Poros hidrofílicos. Crambescidina-816 un inhibidor de canales de calcio

 Poros hidrofílicos. Crambescidina-816 un inhibidor de los canales de calcio Diego A. Fort Sevilla 2010   Poros hidrofílicos. Crambescidina-816 un inhibidor de los canales de calcio Memoria presentada por Diego A. Fort Para optar al grado de Doctor en Ciencias Químicas Sevilla, 2010   Dr. D. Julio D. Martín, Dr. D. Ricardo Pérez Afonso y Dr. Dª. Natalia Pérez-Hernández CERTIFICAN: Que el presente trabajo titulado “Poros hidrofílicos. Crambescidina-816 un inhibidor de los canales de calcio” ha sido realizado bajo nuestra dirección en los laboratorios del Instituto de Investigaciones Químicas (CSIC-Universidad de Sevilla) durante los cursos 2006-2010, constituyendo la Memoria que presenta Die g o A. Fort para optar al g rado de Doctor en Ciencias Químicas. Sevilla, Setiembre de 2010 Fdo. Julio D. Profesor de Investigación del CSIC Fdo. Ricardo Pérez Afonso Científico Titular del CSIC Fdo. Natalia Pérez-Hernández Contratada JAE del CSIC  Esta tesis ha sido realizada en el Instituto de Investigaciones Químicas del CSIC bajo la dirección de los Doctores D. Julio D. Martín, D. Ricardo Pérez Afonso y Dª. Natalia Pérez- Hernández, a quienes expreso mi más sincero agradecimiento.  Agradecimientos: La Química está en el fondo del balón, botija.  A mi Abuela. A mi Padre. 1 INDICE INTRODUCCION .................................................................................................. 3 Estructura del agua y consecuencias. ........................................................... 5 Capítulo 1........................................................................................................... 19 Efecto de la temperatura en la salida y entrada de agua en poros............ 19 1.1 Introducción. ........................................................................................... 21 1.2 Antecedentes y objetivos........................................................................ 31 1.3 Materiales y métodos.............................................................................. 37 1.3.1 Difracción de rayos-X ............................................................................. 37 1.3.2 Calorimetría diferencial de barrido (DSC). ............................................... 37 1.3.3 Termogravimetría (TG) y análisis térmico diferencial (DTA)...................... 38 1.3.4 Difracción de rayos-X en polvo a temperatura variable (VT-PXRD)............ 38 1.4 Discusión de resultados. ......................................................................... 39 1.5 Conclusiones............................................................................................ 52 Capítulo 2........................................................................................................... 55 Efecto del agua en la formación de estructuras cristalinas tubulares. ...... 55 2.1 Introducción. ........................................................................................... 57 2.2 Antecedentes y objetivos........................................................................ 60 2.3 Materiales y métodos.............................................................................. 68 2.3.1 Microscopía óptica ................................................................................. 68 2.3.2 Microscopía electrónica de barrido (SEM) . ............................................... 68 2.3.3 Difracción de rayos-X en polvo (PXRD). .................................................. 69 2.4 Discusión de resultados. ......................................................................... 69 2.5 Material complementario........................................................................ 79 2.6 Conclusiones............................................................................................ 84 Capítulo 3........................................................................................................... 85 Aislamiento, purificación y caracterización de extractos de esponja CRAMBE CRAMBE .......................................................................................... 85 3.1 Introducción . ........................................................................................... 87 3.2 Aislamiento y Purificación ...................................................................... 88 3.2.1 Estabilidad de la muestra................................................................. 92 3.3 Caracterización........................................................................................ 93 3.3.1 Resonancia magnética nuclear de 1H y 13C...................................... 93 3.3.1.1 Experimentos monodimensionales: .................................................. 93 3.3.1.2 Experimentos bidimensionales:........................................................ 94 8 Figura 2. Representación esquemática en la que se resume cambios estructurales de un biopolímero ocasionados por la suma de cambios en la estructura del agua, inducidos por el conocido efecto hidrofóbico, que estabiliza contactos no polares por eliminación de moléculas de agua. Sin embargo, los bioquímicos en general obvian esta relación en los cálculos de estudio del plegamiento de macro-moléculas, debido quizás a que el agua resulta transparente a la mayoría de las técnicas y su comportamiento difícil de evaluar mediante medidas espectroscópicas.12 Aunque se han hecho progresos en este sentido, el problema está aún muy lejos de ser comprendido en su totalidad (Figura 3). Figura 3. Simulación en la que se muestra las moléculas de agua que rodean una proteína desplegada y plegada. Las moléculas de agua que están más cerca de la superficie de la proteína se resaltan con color rojo brillante. 12 S.J. Kim, B. Born, M. Havenith, M. Gruebele, Angew. Chem. Int. Ed ., 2008, 47 , 6486-6489. 9 Estudios espectroscópicos recientes demuestran que las moléculas de agua que se encuentran en posiciones cercanas a la proteína tienen estructura diferente y participan en el proceso de plegamiento. La estructura tetraédrica del agua en estado líquido, en relación con las cuatro moléculas vecinas que la rodean, es muy cuestionada lo que ha sido noticia de periodismo científico.13 Sofisticados estudios de medición ultrarrápida de dispersión en Raman y absorción de rayos-X14,15 o los resultados de difracción de electrones,16 concluyen que las moléculas de agua en estado líquido forman, preferentemente, estructuras lineales y cíclicas en las que cada molécula se conecta con sólo dos de sus vecinas mediante fuertes enlaces por puentes de hidrógeno, en lugar de los tres-cuatro hasta ahora consideradas. Esta aporía o problema sin “visible” solución, continúa siendo un objetivo largamente perseguido. Para obviar los inconvenientes que surgen como consecuencia de identificar la estructura del agua con la de una teoría concreta, lo mejor es adecuarla a la dinámica del instante. Así, mientras esta circunstancia persista, la estructura se puede concebir sin más, como una red de moléculas de agua conectadas por puentes de hidrógeno, sometidas a una dinámica que varía según sean las condiciones en que se encuentren. Esta estructura del agua, en estado líquido, fluctúa y se reorganiza en escalas de tiempos entre 10 fs (10- 14s) y 10 ps (10-11s). En la Figura 4 se esquematiza la fluctuación molecular que ha de ocurrir en la ruptura y formación de un enlace por puente de hidrógeno entre una molécula de agua y dos de sus vecinas. La situación A muestra, mediante flechas, los movimientos traslacionales de las moléculas OaH2 y ObH2 necesarios para que las distancias moleculares se adecuen a la ruptura y formación de un nuevo enlace. La situación B remarca el movimiento rotacional necesario en la molécula O*H2 para que se pueda originar el nuevo enlace. La situación C define el final del proceso con el nuevo enlace ya formado. La 13 S. Begley, The Wall Street Journal , Marzo 10, 2006. A. Fernández-Muerza, El Pais , Enero 03, 2006. 14 Ph. Wernet, D. Nordlund, U. Bergmann, M. Cavalleri, M. Odelius, H. Ogasawara, N.A. Naslund, T.K. Hirsch, L. Ojamae, P. Glatzel, L.G.M. Pettersson, A. Nilsson, Science , 2004, 304 , 995-999. 15 T. Head-Gordon, M.E. Johnson, PNAS , 2006, 103 , 7973-7977. 16 C.-Y. Ruan, V.A. Lobastov, F. Vigliotti, S. Chen, A.H. Zewail, Science , 2004, 304 , 80. 10 secuencia A→B→C muestra como las dinámicas (traslacional y rotacional) de las moléculas se encuentran íntimamente relacionadas. Según la teoría de tetracoordinación, en la situación definida como C la molécula de agua aceptora del enlace (ObH2) se encuentra sobrecoordinada (cinco enlaces por puentes de hidrógeno), mientras que la molécula que ha perdido el enlace (OaH2) queda tricoordinada. Según que la formación y ruptura de enlaces sea concertada o transcurra a través de pasos discretos, estos excesos y defectos en coordinación pueden, ser considerados como situaciones reales en la estructura del agua (intermedios en la transformación) o situaciones extremas irreales (estados de transición). La teoría de organización lineal y cíclica de moléculas de agua se reduce, en el esquema que se dibuja en la Figura 4, a considerar que el paso de A a C ocurre sin la participación del intermedio B y que las moléculas de agua son siempre dicoordinadas. En cualquier caso y con independencia del dibujo estático que al final prevalezca, lo importante es la alteración estructural que provoca en el agua líquida la presencia de una entidad diferente. Las propiedades del agua derivan de su habilidad de formar entre ellas redes fluctuantes de puentes de hidrógeno. Figura 4. Representación esquemática de la formación y ruptura de enlaces por puentes de hidrógeno entre moléculas de agua. El fuerte carácter director de estos enlaces permite que pequeñas agrupaciones de moléculas puedan existir en varias estructuras y formas isoméricas, con consecuencias importantes en los procesos de activación química. Así, influyen en los mecanismos de reacciones de hidrólisis en medio acuoso, donde la cooperatividad entre las moléculas de agua hace que induzcan diferentes B H* O* Oa Ob O* O* H* H* Oa Oa Ob Ob A C 11 grados de activación química, según sea su situación en el agregado molecular.17,18 Un ejemplo de este fenómeno es el conocido efecto Grotthus, que es un mecanismo de transporte de protón por “relevos” entre moléculas de agua a lo largo de cadenas de moléculas.19 La relación entre agrupamientos particulares de las moléculas de agua y la actividad química que transfieren es objeto de constante investigación. Esta investigación requiere, no sólo conocer el número de moléculas de agua que conforman el agregado sino la particularidad de cada forma isomérica involucrada en la solvatación. Un ejemplo es el anión bicarbonato, HCO3–, especie ubicua en la química del medio acuoso. Debido a que es una base débil, juega un papel primordial en los equilibrios ácido-base que ocurren cuando el CO2 se disuelve en agua. Estas especies iónicas son importantes en procesos tales como el control homeostático del pH de los océanos20, o la calcificación de esqueletos externos en muchas especies marinas21 (Esquema 1, izquierda). Las interacciones del disolvente con las especies que están a uno y otro lado de la ecuación de equilibrio, son muy importantes para comprender la cinética y termodinámica de la reacción en la fase acuosa. Se ha comprobado22 que la microsolvatación más favorable del anión bicarbonato, ocurre con cuatro moléculas de agua como dadoras de puentes de hidrógeno al fragmento estructural –CO2, actuando cada uno de estos átomos de oxígeno como doble aceptor de puentes de hidrógeno, estando particularmente desfavorecido el enlace de las moléculas de agua a la función hidroxílica en HCO3–. La separación iónica se favorece por la deslocalización protónica en el medio acuoso. Esta estructura del solvato es la que configura la primera esfera de coordinación del anión y la que lo estabiliza en el entorno acuoso en que se encuentra. 17 M. Beyer, E.R. Williams, V.E. Bondybey, J. Am. Chem. Soc ., 1999, 121 , 1565-1573. 18 G. Niedner-Schatterburg, V.E. Bondybey, Chem. Rev . 2000, 100 , 4059-4086. 19 N. Agmon, Chem. Phys. Lett . 1995, 244 , 456-462. 20 K. Caldeira, M.E. Wickett, Nature 2003, 425 , 365. 21 J.C. Orr, V.J. Fabri, O. Aumont, L. Bopp, S.C. Doney, R.A. Feely, A. Gnanadesikan, N. Gruber, A. Ishida, F. Joss, R.M. Key, K. Lindsay, E. Maier-Reimer, R. Matear, P. Monfray, A. Mouchet, R.G. Najjar, G.-K. Plattner, R.B. Rodgers, C.L. Sabine, J.L. sarmiento, R. Scholitzer, R.D. Slater, I.J. Totterdell, M.-F. Weirig, Y. Yamanaka, A. Yool, Nature , 2005, 437 , 681-686. 22 E. Garand, T. Wende, D.J. Goebbert, R. Bergmann, G. Meijer, D.M. Neumark, K.R. Asmis, J. Am. Chem. Soc ., 2010, 132 , 849-856. 12 OH C O O HH HH O H O H O H O H N O H H O O O H H H H (i) N O O H H O H O H H H O H H (ii) H 2 O CO 2 (H 2 O) n + H 2 O {CO 2 (H 2 O) n+1 [(HCO 3– )H + (H 2 O) n ]} HCO 3– (H 2 O) m + H + (H 2 O) n-m NO + (H 2 O) n + H 2 O {NO + (H 2 O) n+1 (HONO)H + (H 2 O) n ]} H + (H 2 O) n + HNO 2 OH C O O HH HH O H O H O H O H OH C O O HH HH O H O H O H O H N O H H O O O H H H H (i) N O O H H O H O H H H O H H (ii) H 2 O N O H H O O O H H H H (i) N O O H H O H O H H H O H H (ii) H 2 O CO 2 (H 2 O) n + H 2 O {CO 2 (H 2 O) n+1 [(HCO 3– )H + (H 2 O) n ]} HCO 3– (H 2 O) m + H + (H 2 O) n-m NO + (H 2 O) n + H 2 O {NO + (H 2 O) n+1 (HONO)H + (H 2 O) n ]} H + (H 2 O) n + HNO 2 Esquema 1. Efectos del agua en procesos de activación química. Izquierda: Equilibrio ácidobase del anión bicarbonato en medio acuoso. Estructura más favorable del solvato HCO3- (H2O)m. Derecha: Transferencia de carga del ion solvatado NO+(H2O)n al agua generando el solvato del protón H+(H2O)n. Estructuras mas favorables (i) y (ii). La química iónica en la región D de la ionosfera (a 70-85 Km de la superficie de la Tierra), es otro ejemplo en el que la estabilización protónica es paso clave en la formación de ácido nitroso (HONO), por transferencia de carga entre ion NO+ y agua mediante solvatación de un protón (Esquema 1, Derecha). La especie iónica NO+ se forma de la ionización de la especie neutra NO por emisión solar en el ultravioleta. La reacción de NO+ con una molécula de agua requiere una cantidad sustancial de energía23 (35 kcal/mol), barrera energética que se va reduciendo a medida que se adicionan más moléculas de agua, esta reacción es termoneutra en el tetrahidrato y puede llegar a ser exotérmica en solvatos mayores. Sin embargo, la posibilidad de que hidratos mayores del tetrahidrato se formen en condiciones atmosféricas es muy baja.23 El complejo trihidrato es el más pequeño en el que ocurre la transferencia de carga, y sólo el de estructura ( i ) es capaz de transferir la carga positiva al agua ( ii ), mientras que ésta se mantiene en la especie NO+ en cualquiera de los otros posibles isómeros.24 Este resultado demuestra que, también en el estado de vapor, la reactividad es muy sensible a la disposición geométrica de las moléculas de agua. La ralentización que ocurre en los movimientos de las moléculas de agua, cuando entran en contacto con entidades no polares, varía en función de la 23 E. Hamman, E.P.F. Lee, J.M. Dyke, J. Phys. Chem. A , 2001, 105 , 5528-5534. 24 R.A. Relph, T.L. Guasko, M.B. Elliot, M.Z. Kamrath, A.B. MacCoy, R.P. Steele, D.P. Schofield, K.D. Jordan, A.A. Viggiano, E.E. Ferguson, M.A. Johnson, Science , 2010, 327 , 308-312. 13 distancia, por lo que el agua en un organismo biológico está sometida a cambios estructurales constantes, que van desde la dinámica equivalente a la del agua líquida (posibles movimientos traslacionales y rotacionales) a la del hielo, donde sólo los movimientos rotacionales son permitidos. La dinámica del agua afecta al movimiento de las proteínas y la analogía con el agua líquida/hielo es fiel reflejo del comportamiento que tiene el agua en una célula, donde las moléculas de agua se encuentran alejadas pocos nanómetros de las proteínas y otros biopolímeros o bloqueadas entre ellos. Muchos de los movimientos de las proteínas y biopolímeros están condicionados por los cambios estructurales del agua que los rodea.25 Así, sólo si el agua actúa como efecto director se puede comprender que algunas proteínas, particularmente enzimas, sean capaces de atraer a otras moléculas hacia sus centros activos, pudiendo modificar sus estructuras. Son los cambios estructurales del agua los que ponen de manifiesto fenómenos como el efecto hidrofóbico o de hidratación hidrofóbica. Hay innumerables ejemplos de procesos, tanto químicos como biológicos, que son consecuencia de los cambios estructurales del agua en la que se encuentran inmersos. Así, por ejemplo, consideremos la historia que conduce a la formación de un simple copo de nieve y de las causas que hacen que las moléculas de agua se vayan, poco a poco, agregando de forma ordenada a la estructura cristalina inicial. No hay anteproyecto o código genético que organice estas estructuras tan espectaculares y, sin embargo, en contraposición a la libertad en que se fundamentan los principios de la geometría fractal, existe un efecto director que le indica a cada nueva molécula de agua que se incorpora el sitio exacto donde se ha de localizar. La historia comienza en una nube, cuando una diminuta gota de agua de la nube cristaliza, inducida por una partícula de polvo y crea un pequeño cristal de hielo, el cual rápidamente moldea para formar un diminuto prisma hexagonal. El crecimiento del prisma ocurre por incorporación de moléculas de agua que chocan contra las superficies del prisma y, en mayor proporción, sobre los vértices como zonas donde existe 25 P.W. Fenimore, H. Frauenfelder, B.H. McMahon, R.D. Young, PNAS , 2004, 101 , 14408- 14413. 14 mayor probabilidad de choques. Mientras crece, el cristal se mueve entre nubes por acción del viento y es sometido a condiciones variables de temperatura y de saturación de vapor de agua. La concentración de vapor de agua y la temperatura fijan la estructura del agua en cada instante, por tanto, la incorporación continuada de nuevas moléculas de agua al cristal ocurre dictada por la estructura del agua que le rodea en cada momento. Los vértices se desarrollan de manera independiente, sin embargo, el hecho de que la estructura local del agua que rodea al incipiente cristal de nieve sea “prácticamente” la misma, hace que el copo se desarrolle siguiendo una simetría “casi” hexagonal. También es la razón por la que dos copos que se generan desde entornos estructurales de agua distintos, sean diferentes. La Figura 5 se corresponde con microfotografías de copos de nieve, donde se puede observar la simetría hexagonal presente en cada uno de ellos y las diferencias entre los mismos al haberse creado desde entornos estructurales de agua diferentes.26 Figura 5. Diferentes formas de copos de nieve. La diversidad de sus estructuras y la simetría presente en cada una de ellos es consecuencia de la estructura del vapor de agua que los ha albergado en cada momento durante su formación.26 La información sobre la arquitectura de cada copo de nieve está contenida en la estructura del agua que lo rodea en cada instante. El efecto director que tiene el agua consigo misma se manifiesta también en los procesos biológicos, supeditando a sus movimientos los de las macromoléculas. Algunos ejemplos se muestran a continuación. Ciertos organismos marinos generan estructuras sólidas complejas por depósito de minerales en matrices formadas por biomoléculas, siendo estas moléculas las que dirigen su orientación, textura y morfología, al tiempo que influyen 26 K.G. Libbrecht, Rep. Prog. Phys . 