Metodologías de estudio del Biodeterioro utilizadas para la investigación mediante electróquímica

Second European Conference on electrochemical methods applied to the conservation of artworks © F. Bolívar Galiano y col. 28 METODOLOGÍAS DE ESTUDIO DEL BIODETERIORO UTILIZADAS PARA LA INVESTIGACIÓN MEDIANTE ELECTROQUÍMICA Fernando Bolívar Galiano1, Inés Martín Sánchez2, Julio Romero Noguera3, Luis Vallejo Delgado4, Consuelo Vallejo Delgado1, Fernando Poyatos Jiménez1, Mar López Miras2, María BelénRuiz Ruiz1 1 Dpto. Pintura, Universidad de Granada, España 2 Dpto. Microbiología, Universidad de Granada, España 3 Dpto. Pintura y Restauración, Universidad de Sevilla, España 4 Museo Arqueológico de Porcuna, Jaén, España Autor de contacto: Fernando Bolívar Galiano, fbolí[email protected] RESUMEN Metodologías para el estudio de biodeterioro en obras de arte pictóricas y objetos arqueológicos mediante la emulación de procesos reales es lo que queremos mostrar en este trabajo. Este estudio experimental se basa en la inoculación e incubación de microorganismos procedentes de cepas de colección y obras reales en diversos sustratos propios de las obras pictóricas (barnices naturales y sintéticos, pigmentos y aglutinantes) sobre soporte lígneo, madera y vidrio. Los procesos de alteración producidos son analizados con técnicas de microscopia óptica con luz visible y luz ultravioleta (MO), microscopía electrónica de barrido/análisis elemental por energía dispersiva de rayos X (SEM/EDX), microscopia electrónica de barrido de presión variable (VP-SEM/EDX), microscopía electrónica por emisión de campo (FE-SEM), cromatografía de gases-espectrometría de masas (GC-MS), espectroscopía de infrarrojos y micro-Raman (MRS) y como rasgo innovador su aplicación en el campo de la nanaoelectroquómica con las técnicas de microscopia electroquímica de barrido (SECM) y voltamperometría de micropartículas (VPM) y mediante técnicas de Biología Molecular, que han permitido complementar resultados obtenidos previamente con las técnicas convencionales, aportando datos novedosos sobre los procesos de biodeterioro en obras de arte pictóricas y arqueológica, tanto metálicas como pétreas. PALABRAS CLAVE: Biodeterioro, hongos, bacterias, métodos, pintura, conservación, SECM, VPM 1. INTRODUCIÓN Las técnicas nanoelectroquímicas, que proporcionan simultáneamente datos morfológicos y de composición química a escala nanoscópica, representan una herramienta analítica avanzada en el campo de la conservación de patrimonio, y podrían resolver muchos aspectos críticos que presenta el diagnóstico y control del deterioro del patrimonio cultural, tales como las restricciones severas en el muestreo de obras especialmente valiosas, patrimonio que ha sufrido graves pérdidas de material como resultado de catástrofes, o bien en el caso de objetos arqueológicos en los que los materiales pictóricos se encuentran a nivel traza. Second European Conference on electrochemical methods applied to the conservation of artworks © F. Bolívar Galiano y col. 29 2. OBJETO En este contexto, serían aplicables al estudio de los procesos de corrosión y alteración provocados por el ataque microbiológico sobre estos materiales, utilizando probetas inoculadas con los microorganismos adecuados, en las que se emulasen los procesos reales. En la preparación de dichas probetas se ha empleado toda la experiencia previa de nuestro grupo de investigación en este campo de cara a optimizar las metodologías adecuadas para la inoculación e incubación de microorganismos, y conseguir simular los procesos de biodeterioro de la forma más eficaz. Para la aplicación de las nuevas técnicas hemos utilizado diversos microorganismos, hongos y bacterias, procedentes de cepas de colección y obra real, y como sustratos materiales pictóricos diversos: barnices naturales y sintéticos, pigmentos y diversos aglutinantes, así como materiales de carga