Efecto inmunomodulador de la vitamina D en el periodo postrasplante alogénico de progenitores hematopoyéticos

1 UNIVERSIDAD DE SEVILLA DEPARTAMENTO DE MEDICINA HEMATOLOGÍA TESIS DOCTORAL EFECTO INMUNOMODULADOR DE LA VITAMINA D TRAS EL TRASPLANTE ALOGÉNICO DE PROGENITORES HEMATOPOYÉTICOS María Isabel Montero Cuadrado Sevilla 2015 Departamento de Medicina 2 UNIVERSIDAD DE SEVILLA. D. José Antonio Pérez-Simón, Doctor en Medicina por la Universidad de Salamanca. CERTIFICA: Que el presente trabajo titulado “EFECTO INMUNOMODULADOR DE LA VITAMINA D TRAS EL TRASPLANTE ALOGÉNICO DE PROGENITORES HEMATOPOYÉTICOS” realizado por la licenciada Mª Isabel Montero Cuadrado bajo su dirección en el Departamento de Medicina de la Universidad de Salamanca, reúne a su juicio méritos suficientes y originalidad para que su autor pueda obtener el Grado de Doctor de la Universidad de Sevilla. Y para que así conste, expide la presente certificación en Sevilla, a 29 de Septiembre de 2015. Fdo. Dr. José Antonio Pérez Simón Departamento de Medicina 3 UNIVERSIDAD DE SEVILLA. D. Ildelfonso Espigado Tocino, Doctor en Medicina por la Universidad de Sevilla. CERTIFICA: Que el presente trabajo titulado “EFECTO INMUNOMODULADOR DE LA VITAMINA D TRAS EL TRASPLANTE ALOGÉNICO DE PROGENITORES HEMATOPOYÉTICOS” realizado por la licenciada Mª Isabel Montero Cuadrado bajo su dirección en el Departamento de Medicina de la Universidad de Sevilla, reúne a su juicio méritos suficientes y originalidad para que su autor pueda obtener el Grado de Doctor de la Universidad de Sevilla. Y para que así conste, expide la presente certificación en Sevilla, a 29 de Septiembre de 2015. Fdo. Dr. Ildelfonso Espigado Tocino Departamento de Medicina 4 UNIVERSIDAD DE SEVILLA. Dña. Teresa Caballero Velázquez, Doctora en Medicina por la Universidad de Sevilla. CERTIFICA: Que el presente trabajo titulado “EFECTO INMUNOMODULADOR DE LA VITAMINA D TRAS EL TRASPLANTE ALOGÉNICO DE PROGENITORES HEMATOPOYÉTICOS” realizado por la licenciada MªIsabel Montero Cuadrado bajo su dirección en el Departamento de Medicina de la Universidad de Sevilla, reúne a su juicio méritos suficientes y originalidad para que su autor pueda obtener el Grado de Doctor de la Universidad de Sevilla. Y para que así conste, expide la presente certificación en Sevilla, a 29 de Septiembre de 2015. Fdo. Dra. Teresa Caballero Velázquez 5 Agradecimientos 6 A Jose Antonio Pérez Simón, por la idea y el diseño del ensayo en que se basa esta tesis, por su apasionado compromiso con la investigación y por confiar en mí. A Ildelfonso Espigado, por ayudarme a superar los obstáculos, por aportarme su experiencia en la dirección de trabajos científicos y por los muchos años de trabajo juntos. A Teresa Caballero, por el trabajo biológico de la tesis y por sustentar todo el proyecto, por su rigor y generosidad, por ofrecerme su amistad y sus extensos conocimientos. Al Dr. José Villar, tutor del programa de doctorado, por facilitarme los trámites de este proyecto y por su orientación. A Paco Márquez, por el análisis estadístico, por su talento y buena disposición para resolver las continuas dudas que le planteamos. A Paola y a Ana, por su ayuda con el trabajo técnico y su siempre amable colaboración. A los investigadores de todos los centros que han participado en el ensayo de esta tesis, por hacerla posible con su cooperación. A mis compañeros de la primera planta sur del hospital general Virgen del Rocío, por los buenos y malos momentos compartidos. A mis compañeros de la quinta planta del edificio de laboratorios del hospital Virgen del Rocío, por ayudarnos con los enfermos en el día a día. Al personal del Instituto de Biomedicina de Sevilla que trabaja con los hematólogos, en especial, a Ignacio Sánchez Abarca, por ser nuestro nexo con la investigación básica. A mis pacientes, en especial, a los que ya no están, y a sus familias, por todo lo que me enseñaron. 7 A mis padres, mis referentes, por educarnos entre libros y en lo verdaderamente importante. A mis dos hermanas y a mi hermano, por los recuerdos de nuestra infancia, por la fortuna de seguir creciendo juntos A Jesús, mi marido, y a Inés y Manuel, nuestros queridos hijos, por hacerme una persona feliz. 8 Abreviaturas 9 ARNm: ARN mensajero ATG: globulina antitimocítica (en inglés, "antithymocytic globulin") BAAF: factor activador de células B (en inglés, "B-cell activating factor") CAMP: catelicidina (en inglés, "cathelicidin antimicrobial peptide") CDs: células dendríticas. CD: cluster de diferenciación. Células NK: células asesinas naturales (en inglés, "natural killer"). CMH: complejo mayor de histocompatibilidad. CNI: inhibidores de calcineurina (en inglés, "calcineurine inhibitors") CPA: células presentadora de antígeno. CsA: ciclosporina CYP24A1: enzima del citocromo p450 24A1, también conocida como 1,25- dihidroxi vitamina D3 hidroxilasa CYP27B1: enzima del citocromo p450 27B1, también conocida como 25- hidrovitamina D3 1-α- hidroxilasa DAG: diacilglicerol DEFB4: beta defensina (en inglés, "defensine, beta 4") DBP: proteína de unión a albúmina (en inglés, "D site of albumin promoter (albumin D-box) binding protein") EICH: enfermedad injerto contra huésped. EICHa: EICH aguda EICHc: EICH crónica EVOH: enfermedad venooclusiva hepática FGF: factor de crecimiento fibroblástico (en inglés, "fibroblastic growth factor") FK506: tacrolimus GVHD: enfermedad injerto contra huésped (en inglés, "graft versus host disease"). HAMP: hepcidina (en inglés, "hepcidine antimicrobial peptide") HLA: antígeno leucocitario humano (en inglés," human leucocyte antigen") IFN: interferón 16 9. Análisis según la presencia de EICH aguda DISCUSIÓN CONCLUSIONES BIBLIOGRAFIA 1. Introducción 2. Discusión 17 Introducción 18 El trasplante alogénico de progenitores hematopoyéticos representa la única posibilidad de curación para numerosos pacientes con hemopatías malignas. Sin embargo, su principal complicación, la enfermedad injerto contra huésped (EICH), limita su eficacia, siendo la principal causa de morbimortalidad tras el trasplante. 1.1. Inmunobiología de la EICH. De acuerdo al modelo propuesto por Ferrara(1), el desarrollo de la EICH pueden ser divididos en tres etapas secuenciales: activación de las células presentadoras de antígenos (CPAs), activación de las células T del donante, diferenciación y migración y por último la activación de la fase efectora (2)(figura 1). Figura 1. Las tres fases de la inmunobiología de la EICH. 1 1.1. 1. Activación de las células presentadoras de antígenos. La fase temprana de la EICH se pone en marcha por el profundo daño causado en los tejidos sanos del receptor por el tratamiento de acondicionamiento, a lo que se suman los tratamientos previos, la enfermedad subyacente y los procesos infecciosos intercurrentes. Los tejidos dañados 1 Tomado de la siguiente publicación: Sun Y, tawara I, Toubai T, et al. Pathophisiology of acute graft versus host: recents advances. Translational Research 2007 150(4): 197-214 19 responden con múltiples cambios, incluyendo la secreción de citoquinas proinflamatorias, tales como IFN α e IL-1. Estas "señales de peligro" activan a las CPAs del receptor, que incrementan la expresión de moléculas de adhesión, moléculas coestimulatorias y antígenos del complejo mayor de histocompatibilidad (CMH). La lesión del tracto gastrointestinal debido al tratamiento de acondicionamiento es particularmente importante durante este proceso porque favorece la translocación sistémica de productos microbianos inmunoestimulatorios tales como el lipopolisacárido (LPS), con la consiguiente activación de las CPAs. En este caso, el tejido linfoide del tracto gastrointestinal es el lugar en el que se produce la interacción inicial entre las CPAs y los linfocitos T del donante(3,4). Las CPAs del huésped son por tanto críticas en esta fase. 1.1.2. Activación de células T, diferenciación y migración. La interacción entre células T del donante y CPAs del receptor conduce a la activación de las primeras. El receptor de célula T (TCR del inglés “T cell receptor”) del linfocito donante puede reconocer aloantígenos mediante presentación directa (CPAs del huésped) o indirecta (CPAs del donante, en fases más tardías)(figura 2). Para el desarrollo de la EICH se requiere que las células inmunocompetentes del injerto reconozcan proteínas del complejo mayor de histocompatibilidad no expresadas en el donante, siendo también importantes las discrepancias a nivel de antígenos menores de histocompatibilidad (mHA) en caso de sujetos HLA idénticos. Los mHA se definen como aloantígenos capaces de generar una respuesta linfocitaria T entre sujetos HLA idénticos y son péptidos derivados de proteínas intracitoplasmáticas polimórficas que pueden presentarse en la membrana celular asociados a moléculas HLA de clase I o II (5). La presentación de estas proteínas se lleva a cabo tras un procesamiento en el que intervienen complejos enzimáticos a nivel citoplasmático (proteosomas, animopeptidasas) que dan lugar a péptidos de 8-10 aminoácidos. Estos son posteriormente transferidos al retículo endoplásmico mediante el transportador TAP (“transporter associated with antigen procesing”) donde, tras un proceso de maduración en el que intervienen enzimas como la tapasina, calnexina y calreticulina, entre otras, se unen a moléculas HLA de clase I en el caso de 20 proteínas endógenas o a moléculas HLA de clase II en el caso de proteínas exógenas. Una vez que el antígeno ha sido procesado y presentado por la células dendrítica, la interacción del complejo HLA-antígeno con el receptor TCR-CD3 conduce a la activación de de señales intracitoplasmáticas que finalmente provocan la activación linfocitaria. Por tanto, una vez que el linfocito T interacciona con la CD se activan una serie de tirosina-kinasas que conducen a la fosforilación de ITAM (immunoreceptor tyrosine-based activation motifs) en la región intracitoplasmática del receptor TCR. Esto favorece el reclutamiento de ZAP-70 que a través de la Fosfolipasa C (PLC) genera inositol 1,4,5.trifosfato (IP3) y diacilglicerol (DAG) aumentando los niveles de Protein Kinasa-C y calcio (Ca2+) en el citosol. El Ca2+ activa la fosfatasa Calcineurina lo que produce el paso al núcleo de factores de transcripción como NF-κB, NFAT o JNK, induciendo la activación y proliferación linfocitaria. La presentación de antígenos de distintos órganos dianas por las CPAs del huésped y del donante puede tener un papel diferencial en el daño orgánico (6- 8). Se requiere además de la interacción anteriormente mencionada la participación de moléculas coestimulatorias para la generación de una segunda señal que haga posible la proliferación y diferenciación de los linfocitos T(9-12). Existen dos grupos fundamentales de moléculas coestimuladoras, que perteneces a la familia B7 y la del receptor TNF. Su papel en la EICH es muy importante de modo que el bloqueo de señales coestimulatorias positivas (CD28, ICOS, CD40, CD 30, 4-1BB y ex 40) reduce la EICH en modelos murinos mientras que el antagonismo de señales inhibitorias (PDI y CTLA-4) exacerba la EICH. Los factores de transcripción anteriormente mencionados también son activados a través de las rutas de fosfatidil-inositol-3-quinasa (PI3K)- Akt y MAP-kinasas, que dependen de la estimulación del linfocito a través de las señales co-estimuladoras. Finalmente, estas moléculas coestimuladoras también actuarían a través de CARMA-1, una proteína de membrana con actividad guanilato quinasa, que favorece el ensamblaje o acumulación de múltiples receptores en un “inmunosoma”(13,14) (figura 2). 21 Figura 2. Vías de presentación de antígenos en la EICH. Los antígenos endógenos liberados por autofagia pueden ser presentados por las células T CD4 a través de las moléculas HLA clase II 2 En cuanto a los subtipos celulares T que participan en este proceso, existen dos subpoblaciones bien diferenciadas por las proteínas CD8 y CD4, que son correceptoras para la porción constante de las moléculas HLA clase I y clase II respectivamente. Ambas subpoblaciones son fundamentales en la producción de la EICH. Las células T vírgenes definidas por un fenotipo CD45RApos CD45ROneg CCR7pos CD62Lpos pueden causar EICH (15-21). En diversas publicaciones se muestra como la expresión del marcador CD62L es crítica para la regulación de la EICH por las células T reguladoras del donante. Por el contrario, la capacidad de los linfocitos T de memoria para provocar EICH es menor, a pesar de su capacidad para producir rechazo tras trasplante de órgano sólido. En el mismo sentido la expresión de receptor de la quimiocina CC7 (CCR7 del inglés “CC-chemokine receptor 7”) presente en las células "naive" es fundamental para su desplazamiento a los nódulos linfáticos. Modelos animales con ratones deficientes para este receptor (CCR7-/-) muestran un desarrollo de 2 Tomado de la siguiente publicación: Paczesny S, Hanauer D, Sunz Y, et al. New perspectives on the biology of acute graft versus host. Bone Marrow Transplantation 2010 45: 1-11. 