2005, 68, 855-895. 15 sobre las propiedades mecánicas y estructurales del biomineral.27 Así, por ejemplo, las púas del erizo de mar Paracentrotus lividus (Figura 6, izquierda) a pesar de tener varios centímetros de longitud, están constituidas por un único cristal de calcita (CO3Ca, sistema trigonal, grupo espacial R3c) relleno de biopolímeros, polisacáridos y glicoproteínas, que se enhebran según un código específico que no altera la estructura del cristal. Figura 6. Estructuras naturales de calcita. Izquierda: erizo de mar Paracentrotus lividus . Cada espina se corresponde con un único cristal de calcita. Derecha: microfotografía coloreada artificialmente del plancton marino, Acanthoica acanthifera , donde se puede observar la disposición en hélice de placas de calcita.28 De igual forma, en ciertas especies de plancton marino, como es el caso del Acanthoica acanthifera (Figura 6, derecha), aunque no hay macromoléculas que de forma apreciable ocupen la matriz en su corteza de calcita, sí son estas necesarias para el ordenamiento quiral en hélice que se observa.28,29 Las moléculas de agua son co-responsables tanto de la organización intracristalina de los biopolímeros, como de la transmisión de la quiralidad en la formación y moldeo de estas complejas estructuras cristalinas. Los biopolímeros hidratados quedan atrapados en las estructuras de calcita cuando la eliminación parcial de agua da lugar a la nucleación y cristalización del CO3Ca.30,31 Las endosporas de bacterias son formas de vida que subsisten inactivas bajo condiciones extremas, que pueden sobrevivir durante muchos años en estado latente y resistir altas temperaturas, radiaciones y la presencia de sustancias tóxicas. Las bases moleculares de esta inactividad no es bien conocida, pero el 27 H.A. Lowenstam, S. Weiner. On Biomineralization ; Oxford, University Press: New York, 1989. 28 M.D. Hollingsworth , Science , 2009, 326 , 1194-1195. 29 H. Li, H.L. Xin, D.A. Muller, L.A. Estroff, Science , 2009, 326 , 1244-1247. 30 J. Aizenberg, J. Hanson, T.F. Koetzle, S. Weiner, L. Addadi , J. Am. Chem. Soc ., 1997, 119 , 881-886. 31 A.L. Kulak, P. Iddon, Y. Li, S.P. Armes, H. Cölfen, O. Paris, R.M. Wilson, F.C. Meldrum, J. Am. Chem. Soc ., 2007, 129 , 3729-3736. 16 estado físico del agua en los distintos compartimentos de las esporas se sabe que juega un papel muy importante.32 Así, por ejemplo, cuando se les priva de nutrientes, las bacterias de los géneros Bacillus y Clostridium forman endosporas que pueden sobrevivir en un estado metabólico inactivo durante años y recuperar su forma celular activa en minutos, cuando se restauran las condiciones nutricionales adecuadas (Figura 7). La cavidad central de la espora B. subtilis contiene el genoma, cerca de la mitad del contenido proteínico de la espora y una elevada concentración de calcio y otros cationes divalentes formando complejos con el ácido dipicolínico (DPA), que también se encuentra en elevada cantidad. Las proteínas, así como los iones, se encuentran inmovilizados en la cavidad central, el DPA está próximo al estado sólido y la concentración de agua es muy baja comparada a otros sistemas biológicos. Figura 7. Izquierda: preparación del bacilo Bacilus subtilis en la que se puede diferenciar las endosporas teñidas, en color verde, de las células activas, teñidas de color rojo. Derecha: microfotografía electrónica de transmisión de una endospora de B. subtilis , en la que los distintos compartimentos de la espora se diferencias mediante colores: corazón o cavidad central en rojo, córtex en blanco, y membranas en diferentes tonalidades de verde.32 A la cavidad central le rodea el cortex, el cual está constituido principalmente de glicopéptidos hidratados y es donde se localiza el mayor contenido de agua de la espora. La membrana interior aísla esta cavidad del cortex y está formada, esencialmente, de lípidos que se encuentran inmovilizados y mantienen una permeabilidad muy baja al agua, lo que evita la hidratación de la cavidad central y la difusión de especies iónicas así como de moléculas pequeñas, protegiendo el ADN de la cavidad central de ataques químicos. La membrana exterior, formada por proteínas entrecruzadas, protege las esporas de condiciones externas adversas. 32 G.W Gould, Water and the survival of bacterial spores. En Membranes, Metablism, and Dry Organisms . Ed. A.C. Leopold; Cornell University-Press, Ithaca, 1986, pgs. 143-156. 17 En las esporas, las macromoléculas, así como el resto de los componentes orgánicos e inorgánicos, se encuentran inmovilizados.33 Sólo el agua mantiene una dinámica detectable que varía según sea el compartimiento de la espora en que se encuentre. El contenido en agua en la cavidad central del B. subtilis tiene un valor de ~0.6 h ,34 lo que resulta menos de la mitad del valor estándar (~1.5 h ) de otros sistemas biológicos. Esta concentración tan baja de agua genera una dinámica que se encuentra en la escala de tiempo de 50 ps, que no es suficiente para producir difusión y movilidad translacional y rotacional, susceptible de ser medida, en las proteínas y resto de los componentes orgánicos e inorgánicos. La activación térmica aumenta la dinámica del agua y moviliza el metabolismo. Esto hace más permeable la membrana interior y permite el flujo de agua hacia la cavidad central. El cambio en hidratación ocasiona variación en la estructura del agua e incrementa su dinámica, lo que pone en movimiento todo el sistema metabólico que se encontraba en estado latente, recuperando la forma activa de la célula si el entorno nutricional es favorable. Las esporas de bacterias inhiben, de forma reversible, el metabolismo celular sin más que variar la estructura del agua, lo que ocurre por cambios de temperatura y concentración. Estos son sólo tres, de entre los innumerables ejemplos, que demuestran que las variaciones en la dinámica del agua condicionan las consecuencias químicas y biológicas. Vincular a cambios estructurales del agua las causas que hacen variar el auto-ensamblaje de las moléculas de agua, o los cambios en las propiedades físicas de biominerales marinos, o de la resistencia de formas de vida bajo condiciones extremas, es una investigación de interés general y no sólo una investigación de interés en ciencia básica. Conocer las causas que determinan el ordenamiento y ensamblaje de moléculas es una aportación importante en nanotecnología. Conocer las bases de las propiedades de los biominerales marinos, permitirá profundizar sobre el peligroso aumento de acidez en el mar debido al exceso de CO2, lo que reduce la concentración del 33 E. P. Sunde, P. Setlow, L. Hederstedt, B. Halle, PNAS , 2009, 106 , 19334-19339. 34 El nivel de hidratación se expresa de forma convencional en unidades h , definida como el cociente: gramos de H2O/gramos de proteína seca. El valor medio de un sistema biológico es del orden ~1.5 h . 24 resultante II que no necesita ser aislado. La segunda ruta, definida como Ruta B, fué optimizada en el trabajo de tesis doctoral de la Dra. Natalia Pérez.69 Las tablas 1-3 muestran la totalidad de las moléculas preparadas en este proyecto y que han sido recogidas en la tesis de doctorado del Dr. Martín Febles Barroso.70 La totalidad de los compuestos preparados se cristalizaron bajo las mismas condiciones. Se usó tetracloruro de carbono y éter (etílico o isopropílico) hasta conseguir la disolución del sólido y se añadieron tres-cuatro gotas de agua. Después de agitar, se dejó evaporar lentamente el disolvente hasta la formación de cristales. Los empaquetamientos cristalinos se calcularon de los estudios de difracción de rayos-X en monocristal. La Tabla 1 muestra las moléculas sintetizadas en las que los apéndices presentes en la estructura son cadenas lineales de átomos de carbono. Los compuestos 1-6, 13-15 y 17 dan organizaciones estructurales anhidras. Las moléculas 16 y 18 están pendientes de estudio en estado sólido, ya que cristalizan formando agujas muy finas no válidas para estudios de difracción de rayos-X. Las moléculas 7-12 dan estructuras que incorporan agua en organizaciones que resultan ser pseudoisomorfas formando poros de diámetro variable. El interior de los poros se encuentra relleno de moléculas de agua desordenadas que no están conectadas mediante puentes de hidrógeno a la superficie interna de los poros. 69 Dra. Natalia Pérez Hernández, Tesis Doctoral, 2005, Universidad de Sevilla. 70 Dr. Martín Febles Barroso, Tesis Doctoral, 2007, Unuiversidad de La Laguna. 25 O O I R RCO2H O CO2H O HO CO2H R R CO2H + R R O O O HO R R R R OH HO R R OH I IIIa IIIbII OH CO2Et O O HO IVbIVa CO2Et CO2Et VbVa RutaA Ruta B RM + Esquema 2. Análisis retrosintético de las rutas A y B seguidas en la preparación de compuestos con apéndices alquílicos (Ruta A) o alquénicos y alquínicos (Ruta B). El diámetro interior de los poros disminuye en la dirección (±)7·2H2O a (±)12·2H2O. La Figura 8 corresponde a la estructura y empaquetamiento del compuesto (±)11·2H2O, donde se muestran las moléculas de agua que forman parte del patrón de puentes de hidrógeno que estructura el poro y las moléculas de agua que se organizan en el interior del mismo.71 Las estructuras formadas por los compuestos (±)2, (±)372 y (±)4,73 forman cadenas sencillas en las que los monómeros se unen a través de la función ácido carboxílico para dar dímeros, los cuales se interconectan a través de la función OH del grupo alcohólico en 3, o del oxígeno de la función éter en 2 y 4. 71 M. Febles, N. Pérez-Hernández, C. Pérez, M. L. Rodríguez, C. Foces-Foces, M. V. Roux, E. Q. Morales, G. Buntkowsky, H.-H. Limbach, J. D. Martín J. Am. Chem. Soc. 2006, 218 , 10008- 10009. 72 H. Carrasco, C. Foces-Foces, C. Pérez, M. L. Rodríguez, J. D. Martín J. Am. Chem. Soc. 2001, 123 , 11970-11981. 73 N. Pérez-Hernández, M. Febles, C. Pérez, R. Pérez, M. L. Rodríguez, C. Foces-Foces, J. D. Martín J. Org. Chem. 2006, 71 , 1139-1151. 26 En los compuestos 5 y 6 las uniones entre los monómeros ocurre por interacción entre el ácido carboxílico y el grupo hidroxilo del alcohol.73 El oxígeno del éter no interviene y la organización resultante forma dobles cadenas en (±) 6 y estructura bidimensional en (±)5. De la tercera línea de moléculas de la Tabla 1, sólo han sido estudiados los empaquetamientos correspondientes a las moléculas 13 y 17. En ambos casos, las moléculas se estructuran formando dobles cadenas mediante interacción entre el ácido carboxílico y el alcohol.74 Se estudiaron las estructuras correspondientes a las moléculas 14 y 15, pero los empaquetamientos están aún pendientes de determinar. Tabla 1. Selección de hidroxi-ácidos que poseen apéndices lineales de carbono. Los compuestos enmarcados 7-12 forman, por hidratación, cristales pseudoisomorfos de estructura porosa. Son dos las conclusiones de carácter general que pueden deducirse de los resultados obtenidos de las moléculas que se recogen en la Tabla 1. La primera es que a medida que crece el número de átomos de carbono que forman los apéndices, los monómeros, que forman las cadenas o los agrupamientos bidimensionales, tienden a unirse con participación de la función ácido carboxílico y el alcohol. Así, con la excepción del compuesto (±)1,75 la unión 74 C. Foces-Foces, M. L. Rodríguez, resultados no publicados. 75 C. Ruiz-Pérez, M. L. Rodríguez, J. D. Martín, C. Pérez, P. Morales, J. L. Ravelo Acta Crystallogr. 1990, C46 , 1507-1509. 27 ácido carboxílico-ácido carboxílico, se presenta solo en las moléculas de apéndices más pequeños, compuestos (±)2-(±)4, mientras que a partir de la molécula 5 las uniones observadas se corresponden con ácido carboxílicoalcohol. La segunda conclusión es que la incorporación de moléculas de agua a la estructura parece ocurrir solo en un grupo muy pequeño de moléculas [compuestos (±)7·2H2O al (±)12·2H2O)]. Es muy posible que la estructura formada (±)12·2H2O, sea la de diámetro más pequeño susceptible de ser estudiado por difracción de rayos-X. Así, la estructura del homólogo hidrogenado (±)16 y la de los que poseen un átomo de carbono más en los apéndices, compuestos 17 y 18, o bien forman cadenas anhidras (±)17 o cristalizan dando agujas muy finas no válidas para estudios de difracción de rayos-X en monocristal (16 y 18).76 La movilidad conformacional de los apéndices parece ser también un motivo importante para que la hidratación y formación de poros tenga lugar. En la Tabla 2 se relacionan las moléculas que se han sintetizado y cuyo empaquetamiento se ha estudiado. Todas ellas tienen en común que los apéndices son carbonados y las conformaciones restringidas, por estar ramificadas o formar estructuras cíclicas. Con las únicas excepciones de los compuestos 24 y 28, que se estructuran en cadenas formando, respectivamente, un monohidrato y un hemihidrato,72 el resto de los compuestos cristalizan dando organizaciones anhidras. El compuesto 19 forma cadenas de dímeros por unión de los ácidos carboxílicos.77 76 Cristales no apropiados para estudios de difracción de rayos-X en monocristal. 77 C. Foces-Foces, M. L. Rodríguez, M. Febles, C. Pérez, J. D. Martín Acta Crystallogr. 2005, C61 , 339-342. 28 Figura 8. (a): Estructura molecular del compuesto 11 mostrando la molécula de agua contenida en el patrón de puentes de hidrógeno y que forma parte de la estructura del poro. (b) Contorno del poro formado por seis moléculas del compuesto 11 y seis de agua estructural. En el interior del macrociclo se observan las moléculas de agua que desordenadas rellena el interior del poro Tabla 2. Moléculas con apéndices ramificados y cíclicos que presentan rigidez conformacional. El resto de los compuestos mostrados en la Tabla 2 forman cadenas por unión de las funciones ácido carboxílico y el alcohol. La molécula de mayor peso molecular, el compuesto 30, incluye moléculas de tetracloruro de carbono en su estructura,74 lo que probablemente sea debido a la contribución hidrofóbica de los anillos aromáticos. Los resultados obtenidos con las moléculas que se muestran en la Tabla 2 indican que, al igual que con las moléculas de la Tabla 1, la unión entre el ácido carboxílico y el alcohol se favorece al aumentar el número de átomos de carbono en los apéndices. Quizás la conclusión más relevante sea que la movilidad conformacional de los apéndices es muy importante para que la incorporación de moléculas de agua tenga lugar. La presencia de heteroátomos en los apéndices no parece ser tampoco un factor que favorezca la hidratación. Así, se sintetizaron los compuestos que se (a (b) 29 reúnen en la Tabla 3 y comprobado que, con la única excepción del compuesto 31 que no ha podido estudiarse al no ser cristalino, el resto de los compuestos generan estructuras anhidras, lo que demuestra que la polaridad y presencia de apéndices en estados altos de oxidación, no tiene efecto alguno en la incorporación de moléculas de agua en el empaquetamiento cristalino. Tabla 3. Moléculas con apéndices que contienen heteroátomos en diversa funcionalidad.78 Aunque las seis moléculas: 7-12, referidas en la Tabla 1, forman estructuras porosas isomorfas en cuyo interior, los estudios de rayos-X, muestran densidad electrónica atribuible a moléculas de agua, en este capítulo nos referiremos al comportamiento del agua sólo en las estructuras que forman las moléculas 7 y 11. En estos modelos es donde los estudios del estado sólido han ido más lejos. Además, las diferencias entre los diámetros de los poros: 5.9-9.4 Å en (±)7·2H2O72 y 4.2-6.5 Å en (±)11·2H2O71, es lo suficiente amplia como para establecer, sin ambigüedad y en base a los resultados obtenidos, las diferencias en el comportamiento del agua que se mueve en su interior. Los estudios estructurales y de dinámica que sustentan las conclusiones alcanzadas se realizaron utilizando tres técnicas diferentes de análisis: Difracción de rayos-X en monocristal, RMN en estado-sólido y calorimetría diferencial de barrido (DSC). Las moléculas 7 y 11, las hemos sintetizado como racematos en cantidades de gramos y cristalizado bajo condiciones diversas seleccionando las muestras empleadas para cada estudio. 78 M. L. Rodríguez, M. Febles, C. Pérez, N. Pérez-Hernández, J. D. Martín, C. Foces-Foces Acta Crystallogr. 2005, C61 , 138-142. 30 En este capítulo haremos un estudio paralelo de análisis termogravimétrico (TGA) y de difracción de rayos-X en polvo a temperatura variable (VT-PXRD), sobre las estructuras (±)7·2H2O y (±)11·2H2O para demostrar que, en nuestros modelos, las moléculas de agua ya se muevan libres o se encuentren fijas por enlaces por puente de hidrógeno a la superficie del poro, son estables a temperaturas de hasta 25 ºC, por encima de la cual tienden a salirse del poro de forma irreversible. Veremos que este resultado implica que la superficie interior del poro cambia de hidrofílica a hidrofóbica, lo que es una confirmación experimental de que la coexistencia entre los estados del poro lleno y vacío de agua y la sensibilidad de ambas situaciones a los cambios de temperatura son funcionalmente relevantes.79 Discutiremos también las implicaciones de estos resultados experimentales en el funcionamiento de los sistemas naturales. 79 O. Beckstein, M.S. Samsom, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. , 2003, 100 , 7063-7068. 31 1.2 Antecedentes y objetivos. Hemos seleccionado las estructuras que forman las moléculas racémicas 7 y 11 como modelos químicos donde experimentar mecanismos específicos en el transporte del agua. En ambos modelos de poros la proporción de agua es la misma en su estado inicial; no obstante, el contenido de agua en el poro puede hacerse variar dentro de un amplio rango de temperaturas por debajo de la de ambiente, sin que se altere por ello la estructura del patrón de puentes de hidrógeno que sostiene la arquitectura de los poros. Además, estos poros tienen una rango de diámetros internos que, al menos en el de diámetro menor de estructura (±)11·2H2O, la entrada y salida de agua ha de ser en régimen lineal.71 Existe evidencia experimental sobre la ocupación continuada por agua de cavidades no polares en un régimen de estabilidad termodinámica.80,81 En nuestros modelos coexisten dos tipos aparentemente diferentes de moléculas de agua, las unidas por puentes de hidrógeno a las superficies interna de los poros y las que se mueven libremente en su interior sin vinculación aparente a la superficie interna de los mismos. Este último tipo de moléculas, por estudios de rayos-X pueden visualizarse en las estructuras que forman las moléculas 8- 12, no así en el poro de mayor diámetro (±)7·2H2O.71 La Figura 9 muestra en la estructura (±)11·2H2O, las distancias mínimas entre los máximos de densidad electrónica asociados a moléculas de agua en el poro y el monómero que lo forma. Estas distancias son entre las moléculas de agua y los apéndices no polares existentes en los monómeros. En la estructura (±)7·2H2O, esta medición no es posible al encontrarse el agua más deslocalizada y no poder ser observada por estudios de difracción de rayos-X. No obstante, estas agrupaciones de moléculas responden a topologías susceptibles de ser detectadas en otros tipos de espectroscopias82,83,84,85,86,87,88,89 y son 80 B. Yu, M. Blaber, A.M. Gronenborn, G.M. Clore, D.L. Caspar, Proc Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1999, 96 , 103-108. 