Comparación de la producción local y sistemática de mediadores inflamatorios en distintos grupos celulares de pacientes con enfermedad pulmonar obstructiva crónica

UNIVERSIDAD DE SEVILLA FACULTAD DE MEDICINA COMPARACIÓN DE LA PRODUCCIÓN LOCAL Y SISTÉMICA DE MEDIADORES INFLAMATORIOS EN DISTINTOS GRUPOS CELULARES DE PACIENTES CON ENFERMEDAD PULMONAR OBSTRUCTIVA CRÓNICA Trabajo que presenta la licenciada Cecilia López Ramírez para optar al grado de Doctor en Medicina y Cirugía. Sevilla, 2019 D. JOSE LUIS LÓPEZ-CAMPOS BODINEAU, profesor asociado del departamento de Medicina de la Facultad de Medicina de la Universidad de Sevilla. CERTIFICA: Que Dña. Cecilia López Ramírez, Licenciada en Medicina y Cirugía, ha realizado bajo nuestra dirección el trabajo titulado “Comparación de la producción local y sistémica de mediadores inflamatorios en distintos grupos celulares de pacientes con Enfermedad Pulmonar Obstructiva Crónica”. Revisado el presente trabajo por creer que reúne las condiciones necesarias, estimamos que puede ser presentado como Tesis Doctoral. En Sevilla, 2019 Director de tesis, Dr. José Luis López-Campos Bodineau. Doctoranda, Cecilia López Ramírez. ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! CECILIA!LÓPEZ!RAMÍREZ.! Licenciado!en!Medicina!y!Cirugía! Universidad!de!Sevilla!! ! Especialista!en!Neumología! Hospital!Virgen!del!Rocío.!Universidad!de!Sevilla.! ! ! Director!de!Tesis:! JOSÉ!LUIS!LÓPEZ!–CAMPOS!BODINEAU! ! Profesor!Titular-!Departamento!de!Medicina,!Universidad!de!Sevilla.!! Instituto!de!Biomedicina!de!Sevilla!(IBiS).! CIBER!de!Enfermedades!Respiratorias!(CIBERES).!Instituto!de!Salud!Carlos!III,!Madrid,!España.! ! ! ! ©!2019!Ceclopram! Agradecimientos Quiero dar las gracias a Elena Arellano Orden por darme la oportunidad de llevar a cabo este trabajo en el grupo de investigación del Instituto de Biomedicina de Sevilla (IBIS). Gracias a José Luis López-Campos Bodineau, director y tutor de la presente tesis doctoral, de una manera especial por todo lo que me ha enseñado y por el tiempo que ha dedicado a guiarme y a ayudarme a que este trabajo tomase forma. Gracias a todos mis compañeros de la Unidad médico-quirúrgica de enfermedades respiratorias del Hospital Virgen del Rocío, colaboradores en la toma y procesado de las muestras, sin los cuales no hubiera sido posible la realización de esta tesis. Gracias a mi familia, a mis padres y hermanos, por entenderme y hacer que cada día merezca la pena. Y en especial a Juan Antonio, por estar siempre a mi lado. Tabla de contenido INTRODUCCIÓN*.....................................................................................................................*1! 1.!PRESENTACIÓN!.............................................................................................................................!2! 2.!ENFERMEDAD!PULMONAR!OBSTRUCTIVA!CRÓNICA!...............................................................!4! 2.1.$Concepto$............................................................................................................................$4! 2.2.$Epidemiología$.................................................................................................................$7! 2.2.1.!Prevalencia!....................................................................................................................................!7! 2.2.2!Morbilidad!y!Mortalidad!..........................................................................................................!9! 2.2.3!Impacto!económico!y!social!.................................................................................................!11! 2.3$Factores$de$riesgo.$Etiología$...................................................................................$12! Tabaquismo!............................................................................................................................................!12! Biomasa!...................................................................................................................................................!13! Contaminación!atmosférica!............................................................................................................!14! Exposición!laboral!...............................................................................................................................!14! Factores!genéticos!...............................................................................................................................!14! Otros!factores!........................................................................................................................................!15! 2.4$Diagnóstico$.....................................................................................................................$16! 2.5$Estadios$de$la$enfermedad$.......................................................................................$18! 2.6$Fisiopatología$................................................................................................................$20! 2.7$Patogenia$.........................................................................................................................$22! 2.7.1!Inflamación!local!.......................................................................................................................!23! 2.7.2!Disbalance!oxidativo.!..............................................................................................................!24! 2.7.3!Disbalance!proteasas/antiproteasas.!..............................................................................!24! 2.7.4!Apoptosis!.....................................................................................................................................!25! 3.!INFLAMACIÓN!PULMONAR!Y!SISTÉMICA!EN!LA!EPOC!.........................................................!26! 3.1$Consecuencias$de$la$inflamación$local$................................................................$26! 3.2$Inflamación$sistémica$y$sus$consecuencias$.......................................................$29! 3.2.1!Enfermedad!cardiovascular!.................................................................................................!31! 3.2.2!Diabetes!........................................................................................................................................!32! 3.2.3!Depresión!y!ansiedad!.............................................................................................................!32! 3.2.4!Desnutrición!y!miopatía!........................................................................................................!32! 3.2.5!Cáncer!de!pulmón.!Otras!.......................................................................................................!33! 4.!REACTANTES!DE!FASE!AGUDA!EN!LA!INFLAMACIÓN!SISTÉMICA.!......................................!34! HIPÓTESIS*Y*OBJETIVOS*...................................................................................................*38! 1.!HIPÓTESIS!...................................................................................................................................!39! 2.!OBJETIVOS!...................................................................................................................................!40! MÉTODO*.................................................................................................................................*41! 1.!OBJETIVO!1:!EXPRESIÓN!GÉNICA!TISULAR!.........................................................................!42! 1.1.$Población$de$estudio.$.................................................................................................$42! 1.2$Extracción$de$muestra$quirúrgica$y$sanguínea.$.............................................$44! 1.3$Métodos$de$medición.$.................................................................................................$45! 1.4$Determinaciones$de$laboratorio.$...........................................................................$46! 1.4.1!Expresión!génica!de!RFA!en!tejidos!y!sangre.!..............................................................!46! 1.4.2!Medición!de!marcadores!inflamatorios!en!el!plasma!...............................................!48! 2.OBJETIVO!2:!ESTUDIO!EN!MODELOS!CELULARES!...............................................................!49! 2.1$Estudios$in$vitro$con$células$procedentes$de$líneas$comerciales$............$49! 2.1.1!Cultivo!in$vitro!de!células!humanas!..................................................................................!49! 2.1.2!Experimentos!de!estimulación!de!las!células!con!IL-1!............................................!49! 2.1.3!Estudios!de!expresión!génica.!.............................................................................................!50! 2.1.4!Cuantificación!proteica……………………………………………………………………...……..51! 3.!ASPECTOS!ÉTICOS.!.....................................................................................................................!52! 4.!ANÁLISIS!ESTADÍSTICO.!............................................................................................................!53! RESULTADOS*........................................................................................................................*54! 1.!DESCRIPCIÓN!DE!LA!MUESTRA!................................................................................................!55! 2.!OBJETIVO! 1:!EXPRESIÓN! GÉNICA! TISULAR! DE! BIOMARCADORES! Y! CORRELACIÓN! CON! EXPRESIÓN!PROTEICA!EN!SUERO!.................................................................................................................!59! 2.1.$Expresión$de$RFA$en$parénquima$pulmonar$..................................................$59! 2.2.$Expresión$de$RFA$en$arteria$pulmonar$.............................................................$63! 2.3.$Expresión$de$RFA$en$leucocitos$de$sangre$periférica$..................................$66! 2.4.$ Comparación$ en$ la$ expresión$ de$ RFA$ entre$ los$ diferentes$ tipos$ de$ muestras$..................................................................................................................................................$69! 2.5.$Asociaciones$entre$la$expresión$de$los$RFA$en$los$diferentes$tipos$de$ muestras.$.................................................................................................................................................$72! 2.6.$Asociaciones$entre$la$expresión$génica$de$RFA$y$sus$concentraciones$ plasmáticas$.............................................................................................................................................$72! 3.!OBJETIVO!2.!RFA!EN!CÉLULAS!RESPIRATORIAS!Y!COMPARACIÓN!CON!HEPATOCITOS!.!78! 3.1.$Evaluación$de$la$expresión$génica$y$concentraciones$ proteicas$entre$ tipos$celulares$........................................................................................................................................$78! 3.2.$Evaluación$de$la$expresión$génica$y$concentraciones$proteicas$ entre$ pulmón$e$hígado$...................................................................................................................................$95! DISCUSIÓN*..........................................................................................................................*105! CONCLUSIONES*.................................................................................................................*118! ANEXOS*...............................................................................................................................*120! I.!CONSENTIMIENTO!INFORMADO!.............................................................................................!121! II.!CUADERNOS!DE!RECOGIDA!DE!DATOS!(CRD)!....................................................................!125! III.!ÍNDICE!CHARLSON-EDAD!.....................................................................................................!128! BIBLIOGRAFÍA*..................................................................................................................*132! Índice de tablas Tabla 1. Secuencia genotipada, sentido y antisentido, en cada uno de los genes estudiados. ........................................................................................................... 48! Tabla 2. Características generales de la población de estudio. ....................................... 57 Tabla 3. Descripción del tipo de cirugía e histología de los tumores. ............................ 