empleados en preparaciones, con los que se han elaborado probetas sobre diversos soportes, que han tratado de imitar de forma más o menos adecuada a los intereses de cada trabajo la secuencia estratigráfica de materiales que componen las obras de arte pictóricas o los objetos arqueológicos. Hemos estudiado los cambios químicos inducidos por microorganismos sobre diferentes sustratos presentes en obras de arte, tales como barnices naturales diterpénicos y triterpénicos [J. Romero- Noguera et al, 2008; 2010; 2014], resinas sintéticas (acetato de polivinilo, Mowilith) y alquilicas [Mª Teresa Domenech-Carbó et al, 2007; 2008; 2009]. La técnicas analíticas más habitualmente usadas para estudiar químicamente los procesos de deterioro sobre estos materiales han sido la cromatografía de gases acoplada a espectrometria de masas (GC-MS), Pirólisiscromatografia de gases/espectrometría de masas (Py- GC-MS), microscopía electrónica de barrido acoplada a análisis elemental por energía dispersiva de rayos X (SEM-EDX), microscopía óptica convencional o espectroscopía RAMAN. Y como rasgo innovador se incluye las técnicas nanoelectroquímicas de microscopia electroquímica de barrido (SECM) y voltamperometría de micropartículas (VPM). 3. MÉTODOS 3.1. Selección de microorganismos Mediante amplia revisión de la bibliografía clásica existente en nuestros comienzos, allá por el inicio del nuevo milenio, acerca del biodeterioro de bienes culturales [Ross 1963; Heim et al. 1968; Strzelczyk 1981; Giacobini et al. 1983; Bravery 1988; Agraval et al. 1989; Valentín 1990; Giacobini et al. 1988, 1991; Inoue & Koyano 1991; Caneva et al. 1994; Montes Estellés 1994; Bolívar 1995; Petushkova & Lyalikova 1986; Seves et al. 1996; Valentín et al. 1996; Ciferri, 1999; Arai 2000; Walsh 2001], entre otros, se seleccionaron diversos microorganismos saprófitos, comunes en muchos ambientes y procedentes de colección o bien aislados de muestras pictóricas con signos de biodeterioro. Los que proceden de cepas de colección provienen de la CECT (Colección Española de Cultivos Tipo, Universidad de Valencia, Valencia, Spain) y los más habitualmente usados en nuestros estudios son los siguientes: Hongos Acremonium crhysogenum (Ac) (CECT 2718, ATCC 14615), Aspergillus niger (An) (CECT-2088, ATCC 9029), Aureobasidium pullulans (Au) (CECT-2703, ATCC 9348), Cladosporium cladosporioides (Cc) (CECT 2110, ATCC 16022) Penicillium chrysogenum (Pc) (CECT-2306, ATCC 8537), Rhizopus oryzae (Ro) (CECT-2339, ATCC 11145), Mucor rouxii (Mr) (CECT-2655, ATCC 24905), y Trichoderma pseudokoningii (Tp) (CECT-2937). Bacterias Streptomyces celluloflavus (Sc) (CECT-3242, ATCC 29806), Bacillus amyloliquefaciens (Ba) (CECT-493, ATCC 23842) y Arthrobacter oxydans (Ao) (CECT- 386, ATCC 14358). Igualmente, se han incluido en los estudios hongos procedentes de obras pictóricas, tales como Aspergillus versicolor, Phoma herbarum, Chrysonilia sitophila y Cladosporium sp aislados de obras al óleo sobre lienzo en depósito en el Museo de Bellas Artes de Granada “Alegoría de la muerte” (P. Toma) y “S. Francisco de Asís” (autor desconocido), ambas del siglo XVII y muy afectadas por procesos de biodeterioro. 3.2. Probetas Con los microorganismos seleccionados se han inoculado probetas de diversos tipos, entre los que pueden destacarse: -Probetas sobre soporte lígneo. Estas muestras imitan de forma muy fidedigna la estratigrafía completa de una pintura al óleo sobre lienzo barnizada. Para prepararlas se aplicó, sobre tela de lino, una preparación compuesta por cola animal (70 gramos por litro de agua), sulfato cálcico y óxido de zinc e las proporciones típicamente usadas en la tradición pictórica. Sobre lo anterior, se extendió una Second European Conference on electrochemical methods applied to the conservation of artworks © F. Bolívar Galiano y col. 30 pintura al óleo blanca preparada manualmente base de aceite de linaza y