81 A.M. Buckle, P. Cramer, A.R. Fersht, Biochemistry 1996, 4298- 4305. 82 K. Liu, J.D. Cruzan, R.J. Saykally, Science 1996, 271 , 929-933. 83 K. Liu, M.G. Brown, C. Carter, R.J. Saykally, Nature 1996, 381 , 501-503. 84 J.D. Cruzan, L.B. Braly, K. Liu, M.G. Brown, J.G. Loeser, R.J. Saykally, Science 1996, 271 , 59-62. 32 responsables de la hidrofilia y permeabilidad que se observa en estos modelos de poros.71 Figura 9. Estructura parcial del poro de referencia (±)11·2H2O, en el que se muestran las distancias mínimas entre el agua que se localiza en su interior y los homólogos que constituyen el poro. Los contactos ocurren entre el agua y los apéndices no polares del compuesto orgánico. Los experimentos de calorimetría diferencial de barrido (DSC) fueron realizados para las dos estructuras bajo las mismas condiciones.71,90 Se sometieron a un rango de temperaturas: 283 K – 363 K y con velocidad de calentamiento de 10 K/min. Antes de someter las muestras a calentamiento se calibraron en el calorímetro a T = 283 K. Se observó, para los cristales del compuesto 7, un solo pico en el rango 326 K – 364 K (Tpico= 350.1 K) correspondiente a una pérdida de masa del 13.6%. Con el fin de estudiar la reversibilidad del proceso, la muestra se sometió a enfriamiento y se realizó un segundo calentamiento, no observándose efecto térmico en ninguno de los experimentos realizados. Este hecho indica que el proceso es irreversible y que la disminución de la masa es causa de la pérdida irreversible de moléculas de agua. Los cálculos teóricos para la pérdida de dos moléculas de agua es del 13.0%, por lo que se concluye que la estructura cristalina se corresponde con un dihidrato: (±)7·2H2O. 85 K. Liu, M.G. Brown, J.D. Cruzan, R.J. Saykally, Science 1996, 271 , 62-64. 86 C.J. Gruenloh, J.R. Carney, C.A. Arrington, T.S. Zwier, S.Y. Freedericks, K.D. Jordan, Science 1997, 276 , 1678-1681. 87 J. Kim, K.S. Kim, J. Chem. Phys. 1998, 109 , 5886-5895. 88 N. Keutsch, R.J. Saykally, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2001, 98 , 10533-10540. 89 K. Nauta, R.E. Miller, Science 2000, 287 , 293-295. 90 Los estudios de DSC fueron realizados por la Dra. Mª Victoria Roux, Instituto de Química- Física Rocasolano, Madrid. 33 El mismo experimento realizado para cristales del compuesto 11, en el intervalo 283 K – 343 K, muestra que la endoterma de deshidratación ocurre en el rango de 310 K – 338 K (Tpico=329.4 K) y corresponde a una pérdida de masa del 11.7%. Como en el caso anterior, el proceso es irreversible y debido igualmente a la pérdida de dos moléculas de agua (el calculado teórico es del 11.9%). Esta estructura se corresponde pues con un dihidrato: (±)11·2H2O. La conclusión a que se llega por estos estudios, es que ambas estructuras son dihidratos y que, en correspondencia a los estudios de difracción, una de las moléculas de agua forma parte del patrón de puentes de hidrógeno que estructura el poro, mientras la otra, ha de estar deslocalizada en el interior del mismo. Esta segunda molécula de agua se observa por rayos-X en la estructura que forma (±)11·2H2O, pero no se detecta en el caso de (±)7·2H2O.71 Los experimentos de DSC a bajas temperaturas se muestran en la Tabla 4 para (±)7·2H2O y en la Tabla 5 para (±)11·2H2O. Para el poro que forma la molécula 7 (Tabla 4), se puede observar que la variación entálpica más importante, definida como modificación 1, ocurre en el intervalo de temperaturas: Tpico= 232.4 K - 246.4 K. El segundo cambio, modificación 2, se observa en el rango: Tpico= 272.4 K - 279.8 K. En el poro correspondiente a la molécula 11, los estudios de DSC muestran un comportamiento similar (Tabla 5). En este caso, la modificación 1 se observa en el rango de temperaturas: Tpico= 201.6 K - 207.4 K, y para la modificación 2, en el de: Tpico= 267.3 K - 270.6 K. 40 secuencia de tres situaciones que incluyen los siguientes pasos diferenciados: ( i ) Entrada de D2O en estado de gas, y sustitución de H2O en el sólido por D2O; ( ii ) intercambio de hidrógeno (protón y/o deuterón) entre el agua y los grupos carboxílicos; ( iii ) intercambio protón/deuterón entre los grupos carboxílicos y los grupos alcohólicos. El intercambio entre las funciones CO2 H y O H ha sido bien establecido que procede a través de un intermedio cíclico.100,101 Por el contrario, el intercambio protón/deuterón entre funciones de alcohol, no pueden ocurrir directamente sino que necesitan la presencia de impurezas ácidas o básicas.104 La figura 11 (derecha) incluye los intermedios que se proponen para la secuencia i ↔ ii ↔ iii que son respectivamente, las estructuras enmarcadas en amarillo: R 2 2 (9), R 2 2 (6) y R 2 2 (6). Figura 11. Izquierda: Propuesta de la secuencia de deuteración en nuestro modelo de poro. Derecha: Supuestos Intermedios: R 2 2 (9), R 2 2 (6) y R 2 2 (6) (sombreados en amarillo). El patrón de puentes de hidrógeno que se propone como estabilizador del defecto que genera la pérdida de una molécula de agua, conecta el hidroxilo del ácido como dador al oxígeno del éter de la molécula adyacente y el 104 D. Gerritzen, H. H. Limbach, Ber. Bunsenges. Phys. Chem. 1981, 85 , 527-535. Intercambio RCOOD/ROH (iii) Intercambio RCOOH/D 2 O (ii) Intercambio H 2 O/D 2 O (i) O O H O C O HO H H O O H O C O HO D D O O H O C O DO D D O O D O C O DO D D Intercambio RCOOD/ROH Intercambio RCOOH/D 2 O Intercambio H 2 O/D 2 O O O H O C O HO H H O O H O C O HO D D O O H O C O DO D D O O D O C O DO D D O O H O C O D C O O H O D D Estados intermedios propuestos Intercambio RCOOD/ROH (iii) Intercambio RCOOH/D 2 O (ii)Intercambio RCOOH/D 2 O (ii)Intercambio RCOOH/D 2 O (ii) Intercambio H 2 O/D 2 O (i)Intercambio H 2 O/D 2 O (i) O O H O C O HO H H O O H O C O HO H H O O H O C O HO D D O O H O C O DO D D O O D O C O DO D D Intercambio RCOOD/ROH Intercambio RCOOH/D 2 O Intercambio H 2 O/D 2 O O O H O C O HO H H O O H O C O HO D D O O H O C O DO D D O O D O C O DO D D O O H O C O DO O H O C O D C O O H O D D Estados intermedios propuestos 41 carbonilo del ácido, como aceptor del hidrógeno del hidroxilo de la función alcohólica. El sistema R 2 2 (9) está presente en algunos de los empaquetamientos anhidros de estos hidroxi-ácidos, por ejemplo, en las estructuras que forman los monómeros (±)33 o (±)40 (Figura 12).74 Figura 12. Empaquetamiento cristalino de los compuestos (±)33 (Izq.) y (±)40 (Der.). Ambos disponen del mismo patrón R 2 2 (9) de puentes de hidrógeno.74 Las Figuras 13-15 ilustran en mayor detalle los movimientos asociados a la propuesta de intercambio H/D. Para el intercambio definido como ( i ), Figura 13, lo primero que ha de ocurrir es que una molécula de agua deje su lugar vacante. Como el patrón de puentes de hidrógeno queda alterado, es concebible que las dos moléculas orgánicas adyacentes se acerquen y estabilicen su situación por formación de enlaces por puentes de hidrógeno entre el ácido carboxílico de una con el oxígeno del éter de la otra. El patrón de puentes de hidrógeno inicial se recupera por inclusión en este intermedio de una molécula de D2O. En el proceso de intercambio ( ii ), una de las moléculas ha de romper dos de sus enlaces, uno con el agua y otro con la molécula orgánica adyacente (Figura 14). Resulta difícil saber si esta interrupción del patrón de puentes de hidrógeno genera o no defecto en el cristal, ya que no se produce vacante, sólo alteración en los enlaces que conforman la estructura. R 2 2 (9) 42 O C O H O O H O C O H O O HO H H O C O H O O H O C O H O O H O H H O C O H O O H O C O H O O HO H H O C O H O O H O C O H O O H O D D O C O H O O H O C O H O O HO H H O C O H O O H O C O H O O H + D 2 O -H 2 O O C O H O O H O C O H O O HO H H O C O H O O H O C O H O O H O H H O C O H O O H O C O H O O HO H H O C O H O O H O C O H O O H O D D O C O H O O H O C O H O O HO H H O C O H O O H O C O H O O HO D D O C O H O O H O C O H O O HO H H O C O H O O H O C O H O O H + D 2 O -H 2 O + D 2 O -H 2 O Figura 13. Intermedio propuesto en el intercambio H 2O/ D 2O. En cualquier caso será un proceso lento, ya que es bien conocido que la presencia de defectos y movimientos moleculares de moléculas orgánicas en el estado sólido son procesos lentos.105 En cualquier caso, el intercambio y deuteración de la función carboxílica ocurre a través del complejo 1:1 formado por el ácido carboxílico y una molécula de agua deuterada. En tal complejo, tiene lugar una doble y rápida transferencia H / D . O C O H O O H O C O H O O HO H H O C O H O O H O C O H O O H O D D O C O H O O H O C O H O O HO H H O C O H O O H O C O H O O HO D H O C O H O O D O C O H O O HO H H O C O H O O D O C O H O O D OD D O C O H O O H O C O H O O HO H H O C O H O O H O C O H O O DOD H O C O H O O H O C O H O O HO H H O C O H O O H O C O H O O H O D D O C O H O O H O C O H O O HO H H O C O H O O H O C O H O O HO D H O C O H O O D O C O H O O HO H H O C O H O O D O C O H O O D OD D O C O H O O H O C O H O O HO H H O C O H O O H O C O H O O DOD H Figura 14. Intermedios propuestos en el intercambio –CO2 H / D 2O. 105 J. J. Titman, Z. Luz, H. W. Spiess J. Am. Chem. Soc. , 1992, 114 , 3756–3765. 43 La situación original se recupera por un giro rápido de 180º del plano que contiene las funciones COOD/DHO.100,101 Intercambios rápidos similares se han observado por 17O-RMN en estado sólido de complejos cíclicos (COOH)2 en el ácido dimetil malónico.106 Después de recuperar el patrón original y repetir intercambios consecutivos ( i ) y ( ii ), todas las moléculas de agua y funciones de ácido carboxílico se encontrarán deuteradas (-CO2D/D2O), no así los hidrógenos de la función alcohol (-CH2OH). La deuteración de la función de alcohol puede ocurrir según el intercambio ( iii ) (Figura15). Para que el proceso ocurra según este protocolo, en primer lugar se ha de crear una vacante de agua entre dos moléculas orgánicas adyacentes. Estas dos moléculas formarán un complejo cíclico 1:1 entre la función carboxílica de una y el hidroxilo del alcohol de la otra, lo que permitiría la rápida transferencia H/D. Esto requiere reorganizaciones importantes entre las moléculas involucradas; dos de las posibilidades que se pueden barajar se dibujan en la Figura 15. Sucesivos intercambios ( i ) y ( ii ) permitirán completar el proceso de deuteración. Los resultados experimentales no verifican que todos los hidrógenos lábiles se intercambien por deuterio, cuando las estructuras dihidratadas de estos hidroxíácidos se ponen en atmósfera de D2O; sin embargo, si son concluyentes en que los intercambios tienen lugar en las funciones presentes a velocidades que resultan equiparables.71 Esto es consistente con que cuanto mayor sea el número de defectos presentes en el sólido, más homogénea resultará la deuteración, ya ocurra ésta de manera secuencial o simultaneada en el tiempo. 106 B. Filsinger, H. Zimmermann, U. Haeberlen Mol. Phys. 1992, 76 , 157-172. 44 O D D O C O H O O H O C O H O O DO D D O C O H O O H O C O H O O DO D D O C O D O O D O C O D O O DO D D O C O D O O D O C O D O O D O C O H O O H O C O H O O HO H H H OC O H O O D O C OO O H ó O C O H O O H O C O H O O DO D D O H O C O H O O D O C O OH O D D O C O H O O H O C O H O O DO D D O C O H O O H O C O H O O DO D D O C O D O O D O C O D O O DO D D O C O D O O D O C O D O O D O C O H O O H O C O H O O HO H H H OC O H O O D O C OO O H O C OO O H ó O C O H O O H O C O H O O DO D D O H O C O H O O D O C O OH OH Figura 15. Intermedios propuestos en el intercambio –CO2 D /-CH2O H . No puede excluirse el intercambio simultaneo COOH/D2O y COOD/ROH mediante los intermedios cíclicos R 2 2 (6) y R 3 3 (8) (Figura 16). El patrón R 3 3 (8) se encuentra presente en el empaquetamiento cristalino del monómero (±)22.72 En cualquier caso, el proceso global será lento y dirigido por la movilidad de los intermedios propuestos. Figura 16. Posible intercambio simultaneo COOH/D2O y COOD/ROH. La viabilidad de esta propuesta se sustenta en la posibilidad de que las moléculas de agua se puedan intercambiar y crear situaciones vacantes sin que ello afecte a la estructura del cristal. Los resultados obtenidos de deshidratación, tanto de datos de termogravimetría como de calorimetría diferencial de barrido, muestran una única dinámica para los dos tipos O D D O C O D O O D O C O D O O DO D D O C O D O O D O C O D O O DO D D O C O D O O D O C O D O O DO D D O C O D O O D O C O D O O D O D D O C O H O O H O C O H O O HO D D O C O H O O H O C O H O O DO D D O C O H O O H O C O H O O O D D O C O H O O H O C O H O O D O O H H O O C O O H O O D O O H C O O H OD D 45 aparentes de agua;71 sin embargo, no ha sido posible hasta la fecha eliminar el agua sin la consecuente destrucción del poro. Con el fin de estudiar el efecto que la eliminación parcial de las moléculas de agua tiene en la estructura del poro, muestras recién cristalizadas de los compuestos (±)7·2H2O (que forma el poro más ancho) y (±)11·2H2O (que forma el poro más estrecho) se sometieron a estudios paralelos de análisis termogravimétricos (TGA) y medidas de difracción de rayos-X en polvo (VTPXRD) a temperatura variable. En la primera serie de experimentos de VT-PXRD, la temperatura se incrementó desde 30 ºC hasta 150 ºC, a una velocidad de 1 ºC/min. Los resultados indican claramente que los sólidos permanecen cristalinos hasta cerca de 100 ºC (Figura 17). Bajo estas condiciones se observó una transición de fase cuando (±)7·2H2O alcanzó una temperatura entre 65 ºC y 70 ºC. 51015 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 T (ºC) 51015 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 2 θ angle 2 θ angle T (ºC) 51015 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 T (ºC) 51015 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 T (ºC) 51015 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 angle 2 angle T (ºC) 51015 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 angle 2 angle T (ºC) (±)7·2H 2 O (±)11·2H 2 O 51015 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 T (ºC) 51015 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 T (ºC) 51015 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 2 θ angle 2 θ angle T (ºC) 51015 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 2 θ angle 2 θ angle T (ºC) 51015 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 T (ºC) 51015 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 T (ºC) 51015 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 angle 2 angle T (ºC) 51015 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 angle 2 angle T (ºC) (±)7·2H 2 O (±)11·2H 2 O Figura 17. Difractogramas de VT-PXRD correspondientes a los patrones de difracción de los compuestos (±)7·2H2O (superior)y (±)11·2H2O (inferior), obtenidos en el rango de temperaturas 30 ºC a 150 ºC a una velocidad de 1 ºC/min. Esta nueva fase permanece hasta una temperatura cercana a 120 ºC, después de la cual la muestra descompone. El difractograma VT-PXRD de la estructura (±)11·2H2O, muestra un transición de fase análoga pero que ocurre a una temperatura inferior, en el rango 50 ºC a 55 ºC. También esta nueva fase cristalina se mantiene hasta una temperatura más baja, ~90 ºC. En el rango 50-55 ºC, la estructura (±)11·2H2O muestra una pérdida casi total de 46 cristalinidad, situación más difícil de observar en el experimento sobre (±)7·2H2O (Figura 17, superior). Esta transición de fase, que ocurre en ambos compuestos, probablemente se corresponde a una reorganización irreversible en las estructura de los poros. La deshidratación de ambas estructuras se estudió por análisis termogravimétrico a una velocidad de incremento de la temperatura de 1 ºC/min (Figura 18). La pérdida de agua desde (±)7·2H2O ocurre en dos pasos bien definidos: el primero entre aproximadamente 28 ºC y 48 ºC , y el segundo inmediatamente después, entre 50 ºC y 85 ºC. La pérdida de peso asociada a cada paso es, respectivamente, de 4.3% y 8.0%, lo que en total está de acuerdo con el valor teórico de 12.9% que corresponde a la pérdida total del agua de la muestra. %Weight 40 80 120 160 200 40 40 80 120 160 200 40 60 80 100 (±)7·2H 2 O (±) 11·2H 2 O T (º C) %Weight 40 80 120 160 200 40 40 80 120 160 200 40 60 80 100 (±)7·2H 2 O (±) 11·2H 2 O T (º C) Figura 18. Curvas de TGA de (±)7·2H2O (en trazo negro) y (±)11·2H2O (en trazo rojo), obtenidos calentando las muestras a 1 ºC/min. Los resultados obtenidos en TGA y VT-PXRD para la estructura (±)7·2H2O permiten llegar a las conclusiones siguientes: La estructura del poro se mantiene hasta un cierto grado de deshidratación. La coincidencia entre el cambio de fase y la pérdida de agua hace pensar en un cambio en la estructura cristalina de hidratada a anhidra. El análisis de la curva de TGA para el compuesto (±)11·2H2O revela un paso de deshidratación inicial entre aproximadamente 28 ºC y 54 ºC que corresponde con una perdida de 6.9% de agua. El agua continúa perdiéndose hasta que se inicia el proceso de descomposición. Una pérdida de 4.4% se calcula entre 55 47 ºC y 125 ºC, lo que resulta una pérdida total del 11.9% que equivale al calculado teórico. La conclusión a que se llega es similar a la que se obtiene para (±)7·2H2O; esto es, que la estructura de (±)11·2H2O permanece estable hasta cierto grado de deshidratación. En esta muestra, sin embargo, no parece tan claro que la fase de transición conduzca a una estructura completamente anhidra, ya que aparentemente colapsa a 90 ºC, antes de que la totalidad del agua se haya eliminado. Estos resultados iniciales permitieron diseñar nuevos experimentos con el propósito de contestar a las cuestiones siguientes: ¿Es posible mantener la estructura inicial del poro intacta después de la deshidratación total o parcial de agua, a pesar de que estas estructuras se forman por la incorporación de agua?; ¿Se pierde el agua en ambas muestras con la misma facilidad?; ¿Es posible eliminar cierta cantidad de agua y rehidratar las muestra con posterioridad? Como quiera que a la transición de fase se llega aumentando la temperatura de forma uniforme, los difractogramas siguientes se hicieron manteniendo ciertas temperaturas fijas durante algún tiempo. Las medidas de TGA de (±)7·2H2O se hicieron aumentando la temperatura a 1 ºC/min, manteniendo la temperatura constante a 40 ºC y a 65 ºC durante media hora cada vez. En el caso de la muestra (±)11·2H2O se sigue el mismo protocolo pero las temperaturas se mantuvieron constantes a 35 ºC y 45 ºC (Figura 19). En ambas muestras, la primera temperatura que se mantiene constante se corresponde con la estructura inicial de los poros y, en estas condiciones, se observa que se puede evacuar aproximadamente la mitad del agua presente en (±)7·2H2O y cerca de dos tercios del agua presente en (±)11·2H2O. 48 (±) 11·2H2O (±)7·2H2O (±) 11·2H2O (±)7·2H2O Figura 19. Curvas TGA obtenidas para (±)7·2H2O (superior) y (±)11·2H2O (inferior), mostrando las perdidas de agua a temperaturas fijas. La deshidratación en (±)7·2H2O coincide con la que se observa para este compuesto en los difractogramas VT-PXRD, aunque los dos pasos consecutivos de deshidratación se corresponden con temperaturas un poco más bajas (Figura 19, superior). En cambio, la pérdida de masa en (±)11·2H2O no ocurre según pasos discretos sino de forma continuada. Aún cuando el mayor porcentaje de agua se elimina entre 25 y 35 ºC, la deshidratación completa no ocurre hasta que se llega a los 90 ºC. Estos resultados confirman que, efectivamente, la estructura inicial del poro se mantiene durante parte de la deshidratación en un caso y hasta la pérdida de la mayoría del agua en el otro. Con el fin de comprobar que el compuesto (±)11·2H2O pierde gran parte del contenido de su agua a una temperatura muy próxima a la de ambiente, se hizo seguimiento de la pérdida de agua por TGA manteniendo la temperatura constante a 30 ºC durante 2 horas. Transcurrido ese tiempo la temperatura se fue elevando lentamente hasta 140 ºC a una velocidad de 1 ºC/min. Bajo estas condiciones la muestra (±)11·2H2O pierde más del 80% del agua. Sin 49 embargo, la deshidratación completa no ocurre hasta que la temperatura alcanza casi los 100 ºC (Figura 20). Figura 20. Curva de TGA obtenida para el compuesto (±)11·2H2O en el que se muestra la eliminación suave del agua (~80% del contenido total) manteniendo la temperatura a 30 ºC durante 2 horas. En el caso de (±)7·2H2O, la deshidratación total ocurre a una temperatura bastante inferior, cerca de 65 ºC, lo que coincide con la temperatura en la que la transición de fase tiene lugar según los difractogramas de VT-PXRD (Figura 15). La diferencia de temperatura entre la deshidratación de uno y otro poro es aproximadamente de 30 ºC, lo que se puede atribuir a que la atracción entre el agua y la superficie es mayor en el poro que forma la molécula 11, es decir el de menor diámetro. Los experimentos de VT-PXRD descritos no repiten las condiciones de cambios de temperatura que se describen en los estudios de TGA, por lo que se adquirieron una nueva serie de difractogramas con nuevas muestras donde estas condiciones se repiten con exactitud. En el caso de (±)7·2H2O la temperatura se mantuvo constante a 45 ºC y 65 ºC y se incrementó con posterioridad a una velocidad de 1ºC/min, hasta alcanzar la temperatura de descomposición de las muestras. En el caso de (±)11·2H2O la temperatura se mantuvo constante a 30 ºC durante 2 horas, seguido de un incremento de temperatura a la velocidad de 1 ºC/min hasta descomposición de la muestra (Figura 21). La transición de fase ocurre en ambas muestras en el mismo rango de temperaturas que anteriormente, aunque la descomposición térmica de las mismas ocurre a temperaturas ligeramente inferiores. Estos resultados ‐56‐ ‐57‐ 2.1 Introducción. Desde hace algunos años, nuestro grupo de investigación trabaja en la idea de que una organización cristalina sustentada por enlaces por puentes de hidrógeno, puede servir de modelo donde investigar el fenómeno biológico del transporte.112 Puede demostrarse, en estos modelos, que las moléculas de agua ocupan los poros de manera permanente y que se puede obtener mayor grado de hidratación sin alterar por ello el patrón de enlaces por puentes de hidrógeno y, por tanto, sin desestabilizar la estructura del poro que las habilita.71 El diseño sintético seguido para la construcción de los modelos se esquematiza en la Figura 23, donde se interpreta la formación de los poros naturales como una consecuencia termodinámica susceptible de ser modelizada en la interfase agua/disolvente no-polar siguiendo un plan de ordenamiento molecular preconcebido.113 Figura 23. (Izquierda) Representación esquemática de la formación de un poro natural. La incorporación de la proteína en la membrana es causa del favorable efecto hidrofóbico que estabiliza las interacciones entre los lípidos de la membrana y la proteína, así como el resultado de hidratación hidrofóbica en el compacto proteínico. (Derecha) La organización en la interfase de moléculas anfifílicas conduce a cadenas que, cuando cumplen los requerimientos estructurales necesarios, se pliegan cumpliendo los mismos principios termodinámicos que conduce a la organización de los poros naturales.113 112 N. Pérez-Hernández, C. Pérez, M.L. Rodríguez, C. Foces-Foces, P.M. Tolstoy, H.H. Limbach, E.Q. Morales, R. Pérez, J.D. Martín, Bioorg. Med. Chem . 2004 , 12 , 1305-1314. 113 N. Pérez-Hernández, M. V. Roux, M. Febles, E.Q. Morales, C. Pérez, D. Fort, J.D. Martín, Z. Phys. Chem . 2008, 222 , 1105-1116. ‐58‐ Resultado de estos estudios es el conjunto de poros hidrofílicos que forman las moléculas 7-12 relacionadas en la Tabla 1 del capítulo anterior, donde la superestructura molecular del poro se sostiene en una relación estequiométrica entre las moléculas orgánicas y las de agua igual para todos ellos (Ec. 1). Esta ecuación representa, formalmente, un método general de síntesis de agrupamientos moleculares que se auto-ensamblan siguiendo una información concreta que se modula en disolución; esto es, antes que la nucleación a sólido tenga lugar. El resultado experimental se puede valorar también, como la síntesis de agrupaciones moleculares de agua a partir de agua líquida. Aunque estas dos conclusiones se pueden estudiar de forma independiente, se ha visto, y el capítulo anterior es un ejemplo, que las moléculas orgánicas y el agua forman un todo y son, en su conjunto, la respuesta a los requerimientos químico-físicos de la consecuencia termodinámica de compensación entalpía/entropía que hace operativa esta ecuación. nM + mH 2 O M n (H 2 O) m = M n + (H 2 O) m (monómeros) (água líquida) (poro hidratado) (poro anhidro) (agregado de água) Ecuación 1 La Ec. 1 es general y no se circunscribe sólo al modelo objeto de nuestro estudio. Puede ser la simplificación de un proceso biológico, por ejemplo, el plegamiento de una enzima o el reconocimiento entre biomoléculas. En estos casos, no se puede tampoco cometer el error de explicar el resultado analizando el comportamiento del material orgánico de forma independiente del agua que lo causa. Las agrupaciones de biomoléculas son datos de biología estructural que resultan incapaces, por si solos, de explicar las causas que dieron lugar a tales agrupamientos. Hemos publicado un modelo de síntesis de poros basados en estos conceptos.113 Una ventaja interesante de nuestros modelos es que, con independencia de cuál sea el monómero que estructure el poro, la relación monómero/agua es la misma y en la serie de estructuras (±)7·2H2O-(±)12·2H2O, esta relación es 1/2, siempre que nos situemos entre los parámetros que limitan el equilibrio representado en la ecuación anterior. Puesto que el número de moléculas de agua es idéntico en todos los poros y los diámetrosde los mismo son distintos, ‐59‐ la estructura del agua confinada difiere de un poro a otro y la dinámica que relaciona las interacciones de las moléculas de agua entre sí y con las paredes de poro, también es diferente. Se calcula que el número promedio de enlaces por puentes de hidrógeno de las moléculas de agua con sus vecinas en agua líquida a 25 ºC es de 3.5.110 Estos enlaces están continuamente sometidos a procesos de ruptura y formación de otros nuevos, en una escala de tiempo que se mide en subpicosegundos. El movimiento promedio asociado a los reagrupamientos de los enlaces de moléculas en agua líquida se calcula entre 0.1-10 ps.114 Cuando las moléculas de agua entran en contacto con macromoléculas tales como las proteínas, el movimiento de las moléculas de agua se ralentiza en más de un orden de magnitud con respecto al que ocurre en agua líquida.115 Un caso similar ha de ocurrir en nuestros poros ya que la dinámica del agua contenida en cada uno de ellos depende de las interacciones de las moléculas de agua entre sí y con la superficie interna de cada poro,116 por lo que podrían evaluarse, en el infrarrojo-lejano, de forma análoga a como se hace el estudio de la dinámica de moléculas de agua en proteínas.117,118 ,119,120 La comprobación experimental de las diferentes dinámicas que ocurren en los poros sintetizados, es el antecedente de la investigación que recopilamos para este capítulo relativo, al efecto director que tiene el agua en la construcción de estructuras en estado sólido y de la enorme influencia que tienen las estructuras locales del agua en el desarrollo de las distintas superestructuras que se sintetizan. 114 I. Ohmine, S. Saito, Acc. Chem. Res. , 1999, 32 , 741-749. 115 S. K. Pal, J. Peon, B. Bagchi, A. H. Zewail, J. Phys. Chem. B , 2002, 106 , 12376-12395. 116 K. Schröck, F. Schröder, M. Heyden, R. A. Fischer, M.Havenith, Phys. Chem. Chem. Phys. , 2008, 10 , 4732-4739. 117 B. Born, S. J. Kim, S. Ebbinghaus, M. Gruebele, M. Havenith, Faraday Discuss. , 2009, 141 , 161-173. 118 S. Ebbinghaus, S. J. Kim, M. Heyden, X. Yu, M. Gruebele, D. M. Leitner, M. Havenith, J. Am. Chem. Soc. , 2008, 130 , 2374-2375. 119 U. Heugen, G. Schwaab, E. Bruendermann, M. Heyden, X. Yu, D. M. Leitner, M. Havenith, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. , 2006, 103 , 12301-12306. 120 S. Ebbinghaus, S. J. Kim, M. Heyden, X. Yu, U. Heugen, M. Gruebele, D. M. Leitner, M. Havenith, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. , 2007, 104 , 20749-20752. ‐60‐ 2.2 Antecedentes y objetivos. En un estudio precedente, cuyos resultados han sido objeto de una reciente publicación,121 se comparan las absorciones en el infrarrojo lejano (FIR) de los dos poros hidratados de menor diámetro, (±)11·2H2O y (±)12·2H2O (4.2-6.5 Å), y el de diámetro mayor (±)7·2H2O (5.9-9.4 Å), con una estructura que aunque hidratada no forma poro (±)28·1/2H2O y las estructuras anhidras (±)17 y (±)25 (Esquema 3). 7; R 1 = R 2 = CH 2 CH 3 11; R 1 = R 2 = CH 2 CH:CH 2 12; R 1 = CH 2 CH:CH 2 ; R 2 = (CH 2 ) 2 CH 3 17; R 1 = R 2 = (CH 2 ) 2 CH:CH 2 25 28 O COOHHOH 2 C R 2 R 1 O COOHHOH 2 C O COOHHOH 2 C 7; R 1 = R 2 = CH 2 CH 3 11; R 1 = R 2 = CH 2 CH:CH 2 12; R 1 = CH 2 CH:CH 2 ; R 2 = (CH 2 ) 2 CH 3 17; R 1 = R 2 = (CH 2 ) 2 CH:CH 2 25 28 O COOHHOH 2 C R 2 R 1 O COOHHOH 2 C O COOHHOH 2 C Esquema 3. Selección de moléculas de las Tablas 1 y 2 utilizadas en este estudio. La Figura 24 (superior) compara los espectros de transmisión de FIR en la región entre 50 y 670 cm-1 de las estructuras formadas por los poros (±)7·2H2O, (±)11·2H2O y (±)12·2H2O con la anhidra (±)17. Por debajo de los 400 cm-1 las estructuras hidratadas que forman poros, en promedio absorben más que la estructura anhidra pero no con diferencias tan notables como para sostener un estudio diferenciador claro. Entre las hidratadas, las que exhiben un mayor confinamiento del agua (poros de diámetro más pequeño) absorben más que la que dispone de más espacio en el interior del poro (poro de mayor diámetro). Estas observaciones están muy de acuerdo con estudios publicados119 en espectroscopia THz, que demuestran que el agua que solvata a la molécula de lactosa tiene un coeficiente de absorción mayor que el agua líquida, en el rango de frecuencias entre 75 y 90 cm-1. El mismo efecto se observa también en el agua de solvatación de proteínas.117,120 El agua de hidratación restringe su dinámica de forma igual que los agregados de agua que se mueven en los poros más estrechos. En la región entre 400 y 570 cm-1, 121 N. Pérez-Hernández, T.Q. Luong, C. Pérez, J.D. Martín, M. Havenith, Phys. Chem. Chem. Phys. , 2010, 12 , 6928-6932. ‐61‐ hay una notable diferencia entre los poros hidratados y la estructura anhidra. Los primeros absorben aproximadamente un 16-24% más que el último. Además, si se compara el espectro de (±)11·2H2O con los de estructuras que no forman poro, (±)17, (±)25 y 28·1/2H2O, se ve también que la absorción de estos últimos es sensiblemente menor que la del poro hidratado (±)11·2H2O (Figura 24, inferior). Esto indica y sin lugar a dudas, que la mayor absorbancia de éste en la región entre 400 y 570 cm-1 es debida al agua de solvatación que se encuentra en el interior de los poros. 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1.0 Transmittance (±)7·2H 2 O (±)12·2H 2 O (±)11·2H 2 O (±)17 100 200 300 400 500 600 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1.0 Transmittance Wavenumber (cm -1 ) (±)25 (±)11·2H 2 O (±)17 (±)28·1/2H 2 O 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1.0 Transmittance (±)7·2H 2 O (±)12·2H 2 O (±)11·2H 2 O (±)17 100 200 300 400 500 600 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1.0 Transmittance Wavenumber (cm -1 ) (±)25 (±)11·2H 2 O (±)17 (±)28·1/2H 2 O Figura 24. Espectros de transmisión FIR, Teraherzios (THz), entre 50-670 cm-1 ~ 1.5-20.3 THz, donde se comparan: (espectro superior) tres poros hidratados y una estructura anhidra y (espectro inferior) un poro hidratado y tres estructuras, una de ellas hidratada, que no forman poros. La Figura 25 compara los espectros de absorción medidos en FIR de los seis compuestos utilizados en este trabajo.121 Los espectros de todos ellos exhiben absorbancia relativamente pequeña, salvo en la región 400-570 cm-1, donde los que forman poros hidratados tienen una absorbancia significativamente mayor que el resto. ‐62‐ Con el fin de comparar los resultados obtenidos con los del agua y el hielo, se midieron las absorbancias del hielo (a -5ºC) y del agua líquida a diferentes temperaturas en el mismo rango de frecuencias. Los resultados se muestran en la Figura 26. La absorbancia del hielo muestra su característico máximo de absorción a 200 cm-1 y un amplio mínimo entre 300 y 500 cm-1. En frecuencias por encima de 500 cm-1 ocurre un incremento muy rápido en la absorción del hielo. Las gráficas mostradas en la Figura 26 coinciden con las publicadas122 para el espectro de absorción del hielo a 100 K en el mismo rango de frecuencias. La absorbancia del agua líquida muestra un pequeño máximo a 150 cm-1 acompañado de un amplio máximo en el rango 400 y 570 cm-1. Una simulación del espectro de absorción FIR123 y datos experimentales usando espectroscopía de transmisión124 predicen similares valores de absorbancia para el rango en estudio. 7·2H2O 11·2H2O 12·2H2O 17 25 28·½H2O 100 200 300 400 500 600 5 10 15 20 25 30 ATR-Absorbance x 103 Wavenumber (cm-1) Figura 25.Espectros de absorción a 20 ºC, en la región FIR comprendida entre 50 y 650 cm-1, de todos los compuestos utilizados en este estudio. 122 J. E. Bertie, H. J. Labbe, E. J. Whalley, J. Chem. Phys. , 1969, 50 , 4501-4520. 123 J. T. Kindt, C. A. Schmuttenmaer, J. Chem. Phys. , 1997, 106 , 4389-4400. 124 C. Robertson, B. Curnutte , D. Williams, Mol. Phys. , 1973, 26 , 183-191. ‐63‐ Ice Water_0°C Water_5°C Water_10°C Water_20°C 100 200 300 400 500 600 20 40 60 80 100 ATR-Absorbance x 103 Wavenumber (cm-1) 0 5 10 15 20 0 1 2 ATR-Absorbance x 103 Temperature (°C) Figura 26. Espectro que mide la absorbancia del hielo y la dependencia del agua líquida con la temperatura en el rango de temperaturas 0 a 20 ºC. Se resalta, dentro de la figura, el cambio de absorbancia para el agua líquida en el rango 400 a 570 cm-1 a distintas temperaturas (0, 5, 10, 20 ºC), comparada con la correspondiente a 0 ºC. La absorbancia del agua líquida crece de forma casi lineal cuando la temperatura se incrementa. Una comparación con las medidas obtenidas en nuestros poros, demuestra que la causa de la absorbancia que se observa, en el rango de frecuencias referido, es debida al agua que se encuentra atrapada en los poros. Además, tal y como se muestra en la gráfica que se incluye en el interior de la Figura 26, la absorbancia del agua líquida aumenta cuando lo hace la temperatura, de acuerdo con datos experimentales previos que se obtienen haciendo medidas de transmisión.125 El incremento es prácticamente lineal y del orden 1.1×10-4 por cada grado centígrado. Con el fin de comparar las similitudes y diferencias del agua confinada en los poros con el agua líquida, se midieron en el mismo rango de temperaturas, entre -5 ºC y 20 ºC, los espectros de las seis estructuras del estudio. La Figura 27 muestra los espectros del poro hidratado (±)11·2H2O y el compuesto anhidro(±)17. Las estructuras, a pesar de que las moléculas son similares tienen un comportamiento muy diferente. Mientras que la absorbancia del compuesto anhidro (±)17 no cambia con la temperatura (Figura 27, inferior), la absorbancia del compuesto (±)11·2H2O aumenta de forma constante con la 125 H. R. Zelsmann, J. Mol. Struc. , 1995, 350 , 95-114. ‐64‐ temperatura, especialmente en el rango de frecuencias entre 400 y 570 cm-1, exactamente lo mismo que en el agua líquida. Figura 27. (Izquierda) Dependencia del espectro de absorción del hidrato (±)11·2H2O con la temperatura, en el rango entre -5 ºC y 20 ºC (espectro superior), y un estudio equivalente para la estructura anhidra no porosa (±)17 (espectro inferior). Se observa, para la estructura hidratada, un incremento característico similar al encontrado para el agua en el rango de frecuencias entre 400 y 570 cm-1. Mientras que la absorbancia en (±)11·2H2O se incrementa de manera uniforme con la temperatura, el compuesto (±)17 se mantiene independiente de los cambios de temperatura en el rango estudiado.(Derecha) Ampliación de los espectros en la zona de frecuencias: 400 - 570 cm-1. Esta observación es un fenómeno general que ocurre en todos los modelos que se estudiaron; esto es, independencia de la absorbancia con la temperatura en los compuestos que no mantienen estructura porosa y dependencia de la absorbancia con la temperatura cuando la estructura es de poro hidratado. Estos resultados reafirman la asignación hecha de que la absorbancia en el rango 400-570 cm-1 se debe al agua enclaustrada. La Figura 28 muestra un estudio comparativo entre los compuestos (±)7·2H2O, (±)11·2H2O y (±)17 con el agua líquida, en el rango de frecuencias entre 400 y 570 cm-1. El cambio en absorbancia del poro (±)7·2H2O (de diámetro 5.9-9.4 Å) es muy similar al que se observa para el agua líquida. El cambio es también mayor al observado para (±)11·2H2O (de diámetro 4.2-6.5 Å). Esta 11·2H2O_-5°C 11·2H2O_0°C 11·2H2O_5°C 11·2H2O_10°C 11·2H2O_20°C 100 200 300 400 500 600 5 10 15 20 25 ATR-Absorbance x 103 Wavenumber (cm-1) 17_-5°C 17_0°C 17_5°C 17_10°C 17_20°C 100 200 300 400 500 600 5 10 15 20 25 ATR-Absorbance x 103 Wavenumber (cm-1) -5°C 0°C 5°C 10°C 20°C 400 440 480 520 560 10 15 20 25 17 11·2H2O ATR-Absorbance x 103 Wavenumber (cm-1) ‐65‐ observación no es particular para estas dos estructuras, sino que se observa de forma general el mismo efecto en todas las muestras estudiadas. 