22 EICH atenuado mientras que mantienen el efecto injerto contra leucemia. Así mismo, linfocitos T CD45RA- específicos frente a CD19 (CAR+CD45RA-) mantienen su actividad antileucémica mientras que presentan una menor actividad alorreactiva (22) . Los distintos subtipos de células T reguladoras CD4+CD25+ y CD4+CD25-IL10+, las células T gamma delta, las células T dobles negativas (DN-), las células T-NK y las CDs reguladoras controlan las respuestas inmunes mediante anergia o supresión activa de células T alorreactivas(23-31) . Varios estudios han demostrado un papel crítico de las células reguladoras del donante CD4+CD25+Foxp3+ cuando se produce una EICH aguda. Dichas células suprimen la expansión temprana de las células T del donante alorreactivas y su capacidad para inducir EICH sin abolir el efecto injerto contra leucemia (32,33). Sin embargo, estudios posteriores revelan que la coexpresión de CD4 y CD25 es insuficiente para reducir la EICH. Parece que la presencia de ARNm para Foxp3 está significativamente disminuida en las células mononucleares de sangre periférica (SP) de los pacientes con EICH aunque esta expresión no es específica de células T con fenotipo regulador(34, 35). Las células del huésped NK.1+ son otro tipo celular que ha mostrado capacidad para suprimir la EICH en un modo dependiente de IL4 (36). Las células NK del donante son también capaces de afectar a la EICH a través de la vía de las perforinas que depende de IFN γ, reduciendo la cantidad de CPAs o mediante la secreción de factor β de crecimiento transformante (TGF-β) (37). Las CPAs y la activación de células T producen una cascada intracelular que produce transcripción de genes, incluyendo los de las citoquinas y sus receptores. Las citoquinas Th1 (IFN gamma, IL2 y TNF-α) están implicadas en la fisiopatología de la EICH aguda. La producción de IL2 por las células T del donante constituye una de las principales dianas para la profilaxis y tratamiento de la EICH, actuando a este nivel fármacos como los inhibidores de calcineurina (ciclosporina (CsA) o tacrolimus (FK506)) y anticuerpos monoclonales contra la IL-2 y su receptor (CD25). Sin embargo, datos emergentes señalan el papel clave de la IL2 es la generación y mantenimiento de las células T reguladoras CD4+CD25+Foxp3+, lo que sugiere que la 23 prolongada interferencia con esta interleucina puede tener consecuencias a largo plazo en el desarrollo de tolerancia inmunológica (38-41). IFN gamma puede jugar también un papel en la severidad de la EICH en los distintos órganos dianas. Las citoquinas Th1 pueden ser reguladoras o inductoras de la EICH dependiendo del grado de disparidad HLA, la intensidad del acondicionamiento y los subtipos de poblaciones T implicados después del trasplante. De ahí que, aunque la tormenta de citoquinas iniciada en la primera fase se correlacionan con el desarrollo de EICH aguda, la polarización temprana Th1 de las células del donante podría a largo plazo atenuar la EICH, lo que sugiere que cantidades de citoquinas fisiológicas y adecuadas son críticas para la inducción de la EICH mientras que una inadecuada producción (muy baja o muy alta) podría modular la EICH a través de mecanismos negativos de retroalimentación sobre las células T del donante activadas (42-47). Diferentes citoquinas que polarizan las células T hacia una actividad Th2 tales como IL4, G-CSF, IL18, IL11 y fármacos como sirolimus pueden reducir la EICH. A pesar de todo, las subpoblaciones Th1 y Th2 pueden ocasionar daño en diferentes órganos dianas y algunos estudios no son capaces de demostrar un efecto beneficioso de la polarización Th2 en EICH aguda. El paradigma Th1/Th2 en la inmunopatogénesis de la EICH aguda ha sido ampliamente revisado, aun así es complejo e incompletamente conocido (48-56). La IL-10 juega un papel clave en la supresión de la respuesta inmune pero su papel en la regulación de la EICH experimental no está bien definido, aunque parece que existe una asociación entre los polimorfismos genéticos de IL-10 y la severidad de la EICH aguda. TGFβ, otra citoquina supresora, suprime la EICH aguda pero exacerba la EICH crónica. El papel de otras citoquinas, como IL-7, que promueve la reconstitución inmune, o de IL-13 no está claro. Tampoco se conoce el valor de las células Th17 en este contexto (57-63). Las células T del donante migran a los tejidos linfoides, reconocen antígenos en células presentadoras del huésped o del donante y son activadas. Salen posteriormente del tejido linfoide y se dirigen a órganos dianas en los que ocasionan daño tisular. Las interacciones moleculares necesarias para la migración de las células T y el papel de los órganos linfoides durante la EICH 24 aguda es actualmente foco de interés. Las citoquinas juegan un papel clave en la migración de órganos linfoides y a sus dianas tisulares. Algunas citoquinas tales como CCL2.5, CXCL2, CXCL9-11, CCL17 y CCL27 están sobreexpresadas y pueden jugar un papel crítico en la migración de subpoblaciones linfocitarias a órganos dianas como el hígado, el bazo, la piel y los pulmones durante la EICH aguda. Los linfocitos T CXCR3+ y CCR5+ causan EICH aguda en el hígado y en el intestino (64-68). La expresión de CCR5 parece clave para explicar la migración de células T reguladoras en la EICH. Además de las citoquinas y sus receptores, la expresión de selectinas, integrinas y sus ligandos también regula la migración de células inflamatorias a órganos dianas. Por ejemplo, la interacción entre la integrina α4β7 y su ligando Mad CAM-1 es importante para reclutar linfocitos T del donante en las placas de Peyer y para la iniciación de la EICH intestinal (69). También las interacciones con αLβ2/ICAM1,2,3 y α4β1/VCAM2 son importantes para el reclutamiento en pulmón e hígado en los TPH experimentales (64). La expresión de CD62L en las células T reguladoras del donante es crítica para su función en la EICH aguda, lo que sugiere que su migración a tejidos secundarios es importante para sus efectos regulatorios. Se especula con que el requerimiento migratorio de células T del donante a órganos linfáticos específicos (por ejemplo, las placas de Peyer) podría depender de otros factores tales como el régimen de acondicionamiento y el medio inflamatorio (70) (figura 3). 25 Figura 3. Fisiopatología de la EICH, subpoblaciones celulares implicadas. 3 1.1.3. Fase efectora de la EICH. La fase efectora que genera el daño en el órgano diana de la EICH consiste en una cascada compleja en la que participan diversos tipos celulares que modulan las respuestas inflamatorias actuando de forma simultánea o sucesiva. Además, participan en ella citoquinas inflamatorias que se liberan en el tejido tras la actuación de otras citoquinas especializadas en el reclutamiento de células efectoras. La expresión espaciotemporal de su gradiente podría determinar no sólo la severidad de la EICH sino de los órganos afectados (piel, hígado e intestino) (64,71). Los linfocitos T citotóxicos (CTL) son los principales efectores de la EICH a través de una serie de vías, tales como la del ligando Fas-Fas (FasL), la de la granzima-perforina o exocitosis de gránulos o la de receptores de TNF como DR, entre las que se encuentra la del ligando inductor de la apoptosis mediada por TNF (TRAIL:ligando DR4,5)) o la de los inductores débiles de la apoptosis similares a TNF (TWEAK, ligando DR3) (72,77). La implicación de estas moléculas en la EICH ha sido testada utilizando células donantes en las que se ha bloqueado el resto de las vías. La perforina es almacenada en los gránulos de los CTL y células NK junto a la granzima y otras proteínas. Tras el reconocimiento de una célula diana a través de la interacción TCR-CMH, la perforina es segregada e insertada en la membrana celular formando "poros perforantes" que permiten el paso de las granzimas al interior de las células dianas. Esta entrada induce la apoptosis a través de efectores como las caspasas(78-80) . El trasplante de células T deficientes en perforinas se caracteriza por un marcado retraso del inicio de la EICH en aquellos que sólo existe disparidad en MiHA, cuando existe disparidad CHM y MiHA y cuando existen incompatibilidades aisladas HLA clase I o clase II. Aunque la mortalidad y los signos histológicos de la EICH pueden inducirse en ausencia de perforinas, parece que su acción es muy importante en lo que se refiere determinados tipos celulares como los 3 Tomado de la siguiente publicación: Ferrara JLM, Levine JE, Reddy P, et al. Graft versus host disease. The Lancet 2009 373(2): 1550-1561. 32 crónica(142,143). Un estudio reciente muestra que la coestimulación dependiente de CD80/86 es crítica para la inducción de EICH crónica. También se demuestra que esta coestimulación es suficiente para ocasionar EICH crónica cutánea pero se requiere también la CD40 para ocasiona EICH crónica intestinal (139). Estos datos sugieren que existen distintos requerimientos coestimulatorios según el daño del órgano diana. Como hemos comentado anteriormente, las moléculas HLA clase I (A,B y C) estimulan a las células T CD8+ y las de clase II (HLA-DR, -DP, -DQ) estimulan a las células CD4+. Los papeles individuales de estas células en EICH aguda y crónica han sido exhaustivamente estudiados en modelos de ratón. Las células CD4+ vírgenes, a través del contacto con su antígeno presentado por las CPAs, se diferencian en Th1/Th2/Th17 o en células T reguladoras (Tr/Th3), dependiendo de las citoquinas del medio. Si bien las citoquinas Th1(IFN gamma, IL-2 y TNF alfa) están implicadas en la fisiopatología de la EICH aguda, la producción de IL-2 por las células T del donante es la principal diana en las aproximaciones profilácticas y terapeúticas en EICH aguda y crónica. Datos emergentes indican el importante papel de la IL-2 en la generación y mantenimiento de las células T reguladoras CD4+CD25+Foxp3+, sugiriendo que la prolongada interferencia con IL-2 puede tener consecuencias en el desarrollo a largo plazo de tolerancia a un TPH alogénico (144-147). En lo que se refiere a EICH crónica, parece que la polarización Th1 reduce la EICH crónica y el fenotipo Th2 la estimula(148,149), aunque el paradigma Th1/Th2 en la inmunopatogénesis de la EICH es complejo e incompletamente comprendido. Las células T reguladoras secretan IL-10 o TGF-β(Th3). Algunos estudios han demostrado una fuerte asociación entre los polimorfismos de IL-10 y la severidad de la EICH (150). TGF-beta, una citoquina supresora que atenúa EICH aguda y exacerba EICH crónica (151). Varios estudios han demostrado un papel supresor en EICH aguda y crónica para las células T reguladoras del donante CD4+CD25+Foxp3+ (152). En pacientes con EICH crónica, existe un número reducido de células T reguladoras y deficiente expresión de Foxp3 en sangre periférica y en biopsias de mucosas (153-155). Sin embargo, un estudio clínico encuentra que los niveles 33 de ARNm para Foxp3 en el compartimento de las células T CD25+ no son predictores de EICH crónica(156) . Una posible explicación sería, teniendo en cuenta el impacto negativo de los inhibidores de calcineurina en las células T reguladoras, que la EICH crónica se produzca o se exacerbe como consecuencia de la supresión de las células T del donante aloreactivas tanto citopáticas como reguladoras. Los datos experimentales son consistentes con que las células T aloreactivas vírgenes (CD62L+) se asocian con EICH aguda, no sucediendo lo mismo con las células T memoria. La expresión del marcador CD62L propio de linfocito T virgen es crítica para la modulación de la EICH por las células T del donante reguladoras (157,158). En contraste, se ha descrito que las células T memoria del donante activadas por aloantígenos inducen colitis crónica y daño hepático, lo que es más concordante con los hallazgos habituales de la EICH crónica(159). Un subtipo de población T memoria CD8+CD62hi CD44lo que se desarrolla durante la EICH aguda es capaz de autorrenovarse e inducir EICH con rasgos parecidos a la forma crónica cuando se transfiere a receptores(160). El mismo grupo sugiere que las células T CD4+del huésped derivadas del timo también producen cuando son infundidas un cuadro clínico similar a la EICH crónica. Otras observaciones han evaluado la correlación entre la expresión de CD6 y CD44hiCCR7+en las células T memoria CD8+ y CD4+ del donante, sugiriendo un papel de las mismas en ambos tipos de EICH(161). El daño tímico por el tratamiento de acondicionamiento y la atrofia asociada a la edad interrumpe la educación en el timo de las células T y favorecería el desarrollo de EICH crónica por la emergencia de células T autorreactivas dependientes del timo(162). Se ha demostrado recientemente que las células T del donante derivadas de la médula ósea y dependientes del timo que escapan de la selección negativa tienen la capacidad de producir EICH crónica, que se evita con la timectomía de los receptores previos al trasplante(138). Sin embargo, datos procedentes de modelos animales irradiados subletalmente demuestran que el timo del huésped no es necesario para el desarrollo de un cuadro autoinmune similar a la EICH crónica(163). En conjunto, podemos afirmar que, si bien las células T del donante maduras procedentes del aloinjerto son necesarias y suficientes para producir EICH aguda, en la 34 inducción de la EICH crónica juegan un papel tanto estas células como células T del donante generadas a partir de las células madres hematopoyéticas infundidas y dependientes del timo del huésped. 1.2.4. EICH crónica y linfocitos B. Existe un papel potencial de las células B en EICH crónica con el que se ha especulado (164). Se basa fundamentalmente en cuatro observaciones: 1) la presencia de anticuerpos frente antígenos de histocompatibilidad codificados en el cromosoma Y(133); 2) niveles aumentados de células B con respuestas TLR9 alteradas(134); 3) niveles incrementados del factor activador de células B (BAAF), que promueve la supervivencia y activación de células B(165); y 4)niveles aumentados en modelos animales de autoanticuerpos(166). Además, existen datos emergentes sobre respuestas clínicas con rituximab que apoyan el papel patogenético de los linfocitos B en EICH crónica(140,141,167). Sin embargo, desconocemos si participan en el proceso como efectores, inductores o amplificadores . 1.3. Clínica de la EICH. 1.3.2. EICH aguda Clásicamente, la EICH aguda se define como aquélla que se produce antes de los 100 días antes del trasplante y la EICH crónica es la que aparecía posteriormente(169-171). La EICH hiperaguda, aunque infrecuente, es una forma grave que ocurre en la primera semana postinfusión y se caracteriza por fiebre, eritrodermia generalizada ,descamación, hepatitis, inflamación y síndrome de capilaritis(172) . A raíz de la publicación de los criterios de consenso del "National Institute of Health Consensus Development Project" (NIH), se describen también otras formas de expresión de la EICH: la EICH aguda tardía, que se produce después del día +100 postrasplante y un síndrome de superposición con rasgos de EICH aguda y crónica. Estos dos síndromes se producen con mayor frecuencia después de un trasplante con acondicionamiento de intensidad reducida (173,174). Esta conferencia establece 35 que son los signos y síntomas los que definen la EICH aguda o crónica y no su momento de aparición. La EICH aguda es una entidad clínico-patológica, que se produce por el efecto citotóxico de los linfocitos del donante contra las células del huésped (células epiteliales de piel y mucosa, células de los conductos biliares, de las criptas en la mucosa intestinal o de la vía aérea)(1). Los principales órganos dianas de la EICH son: la piel (81% de los pacientes), el tracto gastrointestinal (54%) y el hígado (50%)(168). a) Piel: A menudo la primera manifestación de la EICHa es un rash pruriginoso, maculopapuloso, que aparece en el día entre la segunda y la quinta semana post-infusión, generalmente coincidiendo con el injerto leucocitario; puede ser pruriginoso o doloroso y generalmente comienza con eritema en base del cuello, orejas, hombros, palmas y plantas, recordando a una quemadura solar. La necrosis epidérmica es la forma más severa con formación de bullas y separación epidérmica similar a la que se observa en la epidermiolisis tóxica. La afectación cutánea se clasifica en 4 grados, según la severidad (tabla 2). El diagnóstico diferencial de la EICHa cutánea incluye los efectos de la quimio ó radioterapia, alergia a fármacos e infecciones virales; el diagnóstico debe confirmarse histológicamente (175) b) Hígado La afectación hepática por EICH agudo es infrecuente en ausencia de afectación cutánea. Es característica la ictericia con incremento de bilirrubina conjugada y fosfatasa alcalina, reflejo del daño a nivel de los canalículos biliares. Suele observarse también un incremento de transaminasas, aunque pueden permanecer en niveles normales El diagnóstico diferencial incluye: enfermedad veno-oclusiva hepática, infección (generalmente por virus), sepsis y toxicidad por fármacos como metotrexate (MTX), ciclosporina-A (CSA) y tacrolimus. Es infrecuente el fallo hepático debido únicamente a EICH aguda y así, la presencia de hipoalbuminemia debe hacer sospechar afectación del tubo digestivo o balance nitrogenado negativo más que insuficiencia hepática(176). La 36 biopsia solo será necesaria en aquellos casos en los que no haya manifestaciones de EICH en otros órganos aunque si ésta es necesaria, los cambios histológicos observados