Determinación rápida de microorganismos filamentosos en fangos activados

Existen ntuchos méto«los para Ia estimación de la biomasa de un bioproceso. Sin embargo, ésta puede re_ sultar una tarea laboriosa. tediosa e impracticable. Las muestras que con_ tienen organismos filamentosos, como los fangos activos de E.D.A.R.s. presentan especiales dificultades ya que puede ser necesario estimarlos por separado. En este traba.jo se muestra un ntétodo de recuento de estos organismos sencillo y rápido. EI objetivo es disponer de un método cuantitativo de estimación de micro_ organismos filantentosos para opri_ mizar el uso del hipoclorito sódico en sistemas de fangos activos con pro_ blemas de esponjamiento o espumas. Polobros clove: Depuración biológica Aguas residua_ les. Fangos acli vos, Microoreanis_ rnos filamentosos, Estimaciónde la biomasa. Técnica recuento. Rapide determination of fitamentous microorganims in activated sludge. Despite many merhods available, biomass estimation of a bioprocess may sometimes become laborious and impracticable. Samples conrai_ ning filamentous organisms, as in Wastewater Treatment plants, pre_ sent special counting difficulties. If they are abundant they may need to be estimated separately. In this work a counting method for these orga_ nisms is shown. The main goal is to improve chlorination of activated sludge suff'ering bulking or foarning through a quantitative record offila_ mentous bacteria. Keywords: Biological treatment, Wastewaters. Activated sludge. Filamentous microorganisms, Biomass estimation. Counting. l. lnfoducción T c evaluación de lr biomasa es I una de Iar r ariable\ más impor_ L tant.s de un bioproceso. ya que su determinación nos lleva a la com_ prensión de la eficiencia dej mismo. Se trata de una variable clave para es_ tablecer las tasas de producción, de consumo de nutrientes y el cálculo de los balances de masa de cualquier proceso biológico. por tanto, el dis_ poner de un método preciso para su estimación, en tiempo real, es un ob_ jetivo primordial en la explotación de cualquier proceso biológico. Existen numerosos métodos, di_ rectos e indirectos, para la estima_ ción de biomasa ya sea utilizando técnicas físicas o bioquímicas. A pesar de estos interesantes y prome_ tedores métodos, la evaluación de una población microbiana puede re_ sultar frecuentemente una tarea Ia_ boriosa, tediosa e impracticable desde el punto de vista del tiempo requerido. Aquellas muestras que contienen microorganismos f iIamentosos presentan especiales dilicultades ya que, si son abundantcs. es necesario estimarlos por separa_ do. Este es el caso del sistema de fangos activos de una Estación De_ puradora de Aguas Residuales (EDAR). El proceso de fangos activos es el tratamiento secundario más exten_ dido en el mundo y se trata, sin du_ da, del corazónde una EDAR. La biodiversidad que existe en el fango activo de una EDAR es alta (Taber, 1976; pipes, l97g). Hoy en día, la mayor problemática deteitada a este nivel estriba en el control de las bacterias filamentosas. Estos microorganismos cuando son domi_ nantes causan un gran número de problemas, con un denominador co_ mún: pérdida de la calidad del agua tratada. En general, estos problemas están relacionados con un cambio en las características de sedimenta_ :lól V compactación del fango bio_ lógico. Los fenómenos de esponjamien_ to (b.ulkinil o espumas (foaming) son dos grandes problemas que que_ d¿rn aún por solucionar en eicontrol del proceso de los tratamientos bio_ ARTICUTO§ TECNtCoS Determinación rápida de microorganismos filamentosos en fangos activados Por: Carmen Arnáiz (r). Carmen Jiménez(2) y Fernando Estévez (3) (rr Lda' CC' Biorógicas. Técnico der Laboiatorio de Aguas Residuales. Dpto de Control de calidad de ra Empresa Municifd ¿. auuri..ln.i.nro y Saneamienro de Aguas de Sevilla, pl¿eS¡Sa. t2) Lda. CC. euímicas. Tecnico del Laborarorio d. Agu* Residuales. Dpro. de Control de Calidad de EMASESA. E.D.Á.R. ,,La Ranillai,. Bda San José de palmere. 