Estudio de los mecanismos fisiopatológicos de la ruta sináptica de Neurexinas y Neuroliguinas en la enfermedad de Alzheimer

TESIS DOCTORAL Estudio de los mecanismos fisiopatológicos de la ruta sináptica de Neurexinas y Neuroliguinas en la enfermedad de Alzheimer Francisco Arias Aragón Directores de Tesis: Francisco Gómez Scholl, Amalia Martínez Mir Departamento de Fisiología Médica y Biofísica Universidad de Sevilla Sevilla, 2023 Memoria presentada por Francisco Arias Aragón para optar al grado de Doctor por la Universidad de Sevilla. El presente trabajo de investigación ha sido realizado en el Instituto de Biomedicina de Sevilla (IBiS), bajo la dirección del Doctor Francisco Gómez Scholl y la Doctora Amalia Martínez Mir. Francisco Arias Aragón ha recibido financiación del Ministerio de Economía y Competitividad, con un Contrato Predoctoral de Personal Investigador en Formación. El proyecto de investigación ha recibido financiación del Ministerio de Economía y Competitividad (BES-2016-076579). DEPARTAMENTO DE FISIOLOGÍA MÉDICA Y BIOFÍSICA UNIVERSIDAD DE SEVILLA Dr. Francisco Gómez Scholl, Profesor Titular de Universidad, adscrito al Departamento de Fisiología Médica y Biofísica de la Universidad de Sevilla CERTIFICA: Que Don Francisco Arias Aragón ha realizado bajo su dirección el trabajo titulado “Estudio de los mecanismos fisiopatológicos de la ruta sináptica de Neurexinas y Neuroliguinas en la enfermedad de Alzheimer” que presenta para optar al grado de doctor por la Universidad de Sevilla. Fdo.: Francisco Gómez Scholl Sevilla, 2023 Resumen La enfermedad de Alzheimer (AD) es una enfermedad neurodegenerativa asociada con el envejecimiento caracterizada por un deterioro progresivo de la memoria. La pérdida de la función sináptica es un factor temprano que correlaciona con la progresión de la enfermedad, indicando que alteraciones en la función sináptica contribuyen a los mecanismos patogénicos en AD. Las Neurexinas (Nrxns) son proteínas de membrana localizadas en el terminal presináptico con un papel esencial en la función, mantenimiento y regulación de las sinapsis mediante su adhesión con ligandos postsinápticos, como Neuroliguinas (Nlgns). En los últimos años, nuestro grupo de investigación ha obtenido datos que ponen de manifiesto una disfunción del complejo de Nrxns-Nlgns en AD. Mutaciones de pérdida de función en los genes de Presenilina 1 (PSEN1) y Presenilina 2 (PSEN2) son la causa mayoritaria de los casos de AD familiar (FAD). Las Presenilinas (PS) forman el componente catalítico del complejo γ-secretasa, que interviene en el procesamiento proteolítico de numerosos sustratos. Hemos demostrado previamente que mutaciones en PSEN1 asociadas a FAD y la inhibición de la actividad del complejo PS/γ-secretasa produce el acúmulo del fragmento C-terminal no procesado de Nrxns (NrxnCTF) in vivo e in vitro. En modelos animales con pérdida de función de PS en el cerebro adulto, NrxnCTF se acumula en los terminales presinápticos, coincidiendo con la aparición de defectos tempranos en la plasticidad presináptica y de memoria. Además, el acúmulo selectivo de NrxnCTF en neuronas en cultivo y en el cerebro adulto de ratones transgénicos produce defectos en la liberación de neurotransmisor y de memoria que se asemejan a los defectos ocasionados por una falta de función de PS. Por otro lado, en el grupo se identificó por primera vez una mutación en un gen de Nlgns en un caso de AD, la mutación truncante NLGN1 Thr271fs. Con el fin de profundizar en los efectos in vivo causados por la alteración del sistema de Nrxns-Nlgns en AD, en esta Tesis Doctoral se ha abordado el estudio de las interacciones entre isoformas de Nrxns y Nlgns en las sinapsis, se han generado y analizado ratones con control temporal de pérdida de función de PS durante el envejecimiento y ratones con una acumulación incrementada de NrxnCTF en un contexto de pérdida de función de PS. Por último, se ha realizado la caracterización bioquímica y comportamental del modelo animal que reproduce la mutación Nlgn1 Thr271fs asociada a AD y se ha desarrollado un modelo animal para el estudio de los efectos de la interacción de Nlgn1 con APP. En conjunto, los resultados obtenidos en esta Tesis Doctoral apoyan un papel del sistema de adhesión trans-sináptico formado por Nrxns y Nlgn1 en las alteraciones sinápticas y de memoria en AD. I. Introducción -------------------------------------------------------------------------------------- 10 1 Sistema de adhesión sináptico de Neurexinas y Neuroliguinas ------------------------------ 1 1.1 Organización general de la sinapsis ---------------------------------------------------------------------------- 1 1.2 Neurexinas ------------------------------------------------------------------------------------------------------------ 2 1.3 Neuroliguinas -------------------------------------------------------------------------------------------------------- 4 1.4 Interacción diferencial entre isoformas de Neurexinas y Neuroliguinas ----------------------------- 5 2 La enfermedad de Alzheimer -------------------------------------------------------------------------- 7 2.1 Antecedentes de la enfermedad de Alzheimer ------------------------------------------------------------- 7 2.2 Rasgos fisiopatológicos de la enfermedad de Alzheimer ------------------------------------------------- 8 2.3 Clasificación de la enfermedad de Alzheimer --------------------------------------------------------------- 8 3 Presenilinas ------------------------------------------------------------------------------------------------- 9 3.1 Presenilinas en la enfermedad de Alzheimer -------------------------------------------------------------- 10 3.2 Funciones biológicas de Presenilinas ------------------------------------------------------------------------ 12 3.2.1 Funciones de Presenilinas dependientes de actividad γ-secretasa -------------------------- 12 3.3 Sustratos de Presenilinas --------------------------------------------------------------------------------------- 13 4 Antecedentes I: Neurexinas como sustratos de Presenilinas, mediadores de defectos presinápticos y de memoria --------------------------------------------------------------------------------- 16 5 Antecedentes II: Papel de Neuroliguina 1 en enfermedad de Alzheimer ---------------- 23 5.1 Identificación de una mutación truncante en NLGN1 en un caso de Alzheimer familiar y generación de un ratón knockin -------------------------------------------------------------------------------------- 23 5.2 Interacción de APP y Nlng1 ------------------------------------------------------------------------------------- 24 II. Objetivos------------------------------------------------------------------------------------------- 26 III. Materiales y métodos -------------------------------------------------------------------------- 28 1 Cultivos celulares ---------------------------------------------------------------------------------------- 29 1.1 Células HEK 293T -------------------------------------------------------------------------------------------------- 29 1.1.1 Mantenimiento de la línea celular HEK 293T. ----------------------------------------------------- 29 1.1.2 Transfección de células HEK 293T -------------------------------------------------------------------- 29 1.1.3 Producción de partículas lentivirales ---------------------------------------------------------------- 30 1.2 Cultivo primario de neuronas hipocampales de rata. --------------------------------------------------- 31 1.2.1 Transfección de cultivos neuronales ----------------------------------------------------------------- 31 1.2.2 Infección de cultivos