en los conductos biliares son característicos. c) Intestinal La afectación intestinal es habitualmente la más severa y difícil de tratar. Las manifestaciones clínicas incluyen: anorexia, nauseas, vómitos, diarrea, dolor abdominal de tipo cólico y en casos graves hemorragia e íleo. En cuanto a las características organolépticas de la deposición, ésta suele ser verdosa, pudiendo presentar mucosidad y células de descamación. El volumen de la deposición puede ser muy importante en los casos severos, siendo necesarios una terapia trasfusional, fluidoterapia y soporte nutricional adecuados(176). El diagnóstico diferencial incluye: toxicidad gastrointestinal inducida por el régimen de acondicionamiento o infecciones víricas o bacterianas, por lo que es necesario realizar estudios microbiológicos seriados. Los hallazgos endoscópicos son variables y a menudo inespecíficos, desde la normalidad al edema y el despegamiento de la mucosa; las lesiones pueden ser más prominentes en el ciego, ileon y colon ascendente pero pueden afectar también al estómago, duodeno y recto. La biopsia es obligatoria para el establecer el diagnóstico definitivo de EICHa digestiva. Algunos pacientes presentan una variante de EICH digestiva con afectación predominantemente alta, caracterizada por anorexia, dispepsia, nauseas y vómitos, sin diarrea; estos pacientes suelen responder bien al tratamiento inmunosupresor aunque con frecuencia desarrollan EICH crónica(176) d) Hematopoyesis y sistema inmune La EICHa afecta también al tejido linfoide y así se observa en los ganglios linfáticos una disminución de los centros germinales y anomalías en las poblaciones linfoides, como inversión del cociente CD4/CD8(177). Estas alteraciones aumentan el riesgo de desarrollar infecciones severas postrasplante. e) Afectación ocular 37 Se han descrito síntomas oculares en pacientes con EICHa consistentes en fotofobia, conjuntivitis hemorrágica, formación de pseudomembranas y logoftalmos y está manifestación se ha asociado a peor supervivencia(178) El grado de afectación de los principales órganos (piel, hígado y tubo digestivo) se combina para dar lugar a un sistema de clasificación (tabla 1)(181- 183) que permite predecir la supervivencia de los pacientes. Una posible limitación de este sistema es la escasa concordancia entre médicos. A pesar de ello, la clasificación de Glucksberg continúa siendo la más empleada. Tabla 1: Estadiaje EICH agudo. Órgano Grado 1 Grado 2 Grado 3 Grado 4 Piel Rash <25% SC Rash 25-50% SC Rash >50% SC Eritrodermia generalizada con bullas Hígado Bilirrubina 2-3mg/dl Bilirrubina 3,1-6mg/dL Bilirrubina 6,1/15mg/dL Bilirrubina >15mg/dL Intestino Diarrea >500mL/día Diarrea >1000mL/día Diarrea >1500mL/día Diarrea >2000mL/día o dolor abdominal severo con o sin parálisis 1.3.2. EICH crónica. La EICH crónica es la principal causa de muerte tardía no relacionada con la recaída después del trasplante. La mediana de aparición del EICHc es de 201 días tras el trasplante en caso de donante emparentado HLA idéntico, 159 días tras trasplante de donante no emparentado con alguna disparidad HLA y de 133 días tras trasplante de donante no emparentado. Su presentación puede ser progresiva (EICH aguda activa que se transforma en EICH crónica), quiescente (EICH aguda que se resuelve completamente y posteriormente aparece la EICH crónica) o de novo. 38 La clasificación clásica del EICHc divide a los pacientes en limitado (aquellos que no requieren tratamiento) o extenso (que requieren tratamiento inmunosupresor) (tabla 4)(184,185). Tabla 4: Clasificación de la EICHc en limitada o extensa: A.- EICH crónica limitada: (1 y/o 2) Afectación cutánea localizada (< 50% de la superficie corporal) y/o Afectación hepática limitada (alteración de tests de función hepática con bilirrubina total < 3 mg/dl) B.-Se considera EICHc extensa:  Afectación cutánea extensa ( 50% de la superficie corporal), o  Afectación cutánea y/o hepática limitada asociado a la presencia de  1 de los siguientes criterios:  Biopsia hepática con histología compatible con EICHc (hepatitis crónica agresiva, puentes de necrosis, cirrosis hepática) con bilirrubina  3 mg/dl  Test de Schirmer positivo (< 5 mm )  Biopsia de mucosa oral o glándula salivar con histología diagnóstica de EICHc  Alteración pulmonar compatible con bronquiolitis obliterante sin evidencia de causa viral en el estudio histológico  Afectación intestinal: malaabsorción y/o pérdida de peso > 15% debido a anorexia sin causa evidente excepto la presencia de EICHc. La clasificación propuesta por el "National Institute of Health Consensus Development Project"(NIH) establece 3 grupos de pacientes en función del número de órganos afectados por la EICHc y el grado de afectación de cada órgano. Si bien se recomienda tener una confirmación histológica ésta no es obligatoria si el paciente presenta al menos un criterio “diagnóstico” (tabla 5). A cada órgano se le asigna una puntuación de 0 a 3 según el grado de severidad de la afectación por EICHc (tabla 6), de manera que la EICHc se divide en: (1) leve: afectación de uno o dos órganos (excepto el pulmón) con una puntuación máxima de 1; (2) moderada: 3 ó más órganos afectados con una puntuación máxima de 1 o siempre que un órgano tenga 39 una puntuación de 2 (salvo el pulmón en el que es suficiente una puntuación de 1); (3) grave: cuando al menos 1 órgano alcanza una puntuación de 3 (o bien el pulmón alcanza una puntuación de 2). Algunos criterios han sido recientemente actualizados (tablas 5,6 y 7) 5 . Desde el punto de vista histológico se definen 3 categorías: no EICH, posible y probable. En el primer caso no hay evidencia de EICH, en el segundo la hay pero existen otras posibles causas y en el tercero hay evidencia sin otra causa o diagnóstico competitivo. Tabla 5. Clasificación de la EICH en aguda o crónica Categoría Momento de aparición Síntomas característicos de EICHa Síntomas característicos de EICHc EICHa Clásica Persistente, recurrente, tardía < 100 días postrasplante > 100 días postrasplante Sí Sí No No EICHc Clásica Mixto compuesto Sin límite temporal Sin límite temporal No Sí Sí Sí 5 Tomadas de las siguientes publicaciones: 1) Filipovich AH, Weisdorf D, Pavletic S, et al. National Institutes of Health Consensus Development Project on criteria for clinical trials in chronic graft-versus-host disease:I. Diagnosis and staging working group report. Biol Blood Marrow Transplant. 2005; 11: 945-55. 2)Jagasia N, Greinix H, Arora M et al. National Institutes of Health Consensus Development Project on Criteria for Clinical Trials in Chronic Graft-versus- Host Disease: I. The 2014 Diagnosis and Staging Working Group Report. Biol Bool and Marrow transplant 2015; 21: 389 40 Tabla 6: Criterios diagnósticos de EICHc Criterios: Diagnóstico Característico Otros Común con EICHa Piel Poiquilodermia; liquen plano Cambios escleróticos Morfea, liquen escleroso despigmentación Alt sudación ictiosis Queratosis pilaris Hipo / hiperpigmentación Eritema Rash maculopapular prurito Uñas Distrofia Estrías longitudinales Uñas quebradizas Onicolisis Pterigium ungueal pérdida ungueal Cuero cabelludo Alopecia cicatricial Lesiones descamativas Lesiones papuloescamosas Fragilidad capilar, Encanecimiento prematuro Boca Lesiones liquenoides Xerostomía, mucocele, atrofia mucosa pseudomembranas, ulceras Gingivitis Mucositis Eritema dolor Ojos Sequedad, dolor, conjuntivitis cicatricial, queratoconjuntivitis seca (requiere Schirmer) Fotofobia, hiperpigmentación periorbital blefaritis Genitales femenino Liquen plano-like, liquen escleroso-like, cicatrices o estenosis vaginal, sinequias en clítoris / labios menores fimosis o estenosis / Erosión, fisuras, úlceras 41 masculino cicatrices de uretra o meato Digestivo Membrana esofágica Estenosis hasta 1/3 medio (documentados por endoscopia o contraste) Insuficiencia pancreática exocrina Anorexia, nauseas, vómitos, diarrea, pérdida de peso, retraso crecimiento (niños) Hígado Bilirrubina total, fosfatasa > 2 veces el límite superior de la normalidad (N) AST ó ALT > 2 x N Pulmonar Bronquiolitis obliterante (BO) diagnosticada por biopsia BO diagnosticada por espirometría y radiología Bronquiolitis obliterante con neumonía organizada Muscular, fascia Fascitis, rigidez o contracturas articulares secundarias a esclerosis Miositis ó polimiositis (requiere biopsia) edema, calambres, artralgia, artritis Hematológico e inmunológico Trombocitopenia, eosinofilia, linfopenia, hipo/hipergammaglobulinemia, autoanticuerpos Otros Ascitis, derrame pleural o pericárdico, neuropatía, síndrome nefrótico, miastenia gravis, alt conducción a nivel cardíaco, miocardiopatía Otros indicadores, manifestaciones clínicas o complicaciones relacionadas con EICHc (indicar puntuación 0 a 3 según que el grado de afectación sea leve, moderado o severo) Membrana esofágica Derrame pericárdico Derrame pleural Ascitis Síndrome nefrótico Neuropatía periférica 48 gen promotor contiene un elemento funcional de respuesta a la vitamina D3 (VDRE). Este elemento sólo está presente en los primates más desarrollados, lo que es sugestivo de que la regulación de la vitamina D en esta faceta de la inmunidad innata es un evento reciente del desarrollo evolutivo(217,218). El mecanismo preciso por el cual la activación TLR induce la expresión de VDR y de 1-α hidroxilasa no está aclarado. El análisis de los eventos involucrados en la regulación transcripcional de CYP27 B1 sugiere que la interacción con TLR involucra a la vía JAK/STAT, a las quinasas MAP y al factor nuclear Kappa beta (NF-κβ) y que todo ello se produce de forma sinérgica con la inducción de CYP27B1 por IFN γ. Otros estudios proponen que la inducción de CYP27B1 por TLR2/1 se produce indirectamente a través de la IL-15 e IL17A. La enzima 24-hidroxilasa, cuya función es inactivar a la 1,25 (OH)2 D3, es codificada por un gen (CYP24) que es inducido por 25 OH D3 tras su activación por TLR2/1 en los monocitos(219,220). La regulación de la proteína antibacteriana catelicidina por 1,25 (OH) D3 se describe en una gran variedad de tipos celulares además de en los monocitos: queratinocitos, células epiteliales pulmonares, células mieloides y células del trofoblasto placentario(221). Sin embargo, los mecanismos que controlan la síntesis local de 1,25 (OH)2 D3 varían considerablemente. Aunque la mayoría de los estudios sobre la inmunidad innata mediada por vitamina D se centran en el papel de VDR unido a 1,25 (OH)2 D3 como regulador pivotal transcripcional de catelicidina, es importante saber que otros ligandos pueden interactuar con VDR, como sucede en las células epiteliales biliares en las que la proteína antibacteriana es inducida por VDR a través de las sales biliares. Dado que esto proporciona estabilidad a las sales biliares, se ha propuesto esta aplicación de la vitamina D para el tratamiento de la cirrosis biliar primaria(222,223). Parece demostrado que la vitamina D es un potente estimulador de los mecanismos asociados con la eliminación de patógenos y que la aparición de este sistema en primates (incluyendo el Homo sapiens temprano), expuestos a abundante cantidad de luz solar, constituyó una ventaja evolutiva . De hecho, se trata de un sistema que dispone de mecanismos claves de control ; no sólo dispone de una enzima catabólica , la 24-hidroxilasa, que atenúa las 49 respuestas a 1,25 (OH)2 D3, sino que presenta mecanismos de retroalimentación. 1,25 (OH)2 D3 se muestra como un potente regulador a la baja de TLR2 y TLR4 en monocitos, suprimiendo las respuestas inflamatorias que son activadas por estos receptores. De ahí que, utilizando CYP24 y los mecanismos regulatorios TLR, la vitamina D ayuda a promover respuestas inmunes innatas previniendo el daño tisular asociado a una inflamación excesiva(224,225) (figura 6). Figura 6. Regulación de la respuesta inmune por la vitamina D 7 . 2.1.2. Células dendríticas y presentación antigénica. La inmunidad innata es responsable de la presentación de antígenos resultantes de la eliminación de patógenos y de restos tisulares a las células pertenecientes a la inmunidad adaptativa. Aunque existen varios tipos tisulares que pueden desempeñar esta misión, las más reconocidas de las células profesionales presentadoras de antígenos son las células dendríticas. La expresión de VDR en células purificadas dendríticas fue comunicada por primera vez en 1987(226). Estudios realizados posteriormente purificando células dendríticas de la piel (células de Langerhans) evidenciaron que la 1,25 (OH)2 D3 podía atenuar el efecto de la presentación antigénica(227). Sin embargo, el 7 Tomado de la siguiente publicación: Mathieu C, Adorini L. The coming of age of 1,25 dihydroxivitamin D analogs as immunomodulatory agents. TRENDS in Molecular Medicine 2002: 1-6. 50 papel de la vitamina D y sus metabolitos no fue dilucidado hasta el advenimiento de los modelos de células dendríticas derivadas de monocitos. En el año 2000, estudios paralelos de los grupos de Adovini y Kunner mostraron que la 1,25 (OH)2 D3 y sus análogos sintéticos inhibían la maduración de las células dendríticas derivada de monocitos, suprimiendo su capacidad para presentar antígenos a las células T(228,229). Con base en estas observaciones, se propuso que la vitamina D podría promover la tolerancia y esto fue estudiado en modelos de trasplante de islotes pancreáticos en los que se observó menor tasa de rechazo en ratones tratados con vitamina D(230). Esta respuesta parece ser debida a una maduración disminuida y a la afectación concomitante de los linfocitos T supresores o de las células T reguladoras(231). Otros datos indican que las células dendríticas expresan 1-alfa hidroxilasa de forma similar a los macrófagos(232). La expresión de 1-α hidroxilasa y su actividad se incrementa conforme se produce la diferenciación de la célula dendrítica hacia un fenotipo maduro(233). El tratamiento con 25 (OH) D3 suprime la maduración de las células dendríticas e inhibe la proliferación T, confirmando la existencia de una vía intracrina para la vitamina D similar a la observada en macrófagos. Las células dendríticas maduras muestran bajos niveles de VDR en relación con las células dendríticas inmaduras o con los monocitos. Sin embargo, sintetizan elevados niveles de vitamina D que actuaría sobre las células dendríticas inmaduras, con alta expresión de VDR, previniendo su futuro desarrollo. De este modo, la expresión de VDR y la acción paracrina de la vitamina D permitiría por un lado una inicial presentación antigénica y respuesta de los linfocitos T y, por otro lado, el bloqueo madurativo de las células dendríticas, impediría la sobreestimulación de los linfocitos T(234). Las células dendríticas mieloides son las presentadoras de antígenos más eficaces y las células dendríticas plasmacitoides son las más relacionadas con la tolerancia antigénica. La 1,25 (OH)2 D3 regula preferentemente las células dendríticas mieloides, con lo que parece que el efecto más importante de la vitamina D es suprimir la activación de células T. Aunque los estudios sugieren una aparente insensibilidad de las células dendríticas plasmacitoides a la 1,25 (OH)2 D3, es posible que la síntesis local 51 de vitamina D por estas células podría participar en el mecanismo de tolerancia al actuar sobre el receptor VDR expresado en células T(235,236). 