pigmento blanco de cinc. Finalmente, se protegió la pintura con un barniz terpénico natural compuesto de resina de almáciga y esencia de trementina (Figura 1). Una parte de dichas muestras fueron sometidas a envejecimiento artificial acelerado mediante exposición a luz ultravioleta durante 672 horas para imitar el deterioro de la capa de barniz de una pintura antigua. -Probetas realizadas sobre madera Utilizadas para estudiar el biodeterioro de las obras realizadas sobre el otro gran tipo de soporte pictórico a nivel histórico, la madera. Se prepararon empleando como base rectángulos de madera de chopo de 3x3 cm de superficie y 1 cm de espesor con preparación/imprimación tradicional de yeso/cola y protección con diversos barnices. Figura 1. Estratigrafía de la muestra patrón: (1) tela, (2) capa de preparación, (3) capa de óleo), (4) capa de barniz. -Probetas realizadas sobre vidrio El vidrio es un soporte que hemos elegido muy frecuentemente por su versatilidad, bajo precio y carácter inerte para los materiales estudiados sobre él y los microorganismos inoculados. Las probetas han sido preparadas con una gran variedad de materiales filmógenos, entre los que podríamos citar: -Resinas terpénicas naturales Las resinas terpénicas, empleadas como barnices naturales desde la antigüedad, han sido objeto de especial atención por parte de nuestro grupo de investigación, que se ha materializado en diversas publicaciones en revistas indexadas [J. Romero- Noguera et al, 2008; 2010; 2014]. Los estudios se han realizado sobre barnices diterpénicos tales como la colofonia, la trementina veneciana, el Copal de Manila o resinas solubles en alcohol como la sandáraca, así como en resinas de naturaleza triterpénica, las de mayor calidad y las más empleadas en pintura de caballete, como la almáciga, más tradicional en la Cuenca Mediterránea y el dammar proveniente de Indonesia y ampliamente usado en Europa desde finales del siglo XIX. Estos soportes imitan las características de una superficie barnizada, pero eliminan las posibles interferencias que causan los materiales orgánicos que podemos encontrar en obras de arte reales. Se han empleado portaobjetos de vidrio de tamaño estándar (24x80mm), barnizados a pincel con las resinas estudiadas en tres capas finas sucesivas. Los soportes así preparados se dejaron secar en oscuridad durante 90 días (Figura 2). Figura 2. Resina almáciga sobre soporte vidrio inoculada con microorganismos -Aglutinantes de diversos tipos Se han realizado estudios con diversos pigmentos históricos y aglutinantes naturales tradicionales de diversos tipos: polisacarídicos como la goma arábiga, proteico-lipídico como temple de yema de huevo, de huevo entero o emulsión de huevo con aceite de linaza añadido, y también aglutinantes puramente lipídicos como el aceite de linaza. Como ejemplos pueden darse las siguientes recetas: Serie 1: Pigmentos: amarillo de cadmio y tierra ocre Kremer -Ambos pigmentos aglutinados al 30% con una disolución de goma arábiga -Ambos pigmentos aglutinados con un aglutinante proteico (huevo). Aglutinados al 30% con huevo batido y aglutinados con huevo batido mezclado al 50% con aceite de linaza fresco -Probetas sobre soporte de milar. Pinturas acrílicas comerciales de la marca liquitex Serie 2: Pigmentos de Cobre y Plomo con diferentes aglutinantes: Second European Conference on electrochemical methods applied to the conservation of artworks © F. Bolívar Galiano y col. 31 -Goma arábiga y blanco de plomo al 30% -Goma arábiga y verdigrís al 30% -Huevo batido y blanco de plomo al 30% -Huevo batido y verdigrís al 30% -Huevo+aceite batido y blanco de plomo al 50% -Huevo batido+aceite y verdigris al 50% 3.3. Preparación de los inóculos La preparación de inóculos de microorganismos se ha realizado según técnicas microbiológicas básicas entre las que pueden citarse como ejemplo las siguientes: -Obtención de esporas de hongos