Determinación de valores normales de sustancia P en líquido cefalorraquídeo de neonatos

UNIVERSIDAD DE SEVILLA FACULTAD DE MEDICINA DEPARTAMENTO DE FARMACOLOGÍA, PEDIATRÍA Y RADIOLOGÍA “DETERMINACIÓN DE VALORES NORMALES DE SUSTANCIA P EN LÍQUIDO CEFALORRAQUÍDEO DE NEONATOS” TESIS DOCTORAL María Esther García Rodríguez Sevilla, 2015 ABREVIATURAS BHE barrera hematoencefálica BPEG bajo peso para la edad gestacional CCK colecistoquinina CD células dendríticas CMH células madre hematopoyéticas DS desviaciones estándar EB exceso de bases EDTA ethylenediaminetetraacetic acid EHI encefalopatía hipóxico-isquémica EKA (B, C y D) endokinina A (B, C y D) ELISA enzimoinmunoanálisis EPN endopeptidasa neutra GABA ácido gamma-aminobutírico HIF1A factor hipoxia-inducible 1α HPLC cromatografía líquida de alta eficacia ITU infección del tracto urinario IL interleuquina LCR líquido cefalorraquídeo MAPK “mitogen-activated protein kinase” MDR “multidrug resistant receptor” HK-1 hemokinina 1 NKA (B) neurokinina A (B) NO óxido nítrico NP neuropéptido NPY neuropéptico tirosina NPγ neuropéptido gamma NPK neuropéptido K PAEG peso adecuado para la edad gestacional PCR proteína C reactiva PIC presión intracraneal PL punción lumbar PPT-I preprotaquikinina 1 PRGC péptido relacionado con el gen de la calcitonina RAPG receptor acoplado a una proteína G RIA radioinmunoanálisis RN recién nacido RNMBP recién nacido muy bajo peso RNT recién nacido a término RNPT recién nacido pretérmino RTK receptor taquicinérgico SI sistema inmune SNC sistema nervioso central SP sustancia P TAC (1, 2 y 4) gen preprotaquiquinina (1, 2 y 4) TACR (1, 2 y 3) gen del receptor de taquiquinina (1, 2 y 3) TK taquicinina TNF factor de necrosis tumoral VIP péptido intestinal vasoactivo VRS virus respiratorio sincitial ÍNDICE I. INTRODUCCIÓN 1. EL LÍQUIDO CEFALORRAQUÍDEO 1.1 Formación, flujo y absorción del LCR…...........................................2 1.2 Barreras hematocefalorraquídea y hematoencefálica….....................9 1.3 Estudio del LCR….............................................................................19 2. LA SUSTANCIA P Y EL RECEPTOR NK1 2.1 Neuronas, sinapsis y neurotransmisores.…………………………...34 2.2 Neuropéptidos (NP)………………………………………………...50 2.3 Taquicininas (TK)…………………………………………………..69 2.4 Receptores taquicinérgicos (RTK)………………………………….79 2.5 Sustancia P (SP)…………………………………………………….85 2.6 Receptores NK1…………………………………………….………90 2.6.1 Agonistas de los receptores NK1…………………………………95 2.6.2 Antagonistas de los receptores NK1……………………………...98 2.7 Efectos fisiológicos y fisiopatológicos del sistema SP/NK1 receptor………………………………...…….102 II. HIPÓTESIS Y OBJETIVO 1. HIPÓTESIS…………………………………………………….…..119 2. OBJETIVO……………………………………………….………..121 III. MATERIAL Y MÉTODO 1. MATERIAL 1.1. Material fungible………………………………….. ……….…….123 1.2. Material inventariable……………………………………………..123 1.3. Material biológico: Recogida de muestras………………………..124 2. MÉTODO 2.1. Diseño del estudio………………………………………………....127 2.2. Población del estudio. Número de muestras………………………127 2.3. Aspectos éticos………………………………………………...….127 2.4. Enzimoinmunoanálisis (ELISA)………………………………......128 3. RECOGIDA DE DATOS EPIDEMIOLÓGICOS Y CLÍNICOS……………………………………………………....133 4. ANÁLISIS DE LOS DATOS………………………………….…..134 IV. RESULTADOS………………………………………………..135 V. DISCUSIÓN…………………………………………………….146 VI. RESUMEN……………………………………………………..185 VII. CONCLUSIONES…………………………………………..188 VIII. BIBLIOGRAFÍA…………………………………………...191 FIGURAS Figura 1 Esquematización del flujo normal del LCR Figura 2 Plexo coroideo en un ventrículo lateral Figura 3 Drenaje de un espacio perivascular hacia el espacio subaracnoideo Figura 4 Estructura de la unidad neurovascular y de la unión intercelular estrecha Figura 5 Mecanismos de transporte de la BHE Figura 6 Comparación del recuento de leucocitos en LCR de RN con y sin meningitis Figura 7 Recuento de leucocitos en RN “normales” y “sintomáticos” Figura 8 Dibujos realizados por Cajal de diferentes estructuras del SNC Figura 9 Estructura de una neurona grande perteneciente al encéfalo Figura 10 Fotografía al microscopio óptico de una gran motoneurona Figura 11 Anatomía fisiológica de la sinapsis Figura 12 Sistema de segundo mensajero a través de proteína G Figura 13 Representación esquemática de la síntesis neuronal de NP Figura 14 Estructura de un receptor de la familia de los RAPG Figura 15 Receptor acoplado a proteína G (RAPG) Figura 16 Mecanismos efectores de la proteína G Figura 17 Representación esquemática de la estructura de los RTK Figura 18 Representación esquemática de la organización de los genes que codifican los RTK humanos Figura 19 Imagen tridimendional de la SP Figura 20 Mecanismo de acción de la SP Figura 21 Representación esquemática que muestra los sitios de unión del receptor NK1 Figura 22 Representación tridimensional de la estructura de L-732,138, L-733,060 y aprepitant. Figura 23 Sitios de unión al receptor NK1 de SP y aprepitant Figura 24 Resumen de las acciones hematopoyéticas de la SP y NK-A Figura 25 Descripción del ELISA competitivo para SP Figura 26 Esquema de curva estándar de preparación de ELISA Figura 27 Edad Figura 28 EG Figura 29 Sexo Figura 30 Clínica inicial Figura 31 Valores de PCR Figura 32 Valores SP Figura 33 Prueba de Kolmogorov-Smirnov para una muestra Figura 34 Histograma sobre la distribución de los valores de SP Figura 35 Nube de puntos sobre la correlación Edad/Valor SP Figura 36 Nube de puntos sobre la correlación EG/Valor SP Figura 37 Nube de puntos sobre la correlación PCR/Valor SP Figura 38 Diagnóstico final de los RN sometidos a PL Figura 39 Degradación de la SP en LCR Figura 40 Aumento de los niveles de HIF1A conforme aumentan los de SP TABLAS 5 características finales del LCR pasan a ser las siguientes: presión osmótica, aproximadamente igual a la del plasma; concentración de iones sodio, similar a la del plasma; iones cloruro, en torno a un 15% mayor que en el plasma; iones potasio un 40% menos, y glucosa, aproximadamente un 30% menos. Absorción del LCR a través de las vellosidades aracnoideas. Las vellosidades aracnoideas son proyecciones digitiformes microscópicas de la aracnoides hacia dentro que atraviesan las paredes y van dirigidas hacia los senos venosos. Sus conglomerados forman estructuras macroscópicas llamadas granulaciones aracnoideas, que pueden verse sobresalir hacia los senos. Con el microscopio electrónico se ha observado que las células endoteliales que cubren las vellosidades presentan pasadizos vesiculares directos a través de su soma con unas dimensiones suficientes como para permitir el flujo relativamente libre hacia la sangre venosa de: LCR,moléculas proteicas disueltas, y hasta partículas del tamaño de los glóbulos rojos y blancos (Guyton & Hall, 2011). Espacios perivasculares y LCR. Las grandes arterias y venas del encéfalo se hallan sobre su superficie, pero su tramo final penetra hacia el interior, y arrastra una capa de piamadre, la membrana que cubre al encéfalo, según se observa en la Figura 3. La piamadre está muy poco adherida a los vasos, por lo que existe un espacio, el espacio perivascular, entre ella y cada vaso. Así pues, los espacios perivasculares siguen a las arterias y las venas hacia el encéfalo hasta llegar a las arteriolas y las vénulas. 6 Figura 3 Drenaje de un espacio perivascular hacia el espacio subaracnoideo (Ranson, 1959.) Función linfática de los espacios perivasculares. Como sucede en cualquier otra parte del cuerpo, una pequeña cantidad de proteínas se filtra desde los capilares del encéfalo hacia sus espacios intersticiales. Dado que en el tejido cerebral no existen auténticos vasos linfáticos, este exceso proteico sale contenido en el líquido a través de los espacios perivasculares hasta los espacios subaracnoideos. Al llegar a ellos, las proteínas pasan a circular con el LCR, para absorberse hacia las grandes venas cerebrales a través de las vellosidades aracnoideas. Por tanto, los espacios perivasculares en realidad constituyen un sistema linfático especializado para el encéfalo. Además de transportar líquido y proteínas, también sacan del encéfalo sustancias sólidas extrañas. Por ejemplo, siempre que hay una infección encefálica, los glóbulos blancos muertos y otros residuos infecciosos se expulsan por los espacios perivasculares (Guyton & Hall, 2011). Así, la entrada de leucocitos dentro del parénquima cerebral está controlada por diferentes componentes celulares a nivel de las vénulas postcapilares. La regulación de la entrada celular se lleva a cabo por la migración a través de dos estructuras distintas: la pared vascular y las células gliales subyacentes, con sus correspondientes membranas basales. De este 7 modo, esta “migración” supondría los dos pasos fundamentales de la neuroinflamación (Owens, 2008). Función amortiguadora del LCR Una función fundamental del LCR consiste en amortiguar el encéfalo dentro de su bóveda sólida. El encéfalo y el LCR poseen aproximadamente la misma densidad específica (tan sólo difieren en un 4% más o menos), de modo que el encéfalo se limita a flotar en el seno del líquido. Por tanto, un golpe en la cabeza, si no es demasiado fuerte, desplaza todo el encéfalo a la vez que el cráneo, lo que evita que cualquier porción suya sufra una torsión transitoria por su acción. Participación del LCR en el mantenimiento de la presión intracraneal (PIC) La presión normal del sistema del LCR en una persona tumbada en posición horizontal mide como promedio 130 mm de agua (10 mmHg), aunque puede bajar hasta 65 mm de agua o subir hasta 195 mm de agua incluso en una persona normal sana. Regulación de la presión del LCR por las vellosidades aracnoideas. La velocidad normal de formación del LCR permanece muy constante, por lo que sus cambios rara vez constituyen un factor que influya en el control de la presión. En cambio, las vellosidades aracnoideas funcionan como válvulas que permiten la salida sin problemas del LCR y de su contenido hacia la sangre de los senos venosos mientras que impiden el retroceso de la sangre en un sentido opuesto. Normalmente, esta acción valvular de las vellosidades deja que el LCR comience a fluir hacia la sangre cuando su 8 presión supera en unos 1,5 mmHg a la de la sangre en los senos venosos. Después, si la presión del LCR todavía sube más, las válvulas se abren con mayor amplitud. En condiciones normales, esta variable casi nunca asciende más que unos pocos milímetros de mercurio por encima de la presión en el interior de los senos venosos cerebrales. Por el contrario, en los estados patológicos, a veces las vellosidades quedan bloqueadas por grandes partículas sólidas, por una fibrosis o por un exceso de células sanguíneas que se hayan filtrado hacia el LCR en los casos de una enfermedad cerebral. Tal bloqueo puede elevar la presión del LCR. Medición de la presión del LCR. El procedimiento habitual para medir la presión del LCR es sencillo. En primer lugar, la persona se tumba en posición totalmente horizontal sobre su costado para que la presión del líquido en el conducto raquídeo sea idéntica a la que hay en la bóveda craneal. A continuación, se introduce una aguja de punción en la zona lumbar del conducto raquídeo por debajo del extremo inferior de la médula, y se conecta a un tubo vertical de vidrio cuyo extremo superior está abierto al aire. Se deja que el líquido del conducto vertebral suba por el tubo todo lo que pueda. Si asciende hasta una altura de 136 mm por encima del nivel de la aguja, se dice que su valor es de 136 mm de presión de agua o, dividiendo esta cifra por 13,6, que es la densidad específica del mercurio, de unos 10 mmHg de presión. Hidrocefalia “Hidrocefalia” significa exceso de agua en la bóveda craneal. Este proceso suele dividirse en dos tipos: la hidrocefalia comunicante y la hidrocefalia no comunicante. En la primera, el líquido circula sin problemas desde el sistema ventricular hacia el espacio 9 subaracnoideo, mientras que en la segunda está bloqueada su salida fuera de uno de los ventrículos como mínimo. Normalmente el tipo no comunicante de hidrocefalia está ocasionado por un bloqueo en el acueducto de Silvio, a raíz de la atresia (o cierre) que se produce en muchos bebés antes del nacimiento, o del bloqueo por un tumor cerebral a cualquier edad. Como el líquido se forma en los plexos coroideos de los dos ventrículos laterales y del tercero, el volumen de estas tres cavidades crece mucho. Esto comprime el cerebro contra el cráneo convirtiéndolo en un delgado caparazón. En los RN, la elevación de la presión también hace que se hinche toda la cabeza debido a que los huesos del cráneo aún no se han fusionado. El tipo de hidrocefalia comunicante suele estar causado por el bloqueo que sufre el flujo de líquido en los espacios subaracnoideos en torno a las regiones basales del encéfalo o por el bloqueo de las vellosidades aracnoideas donde normalmente se produce su absorción hacia los senos venosos. Por tanto, se acumula tanto en el exterior del encéfalo como, en menor medida, dentro de los ventrículos. Esto también hará que la cabeza se hinche tremendamente si sucede en el período de lactancia, cuando el cráneo todavía es maleable y puede extenderse, aunque es capaz de dañar el encéfalo a cualquier edad. Un método para tratar los numerosos tipos de hidrocefalia consiste en la colocación quirúrgica de una derivación mediante un tubo de silicona que vaya desde uno de los ventrículos cerebrales hasta la cavidad peritoneal, donde el exceso de líquido puede absorberse hacia la sangre. 1.2 Barreras hematocefalorraquídea y hematoencefálica Ya se ha señalado que la concentración de varios componentes importantes del LCR no coincide con las del líquido extracelular en cualquier otro punto del cuerpo. Además, muchas sustancias moleculares grandes apenas consiguen pasar desde la sangre hacia el LCR o hacia los líquidos intersticiales del encéfalo, aunque estas 10 mismas sustancias salen con facilidad hacia los líquidos intersticiales habituales del organismo. Por tanto, se dice que existen barreras, llamadas barrera hematocefalorraquídea (BHC) y barrera hematoencefálica (BHE), que separan la sangre del LCR y del líquido encefálico, respectivamente (Guyton & Hall, 2011). Mientras que se considera que la BHE se localiza a nivel de las células endoteliales de la microvasculatura del SNC, la BHC queda localizada en las células epiteliales de los plexos coroideos. La función tanto secretora de LCR como de barrera de las células epiteliales de los plexos coroideos se lleva a cabo mediante la expresión de numerosos sistemas de transporte que permiten el transporte directo de iones y nutrientes al LCR y la retirada de agentes tóxicos fuera de éste. En caso de patología del SNC, ambas barreras se alteran, conduciendo a la formación de edema y al reclutamiento de células inflamatorias hacia el SNC (Engelhadrt, 2009). Hay barreras en los plexos coroideos y en las membranas de los capilares tisulares prácticamente en cualquier región del parénquima cerebral excepto en algunas zonas del hipotálamo, la glándula pineal y el área postrema, donde las sustancias difunden sin tantos problemas hacia los espacios tisulares. La facilidad de difusión es notable en estas regiones porque poseen receptores sensitivos que responden a cambios específicos ocurridos en los líquidos corporales, como las variaciones de la osmolaridad y de la concentración de glucosa, así como otros receptores para hormonas peptídicas encargadas de regular la sed, como la angiotensina II. La BHE también contiene moléculas transportadoras específicas que facilitan el transporte de hormonas, como la leptina, desde la sangre hacia el hipotálamo, donde se unen a unos receptores específicos que controlan funciones como el apetito y la actividad del sistema nervioso simpático. En general, las barreras BHC y BHE son muy permeables al agua, dióxido de carbono, oxígeno y la mayoría de sustancias liposolubles, como el alcohol y los 11 anestésicos; parcialmente permeables a electrólitos, como el sodio, el cloruro y el potasio, y casi totalmente impermeables a las proteínas plasmáticas y a la mayor parte de las moléculas orgánicas grandes no liposolubles. Por tanto, las barreras BHC y BHE muchas veces hacen que sea imposible lograr unas concentraciones eficaces de los medicamentos terapéuticos en el LCR o en el parénquima cerebral, como los anticuerpos proteicos y los fármacos no liposolubles. La causa de la baja permeabilidad que presentan las barreras BHC y BHE radica en el modo como están unidas entre sí las células endoteliales de los capilares en el tejido cerebral, mediante las denominadas “uniones intercelulares herméticas o estrechas”. Esto es, las membranas de las células endoteliales adyacentes están íntimamente fusionadas en vez de poseer grandes poros de hendidura entre ellas, como ocurre con la mayor parte del resto de capilares del organismo (Guyton & Hall, 2011). Se considera que la BHE del neonato es inmadura, presentando un aumento de la permeabilidad de los capilares endoteliales a ciertas macromoléculas (Rapoport, 1976; Seller, 1975 y 1975; Adinolfi, 1976). Estructura de la barrera