2.2-Vitamina D e inmunidad adaptativa. Las poblaciones T y B pueden ser divididas en subpoblaciones proinflamatorias, tales como los linfocitos T"helper"(Th)1 y Th17, o en subpoblaciones antiinflamatorias, tales como los TH2 y las células B reguladoras. 2.2.1. Vitamina D y linfocitos T. Las células T no activadas expresan niveles indetectables de VDR, pero la expresión del receptor se incrementa cuando la célula T prolifera tras la activación antigénica. La 1,25(OH)2 D3 inhibe preferentemente las células T "helper", un subtipo de linfocito T efector estrechamente asociado con respuesta inmune celular(240). Varios estudios posteriores confirmaron esta observación y demostraron que el perfil de citoquinas de las células T humanas tratadas con 1,25 (OH)2 D3 las identifica como células Th2, un subtipo de linfocitos T asociado a inmunidad mediada por autoanticuerpos(241,242). La conclusión de estas observaciones es que la vitamina D podría limitar el potencial daño tisular asociado a las respuestas inmunes Th1. Sin embargo, la validez de esta generalización fue cuestionada en modelos de ratón en los cuales la vitamina D era capaz de inhibir las citoquinas asociadas a Th1 (INF gamma) y a Th2 (IL-4) (243). Se ha observado en modelos animales en los que las células inmunes no expresan VDR que existe una población muy reducida Th1. A lo largo de los años, el repertorio de las células T se ha ido incrementando con la caracterización de otro linaje celular diferente a Th1 y Th2, las células Th17, que segregan IL-17 y que tienen un papel esencial para combatir ciertos patógenos, participando además en mecanismos de daño tisular y de inflamación(244,245). El papel de la vitamina D como reguladora de esta población no está bien delimitado pero es interesante señalar que en modelos animales de enfermedad inflamatoria intestinal el tratamiento con vitamina D reduce la expresión de IL-17, mientras que la alteración genética que lleva a la pérdida de CYP27B1 y, por tanto, a la producción de 1,25(OH)2 D3 produce la elevación de esta citoquina(246,247). De ahí que sea posible que la 52 vitamina D ejerza sus efectos sobre la inflamación y la enfermedad autoinmune a través de la regulación de las células Th17. Un cuarto grupo de células T CD4 ejerce funciones más supresoras que efectoras y se conocen como células T reguladoras. Teniendo en cuenta su papel supresor de la proliferación T, se sugirió que la vitamina D podría tener efecto sobre ellas y , en 2002, se demostró que la 1,25 (OH)2 D3, en conjunción con los esteroides, estimulaba la producción de IL-10 por las células T reguladoras CD4+CD25+(248,249). Otros estudios indicaban que la vitamina D producía una diferenciación preferencial T reguladora en relación con la inducción de células dendríticas tolerogénicas(250,239). Sin embargo, parece probado que la vitamina D incrementa la secreción de IL-10 y de TLR9 por las células T reguladoras, con lo que de algún modo constituye un sistema que une las respuestas inmunes y adaptativas(251). Por el contrario, las células T CD8+ muestran una pobre respuesta a la 1,25 (OH)2 D3(238,252-254). A pesar de la importante expresión de VDR que presentan , la 1,25 (OH)2 D3 no parece tener un impacto significativo en modelos animales como la encefalomielitis experimental autoinmune en los que están implicadas las células T CD8+(255,256). Además de su efecto sobre determinadas poblaciones T, estudios recientes muestran que la vitamina D puede ejercer también un efecto sobre el fenómeno de "homing" o tropismo de las células T por tejidos específicos(257). Parece que la vitamina D inhibe la migración de las células T a ganglios linfáticos. Es posible que tenga también un papel activo en la afluencia de linfocitos T a la piel regulando al alza el receptor 10 de citoquinas (CCR10), cuyo ligando CCL27 es expresado por queratinocitos epidérmicos. Esta acción sobre el fenómeno "homing" se produce tanto por la 25 (OH) D3 como por la 1,25 (OH)2 D3 y los autores sugieren que tanto las células dendríticas como los linfocitos T son la fuente de actividad 1 alfa hidroxilasa(258). Sin embargo, la vitamina D parece ejercer un efecto negativo sobre las citoquinas y sus receptores en el tracto gastrointestinal. Parece que esta acción es altamente selectiva sobre las células T ya que estudios más recientes sobre ratones carentes del gen VDR han demostrado una migración aberrante de células T CD8, lo que parece aumentar el riesgo de colitis en estos ratones(259). 53 2.2.2. Vitamina D y linfocitos B. Además de la función clásica de los linfocitos B como precursores de células plasmáticas productoras de anticuerpos y, por tanto, como subtipo celular sobre el que asienta la inmunidad humoral, se han descrito poblaciones de linfocitos B cuya principal función es la producción de IL-10 y que podrían corresponder a subpoblaciones B reguladoras. Algunos modelos animales de enfermedades autoinmunes han revelado que las células B reguladoras productoras de IL-10 pueden suprimir los procesos inflamatorios. La IL-10 derivada de células B parece importante para la generación y mantenimiento de las células T reguladoras. En modelos en los que se bloquea la maduración de células B, existe una capacidad reducida para la inducción de tolerancia y esta incapacidad está asociada con un potencial inadecuado de generación de células T reguladoras FoxP3+. Estos hallazgos son corroborados por modelos murinos de artritis en los que la deficiencia de IL-10 derivada de células B exacerba la enfermedad y presentan bajos niveles de células T reguladoras, que se restablecen con la transferencia de células B productoras de IL-10(260- 267). Déficits en la función y frecuencia de células B reguladoras se han comunicado en la esclerosis múltiple y en el lupus eritematoso sistémico(268-271). Al igual que las células T, las células B activas expresan VDR. Tal como se mostró en estudios experimentales, las células B en reposo presentan bajos pero claramente detectables niveles de ARNm para VDR(272,273). Después de la incubación con anti CD40/IL-21, se observa un incremento en la expresión de VDR. La adición de 1,25 (OH)2 D3, duplica la expresión de ARNm para VDR. VDR parece ser funcional en células B activadas, lo que se concluye de la inducción de ARN m para CYP24A1 en presencia de 1,25 (OH)2 D3(271). Estos datos indican que el mecanismo de retroalimentación negativo es operacional en células B, dado que el ARNm para CYP24A1 no es detectable en células B en reposo. La adición al sobrenadante de cultivos celulares de células B activadas durante 48 horas genera la producción de 1,25 (OH)2 D3, debido a la presencia de CYP27B1 en el sobrenadante(274). Las células B activadas son, por tanto, capaces de metabolizar la vitamina D y responder a su componente activo. Los estudios iniciales indicaban que la 1,25 (OH)2 D3 podría regular la producción de células B y la secreción de inmunoglobulinas, de forma indirecta 54 o de forma directa. La vitamina D podría actuar directamente sobre las células plasmáticas, aunque se conoce poco sobre la expresión de VDR en estas células. Estudios sobre perfiles de expresión génica en células plasmáticas circulantes en pacientes con LES revelan que VDR está regulado al alza en relación con las células B vírgenes memoria(275). La vitamina D parece interferir directamente en la generación de células plasmáticas, pero es menos probable su efecto sobre la inducción de la apoptosis de células plasmáticas o sobre la inhibición de la secreción de inmunoglobulinas . Estudios en los que se cultiva célula B purificadas en presencia de vitamina D evidencian un descenso en el porcentaje y en el número absoluto de células plasmáticas así como en los niveles de IgA, IgG e IgM, siendo los resultados contradictorios con IgE(276-281). La formación de linfocitos B memoria también se ve inhibida por la 1,25 (OH)2 D3. Por tanto, los resultados de la vitamina D sobre las células B podrían resumirse como disminución del "pool" de células B memoria e inhibición de la generación de células plasmáticas, con el consecuente descenso en la secreción de anticuerpos. Sobre células B vírgenes, que constitutivamente expresan VDR y CYP27B1, la respuesta a la vitamina D consiste en incremento en la expresión de VDR , de 25 (OH) D3 y de la enzima degradante de 1,25 (OH)2 D3 CYP24A1. Después de la activación , mejora la expresión de VDR y CYP27B1, lo que incrementa el nivel de 1,25 (OH)2 D3 y estimula el mecanismo de retroalimentación negativo a través del aumento de CYP24A1(272). La participación de las células B reguladoras en la homeostasis inmune ejercida por la vitamina D parece confirmarse en modelos murinos de enfermedades autoinmunes en los que se requiere una vía funcionante mediada por IL-10 para garantizar el efecto sobre la enfermedad de la 1,25 (OH)2 D3(282,283). Todas estas acciones sobre las células B se refuerzan de forma indirecta a través de su efecto sobre los linfocitos T "helper". 2.3. Huella genética de la vitamina D en el sistema inmune. El análisis profundo genómico ha permitido definir una nueva perspectiva sobre la vitamina D y su función en el ser humano. En los macrófagos, la descripción de niveles incrementados de VDR y de 1 α hidroxilasa (CYP27B1) tras un desafío patogénico subrayó la importancia de sistema intracrino de la vitamina D como mediador de la respuesta inmune (284,285). Se sabe 55 actualmente que los macrófagos y las células dendríticas son capaces de responder a la 25 (OH) D3, el mayor metabolito circulante de la vitamina D, lo que proporciona un vínculo entre lestas células y la vitamina D en los humanos. La identificación de cientos de genes dianas para la 1,25 (OH)2 D3 en células inmunes ha aportado también una nueva perspectiva sobre el papel de la vitamina D en el sistema inmune adaptativo. El primero de los estudios genómicos centrado en acciones extraesqueléticas de la vitamina D fue publicado por John White y colaboradores en la universidad McGill de Montreal y utilizó una combinación de arrays de DNA sobre genes regulados por la 1,25 (OH)2 D3 y estrategias in silico (286-293). El análisis profundo de las secuencias dianas que son capaces de ligar a VDR revela elementos de respuesta (VDRE) que se localizan junto a genes promotores de proteínas antibacterianas como la catelicidina (CAMP) y la beta defensina 2 (DEFB4). Sólo CAMP parece ser inducida transcripcionalmente en monocitos (294). El mecanismo subyacente para la regulación diferencial de CAMP y DEFB4 por la 1,25 (OH)2 D3 fue determinado en estudios posteriores. El primero de ellos describía la expresión incrementada en monocitos de DEFB4 tras tratamiento con 1,25 (OH)2D3 e IL- 1. Se requería para ello la ocupación cooperativa de VDRE por el NF-κβ y por otro lado la unión de VDRE con el gen promotor de DEFB4(294) . La importancia de NF-κβ y de VDR como coinductores de la transcripción de DEFB4 fue reforzada posteriormente en estudios sobre la proteína NOD2 de los patógenos intracelulares, inducida transcripcionalmente por la 1,25 (OH)2 D3(295). Las células tratadas con 1,25 (OH)2 D3 y con el ligando de NOD, MDR, un producto de la pared de los microorganismos Gram+ y Gram-, muestran una potente inducción de DEFB4 dependiente de NF-Kbeta (296,297). Sin embargo, la inducción de CAMP es primariamente dependiente de la unión de VDR al promotor VDRE. El elemento VDRE inicialmente identificado como el promotor de CAMP parece ser específico de los primates humanos y subhumanos(298). La adquisición de un elemento VDRE para el gen CAMP parece haber ocurrido por la introducción de un elemento nuclear (SINE) que puso a CAMP bajo el control del receptor VDR. Esta adaptación específica de los primates se ha conservado en humanos y en primates del Viejo y del Nuevo Mundo, sugiriendo 56 que el mecanismo transcripcional regulatorio de CAMP por la vitamina D confiere ventajas biológicas. Se asume que este mecanismo podría estar potentemente activado por los relativamente elevados niveles de 25 (OH)D3 y de 1,25 (OH)2 D3 que son característicos de los primates no humanos. En el hombre moderno, en el que el status de vitamina D es más variable, el mecanismo antibacteriano podría ser menos efectivo. Puesto que hay un mecanismo hipotético que apoya el beneficio de la suplementación con vitamina D en la inmunidad innata, la cuestión más importante radica en qué variación de los niveles de 25 (OH)D3 es capaz de producir una respuesta inmune conducida por su metabolito activo 1,25 (OH)2D3 y VDR. Para las células, el reconocimiento y la respuesta a los patógenos implica la identificación de patrones moleculares asociados a vigilancia de patógenos (PAMPs) mediante receptores de reconocimiento de patrones (PRRs). Entre estos receptores se encuentra la extensa familia de los receptores "Toll like" (TLR), proteínas trasmembrana no catalíticas que interaccionan con específicos PAMPs(299). Muchos genes de macrófagos podrían estar regulados diferencialmente por una lipoproteína de 19 Kd tipo PAMP que interacciona con TLR1/2. En estudios genómicos sobre modelos de infección tuberculosa, el estímulo TLR2/1 a través de esta lipoproteína induce la expresión de CY27B1 y VDR, sugiriendo que en la respuesta macrofágica a Mycobacterium tuberculosis está implicado el sistema endógeno intracrino de la vitamina D. Los macrófagos tratados con el ligando TLR1/2 son reactivos a las formas 1,25 (OH)2 D3 y 25(OH) D3 de la vitamina D, confirmando la eficacia funcional del modelo intracrino. La inhibición de la actividad 1 α hidroxilasa bloquea la acción de la 25 (OH) D3, subrayando la importancia del metabolismo celular específico como determinante de la inmunorregulación de la vitamina D(300). La estimulación de TLR1/2 por Mycobacterium tuberculosis produce además la inducción de la enzima catabólica de la vitamina D (CYP24A1) y de la proteína antibacteriana CAMP. La expresión de la otra proteína antibacteriana DEFB4 es resultado de la acción cooperativa entre la vía TLR1/2, Il-1, la vía NOD2 MDP. Las proteínas antibacterianas tales como CAMP y DEFB4 juegan un papel crucial en la muerte intracelular bacteriana mediada por vitamina D. Los monocitos tratados con concentraciones crecientes del peptido CAMP muestran una reducción dosis dependiente de la internalización de 57 Mycobacterium tuberculosis y una inhibición similar en macrófagos sucede en presencia de 25 OH D3, siendo este efecto interrumpido por los antagonistas de VDR(296). La vitamina D y sus análogos son capaces de promover autofagia, siendo muy importante esta inducción para provocar respuestas antibacterianas a través de la vitamina D en la infección tuberculosa. La síntesis intracrina de 1,25 (OH)2 D3 parece regular la expresión de otra proteína antibacteriana, la hepcidina (HAMP) (301,302). La mayor función atribuida a HAMP parece ser la supresión de la proteína de membrana ferroportina, la única exportadora de hierro intracelular. Este vínculo en células como los enterocitos, hepatocitos y monocitos juega un papel clave en la denominada anemia de proceso crónico(301). Dado que los patógenos como las bacterias utilizan el hierro para mantener el crecimiento, la restricción del hierro de la circulación proporciona una respuesta importante del huésped a la infección sistémica(303). Sin embargo, para patógenos tales como Mycobacterium tuberculosis que evaden la vigilancia inmunológica a nivel intracelular, la acumulación de hierro en este entorno puede promover el crecimiento de patógenos intracelulares. La vitamina D en sus formas 25 OH D3 y 1,25 (OH)2 D3 suprime la transcripción de HAMP en monocitos y hepatocitos, lo que lleva a la liberación del bloqueo a la ferroportina dependiente de HAMP, favoreciendo el transporte del hierro y disminuyendo la concentración del mismo a nivel intracelular(303). La vitamina D ejerce también un efecto regulador sobre los monocitos disminuyendo la expresión de TLR2 y TLR 4 en los mismos, lo que promueve mecanismos de control que limitan la actividad antibacteriana y otras respuestas inmunes. De este modo se previene la sobreelaboración de la respuesta inmune(303). La inducción por VDR en monocitos de CAMP y DEFB4 así como la supresión de HAMP parecen específicas de primates(304). Los neutrófilos expresan VDR pero, al contrario que los monocitos y macrófagos, no parecen expresar una enzima 1 α hidroxilasa funcional y no están sujetos a una activación intracrina del sistema de la vitamina D. Las células dendríticas, que pertenecen al mismo linaje hematopoyético de los monocitos y de los macrófagos, expresan VDR y CYP27B1 y exhiben un 64 sobre la apoptosis de células inflamatorias. Como hemos mencionado anteriormente, parte de esta acción de la vitamina D es dependiente de la actividad de la IL-10 (372-375). 