Los hongos se sembraron en tubos con medio PDA y se incubaron a 28ºC durante una semana. Acabada la incubación, se añadieron 4 ml de tween 80 (0,1% en agua destilada). A continuación, el contenido del tubo se filtró a través de lana de vidrio estéril colocada sobre un embudo estéril. Las suspensiones obtenidas se repartieron en tubos de microcentrífuga y se centrifugaron 5 minutos a 13000 xg. Después se lavaron 3 veces con agua destilada. Tras cada lavado se centrifugó y se eliminó el sobrenadante. Finalmente, el pellet correspondiente a las esporas, se resuspendió en 1 ml de agua ultrapura y se realizó un recuento en cámara de Neubauer. La concentración se ajustó a 105- 106 esporas /ml. -Preparación de suspensiones bacterianas Las bacterias se inocularon en tubos con medio TSB y se incubaron a 28ºC durante 36-48 h. Posteriormente, se centrifugaron en tubos de microcentrífuga (1ml/tubo) y los pellet se lavaron 3-4 veces con agua destilada para eliminar todo resto de medio de cultivo. Finalmente los pellet correspondientes a las células bacterianas se resuspendieron en 1ml de agua ultrapura. La concentración de células se determinó mediante diluciones seriadas y recuento en placa (UFC/ml). Las suspensiones finales se ajustaron a 107 c/ml. 3.4. Inoculación de los soportes e incubación de las muestras Los diferentes tipos de probetas se han inoculado con las suspensiones bacterianas y de esporas ajustadas a altas concentraciones, al menos de 106 esporas/ml en el caso de los hongos y 107-108 células/ml en el caso de las bacterias. Las condiciones de cultivo, para hongos y bacterias, fueron 28ºC de Tª y humedad relativa del 75- 90%, valores de actividad de agua (aw) al menos de 0.85 y durante un período de 20-40 días. Como controles se han utilizado las mismas probetas inoculadas de la misma forma con 20 μl de agua destilada estéril o bien suspensiones de esporas o bacterias autoclavadas que se han mantenido en idénticas condiciones que las muestras inoculadas con microorganismos viables. 4. TÉCNICAS ANALÍTICAS 4.1. Análisis microscópico -Estratigrafía y láminas delgado-pulidas. Con el fin de observar los cambios en las capas más superficiales de las muestras (barniz y capa de color subyacente, especialmente) se ha utilizado la técnica de microscopía óptica con luz transmitida y reflejada, con o sin analizador, debido a su validez para estudiar la sucesión de capas de policromía de una obra de arte, su color, transparencia, espesor y estado de conservación. Se han empleado microscopios como el Olympus, modelo BX-60, con el que se ha obtenido documentación micro fotográfica de las muestras que incluye imágenes en luz reflejada y luz transmitida con y sin polarizadores cruzados para observación superficial, y también estratigrafías preparadas como láminas delgado-pulidas. En este caso se requiere toma de muestra con bisturí, que se engloba en una resina, y una vez polimerizada, se realiza un micro corte transversal a las capas. Las secciones obtenidas se pegan con la misma resina a un portaobjetos de vidrio. Después se realizó un segundo corte que permitió un grosor inicial de un milímetro, el cual se va rebajando con sucesivos pulimentos con carburo de silicio de distinto grano, hasta reducirlo a un grosor de 30µ. Finalmente se da un pulido con pasta de diamante de distinto grano hasta conseguir una superficie especular óptima para su observación con luz reflejada. -Examen con luz visible y con luz ultravioleta Para poder comprobar el estado de conservación de la superficie de las muestras y localizar alteraciones de biodeterioro por oxidación de la capa de barniz (distribución irregular, grosor o ausencia de barniz) se ha recurrido al examen de la imagen con luz visible y la fluorescencia inducida por luz ultravioleta. Esta técnica no exige toma de muestra y es muy utilizada en restauración por su facilidad de uso. El envejecimiento causado por