas ** Hipocampo Corteza frontal *** Código seguro de Verificación : GEISER-8598-9009-566a-4890-b4af-d14e-6f25-b44a | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-8598-9009-566a-4890-b4af-d14e-6f25-b44a 23/11/2020 10:13:34 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000059958 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-8598-9009-566a-4890-b4af-d14e-6f25-b44a 91 D RESULTADOS Figura D.4. Degeneración selectiva de neuronas GABAérgicas PV+ en cultivos de neuronas primarias tratadas con neurosinaptosomas (NS) procedentes de ratones TAU. (A) Determinación, mediante western blot, de Aβ (6E10+82E1), Tau total (TAU46, TAU12) y fosforilado (AT8, AT100) en los NS aislados de ratones WT, APP y TAU. (B) Imágenes representativas de las neuronas primarias, tras 24 de tratamiento con los diferentes NS en medio de neuronas, marcadas con los anticuerpos PV (rojo) y NeuN (verde). Barra de escala: 100 µm. (C) Cuantificación del número de neuronas PV+, (D) NeuN+ y (E) número de neuronas PV+ corregido por el número de neuronas totales (NeuN+) en la condición control (n=15) y tras el tratamiento con NS WT (n=20), APP (n=25) y TAU (n=25). La estadística se ha analizado mediante el test de ANOVA seguido del test de comparación múltiple Tukey (***p<0,001; ****p<0,0001). Mono (4,5KDa) WT 20 - 15 - 10 -2-Mer 3-Mer 6E10+82E1 AT8 TAU46 APP TAU 80 - 50 - WT APP TAU AT100 TAU12 80 - 50 - 80 - 50 - 80 - 50 - Control WT APP TAU PV NeuN A B Nº de células PV+/campo Control WT APP TAU 0 3 6 9 12 15 **** Neuronas PV+ ANOVA; F (3, 81) = 14.60 p < 0.0001 N º d e célu las N euN +/cam p o C on trol WT AP P T AU 0 50 100 150 200 250 300 N euronas N euN + N º d e n euro n a s P V + resp e cto a l nº de célu la s N eu N + (% ) C on trol WT AP P T AU 0 5 10 15 20 *** N euronas P V+ / Neu N+ A N O V A ; F (3 , 8 1 ) = 1 5 .4 7 p < 0 .00 0 1 CD E Código seguro de Verificación : GEISER-8598-9009-566a-4890-b4af-d14e-6f25-b44a | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-8598-9009-566a-4890-b4af-d14e-6f25-b44a 23/11/2020 10:13:34 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000059958 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-8598-9009-566a-4890-b4af-d14e-6f25-b44a 92 D RESULTADOS 1.3. Estudio de la respuesta microglial en la corteza frontal de pacientes de Alzheimer El análisis por RT-PCR en tiempo real de la expresión de múltiples genes microgliales en la corteza frontal de pacientes de Alzheimer revela que, algunos genes aumentan de forma muy significativa con la progresión de la patología, mientras que otros permanecen inalterados o incluso disminuyen de forma patente (Figura S1, Anexo I). Con el fin de obtener conclusiones robustas, y de acuerdo con la bibliografía reciente (Hickman et al., 2013; Keren-Shaul et al., 2017; Mathys et al., 2017; Hendrickx et al., 2017; Navarro et al., 2018; Hansen et al., 2018; Hopperton et al., 2018; Friedman et al., 2018) englobamos los marcadores analizados en 3 grupos que denominamos “población microglial”, “microglía DAM” y “microglía homeostática”. Para cada uno de estos grupos calculamos su Gene Set Score (Sj) (Friedman et al., 2018). Sj se calcula para cada muestra “j”, utilizando el valor “eij”, que es el nivel de expresión normalizado del gen “i” en la muestra “j”. En primer lugar, calculamos la matriz central de la expresión génica “cij” con la fórmula siguiente: 𝑐𝑖𝑗 = 𝑒𝑖𝑗 −1 𝑛𝑠𝛴𝑗𝑒𝑖𝑗; donde “ns” es el número de muestras. “cij” corresponde al nivel de expresión del gen “i” en la muestra “j”, relativo al nivel de expresión medio en todas las muestras. El Sj de un clúster de genes para la muestra “j” (Sj) se define como la media de la matriz “cij”: 𝑆𝑗=1 𝑛𝑔𝛴𝑖𝑐𝑖𝑗; donde “ng” es el número de genes que forman el clúster. Como observamos en la figura D.5, la expresión del gene set score de población microglial no cambia con la progresión de la enfermedad. Sin embargo, se produce un aumento significativo en los genes asociados a microglía DAM, lo que refleja un aumento en la activación microglial. Este incremento se produce de forma paralela a una clara disminución en el gene set score de microglía homeostática únicamente en pacientes Braak V-VI. También estudiamos si existen diferencias en la respuesta microglial de individuos con diferente genotipo APOE, según sean homocigóticos para el alelo ε3 o presenten al menos un alelo ε4. Aunque no observamos diferencias significativas entre individuos Braak II o pacientes Braak V-VI en función del genotipo APOE, existe una leve tendencia a mayor activación microglial en presencia del alelo ε4 (Figura D.6). Dado la intensa patología Aβ existente en la corteza frontal de los pacientes de Alzheimer (Figura D.1), estudiamos la relación entre los diferentes gene set score microgliales y los niveles de Aβ monomérico. Nuestros datos revelan una correlación negativa significativa entre la cantidad de Aβ monomérico y la expresión de genes homeostáticos. Además, se observa una tendencia muy leve a una mayor activación microglial en los individuos con más patología amiloide. Sin embargo, la población microglial no se afecta en función de la cantidad de Aβ (Figura D.7). Código seguro de Verificación : GEISER-8598-9009-566a-4890-b4af-d14e-6f25-b44a | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-8598-9009-566a-4890-b4af-d14e-6f25-b44a 23/11/2020 10:13:34 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000059958 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-8598-9009-566a-4890-b4af-d14e-6f25-b44a 93 D RESULTADOS Figura D.5. Activación microglial en la corteza frontal de pacientes de Alzheimer. Representación de los valores de gene set score de (A) Población microglial (IBA1 y TMEM119), (B) Microglía DAM (CD45, TREM2, CLEC7A, CD11b) y (C) Microglía homeotática (CX3CR1 y P2RY12), en la corteza frontal de individuos Braak 0 (n=10), II (n=13), III-IV (n=12) y V-VI (n=11). Se representan los valores individuales de cada muestra, así como la mediana y los rangos intercuartílicos de los grupos representados. La significancia se ha analizado mediante la prueba de Kruskal-Wallis, seguida de un test de Dunn (*p-<0,05). Figura D.6. Microglía en función del genotipo APOE en individuos Braak II y Braak V-VI. Representación de los valores de gene set score de (A) Población microglial (IBA1 y TMEM119), (B) Microglía DAM (CD45, TREM2, CLEC7A, CD11b) y (C) Microglía homeotática (CX3CR1 y P2RY12), en la corteza frontal de individuos Braak II (ε3, n=7; ε4, n=4) y V-VI (ε3, n=5; ε4, n=7). Los individuos agrupados como ε3 son homocigóticos para este alelo y los ε4 son homo o heterocigóticos para el alelo ε4. Se indican los valores individuales de cada muestra, así como la mediana y los rangos intercuartílicos de los grupos representados. La significancia entre diferentes genotipos se ha analizado mediante la prueba de U de Mann-Whitney. Población microglial "Test Kruskal-Wallis" p=0.9437 Braak 0 Braak II Braak III-IV Braak V-VI 0 1 2 3 4 Gene Set Score (Sj) A Microglía DAM "Test Kruskal-Wallis" p=0.0375 Braak 0 Braak II Braak III-IV Braak V-VI 0 1 2 3 4 Gene Set Score (Sj) * B M icroglía h o m eo stática "Test Kruskal-W allis" p=0.0015 B raak 0 B raak II B raak III-IV B raak V -V I 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 G e n e S e t S core (S j) * C Población microglial "Prueba de Mann-Whitney" Gene Set Score (Sj) Braak II Braak V-VI 0 1 2 3 43 4 Microglía homeostática "Prueba de Mann-Whitney" Gene Set Score (Sj) Braak II Braak V-VI 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 Microglía DAM "Prueba de Mann-Whitney" Gene Set Score (Sj) Braak II Braak V-VI 0 1 2 3 B C A Código seguro de Verificación : GEISER-8598-9009-566a-4890-b4af-d14e-6f25-b44a | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-8598-9009-566a-4890-b4af-d14e-6f25-b44a 23/11/2020 10:13:34 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000059958 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-8598-9009-566a-4890-b4af-d14e-6f25-b44a 94 D RESULTADOS Figura D.7. Análisis de correlación de los diferentes gene set score microgliales con el nivel de Aβ monomérico. Estudio de correlación entre la cuantificación de Aβ monomérico y el gene set score de (A) población microglial, (B) microglía DAM y (C) microglía homeostática, para cada individuo clasificado en función del estadio Braak (Braak 0, n=10; Braak II, n=13; Braak III-IV, n=12; Braak V- VI, n=11). Se muestra la recta de ajuste o regresión lineal. El estudio de correlación se ha llevado a cabo empleando el método de Spearman. En conclusión, nuestros resultados indican que en la corteza frontal de pacientes de Alzheimer no se produce como en el hipocampo una disminución en la población microglial, pero sí una alteración hacia un fenotipo activo. Además, esta región, aunque presenta patología neurofibrilar, se caracteriza especialmente por una importante acumulación de Aβ, que correlaciona con la disminución en la expresión de genes microgliales homeostáticos. Por otra parte, en ambas regiones cerebrales se produce degeneración de neuronas PV+, que parece ser consecuencia, al menos en parte, de la patología Tau. A monomérico 0 20 40 60 80 100 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 Spearman: r = - 0.4278 p = 0.0030 Microglía homeostática (Sj) Braak 0 Braak II Braak III-IV Braak V-VI A monomérico 0 20 40 60 80 100 0 1 2 3 4 Spearman: r = - 0.05472 p = 0.7180 Población microglial (Sj) Braak 0 Braak II Braak III-IV Braak V-VI A monomérico 0 20 40 60 80 100 0 1 2 3 4 Spearman: r = 0.2568 p = 0.0849 Microglía DAM (Sj) Braak 0 Braak II Braak III-IV Braak V-VI A B C Código seguro de Verificación : GEISER-8598-9009-566a-4890-b4af-d14e-6f25-b44a | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-8598-9009-566a-4890-b4af-d14e-6f25-b44a 23/11/2020 10:13:34 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000059958 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-8598-9009-566a-4890-b4af-d14e-6f25-b44a 95 D RESULTADOS 2. RESPUESTA ASTROGLIAL EN LA PATOLOGÍA DE ALZHEIMER Estudios previos del laboratorio demuestran que, en modelos animales de EA, se produce una importante reactividad astrocitaria, junto con un aumento en la respuesta del complemento y una disfunción metabólica de los astrocitos (Sanchez- Mico, 2019). Por ello, en el presente trabajo decidimos caracterizar la respuesta astroglial en muestras cerebrales de pacientes de Alzheimer, así como realizar ensayos in vitro para profundizar en las causas y consecuencias de esta alteración astroglial en el contexto patológico de la EA. 2.1. Aumento de la reactividad astroglial en muestras post mortem de pacientes de Alzheimer En primer lugar, estudiamos en el hipocampo la expresión de genes de astrocitos reactivos con la progresión de la patología de Alzheimer. Posteriormente, analizamos la posible asociación entre la reactividad astroglial y marcadores característicos de la EA, como el genotipo APOE, la neurodegeneración GABAérgica y las patologías Aβ y Tau. Además, analizamos la expresión de los mismos genes en la corteza frontal, con distinto patrón de deposición de Aβ y Tau (Jucker y Walker, 2011). 