neuronales ---------------------------------------------------------------------- 32 1.2.3 Co-Cultivo de células HEK 293T con neuronas corticales--------------------------------------- 32 1.3 Inmunofluorescencia en células en cultivo ---------------------------------------------------------------- 32 2 Generación de vectores de expresión y etiquetado con Flag de distintas isoformas de Neurexinas ------------------------------------------------------------------------------------------------------- 33 2.1 Etiquetado con Flag en vectores de expresión pCAG --------------------------------------------------- 33 2.2 Generación de isoformas de Nrxn en vectores lentivirales de transferencia --------------------- 35 3 Aspectos generales derivados del empleo de modelos animales -------------------------- 36 3.1 Normativa del uso de animales de experimentación---------------------------------------------------- 36 3.2 Población experimental del modelo animal PScKOtemp y PScKO;NrxnCTF ------------------------- 37 3.3 Población experimental del modelo animal Nlgn1 Thr271fs. ----------------------------------------- 37 3.4 Población experimental del modelo animal hAPP751SL -------------------------------------------------- 37 3.5 Extracción de DNA genómico y genotipado de ratones. ----------------------------------------------- 37 4 Técnicas bioquímicas para el análisis de proteínas -------------------------------------------- 39 4.1 Obtención de tejido para la realización de lisados ------------------------------------------------------- 39 4.2 Extracción de proteínas a partir de tejido. ----------------------------------------------------------------- 39 4.3 Extracción de proteínas a partir de cultivos celulares. -------------------------------------------------- 39 4.4 Electroforesis en geles SDS-poliacrilamida y transferencia de proteínas. ------------------------- 40 4.5 Inmunodetección de proteínas -------------------------------------------------------------------------------- 41 4.6 Revelado, toma de imágenes y cuantificación. ----------------------------------------------------------- 41 5 Técnicas para el análisis histológico ---------------------------------------------------------------- 42 5.1 Análisis de proteínas en tejido cerebral--------------------------------------------------------------------- 42 5.1.1 Perfusión transcardíaca, fijación y corte del tejido ---------------------------------------------- 42 5.1.2 Inmunohistoquímica ------------------------------------------------------------------------------------- 42 5.1.3 Toma de imágenes y cuantificación ------------------------------------------------------------------ 43 5.2 Tinción de Golgi-Cox --------------------------------------------------------------------------------------------- 44 5.2.1 Procesamiento de las muestras ----------------------------------------------------------------------- 44 5.2.2 Toma de imágenes y cuantificación de la densidad de espinas dendríticas --------------- 45 6 Experimentos de comportamiento en ratones -------------------------------------------------- 45 6.1 Condiciones generales para la realización de comportamiento en ratones ---------------------- 45 6.2 Análisis SHIRPA ---------------------------------------------------------------------------------------------------- 46 6.3 Evaluación locomotora ------------------------------------------------------------------------------------------ 46 6.4 Evaluación de estereotipias ------------------------------------------------------------------------------------ 47 6.5 Evaluación de preferencia social ------------------------------------------------------------------------------ 47 6.6 Evaluación de la memoria -------------------------------------------------------------------------------------- 48 6.6.1 Reconocimiento de objeto nuevo -------------------------------------------------------------------- 48 6.6.2 Reconocimiento de objeto desplazado ------------------------------------------------------------- 50 6.6.3 Laberinto de Barnes -------------------------------------------------------------------------------------- 50 6.6.4 Condicionamiento al miedo ---------------------------------------------------------------------------- 51 7 Anticuerpos empleados ------------------------------------------------------------------------------- 52 IV. Resultados----------------------------------------------------------------------------------------- 54 1 Interacción Neurexinas-Neuroliguinas ------------------------------------------------------------ 55 1.1 Marcaje de isoformas de α- y β-Nrxn1 mediante la inserción de un epítopo Flag -------------- 56 1.2 Interacción diferencial de isoformas de Neurexinas con isoformas de Neuroliguinas en experimentos de co-cultivo -------------------------------------------------------------------------------------------- 58 1.3 Interacción diferencial de isoformas de Neurexinas con isoformas de Neuroliguinas en un contexto neuronal. ------------------------------------------------------------------------------------------------------- 60 2 Control temporal de la función de Presenilina, generación del modelo animal PScKOtemp --------------------------------------------------------------------------------------------------------- 63 2.1 Validación del modelo temporal inducible PScKOtemp --------------------------------------------------- 65 2.1.1 Análisis de la escisión de Psen1 en el modelo PScKOtemp --------------------------------------- 65 2.1.2 Procesamiento proteolítico de sustratos de γ-secretasa en el modelo animal PScKOtemp 66 2.1.3 Análisis histológico del cerebro de ratones PScKOyoung ----------------------------------------- 67 2.1.3.1 Neurodegeneración en animales PScKOtemp ----------------------------------------------- 68 2.1.3.2 Astrogliosis en los animales PScKOyoung ----------------------------------------------------- 69 2.1.3.3 Microgliosis en animales PScKOyoung --------------------------------------------------------- 71 2.2 Análisis del fenotipo asociado con neurodegeneración causado por la pérdida de función de PS en el cerebro envejecido -------------------------------------------------------------------------------------------- 75 2.2.1 Neurodegeneración en animales PScKOadult ------------------------------------------------------- 76 2.2.2 Astrogliosis en los animales PScKOadult -------------------------------------------------------------- 77 2.2.3 Microgliosis en animales PScKOadult ------------------------------------------------------------------ 77 3 Efecto del incremento específico de los niveles de NrxnCTF en el contexto de pérdida de función de Presenilina ------------------------------------------------------------------------------------ 79 3.1.1 Análisis de expresión de NrxnCTF en los animales PScKO;NrxnCTF ------------------------- 80 3.1.2 Análisis histológico de la expresión de NrxnCTF en animales PScKO;NrxnCTF ----------- 83 4 Caracterización bioquímica y conductual del modelo animal knockin Nlgn1 Thr271fs 86 4.1 Generación del modelo animal knockin Nlgn1 Thr271fs y caracterización de la expresión de Neuroliguina 1 ------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 86 4.2 Caracterización conductual de los animales knockin Nlgn1 Thr271fs ------------------------------ 89 4.2.1 Evaluación general del estado del animal ---------------------------------------------------------- 89 4.2.2 Análisis fenotípico de una población adulta de animales knockin Nlgn1 Thr271fs ------ 89 4.2.2.1 Análisis de locomoción exploratoria: Test de campo abierto ------------------------- 90 4.2.2.2 Análisis de patrones repetitivos: Test de