hematoencefálica La estructura básica de la BHE ha sido descrita hace más de 100 años. Desde entonces se han hecho muchos progresos en el intento de dilucidar los programas que gobiernan la biogénesis de las uniones estrechas y muchos de los principales componentes moleculares del complejo que conforma la unión estrecha endotelial, el cual constituye la principal barrera física paracelular que se ha identificado en la BHE (Bauer, 2014). Como consecuencia de estas peculiares uniones intercelulares la BHE restringe el paso de sustancias hidrofílicas a una ruta transcelular en lugar de tomar una ruta paracelular, como ocurre en otros territorios capilares. Además, las uniones intercelulares estrechas determinan la polaridad funcional de las células endoteliales, 12 resultando la división en un dominio apical y otro basal con diferente expresión de canales iónicos y transportadores a la cara luminal (frente al torrente sanguíneo) y abluminal (frente al líquido intersticial cerebral) de la membrana. La unidad funcional de la unión intercelular estrecha consiste en un complejo proteico que incluye 2 grupos de proteínas: proteínas transmembrana como las “ocludinas”, “claudinas” y las “moléculas asociadas a la unión”, que abarcan el espacio intercelular y conectan células endoteliales adyacentes; y otro grupo de proteínas reguladoras y de soporte citoplásmico, como las proteínas “zónula ocludens”, que conectan las proteínas transmembrana con el citoesqueleto, e inician ciertos mecanismos de señales vía interacción proteína-proteína (Figura 4). La función principal de las ocludinas dentro de la unión estrecha es reguladora (Huber, 2001; Hawkins y Davis, 2005). Las claudinas forman parte del “sello” o fijación primaria de la unión estrecha. Las “moléculas asociadas a la unión” probablemente median el ensamblaje precoz de membranas celulares adyacentes. Figura 4: Estructura de la unidad neurovascular (izquierda) y de la unión intercelular estrecha (derecha) (Benarroch, 2012) 13 Funciones de la barrera hematoencefálica La BHE restringe el paso de iones y fluidos entre la sangre y el cerebro, aporta nutrientes esenciales para el parénquima cerebral y participa en la eliminación de productos potencialmente tóxicos y de desecho. Las células endoteliales cerebrales que forma la BHE expresan proteínas de transporte, la mayoría de las cuales poseen una distribución polarizada con expresión en la cara luminal o abluminal. Así mismo existen receptores que median el paso transendotelial de péptidos y proteínas, y enzimas que metabolizan neurotransmisores o sus precursores (Figura 5). Transporte iónico: La BHE posee una alta densidad de mitocondrias debido a las altas demandas energéticas el transporte activo ATP-dependiente de iones sodio, potasio, cloro, hidrógeno, bicarbonato y calcio. Mediado por transportador: Miembros de la superfamilia de “transportadores solubles” llevan a cabo el transporte específico de nutrientes como glucosa, aminoácidos, ácidos monocarboxílicos, nucleósidos, purinas, aminas y vitaminas a través de las células endoteliales. Un ejemplo importante es el transportador de glucosa GLUT1, que se expresa a una mayor concentración en la cara abluminal que en la luminal y media el transporte facilitado de glucosa a través de la BHE. La expresión de GLUT1 está controlada por el “factor-1 hipoxia-inducible” (HIF-1) y aumenta en el caso de hipoxia y disponibilidad reducida de sustrato en plasma (Zlokovic, 2008). Transportadores ATP-binding cassette (ABC) y transporte por flujo: Los transportadores tipo ABC median el flujo activo de moléculas liposolubles hacia el exterior del endotelio capilar cerebral y sistema nervioso central (Dauchy, 2008). Estos transportadores tienen una función protectora del SNC retirando moléculas endógenas o xenobióticas potencialmente neurotóxicas, o bien reduciendo la penetración de determinadas drogas dentro del SNC. Un importante ejemplo es la P- 14 glicoproteína o MDR1 (multidrug resistant protein 1, que se expresa en la cara luminal y en menor medida en la abluminal. Ciertos antiepilépticos son transportados de este modo (Aronica, 2012; Zhang, 2012). Transporte de péptidos y proteínas: Las células endoteliales de la BHE expresan ciertos sistemas de transporte para péptidos neuroactivos, como arginina-vasopresina, encefalinas, citoquinas y quimioquinas. Las proteínas grandes, como la transferrina, lipoproteínas de baja densidad , leptina, inmunoglobulina G, insulina y factor de crecimiento insulin-like son transportadas mediante transcitosis mediada por receptor para atravesar la BHE (Figura 5) (Zlokovic, 2008). Este proceso requiere la unión de estas proteínas a su receptor específico en la membrana celular, seguido de endocitosis del complejo ligando-receptor, paso al citoplasma y exocitosis al polo opuesto de la célula. Otro mecanismo de transporte de macromoléculas es vía caveolas, las cuales son vesículas que se forman a partir de balsas lipídicas de la membrana plasmática que controla la permeabilidad transcelular de la BHE. Transporte enzimático: las células endoteliales de la BHE expresan enzimas cuyo objetivo son moléculas endógenas y exógenas, incluídos neurotransmisores como catecolaminas y encefalinas y otros mediadores químicos como los leucotrienos. Ejemplos que utilizan este tipo de transporte son la monoaminooxidasa, gammaglutamil transpeptidasa, enzima convertidora de angiotensina y ecto o endopeptidasas (Black, 1994; Brownson, 1994). Migración transendotelial de leucocitos circulantes: La información bidireccional entre la célula inmune y el endotelio constituye un elemento esencial para el normal funcionamiento del sistema inmunitario, así como en el caso de un proceso inflamatorio. Los monocitos circulantes son capaces de penetrar la BHE intacta mediante un proceso de diapédesis a través del citoplasma de las células endoteliales; estos monocitos poseen funciones complementarias a las de la microglia de la zona, o incluso se puede transformar fenotípicamente en microglia. El patrón y 21 - xantocrómico: Significa que es amarillento, color que adquiere cuando ha pasado algún tiempo desde la incorporación de sangre y, por tanto, la hemoglobina se ha transformado, o bien cuando es muy rico en proteínas, que es lo que ocurre en el síndrome de compresión medular con bloqueo del espacio subaracnoideo. c) Composición: al respecto interesa conocer datos citológicos, bioquímicos, y bacteriológicos y serológicos. Más adelante conoceremos las peculiaridades de estos valores en el neonato, al seguir siendo algo controvertidos. Datos citológicos: El LCR normal en el adulto contiene sólo 1-3 células / mm3. El aumento o pleocitosis es propio de las meningitis y meningoencefalitis. Es a base de leucocitos polimorfonucleares en las meningitis bacterianas en general y de linfocitos en la tuberculosa y en las víricas. Estas células proceden de la sangre y pasan al LCR porque debido a la inflamación aumenta la permeabilidad capilar de la BHC. También pueden observarse células tumorales desprendidas de las meninges cuando están infiltradas. Datos bioquímicos: los parámetros solicitados habitualmente son proteínas y glucosa. La hiperproteinorraquia (> 0,4 g/l) se observa en meningitis, en algunos tumores y en el síndrome de compresión medular. En general, las proteínas proceden de la sangre y aumentan, al igual que las células, por el aumento de la permeabilidad de la BHC. En el caso del síndrome de compresión medular las proteínas aumentan por concentración en el líquido que queda aislado por debajo del bloqueo. Así, la regla general es que aumenten paralelamente las proteínas y las células. Cuando aumentan las proteínas y no las células se habla de disociación albúmino-citológica, que es característica de las polineuropatías, en las que la lesión se extiende a las raíces (incluídas en el espacio subaracnoideo), y del síndrome de compresión medular. Con respecto a la glucosa, tiene interés la hipoglucorraquia (valores de glucosa por debajo 22 del 60% de la sanguínea), que es constante en las meningitis bacterianas y tuberculosa. Otros datos bioquímicos que pueden interesar según la situación serían inmunoglobulinas, enzimas, neurotransmisores…etc. Datos bacteriológicos y serológicos: Se pueden aplicar al LCR las mismas técnicas que se utilizan en la sangre y en otros líquidos biológicos para identificar los agentes vivos causantes de la inflamación de las meninges y de los centros nerviosos (Castro del Pozo, 1996). Punción lumbar. Técnica La punción lumbar (PL) es una técnica mediante la cual se accede al espacio subaracnoideo espinal a nivel de la cisterna lumbar utilizando una aguja. En la mayoría de las ocasiones, la PL se realiza para extraer una muestra de LCR con fines diagnósticos, siendo de gran utilidad en enfermedades del SNC (meningitis, encefalitis, enfermedad de Guillain-Barré, enfermedades desmielinizantes, infiltración leucémica, hemorragia subaracnoidea, etc…) (Straus, 2006), aunque también se utiliza para la administración de medicación intratecal, fundamentalmente en el tratamiento de enfermedades oncológicas con infiltración del sistema nervioso central. Esta técnica fue descrita por primera vez en 1891 por Quincke (Quincke, 1891 y 1902) y se utiliza con gran frecuencia en pediatría. Las contraindicaciones de este procedimiento son escasas: hipertensión intracraneal, infección local del punto de punción, trombopenia e inestabilidad hemodinámica. La PL es un procedimiento invasivo no exento de complicaciones, algunas de ellas en relación con una mala técnica. Las más frecuentes son el dolor de espalda en el lugar de la punción y la cefalea pospunción. Son más raros el dolor neurálgico de un miembro inferior durante el procedimiento, la hemorragia epidural, subdural o subaracnoidea, la herniación cerebral (cuando se realiza una PL en 23 un paciente con hipertensión intracraneal), los tumores raquídeos epidermoides (debidos al uso de agujas sin fiador), los abscesos retroperitoneales (por goteo de LCR infectado) o la hipoxia en recién nacidos (por obstrucción de la vía aérea al mantener la posición de flexión cervical) (Reynolds, 2008; Per, 2009, Lee, 2007; Chordas, 2001). La técnica llevada a cabo con precisión y experiencia a la hora de realizar una PL es fundamental. Storch de Gracia y colaboradores han recogido en la siguiente tabla las últimas evidencias sobre la manera más óptima de realizar una punción lumbar, paso a paso (Tabla 1). Análisis citoquímico del LCR en el neonato El análisis del LCR obtenido en la mayoría de las ocasiones por punción lumbar constituye una gran ayuda para los clínicos a la hora de identificar con carácter de urgencia pacientes con meningitis/encefalitis. Por lo tanto, requiere del conocimiento de valores de referencia precisos, especialmente del recuento de glóbulos blancos o leucocitos. Determinar los valores aceptados como normales de leucocitos en neonatos supone un reto desde tiempo atrás, debido a que no es ético realizar una punción lumbar a un neonato sano y asintomático, tratándose de una técnica dolorosa y con potenciales complicaciones, y más aún cuando por si mismos no pueden otorgar un consentimiento informado. 24 Tabla 1: Técnica de la PL en pediatría (Storch De Gracia , 2012). Preparacióncontrol de la ansiedad Sedación no farmacológica:- Ambiente tranquilo.- Padre o madre presente.- Si el niño tiene edad para comprender, se le debe explicar el objetivo y el desarrollo de la prueba.Sedación farmacológica:- Pacientes colaboradores (mayores de 4-6 años): óxido nitroso al 50% con oxígeno inhalado- Pacientes no colaboradores: midazolam (oral, intranasal o intravenoso) o ketamina (intramuscular o intravenosa) (Doyle, 2008; Shavit, 2006). Control del dolor (anestesia local) - Crema de lidocaína al 2,5% asociada a prilocaína al 2,5%.- Cloruro de etilo Posición En decúbito lateral o sedestación Asepsia Se aplica un antiséptico en la parte inferior de la espalda, con un movimiento circular desde el centro hacia la periferia, incluyendo ambos flancos, el inicio de los glúteos y ambas crestas iliacas. Se debe establecer un campo estéril Tipo de aguja Agujas de tipo Quincke (traumáticas):- El orificio es distal con un bisel afilado- Son las más utilizadas en nuestro medio Agujas de tipo Whitacre y tipo Sprotte (atraumáticas):- El orificio está en un lateral de la aguja- La punta es roma, sin filo- Asocian menor incidencia de CPP (Strupp, 2008). Tamaño de la aguja Se ha de utilizar la aguja de menor tamaño que permita extraer la muestra de LCR de forma adecuada (22 G, generalmente) Punto de entrada Se ha de buscar el punto de entrada palpando el espacio interespinoso que queda por debajo de la línea que une las dos crestas ilíacas, que se correspondería con el cuerpo vertebral L4 o el espacio intervertebral L4-L5. Se debe puncionar en el primer o segundo espacio intervertebral inmediatamente inferior a esta línea, que correspondería con los espacios L4-L5 o L5-S1, ambos inferiores a la terminación de la médula espinal en el niño (en el nivel L3 aproximadamente) (Boon, 2004). Introducción de la aguja Orientación del bisel de la aguja con las agujas tipo Quincke: paralelo a las fibras longitudinales de la duramadre, para evitar el desarrollo de cefalea postraumática (Richman, 2006; Ansaloni, 2000; Dooner, 1989; Fink, 1989):- Paciente sentado: bisel hacia un lado - Paciente en decúbito lateral: bisel hacia arriba o hacia abajo. Se ha de insertar la aguja con una inclinación aproximada de 15° en dirección al ombligo. Ruidos o sensaciones percibidas con el avance de la aguja: se corresponden con la perforación de distintas estructuras. La más constante aparece al atravesar el ligamento amarillo (que une las láminas vertebrales). Coincide con una disminución de la resistencia al avance de la aguja. En ese momento se retira el fiador para comprobar si hay flujo de LCR a su través Recogida de muestras La muestra debe ser recogida directamente en un tubo estéril. Nunca se debe aspirar Retirada de la aguja Al terminar, se debe reinsertar el fiador siempre antes de retirar la aguja 25 Así, clásicamente en todos los estudios se evalúan los valores considerados normales en RN con factores de riesgo y/o cierta sintomatología con indicación clara de realización de punción lumbar, en los que finalmente se descarta infección meníngea o encefálica. En esto se basa la amplia variedad de referencias bibliográficas disponibles para ayudar al clínico a interpretar los valores de leucocitos en LCR, entre ellos libros de texto y manuales de pediatría general (Behrman, 2004; McMillan, 2006; Robertson, 2005), de enfermedades infecciosas (Feigin, 2004; Remington, 2006), medicina hospitalaria (Frank, 2005; Perkin, 2008; Zaoutis, 2007), medicina de urgencias (Barem, 2008; Fleisher, 2006), neonatología (Taeusch, 1998), y neurología (Menkes, 2000; Swaiman, 1999). Estos parámetros suelen estar basados en otros textos de referencia o en estudios con importantes limitaciones (Tabla 2). En los siete estudios que se muestran (de 1925 a 1968) parece haber acuerdo general en que la media del recuento de leucocitos en LCR de RN es de 6-7 células/mm3. Tabla 2: Primeros estudios de recuento de leucocitos en LCR de RN (Sarff, 1976). 26 Así, ciertos estudios disponibles incluyen punciones traumáticas (Stewart, 1928; Widell, 1958; Naidoo, 1968; Portnoy, 1985; Sarff, 1976; Roberts, 1925; Wolf, 1961), convulsiones (Naidoo, 1968), sepsis (Nascimento-Carvalho, 1998) e infecciones congénitas (Roberts, 1925; Fielkow, 1991). Los valores que continúan teniendo vigencia como más aceptados internacionalmente como “normales” son los publicados por Sarff et al (The Journal of Pediatrics, 1976). Estudiaron los hallazgos del LCR de 117 RN de alto riesgo sin evidencia de enfermedad bacteriana o vírica del SNC, comparando estos valores con los obtenidos en la valoración inicial del LCR de RN con meningitis bacteriana. El grupo de alto riesgo se constituyó por circunstancias tales como rotura prolongada de membranas, prematuridad, corioamnionitis, ictericia inexplicada, desprendimiento de placenta, fiebre materna o toxemia. De los 132 sujetos iniciales se excluyeron 15 por punción francamente hemorrágica (4), serología positiva a sífilis (7) y demostración microbiológica de meningitis bacteriana o vírica (4). Los 117 RN incluídos en el estudio demostraron cultivo de sangre, orina y LCR estéril, además de no presentar sintomatología alguna compatible con infección vírica o bacteriana. De los 117 RN incluídos, 87 eran RNT, 28 RNPT con PAEG, y 2 RNPT con BPEG. 111 de los 117 RN eran menores de 7 días de edad. Se comparó este grupo de alto riesgo con un grupo de 135 RN con infección bacteriana: 98 con meningitis por gram negativo, 21 con meningitis por streptococo grupo B, y 16 con sepsis sin meningitis. Los resultados se muestran en la siguiente tabla (Tabla 3) (Sarff , 1976). 27 Tabla 3: Parámetros obtenidos en LCR para RN de alto riesgo sin meningitis (Sarff, 1976). Se aprecia que la media de leucocitos en LCR para los 117 RN de alto riesgo fue de 8,4 células / mm3, lo cual es concordante con lo obtenido previamente para RN sanos (Roberts, 1925; Waitz, 1928; Samson, 1931; Otila, 1948; Wyers, 1954; Widell, 1958; Naidoo, 1968). 