2.1.1. Aumento de reactividad astroglial en muestras post mortem de hipocampo de pacientes de Alzheimer Tras evaluar mediante RT-PCR a tiempo real diferentes marcadores de astrocitos reactivos en el hipocampo de pacientes de EA, comprobamos que se produce un patente aumento de GFAP, VIM y ALDH1L1 en pacientes Braak V-VI respecto a individuos control Braak II (Figura D.8). Sin embargo, la expresión de S100β no se modifica con la progresión de la patología y la de acuaporina-4 (AQP-4) tiende a aumentar en pacientes Braak V-VI, aunque los cambios no son significativos. Posteriormente aplicamos un estudio de correlación para comprobar si los diferentes marcadores de reactividad glial cambian de forma paralela en un mismo individuo. La figura D.8 B muestra los coeficientes de correlación de Spearman entre los genes analizados mediante RT-PCR, y, como se observa, sólo existe correlación positiva entre GFAP y VIM, y entre VIM y ALDH1L1, mientras que los demás genes analizados no presentan correlación entre sí. Como se refleja en la figura D.8 C la correlación entre GFAP y VIM es estadísticamente significativa. La baja correlación entre los demás marcadores, así como el diferente perfil de expresión con la progresión de la patología, podría reflejar la existencia de diferentes poblaciones de astrocitos. De hecho, en la figura D.9 observamos que, en la corteza temporal de pacientes de EA, existen astrocitos asociados a placas que expresan simultáneamente GFAP, VIM y ALDH1L1, mientras que la mayoría de los astrocitos del parénquima son solo ALDH1L1+. Código seguro de Verificación : GEISER-8598-9009-566a-4890-b4af-d14e-6f25-b44a | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-8598-9009-566a-4890-b4af-d14e-6f25-b44a 23/11/2020 10:13:34 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000059958 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-8598-9009-566a-4890-b4af-d14e-6f25-b44a 102 D RESULTADOS el hipocampo existe un mayor número de astrocitos GFAP+ que en la corteza frontal (Matias et al., 2019). A pesar de ello, el incremento del gene set score de astrocitos reactivos en las muestras Braak V-VI con respecto a Braak II de la misma región es similar en hipocampo que en corteza frontal (datos no mostrados; prueba U de Mann- Whitney; p=0,7170; corteza frontal, mediana=2,557; rango intercuartílico de 1,421 a 3,001; hipocampo, mediana=2,046, rango intercuartílico de 1,318 a 3,021). En resumen, en pacientes de Alzheimer se produce un aumento en la reactividad de los astrocitos tanto en el hipocampo como en la corteza frontal, que podría mediar la neurodegeneración de neuronas GABAérgicas, principalmente PV+. Esta reactividad parece ser mayor en los individuos con mayor patología, tanto neurofibrilar (principalmente) como amiloide. Sin embargo, se requiere realizar estudios funcionales para obtener conclusiones mas contundentes al respecto. 2.2. Aumento de la respuesta del complemento en el hipocampo y la corteza frontal de pacientes de EA Estudios transcriptómicos previos realizados en nuestro laboratorio en astrocitos aislados de modelos APP y TAU revelan que, en ambos modelos, aunque principalmente en ratones APP, se produce un aumento en la expresión de varios genes del sistema del complemento (Figura D.14). Por ello, en este trabajo decidimos analizar la expresión de genes relacionados con el sistema del complemento en el hipocampo de pacientes de Alzheimer, y su posible relación con la reactividad astroglial, el genotipo APOE, la neurodegeneración GABAérgica y las patologías Aβ y Tau. Además, estudiamos la expresión de estos genes en corteza frontal. Figura D.14. Expresión de genes relacionados con la cascada del complemento en astrocitos aislados de diferentes modelos murinos de la EA. Genes implicados en la cascada del complemento en los astrocitos aislados de animales WT, APP y TAU adultos (WT y APP, 12 meses; TAU, 9 meses), respecto a animales WT, APP y TAU de 3 meses. El esquema de color del heatmap es indicativo del logaritmo del fold change, de -1 (azul) a 1 (rojo). Experimento realizado en nuestro laboratorio por la Dra. María V. Sánchez Micó. 0 1 log FC -1 WT TAU APP Cascada del complemento Vtn C4b Tfpi C1s1 Cd59a C1qa Cfh Plaur C1ra Procr Plat Bdkrb1 Kng1 C3ar1 C8a C1qb Serpina1d Serping1 Cd59b Cr2 Itgam C3 C9 Código seguro de Verificación : GEISER-8598-9009-566a-4890-b4af-d14e-6f25-b44a | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-8598-9009-566a-4890-b4af-d14e-6f25-b44a 23/11/2020 10:13:34 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000059958 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-8598-9009-566a-4890-b4af-d14e-6f25-b44a 103 D RESULTADOS 2.2.1. Aumento de la respuesta del complemento en muestras post mortem de hipocampo de pacientes de EA En el hipocampo de pacientes de EA se produce un aumento significativo en la expresión de ARNm de diferentes componentes del sistema del complemento (C1S, C1R, C3 y C4a-b) con respecto a individuos Braak 0 y Braak II (Figura D.15 A). Los individuos Braak III-IV poseen niveles intermedios en todos los genes analizados, a excepción de C4a-b que presenta niveles similares a Braak 0 y II. El gene set score del sistema del complemento refleja el comportamiento descrito anteriormente para los genes individuales, con un aumento en Braak V-VI respecto a Braak 0 y II, mientras que los individuos Braak III-IV tienen niveles intermedios. Figura D.15. Respuesta del complemento en muestras post mortem de hipocampo de pacientes de Alzheimer. (A) Expresión relativa de ARNm de los genes involucrados en la cascada del complemento C1S, C1R, C3 y C4a-b en el hipocampo de individuos Braak 0 (n=6), II (n=16), III-IV (n=12) y V-VI (n=16). (B) Representación de los valores de gene set score (Sj) de los genes del Complemento indicados previamente. Se representan los valores individuales de cada muestra, así como la mediana y los rangos intercuartílicos de los diferentes estadios Braak. La significancia se ha analizado mediante la prueba de Kruskal-Wallis, seguida de un test de Dunn (*p<0,05; **p<0,01). C1S "Test Kruskal-Wallis" p<0.0001 Braak 0 Braak II Braak III-IV Braak V-VI 0 2 4 6 Unidades relativas ** C1R "Test Kruskal-Wallis" p<0.0001 Braak 0 Braak II Braak III-IV Braak V-VI 0 2 4 6 8 10 Unidades relativas ** C3 "Test Kruskal-Wallis" p=0.0025 Braak 0 Braak II Braak III-IV Braak V-VI 0 2 4 6 8 Unidades relativas * C4a-b "Test Kruskal-Wallis" p=0.0003 Braak 0 Braak II Braak III-IV Braak V-VI 0 2 4 6 8 Unidades relativas * Complemento "Test Kruskal-Wallis" p<0.0001 Braak 0 Braak II Braak III-IV Braak V-VI 0 2 4 6 Gene Set Score (Sj) ** A B Código seguro de Verificación : GEISER-8598-9009-566a-4890-b4af-d14e-6f25-b44a | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-8598-9009-566a-4890-b4af-d14e-6f25-b44a 23/11/2020 10:13:34 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000059958 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-8598-9009-566a-4890-b4af-d14e-6f25-b44a 104 D RESULTADOS 2.2.2. La respuesta del complemento en el hipocampo de pacientes de EA parece estar mediada principalmente por los astrocitos reactivos Considerando que tanto microglía como astrocitos podrían participar en la respuesta del complemento, analizamos de manera conjunta e individual las correlaciones entre el gene set score del complemento con los gene set score de astrocitos reactivos, microglía homeostática y microglía DAM (Figuras D.8 D y D.41 B-C). Como se observa en la figura D.16, el gene set score del sistema del complemento presenta una muy buena correlación con la reactividad astroglial, tanto si se analiza de manera conjunta como de manera individual para cada uno de los genes estudiados. Sin embargo, hay una correlación negativa con el clúster de microgía homeostática, ya que la expresión de estos genes disminuye en los pacientes de EA. Tampoco observamos asociación entre la respuesta del complemento y la microglía DAM. En consecuencia, nuestros datos parecen indicar que los astrocitos reactivos presentan un papel fundamental en la respuesta del complemento que se produce en el hipocampo de pacientes de EA. Figura D.16. Análisis de correlación de los astrocitos reactivos y la respuesta del complemento. (A) Matriz de correlaciones de los gene set score de Complemento (C1S, C1R, C3, C4a- b), Astrocitos reactivos (GFAP y VIM), Microglía homeostática (CX3CR1 y P2RY12) y microglía DAM (TREM2, P2RX4, CD45, CD74, CD11b, CD11c, PU.1, PILRA, CSF1, CSF1R) en muestras de hipocampo de diferentes estadios Braak (n=45). También se incluyen los valores de expresión relativa de los genes incluidos en el gene set score del Complemento. El estudio de correlación se ha realizado empleando el método de Spearman. El número indica el coeficiente de correlación de Spearman, siendo la intensidad del color proporcional a este. Las correlaciones positivas se muestran en azul y las negativas, en rojo (n= 45). (B) Análisis de correlación entre el gene set score de los genes de astrocitos reactivos GFAP y VIM y el gene set score de los genes de la respuesta del complemento C1S, C1R, C3 Y C4a-b, con recta de ajuste o regresión lineal, en el hipocampo de individuos Braak 0 (n=6), II (n=16), III-IV (n=12) y V- VI (n=16). El estudio de correlación se ha llevado a cabo empleando el método de Spearman. Astrocitos reactivos (Sj) Complemento (Sj) 012345 0 2 4 6Braak 0 Braak II Braak III-IV Spearman: r= 0.8403 p<0.0001 Braak V-VI A B Código seguro de Verificación : GEISER-8598-9009-566a-4890-b4af-d14e-6f25-b44a | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-8598-9009-566a-4890-b4af-d14e-6f25-b44a 23/11/2020 10:13:34 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000059958 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-8598-9009-566a-4890-b4af-d14e-6f25-b44a 105 D RESULTADOS 2.2.3. Respuesta del complemento y genotipo APOE en muestras post mortem de hipocampo de pacientes de Alzheimer De igual forma que con los marcadores de reactividad astroglial, estudiamos si existen diferencias en la respuesta del complemento de individuos con diferente genotipo APOE, según presenten dos alelos ε3 o al menos un alelo ε4. Como se observa en la figura D.17, no existen diferencias entre los individuos de un mismo estadio Braak en función del genotipo APOE. Sin embargo, para obtener una conclusión robusta deberíamos ampliar el número de casos incluidos en cada grupo. Figura D.17. Respuesta del complemento en función del genotipo APOE en individuos Braak II y Braak V-VI. Representación de los valores de gene set score de los genes del Complemento C1S, C1R, C3 y C4a-b en el hipocampo de individuos Braak II (ε3, n=9; ε4, n=3) y V-VI (ε3, n=2; ε4, n=7). Los individuos agrupados como ε3 son homocigóticos para este alelo y los ε4 son homo o heterocigóticos para el alelo ε4. Se indican los valores individuales de cada muestra, así como la mediana y los rangos intercuartílicos de los grupos representados. La significancia se ha analizado mediante la prueba U de Mann-Whitney. 