58 Tabla 4. Expresión génica de AAS y PCR de células epiteliales, fibroblastos y hepatocitos frente a controles. .......................................................................... ...79 ! – 2 – 1. Presentación La presente Tesis Doctoral se enmarca en el estudio de la enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC) como enfermedad con repercusión sistémica. Durante la presente introducción abordaremos de manera ordenada el estado del tema de estudio hasta el momento de comenzar nuestras experiencias en el laboratorio. En concreto abordaremos: - Una breve descripción del concepto actual de enfermedad, incidiendo en la importancia de la determinación funcional para el diagnóstico y su categorización. - Una breve descripción de su epidemiología, centrándonos en su prevalencia, mortalidad y morbilidad. - Conceptos básicos sobre su diagnóstico y detección en pacientes con factores de riesgo. - Describir la patogenia de la enfermedad, discutiendo sobre los principales tipos celulares implicados en su génesis. - Evaluar la importancia de la inflamación sistémica dentro del nuevo marco conceptual de la EPOC como enfermedad con repercusión sistémica. – 3 – - Describir los principales reactantes de fase aguda mayores como parte de la inflamación sistémica y base de nuestro estudio. - Evaluar que mediadores inflamatorios en células pulmonares forman parte de la inflamación sistémica, estudiando la importancia de la activación de dicha respuesta a nivel pulmonar mediante su comparación con la síntesis fisiológica a nivel hepático. – 4 – 2. Enfermedad pulmonar obstructiva crónica 2.1. Concepto La EPOC es una enfermedad multidimensional, inflamatoria y progresiva que afecta no sólo a las vías respiratorias y los pulmones, sino también a la circulación pulmonar, a la musculatura respiratoria y a diversos órganos extrapulmonares. En 2004, la European Respiratory Society (ERS) y la American Thoracic Society (ATS) publicaron un documento de consenso en el que se define la EPOC como “un proceso prevenible y tratable, caracterizado por una limitación al flujo aéreo no completamente reversible, generalmente progresiva y asociada a una respuesta inflamatoria anormal de los pulmones a partículas o gases nocivos, fundamentalmente producidos por el hábito tabáquico”1. Por otra parte, la Global Iniciative for Chronic Obstructive Lung Disease (GOLD) publicó en 2017 una definición similar: “la EPOC es una enfermedad común, prevenible y tratable, que se caracteriza por la presencia de síntomas respiratorios persistentes y una limitación al flujo aéreo que se debe a anomalías en las vías aéreas y/o en los alveolos, generalmente causado por una exposición significativa a partículas nocivas o gases “2. Sin embargo, actualmente, aunque parece haber un consenso en – 5 – cómo definir y denominar la enfermedad, aún existen aspectos no exentos de debate en relación a la definición e identificación de esta enfermedad. En primer lugar, el concepto de EPOC lleva implícito una serie de definiciones cuyo significado es necesario entender en el marco de la enfermedad. Es destacable el establecer que se trata de una entidad «prevenible y tratable». Con ello se pretenden destacar dos aspectos clave de la EPOC: por un lado, su posible prevención mediante la evitación de su principal factor de riesgo, el consumo de tabaco y, por otro, su definición sobre la base de una alteración funcional (obstrucción crónica y poco reversible). La limitación u obstrucción crónica al flujo aéreo (OCFA) característica de la EPOC es consecuencia de la enfermedad de la vía aérea pequeña (bronquiolitis obstructiva) y la destrucción parenquimatosa (enfisema). La bronquitis crónica (BC) constituye la manifestación clínica fundamental de la afectación del árbol traqueobronquial en la EPOC. Por consenso internacional, se acepta que un paciente padece BC si presenta tos y expectoración durante más de tres meses al año, dos años consecutivos, en ausencia de otras causas que puedan explicarla como bronquiectasias (BQ) 1. La bronquiolitis, es decir, la inflamación de la pequeña vía aérea periférica de calibre inferior a 2 mm también está presente en la EPOC. De hecho, es su presencia la que contribuye de forma más notable a la limitación del flujo aéreo que caracteriza la enfermedad 3. El enfisema pulmonar se define en términos anatomopatológicos como la destrucción permanente de los espacios aéreos más allá del bronquiolo terminal 4. La desaparición de las paredes alveolo-capilares supone la coalescencia de alveolos vecinos, causa la aparición de auténticas cavidades en el seno del parénquima pulmonar (bullas), dificulta el tránsito de la sangre a través de la circulación pulmonar, lo que es motivo de hipertensión arterial pulmonar (HAP) y cor pulmonale, y altera de forma notable el intercambio pulmonar de gases, especialmente durante el ejercicio. Actualmente sabemos que el concepto de OCFA empleado para definir la enfermedad no se justifica por parámetros clínicos o anatomopatológicos, sino que implica objetivar una OCFA mediante la realización de una espirometría en todos los casos. Sin embargo, padecer una OCFA no equivale a tener una EPOC, ya que existen otras enfermedades que también pueden cursar con una obstrucción en la espirometría (como el asma bronquial, las BQ, las bronquiolitis o lesiones residuales por tuberculosis, entre otras). Por otro lado, el concepto de OCFA ha sufrido un ligero matiz al definirse inicialmente como descenso de los flujos que no cambian notablemente durante varios meses de – 6 – seguimiento 5 hasta el concepto actual de obstrucción no completamente reversible. Este pequeño cambio denota que la EPOC admite que algunos pacientes pueden tener cierto grado de reversibilidad bronquial en la prueba broncodilatadora o tras un tiempo de tratamiento. El punto de corte para establecer una prueba broncodilatadora significativa también ha variado discretamente y se ha situado en 12% y 200 mL 6. Inicialmente, se consideró que una prueba broncodilatadora positiva sería un indicador de una buena respuesta a tratamiento. Sin embargo, esto no se ha demostrado y actualmente no se recomienda el porcentaje de cambio de volumen espirado durante el primer segundo (FEV1) ni para el diagnóstico de la enfermedad, ni para el diagnóstico diferencial con asma, ni para predecir la respuesta al tratamiento 6. En segundo lugar, la afectación extrapulmonar resulta un aspecto esencial para evaluar el impacto global de la enfermedad en el individuo. Se reconoce el papel de uno de sus mecanismos patogénicos más importantes: la respuesta inflamatoria. Es evidente que, en su concepción actual, el término EPOC no sólo se circunscribe exclusivamente al pulmón, sino que también tiene consecuencias sistémicas significativas, siendo por ello una enfermedad multicompartimental en la que conceptos clásicos como los de BC o enfisema y otros más novedosos como inflamación sistémica, agudizaciones o afectación vascular, son algunas de las posibles manifestaciones de la enfermedad que dan lugar a los distintos fenotipos de la misma. Los denominados efectos sistémicos de la EPOC son de descripción relativamente reciente. Aunque en la actualidad es imposible determinar si se trata de una mera asociación de circunstancias o si la EPOC es per se la responsable de la afectación sistémica de muchos pacientes, lo bien cierto es que las guías de actuación clínica no se limitan exclusivamente al aspecto pulmonar de la EPOC 2,7. Aspectos tales como la inflamación sistémica, la HAP, la comorbilidad cardiovascular, la malnutrición, la disfunción muscular esquelética, las alteraciones endocrino-metabólicas, la anemia, la ansiedad o la comorbilidad infecciosa, deben ser tenidos en cuenta en el manejo de la EPOC 8. – 7 – 2.2. Epidemiología El estudio de la epidemiología de la EPOC es una de las prioridades de la investigación de la enfermedad. Los principales datos sobre epidemiología de la EPOC son de prevalencia, mortalidad y morbilidad. La estimación de estas cifras varía entre países, y, en general, están relacionadas de manera directa con la prevalencia del tabaquismo. Factores como la composición y edad de la muestra escogida en la población general, los criterios diagnósticos utilizados, la exposición de la población al tabaquismo y, probablemente, a otros factores ambientales, unido al problema que se deriva de la diversa nomenclatura empleada en el pasado para referirse a la EPOC, explica las diferencias importantes que se pueden encontrar 9. 2.2.1. Prevalencia La EPOC es la enfermedad respiratoria más frecuente en adultos y cuya prevalencia aumenta con la edad 10. El estudio de la prevalencia de la EPOC muestra grandes variaciones dependiendo de la región geográfica estudiada y los criterios diagnósticos empleados para identificar casos. En términos generales, cualquiera que sea la enfermedad, la prevalencia estimada depende de la definición que se use para el diagnóstico. En el caso de la EPOC, se han utilizado diferentes métodos, incluyendo el diagnóstico médico 11, el diagnóstico basado en la presencia de síntomas respiratorios o el diagnóstico basado en la presencia de limitación crónica al flujo aéreo (con o sin una prueba broncodilatadora). Como es de esperar, cada uno de estos métodos aporta resultados muy diversos 12. Desde que se publicaron los documentos GOLD, se aceptó el requisito de la espirometría posbroncodilatadora para establecer el diagnóstico de EPOC, lo que sigue considerándose actualmente como el método de referencia. A pesar de que la espirometría se ha considerado como un método más costoso y requiere una mayor infraestructura que otras formas simplificadas de evaluación de la función pulmonar, es conocido que obtiene cifras de prevalencia más reales. Por este motivo la espirometría es el método recomendando por la guía española de la EPOC (GesEPOC) 13. De manera complementaria, se han publicado algunos cuestionarios que podrían ser utilizados como herramienta de cribado para la detección de casos como el COPD-PS (Chronic Obstructive Pulmonary Disease-Population Screener) 14. – 8 – En los últimos años se han realizado estudios epidemiológicos fiables y reproducibles independientemente de la región geográfica y de los recursos económicos disponibles. Estos estudios se han llevado a cabo según el consenso de la ATS con la ERS y del documento GOLD de 2010 6,15. En España, se han realizado diversos estudios epidemiológicos de base poblacional, el más importante de los cuales es el estudio IBERPOC, realizado a finales del siglo pasado y diseñado para medir la prevalencia y la variación de la distribución de la EPOC en España. Según los resultados de este estudio, la prevalencia de síntomas respiratorios crónicos para la población general está situada en el 4,8% (intervalo de confianza al 95%: 4,1 – 5,4%) para la BC, 40% (IC95%: 38,7 – 41,7%) para la presencia de sibilantes y 13,5% (IC95%: 12,5 – 14,6%) para la tos crónica. De tal manera que el 48% (IC95%: 46,4 – 49,5%) de la población española refería algún síntoma respiratorio. Al incluir la espirometría como diagnóstico, la prevalencia de la enfermedad se estimó en 9,1% (IC95%: 8,1 – 10,2%), que ha sido considerada como prevalencia de la EPOC en España 16. Un dato interesante del estudio IBERPOC es que no había un diagnóstico previo de EPOC en el 78,2% de los pacientes incluidos y diagnosticados de EPOC 17, con lo que la prevalencia de la enfermedad se habría infraestimado considerablemente si se hubiera empleado los informes médicos como método de estimación de la prevalencia. Otro estudio epidemiológico de base poblacional en España es el estudio EPISCAN que actualiza en 2007 los datos de prevalencia en nuestro país 18. Según el estudio EPI-SCAN se estima que, entre los 21,4 millones de españoles con una edad entre 40 y 80 años hay 2.185.764 que presentan EPOC. Por sexos, las cifras corresponden a 1.571.868 varones y 628.102 mujeres. Y ya que el 73% aún no está diagnosticado, puede decirse que más de 1.595.000 españoles aún no lo sabe y, por tanto, no recibe ningún tratamiento para su EPOC 19. Sin embargo, según recientes estimaciones de la Organización Mundial de la Salud (OMS) de la Carga Mundial de Enfermedades (Global Burden of Disease Study —GBD—) 2015,) 20, el número de casos de EPOC en España ha aumentado de los 2,1 millones estimados según EPISCAN en 2007 a 2,9 millones en 2015. En cambio, la prevalencia mundial tiende a la baja, puesto que la estimación de casos de EPOC en el mundo ya no es de 240 millones anuales sino de 174 millones. – 9 – Finalmente, es importante conocer otros estudios de prevalencia de la EPOC a nivel mundial. El estudio BOLD (proyecto Burden of Lung Disease) 21, obtuvo datos de prevalencia de 12 lugares del mundo de los 5 continentes y determinó una prevalencia global para el estadío GOLD II o superior de 10,1% (11,8% para los hombres y 8,5% para las mujeres). En este estudio, la prevalencia de la EPOC estaba relacionada con la edad y el consumo de tabaco en paquetes-año con aumentos significativos de prevalencia al aumentar alguna de estas dos variables, pero con mayor variación para las mujeres, según el área geográfica. Curiosamente, la prevalencia de los no fumadores fue similar a la de los fumadores con un consumo < 10 paq-año. Además, recientemente, siguiendo la propuesta de un estudio anterior de la iniciativa PLATINO 22 (Proyecto Latinoamericano de Investigación en Obstrucción pulmonar), BOLD amplía la opción de utilizar el pico de flujo (PEF) para el cribado de la EPOC. Así, en un sofisticado análisis, BOLD propone 2,2 l/m2/s como el umbral de pico de flujo prebroncodilatación expresado en unidades