41006-5evilla. Teréfono/Fax: 95425r1i1. E-mail: cjimenez @emasesa.com (3r Jefe del Departamento de Aguas Residuales de EMASESA. C/ Escuelas Pías. l. .11003_Sevilla. Teléfono: 95.1590109. Fax: 95,12265 I 1. E-mail: [email protected] G G 3 Ltl u. co :f U o C") I [E TECNOLOGIA DELAGUA f,.esumen 1ógicos de aguas residuales. Por otra parte, cada vez con más asiduidad, los controles microbiológicos de los fangos activos se convierten en controles de rutina entre los realizados periódicamente en la línea de agua. Al mismo tiempo, se detecta Ia necesidad de que este tipo de controles sean 1o más objetivos posibles (Polo & Salvadó, 1997). Cuando estos problemas aparecen en una EDAR hay que recurrir en muchas ocasiones a sistemas correctivos de control, típicamente 1a cloración. La optimización económica del uso del hipoclorito sódico pasa indudablemente por un conocimiento objetivo de la cantidad de filamentos en el lango activo. En 1a literatura científica existen diversas técnicas para el recuento de microorganismos fi lamentosos. Sin embargo. eslas suelen consumir bastante tiempo. Hay que tener en cuenta que si se desea utilizar cualquier técnica de recuento, como anáHsls rutinario. en la explotación de 1a planta de tratamiento, ésta además de ser fiable tiene que proporcionar resultados en tiempo real. Las tecnicas rnás antiguas eran semicuantitativas y en los últimos años se han desarrollado otras más precisas aunque, como se ha comentado antes, lentas de utilizar y, por tanto. incompatibles con 1a explotación diaria de la EDAR. Sezgin et a1. (1978) establecieron una técnica para medir 1a longitud total de los filamentos presentes en un fango activo. Usando una cámara de recuento, asignaban a los filamentos presentes diferentes categorías de longitud; los filamentos más largos se medían individualmente. Pipes (1979) utilizó la cámara de Neubauear para contar el número de filamentos. Giovanetti & Mosse (1980) utilizaron una cuadrícula marcada en cajas de Petri para el análisis cuantitativo de la infección por microrrizas en raíces. Salvadó (1990) contaba el número de intersecciones con una circunferencia grabada en el ocular. Pro su parte, Fry (1990) indicó que el mejor método para estimar Ia longitud total de filamentos es el método de las intersecciones con Ias líneas de una cuadrícula. Pitt & Jenkins (1990) establecieron una técnica específica de recuento de filamentos N oc ardia sp., especialmente conocida por 1o laboriosa y tediosa que resulta. El personal de la planta de tratamiento de San José/Santa Clara en California, empleaba una técnica simplificada de recuento de filamentos, ya que no se determinaba la longitud total de filamentos. Esta técnica aparece descrita en Jenkins et al. (1993). Se establecía el número de intersecciones de los filamentos con un segmento trazado en el ocular del microscopio. Estévez (1997) estableció el término "relación de filamentos", que es la suma del número de filamentos observados que interceptan con la circunferencia exterior del ocular. En el presente trabajo se muestra una técnica de recuento de microorganismos filamentosos del fango activo, sencillo y compatible con la explotación de una EDAR al no consumir mucho tiempo. Esta técnica se basa en el método de las intersecciones con las líneas de una cuadrícula. La cuadrícula utilizada es la de la cámara de recuento Neubauer, más asequible que un ocular con una cuadrícula grabada. Sólo se cuentan las intersecciones con los cuadrados de una de los diagonales centrales. El objetivo perseguido es disponer de una técnica de recuento cuantitativa de bacterias filamentosas, para optimizar el uso del hipoclorito sódico en sistemas de fangos activos con problemas de esponjamiento de fangos (bulking) o espumas (/oaming). 2. Métodos de Troboio y Moteriqles El microscopio óptico utilizado fue un Zeiss Axioplan 2 provisto de contraste de fases, oculares 10x y objetivos 10120140 y 100x. El cabezal dispone de una cámara fotográfica Zeiss MC 80 DX y vídeo cámara Sony CCD-IRIS. Las observaciones se realizaron sobre muestras "in vivo", no prensadas ni teñidas (Salvadó, 1990; Estévez,1997). La cámara de recuento empleada fue Neubauer improved, cuadrícula doble (BRAND, Ref.717820) (ver Figura L). La profundidad de la cámara es de 0,1 mm. La cuadrícula de recuento muestra 9 cuadrados grandes, cada uno de 1 mm2. Los 4 cuadrados grandes de las esquinas señalados con una "L" están divididos en 16 cuadrados con 0,25 mm de lado. El cuadrado grande