2.2.4. Respuesta del complemento y neurodegeneración GABAérgica en muestras post mortem de hipocampo de pacientes de Alzheimer Figura D.18. Análisis de correlación de la respuesta del complemento con la neurodegeneración GABAérgica. (A) Matriz de correlaciones de los niveles de expresión de los genes del sistema del complemento y su gene set score Complemento con los marcadores de neurodegeneración GABAérgica PV, SST y NPY, analizados mediante RT-PCR en tiempo real. El estudio de correlación se ha realizado empleando el método de Spearman. El número indica el coeficiente de correlación de Spearman, siendo la intensidad del color proporcional a este. Las correlaciones positivas se muestran en azul y las negativas, en rojo (n= 45). (B-D) Estudio de correlación entre los valores de gene set score (Sj) de Complemento y la expresión relativa de PV en el hipocampo de individuos Braak 0 (n=6), Braak II (n=16), Braak III-IV (n=8) y Braak V-VI (n=15). Se muestra la recta de ajuste o regresión lineal. El estudio de correlación se ha realizado mediante el método de Spearman. PV Complemento (Sj) 012345 0 2 4 6Braak 0 Braak II Braak III-IV Spearman: r= - 0.8383 p<0.0001 Braak V-VI A B Complemento "Prueba de Mann-Whitney" Gene Set Score (Sj) Braak II Braak V-VI 0 1 2 3 4 53 4 Código seguro de Verificación : GEISER-8598-9009-566a-4890-b4af-d14e-6f25-b44a | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-8598-9009-566a-4890-b4af-d14e-6f25-b44a 23/11/2020 10:13:34 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000059958 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-8598-9009-566a-4890-b4af-d14e-6f25-b44a 106 D RESULTADOS En la matriz de correlaciones de la figura D.18 A, observamos que todos los genes analizados de la respuesta del complemento, así como su gene set score, correlacionan de forma importante con la degeneración de neuronas PV+ y no con la de SST y NPY. En la figura D.18 B confirmamos la correlación significativa entre el gene set score del sistema del complemento y la expresión de ARNm de PV. 2.2.5. Respuesta del complemento y patologías Aβ y Tau en muestras de hipocampo de pacientes de Alzheimer En la figura D.19 A, observamos que no existe una correlación clara entre la respuesta del complemento y la cantidad de Aβ monomérico, de Tau total y de diferentes formas fosforiladas de Tau, aunque sí existe cierta tendencia hacia un aumento en la expresión de los genes del sistema del complemento en aquellos individuos con mayor acumulación de estas proteínas anómalas. Figura D.19. Análisis de correlación de la repuesta del complemento con las patologías Aβ y Tau. Estudio de correlación entre los valores de gene set score (Sj) de Complemento y la carga de (A) Aβ monomérico (n=45), (B) Tau total medido con el anticuerpo TAU46 (n=36), (C) formas fosforiladas de Tau detectadas por el anticuerpo AT8 (n=25) y (D) formas fosforiladas de Tau reconocidas por AT100 (n=20), analizados mediante Western blot. Se muestra la recta de ajuste o regresión lineal. El estudio de correlación se ha llevado a cabo empleando el método de Spearman. 2.2.6. Aumento de la respuesta del complemento en muestras post mortem de corteza frontal de pacientes de Alzheimer En la corteza frontal de pacientes de EA también se produce un aumento en la respuesta del complemento, ya que, como refleja la figura D.20, todos los genes analizados y su gene set score aumentan de forma significativa en estadio Braak V- VI. Sin embargo, a diferencia de lo que sucede en hipocampo, la respuesta del complemento parece ocurrir en etapas avanzadas de la patología, ya que los individuos Braak III-IV presentan un perfil similar al de los controles. A monomérico Complemento (Sj) 0 10 20 30 40 0 2 4 6Braak 0 Braak II Braak III-IV Spearman: r= 0.4452 p=0.0022 Braak V-VI TAU46 Complemento (Sj) 0 20 40 60 80 0 2 4 6Braak 0 Braak II Braak III-IV Spearman: r= 0.5076 p=0.0016 Braak V-VI AT8 Complemento (Sj) 0 20 40 60 80 0 2 4 6Braak 0 Braak II Braak III-IV Spearman: r= 0.5950 p=0.0017 Braak V-VI AT100 Complemento (Sj) 0 20 40 60 80 0 2 4 6Braak 0 Braak II Braak III-IV Spearman: r= 0.5188 p=0.0191 Braak V-VI A B C D Código seguro de Verificación : GEISER-8598-9009-566a-4890-b4af-d14e-6f25-b44a | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-8598-9009-566a-4890-b4af-d14e-6f25-b44a 23/11/2020 10:13:34 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000059958 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-8598-9009-566a-4890-b4af-d14e-6f25-b44a 107 D RESULTADOS Figura D.20. Respuesta del complemento en muestras post mortem de corteza frontal de pacientes de Alzheimer. (A) Expresión relativa de ARNm de los genes del sistema del complemento C1S, C1R, C3 y C4a-b, analizados mediante RT-PCR en tiempo real, en la corteza frontal de individuos Braak 0 (n=18), II (n=13), III-IV (n=12) y V-VI (n=11). (B) Representación de los valores de gene set score (Sj) del complemento en la corteza frontal de individuos Braak 0 (n=18), II (n=13), III-IV (n=12) y V-VI (n=11). Se indican los valores individuales de cada muestra, así como la mediana y los rangos intercuartílicos de los grupos representados. La significancia se ha analizado mediante la prueba de Kruskal-Wallis, seguida de un test de Dunn (*p<0.05; **p<0,01). (C) Expresión del complemento en función del genotipo APOE en la corteza de individuos Braak II (ε3, n=7; ε4, n=4) y V-VI (ε3, n=7; ε4, n=6). Los individuos agrupados como ε3 son homocigóticos para este alelo y los ε4 son homo o heterocigóticos para el alelo ε4. Se indican los valores individuales de cada muestra, así como la mediana y los rangos intercuartílicos de los grupos representados. La significancia se ha analizado mediante la prueba U de Mann-Whitney. Conviene aclarar que los resultados de este apartado se han normalizado respecto los valores de hipocampo Braak II, lo que nos permite concluir que la corteza frontal presenta un nivel de expresión basal de los genes del sistema del complemento inferior al de hipocampo. Sin embargo, al igual que con los genes de reactividad astroglial, el incremento en las muestras Braak V-VI con respecto a C1S en Corteza frontal "Test Kruskal-Wallis" p=0.0023 Braak 0 Braak II Braak III-IV Braak V-VI 0 1 2 3 Unidades relativas * C1R en Corteza frontal "Test Kruskal-Wallis" p=0.0010 Braak 0 Braak II Braak III-IV Braak V-VI 0 1 2 3 4 Unidades relativas * C4a-b en Corteza frontal "Test Kruskal-Wallis" p<0.0001 Braak 0 Braak II Braak III-IV Braak V-VI 0 1 2 3 4 Unidades relativas ** C3 en Corteza frontal "Test Kruskal-Wallis" p=0.0037 Braak 0 Braak II Braak III-IV Braak V-VI 0 1 2 3 4 Unidades relativas * Complemento en Corteza frontal "Test Kruskal-Wallis" p=0.0002 Braak 0 Braak II Braak III-IV Braak V-VI 0 1 2 3 Gene Set Score (Sj) * A B C Complemento en corteza frontal "Prueba de Mann-Whitney" Gene Set Score (Sj) Braak II Braak V-VI 0 1 2 33 4 Código seguro de Verificación : GEISER-8598-9009-566a-4890-b4af-d14e-6f25-b44a | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-8598-9009-566a-4890-b4af-d14e-6f25-b44a 23/11/2020 10:13:34 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000059958 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-8598-9009-566a-4890-b4af-d14e-6f25-b44a 108 D RESULTADOS Braak II de su respectiva región cerebral es similar (datos no mostrados; prueba U de Mann-Whitney; p=0,7211; corteza frontal, mediana=2,290; rango intercuartílico de 1,526 a 3,310; hipocampo, mediana=2,337, rango intercuartílico de 1,680 a 4,179). Tampoco observamos diferencias en función del genotipo APOE (Figura D.20 C). 2.3. Disminución del metabolismo de los astrocitos in vitro, en modelos y pacientes de EA Figura D.21. Disminución del metabolismo de astrocitos aislados de diferentes modelos murinos de la EA. (A) Procesos biológicos (GO: gene ontology) que se encuentran disminuidos en los astrocitos aislados de ratones APP de 12 meses y TAU de 9 meses, respecto a los procedentes de WT de 12 meses. NES: factor de enriquecimiento normalizado. FDR q-val (un valor de p-value ajustado) = 0,05 (*), 0,01 (**), 0,001 (***), 0,0001 (****). (B) Genes implicados en diferentes procesos biológicos que se encuentran disminuidos en los astrocitos aislados de animales APP y TAU. Se muestra el logaritmo del fold change, en código de colores de -1 (azul) a 1 (rojo), respecto a los animales de 3 meses. “FDR” = 0,05 (*), 0,01 (**), 0,001 (***). Experimento realizado de forma previa en nuestro laboratorio por la Dra. María V. Sánchez Micó. Biosíntesis de colesterol Aldh9a1 Pfkp Aldoa Aldh2 Pkm Pfkl Galm Pgk1 Pfkm Eno1b Pgam1 Pdhb Aldoc Acss2 G6pc3 Pgm2 Dld Aldh7a1 Acss1 Dlat Tpi1 Aldh3a2 * * * * * * * * * * * * * * ** ** ** ** ** ** ** ** * ** * ** WT TAU APP Glucólisis/Gluconeogénesis WT TAU APP Ciclo de Krebs Idh3a Dlat Idh1 Cs Pdhb Suclg1 Mdh1 Sdhb Idh2 Idh3g Dlst Ireb2 Fh1 Suclg2 4933405O20Rik Sdhc Sdhd *** ** ** ** ** ** ** ** ** * * * * * * * * ** * * Cnr1 Etfa Hsd17b4 Acox1 Acadl Eci2 Acaa2 Mtor Pex7 Hadhb Hibch Abcd2 Acadvl Pex2 Echs1 Crot Cpt1a Irs1 Hadha Etfdh Cpt2 β-oxidación de ácidos grasos WT TAU APP *** ** ** ** ** ** ** ** ** ** * * * * * * * * * * * * * ** * * * *Sec14l2 Nsdhl Hsd17b7 Apoe Hmgcr Scap Dhcr24 Hmgcs1 Pmvk Cyp51 Por Fdps Pex2 Mvd Insig2 Mvk Sc5d Dhcr7 Lss Apob Fdft1 WT TAU APP ** ** ** ** ** ** ** ** ** * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * ** * Metabolismo del glucógeno WT TAU APP Epm2a Esrrb Pomc Phka1 Pgm5 Irs2 Ppp1r3f Dyrk2 Ppp1r2 Khk Stbd1 Gyg Acadm Pask Ptges3 Agl Akt2 Phka2 Rb1cc1 Tcf7l2 Ppp1cb Akt1 Pfkm Pygm Adrb1 Gaa Gys1 Ppp1r3c Gbe1 Slc37a4 Phkb Epm2aip1 Pygb Ugp2 Pgm2 Ppp1r3d Mtor Irs1 Nr1d1 * * ** ** ** ** * * * * * * * * * * * * * -1 0 1 log FC AB Diferenciación y desarrollo Fase 3 del Metabolismo Metabolismo general -3-2-10 Diferenciación de células endoteliales Desarrollo neuronal de SNC Desarrollo del hipocampo Diferenciación de oligodendrocitos Regulación de la axonogénesis Desarrollo de células gliales Desarrollo de espinas dendríticas Desarrollo del núcleo neural Beta-oxidacion de ácidos grasos Proceso de biosíntesis de carbohidratos Proceso de biosíntesis del ATP Proceso catabólico celular de carbohidratos Proceso metabólico de reserva energética Respiración Celular Cadena de transporte electrónico Fosforilación oxidativa NES (vs. WT) APPSL TAU P301S **** **** **** **** ***** *** *** ** * * * ** ** **** * * ** * * Procesos Biológicos (GO) **** **** Código seguro de Verificación : GEISER-8598-9009-566a-4890-b4af-d14e-6f25-b44a | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-8598-9009-566a-4890-b4af-d14e-6f25-b44a 23/11/2020 10:13:34 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000059958 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-8598-9009-566a-4890-b4af-d14e-6f25-b44a 109 D RESULTADOS En nuestro laboratorio hemos observado un cambio profundo en el perfil transcripcional de los astrocitos en el contexto patológico de la EA, ya que los astrocitos aislados de modelos APP y TAU muestran una disminución en rutas metabólicas centrales, así como en diferentes procesos de diferenciación y desarrollo (Sanchez-Mico, 2019, Figura D.21 A). Tal y como se representa en la figura D.21 B, los procesos metabólicos se afectan mayoritariamente en el modelo con patología amiloide. En base a estos datos, en este proyecto de Tesis doctoral, hemos estudiado el metabolismo de los astrocitos in vitro, y su alteración en presencia de formas solubles de Aβ y Tau, así como en modelos animales y pacientes de la EA. 2.3.1. La disminución metabólica de los astrocitos in vitro podría reducir su capacidad neuroprotectora 2.3.1.1. Disminución metabólica de los astrocitos in vitro en presencia de patología Aβ Tras observar