Descripción de la microbiota fúngica presente en el tracto respiratorio de sujetos con enfermedad pulmonar obstructiva crónica

UNIVERSIDAD DE SEVILLA FACULTAD DE MEDICINA Departamento de Medicina DESCRIPCIÓN DE LA MICROBIOTA FÚNGICA PRESENTE EN EL TRACTO RESPIRATORIO DE SUJETOS CON ENFERMEDAD PULMONAR OBSTRUCTIVA CRÓNICA. Memoria presentada por Elena Campano Cuevas para optar al grado de Doctor. Sevilla, Septiembre de 2016. 2 3 DESCRIPCIÓN DE LA MICROBIOTA FÚNGICA PRESENTE EN EL TRACTO RESPIRATORIO DE SUJETOS CON ENFERMEDAD PULMONAR OBSTRUCTIVA CRÓNICA. Memoria presentada por Elena Campano Cuevas para optar al grado de Doctor Directores Departamento de Medicina FACULTAD DE MEDICINA UNIVERSIDAD DE SEVILLA Enrique Calderón Sandubete Profesor Asociado Departamento de Medicina Carmen de la Horra Padilla Doctora en Farmacia CIBER Epidemiología y Salud Pública 4 A mis padres. 5 AGRADECIMIENTOS Mi más sincero agradecimiento a todas aquellas personas que han colaborado en la elaboración de este trabajo: A los Doctores Enrique Calderón y Javier Medrano, por depositar su confianza en mí y brindarme la oportunidad de realizar esta tesis. Agradezco a mi amiga y Directora de Tesis, la Dra. Carmen de la Horra, la lectura exhaustiva de este trabajo, las correcciones y sugerencias que me sirvieron y aportaron mucho. Gracias por tu paciencia, por todo lo que me has enseñado, por tu disponibilidad dentro y fuera del trabajo, por el esfuerzo que tanto tú como tu familia realizasteis para que yo pudiera hacer esta tesis. A mis amigos y compañeros de laboratorio, Vicente Friaza y Rubén Morilla, por el inmejorable ambiente de trabajo que creamos juntos y por todo lo que me enseñaron y aportaron dentro y fuera del laboratorio. A mi familia, mis padres, mi hermano y Yey por su constante preocupación y apoyo incondicional. Yo no tenía tanta fe en mí, así que supongo que he vivido un poco de la vuestra durante estos años. A mis amigas Lucía, Macarena, Tamara, Yeye y Coco por celebrar conmigo cada paso y saber darme su visión de las cosas que, aunque diferente a la mía, me complementa sin duda. Gracias por las charlas en la cocina, las cañas improvisadas y las cenas de los viernes. Y gracias a los que se fueron demasiado pronto pero siguen estando en mis pensamientos… 6 7 DESCRIPCIÓN DE LA MICROBIOTA FÚNGICA PRESENTE EN EL TRACTO RESPIRATORIO DE SUJETOS CON ENFERMEDAD PULMONAR OBSTRUCTIVA CRÓNICA. 8 ÍNDICE 9 INTRODUCCIÓN 12 1. Enfermedad Pulmonar Obstructiva Crónica. 13 1.1. Definición, diagnóstico e importancia. 13 1.2. Fisiopatología 15 1.2.1. Desequilibrio proteasa-antiproteasa. 16 1.2.2. Estrés Oxidativo. 16 1.2.3. Apoptosis y reparación ineficaz. 18 1.2.4. Inflamación y Procesos Infecciosos. 19 1.2.5. Exacerbaciones. 24 1.3. Tratamiento de la EPOC. 25 2. Microbiota del tracto respiratorio de sujetos con EPOC. 27 2.1 Bacterias y EPOC. 27 2.2 Hongos y EPOC. 29 2.3 Relación colonización-respuesta inmune. 30 2.4 Alteraciones en el parénquima pulmonar inducidas por hongos. 32 2.5. Técnicas de identificación de microorganismos. 35 2.5.1.Técnicas de tinción. 35 2.5.2. Cultivos convencionales. 35 2.5.3. Técnicas de Inmunoensayo. 36 2.5.4. Técnicas analíticas. 37 2.5.5. Técnicas Moleculares. 37 JUSTIFICACIÓN 41 HIPÓTESIS Y OBJETIVOS 42 MATERIAL Y MÉTODOS 43 1. Diseño. 44 2. Población en estudio. 44 2.1. Criterios de inclusión. 44 2.2. Criterios de exclusión. 44 2.3. Parámetros evaluados. 45 2.4. Variables en estudio. 45 3. Métodos. 46 3.1. Obtención y procesamiento inicial de las muestras. 46 3.2. Protocolo de extracción de ADN. 46 3.2.1 Digestión de las muestras. 46 3.2.2 Extracción de ADN partir de muestras de LOF. 47 3.2.3 Extracción de ADN partir de muestras de esputo. 47 3.3. Técnicas de amplificación del ADN. 47 3.4. Identificación molecular de especies fúngicas. 50 3.4.1. Técnica de amplificación de la región ITS. 50 3.4.2. Técnica de Clonación. 51 3.4.3. Técnica de Secuenciación. 56 16 estrés oxidativo, la inflamación sistémica y/o la apoptosis y reparación ineficaz, entre otros aún sin conocer. 1.2.1. Desequilibrio proteasa-antiproteasa. Esta hipótesis defiende que la destrucción del tejido pulmonar y el enfisema se deben a un desequilibrio entre la cantidad de proteasas y sus inhibidores. Por un lado, se ha relacionado el enfisema con una deficiencia de α1-antitripsina (α1AT), inhibidor primario de la elastasa de los neutrófilos. La elastasa degrada la elastina, produciendo así una pérdida de la elasticidad del parénquima pulmonar. Un déficit de antiproteasa, por ejemplo como consecuencia de una mutación genética, permite que la elastasa actúe relativamente sin oposición, cambiando así la balanza a favor de elastolisis. De esta forma, la α1AT mutada promueve la inflamación (Lomas et al., 1993; Shapiro et al., 2005). Por otro lado, se ha propuesto que el humo del tabaco podría ser responsable del desequilibrio y del consecuente desarrollo de enfisema en sujetos que no presentan dicho déficit genético. En este sentido, existe cierta controversia entre estudios que demuestran una reducción en la funcionalidad de las antiproteasas en fumadores, si se compara con la de no-fumadores (Gadek et al., 1979) y otros que afirman que esta deficiencia funcional no es debida a la inactivación por oxidantes en el humo del cigarrillo, puesto que la α1-antiproteasa del pulmón de sujetos fumadores es, al menos, tan eficiente en su actividad como inhibidora de elastasa que la de no-fumadores. Se cree, pues, que la exposición crónica al humo del tabaco produce una acumulación de células inflamatorias en las vías aéreas, especialmente macrófagos y neutrófilos, capaces de liberar proteasas y desbordar la capacidad neutralizadora de las antiproteasas, causando el desarrollo de enfisema (Stone et al., 1983). 1.2.2. Estrés Oxidativo. En el organismo existe un equilibrio entre la toxicidad de los oxidantes y la función protectora que ejercen los antioxidantes de los sistemas de defensa tanto intra como extracelulares. La variación del equilibrio oxidante/antioxidante a favor de los oxidantes se conoce como estrés oxidativo (Sies, 1991). El humo del tabaco tiene altas 17 concentraciones de radicales libres y otros oxidantes (Church et al., 1985; Pryor et al., 1983). Además, en el pulmón también pueden aparecer especies reactivas del oxígeno como consecuencia de procesos celulares normales como la respiración celular (Phaniendra et al., 2015) o como parte de la respuesta defensiva frente a agentes infecciosos (Kratzer et al., 2012). Se ha observado un aumento considerable del estrés oxidativo en fumadores y en pacientes con EPOC (MacNee, 2001). El estrés oxidativo causado por aumento de los niveles de especies reactivas del oxígeno y del nitrógeno, bien sean de origen endógeno o exógeno, parece estar implicado en varios procesos patogénicos asociados a la EPOC. Además de las proteínas y el ADN, un sitio importante de ataque de los radicales libres son los ácidos grasos poliinsaturados de las membranas celulares, produciendo en ellas la peroxidación de lípidos y la consecuente rotura de la bicapa constitutiva de las mismas (Phaniendra et al., 2015). En este sentido, en fumadores sanos se ha observado un incremento sérico significativo de F2-isoprostano, marcador de la peroxidación lipídica, en comparación con sujetos no fumadores (Morrow et al, 1995). Por otra parte, se ha demostrado un aumento de la peroxidación lipídica en el tejido pulmonar de pacientes con EPOC en comparación con sujetos que no tienen desarrollada la enfermedad (Rahman et al., 2002). En ese estudio, el nivel de peroxidación de los lípidos en el epitelio alveolar y endotelio de las vías aéreas se correlacionaba inversamente con el VEF1. En este sentido, otro estudio in vitro confirma que el tabaco, fundamentalmente en su fase volátil donde hay mayor cantidad de oxidantes, induce apoptosis de líneas celulares alveolares tipo II, incluso a baja concentración de oxidantes, y necrosis a altas concentraciones. En este ensayo se midió un aumento de la actividad oxidativa intracelular de los alveolos expuestos al humo. Aún así, los efectos citotóxicos se vieron atenuados cuando las células fueron expuestas a los antioxidantes correspondientes. Puesto que el fluido de revestimiento alveolar tiene actividad antioxidante, éste podría prevenir el efecto citotóxico del tabaco en individuos sanos pero no en aquellos que presenten una enfermedad respiratoria inflamatoria ni en los fumadores crónicos debido a que en ellos esta actividad está disminuida (Hoshino et al., 2001). 18 Además, de forma indirecta el humo del tabaco provocaría también un incremento en la cantidad de especies oxidantes en los pulmones: los fumadores presentan un aumento del número de neutrófilos y macrófagos en el espacio alveolar y una mayor liberación de radicales del oxígeno por parte de estas células, si se compara con no fumadores (Martin et al., 1985; Kilburn et al., 1975). Por otro lado, las frecuentes exacerbaciones que experimentan los pacientes con EPOC, en gran parte secundarias a infecciones, pueden contribuir al reclutamiento y la activación de células fagocíticas al pulmón y aumentar la carga oxidante (Cosío, 2007). En contraposición, el fluido del revestimiento del tracto respiratorio cuenta con antioxidantes que, en teoría, nivelan la balanza neutralizando la acción oxidativa que tiene lugar en el pulmón de manera fisiológica. Algunas de las principales macromoléculas antioxidantes son superóxido dismutasa, catalasa y glutatión reductasa (Cantin et al, 1987; Cantin et al, 1990). Sin embargo, parece que el aumento en la actividad de células inflamatorias en las vías aéreas inferiores sumado a la carga oxidante que procede de la contaminación ambiental y, sobretodo, del humo del tabaco, sobrepasa en la capacidad antioxidante del pulmón, produciendo así una elevación del estrés oxidativo en estos sujetos. 1.2.3. Apoptosis y reparación ineficaz. La apoptosis es un mecanismo bien regulado de muerte celular. Esta muerte celular programada permite la eliminación de células dañadas. Hay datos que demuestran un aumento de la apoptosis del epitelio alveolar y células endoteliales en los pulmones de pacientes con EPOC en comparación con fumadores y sujetos sanos. Dado que esto no es contrarrestado por un aumento de la proliferación de estas células estructurales, el resultado neto es la destrucción del tejido pulmonar y el desarrollo de enfisema (Cosío, 2007). El epitelio alveolar a menudo resulta dañado por una variedad de toxinas inhaladas y/o por el humo del tabaco, y en respuesta a esta lesión se inicia una reparación del tejido por parte de las células del epitelio alveolar (Rennard, 1999). Este aumento en la proliferación de las células de la pared alveolar podría frenar y/o alterar su correcta diferenciación hacia su fenotipo funcional y, por consiguiente, daría lugar a un tejido con estructura y función anómala (Yokohori et al., 2004). 19 Por otro lado, la continúa lesión y regeneración epitelial que tiene lugar en las enfermedades pulmonares crónicas promueve ciclos celulares repetidos en las células del epitelio que pueden acortar la longitud de los telómeros, con lo que potencialmente inducirían la senescencia replicativa (Tsuji et al., 2004). 1.2.4. Inflamación y Procesos Infecciosos. El origen de la inflamación asociada a la EPOC aún es desconocido pero el hábito tabáquico se ha considerado como el punto de partida en la patogénesis de la enfermedad. En la mucosa bronquial de los pacientes con EPOC predominan los linfocitos T, principalmente CD8+, y los macrófagos; y se cree que la presencia de estos linfocitos T podría diferenciar entre los fumadores que desarrollan EPOC y los que no la desarrollan (Saetta et al., 1998). Sin embargo, el hecho de dejar de fumar no revierte el proceso inflamatorio iniciado, lo que sugiere que existen otros factores que mantienen o incluso incrementan esta respuesta inflamatoria de forma crónica. En los sujetos con EPOC, el árbol traqueobronquial suele estar colonizado por microorganismos considerados como posibles patógenos respiratorios, predominantemente H. influenzae no tipificable, S. pneumoniae y Moraxella (Branhamella) catarrhalis (Murphy et al., 2004; Laurenzi et al. 1961; Haas et al., 1977). Estos microorganismos podrían actuar como estímulo para desencadenar una respuesta inflamatoria en el sujeto colonizado y, en el caso de pacientes EPOC, contribuir a la progresión de la enfermedad (Sethi et al., 2006). El fenómeno inflamatorio asociado a la entrada de sustancias tóxicas en las vías aéreas provocaría, entonces, una respuesta defensiva en el huésped que engloba desde la activación de la respuesta inmune hasta la estimulación de la afluencia de células al pulmón, así como la inducción de la diferenciación y la supervivencia de las células inflamatorias o la proliferación y/o activación de las células estructurales, contribuyendo de esta manera al remodelado que tiene lugar en la EPOC. Estudios histológicos muestran que el foco de la inflamación se localiza en el parénquima pulmonar y los bronquiolos. Éstos están obstruidos por la presencia de fibrosis e infiltración por macrófagos y linfocitos, predominando los linfocitos T CD8+ (citotóxicos) (Barnes, 2000). Por tanto, la 20 inflamación es un componente clave para la progresión de la EPOC e involucra a diferentes tipos de células y una gran variedad de mediadores proinflamatorios. Por tanto, la infección bacteriana podría condicionar la etiología, la patogénesis y el curso clínico de la EPOC de varias formas: (a) la infección del tracto respiratorio inferior durante la infancia podría predisponer al sujeto a sufrir la enfermedad en la edad adulta; (b) las bacterias causan exacerbaciones agudas que pueden contribuir significativamente a la morbilidad y la mortalidad de la EPOC, ya que estas infecciones recurrentes podrían acelerar el daño pulmonar asociado a la EPOC; y (c) la colonización/infección crónica de los tejidos respiratorios podría inducir una respuesta inflamatoria crónica produciendo un daño pulmonar progresivo (la hipótesis del círculo vicioso) (Murphy et al., 1992). Figura 1. Hipótesis del círculo vicioso (Sethi, 2000). La hipótesis del círculo vicioso pretende explicar cómo la colonización bacteriana crónica de las vías respiratorias inferiores puede perpetuar la inflamación y contribuir a la progresión de esta enfermedad. Como apoyo sustancial a esta hipótesis se cuenta con la evidencia de que los patógenos bacterianos logran establecerse y persistir en el tracto respiratorio inferior gracias al deficiente aclaramiento mucociliar provocado por el consumo de tabaco. A su vez, la evidencia experimental in vitro demuestra que estos patógenos y sus productos pueden perpetuar dicho fallo en el aclaramiento induciendo la secreción de moco, alterando la actividad mucociliar y provocando daños en el epitelio pulmonar (Sethi, 2000). Todo ello originaría un efecto perjudicial en el pulmón, afectando a su capacidad para eliminar infecciones y estimulando una respuesta 21 inflamatoria crónica que acelera la disfunción pulmonar con o sin la presencia del tabaco. Por otro lado, se ha observado en biopsias de pulmón de pacientes con EPOC en los diferentes estadíos de la GOLD que la progresión de la enfermedad está íntimamente relacionada con un mayor volumen de tejido en las paredes bronquiales y con una acumulación de exudados inflamatorios en la luz de las vías aéreas pequeñas. Conforme avanza la enfermedad, existe una mayor afluencia de neutrófilos, macrófagos, linfocitos T CD8+ y CD4+, células B y mayor cantidad de folículos linfoides en las vías respiratorias, lo que confirma la participación de la inmunidad innata y adaptativa en la patogenia de la EPOC (Hogg et al., 2004). Respuesta Inmune Innata. El sistema inmune innato es el primero en responder a la presencia de agentes patógenos y/o nocivos, y lo hace de una forma genérica e inespecífica. Esta respuesta primaria se realiza gracias a los receptores de reconocimiento de patrones (RRP) que identifican patrones moleculares asociados a patógenos (PMAP) que están presentes en gran variedad de microorganismos (Becker et al., 2015). Además, el daño que ocasiona el humo del tabaco en el epitelio pulmonar desestabilizando la matriz extracelular produce la liberación de productos de ruptura que parece que también pueden actuar como ligando de algunos de estos receptores (Akira et al., 2001). Se ha demostrado que los RRP se expresan en células del sistema inmune innato, es decir, en neutrófilos, macrófagos y células dendríticas (Becker et al., 2015). Los niveles de estas células se ven aumentados en el pulmón de sujetos con EPOC (Hogg et al, 2004). Tras el reconocimiento de los PMAP por parte de los RRP, dichas células de la inmunidad innata desencadenarían una respuesta promoviendo la producción de mediadores inflamatorios como interleuquinas (IL), interferones (IFN) y 22 el factor de necrosis tumoral alfa (TNF-α) (Kawai et al., 2004; Becker et al., 2015). El patrón de citoquinas parece responder, en cada caso, al tipo de microorganismo en cuestión (Sahaza et al., 2015). En este sentido se han publicado estudios que relacionan la presencia de microorganismos (bacterias y hongos) con la respuesta inmunitaria en el ser humano. En un trabajo con cultivos de células humanas de epitelio bronquial se observó un aumento en la liberación de citoquinas proinflamatorias, entre ellas IL-6, IL-8 y TNF-α, causada por la presencia de endotoxinas de H. influenzae (Khair et al., 1994). Más recientemente se ha demostrado también, aunque esta vez in vivo, un aumento de los niveles séricos de IL-6, IL-8 y TNF-α, que se relaciona con la presencia del hongo Pneumocystis jirovecii en el pulmón de pacientes con EPOC (Calderón et al., 2007). Por otro lado, se ha demostrado un aumento de los niveles plasmáticos de la enzima quitotriosidasa en enfermedades como el Gaucher (Hollak et al., 1994), caracterizada por una activación crónica de macrófagos. En este sentido, se ha detectado una elevación en la actividad de esta enzima en fumadores habituales (Seibold et al., 2008) y aún más en aquellos que padecen EPOC (Létuvé et al., 2010). Esta enzima ha sido considerada como parte de la inmunidad innata en el ser humano: una vez secretada por los macrófagos, cataliza la hidrólisis de quitina y, por tanto, actúa en la defensa del huésped frente a patógenos que contienen este carbohidrato en su pared celular, como los hongos (Renkema et al., 1995; van Eijk et al., 2005). Sin embargo, y en contraposición a su efecto protector frente a estos microorganismos, se ha propuesto que esta enzima podría jugar un papel en la patogénesis de la EPOC modificando los procesos de remodelación tisular. De hecho, los niveles de quitotriosidasa en LBA se correlacionan con la obstrucción al flujo aéreo y con el enfisema (Cho et al., 2015). Además de los macrófagos, los neutrófilos también se encuentran aumentados en los pacientes con EPOC (Keatings et al., 1996) y pueden actuar frente al patógeno por mecanismos oxidativos, mediante la producción de enzimas oxidantes como NADPH oxidasa (igual que monocitos y macrófagos) y mieloperoxidasa o también mediante un mecanismo no oxidante con la liberación de enzimas antimicrobianas como lisozimas, lactoferrinas, elastasas, defensinas, gelatinasa y catepsina G (Becker et al., 2015). 