acicalamiento-------------------------------- 91 4.2.2.3 Análisis de interacción social: Test de las tres habitaciones --------------------------- 92 4.2.2.4 Evaluación de la memoria ---------------------------------------------------------------------- 93 4.2.2.4.1 Memoria asociativa: Test de condicionamiento al miedo -------------------------- 94 4.2.2.4.2 Memoria espacial: Test del laberinto de Barnes -------------------------------------- 95 4.2.2.4.3 Memoria de reconocimiento de objeto nuevo ---------------------------------------- 97 4.2.3 Análisis fenotípico de una población envejecida de animales knockin Nlgn1 Thr271fs 100 4.2.4 Análisis de los defectos de memoria en los animales HTZ Nlgn1 Thr271fs -------------- 103 4.3 Caracterización sináptica de los animales HTZ Nlgn1 Thr271fs ------------------------------------- 106 5 Interacción de Neuroliguina1 y APP -------------------------------------------------------------- 108 5.1 Generación modelo animal APP751SL; Nlgn1 Thr271fs y caracterización general --------------- 109 5.2 Análisis de la expresión de Aβ en el modelo animal APP751SL; Nlgn1 Thr271fs ----------------- 111 5.3 Caracterización de la patología Aβ en el modelo animal APP751SL; Nlgn1 Thr271fs ----------- 111 V. Discusión ------------------------------------------------------------------------------------------ 114 1 Interacción entre isoformas de Neurexina1 y Neuroliguinas ----------------------------- 116 2 Análisis de la pérdida de función de Presenilina durante el envejecimiento del cerebro ---------------------------------------------------------------------------------------------------------- 120 3 Impacto del acúmulo específico de NrxnCTF. ------------------------------------------------- 125 4 Análisis del modelo animal Knockin Nlgn1 Thr271fs, los efectos de una mutación asociada a la enfermedad de Alzheimer --------------------------------------------------------------- 129 5 Estudio de la interacción de Neuroliguina1 con APP in vivo ------------------------------- 135 VI. Conclusiones ------------------------------------------------------------------------------------- 139 VII. Anexos -------------------------------------------------------------------------------------------- 142 1 Análisis electrofisiológico de los animales Nlgn1 Thr271fs -------------------------------- 143 VIII. Bibliografía --------------------------------------------------------------------------------------- 147 6 I Introducción de la sinapsis. En sinapsis glutamatérgicas, Nlgn1 aumenta la densidad sináptica y la probabilidad de liberación de neurotransmisores mediante un mecanismo dependiente de su interacción con Nrxns (Chih et al., 2006; Dean, Scholl, Choih, Demaria, et al., 2003). La identificación de otras proteínas de adhesión sináptica en los últimos años revela la existencia de mecanismos alternativos que cooperan con el sistema Nrxns-Nlgns en la formación y función sináptica. Destacan otros ligandos postsinápticos de Nrxns como LRRTMs (Leucine-rich-repeat transmembrane), proteínas transmembrana que se unen a Nrxns en la usencia del SP4 durante la formación de sinapsis glutamatérgicas (Ko et al., 2009; Siddiqui et al., 2010). Se ha descrito la unión selectiva a isoformas de NrxnsΔ4 por parte de otros ligandos como distroglicanos y latrofilinas (Boucard et al., 2012; Reissner et al., 2014). Del mismo modo, existen moléculas de unión específica a αNrxns o βNrxns. Por ejemplo, las proteínas postsinápticas Calsinteninas se unen a αNrxns e inducen la formación de sinapsis excitatorias e inhibitorias sobre interneuronas, aunque más recientemente se ha descrito la unión de Calsinteninas tanto a αNrxns como a βNrxnsSP4 regulando la sinapsis excitatoria en las fibras de Schaffer en el hipocampo (H. Kim et al., 2020). Se han descubierto mecanismos adicionales mediados por moléculas de secreción que hacen de puente entre Nrxns y proteínas postsinápticas. Las cerebelinas (Cblns), glicoproteínas que conectan NrxnsSP4 con el receptor GluD2 (S.-J. Lee et al., 2012). Por otro lado, la proteína Hevin secretada por los astrocitos hace de puente entre αNrxns y Nlgn1 con el sitio de splicing B, isoformas que en otras condiciones no interaccionarían, actuando así de modulador positivo (Fan et al., 2021; Singh et al., 2016). También se ha descrito la existencia de moduladores negativos, como la familia de proteínas MDGA. La proteína MDGA1 bloquea la interacción de Nlgn2 con Nrxns suprimiendo el desarrollo de las sinapsis inhibitorias en neuronas en cultivo (Pettem, Yokomaku, Luo, et al., 2013), mientras que la proteína MDGA2 bloquea la interacción entre Nlgn1 y 2 con Nrxns modulando así negativamente el desarrollo de sinapsis tanto excitatorias como inhibitorias (Connor et al., 2016). La interacción de MDGA1 también se ve afectada por la presencia o ausencia del sitio B de splicing en Nlgn1, siendo capaz de bloquear la capacidad sinaptogénica de Nlgn1 únicamente cuando esta no tiene el sitio de splicing B (Elegheert et al., 2017). Por lo tanto, aunque los diferentes sitios de splicing presentes tanto en Nrxns como en Nlgns regulan su interacción, existe un complejo grupo de 7 I Introducción proteínas que actúan como moduladoras y mediadoras entre las isoformas de splicing que normalmente no interactuarían, lo que acompleja aún más el sistema de interacción Nrxns-Nlgns. El amplio número de proteínas de adhesión sináptica descubierto hasta la fecha, y las complejas interacciones que existen entre ellas, indica la importancia de su función y sugiere la existencia de una redundancia parcial en los circuitos neuronales. En otras palabras, los efectos de la ausencia de una de estas proteínas dependerán del papel específico que desempeñen, así como de la compensación funcional que puedan ofrecer sistemas alternativos con funciones solapantes en la misma sinapsis. Es decir, se pueden dar mecanismos compensatorios para mantener la función sináptica adecuada. 2 La enfermedad de Alzheimer La demencia es el término genérico empleado para abarcar una serie de síntomas deficitarios en las habilidades cognitivas de gravedad suficiente como para interferir en las actividades diarias de los pacientes. La enfermedad de Alzheimer (AD) es la forma más frecuente de demencia con una prevalencia de alrededor 50 millones de personas en todo el mundo, proyectado a triplicarse para el año 2050 (Scheltens et al., 2021). Es una enfermedad neurodegenerativa que afecta al lenguaje, memoria, compresión, atención y razonamiento, siendo el síntoma más común la pérdida de memoria a corto plazo. El desarrollo de la enfermedad antes de los 65 años se considera un inicio temprano y es poco frecuente, representando menos del 10% de los pacientes con AD (Kumar et al., 2022). 