mediante estudios transcriptómicos que, en astrocitos aislados de modelos murinos de EA se produce una importante disminución metabólica, nos planteamos reproducir in vitro este fenotipo energético. Para ello, tratamos astrocitos primarios con fracciones solubles (S1) obtenidas de modelos APP de 12 meses (ricas en formas oligoméricas solubles de Aβ; Figura S2, Anexo I). El metabolismo de los astrocitos se determina usando el analizador de flujo extracelular Seahorse XFp (Ver Materiales y métodos, Apartado 5). Este equipo nos permite medir la velocidad de consumo de oxígeno (OCR) y la velocidad de acidificación extracelular (ECAR) de los astrocitos vivos en tiempo real, tanto en condiciones basales, como tras la administración de diferentes compuestos moduladores del metabolismo (oligomicina, FCCP, rotenona y antimicina A). De esta forma podemos estudiar la respiración mitocondrial ligada al consumo de oxígeno, y la glucólisis, ya que la acidificación del medio se relaciona con la producción de lactato por esta vía. El tratamiento durante 24 horas de un cultivo de astrocitos primarios con fracciones solubles (S1) de ratones APP de 12 meses, aunque origina una ligera bajada en OCR y ECAR, no altera de manera significativa ningún parámetro de la respiración mitocondrial ni de la glucólisis (Figura D.22). Sin embargo, cuando aumentamos el tiempo de tratamiento de los astrocitos a 48 horas, se produce una importante y significativa disminución en todos los parámetros claves de la respiración mitocondrial, aunque no se altera la glucólisis basal, ni el flujo glucolítico máximo (Figura D.23 B). Además, observamos una disminución dependiente del tiempo en la respiración máxima de los astrocitos tras el tratamiento con S1 de ratones APP (Figura D.24). Para disminuir la variabilidad que pueda ocasionar la diferencia en el número de células usadas en los experimentos descritos, hemos corregido los valores de OCR y ECAR por la cantidad total de proteínas, determinada mediante Western blot con el anticuerpo GAPDH (Figuras D.22 E y D.23 E). Aunque en los experimentos a 24 horas existe una mayor variabilidad, que podría contribuir a explicar las diferencias observadas entre réplicas, en los experimentos a 48 horas el número de células empleado es muy homogéneo, lo que aumenta la fiabilidad de nuestros resultados. Código seguro de Verificación : GEISER-8598-9009-566a-4890-b4af-d14e-6f25-b44a | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-8598-9009-566a-4890-b4af-d14e-6f25-b44a 23/11/2020 10:13:34 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000059958 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-8598-9009-566a-4890-b4af-d14e-6f25-b44a 110 D RESULTADOS Figura D.22. Estudio de la respiración mitocondrial y de la glucólisis en astrocitos primarios tratados con S1 de modelos APP de 12 meses durante 24 horas. (A) Estudio de la respiración mitocondrial mediante la medida de la velocidad de consumo de oxígeno (OCR), (B) Parámetros clave de la respiración mitocondrial obtenidos a partir de la OCR, (C) Estudio de la glucólisis mediante la medida de la velocidad de acidificación extracelular (ECAR), (D) Glucólisis basal y flujo glucolítico máximo, en condiciones basales y tras el tratamiento con oligomicina, FCCP y la combinación rotenona y antimicina A, en astrocitos primarios control y previamente tratados con S1 durante 24 horas, empleando el analizador Seahorse XFp. (E) Cuantificación de las proteínas presentes en cada réplica mediante Western blot, empleada para normalizar los valores de OCR y ECAR. Se representan los valores individuales, así como la media± SD para una n=3 por grupo. La estadística se ha analizado mediante el T-test (**p<0,01; ***p<0,001; ****p<0.0001). Glucólisis basal ECAR (mpH/min) Control S1 APP 24 h 30 40 50 60 70 Flujo glucolítico máximo ECAR (mpH/min) Control S1 APP 24 h 30 40 50 60 70 80 90 100 Respiración basal OCR (pmoles/min) Control S1 APP 24 h 0 20 40 60 80 100 120 140 Respiración máxima OCR (pmoles/min) Control S1 APP 24 h 0 100 200 300 Producción de ATP OCR (pmoles/min) Control S1 APP 24 h 0 20 40 60 80 Proton Leak OCR (pmoles/min) Control S1 APP 24 h 0 10 20 30 40 50 A B C D Control S1 APP GAPDH E 37 - Cuantificación de proteínas GAPDH (Unidades relativas) Control S1 APP 24 h 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 24 HORAS 0 20 40 60 80 0 100 200 300 400 500 Tiempo (minutos) OCR (pmoles/min) S1 APP 24 h Control Oligomicina FCCP Rotenona y AntimicinaA 0 20 40 60 80 0 20 40 60 80 100 Tiempo (minutos) ECAR (mpH/min) Control S1 APP 24 h Oligomicina FCCP Rotenona y AntimicinaA Código seguro de Verificación : GEISER-8598-9009-566a-4890-b4af-d14e-6f25-b44a | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-8598-9009-566a-4890-b4af-d14e-6f25-b44a 23/11/2020 10:13:34 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000059958 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-8598-9009-566a-4890-b4af-d14e-6f25-b44a 111 D RESULTADOS Figura D.23. Estudio de la respiración mitocondrial y de la glucólisis en astrocitos primarios tratados con S1 de modelos APP de 12 meses durante 48 horas. (A) Estudio de la respiración mitocondrial mediante la medida de la velocidad de consumo de oxígeno (OCR), (B) Parámetros clave de la respiración mitocondrial obtenidos a partir de la OCR, (C) Estudio de la glucólisis mediante la medida de la velocidad de acidificación extracelular (ECAR), (D) Glucólisis basal y flujo glucolítico máximo, en condiciones basales y tras el tratamiento con oligomicina, FCCP y la combinación rotenona y antimicina A, en astrocitos primarios control y previamente tratados con S1 durante 48 horas, empleando el analizador Seahorse XFp. (E) Cuantificación de las proteínas presentes en cada réplica mediante Western blot, empleada para normalizar los valores de OCR y ECAR. Se representan los valores individuales, así como la media± SD para una n=6 por grupo. La estadística se ha analizado mediante el T-test (*p<0,05; **p<0,01; ***p<0,001). Proton Leak OCR (pmoles/min) Control S1 APP 48 h 0 10 20 30 40 ** Producción de ATP OCR (pmoles/min) Control S1 APP 48 h 0 20 40 60 80 100 * Respiración máxima OCR (pmoles/min) Control S1 APP 48 h 0 100 200 300 400 *** Respiración basal OCR (pmoles/min) Control S1 APP 48 h 0 20 40 60 80 100 120 140 * Flujo glucolítico máximo ECAR (mpH/min) Control S1 APP 48 h 30 40 50 60 70 80 90 100 Glucólisis basal ECAR (mpH/min) Control S1 APP 48 h 30 40 50 60 70 A 0 20 40 60 80 0 100 200 300 400 500 Tiempo (minutos) OCR (pmoles/min) Control S1 APP 48 h Oligomicina FCCP Rotenona y AntimicinaA CD EControl Control S1 APP S1 APP GAPDH B 37 - Cuantificación de proteínas GAPDH (Unidades relativas) Control S1 APP 48 h 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 48 HORAS 0 20 40 60 80 0 20 40 60 80 100 Tiempo (minutos) ECAR (mpH/min) Control S1 APP 48 h Oligomicina FCCP Rotenona y AntimicinaA Código seguro de Verificación : GEISER-8598-9009-566a-4890-b4af-d14e-6f25-b44a | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-8598-9009-566a-4890-b4af-d14e-6f25-b44a 23/11/2020 10:13:34 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000059958 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-8598-9009-566a-4890-b4af-d14e-6f25-b44a 118 D RESULTADOS 2.3.1.2.5. Los astrocitos disminuyen su capacidad neuroprotectora en presencia de las patologías Aβ y Tau Figura D.29. Efecto del medio condicionado por astrocitos en presencia de B27 y S1 de modelos WT, APP y TAU en la supervivencia neuronal. (A) Diseño del experimento. Los astrocitos primarios se tratan durante 24 horas con medio de neuronas con B27 en presencia de S1 de los diferentes modelos animales de 12 meses. El medio condicionado se emplea para tratar a las neuronas durante 48 horas. Imagen creada con BioRender.com. (B) Imágenes representativas de las neuronas primarias, tras las 48 horas de tratamiento, marcadas con los anticuerpos MAP2 (rojo) y NeuN (verde). (C) Cuantificación del número de neuronas MAP2 y NeuN positivas, expresado como porcentaje del número de neuronas con MC Control (+B27, n=14; -B27, n=15; MC Control, n=15; MC S1 WT, n=15; MC S1 APP, n=15; MC S1 TAU, n=15). La estadística se ha analizado mediante el test de ANOVA seguido del test de comparación múltiple Tukey (*p<0.05). Barra de escala: 100 µm. +B27 -B27 MC CONTROL MC S1 APP MC S1 TAU MC S1 WT Neuronas (48h)Astrocitos (24h) + B27 + S1 A B Tratamiento de 48 horas (medio con B27) + B27 - B27 MC CONTROL MC S1 WT MC S1 APP MC S1 TAU 0 100 200 300 Neuronas MAP2+ y NeuN+ (%) * ANOVA; F (5, 83) = 6.280 p<0.0001 C Código seguro de Verificación : GEISER-8598-9009-566a-4890-b4af-d14e-6f25-b44a | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-8598-9009-566a-4890-b4af-d14e-6f25-b44a 23/11/2020 10:13:34 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000059958 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-8598-9009-566a-4890-b4af-d14e-6f25-b44a 119 D RESULTADOS Ya que la retirada del S1 patológico del medio parece producir una recuperación de los astrocitos in vitro, realizamos el experimento usando un medio condicionado por astrocitos en presencia de S1 durante 24 horas y con B27 (Figura D.29 A). Este medio se utiliza para tratar a las neuronas durante 48 horas, tiempo en el que habíamos observado una clara disminución de la viabilidad neuronal en ausencia de B27 (Figura D.27). Como muestra la figura D.29, los MC S1 APP y TAU con B27 no afectan a la supervivencia neuronal, lo que indica, que a pesar de que el S1 permanece en el medio, la presencia de B27 evita la muerte neuronal. Es importante considerar que el tratamiento directo de las neuronas con S1 APP o TAU, incluso en medio con B27, produce una toxicidad muy elevada a las 24 horas (datos no mostrados). Por tanto, podemos concluir que la presencia de S1 procedente de animales APP y TAU evita que los astrocitos liberen factores de pequeña masa molecular con capacidad neuroprotectora. 2.3.2. ¿Disminuye el metabolismo de los astrocitos en modelos de EA? Para evaluar de forma directa el estado metabólico de los astrocitos en modelos APP, hemos desarrollado un método de aislamiento de estas células gliales (Materiales y métodos, Apartado 9.1). En este procedimiento hemos tratado de minimizar el tiempo transcurrido entre el sacrificio del animal y la obtención de las células, reduciendo así la alteración de los metabolitos. Hemos intentado realizar un estudio metabolómico en colaboración con la Dra. Coral Barbas (Universidad San Pablo CEU), aunque no ha sido posible determinar el perfil metabolómico de los astrocitos aislados, probablemente consecuencia del uso de FACS, que puede producir alteraciones metabólicas (Llufrio et al., 2018; Binek et al., 2019). 