2DS sobre la media resultaron ser 23 células / mm3, y 3DS 31 células / mm3, que incluye el 99% de valores. Se observó un número decreciente en la celularidad en los RNT durante la primera semana de vida, y decreciente en los RNPT durante el mismo período, al igual que en el estudio previo de Otila E. (Otila, 1948). Con respecto a los valores de proteínas, hay acuerdo general en todos estos estudios en que estos valores son mayores en RN que en lactantes mayores y niños. El contenido de glucosa en LCR en relación a la glucosa sanguínea es proporcionalmente mayor en RN que en edades posteriores. Se detectaron en este estudio de Sarff valores de glucosa en LCR de entre el 75 y 80% de la glucosa sanguínea (al igual que lo detectado en estudios 28 previos), lo cual nuevamente es considerablemente más elevado que los valores del 40 al 60% para niños y adultos. Las razones por las cuales los niveles de células, glucosa y proteínas son más elevadas en RN (tanto sanos como de alto riesgo) que en lactantes mayores, niños y adultos permanecen aún desconocidas. Originariamente se postuló que podría ser debido a pequeñas hemorragias cerebrales o infecciones virales o protozoarias ocultas (Roberts, 1925), aunque esto parece descartado. Como ya se ha comentado en el apartado previo, existen indicios de que pueda ser debido a un aumento de la permeabilidad de la BHE a estas edades tempranas. Además, esta tendencia parece agudizarse conforme disminuye la edad gestacional. De todos modos, se precisan más estudios para considerar cierta esta teoría. En el estudio de Sarff, al comparar con el grupo de primera evaluación de RN con meningitis bacteriana, quedó manifiesto que los valores de LCR estaban claramente alterados, muy por encima de los límites superiores establecidos como normales (Figura 6). Tan sólo un RN con meningitis de los 119 evaluados presentó en la primera evaluación un LCR completamente normal (encontrándose ya francamente alterado en las siguientes). 29 Figura 6: Comparación del recuento de leucocitos en LCR de RN con y sin meningitis (Sarff, 1976) Para recién nacidos de muy bajo peso (RNMBP) los límites de celularidad, glucosa y proteínas en LCR clásicamente considerados son los publicados por Rodríguez et al (Rodríguez, 1990). Estudiaron el LCR de 43 RNMBP (<1500 g) obtenidos en las primeras 12 semanas de vida. Como criterios de inclusión, habían de ser RN de peso adecuado para la edad gestacional, con cultivo de LCR negativo para bacterias y sin evidencia de sangrado intracraneal mediante ecografía. Obtuvieron los resultados que se muestran, según peso, edad cronológica y edad postconcepcional (Tablas 4, 5, 6 y 7). Tabla 4: Valores de leucocitos en LCR de RNMBP según el peso al nacimiento (Rodríguez, 1990) 30 Tabla 5: Valores de leucocitos en LCR de RNMBP <1.000g según la edad cronológica (Rodríguez, 1990) Tabla 6: Valores de leucocitos en LCR de RNMBP 1.001-1.500 g según la edad cronológica (Rodríguez, 1990). Tabla 7: Valores de leucocitos en LCR de RNMBP según la edad postconcepcional. (Rodríguez, 1990) La media de leucocitos en LCR observada, en este caso para RNMBP, fue de 5 células / mm3, con un máximo en el rango de 44 células / mm3, lo cual es comparable a lo obtenido en estudios previos para RNPT sanos y RNT (Sarff, 1975; Naidoo, 1968). En este caso, el recuento de leucocitos no sufrió variación significativa durante las primeras 12 semanas de vida, pero sí se observó un aumento significativo en las concentraciones de proteínas y glucosa en LCR para RN de menos de 28 semanas de edad postconcepcional (Rodríguez, 1990). Concluyen que estas observaciones son concordantes con la teoría de aumento de la permeabilidad de la BHE a ciertas macromoléculas en RNMBP (Seller, 1975; Adinolfi, 1976). 37 Figura 10: Fotografía al microscopio óptico de una gran motoneurona (x100, H.E.) (Imagen modificada de Mescher, 2010). Una típica motoneurona anterior situada en el asta anterior de la médula espinal está compuesta por tres partes fundamentales: el soma, que es el cuerpo principal de la neurona; el único axón, que se extiende desde el soma hacia un nervio periférico para abandonar la médula espinal, y las dendritas, que constituyen una gran cantidad de prolongaciones ramificadas del soma con unas dimensiones hasta de 1 mm de recorrido hacia las zonas adyacentes en la médula. Sobre la superficie de las dendritas y del soma de la motoneurona se hallan entre 10.000 y 200.000 diminutos botones sinápticos llamados terminales presinápticos, estando aproximadamente del 80 al 95% en las dendritas y sólo del 5 al 20% en el soma. Estos terminales presinápticos ocupan el extremo final de las fibrillas nerviosas originadas en muchas otras neuronas. En gran parte son excitadores: es decir, segregan una sustancia transmisora que estimula a la neurona postsináptica; sin embargo, otras son inhibidoras, y segregan una sustancia transmisora que inhibe a la neurona postsináptica, aunque como veremos más adelante 38 el proceso puede ser mucho más complejo. Las neuronas pertenecientes a otras porciones de la médula y el encéfalo se distinguen de la motoneurona anterior en los siguientes aspectos: 1) las dimensiones del soma celular; 2) la longitud, el tamaño y el número de dendritas, que oscila desde casi 0 a muchos centímetros; 3) la longitud y el tamaño del axón, y 4) el número de terminales presinápticos, que puede oscilar desde tan sólo unos pocos hasta llegar a 200.000. Estas variaciones hacen que las neuronas situadas en las diversas partes del sistema nervioso reaccionen de forma dispar a las señales sinápticas llegadas y, por tanto, ejecuten muchas funciones diferentes. Sinapsis La información recorre el SNC sobre todo bajo la forma de potenciales de acción nerviosos, llamados simplemente «impulsos nerviosos», a través de una sucesión de neuronas, una después de la otra. Sin embargo, además, cada impulso puede: 1) quedar bloqueado en su transmisión de una neurona a la siguiente; 2) convertirse en una cadena repetitiva a partir de un solo impulso, o 3) integrarse con los procedentes de otras células para originar patrones muy intrincados en las neuronas sucesivas. Todas estas actividades pueden clasificarse como funciones sinápticas de las neuronas. Hay dos tipos principales de sinapsis: 1) la sinapsis química y 2) la sinapsis eléctrica. Las sinapsis eléctricas se caracterizan por la presencia de unos canales fluidos abiertos que conducen electricidad directamente desde una célula a la siguiente. La mayoría de ellos consta de pequeñas estructuras proteicas tubulares llamadas uniones en hendidura que permiten el movimiento libre de los iones desde el interior de una célula hasta el interior de la siguiente. Los potenciales de acción se transmiten a través de ellas y de otras uniones semejantes desde una fibra muscular lisa hasta la siguiente en el músculo liso visceral y desde un miocito cardíaco al siguiente en el músculo cardíaco. 39 Sin embargo, casi todas las sinapsis utilizadas para la transmisión de señales en el SNC del ser humano son sinapsis químicas. En ellas, la primera neurona segrega un producto químico denominado neurotransmisor a nivel de la terminación nerviosa, que a su vez actúa sobre las proteínas receptoras presentes en la membrana de la neurona siguiente para excitarla, inhibirla o modificar su sensibilidad de algún otro modo (Figura 11). Figura 11: Anatomía fisiológica de la sinapsis (Guyton, 2011) Las sinapsis químicas poseen una característica sumamente importante que las convierte en un elemento muy conveniente para transmitir la mayor parte de las señales en el sistema nervioso. Siempre conducen las señales en un solo sentido: es decir, desde la neurona que segrega la sustancia transmisora, denominada neurona presináptica, hasta la neurona sobre la que actúa el transmisor, llamada neurona postsináptica. Este es el principio de la conducción unidireccional de las sinapsis químicas y se aleja bastante de la conducción a través de las sinapsis eléctricas, que muchas veces transmiten señales en ambos sentidos. Este mecanismo de conducción unidireccional es de extraordinaria importancia. Da la oportunidad de enviar señales dirigidas hacia objetivos específicos. En efecto, es esta transmisión específica hacia regiones separadas y muy focalizadas, tanto en el sistema nervioso como en los terminales de los nervios periféricos, lo que le 40 permite llevar a cabo sus incontables funciones de sensibilidad, control motor, memoria y otras muchas. Los estudios efectuados sobre los terminales presinápticos con el microscopio electrónico muestran que poseen variadas formas anatómicas, pero en su mayoría se parecen a pequeños botones redondos u ovalados y, por tanto, a veces se les llama botones terminales, botones, pies terminales o botones sinápticos. El terminal está separado del soma neuronal postsináptico por una hendidura sináptica cuya anchura suele medir de 200 a 300 angstroms. En él existen dos estructuras internas de importancia para la función excitadora o inhibidora de la sinapsis: las vesículas transmisoras y las mitocondrias. Las vesículas transmisoras contienen la sustancia transmisora que, cuando se libera a la hendidura sináptica, excita o inhibe la neurona postsináptica (excita si la membrana neuronal posee receptores excitadores e inhibe si tiene receptores inhibidores). Las mitocondrias aportan trifosfato de adenosina (ATP), que a su vez suministra energía para sintetizar más sustancia transmisora. Cuando se propaga un potencial de acción por un terminal presináptico, la despolarización de su membrana hace que una pequeña cantidad de vesículas viertan su contenido hacia la hendidura. Por su parte, el transmisor liberado provoca un cambio inmediato en las características de permeabilidad de la membrana neuronal postsináptica y esto origina la excitación o la inhibición de la célula, en función de las propiedades del receptor neuronal. La membrana del terminal presináptico se llama membrana presináptica. Contiene una gran abundancia de canales de calcio dependientes de voltaje. Cuando un potencial de acción la despolariza, estos canales se abren y permiten la entrada en el terminal de un número importante de iones calcio. La cantidad de sustancia transmisora que sale a continuación hacia la hendidura sináptica desde el terminal es directamente 41 proporcional al total de iones calcio que penetran. No se conoce el mecanismo exacto por el que estos iones propician su liberación, pero se piensa que es el siguiente: Cuando los iones calcio llegan al terminal presináptico, parecen unirse a unas moléculas proteicas especiales situadas sobre la cara interna de la membrana presináptica, llamadas puntos de liberación. A su vez, este enlace suscita la apertura de los puntos de liberación a través de la membrana, y así permite que unas pocas vesículas transmisoras suelten su contenido hacia la hendidura después de cada potencial de acción. En el caso de las vesículas que almacenan el neurotransmisor acetilcolina, existen entre 2.000 y 10.000 moléculas de esta sustancia en cada una y en el terminal presináptico hay suficientes vesículas como para transmitir desde unos cuantos cientos hasta más de 10.000 potenciales de acción. La membrana de la neurona postsináptica contiene una gran cantidad de proteínas receptoras. Las moléculas de estos receptores poseen dos elementos importantes: un componente de unión que sobresale fuera desde la membrana hacia la hendidura sináptica y donde se fija el neurotransmisor procedente del terminal presináptico, y un componente ionóforo que atraviesa toda la membrana postsináptica hasta el interior de la neurona postsináptica. Por su parte, este elemento se desdobla en dos clases: un canal iónico que permite el paso de determinados tipos de iones a través de la membrana o un activador de “segundos mensajeros” que en vez de un canal iónico es una molécula que protruye hacia el citoplasma celular y activa una sustancia o más en el seno de la neurona postsináptica. A su vez, estas sustancias actúan como segundos mensajeros para aumentar o disminuir determinadas funciones específicas de la célula. Los canales iónicos de la membrana neuronal postsináptica suelen ser de dos tipos: 1) canales catiónicos, cuya clase más frecuente deja pasar iones sodio cuando se abren, pero a veces también cumplen esta función con el potasio o el calcio, y 2) canales 42 aniónicos, que permiten sobre todo el paso de los iones cloruro, pero también de minúsculas cantidades de otros aniones. Los canales catiónicos que transportan iones sodio están revestidos de cargas negativas. Esta situación atrae hacia ellos a los iones sodio dotados de carga positiva cuando el diámetro del canal aumenta hasta superar el tamaño del ion sodio hidratado. Pero esas mismas cargas negativas repelen los iones cloruro y otros aniones e impiden su paso. Con respecto a los canales aniónicos, cuando sus diámetros alcanzan las dimensiones suficientes, entran los iones cloruro y los atraviesan hasta el lado opuesto, mientras que los cationes de sodio, potasio y calcio quedan retenidos, básicamente porque sus iones hidratados son demasiado grandes para poder pasar. Más adelante estudiaremos que cuando se abren los canales catiónicos y dejan entrar iones sodio positivos, dicha carga eléctrica excitará a su vez a esta neurona. Por tanto, una sustancia transmisora capaz de abrir los canales catiónicos se denomina transmisor excitador. A la inversa, la apertura de los canales aniónicos permite la entrada de cargas eléctricas negativas, que inhiben a la neurona. Así pues, las sustancias transmisoras que abren estos canales se llaman transmisores inhibidores. Cuando una sustancia transmisora activa un canal iónico su apertura suele producirse en una fracción de milisegundo; si, en cambio, deja de estar presente, el canal se cierra con idéntica velocidad. La apertura y el cierre de los canales iónicos aportan un medio para el control muy rápido de las neuronas postsinápticas. Muchas funciones del SNC, como, por ejemplo, los procesos de memoria, requieren la producción de unos cambios prolongados en las neuronas durante segundos y hasta meses después de la desaparición de la sustancia transmisora inicial. Los canales iónicos no son idóneos para originar una variación prolongada en las neuronas postsinápticas, porque se cierran en cuestión de milisegundos una vez desaparece la sustancia transmisora. Sin embargo, en muchos casos, se consigue una excitación o una 43 inhibición neuronal postsináptica a largo plazo al activar un sistema químico de segundo mensajero en el interior de esta misma célula, y a continuación será este elemento el que genere el efecto duradero. Existen diversos tipos de sistemas de segundo mensajero. Uno de los más frecuentes recurre a un grupo de proteínas llamadas proteínas G (Figura 12). Una proteína G está unida a la porción del receptor que sobresale hacia el interior de la célula. A su vez, la proteína G consta de tres elementos: un componente alfa (a), que es la porción activadora de la proteína G, y unos componentes beta (b) y gamma (g) que están pegados al componente a y también al interior de la membrana celular adyacente a la proteína receptora. Al activarse por un impulso nervioso, la porción a de la proteína G se separa de las porciones b y g y así queda libre para desplazarse por el citoplasma de la célula. Figura 12: Sistema de segundo mensajero a través de proteína G. Una sustancia transmisora procedente de una neurona previa puede activar una segunda neurona primero por la liberación de una proteína G en el citoplasma de esta última. Se ofrecen los cuatro posibles efectos posteriores de la proteína G. 1, apertura de un canal iónico en la membrana de la segunda neurona; 2, activación de un sistema enzimático en la membrana de la neurona; 3, activación de un sistema enzimático intracelular; 4, inicio de la transcripción génica en la segunda neurona. 44 Dentro del citoplasma, el componente a desprendido ejecuta una función o más entre múltiples posibles, según las características específicas de cada tipo de neurona. En la Figura 12 se recogen cuatro de los cambios que pueden suceder. Son los siguientes: 1. Apertura de canales iónicos específicos a través de la membrana celular postsináptica. En el extremo superior derecho de la figura se observa un canal de potasio que está abierto en respuesta a la proteína G; este canal suele permanecer así durante un tiempo prolongado, a diferencia del rápido cierre experimentado por los canales iónicos activados directamente que no recurren al sistema de segundo mensajero. 2. Activación del monofosfato de adenosina cíclico (AMPc) o del monofosfato de guanosina cíclico (GMPc) en la neurona. Recuerde que tanto el AMPc como el GMPc pueden activar una maquinaria metabólica muy específica en la neurona y, por tanto, poner en marcha cualquiera de las múltiples respuestas químicas, entre ellas los cambios prolongados en la propia estructura celular, que a su vez modifican la excitabilidad de la neurona a largo plazo. 