de litros por segundo por la altura en metros al cuadrado para identificar EPOC moderada a grave 23. Este umbral de 2,2 l/m2/s ha sido propuesto porque tiene la mejor sensibilidad frente al valor predictivo positivo y la mejor relación coste-beneficio entre los diferentes escenarios de la combinación del PEF, cuestionarios y espirometría. En definitiva, BOLD concluye que la medición del PEF en todo el mundo, sin broncodilatación, y dentro del contexto de cualquier sistema de salud, es un paso hacia adelante rápido, barato y cómodo para mejorar la detección de casos de EPOC. 2.2.2 Morbilidad y Mortalidad La EPOC es una causa elevada de morbilidad, mortalidad y discapacidad en España. Los datos de morbilidad en EPOC presentan problemas metodológicos, ya que están sujetos a registros sobre la accesibilidad de la atención sanitaria y la utilización de los servicios sanitarios (número de visitas al médico, los ingresos por agudizaciones y las visitas a urgencias) de cada área geográfica. Siendo la EPOC una enfermedad crónica y progresiva es esperable encontrar una alta carga de enfermedad y morbilidad. Los estudios de carga de enfermedad tienen como objetivo medir y comparar la pérdida de salud de la población por distintas causas, considerando las consecuencias mortales y no mortales de las enfermedades 24 a través del indicador sintético “Años de – 10 – Vida Ajustados por Discapacidad” (AVAD). Los AVAD resultan de la combinación de los Años de Vida Perdidos (AVP) o mortalidad prematura y los Años Vividos con Discapacidad (AVD) o mala salud. Según la Encuesta de Morbilidad Hospitalaria de 2005 las altas por EPOC supusieron el 6,5% del total. En España las enfermedades respiratorias suponen la 4ª causa de carga de enfermedad (7,5% del total de AVAD) con un componente importante de discapacidad. En hombres, la EPOC se encuentra entre las enfermedades con un mayor número de AVAD (4,1% sobre el total de AVAD), siendo en mujeres la carga de enfermedad algo inferior (1,3% sobre el total de AVAD) 25. En 2015 la EPOC causó el 2,6% de AVAD. Las estimaciones globales de mortalidad realizadas por la OMS recientemente actualizadas, reiteran que la EPOC ha pasado de ser la quinta causa de muerte en 1990 a la cuarta desde el año 2000, sólo por detrás de la enfermedad coronaria isquémica dentro de las enfermedades cardiovasculares (ECV), la cerebrovascular y el Alzheimer, y por delante del cáncer de pulmón (CP), y se espera que sea la tercera en 2020 26,20. Según estos datos, en 2015, la EPOC provocó el fallecimiento de 3,2 millones de personas, lo que supuso un aumento de la mortalidad por esta causa del 11,6% respecto a 1990, y que dado su relación con el tabaquismo la convierten en una de las mayores causas de muerte evitable. Conocer el motivo por el que un paciente con EPOC fallece es importante porque puede identificar dianas terapéuticas. Múltiples estudios coinciden en señalar la dificultad que supone especificar la causa última de la muerte 27, más aún en los pacientes con EPOC, ya que con frecuencia padecen enfermedades graves cuya presentación final es muy similar a la EPOC 28. La mortalidad global a los 4-7 años en los pacientes diagnosticados con EPOC, con una media de 65-70 años, oscila entre el 30-48% 29, con tasas de mortalidad del 3,6% anual 30, y de 12,7 fallecimientos por cada 100 personas-año de seguimiento 31, dependiendo, sobre todo, de la severidad de la obstrucción aérea en el momento del diagnóstico 29,32,33. Los pacientes con EPOC grave fallecen al menos 3 años antes que aquellos con enfermedad moderada, y estos, 4 años antes que los pacientes control a igualdad de edad y sexo 34. La insuficiencia respiratoria es la principal causa de mortalidad en los pacientes con EPOC que fallecen en el hospital 35,36, pero aun así constituyen menos del 50% de los muertos de ese grupo, – 11 – correspondiendo el resto a ECV, infecciones respiratorias, embolismos pulmonares, CP y otros tumores 37,38. El análisis de mortalidad realizado durante el estudio TORCH (Toward a Revolution in COPD Health) 39 reveló que, de manera global, la mayoría de los pacientes (35%) fallecieron por causa respiratoria, seguidos de las causas cardiovasculares (26%) y del cáncer (21%). Por otro lado, las causas de mortalidad varían según el grado de gravedad de la EPOC. En los pacientes con EPOC leve o moderada la principal causa de mortalidad es el cáncer y las ECV, mientras que en los EPOC con FEV1< 60% el fallo respiratorio es la causa más importante 40. De cualquier modo, parece que los pacientes con EPOC fallecen más como consecuencia de una enfermedad concomitante que por la misma EPOC. 2.2.3 Impacto económico y social En España, el impacto que la EPOC genera sobre los costes económicos es considerable. El coste anual por paciente con EPOC es alto en comparación con otras patologías respiratorias crónicas, como el asma 41. Existen unos costes hospitalarios notablemente mayores, explicados en parte por la mayor edad media de los pacientes y por el progresivo e irreversible deterioro de la función respiratoria 42,43. La EPOC ocasiona el 10% de las consultas de neumología, el 7% de todos los ingresos hospitalarios y el 35% de las incapacidades laborales permanentes, por lo que el impacto sanitario, social y económico es elevado. Varios estudios realizados en España, resto de Europa y América han tratado de estimar el coste global de la enfermedad. Los resultados son dispares, y entre las razones que pueden explicar esto, se encuentran las diferencias en el coste sanitario entre países y el método empleado. En España los datos del estudio IBERPOC permitieron estimar que el coste de la EPOC fue de 238,82 millones de euros, derivados únicamente de costes sanitarios directos. Se hizo multiplicando el coste por paciente diagnosticado de EPOC en el estudio, por el número de pacientes extrapolados de la prevalencia de la enfermedad encontrada en el propio estudio IBERPOC 44. La mayor carga era por hospitalizaciones (41%) seguido del gasto en tratamiento farmacológico (37%). Del coste total del tratamiento farmacológico de la EPOC, los fármacos administrados para el tratamiento – 18 – una mayor frecuencia de agudizaciones que los pacientes sin expectoración crónica 70,71,72. • Fenotipo agudizador con enfisema: El fenotipo enfisema incluye a los pacientes con EPOC con diagnóstico clínico/radiológico/funcional de enfisema, que presentan disnea e intolerancia al ejercicio como síntomas predominantes. Los pacientes con fenotipo enfisema presentan una tendencia a un índice de masa corporal reducido. No debe confundirse el diagnóstico de fenotipo enfisema con la presencia de enfisema pulmonar. Los signos de enfisema pueden encontrarse en cualquiera de los fenotipos, e incluso en fumadores sin criterios de EPOC. Figura 1. Combinaciones fenotípicas según GesEPOC. 2.5 Estadios de la enfermedad La reducción del flujo aéreo es la alteración funcional dominante en la EPOC, por lo que las mediciones espirométricas constituyen la herramienta principal para establecer el diagnóstico de la enfermedad, evaluar la gravedad y seguir el curso evolutivo. El FEV1, expresado como porcentaje del valor de referencia, es el mejor indicador de la gravedad de la obstrucción del flujo aéreo 73. Dado que la EPOC cubre – 19 – un amplio espectro de formas clínicas, se propone la siguiente clasificación en cuatro grados de severidad sobre la base del valor del FEV16: • EPOC leve (estadio I de la GOLD): FEV1 es mayor o igual al 80% del valor de referencia; • EPOC moderada (estadio II de la GOLD): FEV1 es menor del 80% pero mayor o igual al 50% del valor de referencia; • EPOC grave (estadio III de la GOLD): FEV1 es menor del 50% pero mayor o igual al 30% del valor de referencia. • EPOC muy grave (estadio IV de la GOLD): FEV1 es menor del 30% del valor de referencia. Los límites que se establecen son de carácter empírico y corresponden con los establecidos por las distintas sociedades74, con el objetivo de facilitar las recomendaciones sobre las pautas de tratamiento y el empleo de los recursos sanitarios. La GOLD 2017 clasifica a los pacientes con EPOC en una cuadrícula con 4 categorías identificada con las letras A, B, C y D, según la evaluación de los síntomas (grado de disnea según la escala modificada de la Medical Research Council (mMRC) o puntuación en el cuestionario CAT (COPD Assessment Test)) y el número de exacerbaciones, representados en el eje horizontal y vertical de la cuadrícula, respectivamente. De esta manera, los grupos A y C corresponden a los pacientes menos sintomáticos (disnea < 2 de la mMRC o puntuación CAT <10) mientras que los grupos B y D representan una mayor carga sintomática (disnea ≥ 2 de la mMRC o puntuación CAT ≥10). En función del número de exacerbaciones se definen los grupos A y B con ≤1 exacerbaciones anuales ambulatorias, mientras que los pacientes de los grupos C y D tienen exacerbaciones más frecuentes (≥2) o ≥1 con hospitalizaciones. – 20 – Figura 2. Esquema de evaluación clínica del paciente con EPOC, propuesto por la estrategia GOLD 2017. 2.6 Fisiopatología Los cambios fisiopatológicos característicos de la EPOC incluyen la hipersecreción mucosa, la disfunción ciliar, la limitación al flujo aéreo, la hiperinsuflación pulmonar, las alteraciones en el intercambio de gases, la hipertensión pulmonar, el cor pulmonale y las manifestaciones sistémicas. – 21 – Hipersecreción mucosa y disfunción ciliar: La inflamación pulmonar en la EPOC se asocia con un incremento de células caliciformes e hiperplasia de glándulas mucosas, responsables directas de la hiperproducción de moco característica de algunos pacientes con la enfermedad. Asimismo, el tabaco modifica la respuesta de las células epiteliales ciliadas con alteraciones en el barrido mucociliar, permitiendo la colonización por microorganismos y favoreciendo la infección. Estos cambios pueden estar presentes incluso varios años antes de que aparezcan otros alteraciones fisiológicas observadas en la EPOC 75. Limitación al flujo aéreo e hiperinsuflación pulmonar: La principal característica fisiopatológica de la EPOC es la limitación espiratoria al flujo aéreo como consecuencia del estrechamiento de la vía aérea periférica y, en menor medida, de la pérdida de elasticidad y destrucción del parénquima pulmonar, como resultado del enfisema, y de la oclusión de la luz por secreciones mucosas 76. A medida que progresa la obstrucción, el vaciado pulmonar es más lento y el intervalo entre los esfuerzos inspiratorios no permiten la espiración completa, lo que produce una hiperinsuflación por atrapamiento aéreo. Como consecuencia de ello, la musculatura inspiratoria se acorta y se hace menos efectiva para generar la tensión deseada. La hiperinsuflación puede cambiar el radio de curvatura del diafragma, colocándolo en desventaja mecánica, lo que supone una sobrecarga adicional para los músculos inspiratorios. Todo ello lleva a un incremento de la sensación de esfuerzo muscular y la consiguiente disnea. Este efecto deletéreo de la hiperinsuflación se ve aumentado durante el ejercicio. Alteraciones en el intercambio de gases: En estadios avanzados de la enfermedad, la obstrucción en la vía aérea periférica, la destrucción del parénquima y las alteraciones vasculares pulmonares reducen la capacidad pulmonar para el intercambio de gases, lo que produce hipoxemia y, en una fase posterior, hipercapnia. El desequilibrio en la relación ventilación/perfusión es el principal mecanismo implicado en la hipoxemia. La hipercapnia crónica generalmente refleja disfunción de la musculatura inspiratoria e hipoventilación alveolar. Hipertensión arterial pulmonar y cor pulmonale: La HAP en el paciente con EPOC suele aparecer de forma tardía, generalmente después del desarrollo de hipoxemia grave (PaO2 < 60 mmHg) y suele ser leve o moderada. Sin embargo, la hipoxemia puede empeorar transitoriamente durante las agudizaciones, el ejercicio e – 22 – incluso el sueño. Los factores implicados actualmente en el desarrollo de la HAP son la vasoconstricción, el remodelado de las arterias pulmonares 77 (engrosamiento de la íntima de las arterias musculares y muscularización de las arteriolas) y la destrucción del lecho capilar pulmonar producido por el enfisema. En las fases avanzadas de la enfermedad, la hipoxia juega un papel principal en el desarrollo de la HAP, y produce vasoconstricción de las arterias pulmonares y remodelado de las paredes vasculares. La HAP se asocia al desarrollo posterior de cor pulmonale, definido éste como una “hipertrofia del ventrículo derecho debida a enfermedades que afectan a la función y/o estructura pulmonar, excepto cuando estas alteraciones pulmonares sean el resultado de enfermedades primarias del lado izquierdo del corazón, como las cardiopatías congénitas”. 