23 La consecuencia global sería, por tanto, una respuesta inflamatoria que, por un lado, descargaría una cantidad excesiva de citoquinas y quimiocinas y, por otro, liberaría proteasas que destruiría el tejido pulmonar. Finalmente, las células de la defensa innata, una vez son activadas por el patógeno, migran a los nódulos linfáticos para activar a los linfocitos T, constituyendo la interfase entre la respuesta innata y la adaptativa (Duez et al., 2006). Tal y como se observa en la figura 2, la inmunidad innata es la primera línea de defensa frente a patógenos. Las células dendríticas y los macrófagos reconocen a los patógenos mediante los RRP (principalmente los receptores Toll-like), los fagocitan y promueven la expresión de citoquinas y la presentación de antígenos a través del complejo mayor de histocompatibilidad. Este fenómeno produce la activación y diferenciación de las células T a linfocitos Th1 o Th2, regulando así la respuesta inmune adaptativa (Arancibia et al., 2007). Figura 2. Ilustración donde se resume la interfase entre la respuesta innata y la adaptativa (Arancibia et al., 2007). Respuesta Inmune Adaptativa La inmunidad adquirida o adaptativa comienza con la identificación de péptidos específicos de patógenos presentados por las células presentadoras de antígenos. Entre 24 las células que procesan y presentan el antígeno unido a las moléculas del complejo mayor de histocompatibilidad de clase II, figuran los monocitos-macrófagos, las células dendríticas y las células B. Posteriormente, se desencadena una respuesta inmunitaria celular, mediada por linfocitos T, y una respuesta humoral, mediada por linfocitos B (Xu et al., 2004). La presentación de antígenos en los nódulos linfáticos promueve la maduración y diferenciación de los linfocitos T a Linfocitos T CD8+ citotóxicos. Por otro lado, los RRP inducen la liberación de IL que, a su vez, promueven la diferenciación de las células T a linfocitos T helper (CD4+). Los linfocitos T helper-1 (promovidos por la IL- 12) producen IL-2, IFN-γ y TNF-α, y controlan reacciones de inmunidad celular útiles frente a infecciones por microorganismos de crecimiento intracelular. Los linfocitos T helper-2 (promovidos por la IL-4) producen IL-4, IL-5 e IL-6, y colaboran en las reacciones de inmunidad humoral, fundamentales para neutralizar toxinas e infecciones por gérmenes de crecimiento extracelular (Arancibia et al., 2007; Xu et al., 2004; Redecke et al., 2004). Estos linfocitos migran al lugar de la lesión y atacan a las células dañadas (en el caso de la EPOC a las células de barrera del epitelio pulmonar, que son las que están expresando estos antígenos en su superficie). Dicho ataque se realiza por la liberación, por parte de los linfocitos T CD8+, de perforinas y granzimas que causan la muerte celular y la apoptosis que induce el enfisema (Barnes et al., 2004). 1. 2. 5. Exacerbaciones. El curso clínico de la EPOC puede presentar episodios recurrentes caracterizados por un aumento agudo-subagudo de inflamación tanto sistémica como localizada en las vías respiratorias, que conlleva un incremento de los síntomas respiratorios. Estos episodios se conocen como exacerbaciones, tienen un impacto negativo en la calidad de vida del paciente y contribuyen a la disminución acelerada de la función pulmonar que caracteriza a la EPOC (Donaldson et al., 2002; Perera et al., 2007). Las exacerbaciones pueden ser producidas por microorganismos, principalmente bacterias (Sethi et al., 2008a). Sin embargo, también han sido asociadas con la detección de virus (Rohde et al., 2003). Además, en un estudio llevado a cabo por nuestro grupo, donde se incluyeron pacientes no inmunodeprimidos con EPOC se 25 observaron niveles de linfocitos totales y CD4+ en sangre periférica más elevados en los pacientes colonizados por P. jirovecii, en comparación con los no colonizados, lo cual podría estar en relación con la progresión de la enfermedad y las exacerbaciones de la misma (Varela et al., 2003). 1.3. Tratamiento de la EPOC. La EPOC es una entidad irreversible, los fármacos que se usan en su tratamiento tienen como fin prevenir y controlar los síntomas a la vez que reducen la frecuencia y gravedad de las exacerbaciones y mejoran la calidad de vida de los pacientes y la tolerancia al ejercicio. - Abandono del hábito tabáquico El cese del hábito tabaquito es fundamental para disminuir la velocidad de progresión de la enfermedad. Parece que cuando se deja de fumar, los pacientes con EPOC leve-moderada tienen un declive del VEF1 menor que los pacientes que no abandonan el hábito (Scanlon et al., 2000). Aunque se ha observado que los sujetos con EPOC que dejan de fumar no experimentan una reducción en el grado de inflamación pulmonar, los autores achacan esta inflamación persistente a la reparación del tejido dañado (Willemse et al., 2005). Por tanto, y al demostrarse una mejora transitoria en VEF1 de pacientes EPOC que dejan de fumar, se ha propuesto el uso concomitante de otras terapias durante el abandono del tabaco para así amplificar estos efectos a nivel de la función pulmonar (Dhariwal et al., 2014). - Fomento del ejercicio físico. La rehabilitación pulmonar se realiza en pacientes con EPOC para reducir los síntomas, mejorar la función pulmonar y estabilizar o revertir las manifestaciones sistémicas de la enfermedad (Nici et al., 2006). El entrenamiento muscular inspiratorio consigue mejorar la fuerza y resistencia muscular, disminuir la disnea y, en definitiva, mejorar la calidad de vida de los pacientes (Gosselink et al, 2011). Parece que los sujetos EPOC más activos físicamente tienen menor riesgo de hospitalización (Seidel et 32 Asimismo, se ha determinado que las células dendríticas humanas también pueden ser estimuladas para producir ciertas citoquinas en función de la bacteria con la que entren en contacto. Así, bacterias de las familias Haemophilus spp. y Moraxella spp., consideradas como patógenos potenciales asociados a asma y EPOC, inducen una expresión de las citoquinas IL-23, IL-12p70 e IL-10 mucho más intensa que las bacterias consideradas como comensales. También se he descrito en el mismo trabajo que la co-exposición a Prevotella spp., identificado como organismo comensal, reducía la respuesta de IL-12p70 inducida en las células dendríticas en respuesta a H. influenzae (Larsen et al., 2012). Por otro lado, aunque la presencia de los hongos en el pulmón de los EPOC ha sido menos estudiada que la de las bacterias, sí existen algunos trabajos que relacionan una alteración en la respuesta inmune del huésped con la colonización fúngica. En el caso de Pneumocystis, un hongo atípico que se localiza en el pulmón, se conoce que tan sólo la colonización ya puede inducir elevación de interleuquinas proinflamatorias en el lavado broncoalveolar de modelos animales inmunodeprimidos (Shipley et al., 2010). Además, en un estudio piloto realizado en 51 pacientes con EPOC se observó un aumento significativo de los valores de IL-8, IL-6 y TNF-α a nivel sistémico en los sujetos colonizados por P.jirovecii (Calderón et al., 2007) y, recientemente, se ha observado un aumento en la expresión de genes que codifican la respuesta Th1 en muestras pulmonares de pacientes colonizados por este microorganismo (Fitzpatrick et al., 2014). De la misma manera, la presencia de otras especies fúngicas pueden provocar alteraciones inmunológicas en el hombre. En este sentido, se ha demostrado que Candida albicans y Aspergillus fumigatus promueven la liberación de IL-8 y IL-12p70 en células dendríticas infectadas in vitro (Fidan et al., 2014). Este estudio precede al de Maher de 2015, en el que se corrobora que C. albicans es capaz de inducir, in vitro, la producción de las citoquinas proinflamatorias IL-1β, IL-6, IL-22 e IL-23 en células dendríticas (Maher et al., 2015). Recientemente se ha demostrado que Histoplasma capsulatum provoca un aumento en la producción de citoquinas en el pulmón de ratones inoculados intranasalmente. Se determinó el perfil de citoquinas de las respuestas innata, innata- 33 adaptativa y adaptativa del huésped durante los 28 días siguientes a la infección, y se observó una elevación de IL-1-β, IL-4, IL-6, IL-10, IL-12, IL-17, IL-23, IL-22, TNF-α e IFN-γ. Además en el artículo se mostró que los niveles de citoquinas variaban según qué cepa infectara al huésped, la brasileña o la norteamericana (Sahaza et al., 2015). 2.4 Alteraciones en el parénquima pulmonar inducidas por hongos. Los -glucanos, componente estructural principal de la pared celular de la mayoría de los hongos, participan en la respuesta inflamatoria del huésped mediante su unión a receptores específicos de reconocimiento de patógenos (Hohl et al., 2005; Brown et al., 2003a). Esta respuesta inflamatoria en pacientes con EPOC, aunque es necesaria para el aclaramiento de la infección, podría ocasionar una excesiva morbilidad al aumentar el daño pulmonar. Los -glucanos son una clase de polímeros de glucosa unidos por enlace -(1,3) y (1,6) que forman parte de la pared celular de muchos hongos que se encuentran en el ambiente. Son estructuras muy conservadas que no se encuentran en células de mamífero y, por tanto, se consideran un patrón molecular asociado a patógenos (Willment et al., 2001). De hecho, los niveles de (1/3)--D-glucanos medidos en suero se han propuesto como marcadores de la presencia de infecciones fúngicas invasivas en el hombre (De Pauw et al., 2008). Existen diferentes RRP presentes en las células del sistema inmune innato capaces de reconocer moléculas características de microorganismos (Becker et al., 2015). - Los receptores de lectina tipo C, presentes en macrófagos, monocitos, células dendríticas, neutrófilos y eosinófilos (Willment et al., 2005) juegan un papel fundamental en la mediación de la inmunidad frente a géneros fúngicos como Candida y Aspergillus. En concreto, los receptores Dectin-1 reconocen los β-gluganos de estos hongos. - Los receptores Toll-like (TLR), presentes en células dendríticas y macrófagos (Cohen et al., 2013; Tsuji et al., 2000). Su localización puede variar, de manera que de los 10 que se han identificado en humanos, los 34 TLR1; 2; 4; 5; 6; y 10 se expresan en la superficie celular y migran a los fagosomas (vesícula rodeada de membrana en un fagocito que se forma por la invaginación de la membrana celular y del material fagocitado) tras activarse por la interacción con su ligando. Los TLR3; 7; 8; y 9 se expresan en compartimientos intracelulares, principalmente en el endosoma y el retículo endoplasmático (Duez et al., 2006; Arancibia et al., 2007). Cada TLR reconoce un grupo de moléculas características, entre ellas los βgluganos de hongos (Netea et al., 2006). La unión del β-glugano con su receptor puede desencadenar varias respuestas: por un lado, parece inducir la fagocitosis del hongo por parte de los macrófagos; por otro lado, podría desencadenar una señalización intracelular que culminaría con la secreción de citoquinas y mediadores de la inflamación (Brown et al., 2003a; Steele et al., 2003; Gantner et al., 2005; Bellanger et al., 2011; Chamilos et al., 2010). Además se ha propuesto que los β-gluganos podrían tener actividad quimiotáctica sobre los neutrófilos (Sato et al., 2006). En este sentido, se ha observado experimentalmente que los β-gluganos son un elemento de reconocimiento clave para la fagocitosis de especies fúngicas como Pneumocystis carinii y C. albicans (Steele et al., 2003; Gantner et al., 2005) y parece que inducen la maduración de células dendríticas in vitro, elevando la producción de IL- 8 y IL-12p70 (Fidan et al., 2014). Estudios sobre los β-gluganos de la pared celular de Pneumocystis evidencian que estos polisacáridos tienen la capacidad de inducir la activación de múltiples vías inflamatorias en el huésped y se ha propuesto que los β-gluganos de la pared celular contribuyen a las exagerada respuesta inflamatoria provocada por los macrófagos alveolares, favoreciendo el fallo respiratorio en pacientes con neumonía grave por Pneumocystis (Lebron et al., 2003; Vassallo et al., 1999a; Vassallo et al., 1999b; Limper et al., 1989). Además se ha demostrado que los β-gluganos de Pneumocystis pueden activar las células dendríticas y modular las respuestas de las células T (Carmona et al., 2006), crucial para el aclaramiento de Pneumocystis y que los βgluganos preparan a las células dendríticas de manera que polaricen a las células T para que se diferencien a Th17, que promueve una mayor resistencia inmune antifúngica del huésped (Zelante et al., 2007). 35 Además los β-gluganos activan al complemento, estimulando así la fagocitosis y/o desgranulación citotóxica (Ross et al., 1999). Por lo tanto, estos polímeros podrían tener efectos moduladores en el sistema inmunológico mediante varios mecanismos: activación de los macrófagos, fagocitosis del patógeno y liberación de citoquinas proinflamatorias. Con objeto de medir la inflamación sistémica, tanto en pacientes EPOC como en sujetos con otras afecciones crónicas, se recurre a la medida de “marcadores inflamatorios” plasmáticos, por ejemplo: IL-6, IL-8, TNF-α. Sería interesante estudiar si existe un cambio significativo en los niveles de otros mediadores inflamatorios y si este posible aumento podría deberse a la colonización por algún hongo en particular. 2.5. Técnicas de identificación de microorganismos. 2.5.1. Técnicas de tinción. El método más rápido para la detección de microorganismos en una muestra clínica es el examen microscópico de la misma. Este examen puede aportar, en ocasiones, un diagnóstico definitivo y en otras, un diagnóstico de sospecha previo a la confirmación definitiva por cultivo. Por lo tanto, es un procedimiento que debería ser realizado en todos los laboratorios ya que puede realizarse mediante técnicas sencillas, aunque a veces puede requerir tinciones complejas, permitiendo dirigir los medios adecuados para el cultivo de la muestra (Schwarz, 1982). La tinción de Gram, típicamente utilizada para diferenciar bacterias Grampositivas de las Gram-negativas, también se usa en levaduras como Candida. Otros hongos pueden ser visualizados y diferenciados mediante otras técnicas de tinción como el colorante hematoxilina-eosina, la tinción de Gridley y la Metenamina de Plata de Grocott, entre otros (Huppert et al., 1978; Schwarz, 1982). 2.5.2. Cultivos convencionales. La identificación de microorganismos en la rutina médica suele basarse en el cultivo convencional seguido de una identificación fenotípica. 36 Las muestras de esputo pueden ser cultivadas en varios tipos de medios: sangreagar, chocolate-agar, medio de eosina-azul de metileno, agar Sabouraud dextrosa y MacConkey agar, entre otros (Bakare et al., 2003; Ajao et al., 2011; Pravin Charles et al., 2015). Basándose en el fenotipo del microorganismo y el medio en el que crece, se puede identificar al hongo o la bacteria presente en la muestra sembrada mediante microscopia (Bakare et al., 2003). Además, se pueden aplicar técnicas de tinción para facilitar la identificación del microorganismo al microscopio. Los agares cromogénicos, como el CHROMagar, también pueden ayudar en la identificación de microorganismos y son ampliamente utilizados en los laboratorios clínicos. Las placas de CHROMagar contienen un sustrato que es hidrolizado por un microorganismo específico, produciéndose así una reacción que da lugar a una coloración específica permitiendo incluso la diferenciación de especies pertenecientes al mismo género (Odds et al., 1994; Cooke et al., 2002). Sin embargo, estas técnicas resultan muy limitadas cuando se trata de microorganismos que necesitan condiciones particulares de crecimiento, por ejemplo anaerobiosis, y nula en el caso de microorganismos no cultivables. 2.5.3. Técnicas de Inmunoensayo. Se han desarrollado técnicas para la detección de microorganismos basándose en la reacción antígeno-anticuerpo (Ag-Ac), como el ensayo por inmunoadsorción ligado a enzimas (ELISA). Puesto que esta interacción Ag-Ac es específica, al detectarla a partir de la muestra del huésped se puede determinar el agente causal de la infección. Para detectar un antígeno con la técnica ELISA, la muestra a analizar se fija al pocillo de una placa de poliestireno. El anticuerpo específico del microorganismo que estamos testando está unido a una enzima y a continuación se añade al pocillo. Si el antígeno específico de este anticuerpo está presente en la muestra se producirá la unión Ag-Ac. Los anticuerpos que no se unan serán eliminados por técnicas de lavados con los buffer adecuados. A continuación se añadirá el sustrato enzimático al pocillo. Las enzimas que han quedado en el pocillo porque están ancladas al Ac reaccionarán con el sustrato dando lugar a una señal visible indicando entonces la presencia del microorganismo en la muestra (Engvall et al., 1971). 37 A modo de ejemplo, en la identificación de hongos se ha desarrollado un ELISA indirecto que detecta el anticuerpo IgG contra Candida albicans y Aspergillus fumigatus en muestras de suero (Przyklenk et al., 1987). Esta técnica tiene el inconveniente de que permite evaluar un número reducido de microorganismos al mismo tiempo, por lo que resulta poco práctica en estudios de la microbiota global de un paciente. 2.5.4. Técnicas analíticas. Entre las técnicas de microanálisis utilizadas en la última década para la identificación microbiana se encuentra la espectrometría de masas de proteínas. Este método permite la identificación de una molécula mediante la medición de su masa en relación a su carga y también la identificación de los fragmentos generados a partir de ella. Tras la desorción/ionización láser de una molécula (por ejemplo péptidos y proteínas que forman parte de hongos y bacterias) en una matriz determinada, el espectrómetro puede calcular el tiempo de migración de cada fragmento de esta molécula a través de un trayecto predeterminado y emitir un espectro de masas que será característico de cada microorganismo para una misma emisión del láser y una misma distancia de migración. La identificación se realiza a través de la comparación del espectro que resulta de una bacteria u hongo con todos los espectros de masas contenidos en una base de datos comercial. Este método presenta limitaciones en relación al manejo de microorganismos previo a la realización del espectro de masas, a la ausencia de ciertas especies en las bases de datos y a la dificultad en la identificación de mezclas de microorganismos. Aún así, el uso de esta tecnología en los laboratorios clínicos ha sido uno de los cambios más importantes en el campo de la identificación microbiológica después de los métodos moleculares (García et al., 2012). 2.5.5. Técnicas Moleculares. Finalmente, en los últimos años se han desarrollado técnicas moleculares para la identificación de microorganismos. 