3. Activación de una enzima intracelular o más. La proteína G puede activar directamente una enzima intracelular o más. A su vez, las enzimas pueden estimular cualquiera de las numerosas funciones químicas específicas en la célula. 4. Activación de la transcripción génica. Este es uno de los efectos más importantes ocasionados por la activación de los sistemas de segundo mensajero, debido a que la transcripción génica puede provocar la formación de nuevas proteínas en el seno de la neurona, modificando de ese modo su maquinaria metabólica o su estructura. En efecto, se sabe en general que aparecen cambios estructurales en las neuronas oportunamente activadas, sobre todo en los procesos de memoria a largo plazo. 45 Está claro que la activación de los sistemas de segundo mensajero dentro de la neurona, ya pertenezcan al tipo de la proteína G o a otras clases, resulta importantísima para variar las características de la respuesta a largo plazo en diferentes vías neuronales. Algunos receptores postsinápticos, cuando se activan, provocan la excitación de la neurona postsináptica, y otros su inhibición. La importancia de poseer tanto el tipo inhibidor de receptor como el excitador radica en que aporta una dimensión añadida a la función nerviosa, dado que permite tanto limitar su acción como excitarla. (Guyton & Hall, 2011). Neurotransmisores Hasta hoy se han descubierto más de 50 sustancias neurotransmisoras importantes. Entre las mejor conocidas figuran las siguientes: acetilcolina, noradrenalina, adrenalina, histamina, ácido g-aminobutírico (GABA), glicina, serotonina y glutamato (Guyton & Hall, 2011). Para considerar una sustancia como neurotransmisora en sentido estricto, debe cumplir cuatro requisitos (Ceballos, 1997): 1. Debe sintetizarse en la neurona. 2. Debe estar presente en el terminal nervioso y liberarse en cantidades necesarias para ejercer su acción sobre la neurona postsináptica u órgano efector. 3. Su administración exógena, en concentraciones apropiadas, debe provocar el mismo efecto que el obtenido cuando la sustancia de libera de forma endógena. 4. Debe existir un mecanismo específico para eliminar la sustancia del espacio sináptico. Existen diferentes clasificaciones de neurotransmisores. Una de las más aceptadas en la actualidad los divide en dos grandes grupos: los transmisores de acción rápida y molécula pequeña (NT clásicos) y neuropéptidos (NP) (Tabla 9). 46 Tabla 9: Clasificación de los NT según el tipo de molécula y mecanismo de acción (Modificada de Guyton & Hall, 2011). Los transmisores de acción rápida y molécula pequeña son los que producen las respuestas más inmediatas del sistema nervioso (p.e. la transmisión de las señales sensitivas hacia el encéfalo y de las señales motoras hacia los músculos). En cambio los NP suelen provocar acciones más prolongadas, como son los cambios a largo plazo en el número de receptores neuronales, la apertura o el cierre duraderos de ciertos canales iónicos e incluso las modificaciones persistentes en la cantidad de sinapsis o su tamaño. En la mayoría de los casos, los tipos de transmisores de molécula pequeña se sintetizan en el citoplasma del terminal presináptico y las numerosas vesículas 53 convertasas, responsables de recortar los propéptidos para dar lugar a sus formas bioactivas (Hokfelt, 2000). Los NP pueden estar presentes en las neuronas al menos de tres maneras diferentes (Tohyama, 1992): • A altas concentraciones en condiciones normales, lo que indica que están funcionalmente disponibles para su liberación en cualquier momento. • A concentraciones bajas o indetectables en condiciones normales: en estos casos la síntesis será estimulada sólo en ciertas condiciones, por lo que precisan de un estímulo específico para adquirir relevancia funcional. • Con alta expresión en etapas tempranas del desarrollo, generalmente prenatal, y posterior disminución de la misma en la etapa postnatal. Parece que existe una relación entre el segundo y el tercer modo de expresión, ya que muchos de los NP que aparecen durante la ontogénesis pueden ser “reactivados” posteriormente en la vida adulta por estímulos específicos. También hay que señalar que un mismo NP puede expresarse de cualquiera de estas tres formas dependiendo del tipo de neurona y del uso que cada neurona le dé a cada NP en cada situación particular. 54 Figura 13: Representación esquemática de la síntesis neuronal de NP, explicación en el texto (Hokfelt, 2003). Aunque los NP están presentes por todo el sistema nervioso (cerebro, médula espinal, tracto gastrointestinal, ganglios autonómicos y sensoriales…), en cada región siguen un patrón de distribución propio y diferente. También hay evidencias de que los NP, a pesar de su nombre, se expresan en las células gliales, aunque la función que ejercen en éstas células no neuronales continúa siendo controvertida (Hokfelt, 2000). La mayoría de los estudios se centran en la demostración en cultivos celulares, como por ejemplo la demostración de RNAm de pre-proencefalina, RNAm de preprosomatostatina y el NP encefalina en astrocitos (Klein y Fricker, 1992; Melner, 1990; Schwartz y Simantov, 1988; Shinoda, 1992, 1989; Spruce, 1990; Steine-Martin, 1991; Vilijn, 1988). El péptido natriurético auricular ha sido encontrado en astrocitos de cerebro canino in situ (McKenzie, 1992). Del mismo modo, se ha hallado galanina en células gliales in vivo de cerebro de rata (Zhang, 1992). 55 Plasticidad de los NP Otra característica de la expresión de los NP es su plasticidad, ya que su nivel de expresión puede variar considerablemente en diferentes condiciones, incluyendo variaciones endógenas diurnas y tras manipulaciones experimentales. Tras su liberación, la reposición de los NP se produce casi exclusivamente a través de nueva síntesis ribosomal, y es que tras la activación neuronal y correspondiente liberación peptídica se produce una sobreexpresión de los niveles de ARNm con esta finalidad (Schalling, 1987). Esta es la razón por la que, a diferencia de lo que ocurre con los neurotransmisores clásicos, tras la liberación de los NP se produce una considerable demora hasta que se restablecen los niveles previos en las terminaciones nerviosas, debido además al lento transporte de los NP desde el soma hasta las terminaciones nerviosas vía axonal (una excepción a esta norma podría ser el neurotransmisor CCK, para el que parece haberse descrito un mecanismo de resíntesis más rápido (Migaud, 1995)). Este mecanismo de síntesis, que puede parecer menos eficaz, se refleja en la dinámica de las sinapsis peptidérgicas, en la que aunque los péptidos se liberan de forma intermitente compensan este fenómeno al presentar una acción más duradera. Así, por ejemplo, neurotransmisores clásicos como las catecolaminas pueden ser localmente sintetizados en las terminaciones nerviosas y repuestos mediante eficientes mecanismos, siendo la tasa o frecuencia de síntesis regulada por fosforilación enzimática. De este modo, los niveles de neurotransmisores clásicos se mantienen constantes bajo diversas condiciones. Para el estudio de los mecanismos de regulación de la síntesis de los neurotransmisores peptidérgicos se han empleado técnicas de hibridación in situ (Young, 1990), analizando los niveles de RNAm del péptido en el soma neuronal bajo varias condiciones experimentales. Los más estudiados han sido los de las neuronas sensoriales primarias y las neuronas del núcleo estriado de rata, aunque 56 regulaciones similares a las de estas localizaciones se dan en otros muchos sistemas. Las neuronas sensoriales primarias contienen grandes cantidades de NP y constituyen un buen modelo para el análisis de los mecanismos de regulación peptidérgicos. Algunos de estos péptidos, como por ejemplo la SP y el péptido relacionado con el gen de la calcitonina, se encuentran presentes en muchas neuronas de los ganglios de la raíz dorsal ganglionar bajo condiciones normales. Ambos facilitan la neurotransmisión en el asta dorsal (además de presentar efectos periféricos, como la vasodilatación), y se ha observado que sus niveles descienden tras axotomía (Nielsch, 1987; Noguchi, 1990). Otros NP como el VIP (péptido intestinal vasoactivo), PHI (péptido histidinaisoleucina), galanina y NPY (neuropéptido tirosina) normalmente se expresan en niveles bajos, pero aumentan enormemente tras manipulación experimental, especialmente axotomía (Hokfelt, 1987; Shebab y Atkinson, 1986; Wakisaka, 1991). Además, los receptores peptidérgicos son también regulados en la raíz dorsal ganglionar tras axotomía, incluyendo los receptores CCKB(Zhang, 1993), NPY Y1 (Zhang, 1994) y NPY Y2 (Zhang, 1997). Tales hallazgos sugieren que cambios en la sensibilidad a los NP podría ayudar a las neuronas sensoriales primarias en su adaptación en situaciones de trauma. En conjunto, las neuronas sensoriales primarias varían su fenotipo tanto en relación a los mensajeros como a los receptores y función tras lesión nerviosa periférica, y las neuronas de la raíz dorsal ganglionar se adaptan a esta nueva situación mediante la supresión de transmisores excitatorios y aumento de los inhibitorios, promoviendo mecanismos de regeneración y supervivencia. Todo esto es concordante con la visión general existente de la respuesta de las neuronas a la lesión, principalmente basada en estudios sobre motoneuronas (Kreutzberg, 1982), enfatizando que la maquinaria de síntesis de la neurona es reprogramada desde la síntesis de transmisores hasta la producción de moléculas para la supervivencia y recuperación. Existe evidencia de que 57 cambios similares ocurren cuando las neuronas cerebrales son dañadas o sufren algún tipo de degeneración. Así, recientes estudios sobre modelos de Alzheimer en ratones sugieren que la galanina y otros péptidos sufren una regulación al alza de una manera específica en hipocampo y corteza ventral en ratones ancianos transgénicos con alta densidad de placas (Díez, 1999). Otro claro ejemplo de cambios en la expresión de NP en el cerebro relacionados con la enfermedad ha sido aportados en estudios sobre varios modelos de animales epilépticos, donde el NPY y otros NP se ven incrementados radicalmente, especialmente en el hipocampo (Gall, 1990; Schwarzer, 1996). Los ganglios basales y estructuras asociadas están relacionados con varias patologías severas del SNC, como la enfermedad de Parkinson y la corea de Huntington. Casi todo el interés se ha centrado en la dopamina y sus funciones, pero los NP también han de ser considerados por su involucración en estas patologías (Gerfen y Wilson, 1996; Graybiel, 1990). Así, la mayoría de las neuronas dopaminérgicas contienen NP, en particular CCK, y las prolongaciones neuronales expresan NP en cantidades elevadas o escasas. De estos últimos, una población contiene SP y dinorfina, y son proyectadas hasta la zona reticulada de la sustancia nigra, mientras que el otro tipo expresan encefalina, y proyectan principalmente al globus pallidus (Gerfen y Wilson, 1996; Graybiel, 1990). Técnicas de doble tinción han demostrado que muchas de estas neuronas peptidérgicas utilizan GABA como su principal neurotransmisor (Penny, 1986). Encefalina, SP y dinorfina son regulados por la señal dopaminérgica procedente de la sustancia negra, como han evidenciado varios experimentos. De este modo, una atenuación en la señal dopaminérgica en el estriado, por ejemplo mediante la lesión de la vía nigroestriatal con 6-hidroxidopamina o mediante el tratamiento con inhibidores de los receptores dopaminérgicos, produce un incremento en la expresión de encefalina y una disminución de dinorfina y SP, mientras que el tratamiento con agonistas 58 dopaminérgicos aumenta los niveles de dinorfina y SP pero no así de encefalina (Gerfen y Wilson, 1996). En el estriado, la dopamina también regula al NP neurotensina, presentando ambos interesantes interacciones clínicas (Kitabgi, 1989; Nemeroff, 1986). Así, las drogas que atenúan la transmisión dopaminérgica, como el haloperidol, 6- hidroxidopamina y reserpina, aumentan los niveles de neurotensina en el estriado de la rata vía receptores D2 (Deutch y Zahm, 1992). Además, la estimulación de los receptores dopaminérgicos, pero en este caso los receptores D1 (con metanfetamina), aumenta igualmente los niveles de neurotensina (Letter, 1987; Wachi, 1987). La neurotensina regulada a través del receptor D1 se encuentra en las neuronas nigroestriatales (Castel, 1993), mientras que la neurotensina regulada a través del receptor D2 aparece en las neuronas que proyectan hacia el globus pallidus. Esto entra en consonancia con lo clásicamente conocido de que las neuronas nigroestriatales se rigen principalmente por receptores D1 y las del globus pallidus contienen receptores D2 (Gerfen y Wilson, 1996). Sinapsis peptidérgicas En las sinapsis peptidérgicas, al igual que en las del resto de neurotransmisores, se produce una despolarización del terminal presináptico seguida de una apertura de canales de Ca++ voltajedependientes que permite la entrada de este catión al interior de la neurona. Estos iones Ca++ promueven que las vesículas que contienen los NP viertan su contenido al espacio sináptico tras fusionarse con la membrana plasmática del terminal presináptico. Sin embargo la liberación de los NP se desencadena por elevaciones de concentración de Ca++ citoplasmático mucho menores que la de los neurotransmisores clásicos (Verhage, 1991). Desde 1990 existe evidencia morfológica 59 de que los NP pueden liberarse extrasinápticamente (Figura 13) (Thureson-Klein y Klein, 1990). En el terminal postsináptico, al ser insolubles en la membrana plasmática, los NP deben ejercer sus efectos interactuando con los receptores de la superficie celular (Dobrescu, 1998). Esta interacción normalmente da lugar a un cambio en la estructura tridimensional del receptor, fenómeno que origina una cascada de eventos en la célula postsináptica que se traducirá en la respuesta celular. La eliminación de los neurotransmisores tras su liberación a la hendidura sináptica resulta crítica para la eficacia de la transmisión nerviosa. En el caso de los NP, esta eliminación es mucho más lenta que en el de los neurotransmisores de pequeño tamaño molecular, ya que a diferencia de estos últimos, los NP no pueden recaptarse por el terminal presináptico para su reutilización y sólo pueden eliminarse mediante difusión y proteolisis por peptidasas extracelulares (Akopian, 1991). Además se ha comprobado que el proceso de eliminación de los NP depende de la función que desempeñan: los que actúan como neurotransmisores tienen una vida corta mientras que los neuromoduladores tendrán un retraso en los mecanismos de degradación para permitirles cumplir su función (Checler, 1993). Debido al laborioso método de síntesis descrito, los NP se encuentran en el SNC a concentraciones entre 1000 y 100.000 veces menores que las de los neurotransmisores de molécula pequeña (los NP cerebrales se encuentran en concentraciones del orden de 10-12-10-15 mol /mg de proteína, mientras que la de acetilcolina o norepinefrina, entre 10-9-10-10 mol/ mg) y por tanto, se liberan en una cantidad mucho menor que los neurotransmisores clásicos. Esta diferencia de concentración se compensa por varias circunstancias. En primer lugar, los NP poseen una afinidad por sus receptores diez mil veces mayor que la de los neurotransmisores clásicos, lo cual les confiere una potencia mucho mayor. Además, actúan a través de 60 vías intracelulares que pueden proporcionar una amplificación significativa. Por último, al ser más lentos los mecanismos por los que los NP se eliminan de la hendidura sináptica, éstos permanecen accesibles a sus receptores durante más tiempo (Fuxe, 1994). Como ya se ha comentado, otra característica importante de los NP es que a menudo ocasionan acciones mucho más duraderas, como son el cierre prolongado de los canales de calcio, cambios persistentes en la maquinaria metabólica de las células, activación o desactivación de genes específicos dentro del núcleo celular y alteraciones a largo plazo de la cantidad de receptores excitadores o inhibidores. Algunos de estos efectos duran días, pero otros quizás meses o años. Un avance importante en el campo de los NP fue descubrir que éstos casi siempre coexisten y se liberan de forma conjunta con uno o más neurotransmisores clásicos (Hokfelt, 1980; Hokfelt, 1980; Karhunen, 2001; Lundberg, 1996). Este fenómeno contradice e invalida la hipótesis enunciada por Henry Dale en 1935 (posteriormente conocido como Principio de Dale), según la cual una determinada neurona libera en todas sus terminaciones un único tipo de neurotransmisor, que define el tipo de neurona (Dale, 1935). De hecho en las neuronas adultas es habitual la coexistencia de un neurotransmisor de molécula pequeña con uno o más de naturaleza peptídica. En este sentido, los NP ejercen un papel de neuromodulador, ya que tienen la capacidad de modificar la acción de los otros neurotransmisores (Kandel, 1998). De esta manera surge el concepto morfológico de coexistencia y el funcional de cotransmisión, que implican la regulación de un neurotransmisor no peptídico