biodeterioro de un material desencadena procesos de oxidación y polimerización que realzan su fluorescencia, de ahí que la capa de barniz destaque por su aspecto lechoso cuando está envejecida. La intensidad de la fluorescencia es mayor cuanto mayor Second European Conference on electrochemical methods applied to the conservation of artworks © F. Bolívar Galiano y col. 32 sea el espesor del estrato. El instrumental de medida que hemos empleado más frecuentemente para análisis de muestras emplea regiones espectrales que van de 400nm a 780nm, en el caso de la luz visible, y de 200nm a 400nm, para la luz ultravioleta, como la lámpara de Wood con tubos fluorescentes VL-215M de 60W (15 W de iluminación UV en un rango de 270-380 nm llegando a superficie iluminada 8mW/cm2). La respuesta visible se ha registrado con una cámara fotográfica Canon digital IXUS 8015 con objetivo 6,2-18,6 mm. -Microscopía electrónica de barrido/análisis elemental por energía dispersiva de rayos X. Microscopia electrónica de barrido de presión variable (VPSEM/EDX). Se emplea para el análisis elemental de pigmentos y materiales inorgánicos en general, en combinación con las técnicas de microscopía óptica. -Microscopía electrónica por emisión de campo FESEM. Empleada para observar en imágenes los efectos de la acción de los microorganismos sobre los materiales tales como la alteración y hasta desaparición de adhesivos y soportes y alteraciones superficiales. -Cromatografía de gases-espectrometría de masas GCMS) La técnica de análisis más empleada para estudiar cambio químicos en los materiales estudiados ha sido la cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas, por su versatilidad, y posibilidad de análisis de todos los componentes volátiles de peso molecular bajo y medio en una sola analítica. El protocolo más frecuentemente utilizado ha sido el siguiente: Figura 3. Imagen de microorganismo obtenida mediante microscopio electrónico Tras el período de incubación, las muestras correspondientes a los patrones, hongos con crecimiento y bacterias, se tomaron raspando la superficie del barniz con un bisturí estéril, obteniéndose una cantidad aproximada de 5 mg por muestra. La derivatización se realizó con el agente transesterificador Meth. Prep. II (Alltech), compuesto de hidróxido de mtrifluorometil-fenil-trimetil-amonio. El análisis se llevó a cabo con un sistema integrado compuesto por un cromatógrafo de gases Carlo Erba serie 8000 modelo 8060 (Thermo Instruments, USA) acoplado con un espectrómetro de masas Platform II (Waters, USA). Para la cromatografía gaseosa se empleó una columna capilar HP-1 MS (fase estacionaria metilpolisiloxano, 30 m x 0.25 mm I.D x 0.25 µm de espesor). Las condiciones cromatográficas han sido: temperatura inicial de 120°C, e incremento a razón de 10°C/min hasta 300°C e isoterma durante 20 min. El gas portador fue Helio, con un flujo de 1.2 ml/min y una presión de 14 Psi. Las muestras se inyectaron en modo splitless. Para el análisis mediante espectrometría de masas, se usó una fuente de ionización por impacto electrónico (70 eV). El rango de escaneo ha sido de m/z 50 a 500, con ciclos de 1s. El software utilizado en la adquisición y procesado de las muestras fue Mass Lynx v.4.0. Los espectros de masas se han adquirido en el modo total ión monitoring mode (Full Scan) y se ha empleado el área de los distintos picos aparecidos en el TIC para obtener información cuantitativa. Las temperaturas de la interfase y de la fuente de iones han sido respectivamente de 300ºC y 210 °C. Para la identificación de compuestos se usaron la librería de espectros de masas Wiley, así como bibliografía especializada. -Espectroscopía de Infrarrojos y Micro-Raman (MRS) Para poder analizar los cambios a nivel superficial de los componentes filmógenos orgánicos en las muestras y así evaluar químicamente los procesos de biodeterioro se ha utilizado también la