2.1 Antecedentes de la enfermedad de Alzheimer El psiquiatra alemán Alois Alzheimer describió originalmente AD en 1907, publicando su investigación en el artículo titulado “Sobre una enfermedad grave y peculiar de la corteza cerebral”. En este artículo describió a una mujer de 51 años, Auguste Deter, con síntomas de paranoia, problemas de retención de información, problemas de atención, agresividad, mala compresión y comunicación. La paciente falleció tras cuatro años y medio de enfermedad. Tras un análisis histológico del cerebro, 8 I Introducción Alois Alzheimer describió una atrofia cerebral, la presencia de depósitos extracelulares dispersos por toda la corteza, agregados neurofibrilares y cambios en las células gliales (Strassnig & Ganguli, 2005). En 1910, otro psiquiatra alemán, Emil Kraepelin, nombró esta nueva entidad clínica y patológica como enfermedad de Alzheimer, nombre que se sigue empleando hoy en día. 2.2 Rasgos fisiopatológicos de la enfermedad de Alzheimer En el cerebro de los pacientes con AD se han descrito dos estructuras subcelulares características, las placas de β amiloide (Aβ) y los ovillos neurofibrilares. Aβ se produce por el procesamiento secuencial del precursor de la proteína β amiloide (APP) por parte de la β- y γ-secretasa, y tiene una longitud típica de 38, 40 y 42 aminoácidos (Haass et al., 2012). Estos péptidos Aβ tienden a agregar entre ellos formando oligómeros, protofibrillas y fibrillas, que son detectables en los cerebros de pacientes de AD. Debido a la mayor hidrofobicidad proveniente del fragmento C-terminal más largo, Aβ42 tiene mayores capacidades de agregación (Long & Holtzman, 2019). Los ovillos neurofibrilares son otro tipo de agregados compuestos, principalmente, por la proteína Tau fosforilada. La proteína Tau en situaciones fisiológicas se encuentra asociada a los microtúbulos proporcionando estabilidad al citoesqueleto de las neuronas facilitando el mantenimiento de la estructura celular y el transporte vesicular. Cuando esta proteína se hiperfosforila, se disocia de los microtúbulos y comienza a formar agregados proteicos (Rawat et al., 2022). 2.3 Clasificación de la enfermedad de Alzheimer AD se puede clasificar en dos tipos dependiendo de sus factores genéticos: - AD esporádica. Se clasifica dentro de este tipo las enfermedades que debutan de manera más tardía, generalmente después de los 65 años de edad. Representa un 90-95% del total de los enfermos de AD y no presenta un patrón claro de herencia. - AD familiar (FAD). Es una enfermedad de inicio más temprano, con una aparición entre los 30 y 65 años generalmente. Representa entre el 5 y el 10% del total de 9 I Introducción pacientes con AD. Presenta un patrón de herencia autosómica dominante y está asociada a mutaciones en numerosos genes. Entre los más importantes destacan APP, en el cromosoma 21; Presenilina 1 (PSEN1), en el cromosoma 14 y Presenilina 2 (PSEN2), en el cromosoma 1 (Selkoe, 2001), siendo las mutaciones en los genes de PSEN las que abarcan hasta el 90% de los casos descritos de FAD. La identificación mutaciones en los genes APP, PSEN1 y PSEN2 en FAD ha supuesto un gran avance en el estudio de mecanismos fisiopatológicos asociados con AD. 3 Presenilinas Las Presenilinas (PS1 y PS2) son proteínas transmembrana multipaso con actividad catalítica proteasa de unos 50 KDa. Representan la subunidad catalítica del complejo γsecretasa y tienen un papel importante en la aparición y progresión de AD (Stanga et al., 2018). El complejo γ-secretasa está formado por la asociación de PS1 o PS2 con otras tres proteínas de membrana: Nicastrina, Aph-1 (Aph1a o Aph-1b en humanos; Aph1a, Aph-1b o Aph-1c en roedores) y Pen-2, dando lugar esta combinación a cuatro y seis γ-secretasas distintas en humanos y roedores, respectivamente (Dehury et al., 2019; Wolfe & Miao, 2022). La formación del complejo activo γ-secretasa comienza con la incorporación de PS al dímero formado por Aph1 y Nicastrina. A continuación, y tras la unión de PS al dominio transmembrana de Nicastrina, se ensambla Pen-2 a PS, teniendo lugar la endoproteolisis de PS para formar el complejo activo PS/γ-secretasa (Thinakaran et al., 1996). El proceso de endoproteolisis de PS da lugar a los fragmentos NTF y CTF de PS de 27-20 kDa y 16-20 kDa, respectivamente (Dehury et al., 2019). La actividad proteolítica de PS está mediada por dos residuos de aspartato en las posiciones 257 y 385 localizados en el sexto y séptimo dominio transmembrana, respectivamente. Estos residuos son esenciales para la actividad endoproteolítica de PS y, por tanto, para la actividad γ-secretasa (Kimberly et al., 2000; Wolfe et al., 1999). La localización subcelular del complejo γ-secretasa viene determinado por la presencia de PS1 o PS2. Por un lado, si está presente PS1, el complejo γ-secretasa se localiza principalmente en la membrana plasmática, mientras que, si es PS2 la presente, 10 I Introducción este se localiza en la red retículo endoplásmico-Golgi y en los endosomas de reciclaje. Además, la localización subcelular se puede ver afectada por el componente Aph1, pudiendo localizarse en compartimentos endocíticos tardíos (Meckler & Checler, 2016). La distinción entre complejos con PS1 o PS2 puede tener importantes implicaciones en la especificidad de sustratos de estos. Por ejemplo, los complejos PS1/γ-secretasa juegan un papel predominante en el procesamiento de APP y Notch comparado con los que contienen PS2 (Stanga et al., 2018). 3.1 Presenilinas en la enfermedad de Alzheimer Actualmente se conocen más de 300 mutaciones en PSEN1 asociadas con FAD (www.alzforum.org). Las mutaciones en PSEN1 no están concentradas en una región específica del gen, sino que se distribuyen a lo largo de toda su secuencia. Se localizan principalmente en el gran lazo hidrofílico, en las zonas cercanas o en las interfases con la membrana, o en los dominios transmembrana altamente conservados. (Kabir et al., 2020) (Figura 3). El patrón de herencia autosómica dominante en las mutaciones en genes de PS asociadas con FAD se puede explicar desde dos puntos de vista: por un lado, estas mutaciones actuarían produciendo una ganancia de función, con una sobreproducción Figura 3. Mutaciones descritas en PSEN1. En la imagen se muestra la distribución de las distintas mutaciones descritas en el gen PSEN1. Se incluyen mutaciones de cambio de sentido, pequeñas inserciones y deleciones. En rojo, mutaciones patogénicas en PS1. En verde, mutaciones benignas y en azul mutaciones no clasificadas. En amarillo, los dos residuos Aspartatos (D257 y D385) pertenecientes al sitio catalítico de PS1. Alzforum.com, Versión 4.7-2023. 11 I Introducción de productos del procesamiento (Hardy & Selkoe, 2002). Por otro lado, las mutaciones en PSEN podrían generar una pérdida de función, con el consecuente acúmulo de sustratos (Shen & Kelleher III, 2007). Resolver esta dicotomía tiene implicaciones clínicas relevantes. En el caso de que las mutaciones en PSEN causaran una ganancia de función, la inactivación de la actividad de PS o del complejo γ-secretasa podría aliviar la sintomatología o el avance de AD. Por el contrario, si nos encontráramos ante mutaciones de pérdida de función, sería importante encontrar aproximaciones farmacológicas que impidieran la acumulación de sustratos posiblemente patogénicos para frenar el desarrollo de la AD. Trabajos realizados en los últimos años apoyan un mecanismo que actúa a través de mutaciones de pérdida de función de PS. Por un lado, las mutaciones en PSEN asociadas a FAD se encuentran distribuidas a lo largo de toda la secuencia de la proteína, por tanto, es difícil imaginar un escenario en el que dichas mutaciones confieran una ganancia de función. En un estudio reciente se han analizado in vitro 138 mutaciones patogénicas en PSEN1 relacionadas con FAD y como influyen en la producción del péptido Aβ. Sorprendentemente, el 90% de las mutaciones estudiadas redujeron el procesamiento de APP, observándose una menor generación de Aβ40 y Aβ42 (Sun et al., 2017). Este estudio reveló que las mutaciones patogénicas en PSEN1 inhibían, en lugar de incrementar, la actividad del complejo PS/γ-secretasa. Por otro lado, se han realizado estudios in vivo donde se induce la pérdida de función de PS. Los animales PScKO son uno de los modelos más estudiados que apoyan el mecanismo de pérdida de función de PS. En este modelo animal, la inactivación de PS ocurre en las neuronas glutamatérgicas del cerebro adulto a partir de las cuatro semanas de edad. Los estudios realizados en los animales PScKO han reportado defectos tempranos en la plasticidad presináptica y de memoria (Saura et al., 2004; Wines-Samuelson et al., 2010). Resultados similares se han obtenido con la inhibición de otro de los componentes del complejo γ-secretasa como Nicastrina (Tabuchi et al., 2009). Además, la asociación de mutaciones de pérdida de función de PS con AD se ha visto reforzada por la generación de modelos de ratón Knockin (KI) donde se reproducen mutaciones en PSEN1 asociadas a FAD (Guo et al., 1999; Xia et al., 2015, 2016). Apoyando este mecanismo de pérdida de función, ensayos clínicos en fase III que trataban pacientes con inhibidores de la actividad PS/γ-secretasa han tenido que ser 12 I Introducción cancelados debido al incremento en la incidencia de los efectos adversos en los pacientes tratados (Doody et al., 2013). En conjunto, estos datos han llevado a postular la “hipótesis de Presenilinas”, según la cual la pérdida de función de PS, con el consecuente acúmulo de sus sustratos, sería la que tendría un papel iniciador en AD ocasionando defectos sinápticos y de memoria precedentes a la posterior neurodegeneración en pacientes (Shen & Kelleher III, 2007). 