2.7 Patogenia Desde el punto de vista de la patogenia de la EPOC, a pesar de ser una enfermedad con un agente causal conocido, aún existen numerosos aspectos desconocidos sobre los mecanismos biológicos que llevan a la aparición de la enfermedad. El principal motivo de controversia es dilucidar por qué algunos sujetos fumadores desarrollan la enfermedad mientras otros no. Sabemos que sólo el 15-20% de los fumadores desarrollan la enfermedad, por lo que el tabaco es una causa necesaria pero no suficiente. En la mayoría de los fumadores esta inflamación local inducida por el humo del tabaco es autolimitada y la enfermedad no se desarrolla. En este contexto, los cambios que acontecen parecen estar limitados exclusivamente a una función fisiológica reparadora tras una agresión. Sin embargo, en una subpoblación elevada de fumadores (15-20%) esta respuesta autolimitada en un momento determinado cambia a un proceso inflamatorio irreversible e independiente de la continuación del hábito tabáquico 78. Hasta el momento no se conocen los factores relacionados con este cambio y mientras no los conozcamos seguiremos sin conocer uno de los datos fundamentales en la patogenia de la enfermedad. La inflamación del aparato respiratorio en la EPOC ha sido extensamente estudiada durante las últimas décadas. De su estudio se desprende que se trate de una – 23 – enfermedad predominantemente neutrofílica en la que los linfocitos CD8 juegan un papel importante. Desde el punto de vista patogénico parece que puede estar implicados al menos 4 mecanismos: inflamación local, disbalance oxidativo, apoptosis y disbalance proteasas/antiproteasas. 2.7.1 Inflamación local Con respecto a la inflamación local nos referimos a los mecanismos inflamatorios relacionados directamente con la enfermedad que ocurren en el aparato respiratorio. Esta afectación puede ocurrir en las vías aéreas centrales, periféricas y el parénquima pulmonar 7. En pacientes EPOC se observa una respuesta anómala del organismo ante el estímulo del humo del tabaco. Aun así, el tabaquismo crónico produce una reacción inflamatoria en todos los fumadores, pero sólo una parte de estos fumadores serán “susceptibles” al desarrollo de la enfermedad. Es en estos pacientes donde se objetiva una inflamación excesiva. Es importante por ello comentar en este punto el estudio publicado por Lappere y cols 79, en el que empleando un diseño observacional transversal estudiaron a un grupo de 114 pacientes con EPOC. Se estudió la inflamación presente en biopsias bronquiales y compararon 3 grupos de pacientes: fumadores activos, exfumadores de menos de 3,5 años de abandono del hábito tabáquico y exfumadores de más de 3,5 años sin hábito tabáquico. Los autores observaron que el infiltrado celular persistía de manera similar en los 3 grupos, a pesar de llevar un tiempo sin fumar, por lo que la inflamación perpetúa en el tiempo a pesar de haber dejado de fumar. Por tanto, ante el estímulo inflamatorio provocado por el humo de tabaco (o por productos gaseosos procedentes de la combustión de biomasa) se desencadena una reacción inflamatoria persistente. De este estudio se desprende que una vez establecida la inflamación, ésta parece ser independiente del consumo de tabaco. Por otro lado, las agudizaciones se asocian a un aumento de la reacción inflamatoria local con un aumento de diversos marcadores inflamatorios durante la misma, lo cual parece ser independiente al estadio de la enfermedad y a la etiología de la agudización 80. Aunque los pacientes con EPOC estable tienen ya una inflamación bronquial, caracterizada por macrófagos y linfocitos CD8, este patrón cambia durante – 24 – las exacerbaciones, con un incremento de neutrófilos e, incluso, en los más leves, eosinófilos. Aun así, la posible relación entre la inflamación y la causa, la frecuencia y la gravedad de una agudización no está clara. Trabajos recientes en el estudio del componente inflamatorio, describen que los principales elementos celulares implicados en esta respuesta inflamatoria son las células epiteliales bronquiales, los fibroblastos, las células dendríticas, los macrófagos, neutrófilos y linfocitos CD8 81. 2.7.2 Disbalance oxidativo. El estrés oxidativo o, mejor dicho, el disbalance oxidantes/antioxidantes parece tener un papel relevante en la patogenia de la EPOC. El desequilibrio entre oxidantes exógenos y antioxidantes endógenos produce la lesión de los componentes de la matriz extracelular y del epitelio de la vía aérea, así como inflamación mediada por citocinas. El humo del tabaco contribuye al estrés oxidativo, ya que es una gran fuente de oxidantes, principalmente radicales libres y óxido nítrico, y favorece la acumulación de leucocitos en el pulmón, que también liberan radicales libres y producen cambios conformacionales en las proteínas alterando su estructura y función 82. Además, es de suponer que cualquier alteración genética en las enzimas antioxidantes presentes en el pulmón, como la glutatión-S-transferasa (GST) 83, la superóxido dismutasa (SOD) y la catalasa, entre otras, produzca un aumento del estrés oxidativo y, por tanto, del daño pulmonar producido por el tabaco. Por otro lado, el estrés oxidativo tiene un papel en la activación de las proteasas, facilitando su acción y estimulando de esta manera esa otra vía patogénica. 2.7.3 Disbalance proteasas/antiproteasas. El disbalance entre proteasas y antiproteasas fue descrito como mecanismo de importancia en el enfisema ante el hallazgo de la deficiencia genética de alfa1 antitripsina, principal inhibidor de la elastasa de neutrófilos en el tracto respiratorio. Las células inflamatorias liberan varias proteasas que exceden la protección de inhibición de las antiproteasas en los pulmones. Entre otros, los neutrófilos tienen la capacidad de secretar proteasas, incluidas la elastasa de los neutrófilos, catepsina G, proteinasa 3, así como metaloproteasas de matriz (MMP), 84 como MMP-8 y MMP-9. Estas proteasas pueden contribuir a la destrucción alveolar y son potentes estimulantes de la secreción – 25 – de moco. Existen al menos 17 MMP descritas, de las que varias han obtenido relación con la EPOC, principalmente la MMP-1 (colagenasa), MMP-9 (gelatinasa B) y MMP- 12 (metaloelastasa). Están controladas por los inhibidores tisulares de las MMP y su papel ha sido estudiados en EPOC observando una relación con el grado de obstrucción 85. 2.7.4 Apoptosis La apoptosis o muerte celular programada se ha asociado con el enfisema gracias a la instilación de un agente proapoptótico como la caspasa 3 y la interrupción de la señal del factor de crecimiento del endotelio vascular (VEGF). La inyección intratraqueal de la caspasa 3 en ratones causa la apoptosis de las células de la pared alveolar (principalmente células epiteliales), lo que lleva a la destrucción de la pared alveolar y al aumento de los espacios aéreos. El VEGF es un factor de supervivencia de las células endoteliales y su retirada da lugar a la apoptosis de éstas. En pacientes con enfisema se han observado una reducción del VEGF y un aumento de la apoptosis de las células endoteliales. Además, diversos trabajos llegan a establecer un círculo vicioso entre la apoptosis y estrés oxidativo. Estos datos permiten plantear la posibilidad de que varios factores, como la proteólisis excesiva, la apoptosis y el estrés oxidativo, interactúan para destruir el parénquima y provocar enfisema, conformando así un cuadro global de la patogenia de la EPOC 86,87. – 26 – 3. Inflamación pulmonar y sistémica en la EPOC 3.1 Consecuencias de la inflamación local El humo del tabaco contiene un conjunto de más de 4.700 compuestos químicos que incluyen altas concentraciones de oxidantes y de radicales libres 88. La lesión que produce la inhalación del humo del tabaco desarrolla una respuesta inflamatoria que inicialmente se desencadena de manera innata, como sucede en cualquier tipo de agresión 89. La inmunidad innata es una respuesta rápida e inespecífica, donde las células del sistema inmune reconocen y responden a agentes patógenos de forma genérica y, a diferencia del sistema inmune adaptativo, no confieren inmunidad ni protección a largo plazo. Esta respuesta inmune inicial, desencadenada por el humo del tabaco, desestabiliza la matriz extracelular del parénquima pulmonar y los productos de su ruptura, como el ácido hialurónico y los β-glucanos, que actúan como ligandos de los TLR (toll-like receptors), sensores de las células del sistema inmune innato que reconocen los patrones moleculares expuestos por los agentes patógenos en la superficie de moléculas del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC), e inician la respuesta inmune frente al tejido lesionado 90,91. Tras su unión, activan la vía de transcripción del NF-kB (nuclear factor kappa-B) 91, induciendo a las células epiteliales a producir – 27 – mediadores de inflamación. El resultado final es una respuesta inflamatoria en la que los macrófagos y las células dendríticas descargarán una batería de mediadores inflamatorios, estableciéndose así las condiciones necesarias para activar el sistema inmune adaptativo 92. Estos mediadores inflamatorios se dividen en citocinas (TNFα (factor de necrosis tumoral-α), INF-γ interleucinas como IL-1, , IL-6, entre otras), quimiocinas (IL-8, MCP-1, etc) factores de crecimiento (CS-CSF, TGF- β, EGF) y proteasas (serinaproteasas como la elastasa, catepsina-G y proteinasa-3, cisteinaproteasas y MMP). La acción proteolítica de estas últimas, tanto de las MMP como de la elastasa, genera fragmentos de matriz extracelular que pueden ser reconocidos como autoantígenos por parte del sistema inmune, colaborando así en la progresión de la enfermedad 93. Es entonces cuando se activa el proceso de inmunidad adquirida. El daño tisular producido en el pulmón provoca la liberación de nuevos productos, como fragmentos celulares o de la matriz extracelular, siendo las células dendríticas inmaduras las encargadas de alertar al sistema inmune adaptativo de la presencia de estos productos de lesión tisular 90. A continuación, estas células maduran cuando los TLR se unen a sus ligandos, expresando altos valores de proteínas del MHC de clase II y moléculas coestimuladoras CD80 y CD86, que le conducirán a los ganglios linfáticos locales donde le presentaran los antígenos a las células T 94. La expresión de IL-12 por las células dendríticas activa el transductor de la señal y activa la transcripción STAT-4, (signal transducer and activator of transcription-4), lo que induce a las células T a diferenciarse en el tipo 1 (Th1) y a su vez producir interferón gamma (IFN γ). En fumadores con EPOC hay un marcado aumento de las células dendríticas maduras en las vías respiratorias periféricas, que probablemente está relacionado con la alta expresión en los pulmones de CCL20, como quimioatrayentes de células dendríticas. Hay también un aumento de los linfocitos T cooperadores CD4+ que expresan STAT-4 en los pulmones. Es probable que las células lesionadas, necróticas y apoptóticas de los pulmones de los fumadores sean absorbidas por las células dendríticas y presentadas por éstas a las moléculas del MHC de clase I y a los linfocitos T citotóxicos CD8+. – 34 – 4. Reactantes de fase aguda en la inflamación sistémica. La inflamación sistémica en la EPOC se define como un aumento de los niveles de marcadores inflamatorios de diferentes vías biológicas.106 Dentro de estos biomarcadores inflamatorios sistémicos, destacan los RFA por ser unos de los más estudiados debido a su papel como nexo de fisiológico entre la respuesta inflamatoria local y sistémica 127. Los RFA constituyen un grupo heterogéneo de proteínas sintetizadas en el hígado y cuya cantidad en la circulación aumenta rápidamente en presencia de inflamación y necrosis tisular 128. Los RFA tienen una función biológica muy variada y se han descrito diversas clasificaciones según distintos aspectos. El incremento o disminución de la síntesis de estos RFA es debido principalmente a citocinas liberadas desde el foco inflamatorio entre las que destacan principalmente la IL-1, la IL-6 y el TNF-α. Dentro de estos reactantes y en función de la capacidad de estimulación distinguimos los RFA mayores, también llamados proteínas con cinética de evolución rápida, cuya concentración en suero aumenta hasta mil veces ante un estímulo y cuya elevación es medible a las 4-6 horas de la agresión tisular; y los RFA menores cuya concentración aumenta en menor medida. – 35 – Entre los RFA mayores se encuentras la PCR y el amiloide A sérico (AAS). Ambos reactantes tienen un papel relevante en la reacción aguda del ser humano ante diversas agresiones externas. Durante un daño agudo los RFA intervienen en la respuesta sistémica realizando funciones como la inducción de enzimas que degradan la matriz extracelular como las metaloproteinasas, acción quimiotáctica de células inflamatorias, participación en el metabolismo lipídico o su trasporte y efectos proinflamatorios y antinflamatorios de regulación, entre los que destaca aumentar la quimiotaxis y opsonización, activar células inflamatorias o modular respuestas inmunes 129. Por tanto, el papel de estos RFA mayores en la respuesta aguda puede resumirse en; acción inmunomoduladora 130, efectos sobre el genoma 131 y efectos sobre el metabolismo lipídico 132. La PCR es una proteína muy estable constituida por 5 moléculas idénticas de subunidades de 23 kDa no glicosiladas organizadas como discos pentagonales