espectroscopía de infrarrojos y micro-Raman. Los estudios por espectroscopía infrarroja FTIR por compresión se han realizado siguiendo técnicas habituales. A partir de las probetas se han obtenido muestras que se han preparado triturándolas finamente con bromuro de potasio a una concentración de 1% p/p y esta mezcla en polvo se ha comprimido para formar un pellet translúcido a través del cual puede pasar la radiación. Los espectros fueron obtenidos en modo de absorción en el infrarrojo medio (400-4000 cm-1) con un equipo de espectroscopia Nicolet 205XB a una resolución de 2 cm-1. La espectroscopía Raman es una técnica analítica que proporciona información química y estructural de un compuesto o material (orgánico o inorgánico) permitiendo su identificación. Se basa en el examen de la luz dispersada por un material al incidir sobre él un haz de luz monocromático. Solo una pequeña porción de la luz es dispersada inelásticamente experi-mentando ligeros cambios de frecuencia que serán característicos del material analizado con independencia de la Second European Conference on electrochemical methods applied to the conservation of artworks © F. Bolívar Galiano y col. 33 frecuencia de la luz incidente. Esta técnica se ha consolidado en los últimos años como una técnica especialmente adecuada para la caracterización de pigmen-tos porque es una técnica no destructiva que permite la observación de micromuestras sin tratamiento previo y con una elevada resolución espacial (del orden de una micra. Los espectros Raman de las muestras se han obtenido con un espectrómetro micro-Raman cofocal Jasco NRS- 5100, equipado con detector CCD con refrigeración Peltier y len-tes objetivo Olympus. La fuente de excitación utilizada ha sido un láser de estado sólido de 785´11nm, operando a una potencia variable entre 0.6 y 5.9 mW (según la composición de la muestra) y con una red de difracción de 600 líneas/mm. La lente objetivo utilizada ha sido de 5x, 20x y 100x con una resolución por debajo de 1μm. Los espectros, con una resolución espectral de 1,62 cm-1, se han registrado en varios rangos desde 200 a 1800 cm-1. Los tiempos de integración han sido de 15 segundos y 15 acumulaciones. 5. BIOLOGÍA MOLECULAR En este estudio, tuvimos que poner a punto las técnicas moleculares para el caso de los hongos para identificarlos en obra real, para lo que se realizó una comparación con los métodos de identificación tradicionales basados en la obtención de cultivos puros y la observación de los mismos mediante microscopía óptica. Es por ello que se utilizan ambas metodologías. Como es sabido, las técnicas tradicionales de identificación de hongos presentan serias limitaciones y de ahí la necesidad de utilizar técnicas moleculares basadas en el estudio del DNA (extracción de DNA, PCR, TTGE, etc.). Para realizar ese estudio se procedió, en primer lugar, a aislar microorganismos de obra real a partir de pinturas de caballete con signos de biodeterioro. Los microorganismos se han aislado en esta ocasión de cuadros ubicados en la sacristía de la Basílica de San Juan de Dios de Granada. Las obras estudiadas pertenecen al pintor Pedro Atanasio Bocanegra, nacido en Granada el 12 de mayo de 1638 y fallecido en 1689. Estas obras pertenecen a la etapa de formación del pintor, por lo que están datadas hacia mediados del siglo XVII. Técnicamente se trata de pintura al óleo (pigmentos inorgánicos y aglutinantes oleosos sobre capa de preparación de sulfato cálcico y cola animal) sobre lienzo (soporte textil que se realiza con fibras de cáñamo y lino). Los cuadros usados para este estudio han sido los siguientes: •Cuadro 1. Huída a Egipto. •Cuadro 2. Martirio de San Bartolomé. •Cuadro 3.Virgen del Rosario. •Cuadro 4. Nacimiento de la Virgen. Toma de muestras y aislamiento de microorganismos. Frotando con un hisopo estéril sobre la superficie del cuadro en zonas afectadas para sembrar por el método de estrías, placas de Petri que contenían medio de cultivo TSA (para bacterias) y Sabouraud con cloranfenicol (para hongos). La obervación microscópica de los hongos se realizó a partir de muestras teñidas con azul de Lactofenol extraidas con cinta adhesiva. 