38 En el caso de las bacterias, la identificación basada en técnicas moleculares suele utilizar la secuencia del ARN ribosomal 16S rRNA, marcador molecular presente en la gran mayoría de bacterias (Sibley et al., 2011; Guss et al., 2011). En el caso de los hongos, estas técnicas se basan en la amplificación de genes ribosomales, que están presentes en la mayoría de los organismos en un alto número de copias, ayudando así a la detección y aumentando la sensibilidad de la reacción de PCR. Para el desarrollo de estas técnicas se han estudiado diferentes regiones del ADN fúngico como posibles dianas de amplificación (Schoch et al., 2012). El ADN ribosomal de los hongos (rDNA) está organizado en unidades que se repiten cientos de veces a lo largo del genoma. Cada una de estas unidades consta de tres genes, el gen que codifica para la subunidad mayor (25S), el gen que codifica para la subunidad menor (18S) y el gen que codifica para la subunidad 5.8S, separados por secuencias no codificantes conocidas como regiones espaciadoras internas transcritas (ITS; del inglés Internal Transcribed Spacer) (Atkins et al., 2004). En la Figura 3 se puede observar un esquema de esta zona. Figura 3. Representación de las regiones ITS. El problema recae en la dificultad de diferenciar especies del mismo género y para solventarlo se ha propuesto el estudio de la región ITS entre los genes 18S y 5.8S rRNA (región ITS1) y/o entre los genes 5.8S y 28S rRNA (región ITS2) (Leaw et al., 2006, Nilsson et al., 2009), ya que esta región tiene áreas muy conservadas filogenéticamente y áreas de gran variabilidad interespecífica (Esteve-Zarzoso et al., 1999). Las regiones ITS han sido las más secuenciadas en los últimos años para la identificación del ADN fúngico y en estudios de filogenia y taxonomía, a partir de todo tipo de muestras, desde ambientales hasta clínicas (Schoch et al., 2012; Romanelli et al., 2014; De Beeck et al., 2014; Nilsson et al., 2009). Esta región tiene la más elevada probabilidad de éxito en la identificación de especies fúngicas, aun siendo muy cercanas filogenéticamente (Schoch et al., 2012). 39 Algunos de los métodos utilizados como técnica molecular de identificación son: la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR), los Polimorfismos de Longitud de Fragmentos de Restricción (RFLP) (Rogers et al., 2003), los microarrays (Cox et al., 2010), la clonación y secuenciación (Harris et al., 2007) y el uso de la nueva generación de sistemas de secuenciación masiva (Erb-Downward et al., 2011; Guss et al., 2011). En este sentido, se puede recurrir a la PCR para amplificar marcadores moleculares pertenecientes a microorganismos (Erlich et al., 1991). Para ello se han usado tanto cebadores específicos para una especie concreta como cebadores universales capaces de detectar diferentes géneros (Logotheti et al., 2009; Liesack et al., 1992; Reddy et al., 1993). Al usar cebadores universales, las técnicas de PCR generan productos de diferente longitud proporcionando un perfil de la microbiota (Suzuki et al., 1998). Estos fragmentos amplificados pueden después ser secuenciados para facilitar la identificación de los diferentes géneros y especies presentes en la muestra de partida. El desarrollo de la PCR Multiplex, en la que se combinan parejas de cebadores específicos para detectar múltiples microorganismos en la misma reacción, ha permitido la identificación en paralelo de diferentes especies de Aspergillus (Logotheti et al., 2009). Sin embargo, esta técnica puede resultar insuficiente debido a la desigual amplificación de ciertos loci y la dificultad para reproducir algunos resultados (Henegariu et al., 1997). Hay muchos microorganismos que tienen la misma longitud de fragmento amplificado al usar determinados cebadores universales aunque las secuencias de dichos fragmentos no sean iguales. Por ello, en la mayoría de los casos se recomienda la secuenciación de dichos amplicones para diferenciar los microorganismos. El método de secuenciación más común es la secuenciación Sanger, desarrollada en los años 70. Con este método, el ADN se divide en 4 reacciones, cada una de ellas con los 4 deoxinucleótidos estándar (dNTPs), 1 dideoxinucleótido (ddNTP) y una polimerasa. La cadena de ADN complementaria se va creando a partir de los dNTPs y cuando se añade un ddNTP, la reacción de extensión finaliza. Por tanto, se producen fragmentos de diferente longitud que pueden separarse por tamaño y visualizarse usando radioactividad para determinar la secuencia de ADN (Sanger et al., 1977). Además, esta técnica se puede modificar para que todas las reacciones se den en el mismo tubo. Para ello, los cuatro tipos diferentes de ddNTP se marcan con fluorescencia de manera que 40 los fragmentos se separan por tamaño y la secuencia se determina por fluorescencia. Una vez generada la secuencia, ésta se compara con secuencias almacenadas en las bases de datos disponibles, como el GenBank (Benson et al., 2008) para identificar al microorganismo. Más recientemente se ha desarrollado la técnica de pirosecuenciación, con la que se obtienen también datos cuantitativos. Esta técnica se basa en un proceso conocido como secuenciación ‘by synthesis’, una técnica que permite la monitorización de la síntesis de ADN en tiempo real. La pirosecuenciación se fundamenta en el principio de que el pirofosfato (PPi) se libera cuando la ADN polimerasa añade un nucleótido nuevo a la cadena complementaria que está creando. Este PPi se transforma en adenosina trifosfato (ATP), que se utiliza como un sustrato en una reacción química que resulta en la emisión de luz visible. La cantidad de luz producida se relaciona con la cantidad de síntesis. Los dNTPs se añaden secuencialmente y la luz es sólo emitida si el dNTP añadido a la reacción es el siguiente en ser incorporado a la cadena creciente (Ahmadian et al., 2006). La pirosecuenciación puede producir gran cantidad de lecturas de secuencias en una pequeña cantidad de tiempo. De esta forma, este método es más eficiente que el método de Sanger para secuenciar una gran biblioteca de clones. Es importante destacar que la pirosecuenciación ha superado a los métodos tradicionales de detección en el ámbito clínico mediante la identificación del 91% de los aislamientos al menos a nivel de género. El 9% restante no pudo ser identificado porque las secuencias leídas eran demasiado cortas, lo cual es un claro inconveniente de la técnica (Luna et al., 2007). Sin embargo, en un estudio comparativo entre pirosecuenciación y método Sanger en muestras de esputo de pacientes con Fibrosis Quística se observó que ambas técnicas eran capaces de identificar prácticamente las mismas bacterias, aunque la pirosecuenciación mostrase una estimación más fiable sobre la abundancia de cada especie (Armougom et al., 2009). 41 JUSTIFICACIÓN La microbiota no bacteriana que coloniza el pulmón no ha sido todavía bien caracterizada y es un área que demanda investigación. La EPOC representa un problema sociosanitario de primera magnitud por su alta morbi-mortalidad. Es una enfermedad prevenible y tratable desencadenada por el humo del tabaco en la que hay un proceso inflamatorio complejo y multidimensional que se inicia en el pulmón pero que se acompaña de manifestaciones sistémicas (Cosío, 2007). Los agentes infecciosos colonizadores del árbol respiratorio pueden amplificar la respuesta inflamatoria desencadenada por el tabaco. La capacidad demostrada de un hongo como Pneumocystis jirovecii para inducir la liberación de citoquinas proinflamatorias permite plantear la posibilidad de que la colonización por otros hongos en estos pacientes puede desencadenar o favorecer la progresión de este proceso (Calderón et al., 2007. La demostración de este hecho tendría una gran importancia clínica pues disponemos de fármacos efectivos para el tratamiento de estas infecciones que podrían mejorar el pronóstico de los pacientes con EPOC que las presenten. En definitiva, podemos intuir que la colonización fúngica en el pulmón de sujetos con EPOC podría modificar la respuesta inmune del huésped y sería, por tanto, interesante describir la flora fúngica presente en el tracto respiratorio de los pacientes con enfermedad pulmonar crónica, observar si existe una relación con los diferentes estadios de la enfermedad y analizar su posible relación con la respuesta inflamatoria sistémica. En este sentido, una parte de este estudio también se propone evaluar la relación entre la presencia de hongos en el tracto respiratorio de los sujetos con EPOC y el nivel de β-glucanos en suero, al igual que comprobar si existe una correlación entre la respuesta inflamatoria del paciente y la concentración sistémica de β-glucanos. 48 La primera fase se conoce como desnaturalización y se realiza a una temperatura de 94ºC. Con ella se consigue la separación de la doble cadena de ADN que actúa como molde. La segunda fase es la fase de hibridación, en la que existe un descenso en la temperatura para permitir que los cebadores se unan por complementariedad al ADN molde. La temperatura de hibridación es específica de cada fragmento y de los cebadores empleados. Por último, en la fase de extensión, la enzima Taq polimerasa incorpora los desoxinucleótidos disponibles en el medio de manera complementaria a partir del extremo 3’ libre de la región en que han hibridado los cebadores. La temperatura de esta fase de elongación suele ser de 72ºC. Una vez realizadas las PCR, los productos amplificados se separaron por electroforesis en gel de agarosa y se visualizaron mediante tinción con bromuro de etidio. La agarosa es un polímero lineal constituido por unidades alternantes de D- y L- galactosa unidas por enlaces glicosídicos -(1->3) y -(1->4). Al solidificar forma un entramado tridimensional con poros de un diámetro entre 50 nm y más de 200 nm. En estos geles, las moléculas lineales de ADN migran hacia el polo positivo con una velocidad inversamente proporcional a su tamaño, dentro de ciertos límites. Para preparar el gel se añadieron los gramos de agarosa (Agarosa D1 Low EEO de pronadisa) necesarios para conseguir la concentración deseada (1,5 gramos en el caso de geles al 1,5% y 2 gramos para geles al 2%) a 100 ml de tampón TBE 0,5X preparado a partir de una solución del TBE 5X (54g de Tris base, 27,5g de ácido bórico y 20 ml de EDTA 0,5M a pH = 8). La mezcla se calentó en un microondas para favorecer la homogenización y, una vez disuelta la agarosa en su totalidad, se dejó enfriar parcialmente y se añadió 4,5 µl de bromuro de etidio. El bromuro de etidio (3,8 diamino-6-etil-5-fenilfenatridium bromuro) se utiliza para visualizar el ADN. Este compuesto, que es un mutágeno muy potente, se intercala entre las bases del ADN. Absorbe radiaciones a 302 y 366 nm (emitidas por las fuentes 49 comerciales de luz ultravioleta), reemitiendo parte de la energía absorbida a 590 nm, longitud de onda que corresponde a la región rojo-naranja del espectro visible. La mezcla se pasa al molde del gel, se inserta el peine para formar los pocillos donde se coloca el producto de PCR y se deja enfriar durante, al menos, 30 minutos. Una vez solidificado, se retira el peine y el gel se sumerge en la cubeta de electroforesis conteniendo el buffer TBE 0,5X. Se utilizaron 8 µl del producto de la amplificación para su visualización en el gel. Para ello, se mezclaron con 2 µl buffer de carga 6X compuesto al 0,25% de azul de bromofenol (25 mg), 0,25% xylene cyanol FF (25mg) y sacarosa al 40% peso/volumen (4g) y se colocaron en su pocillo correspondiente en el gel. Además, a uno de los pocillos se añade un marcador de peso molecular (Hyperladder IV de Bioline) que se usa como referencia para conocer el tamaño aproximado de los fragmentos amplificados por PCR. El azul de bromofenol (3, 3, 5, 5-Tetrabromofenol Sulfonftaleína) es de menor peso molecular que las moléculas de ADN por lo que migra más rápido. De forma contraria, el xylene-cyanol migra más lentamente. Al ser visibles por su coloración son utilizados como indicadores del avance electroforético y permiten detener la migración de las moléculas de ADN en el gel en el momento adecuado. El efecto mutagénico del bromuro de etidio y el efecto irritante leve del azul de bromofenol obligan al uso de guantes durante la ejecución del procedimiento y la manipulación de los materiales que han estado en contacto con ellos. Tras cubrir la cubeta de electroforesis, se aplicaron 100V de voltaje con la fuente de alimentación que está conectada a la cubeta. Cuando el frente del gel alcanzó los 2/3 del total se consideró acabada la electroforesis. Los geles se visualizaron bajo la luz ultravioleta de un transiluminador (Biodoc-It Imaging System 2UV Tansiluminator) y se identificaron las bandas de interés en función del tamaño, que se determina por su posición relativa respecto a las bandas del marcador de peso molecular de tamaño conocido. 50 3.4. Identificación molecular de especies fúngicas. 3.4.1. Técnica de amplificación de la región ITS. La identificación molecular de las especies fúngicas presentes en el tracto respiratorio de los individuos incluidos en el estudio se realizó mediante la amplificación por Nested-PCR de las regiones ITS usando pares de cebadores universales para hongos. Para ello se realizaron dos rondas consecutivas. Una primera ronda se realizó con los cebadores externos ITS-1 e ITS-4, descritos por T.J. White (White et al., 1990). Estos cebadores flanquean una región de entre 500 y 800 pb conservada del genoma de gran variedad de hongos: ITS-1: 5’- TCCGTAGGTGAACCTGCGG -3’. ITS-4: 5’- TCCTCCGCTTATTGATATGC -3’. La mezcla de PCR se preparó para un volumen final de 25 µl, que incluía: 3µl del ADN extraído de cada alícuota, 2,5 µl de NH4 reaction Buffer 10x (Bioline), 0,2 µl de Taq (BioTaq DNA pol. 5U/ µl de Bioline), 0,5 µl de una mezcla de nucleótidos trifosfato (1µM de cada dNTP), 0,5 µl de cada cebador (concentración de 20 µM cada uno) y 1,25 µl de MgCl2 50mM. La tabla 2 muestra el programa que se siguió. Tabla 2. Condiciones de la primera ronda de Nested-PCR utilizada para detectar la presencia de la región ITS de los hongos. ETAPA Nº DE CICLOS TEMPERATURA (ºC) TIEMPO Activación 1 95 5 minutos Desnaturalización Hibridación Extensión 35 94 55 72 30 segundos 45 segundos 30 segundos Terminación 1 72 7 minutos A continuación, a partir de los productos de PCR de esta primera ronda se realizó una segunda ronda con la pareja de cebadores ITS-3 e ITS-4 (White et al., 1990), que amplificaban una región de unos 200-500 pb: ITS-3: 5’- GCATCGATGAAGAACGCAGC -3’. ITS-4: 5’- TCCTCCGCTTATTGATATGC -3’. 51 La mezcla de PCR para esta segunda ronda se preparó para un volumen final de 40 µl, que incluían: 4µl de ADN, 4 µl de NH4 reaction Buffer 10x (Bioline), 0.3 µl de Taq (BioTaq DNA pol. 5U/ µl de Bioline), 1 µl de una mezcla de nucleótidos trifosfato (1µM de cada dNTP), 1 µl de cada cebador a una concentración de 20 µM cada uno y 2 µl de MgCl2 50mM. El programa era similar pero, en este caso, para 40 ciclos y se detalla en la Tabla 3. Tabla 3. Condiciones de la segunda ronda de Nested-PCR utilizada para detectar la presencia de la región ITS de los hongos. ETAPA Nº DE CICLOS TEMPERATURA (ºC) TIEMPO Activación 1 95 5 minutos Desnaturalización Hibridación Extensión 40 94 55 72 45 segundos 45 segundos 45 segundos Terminación 1 72 7 minutos Los productos de PCR se resolvieron por electroforesis en gel de agarosa al 2% con bromuro de etidio y las bandas se visualizaron con el Transiluminador. A continuación se procedió a la preparación de los fragmentos amplificados para su secuenciación. Para ello, las muestras se dividieron en tres grupos: Las muestras en las que amplificaron varios fragmentos que no se separaban totalmente durante la electroforesis en gel por tener tamaño parecido fueron clonadas antes de ser purificadas y secuenciadas. Las muestras en las que aparecieron varios fragmentos que diferían en peso molecular lo suficiente como para separarse en el gel más de 50 pb fueron añadidas en su totalidad a un gel de agarosa. A partir del gel, estas bandas se cortaron con la ayuda de un bisturí y se purificaron antes de ser secuenciadas. Las muestras en las que solo amplificó un fragmento se consideraron colonizadas por una sola especie fúngica y se purificaron directamente. 3.4.2 Técnica de Clonación. Los fragmentos que se amplificaron con los cebadores universales ITS y que tenían diferente tamaño pero peso molecular parecido dentro de una misma muestra no se separaban lo suficiente como para poder ser recortados a partir del gel de agarosa y 52 así poder ser secuenciados después. En estos casos, estos productos de PCR fueron clonados para su posterior purificación y secuenciación. El protocolo de clonación se basó en 3 pasos: 1º) Reacción de Ligación. Esta reacción se realiza para insertar un fragmento de ADN de doble cadena en un vector de clonación, que son moléculas transportadoras que transfieren y replican fragmentos de ADN que llevan insertados. Existen varios tipos de vectores, entre ellos los plásmidos, que son moléculas de ADN circular de doble cadena y extracromosómico que tienen capacidad de reproducirse de manera independiente del ADN cromosomal de la bacteria en la que son introducidos. En resumen, un vector plasmídico ha de poseer unas características determinadas: la presencia en su ADN de una secuencia que le confiera la capacidad de duplicarse de manera autónoma respecto del cromosoma bacteriano principal; la presencia de un gen que lo haga resistente a un antibiótico para poder seleccionar los clones de células bacterianas que contengan los plásmidos; y, por último, la presencia de secuencias de reconocimiento que permitan la inserción del fragmento de ADN exógeno. La unión del fragmento de ADN que se desea clonar con el vector de clonación se realiza por medio de una unas enzimas denominadas ADN-ligasas. Estas enzimas requieren como sustrato dos extremos de ADN; un extremo 5’ (portador de un grupo fosfato) y un extremo 3’ (grupo hidroxilo de la desoxirribosa). La ligasa puede unir tanto extremos romos como extremos cohesivos. Los vectores que transportan un fragmento insertado se denominan vectores recombinantes. En este trabajo, la reacción de ligación de los productos amplificados se llevó a cabo con el vector de clonación pGEM®-T Easy Vector (PROMEGA). Como se muestra en la siguiente imagen, este vector tiene 3015 pb. Entre ellas, posee un gen que le confiere a la bacteria resistencia frente a la ampicilina. 53 Figura 4. pGEM®-T Easy Vector (Promega®). Para calcular la cantidad óptima de inserto que debíamos añadir a 1 µl de pGEM®-T Easy Vector (50ng/µl) se cuantificó la concentración de ADN de cada muestra amplificada y se usó la siguiente ecuación: (𝑛𝑔 𝑑𝑒 𝑣𝑒𝑐𝑡𝑜𝑟 ∗ 𝑘𝑏 𝑑𝑒 𝑖𝑛𝑠𝑒𝑟𝑡𝑜) 𝑘𝑏 𝑑𝑒 𝑣𝑒𝑐𝑡𝑜𝑟 ∗ 𝑟𝑎𝑡𝑖𝑜 𝑚𝑜𝑙𝑎𝑟 𝑑𝑒𝑙 𝑖𝑛𝑠𝑒𝑟𝑡𝑜:𝑣𝑒𝑐𝑡𝑜𝑟 En la ecuación, ng: nanogramos; kb: kilobases. La cantidad de ADN calculado en cada caso se colocó en un eppendorf de 0,2 ml al que también se añadieron: 5 µl de 2X Rapid Ligation Buffer T4 DNA Ligase, 1 µl de pGEM®-T Easy Vector (50 ng/µl), 1 µl de T4 DNA Ligase (3 U Weiss/µl) y agua estéril libre de nucleasas hasta alcanzar un volumen final de 10 µl. Además, se incluyó un eppendorf que contenía 2 µl de ADN (inserto) suministrado también por PROMEGA y que actúa como control positivo de la reacción de ligación. La mezcla se incubó a 16 ºC en el termociclador (Biometra T1 Thermocycler) durante, al menos, 12 horas para favorecer la reacción de ligación. 