0°C 5°C 10°C 20°C 400 440 480 520 560 Liquid water 7·2H2O 11·2H2O 17 ATR-Absorbance Wavenumber (cm-1) Figura 28. Comparación con el agua líquida de la variación de la absorbancia con la temperatura de los compuestos con estructura de poros hidratados, (±)7·2H2O y (±)11·2H2O, y la estructura anhidra (±)17. El estudio demuestra que cuanto menor es el confinamiento del agua, poro de diámetro más largo, mayor es el parecido con el agua líquida de la ganancia en absorbancia con la temperatura. Esta investigación permite hacer, de manera experimental, una valoración cualitativa de la dinámica del agua y su dependencia con el diámetro del poro. Demuestra también la sensibilidad de la espectroscopía FIR como metodología para medir agua en el interior de estructuras a nivel de sub-nanoporos. La conclusión de este estudio experimental se resume en las gráficas que se muestran en la Figura 29, donde se comparan las variaciones de la absorbancia con la temperatura en todos los modelos elegidos para el estudio. En el caso de (±)7·2H2O se obtiene un incremento lineal aproximado a 1.0×10-4 por 1 ºC. Es muy similar al que se obtiene para el agua líquida. Cuando los poros son mas estrechos, (±)11·2H2O y (±)12·2H2O, el incremento en absorbancia que exhiben es menor. Las moléculas de agua en estos poros mantienen una "dinámica" superior a la de las moléculas de agua en el hielo, pero inferior a la del agua líquida y a la contenida en el poro (±)7·2H2O. Por tanto, su absorbancia es menos dependiente de la temperatura que la del agua líquida. ‐72‐ simulados reversibles de ensamblaje de nanotubos de carbono de diámetros diferentes en agua.132 Durante la preparación de las muestras para los estudios de SEM, resultó muy difícil orientar los tubos de forma que quedaran los más perpendicular posible y en la dirección en que se efectúa la visión, por lo que es difícil saber por esta técnica si los huecos se extienden totalmente o no a través de los poros. Figura 31. Imágenes SEM de baja resolución de tubos preparados de (±)11 mostrando la destrucción parcial que produce la técnica. (A) Poro poligonal, (B) poro octogonal, (C) poros hexagonales, (D) poro altamente destruido por excesiva exposición al bombardeo electrónico. Las imágenes en microscopia óptica de los tubos colocados en orientación vertical, confirman, plenamente, las estructuras tubulares de las muestras, al tiempo que muestran la muy pobre definición y elevada irregularidad en las formas de los huecos (Figura 33). 132 J. Zou, B. Ji, X. Q. Feng, H. Gao, Nano Lett. 2006, 6 , 430-434. ‐73‐ Figura 32. Imagenes SEM de baja resolución de tubos formados por (±)11 que muestran la inserción de un poro de menor diámetro en otro de diámetro mayor. La formación espontánea de cristales de moléculas orgánicas formando tubos, es poco usual pero no desconocida, y son varios lo mecanismos descritos para justificar su formación.133,134,135 Figura 33. Microscopía óptica de imágenes de tubos de (±)11 de diferentes diámetros vistas desde una posición vertical. Las imágenes (A-C) muestran la base hexagonal de la mayoría de las estructuras tubulares. El tamaño de los huecos interiores varía de un cristal a otro y la forma es muy irregular. (D) Visión superior de un cristal sólido donde se puede observar, justo en el centro de la base, la formación incipiente del poro. (E y F) Visión con luz de transmisión donde se puede apreciar el alto grado de desorden y falta de cristalinidad que existe en las bases de los prismas y poros. Cada uno de los mecanismos propuestos se basan en las particularidades de las estructuras químicas de las moléculas que forman los tubos. Así, la mayoría de los tubos que se forman desde estructuras orgánicas disponen de poro interior con una perfecta geometría circular como la de los nanotubos de carbono; por ejemplo, los tubos de péptidos amiloides,136,137 lípidos,138,139,140,141 ácidos 133 Y. Yin, R. M. Rioux, C. K.Erdonmez, S. Hughes, G. A. Somorjai, A. P. Alivisatos, Science 2004, 304 , 711-714. 134 X. Zhang, X. Zhang, W. Shi, X. Meng, C. Lee, S. Lee, Angew. Chem. Int. Ed. 2007,41525- 1528. 135 J. Park, H. Zheng Y.-w. Jun, A.P. Alivisatos, J. Am. Chem. Soc. 2009, 131 , 13943-13945. 136 K. Lu, J. Jacob, P. Thiyagarajan, V. P. Conticello, D. G. Lynn, J. Am. Chem. Soc. 2003, 125 , 6391-6393. 137 H. Yokoi, T. Kinoshita, S. Zhang, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2005, 102 , 8414-8419. 138 J. M. Schnur, Science 1993, 262 , 1669-1676 ‐74‐ biliares,142 o derivados de glutamato,143 lo que sugiere características intrínsecas comunes de estas moléculas, todas ellas de naturaleza anfifílica, que operan en la organización de sus auto-ensamblajes. Cuando se siembra una solución de CCl4/H2O saturada de (±)11 con un cristal pequeño de forma tubular, el crecimiento lineal del cristal continúa aunque muy lentamente. Con el fin de estudiar el proceso de formación del tubo y de la evolución de su morfología con el tiempo, se hizo un estudio detallado que se siguió por microscopía óptica. La alta transparencia de los cristales permite observar el crecimiento de las oquedades mediante visión lateral de los mismos (Figura 34). Figura 34. Evolución temporal de la morfología de cristales de (±)11 en disolución: Las imágenes son de microscopía óptica y la visión es lateral. (A-C) muestras diferentes de semitubos obtenidas después de un crecimiento de 6-12 horas. Interesante observar la simetría de los semi-tubos en su etapa de formación. (D)Visión vertical de los fragmentos de ruptura del cristal de la microfotografía (A) sobre el lugar indicado por las flechas azules que muestra que el poro aún no se ha formado en la zona donde se produce el corte. (E) Semi-tubo de la microfotografía (B) después de 1-2 días de ser repuesto en la disolución. (F) La misma operación del cristal de la microfotografía (C) recolocado en la disolución y mantenido por un tiempo extra de una semana. En (E) y (F) el hueco de los poros los marca el color azul más intenso, las flechas amarilla señalan, en ambos casos, el grosor de las paredes de los poros. 139 J. Fuhrhop, W. Helfric Chem. Rev. 1993, 93 , 1565-1582. 140 M. S. Spector, K. R. K. Easwaran, G. Jyothi, J. V. Selinger, A. Singh, J. M. P. Schnur, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1996, 93 , 12943-12946. 141 Y. Zhao, N. Mahajan, R. Lu, J. Fang, Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A 2005, 102 , 7438-7442. 142 D. S. Chung, G. B. Benedek, F. M. Konikoff, J. M. Donovan Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1993, 90 , 11341-11345. 143 N. Nakashima, S. Asakuma, T. Kunitake, J. Am. Chem. Soc. 1985, 107 , 509- 510. A B C EF D ‐75‐ Figura 34(A-C), semi-tubos obtenidos después de 6-12 horas. Es importante hacer resaltar la simetría, marcada por el color más intenso en las zonas perforadas de los cristales que forman semi-tubos. Es posible que estos tipos de cristales se hayan obtenido con anterioridad, aunque sin ser reconocidos, debido a la dificultad de distinguir, en cristales pequeños, los tubos de los prismas sólidos. La micro-fotografía 34(D) muestra en orientación vertical los fragmentos producto de cortar el semi-tubo 34(A) en la zona indicada por las flechas azules. Se puede observar la ausencia de poro en la sección del corte. La Figura 34(E) muestra al semi-tubo 34(B) depués de dos días más en la disolución. La Figura 34(F) se corresponde con el cristal 34(C) después de una semana más en disolución. Desde un punto de vista teórico,144 el mecanismo de formación de estos cristales implica el conocimiento previo de las situaciones que limitan el equilibrio. Sin embargo, sobre las bases de la información experimental acumulada, proponemos una aproximación mecanística basada en la propuesta145,146,147,148 “disolver y crecer”, que acredita la formación de estructuras porosas en especies iónicas por intercambio de contra-ión. La “disolución” comienza en los centros de las superficies de ambas bases del prisma y continúa hacia el interior a lo largo del eje del prisma, lo que gradualmente, convierte, al “crecer”, los prismas sólidos en semi-tubos y finalmente en tubos (Figura 35). La naturaleza hexagonal del prisma proviene de la simetría del monocristal formado por apilamiento de anillos hexaméricos de las moléculas orgánicas que configuran el cristal de estructura (±)11·2H2O [Figura 35(A)]. La hidratación y el empaquetamiento cristalino presente en (±)11·2H2O no se altera en la formación de los tubos, lo que se confirma en los difractogramas de difracción de rayos-X en polvo. 144 Y. Saito, 1996, Statistical Physics of Crystal Growth , Oxford: Oxford University Press. M. Ohara, R. C. Reed, 1973, Modelling Crystal Growth Rates from Solution , Englewood Cliffs, NJ: Prentice-Hall. 145 F. Li, Y. Ding, P. Gao, X. Xin, Z. L. Wang, Angew. Chem. Int. Ed . 2004, 43 , 5238-5242. 146 Ch.-J. Jia, L. D. Sun, Z.-G. Yan, L.-P. You, F. Luo, X.-D. Han, Y.-Ch. Pang, Z. Zhang, Ch.-H. Yan, Angew. Chem. Int. Ed . 2005, 44 , 4328-4333. 147 A. Wei, X. W. Sun, C. X. Xu, Z. L. Dong, Y. Yang, S. T. Tan, W. Huang, Nanotechnology 2006, 17 , 1740-1744. 148 Y. S. Zhao, J. Xu, A. Peng, H. Fu, Y. Ma, L. Jiang, J. Yao, Angew. Chem. Int. Ed. 2008, 47 , 7301-7305. ‐76‐ Los defectos que mayormente se observan en el centro de las superficies basales, son consecuencia de la pérdida de cristalinidad que ocurre por difusión de moléculas de agua desde estas superficies. Como ocurre en la interfase hielo-aire, en la interfase sólido-disolución las moléculas de agua sólo están en la superficie del sólido parcialmente coordinadas a las moléculas orgánicas, lo que facilita su difusión. La pérdida de las moléculas de agua de las superficies basales del sólido deja en mayor libertad las moléculas orgánicas que tienden a “redisolverse” en la disolución, al tiempo que generan pérdida de cristalinidad y defectos en las superficies que forman las bases de los prismas. Como consecuencia se crea mayor concentración de moléculas orgánicas, que se localiza sobre las superficies desde donde se han disuelto y recristalizan sobre zonas que ofrezcan mayor cristalinidad, esto es, los bordes de la superficie basal, o dan lugar a la generación de nuevos estructuras sobre la superficie exterior del prisma [Figura 35(B)]. Este proceso de “disolución-recristalización” da lugar a la formación de los huecos, que se inician desde ambas bases del prisma, y al crecimiento de las paredes laterales o creación de anillos exteriores, que conducen a un aumento del diámetro externo del cristal [Figura 35(B-D)]. Pero ¿qué es lo que sincroniza el crecimiento simétrico en las dos direcciones? La respuesta es, nada. El crecimiento viene conducido por las concentraciones locales que se organizan sobre las bases de los prismas, por lo que el desarrollo de ambos terminales resulta idéntico en cada cristal y diferente entre cristales distintos. Este mecanismo explica varias de las particularidades que se observan, por ejemplo, la formación de tubos concéntricos donde el tubo interior moldea la formación del exterior (Figura 32), o la gran diversidad de cristales que se originan en cada cristalización debido a que los cristales crecen según concentraciones particulares a cada uno de ellos. La agitación esporádica de la disolución conduce a la homogeneidad de los cristales debido a la eliminación de concentraciones locales. ‐77‐ Prisma sólido Macroporo A B Subnanoporos Microporo C ≡ Subnanoporos Prisma sólido Macroporo A BB Subnanoporos Microporo C ≡ Subnanoporos D Figura 35. (A) (Izquierda) Empaquetamiento estructural de (±)11·2H2O, se selecciona el apilamiento de cuatro anillos formados por hexámeros moleculares. (Derecha) Representación esquemática del ensamblaje de cuatro anillos. (B) Ilustración esquemática del proceso de “disolución-cristalización”. (C y D) Representaciones esquemáticas que muestran visión superior y lateral del crecimiento: prisma→ semi-tubo→tubo. El “crecimiento” en la dirección del eje del prisma ocurre durante la primera etapa de construcción de los semi-tubos. Hay un momento en que las longitudes de las superficies laterales comienzan a disminuir y las nuevas ‐78‐ cristalizaciones ocurren sobre estas superficies, produciendo un ensanche del tubo [(Figura 35(D)]. Los cristales más largos se corresponden siempre con semi-tubos [Figura 30(A)]. ‐79‐ 2.5 Material complementario A continuación se adjuntan las Figuras C1-C5 que visualizan en mayor detalle los aspectos estructurales que se resaltan en las Figuras 30-34 del texto. Figura C1. Imágenes fotográficas de cristales formados por crecimiento de (±)11·2H2O. La naturaleza de los tubos y semitubos se puede distinguir con claridad a simple vista ‐80‐ Figura C2. Cristales separados sin selección previa. Se puede observar la gran variedad de estructuras tubulares presentes en una cristalización y la transparencia de los cristales ‐81‐ Figura C3. Imágenes SEM en baja resolución de las estructuras tubulares sin la protección previa de las muestras con una capa de oro. Se puede observar el alto deterioro que ocasiona el someter las muestras al bombardeo electrónico. ‐88‐ 3.2 Aislamiento y Purificación La recolección de esponja Crambe crambe se realizó en el Parque Natural del Estrecho en junio de 2008, en la Punta de Tarifa, buceando a 30-40 metros de la costa y a una profundidad de 12-15 m. La esponja se colocó en acetona, en el mismo barco, y conservó a baja temperatura en el laboratorio (4 ºC). Después de maceración con acetona (48 horas por 3 veces, hasta agotamiento) se realizó una disolución/suspensión en agua y se extrajo con n -butanol. Las fases orgánicas combinadas se secaron sobre sulfato de magnesio, se filtró a través de placa filtrante y se llevó a sequedad. Se obtuvo un residuo seco de 102 g. El residuo se purificó por sucesivas cromatografías que se esquematizan a continuación. Todas las fracciones obtenidas se siguieron por TLC en sílica, desarrolladas con n -butanol:ácido acético:agua (6:1.5:2.5; v/v/v) y reveladas por inmersión en solución de fosfomolíbdico al 10% en etanol, y posterior calentamiento. El producto buscado tiene un Rf de 0.45. (1) Columna Sephadex LH-20 (Sigma-Aldrich)  Características de la columna Longitud: 66 cm Diámetro interno: 4 cm Vol. Total: 829 mL Vol. Elución (60% VT): 498 mL Vol. Frac.: 20 mL Vol. muestra: 20 mL Flujo: 3 mL/m Extracto: 2.1 g Eluyente: MeOH Vol. muerto: 300 mL Se reunieron las fracciones que, según la TLC correspondiente, contenían el producto deseado. ‐89‐ (2) Columna semipreparativa μ-Bondapak RP18 (Waters)  Características de la columna Partícula: 10 µm (diámetro medio de partícula) Dimensiones: (7,8 x 300 mm) Flujo: 1,55 mL/min Detección: UV a 230 nm Eluyente: MeOH : NaCl (0,1M); (9 : 1) Muestra: 184 mg disuelta en 1,5 mL de MeOH Inyección: 100 µL Se obtuvo el siguiente cromatograma para cada inyección: Cromatograma 1. Cromatograma obtenido luego de las 2 primeras columnas. Recolectamos a partir del minuto 5 hasta el minuto 15, tomando fracciones cada 30 seg. Cada fracción fue llevada a sequedad en rotavapor, con lo cual aparece un precipitado de color blanco, debido al NaCl. Se le añaden 2 mL de CHCl3 y se filtra a través de un ACRODISC GHP de 25 mm y 0.2 µm de luz (Waters) a un vial de 2 mL, que se lleva a sequedad en corriente de nitrógeno. Se reunieron las fracciones que, según la TLC correspondiente, contenían el producto deseado. ‐90‐ (3) Columna Xbridge RP 18 (Waters)  Características de la columna Partícula: 5 µm (diámetro medio de partícula) Dimensiones: 10 x 250 mm Flujo: 5 mL/min Detección: UV a 212 nm Eluyente: Gradiente de MeOH : NaCl 0,1M Muestra: 100 mg disuelta en 2 mL de MeOH Inyección: 100 µL Gradiente: Tiempo Flujo %A %B %C %D Curva --- 5 60 0 40 0 --- 1 5 60 0 40 0 6 45 5 75 0 25 0 6 45.10 5 60 0 40 0 6 60 5 60 0 40 0 6 Se obtuvo el siguiente cromatograma para cada inyección: Fracción 1 Fracción 2 Fracción 3 Cromatograma 2. Cromatograma obtenido luego de la 3er columna. ‐91‐ Se obtuvieron tres fracciones cuyos cromatogramas se muestran a continuación. Cada fracción se sometió al mismo procedimiento de concentración, disolución en CHCl3 y filtrado que el descrito anteriormente para las fracciones obtenidas en la columna semipreparativa. Los cromatogramas que siguen se realizaron en una columna Xbridge pero de dimensiones analíticas (3,5 x 150 mm) y en las mismas condiciones que las de la semipreparativa indicada anteriormente, inyectando en este caso 5 µL. Fracción 1Blanco Fracción 2 Fracción 3 12 mg 47,5 mg 18,6 mg Cromatograma 3. Cromatograma de cada fracción obtenida. En la Fracción 2 se obtuvieron 57 mg de muestra que fueron utilizados para los experimentos que se describen a continuación. ‐92‐ 3.2.1 Estabilidad de la muestra La muestra obtenida, seca y guardada a temperatura ambiente, permanece inalterada con el tiempo. A continuación se muestran dos espectros de RMN de protón de la misma muestra realizados el 22 de abril de 2009 y el 4 de diciembre de 2009 (Figura 38): 22-04-2009 0.05.010.0 04-12-2009 0.05.010.0 Figura 38. Espectros de RMN de protón de la muestra. ‐93‐ 3.3 Caracterización Las crambescidinas 816 y 800 presentan un núcleo de guanidina pentacíclica unido por una cadena lineal de ω-hidroxi ácido a una unidad de hidroxiespermidina. La crambescidina 816 contiene un oxígeno adicional, que forma un alcohol sobre el carbono 13, respecto de la crambescidina 800. Extensos estudios de RMN han demostrado que la configuración relativa de los núcleos pentacíclicos de las crambescidinas 816 y 800 son idénticos.149 La configuración absoluta del núcleo pentacíclico de la crambescidina-816 se determinó por degradación oxidante,150 mientras que la configuración absoluta del carbono 43 de la cadena de espermidina fue asignada mediante el método de Mosher.149b 3.3.1 Resonancia magnética nuclear de 1H y 13C Las señales de 1H y 13C correspondientes a las posiciones 1-34, 38, los protones guanidínicos y el protón hidroxílico sobre el carbono 13 (ver Figura 39) de la crambescidina-816 se asignaron en base a experimentos de RMN mono- y bidimensional de la muestra. Las señales restantes no se pudieron asignar. Estas asignaciones realizadas concuerdan con los datos presentes en la bibliografía,149a,151 excepto para la posición 16 (Tabla 6). 3.3.1.1 Experimentos monodimensionales:  1H-RMN Secuencia utilizada: zg30 , con 30º flip angle (ángulo de aleteo).  13C-RMN Secuencia utilizada: zgpg30 , desacoplado ( power-gated) con 30º flip angle (ángulo de aleteo).  DEPT135 Secuencia de transferencia de polarización desacoplando durante la adquisición. 149 (a) E. A. Jares-Erijman, R. Sakai, K. L. Rinehart, J. Org. Chem. 1991, 56 , 5712–5715. (b) R. G. S. Berlinck, J. C. Braekman, D. Daloze, I. Bruno, R. Riccio, S. Ferri, S. Spampinato, E. Speroni, J. Nat. Prod. 1993, 56 , 1007–1015. 150 E. A. Jares-Erijman, A. L. Ingrum, J. R. Carney, K. L. Rinehart, R. Sakai, J. Org. Chem. 1993, 58 , 4805–4808. 151 K. J. Rinehart, E. A. Jares-Erijman, US Patent 5,576,734. ‐94‐ 3.3.1.2 Experimentos bidimensionales:  COSY Secuencia utilizada: cosygpmfph , de correlación homonuclear, sensible a la fase que utiliza gradientes para la selección de caminos de transferencia de coherencia.  HSQC Secuencia utilizada: hmqcgpqf , de correlación heteronuclear; desacopla durante la adquisición y utiliza gradientes para la selección de caminos de transferencia de c  oherencia.  HMBC Secuencia utilizada: hmbcgpndqf , de correlación heteronuclear optimizada para acoplamientos a larga distancia; no desacopla durante la adquisición y utiliza gradientes para la selección de caminos de transferencia de coherencia.  NOESY Secuencia utilizada: noesygpph , de correlación homonuclear a través de acoplamientos dipolares, sensible a la fase y que utiliza gradientes durante el tiempo de mezcla.  