5.1 Extracción de DNA fúngico Se ha tratado de optimizar el procedimiento de extracción de ADN de hongos basado en la congelación con nitrógeno líquido. Este método consiste en congelar cultivos puros de los hongos usando nitrógeno líquido. Simultáneamente se procede a macerar los micelios con ayuda de un mortero hasta conseguir un polvo fino que será usado para la extracción de DNA. La extracción se llevó a cabo según el protocolo desarrollado por Martin-Platero et al, 2007 con la variación de que en este caso, no se añade Lisozima, cuya función es romper la pared celular bacteriana. En la figura siguiente se muestra la presencia de DNA obtenido a partir de distintos hongos. Second European Conference on electrochemical methods applied to the conservation of artworks © F. Bolívar Galiano y col. 34 Figura 4. Electroforesis en gel de agarosa de los productos obtenidos mediante la amplificación con el primer M13 usando el DNA de distintos hongos. Calle1: patrón de pesos moleculares 1kb. Calle 2: C4M1V. Calle 3: C2M1Q. Calle 4: C4M1C. Calle 5: C3M1H. Calle 6: C4M2sab. Calle 7: C3M1A. Calle 8: C4M1K. Calle 9: C4M1G. Calle 10: patrón de pesos moleculares 1kb. Calle 11: C4M1X. Calle 12: C4M2D. Calle 13: C2M3B. Calle 14: C2M1R. Calle 15: C4M1D. Calle 16: C4M2F. Calle 17: C3M1sab. Calle 18: C1M1K. Calle 19: patrón de pesos moleculares 1kb. Calle 20: control negativo. Electroforesis en gel de agarosa de muestras de DNA obtenido mediante el método basado en congelación con Nitrógeno líquido. Calle 1: patrón de Pesos Moleculares. Calle2: DNA obtenido a partir del hongo de colección Chaetomium globosum. Calle 3: DNA obtenido a partir del hongo de colección Trichoderma pseodukoningii. Calle 4: DNA obtenido a partir del hongo de colección Rhizopus oryzae. Calle 5: DNA obtenido a partir del hongo de colección Cladosporium cladosporoides. Calle 6: DNA obtenido a partir del hongo de colección Acremonium crhysogenum. Calle 7: DNA obtenido a partir del aislado C4M1A. Calle 8: DNA obtenido a partir del aislado C1M1E. Calle 9: DNA obtenido a partir del aislado c4m1x. 5.2. RAPD M13 Se realizó un RAPD, utilizando como primer M13. Esta técnica nos permite obtener la huella genética de cada hongo objeto de estudio. 5.3 Análisis de la huella genética de los hongos La huella genética de cada hongo generada a partir de la técnica del RAPD M13 fue analizada con el programa Fingerprinting; este programa se encarga de comparar uno a uno el patrón de bandas de cada microorganismo y los agrupa atendiendo a su similitud, nunca en base a criterios filogenéticos. Como resultado, obtenemos un dendrograma en el que aparecen los distintos hongos organizados en grupos o clusters. Podemos discriminar el porcentaje de similaridad por debajo del cual vamos a considerar que se trata de microorganismos o cepas distintas. Con este procedimiento lo que conseguimos es tipificar a los microorganismos, ordenarlos en grupos atendiendo a su similitud. Para ello, se usaron hongos de colección como controles del patrón de bandas obtenido. Aquellos hongos aislados a partir de obra real que mostraron una semejanza mayor del 70% se consideraron como especímenes relacionados, mientras que aquellos que mostraron una semejanza menor del 70% se consideraron como no relacionados. DENDROGRAMA Pearson correlation (Opt:0.35%) [0.0%-100.0%] RAPD M13 100 80 60 40 20 RAPD M13 21r 21h Tp 42sab 13e 42f 23b Cc 41g 31a 41k 31h 12f Cg 41d 31sab Mr 11k Ro 41c 11tsaa 41v F 11c A p 21a 21q 21d 11b 11f 21e Pc 41x 23c 12e 12g 23a A c Figura 5. Dendrograma realizado a partir del patrón de bandas obtenido con el RAPD M13 en el que aparecen los distintos hongos organizados en grupos o clusters. 