2º) Transformación. Tras la reacción de ligación, obtenemos en cada caso una molécula que consta del inserto de ADN unido al vector recombinante. El siguiente paso en el proceso de 54 clonación sería la introducción de este material genético en células bacterianas hospedadora mediante un proceso llamado Transformación. Para ello se usaron cepas JM109 High Efficiency Competent Cells (Promega®). Antes de empezar, se prepararon los materiales y reactivos necesarios para realizar la transformación, tal y como se detalla a continuación: Medio LB (Luria Bertani): Se prepararon 500 ml de medio LB para favorecer el crecimiento de las bacterias recombinantes. Para ello, se pesaron 5 g. de Bacto-tryptone, 2,5 g. de Extracto de levadura y 2,5 g. de NaCl y se diluyeron en 500 ml de agua destilada. El pH de la mezcla se ajustó a 7.0 con NaOH y se autoclavó para asegurar que el medio era totalmente estéril. Medio LBA (LB-agar): Se preparó del mismo modo que el medio LB y, antes de autoclavarlo, se le añadieron 7,5 g. de agar bacteriológico. Tras el proceso de esterilización en autoclave y una vez que la temperatura del medio alcanzó los 50ºC aproximadamente, se añadió ampicilina hasta una concentración final de 100μg/ml y se prepararon placas de petri añadiendo unos 36 ml de medio LBA a cada una. Estas placas se dejaron enfriar en campana para que el agar se solidificase y a continuación se guardaron a 4ºC. Medio SOC (Super Optimal broth with Catabolite Repression): Primero se prepararon 100 ml de medio SOB (Super Optimal Broth) mezclando 2 g. de Bacto®- tryptone, 0,5g de Extracto de levadura, 1 ml de NaCl (1M), 0.25 ml de KCl (1M) y 1ml de MgCl2 (2M); y disolviéndolo en 100 ml de agua destilada. A continuación el SOB fue autoclavado y, al alcanzar de nuevo la temperatura ambiente, se pasó a medio SOC añadiéndole 1 ml de glucosa (2M) previamente esterilizada con filtro de jeringa. La solución se mantuvo a 4ºC hasta el momento de ser utilizada. IPTG (isopropil-β-D-1-tiogalactopiranósido): Se preparó una solución stock de IPTG para una concentración final de 0,1M, añadiendo 1,2g de IPTG a 50 ml de agua destilada. La mezcla se esterilizó con filtro de jeringa y se guardaron alícuotas a -20ºC. X-Gal (5-bromo-4-cloro-3-indolil-β-D-galactopiranósido): Se prepararon alícuotas de 2 ml disolviendo 100 mg de X-Gal en 2 ml de N,N -dimetil-formamida. Se cubrieron con papel de aluminio para protegerlas de la luz y se guardaron a -20°C. 55 Una vez preparados los materiales, se procedió a realizar la transformación. Se centrifugaron los tubos que contenían las reacciones de ligación para asegurar que todo el contenido se desplazaba al fondo del eppendorf. De cada muestra de ligación se tomaron 5 µl y se añadieron a tubos eppendorf de 1,5 ml estériles que teníamos depositados en hielo. Los tubos que contenían a las células competentes JM109, conservadas a – 80ºC, se depositaron en hielo durante unos 5 minutos para después añadir 50 µl de células a cada tubo que contenía los 5 µl de reacción de ligación y se incubaron en hielo durante 20 minutos. Transcurrido este tiempo, se realizó un choque de calor sobre las células manteniéndolas en un baño a 42ºC durante 45-50 segundos para, después, traspasar los tubos inmediatamente al hielo, donde se mantuvieron durante 2 minutos. Tras este proceso se considera que los vectores con el inserto ligado han sido introducidos en las células. Para favorecer el crecimiento de las células, se añadieron 950 µl de medio SOC a temperatura ambiente a cada tubo y se incubaron a 37ºC con agitación moderada (150 rpm aproximadamente) durante una hora y media. El tiempo de espera se empleó en preparar las placas de petri con el medio LBA solidificado para posteriormente ser cultivadas. Para ello, se usó la campana para favorecer la esterilidad y cada placa de petri se suplementó con isopropil-β-D-1- tiogalactopiranósido (IPTG) (0,5 mM) y 5-bromo-4-cloro-3-indolil-β-D- galactopiranósido (X-Gal) (80µg/ml), y se extendieron sobre la superficie del agar con la ayuda de un asa de siembra. Las placas se taparon y se mantuvieron a 37 ºC durante al menos 30 minutos para favorecer la absorción de IPTG y X-Gal. 3º) Crecimiento de colonias. El crecimiento de colonias a partir de las células transformadas se realizó sembrando 100μl de cada cultivo de transformación en el medio LBA sólido con ampicilina, IPTG y X-Gal; e incubando cada placa a 37º C durante 16-24 horas. En condiciones de crecimiento adecuadas, la célula bacteriana hospedadora se divide y genera millones de células, cada una de las cuales contiene varios ejemplares del plásmido recombinante, de manera que en este proceso se consigue obtener muchas moléculas del plásmido y de su inserto. Además, dado que el vector recombinante que 56 utilizamos es portador de resistencia ampicilina, el uso de este antibiótico en el medio LBA permite el crecimiento únicamente de células bacterianas que contienen dicho vector en su interior. La molécula de IPTG es absorbida por la bacteria y, vez dentro de la célula, induce la transcripción del gen que codifica la β-galactosidasa, enzima que cataliza la hidrólisis de β-galactósidos a monosacáridos. Las colonias bacterianas que han sido transformadas se pueden identificar usando el X-Gal, ya que este compuesto puede ser metabolizado por la β-galactosidasa en 5-bromo-4-cloro-3-hidroxindol, un compuesto de color azul. Las células transformantes en las que se ha introducido el vector no recombinante con el operón lac intacto, una vez inducidas por IPTG, expresarán activamente β-galactosidasa, que hidroliza X-gal y colorea de azul sus colonias. Por el contrario, las colonias de células transformantes que han captado un plásmido con el operón lac recombinante, en cuyo interior ha sido insertado el fragmento de ADN de interés, sufren con la inserción la inactivación del gen lacZ (uno de los genes que codifica la β-galactosidasa) y por tanto, no pueden expresar β-galactosidasa ni degradar X-gal, permaneciendo sus colonias de color blanco. De esta forma, se pudieron seleccionar 5 colonias blancas (con el inserto debidamente acoplado al plásmido) de cada muestra y se hicieron crecer en medio LB líquido con ampicilina de nuevo a 37ºC, esta vez con agitación, durante 24 horas. 3.4.5 Técnica de Secuenciación. Los productos de PCR suelen contener restos de cebadores, dNTPs, enzima y demás componentes que han sido utilizados durante el proceso de PCR y que interfieren directamente en la secuenciación disminuyendo la calidad de las secuencias que se obtengan. Por este motivo, es necesario llevar a cabo un paso de purificación previa a la secuenciación de los productos de PCR. A continuación, se realiza una reacción de secuenciación a partir de los productos purificados. Este proceso consiste en una PCR en la que, a partir de un molde de ADN, se obtienen fragmentos de amplificación cuyo tamaño difiere en una sola base. Se consigue añadiendo a la mezcla de reacción nucleótidos marcados con moléculas fluorescentes que, al incorporarse al final de la cadena (en el extremo 3’) produce la 57 terminación del fragmento. Al usar nucleótidos terminales que lleven cuatro tipos distintos de marcaje (uno diferente para cada nucleótido), las cuatro reacciones de terminación específica (ddATP, ddCTP, ddGTP, y ddTTP) se pueden llevar a cabo en el mismo tubo (Prober et al., 1987), de manera que se puede determinar cuál es el nucleótido terminal de los fragmentos de ADN amplificados en base en su señal y así resolver la secuencia del fragmento de ADN con sólo un carril. Este método asegura que todas las cadenas sintetizadas a partir del molde lleven incorporada una sola marca y la seña que cada fragmento emite depende del nucleótido terminal incorporado. Tras la reacción de secuenciación, se realiza la precipitación de la reacción de secuencia. En este paso se eliminan los reactivos sobrantes de la reacción y otras moléculas que puedan interferir en la lectura del secuenciador. 1º) Purificación. Muestras con un solo fragmento amplificado. Una vez realizada la PCR, aquellas muestras en las que se amplificó un solo fragmento cuando se utilizaron los cebadores ITS fueron directamente purificadas utilizando un proceso de purificación basado en la cromatografía de exclusión molecular para obtener el fragmento de ADN amplificado susceptible de ser secuenciado. Para ello, el producto de PCR se hizo pasar a través de una columna que contiene un lecho de un material poroso, en nuestro caso de sephacryl (Sephacryl S-400 HR de GE Healthcare). El diámetro del poro es el factor que selecciona el tamaño de la molécula a purificar. Los primeros pasos a seguir son preparar el Sephacryl, montar las columnas de cromatografía y purificar el ADN, siguiendo los protocolos descritos a continuación. A. Preparación del Sephacryl: - Preparar 50 mL de Sephacryl y buffer TE (10 mM Tris-Cl, pH 7,5 y 1 mM EDTA) mezclados al 50%. Mezclar bien y centrifugar cinco minutos a 700g. - Retirar el sobrenadante y añadir buffer TE hasta 50 ml. Volver a centrifugar 5 minutos a 700g. Repetir este paso. 64 1.5 µl de MgCl2 50mM. El programa era similar pero, en este caso, se aumentó el número de ciclos hasta 40, tal y como se detalla a continuación. Tabla 5. Condiciones de la segunda ronda de Nested-PCR utilizada para detectar la presencia del gen mtLSU rRNA de P. jirovecii. ETAPA Nº DE CICLOS TEMPERATURA (ºC) TIEMPO Activación 1 94 5 minutos Desnaturalización Hibridación Elongación 40 92 55 72 30 segundos 30 segundos 2 minutos Extensión 1 72 5 minutos Los productos de PCR se resolvieron por electroforesis en gel de agarosa al 2% que contenía bromuro de etidio, tal y como se explicó anteriormente, y las bandas se visualizaron con el transiluminador. Por otro lado, la identificación de P. jirovecii a partir del ADN extraído de las muestras de LOF y esputo también se realizó utilizando la técnica de PCR a Tiempo Real. Este método es una modificación de la PCR convencional y se basa en la monitorización del proceso usando fluoróforos específicos del ADN bicatenario o sondas fluorescentes específicas de la secuencia, que generan una señal fluorescente proporcional a la cantidad de producto de la PCR, con lo que se consigue la visualización en directo del perfil completo de amplificación de la diana. En nuestro estudio, esta técnica se realizó con el equipo LightCycler 1.5 (Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Germany), que ofrece la posibilidad de analizar la curva de fusión del producto, haciendo posible la caracterización del fragmento amplificado por su temperatura de fusión (Tm). Se usó SYBR-Green (LightCycler® FastStart DNA Master SYBR Green I, Roche Molecular Biochemicals) como fluoróforo, que se une con gran afinidad al ADN bicatenario, aumentando su fluorescencia unas 1.000 veces. La PCR-TR se realizó en un volumen final de 20 µl, con los cebadores pAZ102-X y pAZ102-Y, anteriormente detallados, a una concentración de 250 nM cada uno, MgCL2 1mM y 2 µl de ADN de la muestra. El programa de PCR que se utilizó se describe en la tabla 6. Como se observa en la tabla, durante el proceso de amplificación se añadió una etapa final a 76ºC durante 1 65 segundo para medir la señal de fluorescencia únicamente de la sonda unida específicamente al ADN bicatenario. Para que una muestra fuese considerada positiva, ésta debía cumplir tres criterios: que el análisis cualitativo realizado por el software del LightCycler mostrase las muestras como positivas; que la amplificación fuese detectada antes del ciclo 35; y que la Tm del fragmento amplificado tuviera un valor entre 78 y 81º C. Tabla 6. Condiciones de la PCR a Tiempo Real utilizada para detectar la presencia del gen mtLSU rRNA de P. jirovecii. ETAPA Nº CICLOS TEMPERATURA (ºC) TIEMPO Activación 1 95 8 minutos Desnaturalización Hibridación Extensión 40 95 55 72 76 5 segundos 15 segundos 10 segundos 1 segundo Anneling 1 95 65 95 30 segundos 30 segundos 0 segundos Enfriamiento 1 40 30 segundos 3.6. Medidas de Control. Las muestras se procesaron a ciegas y bajo código. Dentro del control interno del sistema, se utilizaron controles positivos y negativos. Para evitar falsos-positivos, se usaron pipetas con filtro en cada paso. La extracción del ADN, la preparación de las mezclas de reacción, la adicción del ADN a las mezclas de reacción de la PCR, la amplificación por PCR y la detección se realizaron en diferentes áreas del laboratorio. Para detectar cualquier contaminación cruzada que hubiera podido tener lugar se usaron siempre controles negativos de agua estéril. En todas las muestras que resultaron negativas por la técnica de PCR se estudió la presencia del gen de la beta-globina para descartar procesos de inhibición de la PCR o mala calidad de la muestra. En cada uno de los procesos de digestión de las muestras se utilizó suero fisiológico como control negativo de la posible contaminación que pudiera tener lugar en las muestras durante su manejo. 66 3.7. Criterios de interpretación de los resultados y definición de colonización. En la identificación de P. jirovecii, se consideró que una muestra era positiva o negativa si presentaba el mismo resultado en las dos alícuotas estudiadas para cada caso. Por otro lado, en la identificación del resto de las especies fúngicas, se consideró que una muestra era positiva al observarse la amplificación de la región ITS en las dos alícuotas. Por tanto, para los fines de este estudio se definió la colonización de una muestra como la identificación del ADN del microorganismo sin que existan signos ni síntomas clínicos o radiológicos de neumonía o de infección respiratoria en el paciente. 3.8. Cuantificación de citoquinas y quitotriosidasa. Se cuantificaron las concentraciones sistémicas de las citoquinas IL-1 IL-1, IL-2, IL-6, IL-8, IL-10, IL-12p70, IFN- y TNF- con dos array de ELISA (Custom Human 5-Plex Array y Human Cytokine Array 1, ambos proporcionados por Aushon Biosystems) que detectaban la presencia de cinco o nueve proteínas a la vez, respectivamente. Cada pocillo de la placa contenía anticuerpos específicos para capturar a su citoquina correspondiente, de manera que una vez incubada la placa con los estándares y las muestras, las proteínas que no nos interesaban no se unieron y se eliminaron con el lavado. Después se añadieron anticuerpos marcados con biotina que se unen específicamente a un segundo epítopo de las proteínas diana. Tras incubar y lavar la placa para eliminar el exceso de anticuerpos, se añadió la Estrepavidina-HRP que es una enzima que reacciona con gran variedad de sustratos para producir una señal luminiscente que es detectada en un espectrofotómetro utilizando 450 nm como longitud de onda principal. La cantidad de señal producida es proporcional a la concentración de cada proteína en los estándares y en las muestras. La cuantificación de los niveles séricos de quitotriosidasa se realizó en el Laboratorio Central del Hospital Universitario Virgen del Rocío utilizando equipos automatizados comerciales y siguiendo un protocolo previamente publicado (Hollack et al., 1994). Para ello, primeramente se prepararon dos soluciones tampón: 67 1. Tampón Citrato/Fosfato a pH 5,2: se preparó mezclando 50 ml de solución de citrato (solución de ácido cítrico 100 mM) con 52,5 ml de solución de fosfato (solución de PO4HK2 200 mM). Una vez preparado, el tampón se conservó a 4ºC. 2. Tampón Glicina 0,3 M a pH 10,6: se preparó disolviendo 5,62 g de glicina en 200 ml de agua destilada y se llevó a pH 10,6 con una solución de NaOH 5N. Una vez preparado, también se conservó a 4ºC. Además se preparó una solución de 4-Methylumbelliferyl-β-D-N,N',N''- triacetylchitotrioside (4-MUF-QT) 0,025 mM, un sustrato fluorogénico que en principio no es fluorescente pero que produce un compuesto fluorescente cuando la enzima quitotriosidasa actúa sobre él. Por otro lado, se preparó una Curva de Calibración utilizando el Tampón Citrato/Fosfato para hacer las diluciones del estándar. La actividad quitotriosidasa se midió incubando 10 µl de cada muestra de suero con 100 µl de sustrato 4-MUF-QT durante 15 minutos a 37ºC. A continuación, la reacción se paró añadiendo a cada muestra 2 ml del Tampón de Glicina y se leyó la fluorescencia a 365/445 nm. Los resultados se obtuvieron por interpolación a partir de la Curva de Calibración y se expresaron en nmoles/ml/hora. 3.9. Cuantificación de MCP-1. La proteína humana MCP-1 se cuantificó en el suero de cada paciente mediante un ensayo inmunoenzimático (Human MCP-1 ELISA Kit) proporcionado por Thermo Scientific. Por recomendación del fabricante, los sueros no se diluyeron para este análisis y los valores obtenidos se compararon con aquellos esperados para adultos sanos (228-475 pg/ml). 3.10. Cuantificación de β-glucanos. Se midió la concentración sistémica de β-glucanos en el suero de cada paciente usando el Kit Assay for (13)-B-D-Glucan in Serum, proporcionado por Fungitell® (Associates of Cape Cod, Inc., EE.UU.). Aunque este ensayo está indicado para el diagnóstico presuntivo de la infección por hongos, no detecta ciertas especies de hongos 68 como el género Cryptococcus, que produce niveles muy bajos de este polisacárido; ni hongos de la familia Zygomycetes, que no producen (1→3)-β-D-glucano. Sin embargo, este ensayo colorimétrico sí puede detectar β-glucanos producidos por otros hongos patógenos oportunistas, entre ellos: Candida spp., Aspergillus spp., Fusarium spp., Saccharomyces cerevisiae y Pneumocystis jirovecii. El ensayo se basa en que el factor G de un lisado de amebocitos de Limulus es sensible a este componente de la pared fúngica. El Fungitell Reagent está modificado para eliminar el factor C, de manera que el β-glucano actuaría sólo sobre el Factor G, una serina proteasa. Una vez activada esta enzima, se produce una cascada enzimática que termina creando un cromóforo que absorbe a una longitud de onda de 405 nm. El ensayo cinético Fungitell se basa, pues, en la determinación de la tasa de aumento de densidad óptica producido por una muestra. Esta tasa se interpreta frente a una curva estándar para producir estimaciones de la concentración de (1-3)-β-D-glucano en la muestra. 3.10.1. Protocolo del ensayo Fungitell. Primero se procedió a la preparación de la curva estándar de glucano: se disolvió el estándar suministrado por el kit con el volumen de RGW indicada en el vial, para hacer una solución de 100 pg/ml. A partir de esta solución, se hicieron diluciones usando tubos libres de glucanos, de manera que al final teníamos diferentes concentraciones: 50 pg/ml, 25 pg/ml, 12,5 pg/ml y 6,25 pg/ml. A continuación, se preparó el reactivo alcalino de pre-tratamiento del suero, que convierte glucanos de triple hélice en glucanos de cadena simple que son más reactivos en el ensayo. Se combinaron entonces volúmenes iguales de KOH (0,25 M) y KCl (1,2 M) en tubos libres de glucanos. Las muestras de suero ya descongeladas se homogeneizaron usando un vórtex para después transferir 5 µl de cada una al pocillo de la placa designado en cada caso. Cada muestra se testó por duplicado. Inmediatamente se añadieron 20 µl de reactivo de pre-tratamiento del suero, se agitó la placa durante 10 segundos para mezclar el contenido de los pocillos y se incubó durante 10 minutos a 37 ° C en el lector de placas de incubación. 