simples por lo que se denomina pentraxina. Es una proteína no glicosilada de simetría cíclica cuyo nombre es debido a que es capaz de precipitar el polisacárido C de la cápsula del Streptococcus pneumoniae. La concentración normal de la PCR en nuestro organismo es de 1 mg/ml. Podemos encontrar niveles elevados de PCR en suero o plasma como respuesta no específica a infecciones (elevación más importante en las infecciones bacterianas), inflamación aguda no infecciosa como en la pancreatitis o la artritis reumatoide, en tumores sólidos, traumatismos, ECV, etc. Una vez sintetizada, la PCR se une a las inmunoglobulinas G, las membranas de las células apoptóticas, a la cascada del complemento, a los marcadores de superficie CD64 y los CD16 y a las células endoteliales. La capacidad de la PCR para activar el complemento y opsonizar partículas parece ser importante en la respuesta de la inmunidad innata frente a los patógenos. La PCR tiene la capacidad tanto de opsonizar células apoptóticas, como de desacoplar las proteínas del complejo de ataque a la membrana dependiente del complemento. Esto permite una mayor permanencia de las células apoptóticas antes de ser eliminadas, aunque facilitando su captación por fagocitos. Así, la PCR juega un papel preponderante en limitar la activación de respuestas de inmunidad adaptativa. La PCR ha sido estudiada de manera amplia en los pacientes con EPOC observándose su participación como marcador de la repercusión sistémica de la – 36 – enfermedad, como marcador pronóstico sobre la mortalidad, como marcador para distinguir una exacerbación infecciosa del resto, relacionándose con una disminución acelerada de la función pulmonar y muchos otros resultados clínicamente relevantes 99,133. El AAS, otro importante reactante de fase aguda en los seres humanos, es una proteína que pertenece a la familia de la apoliproteínas y forma parte de la estructura de las HDL. Aunque se ha descrito una síntesis extrahepática en células epiteliales y epitelios de órganos en contacto con el medio exterior como glándulas mamarias, tracto digestivo y vía aérea, generalmente es sintetizada en su mayor parte por los hepatocitos. Sus valores basales en individuos sanos son muy bajos y pueden aumentar rápidamente a valores muy elevados en respuesta a la infección e inflamación comportándose como un RFA mayor. El aclaramiento plasmático del AAS es muy rápido y, por lo tanto, los niveles disminuyen rápidamente en cuanto el estímulo nocivo desaparece. Estas características hacen que el AAS sea especialmente adecuado para la supervisión en tiempo real de la actividad inflamatoria, dando una buena indicación del estado actual de la enfermedad del individuo. En este sentido se le han atribuido algunas aplicaciones clínicas. Por ejemplo, las recaídas o exacerbación de la enfermedad inflamatoria así como tratamientos ineficientes irán acompañados de nuevos aumentos en los niveles séricos de AAS y por lo tanto mediciones repetidas ayudan a la supervisión del tratamiento y la recuperación del paciente 134. Otra característica importante del AAS es que sus niveles reflejan la intensidad de la inflamación y, por tanto, podrían dar una indicación del pronóstico del paciente 135. El AAS puede ayudar a diferenciar entre enfermedades infecciosas y no infecciosas ayudando a la detección temprana de las primeras, permitiendo de este modo un inicio precoz del tratamiento y una mejoría el resultado final 136. Curiosamente, PCR y AAS comparten estímulos secretores, con un patrón de aumento similar en el suero 137. Debido a esta conexión entre ambos biomarcadores, se hace necesario su estudio conjunto para verificar que los efectos atribuidos a una molécula no son consecuencia de la actuación de la otra. No obstante, la implicación final de los RFA en la patogenia de las manifestaciones sistémicas de la EPOC no ha sido completamente dilucidado, – 37 – planteándose cuestiones no resueltas sobre su secreción, perpetuación en el tiempo e influencia final en un determinado efecto de la enfermedad en órganos diana distintos del pulmón. Tras la afirmación de que en la EPOC existe la participación de un componente inflamatorio, tanto a nivel local como sistémico, teniendo este último importantes consecuencias a nivel extratorácico, sería muy útil definir el origen de ésta inflamación sistémica. A pesar de que el hígado se ha considerado tradicionalmente como su principal fuente, se ha descrito que el propio pulmón es capaz de sintetizar moléculas proinflamatorias109. Por este motivo, se ha planteado la hipótesis de que tales moléculas podrían ser liberadas desde el tejido pulmonar a la circulación sistémica, planteando un origen alternativo a la producción de estos biomarcadores inflamatorios en la EPOC. Sin embargo, esta hipótesis se contradice con la falta de correlación entre la expresión local y sistémica de los biomarcadores inflamatorios en la EPOC. Nuestro grupo ha demostrado anteriormente que los bronquios y el parénquima pulmonar son capaces de sintetizar PCR y AAS en pacientes con EPOC en comparación con fumadores que no desarrollaron la enfermedad 109. En particular, se observó que la expresión de marcadores de inflamación es diferente en los fibroblastos, células epiteliales, y macrófagos 110. Sin embargo, el papel de las arterias pulmonares y leucocitos de sangre periférica como una fuente potencial de marcadores de inflamación sistémica en la EPOC aún no ha sido evaluado. La posible participación de la pared arterial o leucocitos de sangre periférica en la inflamación EPOC también explicaría la conocida asociación de esta enfermedad con eventos adversos cardiovasculares 138. En la presente Tesis Doctoral hemos tratado de comparar la expresión génica de RFA tanto a nivel local, en el parénquima pulmonar y tejido vascular de arteria pulmonar, como a nivel sistémico, en células sanguíneas y plasma, de pacientes con EPOC y fumadores sin la enfermedad. Posteriormente comparamos la síntesis de estos mediadores inflamatorios en células pulmonares con respecto a nivel hepático, principal síntesis en humanos, con objeto de determinar la contribución de cada uno a la inflamación sistémica. Dado que la inflamación juega un papel crítico en el desarrollo, curso y la gravedad de la EPOC, los hallazgos del presente trabajo contribuirán a un mayor conocimiento de la patogenia de la enfermedad y sus repercusiones sistémicas que podrían culminar en mejorar los enfoques actuales de diagnóstico, pronóstico y detección de nuevas dianas terapéuticas en un futuro. – 38 – Hipótesis y objetivos – 39 – 1. Hipótesis Existe producción local de RFA en el tejido pulmonar y sistémica en sangre periférica de pacientes con EPOC frente a fumadores sanos, que indica una síntesis más elevada a nivel pulmonar, incluso comparándola con la síntesis fisiológica a nivel hepático. – 40 – 2. Objetivos 1. Comparar la expresión génica de PCR y AAS en el parénquima pulmonar, en tejido vascular de arteria pulmonar y sangre periférica de pacientes con EPOC frente a fumadores sanos. Estudiar la relación entre la expresión tisular y la concentración sérica de las proteínas. 2. Evaluar la producción de RFA en células epiteliales bronquiales, fibroblastos pulmonares y hepatocitos humanos, comparando la producción pulmonar frente a la hepática. – 41 – Método – 42 – 1. OBJETIVO 1: expresión génica tisular 1.1. Población de estudio. Se diseño un estudio analítico observacional de caso-control, en el que se compararon los niveles de expresión génica de PCR y AAS en muestras quirúrgicas de parénquima pulmonar, tejido vascular de arteria pulmonar y sangre periférica de pacientes con EPOC en fase estable frente a fumadores sin la enfermedad. Todos los sujetos incluidos en el estudio eran pacientes que se encontraban en lista de espera para cirugía de resección pulmonar (lobectomía o neumonectomía) por sospecha de neoplasia pulmonar primaria e ingresaron de forma programada en la planta de la Unidad Médico-Quirúrgica de Enfermedades Respiratorias del Hospital Universitario Virgen del Rocío para la realización de la técnica quirúrgica prevista. El diagnóstico de EPOC se realizó en función de la normativa internacional GOLD 20166 y la normativa nacional SEPAR GesEPOC13, exigiéndose una exposición prolongada a inhalantes de riesgo (consumo acumulado de tabaco > 10 paq-año) y tener una espirometría con una obstrucción crónica al flujo aéreo con un cociente FEV1/FVC menor de 0,7, realizada en fase estable y que no fuera completamente reversible tras el test broncodilatador. Para su inclusión en el estudio los sujetos debían cumplir los siguientes criterios: – 43 – - Aceptación a participar en el estudio - Ser mayores de 40 años - Estabilidad clínica en los 2 meses previos a la intervención, valorando para ello la asistencia a servicios de urgencia, visita no programada al médico u hospitalización por descompensación respiratoria, según refiriera el paciente o constara en su historia clínica. - Capacidad para completar los cuestionarios y estudios complementarios. - No contraindicaciones para los estudios. - Estar en lista de espera para cirugía de resección pulmonar. - Tiempo desde la apertura de plano cutáneo y la toma de la muestra quirúrgica menor de 2 h. Se excluyeron aquellos pacientes con: - Historia de infecciones respiratorias agudas en los dos meses anteriores - Una neoplasia diagnosticada previamente - Haber recibido tratamiento con radioterapia y / o quimioterapia - Presencia de enfermedades crónicas enfermedades inflamatorias, que pudiera estar asociada a una alteración de la expresión de RFA, como son la inmunosupresión, la aparición de algún evento isquémico agudo de cualquier naturaleza en los seis meses previos, disponer de ventilación mecánica domiciliaria, insuficiencia cardíaca congestiva, padecer insuficiencia renal terminal, cirrosis hepática o artritis reumatoide entre otras. La cantidad de tiempo transcurrido entre la abertura de la capa cutánea y la extracción de la muestra anatómica se midió en todos los participantes, excluyendo los casos con un tiempo de >2h debido al potencial incremento en los marcadores inflamatorios relacionada con la cirugía. En caso de cumplir dichos criterios de inclusión, en una entrevista llevada a cabo el día del ingreso para la cirugía se informó al paciente de la naturaleza del estudio y se solicitó el consentimiento informado para su inclusión en el mismo (Anexo I). Además, en esta visita se realizó una evaluación clínica, recogiendo de cada sujeto edad, sexo, hábito tabáquico recogido en paquetes-año, estabilidad clínica actual y en los meses previos, el grado de disnea usando la escala de la mMRC, comorbilidades y el – 50 – estudio de dosis respuesta, se eligió la dosis de 10ng/ml IL-1 (R&D System, Minneapolis MN) como estímulo pro-inflamatorio. Las células se cultivaron durante 24 y 48 horas a esa concentración de IL-1 Cada experimento se repitió cuatro veces. En paralelo se recogieron muestras controles de cultivo sin tratar pero con el mismo tipo de medio de cultivo y durante el mismo periodo de incubación. En cada uno de los puntos, se midió la viabilidad con trypan-blue celular por el método de exclusión por Trypanblue 0.4% (Sigma, GmbH, Alemania) y se contaron en una cámara hemocitómetro. Posteriormente, las células se centrifugaron a 1.000 rpm durante 5 minutos, alicuotamos el sobrenadante y se guardó a -80ºC para determinar posteriormente proteínas mediante ELISA. El pellet se congeló en nitrógeno líquido y después se guardó a -80ºC para posteriores determinaciones. 2.1.3 Estudios de expresión génica. Extracción de ARN. A las 24 horas de incubación de las células con IL-1, se les extrajo el ARN mediante un kit comercial High Pure RNA Isolation Kit (Roche, Alemania) siguiendo el protocolo del fabricante. Las muestras obtenidas se guardaron a -80ºC hasta su utilización. La concentración de ARN de cada muestra se determinó midiendo la densidad óptica mediante un espectofotómetro (nanodrop, ND-100 Wilmington, DE, USA) y la calidad de las mismas se comprobó mediante la razón entre las densidades ópticas a 260 y 280nm, siendo ésta de 2.0. Obtención de ADN complementario (ADNc). El ADNc fue sintetizado a partir de 100 ng de ARN total mediante la retrotranscriptasa iScript cDNA synthesis (BioRad, CA, USA) siguiendo las instrucciones del fabricante. La reacción se mantuvo a 25ºC durante 5 minutos, seguido por 42ºC durante 30 minutos y 85ºC durante 5 minutos para inactivar a la enzima. PCR a tiempo real (RT-PCR). Para la determinación de la expresión génica, se realizaron por reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa a tiempo real en el termociclador Applied Biosystems® 7900 Real-Time PCR System (Life Technologies, Grand Island, NY, USA). Usamos el ARN ribosómico 18s como control interno y para la normalización de los genes en estudio. El análisis de la expresión génica relativa se llevó a cabo mediante el método 2-ΔCt 7. que compara la expresión – 51 – bFGF, α-SMA o AQ1 en los cultivos tratados con los no tratados (controles) y normaliza con la expresión del gen constitutivo (ARN 18s). Definimos Ct como el número de ciclos requerido para que la señal fluorescente alcance el umbral de detección. 