TOCSY Secuencia utilizada: mlevph , de correlación homonuclear ( Hartman-Hahn) con bloqueo de spin y sensible a la fase. 23 33 31 24 27 28 35 34 38 37 32 36 40 45 44 43 39 41 42 25 26 29 30 N N H N HO O HRO O 1 2 3 4 7 6 8 5 910 11 12 14 13 21 17 16 15 18 22 19 20 N O NH2 OH NH2 Cl R = OH, crambescidina 816 R = H, crambescidina 800 Figura 39: Estructura y numeración de las crambescidinas 816 y 800. ‐95‐ Una simple observación de la estructura del “núcleo” nos permite diferenciar tres sistemas de spin (cadenas azul, roja y verde) (Figura 40). N N H N H OO OH H O HO R Cl Figura 40. Tres sistemas de spin en el “núcleo” de crambescidina-816. En dicho sistema se observan cuatro protones aislados (singletes). La estrategia aplicada es la selección de una señal característica para el comienzo de la asignación y, en base a los espectros mono y bidimensionales, asignar señales de 1H y 13C de cada sistema de spin . Luego se correlacionan los sistemas de spin mediante experimentos de HMBC y NOESY. Aplicando la estrategia anteriormente descrita se realizó una asignación de la crambescidina-816. En la Tabla 6 se detallan los valores asignados y se comparan con los valores reportados en la literatura. ‐96‐ Asignación propuesta δ (ppm) δ (ppm) H-1 0.87 (t, 7.2 Hz) C-1 10.1 H-2a H-2b 1.58–1.50 (m) 1.50–1.43 (m) C-2 29.0 H-3 4.53–4.46 (m) C-3 71.2 H-4 5.51–5.44 (d, 11.0 Hz) C-4 133.6 H-5 5.71–5.63 (t, 8.6 Hz) C-5 129.8 H-6a H-6b 2.39–2.26 (m) 2.23–2.18 (m) C-6 23.4 H-7a H-7b 1.98–1.90 (m) 2.51–2.40 (m) C-7 37.0 – – C-8 83.5 H-9a H-9b 2.59–2.52 (m) 1.48–1.38 (m) C-9 36.9 H-10 4.36–4.24 (m) C-10 52.4 H-11a H-11b 2.39–2.26 (m) 1.58–1.50 (m) C-11 29.5 H-12a H-12b 2.20–2.11 (m) 2.09–1.99 (m) C-12 37.2 OH 5.82 (s) C-13 88.6 H-14 3.36 (s) C-14 54.5 – – C-15 83.0 H-16a H-16b 2.39–2.26 (m) 1.35–1.19 (m) C-16 29.1 H-17a H-17b 1.83–1.71 (m) C-17 18.1 H-18a H-18b 1.67–1.58 (m) C-18 32.1 H-19 4.15–4.02 (m) C-19 68.8 H-20 1.10 (d, 6.0 Hz) C-20 21.4 – – C-21 148.1 – – C-22 167.1 H-23 4.15–4.02 (m) C-23 65.9 H-24 1.67–1.60 (m) C-24 28.4 H-25 1.37–1.28 (m) C-25 25.8 H-26– H-34 1.28–1.20 (m) C-26– C-34 – – C-38 175.5 J. Org. Chem. 1991, 56 , 5712–5715 δ (ppm) δ (ppm) H-1 0.88 (t, 7.0 Hz) C-1 10.1 H-2a H-2b 1.65 (m) 1.45 (ddq) C-2 29.0 H-3 4.47 (br d, 10.0 Hz) C-3 71.2 H-4 5.50 (br d, 11.0 Hz) C-4 133.6 H-5 5.72 (br t) C-5 129.7 H-6a H-6b 2.37 (m) 2.19 (m) C-6 25.8 H-7a H-7b 1.95 (m) 2.40 (m) C-7 36.8 – – C-8 83.5 H-9a H-9b 2.65 (dd, 13.0, 4.5 Hz) 1.44 (t, 13.0 Hz) C-9 36.8 H-10 4.29 (m) C-10 52.4 H-11a H-11b 2.41 (m) 1.60 (m) C-11 29.7 H-12a H-12b 2.20 (m) 2.00 (m) C-12 36.8 OH – C-13 88.6 H-14 3.46 (s) C-14 54.4 – – C-15 83.0 H-16a H-16b 1.87 (m) 1.65 (m) C-16 41.5 H-17a H-17b 1.70 (m) 2.00 (m) C-17 18.0 H-18a H-18b 1.35 (m) 1.72 (m) C-18 32.0 H-19 3.96 (m) C-19 68.7 H-20 1.12 (d, 6.5 Hz) C-20 21.4 – – C-21 148.0 – – C-22 167.1 H-23 4.15 (t, 6.5 Hz) C-23 65.9 H-24 1.62 (m) C-24 28.4 H-25 – C-25 25.8 – – – – – – C-38 175.4 Tabla 6 Desplazamientos químicos de 1H y 13C de crambescidina-816. ‐97‐ Espectro 1. 1H RMN de la muestra de Crambe crambe. ‐104‐ 3.3.4 Espectroscopía de infrarrojo IR [ _  (cm–1), neat]: 3450–3050 (s, N–H, O–H), 2967 (s, as CH3), 2926 (s, as CH2), 2854 (s, s CH2), 2050 (w), 1735 [s, C(=O)–O], 1646 [s, C(=N)–N, C(=O)–N], 1615 [s, C(=N)–N], 1464 (s, s CH2), 1261 [s, as C–C(=O)–O], 1089 (s, C–O), 1015 (s, C–O), 801 (s), 758 (s). s = strong, w = weak, as = asymmetric streching, s = symmetric streching, ・ = scissoring. Figura 46. Espectro de infrarrojo de la muestra. En la siguiente tabla se indican las señales del espectro de infrarrojo para la crambecidina-816, y para el ester metílico del núcleo de crambescidina-800. Compuesto  (cm-1) Referencia Crambescidina 816 3350–3250, 1734, 1644–1616 J. Nat. Prod. 1993, 56 , 1007–1015 3230, 3106, 2968, 2934, 2872, 1735, 1659, 1614, 1437, 1204, 1165, 1089, 1016, 924, 728 J. Am. Chem. Soc. 1994, 116 , 549–557 Tabla 9. Valores de infrarrojo citados en bibliografía ‐105‐ 3.4 Conclusiones Se aislaron los compuestos crambescidina-816 y crambescidina-800 de la esponja Crambe crambe . Dicho aislamiento proporcionó 57 mg de una muestra que es una mezcla 3:1 de ambos compuestos, como se corroboró por resonancia magnética nuclear de protón. La caracterización, utilizando las técnicas espectroscópicas indicadas anteriormente, permitió observar diferencias a nivel de 2 carbonos en el núcleo de crambescidina-816. Por comparación con los valores asignados para ptillomycalina-A, podemos decir que nuestros valores se asemejan más que los reportados por Jares-Erijman.149 ‐106‐ ‐107‐ Capítulo 4 Planteamiento sintético de la crambescidina 816 y compuestos relacionados. ‐108‐ ‐109‐ 4.1 Introducción En años recientes se han aislado de esponjas marinas un elevado número de metabolitos con estructuras de alcaloides.152,153 Entre estos metabolitos se encuentran los que poseen un núcleo de guanidinio y que son denominados crambescidinas. La Figura 1 muestra algunos ejemplos; la ptilomycalina-A (1)154 y la crambescidina-800 (2)155, se diferencian en los distintos grados de oxidación de la cadena lateral en C-14. Por su parte, la 13,14,15- isocrambescidina-800 (3)156 y la crambescidina-816 (4)155,157 son ejemplos que se diferencian en el grado de oxidación y en la estereoquímica de los centros carbonados del núcleo pentacíclico. La crambescina-A (5)158 y las batzelladinas- B (6)159 y -F (7)160, también incluidas en la Figura 47, presentan mas de un núcleo de guanidinio. 152 M. G. König, D. A. Wright, Planta Med. 1996, 62 , 193–211. 153 (a) R. G. S. Berlinck, A. C. B. Burtoloso, M. H. Kossuga, Nat. Prod. Rep. 2008, 25 , 919–954. (b) R. G. S. Berlinck, M. H. Kossuga, Nat. Prod. Rep . 2005, 22 , 516–550. (c) R. G. S. Berlinck, Nat. Prod. Rep. 2002, 19 , 617–649. (d) R. G. S. Berlinck, Nat. Prod. Rep. 1999 , 16 , 339–365. (e) R. G. S. Berlinck, Nat. Prod. Rep. 1996, 13 , 377–409. (f) R. G. S. Berlinck, Prog. Chem. Org. Nat. Prod. 1995, 66 , 119–295. 154 (a) I. Ohtani, T. Kusumi, H. Kakisawa, Y. Kashman, S. Hirst, J. Am. Chem. Soc. 1992, 114 , 8472–8479. (b) I. Ohtani, T. Kusumi, H. Kakisawa, Tetrahedron Lett. 1992, 33 , 2525–2528. (c) Y. Kashman, S. Hirsh, O. J. McConnell, I. Ohtani, T. Kasumi, H. Kakisawa, J. Am. Chem. Soc. 1989, 111 , 8925–8926. 155 E. A. Jares-Erijman, R. Sakay, K. L. Rinehart, J. Org. Chem. 1991, 56 , 5712–5715. 156 E. A. Jares-Erijman, A. L. Ingrum, J. R. Carney, K. L. Rinehart, R. Sakai, J. Org. Chem. 1993, 58 , 4805–4808. 157 R. G. S. Berlink, J. C. Braekman, D. Daloze, I. Bruno, R. Riccio, S. Ferri, S. Stampinato, E. Speroni, J. Nat. Prod. 1993, 56 , 1007–1015. 158 R. G. S. Berlink, J. C. Braekman, D. Daloze, K. Hallenga, R. Ottinger, I. Bruno, R. Riccio, Tetrahedron Lett. 1990, 31 , 6531–6534. 159 A. D. Patil, N. V. Kumar, W. C. Kokke, M. F. Bean, A. J. Freyer, C. De Brosse, S. Mai, A. Truneh, D. J. Faulkner, B. Carte, A. L. Breen, R. P. Hertzberg, R. K. Johnson, J. W. Westley, B. C. M. Potts, J. Org. Chem. 1995, 60 , 1182–1188. 160 A. D. Patil, A. J. Freyer, P. B. Taylor, B. Canté, G. Zuber, R. K. Johnson, D. J. Faulkner, J. Org. Chem. 1997, 62 , 1814–1819. ‐110‐ N H N N H OO H H O O 14 X O N NH2 NH2 R 1, R = H, Ptilomycalina-A 2, R = OH, Crambescidina-800 10 13 14 15 3 8 N H N N H OO H H O O 14 X O N NH2 NH2 OH 3, 13,14,15-Isocrambescidina-800 14 15 N H N N H OO OH H O O 14 X O N NH2 NH2 OH 4, Crambescidina-816 14 HN N N H O O N 3 NH2 NH2 R 7 5,R=CH 2CH2CH3, Crambescina-A N H N N H H O O 6, R = Batzelladina-B X N H N N H H H O O 4 n-C7H15 7, Batzelladina-F N H N N H H n-C7H15 Figura 47. Alcaloides, aislados de esponjas marinas, con uno (1–4) o varios (5–7) núcleos de guanidinio. En las moléculas que contienen la funcionalidad de guanidina se observa que ésta tiene una gran incidencia en la actividad biológica de las mismas, lo que se atribuye a las diversas formas en las que el ion guanidinio puede participar en interacciones no covalentes.161 La crambescidina-800 (2), y varios otros alcaloides de la misma familia, presentan baja y media actividad en líneas celulares de cáncer en humanos y se investigan como agentes antineoplásticos.154,155,162,163,164 Las batzelladinas-A y -B (6), son los primeros compuestos de origen natural que inhiben la infección en humanos (CD4) por el 161 J. V. Greenhill, P. Lue, Prog. Med. Chem. 1993, 30 , 203–326. 162 (a) J.-G. Shi, F. Sun, K. L. Rinehart, WO Pat. 9846575, October 22, 1998; CAN 129:288014 (b) K. L. Rinehart, E. A. Jares-Erijman, U.S. Patent 5,756,734, May 26, 1998; CAN 129:38964. 163 R. Tavares, D. Daloze, J. C. Braekman, E. Hajdu, G. Muricy, R. W. M. van Soest, Biochem. Syst. Ecol. 1994, 22 , 645–646. 164 Z. D. Aron, H. Pietraszkiewicz, L. E. Overman, F. Valeriote, C. Cuevas, Bioorg. Med. Chem. Lett. 2004, 14 , 3445–3449. ‐111‐ HIVgp-120, que es un paso crítico en el ciclo del virus de SIDA.159 Los alcaloides con estructuras de batzelladinas son también referencias como inhibidores de otras interacciones entre proteínas. Así, por ejemplo, las batzelladinas F (7) y G inducen la disociación de la proteína tirosina quinasa p56 en sus complejos con el CD4.160 A pesar del amplio rango de actividades que presentan los alcaloides con estructuras de crambescidina, hay un conocimiento muy limitado sobre las relaciones estructura/actividad de estas moléculas naturales. Ha quedado bien establecido que la presencia de la cadena lateral es muy importante para que desarrolle actividad anticancerígena.164,165 Sin embargo, las amidas sencillas de ácidos ω-hidroxicarboxílicos, y en ausencia de funciones de guanidinio, muestran tener una actividad significativamente inferior.154b,166 Se conoce muy poco de la medida en que la cadena en C-14 influye en la bioactividad de estas moléculas. Una de las razones es la ausencia de estudios sistemáticos, debido a la dificultad de eliminar la cadena sin afectar el sistema pentacíclico que incluye el fragmento guanidínico. Así, Kashman y col. muestran en la ptilomycalina- A,154b que la hidrólisis ácida o básica, o la reducción con hidruros metálicos, o la hidrogenación/oxidación, da siempre lugar a una mezcla intratable de productos. La dificultad de acceder al núcleo pentacíclico de la ptilomycalina-A (1) por degradación, se mitiga por ser el único de la familia que se ha podido aislar de fuente natural.167 Por todo ello, la síntesis química es, en la práctica, la única posibilidad de acceso a los diferentes núcleos pentacíclicos presentes en los alcaloides de crambescidinas y análogos. 165 (a) C. G. Moore, P. J. Murphy, H. L. Williams, A. T. McGown, N. K. Smith, Tetrahedron Lett. 2003, 44 , 251–254. (b) A. Georgieva, M. Hirai, Y. Hashimoto, T. Nakata, Y. Ohizumi, K. Nagasawa, Synthesis 2003, 1427–1432. (c) G. P. Black, S. J. Coles, A. Hizi, A. G. Howard- Jones, M. B. Hursthouse, A. T. McGown, S. Loya, C. G. Moore, P. J. Murphy, N. K. Smith, N. D. A. Walshe, Tetrahedron Lett. 2001, 42 , 3377–3381. (d) B. B. Snider, Z. Shi, J. Am. Chem. Soc. 1994, 116 , 549–557 166 E. Palagiano, S. De Marino, L. Minale, R. Riccio, F. Zollo, M. Iorizzi, J. B. Carré, C. Debitus, L. Lucarain, J. Provost, Tetrahedron 1995, 51 , 3675–3682. 167 K. M. Meragelman, T. C. McKee, J. B. McMahon, J. Nat. Prod. 2004, 67 , 1165–1167. ‐112‐ Además de la general y significativa bioactividad antitumoral, antiviral y antifúngica154,166,168,169,170,171 o la inhibitoria a Na+, K+, y Ca2+-ATPasas159 que presentan los alcaloides crambescidínicos, se identifican otras actividades más específicas en estructuras particulares de estas moléculas. Una de ellas, la crambescidina-816 (4) tiene un efecto antagonista al Ca2+ (IC50 1.5 × 10−4 μM) más potente que la nifedipina (IC50 1.2 μM), bloqueador selectivo de canales de Ca2+ del tipo L,156,157 actividad que no ha sido encontrada en ningún otro miembro de la familia. Este alcaloide se aísla de la esponja Crambe crambe que habita incrustada en zonas rocosas y a escasa profundidad en el litoral mediterráneo. El trabajo que se describe a continuación se ha desarrollado dentro de un proyecto multidisciplinar de investigación en el marco del Eje C de referencia CTQ 2007-61024. Tiene entre sus objetivos, el aislamiento del medio natural de la crambescidina-816 y el valorar esquemas de síntesis que permitan preparar el núcleo pentacíclico del compuesto crambescidina-816, siguiendo una simplificación que permita el estudio de las relaciones de estructura/actividad en modelos más simples. Estos estudios, procurarán las bases donde desarrollar protocolos que faciliten profundizar en las singularidades de los canales de Ca2+ dependiente de voltaje, frente a los canales de Na+ y K+. El modelo farmacológico seguido es similar al publicado por nuestro grupo de investigación sobre poliéteres naturales (brevetoxinas), en comparación con modelos de diseño no naturales generados por síntesis química, evaluando los efectos que causan sobre canales de Na+ dependientes de voltaje.172 168 J. E. H. Lázaro, J. Nitcheu, N. Mahmoudi, J. A. Ibana, G. C. Mangalindan, G. P. Black, A. G. Howard-Jones, C. G. Moore, D. A. Thomas, D. Mazier, C. M. Ireland, G. P. Concepcion, P. J. Murphy, B. Diquet, J. Antibiot. 2006, 59 , 583–590. 169 M. Laille, F. Gerald, C. Debilús, Cell. Mol. Life Sci . 1998, 54 , 167–170. 170 A. Olszewski, K. Sato, Z. D. Aron, F. Cohen, A. Harris, B. R. McDougall, W. E. Robinson, Jr., L. E. Overman, G. A. Weiss, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2004, 101 , 14079–14084. 171 S. Aoki, Anticancer Res. 2004, 24 , 2325-2330. 172 M. L. Candenas, F. M. Pinto, C. G. Cintado, E. Q. Morales, I. Brouard, M. T. Díaz, M. Rico, E. Rodríguez, R. M. Rodríguez, R. Pérez, R. L. Pérez, J. D. Martín, Tetrahedron 2002, 58 , 1921– 1942. ‐113‐ Los canales de Ca2+ dependientes de voltaje pertenecen a la superfamilia de canales estructuralmente homólogos, que también incluye a los de Na+ y K+.173 En condiciones fisiológicas, los canales de Ca2+ tipo-L22 son permeables a cationes divalentes (p. ej. Ca2+, Sr2+ y Ba2+) e impiden la difusión de cationes monovalentes en una relación ~1000:1.174 Aunque los centros de recepción externa de los cationes y la interna de selectividad, en estos tres tipos de canales, han de ser diferentes, el conocimiento de la estructura del canal bacteriano de K+ (KcsA)175 permite hacer estudios de modelización en el resto de sus homólogos estructurales. Así, la combinación del conocimiento estructural del KcsA y la alta afinidad de los canales de Na+ con las toxinas naturales176 tetrodotoxina (TTX) y saxitoxina (STX), ha permitido definir, en estos canales, el centro receptor del catión guanidinio y modelizar la estructura del vestíbulo de recepción catiónica exterior del poro.177,178 Tal situación no ocurre en los canales de Ca2+ tipo L, a pesar de ser alta su selectividad. En ausencia de cationes de Ca2+, el canal muestra ser muy permeable a cationes monovalentes inorgánicos (Na+, Li+) y orgánicos (metilamonio, di-, tri- y tetrametilamonio [TMA]), lo que hace suponer la existencia de un diámetro interno de, al menos, 6 Å para poder acomodar al ion TMA.179 Los canales de Ca2+ tipo L son moderadamente sensibles a dihidropiridinas (DHP; p. ej., nifedipina), fenilalquilaminas (p. ej., verapamil), benzotiazepinas (p. ej., diltiazem), por lo que se les refiere normalmente como receptores dihidropiridínicos. La alta afinidad observada por canales de Ca2+ tipo L al alcaloide marino crambescidina-816, demuestra la existencia de un centro receptor específico, lo que, en combinación con el conocimiento estructural que se dispone, podría dar una visión de la estructura del lugar de recepción 173 Los canales de Ca2+ dependientes de voltaje se clasifican según los tiempos de activación/inactivación en transitorios (tipo T) o duraderos (tipo L). 174 B. Hille, “Ionic Channels of Excitable Membranes”, 2nd ed., 1992, Sinauer, Sunderland, MA. 175 D. A. Doyle, J. M. Cabral, R. A. Pfuetzner, A. Kuo, J. M. Gulbis, S. L. Cohen, B. T. Chait, R. MacKinnon Science 1998, 280 , 69–77. 176 W. A. Catterall, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 1980, 20 , 15–43. 177 G. M. Lipkind, H. A. Fozzard, Biophys. J. 1994, 66 , 1–13. 178 W. A. Catterall, Neuron 2000, 26 , 13–25. 179 G. M. Lipkind, H. A. Fozzard, Biochem. 2001, 40 , 6786–6794. ‐120‐ La preparación de las estructuras tipo 25 se proyecta según un acoplamiento de Eschenmoser196 de las estructuras 26 y los correspondientes α-bromo ésteres derivados de las estructuras 27, seguido por las siguientes dos etapas: a) tratamiento con ácido p-toluenosulfónico, para así inducir la formación intramolecular de la estructura de guanidina tricíclica y b) introducción del resto oxigenado de la futura posición C-13 presente en la crambescidina-816, mediante una adición intermolecular tipo Michael con control estereoquímico de sustrato. La posterior hidrogenación del producto de acoplamiento da acceso a derivados de la familia de la ptilomycalina-A (Figura 47). Los cálculos de Mecánica Molecular de las correspondientes ureas tricíclicas indican, de manera inequívoca, suponiendo control termodinámico para los procesos, que los transcursos estereoquímicos de las reacciones propuestas conducirán a productos de configuraciones correspondientes a las determinadas para estos productos naturales.197 La formación de un éster α,β-insaturado se preparará siguiendo la metodología sintética desarrollada por el grupo el Dr. Kishi198 en la síntesis de la guanidina natural saxitoxina. Una posterior reducción, mediante hidrogenación catalítica o tratamiento con tri-acetoxiborohidruro sódico en presencia de ácido ácetico,199 generarán las structuras tipo 23. La síntesis proseguirá con el acoplamiento de 23 con el éster 24, mediante la formación del correspondiente enolato de Li a baja temperatura. La síntesis propuesta para el éster (en el que P3 es un grupo protector de silicio) estará basada en la adición enantioselectiva de dietilzinc a aldehídos, desarrollada por el grupo del Dr. Seebach.200 Tratamiento posterior con base (LiOH) conllevará la formación de los correspondientes ácidos de los ésteres metílicos 22. La adición de ácido clorhídrico en metanol debería inducir simultáneamente la descarboxilación del β-cetoácido 21, la desprotección del alcohol secundario con protección de silicio (P3) y la formación de la estructura R. Downham, K. S. Kim, M. Woods, Tetrahedron 1994, 50 , 7157–7176. (d) G. J. Boons, D. A. Entwistle, S. V. Ley, M. Woods, Tetrahedron Lett. 1993, 34 , 5649–5652. 196 O. David, J. Blot, C. Bellec, M.-C. Fargeau-Bellassoued, G. Haviari, J.-P. Célerier, G. Lhommet, J.-C. Gramain, D. Gardette, J. Org. Chem. 1999, 64 , 3122–3131. 197 Estudios realizados en el grupo del Dr. Pedro Noheda. 198 R. Fujimoto, Y. Kishi, J. F. Blount, J. Am. Chem. Soc. 1980, 102 , 7154–7156. 199 C. Cimarelli, G. Palmieri, J. Org. Chem. 1996, 61 , 5557–5563. 200 B. Weber, D. Seebach, Tetrahedron 1994, 50 , 7473–7484. ‐121‐ de guanidina pentacíclica 20. Dependiendo del ácido a emplear los productos resultantes presentarán diferentes contraiones (X− en Esquema 6). Finalmente, la crambescidina-816 se preparará mediante reacciones de esterificación del ácido presente en la estructura 20 y un derivado de espermidina 19. Los análogos de espermidina 19 serán preparados siguiendo la metodología de Hart y colaboradores.201 La síntesis se plantea siguiendo criterios de máxima simplificación con el objetivo de que sea eficaz como tecnología de aplicación en investigación farmaceútica. Los resultados que se describen a continuación son mi aportación en el desarrollo de este proyecto de síntesis. 