69 Este tiempo de espera se empleó en la reconstitución de un vial de reactivo Fungitell mediante la adición de 2,8 ml de RGW y después añadiendo 2,8 ml de tampón de reconstitución Pyrosol. Se realizó en tubo libre de glucanos que se cerró con Parafilm y se agitó suavemente para disolver completamente. Al finalizar la incubación del suero, se retiró la placa del incubador, se añadieron 25 µl de cada estándar por duplicado a su pocillo correspondiente y se utilizó RGW como control negativo. A continuación, se añadieron 100 µl de reactivo Fungitell a cada pocillo, se agitó la placa y se introdujo la placa en el lector de microplacas (previamente equilibrado a 37 °C), donde se leyó a 405 nm menos 490 nm, durante 40 minutos a 37 ° C. Se calculó la tasa media de cambio de densidad óptica (unidades mili-absorbancia por minuto) para todos los puntos entre 0 y 40 minutos. 3.10.2. Interpretación de los resultados. Los resultados se expresaron en pg/ml. Se consideraron resultados negativos para infección invasiva aquellos valores de β-glucanos inferiores a 60 pg/mL y positivos aquellos valores que eran iguales o superiores a 80 pg/ml. Los resultados cuyos valores se encontraban en el intervalo de 60 a 79 pg/mL sugieren una posible infección fúngica invasiva pero se consideraron indeterminados. 3.11. Recogida y análisis de datos. Los datos epidemiológicos, clínico-biológicos, inmunológicos y microbiológicos se recogieron en un formato estandarizado, utilizando para ello un cuaderno de recogida de datos (Anexo I). Todos los datos fueron traspasados a soporte magnético, mediante procedimientos operativos que contemplan: doble introducción de información, contraste automático de datos, detección de valores atípicos y rutinas de depuración lógica para la detección de inconsistencias. Toda la información se introdujo en una base de datos construida expresamente para este proyecto, garantizando mediante la encriptación bajo código el cumplimiento de la normativa vigente sobre protección de datos de carácter personal (Ley Orgánica 15/1999). 70 Se realizó una estadística descriptiva de las variables del estudio. La comparación de variables cualitativas se realizó aplicando el test exacto de Fisher o el test Chi-cuadrado de Pearson, según el tamaño de la muestra. Las variables cuantitativas se compararon mediante la Prueba de Mann-Whitney, excepto en el estudio de la relación de β-glucanos con la respuesta inflamatoria en el que se empleó el análisis Rho de Spearman. Para las variables cualitativas se utilizaron frecuencias absolutas, mientras que las variables cuantitativas se expresaron como media y desviación estándar (Md±DE). Se comprobó la normalidad de la distribución de las variables cuantitativas mediante las pruebas de Shapiro-Wilk (n<50) y Kolmogorf- Smirnof (n>50). El análisis estadístico se realizó utilizando el paquete estadístico SPSS versión 14.0. El nivel de significación estadística se estableció para un valor de p < 0,05. 3.12. Aspectos éticos. En el presente estudio se aplicaron los principios éticos recogidos en la última revisión de la Declaración de Helsinki, así como los recogidos en el Convenio del Consejo de Europa relativo a los derechos humanos y la biomedicina y en la Declaración Universal de la UNESCO sobre el genoma humano y los derechos humanos. Se cumplieron todos los requisitos establecidos en la legislación española en el ámbito de la investigación biomédica, la protección de datos de carácter personal y la bioética. El presente estudio contó con la aprobación oficial del Comité de Ética de la Investigación del Hospital Universitario Virgen del Rocío de Sevilla. La participación en el proyecto fue voluntaria y la solicitud de participación fue realizada como una propuesta de investigación en salud, independiente del proceso asistencial convencional del sistema sanitario. A cada participante se le informó por escrito de la naturaleza de la investigación y del uso de la información obtenida, así como de su derecho al acceso, modificación o eliminación de los registros en cualquier momento. Se garantizó la confidencialidad de los datos así como su utilización solo para los fines especificados del estudio. Además se solicitó un consentimiento informado por escrito (Anexo II) a los participantes. 71 RESULTADOS 72 1. Características de la población estudiada. En el estudio se incluyeron un total de 76 sujetos que, voluntariamente, firmaron el consentimiento informado para participar en el mismo. De todos ellos se obtuvieron simultáneamente muestras de esputo espontáneo y de lavado orofaríngeo (LOF). En el mismo momento se extrajo sangre total para la obtención de muestras séricas. Los datos espirométricos obtenidos de las pruebas funcionales respiratorias a las que fueron sometidos estos individuos previamente a la inclusión en el estudio permitieron establecer el estadio de la EPOC que presentaba cada uno de ellos según criterios de la GOLD, así, se dividieron en tres categorías. Se incluyeron como grupo control (n=9) sujetos con historia tabáquica actual o reciente pero sin diagnóstico de EPOC que presentaban un VEF1/VFC > 0,7. Los individuos con diagnóstico de EPOC (VEF1/VFC < 0,7) se dividieron en dos grupos en función de la gravedad de la enfermedad que presentaban en el momento de la inclusión. Se consideraron como pacientes con EPOC leve/moderada los pacientes con un VEF1 ≥ 80% y que, por tanto, se encuentran en estadio 1 según los criterios de la GOLD (n=17); junto con los pacientes con un VEF1 entre el 79 y el 50 %, correspondiente al estadio 2 (n=17). Se consideraron como pacientes con EPOC grave/muy grave aquellos pacientes (n= 18) que presentaban una limitación grave del flujo aéreo correspondiente al estadio 3 (VEF1 del 49 al 30%) y los sujetos en estadio 4 de la clasificación de la GOLD, con una limitación al flujo aéreo muy grave y con un VEF1 menor al 30% (n=15). Estos datos se ilustran en la Figura 5 y se resumen en la Tabla 7. Figura 5. Descripción del número de sujetos por grupo de estudio No EPOC Estadio 1 Estadio 2 Estadio 3 Estadio 4 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 Número de sujetos Control EPOC Leve EPOC Grave 73 Tabla 7. Número de pacientes incluidos en el estudio, analizados según la clasificación de la GOLD. GRUPOS NÚMERO DE INDIVIDUOS N (estadio GOLD) % DE LA MUESTRA Controles n= 9 (Estadio 0) 11,8 EPOC Leve n=17 (Estadio 1) n=17 (Estadio 2) 44,8 EPOC Grave n=18 (Estadio 3) n=15 (Estadio 4) 43,4 Total n= 76 100 2. Características clínico-biológicas de la población. En la Tabla 8 se muestran los datos demográficos y clínico-epidemiológicos recogidos de cada sujeto, tales como: edad, sexo, hábito tabáquico y función pulmonar. En los 76 sujetos incluidos en el estudio, la edad media era de 68,01 ±11,07 (edad media ± DE). El 90,8% de ellos eran hombres y el 9,2 % mujeres. Respecto al hábito tabáquico, todos los sujetos habían estado expuestos al humo del cigarrillo en algún momento de su vida. En concreto, 27 de estos individuos (35,5 %) eran fumadores activos en el momento de la toma de las muestras, mientras que los otros 49 (64,5 %) eran exfumadores. Siguiendo los criterios del estudio, en el momento de la toma de muestra los sujetos presentaban situación clínica estable, ninguno de ellos sufría exacerbación de la EPOC, ni ninguna otra condición que pudiera contribuir a la activación de la respuesta inmune. Tampoco habían seguido tratamiento con antibióticos en al menos los tres meses previos. Tabla 8. Características clínico-epidemiológicas de los sujetos incluidos en el estudio. CARACTERÍSTICAS CONTROL EPOC LEVE EPOC GRAVE Edad (edad media ± DE) 58,11 ± 15,19 67,88 ± 9,66 70,85 ± 9,88 Sexo (% hombres) 55,56 94,12 96,97 Fumador activo (%) 77,78 35,29 21,21 % de VEF1 (media ± DE) 95,00 ± 13,12 74,30 ± 19,17 36,40 ± 7,48 80 Además, se identificaron hongos que solo aparecían en una muestra de paciente cada uno. Éste fue el caso del género Torulaspora, en el que no se pudo concretar la especie; y las especies Antrodia sinuosa, Aspergillus restrictus, Cystofilobasidium capitatum, Dioszegia hungarica, Phialocephala trigonospora, Phlebiopsis peniophoroides, Pichia fermentans, Rhodosporidium babjevae, Trametes versicolor y Zygosaccharomyces rouxii. Por último, en uno de los casos del grupo control y en dos de los pacientes se consiguió amplificar la región ITS pero la secuencia que se obtuvo no correspondía a ninguna especie fúngica que en la actualidad estuviese descrita en la base de datos de PubMed. En estos casos, se consideraron como hongos no identificables (HNI). 3.2 Colonización por hongos y grados de la EPOC. En la Figura 6 se muestra la diversidad y la frecuencia de colonización de las especies y géneros fúngicos identificados en cada grupo de pacientes con EPOC. Alternaria spp. Antrodia sinuosa Aspergillus spp. Candida spp. Cladosporium spp. Cryptococcus spp. Cystofilobasidium capitatum Debaryomyces hansenii Dioszegia hungarica Galactomyces geotrichum Penicillium spp. Peniophora spp. Phialocephala trigonospora Phlebiopsis peniophoroides Pichia fermentans Pneumocystis jirovecii Rhodosporidium babjevae Rhodotorula spp. Saccharomyces cerevisiae Sporobolomyces spp. Torulaspora spp. Trametes versicolor Wallemia sebi Zygosaccharomyces rouxii EPOC Leve EPOC Grave Figura 6. Descripción de géneros y especies fúngicas en los dos grupos de EPOC. La frecuencia con la que cada hongo aparece en uno u otro grupo fueron analizadas con el test Chi-cuadrado de Pearson para valorar si había alguna relación entre la colonización por hongos y la gravedad de la EPOC. En este análisis se excluyeron a los sujetos control por no presentar la enfermedad. Se concluyó que no existían diferencias estadísticamente significativas en la prevalencia de la colonización 81 por los distintos hongos entre los dos grupos EPOC considerados. Estos datos se muestran en la tabla 13. 82 Tabla 13. Colonización por hongos y gravedad de la EPOC HONGO EPOC LEVE (n=34). Núm. Colonizados (%) EPOC GRAVE (n=33). Núm. Colonizados (%) Chi-cuadrado de Pearson (p) Género Alternaria - A. alternata - A. pluriseptata - A. tenuissima 1 (2,9) 1 (2,9) 0 (0) 1 (2,9) 3 (9,1) 0 (0) 1 (3,0) 0 (0) 0,288 Antrodia sinuosa 0 (0) 1 (3,0) 0,306 Aspergillus restrictus 0 (0) 1 (3,0) 0,306 Género Candida - C. albicans - C. galbrata - C. galli - C. intermedia - C. orthopsilosis - C. pararugosa - C. sake - C. tropicalis 19 (55,9) 14 (41,2) 3 (8,8) 1 (2,9) 1 (2,9) 1 (2,9) 1 (2,9) 1 (2,9) 2 (5,9) 17 (51,5) 13 (39,4) 2 (6,1) 0 (0) 0 (0) 0 (0) 0 (0) 0 (0) 3 (9,1) 0,720 Género Cladosporium - C. cladosporioides - C. herbarum 14 (41,2) 1 (2,9) 0 (0) 7 (21,2) 2 (6,1) 1 (3,0) 0,078 Género Cryptococcus - C. neoformans 0 (0) 0 (0) 2 (6,1) 1 (3,0) 0,145 Cystofilobasidium capitatum 1 (2,9) 0 (0) 0,321 Debaryomyces hansenii 0 (0) 2 (6,1) 0,145 Dioszegia hungarica 0 (0) 1 (3,0) 0,306 Galactomyces geotrichum 1 (2,9) 1 (3,0) 0,983 Género Penicillium - P. brevicompactum - P. minioluteum 1 (2,9) 1 (2,9) 0 (0) 1 (3,0) 0 (0) 1 (3,0) 0,983 Género Peniophora - P. lycii - P. rosea 2 (5,9) 1 (2,9) 1 (2,9) 0 (0) 0 (0) 0 (0) 0,157 Phialocephala trigonospora 1 (2,9) 0 (0) 0,321 Phlebiopsis peniophoroides 0 (0) 1 (3,0) 0,306 Pichia fermentans 0 (0) 1 (3,0) 0,306 Pneumocystis jirovecii 14 (41,2) 13 (39,4) 0,882 Rhodosporidium babjevae 1 (2,9) 0 (0) 0,321 Género Rhodotorula - R. mucilaginosa - R. slooffiae 3 (8,8) 2 (5,9) 1 (2,9) 0 (0) 0 (0) 0 (0) 0,081 Saccharomyces cerevisiae 1 (2,9) 1 (3,0) 0,983 Género Sporobolomyces - S. coprosmae - S. roseus 3 (8,8) 1 (2,9) 3 (8,8) 2 (6,1) 0 (0) 2 (6,1) 0,667 Género Torulaspora 1 (2,9) 0 (0) 0,321 Trametes versicolor 1 (2,9) 0 (0) 0,321 Wallemia sebi 0 (0) 2 (6,1) 0,145 Zygosaccharomyces rouxii 0 (0) 1 (3,0) 0,306 HNI 1 (2,9) 1 (3,0) 0,983 83 Se observa una elevada prevalencia del género Candida tanto en pacientes con EPOC leve (55,9%) como en EPOC grave (51,5%), siendo C. albicans la especie más frecuente. C.galbrata y C. tropicalis también fueron identificadas con una frecuencia similar en los diferentes estadios de la enfermedad (entre dos y tres casos cada una). Sin embargo, parece que en los pacientes con EPOC leve hay más variabilidad de especies, identificándose: C. sake, C. orthopsilosis, C. pararugosa, C. intermedia y C. galli. Estas especies sólo se amplificaron una vez cada una y sólo en los estadios más leves de la enfermedad. En cuanto a la frecuencia de P. jirovecii, fue prácticamente similar en pacientes con EPOC leve y con EPOC grave, con prevalencias de colonización del 41,2 y 39,4%, respectivamente. El género Cladosporium se identificó en los estadios más leves de la enfermedad, con una prevalencia de colonización del 41,2% frente al 21,2% observado en pacientes con EPOC grave. La especie C. herbarum sólo se identificó en un caso de EPOC grave, mientras que C. cladosporioides se identificó en los dos grupos. Aun así, en la mayoría de los casos no se pudo determinar la especie. El género Sporobolomyces colonizaba el tracto respiratorio de tres pacientes con EPOC leve y dos con EPOC grave. En el primer grupo se identificaron las especies S. roseus y S. coprosmae, mientras que el segundo grupo sólo S. roseus. De igual forma, el género Alternaria se encontró en ambos grupos, sin embargo en la EPOC grave sólo se pudo determinar hasta nivel de especie un caso de A. pluriseptata, mientras que en EPOC leve se identificaron las especies A. alternata y A. tenuissima. Las especies Galactomyces geotrichum y Saccharomyces cerevisiae fueron cada una identificadas en un paciente de cada grupo. El género Penicillium también se secuenció en los dos grupos, con la diferencia de que la especie P. brevicompactum sólo se identificó en un paciente con EPOC leve y la especie P. minioluteum en un paciente con EPOC grave. Finalmente, los géneros Rhodotorula, Torulaspora y Peniophora y las especies Cystofilobasidium capitatum, Phialocephala trigonospora, Rhodosporidium babjevae y Trametes versicolor se identificaron en las muestras que pertenecían a pacientes con 84 EPOC leve; mientras que el género Cryptococcus y las especies Antrodia sinuosa, Aspergillus restrictus, Debaryomyces hansenii, Dioszegia hungarica, Phlebiopsis peniophoroides, Pichia fermentans, Wallemia sebi y Zygosaccharomyces rouxii solo colonizaban pacientes con EPOC grave. De las 67 muestras de esputo recogidas de los pacientes incluidos en el estudio, dos resultaron positivas para la colonización por hongos tras amplificar la región ITS por PCR y posterior secuenciación del fragmento amplificado, pero la identificación del microorganismo no se pudo llevar a cabo porque la secuencia se correspondía con secuencias fúngicas registradas en PUBMed pero no aparecía ninguna taxonomía concreta. Una de estas muestras era de un paciente con estadio I de la GOLD y la otra pertenecía a un paciente con estadio III. 3.3. Estudio de la respuesta inflamatoria sistémica. 3.3.1. Comparación entre sujetos colonizados y no colonizados en el total de la población estudiada. Se determinó la respuesta inflamatoria sistémica en el total de la población estudiada con el fin de comprobar si existía una relación entre la colonización por hongos en el tracto respiratorio de los sujetos en estudio y los niveles séricos de varias citoquinas. Las determinaciones se realizaron de manera individual y por duplicado en cada una de las muestras, tal como se indica en el apartado de Material y Método. Para ello se usaron lotes de ELISA convencional para medir los niveles de MCP-1 (pg/ml) y un Array comercial de multicitoquinas (AUSHOM) basados en quimioluminiscencia con los que se midieron las concentraciones séricas en pg/ml de las citoquinas proinflamatorias: IL-1α, IL-1β, IL-2, IL-8, IL-12p70, TNF-α e IFN-γ; la citoquina antiinflamatoria IL-10; y la citoquina IL-6, que tiene actividad proinflamatoria y antiinflamatoria. Además, se midió la actividad sérica de la enzima quitotriosidasa, componente de la inmunidad innata utilizada en la defensa contra hongos. Esta proteína está considerada como un biomarcador de la estimulación de macrófagos, siendo principalmente producida en situaciones de activación crónica de éstos. Al igual que con las citoquinas, previamente descritas, se estudió estadísticamente la alteración de 85 los niveles de actividad de quitotriosidasa en función de situación de colonización y no colonización por los tres géneros fúngicos más frecuentes hallados en las muestras de esputo. Se compararon los valores medios calculados para cada citoquina entre sujetos colonizados y no colonizados por los hongos cuya prevalencia era mayor al 30 % en alguno de los grupos, en concreto, los géneros Candida, Pneumocystis y Cladosporium. A continuación se aplicó la Prueba de Mann-Whitney a los datos medidos para estudiar si la presencia de estos hongos en el pulmón de estos individuos producía un cambio estadísticamente significativo en los niveles séricos de estas citoquinas y de la actividad de la quitotriosidasa y, por tanto, una alteración de la respuesta inflamatoria sistémica del huésped. Estos datos se muestran en las Tablas 14, 15 y 16. Tabla 14. Comparación de los niveles séricos de citoquinas y de actividad de quitotriosidasa entre sujetos colonizados y no colonizados por el género Candida. CONCENTRACIÓN (pg/ml para citoquinas y nmoles/ml/hora para quitotriosidasa) FUNCIÓN EN EL SISTEMA INMUNE BIOMARCADOR SUJETOS NO COLONIZADOS (N=29) SUJETOS COLONIZADOS (N=31) PRUEBA DE MANNWHITNEY (P) MCP-1 757,00 ± 77,22 952,48 ± 94,69 0,189 Factor quimiotáctico IL-8 21,17 ± 8,50 15,67 ± 2,51 0,796 IL-6 24,79 ± 9,81 14,89 ± 2,50 0,579 Proinflamatoria, respuesta inmune innata y adaptativa INF-γ 13,83 ± 4,78 4,46 ± 0,96 0,840 IL-1α 2,74 ± 1,20 3,24 ± 1,31 0,143 Proinflamatoria y respuesta inmune innata IL-1β 2,64 ± 1,09 1,17 ± 0,38 0,603 Inmunosupresora, respuesta inmune innata y adaptativa IL-10 3,53 ± 1,20 1,49 ± 0,22 0,127 Respuesta inmune innata y adaptativa TNF-α 29,27 ± 9,99 21,65 ± 4,10 0,700 IL-12p70 9,20 ± 5,05 4,75 ± 1,72 0,773 Respuesta inmune innata Quitotriosidasa 81,59 ± 9,40 120,73 ± 15,53 0,021 Respuesta inmune adaptativa IL-2 29,93 ± 18,83 7,80 ± 2,96 0,111 86 Los sujetos colonizados por el género Candida mostraron niveles séricos diferentes a los encontrados en sujetos no colonizados, pero en ningún caso estas diferencias resultaron significativas de manera estadística. Tampoco se apreciaron diferencias significativas en los niveles de MCP-1 entre individuos colonizados y no colonizados. Sin embargo, los niveles de actividad de quitotriosidasa, enzima que representa la actividad de los macrófagos, sí se vieron influenciados por la presencia del género Candida: los sujetos colonizados y no colonizados presentaban niveles séricos de quitotriosidasa de 120,73 ± 15,53 