2.5.2.2. Vitamina D y diabetes tipo 1. Los resultados publicados sugieren que existe un vínculo entre el déficit de la vitamina D y otra enfermedad autoinmune, la diabetes mellitus tipo 1, habiéndose comunicado en adolescentes con esta enfermedad bajos niveles de 25 (OH)D3 (376-378). Varios estudios indican que algunos haplotipos VDR confieren protección contra la diabetes y más recientemente se ha comunicado que las variantes genéticas de CYP27b1 afectan a la suceptibilidad de padecer diabetes tipo 1 (379,380). En modelos de ratón de diabetes tipo 1, se ha evidenciado una mayor severidad de la enfermedad en condiciones de restricción de vitamina D (381). 2.5.2.3. Vitamina D y enfermedad de Crohn. Las respuestas inmunes desrreguladas observadas en enfermedades inflamatorias intestinales tales como la enfermedad de Crohn parecen estar ligadas a la vitamina D. Los pacientes con enfermedad de Crohn presentan niveles descendidos de 25 (OH) D3 (382-384). En varios modelos animales se ha demostrado que la 1,25 (OH)2 D3 juega un papel fundamental en la fisiopatología de formas inducidas de enfermedad inflamatoria (385-387). La expresión de 1 alfa hidroxilasa ha sido detectada en el colon humano, encontrándose la enzima activadora de vitamina D regulada al alza y su expresión asociada a niveles elevados de 1,25 (OH)2 D3 en pacientes con enfermedad de Crohn, indicando que, como en casos de sarcoidosis, la síntesis localizada del metabolito de la vitamina D puede pasar a la circulación en casos de enfermedad persistente (388). Los estudios actuales tienden a considerar que en la iniciación del mecanismo inmune iniciador de la enfermedad de Chron se implican respuestas inmunes aberrantes contra la microbiota entérica, en las que podría influir la vitamina D con su efecto sobre la inmunidad innnata y sobre la inmunidad adaptativa (389). 2.5.3 Vitamina D en hemopatías malignas. 65 Experimentos en los que se tratan líneas celulares de células madres hematopoyéticas y líneas celulares leucémicas con la forma activa de la vitamina D demuestran un incremento en la diferenciación monocito/macrófago y un aumento en el número de células maduras que no se evidencia en ratones que carecen de VDR (390-392). Después de su unión al análogo de la vitamina D, VDR forma un homodímero o se une al receptor X de los retinoides (RXR), que procede a interactuar con VDRE originando una señal de transcripción sobre varios ARNs efectores (393,391). El receptor del ácido retinoico (RAR) es un compañero de dimerización alternativo para RXR (394). Así como la actividad de VDR conduce a la diferenciación monocítica, la actividad RAR lleva a la diferenciación de granulocitos maduros (391). Experimentos con cultivos celulares sugieren que RAR activado y VDR compiten por su unión con RXR y el equilibrio relativo entre los dímeros RAR/RXR y VDR/RXR influye en la relativa actividad de la granulopoyesis o la monopoyesis (395). En modelos animales, la carencia de VDR y RAR permite generar apropiadas unidades formadoras de colonias de monocitos y granulocitos con lo que se sospecha que el efecto primario de la vitamina D se produce sobre la señalización de citoquinas y sobre las etapas finales de diferenciación de estos dos tipos celulares. La complejidad de la interacción entre VDR y RXR ha quedado reflejada en recientes observaciones en las que se demuestra que el ácido retinoico y la vitamina D pueden potenciar su acción mutuamente, de forma que la estimulación de VDR parece incrementarse en presencia de la unión RARRXR (391). 2.5.3.1. Vitamina D como terapia de diferenciación en patología mieloide. Debido al efecto anteriormente mencionado sobre la maduración, se ha utilizado la vitamina D y sus análogos como tratamiento en neoplasias mieloides, particularmente síndromes mielodisplásicos (SMD) y leucemias agudas mieloblásticas (LAM). Experiencias preclínicas específicas con HL-60 y otras líneas leucémicas, tales como U-937 y THP-1, han mostrado diferenciación y apoptosis de blastos con vitamina D, lo que sugiere que estos componentes, como el ATRA en la LPA, revierten el bloqueo de la diferenciación de los mieloblastos (391,396,397). El mecanismo exacto por el que se produce este efecto a través de la activación del receptor de la vitamina D 66 no está del todo aclarado y las investigaciones han revelado complejas señales cruzadas que implican a la quinasa P13, a la activación de múltiples escalones prodiferenciación en la vía MAPK y probablemente a la regulación al alza de factores como p53 (396). Ensayos preclínicos tempranos utilizando dosis suprafisiológicas que inducían diferenciación reflejaron la posibilidad de producir con las mismas hipercalcemia (391,398). Sin embargo, otros trabajos demostraron que el fraccionamiento de la dosis podría conseguir el mismo efecto sobre la diferenciación, manteniéndose el nivel de la vitamina D en rango fisiológico (399). Existen varios estudios en los que se ha empleado la terapia con vitamina D como único agente en SMDs. El primer estudio se efectuó por Koeffler y colaboradores en 1985, comunicando 18 pacientes tratados con 1,25 (OH)2 D3 con una dosis superior a 2 microgramos al día. Aunque 18 pacientes presentaron respuestas hematológicas menores, la respuesta no persistía más de 12 semanas y la hipercalcemia fue una toxicidad común del tratamiento. Además, al tratarse los pacientes de una población con SMDs de alto riesgo, siete individuos desarrollaron una LAM durante el periodo de estudio (398). Takahashi y colaboradores trataron 11 pacientes con SMD con 1,25 (OH)2 D3 con resultados similares, aunque fueron capaces de reducir la hipercalcemia asociada con dosificación intermitente (400). Otros estudios con análogos de la vitamina D, con una administración de 2000-4000 UI diariamente en pacientes con SMD no consiguieron demostrar respuestas hematológicas aunque la tolerancia fue adecuada (401). Recientemente, Motomura y colaboradores aleatorizaron una serie de 30 pacientes a recibir 25 (OH) D3 frente a tratamiento de soporte, con un porcentaje similar en ambos grupos de pacientes de bajo y alto riesgo. sólo uno de los 15 pacientes del grupo de la vitamina D progresó a LAM frente a siete del grupo control (402). Existen varios intentos de combinación de la vitamina D con otros agentes citotóxicos y prodiferenciación. Siitonen y colaboradores comunicaron una serie de 19 pacientes con todos los tipos y categorías de riesgo de SMDs tratados con una combinación de ácido 13-cis retinoico, 1,25 dihidroxicolecalciferol (un microgramo al día) y ácido valproico, utilizado como inhibidor de la histona deacetilasa (403). Tres pacientes obtuvieron una respuesta hematológica menor, 67 pero se registró intolerancia en ocho pacientes debido al ácido 13-cis retinoico y al ácido valproico. Una vía prometedora consiste en la utilización de factores de crecimiento con agentes prodiferenciación. En el año 2008 se realizó un estudio con 63 pacientes con SMDs que excluía a los pacientes de alto riesgo con una combinación de eritropoyetina, ácido 13-cis retinoico, 1,25 (OH)2 D3 y tioguanina si existían blastos presentes. Se obtuvo una respuesta eritroide global del 60%, siendo del 93% en pacientes de bajo riesgo(404). Posteriormente se combinaron los análogos de la vitamina D con quimioterapia citotóxica en una serie de 53 pacientes con SMD en los que se añadió 13-cis retinoico (20- 40 mg al día) a 1,25 (OH)2D3 (1-1,5 micg al día) con o sin tioguanina. La tasa de respuesta global fue del 60% pero la tasa de respuestas completas fue baja. El 50% de los pacientes consiguió independencia transfusional (405). El único estudio que empleó vitamina D en monoterapia en LAM fue realizado en los años ochenta sobre 5 pacientes, cuatro de los cuales presentaron una reducción transitoria en el número de blastos y sólo en uno se describió una breve normalización del estudio medular (400). Existen dos series de pacientes ancianos con LAM tratados con citarabina a bajas dosis, vitamina D y otro agente. Slapak y colaboradores comunicaron en 1992 el uso de citarabina en infusión continua durante 21 días (20 mg/m2/ día), hidroxiurea (500 mg dos veces al día)y 1,25 (OH)2 D3 (0,5 micg dos veces al día) (406). Se obtuvo una tasa de respuesta global del 79%, con un 45% de respuesta completa. La toxicidad fue primariamente hematológica consistiendo en neutropenia y trombopenia, sólo dos pacientes desarrollaron hipercalcemia asintomática que no requirió tratamiento. La media de duración de la remisión fue de 9,8 meses. Estos resultados se consideraron al menos no inferiores a los conseguidos con citarabina como único agente. Ferrero y colaboradores realizaron otro estudio en el año 2008 con una población similar de 30 pacientes (24 LAM, 6 SMD) en los que emplearon citarabina subcutánea (8 mg/m2 dos veces al día), 1,25 (OH)2 D3 (1 micg al día), ácido 13-cis retinoico (20-40 mg al día) y tioguanina (40 mg al día). La mediana de supervivencia fue de 7,5 meses, siendo de 16 meses para los respondedores. La toxicidad se relacionó fundamentalmente con las citopenias (407). El único estudio publicado en la literatura en el que se compara el tratamiento combinado con análogos de 68 la vitamina D (1,25 dihidroxicolecalciferol 1 micg al día) y quimioterapia (citarabina 15 mg/m2/ día por vía subcutánea hasta que los blastos fueron inferiores al 50%) frente a un grupo control fue realizado en Suecia sobre un total de 78 pacientes, 68 con SMD y 15 con LAM. La mitad de los pacientes recibió además ácido 13-cis retinoico (1 mg/Kg/día). La media de supervivencia fue de 10,5 meses, sin diferencia significativa entre ambos brazos (408). 2.5.3.2.Vitamina D en hemopatías malignas no mieloides. Hay pocos estudios que evalúen el papel de la vitamina D en los desórdenes no mieloides. Muchos estudios preclínicos han demostrado actividad del análogo de la vitamina D EB1089 en la línea celular de mieloma múltiple H929. En este caso, el agente parece promover la apoptosis e inducir la detención del ciclo celular por regulación a la baja de quinasas dependientes de ciclinas, una actividad que es incrementada por TGF-β(409-411). Hay estudios preclínicos que demuestran que la vitamina D tiene un efecto inhibitorio sobre células linfoides neoplásicas, pero hasta la fecha no se han realizado estudios en humanos (412). 2.5.3.3. Vitamina D como moduladora de la respuesta inmune en trasplante alogénico. Existe un considerable interés en los análogos de la vitamina D por sus efectos inmunomoduladores, lo que podría tenerse en cuenta en los protocolos terapeúticos de pacientes sometidos a TPH alogénico. Los genes VDR son polimórficos en la población humana y esta variación genética en VDR ha sido sometida a investigación en pacientes sometidos a alo-TPH. Los polimorfismos VDR fueron determinados a partir de los distintos lugares de anclaje de las enzimas de restricción (413). Aunque las vías exactas por las que estos polimorfismos influyen en la actividad de VDR no se conocen, se han asociado estas variaciones genéticas con variabilidad en la función inmune de la vitamina D y sus otras acciones tales como crecimiento, formación ósea y suceptibilidad a las enfermedades infecciosas. Cho y colaboradores llevaron a cabo un análisis de 147 pacientes coreanos que fueron sometidos a alo-TPH. Analizaron los polimorfismos para VDR de los receptores y evaluaron retrospectivamente la asociación con el 69 pronóstico de los pacientes incluyendo infección, EICH, supervivencia global y supervivencia libre de enfermedad. Los hallazgos más significativos muestran una correlación entre los polimorfismos del lugar de anclaje de la enzima de restricción Taq1 y la supervivencia, de forma que los heterocigotos (que poseen al menos una copia del alelo C) tienen mejor supervivencia global y libre de enfermedad que los homocigotos TT. El significado funcional de esta variación alélica es desconocido y no se comunicó una asociación directa con una myor o menor actividad VDR. Este estudio también encontró que los receptores con dos copias para el alelo "A", relacionado con los polimorfismos par el lugar de anclaje de Apal, experimentaron tasas descendidas de EICH aguda e infección (414). Estos polimorfismos se han relacionado con actividad de VDR de modo que la homocigosidad para el alelo "a" se traduce en mayor actividad (415). Middleton y colaboradores estudiaron una cohorte de 88 pacientes con hemopatías malignas mieloides sometidos a TPH alogénico de hermano HLA idéntico correlacionando los polimorfismos VDR de receptores y donantes con el pronóstico (413). Al igual que Cho y colaboradores, detectaron una marcada tendencia hacia la disminución de EICH aguda en receptores con genotipo AA (baja actividad de VDR). Los receptores con genotipo aa y elevada actividad de VDR mostraron mayor tendencia a la EICH aguda, aunque no hubo diferencias significativas. Sin embargo, los receptores de donantes con baja actividad VDR (AA) presentaron mayor riesgo de muerte. Esta disminución de supervivencia no fue aplicable para pacientes que recibieron ciclosporina como única profilaxis de EICH. Bogunia-Kubik y colaboradores publicaron un análisis de 123 pacientes polacos que incluía también enfermos sometidos a alo-TPH de donante no relacionado (415). Encontraron una asociación entre el genotipo FF, que se asocia a mayor actividad VDR, y el pronóstico del TPH. si el donante y el receptor poseen el genotipo FF, los receptores presentan mayor tasa de EICH. El genotipo Apal, como en otros estudios, también presentaba impacto en el riesgo de EICH. En este caso, al contrario de lo que sucedía en el estudio de Middleton, el genotipo del donante AA (baja actividad VDR) se relacionaba con mayor riesgo de EICH en comparación con el genotipo que tuviera al menos un 70 alelo a, Al mismo tiempo, los receptores aa (alta actividad VDR) presentaban alto riesgo de muerte y de EICH en comparación con el genotipo de baja actividad VDR, lo que es consistente con otros estudios. Claramente, el receptor de la vitamina D y su mediación sobre la señalización inmune parece presentar un impacto sobre la reconstitución inmune después del TPH y el riesgo de infección, la enfermedad injerto contra el huésped y el efecto injerto contra enfermedad. Si esta relación fuera bien comprendida, podría suponer un potencial papel terapeútico para la vitamina D(figura 7). Figura 7. Efectos posibles de la vitamina D sobre el TPH alogénico 8 8 Tomado de la siguiente publicación: Benrashid M, Moyers K, Mohty m, et al. Vitamin D deficiency, autoimmunity and graft-versus-host-disease risk: Implication for preventive therapy. Experimental Hematology 2012; 40: 263-267. 