o de molécula pequeña por otro de naturaleza neuropeptídica. Esta acción se ve favorecida por la lenta degradación y amplia difusión peptídica, lo cual permite controlar grupos neuronales incluso lejanos a su liberación (Björklund, 1992; Ceballos, 1997). Esta neuromodulación también la ejercen regulando la liberación de distintos 61 neurotransmisores (Maneuf, 1994; O'Connor, 1992), ya que en las terminaciones neuronales presinápticas existen receptores de NP (Ceballos, 1997). Este fenómeno de cotransmisión permitió aclarar fenómenos inexplicables hasta entonces, como era el hecho de que la interacción de un neurotransmisor no peptídico con su receptor en presencia de un NP ejerza una acción diferente o independiente a la que realiza dicho neurotransmisor de manera aislada sobre el mismo receptor; y es que la acción del NP es la de modular, positiva o negativamente, la acción del no peptídico, interfiriendo en la interacción de éste último sobre su receptor (Hokfelt, 1980; Lundberg, 1985). Los neurotransmisores clásicos también pueden coexistir entre ellos en una misma neurona, por ejemplo, GABA, glutamato, glicina y ATP (Hokfelt, 2000). Se ha visto que glicina y GABA coexisten en las células de Golgi cerebelosas (Ottersen, 1988) y en la médula espinal (Todd y Sullivan, 1990), y que realmente ambos pueden ser liberados conjuntamente en la médula espinal (Jonas, 1998). En la actualidad se conocen numerosos ejemplos de cotransmisión neuronal en diferentes localizaciones. Sabemos que en el asta dorsal de la médula espinal la SP coexiste tanto con neurotransmisores clásicos (catecolaminas) (Ljungdahl, 1978) como con otros NP (VIP, galanina, neurotensina, CCK) (Radhakrishnan y Henry, 1995). Otro ejemplo de cotransmisión de un NP con un neurotransmisor de molécula pequeña ha sido descrito en las neuronas del ganglio de la raíz dorsal, donde coexisten SP y glutamato, comprobándose que cuando se antagonizan ambos neurotransmisores la excitación se reduce enérgicamente, lo que sugiere la existencia de una interacción sinérgica que induce sensibilidad central (De Biasi y Rustioni, 1988). Aunque se ha intentado establecer una relación en la coexistencia y colocalización de los diferentes tipos de neurotransmisores, parece que no hay ninguna regla general o patrón de combinación. La coexistencia parece ser un fenómeno tan generalizado que la cuestión podría ser si realmente existe algún NP que 62 no coexista con un neurotransmisor clásico.Una posible excepción serían las neuronas magnocelulares hipotalámicas, que contienen los neuropéptidos oxitocina y vasopresina como sus principales neurotransmisores (Brownstein y Mezey, 1986). En las neuronas parvocelulares hipotalámicas, relacionadas con el control de la hipófisis anterior, en las que los NP son presumiblemente los transmisores más importantes, excepto por algunas neuronas tuberoinfundibulares que parecen contener dopamina, factor inhibidor de la prolactina, como transmisor principal (Hokfelt y Fuxe, 1972). Algunas neuronas de CRH de los núcleos paraventriculares expresan GAD (ácido glutámico-decarboxilasa) y sintetizan GABA (Meister y Hokfelt, 1988). De nuevo el CRH es probablemente el neurotransmisor principal, y el GABA posiblemente un modulador de su liberación. En prácicamente ninguna del resto de las neuronas, que se sepa, es el NP el neurotransmisor principal. Actualmente la máxima atención se centra en el estudio de la coexistencia de NP con aminas biógenas y acetilcolina. Por ejemplo, en la rata las neuronas 5-HT más caudales del asta anterior medular expresan también TRH y SP, mientras que las del asta posterior carecen de estos NP (Hokfelt, 2000). Los NP también pueden actuar como neurohormonas, es decir, actuar sobre poblaciones celulares (incluyendo neuronas) situadas a distancia tras ser liberados directamente a la sangre o al líquido extracelular (Strand, 1999). Y es que, en general, las neuronas pueden liberar un “cóctel” de moléculas mensajeras con un amplio espectro de acciones biológicas y diferente información temporal (señales lentas, intermedias y rápidas). Además, un NP concreto puede actuar como neurotransmisor en una sinapsis y ser liberado extrasinápticamente para ejercer acciones moduladoras u hormonales en otros lugares próximos o distantes que posean receptores para él. Por todo ello resulta muy difícil establecer exactamente todas las funciones que desempeña un determinado NP. 69 señalización en dichas situaciones y que la comunicación peptidérgica funcionaría como un “lenguaje” del cerebro enfermo susceptible de convertirse en una importante diana para el desarrollo farmacológico en diversas patologías (Hokfelt, 2000). 2.3 TAQUICININAS Las taquicininas (TK) constituyen la más extensa familia de péptidos conocida en los metazoos y está formada por elementos con actividad neurotransmisora presentes en mamíferos, anfibios, moluscos e invertebrados. Como su nombre indica, las TK se caracterizan por poseer una rápida y potente actividad contráctil de la musculatura, aunque también se ha demostrado el papel fundamental que desempeñan en el control y regulación de diversas acciones fisiológicas. Aunque durante muchos años se pensó que tenían únicamente un origen neuronal, hoy se sabe que están presentes en diversos tejidos de la anatomía de diferentes especies animales. En todas las especies que poseen esta familia de péptidos, éstos ejercen su acción mediante la unión y activación de diferentes isoformas de RAPG del tipo rhodopsin-like. El descubrimiento de las TK en vertebrados no mamíferos se remonta a la década de los 40, momento en que se aisló en una especie de pulpo mediterráneo una sustancia desconocida –que posteriormente sería conocida como eledoisinacon capacidad para disminuir la presión sanguínea, contraer la musculatura lisa intestinal y estimular la salivación de una forma profusa en perros y ratas (Erspamer, 1949). En invertebrados, tras varias décadas de investigación, se confirmó la existencia de estos péptidos en estructuras nerviosas de la langosta migratoria (Schoofs, 1990) y en glándulas salivares de una especie de mosquito (Champagne y Ribeiro, 1994). La estructura primaria de las TK se encuentra bastante conservada entre diferentes especies animales, tanto vertebrados como invertebrados. Esta alta estabilidad estructural sugiere una fuerte presión selectiva a lo largo de la 70 evolución, es decir, las mutaciones que implican cambios conservadores en la secuencia de aminoácidos favorecen su supervivencia evolutiva (Almeida, 2004). Estructura de las TK de los mamíferos Las TK de mamíferos, anteriormente conocidas como neurocininas, constituyen una familia de péptidos integrada clásicamente por tres miembros: sustancia P (SP), neurokinina A (NKA) y neurokinina B (NKB). Posteriormente se han sumado el neuropéptido K (NPK) y el neuropéptido gamma (NPγ) -ambas formas elongadas de la NKA-, la hemokinina-1 (HK-1) y las endoquininas (Tabla 11). Desde el punto de vista químico, todas las TK de mamíferos presentan dos zonas definidas: una secuencia pentapeptídica característica común en el extremo hidrofóbico carboxi-terminal, Phe-X-Gly-Leu-MetNH2, (Regoli, 1994), y una secuencia aminoterminal, variable en las diferentes TK, que es la responsable de su selectividad. Según el residuo que ocupe la posición Xen la secuencia C-terminal, se distinguen dos tipos de TK: las aromáticas, en las que Xes un aminoácido aromático (Phe, Tyr), y las alifáticas, en las que es un aminoácido alifático (Val, Ile). De forma característica, todas las TK son aminopéptidos, es decir, presentan un grupo amino en la metionina carboxiterminal. Mientras que el extremo amino-terminal define la especificidad de las TK frente al subtipo específico de receptor (Schwyzer, 1987), la secuencia C-terminal es la encargada de la interacción y activación de dicho receptor, a través de la cual ejercerá sus funciones biológicas (Cascieri, 1992; Krause, 1992; Maggi, 1995). La amidación de la metionina terminal es esencial para su funcionamiento, y por ello los péptidos tachykinin-like de los invertebrados, con una arginina en el C-terminal, son incapaces de activar los receptores taquicinérgicos (RTK) de mamíferos. 71 Tabla 11:Secuencia de los diferentes NP que integran la familia de las TK de mamíferos. A) Los aminoácidos subrayados son los que conforman la secuencia C-terminal común de las TK. En negrita se representa el residuo aromático o alifático correspondiente. B) Péptido relacionado con las TK (tachykinin-like). Mientras que la secuencia de la SP, NKA y NKB es idéntica en todos los mamíferos en los que se ha estudiado, la del resto de TK varía entre diferentes especies. La SP fue la primera TK descubierta (Von Euler y Gaddum, 1931) y supuso el punto de 72 partida de una larga historia de investigación en este campo. Cincuenta años después se aislaron en la médula espinal del cerdo la NKA y NKB (Kangawa, 1983; Kimura, 1983), con diferencias respecto a la SP en la actividad farmacológica a nivel central y periférico y en su afinidad por el subtipo de RTK. En los años siguientes se encontraron péptidos estructural o funcionalmente parecidos en el SNC de varios vertebrados y anfibios, como el NPK (Nawa, 1984; Tatemoto, 1985) y el NPγ (Kage, 1988), que son formas elongadas de la NKA. En el año 2000 se encontró una nueva TK en el ratón con actividad reguladora de la linfopoyesis B y expresión principalmente en tejido no neuronal, a la que se llamó HK- 1 (Zhang, 2000). El descubrimiento de la HK-1 dio paso a la descripción de un nuevo grupo de TK, las endoquininas, con una estructura variable entre diferentes especies animales. En humanos, la HK-1 presenta una secuencia que coincide en sus seis últimos aminoácidos con la SP, mientras que la EKA y EKB son formas elongadas por el extremo N-terminal de la HK-1 (la EKA es un péptido de 47 aminoácidos, mientras que la EKB, de 41 aminoácidos, es una forma truncada de la EKA) (Kurtz, 2002; Page, 2003). Mientras que la EKA y EKB poseen la secuencia clásica ya comentada de las TK, la EKC y EKD tienen una estructura tachykinin-like (Phe-X-Gly-Leu-LeuNH2), variante de la forma clásica. Esta variación en su estructura hace que la EKC y EKD no presenten afinidad por ninguno de los tres RTK. En la última década se ha propuesto la inclusión de nuevos péptidos periféricos similares a las TK en esta familia. Mediante búsqueda bioinformática se identificó el péptido-1 similar a las TK del cromosoma 14, C14TKL-1,ampliamente expresado en tejidos periféricos y con actividad agonista frente al receptor NK1 a pesar de su secuencia tachykinin-like (Phe-Tyr-Gly-Tyr-Met-NH2) (Jiang, 2003). Su gen y secuencia precursora todavía no se han identificado, por lo que la inclusión de C14TKL- 73 1 como una nueva TK y la consideración de su gen como TAC5 sería prematura. También en 2003 (Zimmer, 2003) se descubrió la virokinina bovina, una TK codificada por un gen del virus respiratorio sincitial bovino procesado y liberado por células de mamíferos infectadas, y por tanto no codificada por el genoma de ningún mamífero. Esta TK tiene la capacidad de infectar e interferir en la función de diferentes tipos de células periféricas. La secuencia primaria de la virokinina está muy conservada en todos estos virus. Podría representar una nueva forma de mimetismo molecular, que beneficiaría al virus al permitirle interactuar con los RTK para, de esta forma, modular la respuesta inflamatoria e inmune del huésped. Localización y acciones de las TK Desde hace más de una década, la activación de los RTK se ha implicado en una gran variedad de acciones biológicas. Se ha descrito su participación en la modulación y transmisión de la percepción del dolor, regulación del comportamiento emocional y otras funciones autonómicas a nivel del sistema nervioso central, modulación de la contractilidad del músculo liso, vasodilatación, sensibilidad visceral, inducción de la inflamación neurogénica y hematopoyesis a nivel periférico, activación del sistema inmune y activación de la secreción de glándulas endocrinas (Longmore, 1997). Aunque clásicamente se ha considerado a las terminaciones nerviosas sensibles a capsaicina como la principal fuente de TK a nivel periférico (Lundberg, 1996; Maggi y Meli, 1988), hoy en día se sabe que existen otras fuentes neuronales y no neuronales que originan las TK a este nivel. De hecho, el descubrimiento de la HK-1 en 2000 (Zhang, 2000) supuso la ruptura del dogma que establecía que la presencia de las TK estaba restringida de forma exclusiva al tejido neuronal, y que realizaban su acción a nivel periférico mediante su liberación desde terminaciones nerviosas. La existencia de TK ha 74 sido comprobada no sólo en células no neuronales del sistema inmune (Weinstock, 1988), inflamatorio (Khare, 1998) y endotelio vascular (Linnik y Moskowitz, 1989), sino también en las células tirotropas y somatotropas de la hipófisis anterior (Brown, 1991), en células enterocromafines (Simon, 1992), en fibroblastos (Bae, 2002) y células epiteliales (Chu, 2000), células musculares lisas intestinales y de la vía aérea (Khan y Collins, 1994; Maghni, 2003), en diferentes tipos de órganos reproductores femeninos (Pintado, 2003), circulando en la sangre (Pernow, 1983) e incluso en la placenta, un órgano carente de inervación (Muñoz, 2010; Page, 2000). A nivel del tracto gastrointestinal, las TK actúan como neurotransmisores en diferentes circuitos nerviosos que regulan la motilidad gastrointestinal, secreción y funciones vasculares. También colaboran en la transmisión nerviosa espinal aferente que inerva el tracto gastrointestinal y desempeñan funciones en la respuesta del intestino a la inflamación. Las TK coexisten con la acetilcolina, principal neurotransmisor de las neuronas excitatorias que inervan el músculo intestinal, y actúan como cotransmisores de dichas neuronas. La transmisión excitatoria está mediada por NK1R (sobre todo en las células intersticiales de Cajal) y NK2R en el músculo. Las TK también participan en la neurotransmisión excitatoria lenta de las sinapsis neuro-neuronales a través de los receptores NK1 y NK3, afectando a la motilidad del intestino. A nivel del epitelio intestinal, la activación de los receptores NK1 y NK2 estimula la secreción de fluidos. Además, las TK son liberadas desde las terminaciones centrales de las neuronas gastrointestinales aferentes en la médula espinal, participando en las vías nociceptivas (Shimizu, 2008). La NKB, que en principio de creía restringida al SNC, hoy se sabe que presenta una expresión periférica tan amplia como la SP. Esta TK ha sido descrita en la placenta humana y de rata (Page, 2000), así como en el útero (Pinto, 2001) y otros tipos de células reproductivas no neuronales de ratón (Pintado, 2003). Además se ha 75 relacionado con el desarrollo de preeclampsia (Page, 2000; Pinto, 2004). Recientemente se ha descubierto la presencia del receptor NK3 en osteoclastos de la médula ósea de ratón, y se ha sugerido que la NKB activa la formación de osteoclastos y la resorción ósea a través de dichos receptores (Ichiki, 2011). Tanto la HK-1 como las endokininas A, B, C y D se expresan de forma preferente en células no neuronales. De hecho, la expresión predominantemente periférica y elevada potencia agonista frente a los receptores NK1 que presentan las endoquininas A y B, llevó a postular que éstas endoquininas en realidad podrían ser los principales ligandos endógenos del receptor NK1, actuando a través de un mecanismo endocrino-paracrino, en tejidos no inervados en los que la SP no se expresa (Page, 2004; Page, 2003). Han sido descritas varias moléculas con capacidad de unión a las TK. En el suero de pacientes con fibrosis de médula ósea se han encontrado complejos de SP y fibronectina. La fibronectina es un componente de la matriz extracelular de la médula ósea que comparte cierta similitud con el receptor NK1 y podría ejercer un papel protector en la digestión de la SP, donde SP (1-4) se comporta como un regulador negativo de la hematopoyesis (Rameshwar, 1995; Rameshwar, 2003). También se ha encontrado similitud estructural entre el receptor NK1 y el factor de crecimiento hematopoyético proteico transmembrana inductor del receptor NK1. Este factor se une de forma no covalente a la SP e induce la expresión del receptor NK1 endógeno en los fibroblastos de la médula ósea (Bandari, 2002). Genes de las TK Las TK de mamíferos están codificadas por tres genes diferentes denominados preprotaquiquininas (TAC)1,TAC3 yTAC4, de acuerdo con el Comité de Nomenclatura de Genes de la Organización del Genoma Humano 76 (http://www.gene.ucl.ac.uk/nomenclature/). Esta nomenclatura sustituye a los términos previamente usados PPT-A/PPT-I (TAC1), PPT-B/PPT-II (TAC3) y PPT-C (TAC 4) (Patacchini, 2004). El gen TAC1 codifica la SP, NKA y sus formas elongadas NPK y NPγ; TAC3 codifica la NKB y TAC4 la HK-1 y endoquininas (Tabla 12). El primer gen clonado fue TAC1, en 1983 a partir de cerebro bovino (Nawa, 1983). Inicialmente se pensó que se trataba de dos genes diferentes, uno que contenía la SP (TAC1) y otro que codificaba la NKA (al que se llamó TAC2). Hoy sabemos es un mismo gen constituido por siete exones, de los que el exón 3 y 6 codifican la SP y NKA, respectivamente. También se conoce que, mediante splicing (o empalme) alternativo del exón 6, este gen puede dar lugar a cuatro isoformas diferentes de ARNm: las formas α y δ, que sólo codifican la síntesis de SP, y las formas β y γ, que codifican la síntesis tanto de SP como NKA (Harmar, 1990; Kawaguchi, 1986; Nawa, 1984). Para la formación de NPK y NPγ se precisa la inclusión o exclusión del exón 4 en las formas β y γ de TAC1, respectivamente (Kage, 1988; Tatemoto, 1985). Tabla 12: Genes de las TK humanas (Pennefather, 2004). 