nmoles/ml/hora y 81,59 ± 9,40 nmoles/ml/hora respectivamente (p = 0,021). En la Figura 7 se representan estos datos. Figura 7. Representación gráfica de los niveles séricos de citoquinas, MCP-1 y actividad de quitotriosidasa en sujetos colonizados y no colonizados por el género Candida. Por otro lado, tal y como se muestra en la Tabla 15, los sujetos colonizados por P. jirovecii presentaban niveles séricos de IL-1α, IL-6, IL-8, TNF-α y del factor atrayente de macrófagos MCP-1 significativamente elevados respecto a los sujetos no IL-1α IL-1β IL-2 IL-6 IL-8 IL-10 IL-12p70 TNF-α IFN-γ 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 No colonizado Colonizado Citoquinas Concentración (pg/ml) MCP-1 0 100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 Concentración (pg/ml) Quitotriosidasa 0 25 50 75 100 125 150 Concentración (pg/ml) 87 colonizados. Sin embargo, no se apreciaron cambios en los niveles del resto de las citoquinas analizadas. Tampoco se observó una influencia estadísticamente significativa de este hongo sobre los niveles de actividad de quitotriosidasa en los pacientes colonizados. La Figura 8 representa gráficamente estos valores. Tabla 15. Comparación de los niveles séricos de citoquinas y quitotriosidasa entre sujetos colonizados y no colonizados por P.jirovecii. CONCENTRACIÓN (pg/ml para citoquinas y nmoles/ml/hora para quitotriosidasa) FUNCIÓN EN EL SISTEMA INMUNE BIOMARCADOR SUJETOS NO COLONIZADOS (N=37) SUJETOS COLONIZADOS (N=23) PRUEBA DE MANNWHITNEY (P) MCP-1 729,40 ± 67,33 1064,87 ± 109,96 0,015 Factor quimiotáctico IL-8 16,15 ± 6,60 21,83 ± 3,52 <0,001 IL-6 12,05 ± 1,69 31,93 ± 12,25 0,041 Proinflamatoria, respuesta inmune innata y adaptativa INF-γ 6,26 ± 1,88 13,38 ± 5,50 0,139 IL-1α 1,09 ± 0,32 6,08 ± 2,12 <0,001 Proinflamatoria y respuesta inmune innata IL-1β 1,45 ± 0,56 2,58 ± 1,18 0,258 Inmunosupresora, respuesta inmune innata y adaptativa IL-10 1,53 ± 0,21 4,00 ± 1,50 0,126 Respuesta inmune innata y adaptativa TNF-α 14,45 ± 3,07 42,83 ± 12,06 0,040 IL-12p70 3,15 ± 0,75 12,93 ± 6,54 0,802 Respuesta inmune innata Quitotriosidasa 113,97 ± 14,41 82,26 ± 7,45 0,164 Respuesta inmune adaptativa IL-2 6,78 ± 1,89 37,36 ± 23,75 0,209 88 Figura 8. Representación gráfica de los niveles séricos de citoquinas, MCP-1 y actividad de quitotriosidasa en sujetos colonizados y no colonizados por P. jirovecii. IL-1α IL-1β IL-2 IL-6 IL-8 IL-10 IL-12p70 TNF-α IFN-γ 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 No colonizado Colonizado Citoquinas Concentración (pg/ml) MCP-1 0 100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 Concentración (pg/ml) Quitotriosidasa 0 25 50 75 100 125 150 Concentración (pg/ml) 89 Tabla 16. Comparación de los niveles séricos de citoquinas y actividad de quitotriosidasa entre sujetos colonizados y no colonizados por el género Cladosporium. Tal y como se observa en la Tabla 16, los niveles séricos de citoquinas no parecían verse alterados de manera estadísticamente significativa en los sujetos colonizados por el género Cladosporium. De igual modo, tampoco se apreciaron diferencias significativas en los niveles de actividad de la quitotriosidasa entre sujetos colonizados y no colonizados. Estos datos se representan en la Figura 9. CONCENTRACIÓN (pg/ml para citoquinas y nmoles/ml/hora para quitotriosidasa) FUNCIÓN EN EL SISTEMA INMUNE BIOMARCADOR SUJETOS NO COLONIZADOS (N=40) SUJETOS COLONIZADOS (N=20) PRUEBA DE MANNWHITNEY (P) MCP-1 870,75 ± 73,64 832,50 ± 117,80 0,818 Factor quimiotáctico IL-8 15,11 ± 2,53 24,76 ± 11,87 0,900 IL-6 21,35 ± 7,13 16,31 ± 3,93 0,471 Proinflamatoria, respuesta inmune innata y adaptativa INF-γ 10,81 ± 3,52 5,34 ± 1,64 0,893 IL-1α 3,89 ± 1,29 1,23 ± 0,46 0,147 Proinflamatoria y respuesta inmune innata IL-1β 2,09 ± 0,81 1,48 ± 0,57 0,879 Inmunosupresora, respuesta inmune innata y adaptativa IL-10 2,69 ± 0,89 2,04 ± 0,37 0,406 Respuesta inmune innata y adaptativa TNF-α 29,70 ± 7,37 16,58 ± 5,27 0,242 IL-12p70 8,66 ± 3,83 3,37 ± 1,17 0,944 Respuesta inmune innata Quitotriosidasa 99,19 ± 9,73 107,05 ± 21,19 0,875 Respuesta inmune adaptativa IL-2 23,10 ± 13,81 9,30 ± 2,93 0,335 96 Por otro lado, los niveles séricos de MCP-1 aumentaba de manera significativa por la presencia de P. jirovecii en los estadios más leves de la enfermedad. Finalmente, la colonización por esta especie no parece alterar de manera estadísticamente significativa la actividad sérica de la enzima quitotriosidasa en los pacientes con EPOC. Estos datos se ilustran en las Figuras 14 y 15. Figura 14. Representación gráfica de los niveles séricos de MCP-1 en pacientes colonizados y no colonizados por Pneumocystis jirovecii en los dos grupos de pacientes EPOC. Figura 15. Representación gráfica de los niveles de actividad de quitotriosidasa en pacientes colonizados y no colonizados por Pneumocystis jirovecii en los dos grupos de pacientes EPOC. Quitotriosidasa 0 20 40 60 80 100 120 140 EPOC Leve Concentración (pg/ml) Quitotriosidasa 0 20 40 60 80 100 120 140 No Colonizado Colonizado EPOC Grave Concentración (pg/ml) MCP-1 0 200 400 600 800 1000 1200 1400 EPOC Leve Concentración (pg/ml) MCP-1 0 200 400 600 800 1000 1200 1400 No Colonizado Colonizado EPOC Grave Concentración (pg/ml) 97 Tabla 19. Comparación de los niveles séricos de citoquinas y quitotriosidasa entre sujetos colonizados y no colonizados por el género Cladosporium en los dos grupos de EPOC. EPOC Leve EPOC Grave Función Citoquina No colonizado (n=18) Colonizado (n=13) Prueba de Mann-Whitney (P) No colonizado (n=15) Colonizado (n=15) Prueba de Mann-Whitney (P) MCP-1 (pg/ml) 876,22 ± 115,43 819,77 ± 138,81 0,924 879,65 ± 94,02 856,14 ± 232,04 0,902 Factor quimiotáctico IL-8 (pg/ml) 15,95 ± 4,91 30,33 ± 18,18 0,749 15,72 ± 2,61 14,40 ± 4,51 0,607 IL-6 (pg/ml) 26,56 ± 15,36 18,35 ± 5,44 0,904 18,41 ± 3,73 12,54 ± 5,14 0,111 Proinflamatoria, respuesta inmune innata y adaptativa INF-γ (pg/ml) 7,64 ± 3,60 6,21 ± 2,30 0,702 12,87 ± 5,47 3,74 ± 1,99 0,486 IL-1α (pg/ml) 3,12 ± 0,86 1,34 ± 0,68 0,073 4,33 ± 2,16 1,03 ± 0,44 0,941 Proinflamatoria y respuesta inmune innata IL-1β (pg/ml) 1,15 ±0,68 1,81 ± 0,82 0,271 2,77 ± 1,29 0,86 ± 0,53 0,396 Inmunosupresora, respuesta inmune innata y adaptativa IL-10 (pg/ml) 2,59 ± 1,19 1,97 ± 0,38 0,388 2,71 ± 1,25 2,18 ± 0,85 0,980 Respuesta inmune innata y adaptativa TNF-α (pg/ml) 32,86 ± 8,69 16,48 ± 7,03 0,065 25,99 ± 11,06 16,77 ± 8,25 0,941 IL-12p70 (pg/ml) 11,33 ± 7,45 4,38 ± 1,75 0,378 6,20 ± 2,92 1,49 ± 0,25 0,351 Respuesta inmune innata Quitotriosidasa (nmoles/ml/hora) 113,25 ± 19,25 106,07 ± 28,83 0,660 86,85 ± 7,45 108,87 ± 31,22 0,677 Respuesta inmune adaptativa IL-2 (pg/ml) 8,61 ± 4,44 12,18 ± 4,28 0,130 33,44 ± 23,77 3,96 ± 1,57 0,899 98 El análisis comparativo entre pacientes colonizados y no colonizados por el género Cladosporium en cada grupo de EPOC no mostró diferencias estadísticamente significativas para ninguno de los marcadores inflamatorios estudiados, tal y como se observa en la Tabla 19. Estos datos aparecen representados en las Figuras 16, 17 y 18. Figura 16. Representación gráfica de los niveles séricos de citoquinas en pacientes colonizados y no colonizados por el género Cladosporium en los dos grupos de pacientes EPOC. Figura 17. Representación gráfica de los niveles séricos de MCP-1 en pacientes colonizados y no colonizados por el género Cladosporium en los dos grupos de pacientes EPOC MCP-1 0 100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 No Colonizado Colonizado EPOC Grave Concentración (pg/ml) MCP-1 0 100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 EPOC Leve Concentración (pg/ml) IL-1α IL-1β Il-2 IL-6 IL-8 IL-10 IL-12p70 TNF-α IFN-γ 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 No colonizado Colonizado EPOC Leve Concentración (pg/ml) IL-1α IL-1β Il-2 IL-6 IL-8 IL-10 IL-12p70 TNF-α IFN-γ 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 EPOC Grave Concentración (pg/ml) 99 Figura 18. Representación gráfica de los niveles de actividad de quitotriosidasa en sujetos colonizados y no colonizados por el género Cladosporium en los dos grupos de pacientes EPOC. 4. Cuantificación de los niveles séricos de β-glucano en el total de la población estudiada. Con el propósito de detectar y cuantificar los (1,3)-β-D-glucanos presentes en las muestras de suero de los sujetos en estudio, se utilizó el ensayo Fungitell. Este ensayo ha presentado una sensibilidad de entre el 70 y el 100% cuando se ha estudiado en diferentes grupos de pacientes con neumonía por Pneumocystis y, además, altos valores predictivos negativos, por lo que se consideró una técnica válida para realizar las mediciones de β-glucano en nuestro estudio (He et al., 2015). Siguiendo las recomendaciones del fabricante, se consideraron resultados negativos aquellos valores de β-glucanos inferiores a 60 pg/ml y positivos aquellos valores que eran iguales o superiores a 80 pg/ml. Hay que tener en consideración que un resultado positivo significa que se ha detectado (1,3)-β-D-Glucano en la muestra, pero no define la presencia de enfermedad y debe ser usado en combinación con otros parámetros clínicos o biológicos para establecer un diagnóstico. Por otro lado, los resultados cuyos valores se encontraban en el intervalo de 60 a 79 pg/ml sugieren una posible infección fúngica pero se consideraron indeterminados. Las muestras de suero de cada uno de los sujetos se usaron para llevar a cabo dicho ensayo. Cada una de ellas se estudió por duplicado y se repitió el ensayo para aquellas cuyos valores duplicados diferían con un CV mayor a 10 %. El resultado de cada individuo se obtuvo haciendo una media entre el valor obtenido para cada Quitotriosidasa 0 20 40 60 80 100 120 EPOC Leve Concentración (pg/ml) Quitotriosidasa 0 20 40 60 80 100 120 No Colonizado Colonizado EPOC Grave Concentración (pg/ml) 100 duplicado de la misma muestra. De ellas, 58 presentaban valores de β-glucanos inferiores a 60 pg/ml, por lo que se consideraron negativas; 17 de ellas tenían valores superiores a 80 pg/ml y, por tanto, se clasificaron como positivas, y sólo una muestra se identificó como indeterminada por presentar un valor de 64,7 pg/ml. Los valores de β-glucanos obtenidos se relacionaron con la presencia o ausencia de los tres géneros que presentaron mayor prevalencia en el total de la muestra estudiada, es decir, los géneros Candida, Pneumocystis y Cladosporium, utilizando para ello la Prueba de Mann-Whitney. En el análisis también se incluyó la especie C.albicans por presentar elevada prevalencia de colonización en la muestra y porque el test Fungitell es especialmente sensible a los β-glucanos producidos por esta especie en concreto. La concentración media de β-glucanos medida en el suero de sujetos colonizados por Candida (n=40) fue de 54,93 ± 12,23 pg/ml, muy similar a la detectada en los individuos que no estaban colonizados (n=36) por este género (50,59 ± 12,63 pg/ml). Además se realizó el mismo análisis para comparar los valores séricos de βglucanos entre sujetos colonizados (n=31) y no colonizados (n=45) por la especie C. albicans, y aunque parece que en este caso la concentración de β-glucanos es mayor en los individuos colonizados que en los no colonizados (62,69 ± 15,30 vs 46,11 ± 10,35 pg/ml), la diferencia sigue siendo no significativa estadísticamente (p=0,875). El nivel medio de β-glucanos en el suero de los sujetos no colonizados por P. jirovecii (n=43) fue algo superior al medido en aquellas muestras que pertenecían a individuos colonizados (n=33) por este hongo (57,24 ± 11,56 vs 47,19 ± 13,47 pg/ml), diferencia que tampoco resultó ser estadísticamente significativa (p=0,198). Por último, se compararon los valores séricos medios de este marcador en pacientes colonizados (n=24) y no colonizados (n=52) por el género Cladosporium, que eran 43,22 ± 11,59 y 57,33 ± 11,61 pg/ml, respectivamente. En este análisis tampoco se encontraron diferencias significativas entre los dos valores. Todos estos datos se muestran en la Tabla 20. 101 Tabla 20. Comparación de los valores medios de β-glucanos medidos en suero de sujetos colonizados y no colonizados por los géneros Candida, Pneumocystis y Cladosporium. HONGO CONCENTRACIÓN DE B- GLUCANO EN SUJETOS NO COLONIZADOS (pg/ml) CONCENTRACIÓN DE B- GLUCANO EN SUJETOS COLONIZADOS (pg/ml) PRUEBA DE MANNWHITNEY (p) Candida spp. Candida albicans 50,59 ± 12,63 46,11 ± 10,35 54,93 ± 12,23 62,69 ± 15,30 0,966 0,875 P. jirovecii 57,24 ± 11,56 47,19 ± 13,47 0,198 Cladosporium spp. 57,33 ± 11,61 43,22 ± 11,59 0,714 5. Estudio de la relación entre los niveles séricos de β-glucanos y la respuesta inflamatoria sistémica. Las siguientes figuras muestran la correlación entre los niveles séricos de βglucanos y algunas citoquinas en el total de la muestra. También se analiza la posible relación entre los β-glucanos y la actividad de quitotriosidasa. Figura 20. Distribución de los niveles de IL-8 en función de la concentración de βglucanos. Figura 21. Distribución de la actividad de Quitotriosidasa en función de la concentración de β-glucanos. Figura 22. Distribución de los niveles de TNF-a en función de la concentración de β-glucanos. Figura 19. Distribución de los niveles de IL-6 en función de la concentración de βglucanos. 102 Al observar esta correlación no lineal, se utilizó el análisis no paramétrico Rho de Spearman para conocer si unos niveles más altos de β-glucanos se asociaban a una elevación en los niveles de las citoquinas y de actividad de la quitotriosidasa medidos en el suero de estos pacientes. En dicho análisis no se apreció una relación estadísticamente significativa entre ninguna de las variables estudiadas excepto con la IL-8 (p=0,031). Parece que un aumento en los niveles de β-glucanos en sangre podría producir un incremento en los niveles de esta citoquina. Al observar la correlación entre estas dos variables (β-glucanos e IL-8) vemos que hay dos valores de IL-8 que están muy alejados del resto, ambos por encima de los 200 pg/ml. Puesto que estos dos valores podrían estar alterando la significación encontrada al aplicar el análisis Rho de Spearman, hicimos un segundo análisis dando como perdidos estos dos valores citados (véase Figura 23) y, de nuevo, la relación entre los niveles séricos de β-glucanos y la citoquina IL-8 resultaba significativa (p=0,017). Figura 23. Correlación que existe entre niveles séricos de β-glucanos e IL-8 al considerar como perdidos los dos valores superiores a 200 pg/ml. 103 DISCUSIÓN 104 Las técnicas de identificación basadas en el cultivo, aunque ampliamente utilizadas, no permiten la detección de la mayoría de los hongos que forman parte del micobioma del ser humano (Cui et al., 2013). El presente estudio resulta, pues, novedoso puesto que utiliza técnicas moleculares para caracterizar la microbiota fúngica presente en el tracto respiratorio de pacientes con EPOC. El análisis molecular de la presencia de la región espaciadora interna (ITS), conservada en la mayoría de los hongos, junto con el análisis molecular del loci mtLSU de Pneumocystis jirovecii, aporta información sobre la distribución de hongos en estos pacientes y en relación a los diferentes estadios de la enfermedad, mostrando que no existen diferencias significativas en cuanto a la colonización por diferentes especies fúngicas conforme progresa la enfermedad. Asimismo, en este trabajo se ha evaluado el posible impacto que esta colonización pudiera tener sobre la respuesta inflamatoria sistémica de estos sujetos, sugiriendo que los géneros Candida y Pneumocystis son los únicos que alteran dicha respuesta en el huésped. Por otra parte, el presente trabajo estudia el posible uso de los niveles séricos de β-glucanos como biomarcador de la colonización fúngica del tracto respiratorio, mostrando que no resulta útil para identificar la colonización fúngica en pacientes con EPOC. Finalmente, en este estudio se analiza la posible relación entre los niveles sistémicos de β-glucanos y marcadores inflamatorios, concluyendo que, posiblemente, el polisacárido fúngico influya en la concentración sérica de la interleuquina 8. 1. Limitaciones. El desarrollo del presente trabajo cuenta con una serie de limitaciones asociadas al tipo de muestras utilizadas, a las técnicas aplicadas y/o al tamaño muestral. - Tipo de muestra. El esputo se considera una muestra sucia y no es totalmente representativa de la microbiota del pulmón. En este sentido, se han publicado estudios que consideran que el LBA es más representativo de la mucosa bronquial que el esputo (Cabrera-Rubio et al., 105 2014). Sin embargo, nuestro estudio no incluía pacientes intubados, por tanto no tuvimos acceso a muestras como el aspirado bronquial o el LBA. Al ser una muestra poco invasiva, el esputo es frecuentemente utilizado en estudios epidemiológicos que exploran la microbiota del pulmón de sujetos con distintas afecciones respiratorias (García-Núñez et al., 2014; Willger et al., 2014). Por tanto, y sabiendo que lo ideal sería utilizar muestras de LBA, asumimos la limitación y sabemos que los resultados podrían variar si se tuviera acceso a otro tipo de muestras. En cuanto a la identificación de P. jirovecii en el presente trabajo, además del esputo se usaron muestras de LOF, que pueden ser fácilmente obtenidas de forma no invasiva. Si bien el LOF tampoco es una muestra tan representativa del tracto respiratorio como lo es el LBA, en los últimos años varios estudios han demostrado la utilidad del LOF como muestra respiratoria para estudiar el fenómeno de la colonización por Pneumocystis (Vargas et. al. 2000; Medrano et. al., 2005; Respaldiza et. al., 2006; Wissmann et. al., 2011, Samuel et. al., 2011). En concreto, la PCR anidada del gen mtLSU rRNA de Pneumocystis en muestras de lavado orofaríngeo ha sido utilizado con éxito en estudios previos (Medrano et. al., 2005; Respaldiza et. al., 2006; Wissmann et. al., 2011), habiéndose demostrado que tiene una sensibilidad del 95,6% y una especificidad del 87,5% para el diagnóstico de la colonización por este hongo (Respaldiza et. al., 2006). - Colonización transitoria o crónica. Por otro lado, el presente trabajo se ha realizado a partir de muestras tomadas en un momento concreto y no se ha llevado a cabo un seguimiento de cada paciente adquiriendo muestras sucesivas para compararlas en el tiempo. Este hecho podría considerarse una limitación porque no es posible concluir con certeza que los hongos identificados estén presentes de forma permanente en el tracto respiratorio de estos pacientes. De hecho, puede que estos microorganismos sean eliminados del tracto respiratorio por el aclaramiento pulmonar a lo largo del tiempo y no constituyan una colonización verdadera. 