71 Hipótesis 72 Merced a su interacción con VDR presente en todas las células del sistema inmunitario, la vitamina D es capaz de inhibir la activación de células dendríticas y la proliferación y producción de citocinas por poblaciones efectoras de linfocitos T, actuando además de forma directa e indirecta sobre los linfocitos B. Todo este potencial inmunomodulador permitiría su aprovechamiento terapeútico en la compleja interacción entre donante y receptor que se genera tras el trasplante alogénico de progenitores hematopoyéticos. En base a este efecto, su administración en el periodo peri y postrasplante podría disminuir el riesgo de EICH, una enfermedad que condiciona la morbilidad y mortalidad de los pacientes trasplantados, reduciendo los requerimientos de tratamiento inmunosupresor y mejorando el pronóstico de estos enfermos (415,416). 73 Objetivos 80 -Signos de EICH: signos/síntomas de EICH aguda en piel, hígado y/o tubo digestivo, registrándose estadio global y por órgano afecto. En todas la visitas excepto en el día -5. -Analítica estándar: incluía bioquímica general (perfil básico con ionograma, hepático y renal) y hemograma. - Efectos adversos: según apartado 1.3. de seguridad. -Tratamiento concomitante. 1.4. Seguridad. La seguridad se evaluó en los pacientes que recibieron el farmaco de estudio. Se recogieron todos los efectos adversos que sucedieron durante todo el periodo de estudio hasta la visita de control del dia +150. Se emplearon las siguientes definiciones: Acontecimiento adverso se definió como una observacion clínica imprevista o anormal que no es beneficiosa para el paciente. Acontecimiento adverso grave se definió como cualquier experiencia que es fatal o amenazante para la vida, que produce una alteración persistente o significativa (según el investigador principal), que requiere la hospitalización del paciente o la prolongación de la hospitalizacion, una anomalía congénita, o una sobredosis de los fármacos del estudio. Cualquier toxicidad de grado 4 se considerara un acontecimiento adverso grave. Los investigadores de cada centro debían comunicar inmediatamente al promotor todos los acontecimientos adversos graves. El promotor notificaría a la Agencia Española de Medicamentos y Productos Sanitarios todas las sospechas de reacciones adversas graves y a la vez inesperadas asociadas a los medicamentos en investigación. El plazo maximo de notificacion sería de 15 dias naturales a partir del momento en que el promotor hubiera tenido conocimiento de la sospecha de reaccion adversa. 1.5. Muestras biológicas. La extracción de las muestras biológicas se llevó a cabo en los siguientes momentos postrasplante: 81  Días -5, +1, +7, +14 y +21 postrasplante: 10 ml de sangre periférica en heparina para determinación de niveles de vitamina D en plasma.  Días +1, +7,+14, +21, +56, +100: 10 ml de sangre periférica en tubo de gelosa para estudio de citocinas en el suero obtenido mediante citometría de flujo.  Días -5, +1, +7, +14 y +21 postrasplante: 10 ml de sangre periférica en heparina para determinación de niveles de vitamina D en plasma.  Días +1, +7,+14, +21, +56, +100: 10 ml de sangre periférica en tubo de gelosa para estudio de citocinas en el suero obtenido mediante citometría de flujo.  Días +21, +56, +100: 10 ml de sangre periférica en tubo de heparina para estudio de diferentes subpoblaciones celulares del sistema inmune. Los estudios biológicos se llevaron a cabo en al menos los 10 primeros pacientes de cada cohorte de los pacientes incluídos en el hospital Virgen del Rocío:  16 pacientes en el GC  10 pacientes en LdD  14 pacientes en HdD. Además se analizarón las mismas poblaciones en cuatro controles sanos. 2. Métodos 2.1. Estudios de inmunofenotipo 2.1.1. Materiales A continuación se enumeran los reactivos necesarios para llevar a cabo los estudios de citometría de flujo:  Brefeldina A procede de Sigma-Aldrich, nos permite inhibir la secreción de proteínas y por lo tanto podemos emplearla para el estudio de 82 proteínas intracelulares con activación linfocitoria. Para activación de los linfocitos T se empleo: PMA (Phorbol 12-Myristato 13 acetato) de Sigma- Aldrich e Ionomycin calcium salftfrom steptomyces conglobatus de Sigma-Aldrich.  En estudios de membrana, Lysing Solution 10X Concentrate (BD FACS) se utiliza para lisar eritrocitos bajo condiciones hipotónicas preservándose los leucocitos. Para el estudio de proteínas intracelulares se empleó Cell Permeabilization Kit (FIX & PERN). Las muestras se procesan en tubos de 5 ml de Round Bottom Test Tubes, 5ML (Falcon).  Además como fluidos necesarios en el procesamiento y adquisición de muestras utilizamos: Sheath Fluid (BD FACSFlow), Shutdown Solution (BD FACS), CellWASH (BD Biosciences) y Clean Solution (BD FACS).  Para el control y calibración de los citómetros se emplearon Cytometer Setup & Tracking (CST) Beads Kit (BD) y SPHERO Rainbow Calibration (Cytognos). La calibración y compensación de los citómetros se lleva a cabo según las recomendaciones de Euroflow.  Los estudios de expresión protéica del gen FOXP3 en linfocitos T se desarrollaron con el kit de FOXP3 Staining Buffer Set de eBioscience (San Diego, CA, EEUU).  Para llevar a cabo el estudio de citoquinas solubles, usamos Human Th1/Th2 Cytokine Kit II para las citoquinas IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, TNF-α e IFNγ.  Utilizamos el citómetro de flujo modelo FACSCanto II (Becton Dickinson Bioscience San Jose, CA, EEUU) y los programas informáticos: Infincyt 7 (Cytognos S.L. Salamanca, España) y FACSDiva (Becton Dickinson Bioscience, San Jose, CA, EEUU)  El análisis estadístico se realizó mediante el programa estadístico SPSS software program (SPSS .0, Chicago IL).  Los anticuerpos monoclonales, empleados para análisis por citometría de flujo se detallan a continuación en la tabla 3: 83 Tabla 3: Anticuerpos monoclonales utilizados en el estudio. Anticuerpo Fluorocromo Isotipo Clon Procedencia BDCA1 PE Mouse IgG1κ F10/21A3 BD Pharmingen CCR7 PE Mouse IgG2A 150503 R&D Systems CD11a FITC Mouse BALB/c IgG2a, κ G-25.2 BD Biosciences CD11C PerCP Cy5.5 Mouse BALB/c IgG1, κ B-ly6 BD Pharmingen CD123 APC Mouse IgG2a AC145 Immunostep CD127 PE Mouse IgG1κ HIL-7R-M21 BD Pharmingen CD14 APC-H7 Mouse IgG2b, κ MΨP9 BD Biosciences CD158a FITC Mouse IgM, κ HP-3E4 BD Pharmingen CD16 PE Mouse IgG1 3G8 Beckman Coulter CD16 V450 Mouse IgG1 3G8 BD Horizon CD16 FITC Mouse BALB/c IgG2a, κ CLB/fcGran1 BD Biosciences CD161 PE Mouse C3H DX12 BD Biosciences CD25 FITC Mouse IgG1κ 2A3 BD Biosciences CD3 PerCP Cy5.5 Mouse IgG1κ SK7 BD Biosciences CD33 PerCP Cy5.5 Mouse BALB/c IgG1, κ P67.6 BD Biosciences CD4 PerCP Cy5.5 Mouse IgG1κ SK3 BD Biosciences CD40L APC Mouse IgG1κ TRAP1 BD Pharmingen CD45 V500 Mouse IgG1, κ 2D1 BD Biosciences CD45RA FITC Mouse BALB/c IgG1, κ L48 BD Biosciences CD56 PE Mouse IgG1, κ MY31 BD Biosciences CD56 APC Mouse BALB/c IgG2b, κ NCAM16.2 BD Biosciences CD64 PE Mouse BALB/c IgG1, κ 10,1 BD Biosciences CD8 APC Mouse BALB/c IgG1, κ SK1 BD Biosciences CD86 PE-Cy7 Mouse IgG2b, κ IT2.2 BioLegend CD94 FITC Mouse BALB/c IgG1, κ HP-3D9 BD Pharmingen Foxp3 APC Rat IgG2a κ PCH101 eBioscience HLA-DR APC Mouse BALB/c IgG2, κ L243 BD Biosciences HLA-DR FITC Mouse BALB/c IgG2, κ L243 BD Biosciences HLA-DR V450 Mouse BALB/c IgG2, κ L243 BD Horizon INF-ɣ PE Mouse IgG1κ B27 BD Pharmingen NKAT2 PE Mouse IgG2a, κ DX27 BD Pharmingen NKB1 FITC Mouse BALB/c IgG1, κ DX9 BD Pharmingen Lymphogram CD8-CD19-FITC CD3-CD56-PE CD4-PECy5 IgG2a-IgG1 IgG2a-IgG2b IgG1 Cytognos 84 2.1.2. Estudio de proteínas de membrana El protocolo para marcar antígenos de membrana comprende los siguientes pasos: 1. Añadir el volumen apropiado de cada anticuerpo frente al antígeno de membrana 2. Añadir 100μl de muestra. 3. Mezclar bien. 4. Incubar durante 15 minutos a temperatura ambiente en oscuridad. 5. Añadir 2mL de FACS Lysing solution 1X (1mL de FACS Lysing solution diluido en 9ml de agua destilada). 6. Incubar durante 10 minutos a temperatura ambiente en oscuridad. 7. Centrifugar durante 5 minutos a 2000rpm. 8. Retirar el sobrenadante utilizando una pipeta Pasteur. 9. Lavar con 2mL de Cell-Wash+Albúmina. 10. Mezclar bien. 11. Centrifugar durante 5 minutos a 2000rpm 12. Retirar el sobrenadante utilizando una pipeta Pasteur dejando aproximadamente 50μL en el tubo. 13. Resuspender el pellet en 300μL de Facs Flow + Albúmina. 14. Adquirir en el citómetro FACSCanto II empleando el programa FACS Diva. 15. El análisis se lleva a cabo con el programa Inficyt (Cytognos). Estrategia de análisis: En todos los estudios realizados se comienza con la misma estragia de análisis dirigiada a identificar la población hematológica utilizando el diagrama que enfrenta CD45, el antígeno panleucocitario, a SSC y a excluir tanto los dobletes según el diagrama que enfrenta FSC-A/FSC-H como el debris por las características de dispersión de luz de las células (FSC/SSC) respectivamente. 85 Seleccionamos la población hematológica CD45+. Excluimos los dobletes mediante una selección en el diagrama que enfrenta FSC-A/FSC-H. Por último seleccionamos la población que tenga un FSC y SSC adecuado. 2.1.2.1. Análisis inmunofenotípico de CDs Para evaluar inmunofenotípicamente las CDs hicimos las combinaciones de anticuerpos monoclonales: Se lleva a cabo el protocolo para marcar antígenos de membrana generérico y se adquiere 500.000 eventos para su análisis. V450 V500 FITC PE PerCPCy5.5 PE Cy7 APC APCH7 CD16 CD45 HLADR BDCA1 CD11c CD86 CD123 CD14 86 Se identifican tres poblaciones diferentes:  Células dendríticas plasmocitoides: de fenotipo HLADR+ CD123++ CD11c- CD16- CD14- BDCA1- CD45+. Las identificamos por su expresión fuerte de CD123 y positivas para HLADR según la siguiente figura:  Células dendríticas derivadas de monocitos: de fenotipo HLADR+ CD123+d CD11c+ CD16++ CD14-/+d BDCACD45+. Las identificamos por su expresión de CD11c junto con expresión intensa de CD16 y negativas o débilmente positivas para CD14. Son débilmente positivas para CD123 y positivas para HLADR: Basófilos 87  Células dendríticas mieloide BDCA1: HLADR+ CD123- CD11c+ CD16- CD14- BDCA+ CD45+. Se selecciona po su positividad en CD11c y BDCA1, siendo negativas para CD123 y positivas para HLADR. Además se comprueba que su negatividad para CD16 y CD14. 2.1.2.2. Análisis inmunofenotípico de poblaciones linfocitarias Para evaluar inmunofenotípicamente las poblaciones celulares utilizamos la combinacion de anticuerpos monoclonales: Se lleva a cabo el protocolo para marcar antígenos de membrana generérico y se adquiere 100.000 eventos para su análisis. Se separan los linfocitos T según su expresión de CD3 (en rojo) en la positividad fuerte en PE. Además se separan según su expresión de CD4 y CD8, identificando los CD4+, CD8+, dobles positivos (CD4+CD8+) y dobles negativos (CD4-CD8-). Además en azul se diferencia la población de células NK CD56+ que se situan en el positivo débil en PE. Por último, FITC PE PerCPCy5.5 APC CD8-CD19 CD3-CD56 CD4 HLADR 88 tras retirar la población de células NK y linfocitos T CD8 podemos separar los linfocitos B CD19+ en naranja colocada en la positividad débil de FITC. 2.1.2.2.1. Análisis inmunofenotípico de linfocitos T naive/memoria/efector Se emplea la combinación de anticuerpos CD45RA-PE y CCR7-FITC para determinar los linfocitos T naive, efectores y de memoria central y periferica tanto en los linfocitos T CD4 como en los linfocitos T CD8. Se lleva a cabo el protocolo para marcar antígenos de membrana generérico y se adquiere 100.000 eventos para su análisis. Según estas proteínas de membrana son: -linfocitos T naive: CD45RA+CCR7+ -linfocitos T efectores: CD45RA+CCR7- -linfocitos T memoria central (MC): CD45RA-CCR7+ -linfocitos T memoria periférica (MP): CD45RA-CCR7- 89 2.1.2.2.2. Análisis inmunofenotípico de células NK Se utiliza las siguientes combinaciones de anticuerpos: Se lleva a cabo el protocolo para marcar antígenos de membrana generérico y se adquiere 100.000 eventos para su análisis. Se identifican las células NK con expresión débil de CD56 denominadas CD56 "weak" y aquellas que expresan más intensamente este marcador CD56 "bright" (en negro). Estas últimas se caracterizan por mayor intensidad en la expresión de CD94 en práctica ausencia de CD16. Además se identifca la expresión de diferentes receptor KIR como CD158a, CD161, NKB1 y NKAT2. 2.1.2.2.3. Estudio de linfocitos T reguladores Las muestras se marcaron con los anticuerpos de membrana (CD25- FITC, CD127-PE y CD4-PerCPCy5.5.). Incubamos a temperatura ambiente y oscuridad durante 15 minutos. Trascurrido este tiempo de incubación las FITC PE PerCPCy5.5 APC CD94 CD56 CD3 HLADR CD11a CD16 CD3 CD56 CD158a CD161 CD3 CD56 NKB1 NKAT2 CD3 CD56 96 97 Resultados 98 1. Perfil de seguridad. No se reportaron efectos adversos graves en el estudio, y específicamente no se comunicó ningún episodio de hipercalcemia relacionado con la administración de vitamina D. La toxicidad observada fue de baja frecuencia y de carácter gastrointestinal. Tal como queda reflejado en la tabla 1, cinco pacientes tuvieron que suspender el tratamiento por intolerancia digestiva. Tabla 1. Toxicidades relacionadas con el tratamiento con vitamina D. Toxicidad global (n) VitD1000UI(n) VitD5000 UI(n) Nausea Total Grado 1 Grado 2-3 10 5 5 5 3 2 2 1 7 3 3 4 Diarrea Total Grado 1 Grado 2-3 10 5 5 3 2 1 7 3 4 Toxicidad cardiaca 0 0 0 Toxicidad hepática 0 0 0 Toxicidad neurológica 0 0 0 Laboratorio Hipercalcemia 0 0 0 Se utilizaron los criterios de toxicidad del "National Cancer Institute" (NCI) para ensayos onco-hematológicos identificando grado 0 como ausencia de síntomas, grado 1 o leve como síntomas leves que no precisan intervención; 99 grado 2 o moderado cuando precisan una intervención mínima y/o condicionan alguna limitación de actividad al paciente y, por último, grado 3 o grave cuando requiere hospitalización (limitación del paciente para cuidarse por sí mismo). No se comunicaron fallos de injerto en ninguno de los tres grupos; la mediana de células CD34 infundidas fue de 5,5x106/Kg (rango 1,2- 12,40x106/Kg). La mediana de recuperación de neutrófilos por encima de 0,5 x 109 / L fue de 16 días (rango 10-71 días) y la de plaquetas por encima de 20 x 109 / L de 13,1 días (rango 0-94 días). 