3.2 Funciones biológicas de Presenilinas PS son el centro activo del complejo γ-secretasa y se descubrieron a consecuencia de sus funciones en la generación del péptido Aβ asociado a AD. Desde su descubrimiento se han identificado numerosos sustratos y proteínas con las que interaccionan, indicando que deben tener diversas funciones a lo largo de la vida (Haapasalo & Kovacs, 2011). Las funciones de PS se pueden clasificar en base a la participación o no del complejo γsecretasa. Dentro de las funciones independientes de la actividad γ-secretasa, se encuentran la estabilización de β-catenina en la ruta de señalización de Wnt (Duggan & McCarthy, 2016; H. Huang & He, 2008) y la activación de canales de Ca2+ y regulación de la homeostasis del Ca2+ intracelular (H. Zhang et al., 2010, 2015). Debido a la importancia y relación con los objetivos de esta Tesis Doctoral, las funciones de PS dependientes de actividad γ-secretasa se describen en detalle a continuación. 3.2.1 Funciones de Presenilinas dependientes de actividad γ-secretasa La función del complejo PS/γ-secretasa es el procesamiento proteolítico de diversos sustratos. Estos sustratos son mayoritariamente proteínas integrales de membrana tipo I (S. Zhang et al., 2013). Los sustratos de PS tienen funciones importantes en rutas de señalización, adhesión celular y migración, crecimiento de neuritas y formación de la sinapsis. El procesamiento por parte del complejo PS/γ-secretasa, una vez desprendido el ectodominio del sustrato (Struhl & Adachi, 2000), tiene lugar en el límite entre los dominios transmembrana y citoplasmático o en sus inmediaciones (Figura 4). Además, parece que el corte por parte de PS/γ-secretasa no depende de una secuencia específica de aminoácidos, sino más bien, de la conformación del dominio transmembrana del sustrato (Weihofen & Martoglio, 2003). A consecuencia del corte 13 I Introducción producido por el complejo PS/γ-secretasa, se genera un dominio intracelular (ICD) que es liberado en el citosol (Figura 4). Se ha descrito que algunos de estos ICDs se translocan al núcleo, sugiriendo una posible función en la regulación génica (Araki et al., 2004; Okochi et al., 2002). La generación del ICD es consecuencia directa de la función del complejo γsecretasa, ya que una falta de función de PS/γ-secretasa, bien por el empleo de inhibidores farmacológicos o por mutaciones en PS, previenen la formación de los ICDs y producen el acúmulo consecuente de los CTFs no procesados (Haapasalo & Kovacs, 2011). 3.3 Sustratos de Presenilinas Hay descritos una gran variedad de sustratos de PS/γ-secretasa con diferencias en función biológica, estructura y localización celular. Desde la caracterización molecular del complejo PS/γ-secretasa en 1999 (Wolfe et al., 1999), se han descrito casi 150 sustratos diferentes (Güner & Lichtenthaler, 2020). Generalmente se asume que el procesamiento por parte del complejo γ-secretasa contribuye a uno de los siguientes propósitos o combinación de estos: regulación de los niveles de las proteínas sustrato mediante su degradación, transducción de señal mediante la liberación del ICD o liberación de un péptido pequeño que pueda tener función fisiológica. El procesamiento del receptor Notch es un ejemplo de señalización inducida mediante el procesamiento por parte de PS/γ-secretasa (de Strooper et al., 1999; Figura 4. Esquema del procesamiento mediado por PS/γ-secretasa. Se produce un primer corte proteolítico mediado por metaloproteasas, con la consecuente liberación del ectodominio al medio extracelular. A continuación, el fragmento C-terminal (CTF) es procesado por γ-secretasa, liberando así el dominio intracelular de la proteína (ICD). Esquema generado con biorender.com. 14 I Introducción Hartmann et al., 2002). Notch es una proteína de membrana cuya función como factor de activación transcripcional requiere del procesamiento por parte del complejo PS/γsecretasa. Tras ser procesado se vuelve transcripcionalmente activo. El proceso de activación de Notch tiene importantes funciones durante el desarrollo (Artavanis- Tsakonas et al., 1999). Es interesante destacar que el procesamiento de Notch por parte de PS parece no ser homogéneo durante la edad de los animales. Durante el desarrollo embrionario de animales con pérdida de función de PS se observa un bloqueo en la cascada de señalización mediada por Notch dependiente de su procesamiento (W. Y. Kim & Shen, 2008). Sin embargo, animales PScKO adultos, no se observan alteraciones en la cascada de señalización de Notch, mientras que el resto de los sustratos de PS sufren un claro acúmulo debido a su falta de función (Huakui Yu et al., 2001). Por otro lado, uno de los sustratos de PS/γ-secretasa que ha obtenido una gran relevancia en relación con AD es la proteína precursora del péptido β amilode (APP). APP es una glicoproteína transmembrana tipo I que al ser procesada proteolíticamente genera el péptido Aβ. APP se encuentra muy conservado evolutivamente y, mediante splicing alternativo, se generan al menos 10 isoformas diferentes, apuntando a un potencial papel en la fisiología de la célula (Cho et al., 2022). Las isoformas más abundantes son las que contienen 695, 751 y 770 aminoácidos (Selkoe, 2001). APP puede ser procesado por tres tipos distintos de proteasas: α-, β-, y γ-secretasa. Existen dos vías de procesamiento de APP: la vía no amiloidogénica y la vía amiloidogénica. En la vía no amiloidogénica, el procesamiento comienza con un corte por parte de α-secretasa en el dominio extracelular, generando un fragmento N-terminal de APP soluble (sAPPα) y un fragmento C-terminal de 83 aminoácidos (C83). El CTF es procesado por la γ-secretasa en su dominio transmembrana generando un péptido de 23 aminoácidos (p3) que se libera al medio extracelular y un fragmento citosólico correspondiente al dominio intracelular de APP (AICD). En la vía no amiloidogénica no se genera el péptido Aβ ya que sitio de corte de la α-secretasa se encuentra en la secuencia aminoacídica del mismo (Checler, 1995; Papadopoulos et al., 2022). La proteína ADAM13, ADAM10 y ADAM9 han sido propuestas como responsables de la actividad α-secretasa encargada del procesamiento no amiloidogénico de APP (Haass et al., 2012). En la ruta amiloidogénica, APP es procesado por β-secretasa, generando el extremo soluble N-terminal (sAPPβ) y un CTF asociado a membrana de 99 aminoácidos (C99). Este 15 I Introducción CTF es procesado por el complejo γ-secretasa generando el péptido Aβ y un fragmento AICD (Papadopoulos et al., 2022; Takami et al., 2009). Como proteína con actividad