112 deberse al hecho de que Hauser sólo incluyó a dos pacientes en su análisis (Hauser et al., 2014). En Tabla 21 se muestra un resumen con los datos más relevantes de estos estudios, incluyendo el tamaño muestral, el tipo de población en estudio, la técnica que se emplea para identificar el ADN del género Candida y las muestras sobre las que se aplican estas técnicas, así como el resultado obtenido sobre la colonización por este hongo. Tabla 21. Resumen de los estudios que informan de la prevalencia de colonización por Candida en diferentes afecciones pulmonares. Estudio n Población Técnica/muestra % colonización Ghannoum et al., 2010 20 Sujetos sanos PS/EB 75 Charlson et al., 2012 21 Trasplantados de pulmón PS/LOF y LBA >63 Delhaes et al., 2012 4 FQ PS/ES 100 Güngör et al., 2013 48 FQ Cultivo/ES y FG >62,5 Przybylowska et al., 2014 53 EPOC Cultivo/FD >46 Noni et al., 2015 121 FQ Cultivo/ES 49,4 Chotirmall et al.,2010 89 FQ Cultivo/ES 49,4 Hauser et al., 2014 2 FQ PCR/ES 100 Abreviaturas: EB, enjuague bucal; EPOC, enfermedad pulmonar obstructiva crónica; ES, esputo; FD, frotis dental; FG, frotis de garganta; FQ, fibrosis quística; LBA, lavado broncoalveolar; LOF, lavado orofaríngeo; PCR, reacción en cadena de la polimerasa; PS, pirosecuenciación. Nuestros datos no mostraron diferencias en la frecuencia de colonización por Candida entre sujetos control y pacientes con EPOC y tampoco en relación a la gravedad de la enfermedad. Sin embargo, llama la atención que la especie C. albicans sea la única que aparece en los sujetos control y que en los estadios más graves de la EPOC haya una menor diversidad de especies pertenecientes a este género que en la EPOC más leve. Como hemos citado previamente, en la mayoría de las publicaciones sobre colonización fúngica en pulmón de sujetos con afecciones respiratorias la especie C.albicans es la más frecuentemente identificada dentro de su género. El hecho de encontrar gran diversidad de especies de este género en los pacientes con EPOC leve estudiados también se ha observado en pacientes con FQ (Güngör et al., 2013), de nuevo siendo C. albicans la especie más frecuente. Con estos datos y nuestros resultados, planteamos que probablemente esta especie esté mejor adaptada al huésped y 113 que compita con otras especies de Candida por los recursos del nicho ecológico, de ahí el hecho de encontrarla en los sujetos control como única especie del género. Cuando se instaura la EPOC en los pacientes, éstos empiezan a sufrir alteraciones fisiopatológicas en el pulmón, quizás favoreciendo la colonización por diferentes especies de Candida y, conforme progresa la enfermedad, las alteraciones fisiológicas e inmunológicas del huésped podrían favorecer el crecimiento de C.albicans, si realmente es la especie mejor adaptada, dando lugar a dos posibles consecuencias: 1) C.albicans aumenta su población y reduce o evita la colonización por otras especies; 2) las demás especies siguen estando presentes pero la elevada carga de ADN de C.albicans evita la identificación de otras especies minoritarias. 2.2. Pneumocystis jirovecii. La identificación de P. jirovecii se realizó utilizando el locus mtLSU, muy utilizado en estudios epidemiológicos por tratarse de un gen multicopia, lo que facilita su amplificación cuando la cantidad de microorganismos presente en la muestra es muy baja (Wakefield, 1994). De hecho, en la mayoría de las publicaciones sobre colonización fúngica en el pulmón de sujetos con afecciones respiratorias no se aprecia esta especie porque suele tratarse de estudios que usan la amplificación de la región espaciadora interna (ITS) como método de identificación y P. jirovecii sólo tiene una copia del locus ITS2 en su genoma (Nahimana et al., 2000). Tampoco se aprecia en estudios basados en el cultivo puesto que, hasta el momento, no se ha desarrollado ningún tipo de cultivo estandarizado que permita el crecimiento de esta especie (Chabé et al., 2011). Pneumocystis jirovecii tiene un considerable tropismo pulmonar en el ser humano. Se estima que alcanza una elevada prevalencia en sujetos inmunodeprimidos por ser un hongo oportunista pero que también coloniza población general sin causar sintomatología (Calderón et al., 2004a; Medrano et al., 2005). En este sentido, se han publicado diferentes datos sobre la presencia de P. jirovecii en población sana de nuestra área, comunicándose un 20% de colonización por Medrano en 2005 usando PCR anidada en muestras de LOF (Medrano et al., 2005) y un 73% de exposición al microorganismo publicado por Respaldiza en 2004 usando Western blot en muestras 114 séricas de niños (Respaldiza et al., 2004). Estos datos ponen de manifiesto que este hongo está muy extendido en nuestra región. En un estudio realizado en Chile a partir de biopsias y autopsias de individuos fallecidos de forma accidental y/o violenta, es decir, sin existir una causa médica, se observa una prevalencia de colonización del 64,9% (Ponce et al., 2010). Por tanto, la alta frecuencia de identificación de Pneumocystis en nuestro grupo control podría considerarse normal, aunque el número de sujetos era muy pequeño para poder establecer datos de prevalencia. Es importante tener en cuenta que, aunque esta especie no produzca una patología en individuos sanos, éstos podrían actuar como reservorio del hongo y ser fuente de infección para otros individuos, por ejemplo, para sujetos con EPOC. Por otro lado, se ha estudiado la prevalencia de colonización por Pneumocystis en diferentes enfermedades respiratorias crónicas. Estos datos pueden variar de un estudio a otro, aún coincidiendo en la enfermedad de base, en función del tipo de muestra y la técnica utilizada para la identificación del hongo. Teniendo esto en cuenta, se han publicado prevalencias de entre el 1,3 hasta el 38,2% en pacientes con FQ (Gal et al., 2010; Respaldiza et al., 2005; Pederiva et al., 2012); una prevalencia del 33,8% en enfermedad pulmonar intersticial (Vidal et al., 2006); y hasta un 100% de prevalencia en sujetos con cáncer de pulmón microcítico (de la Horra et al., 2004). En el ámbito de la EPOC se ha incrementado el número de estudios epidemiológicos de colonización por este hongo en los últimos 20 años, desde que Calderón y su equipo identificaran esta especie, usando técnicas de tinción, en el 10% de los sujetos con bronquitis crónica (Calderón et al., 1996). Desde este momento y con el uso de la PCR, se han descrito prevalencias de colonización que concuerdan con la encontrada en nuestro estudio para pacientes con EPOC: 40,5% (Probst et al., 2000); 40,5% (Calderón et al., 2004b); y 42.1% (Sivam et al., 2011). Un trabajo realizado recientemente en el Líbano (Khalife et al., 2015) determina una prevalencia de colonización por P. jirovecii del 17,3% en los 23 pacientes que se incluyeron en el estudio. Estos sujetos no presentaban síntomas de infección respiratoria y tampoco habían seguido tratamiento anti-Pneumocystis en los 115 seis meses previos a la inclusión en el estudio. La identificación del ADN de este microorganismo se realizó a partir de muestras de LOF, esputo, LBA y aspirado nasal y traqueal mediante amplificación por PCR anidada del gen mtLSU. No se puede descartar que esta prevalencia sea inferior a la nuestra debido a que en nuestro estudio pudiera haber falsos positivos que no se detectaron como tal porque no hubo posterior secuenciación del microorganismo, tal y como hicieron S. Khalife et al. en su trabajo, sin embargo esto parece poco probable puesto que en nuestro estudio sólo se consideraron positivas aquellas muestras que amplificaron la región de 256 pb en dos alícuotas diferentes o por distintos métodos en la misma alícuota. Es más probable que las diferencias se deban a variaciones geográficas en la prevalencia de Pneumocystis debidas a factores climáticos como ocurre con otros hongos (Varela et al., 2004). En este sentido, se obtuvieron frecuencias del 16 % mediante PCR en esputo de pacientes EPOC de Amiens, Francia, (Nevez et al., 2006) donde predomina un clima principalmente lluvioso y del 19,1% mediante PCR en biopsias pulmonares de fumadores con EPOC en San Francisco, EEUU (Morris et al., 2004). Un estudio previo realizado por nuestro grupo en 2007 concluyó que el 55% de los pacientes con EPOC presentaban colonización de las vías respiratorias por Pneumocystis (Calderón et al., 2007). Al aplicar el test estadístico Chi-cuadrado para comparar los datos de este estudio con los obtenidos en el presente trabajo sobre la prevalencia de P.jirovecii en pacientes con EPOC se observó que no había diferencias significativas (p=0,164). Por otro lado, se ha demostrado que, independientemente del hábito tabáquico, la prevalencia de colonización por P. jirovecii se correlaciona positivamente con el grado de obstrucción al flujo aéreo y, por tanto, con la gravedad de la EPOC (Morris et al., 2004), siendo la prevalencia más elevada en los estadíos avanzados de la enfermedad y sugiriendo que el ecosistema de las vías aéreas de pacientes con una obstrucción más grave representa un ambiente propicio para la colonización por este hongo. En nuestro estudio no se observan diferencias de prevalencia de colonización por esta especie entre los estadíos más leves y más graves de la enfermedad. Estas diferencias pueden deberse a condiciones diferentes a la EPOC ya que en el estudio de Morris pudo existir un sesgo de selección y diagnóstico. Las muestras de los pacientes en estadio 4 procedían de tejido pulmonar porque todos los pacientes fueron 116 trasplantados, mientras que las muestras del resto de los pacientes eran de LBA. Otra diferencia es que todos los pacientes del estudio de Morris eran fumadores activos mientras que en nuestro trabajo hay un claro declive en el número de sujetos que fuman conforme progresa la enfermedad y se ha demostrado en modelos animales que la colonización por Pneumocystis junto a la exposición al humo del tabaco acelera el desarrollo de enfisema (Christensen et al., 2008). En definitiva, la prevalencia de colonización por P. jirovecii en los pacientes con EPOC de nuestro entorno pone de manifiesto la importancia de contar en los centros clínicos con técnicas diagnósticas rápidas y fiables que identifiquen este hongo no cultivable, ya que los sujetos colonizados con afección pulmonar podrían estar en riesgo de desarrollar una neumonía por Pneumocystis (PcP) o servir como reservorio y fuente de infección para otros sujetos. Además, como explicaremos más adelante, Pneumocystis parece estimular la respuesta inflamatoria del huésped, lo que conllevaría un daño pulmonar añadido y probablemente influiría en la progresión de enfermedades pulmonares como la EPOC (Calderón et al, 2007; Morris et al., 2008). En la Tabla 22 aparecen resumidos los datos más relevantes de estos estudios, como son el tamaño muestral, el tipo de población en estudio, la técnica utilizada para identificar la colonización por P. jirovecii, las muestras sobre las que se aplican estas técnicas y la frecuencia de colonización observada. 117 Tabla 22. Resumen de los estudios que informan de la prevalencia de colonización por Pneumocystis jirovecii en diferentes afecciones pulmonares. Estudio n Población Técnica/muestra % colonización Gal et al., 2010 76 FQ PCR-TR y N-PCR/ES 1,3 Respaldiza et al., 2005 88 FQ N-PCR/ES y LOF 21,5 Pederiva et al., 2012 34 FQ N-PCR/LBA 38,2 Vidal et al., 2006 80 EPI N-PCR/LBA 33,8 de la Horra et al., 2004 10 CP N-PCR/BP 100 Calderón et al., 1996 50 EPOC Tinción e IF/ES 10 Probst et al., 2000 37 EPOC N-PCR/LBA, ES y AB 40,5 Calderón et al., 2004 37 BC N-PCR/ES 40,5 Sivam et al., 2011 19 EPOC N-PCR/BP 42,1 Khalife et al., 2015 23 EPOC N-PCR/ LOF, ES, LBA, AN y AT 17,3 Morris et. al., 2004 30 68 EPOC (Estadio 4) Fumadores EPOC N-PCR/BP 36,7 19,1 Nevez G, 2006 50 EPOC N-PCR/ES 16 Calderón et al., 2007 51 EPOC N-PCR/ES 55 Abreviaturas: AB, aspirado bronquial; AN, aspirado nasal; AT, aspirado traqueal; BC, bronquitis crónica; BP, biopsia de pulmón; CP, cáncer de pulmón; EPI, enfermedad pulmonar intersticial; EPOC, enfermedad pulmonar obstructiva crónica; ES, esputo; FQ, fibrosis quística; IF, inmunofluorescencia; LBA, lavado broncoalveolar; LOF, lavado orofaríngeo; N-PCR, Nested PCR; PCR-TR, PCR a Tiempo Real. 2.3. Otros hongos patógenos. En los pacientes de nuestro estudio también se identificaron secuencias de los géneros Aspergillus, Alternaria, Cryptococcus y Malassezia. A pesar de ser menos frecuentes, su presencia debe tenerse en cuenta ya que estos microorganismos pueden ser patógenos. Dentro del género Aspergillus, en nuestra población en estudio sólo pudo identificarse un caso portador de Aspergillus restrictus en un paciente con EPOC grave. La única publicación en la que se relaciona a esta especie con alguna afección respiratoria lo identifica como posible agente causal de asma en adultos (Itabashi et al., 2007). Dentro del género Aspergillus, la especie que más frecuentemente ha sido identificada en muestras respiratorias de sujetos con enfermedades pulmonares es A. fumigatus (Bakare et al., 2003; Laroumagne et al., 2012). Es de extrañar que no la hayamos identificado en nuestros pacientes. No creemos que la ausencia de esta especie 118 en nuestro estudio se deba a un déficit de la técnica en cuanto a la región que hemos utilizado como diana de amplificación puesto que esta misma región se ha empleado en estudios previos con éxito (Delhaes et al., 2012). Chotirmall explica en su revisión que la mutación en el gen CFTR que sufren los pacientes con FQ afecta a las interacciones entre las células epiteliales y los microorganismos, tales como A. fumigatus, porque con la función de barrera del epitelio pulmonar alterada y la acumulación de moco el aclaramiento del patógeno no es efectivo, favoreciendo la presencia prolongada del hongo en el pulmón y la germinación del mismo (Chotirmall et al., 2014). Puede que estos factores que predisponen el pulmón de los pacientes con FQ a la colonización por A. fumigatus no se den en los pacientes con EPOC y por eso no se haya identificado esta especie en nuestra muestra. Sin embargo, se estima que este género causa Aspergillosis Pulmonar Invasiva en el 22,1% de los pacientes con EPOC y que, en el 83% de los casos, la especie responsable es A. fumigatus (Guinea et al., 2009). Es posible que la ausencia de esta especie en nuestra muestra se deba a que los pacientes del presente trabajo se encontraban en situación clínica estable. En un trabajo en el que se usaron cultivos específicos para la identificación de hongos filamentosos a partir de muestras respiratorias de sujetos con EPOC se observó la presencia del género Aspergillus en el 42 % de los pacientes (siendo A.fumigatus la especie más común). Esta alta prevalencia se relacionó con el uso de corticoesteroides, puesto que los pacientes con cultivo positivo para A. fumigatus usaban mayores dosis. Sin embargo, en este estudio los resultados no fueron reproducibles cuando se utilizó la misma técnica en la identificación de A. fumigatus en los meses posteriores (Bafadhel et al., 2014). El género Crytococcus se identificó en dos pacientes con EPOC grave: en un caso sólo se identificó el género y en el otro caso se concretó la especie C. neoformans. Este hongo suele colonizar el pulmón de un huésped inmunocompetente de manera asintomática y sin inducir patología, aunque sí puede ocasionar graves infecciones como meningitis en sujetos inmunodeprimidos. En la literatura aparece algún caso de cryptococcosis pulmonar en sujetos inmunocompetentes (Aberg et al., 1999; Barbosa et al., 2006), pero son situaciones muy infrecuentes. En nuestro trabajo, el hecho de que Crytococcus haya sido identificado sólo en los estadios más graves de la EPOC podría 119 estar en relación con un mayor deterioro fisiológico y anatómico del pulmón del huésped; o quizás se deba al tamaño muestral, ya que se estima que Cryptococcus tiene una baja prevalencia de colonización en pacientes con enfermedades pulmonares crónicas (Delhaes et al. 2012). Por otro lado, en nuestro estudio se identificó el género Alternaria en cuatro pacientes. Este género contiene varias especies que causan infecciones oportunistas en el ser humano. Se ha demostrado que los pacientes con EPOC son susceptibles a desarrollar alergias y micosis broncopulmonares causadas por especies de este género (Agarwal et al., 2015). En este sentido, sería interesante aumentar el tamaño muestral de nuestro trabajo para investigar la posible influencia del género Alternaria en la progresión de la EPOC. Finalmente, Malassezia globosa se secuenció solo en uno de los casos control. Este hongo reside habitualmente en la piel tanto de humanos como de animales y es responsable de enfermedades cutáneas como la pitiriasis versicolor (Zeinali et al., 2014) y la dermatitis seborreica (Gaitanis et al., 2012). A pesar de que Malassezia puede modificar la respuesta inmune a nivel local promoviendo la liberación de citoquinas proinflamatorias en las células epidérmicas, la mayoría de los casos publicados en los que este género fuera responsable de infecciones sistémicas eran sujetos con una acusada inmunodepresión y que recibían nutrición parenteral con suplemento lipídico (que estimula el crecimiento de este hongo) a través de un catéter central (Gaitanis et al., 2012; Shparago et al., 1995). Esta especie no puede cultivarse a menos que se usen medios con características especiales, quizás por ello su presencia en patología pulmonar aún no ha sido bien caracterizada hasta la fecha. Sin embargo, se ha detectado su presencia en algunos estudios donde se describía el micobioma del pulmón de sujetos con FQ (Delhaes et al., 2012; Mounier et al., 2014). En nuestro estudio esta especie no ha sido identificada en los pacientes con EPOC y solo en uno de los controles, no pudiéndose descartar que procediera de una contaminación cutánea. 2.4. Hongos ambientales. En nuestra población en estudio también se identificaron otros hongos que suelen encontrarse en el medioambiente pero que no han sido descritos como patógenos para el ser humano. Tal es el caso de los géneros: Cladosporium, Debaryomyces, 120 Galactomyces, Penicillium, Rhodosporidium, Rhodotorula, Saccharomyces, etc. Estos hongos se han identificado como champiñones, hongos de humedades de las casas, o asociados a agua, suelo y plantas. También algunos de ellos se usan habitualmente en la industria alimentaria. Las secuencias de estos microorganismos están presentes en baja abundancia en nuestra muestra, lo cual apoya la hipótesis de que son hongos pasajeros de la microbiota del pulmón en la EPOC. La mayoría de ellos también han sido identificados con una baja prevalencia en otras afecciones respiratorias como FQ, asma y en sujetos con trasplante de pulmón (Göngür et al., 2013; Bakare et al., 2003; Charlson et al., 2012; Delhaes et al., 2012; van Woerden et al., 2013). 