central está dividido en 25 cuadrados medianos con lados de 0,2 mm, estando cada cuadrado mediano subdividido en ARTICULOS TECNICOS Fig. 1 . Cómoro de recuenio Neubouery detolle de lo cuodriculo centrol. G G 3 LLJ cY. CO :f t-- (J o Cr) g E TECNOLOGIA DEL AGUA ARTICUTOS TECNICOS El recuento es rápido y no resulta , cansado Número de intersecciones de filomentos con los cuodrodos oue conformon uno de los diogonoles del cuqdrodo centrol de lo cómoro de Neubouer. Csdo volór es lo medio de l2 recuentos. Dodo lo obundoncio de filomentos en lo fose 2, el recuento se reolizó en muestros diluidos (Foctor de dilución=S) 16 cuadrados pequeños con 0,05 mm de lado. Se realizó el recuento de las intersecciones con una de los diagonales del cuadrado central que incluye 20 cuadrados pequeños dentro de los 5 cuadrados medianos señalados con una "E". Hay que decir que este diagonal se incluye prácticamente entera en el campo visual del microscopio, con lo que el recuento es rápido y no resulta cansado ni tedioso. Los recuentos fueron realizados con el objetivo de 20x, "in viyo" y con contraste de fases. Se contó e1 número de intersecciones con una de los diagonales del cuadrado central de los filamentos libres y aquellos que se extienden desde el flóculo ya sean rectos, ligeramente curvados. curvados o torcidos. También se contaron los que estaban en el interior de los flóculos y podían distinguirse entre la estructura flocular. Una cámara de recuento frecuente en cualquier laboratorio de aguas residuales es la cámara de Fuchs- Rosenthal, utilizada en el recuento de pequeños flagelados para estabiecer el Indice Biótico del Fango Activo (SBI, Sludge Biotic Index), según Madoni (1994). La profundidad de la cámara es de 0,2 mm. La cuadrícula de recuento tiene 1 6 cuadrados grandes de 1 mm de lado. Cada cuadrado grande está subdividido en 16 cuadrados pequeños de 0,25 mm de lado. Se comprobó que ei recorrido de la diagonal de esta cuadrícula es muy largo, con lo cual TECNOLOGIA DEL AGUA 04/03/99 o8/03/ee 11/03/99 15/03/ee 16/03/ee 17 /A3/ee 18/03/9e 22/A3/ee x/a3/ee un solo recuento resulta cansado. Además, la profundidad de Ia cámara es el doble que la de la cámara de Neubauer, por 1o que hay más planos que observar, dificultándose enormemente el recuenio. Las muestras para este estudio fueron recogidas de la EDAR. "La Ranilla" de Sevilla, instalación que explota la Empresa Municipal de Abastecimiento y Saneamiento de Aguas de Sevilla, S.A. (EMASESA). Esta depuradora posee dos fases de tratamiento, con un caudal de diseño de 25.000 m3/d cada una. Durante el período de experimentación las condiciones de trabajo fueron las siguientes: carga másica de 0,83 y 0,22k9 DBOr/kg SSLM, respectivamente, y concentración media de oxígeno disuelto de2,8 mgil en la fase 1 y de 5 ,2 mgl en la fase 2. 3. Resultodos y Discusión Los resultados obtenidos se muestran en la Tabla 1. En la fase 1, se observa que en los días 041 03 199, 08 I 03 199 y I I / 03 199 el número de intersecciones es muy similar. La media de esos valores era 9,55 y la desviación estándar + 0,25. 9,33 9,50 ,j, Fose 2 Ne iniersecciones 79,3 153 19,3 135 13,7 55,0 11 ,6 67,9 21,8 g4,2 28,9 go,g En esta primera fase las bacterias filamentosas dominantes eran bacterias libres (tipo 1863 y 0211), que conferían turbidez al clarificado. Las bacterias filamentosas en el interior del flóculo que proporcionan una red o "microesqueleto" en el que se adhieren las bacterias floculantes eran escasas (ausencia de macroestructura). Esto daba como resultado que muchos flóculos fueran de tamaño pequeño y débil consistencia. Este tipo de flóculo no decantaba bien y en el decantador secundario no se detectaba una interfase clara entre el fango decantado y el líquido sobrenadante, sino que ésta era difusa. Esta situación empeoró a partir del26102199, cuando se detectó un gran vertido de detergentes. que provocó una importante defl oculación (disgregación fl ocular) del fango activo. Además, durante los días citados anteriormente, la abundancia de filamentos fue escasa: criterio de abundancia algunos/comunes, categoría numérica 2l3,fllamentos no en todos los flóculos con baja densidad (1-5lflócu- los) (criterio cualitativo de abundancia de filamentos según Jenkins