2.3.3. Disminución del metabolismo de los astrocitos en el hipocampo de pacientes de EA Ya que nuestros resultados de estudios in vitro y en modelos animales de EA apuntan hacia una disminución del metabolismo de los astrocitos en presencia de las patologías Aβ y Tau, decidimos analizar el metabolismo de los astrocitos en muestras de enfermos de Alzheimer. En primer lugar, elegimos los marcadores a estudiar en base a los genes y rutas del metabolismo afectados mayoritariamente en los modelos APP y TAU (Figura D.21). Además, ante la incapacidad técnica de aislar distintas poblaciones celulares a partir de muestras humanas post mortem, seleccionamos genes expresados de forma diferencial en astrocitos, utilizando el algoritmo “Tau”, cedido por la Dra. Elena Galea (Universidad Autónoma de Barcelona), así como bases de datos transcriptómicas previamente publicadas (Zhang et al., 2016). El algoritmo “Tau” (Kryuchkova-Mostacci y Robinson-Rechavi, 2017), junto con el método Weighted Correlation Network Analysis (WGCNA), permite identificar grupos o clústeres de genes, asignándole a cada uno de ellos un valor, comprendido entre 0 y 1, que es indicativo de su especificidad hacia un tipo de célula del SNC. Código seguro de Verificación : GEISER-8598-9009-566a-4890-b4af-d14e-6f25-b44a | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-8598-9009-566a-4890-b4af-d14e-6f25-b44a 23/11/2020 10:13:34 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000059958 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-8598-9009-566a-4890-b4af-d14e-6f25-b44a 120 D RESULTADOS Figura D.30. Expresión de ARNm de las enzimas reguladoras de la glucólisis PFKM y PKM en el hipocampo de pacientes de EA. (A) Expresión relativa de las enzimas PFKM y PKM, analizadas mediante RT-PCR en tiempo real, en el hipocampo de individuos Braak 0 (n=8), II (n=17- 23), III-IV (n=15) y V-VI (n=21). Se indican los valores individuales de cada muestra, así como la mediana y los rangos intercuartílicos de los grupos representados. La significancia se ha analizado mediante la prueba de Kruskal-Wallis, seguida de un test de Dunn (*p<0.05). (B) Representación esquemática de la glucólisis, indicando las principales enzimas implicadas en su regulación, así como las reacciones en las que participan. Las enzimas estudiadas en este proyecto se destacan en rojo. (C) Estudio de correlación entre los valores de expresión relativa de las enzimas PFKM y PKM. Se muestra la recta de ajuste o regresión lineal. El estudio de correlación se ha llevado a cabo empleando el método de Spearman. ADP (…) GLUCÓLISIS Glucosa Glucosa-6-fosfato Fructosa-6-fosfato Fructosa-1,6-bifosfato Fosfoenolpiruvato Piruvato Hexoquinasa Fosfofructoquinasa(PFKM) Piruvato quinasa (PKM) ATP ADP ATP 2 ATP 2 ADP PKM "Test Kruskal-Wallis" p=0.0780 Braak 0 Braak II Braak III-IV Braak V-VI 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 Unidades relativas PFKM "Test Kruskal-Wallis" p=0.0058 Braak 0 Braak II Braak III-IV Braak V-VI 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 Unidades relativas * 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 Spearman: r=0.5187 p<0.0001 PKM PFKM Braak V-VI Braak III-IV Braak II Braak 0 A C B Código seguro de Verificación : GEISER-8598-9009-566a-4890-b4af-d14e-6f25-b44a | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-8598-9009-566a-4890-b4af-d14e-6f25-b44a 23/11/2020 10:13:34 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000059958 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-8598-9009-566a-4890-b4af-d14e-6f25-b44a 121 D RESULTADOS Considerando que la glucólisis es uno de los principales procesos biológicos afectados en los modelos de EA, estudiamos las dos principales enzimas reguladoras de esta vía, fosfofructoquinasa y piruvato quinasa (Figura D.30 B). En concreto, analizamos la expresión de la isoforma muscular de fosfofructoquinasa-6 (PFKM) y las isoformas M1 y M2 de piruvato quinasa (PKM), siendo M1 la principal en cerebro. En la figura D.30 A se observa una disminución de la expresión de PFKM (significativa) y de PKM (casi significativa) en pacientes Braak V-VI con respecto a estadios Braak II y III-IV. De hecho, la correlación entre los niveles de ARNm de ambas enzimas es buena, indicando que la expresión de ambos genes disminuye de forma paralela en los mismos individuos. Estos datos sugieren que la glucólisis está disminuida en los astrocitos de pacientes de EA, pero no en estadios previos a la demencia. La fase III del metabolismo es otro proceso biológico que disminuye en los ensayos in vitro y en los modelos de EA, por lo que nos centramos en la expresión de la enzima isocitrato deshidrogenasa (IDH). En humanos, esta enzima existe en tres isoformas: IDH1, localizada en el citosol y los peroxisomas, e IDH2 e IDH3, isoformas mitocondriales. IDH3 cataliza la tercera etapa del ciclo de Krebs en las mitocondrias, depende de NAD+ y es una de las enzimas reguladoras del ciclo. IDH2 e IDH1 catalizan la misma reacción, pero fuera del contexto del ciclo del ácido cítrico (Figura D.31 A). En este trabajo, hemos analizado la expresión de la subunidad alfa de IDH3 (IDH3a) como marcador del ciclo de Krebs en astroglía, así como la de IDH2, enzima mitocondrial expresada preferentemente por astrocitos que no participa en este ciclo. Como observamos en la figura D.31 B, en pacientes de EA se produce una disminución significativa en la expresión de IDH3a con respecto a individuos Braak II. Las muestras Braak III-IV presentan un comportamiento intermedio. Sin embargo, IDH2 no se afecta con la progresión de la patología de Alzheimer. De hecho, no hay correlación entre la expresión de ambas enzimas (Figura D.31 C). Podemos, pues, concluir que el ciclo de Krebs parece disminuir de forma específica en los astrocitos de pacientes de EA. En los astrocitos de modelos APP y TAU también se produce una disminución significativa en la expresión de varios genes implicados en la biosíntesis y catabolismo de carbohidratos. Ya que los astrocitos almacenan la mayor parte del glucógeno cerebral (Deitmer et al., 2019), decidimos estudiar la glucógeno fosforilasa, enzima limitante de la degradación de glucógeno, y la fosfoglucomutasa, que participa en la glucogenólisis y en la glucogenogénesis (Figura D.32 A). En concreto, cuantificamos la expresión de los genes que codifican la isoforma cerebral de la glucógeno fosforilasa (PYGB) y la fosfoglucomutasa-1 (PGM1). En la figura D.32 B y C se observa que la expresión de estos genes no se modifica con la evolución de la EA, aunque existe buena correlación entre ambos, lo que sugiere que en los astrocitos de pacientes de EA no se altera el metabolismo del glucógeno. Código seguro de Verificación : GEISER-8598-9009-566a-4890-b4af-d14e-6f25-b44a | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-8598-9009-566a-4890-b4af-d14e-6f25-b44a 23/11/2020 10:13:34 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000059958 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-8598-9009-566a-4890-b4af-d14e-6f25-b44a 122 D RESULTADOS Figura D.31. Expresión relativa de las enzimas IDH3a, que cataliza la tercera etapa del ciclo de Krebs, e IDH2 en el hipocampo de pacientes de EA. (A) Representación esquemática del ciclo de Krebs, donde participa la enzima IDH3, y de la reacción catalizada por IDH2, que no pertenece al ciclo. Las enzimas estudiadas en este proyecto se destacan en rojo. Imagen creada con BioRender.com. (B) Expresión relativa de ARNm de IDH3a e IDH2, analizadas mediante RT-PCR en tiempo real, en el hipocampo de individuos Braak 0 (n=8), II (n=13-25), III-IV (n=15) y V-VI (n=12-29). Se indican los valores individuales de cada muestra, así como la mediana y los rangos intercuartílicos de los grupos representados. La significancia se ha analizado mediante la prueba de Kruskal-Wallis, seguida de un test de Dunn (*p<0.05). (C) Estudio de correlación entre los valores de expresión relativa de las enzimas IDH3a e IDH2 (n=48). Se muestra la recta de ajuste o regresión lineal. El estudio de correlación se ha llevado a cabo empleando el método de Spearman. IDH3a "Test Kruskal-Wallis" p=0.0210 Braak 0 Braak II Braak III-IV Braak V-VI 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 Unidades relativas * IDH2 "Test Kruskal-Wallis" p=0.1019 Braak 0 Braak II Braak III-IV Braak V-VI 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 Unidades relativas 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 Spearman: r=0.01042 p=0.9452 IDH2 IDH3a Braak V-VI Braak III-IV Braak II Braak 0 IDH2 IDH3 A C B Código seguro de Verificación : GEISER-8598-9009-566a-4890-b4af-d14e-6f25-b44a | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-8598-9009-566a-4890-b4af-d14e-6f25-b44a 23/11/2020 10:13:34 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000059958 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-8598-9009-566a-4890-b4af-d14e-6f25-b44a 123 D RESULTADOS Figura D.32. Expresión relativa de las enzimas implicadas en el metabolismo del glucógeno PYGB y PGM1 en el hipocampo de pacientes de EA. (A) Representación esquemática de los procesos de glucogenólisis y glucogenogénesis. Las enzimas estudiadas en este proyecto se destacan con un cuadro rojo. (B) Expresión relativa de ARNm de PYGB y PGM1, analizadas mediante RT-PCR en tiempo real, en el hipocampo de individuos Braak 0 (n=8), II (n=13-26), III-IV (n=15) y V-VI (n=12-38). Se indican los valores individuales de cada muestra, así como la mediana y los rangos intercuartílicos de los grupos representados. La significancia se ha analizado mediante la prueba de Kruskal-Wallis, seguida de un test de Dunn. (C) Estudio de correlación entre los valores de expresión relativa de las enzimas PYGB y PGM1 (n=48). Se muestra la recta de ajuste o regresión lineal. El estudio de correlación se ha realizado empleando el método de Spearman. Glucógeno Glucosa 1-fosfato Glucosa 6-fosfato Glucosa PYGB *Enzima desramificante GLUCOGENÓLISIS GLUCOGENOGÉNESIS Enzima ramificante Glucógeno sintasa UDP-Glucosa pirofosforilasa Cebador de glucógeno (n) UDP UTP PPi Pi Glucosa libre Glucoquinasa Glucosa 6-fosfatasa UDP-Glucosa Glucógeno (n+1) PGM1 "Test Kruskal-Wallis" p=0.4301 Braak 0 Braak II Braak III-IV Braak V-VI 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 Unidades relativas PYGB "Test Kruskal-Wallis" p=0.2985 Braak 0 Braak II Braak III-IV Braak V-VI 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 Unidades relativas 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 Spearman: r=0.6408 p<0.0001 PGM1 PYGB Braak V-VI Braak III-IV Braak II Braak 0 A C B Código seguro de Verificación : GEISER-8598-9009-566a-4890-b4af-d14e-6f25-b44a | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-8598-9009-566a-4890-b4af-d14e-6f25-b44a 23/11/2020 10:13:34 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000059958 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-8598-9009-566a-4890-b4af-d14e-6f25-b44a 124 D RESULTADOS Por otra parte, referente al metabolismo de ácidos grasos en los astrocitos, analizamos la expresión del gen que codifica la enzima carnitina palmitoiltransferasa 1 A (CPT1A), que media el transporte de ácidos grasos de cadena larga a través de la membrana mitocondrial externa para su posterior βoxidación (Figura D.33 B). Como se observa en la figura D.33 A, la expresión de CPT1A no disminuye con la progresión de la EA, sino que aumenta significativamente en pacientes Braak V-VI respecto a individuos Braak 0. Figura D.33. Expresión relativa de la enzima CPT1A implicada en el transporte de ácidos grasos de cadena larga a la matriz mitocondrial, para una posterior β-oxidación, en el hipocampo de pacientes de EA. (A) Expresión relativa de ARNm de CPT1A, analizada mediante RT-PCR en tiempo real, en el hipocampo de individuos Braak 0 (n=8), II (n=26), III-IV (n=15) y V-VI (n=37). Se indican los valores individuales de cada muestra, así como la mediana y los rangos intercuartílicos de los grupos representados. La significancia se ha analizado mediante la prueba de Kruskal-Wallis, seguida de un test de Dunn. (B) Representación esquemática del transporte de ácidos grasos al interior de la mitocondria, donde la enzima CPT1A (verde) desempeña un papel clave. Imagen creada con BioRender.com. Por último, analizamos la expresión del gen que codifica la enzima limitante de la síntesis de colesterol, 3-hidroxi-3-metil-glutaril-CoA reductasa (HMGCR, Figura D.34 A). Como se muestra en la figura D.34 B, se produce una disminución significativa en la expresión de HMGCR en pacientes Braak V-VI respecto a individuos Braak II, que podría ser indicativa de una disminución en la síntesis de colesterol en los astrocitos de pacientes de EA. Además, si analizamos la correlación entre las enzimas implicadas en los procesos metabólicos que disminuyen en la EA (glucólisis, ciclo de Krebs y síntesis de colesterol), observamos que la disminución en su expresión se produce de forma paralela en los mismos individuos (Figura D.35). En resumen, nuestros datos parecen confirmar que en los astrocitos de pacientes de EA se produce una disfunción metabólica, que afecta, al menos, a la glucólisis, ciclo de Krebs y síntesis de colesterol. Acil-CoA + Carnitina CPT1A Acetil-CoA CITOSOL MATRIZ MITOCONDRIAL CPT1A "Test Kruskal-Wallis" p=0.0319 Braak 0 Braak II Braak III-IV Braak V-VI 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 Unidades relativas * AB Código seguro de Verificación : GEISER-8598-9009-566a-4890-b4af-d14e-6f25-b44a | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-8598-9009-566a-4890-b4af-d14e-6f25-b44a 23/11/2020 10:13:34 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000059958 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-8598-9009-566a-4890-b4af-d14e-6f25-b44a 125 D RESULTADOS Figura D.34. Expresión relativa de la enzima HMGCR, principal punto de regulación de la síntesis de colesterol, en el hipocampo de pacientes de EA. (A) Representación esquemática de la síntesis de colesterol, indicando la reacción en la que participa la enzima HMGCR. (B) Expresión relativa de ARNm de HMGCR, analizada mediante RT-PCR en tiempo real, en el hipocampo de individuos Braak 0 (n=8), II (n=24), III-IV (n=15) y V-VI (n=37). Se indican los valores individuales de cada muestra, así como la mediana y los rangos intercuartílicos de los grupos representados. La significancia se ha analizado mediante la prueba de Kruskal-Wallis, seguida de un test de Dunn (*p<0.05). Figura D.35. Análisis de correlación entre enzimas reguladoras de procesos metabólicos afectados en el hipocampo de pacientes de Alzheimer. Estudio de correlación de los valores de gene set score (Sj) de los genes glucolíticos PFKM y PKM, la enzima del ciclo de Krebs IDH3a y la enzima reguladora de la síntesis del colesterol HMGCR. Se muestra la recta de ajuste o regresión lineal. El estudio de correlación se ha realizado empleando el método de Spearman. HMGCR "Test Kruskal-Wallis" p=0.0244 Braak 0 Braak II Braak III-IV Braak V-VI 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 Unidades relativas * SÍNTESIS DE COLESTEROL Acetil-CoA 3-hidroxi-3-metilglutaril-CoA Mevalonato Escualeno HMGCR 2 NADP++ CoA 2 NADPH + 2H+ Colesterol A B 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 Spearman: r=0.6297 p<0.0001 Glucólisis (Sj) IDH3a Braak V-VI Braak III-IV Braak II Braak 0 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 Spearman: r=0.6967 p<0.0001 HMGCR IDH3a Braak V-VI Braak III-IV Braak II Braak 0 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 Spearman: r=0.6719 p<0.0001 Glucólisis (Sj) HMGCR Braak V-VI Braak III-IV Braak II Braak 0 Código seguro de Verificación : GEISER-8598-9009-566a-4890-b4af-d14e-6f25-b44a | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-8598-9009-566a-4890-b4af-d14e-6f25-b44a 23/11/2020 10:13:34 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000059958 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-8598-9009-566a-4890-b4af-d14e-6f25-b44a 126 D RESULTADOS 3. INFILTRACIÓN DE CÉLULAS INMUNES EN EL PARÉNQUIMA CEREBRAL DE PACIENTES DE ALZHEIMER El SNC de los vertebrados superiores posee una separación inmune de la periferia, con acceso limitado para las células inmunes circulantes, los metabolitos inmunoactivos y las moléculas de señalización (Kierdorf et al., 2019). En condiciones fisiológicas, las principales células que regulan y participan en la respuesta inmune en el parénquima del SNC son la microglía y los astrocitos (Liu et al., 2014; Heneka et al., 2015; Hane et al., 2017a). Sin embargo, en la EA conforme la patología progresa, estas células pierden su función protectora y ganan funciones tóxicas (Navarro et al., 2018; Perez-Nievas y Serrano-Pozo, 2018; Sánchez-Mejías et al., 2016), estimulando un ambiente proinflamatorio, y la liberación de quimioquinas que podrían facilitar, unido a las posibles alteraciones en la BHE, la entrada de células del sistema inmune periférico. Actualmente existe gran controversia sobre el tema, debido principalmente a la dificultad para diferenciar las células mieloides periféricas de la microglía. Por ello, en el presente trabajo, realizamos distintos abordajes experimentales con el fin de aclarar si se produce o no infiltración de células inmunes periféricas en el parénquima cerebral de modelos animales de la enfermedad y de pacientes de Alzheimer. 3.1. En el parénquima cerebral de ratones transgénicos modelos de EA la infiltración de CDM es muy limitada En primer lugar, aislamos, y posteriormente caracterizamos y cuantificamos, la microglía, las CDM y los linfocitos en modelos murinos con placas de Aβ (APP), y con formas fosforiladas de Tau (TAU). 3.1.1. Aislamiento y caracterización de microglía, CDM y linfocitos de la corteza cerebral e hipocampo de distintos modelos murinos de EA El método empleado se basa en la detección mediante FACS del perfil de expresión de CD11b y CD45 en los distintos tipos celulares (Ford et al., 1995; Chiu et al., 2013; Goldmann et al., 2016; Rosenzweig et al., 2019) (Materiales y Métodos, Apartado 9.2). En primer lugar, seleccionamos mediante citometría de flujo las células individuales, atendiendo a su complejidad y tamaño celular (descartando debris, restos celulares y de mielina). Posteriormente, mediante inmunomarcaje fluorescente con CD45 y CD11b, distinguimos las tres poblaciones de interés (Figuras D.36 A y B). Por una parte, la población de linfocitos se caracteriza por ser CD11b-/ CD45high. Además, se observan dos poblaciones positivas para CD11b y CD45, pero con una diferente expresión de este último. La población CD11b+/ CD45medium corresponde a las células microgliales, mientras que las CDM son CD11b+/ CD45high. Una vez aisladas las tres poblaciones, comprobamos, mediante RT-PCR en tiempo real (Figura D.36 C), que los marcadores microgliales Trem2 y Cx3cr1 se expresan principalmente en la población CD11b+/CD45medium, y que las células CD11b+/CD45high son, a diferencia de la población microglial, positivas para Ccr2 y Código seguro de Verificación : GEISER-8598-9009-566a-4890-b4af-d14e-6f25-b44a | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-8598-9009-566a-4890-b4af-d14e-6f25-b44a 23/11/2020 10:13:34 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000059958 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-8598-9009-566a-4890-b4af-d14e-6f25-b44a 127 D RESULTADOS Ly6c, tal y como está descrito para las CDM. La población CD11b-/CD45high expresa, además de Ccr2 y Ly6c, el marcador específico de linfocitos T CD3. Al comparar los niveles de expresión de los marcadores analizados en la figura D.36 C, observamos que la expresión de Trem2 y Cx3cr1 es significativamente mayor que la de los otros marcadores, lo que concuerda con que, las células microgliales son las predominantes en el parénquima cerebral. Figura D.36. Aislamiento y caracterización fenotípica de microglía, CDM y linfocitos en corteza cerebral e hipocampo de modelos de EA, jóvenes y adultos. (A-B) Aislamiento mediante FACS, en función de CD11b y CD45, de microglía, CDM y linfocitos de ratones (A) APP de 6 y 18 meses y (B) TAU de 4 y 12 meses (n=3). (C) Caracterización mediante RT-PCR de la expresión de los marcadores fenotípicos de las 3 poblaciones aisladas (microglía, CDM y linfocitos) Trem2, Cx3xr1, Ccr2, Ly6c y CD3. La expresión de estos marcadores se ha corregido por la expresión del gen housekeeper GAPDH. Los datos se representan como media± SD para una n≥3 por grupo. La estadística se ha analizado mediante el test ANOVA seguido del test de comparación múltiple Tukey (*p<0,05; **p<0,01; ****p<0,0001). Puesto que en la microglía activa aumenta la expresión de CD45, decidimos utilizar, además de CD11b y CD45, el anticuerpo Ly6c para confirmar y garantizar una adecuada separación de las CDM (Ly6c+) de la población microglial (Ly6c-). Incluimos también en el estudio un control sin patología (WT), que debe tener un porcentaje considerablemente menor de microglía activa. Para evaluar si el nivel de infiltración varía con el área cerebral estudiada, procesamos por separado hipocampo y corteza. Como se observa en la figura D.37 la población microglial en los modelos APP y TAU comparada con el WT, se desplaza ligeramente hacia una expresión mayor de CD45. Además, el uso del marcador Ly6c nos confirma que la separación realizada CD3 "ANOVA" F(2,9)=12.22; p=0.0027 Microglía CDM Linfocitos 0.0 0.1 0.2 0.3 Expresión de ARNm ** Cx3cr1 "ANOVA" F(2,10)=6.065; p=0.0188 Microglía CDM Linfocitos 0 5 10 15 20 Expresión de ARNm * Ly6c "ANOVA" F(2,10)=2.731; p=0.1132 Microglía CDM Linfocitos 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 Expresión de ARNm Ccr2 "ANOVA" F(2,12)=2.580; p=0.0023 Microglía CDM Linfocitos 0.00 0.02 0.04 0.06 0.08 0.10 Expresión de ARNm *** Trem2 "ANOVA" F(2,11)=61.41; p<0.0001 Microglía CDM Linfocitos 0 1 2 3 4 5 Expresión de ARNm **** 6 meses CD11b CD11b CD11b CD11b 4 meses CD45 CD45 A. APP 12 meses CD45 CD45 B. TAU 12 meses Linfocitos Microglía CDM C Código seguro de Verificación : GEISER-8598-9009-566a-4890-b4af-d14e-6f25-b44a | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-8598-9009-566a-4890-b4af-d14e-6f25-b44a 23/11/2020 10:13:34 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000059958 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-8598-9009-566a-4890-b4af-d14e-6f25-b44a 134 D RESULTADOS Figura D.42. Expresión de ARNm de diferentes citoquinas quimiotácticas y de receptores de dichas quimioquinas en muestras hipocampales humanas. (A-B) Expresión relativa (A) de las citoquinas CCL2, CCL3, CCL4 y CCL5 y (B) de los receptores de quimioquinas CCR1, CCR2 y CCR5 en el hipocampo de individuos Braak II (n=15) y Braak V-VI (n=15). Se representan los valores individuales de cada muestra, así como la mediana y los rangos intercuartílicos de los grupos representados. La significancia se ha analizado mediante la prueba U de Mann-Whitney (*p<0,05). (C-E) Expresión relativa de (C) CCL2, (D) CCL4 y (E) CCR2 en el hipocampo de individuos Braak 0 (n=8), II (n=21), III-IV (n=9) y V-VI (n=28). Se representan los valores individuales de cada muestra, así como la mediana y los rangos intercuartílicos de los grupos representados. La significancia se ha analizado mediante la prueba de Kruskal-Wallis, seguida de un test de Dunn (*p-<0,05; **p<0,01). 