3. Relación entre la colonización por hongos y la respuesta inflamatoria sistémica del huésped. Cada vez hay más pruebas que sugieren una relación patogénica de los hongos en las enfermedades respiratorias crónicas (Reponen et al, 2012; Hulin et al, 2013). Se ha establecido que el desarrollo del sistema inmune del huésped depende de su relación simbiótica con el microbioma y, por tanto, que el micobioma podría actuar como un cofactor en la respuesta inflamatoria pulmonar (Marsland et al., 2014). De hecho, existe una evidencia creciente de que el micobioma del pulmón tiene un impacto importante sobre la evolución clínica de enfermedades respiratorias crónicas como el asma, las bronquiectasias, la FQ o la EPOC (Nguyen et al, 2015). Por tanto, resulta esencial profundizar en el estudio del micobioma respiratorio, con el fin de mejorar el manejo del paciente. Las alteraciones inflamatorias podrían constituir uno de los mecanismos fisiopatológicos más importantes en el desarrollo y progresión de las enfermedades pulmonares crónicas como la EPOC (Wouters et. al., 2005). De hecho, la EPOC se caracteriza por un intenso proceso inflamatorio crónico de las vías aéreas, el parénquima y los vasos pulmonares. Además, se ha observado un aumento de la concentración sistémica de marcadores inflamatorios, entre ellos IL-6 e IL-8, en sujetos con EPOC (Su et al., 2016). No se conoce con exactitud cómo los pacientes con EPOC desarrollan una inflamación sistémica, pero se barajan varias hipótesis. Es posible que el proceso inflamatorio local se extienda hacia la circulación periférica induciendo una reacción inflamatoria generalizada en el paciente, o que sean factores genéticos y/o 121 constitutivos de los sujetos con EPOC los que predispongan a estos pacientes a sufrir tanto una inflamación local como sistémica, o incluso que la EPOC cause primero una inflamación sistémica que conllevaría al deterioro de las vías aéreas (Gan et al., 2004). Aunque se cree que el humo del tabaco es el desencadenante de la cascada inflamatoria en la EPOC, se sabe que hay fumadores con distinto grado de inflamación y exfumadores que tienen una inflamación persistente, incluso después de cesar en su hábito. Estos hallazgos sugieren que existen otros factores que incrementan o mantienen el proceso inflamatorio crónico una vez se ha establecido (Barnes et. al., 2000) y, en este sentido, se ha propuesto que la colonización microbiana del tracto respiratorio de sujetos con EPOC sea, en parte, responsable de que se perpetúen la inflamación y la destrucción pulmonar. Esta hipótesis se basa en los datos experimentales que apuntan a la colonización bacteriana en sujetos con EPOC como posible responsable de la elevación de los niveles de IL-8 y TNF- α en esputo y en LBA de estos pacientes y de un mayor grado de obstrucción de las vías respiratorias (Patel et. al., 2002; Patel et. al., 2004). De igual forma, las infecciones víricas también han sido relacionadas con una progresión más acelerada de la enfermedad a través de la inflamación pulmonar (Rhode et. al, 2003). En este sentido, en el presente estudio se observa un aumento de las citoquinas inflamatorias IL-6, IL-8 y TNF- α a nivel sistémico en los pacientes con EPOC colonizados por Pneumocystis jirovecii. Sin embargo, no se aprecian dichas alteraciones en los marcadores de la inflamación medidos en relación a la colonización por otros hongos frecuentes en nuestra muestra como Candida y Cladosporium. Estos resultados sugieren que la presencia de P. jirovecii en el tracto respiratorio de sujetos con EPOC podría condicionar cambios en el sistema inmunitario del huésped caracterizados por una activación de la respuesta inflamatoria. Esta misma hipótesis fue ya sugerida en 2007 a partir de un estudio piloto realizado por nuestro grupo en el que también se evidenció una elevación de IL-6, IL-8 y TNF-α en sangre periférica de pacientes con EPOC colonizados por Pneumocystis (Calderón et. al., 2007). Además de promover la respuesta inflamatoria mediada por neutrófilos, se ha propuesto que estos mediadores inflamatorios podrían destruir el parénquima pulmonar, por lo que el principal tratamiento de la EPOC se basa en la supresión de la inflamación para prevenir estas complicaciones (Emami Ardestani et al., 2015). 128 La presencia del género Candida, sin embargo, parece estar en relación con la actividad sérica de la enzima quitotriosidasa, sugiriendo que fomenta en el huésped el desarrollo de una respuesta inflamatoria mediada principalmente por macrófagos. De esta forma, la colonización de las vías respiratorias por ambos microorganismos podría jugar un papel causal o potenciador de la progresión de enfermedades pulmonares. Sin embargo, se necesitan nuevos estudios que delimiten el verdadero papel de la colonización en esta patología y que determinen el mecanismo exacto de su efecto en el pulmón. Adicionalmente, sería necesario evaluar si el tratamiento anti-fúngico puede atenuar el proceso inflamatorio en estos pacientes colonizados, lo que permitiría tratar un posible factor de progresión de esta patología. 4. Relación entre la colonización por hongos y la concentración sistémica de βglucanos. El diagnóstico de infecciones invasivas causadas por hongos mediante técnicas de cultivo requiere varios días y puede dar falsos negativos hasta en el 50% de los casos de infección sistémica por Candida o Aspergillus (Pickering et al., 2005). El examen histopatológico de tejido biopsiado requiere un procedimiento muy invasivo para la obtención de la muestra y, por tanto, en ocasiones no es un método viable. Por tanto, se precisa el estudio de biomarcadores que aceleren el diagnóstico de este tipo de infecciones. La presencia del (1->3)-β-glucano en sangre de un paciente es indicativo de una infección fúngica, por lo que, en los últimos años, se ha estudiado la utilidad que aportaría la medida de este polisacárido en suero para la práctica clínica. El β -glucano es un polisacárido característico de la pared celular de la mayoría de los hongos, exceptuando a Cryptococcus neoformans y la familia Zygomycetes (Pickering et al., 2005). En este sentido, el β-glucano ha podido ser detectado en suero de pacientes con diferentes infecciones fúngicas, incluyendo candidiasis invasiva, aspergilosis invasiva, fusariosis invasiva y neumonía por Pneumocystis jirovecii, pero sin especificidad sobre ninguna de estas especies de hongos (Arvanitis et al., 2014). En nuestro estudio hemos utilizado el test Fungitell para medir los niveles de βglucano en el suero de los sujetos que componen nuestra muestra. Este test ha demostrado tener una sensibilidad y especificidad del 92,9 y 100%, respectivamente, en 129 pacientes con infecciones fúngicas invasivas (Pickering et al., 2005). Además esta técnica se realiza en unas horas, lo cual le aporta una enorme ventaja en la práctica clínica frente al cultivo convencional. En nuestro estudio pretendíamos observar si la presencia de colonización por hongos en el pulmón de los sujetos con EPOC podría relacionarse con los niveles de este componente fúngico en sangre y evaluar su utilidad para identificar la situación de portador. En el presente trabajo no se han observado diferencias estadísticamente significativas en los niveles de β-glucano cuando se comparan pacientes colonizados con pacientes no colonizados por los hongos que fueron identificados con mayor frecuencia en las muestras de esputo. El test Fungitell resulta efectivo en situación de infección pero, en nuestro caso, los pacientes no sufrían exacerbación ni tenían síntomas de infección respiratoria en el momento de la toma de muestra, por lo que los casos en los que se ha detectado la presencia de hongos en el tracto respiratorio de estos sujetos indicarían una colonización pero no una infección. Este hecho ha de tenerse en cuenta a la hora de interpretar los resultados obtenidos, puesto que durante la colonización la carga de microorganismo, y por tanto de los componentes de su pared, es muy inferior a la cantidad de patógenos presente durante una infección. Ésta podría ser la razón por la cual no se observó una elevación en los niveles de β-glucano en suero en relación a la presencia de hongos en las muestras de esputo de los pacientes con EPOC. Quizás si hubiésemos realizado este test en muestras de esputo hubiéramos podido encontrar diferencias significativas al medir la cantidad de β-glucano a nivel local, pero por el momento no tenemos constancia de ningún test que mida la cantidad de β-glucano en este tipo de muestra (Arvanitis et al., 2014). En 2003 se publicó el caso de un paciente con EPOC con aspergilosis pulmonar invasiva en el que no se pudo detectar una elevación de los niveles de β-glucano en sangre hasta 15 días tras su ingreso, implicando que, aunque la medición de este polisacárido podría ser un método más válido en el diagnóstico de esta infección que otros test, los ensayos que miden β-glucano en suero no son lo suficientemente efectivos en el diagnóstico clínico precoz de la infección pulmonar por Aspergillus (Okada et al., 2003). Otra posible explicación es que, aunque el β-glucano está presente en la gran mayoría de los hongos, no en todos ellos se encuentra en la misma proporción. De 130 hecho, los niveles de β-glucano en géneros como Alternaria y Aspergillus son relativamente bajos (Knutsen et al., 2011). Las técnicas de identificación de hongos que hemos utilizado en el presente trabajo aportan datos cualitativos sobre la colonización del tracto respiratorio del huésped, pero no tenemos información cuantitativa acerca de la carga parasitaria de cada especie. En la pared celular de P. jirovecii parece que los β-glucanos están presentes en cantidad significativa (Steele et al., 2003). En un estudio comparativo entre los niveles de β-glucanos entre sujetos colonizados por Pneumocystis y sujetos con PcP, diferenciados en función del número de copias de ADN del hongo por µl, se observó que 23 de los 29 sujetos colonizados tenían valores séricos de β-glucanos inferiores a 80pg/ml, y por tanto eran considerados negativos para este biomarcador según el fabricante de Fungitell (Damiani et al., 2013). Estos datos concuerdan con nuestros resultados ya que en nuestra muestra 25 de los 30 sujetos colonizados y 34 de los 41 no colonizados presentan valores de β-glucano en plasma inferiores a 80pg/ml. En conclusión, el test Fungitell no resulta adecuado para diagnosticar la situación de colonización fúngica en sujetos que no sufren una infección invasiva. Además, en caso de que fuera válido, podría indicar la colonización pero no identificar al microorganismo concreto responsable de dicha colonización (Lamoth et al., 2012). En este sentido, Esteves y su grupo proponen la utilización de este test en combinación con el análisis serológico de otros biomarcadores, como el antígeno Krebs von den Lungen-6, para aumentar la especificidad del test Fungitell en el diagnóstico de la neumonía causada por P. jirovecii (Esteves et al., 2015). Además de los (1,3)-β-D-Glucanos de patógenos fúngicos oportunistas que se pueden detectar mediante el ensayo Fungitell, tales como Candida spp., Aspergillus spp., Saccharomyces cerevisiae y Pneumocystis jirovecii, se ha observado que hay ciertas infecciones bacterianas que podrían generar resultados positivos en este test y por tanto ocasionar falsos positivos al utilizar este ensayo en el diagnóstico de infecciones fúngicas. De hecho, se ha observado la reactividad de este test a partir de muestras sanguíneas de pacientes con bacteriemia. Uno de los (1,3)-β-D-glucanos bacterianos que parece generar resultados positivos en el Ensayo Fungitell es el producido por Pseudomonas aeruginosa (Mennink-Kersten et al., 2008). 131 5. Estudio de la correlación entre la concentración sérica de β-glucanos y la respuesta inflamatoria sistémica. Los β-glucanos de la pared celular de los hongos no se encuentran en mamíferos, por lo que pueden ser reconocidos como patrones moleculares asociados a patógenos por el sistema inmune innato del hombre (Brown et al., 2003b). En este sentido, son varios los estudios que afirman que los glucanos poseen actividades inmunoestimuladoras (Harada et al., 2004; Lee et al., 2002). Sin embargo, los trabajos publicados sobre los efectos inmunológicos que desencadenan estos PMAP en el huésped aportan datos a menudo contradictorios. Esto se debe, principalmente, a la utilización de glucanos diferentes derivados de distintas fuentes fúngicas (Brown et al., 2003b), ya que los efectos inmunomoduladores de los glucanos difieren según su grado de ramificación, la longitud del polímero y su estructura terciaria (Okazaki et al., 1995) y todavía no hay consenso acerca de los requisitos estructurales básicos para la actividad biológica de cada uno (Brown et al., 2003b). La respuesta inmune innata desempeña un papel central en el control de infecciones fúngicas. Cada vez hay más pruebas de que los glucanos están implicados en la iniciación de muchos aspectos de esta respuesta (Brown et al., 2003b; McIntosh et al., 2005; Kernodle et al., 1998). Por un lado, se ha observado in vitro un efecto inductor sobre la quimiotaxis de neutrófilos por parte de los β-glucanos de la pared de hongos como Saccharomyces cerevisiae (Wakshull et al., 1999; Liang et al., 1998) y C. albicans (Sato et al., 2006), sugiriendo que estos PMAP podrían fomentar la acumulación de neutrófilos durante la inflamación pulmonar inducida por hongos (Vassallo et al., 2000). Por el contrario, otros tipos diferentes de glucanos no afectaron a la migración de neutrófilos (Sato et al., 2006). Por otro lado, se postula que hay β-glucanos capaces de activar a los macrófagos directamente (Kataoka et al., 2002; Okazaki et al., 1996; Adachi et al., 1994) y promover la liberación de citoquinas (Harada et al., 2004; Lee et al., 2002). Carmona y su grupo han demostrado que los ß-glucanos de la pared de Pneumocystis inducen la producción de TNF-α en los macrófagos (McCann et al., 2005) y que estimulan a las células epiteliales de las vías respiratorias de ratas para secretar la proteína inflamatoria de macrófagos 2 (MIP-2) (Evans et al., 2005; Hahn et al., 2003). Posteriormente, 132 Carmona y sus colaboradores han demostrado que las células epiteliales de las vías respiratorias humanas secretan cantidades significantes de IL-8, el homólogo humano de MIP-2, en respuesta al β-glucano de la pared celular de Pneumocystis (Carmona et al., 2010). Sin embargo, los eventos a través de los cuales los β-glucanos de Pneumocystis inician la activación de las células epiteliales en las vías respiratorias no están claros (Carmona et al., 2010). En este sentido, otro estudio ha mostrado la capacidad in vitro del β-glucano de la pared celular de C. albicans para inducir la expresión y secreción de TNF-α e IL-8 en monocitos humanos (Li et al., 2009). Igualmente, otro trabajo realizado con modelos animales concluye que el β-glucano aislado de la pared celular de C. albicans tiene un efecto sobre el sistema inmune del ratón in vivo, induciendo una inflamación neutrofílica y eosinófila en las vías respiratorias del animal que cursa con un incremento local de los niveles de TNF-α, IL- 1β, IL-6, macrophage inflammatory protein-1α y MPC-1, entre otros mediadores de la inflamación (Inoue et al., 2007). En nuestro estudio se evidenció una asociación entre los niveles séricos de βglucano y de IL-8 que se mantenían incluso al eliminar del análisis estadístico los valores extremos observados en casos. Anteriormente hemos detallado que tanto el β-glucano de Candida como el de Pneumocystis, los hongos predominantes en nuestra muestra, son capaces de inducir un aumento de IL-8 en células del sistema inmunitario del huésped. No podemos asegurar que los niveles de β-glucano en sangre de nuestros pacientes se deban a una u otra especie ya que no encontramos una relación significativa. Sin embargo, creemos que tiene gran interés el hallazgo que parece indicar que los niveles de β–glucanos pueden influir en la respuesta inflamatoria del huésped aumentando la expresión de IL-8 y probablemente fomentando la movilización de neutrófilos. Wouters y su equipo realizaron un trabajo con cultivos celulares que sugiere una correlación entre la presencia de un β-glucano bacteriano y la producción de las citoquinas IL-1β, IL6, IL8 y TNF-α por parte de las células sanguíneas de individuos sanos. En este estudio se apreció que la producción de citoquinas era dependiente de la concentración de glucano al que las células fueron expuestas y afirma que la respuesta inflamatoria inducida por el glucano varía de un individuo a otro, principalmente en el caso de las citoquinas IL-1β e IL-6. En este sentido, se ha sugerido que la liberación 133 celular de citoquinas en respuesta a estímulos como los glucanos puede ser diferente entre individuos debido a factores genéticos, como mutaciones en los TLR; a una exposición mantenida a sustancias proinflamatorias como polvo orgánico, o a enfermedades subyacentes como aquellas que cursan con una inflamación crónica (Wouters et al., 2002). Teniendo esto en cuenta, estos trabajos no serían del todo comparables con el nuestro ya que probablemente nuestros datos sean los primeros en sugerir la influencia de los β-glucano sobre los niveles de IL-8 a nivel sistémico. 134 CONCLUSIONES 135 1. Los resultados de este estudio confirman la existencia de una elevada prevalencia de colonización por hongos en sujetos con EPOC y, por primera vez, muestran la diversidad de géneros y especies fúngicas presentes en las vías respiratorias de estos pacientes, siendo Candida albicans y Pneumocystis jirovecii los hongos oportunistas más frecuentes en el tracto respiratorio de los sujetos con EPOC. 2. No se han observado diferencias en la distribución de la micobiota pulmonar en relación con el estadio de la EPOC. 2.1. La colonización por Pneumocystis jirovecii del tracto respiratorio de pacientes con EPOC se asocia a un incremento sistémico de los niveles de citoquinas proinflamatorias IL-1-α, IL-2, IL-6, IL-8, TNF-α y MCP-1, sugiriendo que Pneumocystis podría inducir una respuesta inflamatoria, mediada principalmente por macrófagos y neutrófilos, en el huésped. 2.2 El perfil de la respuesta inflamatoria inducida por Pneumocystis parece depender en parte del estadio de la EPOC, observándose en la EPOC leve-moderada incrementos de IL-1-α, IL-8, y MCP-1 y en la EPOC grave solo de IL-1-α e IL-8. 2.3. La colonización del tracto respiratorio de estos pacientes por el género Candida se asocia a un incremento sistémico de la actividad de la enzima quitotriosidasa en pacientes con EPOC leve-moderado, sugiriendo que este hongo podría inducir una respuesta inflamatoria en el huésped fomentando el aumento de la actividad de los macrófagos en los estadíos iniciales de la enfermedad. 3. La presencia de colonización por hongos en el tracto respiratorio de pacientes con EPOC no puede identificarse mediante la cuantificación sérica de β-glucanos. 4. La elevación de los niveles séricos de β-glucanos parece inducir un incremento en la producción sistémica de IL-8 en el huésped, sugiriendo que estos polisacáridos podrían ser reconocidos como patrones moleculares asociados a patógenos por el sistema inmune del huésped y desencadenar una respuesta inflamatoria sistémica. 136 BIBLIOGRAFÍA 137 Aberg JA, Mundy LM, Powderly WG. Pulmonary cryptococcosis in patients without HIV infection. Chest. 1999 Mar; 115(3):734-40. Adachi Y, Okazaki M, Ohno N, Yadomae T. Enhancement of cytokine production by macrophages stimulated with (1->3)-beta-D-glucan, grifolan (GRN), isolated from Grifola frondosa. Biol Pharm Bull. 1994 Dec; 17:1554–1560. Agarwal K, Gaur SN, Chowdhary A. The role of fungal sensitisation in clinical presentation in patients with chronic obstructive pulmonary disease. 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