77 Como consecuencia de este splicing a nivel de TAC1, la SP puede expresarse a nivel regional de forma aislada, mientras que la NKA siempre estará acompañada de la expresión de SP. Se ha comprobado la expresión de TAC1 en todos los tejidos humanos, especialmente en cerebro, corazón, bazo, colon, cerebro fetal, glándula mamaria (Maggi, 1995, 1997; Pinto, 2004) y placenta (Marzioni, 2005). Además se ha visto cómo cada especie animal tiene una diferente expresión de las distintas variantes de splicing que no parece ser específica de cada tipo de tejido, cuyo significado se desconoce. En humanos las isoformas más abundantes son la γ y β, ambas codificantes tanto de SP como NKA (Bannon, 1992; Lai, 1998; Pintado, 2003), por lo que en muchas ocasiones ambas TK se sintetizan y liberan como cotransmisores tanto a nivel central como periférico (Maggi, 2000). El gen TAC3 codifica exclusivamente la NKB (Hokfelt, 2001; Kotani, 1986; Page, 2000). Este gen está compuesto por siete exones, de los cuales el 5 codifica la NKB. Aunque su organización en humanos y bovinos es similar a la de TAC1, su procesamiento es mucho menos complejo (Page, 2001). En humanos existen dos isoformas precursoras, la αTAC3 yβTAC3, que se diferencian en los últimos 24 aminoácidos del extremo C-terminal (Page, 2005). Aunque inicialmente no se consiguió aislar la NKB en tejido periféricos mediante estudios de inmunorreactividad (Moussaoui, 1992), estudios posteriores demostraron una intensa expresión del ARNm de NKB en la placenta humana (Page, 2000). De hecho, se ha comprobado que la expresión de TAC3 en tejidos humanos es igual o incluso más amplia que la de TAC1 (Pinto, 2004). Estos hallazgos sugieren que la NKB debe ejercer un papel similar al de la SP tanto en el SNC como en tejidos periféricos. Se piensa que esta TK está implicada en la cascada de señales neuroendocrinas que tienen lugar en la pubertad, ya que 78 mutaciones en el gen TAC3 son causa de hipogonadismo hipogonadotrópico normosómico idiopático (Topaloglu, 2010). El descubrimiento de TAC4,el tercer gen de las TK de mamíferos, por Zhang et al supuso un hito en el campo de las taquicininas. Estos autores identificaron el nuevo gen a partir de células hematopoyéticas de estirpe linfoide B de la médula ósea de ratón al que llamaron preprotaquiquinina-C, posteriormente renombrado como TAC4. Éste gen era responsable de la codificación de una TK con amplia distribución periférica no neuronal hasta entonces desconocida (Zhang, 2000). Un par de años más tarde Kurtz aislaron y caracterizaron en humanos el gen ortólogo al TAC4 descrito en ratón, responsable de un péptido, la HK-1, que por compartir la secuencia carboxi terminal característica de las TK fue incluido como miembro de esta familia (Kurtz, 2002). En humanos, este gen está integrado por cinco exones, de los que el 2 codifica la HK-1. Mediante splicing alternativo puede dar lugar a cuatro isoformas distintas de ARNm: α, β, γ y δ. Cada variante codifica de una forma diferencial los diferentes péptidos que conforman el grupo de las endoquininas: EKA, EKB, EKC y EKD. Así, mientras que la EKB está codificada por las cuatro isoformas, la EKA y la EKC únicamente lo están por αTAC4 y la EKD por βTAC4. La distribución de las cuatro isoformas de TAC4 no ha sido definida completamente, aunque sí se sabe que α y γTAC4 se expresan ampliamente en diferentes tejidos periféricos humanos, particularmente en la placenta, y de una forma escasa en el cerebro (Page, 2004; Page, 2003). Recientemente se han descubierto niveles muy elevados de expresión de este gen en el epitelio olfatorio de ratón, tejido de origen neurológico (Tran, 2011). 85 el hígado y pulmón de ratón la NKB induce la formación de edema por un mecanismo independiente de los tres RTK conocidos (Grant, 2002). En contra de los argumentos anteriores figura el hecho de que en cada especie de mamífero existe sólo un miembro de cada tipo de RTK, lo cual sugiere que los tres receptores que conocemos en la actualidad constituirían una familia completa. Tampoco se podría descartar la existencia de nuevos RTK que pertenezcan a una familia diferente de receptores acoplados a una proteína G. Esta hipótesis estaría apoyada por hechos como la interacción de los opioides con los RTK, así como la unión de análogos de la SP y antagonistas del receptor NK1 con receptores opioides. Además, se ha comprobado cómo la naloxona se comporta como antagonista de un análogo de la SP (Lei, 1991; Sakurada, 1999). 2.5 SUSTANCIA P La SP es la TK estudiada desde hace más tiempo, siendo la mejor caracterizada en cuanto a su distribución, liberación, acciones fisiológicas e implicación fisiopatológica en diversos procesos patológicos. En 1931 Euler y Gaddum, tratando de encontrar acetilcolina en extractos hipotalámicos e intestinales equinos, describieron por primera vez la presencia de un factor resistente a la atropina con una potente capacidad para estimular la contracción muscular y disminuir la presión sanguínea (Von Euler y Gaddum, 1931). Comprobaron que este compuesto mantenía su actividad cuando, tras evaporarse, se convertía en un polvo seco, motivo por el que lo llamaron “P” (de powder, polvo en inglés) en sus anotaciones (Hokfelt, 2001). En la década de los 50 se comprobó la existencia de SP en diferentes áreas del cerebro, médula espinal, plexo nervioso de la capa muscular del tracto gastrointestinal y nervios y ganglios del sistema nervioso periférico (Pernow, 1983). A comienzos de la década de los 70, Susan Leeman 86 y colaboradores fueron los primeros en identificar la SP como un undecapéptido (Chang, 1971), sintetizar el compuesto (Tregear, 1971) y poner a punto un radioinmunoensayo para SP (Powell, 1973). La SP es soluble en agua y alcohol, e insoluble en éter y cloroformo. Tolera ebullición a pH entre 1-7 y es rápidamente destruída en medio alcalino. En electroforesis se desvía hacia el cátodo a pH< 10 y su punto isoeléctrico está próximo a 9. La actividad biológica de la SP es inactivada por la tripsina y la pepsina y resiste la acción de las carboxipeptidasas (Pernow B, 1983). La secuencia de 11 aminoácidos de la SP es la siguiente: H-Arg-Pro-Lys-Pro-Gln-Gln-Phe-Phe-Gly-Leu-Met-NH2 Figura 19: Imagen tridimendional de la SP Como ya se ha comentado, la SP ejerce sus funciones mediante su unión con el receptor NK1, del que es su principal ligando y por el que más afinidad presenta de los tres RTK descritos hasta ahora. La porción N-terminal de la SP presenta la máxima capacidad para inducir la desensibilización del receptor NK1 (Vigna, 2001). De hecho, diferentes estudios han mostrado que fragmentos N-terminales como SP(1-4) y SP(1-7) son activos metabólicamente (Joshi, 2001; Zhou & Nyberg, 2002), y que la formación de los mismos puede ser bloqueada por la acción de inhibidores específicos de las 87 endopeptidasas. Paradójicamente, el metabolito SP (1-7) tiene algunos efectos similares y otros opuestos a los de la SP completa (Hallberg & Nyberg, 2003). Mecanismo de acción La SP realiza acciones como neurotransmisor, neuromodulador (al regular la actividad de otros neurotransmisores) y hormona, ya que ejerce su actividad a distancia de los lugares donde es liberada. Su actividad neurotransmisora fue propuesta ya en la década de los 50 (Lembeck, 1953). Tras ser liberada del terminal presináptico en respuesta al estímulo despolarizante, la SP se inactiva fundamentalmente a través de la degradación por peptidasas, no participando en su inactivación la recaptación de este NP. Benuck et al describieron en 1975 una EPN (endopeptidasa neutra) parcialmente purificada a partir de cerebro de rata con actividad proteolítica sobre la SP (Benuck & Marks, 1975). Posteriormente se comprobó que la coexistencia en las mismas células de esta EPN con receptores NK1 reducía marcadamente la unión de la SP a éstos últimos, debido a la degradación acelerada que experimentaba la SP (Okamoto, 1994). La EPN (EC 3.4.24.11, también llamada encefalinasa) es una metalopeptidasa de membrana que cataliza la ruptura de aminoácidos hidrofóbicos no terminales por su vertiente amino. Actúa sobre diferentes péptidos además de la SP, como son la insulina (cadena B), péptidos opioides, encefalinas, péptido natriurético auricular, péptido natriurético cerebral, neurotensina y neuropéptido Y. Esta enzima es inhibida primariamente por el EDTA (ácido etilendiaminotetraacético), phosphoramidon y thiorfan, y es reactivada por el zinc. La EPN es idéntica al antígeno común de la leucemia aguda linfoblástica común, un marcador proteico de la leucemia aguda linfocítica (Eberlin, 2012; Offermanns y Rosenthal, 2008; Painter, 1988). Intracelularmente, la unión SP/NK1 receptor es seguida de una hidrólisis de fosfoinositol, movilización del calcio, aumento de los niveles de AMPc y la activación 88 del sistema proteinquinasa activadora de mitógenos (MAPK) (Luo, 1996) (Figura 20). La ruta endocelular tras la internalización del complejo SP/NK1 receptor ha sido estudiada en profundidad por Grady et al (Grady, 1995). Gracias a los estudios con microscopia confocal usando SP marcada y anticuerpos anti receptor NK1, se puede detallar la ruta intracelular así como los procesos de degradación y reciclaje de dichos receptores. Se ha podido determinar que la SP y su receptor se internalizan rápidamente mediante la acción de la clatrina en los denominados endosomas tempranos. En ausencia de SP, el receptor NK1 se localiza en la membrana plasmática, pero cuando la célula está expuesta a este NP, el receptor y el ligando se unen, tras activarse la ruta, se inicia la agrupación en la membrana y se desplazan conjuntamente hacia el interior de la célula por endocitosis. Es posible que este método no sea el único método de entrada como aseguran algunos autores. Se ha observado que una vez el complejo se internaliza se dirige a la región perinuclear donde se origina una acidificación del endosoma provocando la disociación de SP y receptor NK1. Finalmente, se comprueba que los receptores aparecen de nuevo en la membrana. Existen distintas teorías para explicar este fenómeno; síntesis de nuevos receptores, inserción de receptores preformados o reciclaje de los receptores internalizados. Por el contrario, el ligando se degrada enzimáticamente en el interior de los endosomas ya que no aparece de nuevo en la membrana plasmática junto con los receptores. Parece ser que este mecanismo de endocitosis y reciclaje de los receptores sería uno de los mecanismos responsables de la regulación de los fenómenos desensibilización y resensibilización ante la presencia de SP, de este modo la célula se haría insensible a cantidades excesivas de SP y se conseguiría una regulación celular frente a este NP. 89 Figura 20. Mecanismo de acción de la SP (Modificado de Muñoz, 2011). Otro mecanismo de regulación del sistema SP/NK1 receptor sería a través del grupo carboxilo terminal que contiene serina y treonina que cuando se fosforila, causa la desensibilización del receptor en respuesta al estímulo repetido del agonista (O'Connor 2004). Distribución y localización Los primeros datos de la distribución y localización de la SP en el SNC y periférico fueron obtenidos mediante técnicas de cromatografía líquida de alta eficacia (HPLC) en combinación con estudios radioinmunológicos e inmunohistoquímicos (Höktfelt, 1975, 1977; Pernow, 1983; Maggio, 1985), empleando anticuerpos selectivos frente a SP.En este aspecto es importante señalar que algunos estudios han puesto en evidencia una reactividad cruzada de los anticuerpos anti-SP con otras endoquininas similares a la SP, como la HK-1, EKA y B (Graham, 2004; Page, 2004), e incluso con la virokinina (Zimmer, 2003). Numerosos autores han descrito la existencia de SP en la mayoría de las partes del SNC y periférico de todos los mamíferos estudiados, 90 incluyendo al hombre, si bien su distribución en muy variable entre diferentes áreas anatómicas. En el SNC la SP se localiza en la corteza cerebral en las áreas somatomotora, somatosensorial, visual y olfatoria. Sin embargo, es a nivel subcortical donde se hallan los mayores niveles de este péptido: los núcleos caudado y putamen presentan una densidad muy elevada de somas celulares que expresan SP, presentando proyecciones de fibras axonales a la sustancia negra. De esta forma el área nigroestriada supone una de las áreas de mayor concentración del péptido. También hallamos SP en los núcleos amigdalares del hipocampo, cápsula interna y séptum. En el tronco encefálico se localiza entre los principales núcleos neuronales (destacando el trigémino), y en la médula espinal sobre todo a nivel de las astas posteriores. A nivel del sistema nervioso periférico, la SP se localiza principalmente en las neuronas sensoriales primarias de los ganglios espinales, cadena cervical simpática y en los ganglios yugular, nodoso y trigeminal (Beaujouan, 2004). En el resto del organismo, la SP está ampliamente distribuida, localizándose alrededor de los vasos sanguíneos o terminaciones nerviosas en la mayoría de órganos y tejidos: piel, folículos pilosos, glándulas sudoríparas, aparato respiratorio, genitourinario y cardiovascular, en los plexos mientérico y submucoso del sistema digestivo e incluso en la pulpa dentaria (Pernow, 1983; Severini, 2002; Shimizu, 2008). También se ha aislado en la práctica totalidad de fluidos del organismo: sangre, LCR, orina (Altuntas, 2014), saliva (Parris, 1990), líquido peritoneal (Sanfilippo, 1992), leche materna (Ducroc, 1995)… Es decir, presenta una distribución universal. 2.6 RECEPTORES NK1 El receptor NK1 pertenece al tipo de receptores denominados “RAPG”. Su estructura consiste en siete hélices transmembrana conectadas entre sí a través de tres 91 bucles intra y otros tres extracelulares, con un extremo N-terminal extracelular y otro C- terminal intracelular. El núcleo lo conforma el haz de siete α-hélices transmembrana contraídas y estabilizadas como resultado de sus mutuas interacciones electrostáticas e hidrofóbicas y una red de enlaces en este entorno lipofílico. Los bucles extracelulares se organizan en cuatro filamentos de hoja plegada-β, mientras que los intracelulares carecen de estructura determinada (Okada y Palczewski, 2001; Stenkamp, 2002). Aunque se desconoce el mecanismo exacto, parece ser que, tras la unión al ligando, la traducción de la señal en los RAPG se lleva a cabo mediante una reordenación del haz de α-hélices que induce un cambio de conformación en la superficie citoplasmática del receptor que es trasmitido a la proteína G para que complete el mecanismo de señal (Ernst y Bartl, 2002). Los hallazgos de diferentes trabajos defienden que el receptor NK1 responde a un modelo de activación multimodal, en el que la unión de cada ligando induce en el receptor una conformación única estable y específica que le permite activar una o más proteínas G de una manera ligando-específica (Lecat, 2002; Palanche, 2001). Esta conformación adoptada por el receptor está condicionada tanto por el ligando (Hastrup y Schwartz, 1996) como por el microambiente, es decir, el medio extracelular y la composición fosfolipídica de la membrana en la proximidad del receptor (Villar, 1998). Se ha demostrado la existencia de diferentes conformaciones activas tanto en el receptor NK1 como en el NK2, presentando cada una de ellas una forma preferencial para activar cada uno de los diferentes mecanismos efectores además de una afinidad diferente por los distintos agonistas y antagonistas (Hastrup y Schwartz, 1996; Lecat, 2002; Maggi y Schwartz, 1997; Palanche, 2001). En los últimos años se ha intentado identificar el sitio de unión de la SP con el receptor NK1. Como resultado de numerosos trabajos se cree que esta unión, dado el carácter hidrofílico de la SP, se produce a nivel de múltiples dominios de la cara 92 extracelular del receptor (Figura 21). En este sitio de unión ejercen un papel destacado algunos aminoácidos de los bucles extracelulares (como el Asn96 y Met181, del primer y segundo bucle, respectivamente), hélices transmembrana (His108 y Tyr287, de la III y VII hélice, respectivamente) y extremo N-terminal (Asn23, Gln24 y Phe 25) (Fong, 1993; Huang, 1994; Kage, 1996). Los antagonistas no peptídicos, por su naturaleza hidrófoba, tienen su lugar de unión al receptor NK1 localizado más profundamente, entre los segmentos transmembrana, a diferencia de la SP (Figura 21) (Gether, 1993). De esta manera, la unión de la SP al receptor NK1 estabiliza una serie de conformaciones activas del