5.4 Amplificación mediante PCR del DNA fúngico El paso siguiente en el proceso de identificación molecular consiste en la amplificación, mediante PCR, del DNA fúngico empleando primers que corresponden a regiones altamente conservadas del rRNA 18S, lo que nos permitirá identificar los distintos hongos presentes en la muestra. Se utilizaron los primers SF/SR (A. Karakousis et al., 2006), que permiten la amplificación de fragmentos de 504-505 pb del rRNA 18S. •18S-forward primer 5´- ATTGGAGGGCAAGTCTGGTG-3´. •18S-reverse primer 5´- CCGATCCCTAGTCGGCAT-3´. Second European Conference on electrochemical methods applied to the conservation of artworks © F. Bolívar Galiano y col. 35 Figura 6. Electroforesis en gel de agarosa de los productos obtenidos mediante la amplificación con los primers SF/SR usando el DNA de los distintos hongos. Calle 1: patrón de pesos moleculares 1kb. Calle 2: control negativo. Calle 3: C2M1B. Calle 4: C2M1Q. Calle 5: C4M1C. Calle 6: C4M1V. Calle 7: C4M1K. Calle 8: C4M1X. Calle 9: C2M3A. Calle 10: C4M1D. Calle 11: Aureobasidum pullulans. Tras esta amplificación, se procedió a la purificación de los productos de PCR y finalmente, se llevó a cabo la secuenciación de los productos de amplificación obtenidos tras realizar una PCR con los primers del rRNA 18S de un especimen representativo de cada grupo de especimenes relacionados. Mediante el programa BLAST se encontraron numerosas secuencias en GenBank homólogas al fragmento amplificado de cada espécimen representativo, lo que indica que se necesitan primers que nos permitan una mejor discriminación entre los distintos especímenes de hongos aislados. Lo último es trabajar con primers correspondientes a las regiones ITS del ADNr de hongos, que son regiones que presentan mayor variabilidad entre las distintas especies de hongos y, por tanto, mayor facilidad a la hora de su identificación. Los primeros escogidos, en base a revisión bibliográfica, son los siguientes: •ITS1: 5´- TCCGTAGGTGAACCTGCGG -3´ (White et al, 1990). •ITS4: 5´- TCCTCCGCTTATTGATATGC-3´ (White et al, 1990). También se está trabajando en la puesta a punto de extracciones de DNA total a partir de muestras de obra real usando dos métodos distintos que se diferencian en las enzimas empleadas a la hora de conseguir la ruptura de la pared celular fúngica. •Lysing Enzymes de Trichoderma harzianum. Contiene actividades βglucanasa, celulasa, proteasa y quitinasa. •Usando una mezcla de dos enzimas: zymolyasa y quitinasa. 6. CONCLUSIONES Los resultados y experiencias de la colaboración entre químicos, biólogos y restauradores a lo largo de cinco proyectos nacionales coordinados (Valencia-Granada), han demostrado la importancia de aunar estas disciplinas para la consecución de resultados imposibles de obtener desde una sola óptica. Esta trayectoria nos ha permitido poder aportar desde nuestros laboratorios los métodos biológicos que cobran sentido cuando las mismas muestras son analizadas y estudiadas por laboratorios químicos altamente especializados, como es el caso del electroquímico de la Universidad de Valencia. 7. AGRADECIMIENTOS Este trabajo ha sido posible gracias a la experiencia compartida de sus miembros, con la financiación de los cinco proyectos coordinados del MICINN, culminados con el CTQ2011.28079.C03 con la Dra. Doménech a la cabeza. Así como a instituciones que nos han abierto sus puertas: Instituto de Restauración UPV, Museos de Granada, Jaén y Porcuna y su Yacimiento de Cerrillo Blanco, entre otros. 8. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS Agraval, O.P., S. Dhawan, K.L. Garg (1989) Microbial deterioration of paintings: A rewiew. Lucknonow: Intach Conservation Centre, 1-51. Arai H. (2000) Foxing caused by fungi: twenty-five years of study. International Biodeterioration & Biodegradation, 46: 181-188. 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