etal.,1993). Dadas las características del flóculo en la fase 1, así como la escasa Fose I Ne inlersecciones G G I LLJ C¿, CO l - O C C.) I EE o o- 3 L_tl dz co l F_ U o cr) g E densidad y diversidad de microorganismos, se procedió a la inoculación en esta fase con los fangos en exceso de la fase 2, los días 10103199 y 11103199 desde las 8.00 a las 14.00 horas, y el día 12103199 desde las 8.00 a las 17.00 horas. Se puede observar en la Tabla 1, que el número de intersecciones se triplicó tras esta inoculación. Esto nos indica que el método es suficientemente sensible para detectar cambios rápidos. En la fase 2, se observó durante el período de estudio una gran abundancia de filamentos, categoría numérica 5: abundantes. filamentos en todos los flóculos con densidad alta (>20 filamentos/flóculo). Debido a esta abundancia de filamentos 1os flóculos tenían una estructura muv abierta. con frecuentes puente5 interfloculares. E,sto hacía que el IVF de esta cuba fuera alto (superior a 200 ml/g), es decir, estábamos ante una situación de bulking filamentoso. Vemos en la Tabla 1, que el número de intersecciones en la fase 2 era alto durante los días 08103199, 15103199 y 16103/99. Se procedió a la cloración de la recirculación de esta cuba a mediodía del 16/03199 con 1 8 l/h de hipoclorito sódico (150 g Cl,/l). La cloración continuó hasta la noche del 18/03199. Se observa en la Tabla I que el número de intcrsccciones disntinuyó 2.5 veces ll día siguicnte del comienzo de Ia ckrracirin. De nuevo, esto indica que esta técnica de recuento es capaz de detectar rápidamente cambios en la cantidad de filamentos. Una vez interrumpida la cloración, el número de intersecciones aumentó, si bien no se alcanzaron Ios niveles inicia- 1es. En la Tabla 1 se muestran el número de intersecciones de filamentos con los cuadrados de una de las diagonales centrales de la cámara de recuento. No obstante, puede ser interesante expresar los resultados en metros de filamento por ml de licor mezcla. Para ello, se realizaron dos cálculos que relacionan la longitud total de filamentos extendidos TECNOLOGIA DEL AGUA ARTICUtOS TECNtCOS en un área dada con el número de veces que éstos interceptan con una cuadrícula situada en dicha área. El volumen de muestra es el contenido en el cuadrado grande central de la cámara de recuento utilizada. es decir,0,1 pl. Cálculo I nxdxF T- L_ Cálculo 2 T- L_ 2xrx2xY nxAxF rx 1xV Donde: L = longitud total de filamentos (mm/p1ó mimi) n = número de intersecciones r = número de recuentos V = r,olumen de muestra (0,1 pl) F = 10.5 d = diagonal del cuadrado grande central de la cámara de Neubauer (mm) A = área del cuadrado grande central de la cámara de Neubauer (mm') I = Lperímetros de los cuadrados pequeños de Ia diagonal (mm) Si se sustituyen los valores fijos, únicamente se tendrá que multiplicar una constante por el número medio de intersecciones; Cálculo I n L (mm/¡rl-;m/ml) =- x37,12 r Cálculo2 n L (mm/¡rl-;nrlml) =- x26,25 r En el primer cálculo, se divide el número de intersecciones por 2 para obtener el número de tramos y se considera que la longitud media de tramo es la diagonall2. Por último, se extrapola al número total de cuadrados pequeños del cuadrado grande central de la cámara de Neubauer (F=10,5). Es un cálculo intuitivo. En el segundo cálculo. siguiendo a Giovannetti & Mosse (1980), se tiene en cuenta el área total observada, longitud total del transecto sobre el que se realiza el recuento (suma de los perímetros de los cuadrados pequeños) y se extrapola al número total de cuadrados pequeños del cuadrado grande central de la cámara de Neubauer (F=10.5). Es un cálculo matemático. Los resultados aparecen en la Tabla2. Como se observa en la Tabla 2, ambos cálculos son bastante similares. Por tanto, podemos trabajar si desea con el primero que, como hemos dicho, es más intuitivo que matemático. De esta forma se podría hablar de "longitud media de filamentos/ml de licor mixto". Esta técnica está implantada en el Laboratorio de Aguas Residuales de EMASESA como análisis de rutina en el estudio de la calidad de fanpos activos. 