2.1.4 Cuantificación proteica. En los sobrenadantes de los cultivos celulares se midieron los niveles de ambas proteínas, PCR y AAS. Las determinaciones se realizaron mediante ELISA (Quantikine R&D Systems Minneapolis, MN) siguiendo las instrucciones del fabricante. – 52 – 3. Aspectos éticos. El protocolo de estudio fue aprobado por el Comité de Revisión Institucional del Hospital Virgen del Rocío, Sevilla, España (CEI código 2013/023), observándose las normas de la Declaración de Helsinki para estudios con seres humanos y se obtuvo consentimiento informado por escrito de cada participante previo a la inclusión en el estudio. Los registros clínicos se anonimizaron en la base de datos asignando un código numérico a través de un algoritmo. No se ingresó información personal que pudiera usarse directa o indirectamente para identificar a una persona. Debido a la naturaleza retrospectiva del estudio, la anonimización de los datos y la falta de intervenciones de investigación activas, se dejó de aplicar el consentimiento informado. El comité de ética fue consciente de estas circunstancias claramente explicadas en el protocolo y aprobó este procedimiento. – 53 – 4. Análisis estadístico. Todos los análisis estadísticos se realizaron con el programa SPSS (Statistical Package for the Social Sciences, IBM Corporation, Somers, NY, EE.UU) versión 24.0. Los estadísticos descriptivos usados para las variables continuas fueron la media y la desviación estándar y frecuencias y porcentajes para las variables categóricas. Los estudios inferenciales se realizan con tests paramétricos, salvo que alguna de las variables incluidas en el análisis demuestre no seguir una distribución normal. En el estudio de la expresión de RFA, tanto a nivel de tejido como a nivel celular, entre pacientes EPOC y fumadores sanos se utilizó la prueba t de Student para datos independientes (test de Mann-Whitney en caso de no paramétrico), previa verificación de la igualdad de las varianzas con el test de Levene. Los datos categóricos se compararon con la prueba de χ2. Los valores de expresión génica relativa se evaluaron con el método 2-∆∆Ct En la estadística comparativa se aplicó el test de Wilcoxon para comparar los valores de expresión génica de acuerdo a la ubicación anatómica. Los datos categóricos se compararon con la prueba de χ2. Las asociaciones entre la expresión génica del tejido y los niveles plasmáticos de biomarcadores inflamatorios se analizaron con el coeficiente de correlación de Spearman. Se acepta un error alfa de 0,05. – 54 – Resultados – 55 – 1. Descripción de la muestra La muestra estaba compuesta de 102 sujetos, de los cuales 40 (39,2%) pacientes cumplían los criterios diagnósticos de EPOC y 62 eran fumadores sin la enfermedad. Las principales características de los participantes del estudio se resumen en la Tabla 2. La mayoría de los pacientes fueron varones, tanto en el grupo de casos (37 varones; 92,5%) como en el grupo control (48 varones; 77,4%). Predominaban los pacientes exfumadores en ambos grupos, a excepción de 17 fumadores activos en el grupo control (27,4%) y 13 fumadores activos en el grupo de pacientes EPOC (32,5%). Ningún paciente fumó el día previo a la intervención. Hubo diferencia estadísticamente significativa entre el consumo acumulado en paquetes-año entre ambos grupos, siendo 69,7 en los casos frente a 43,5 en los controles. En cuanto a las comorbilidades los pacientes con EPOC demostraron tener un índice de Charlson mayor, pero sin alcanzar esta diferencia la significación estadística. La distribución de pacientes por estadios GOLD era: 11 (27,5%) pacientes en estadio GOLD I, 24 (60%) en estadio GOLD II, 5 (12,5%) en estadio GOLD III y ningún paciente en estadio GOLD IV. Con respecto al número de agudizaciones, 24 pacientes (60%) no habían tenido ninguna agudización en el año previo y 16 (40%) referían haber tenido una o dos agudizaciones (8; 20% y 8; 20% respectivamente) por lo teníamos algún caso que correspondía al fenotipo agudizador frecuente. En relación con el tratamiento, 14 (35%) pacientes con EPOC estaban recibiendo tratamiento con corticoides inhalados, de los cuales todos estaban en tratamiento combinado, 3 (7,5%) – 56 – pacientes estaban en tratamiento en monoterapia con un ß2-agonistas de acción prolongada y 18 (45%) pacientes con tiotropio. En la tabla 3 se resumen el tipo de cirugía practicada y las distintas histologías de los tumores. Los procedimientos quirúrgicos consistieron en neumectomías (17,6%), lobectomías (78,4%) y resecciones atípicas (4%). Las operaciones se llevaron a cabo en el hemitórax derecho e izquierdo en el 54,9% y el 45,1% de los pacientes, respectivamente. Los tipos histológicos más comunes fueron el carcinoma de células escamosas (epidermoide) (42,2%) y adenocarcinomas (31,4%). Los resultados del examen patológico no revelaron tumores malignos en el 7,8% de los pacientes del estudio. – 57 – Tabla 2. Características generales de la población de estudio. Controles (n=62) Pacientes con EPOC (n=40) Valor p* Hombres (n) 48 (77,4%) 37 (92,5%) 0,046 Edad (años) 64,4 ± 13.5 67,4 ± 8.01 NS Tabaquismo activo 17 (27,4%) 13 (32,5%) NS Consumo acumulado (paq-año) 43,5 ± 34,7 69,7 ± 33,1 0,001 Índice Charlson-edad 4,9 ± 2.2 5,7 ± 1,7 NS FVC (%) 98,7 ± 20,45 91,6 ± 19 NS FEV1 (%) 94,0 ± 19,89 69,0 ± 18,4 < 0,001 FEV1/FVC (%) 77,1 ± 6,9 59,0 ± 9,7 < 0,001 Los datos se expresan como medias y desviaciones estándar para las variables continuas y frecuencias y porcentajes para las variables categóricas. * Los valores p se calcularon con la prueba t de Student (variables continuas) o la prueba de χ2 (variables categóricas). Abreviaturas: FVC: capacidad vital forzada; FEV1: volumen espiratorio forzado en el primer segundo; NS: no significativo. – 58 – Tabla 3. Descripción del tipo de cirugía e histología de los tumores. Controles (n=62) Pacientes con EPOC (n=40) Valor p* Tipo de resección • Neumonectomía • Lobectomía • Atípica 7 (11,3%) 53 (85,5%) 2 (3,2%) 11 (27,5%) 27 (67,5%) 2 (5%) 0,036 0,031 NS Hemitórax: • Derecho • Izquierdo 36 (58%) 26 (42%) 20 (50%) 20 (50%) NS NS Histología • Adenocarcinoma • Epidermoide • Otros • Tumor benigno • No neoplasia 21 (33,9%) 23 (37,1%) 12 (19,4%) 3 (4,8%) 3 (4,8%) 11 (27,5%) 20 (50%) 7 (17,5%) 2 (5%) 0 NS NS NS NS NS * Calculado para la diferencia entre gurpos mediante el test de la Chi-cuadrado o el test de Mann-Whitney, según la naturaleza de la variable. Abreviaturas: NS: no significativo. – 59 – 2. Objetivo 1: expresión génica tisular de biomarcadores y correlación con expresión proteica en suero Al analizar la expresión génica de PCR y AAS en el parénquima pulmonar, tejido vascular de arteria pulmonar y leucocitos de sangre periférica, observamos que los tres tipos de muestras expresaban ambos biomarcadores. 2.1. Expresión de RFA en parénquima pulmonar La expresión génica en el parénquima pulmonar de PCR y AAS fue mayor en los pacientes con EPOC frente a fumadores sanos. Sin embargo, la expresión de AAS no difirió significativamente entre los dos grupos (Figura 4). En el parénquima pulmonar, hemos encontrado correlaciones positivas significativas entre la expresión de AAS1 y PCR (r = 0,208, p = 0,037), AAS1 y AAS2 (r = 0,515, p <0,001), y AAS1 y AAS4 (r = 0,789, p <0,001). – 66 – 2.3. Expresión de RFA en leucocitos de sangre periférica Se encontró que la expresión génica de PCR, AAS1, y AAS4 en leucocitos de sangre periférica difiere significativamente entre los pacientes con EPOC y los fumadores sanos. En línea con los resultados obtenidos en la arteria pulmonar, la expresión AAS2 fue mayor del 100% en los pacientes con EPOC que en los controles (Figura 8). Hubo una correlación positiva entre la expresión de AAS1 y AAS4 (r = 0,985, p <0,001). Se encontraron diferencias estadísticamente significativas entre grupo EPOC grado I de la GOLD y fumadores sanos en niveles de expresión de AAS1 (p = 0,037) y AAS4 (p = 0,018). Además, se observaron diferencias significativas en los niveles de expresión AAS4 entre pacientes EPOC grado I y II de la GOLD (p = 0,030; Figura 9B y figura 9D respectivamente). No se encontraron diferencias estadísticamente significativas entre los demás RFA y los diferentes estadios de enfermedad. Figura 8. Niveles de expresión génica de los RFA de los fumadores sanos (controles) y de los pacientes con EPOC en leucocitos de sangre periférica. 0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 mRNA*(r.u.)*en*sangre*periférica PCR AAS1 AAS2 AAS4 CONTROL EPOC – 67 – Figura 9. Perfil de expresión de PCR (A) y subtipos de AAS (B,C,D) en las células sanguíneas de acuerdo al grado de la EPOC. A) B) 0 5 10 15 20 25 30 35 CNT III III mRNA*PCR*(r.u.)*en*sangre* periférica GRADO*DE*ENFERMEDAD 0 1 2 3 4 5 CNT III III mRNA*AAS1*(r.u.)*en*sangre* periférica GRADO*DE*ENFERMEDAD – 68 – C) D) Abreviaturas: CNT, fumadores sanos (controles); I, EPOC GOLD I; II, EPOC GOLD II; III, EPOC GOLD III. 0 5 10 15 20 25 30 35 CNT III III mRNA*AAS2*(r.u.)*en*sangre* periférica GRADO*DE*ENFERMEDAD 0 1 2 3 4 5 CNT III III mRNA*AAS4*(r.u.)*en*sangre* periférica GRADO*DE*ENFERMEDAD – 69 – 2.4. Comparación en la expresión de RFA entre los diferentes tipos de muestras A continuación, procedemos a comparar la expresión de los distintos RFA (PCR y AAS) en los tres tipos de muestras, parénquima pulmonar, arteria pulmonar y leucocitos de sangre periférica (Figura 10). La expresión de AAS fue significativamente mayor en el parénquima pulmonar que en la arteria pulmonar (100% más alto para AAS1 y AAS4, p = 0,015 y p <0,001, respectivamente; 8 veces mayor para AAS2, p <0,001) y leucocitos de sangre periférica (16 veces más altos para AAS1, 439 veces mayor para AAS2, y 5 veces mayor para AAS4; p <0,001). En comparación con los leucocitos de sangre periférica, la expresión de AAS fue significativamente mayor en la arteria pulmonar (8 veces mayor para AAS1, p <0,001; 50 veces más altos para AAS2, p <0,001; y 2,3 veces más alta para AAS4, p = 0,019). Sin embargo, no se observaron diferencias en la expresión de la PCR entre el parénquima pulmonar, la arteria pulmonar y leucocitos de sangre periférica. – 70 – Figura 10. Comparación de los niveles de expresión génica de distintos RFA en diferentes tejidos (células de la sangre, arteria pulmonar y parénquima pulmonar) de los pacientes con EPOC. 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 mRNA*PCR*(r.u.) SANGRE ARTERIA! PARÉNQUIMA!!!!!! – 71 – – 72 – 2.5. Asociaciones entre la expresión de los RFA en los diferentes tipos de muestras. A continuación, se investigó la asociación entre la expresión de RFA en el parénquima pulmonar, arteria pulmonar, y leucocitos de sangre periférica. Se identificaron correlaciones positivas significativas entre los niveles de expresión génica de PCR en la arteria pulmonar y leucocitos de sangre periférica (r = 0,195, p = 0,04), AAS1 en el parénquima pulmonar y leucocitos de sangre periférica (r = 0,743, p <0,001), y AAS4 en el parénquima pulmonar y leucocitos de sangre periférica (r = 0,980, p <0,001). Además, hubo una asociación significativa entre la expresión AAS1 en el parénquima pulmonar y AAS4 en leucocitos de sangre periférica (r = 0,758, p <0,001), así como AAS4 en el parénquima pulmonar y AAS1 en leucocitos de sangre periférica (r = 0,966, p < 0,001). Se identificaron las diferencias más marcadas en la expresión para AAS2. 2.6. Asociaciones entre la expresión génica de RFA y sus concentraciones plasmáticas Los niveles plasmáticos de PCR mostraron una tendencia hacia niveles más altos en los pacientes con EPOC (4,4 ± 1,73 mg / ml) frente a fumadores sanos (3,8 ± 2,04 mg/ml, p >0,05). Las concentraciones de AAS en plasma fueron significativamente mayores en los pacientes con EPOC (5,6 ± 1,3 mg / ml) que en los controles (4,6 ± 21 mg / ml, p = 0,031) (Figura 11). Los niveles de AAS aumentaron en paralelo con la gravedad de la EPOC (Figura 12). Se identificó una asociación positiva significativa entre los niveles de PCR en plasma y los niveles de AAS (r = 0,617, p <0,001) (Figura 13). Sin embargo, no hubo correlación significativa entre los niveles plasmáticos de PCR y su expresión génica en el parénquima pulmonar (r = -0,127, p <0,4), la arteria pulmonar (r = -0,049, p <0,7) y leucocitos de sangre periférica (r = -0,271, p <0,09). Tampoco hubo correlación significativa entre los niveles plasmáticos de AAS y su – 73 – expresión génica en el parénquima pulmonar (r = -0,207, p <0,56), arteria pulmonar (r = -0,037, p <0,054) y leucocitos en sangre periférica (r = -0,117, p <0,29) Figura 11. Concentraciones plasmáticas de PCR y AAS en los fumadores sanos (controles, CNT) y los pacientes EPOC. – 74 – – 75 – Figura 12. Concentraciones plasmáticas de PCR y AAS en los fumadores sanos (controles, CNT) y los pacientes con diferentes estadios de la EPOC. – 82 – D) Figura 15. Expresión génica de PCR y subtipos de AAS en células epiteliales bronquiales estimuladas. 