βsecretasa se ha identificado a la proteína BACE1 (Lichtenthaler et al., 2022; Vassar et al., 1999). El péptido Aβ puede formar agregados en forma de oligómeros en determinadas circunstancias, los cuales son capaces de polimerizar en grandes depósitos de fibras que pueden llegar a formar placas asociadas a astrogliosis y microgliosis (Armstrong, 2009). Por último, se han descrito sustratos del complejo γ-secretasa con dominios citoplásmicos mucho más cortos, lo que parece indicar que su ICD no tenga función de señalización, al menos conocida. Al igual que el ICD, se desconoce si el segundo producto del complejo γ-secretasa, el péptido corto y secretado tipo Aβ, tiene alguna función fisiológica. Aβ tiene una función establecida en la fisiopatología de AD y mutaciones en APP, PSEN1 o PSEN2 producen una herencia dominante de formas de FAD. Algunas mutaciones asociadas con FAD producen una mayor generación del péptido Aβ42 (Artavanis-Tsakonas et al., 1999; Moehlmann et al., 2002). Estos datos sirven de apoyo para la postulación de la teoría amiloidogénica, que apoya la producción masiva de formas largas del péptido Aβ como Aβ42 como principal responsable de AD (Hardy & Selkoe, 2002). Sin embargo, no está claro que PS promueva los déficits de memoria y supervivencia neuronal mediante el procesamiento de APP, poniendo en duda si este es el único sustrato patogénico del complejo γ-secretasa. Por ejemplo, pacientes que poseen mutaciones en APP desarrollan la enfermedad de manera más tardía que pacientes con mutaciones en los genes de PSEN (Ryman et al., 2014). Por otro lado, en estudios post mortem y de imagen en vivo empleando PET se han encontrado que pacientes con pocos o ningún síntoma clínico de demencia presentaban elevados niveles de placas amiloides (Klunk et al., 2009). Estos datos indican que el péptido Aβ no es suficiente para causar AD. La mera sobreproducción de Aβ, incluyendo la forma larga Aβ42, no causa neurodegeneración en modelos animales (Mucke et al., 2000), sugiriendo que la sobreproducción de Aβ puede no ser suficiente para el inicio de la neurodegeneración (J. Kim et al., 2013). Por otro lado, en modelos animales KI con mutaciones en Psen1 asociadas a FAD se observa una reducción en los niveles de Aβ40 y Aβ42, lo que concuerda con mecanismos de pérdida de función de PS (Tambini & D’Adamio, 2020; Xia et al., 2016). Se propone así dos rutas paralelas relacionadas con AD, una que depende de la producción de Aβ ocasionando la formación de placas, y otra, 22 I Introducción El déficit en la memoria es uno de los marcadores clave en AD y en los modelos animales carentes de función de PS. Realizamos una evaluación de la memoria de los animales NrxnCTF en diferentes paradigmas. Por un lado, no se encontraron defectos en la prueba de reconocimiento de objeto nuevo ni en la memoria espacial (Sánchez-Hidalgo et al., 2022). Sin embargo, en los ratones NrxnCTF presentaron defectos en la memoria asociativa, reportados como una reducción en el tiempo de congelación asociado al tono en la prueba de condicionamiento al miedo (Sánchez-Hidalgo et al., 2022). Estos datos indican que la expresión del transgén NrxnCTF en el cerebro de animales adultos genera un descenso en las estereotipias, sutiles diferencias en la interacción social y defectos en la memoria asociativa. La expresión presináptica de NrxnCTF en las neuronas corticales junto con el descenso observado en la memoria asociada al miedo en los animales NrxnCTF apuntan a que las sinapsis entre la corteza prefrontal y la amígdala basolateral (mPFC-BLA) puede ser una ruta potencial para descubrir los efectos sinápticos causados por el transgén NrxnCTF. En colaboración con el grupo del Dr José María Delgado (UPO), se implantaron electrodos de estimulación y de registro en el mPFC y la BLA, respectivamente, de animales controles y NrxnCTF para registrar potenciales de campo evocados (fEPSP). Tanto los animales controles como los ratones NrxnCTF presentaron curvas input/output con perfiles sigmoidales similares, sugiriendo que las propiedades funcionales de las sinapsis mPFC-BLA no se vieron afectadas en los ratones transgénicos. Sin embargo, en un análisis de plasticidad sináptica a corto plazo, se observó una facilitación más tardía en los animales NrxnCTF (Figura 9), indicando que la acumulación de NrxnCTF retrasa el rango óptimo para la facilitación sináptica en las sinapsis mPFC-BLA. Figura 9. PPF evocada en las sinapsis mPFC-BLA en animales controles y NrxnCTF. Arriba, ilustraciones de ejemplos de registros de fEPSP de animales controles y NrxCTF durante la PPF, representación de los 3 tiempos de intervalos de máxima facilitación (20, 40 y 100 ms). Abajo, resultados del test de PPF de animales controles y NrxnCTF. Los datos representan el ratio del segundo pulso entre el primer pulso de la amplitud del fEPSP multiplicado por 100, sobre los intervalos inter-estímulo crecientes (10, 20, 40, 100, 200 y 500). Cada punto representa el valor medio de 10 estímulos en 10 animales por grupo. * p<0.05 en comparación con los valores a 500 ms, el valor más similar a los valores basales. Experimentos realizados en colaboración con José María Delgado. Adaptado de Sánchez-Hidalgo et al., 2022. 23 I Introducción En conjunto, los datos obtenidos en el análisis fenotípico, conductual y electrofisiológico indican que la acumulación in vivo específica de NrxnCTF manteniendo la función de PS intacta provoca defectos en la memoria asociativa al miedo y en la plasticidad presináptica a corto plazo. 5 Antecedentes II: Papel de Neuroliguina 1 en enfermedad de Alzheimer 5.1 Identificación de una mutación truncante en NLGN1 en un caso de Alzheimer familiar y generación de un ratón knockin Parte de los resultados expuestos a continuación fueron publicados por nuestro grupo en el artículo titulado “A truncating mutation in Alzheimer’s disease inactivates neuroligin-1 synaptic function” en Neurobiology of Aging (Tristán-Clavijo et al., 2015). Mutaciones truncantes e inactivantes en NLGN3 y NLGN4X se han asociado previamente a enfermedades del neurodesarrollo, particularmente a trastornos del espectro autista (TEA) e incapacidad intelectual (Jamain et al., 2003; Laumonnier et al., 2004). Nlgns y Nrxns son sustratos de PS, un componente de la γ-secretasa donde frecuentemente se encuentran mutaciones asociadas a AD (Peixoto et al., 2012; Saura et al., 2011; Suzuki et al., 2012). Con el objetivo de esclarecer el papel de Nlgn1 en AD, nuestro grupo describió una mutación de cambio de pauta de lectura en el gen NLGN1 en una paciente de AD (Tristán-Clavijo et al., 2015). Tras una secuenciación de la región codificante de NLGN1 en un grupo de 192 pacientes de AD, el grupo identificó una inserción de dos pares de bases en la posición 875 (c.875_876insTT; p.Thr271fs) en una de las pacientes. Se confirmó la ausencia de mutaciones en otros genes asociados a AD como PSEN1, PSEN2 y APP o en otras NLGNs como NLGN2, NLGN3 y NLGN4. La inserción de dos pares de bases afecta al residuo Thr271 de Nlgn1, localizado N-terminal del sitio de splicing alternativo B. La inserción predice un codón de STOP prematuro en la posición 284 para isoformas de Nlgn1 que carezcan del sitio B (Nlgn1 284X) o en la posición 293 para isoformas que si contengan dicho sitio (Nlgn1 293x). 