2. Enfermedad injerto contra huésped. 2.1. EICH aguda. La incidencia acumulada de EICH aguda global o grado II-IV al día +100 tras el trasplante fue para el grupo control del 57.1% y 43.9% respectivamente, para el grupo de vitamina D de bajas dosis del 59.6% y 44.7% y para el grupo de vitamina D de altas dosis del 57.1% y 51% , sin mostrar diferencias significativas entre los tres grupos tal como se muestra en las figuras 1 y 2 (p=0.71 y p=0.98 respectivamente). Figura 1. Incidencia acumulada de EICH aguda global y grados II-IV 100 Todos los pacientes que presentaron EICH aguda de grado igual o superior a 2 recibieron tratamiento esteroideo sistémico. 2.2. EICH crónica. La incidencia acumulada de EICH crónica tanto global como grado moderado-severo al año del trasplante fue significativamente más baja entre los pacientes incluidos en el grupo de dosis bajas (LdD: 37.5% y19.5%, respectivamente) y dosis altas (HdD 42.4% y 27%, respectivamente) en comparación con aquellos pacientes que no recibieron vitamina D ( grupo control) (67.5% y 44.7%, respectivamente) con p=0.019 y p=0.026 para la EICH global y el grado moderado-severo, respectivamente (figura 2). Figura 2. Incidencia acumulada de EICH crónica global y grado moderado-severo En el análisis multivariante, únicamente el tratamiento con vitamina D influyó significativamente en el riesgo de desarrollar EICH crónica global o moderada-severa (tablas 3 y 4). 101 Tabla 3.Análisis multivariante para la EICH crónica global. HR IC-95%INF IC-95%SUP p-valor Covariante_aGVHD 1,08277545 0,56150216 2,08797539 0,81237196 COHORTES 0,00303523 - Control (Referencia) 1 - Vit-D Bajas Dosis 0,3171506 0,14944507 0,67305333 0,00277813 - Vit-D Altas Dosis 0,36135827 0,17380473 0,75130175 0,00641715 EDAD 1,01919348 0,99024983 1,04898312 0,19587623 Estatus al trasplante (fase avanzada) 1,19093594 0,62176949 2,28111615 0,59822301 Tipo de donante (NO EMPARENTADO) 1,46180201 0,67386552 3,17105574 0,33658714 Fuente de progenitores (MO) 0,78474184 0,22103614 2,78605908 0,70768365 Acondicionamiento no mieloablativo 0,94832249 0,37385898 2,40549404 0,91104012 LMA/ SMD 1,19353571 0,41416715 3,43949902 0,74319748 Profilaxis de EICH 0,92973902 - CsA/MTX 1 - TKR/MTX 1,15005836 0,39950792 3,31065841 0,79550518 - TKR/RAPA 0,82915241 0,32728988 2,10056515 0,69282186 - OTRAS INMUNOPROFILAXIS 0,70922891 0,08315197 6,04923309 0,75340171 HR: hazard ratio; IC: intervalo de confianza Tabla 4.Análisis multivariante para la EICH crónica grado moderado-severo. HR IC-95%INF IC-95%SUP p-valor Covariante_aGVHD 0,80152833 0,37092673 1,73200692 0,57360088 COHORTES 0,00313406 - Control (Referencia) 1 - Vit-D Bajas Dosis 0,22124595 0,08500154 0,57586919 0,00199695 - Vit-D Altas Dosis 0,33723546 0,1427857 0,79649259 0,01318 EDAD 1,02303922 0,98517314 1,06236073 0,2365356 Estatus al trasplante (fase avanzada) 1,12315953 0,52232895 2,41512047 0,76621003 Tipo de donante (NO EMPARENTADO) 2,74053435 1,12563796 6,67224168 0,02637449 Fuente de progenitores (MO) 0,29214057 0,03454501 2,47057741 0,25862294 Acondicionamiento no mieloablativo 0,73354789 0,23194333 2,31993092 0,59787311 LMA/ SMD 1,90648354 0,86192059 4,21695399 0,11113756 Profilaxis de EICH 0,99185326 - CsA/MTX 1 - TKR/MTX 1,11630973 0,33993943 3,66579256 0,85607732 - TKR/RAPA 0,91266137 0,30687459 2,71430357 0,86946103 - OTRAS INMUNOPROFILAXIS 0,93605742 0,10492271 8,35094232 0,95280919 HR: hazard ratio; IC: intervalo de confianza 3. Recaída, mortalidad no relacionada con la recaída y supervivencia global. La incidencia acumulada de recaída a un año de seguimiento tras el trasplante fue 15.4% en el GC, 31.1% en el LdD y 18.1% en HdD, (p=0.1). Del 102 mismo modo, tampoco hubo diferencias significativas en la incidencia acumulada de mortalidad no relacionada con la recaída al año de trasplante, siendo del 17.9%, 15.6% y 19.2% para el grupo control, LdD y HdD, respectivamente (p=0.8) (figura 3). Figura 3. Incidencia acumulada de recaída y mortalidad no relacionada con la recaída a un año de seguimiento Las causas de fallecimiento estuvieron mayoritariamente relacionadas con la recaída en los grupos control y de vitamina D a dosis bajas, mientras que en el grupo de vitamina D a dosis altas la EICH con o sin infección asociada fue la principal causa de muerte (tabla 5). Tabla 5: Causas de éxitus en los grupos de estudio. GC (n) LdD(n) HdD(n) Infección 4 4 3 EICH+/- Infección 3 4 7 Recaída 4 9 1 Causa neurológica 1 2 0 FMO 0 0 1 FMO: Fracaso multiorgánico. 103 En cuanto al impacto de la vitamina D sobre la supervivencia libre de evento (SLE) y supervivencia global (SG), no se registraron diferencias entre los tres grupos (p=0.38 y p=0.24 respectivamente). En este sentido, con una mediana de seguimiento de 2 años, la SLE y la SG fue del 57% y 71%, 42% y 50% y 45% y 55% para CG, LdD and HdD, respectivamente (figura 4). Figura 4. Kaplan-Meier de supervivencia libre de evento y supervivencia global. 4. Infección por CMV. Dado que los episodios de infecciones bacterianas y fúngicas no se registraron con suficiente precisión en los diferentes centros y en muchos casos estaban condicionados por el historial previo de infecciones de los pacientes, centramos el estudio en el análisis de la tasa de infección por CMV. Dispusimos de información sobre el 88% de los enfermos incluidos en el ensayo, es decir, sobre 130 pacientes, 44 pertenecientes al grupo control (33%), 45 del grupo de vitamina D a bajas dosis (34,6%) y 41 del grupo de vitamina D a dosis altas (31,5%). La tasa de infección por CMV en los diferentes grupos fue la siguiente: 40,9% en el grupo control, 28,8% en el grupo de vitamina D a dosis bajas, 24,3% en el grupo de vitamina D a dosis altas 104 (figura 10), sin diferencia estadísticamente significativa. Once pacientes desarrollaron enfermedad por CMV (26% del total de los infectados), sin diferencias significativas entre los grupos. La incidencia acumulada de infección por CMV se muestra en la figura 5. Figura 5. Incidencia acumulada de infección por CMV. 5. Estudios de inmunofenotipo 5.1. Células dendríticas en sangre periférica. En la tabla 6 se resumen los porcentajes y números absolutos de los diferentes subtipos de CDs en sangre periférica, tanto en las tres cohortes de pacientes como en un grupo control de individuos sanos. Tal como queda reflejado, no existen diferencias entre los tres grupos de pacientes sometidos trasplante independientemente de que reciban o no vitamina D, aunque sí se registraron diferencias significativas con los controles sanos, siendo el numero de CDs > # cuminc of CMV inf: > outinc(y,1) group 1 control cuminc(%) Lower Upper 0 0.0 NaN NaN 100 35.9 23.4 54.9 200 35.9 23.4 54.9 300 38.4 25.7 57.5 365 38.4 25.7 57.5 730 38.4 25.7 57.5 1095 38.4 25.7 57.5 group 2 Bajas dosis cuminc(%) Lower Upper 0 0.0 NaN NaN 100 15.0 7.1 31.7 200 17.5 8.8 34.6 300 20.0 10.7 37.5 365 20.0 10.7 37.5 730 20.0 10.7 37.5 1095 NA NA NA group 3 altas dosis cuminc(%) Lower Upper 0 3.1 0.4 22.2 100 6.2 1.6 24.5 200 9.5 3.2 28.5 300 9.5 3.2 28.5 365 9.5 3.2 28.5 730 NA NA NA 1095 NA NA NA 105 plasmocitoides y mieloides BDCA1+ significativamente más bajo en los pacientes en los días +56 y +100 postrasplante (Figura 6). Tabla 6. Medias y error estándar de las poblaciones de CDs Media+/-SEM SANOS CONTROL DOSIS BAJAS DOSIS ALTAS %Plasmocitoides 0,19+/-0,05 Dia +21 0,19+/-0,02 0,64+/-0,11 0,15+/-0,04 Dia +56 0,05+/-0,02# 0,05+/-0,03# 0,02+/-0,01# Día +100 0,04+/-0,02# 0,03+/-0,01# 0,02+/-0,01# NºPlasmocitoide 11,28+/- 2,91 Dia +21 7,69+/-2,26 9.94+/-3.59 5.27+/-1.21 Dia +56 1,31+/-0.43# 1.56+/-0.61# 0.86+/-0.38# Día +100 0.92+/-0.50# 1.31+/-0.46# 1.08+/-0.34# %BDCA1 0.19+/-0.06 Dia +21 0,13+/-0,03 0,26+/-0,10 0,16+/-0,05 Dia +56 0,05+/-0,02 0,08+/-0,02 0,05+/-0,02# Día +100 0,05+/-0,02 0,07+/-0,02# 0,06+/-0,02# NºBDCA1 10.91+/-3.13 Dia +21 5,33+/-1,80 9,52+/-3,25 5,97+/-1,97 Dia +56 1,33+/-0,56# 3,21+/-0,76# 2,04+/-0,63# Día +100 1,92+/-0,80# 4,08+/-1,83# 2,73+/-0,82# %Monocitoides 0.88+/-0.16 Dia +21 1,10+/-0,26 1,39+/-0,46 1,99+/-0,75 Dia +56 1,47+/-0,97 0,48+/-0,16 0,66+/-0,27 Día +100 0,75+/-0,44 0,51+/-0,17 0,78+/-0,28 NºMonocitoides 50.03+/-6.68 Dia +21 44,54+/-14,34 63,60+/-22,25 72,43+/-25,17 Dia +56 31,16+/-17,74 21,91+/-7,13 33,78+/-13,17 Día +100 20,47+/-7,78 37,35+/-14,41 34,29+/-11,68 SEM: error estándar de la media #Diferencias significativas entre sanos y grupos de tratamiento (p<0.05). Figura 6. Nº de células dendríticas plasmocitoides y mieloides BDCA1+ 112 Tabla 11. Porcentaje y número de linfocitos T reguladores Media (SEM) SANOS CG LdD HdD Treg Dia +21 Dia +56 Día +100 0,07(0,02) 0,43(0,10) #* 0,17(0,03) * 0,28(0,11) * 0,05(0,01) * 0,09(0,05) *+ 0,03(0,01)*+ 0,026(0,08) 0,14(0,03) + 0,13(0,02) + Treg Absoluto Dia +21 Dia +56 Día +100 4.05(1,16) 17,55(6,58) * 7,96(1,62) * 14,79(5,20) * 2,37(0,97) *+ 2,97(0,90) *+ 3,34(1,18) * 9,71(2,30) + 7,94(2,49) + 7,12(1,46) #diferencias significativas entre grupos de tratamiento y cohorte sana (p<0.05) *diferencias significativasentre GC y LdD (p<0.05) ♦diferencias significativas entre CG yHdD(p<0.05) +diferencias significativas entre LdDy HdD (p<0.05) 5.2.4. Células NK No se observaron diferencias en los porcentajes ni en las cifras absolutas de células NK entre los tres grupos de tratamiento ni con respecto a los sujetos sanos. Sin embargo, se apreciaron diferencias entre los sujetos sanos y los tres grupos de pacientes en los que se refiere a las subpoblaciones de células NK CD56+ “bright” y “weak”, tal como se representa en la tabla 12; en este sentido, observamos un mayor porcentaje de células CD56 “bright” en los tres grupos de pacientes con respecto a los sujetos sanos. Tabla 12. Subpoblaciones de células NK Media (SEM) SANOS CG LdD HdD Células NK Día +21 Día +56 Día +100 6.36(1,89) 4,76(0,74) 4,16(0,86) 4,25(0,56) 6,92(1,14) 4,14(0,83) 3,10(0,86) 6,98(1,02) 3,38(0,94) 3,72(0,68) Células NK Absoluto Día +21 Día +56 Día +100 378.28(112,41) 220,27(36,95) 178,99(29,79) 232,19(48,60) 273,48(43,34) 208,89(40,69) 212,17(53,55) 273,17(36,19) 170,20(49,35) 187,60(38,37) Bright Día +21 Día +56 Día +100 5.35(1,23) 24,87(2,47) # 21,60(2,63) # 22,67(2,61) # 33,85(6,35) # 17,36(3,79) 20,13(3,31) # 21,04(2,21) # 19,49(3,70) 21,67(3,55) # Weak Día +21 Día +56 Día +100 94.65(1,23) 75,13(2,47) # 78,40(2,63) # 77,32(2,61) # 66,15(6,35) # 82,51(3,78) 79,83(3,32) # 78,83(2,21) # 80,51(3,70) 78,33(3,55) # #diferencias significativas entre grupos de tratamiento y cohorte sana (p<0.05) *diferencias significativasentre GC y LdD (p<0.05) ♦diferencias significativas entre CG yHdD(p<0.05) +diferencias significativas entre LdDy HdD (p<0.05) 113 6. Activación linfocitaria Centrando el análisis en la expresión de CD40L, se encontraron niveles disminuidos de CD40L en los grupos de vitamina D con respecto al control en el día +100 (Figura 12). También se encontraron diferencias en este marcador entre los sujetos sanos y las diferentes cohortes de tratamientoen los días +21, +56 y +100 postrasplante, con disminución del nivel de expresión tal como queda reflejado en la tabla 13. En lo que se refiere a la expresión intracelular de interferón, no se observaron diferencias entre los tres grupos, aunque cuando comparábamos las cohortes de pacientes con los sujetos sanos los niveles de IFN estaban significativamente aumentados en el día +100 postrasplante (tabla 13). Figura 12. IFN y CD40L intracitoplasmático Tabla 13. Niveles de IFN y CD40L intracitoplasmático Media (SEM) SANOS CG LdD HdD IFN Día +21 Día +56 Día +100 29.32(2,49) 29,70(4,19) 33,66(6,16) 49,59(4,21) # 34,13(4,62) 43,28(6,83) 53,47(6,49) # 30,00(5,19) 40,12(5,62) 45,54(3,93) CD40L Día +21 Día +56 Día +100 62.55(3,77) 33,14(6,57) # 38,85(5,47) # 49,09(2,13) #*♦ 32,33(7,32) 25,98(6,41) # 24,46(4,53) #*+ 31,42(5,24) # 35,36(3,77) # 39,58(3,67) #♦+ #diferencias significativas entre grupos de tratamiento y cohorte sana (p<0.05) *diferencias significativasentre GC y LdD (p<0.05) ♦diferencias significativas entre CG yHdD(p<0.05) +diferencias significativas entre LdDy HdD (p<0.05) 114 6. Citocinas en suero. Con respecto a las citocinas en suero, los valores fueron similares en los distintos grupos de tratamiento y en los controles sanos, salvo IFNγ que presentó niveles más elevados en el grupo control (media 18,9) en el día +14 frente a los otros dos grupos, sin diferencias significativas entre los dos grupos de tratamiento (media LDvitD 8,4 y media HDvitD 7,7) (figura 13). Además, todos los pacientes incrementaban significativamente IL6 en los primeros 14 días del trasplante. Figura 13. Citocinas en suero. 8. Niveles de vitamina D. Respecto a los niveles plasmáticas de la 25-hidroxi-vitaminaD (tabla 14), es relevante señalar que antes de la administración de vitamina D en el día -5, los tres grupos presentaban niveles por debajo del límite inferior de la normalidad (rango nivel normal: 50-250 nmol/L). En cambio, los niveles plasmáticos de 25-hidroxivitamina D fueron significativamente superiores en los pacientes incluidos en HdD desde el día +7 postrasplante mientras que para el 115 grupo LdD se apreció un incremento en el límite de la significación estadística únicamente en el día +21. (Figura 14). Tabla 14. Niveles plasmáticos de 25-hidroxivitamina D Media+/-ESM (ng/ml) CONTROL LdD HdD Día -5 44,8+/-4,7 41,9+/-4,9 44,3+/-3,5 Día +1 46,7+/-5,8 39,1+/-4,2 46,6+/-2,5 Día +7 44 +/-5,2 37,2+/-4 50,4+/-2,8 Día +14 45,6+/-3,9 39,6+/-3,9 56,8+/-2,6 Día +21 47,3+/-5,5 53,9+/-6,1 71,3+/-4,8 Figura 14. Niveles plasmáticos de 25-hidroxivitamina D 116 9. Análisis según desarrollo de EICH agudo Dado el diseño del estudio y los momentos en los que se extrajeron las muestras biológicas, pudimos evaluar las variables biológicas en nuestros pacientes en función de la presencia o no de enfermedad injerto contra huésped aguda. En total 30 pacientes desarrollaron EICH aguda y 15 no la presentaron. No encontramos diferencia en los niveles de vitamina D en plasma en los pacientes hubieran o no desarrollado EICH aguda tal como se refleja en la figura 15. Figura 15. Niveles plasmáticos de vitamina D 117 Respecto a las CDs destaca que los pacientes que desarrollaron EICH aguda presentaron menor porcentaje y número absoluto de células dendríticas monocitoides en los tres momentos estudiados (+21, +56 y +100) (p<0.05). En el caso de las CDs plasmocitoides se observaron diferencias en el porcentaje en el día +56 y +100 y en número exclusivamente en el día +56. Las CDs BDCA1 no mostraban diferencias en número, con menor porcentaje en el +56 (Figura 16). Figura 16. Subpoblaciones de células dendríticas. No se No se No se encontraron diferencias en los leucocitos, linfocitos T, subpoblaciones CD4+ y CD8+, Treg, células NK ni subpoblaciones NK “bright/weak” entre los pacientes que desarrollaron EICH aguda frente a los que no, tal como se muestra en la tabla 14. 