201 A-L. Grillot, D. J. Hart, Tetrahedron 1995, 51 , 11377-11392. ‐122‐ 4.4 Plan de síntesis del núcleo de Crambescidina-816 4.4.1 Síntesis de posibles compuestos de partida para la construcción del núcleo de crambescidina-816 Siguiendo la propuesta retrosintética planteada, nos centramos inicialmente en la búsqueda de posibles compuestos de partida sobre los que trabajar en la construcción del núcleo pentacíclico de la crambescidina-816 (Esquema 6). Para la construcción del intermedio sintético 23, se siguen las alternativas que se exponen en el Esquema 7. Implican la síntesis de 28, 30-31 y 29, modelos que disponen respectivamente de los anillos A y C, presentes en el núcleo pentacíclico de las crambescidinas. Esquema 7. Moléculas de partida a preparar. En ambas alternativas se plantea una reacción de acoplamiento tipo Stille entre un haloderivado (28 o 31) y el stannano 29 (M = SnBu3). ‐123‐ Para la preparación de compuestos de estructura 29 se sigue la metodología enantioconservativa desarrollada por el Prof. Steve Ley,195 que utiliza el ester etílico del ácido láctico como sustancia de partida (Esuqema8). Esquema 8. Retrosíntesis propuesta para el compuesto 29. Los compuestos de estructura 28 se sintetizan según el Esquema retrosintético 9. Esto es, tratamiento del anhídrido succínico con trifenilfosforaniliden acetato de metilo o etilo y posterior ciclación del producto de condensación con una base y una fuente de halógeno (bromo o yodo), para obtener las correspondientes ester halo lactonas tipo 28. Esquema 9. Retrosíntesis propuesta para 28. Las estructuras del tipo 30 (Esquema 10) se sintetizan mediante protección de la succinimida a nivel del NH, y posterior desimetrización por acoplamiento de Wittig, seguido de reducción del doble enlace y de un segundo acoplamiento de Wittig (o tioWittig si no fuera suficientemente reactivo). La posterior desprotección y guanilación con una tiourea protegida da lugar a los precursores sintéticos deseados tipo 30, con sustitución diferenciada en las posiciones C-2 y C-5. ‐124‐ Esquema 10. Restrosintésis propuesta para el compuesto 30. 4.4.1.1 Preparación del vinilstannano 38 La preparación del compuesto 38 se realizó siguiendo el esquema sintético que se muestra a continuación (Esquema 11). (S) OH OOEt a OTBS OOEt O O OTBS OTBS O H b d O O OTBS e O O (S) OH f O c Reactivos y condiciones de reacción:(a) TBDMSCl (1.1 eq), imidazol (1.1 eq), DMF, t.a., 48 h; 85 %. (b) DIBAL-H (1.1 eq), CH2Cl2, -78ºC, 1 h. (c) 2-(1,3-dioxan-2-il)etiltrifenilfosforano (1.1 eq), KHMDS(1.1eq),THF,0ºC->t.a.,36h;60%.(d)H 2(1 atm), PtO2(0.04 eq), AcOEt, t.a., 3 h; 89 %. (e) TBAF (1.4 eq), THF, t.a., 10 h; 92 % (f) PhSO2(1.1 eq), CaCl2, CH2Cl2, t.a., 3 h; 48 %. (g) i) 1.1 eq n-BuLi, 1.1 eq SnBu3Cl, THF, -78 ºC, 3 h; ii) 5 eq DIEA, CHCl3, reflujo, 12 h; 79 %. OSO2Ph SnBu3 g 32 33 34 37 36 35 38 Etil ester del lactato de etilo Esquema 11. Preparación del compuesto 38 Se inicia la síntesis partiendo del enantiómero comercial (S)-lactato de etilo mediante protección del alcohol con TBS con excelente rendimientos (85%). Luego se realiza una reducción del grupo carboxilato a aldehido (33) con DIBAL-H y el producto de reducción se utiliza directamente, sin purificar, en la siguiente reacción con el fin de evitar procesos de racemización. El acoplamiento por reacción de Wittig con 2-(1,3-dioxan-2-il)etiltrifenilfosforano ‐125‐ comercialmente disponible, utilizando KHMDS como base, da lugar al cisalqueno 34 con un rendimiento global del 60% para las dos reacciones. La hidrogenación del doble enlace, utilizando dióxido de platino como catalizador, produce el producto hidrogenado 35 con un 89% de rendimiento. Sobre este producto se realiza la desprotección del alcohol, con fluoruro de tetrabutilamonio, que conduce al alcohol 36 con un rendimiento del 92%. La reacción del compuesto 36 con ácido bencensulfínico (preparado previo a su uso) produce la sulfona cíclica 37, como una mezcla de isómeros (R = 48%). El tratamiento de la sulfona 37 con n-BuLi y la adición de cloruro de tributil estaño permite obtener el estaño derivado 38 (R = 79%). El rendimiento global de esta secuencia es de 16%. La metalación del dihidropirano se realizó en tres pasos de reacción. Mediante tratamiento con el ácido bencensulfínico conduce, en primer lugar, a la tetrahidropiranil sulfona 39 en 80% de rendimiento. La eliminación del grupo bencenosulfónico, con n -Buli a baja temperatura, da lugar al intermedio de vinil-litio que se convierte en el correspondiente vinil estannano 40, por tratamiento con cloruro de tributil estaño (R = 79%) (Esquema 12). También es posible preparar este compuesto (40) directamente, con un 49% de rendimiento, en un paso de reacción por tratamiento, a baja temperatura, con tert -butil litio y posterior conversión al estannano con cloruro de tributil estaño. Esquema 12. Preparación de la normetil sulfona de Ley 40. ‐126‐ 4.4.1.2 Preparación de las ester halo lactonas 28 Esquema 13. Apertura de anhídrido succínico. Para la construcción de las ester halo lactonas 28 (Esquema 9) se plantea una serie de reacciones partiendo de anhídrido succínico, que por tratamiento a – 5 ºC de su solución en cloroformo y adición de trifenilfosforaniliden acetato de etilo o metilo, se obtienen los derivados de cadena abierta 41 y 42 con rendimientos superiores a 83 %. (Esquema 13) Si este derivado se calienta en THF durante 4 horas se obtiene el producto ciclado correspondiente (43 y 44), como una mezcla E:Z (3:1), según se confirma por RMN. Esquema 14. Preparación de ester lactonas 43 y 44. Si se adiciona una base (trietilamina en este caso), y una fuente de bromo (Br2) se obtienen las ester bromo lactonas 45 y 46, con rendimientos mayores a 86%, tanto para el éster metílico como etílico (Esquema 15). Los productos se obtienen como una mezcla E:Z aproximadamente de 3:1, según se confirma por RMN de protón. La purificación de estos compuestos es tediosa, siendo necesaria una primera purificación por cromatografía en columna con diclorometano, en la cual se separan ambos estereoisómeros del óxido de ‐127‐ trifenilfosfina y una segunda purificación cromatográfica, utilizando una mezcla de hexano y acetato de etilo, lo que nos permite obtener los productos de interés con rendimientos superiores a 86%. Esquema 15. Preparación de ester bromo lactonas 45 y 46. Para obtener el yododerivado 47 se ensayó la reacción utilizando yodo como fuente de halógeno, pero se obtuvo el producto de interés, por lo que esta reacción se realizó utilizando N-iodosuccinimida. El rendimiento de esta reacción es del 87%, aunque no es posible separar ambos estereisómeros (Esquema 16). Esquema 16. Preparación de la metil ester yodo lactona 47. El compuesto 43 también se preparó por reacción de Wittig de anhídrido succínico con la sal de bromonio del fosfonoacetato de metilo, utilizando bromuro de litio y carbonato de potasio como base, THF como disolvente y agitando a temperatura ambiente durante 12 horas. Se obtiene la mezcla de estereoisómeros como en el caso anterior, pero con un rendimiento inferior (63%) (Esquema 17). ‐128‐ Esquema 17. Alternativa para la preparación de 43. Una vez purificado el bromoderivado 46(Z), se ensaya la reacción de acoplamiento de Stille con el derivado de estaño modelo, 40, preparado según se describió anteriormente (Esquema 18). OSnBu3 O O O OEt O a 40 46(Z) 48 Reactivos y condiciones de reacción: (a) Pd(PPh3)4, acetonitrilo, reflujo, 4 h. O O O OEt Br + Esquema 18. acoplamiento de Stille de los compuestos 46(Z) y 40. Para esta reacción se utilizó una modificación de las condiciones descritas por Stille y colaboradores202, utilizando tetrakis de trifenilfosfina paladio (0) como catalizador y acetonitrilo como disolvente. La mezcla de reacción se calienta a reflujo durante 4 horas. La purificación por cromatografía permite obtener el compuesto de interés, pero éste se descompone incluso bajo atmósfera de argón. Una posible alternativa sería realizar la conversión lactona/lactama en 46(Z) mediante apertura con un compuesto nitrogenado, y posterior ciclación para obtener el haloderivado correspondiente de pirrolidona con el que ensayar la reacción de acoplamiento de Stille. 202 (a) A. M. Echavarren y J. K. Stille; J. Am. Chem. Soc. 1987, 109 , 5478-5486. (b) H. B. Kwon, B. H. McKee y J. K. Stille; J.Org. Chem. 1990, 55, 3114-3118. ‐129‐ Esquema 19. Posible apertura y ciclación del compuesto 46(Z). Siguiendo la referencia de Abell y colaboradores203, se realiza la apertura y ciclación con amoníaco en metanol. Sobre el compuesto 43 la reacción es exitosa, y se consigue el producto 49A con un 73% de rendimiento, con la configuración Z del doble enlace debido a la estabilización por puente de hidrógeno, según se indica en el Eesquema 17. El primer paso es la apertura con amoníaco, para una posterior ciclación y deshidratación para obtener el producto de interés. a O O O OMe N H O(Z) b Reactivos y condiciones de reacción: (a) NH3-MeOH (10 eq), CH2Cl2, t.a. 1 h. quant. (b) 1.2-dicloroetano, reflujo,3d;73%. OMe O NH2 O O OMe O 43 49A Esquema 20. Apertura y ciclación del ester lactona derivado 43. 203 A. D. Abell, M. D. Oldham y J. M. Taylor; J. Org. Chem. 1995, 60 , 1214-1220. ‐136‐ Con el objetivo de estudiar la protección de succinimidas y su reactividad, se eligieron grupos protectores con características de dadores de electrones (OBn), atractores de electrones (BOC) y grupos neutros (Bn), así como tambien PMB y TBDMS. En el caso del grupo BOC fue posible la obtención del compuesto de interés; partiendo de succinimida, mediante la utilización de BOC2O y utilizando acetonitrilo como disolvente y 4-DMAP como catalizador, se obtiene el producto 54 con un rendimiento del 91%. La reacción de formación de bencilsuccinimida, 55, utilizando bromuro de bencilo e hidruro de potasio como base, a temperatura ambiente, permitió obtener el producto de interés pero con un rendimiento del 30%, por lo cual se prepara partiendo de anhídrido succínico y bencilamina en THF a reflujo, con un rendimiento del 86%. En el caso de la oxibencilsuccinimida, 56, se obtiene a partir de N- hidroxisuccinimida y bromuro de bencilo, utilizando carbonato de calcio y éter corona en acetona y en condiciones de reflujo, con un rendimiento del 86%. El PMB derivado 57 fue preparado por tratamiento de succinimida con carbonato de potasio como base y cloruro de parametoxibencilo, en condiciones de reflujo durante 12 horas, con un rendimiento del 89%. El TBDMS 58 derivado fue preparado por tratamiento de succinimida con cloruro de TBDMS y TEA y 4-DMAP como base, agitando a temperatura ambiente durante 12 horas. Se obtuvo el producto con un 70% de rendimiento. ‐137‐ 54 N O O H N O O Boc a O O O N O O Bn b N O O OH N O O OBn c N O O H N O O PMB d N O O H N O O TBDMS e 55 56 57 58 Reactivos y condiciones de reacción: (a) Boc2O (1 eq), 4-DMAP (0.15 eq), ACN, r.t., 30 m; 91 %. (b) bencilamina (1 eq), THF, reflujo, 2h; 86 %. (c) bromuro de bencilo (1.1 eq), CaCO3(1 eq), 18c6 (0.05 eq), acetona, reflujo, 16 h; 86 %. (d) PMBCl (1.1 eq), K2CO3(3 eq), ACN, reflujo, 24 h; 83 %. (e) TBDMSCl (1.5 eq), TEA (2.5 eq), 4-DMAP (cat.), CH2Cl2, t.a. 12 h; 70 %. Esquema 27. Modelos de protección de succinimidas. ‐138‐ Luego se ensayó la reacción de las succinimidas protegidas con reactivo de Lawesson. Inicialmente se utilizaron 3 equivalentes del reactivo, pero ajustando las condiciones de reacción se observó que se consiguen los mismos resultados usando solo 1 equivalente. Esquema 28. Reacción de succinimidas protegidas con reactivo de Lawesson. Si bien es posible obtener los compuestos deseados, los rendimientos no son buenos (22%, 14% y 18% para 59, 60 y 61, respectivamente). ‐139‐ 4.4.1.2.1.1 Modelos de acoples tipo Wittig sobre succinimidas protegidas Como una aproximación a las reacciones de acoplamiento que serán necesarias hacer, se utilizaron los derivados de succinimidas protegidas 59, 60 y 61 para hacer la reacción de acoplamiento de Wittig (Esquema 29). Esquema 29. acoplamientos tipo Wittig sobre succinimidas protegidas La reacción se lleva a cabo sin disolvente y calentando en un baño de arena a 175 ºC durante 20 horas. Se observa que los productos funden para formar una masa de color oscuro que, luego de completado el tiempo de reacción, se disuelve en una mezcla de n-hexano-acetato de etilo y purifica por columna cromatográfica. Cuando se utiliza un grupo bencilo u oxibencilo para la reacción de acoplamiento, se obtienen los productos deseados, 62 y 63, con buenos rendimientos (86% en ambos casos) y solo uno de los esteroisómeros, asignado en ambos casos como el isómero E. Cuando el grupo protector es Boc se obtiene el producto de acoplamiento pero se elimina el grupo Boc, obteniéndose la succinimida sin proteger 49A y como una mezcla de ambos isómeros E:Z (~2:1), según se confirma por RMN. Ajustando las condiciones de reacción, utilizando tolueno como disolvente y calentando durante 20 horas a 90 ºC, fue posible obtener el compuesto de acoplamiento con el grupo protector Boc, 64A, con un rendimiento del 73%. También se obtuvo el compuesto de doble acoplamiento de Wittig, 64B, como producto secundario (5%) (Esquema 30). ‐140‐ Reactivos y condiciones de reacción: tolueno, 90 ºC, 20 h. 64A, R = Me 65A, R = Et N O O Boc Ph3P OR O N O O OR Boc N O OR Boc RO O 64B, R = Me 65B, R = Et 54 Esquema 30. Acoplamientos tipo Wittig sobre BOC-succinimida. Esta reacción también se realizó con el éster etoxicarbonilmetilen trifenilfosforano, y los rendimientos para la obtención de 65A y 65B fueron de 61 y 20%, respectivamente. ‐141‐ Una vez ajustadas las condiciones para la preparación de los productos de acoplamiento mediante reacciones de Wittig, se intentó realizar bromaciones sobre el alqueno, para utilizar junto con compuestos de estructura 29 en acoplamientos de tipo Stille. Las condiciones ensayadas fueron: tratamiento del alqueno con bromo y trietilamina como base a baja temperatura, y tratamiento con nbromosuccinimida y DMAP como base a temperatura ambiente (Esquema 31). Esquema 31. Intentos de bromación a nivel del alqueno. En ninguna de las condiciones ensayadas se obtuvo el producto deseado ya que, posiblemente, la acidez de los protones metilénicos hace que la halogenación se de en los carbonos 2 y 3 del anillo, y una posterior eliminación da lugar al producto insaturado a este nivel. ‐142‐ También se ensayaron reacciones de epoxidación y los resultados fueron negativos para todas las condiciones ensayadas (Esquema 32). Esquema 32. Intentos de epoxidación. Condiciones de reacción ensayadas:  mCPBA (1.2 eq), CH2Cl2, temperatura ambiente, 3 horas.205  TBHP (1.5 eq), n-BuLi (1.1 eq) THF, -78 ºC, 12 horas.206  TBHP (1.5 eq), VO (acac)2 (0.1 eq), benceno, temperatura ambiente, 24 horas.207 Se intentó la epoxidación asistida por ácido fenil borónico sobre el compuesto acoplado de N-hidroxisuccinimida 63D, pero la reacción tampoco dio resultado. Esquema 33. Intento de epoxidación sobre el compuesto 63D. Condiciones de reacción ensayadas:  NMO (1.2 eq), OsO4 (cat.), ácido feniborónico (1.2 eq), CH2Cl2, temperatura ambiente, 12 horas.208 205 R. S. Porto, M. L. A. A. Vasconcellos, E. Ventura, F. Coelho, Synthesis , 2005, 2297-230. 206 Tesis Doctoral Dácil Zurita Espinosa, La Laguna, 1991. 207 K. B. Sharpless, R. C. Michaelson J. Am. Chem.Soc. 1973, 95 , 6136-6137. 208 A. Gypser, D. Michel, D. S. Nirschl, K. B. Sharpless J. Org. Chem. 1998, 63, 7322-7327. ‐143‐ 4.4.1.2.1.2 Diferenciación C2-C5 en succinimidas protegidas Con el fin de eliminar el grupo carbonilo remanente y, de igual manera, conseguir diferenciar las posiciones C-2 y C-5 del heterociclo, estudiamos en primer lugar reacciones de hidrogenación del sistema cabonílico insaturado. La hidrogenación se consigue a 4 atmósferas de presión, utilizando Pd sobre carbono como catalizador y acetato de etilo como disolvente. Después de 24 horas de reacción se obtuvo el producto hidrogenado, tanto para el caso del producto de Wittig 64A (Esquema 34) como para el de doble acoplamiento de Wittig 64B (Esquema 35). Las transformaciones fueron cuantitativas. Esquema 34. Hidrogenación del compuesto 64ª. Esquema 35. Hidrogenación del compuesto 64B. Una vez obtenido el producto reducido, intentamos sobre el compuesto 68 un nuevo acoplamiento de tipo Wittig con las condiciones puestas a punto para el grupo protector Boccalentando a 90 ºC una solución del alqueno en tolueno durante 24 horas. Dado que dicha transformación directa no fue posible, por lo que se realizó una activación para obtener el tioderivado 70, utilizando el reactivo de Lawesson como se describió anteriormente, seguido de una reacción de tioWittig (Esquema 36). Esta reacción fue exitosa, si bien requiere 48 horas de reacción y la utilización de 3 equivalentes del trifenilfosforaniliden acetato de metilo. De esta manera, se obtiene un compuesto diferenciado en C2 y C5 (71). ‐144‐ a Reactivos y condiciones de reacción: (a) R. Lawesson (0.55 eq), THF, 65 ºC, 90 m; 63 %. b) tolueno, 90ºC,48h;83%. 70 N S Boc OMe O N O Boc OMe O Ph3P OMe O N Boc OMe OO MeO Ph3P OMe O71 b 68 Esquema 36. Preparación del compuesto 71. Posteriormente ensayamos reacciones de desprotección del grupo Boc. Las condiciones óptimas se obtuvieron utilizando 6 equivalentes de ácido trifluoroacético en diclorometano anhidro y a temperatura ambiente, agregando 3 equivalentes al inicio de la reacción y luego 3 equivalentes más a las 2 horas. ‐145‐ De esta manera se obtuvieron los diferentes derivados desprotegidos 72-75 (Esquema 37): 68 70 69 71 Reactivos y condiciones de reacción: (a) TFA (6 eq), CH2Cl2, t.a., 3-5 h. 72 N O Boc OMe O N H OOMe O N S Boc OMe O N H SOMe O N Boc OMe O MeO O N H OMe O MeO O N Boc OMe O MeO O N H OMe O MeO O 73 74 75 a a a a Esquema 37. Desprotección de los derivados 68-71 utilizando TFA. La desprotección se consigue, en todos los casos, en las condiciones antes mencionadas, a excepción del producto de doble acoplamiento de Wittig, 64B, en el que se produce la doble interconversión E -> Z antes de que la eliminación del grupo protector tenga lugar. No obstante, manteniendo la reacción con 10 equivalentes de TFA se consigue la desprotección y obtención exclusiva del isómero Z,Z (Esquema 38). ‐248‐ AE: Calculado para C18H29N3O6: C, 56.38; H, 7.62; N, 10.96; O, 25.04. Observado: C, 56.90; H, 7.70; N, 11.29 ‐249‐ Preparación de 2-(2-metoxi-2-oxoetil)pirrolidina-1-carboxilato de terc -butilo (85).233 Se disuelve el producto de acoplamiento de Wittig 82 (100 mg, 0.41 mmol, 1 eq) en AcOEt (5 mL) y se agrega una punta de espátula de Paladio al 10% sobre carbono. Se coloca bajo hidrógeno a una presión de 4 atm de y se agita vigorosamente durante 24 horas. Se filtra a través de celite y lleva a sequedad. Se obtiene el producto reducido 85 como un aceite incoloro que se utiliza, sin purificación previa, en la siguiente reacción (97.8 mg, R = 97%). Rf: 0.54 (n-Hexano:AcOEt; 7:3) 1H RMN (500 MHz, CDCl3) δ (ppm): 4.11 (1H, d, J = 33.3 Hz, H2), 3.64 (3H, s, OMe), 3.41–3.25 (2H, m, H5), 2.84 (1H, dd, J = 6.42, 13.9 Hz, H1’), 2.28 (1H, dd, J = 14.8, 9.9 Hz, H1’), 2.11–1.94 (1H, m, H3), 1.81 (2H, dd, J = 9.5, 4.5 Hz, H4), 1.75 (1H, d, J = 27.8 Hz, H3), 1.43 (9H, s, H4’’) 13C RMN (125 MHz, CDCl3) δ (ppm): 171.9 (C2’), 154.2 (C1’’), 79.5 (C3’’), 54.0 (C2), 51.5 (OMe), 46.5 (C5), 39.1 (C1’), 31.2 (C3), 28.6 (C4’’), 23.5 (C4) EM (ESI); m/z (int. rel.): 282 ([M + K]+, 41), 266 ([M + Na]+, 100) IR (NaCl)  (cm-1): 2975, 1738, 1694, 1393, 1168, 772 AE: Calculado para C12H21NO4: C, 59.24; H, 8.70; N, 5.76; O, 26.30. Observado: C, 59.79; H, 8.08; N, 6.04 233 Y. J. Zhang, J. H. Park, S. Lee, Tetrahedron: Asymmetry 2004, 15 , 2209-2212. ‐250‐ Preparación de 2-(pirrolidin-2-il)acetato de metilo (86).234 A una disolución del producto de reacción de Wittig reducido 85 (55 mg, 0.226 mmol, 1 eq) en CH2Cl2 seco (4 mL), se adiciona TFA (0.1 mL, 0.91 mmol, 4 eq) y se agita a temperatura ambiente durante 90 minutos. Se vuelve a adicionar TFA (0.1 mL, 0.91 mmol, 4 eq) y se agita durante 2 horas. Se neutraliza con NaHCO3 (10 %), se extrae con CH2Cl2, se seca (MgSO4), se filtra y lleva a sequedad. Se obtiene el producto 86 como un aceite que se utiliza, sin purificación previa, en la siguiente reacción (31 mg, 97%). 