0 2 4 6 8 10 12 14 24 48 mRNA%AAS4%(r.u.) CNT IL1/(10/ng/ml) p= NS 0 5 10 15 20 25 AAS1 AAS2 AAS4 PCR mRNA%(r.u) IL1/(10ng/ml)/24h IL1/(10ng/ml)/48h – 83 – Figura 16. Concentración proteica de PCR y AAS en células epiteliales bronquiales estimuladas frente a controles. 0 2 4 6 8 10 12 14 24 48 Niveles%AAS%%(mg/L) CNT% IL1%(10ng/ml) p=/0.029 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 24 48 Niveles%PCR%%(mg/L) CNT% IL1%(10ng/ml) p=NS – 84 – A nivel de fibroblastos, destaca la mayor expresión de AAS2 y de forma significativa frente al resto de marcadores (p=0,029). Esta diferencia es significativa para los tres tipos de AAS (p = 0,029 para AAS1; p = 0,029 para AAS4) (Figura 17-18). Sin embargo, éste aumento no es significativo a nivel de proteínas (Figura 19). También aumenta la expresión y niveles de proteínas cuando se les trata con IL-1 con respecto al control (células no tratadas) a nivel de PCR a las 24 horas (p=NS) Figura 17. Expresión génica de PCR (A) y subtipos de AAS (B, C, D) en fibroblastos pulmonares estimulados frente a controles. A) 0 10 20 30 40 50 60 70 80 24 48 mRNA%PCR%(r.u) CNT IL1/(10ng/ml) p=NS – 85 – B) C) 0 20 40 60 80 100 120 24 48 mRNA%AAS1%(r.u.) CNT IL1/(10ng/ml) p=0.029 0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 24 48 mRNA%AAS2%(r.u.) CNT IL1/(10/ng/ml) p=0.029 – 86 – D) Figura 18. Expresión génica de PCR y subtipos de AAS en fibroblastos pulmonares estimulados. 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 24 48 mRNA%AAS4%(r.u.) CNT IL1/(10ng/ml) p=0.029 0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 AAS1 AAS2 AAS4 PCR mRNA%(r.u.) IL1/(10ng/ml)/24h IL1/(10ng/ml)/48h – 87 – Figura 19. Concentración proteica de PCR y AAS en fibroblastos pulmonares estimulados frente a controles. 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4 1,6 1,8 2 24 48 Niveles%AAS%%(mg/L) CNT% IL1%(10ng/ml) p=NS 0 0,5 1 1,5 2 2,5 24 48 Niveles%PCR%(mg/L) CNT% IL1%(10ng/ml) p=NS – 88 – Con respecto a los hepatocitos estimulados con IL-1, encontramos una expresión con tendencia a la significación y mayores niveles de AAS 1 y AAS2 que los controles (p= 0,057) para hepatocitos de hepatocarcinoma (HEP3B); no así para hepatocitos sanos (CRL2706) donde destaca mayor expresión para AAS4, de forma no significativa (p= 0,6) (Figura 20-23). A nivel de PCR hay un aumento no significativo en la expresión génica para las células tratadas con IL-1 versus el control para ambos tipos de hepatocitos y un aumento no significativo a nivel de proteínas (datos mostrados para hepatocitos de hepatocarcinoma (HEP3B)) (Figura 24). Se obtuvieron dificultades por lento crecimiento sobre todo con la línea de hepatocitos sanos (CRL2706) por lo que de los RFA solo presentamos su expresión génica y no la determinación de proteínas. Figura 20. Expresión génica de PCR (A) y subtipos de AAS (B, C, D) en hepatocitos CRL2706 estimulados (sanos) frente a controles. A) 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 24 48 mRNA%PCR%%(r.u.) CNT IL1/(10/ng/ml) p=NS – 89 – B) C) 0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 24 48 mRNA%AAS1%(r.u.) CNT IL1/(10ng/ml) p=NS 0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 24 48 mRNA%AAS2%(r.u.) CNT IL1/(10/ng/ml) p=NS – 90 – D) Figura 21. Expresión génica de PCR y subtipos de AAS en hepatocitos CRL2706 estimulados (sanos). 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 24 48 mRNA%AAS4%(r.u.) CNT IL1/(10ng/ml) p=NS 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 AAS1 AAS2 AAS4 PCR mRNA%(r.u.) IL1/(10ng/ml)/24h IL1/(10ng/ml)/48h – 91 – Figura 22. Expresión génica de PCR (A) y subtipos de AAS (B, C, D) en hepatocitos HEP3B estimulados (hepatocarcinoma) frente a controles. A) B) 0 2 4 6 8 10 12 14 24 48 mRNA%PCR%(r.u.) CNT IL1(/10/ng/ml) p=/NS 0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 24 48 mRNA%AAS1%(r.u.) CNT IL1(/10/ng/ml) p=/NS – 98 – Figura 27. Expresión génica de AAS4 tras incubación con IL-1 a las 24 y las 48 horas 1 10 100 1000 10000 Hepatocitos/ CRL2706 Hepatocitos/HEP3B Epiteliales Fibroblastos mRNA%(r.u.) AAS2%48h 1 10 100 1000 Hepatocitos/ CRL2706 Hepatocitos/HEP3B Epiteliales Fibroblastos mRNA%(r.u.) AAS4%24h – 99 – Figura 28. Expresión génica de PCR tras incubación con IL-1 a las 24 y las 48 horas 1 10 100 1000 Hepatocitos/ CRL2706 Hepatocitos/HEP3B Epiteliales Fibroblastos mRNA%(r.u.) AAS4%48h 1 10 100 Hepatocitos/ CRL2706 Hepatocitos/HEP3B Epiteliales Fibroblastos mRNA%(r.u.) PCR%24h – 100 – 1 10 100 Hepatocitos/ CRL2706 Hepatocitos/HEP3B Epiteliales Fibroblastos mRNA%(r.u.) PCR%48h – 101 – Figura 29. Concentraciones proteicas de PCR y AAS en los diferentes grupos celulares. – 102 – – 103 – – 104 – – 105 – Discusión ! – 106 – El presente trabajo estudia la vía patogénica de la inflamación sistémica en la EPOC. Nuestros resultados muestran información relevante acerca de la producción de RFA aguda en el parénquima pulmonar con objeto de analizar qué tipos celulares son los principales responsables de esta secreción, y la compara con la síntesis a otros niveles, incluyendo el tejido vascular, la sangre periférica y la síntesis fisiológica a nivel hepático, permitiéndonos avanzar en el conocimiento de la patogénesis de la enfermedad y sus repercusiones sistémicas. Estudios anteriores han demostrado consistentemente que la inflamación en la EPOC no se limita a las vías respiratorias y los pulmones, si no que se asocia a un cierto grado de inflamación sistémica 99. Aunque el aumento de los niveles de PCR, IL-6, IL-8 y TNFα han sido reportados en pacientes con EPOC,104,139 el origen de la producción de moléculas proinflamatorias en esta entidad clínica sigue sin estar claro. Hasta el momento, una de las teorías más aceptadas sigue siendo el fenómeno de “derramamiento” (spill over) de mediadores inflamatorios al torrente sanguíneo, siendo el pulmón el origen de esta inflamación 140. Sin embargo, resultados más recientes cuestionan esta hipótesis, porque no se han identificado asociaciones significativas entre las vías respiratorias y las concentraciones sistémicas de citoquinas proinflamatorias 111. Del mismo modo, las cargas inflamatorias de esputo y de plasma inducida no se correlacionaron entre sí, poniendo esta teoría del origen de la inflamación sistémica en tela de juicio.140 Es por ello que la posibilidad de una causa inversa no pueda descartarse, en la que la propia inflamación sistémica, sea la responsable de generar lesión a nivel de vía respiratoria, parénquima y vasculatura pulmonar 141.Tampoco puede descartarse posibles factores genéticos y constitucionales que puedan predisponer a los pacientes con EPOC a cierto grado de inflamación, tanto pulmonar como sistémica 142. La importancia clínica del aumento de marcadores de inflamación sistémica en pacientes con EPOC reside no sólo en sus manifestaciones extra-pulmonares (incluyendo el aumento del riesgo de trastornos cardiovasculares) 143,144, sino en su asociación con el deterioro de la calidad de vida, riesgo de exacerbaciones145,146 y posiblemente con el pronóstico de la enfermedad 147,148. Ciertas características de los pacientes EPOC en estadio avanzado, como son la debilidad del músculo esquelético y el consiguiente decondicionamiento físico entre otros, están poco relacionadas con el – 107 – grado de limitación al flujo aéreo, y sin embargo parecen vincularse a una respuesta inflamatoria sistémica 149. En un primer momento del estudio, se realizó una comparación de la expresión de RFA en el parénquima pulmonar, arteria pulmonar, y leucocitos de sangre periférica de pacientes con EPOC. También se midió los niveles de PCR en plasma y las concentraciones de AAS con el objetivo de establecer si existen asociaciones significativas con su expresión génica en el tejido. Para poder interpretar de forma correcta los resultados, se deben tener en cuenta ciertas consideraciones de nuestro estudio. En primer lugar, los pacientes incluidos presentaban en su mayoría función pulmonar leve o moderada (estadio I y II de la GOLD), y solo 5 pacientes se encontraban en estadios avanzados de la enfermedad (estadio III de la GOLD). Al ser pacientes sometidos de forma programada a cirugía de resección pulmonar, aumenta la dificultad para obtener muestras quirúrgicas de pacientes EPOC en estadios avanzados graves. Por ello, se debe tener en cuenta cierta falta de homogeneidad en la representación de la muestra. Según estudios previos y lo revisado en un metanálisis y revisión sistemática por Gan y cols.99 se han descrito aumento de mediadores inflamatorios sistémicos como el TNF-α, algunas ILs, proteínas de fase aguda (PCR, fibrinógeno, proteína de unión a lipopolisacáridos (LBP)) y recuento de neutrófilos en pacientes EPOC en fases estables de la enfermedad. Sin embargo, aunque no se conocen bien los mecanismos responsables de esta inflamación sistémica, se ha planteado que está sería mayor mientras más avanzada es la enfermedad 150. Uno de los marcadores de inflamación sistémica que se ha demostrado que aumenta ligeramente en pacientes con EPOC en comparación con controles sanos es la PCR 105. La prevalencia del aumento de la PCR en la EPOC se examinó en la Tercera Encuesta Nacional de Examen de Salud y Nutrición (NHANES III) 151 donde se observa que la PCR parece aumentar con el grado de severidad de la EPOC; 41% de los pacientes con EPOC moderada (FEV1 ≥ 50–80% previsto) tenían un nivel de PCR > 3 mg / l y 6% tenían un nivel > 10 mg / l, mientras que el 52% de los pacientes con EPOC grave (FEV 1 <50% previsto) tenía un nivel de PCR > 3 mg / l y el 23% tenía un nivel > 10 mg / l. En segundo lugar, se incluyeron pacientes con dos agudizaciones al año, por lo teníamos casos que correspondían al fenotipo agudizador frecuente (pacientes que – 114 – de la EPOC se ha estudiado previamente en diversos trabajos. Estudios sobre biopsias bronquiales identifican a las células epiteliales como componentes del proceso inflamatorio 171, añadiendo que esta relación está asociada a la intensidad del tabaquismo 172. Por otro lado, los fibroblastos intervienen en la patogenia de la EPOC, especialmente en la afectación bronquiolar de la vía aérea fina, en la que se ha demostrado una proliferación peribronquiolar, que resulta ser el factor más limitante en la génesis de la obstrucción crónica al flujo aéreo 173. Los fibroblastos son las principales células responsables en la producción y mantenimiento de la matriz extracelular en el pulmón. Por tanto, la alteración en la capacidad funcional de estos fibroblastos puede desempeñar un papel relevante en la patogénesis del enfisema pulmonar, que se traduce en una desestructuración del tejido. Recientemente se ha sugerido una comunicación disfuncional del epitelio-fibroblasto a través de la liberación de mediadores que juegan un papel clave en la inflamación crónica y los procesos de remodelación en la EPOC 174. Este último estudio demuestra a través de la producción de IL-1α derivada de las células epiteliales pulmonares estimuladas en co-cultivo con fibroblastos pulmonares, la inducción de un fenotipo de fibroblasto pulmonar proinflamatorio que se ve reforzado aún más con la exposición al humo del tabaco en la EPOC. Centrándonos en la expresión de RFA en el hígado, en un primer momento empleamos hepatocitos procedentes de líneas celulares de pacientes con hepatocarcinoma (HEP3B). El vínculo entre diversos RFA y el mayor riesgo de desarrollar varios cánceres humanos se ha ilustrado claramente en muchos estudios epidemiológicos 175. Estudios recientes no solo confirman una mayor expresión de AAS en el suero de pacientes con hepatocarcinoma en comparación con pacientes con lesiones benignas o sin enfermedad, si no que observan una asociación significativa entre las concentraciones elevadas de este biomarcador y la reducción de la supervivencia global, lo que determinaría su utilidad como marcador pronóstico176. Varios estudios han subrayado el papel del AAS en la carcinogénesis, aparentemente debido a su capacidad para interactuar con la matriz extracelular, que tiene una gran influencia en la iniciación y el desarrollo del tumor. Los niveles séricos de AAS aumentaron en pacientes con CP 164,177,178, cáncer de próstata 179, carcinoma colorrectal 180 y carcinoma de células renales 181. Además, estudios previos propusieron – 115 – una correlación directa entre las concentraciones de AAS y la etapa del tumor en la que se encontró un mayor porcentaje de niveles elevados de AAS en pacientes con enfermedad más avanzada 182. Además, estudios epidemiológicos recientes, incluso sugieren que los niveles elevados de AAS circulantes pueden estar relacionados con un mayor riesgo de cáncer futuro en individuos aparentemente sanos 183,184. La PCR también desempeña un papel clave en una amplia gama de procesos inflamatorios y desarrollo de tumores. A nivel hepático, diversos estudios demuestran también que el nivel elevado de PCR preoperatoria es indicador predictivo independiente y significativo de mal pronóstico y recurrencia temprana en pacientes con hepatocarcinoma 185,186. En nuestro trabajo encontramos, una mayor expresión génica para PCR y todos los subtipos de AAS en el grupo de hepatocitos con hepatocarcinoma (HEP3B) frente a hepatocitos sanos (CRL2706), destacando