118 Aunque tampoco hubo diferencias en el porcentaje de CD4+ ni CD8+ si en el cociente CD4/CD8, siendo menor en los pacientes con EICH aguda en los días +56 (p=0,052) y +100 (p=0,025) (figura 17). Figura 17. Ratio CD4/CD8 según la presencia de EICH aguda Además, los pacientes que desarrollaron EICH aguda presentaron menor porcentaje y número de linfocitos B en el día +100 (p=0,016). (figura 18) Figura 18. Porcentaje y número de linfocitos B 119 En relación a la razón de linfocitos CD4 y CD8 naive/efectores/memoria únicamente se objetivaron diferencias en los linfocitos CD4 efectores siendo más altos en los pacientes que desarrollaron EICH aguda en el día +56 (p=0,05) y en el día +100 (p=0,042) (figura 19). Figura 19. Linfocitos CD4+ efectores CD45RA+CCR7- Con respecto a los parámetros de activación de linfocitos T, destaca fundamentalmente que en el día +100 se observaba mayor IFN intracitoplamático en los pacientes con EICH aguda (p=0.008). Además éstos presentaron menor expresión de CD40L en el día +21 (p=0.039)(figura 20). Figura 20. Activación linfocitaria. 120 Tabla 14. Número absoluto de poblaciones (*diferencias significativas p<0,05) Poblaciones EICH Media(ESM) Día +21 Media(ESM) Día +56 Media(ESM) Día +100 Leucocitos NO 4.473,33(639,79) 4.311,43(620,48) 6.672,31(1.125,7) SI 5.175,17(719,76) 5.387,33(431,63) 5.715,00(818,28) Linfocitos NO 821,68(170,75) 1.033,87(185,96) 1.399,99(336,57) SI 1.021,46(124,63) 945,58(214,00) 1.217,45(222,14) Linfocitos T NO 572,40(142,66) 719,97(150,12) 1.051,64(277,25) SI 760,54(107,95) 817,04(205,97) 1.045,85(208,94) CD4+ NO 260,52(46,70) 291,95(51,58) 418,25(97,21) SI 336,63(53,78) 241,78(39,81) 362,04(60,18) CD8+ NO 233,18(78,81) 333,22(100,30) 539,39(181,60) SI 347,67(62,10) 512,97(169,14) 591,29(144,34) CD4-CD8- NO 70,58(37,67) 86,42(39,89) 84,17(23,23) SI 65,94(13,82) 36,98(7,62) 51,82(11,20) CD4+CD8+ NO 7,99(1,79) 8,35(1,92) 9,85(1,97) SI 6,56(1,00) 9,00(2,83) 9,49(3,32) Cels NK NO 260,72(43,33) 280,17(45,91) 288,64(62,50) SI 243,23(26,25) 137,44(20,36) 176,87(25,46) CD56++ NO 27,45(2,80) 23,97(2,77) 25,46(2,77) SI 24,91(2,76) 18,14(2,35) 20,00(2,21) CD56+ NO 72,55(2,80) 75,98(2,76) 74,54(2,77) SI 75,09(2,76) 81,83(2,35) 79,99(2,21) Linfocitos B NO 6,93(1,79) 32,58(10,56) 59,73(17,29)* SI 10,30(4,24) 21,10(4,95) 35,04(12,37)* Treg NO SI 7,31(1,27) 13,83(4,76) 9,46(2,65) 5,36(0,98) 11,19(2,87) 9,02(3,44) 121 Discusión 128 justificarse por el efecto sinérgico entre esteroides y vitamina D. Ya Jirapongsananuruk y colaboradores demuestran en un estudio sobre muestras de 16 sujetos sanos como el empleo de dexametasona junto con 1,25 (OH)2 D3 intensifica el efecto inmunosupresor de los corticoides vía Th1 bloqueando el efecto inhibitorio de la vía Th2 que queda de esta forma liberada42. En una revisión publicada en el año 2014 sobre vitamina D y hormonas esteroideas, Cutolo y colaboradores corroboran estos resultados43. Todo ello viene a confirmar nuestra hipótesis de trabajo y completan estudios exploratorios retrospectivos como los llevados a cabo por Glotzbecker y colaboradores que, sobre una serie de 53 pacientes, comprobaron que aquéllos con bajos niveles de vitamina D, en su caso inferiores a 25 nM/mL, presentaban mayor riesgo de desarrollar EICH crónica1. Recientemente, Von Bahr y colaboradores han comunicado también, sobre una serie de 166 pacientes, que los niveles vitamina D inferiores a 42 nmol/mL también se asocian a mayor riesgo de padecer EICH crónica24. Ya Silva y colaboradores sugirieron el potencial efecto beneficioso de la vitamina D en un grupo de 12 pacientes que recibieron vitamina D a dosis de 1000 UI más carbonato cálcico como tratamiento de la osteopenia tras el trasplante, objetivándose una mejoría de la EICH crónica sin efectos secundarios valorables44. En nuestro estudio la administración de 1000 UI o 5000 UI diarias de vitamina D en los primeros 100 días postrasplante disminuye el riesgo de desarrollar EICH crónica sin afectar el de EICH aguda, lo que pone de manifiesto la diferencia fisiopatológica entre ambas entidades. En la primera, existe un potente componente inflamatorio mientras que en la segunda predominan los fenómenos autoinmunes y la fibrosis. Se describe que en la EICH aguda predomina la respuesta Th1/Th17, mientras que en la EICH crónica la vía Th2 es preponderante, si bien hay controversia sobre esta cuestión. Tal como sugiere Toubai en su revisión sobre la fisiopatología de la EICH45, el paradigma Th1/Th2 de las células T del donante en las formas aguda y crónica ha evolucionado. Datos experimentales muestran que cantidades adecuadas y fisiológicas de citoquinas Th1 son críticas para la inducción de la EICH, mientras que una producción alterada (baja o alta) podría inhibirla. Igualmente, la polarización Th2 en algunos modelos reduce la EICH 129 mientras que en otros estudios no puede probarse beneficio alguno. En lo que se refiere a la EICH crónica, un estudio reciente de Hayashida y colaboradores sobre biopsias de mucosa oral y de glándulas salivares de 16 pacientes con EICH crónica46, sugiere que la EICH crónica podría iniciarse y mantenerse por células Th1, progresando posteriormente con la acumulación de células Th2 a través de la interacción con quimoquinas y receptores de quimoquinas. La subpoblación Th17 parece jugar también un papel importante en la EICH crónica, tal como muestra el trabajo de Nishimori de 2011 sobre un modelo de EICH crónica de ratón47. En 2014, Brüggen y colaboradores ponen también énfasis en los diferentes mecanismos que separan la EICH aguda de la EICH crónica a partir de su estudio sobre biopsias cutáneas en pacientes con EICH, mostrando una predominancia de citoquinas Th2 y un incremento en la producción de IL-22 por células T CD4 en pacientes con EICH aguda y un patrón Th1/Th17 en la EICH crónica, con elevadas cantidades de interferón gamma y de IL-17 producidas por células CD848. Debe destacarse también el papel crucial que la alteración de la función tímica juega en el desarrollo de la EICH . Mediante el proceso de selección negativa, en condiciones fisiológicas, las células autorreactivas son eliminadas, generando lo que se denomina "tolerancia central" mediante un proceso de delección clonal en el que intervienen células dendríticas tímicas. La selección positiva se lleva a cabo mediante el epitelio cortical tímico. En la EICH aguda, las células T maduras del donante se expanden de un modo independiente del timo y son responsables del inicio de la enfermedad. Sin embargo, en una fase más tardía, los linfocitos T generados de novo a partir de las células madres del donante, deberían sufrir el proceso fisiológico de selección negativa en el timo. Sin embargo, la selección negativa está alterada en pacientes con EICH crónica, como mostraron Sakoda y colaboradores, favoreciendo la emergencia de clones T autorreactivos que causan EICH crónica incluso en presencia de células T reguladoras49. Recuperación inmune postrasplante y EICH aguda. Además, en el presente estudio pudimos constatar algunas diferencias llamativas en la recuperación de la respuesta inmune postrasplante en función 130 del desarrollo de EICH o no. Así, las células dendríticas plasmacitoides estaban disminuidas en sangre periférica en pacientes con EICH aguda en el día +56 en comparación con aquellos que no desarrollaron EICH aguda. Del mismo modo, las células dendríticas monocitoides también estaban disminuidas en los pacientes que desarrollaron EICH en los días +21, +56 y +100. Tal como hemos mencionado anteriormente, las células dendríticas plasmacitoides están relacionadas con la tolerancia. Podría ser coherente, por tanto, que se objetivara un menor número de las mismas en paciente con EICH aguda. Recientemente, Peric y colaboradores, en una serie de 79 pacientes, describen un descenso en la cifra de células dendríticas en el día +100 con una peor supervivencia y un mayor riesgo de EICH aguda severa50. En cuanto a las poblaciones linfocitarias T, encontramos en nuestro estudio una ratio CD4/CD8 significativamente descendida en los pacientes con EICH aguda en los días +56 y +100. Estos resultados son difíciles de interpretar teniendo en cuenta que son pacientes que reciben tratamiento esteroideo, lo que podría influir en dicha ratio. Más concordante con lo descrito en la literatura es el hallazgo de un incremento en los linfocitos CD4 efectores vírgenes (CD45RA+CCR7-) en los enfermos con EICH aguda en los días +56 y +100 postrasplante. En 2014, Podgorny y colaboradores realizaron un análisis sobre subpoblaciones celulares en 216 pacientes sometidos a TPH alogénico llegando a esta misma conclusión aunque también demostraron un incremento en las poblaciones CD4 y CD8 de memoria que comienzan a disminuir conforme nos acercamos al día +100 51. La molécula CD45, una fosfatasatirosina que regula la señalización a través del receptor de antígenos y el receptor de ciertas citocinas, se diferencia entre las células T vírgenes y memoria por su forma más que por su nivel de expresión. Existen múltiples isoformas identificadas que se gegeneran por un procesamiento diferencial o "splicing" de tres exones extracelulares (A, B y C). Las células T vírgenes expresan las isoformas con los más altos pesos moleculares (comúnmemente referidas como CD45RA en humanos). Durante el curso de la activación, los linfocitos T cambian la expresión de CD45 a bajos pesos moleculares (definido como CD45RO). Ya en el año 2004, Xystrakis y colaboradores demostraron en un modelo animal que sólo las poblaciones CD4 CD45RA efectoras eran 131 capaces de generar aloestimulación tras el trasplante 52. Este incremento de linfocitos CD4 efectores vírgenes que observamos en periodos más tardíos con respecto a la infusión en pacientes con EICH aguda resulta difícil de interpretar teniendo en cuenta que la nueva linfopoyesis tímica procedente del donante se origina a partir de los tres meses del trasplante y pone de manifiesto que probablemente esta población efectora proceda de la proliferación de las linfocitos T del donante vírgenes inicialmente infundidos. Otra posible explicación sería reversión del fenotipo de memoria a vírgen ante la persistencia del antígeno 53, considerando que en nuestro caso este antígeno podría estar representado por los péptidos pertenecientes al sistema menor de histocompatibilidad . Los linfocitos B se encuentran descendidos en nuestro estudio en el día +100 en los pacientes con EICH aguda. Tal como describen Sánchez-García y colaboradores en su análisis de la linfopoyesis normal y patológica a partir de muestras de 39 pacientes con leucemia aguda linfoblástica B sometidos a aloTPH, la EICH aguda se asocia con una marcada inhibición de los precursores normales pro-B y pre-B en los días +30 y +60 54. Aunque no puede descartarse que esto sea debido al propio tratamiento de la EICH, las células T del donante pueden contribuir a esta inmunodeficiencia B mediante citotoxicidad mediada a través del ligando Fas o mediante liberación de citoquinas tales como interferón-gamma, que inhibe la linfopoyesis B. Este descenso de linfocitos B probablemente sea más que una causa una consecuencia de la enfermedad injerto contra huésped ya que las células B juegan un papel fundamental en las respuestas fisiológicas inmunes y, en el contexto del trasplante, tras la activación del receptor BCR y de moléculas coestimulatorias como CD40, los linfocitos B constituyen potentes células presentadoras de antígenos, que estimulan a las poblaciones de linfocitos T CD4 y CD8. Por otro lado, algunas subpoblaciones B pueden ejercer funciones inmunomoduladoras, manteniendo la tolerancia periférica CD4 y CD8 mediante mecanismos como la delección, inducción de anergia y supresión mediada por citoquinas tal como se ha demostrado en algunos trabajos55-57. En cuanto a las células NK, existe un descenso de las mismas en el día +56 en los pacientes con EICH aguda. Este dato es concordante con lo publicado en la 132 literatura; Yim y colaboradores, en un estudio publicado en 2013 sobre 59 pacientes pediátricos sometidos a TPH alogénico58, demostraron que la EICH aguda retrasaba la reconstitución de las células NK, siendo este dato corroborado en 2014 por Kheav especialmente en la población CD56 débil59 . Las células NK constituyen la primera población linfocitaria que se reconstituye después del TPH alogénico, con una primera expansión de la subpoblación CD56 brillante productora de citoquinas, seguida de la proliferación de una subpoblación intermedia CD56 brillante CD16 débil para pasar al desarrollo de la subpoblación dominante CD56 débil caracterizada por su mayor actividad citotóxica. El descenso que objetivamos de la población global en pacientes con EICH aguda podría también estar relacionado con el tratamiento esteroideo o ser una consecuencia de la EICH. La expresión de algunos ligandos de las células NK como NKG2 importantes para la respuesta antitumorales y antivirales de estas células así como para la activación de las mismas y que contribuyen al aloreconocimiento se inhiben tras la exposición a determinadas citoquinas como las liberadas durante la EICH aguda y esto podría contribuir al bloqueo de esta población 60, 61. Todo ello podría perpetuar la EICH ya que las células NK disminuyen la activación de los linfocitos T por las células presentadoras de antígenos destruyendo directamente estas células. Resulta más probable que la disminución de la expresión de CD40L que observamos en los linfocitos T de nuestros pacientes esté más relacionada con el tratamiento de estos enfermos que con los mecanimso de regulación de esta molécula 62. 133 Conclusiones 134 1.- La administración de vitamina D a dosis de 1000 UI y 5000 UI en pacientes sometidos a aloTPH es segura y permite incrementar sus niveles en sangre a partir de los 21días postrasplante. 2.- La administración de vitamina D postrasplante disminuye el riesgo de EICH crónica así como la severidad de la misma, aunque no presenta impacto sobre la forma aguda de la enfermedad. El efecto observado con la dosis de 1000 UI diarias es similar al que se objetiva con la de 5000 UI. 3.- Nuestros datos biológicos, aunque limitados, nos hacen suponer que este efecto se deba a una estimulación Th2 inicial y a una supresión Th1 más tardía. Las modificaciones que se observan en los grupos que recibe vitamina D frente al que no la recibe se resumirían del siguiente modo: disminución de infocitos B circulantes, reducción de linfocitos T CD4 y CD8 "naive" e incremento de efectores memoria, disminución de la expresión de CD40 L en linfocitos activados, y descenso de los niveles de IFN. 4.-Los pacientes en tratamiento con vitamina D tienen un menor riesgo de infección por CMV, con una tasa de infección del 28,8% y 24,3% en los pacientes que recibieron vitamina D 1000 UI y 5000 UI respectivamente, aunque las diferencias no fueron estadísticamente significativas. 5.- .-Los pacientes en tratamiento con vitamina D tienen un menor riesgo de infección por CMV, con una tasa de infección del 28,8% y 24,3% en los pacientes que recibieron vitamina D 1000 UI y 5000 UI respectivamente frente al 40% del grupo control, aunque las diferencias no fueron estadísticamente significativas. 6.-El subanálisis de los datos biológicos de los pacientes con EICH aguda es coherente con los datos publicados y confirma hallazgos recientes sobre la fisiopatología de esta enfermedad como el valor de los recuentos de células dendríticas en sangre periférica como parámetro predictivo, aunque se requieren estudios más amplios para profundizar en este aspecto. 135 Bibliografía 136 1. 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