1H RMN (500 MHz, CDCl3) δ (ppm): 9.54 (1H, s.a., NH), 3.93 (1H, s.a., H2), 3.71 (3H, s, OMe), 3.40 (2H, d, J = 5.3 Hz, H5), 3.00 (1H, dd, J = 17.3, 8.4 Hz, H2’), 2.77 (1H, dd, J = 17.4, 5.3 Hz, H2’), 2.44–2.23 (1H, m, H3), 2.23–1.98 (2H, m, H4), 1.88–1.69 (1H, m, H3) 13C RMN (125 MHz, CDCl3) δ (ppm): 170.8 (C1’), 55.6 (C2), 52.1 (OMe), 45.2 (C5), 36.0 (C2’), 30.6 (C3), 23.7 (C4) EM (ESI); m/z (int. rel.): 144 ([M + H]+, 100) IR (NaCl)  (cm-1): 2921, 1731, 1677, 1441, 1200, 1141 234 G. H. Fülep, C. E. Hoesl, G. H., K. T. Wanner, E. J. Med. Chem. 2006, 41 , 809–824. ‐251‐ Preparación de 2-(1-(N,N'-bis( terc -butoxicarbonil)carbamimidoil)- pirrolidin-2-il)acetato de metilo (87). Procedimiento A: N O O NHN OO O O N H O OMe SMBBT HgCl2 TEA DMF 87 86 Se disuelve la amina 86 (9 mg, 0.06 mmol, 1 eq), S-metil bisbocisotiourea (SMBBIT) (19 mg, 0.066 mmol, 1.1 eq) y la trietilamina (0.03 mL, 0.2 mmol, 3 eq) en DMF seca (0.6 mL). Se adiciona cloruro de mercurio (18 mg, 0.066 mmol, 1.1 eq). La suspensión resultante se agita a temperatura ambiente durante 12 horas. Al cabo de ese tiempo se lleva a sequedad, se redisuelve en Et2O, lava con NH4Cl, seca (MgSO4), filtra y lleva a sequedad. Se purifica por columna cromatográfica utilizando una mezcla de n-Hexano:AcOEt (7:3) como fase móvil, se obtiene el producto guanilado 87 como un sólido blanco-amarillo (19.7 mg, R = 85%). Procedimiento B: Se disuelve el producto guanilado 84 (100 mg, 0.26 mmol, 1 eq) en AcOEt seco (5 mL) y se agrega una punta de espátula de Paladio al 10 % sobre carbono. Se coloca bajo hidrógeno a una presión de 4 atm de y se agita vigorosamente durante 24 horas. Se filtra a través de celite y se lleva a sequedad. Se obtiene el producto reducido 87 como un aceite incoloro que se utiliza, sin purificación previa, en la próxima reacción (90.3 mg, R = 90 %). P.F.: 137-139 ºC ‐252‐ Rf: 0.41 (n-Hexano:AcOEt; 7:3) 1H RMN (500 MHz, CDCl3) δ (ppm): 4.61 (1H, s, H2), 3.70 (3H, s, OMe), 3.64 (1H, dd, J = 16.8, 9.9 Hz, H5), 3.57–3.42 (1H, m, H5), 3.13 (1H, s, H3), 2.47 (1H, dd, J = 15.6, 8.7 Hz, H3), 2.27 (1H, dd, J = 14.5, 8.8 Hz, H2’), 1.95 (1H, d, J = 11.1 Hz, 1H2’), 1.77 (2H, dd, J = 12.3, 6.4 Hz, H4), 1.51 (18H, s, H6’’) 13C RMN (125 MHz, CDCl3) δ (ppm): 174.0 (C1’), 167.3 (C1’’), 154.4 (C3’’), 85.6 (C5’’), (C2) 59.8 (C2), 51.3 (OMe), 48.0 (C5), 28.7 (C2’), 27.8 (C3), 24.2 (C6’’), 14.3 (C4) EM (ESI); m/z (int. rel.): 385 ([M + H]+, 100) HRMS: Calculado para C18H30N3O6 [M-H]+= 384.2135. Observado = 384.2121 IR (NaCl)  (cm-1): 2279, 1750, 1706, 1652, 1595, 1436, 1137, 847 AE: Calculado para C18H31N3O6: C, 56.09; H, 8.11; N, 10.90; O, 24.90. Observado: C, 56.41 H, 7.75; N, 11.13. ‐253‐ Preparación de 5-metil-3,4-dihidro-2H-pirrol (90). Se disuelve el alqueno 82 (24 mg, 0.1 mmol, 1 eq) en HCl 2M (5 mL) y calienta a reflujo durante 2 horas. Se lleva a sequedad, redisuelve en agua (5 mL) y adicionan 250 mg de resina Dowex-50W. Despúes de 2 horas la suspensión se filtra y lleva a sequedad. Se obtienen 8 mg del producto 90 que no se purifica. 1H NMR (400 MHz, D2O) δ (ppm): 4.01 (2H, t, J = 7.6 Hz, H2), 3.10 (2H, t, J = 8.1 Hz, H4), 2.44 (3H, s, Me), 2.31–2.20 (2H, m, H3) 13C NMR (100 MHz, D2O) δ (ppm): 159.4 (C5), 53.3 (C1), 38.1 (C4), 19.6 (C3), 17.6 (Me) ‐254‐ Preparación de 5-metil-3,4-dihidro-2H-pirrol-2-ona (91).235 Se disuelve el alqueno 64A (240 mg, 1 mmol, 1 eq) en HCl 2M (15 mL) y se calienta a reflujo durante 2 horas. Se lleva a sequedad, redisuelve en agua (15 mL) y adicionan 250 mg de resina Dowex. Despúes de 2 horas la suspensión se filtra y lleva a sequedad. Se obtienen 83 mg del producto 91 que no se purifica. 1H NMR (400 MHz, D2O) δ (ppm): 2.76 (2H, t, J = 6.3 Hz, H3), 2.49 (2H, t, J = 6.3 Hz, H4), 2.12 (3H, s, Me) 13C NMR (100 MHz, D2O) δ (ppm): 177.3 (C2), 161.2 (C5), 37.7 (C3), 29.1 (Me), 27.7 (C4) 235 W. M. Kan, C-L. Cheng, C-Y. Chern, Synthetic Communications 2004, 34 , 4257-4264. ‐255‐ Preparación de 2-(5-oxopirrolidin-2-il)ácido acético (92).230 Método A: Se disuelve el producto reducido 72 (32 mg, 3.89 mmol, 1 eq) en metanol (1 mL), se añade NaOH 3N (1 mL) y la solución resultante se agita a temperatura ambiente durante 18 horas. Se filtra y lleva a sequedad. Se obtienen 18 mg del producto 92 que no se purifica (R = 62%). Método B: Se disuelve el producto reducido 72 (1 g, 3.89 mmol, 1 eq) en HCl 2M (20 mL) y se calienta a reflujo durante 2 horas. Se lleva a sequedad, se redisuelve en agua (15 mL) y se adicionan 900 mg de resina Dowex. Despúes de 2 horas se filtra y lleva a sequedad. Se obtienen 464 mg del producto 92 que no se purifica (R = 51%). ‐256‐ Método C: Se disuelve el producto reducido 68 (257 g, 1 mmol, 1 eq) en HCl 2M (10 mL) y se calienta a reflujo durante 2 horas. Se lleva a sequedad, se redisuelve en agua (15 mL) y se adicionan 900 mg de resina Dowex. Despúes de 2 horas se filtra y lleva a sequedad. Se obtienen 316 mg del producto 92 P.F.: 270 ºC (desc.) 1H NMR (500 MHz, D2O) δ (ppm): 3.62–3.50 (1H, m, H2), 2.72 (1H, dd, J = 17.8, 4.6 Hz, H2’), 2.60 (1H, dd, J = 17.8, 7.9 Hz, H2’), 2.41 (2H, t, J = 7.5 Hz, H4), 1.95–1.79 (2H, m, H3) 13C NMR (125 MHz, D2O) δ (ppm): 176.4 (C5), 173.8 (C1’), 47.6 (C2), 35.5 (C2’), 29.5 (C4), 26.9 (C3) EM (ESI); m/z (int. rel.): 144 ([M + H]+, 100) ‐257‐ Preparación de (E)-2-(benciloxi)-2-oxoetiliden)-5-(2-metoxi-2- oxoetil)pirrolidin-1-carboxilato de terct -butilo (93). N OO O O OO tolueno 90 ºC 48 h NS Boc Ph3P OBn O MeO O 70 93 A una solución del tioderivado 70 (273 mg, 1 mmol, 1 eq) en tolueno (15 mL) se adiciona trifenilfosforaniliden acetato de bencilo (1.23 g, 3 mmol, 3 eq). La mezcla se calienta a reflujo durante 48 horas. Se deja enfriar, se filtra y lleva a sequedad. Se purifica por columna cromatográfica utilizando CH2Cl2 como fase móvil. Se obtiene el producto de acoplamiento 93 como un sólido de color marrón claro (293 mg, R = 75%). 1H RMN (500 MHz, CDCl3) δ (ppm): 7.36-7.34 (5H, m, Har), 6.57 (1H, s, H1’), 5.15 (2H, s, H4’) , 4.56 (1H, t, J = 7.4 Hz, H5), 3.72 (3H, s, OMe), 3.53 (1H, dd, J = 18.3, 8.7 Hz, H3), 3.01–2.89 (1H, m, H3), 2.78 (1H, dd, J = 15.2, 2.8 Hz, H1’’), 2.44 (1H, dd, J = 15.2, 10.3 Hz, H1’’), 2.12–2.02 (1H, m, H4), 1.90– 1.80 (1H, m, H4), 1.55 (9H, s, H4’’’). 13C RMN (125 MHz, CDCl3) δ (ppm): 171.1 (C2’’), 168.5 (C2’), 157.1 (C2), 151.2 (C1’’’), 136.9 (C5’), 128.4 (C6’), 127.8 (C7’), 126.9 (C8’), 96.5 (C1’), 82.7 (C3’’), 65.2 (C4’), 57.9 (C5), 51.8 (OMe), 37.8 (C1’’), 29.7 (C3), 28.1 (C4’’’), 26.3 (C4) IR (NaCl)  cm-1) 1728, 1614, 1298, 1122, 1011 AE: Calculado para C21H27NO6: C = 64.77, H = 6.99, N = 3.60. Observado: C = 64.57, N = 3.969, H = 6.77 ‐264‐ Preparación de (E)-2-(pirrolidin-2-iliden)acetato de bencilo (100). A una disolución del producto de acoplamiento de Wittig 96 (63 mg, 0.236 mmol, 1eq) en CH2Cl2 seco (5 mL) se adiciona, gota a gota, ácido trifluoroacético (0.05 mL, 0.71 mmol, 3 eq). La mezcla se agita bajo argón a temperatura ambiente durante 3 horas, después de las cuales se añaden 3 equivalentes de TFA, también gota a gota. Despúes de 2 horas se adiciona una solución de NaHCO3 (sat.) hasta pH neutro. Se extrae con CH2Cl2 (5 mL x 3). Las fases orgánicas combinadas se secan (MgSO4), se filtra y lleva a sequedad. Se obtienen 32 mg del producto desprotegido, 100, como un aceite incoloro (R = 82%). 1H RMN (500 MHz, CDCl3) δ (ppm): 7.92 (1H, s.a., NH), 5.96 (1H, ddd, J = 22.6, 10.7, 5.5 Hz, H5’), 5.31 (1H, dd, J = 17.2, 1.5 Hz, H6’), 5.19 (1H, dd, J = 10.4, 1.1 Hz, H6’), 4.584 (1H, s, H1’), 4.573 (2H, s, H4’), 3.53 (2H, t, J = 6.9 Hz, H5), 2.60 (2H, t, J = 7.8 Hz, H3), 2.06–1.90 (2H, m, H4) 13C RMN (125 MHz, CDCl3) δ (ppm): 170.3 (C2’), 167.0 (C2), 133.8 (C5’), 116.8 (C6’), 76.1 (C1’), 63.3 (C4’), 47.1 (C5), 32.3 (C3), 22.0 (C4) ‐265‐ Preparación de (E)-2-(1-(N,N'-bis( terct - butoxicarbonil)carbamimidoil)-5-(2-metoxi-2-oxoetil)pirrolidin-2- iliden)acetato de bencilo (101). Se disuelve el producto desprotegido 97 (88 mg, 0.304 mmol, 1 eq) en DMF (12 mL) y se adiciona S-metil bisbocisotiourea (SMBBIT) (92 mg, 0.334 mmol, 1.1 eq), y trietilamina (0.13 mL 0.912 mmol, 3 eq). A esa mezcla, bajo argón, se añade cloruro de mercurio (91 mg, 0.334 mmol, 1.1 eq). La suspensión resultante se agita 12 horas a temperatura ambiente. Se lleva a sequedad, se agrega agua y se extrae con Et2O (10 mL x 3). Las fases orgánicas combinadas se lavan con NH4Cl (sat.), se secan (MgSO4), se filtran y se lleva a sequedad. Se purifica por columna cromatográfica utilizando una mezcla de n-Hexano:AcOEt (7:3) como fase móvil. Se obtiene el producto guanilado 101 como un aceite incoloro (79 mg, R = 49%). 1H RMN (500 MHz, CDCl3) δ (ppm): 8.16 (1H, s.a., NH), 7.36-7.34 (5H, m, Har), 5.65 (1H, s, H1’), 5.14 (2H, s, H4’), 4.76–4.65 (1H, m, H5), 3.70 (3H, s, OMe), 3.38 (1H, dd, J = 18.6, 8.4 Hz, H3), 3.18–2.96 (1H, m, H3), 2.61 (1H, d, J = 8.7 Hz, H1’), 2.49 (1H, dd, J = 15.7, 9.4 Hz, H1’), 2.30–2.17 (1H, m, H4), 1.99–1.78 (1H, m, H4), 1.46 (18H, s, H6’’’) ‐266‐ Preparación (E)-2-(1-(N,N'-bis( terct -butoxicarbonil)carbamimidoil) pirrolidin-2-iliden) acetato de bencilo (102). Se disuelve el producto desprotegido 98 (14 mg, 0.06 mmol, 1 eq) en DMF (2 mL) y se adiciona S-metil bisbocisotiourea (SMBBIT) (20 mg, 0.071 mmol, 1.1 eq), y trietilamina (0.03 mL 0.18 mmol, 3 eq). A esa mezcla, bajo argón, se añade cloruro de mercurio (19 mg, 0.071 mmol, 1.1 eq). La suspensión resultante se agita 12 horas a temperatura ambiente. Se lleva a sequedad, se agrega agua y se extrae con Et2O (10 mL x 3). Las fases orgánicas combinadas se lavan con NH4Cl (sat.), se secan (MgSO4), se filtran y se lleva a sequedad. Se purifica por columna cromatográfica utilizando una mezcla de n-Hexano:AcOEt (7:3) como fase móvil. Se obtiene el producto guanilado 102 como un aceite incoloro (12 mg, R = 43%). 1H RMN (500 MHz, CDCl3) δ (ppm): 7.43–7.34 (5H, m, Har), 5.85 (1H, s, H1’), 5.14 (2H, s, H4’), 3.86 (2H, t, J = 6.9 Hz, H5), 3.26 (2H, t, J = 7.0 Hz, H3), 2.04-1.95 (2H, m, H4), 1.51 (18H, s, H6’’) ‐267‐ Preparación de (E)-2-(1-(N,N'-bis( terct - butoxicarbonil)carbamimidoil)-5-(2-metoxi-2-oxoetil)pirrolidin-2- iliden)acetato de alilo (103). Se disuelve el producto desprotegido 99 (75 mg, 0.313 mmol, 1 eq) en DMF (10 mL) y se adiciona S-metil bisbocisotiourea (SMBBIT) (95 mg, 0.334 mmol, 1.1 eq), y trietilamina (0.15 mL 0.939 mmol, 3 eq). A esa mezcla, bajo argón, se añade cloruro de mercurio (94 mg, 0.344 mmol, 1.1 eq). La suspensión resultante se agita 12 horas a temperatura ambiente. Se lleva a sequedad, se agrega agua y se extrae con Et2O (10 mL x 3). Las fases orgánicas combinadas se lavan con NH4Cl (sat.), se secan (MgSO4), se filtran y se lleva a sequedad. Se purifica por columna cromatográfica utilizando una mezcla de n-Hexano:AcOEt (7:3) como fase móvil. Se obtiene el producto guanilado 103 como un aceite incoloro (88 mg, R = 59%). 1H RMN (500 MHz, CDCl3) δ (ppm): 8.14 (1H, s.a., NH), 5.92 (1H, tt, J = 10.8, 6.6 Hz, H5’), 5.62 (1H, s, H1’), 5.30 (1H, dt, J = 17.2, 2.8 Hz, H9), 5.24–5.12 (1H, m, H9), 4.70 (1H, ddd, J = 11.8, 7.3, 4.1 Hz, H5), 4.58 (2H, t, J = 4.9 Hz, H4’), 3.70 (3H, s, OMe), 3.37 (1H, dd, J = 18.7, 8.5 Hz, H3), 3.08 (1H, dd, J = 13.3, 4.5 Hz, H3), 3.07–2.99 (1H, m, H1’’), 2.48 (1H, dd, J = 15.7, 9.4 Hz, H1’’), 2.28–2.09 (1H, m, H4), 1.92–1.79 (1H, m, H4), 1.55–1.44 (18H, m, H6’’’) 13C RMN (125 MHz, CDCl3) δ (ppm): 171.3 (C2’’), 167.3 (C2’), 159.1 (C2), 151.3 (C3’’’), 132.9 (C5’), 117.5 (C6’), 94.7 (C1’), 77.8 (C5’’’), 64.2 (C4’), 60.1 (C5), 51.7 (OMe), 37.6 (C1’’), 29.9 (C3), 28.0 (C6’’’), 26.5 (C4) ‐268‐ Preparación de (E)-2-(1-(N,N'-bis( terct - butoxicarbonil)carbamimidoil)pirrolidin-2-iliden) acetato de alilo (104). N H O O SMBBIT HgCl2 TEA DMF calor N O O N H N O O O O 100 104 Se disuelve el producto desprotegido 100 (32 mg, 0.19 mmol, 1 eq) en DMF (5 mL) y se adiciona S-metil bisbocisotiourea (SMBBIT) (58 mg, 0.21 mmol, 1.1 eq), y trietilamina (0.08 mL 0.57 mmol, 3 eq). A esa mezcla, bajo argón, se añade cloruro de mercurio (57 mg, 0.21 mmol, 1.1 eq). La suspensión resultante se agita 12 horas a temperatura ambiente. Se lleva a sequedad, se agrega agua y se extrae con Et2O (10 mL x 3). Las fases orgánicas combinadas se lavan con NH4Cl (sat.), se secan (MgSO4), se filtran y se lleva a sequedad. Se purifica por columna cromatográfica utilizando una mezcla de n-Hexano:AcOEt (7:3) como fase móvil. Se obtiene el producto guanilado 104 como un aceite incoloro (47 mg, R = 6%). 1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ (ppm): 5.93 (1H, ddd, J = 22.6, 10.8, 5.6 Hz, H5’), 5.84 (1H, s, H1’), 5.31 (1H, d, J = 17.2 Hz, H9’), 5.22 (1H, d, J = 10.4 Hz, H9’), 4.59 (2H, d, J = 5.5 Hz, H4’), 3.85 (2H, t, J = 7.0 Hz, H5), 3.24 (2H, dd, J = 10.8, 4.4 Hz, H3), 1.96 (2H, p, J = 7.3 Hz, H4), 1.51 (18H, s, H6’’). 13C NMR (125 MHz, CDCl3) δ (ppm): 167.5 (C2’), 158.9 (C2), 152.1 (C3’’), 132.9 (C5’), 117.5 (C6’), 95.7 (C1’), 78.3 (C5’’), 64.2 (C4’), 52.4 (C5), 32.2 (C3), 28.0 (C6’’), 20.9 (C4) ‐269‐ Preparación de (2E)-(1-( terct -butoxicarbonil)-5-(2-metoxi- oxoetil)pirrolidin-2-iliden) ácido acético (105). Método A: A una solución de producto de partida, 95, (80 mg, 0.236 mmol, 1 eq) en acetonitrilo seco (2 mL) se le adiciona el complejo de paladio (108 mg, 0.094 mmol, 0. 4 eq) y morfolina (0.06 mL, 0. 74 mmol, 3 eq). La suspensión resultante se agita a temperatura ambiente durante 2 horas. Se filtra a través de celite y lleva a sequedad. Se purifica por columna cromatográfica utilizando una mezcla de n-Hexano:AcOEt (7:3) como fase móvil. Se obtiene el producto 105 como un aceite amarillo (48 mg, R = 68%). Método B: A una solución del producto de reacción de Wittig 93 (13 mg, 0.034 mmol, 1 eq) en AcOEt (5 mL) se agrega una punta de espátula de Paladio al 10 % sobre carbono. Se coloca bajo hidrógeno a una presión de 1 atm y se agita vigorosamente durante 2 horas. Se filtra a través de celite y se lleva a sequedad. Se obtienen 9 mg del producto 105 como un aceite amarillo que no se purifica. ‐270‐ 1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ (ppm): 6.46 (1H, s, H2’), 4.57 (1H, t, J = 7.5 Hz, H5), 3.71 (3H, s, OMe), 3.52 (1H, dd, J = 18.6, 8.9 Hz, H3), 3.00–2.85 (1H, m, H3), 2.79 (1H, d, J = 13.2 Hz, H1’’), 2.45 (1H, dd, J = 15.0, 10.2 Hz, H1’’), 2.13–1.98 (1H, m, H4), 1.89–1.79 (1H, m, H4), 1.55 (9H, s, H4’’’) 13C NMR (125 MHz, CDCl3) δ (ppm): 171.1 (C2’’), 158.7 (C1’) (FALTA C2), 151.2 (C1’’’), 96.1 (C2’), 83.2 (C3’’’), 58.1 (C5), 51.9 (OMe), 37.7 (C1’’), 28.4 (C3), 28.1 (C4’’’), 26.1 (C4) ‐271‐ Preparación de (2E)-(1-( tert -butoxicarbonil)pirrolidin-2-iliden) ácido acético (106). Método A: A una solución de producto de partida, 96, (63 mg, 0.236 mmol, 1 eq) en acetonitrilo seco (2 mL) se le adiciona el complejo de paladio (108 mg, 0.094 mmol, 0. 4 eq) y morfolina (0.06 mL, 0. 74 mmol, 3 eq). La suspensión resultante se agita a temperatura ambiente durante 2 horas. Se filtra a través de celite y se lleva a sequedad. Se purifica por columna cromatográfica utilizando una mezcla de n-Hexano:AcOEt (7:3) como fase móvil. Se obtiene el producto 106 como un aceite amarillo (38 mg, R = 71 %). Método B: A una solución del producto de reacción de Wittig 94 (97 mg, 0.31 mmol, 1 eq) en AcOEt (5 mL) se agrega una punta de espátula de Paladio al 10 % sobre carbono. Se coloca bajo hidrógeno a una presión de 1 atm y se agita vigorosamente durante 2 horas. Se filtra a través de celite y se lleva a sequedad. Se obtienen 69 mg del producto 106 como un aceite amarillo que no se purifica. 1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ (ppm): 6.50 (1H, s, H2’), 3.69 (2H, t, J = 7.2 Hz, H5), 3.27–3.15 (2H, m, H3), 1.93–1.84 (2H, m, H4), 1.54 (9H, s, H4’’) 13C NMR (125 MHz, CDCl3) δ (ppm): 173.2 (C1’), 159.5 (C2), 152.1 (C1’’), 95.0 (C2’), 82.4 (C3’’), 50.0 (C5), 32.3 (C3), 28.2 (C4’’), 20.8 (C4) ‐272‐ Preparación de 2-(1-( tert -butoxicarbonil)-5-(2-metoxi-2-oxoetil)- pirrolidin-2-il) ácido acético (107). A una solución del producto de reacción de Wittig 93 (29 mg, 0.09 mmol, 1 eq) en AcOEt (2 mL) se agrega una punta de espátula de Paladio al 10 % sobre carbono. Se coloca bajo hidrógeno a una presión de 4 atm y se agita vigorosamente durante 24 horas. Se filtra a través de celite y lleva a sequedad. Se obtienen 9 mg del producto 107 como un aceite amarillo que no se purifica. ‐273‐ Preparación de 2-(1-( tert -butoxicarbonil)pirrolidin-2-il) ácido acético (108).236 A una solución del producto de reacción de Wittig 94 (80 mg, 0.25 mmol, 1 eq) en AcOEt (6 mL) se agrega una punta de espátula de Paladio al 10 % sobre carbono. Se coloca bajo hidrógeno a una presión de 4 atm y se agita vigorosamente durante 24 horas. Se filtra a través de celite y lleva a sequedad. Se obtienen 52 mg del producto 108 como un aceite amarillo que no se purifica. 1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ (ppm): 4.14-4.13 (1H, m, H2), 3.36-3.34 (2H, m, H5), 2.36 (2H, d, J = 11.9 Hz, H4), 2.09-2.07 (1H, m, H3), 1.85 (2H, d, J = 27.2 Hz, H2’), 1.83-1.82 (1H, m, H3), 1.47 (9H, s, H4’’) 13C NMR (125 MHz, CDCl3) δ (ppm): 171.1 (C1’), 154.7 (C1’’), 79.9 (C3’’), 53.9 (C2), 46.2 (C5), 38.8 (C4), 31.3 (C2’), 28.7 (C4’’), 22.8 (C3) 236 D. W. Knight, A. C. Share, P. T. Gallagher, J. Chem. Soc. Perkin trans 1 1997, 14 , 2089- 2097. ‐280‐ Preparación del ácido del CBZ derivado (115). A una disolución de la amida 112 (95 mg, 0.126 mmol, 1 eq) en metanol seco (3 mL) se adicionan 25 mg de resina Dowex ácida (50W). Se agita a temperatura ambiente durante 8 horas bajo argón. Al cabo de ese tiempo se filtra y lleva a sequedad. Se obtienen 71.4 mg del alcohol 115 como un sólido blanco que no se purifica (R = 85%). 1H NMR (500 MHz, MeOD4) δ (ppm): 7.35 (10H, s.a., Har), 5.09 (4H, s), 3.56 (1H, t, J = 6.7 Hz), 3.34 (1H, dd, J = 11.2, 9.7 Hz), 3.24–3.10 (1H, m), 2.45– 2.23 (1H, m), 1.78 (1H, s), 1.75–1.67 (1H, m), 1.64–1.41 (1H, m), 1.30 (3H, s) 13C NMR (125 MHz, MeOD4) δ (ppm): 174.3, 171.5, 157.5, 151.5, 128.1, 127.6, 127.4, 127.3, 66.0, 61.6, 45.4, 43.1, 39.8, 32.6, 32.5, 32.3, 29.4, 29.4, 29.3, 29.2, 29.2, 29.1, 26.8, 25.6, 25.4, 24.4