3.2.4. El clúster CDM? no se expresa en células microgliales En los apartados anteriores, hemos descrito evidencias de una posible infiltración de CDM en el hipocampo de pacientes de EA. Sin embargo, los genes incluidos en el clúster de CDM? podrían ser expresados por microglía. Por ello, en base a estudios previos en otras patologías con infiltración de CDM, como gliomas o esclerosis múltiple (Zhang et al., 2011b; Venteicher et al., 2017; Müller et al., 2017a; DePaula-Silva et al., 2019; Haage et al., 2020), analizamos un mayor número de genes expresados de forma preferente en CDM respecto a microglía. Para ello utilizamos Taqman® Array Cards, que, en un mismo experimento y de forma sencilla y rápida, permiten cuantificar la expresión de múltiples genes en distintas muestras, minimizando la manipulación y el posible error asociado. Unidades relativas CCR1 CCR2 CCR5 0 5 10 15 20 Braak II Braak V-VI * RECEPTORES DE QUIMIOQUINAS Unidades relativas CCL2 CCL3 CCL4 CCL5 0 5 10 15 Braak II Braak V-VI * * QUIMIOQUINAS CCL2 "Test Kruskal-Wallis" p<0.0001 Braak 0 Braak II Braak III-IV Braak V-VI 0 5 10 15 20 ** Unidades relativas CCR2 "Test Kruskal-Wallis" p=0.0090 Braak 0 Braak II Braak III-IV Braak V-VI 0 5 10 15 20 Unidades relativas * CCL4 "Test Kruskal-Wallis" p=0.0159 Braak 0 Braak II Braak III-IV Braak V-VI 0 1 2 3 4 Unidades relativas ** A B C D E Código seguro de Verificación : GEISER-8598-9009-566a-4890-b4af-d14e-6f25-b44a | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-8598-9009-566a-4890-b4af-d14e-6f25-b44a 23/11/2020 10:13:34 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000059958 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-8598-9009-566a-4890-b4af-d14e-6f25-b44a 135 D RESULTADOS Figura D.43. Expresión de ARNm de genes de CDM en muestras post mortem de hipocampo mediante Taqman® Array Cards. (A) Representación mediante heatmap o mapa de calor de los valores tipificados (z-score) de la expresión de genes asociados a CDM en el hipocampo de individuos Braak 0 (n=8), II (n=15), III-IV (n=15) y V-VI (n=23). Las muestras han sido ordenadas en base a un análisis de clúster jerárquico (Método de Ward, distancia de Manhattan). En el margen superior, se muestra el dendograma obtenido y una barra de color que indica el estadio Braak de cada una de las muestras. El esquema de color del heatmap está basado en la distribución z-score, de -1,5 (azul) a 1,5 (rojo). (B) Representación de los valores de gene set score (Sj) de los genes asociados a CDM, incluidos en el heatmap de la figura A. Se representan los valores individuales de cada muestra, así como la mediana y los rangos intercuartílicos de los grupos representados. La significancia se ha analizado mediante la prueba de Kruskal-Wallis, seguida de un test de Dunn (**p<0,01). (C) Análisis de correlación entre los valores de gene set score (Sj) de CDM analizados mediante Taqman® Array Cards y los valores de Sj del clúster de genes CDM? medido por RT-PCR en tiempo real (Figura D.41 D), con recta de ajuste o regresión lineal (±SD). El estudio de correlación se ha llevado a cabo empleando el método de Spearman. Tras medir la expresión de los genes seleccionados en cada una de las muestras, observamos que todos ellos aumentan de forma clara principalmente en pacientes Braak V-VI (Figura D.43 A). En la figura D.43 B, representamos el gene set score calculado para la expresión de estos genes asociados a CDM (CD163, CDM "Test Kruskal-Wallis" p<0.0001 Braak 0 Braak II Braak III-IV Braak V-VI 0 2 4 6 Gene Set Score (Sj) ** CDM? (Sj) (RT-PCR) 02468 0 2 4 6Braak 0 Braak II Braak III-IV Spearman: r=0.7118 p<0.0001 Braak V-VI CDM (Sj) (Array Cards) Braak 0 Braak II Braak III-IV Braak V-VI A B C Código seguro de Verificación : GEISER-8598-9009-566a-4890-b4af-d14e-6f25-b44a | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-8598-9009-566a-4890-b4af-d14e-6f25-b44a 23/11/2020 10:13:34 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000059958 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-8598-9009-566a-4890-b4af-d14e-6f25-b44a 136 D RESULTADOS IFITM2, IFITM3, F13A1, NPC2, TAGLN2, HLA-DR -que incluye la expresión de HLA-DRB1, HLA-DRB4 y HLA-DRB5-, LILRB2, CXCL16 y NR4A1). Nuestros resultados muestran un aumento patente de este gene set score con la progresión de la patología, observándose una tendencia a aumentar en Braak III-IV, y un claro y significativo aumento en pacientes Braak V-VI. Además, tal y como se muestra en la figura D.43 C, el gene set score de los genes asociados a CDM (Figura D.43 B) presenta muy buena correlación (r=0.7118) con el de los genes incluidos en el clúster de CDM? (Figura D.41 D), lo que podría indicar que ambos grupos de genes se expresan en la misma población celular. Por tanto, el claro aumento en la expresión de genes asociados a CDM en el hipocampo de pacientes de EA, así como la buena correlación de estos con el clúster CDM?, apoyan la hipótesis de que este clúster corresponde a CDM, y no a microglía. Para confirmar esta hipótesis, realizamos, en colaboración con el grupo de la Dra. Antonia Gutiérrez, estudios inmunohistoquímicos empleando como marcador CD163, uno de los genes asociados a CDM que aumenta de forma muy significativa en pacientes de EA. En la figura D.44 A observamos que en individuos Braak 0 las células CD163+ se restringen a los vasos sanguíneos. En Braak II, aunque podemos encontrar escasas células CD163+ en el parénquima (Figura D.44 B2 y B4), la gran mayoría se restingen también a los vasos (Figura D.44 B1 y B3). Sin embargo, en pacientes Braak V-VI hay numerosas células CD163+ en el interior del parénquima hipocampal (Figura D.45 A). Estas células son ramificadas y suelen encontrarse en áreas próximas a vasos sanguíneos. Muchas de estas células, pero no todas, se encuentran asociadas a placas de Aβ, aunque también existen numerosas placas sin células CD163+. Además, como ocurre en controles y en estadio II de Braak, existen células CD163+ alineadas, probablemente marcando a macrófagos asociados al SNC que se localizan en el espacio perivascular de los vasos sanguíneos. En la figura D.45 se muestra la heterogeneidad en la distribución espacial de las células CD163+ en comparación con la microglía. Mientras que la microglía IBA1+ se distribuye de forma homogénea por el parénquima hipocampal (Figura D.45 B), en una sección consecutiva del mismo individuo se observa que las células CD163+se localizan de manera heterogenea, existiendo regiones con un mayor número de células y otras en las que prácticamente no existe marcaje. La figura D.46 muestra la cuantificación de la carga de CD163 en el hipocampo de pacientes Braak V-VI con respecto a individuos Braak II. En concordancia con lo observado a nivel de ARNm (Figura S3, Anexo I), en el hipocampo de enfermos de Alzheimer se produce un patente aumento de CD163, acompañado de un incremento significativo en la carga de Aβ extracelular. Sin embargo, la carga de IBA1 no se modifica de forma paralela. En conjunto, estos resultados indican que, con el avance de la patología de Alzheimer se produce en el parénquima hipocampal un importante aumento de células CD163+ correspondientes a CDM, sin que varie el número total de células microgliales. Además, describimos a CD163 como un marcador diferencial de la población de CDM estudiada. Código seguro de Verificación : GEISER-8598-9009-566a-4890-b4af-d14e-6f25-b44a | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-8598-9009-566a-4890-b4af-d14e-6f25-b44a 23/11/2020 10:13:34 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000059958 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-8598-9009-566a-4890-b4af-d14e-6f25-b44a 137 D RESULTADOS Figura D.44. Inmunohistoquímica con los anticuerpos CD163 y OC en muestras post mortem de hipocampo de individuos sin patología de Alzheimer. Inmunomarcaje para CD163 y OC, que detecta formas fibrilares de Aβ, en el hipocampo de individuos (A) Braak 0 y (B) Braak II. Imágenes cedidas por el grupo de la Dra. Antonia Gutiérrez. Barra de escala: (A1, B1) 1 mm, (A2-4) 50 µm, (A5, B3) 200 µm, (A6, B2, B4) 100 µm. CD163/OC BRAAK II BRAAK 0 GD CA3 CA1 A1 A5 A2 A6 A3 A4 B1 B2 B3 B4 GD CA3 CA1 Código seguro de Verificación : GEISER-8598-9009-566a-4890-b4af-d14e-6f25-b44a | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-8598-9009-566a-4890-b4af-d14e-6f25-b44a 23/11/2020 10:13:34 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000059958 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-8598-9009-566a-4890-b4af-d14e-6f25-b44a 138 D RESULTADOS Figura D.45. Inmunohistoquímica para CD163, OC e IBA1 en muestras post mortem de hipocampo de pacientes de Alzheimer. (A) Inmunomarcaje para CD163 y OC, que detecta formas fibrilares de Aβ, en el hipocampo de pacientes Braak V-VI. (B) Inmunohistoquímica con el anticuerpo IBA1, marcador de población microglial, en una sección consecutiva de la misma muestra empleada en la figura A. Imágenes cedidas por el grupo de la Dra. Antonia Gutiérrez. Barra de escala: (A1, B) 500 µm, (A2-3) 100 µm, (A4) 200 µm, (A5) 250 µm. CA2 CA3 GD Sub CA1 BRAAK V-VI Sub CA1 GD GD CA1 CA2 Sub CA3 IBA1 B A1 A2 A3 A4 A5 CD163/OC Código seguro de Verificación : GEISER-8598-9009-566a-4890-b4af-d14e-6f25-b44a | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-8598-9009-566a-4890-b4af-d14e-6f25-b44a 23/11/2020 10:13:34 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000059958 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-8598-9009-566a-4890-b4af-d14e-6f25-b44a 139 D RESULTADOS Figura D.46. Cuantificación de la carga de CD163, IBA1 y Aβ extracelular mediante inmunohistoquímica en muestras post mortem de hipocampo de individuos Braak II y Braak V-VI. Se indican los valores individuales de cada muestra, así como la mediana y los rangos intercuartílicos de los grupos representados. La significancia se ha analizado mediante la prueba de Mann-Whitney (**p<0,01; ***p<0,001). Cuantificación cedida por el grupo de la Dra. Antonia Gutiérrez. 