24 I Introducción Para analizar los efectos de la mutación en la función de Nlgn1, se generaron vectores de expresión de las proteínas mutantes y se observó que la mutación resultó en la expresión de proteínas truncadas de unos 30 KDa que se acumularon en el retículo endoplásmico (RE) sin alcanzar la superficie celular (Tristán-Clavijo et al., 2015). Además, se analizó la capacidad sinaptogénica de estas proteínas mutantes en cultivos neuronales observándose que no lograron la formación de sinapsis glutamatérgicas. En conjunto, estos datos indican que la mutación Nlgn1 Thr271fs asociada a AD resulta en la producción de una proteína truncada de 30 KDa que se acumula en el RE y que carece de capacidad sinaptogénica. La mutación Nlgn1 Thr271fs produce una pérdida de expresión de Nlgn1, que podría ir acompañada de un efecto adicional mediado por el fragmento truncado de 30 KDa en el caso de expresarse in vivo. Con el objetivo de profundizar en las posibles consecuencias de la mutación Nlgn1 Thr271fs asociada a AD, en el grupo se generó un ratón KI empleando tecnología TALENS para incorporar la inserción de dos timinas en el gen de Nlgn1 del ratón. Los detalles de la generación del nuevo modelo animal KI Nlgn1 Thr271fs se desarrollan en el apartado de resultados de esta Tesis Doctoral 5.2 Interacción de APP y Nlng1 Existen numerosos estudios que apoyan que los péptidos Aβ causan déficits sinápticos y de memoria afectando el sistema Nrxns-Nlgn1. Se ha mostrado que mediante inyecciones agudas de Aβ en el hipocampo del ratón se genera una reducción parcial de Nlgn1 mediante mecanismos epigenéticos produciendo disfunción en las sinapsis glutamatérgicas y en memoria (Bie et al., 2014). Además de mediante mecanismos epigenéticos, el péptido Aβ podría impedir el correcto funcionamiento del sistema Nrxns- Nlgn1 mediante interacción directa proteína-proteína, como se ha observado más recientemente en neuronas en cultivo (Brito-Moreira et al., 2017; Naito et al., 2017). En conjunto, los datos clínicos y experimentales parecen apoyar que los péptidos Aβ puedan actuar mediante un descenso en los niveles o función de Nlgn1. Sin embargo, no se conoce si existen otros efectores de Aβ que pudieran jugar un papel más relevante que Nlgn1 in vivo. Basados en esta hipótesis, esperaríamos que los efectos deletéreos mediados por Aβ se vieran incrementados en modelos animales con una reducción 25 I Introducción parcial de Nlgn1, pero que preservaran otros efectores potenciales de Aβ intactos. Por el contrario, otros estudios han demostrado que Nlgn1 actúa como un receptor sináptico de Aβ desencadenando su nucleación (Dinamarca et al., 2011, 2015). Esta hipótesis implicaría que en modelos animales con una reducción de los niveles de Nlgn1 podrían verse reducidos los efectos deletéreos del acúmulo de Aβ. Por otro lado, podría existir una interacción entre Nlgn1 y APP a través del propio APP o de otros de sus metabolitos. Para esclarecer la relación entre Nlgn1 y APP, es necesario la generación de nuevos modelos animales que expresen mutaciones en APP en un fondo genético con distintos niveles de Nlgn1. II. OBJETIVOS 27 III Objetivos El objetivo general de esta Tesis Doctoral ha sido profundizar en la posible relación del sistema de adhesión sináptico formado por Nrxns y Nlgns con AD mediante la generación de nuevos modelos celulares y animales. Los objetivos específicos de esta Tesis doctoral han sido: 1. Estudio de la interacción diferencial de isoformas de splicing de Nrxn1 con Nlgn1 y -2 en la sinapsis. 2. Generación y validación de un modelo animal con control temporal de la pérdida de función de Presenilinas en el cerebro adulto. 3. Generación y validación de un modelo animal de sobreexpresión de NrxnCTF en un contexto de pérdida de función de Presenilinas. 4. Caracterización fenotípica y conductual del modelo animal knockin Nlgn1 Thr271fs asociado a enfermedad de Alzheimer. 5. Generación de un modelo animal para el estudio de la interacción entre APP y Nlgn1. III. MATERIALES Y MÉTODOS 29 III Materiales y métodos 1 Cultivos celulares 1.1 Células HEK 293T 1.1.1 Mantenimiento de la línea celular HEK 293T. La línea celular HEK 293T deriva de células embrionarias de riñón humano. Esta línea celular es una modificación de la línea HEK 293, tras su transformación y expresión estable de los genes E1A y E1B, genes del antígeno T de la proteína SV40. Esta línea celular se ha empleado en esta tesis dada su facilidad para ser transfectada y sobreexpresar proteínas exógenas. El mantenimiento y cultivo de esta línea celular se ha realizado empleando frascos de cultivo (JetBiofil) en medio de cultivo Dulbecco´s modified Eagle Medium (DMEM, Gibco) suplementado con un 10% de suero fetal bovino (FBS, HyClone, Thermo Fisher Scientific), glutamax 2mM (Gibco), penicilina 100 U/ml y estreptomicina 100 µg/ml (Gibco). Las células se mantuvieron en condiciones de 37 °C y 5% de CO2 en un incubador. 1.1.2 Transfección de células HEK 293T La transfección de esta línea celular se realizó empleando lipofectamina 2000 (Invitrogen). En placas estériles de 24 pocillos (JetBiofil) se cultivaron las células HEK 293T para conseguir un 60% de confluencia el día de la transfección. Se realizó una mezcla de 1.5 µl de lipofectamina 2000 más 100 µl de medio de cultivo Optimem (Life Technologies) por pocillo a transfectar. Por otro lado, se mezcló el plásmido a transfectar junto con 100 µl de Optimem por pocillo a transfectar. La mezcla de Optimem con lipofectamina 2.000 se añadió a la mezcla que contiene el plásmido a transfectar y se incubó a temperatura ambiente durante 30 minutos. La mezcla de lipofectamina 2.000 junto al plásmido a transfectar se añadió a los pocillos de células HEK 293T, a los que previamente se ha sustituido su medio de cultivo por 800 µl de Optimem. Las células se incubaron durante 2 horas a 37 °C y 5% de CO2. Pasado este tiempo se detuvo la transfección sustituyendo el medio por DMEM suplementado con un 10% de FBS, 2 mM glutamax (Gibco), 100 U/ml penicilina y 100 µg/ml estreptomicina (Gibco). 30 III Materiales y métodos 1.1.3 Producción de partículas lentivirales Todos los protocolos que incluyen el manejo de lentivirus se realizaron en una campana de seguridad biológica clase 2 (Telstar). Los residuos generados se desinfectaron con lejía y se desecharon en un contenedor de residuos sanitarios infecciosos. El protocolo de generación de partículas lentivirales se realizó como se ha descrito previamente (Gascón et al., 2008). Se emplearon dos placas de cultivo de 15 cm de diámetro por cada preparación lentiviral sembradas el día previo con 15x106 células HEK 293T en un volumen de 25 ml de medio DMEM suplementado. A las 24 horas de la siembra, se descartaron 5 ml de medio y se transfectaron las células siguiendo el método de fosfato cálcico. Se emplearon 10 µg de pCAG-VSVgΔC, 15 µg de Δ8.9 y 20 µg del vector lentiviral de transferencia. pCAG-VSVgΔC codifica la proteína de la cápsida del virus de la estomatitis vesicular (VSV). Δ8.9 codifica la maquinaria de retrotranscripción e integración del material genético. El vector de transferencia codifica la secuencia de la proteína de interés a expresar bajo el control del promotor de sinapsina. Se mezcló el ADN de los diferentes plásmidos con 200 µl de CaCl2 2.5 M y agua estéril hasta los 2 ml de volumen total. A continuación, gota a gota sobre un vórtex en agitación, se añadieron 2 ml de HBS 2x pH 7.05 (Na2HPO4 1.5 mM, NaCl 280 mM, HEPES 50 mM). Se realizó una mezcla por burbujeo durante 30 segundos y se añadió gota a gota a la placa de cultivo. Las células se incubaron durante 4 horas a 37 °C con la mezcla de transfección. Tras este tiempo, se lavó la placa con tampón fosfato salino frío (PBS por sus siglas en inglés) y se añadieron 20 ml de medio fresco. Pasadas 72 horas de expresión, se recogieron las partículas virales generadas. El medio se centrifugó a 2000 rpm durante 5 minutos para eliminar restos celulares y se filtró con una membrana de SFCA de 0.45 µm de amplitud de poro (Nalgene). El medio se