3. Conclusiones La técnica de recuento de bacterias filamentosas quedaría establecido como sigue: . Agitar suavemente durante 2-3 minutos el licor mixLo. . Secolocauna gota sobre lacámara de Neubauer y se cuenta el número de intersecciones con cada uno de los lados de los 20 cuadrados pequeños que forman una de los diagonales del cuadrado central. Se realiza el recuento de la muestra "invivo", no prensada ni teñida, a 200 aumentos, y con contraste de fases. Si el recuento resulta dificultoso por 1a abundancia de filamentos se diluye la muestra. . Si se desea, expresar los resultados en m/ml mediante alguno de los cálculos mostrados en el apartado de resultados. Esta técnica se ha mostrado útil desde el punto de vista de la explotación de la EDAR. De hecho, ha proporcionado información rápida sobre el aumento de la abundancia de filamentos, tras 1a inoculación de :l i: ' : ARTICULO§ TE€NICO§ Contidod de filomentos, expresodo como m/ml de licor mezclo según el método de cólculo 1 y 2 una de las fases de tratamiento. así como de la dismrnución de la cantidad de f-ilamentos tras un proceso de cloración en otra. Los datos expresados como "longitud media de filarnentos/m1 de licor mixto" parecen tener validez desde el punto de vista matemático, si bien son algo más intuitir os. Con esta técnica. se puede contar el número de intersecciones de los filamentos libres y aquellos que se extienden desde el flóculo, ),a sean rectos, iigeramente curvados. curvados, torcidos, o enrollados. También es posible contar los que estén en el interior de los flóculos y puedan distinguirse entre la estructura flocular. El siguiente paso, sería establecer a partir de qué y hasta qué número de intersecciones (ó m/ml) por mg de SSVLM es recomendabie la cloración. Agrodecimientos Deseamos dar las gracias al Grupo de Tratamiento de Aguas Residuales de 1a Escuela Universitaria Politécnica de Sevilla, que muy amablemente nos ha prestado su cámara de Neubauer para comenzar este estudio. y a EMASESA por las facilidades para la realización del presente trabajo. Fecho 04/03/9e 0B/03/ee 1t /03/ee 15/03/ee 16/03/ee 17 /03/ee 1B/03/ee 22/03/ee 23/03/ee Cólculo I 346 353 3ó5 716 509 431 809 I 0ó9 5679 50r 1 2041 2520 3126 2999 6. 11. Fose ICólculo 2 245 249 258 507 3ó0 305 572 756 Bibliogrofio i, Estér,ez, F. (1997). Optimización del uso de hipoclorito sódico en problemas de esponj amiento. M icroorganismos filamentosos en el fango activo, pp. 137 -141. Publicación de la Empresa Municipal de Abastecimiento y Saneamiento de Aguas de Sevilla, s.A. (EMASESA). I.S.B.N. 84-923139-0-0. 2. Fr¡,. J.C. (1990). Direct methods and biomass e5timation. Methods in N4icrobiology 22, +1. 3. Giovannetti. N{. & Mosse. B. (1980). An evaluation of techniques for measuring vesicular arbuscular mycorrhizal infection in roots. New Phi,tologist 84,,189. 4. Jenkins, D., Daigger, G.T. and Richard, M.G. (1993). Manual on the causes and control of activated sludge bulking and foaming. 2nd Edition, Lewis Publishers Inc., Chelsea. ML I.S.B.N. 0-8',7 37 1 -87 3 -9. 5. Madoni, P. (1994). A Sludge Biotic Index (SBI) for the evaluation ofthe biological perfomance of activated sludge plants based on the microfauna analysis. Water Research 28,61. Fose 2 Cólculo I Cólculo2 2906 2056 1. 8. 9. . ' ,', ,4016 3544 1 444 1782 2210 2121 Pipes, WO. (1978). Microbiology of activated sludge bulking. Advances in Applied Microbiololgy 24,85. Pipes, W.O. (1979). Bulking, deflocculation and pin-point floc. Journal of WaterPollution and Control Federation 51, 62. Pitt, P.A. & Jenkins, D. (1990). Causes and control of Nocardia in activated sludge. Journal of Water Pollution and Control Federation 62,143. Polo, P & Salvadó, H. (1997). Problemas de bulking y foaming en la práctica diaria de una E.D.A.R. Microorganismos fi lamentosos en el fango activo, pp. 137-144. Publicación de la Empresa Municipal de Abastecimiento y Saneamiento de Aguas de Sevilla, S.A. (EMASESA). I.S.B.N. 84-923 1 39-0-0. Salvadó, H. (1990). Métodorápido para el control del bulking. Tecnología del Agua 67,60. Sezgin, M. Palm, J.H. & Parker, D.S. (1978). A unified theory of filamentous activated sludge bulking. Journal of Water Pollution and Control Federation 50,362. Taber, W.A. (1976). Wastewater microbiology. Annual Reviews Microbiology 30, 263. 10. G G I LL] M cO f - () C 3 E 12. TECNOLOG]A DEL AGUA View publication statsView publication stats