3.2.5. En la EA los macrófagos asociados al SNC no parecen infiltrarse en el parénquima cerebral Como se ha indicado en la introducción, el SNC alberga una población heterogénea de células mieloides residentes, que incluyen, además de a la microglía del parénquima, a los macrófagos asociados al SNC, entre los que se encuentran los macrófagos perivasculares (Jordão et al., 2019). Dichos macrófagos residentes podrían expresar la mayoría de los genes asociados a CDM. En la figura D.47 A, se esquematizan las diferentes células mieloides que podrían expresar, al menos en parte, genes asociados a CDM en el SNC: microglía, macrófagos asociados al SNC, monocitos y CDM. A pesar de que todas ellas comparten gran parte de los marcadores fenotípicos, es posible identificar algunas por su posición anatómica y/o morfología. Los macrófagos perivasculares son células alargadas localizadas en el espacio perivascular o de Virchow-Robin (Zeisel et al., 2015; Goldmann et al., 2016) con una morfología relativamente simple, en comparación con la microglía altamente ramificada del parénquima. Además, debido a la contaminación sanguínea de las muestras, estos genes podrían corresponder a monocitos localizados en el interior de los vasos sanguíneos o a CDM infiltradas en el parénquima cerebral. Para tratar de dilucidar qué tipo celular expresa los genes asociados a CDM en el hipocampo de pacientes de EA, en primer lugar, medimos mediante RT-PCR en tiempo real la expresión de MRC1 (Figura D.47 B), marcador de elección, junto a CD163, para diferenciar macrófagos asociados al SNC de microglía. Nuestros resultados muestran que, a diferencia de lo observado en los genes asociados a CDM, MRC1 no aumenta con la progresión de la patología, manteniéndose inalterado en los diferentes estadios Braak. Además, en colaboración con el grupo de la Dra. Antonia Gutiérrez, realizamos una inmunohistoquímica con MRC1 en muestras post mortem de hipocampo de pacientes de EA, observando que las células MRC1+ se localizan exclusivamente en el interior del espacio perivascular, pero no en el parénquima cerebral (Figura D.47 C). CD163 "Test Mann-Whitney" p=0.0008 Braak II Braak V-VI 0 1 2 3 4 Carga de CD163 (%) *** IBA1 "Test Mann-Whitney" p=0.4082 Braak II Braak V-VI 0 5 10 15 20 25 Carga de IBA1 (%) A extracelular "Test Mann-Whitney" p=0.0047 Braak II Braak V-VI 0 5 10 15 Carga de A extracelular OC+ (%) ** A B C Código seguro de Verificación : GEISER-8598-9009-566a-4890-b4af-d14e-6f25-b44a | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-8598-9009-566a-4890-b4af-d14e-6f25-b44a 23/11/2020 10:13:34 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000059958 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-8598-9009-566a-4890-b4af-d14e-6f25-b44a 140 D RESULTADOS Además, realizamos una inmunofluorescencia doble para CD163 y MRC1 en individuos Braak II y Braak V-VI (Figuras D.47 D y E), comprobando que los macrófagos perivasculares de los vasos sanguíneos co-expresan ambos marcadores, mientras que las células CD163+ del interior del parénquima no se marcan con MRC1. Figura D.47. Estudio del perfil de expresión de MRC1 y de su distribución en el hipocampo de individuos Braak II y Braak VI. (A) Representación esquemática de diferentes células mieloides que podrían expresar, al menos en parte, los genes asociados a CDM en el SNC. Imagen creada con BioRender.com. (B) Expresión relativa de MRC1 en el hipocampo de individuos Braak 0 (n=8), II (n=21), III-IV (n=9) y V-VI (n=28). Se representan los valores individuales de cada muestra, así como la mediana y los rangos intercuartílicos de los grupos representados. La significancia se ha analizado mediante la prueba de Kruskal-Wallis, seguida de un test de Dunn. (C) Inmunomarcaje para MRC1 en el hipocampo de pacientes Braak V-VI. Imágenes cedidas por el grupo de la Dra. Antonia Gutiérrez. (D-E) Inmunofluorescencia doble para CD163 y MRC1 en muestras post mortem de hipocampo de individuos (D) Braak II y (E) Braak V-VI. Imágenes cedidas por el grupo de la Dra. Antonia Gutiérrez. Barra de escala: 20 µm. CD163 MRC1 Merge CD163 MRC1 Merge 50 µm 100 µm MRC1 200 µm Célula endotelial Macrófago perivascular Monocito CDM Microglía MRC1 "Test Kruskal-Wallis" p=0.4187 Braak 0 Braak II Braak III-IV Braak V-VI 0 1 2 3 4 Unidades relativas A B C BRAAK II BRAAK VI D CD163 MRC1 Merge CD163 MRC1 Merge BRAAK V-VI BRAAK II E BRAAK V-VI Código seguro de Verificación : GEISER-8598-9009-566a-4890-b4af-d14e-6f25-b44a | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-8598-9009-566a-4890-b4af-d14e-6f25-b44a 23/11/2020 10:13:34 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000059958 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-8598-9009-566a-4890-b4af-d14e-6f25-b44a 141 D RESULTADOS Por tanto, los macrófagos asociados al SNC permanecen en el espacio perivascular y no parecen alterarse con la patología de Alzheimer, a diferencia de las células CD163+. Por tanto, la infiltración de células CD163+ observada en el apartado anterior sería debida exclusivamente a CDM. 3.3. ¿Existe relación entre la infiltración de CDM y otros aspectos de la patología de Alzheimer? Tras demostrar que existe infiltración de CDM en el hipocampo de pacientes de Alzheimer, analizamos mediante un análisis de clúster jerárquico su relación con el estadio de Braak, el género, el genotipo APOE, y otros aspectos importantes en la patología. Para ello, clasificamos de forma no supervisada los individuos en tres grupos o clústeres en función del nivel de expresión del gene set score de CDM (Figura D.48 A), de forma que, es bajo para el clúster 1, intermedio para el clúster 2 y elevado para el clúster 3 (Figura D.48 B). En la figura D.48 C observamos que existe asociación significativa (prueba de chi-cuadrado; Braak V-VI respecto a Braak II; p=0,0066) entre el estadio Braak y el nivel de infiltración. De hecho, el 100% de las muestras Braak 0 se incluyen en el clúster 1, mientras que el clúster 3 está formado, casi exclusivamente (81,25 %), por pacientes de Alzheimer. Por su parte, el 77,77% de los individuos Braak III-IV se localiza en el clúster 2 y las muestras Braak II se distribuyen principalmente entre los clústeres 1 y 2. Sin embargo, no observamos asociación en función del género y el genotipo APOE (Figura D.48 D y E). Tampoco existe relación entre el nivel de infiltración de CDM y la edad de inicio de la patología, la edad de muerte y los años de supervivencia tras el diagnóstico (Figura D.49). También estudiamos la relación de las patologías Aβ y Tau (Figura D.50) con la infiltración de CDM. En la figura D.51 observamos que los niveles de Aβ monomérico aumentan con la infiltración de CDM (clústeres 2 y 3). También se produce un aumento significativo de la carga de Tau agregado (TAU46) en el clúster 3, y una tendencia al aumento de las formas fosforiladas de Tau reconocidas por AT8 en los clústeres 2 y 3. Sin embargo, no existen diferencias entre las formas fosforiladas de Tau detectadas por AT100 en función del grado de infiltración. Aunque estos datos sugieren una relación de la infiltración de CDM con la acumulación de Aβ y Tau, cabe destacar que no correlacionan de forma significativa (Figura D.59). Empleado los genes asociados a los subtipos de microglía mediante el análisis de clúster (Figura D.41 B y C), observamos que el gene set score de microglía homeostática disminuye significativamente en el grupo con mayor grado de infiltración, mientras que el de microglía DAM aumenta significativamente en los individuos del clúster 2 y 3 (Figura D.52). Código seguro de Verificación : GEISER-8598-9009-566a-4890-b4af-d14e-6f25-b44a | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-8598-9009-566a-4890-b4af-d14e-6f25-b44a 23/11/2020 10:13:34 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000059958 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-8598-9009-566a-4890-b4af-d14e-6f25-b44a 142 D RESULTADOS Figura D.48. Clasificación mediante análisis de clúster de los individuos en función de la expresión del gene set score de CDM. (A) Representación mediante heatmap o mapa de calor de los valores tipificados (z-score) de la expresión de los genes de CDM analizados mediante RT-PCR en tiempo real. Se muestra el dendograma obtenido mediante clustering jerárquico (Método de Ward, distancia de Manhattan; genes, n=9; muestras, n=66). La barra de color superior indica el clúster al que pertenece cada uno de los individuos (Clúster 1, 2 o 3). La barra de color inferior representa el estadio Braak de cada una de las muestras. El esquema de color del heatmap está basado en la distribución z-score, de - 1,5 (azul) a 1,5 (rojo). (B) Representación de los valores del gene set score CDM en función del clúster definido en la figura A (Clúster 1, n=23; clúster 2, n=27; clúster 3, n=16). Se representan los valores individuales de cada muestra, así como la mediana y los rangos intercuartílicos de los grupos representados. La significancia se ha analizado mediante la prueba de Kruskal-Wallis, seguida de un test de Dunn (**p<0,01; ****p<0,0001). (C) Número de individuos, clasificados en función del estadio Braak, que constituyen cada uno de los clústeres. La significancia de la asociación entre estadio Braak y clúster se ha analizado mediante la prueba de chi-cuadrado, comparando Braak II con respecto a Braak V-VI (p=0.0066). (D) Número de individuos, clasificados en función del género, en cada uno de los clústeres. La significancia de la asociación se ha analizado mediante la prueba de chi-cuadrado (p=0.6329). (E) Distribución por genotipo APOE en cada uno de los clústeres. Las muestras se han clasificado según presenten los dos alelos ε3 o al menos un alelo ε2 o ε4. Clúster 1 Clúster 2 Clúster 3 0 5 10 15 20 Genotipo ApoE Número de individuos 2 3 4 Clúster 1 Clúster 2 Clúster 3 0 5 10 15 20 25 30 Género Número de individuos Masculino Femenino Clúster 1 Clúster 2 Clúster 3 0 5 10 15 20 25 30 Estadio Braak Número de individuos Braak 0 Braak II Braak III-IV Braak V-VI CDM "Test Kruskal-Wallis" p<0.0001 Clúster 1 Clúster 2 Clúster 3 0 5 10 15 **** Gene Set Score (Sj) ** A B C D E Clúster 1 Clúster 2 Clúster 3 Braak0 BraakIII-IV Braak II BraakV-VI Código seguro de Verificación : GEISER-8598-9009-566a-4890-b4af-d14e-6f25-b44a | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-8598-9009-566a-4890-b4af-d14e-6f25-b44a 23/11/2020 10:13:34 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000059958 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-8598-9009-566a-4890-b4af-d14e-6f25-b44a 143 D RESULTADOS Figura D.49. Ausencia de relación entre la infiltración de CDM y aspectos clínicos. (A) Edad de inicio de la patología en los 3 clústeres con un aumento progresivo de infiltración de CDM (Clúster 1, n=3; clúster 2, n=4; clúster 3, n=5). (B) Edad de muerte de los individuos en función del clúster (Clúster 1, n=15; clúster 2, n=26; clúster 3, n=16). (C) Años de supervivencia tras el diagnóstico en función del nivel de infiltración de CDM (Clúster 1, n=3; clúster 2, n=4; clúster 3, n=5). Se representan los valores individuales de cada muestra, así como la mediana y los rangos intercuartílicos de los grupos representados. La significancia se ha analizado mediante la prueba de Kruskal-Wallis, seguida de un test de Dunn. Edad de inicio "Test Kruskal-Wallis" p=0.7291 Clúster 1 Clúster 2 Clúster 3 50 60 70 80 90 100 Años Edad de exitus "Test Kruskal-Wallis" p=0.2905 Clúster 1 Clúster 2 Clúster 3 40 60 80 100 Años Supervivencia desde el diagnóstico "Test Kruskal-Wallis" p=0.2838 Clúster 1 Clúster 2 Clúster 3 0 5 10 15 Años A B C Código seguro de Verificación : GEISER-8598-9009-566a-4890-b4af-d14e-6f25-b44a | Puede verificar la integridad de este documento en la siguiente dirección : https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida ÁMBITOPREFIJO CSV FECHA Y HORA DEL DOCUMENTO GEISER GEISER-8598-9009-566a-4890-b4af-d14e-6f25-b44a 23/11/2020 10:13:34 Horario peninsular Nº registro DIRECCIÓN DE VALIDACIÓN O00008745e2000059958 https://sede.administracionespublicas.gob.es/valida GEISER-8598-9009-566a-4890-b4af-d14e-6f25-b44a 246 I BIBLIOGRAFÍA Beccari S, Diaz-Aparicio I, Sierra A. Quantifying Microglial Phagocytosis of Apoptotic Cells in the Brain in Health and Disease. 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