receptor que serán reconocidas por la proteína G específica (Holst, 1998). En este aspecto, se conoce que algunos aminoácidos como Phe268, Glu78 o Tyr205 ejercen un papel importante en la estabilización de esa conformación activa o en la activación del mecanismo de señal. Gly166 y Tyr216 son residuos de las hélices transmembrana IV y V, respectivamente, que también se relacionan con el mantenimiento de la conformación correcta del receptor NK1 de cara a la selectividad del mismo por la SP. Así, mutaciones que afectan a estos dos aminoácidos aumentan la afinidad del receptor NK1 por diferentes ligandos como NKA, NKB y septide (Ciucci, 1996). En el caso de Gly166, éste se encuentra sustituido de forma natural en los receptores NK2 y NK3, por lo que se piensa que juega un papel importante en las características de afinidad divergentes que los tres RTK han adquirido a lo largo de la evolución (Kage, 1996). Existen dos isoformas funcionales del receptor NK1: una larga o completa (407 aminoácidos) y otra corta o truncada en el extremo C-terminal (311 aminoácidos) (Fong, 1992; Mantyh, 1996). Este extremo contiene una serie de sitios que median en la fosforilación e internalización del receptor al activarse tras su unión al ligando. Por este motivo la isoforma corta, que podría considerarse un subtipo de receptor, presenta una 93 afinidad por la SP diez veces inferior (Fong, 1992), y además podría no seguir las mismas vías de señalización (Dery, 2001), presentar defectos de internalización (Bohm, 1997) y resistencia a la desensibilización homóloga en comparación con la isoforma larga (Li, 1997). En humanos, la isoforma larga del receptor NK1 es la más prevalente en el cerebro, mientras que la truncada está más representada en tejidos periféricos (Caberlotto, 2003). De la misma forma se ha comprobado una expresión diferente de los genes TAC1 yTAC4 en tejidos humanos, con un predominio de TAC4 en tejidos periféricos, especialmente en los del sistema inmune. Se ha sugerido que podría existir cierta correlación entre la preferencia con la que algunos tejidos expresan la isoforma larga o corta del receptor NK1 y cómo esos mismos tejidos expresan predominantemente SP o endoquininas y otros péptidos SP-like (Page, 2003). Figura 21. Representación esquemática que muestra los sitios de unión de la SP (a) y del antagonista no peptídico CP-96,345 en el receptor NK1 (b). La primera imagen muestra la visión extracelular en la que se representan los bucles y la región N-terminal. Los círculos verdes representan los residuos que interactúan con la SP. En la segunda imagen las siete regiones transmembrana se muestran como hélices, y los círculos rojos representan los sitios de unión del antagonista CP-96,345. (Hokfelt, 2001). 94 Existen varios subtipos de receptor NK1 según la afinidad que presenten por ciertos ligandos. Tanto [3H]SP o como [3H][Pro9]SP tienen gran afinidad y potencia (Mussap, 1993) frente a los receptores NK1 denominados “clásicos”, que son aquellos para los que la SP es la única TK endógena con alta afinidad. Otra modalidad de receptor NK1 es el que presenta alta afinidad por ligandos del tipo [Glp6,Pro9]SP(6-11) (septide). Estos NK1, denominados “septide-sensibles”, poseen alta afinidad por varias TK como la NKA, NPK, NPγ y NKB, así como algunos análogos de la SP y NKA, ligandos todos ellos que presentan una débil afinidad por los receptores NK1 “clásicos”. En cambio la SP, al igual que los agonistas y antagonistas selectivos de los receptores NK1 “clásicos”, poseen una alta afinidad por ambos tipos de receptores (Beaujouan, 1999). La SP (6-11) sólo reconoce el sitio de unión de alta afinidad “septide sensible”, que resulta ser la mínima longitud cadena necesaria para activar el receptor, que coincide con los últimos seis aminoácidos de la EKA y B (Beaujouan, 2004; Page, 2004; Severini, 2002). Un tercer subtipo de receptor ha sido descrito con el nombre “nuevo NK1 sensible”. Éste posee alta afinidad por TK de mayor longitud y no por septide o SP (6-11) (Beaujouan, 2004). Se ha sugerido que los subtipos de “clásico” y “septide sensible” en realidad representan variantes en la conformación del mismo receptor con capacidad para activar diferentes sistemas de transducción de la señal y de esta forma ejercer diferentes funciones. Así, estudios in vitro han demostrado que los receptores “clásicos” están ligados a la activación de una adenilato ciclasa mientras que los “septide sensibles” lo están a la activación de una fosfolipasa C (Sagan, 1997; Torrens, 2000). Sin embargo, en estudios in vivo los receptores clásicos estaban ligados a la activación de una fosfolipasa C y raramente a una adenilato ciclasa (Beaujouan, 2004). 101 L-732,138 (Figura 22), es aproximadamente 1.000 veces más potente para el receptor NK1 que para el NK2 y el NK3 en humanos y 200 veces más potentes en el receptor NK1 humano que en ratas (MacLeod, 1994). Es capaz de antagonizar el aumento de permeabilidad vascular de la piel, produce una atenuación de la hiperalgesia (Cahill, 2002) y ejerce una acción antitumoral contra varias líneas celulares tumorales humanas (Muñoz, 2007, 2007, 2008, 2010, 2011, 2012, 2012). Figura 22. Representación tridimensional de la estructura química de L-732,138 (a), L-733,060 (b) y aprepitant (c). Los átomos de carbono están representados en gris, hidrógeno en blanco, nitrógeno en azul, oxígeno en rojo y flúor en amarillo (Modificado de Rosso, Muñoz y Berger, 2012). Por su repercusión clínica es importante L-733,060 (Figura 22), antagonista desarrollado a partir de CP-99,994 (Huang, 2003) muy bien estudiado, que presenta actividad analgésica (Parenti, 2012), antidepresiva (Guiard, 2004), ansiolítica y frente a trastornos del estado de ánimo (Rupniak, 2000), eficacia en la enfermedad inflamatoria hepática (Bang, 2003) y actividad antitumoral en diferentes líneas celulares humanas 102 (Muñoz, 2012; Muñoz, 2004; Muñoz, 2004; Muñoz, 2008; Muñoz, 2005; Muñoz, 2005; Rosso, 2008). Entre estos antagonistas también destaca MK-869 (Figuras 22 y 23), conocido posteriormente como aprepitant (Figura 22), que ha sido empleado para el tratamiento del dolor (Chizh, 2007), prurito (Santini, 2012), migraña, emesis (Tattersall, 2000), trastornos psiquiátricos como depresión (Kramer, 1998) y como fármaco antitumoral (Kast, 2009; Muñoz y Rosso, 2010). La FDA (Food and Drug Administration) aprobó la indicación de aprepitant oral para las náuseas y vómitos inducidos por quimioterapia. Una proforma de este fármaco, fosaprepitant, está también aprobada para su empleo intravenoso (Navari, 2007). Figura 23: Sitios de unión al receptor NK1 de SP y aprepitant. El antagonista se une a los segmentos profundos transmenbrana del receptor NK1 y la SP a sus hélices extracelulares (Muñoz, 2011) 103 2.7 EFECTOS FISIOLÓGICOS Y FISIOPATOLÓGICOS DEL SISTEMA SP/NK1 RECEPTOR A concentraciones fisiológicas la SP ejerce múltiples acciones en todo el organismo. Entre ellas destacan las llevadas a cabo sobre el sistema inmune (SI) (Eglezos, 1991; Hartung y Toyka, 1989; McGillis, 1990; Maggi, 1997). La SP ejerce un papel inmunomodulador actuando tanto a través el SNC como periférico, y se ha llegado a pensar que forma parte del complejo sistema de la inmunidad innata (Pennefather, 2004). El balance entre NP proinflamatorios y antiinflamatorios resulta crucial para mantener una situación inflamatoria basal de reposo y de autotolerancia, de forma que la ruptura de este delicado equilibrio jugaría un papel relevante en la patogénesis de enfermedades inflamatorias crónicas y autoinmunes (Reinke y Fabry, 2006). El complejo SP-NK1 receptor desempeña un papel fundamental en la regulación de la actividad inmunológica, modulando la respuesta inflamatoria y, por ende, ante agentes infecciosos (Douglas y Leeman, 2011). Su papel etiopatogénico se ha relacionado con un gran número de procesos patológicos de esta índole. En líneas generales, la SP ejerce un efecto proinflamatorio en el SI, aumentando la respuesta inflamatoria a nivel del aparato respiratorio, gastrointestinal y musculoesquelético (O'Connor, 2004). La SP a través del receptor NK1, retrasa la apoptosis y, por tanto, aumenta la supervivencia de los neutrófilos (Bockmann, 2001), macrófagos (Kang, 2001) y precursores de linfocitos T y B (Zhang, 2000; Zhang y Paige, 2003). La SP también potencia la proliferación de los linfocitos T inducida por antígenos o mitógenos (Calvo, 1992). Los monocitos/macrófagos expresan SP de forma constitutiva, y la expresión de receptores NK1 está aumentada en células mieloides infiltrantes (Goode, 2000). Además, la SP estimula la secreción de citoquinas proinflamatorias por estas 104 células mononucleares En los focos inflamatorios de enfermedades inflamatorias crónicas como la colitis ulcerosa o el asma, tanto los macrófagos como los eosinófilos son productores activos de SP (Ho, 1997; Metwali, 1994; Pascual y Bost, 1990). Se ha demostrado que sus efectos se amplifican por la pérdida de su principal enzima degradante, la EPN, de las células epiteliales que resultan dañadas en los procesos crónicos (Hwang, 1993). La SP ha demostrado tener efectos directos sobre la respuesta funcional de los neutrófilos: induce la quimiotaxis, potencia la fagocitosis, la exocitosis y promueve el paso de situación de reposo a estado activado (Lloyds y Hallett, 1993; Tanabe, 1996). Además, a altas concentraciones la SP prolonga la vida media de los neutrófilos, aumenta su concentración intracelular de calcio y estimula la liberación de radicales O2- y de IL-8 por estas células (Lloyds y Hallett, 1993; Serra, 1994). La SP también aumenta la citotoxicidad de las células natural-killer, y reduce su actividad migratoria (Lang, 2003), aunque existen estudios más recientes en los que parece ejercer el efecto contrario (Monaco-Shawver, 2011). Las células dendríticas (CD), pertenecientes al sistema mononuclear fagocítico, formanparte de la inmunidad innata y actúan como las más potentes células presentadoras de antígenos de nuestro SI. La liberación de SP en el foco inflamatorio es capaz de reclutar CD inmaduras hacia el mismo (Lambrecht, 2001). El estímulo in vivo de CD con agonistas del receptor NK1 promueve una respuesta inmune del tipo CD4+- Th1 y CD8+- Tc (Mathers, 2007). Las CD expresan receptores NK1 y son capaces de aumentar la expresión de este receptor ante estímulos como lipopolisacáridos bacterianos (Janelsins, 2009; O'Connor, 2004). Además, tanto la SP como sus análogos a concentraciones fisiológicas inducen un efecto antiapoptótico sobre estas CD, mediado por el receptor NK1 (Janelsins, 2009). Recientemente se ha descrito que tanto la SP como la HK-1 inducen la diferenciación de células T CD4+ memoria hacia células Th17, a través de la producción monocitaria de 105 IL-1β, IL-23 y TL1A. De esta manera, la SP y la HK-1, liberadas tanto por terminaciones nerviosas sensitivas como por células inflamatorias, estimularían la activación y producción de citoquinas de las células mieloides infiltrantes, lo que conduce a la generación de células Th17 y al inicio o mantenimiento de este tipo de respuesta inflamatoria (Cunin, 2011). Todo esto explica que, en situaciones en las que predomine la secreción de SP sobre otros NP anti-inflamatorios se favorezca la aparición de trastornos inflamatorios crónicos o autoinmunes. Cada vez hay más evidencia que apoya la existencia de una comunicación activa y bidireccional entre SNC y SI (Elenkov, 2000; Steinman, 2004). De esta forma se acepta que el SNC puede estimular o inhibir la actividad de la inmunidad tanto innata como adquirida y, a su vez, el SI a través de la liberación de citoquinas puede influenciar la actividad del propio SNC. Algunos péptidos con funciones de señalización neural o neuroendocrina han demostrado presentar una potente actividad antimicrobiana, por lo que el SNC podría utilizarlos como agentes anti-infecciosos al enviarlos de forma rápida y precisa a los lugares infectados. Los NP tienen propiedades antimicrobianas y se comportan como moléculas anfipáticas, lo cual les permite alcanzar altas concentraciones tanto en el espacio acuoso que hay entre la terminación nerviosa y su receptor como en la membrana de la célula a la que se dirigen (Brogden, 2005). En concreto, la SP posee actividad antimicrobiana in vitro frente a Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Enterococcus faecalis, Proteus vulgaris, Pseudomonas aeruginosa y Candida albicans (Kowalska, 2002). Así, el sistema SP-NK1 receptor se considera el principal mediador en la interacción recíproca existente entre el SI y el SNC (Hartung y Toyka, 1989; Maggi, 1997; Severini, 2002). Por ello, una secreción predominante de SP, de actividad proinflamatoria, sobre otros NP antiinflamatorios favorecerá la aparición de trastornos inflamatorios crónicos y 106 autoinmunes tanto en el SNC como en tejidos periféricos (Reinke, 2006). Esta capacidad del SNC para interaccionar con el SI y el sistema endocrino estableciendo una comunicación bidireccional con ambos basada en un lenguaje químico de neurotransmisores, hormonas y citoquinas ha llevado a hablar de la existencia de un eje neuro-inmuno-endocrino (Blalock, 2002). La prevención de los efectos proinflamatorios de la SP, utilizando antagonistas de los receptores NK1, puede tener potencial efecto terapéutico en enfermedades inflamatorias tales como asma, sarcoidosis, bronquitis crónica, enfermedad inflamatoria intestinal, cistitis, artritis reumatoide (Anichini, 1997), y de hecho en cualquier enfermedad inflamatoria (O’Connor, 2004). La SP y el receptor NK1 actúan como moduladores de la respuesta inmune en la infección por el VIH. Se han encontrado niveles de SP elevados en el plasma de pacientes infectados por el VIH (Douglas, 2008; Douglas, 2001). Los macrófagos y linfocitos de pacientes infectados por este virus expresan más SP, lo que llevó hace ya más de una década a plantear la hipótesis de que la interacción del VIH con la SP podría tener gran relevancia en la inmunopatogénesis de la infección por el VIH y SIDA (Ho, 2002). También se ha demostrado la implicación de esta TK en los trastornos neuropsiquiátricos presentes en individuos infectados por este virus (Ho y Douglas, 2004). El bloqueo de los receptores NK1 con aprepitant ejerce un efecto anti-VIH-1 en células mononucleares de sangre periférica, además de una sinergia con algunos inhibidores de las proteasas (Manak, 2010). Recientemente se ha comprobado que la SP aumenta la expresión del VIH-1 en neuroesferas de origen fetal infectadas por este virus (Schwartz, 2013). En los últimos años, se ha demostrado que el aprepitant inhibe la infección por VIH, (Wang, 2007). El aprepitant es el antagonista antirretroviral para VIH-1 más potente y esta actividad anti VIH es sinérgica con otros antirretrovirales por lo que hacen de él un excelente agente terapéutico. La asociación entre la depresión, la 107 ansiedad y el estrés con la progresión de la enfermedad del VIH sugiere que factores neurobiológicos y neurofisiológicos jugarían un papel importante en la modulación del VIH a través de las vías neuro-endocrino-inmunológicas. Así, el uso de antagonistas del receptor NK1 (aprepitant, por ejemplo) podría mejorar tanto el estrés emocional como la infección. El control neuropeptídico del SI se inicia desde la propia hematopoyesis medular. Las células madre hematopoyéticas (CMH) y mesenquimales de la médula ósea responden a diferentes estímulos durante la hematopoyesis. La médula ósea está inervada por fibras nerviosas peptidérgicas y simpáticas, habiéndose encontrado fibras con expresión de TK (Fras, 2003). Esta inervación es necesaria para la retención de CMH y otros progenitores en la propia médula ósea (Afan, 1997), y se ha comprobado que cualquier alteración neural de la hematopoyesis se traduce en una disfunción inmunológica (Kang, 2004). Así, la liberación de neurotransmisores, entre los que destacan la SP y NK-A, resultaría fundamental para mantener una homeostasis hematopoyética. Todo esto ha llevado a hablar de la existencia de un eje neuro-inmuno- hematopoyético (Rameshwar y Gascon, 1997). La figura 24 representa los diferentes niveles de la hematopoyesis en los que participan tanto la SP como la NKA: en cada punto en el que actúa la SP, la NK-A realiza una acción hematopoyética opuesta y una retroalimentación negativa (Rameshwar y Gascon, 1995). De esta manera, la SP y la NK-A tienen efectos opuestos en cuanto a la proliferación de las CMH, regulando la misma por un mecanismo autocrino y/o paracrino (Kang, 2004). Estudios recientes señalan el probable papel de la enzima conversora de angiotensina y un sistema reninaangiotensina propio de la médula ósea, a través del cual la angiotensina II actuaría de forma conjunta y coordinada con la SP y otros NP en la regulación de la hematopoyesis (Shen y Bernstein, 2011). 