una mayor expresión de AAS1 y AAS2 de forma significativa en este grupo de hepatocitos frente al resto de tipos celulares estudiados. Sin embargo, existe un factor limitante importante al utilizar este grupo celular, que puede relacionarse con el mayor nivel de inflamación obtenido a nivel de hepatocitos con enfermedad, no mostrando así la verdadera síntesis fisiológica a nivel hepático presente en nuestros pacientes con EPOC. Por ello en un segundo tiempo empleamos hepatocitos sanos, eliminando ese factor limitante en este segundo grupo celular. Cuando comparamos la expresión génica a nivel pulmonar con la síntesis fisiológica a nivel hepático, vemos que la expresión génica a nivel pulmonar, en células epiteliales y fibroblastos, es significativamente mayor a nivel de todos los marcadores inflamatorios en comparación con los hepatocitos sanos (CRL2706). Sin embargo, a este nivel no pudieron compararse las concentraciones plasmáticas frente al grupo de hepatocitos sanos, al presentarse dificultades por lento crecimiento en esta línea celular. Se deben tener en cuenta algunas limitaciones para los estudios realizados a nivel de cultivos celulares como el nuestro, a la hora de evaluar la relación potencial y reflejar completamente la situación in vivo. Nuestro equipo cuenta con una amplia experiencia en el cultivo celular, tanto en líneas comerciales como de cultivo primario procedentes de muestras humanas. Sin embargo, las limitaciones que surgen ante este – 116 – tipo de estudios in vitro son especialmente debidas los problemas de mantenimiento de las líneas celulares. Además, la mayoría de los estudios disponibles son pequeños en tamaño y alcance y, como tales, pueden haber carecido por sí mismos de suficiente poder estadístico para abordar este problema de manera adecuada. Esto es importante a tener en consideración, ya que se observa una marcada heterogeneidad de la respuesta inflamatoria sistémica, tanto a nivel de pacientes como de las proteínas. Varios biomarcadores de inflamación se caracterizan por una distribución asimétrica y muestran una considerable variabilidad analítica.105 Además la presencia de una determinada carga inflamatoria sistémica debe interpretarse con cautela debido a su gran variabilidad interindividual entre pacientes. Por otro lado, no podemos descartar el papel que juegan otros tipos de células pulmonares menos estudiados en la síntesis de inflamación en la EPOC. En este sentido, nuestro grupo estudia el papel de las células dendríticas en la patogenia de la EPOC 187, tema actual de debate, ya que las investigaciones en humanos, animales e in vitro arrojan resultados contradictorios 188,189. Las células dendríticas parecen ser una agente clave en la modulación de la respuesta inmune y podrían tener un papel relevante en la patogenia de la enfermedad. Nuestros resultados confirman los resultados anteriores del trabajo de Stoll et al 190. al mostrar que el humo del tabaco es el principal determinante en la falta de maduración de las células dendríticas en el pulmón. Nuestros últimos resultados a nivel hepático provienen de modelos celulares de sujetos sanos, con idea de explorar el comportamiento fisiológico. Sin embargo, debemos reproducir este estudio en pacientes con EPOC, para determinar si el comportamiento del tejido hepático de estos pacientes se comporta de manera similar, y si esta expresión de biomarcadores a nivel pulmonar es independiente o no de la síntesis fisiológica hepática, contribuyendo a aclarar el origen de esta inflamación sistémica en la EPOC. Por este motivo, nuestro grupo ha iniciado un nuevo proyecto de investigación para tratar de dilucidar el papel de las células hepáticas en este contexto clínico. La población a estudio serán pacientes EPOC y fumadores o exfumadores con un consumo acumulado de >10 paquetes-año sin la enfermedad, sometidos a biopsia hepática para estudio de cirrosis hepática y aquellos sometidos a biopsia hepática por transaminasemia elevada. Este segundo grupo nos servirá como control de las posibles alteraciones que puedan tener los pacientes cirróticos. – 117 – En definitiva, los conocimientos actuales de los distintos mecanismos que subyacen a la inflamación de la EPOC están aumentando significativamente en los últimos años, pero sigue lejos de ser completa. Se necesitan más estudios para identificar las posibles fuentes sistémicas de moléculas proinflamatorias en pacientes con EPOC. El interés por identificar nuevos biomarcadores pronósticos inflamatorios de la EPOC tiene como objetivo final, dilucidar el nexo de unión entre la EPOC y la afectación sistémica de la misma y ofrecer y mejorar nuevos enfoques terapéuticos a medida 191. – 118 – Conclusiones PRIMERA. Mediante el análisis de expresión génica de RFA mayores hemos demostrado que está síntesis es más marcada en pacientes con EPOC que en fumadores sin la enfermedad. SEGUNDA. De acuerdo con la metodología empleada se constata que el parénquima pulmonar es la principal fuente de RFA en pacientes con EPOC en comparación con arteria pulmonar y la circulación periférica. TERCERA. No se observan asociaciones entre la expresión de RFA pulmonares y sus niveles en plasma circulante, por lo que la fuga de proteínas inflamatorias de los pulmones a la corriente sanguínea es poco probable. CUARTA. El hígado no es el único responsable en la síntesis de PCR y AAS, sino que el pulmón es también capaz de realizar esta síntesis. QUINTA. Destaca la expresión a nivel pulmonar por parte de fibroblastos, lo que daría un mayor protagonismo al papel de estas células en la respuesta inflamatoria. SEXTA. El estudio de cultivos celulares aporta poblaciones celulares aptas para el estudio de la síntesis de biomarcadores, con las limitaciones comentadas. – 119 – SÉPTIMA. El estudio comparativo entre las células pulmonares y los hepatocitos muestra una mayor expresión para determinados RFA por parte del pulmón en comparación con la síntesis fisiológica a nivel hepático. OCTAVA. Son necesarios futuros estudios que corroboren los resultados encontrados a nivel de cultivos celulares, permitiéndonos determinar si el comportamiento del tejido hepático en los pacientes con EPOC se comporta de manera similar. – 120 – Anexos – 121 – I. Consentimiento informado – 122 – Consentimiento informado. Yo,_____________________________________________________________ He leído la hoja de información que se me ha entregado. He podido hacer preguntas sobre el estudio. He recibido suficiente información sobre el estudio. He hablado con el Dr.________________________________. Comprendo que mi participación es voluntaria. Comprendo que puedo retirarme del estudio: -Cuando quiera. -Sin tener que dar explicaciones. -Sin que esto repercuta en mis cuidados médicos. Presto libremente mi conformidad para participar en el estudio. Sevilla, a __________ de _______________________ de _________ Firma del participante o su representante legal. – 123 – Anexo I. Consentimiento informado. Hoja de información al paciente. Estimado paciente: Próximamente, Ud. va a ser intervenido en el quirófano por un problema de salud relacionado con su aparato respiratorio. Durante la intervención se le quitará parte de un pulmón. Esta parte quitada irá al laboratorio del hospital donde se procederá a realizar cuantos análisis sean necesarios según la naturaleza del proceso que Ud. padezca. Actualmente, estamos llevando a cabo un proyecto de investigación con objeto de determinar algunos mecanismos inflamatorios en pacientes con enfermedades pulmonares como la suya. Por este motivo, le pedimos su colaboración en este proyecto. Este estudio ha obtenido la aprobación del Comité Ético del Hospital Universitario Virgen del Rocío y en él se respetarán las recomendaciones éticas internacionales para estudio con seres humanos (Declaración de Helsinki). El objetivo de este proyecto es estudiar si algunas moléculas inflamatorias, llamadas reactantes de fase aguda, son producidas por el aparato respiratorio. Durante su participación en el estudio será necesario realizarle una analítica de sangre adicional, una medición de la composición corporal y una prueba de marcha andando durante 6 minutos. Además, precisamos es su consentimiento para poder realizar alguna prueba más a la pieza anatómica que le sea extraída durante la intervención. Es importante que sepa que bajo ningún concepto se le extraerá mayor cantidad de tejido de la que sea estrictamente necesaria por su intervención. En caso de que la muestra obtenida no sea satisfactoria para el objetivo de este trabajo, no lo incluiremos en el estudio, pero en ningún caso se tomarán muestras añadidas para este trabajo. Los beneficios que se derivarán de este estudio serán un mayor conocimiento de los mecanismos que subyacen en la inflamación pulmonar y que son responsables de algunas enfermedades pulmonares y de sus repercusiones en el resto del organismo. – 130 – Cardiopatía valvular. Incluye: • Pacientes con una estenosis o insuficiencia valvular aórtica o mitral hemodinámicamente significativa. • Pacientes con prótesis valvulares aórtica o mitral, • prolapso valvular mitral sintomático, • hipertrofia septal asimétrica que requiera tratamiento • insuficiencia tricuspídea. Enfermedad vascular periférica. Incluye: • Pacientes con claudicación intermitente. • Pacientes con by-pass femoral por insuficiencia arterial. • Pacientes con episodios de gangrena o insuficiencia arterial aguda. • Aneurisma no tratado de aorta torácica o abdominal de 6 o más centrímetros. Hipertensión. Incluyen: • Pacientes con TAD > 120 mmHg. • Pacientes con TAD entre 100 – 120 mmHg. • Pacientes con TAD < 100 e hipertensos bien controlados. Enfermedad cerebrovascular. Incluye a pacientes con historia de accidentes cerebrovasculares con lesiones residuales mínimas o ausentes así como AIT. Parálisis. Incluye pacientes con hemiplejía o paraplejia como resultado de un accidente cerebro vascular u otras enfermedades. Demencia. Pacientes con déficit cognitivo crónico. Otras enfermedades neurológicas. Incluye: • Enfermedad de Parkinson. • Epilepsia no controlada. • Síncope de causa no filiada. Enfermedad pulmonar. Incluye: • Leve. Pacientes disneicos con actividad física moderada sin tratamiento o disneicos sólo durante las crisis (asma). • Moderada. Pacientes disneicos con actividad física pequeña con o sin tratamiento y aquellos disneicos con actividad moderada a pesar de tratamiento. • Severa. Pacientes con disnea de reposo a pesar de tratamiento, pacientes que requieran oxígeno de manera constante, pacientes con retención de carbónico y aquellos con PO2 < 60 mmHg (50 Torr). Diabetes. Incluye: • Severa. Pacientes con afectación de órganos diana (retinopatía, nefropatía o neuropatía). • Moderada. Pacientes con hospitalizaciones por cetoacidosis, coma hiperosmolar, que requieran hospitalizaciones para control de la diabetes y diabetes juveniles o brittle. • Leve. Todo el resto de diabetes que se tratan con insulina y/o ADO, pero no sólo con dieta. Otros trastornos endocrinos. Hipopituitarismo, insuficiencia adrenal y acidosis recurrente. Enfermedad renal. Incluye: – 131 – • Severa: pacientes en diálisis o trasplantados o con uremia. • Moderada: creatinina > 3 mgr/dL. • Leve: creatinina 2 – 3 mgr/dL. Enfermedad hepática. Incluye: • Severa: cirrosis con hipertensión portal y antecedentes de sangrado por varices (con las tres). • Moderada: cirrosis con hipertensión portal pero sin antecedentes de sangrado por varices. • Leve: cirrosis sin hipertensión portal o hepatitis crónica. Enfermedad inflamatoria intestinal. Pacientes con colitis ulcerosa o enteritis regional. Enfermedad ulcerosa péptica. Pacientes que han precisado tratamiento para ulcera, incluyendo a los que han sangrado. Sangrado gastrointestinal. Pacientes que han tenido un episodio de sangrado gastrointestinal con necesidad de transfusión por causas distintas a la enfermedad ulcerosa péptica. SIDA. Pacientes con SIDA demostrado o probable. Linfoma. Pacientes con Hodgkin, linfosarcoma, macroglobulinemis de Waldestrom, mieloma y otros linfomas. Leucemias. Pacientes con leucemia aguda o crónica, mieloide o linfoide y policitemia vera. Cáncer metastásico. Incluyendo mama, pulmon, colon y otros tumores sólidos. Tumores. Pacientes con tumores sólidos sin evidencia de metástasis con inicio de tratamiento en los 5 años previos, incluyendo mama, pulmon, colon y otros tumores sólidos. Enfermedad reumatológica. Pacientes con LES, polimiositis, EMTC, polimialgia reumática y artritis reumatoide moderada-severa. Coagulopatías. Pacientes con anticoagulantes circulantes u otras coagulopatías. – 132 – Bibliografía – 133 – 1. Celli BR, MacNee W. Standards for the diagnosis and treatment of patients with COPD: a summary of the ATS/ERS position paper. Eur Respir J. 2004; 23:932- 46. 2. World Health Organization. GOLD executive committe. Global initiative for Chronic Obstructive Pulmonary Disease. Disponible en: www.goldcopd.com. 3. Hogg JC, Chu F, Utokaparch S, et al. The nature of small-airway obstruction in chronic obstructive pulmonary disease. 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