108 Figura 24. Resumen de las acciones hematopoyéticas de la SP y NK-A. (I) La SP tiene un efecto estimulatorio sobre los progenitores primitivos de la médula ósea. (II) La SP estimula la proliferación de los progenitores eritroides precoces (BFU-E) y tardíos (CFU-E). (III-VI) La SP tiene un efecto sinérgico con diversas citoquinas para inducir la proliferación de las colonias mixtas mieloide-eritroide. Las flechas indican estimulación hematopoyética por la SP (Kang, 2004). A nivel del sistema nervioso (SN), son numerosas las acciones en las que de manera fisiológica participa la SP. En la corteza cerebral, la SP es capaz de aumentar la actividad neuronal de manera intensa y duradera, actuando así como modulador neuronal (Hokfelt, 1982). También actúa sobre el eje hipotálamo-hipofisario produciendo un aumento en la liberación de hormonas (Baertschi, 1981). La localización clásica de liberación de la SP es la sustancia nigra, si bien sus acciones en esta localización son complejas y deben estar relacionadas con su interacción con otros neurotransmisores mediante fenómenos de cotransmisión, como el GABA y la dopamina (Jessell, 1978; Somogyi, 1982). La presencia de SP y su receptor NK1 en la amígdala sugiere su participación en el comportamiento emocional y la respuesta neuroquímica al estrés (De Felipe, 1984). Existen datos que asocian efectos neuroprotectores a la SP a dosis fisiológicas (Amadoro, 2007; Lallemend, 2003), así 109 como efectos neurotróficos en cuanto a la regeneración neuronal tras un daño agudo (Kim, 2015; Park, 2007).También se le atribuye participación en la formación del SNC durante la embriogénesis (De Felipe, 1995). Es importante mencionar su implicación en la “inflamación neurogénica”, en la que ha demostrado ser el principal neurotransmisor. Ésta consiste en un fenómeno de vasodilatación, aumento de la permeabilidad microvascular, dolor, extravasación de proteínas y edema tisular asociado a la liberación de neuropéptidos. Se cree que es consecuencia de un reflejo axoniano que tiene lugar en las terminaciones de las neuronas sensoriales como consecuencia de la estimulación eléctrica, mecánica y química de las fibras C de dichas terminaciones. Aunque en esta conexión se ha postulado la intervención de diferentes neurotransmisores (acetilcolina, noradrenalina, bradiquinina, histamina, serotonina o prostaglandinas), actualmente existe evidencia para afirmar que la SP es el principal mediador de este tipo de respuesta inflamatoria tanto a nivel del SNC como periférico (Lembeck y Holzer, 1979; Pernow, 1985). La SP, a nivel del endotelio vascular, produce vasodilatación, aumento de la permeabilidad capilar, extravasación plasmática y aumento de la expresión de las moléculas de adhesión ICAM-1, facilitando por medio de éstas la migración transendotelial e infiltración de los neutrófilos en el foco inflamatorio (Nakagawa, 1995; Quinlan, 1998). También presenta actividad neuroinmunorreguladora sobre la inmunidad celular y humoral, estimulando la proliferación de células T (Payan, 1983), diferenciación de células B, degranulación de mastocitos y diapédesis leucocitaria (Krause, 1992; McGillis, 1990). La SP liberada por los astrocitos activa diferentes moduladores transcripcionales, entre los que destaca el factor de transcripción NF-kappaB, con un papel muy importante en la regulación de la expresión de moléculas proinflamatorias como IL-8 y que además participa en la regulación de la apoptosis (Fiebich, 2000; Lieb, 110 1997). La SP también induce un aumento en la expresión de IL-2 por las células T (Calvo, 1992; Rameshwar, 1993), e IL-1, IL-6 y TNF-α por astrocitos (Gitter, 1994) y monocitos (Lotz, 1988). Además, la disponibilidad de modelos animales knockout para SP/NKA ha permitido comprobar que la expresión de estas TK en las neuronas sensoriales y células hematopoyéticas es necesaria para el desarrollo de inflamación en la vía aérea tras la formación del complejo antígeno-anticuerpo (Chavolla-Calderon, 2003). Por todo esto la inflamación neurogénica representa uno de los ejemplos más notables del papel que la SP desempeña en procesos fisiopatológicos (Severini, 2002). La SP se encuentra íntimamente relacionada con la epilepsia, ha sido implicada en la generación de status epiléptico (Zachrisson, 1998), y disminuye el umbral de inicio de la actividad convulsiva. Spantide II, un antagonista del receptor de la SP, es capaz de suprimir la actividad electroencefalográfica y prevenir el desarrollo de nuevas crisis en modelo experimental animal (Liu, 1999). Estos datos demuestran el papel proconvulsivante de la SP y de su gen TAC-1. Recientemente se ha demostrado un aumento en la expresión tanto de SP como del receptor NK1 en las neuronas y células gliales del hipocampo de enfermos con esclerosis mesial temporal (Blanco, 2012). La adición de un bloqueante del receptor NK1 al tratamiento actual con antiepilépticos como la lamotrigina, puede ser beneficioso en pacientes que sufren epilepsia refractaria (Kalinichev, 2010; Muñoz y Coveñas, 2014). Los pacientes afectos de esclerosis lateral amiotrófica presentan un patrón de células que expresan SP diferente en comparación con sujetos controles (Gillberg, 1982; Matsuishi, 1999). En la enfermedad de Parkinson, numerosos trabajos han establecido una relación entre el debut de la enfermedad con la degeneración de diferentes tipos neuronas que contienen SP en la sustancia nigra, ganglios basales y áreas circundantes (Cui, 2008; Gai, 1991; Mauborgne, Javoy- Agid, 1983). También se ha relacionado la 117 mitogénesis a través del receptor NK1 en una línea celular de astrocitoma humano. Demostraron que esta respuesta mitogénica estaba mediada por la incorporación de una [3H]timidina al ADN. Este proceso está relacionado con la estimulación de la actividad de la tirosincinasa y las cinasas extracelulares reguladas por señal (Erk1 y Erk2) (Luo, 1996). Pocos años después se demostró en un modelo animal, consistente en inyectar células tumorales de astrocitoma humano a ratones atímicos, que el complejo SP-NK1 receptor participa en desarrollo y crecimiento in vivo del tumor (Palma, 2000). Con estos hallazgos se abría un nuevo camino para el empleo de antagonistas de los receptores NK1 como potenciales tratamientos anticancerosos. Ya en la última década, numerosos trabajos, entre los que destacan los realizados por el grupo del Dr. Miguel Muñoz Sáez, han puesto de manifiesto que tanto la SP como su receptor NK1 se expresan en diferentes tipos de células tumorales. En todas las líneas tumorales estudiadas la SP induce la proliferación celular y la mitogénesis, habiéndose demostrado el efecto antitumoral derivado del bloqueo los receptores NK1 con diferentes antagonistas específicos de este receptor. Destacan los estudios llevados a cabo en líneas celulares de retinoblastoma (Muñoz, 2007; Muñoz, 2005), neuroblastoma y glioma (Muñoz, 2004; Muñoz, 2005), leucemia aguda linfoblástica (Muñoz, 2012), melanoma (Muñoz, 2004; Muñoz, 2010), adenocarcinoma gástrico y de colon (Rosso, 2008), cáncer de mama (Bigioni, 2005), laríngeo (Esteban, 2009; Muñoz, 2008) y en cáncer de pulmón (Muñoz, 2012). También se ha estudiado el papel de la SP y su receptor en el tejido tumoral de cáncer de páncreas (Friess, 2003), tumor queratoquístico odontogénico (Gonzalez Moles, 2008) y en el carcinoma oral de células escamosas (Brener, 2009). Por todo esto el bloqueo de los receptores NK1 se ha convertido en una diana terapéutica de creciente interés en los últimos años (Muñoz y Coveñas, 2010, 2011, 2012; Muñoz, 2012; Muñoz y Rosso, 2010; Muñoz, 2010, 2011; Rosso, 2012). 118 II. HIPÓTESIS Y OBJETIVO 119 1. HIPÓTESIS Las TK son una familia de péptidos muy ampliamente distribuída en animales vertebrados e invertebrados. En las últimas décadas numerosos trabajos han puesto de manifiesto la presencia de TK, fundamentalmente la SP y su receptor NK1, en diversos órganos y tejidos de nuestra anatomía. A partir de este descubrimiento se ha postulado su papel etiopatogénico en una gran variedad de fenómenos fisiológicos y patológicos, aumentando el conocimiento que tenemos de dichas condiciones y abriendo el camino al planteamiento de nuevas estrategias terapéuticas. Es conocido que la SP se encuentra involucrada en diversas patologías que afectan al SNC, como infecciones, depresión, epilepsia, trastornos del sueño…, entre otros. Se conoce también, que la SP fisiopatológicamente participa de manera principal en procesos de inflamación, inmunidad, neoplasia, embriogénesis, etc. Actualmente se desconocen los valores “normales”, “basales” o “fisiológicos” de SP en LCR de RN sin patología del SNC, tanto a término como prematuros. Este conocimiento nos aportaría unos valores de referencia fundamentales que nos abriría camino a iniciar el estudio sobre la desviación en dichos valores que encontraríamos en caso de patología, principalmente meningitis/encefalitis, hemorragia, asfixia perinatal, tumores, malformaciones, etc. La disponibilidad de antagonistas selectivos de los receptor NK1, de tipo no peptídico, abre la posibilidad de bloquear los efectos de la SP en la práctica clínica, si se llegara a probar que ésta desempeña un papel relevante en los procesos referidos en el neonato. Actualmente sólo existe una aproximación a dichos valores “normales”, estudiados en muy escasos pacientes y mediante la técnica de RIA. Este “vacío” es debido principalmente al hándicap que supone para la obtención de las muestras la 120 realización de una punción lumbar, técnica invasiva y no exenta de potenciales riesgos, en RN que se suponen “sanos”. Nuestro objetivo seria determinar los valores normales de SP en RN mediante la técnica de ELISA y en una muestra representativa que permita la obtención de valores fiables definitivos a partir de los cuales basar futuras investigaciones. Contamos con la enorme ventaja inicial para la obtención de las muestras de realizar el estudio en un centro de tercer nivel, con la disponibilidad de un elevado número de pacientes que nos permita trabajar con el número de muestras adecuado para nuestros fines. Para salvar el mencionado hándicap, el estudio se ha realizado sobre RN con factores de riesgo para que la indicación de una PL sea éticamente factible, en los que se descarte patología del SNC. Así, partiendo de: 1º - La SP es una molécula con características de neurotransmisor, neuromodulador y hormona. 2º - La SP se distribuye ampliamente por todo el organismo. 3º - La SP esta ampliamente distribuída en el SNC. 4º - La SP es el mediador principal de la inflamación neurogénica. Consideramos las siguientes hipótesis: 1º- La SP a través de su receptor NK1 interviene en el desarrollo y fisiología normal del sistema nervioso. 2º- El sistema SP/receptor NK1 está implicado en del desarrollo del SNC y en diferentes patologías como las causadas por infección, hipoxia-isquemia, hemorragia o inflamación. 3º- Los niveles de SP en LCR de RN podrían variar en función de la edad gestacional, edad cronológica y diferentes estados patológicos. Por tanto y en base a lo anteriormente expuesto, pensamos que los valores de SP en LCR de RN estarían más elevados en las patologías que afectan al SNC como las que 121 cursan con inflamación; los valores basales con los que cotejarlos quedarían así establecidos con este estudio, constituyendo la base de futuras investigaciones que interrelacionen patología del SNC y SP en el RN. 2. OBJETIVO Determinar los valores normales o basales de SP en LCR en RN. 122 III. MATERIAL Y MÉTODO 123 1. MATERIAL. 1.1. MATERIAL FUNGIBLE. 1. Pipetas serológicas estériles de 1 ml, 5 ml y 10 ml (Becton Dickinson®, Francia). 2. Puntas de pipetas estériles de 1-10 μl y 20-200 μl (Nunc Brad Products®, Dinamarca). 3. Pipetas Pasteur estériles desechables de 3 ml (Nunc Brad Products®, Dinamarca). 4. Tubos eppendorf de 1,8 ml (Daslab Nirco®). 5. O-Phenantroline (Sigmas Aldrich®) 6. Kits para determinación de SP para Enzimoinmunoanálisis (Cayman®). 7. Agua ultra pura de 1 L (Cayman®). 8. Film transparente (Parafilm® M). 1.2. MATERIAL INVENTARIABLE. 1. Soporte de acero inoxidable (Air Liquide®). 2. Frigorífico (Superser Ecologic®). 3. Congelador de - 80 ºC (New Brunswick Scientific Co., Inc. USA). 4. Vortex (Gene 2, Scientific industries ®, U.S.A.). 5. Cronómetro digital (Digital timer®, China). 6. Micropipetas de 10, 100 μl y 1 ml (Pipetman, Gilson®). 7. Lavador automático de microplacas de 96 pocillos (Atlantis 2, ASYS Hitech Biochrom Ltd). 8. Lector de placa capaz de medir absorbancia de 405-420 nm TECAN (Spectra classic, Barcelona, España). 9. Cilindro graduado de 500 ml para preparar el buffer de lavado (Cosela S.L). 10. Placa horizontal orbital de placas Orbit 300 (Labnet®). 124 11. Pipeta multicanal de 200 μl (Durviz®). 12. Centrifugadora refrigerada para eppendorf (5415R eppendorf®). 13. Programa estadístico SSPS versión 19.0. 1.3. MATERIAL BIOLÓGICO. Recogida de las muestras. Las muestras de LCR fueron obtenidas de forma aleatoria entre pacientes menores de 30 días de vida ingresados en la Unidad de Gestión Clínica de Neonatología del Hospital Universitario Virgen del Rocío que precisaran de la realización de una PL por indicación médica. La PL es un procedimiento obligado según diversos protocolos en RN. Así, su realización está indicada cuando existe fiebre, clínica de sepsis, asfixia perinatal, riesgo de transmisión vertical de determinados gérmenes, convulsiones u otro tipo de clínica neurológica, sospecha de enfermedad metabólica, etc. En esta ocasión, la PL se realizó según indicación clínica, como es lo habitual. El tamaño muestral necesario se calculó a partir del trabajo publicado por Tam et al (1985), a través de la fórmula para determinar la media de una variable (valor de SP en LCR) en una población asumiendo distribución normal, con una seguridad (1- alfa)=95% y precisión del 5%. Para la citada precisión del 5%, obtenemos que necesitamos un n = 31. Se recogieron muestras de LCR de todos los RN que cumplieron los criterios de inclusión en el estudio mediante el procedimiento habitual, a saber: aplicación de parche de crema EMLA como anestésico local en zona lumbar, unos 15 minutos antes de la 125 realización de la técnica; paciente en decúbito lateral izquierdo, ayudante flexionando al RN en posición fetal ligeramente forzada; asepsia de la zona con clorhexidina acuosa 0,2%, en movimiento espiral de dentro a fuera; aguja para PL tipo Quincke tamaño 22 G para RN > 2500 g y 25 G para < 2500 g; buscando el punto de entrada palpando el espacio interespinoso que queda por debajo de la línea que une las dos crestas ilíacas, que se correspondería con el cuerpo vertebral L4 o el espacio intervertebral L4-L5, puncionando en el primer o segundo espacio intervertebral inmediatamente inferior a esta línea, que correspondería con los espacios L4-L5 o L5-S1, ambos inferiores a la terminación de la médula espinal (en el nivel L3 aproximadamente); se introduce con ángulo de unos 15º en dirección al ombligo y bisel hacia arriba; al notar la resistencia por el paso a través del ligamento amarillo, se retira la guía y se deja gotear (nunca aspirar) hasta obtención de 1 ml de LCR que se introduce en criovial Eppendorf (más 0,5 + 0,5 ml que se introducen en tubos estériles transparentes para estudios rutinarios); colocación de nuevo de la guía y retirada de la aguja; aplicación de apósito estéril. Las muestras se procesaron en los siguientes 30 minutos. Al criovial Eppendorf se añadió O-Phenantroline, 20 mcl/ml. A continuación se centrifugaron a 4ºC durante 15 minutos y 1500 rpm. Finalmente, alícuotas de 200 mcl del sobrenadante se congelaron a -80º hasta el momento del análisis. Se recolectaron un total de 116 muestras, y tras aplicar estrictamente los criterios de inclusión y exclusión que se citan a continuación, realizamos el estudio sobre 63 muestras, número bastante superior a las 31 muestras necesarias calculadas. Además, todos los cálculos se han realizado por duplicado sobre 2 muestras de cada individuo, lo que nos ofrecerá mayor fiabilidad del método. Por lo tanto, realmente se han analizado 126 muestras de LCR. 126 Criterios de inclusión: 1. RN ingresados en la UGC Neonatología del HUVR que se vean sometidos a la realización de PL por INDICACIÓN MÉDICA. 2. Consentimiento informado firmado por los progenitores. 3. A la extracción, LCR macroscópicamente normal. 4. Citoquímica LCR normal. 5. Tinción de Gram negativa. 6. Cultivo LCR negativo. 7. Edad inferior a 30 días. Los valores citoquímicos de LCR serán considerados normales según lo publicado por Sarff et al (The Journal of Pediatrics 1976) en relación a RNT, y por Rodríguez et al (The Journal of Pediatrics 1990) para los RNPT. Criterios de exclusión: 1. No obtención del consentimiento por parte de los progenitores. 2. LCR macroscópicamente turbio o purulento a la extracción. 3. Citoquímica LCR alterada. 4. Tinción de Gram positiva. 5. Cultivo LCR positivo. 6. Edad superior a 30 días. 229 Robinson P, Garza A, Moore J, Eckols TK, Parti S, Balaji V, Vallejo J, Tweardy DJ. Substance P is required for the pathogenesis of EMCV infection in mice. Int J Clin Exp Med 2009;2:76–86. Rodriguez PL, Jiang S, Fu Y, Avraham S, Avraham HK. The proinflammatory peptide substance P promotes blood-brain barrier breaching by breast cancer cells through changes in microvascular endothelial cell tight junctions. 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