pasó a tubos Ultra-Clear de 38.5 ml (Beckman Coulter) y se centrifugó a 25000 rpm durante 90 minutos en la ultracentrífuga Optima L-100 XP empleando el rotor Sw32 Ti (Beckman Coulter). El precipitado con las partículas lentivirales se resuspendió en 100 µl de PBS frío y se dejó a 4ºC durante 16 horas. Tras este tiempo, la preparación lentiviral se separó en alícuotas de trabajo y se almacenó a -80 °C hasta su uso. 31 III Materiales y métodos 1.2 Cultivo primario de neuronas hipocampales de rata. Los cultivos primarios de hipocampo se realizaron a partir de embriones de 18 días de gestación (E18) de ratas Wistar provenientes del Servicio de Producción y Experimentación animal del IBiS. La rata gestante se sacrificó mediante inhalación de CO2. Se extrajeron los embriones mediante una cesárea y se colocaron en una placa de Petri estéril, se decapitaron y se extrajeron los cerebros que se colocaron en una placa de 6 cm de diámetro con DMEM (Gibco) suplementado con Glutamax 2 mM en hielo. Bajo la lupa, se diseccionaron las hemicortezas con unas pinzas de punta fina Dumont #5 (Fine Scientific Tools) y se distribuyeron en placas de 3.5 cm de diámetro con 2 ml de DMEM suplementado con Glutamax 2 mM. En la campana de flujo laminar se realizaron dos cortes con un escalpelo a cada hipocampo y se añadió 220 µl de tripsina al 2.5% (Gibco). Se dejó actuar la tripsina en el incubador durante 15 minutos. Tras la incubación, el tejido se disgregó mecánicamente en un tubo con 2 ml de medio DB1 (DMEM suplementado con suero fetal bovino 10%, D-(+)-glucosa [Sigma] 44.4 mM, Glutamax 2 mM, penicilina 100 U/ml y estreptomicina 100 µg/ml [Gibco]) mediante pases por pipetas Pasteur de vidrio con la apertura de la punta reducida al 50% y posteriormente al 25%. Tras la disgregación mecánica, las células en suspensión se contaron en una cámara de Neubauer empleando azul de tripano (Sigma). Se sembraron 65.000 células por pocillo de una placa de 24 pocillos con cubreobjetos previamente tratados con poli-D-Lisina (0.5 mg/ml) disuelta en ácido bórico 75 mM pH 8.2 filtrado. Las neuronas se cultivaron durante 150 minutos en medio DB1 y posteriormente se sustituyó por medio Neurobasal completo (Neurobasal [Gibco], B27 [Invitrogen], Glutamax 2 mM, penicilina 100U/ml, estreptomicina 100 µg/ml). 1.2.1 Transfección de cultivos neuronales Las neuronas sembradas en placas de cultivo de 24 pocillos se transfectaron con lipofectamina 2.000 (Invitrogen). Se realizó una mezcla de 0.5 µl de lipofectamina 2.000 más 50 µl de medio de cultivo Neurobasal (Gibco) por pocillo a transfectar. Por otro lado, se realizó una mezcla del plásmido a transfectar junto con 50 µl de Neurobasal por pocillo a transfectar. La mezcla de Neurobasal con lipofectamina 2.000 se añadió a la mezcla que contiene el plásmido a transfectar y se incubó a temperatura ambiente durante 20 38 III Materiales y métodos con 75 µl de solución A (25 mM NaOH, 0.2 mM EDTA pH 12). A continuación, las muestras se neutralizaron con 75 µl de solución B (40 mM Tris-HCl, pH 5.5). Para la reacción de PCR se emplearon 40 ng de ADN, la polimerasa GoTaq Flexi, nucleótidos, magnesio, tampón para la polimerasa sin tampón de carga (Promega) y los oligonucleótidos especificados en la tabla 4. La reacción se realizó en el termociclador Veriti 96 well Thermal Cycler (Applied Biosystems) empleando el siguiente programa: 3 minutos de desnaturalización inicial a 95ºC seguidos de 40 ciclos de desnaturalización (45 s a 94 °C), hibridación (45 s, temperatura especificada en la tabla 4 para cada amplicón) y extensión (45 s a 72 °C), finalizando con un ciclo de 7 minutos a 72 °C para una extensión final. Únicamente para la genotipación de la línea de animales Nlgn1 Thr271fs, tras la PCR, se realizó una reacción de restricción empleando la enzima HpaI (New England Biolabs) empleando el tampón CutSmart (New England Biolabs). La reacción de restricción se llevó a cabo durante 2 horas a 37 °C. El producto resultante se migró en un gel de 0.8% agarosa (Conda Lab) disuelta en TAE (40 mM Tris pH 7.6, 20 mM ácido acético, 1 mM EDTA) y teñido con bromuro de etidio 0.00002% empleando el equipo de electroforesis Mupid-one (Takara). Amplicón Oligonucleótido sense Oligonucleótido anti-sense Tª Hibridación Nlgn1 ex6 5’-TCCAGGCTTCTTGAGCACAG-3’ 5’-CATCTTACCCAGCTCCATGG-3’ 64 °C Psen1 5'-GGTTTCCCTCCATCTTGGTTG-3' 5’-TGCCCCCTCTCCATTTTCTC-3’ 5’-TGCCCCCTCTCCATTTTCTC-3’ 60 °C Psen2 5’-CATCTACACGCCCTTCACGG-3’ 5’-AAGGGCCAGCTCATTCCTCC-3’ 5’-AAGGGCCAGCTCATTCCTCC-3’ 65 °C CreERT2 5’-GGTTCTCCGTTTGCACTCAGGA-3’ 5’-CTGCATGCACGGGACAGCTCT-3’ 5’-GCTTGCAGGTACAGGAGGTAGT-3’ 63 °C NrxnCTF 5’-GTACAAGTACAGAAACCGGG-3 5’-CACACCACAGAAGTAAGGTTCC-3’ 58 °C Actina 5’-GCTGGAAACGATCACATACCG-3’ 5’-AGCTCCTGATGATCCAATGG-3’ 58 °C hAPP751SL 5´-GGCTGAGGAACCCTACGAAGA-3’ 5´-CAAAGTACCAGCGGGAGATCA-3’ 60 °C Tabla 4. Secuencia de las parejas de oligonucleótidos empleadas para el genotipado de los ratones 39 III Materiales y métodos 4 Técnicas bioquímicas para el análisis de proteínas 4.1 Obtención de tejido para la realización de lisados Los animales se sacrificaron mediante dislocación cervical y posteriormente se decapitaron. Tras separar la calota craneal, el cerebro se extrajo empleando una espátula de microcirugía. El cerebro completo se pasó a una placa de 6 cm de diámetro (JetBiofil) con PBS. Bajo la lupa y manteniendo la placa sobre hielo para evitar la degradación del tejido, se localizaron y diseccionaron las estructuras cerebrales de interés empleando unas pinzas de punta fina Dumont #5 (Fine Scientific Tools). El tejido diseccionado se congeló en nitrógeno líquido en tubos de microcentrífuga de 1.5 ml (Eppendorf). 4.2 Extracción de proteínas a partir de tejido. La extracción de proteínas se realizó empleando tampón de lisis (Tris-HCl 50 mM pH 7.4, NaCl 100 mM, MgCl2 5 mM, 1% Tritón X-100, 0.1% SDS) suplementado con un cóctel de inhibidores de proteasas (Complete Mini EDTA-free tablets, Roche). El volumen de tampón de lisis utilizado en la extracción dependió de la estructura cerebral a lisar. Empleando un pistilo de plástico con forma cónica acoplado a un homogenizador portátil a motor (VWR), se realizó una primera disgregación mecánica del tejido. A continuación, se realizó una segunda disgregación mecánica mediante 10 pases por una jeringa de 27G (BD). Tras 10 minutos en hielo, se realizó una centrifugación a 13.000 rpm durante 10 minutos a 4 °C en una centrífuga de mesa para descartar los restos insolubles y se apartó el sobrenadante conteniendo la parte de proteínas solubles. Todo el proceso se realiza en hielo. Los lisados se separaron en alícuotas de trabajo y se conservaron a -80 °C hasta su utilización. 4.3 Extracción de proteínas a partir de cultivos celulares. Partiendo de las células sembradas en pocillos se lavó con PBS frío. Tras eliminar el PBS se añadieron 100 µl a cada pocillo de tampón de lisis (Tris-HCl 50 mM pH 7.4, NaCl 100 mM, MgCl2 5 mM, 1% Tritón X-100, 0.1% SDS) suplementado con un cóctel de inhibidores de proteasas. Tras una incubación durante 10 minutos sobre hielo, las 40 III Materiales y métodos muestras se disgregaron mecánicamente mediante 10 pases por una jeringa de 27 G. Tras 10 minutos en hielo, se realizó una centrifugación a 13.000 rpm durante 10 minutos a 4 °C en una centrífuga de mesa para descartar los restos insolubles y se apartó el sobrenadante conteniendo la parte de proteínas solubles. Todo el proceso se realiza en hielo. Los lisados se separaron en alícuotas de trabajo y se conservaron a -80 °C hasta su utilización. 4.4 Electroforesis en geles SDS-poliacrilamida y transferencia de proteínas. Se cuantificó la cantidad de proteínas totales presentes en las muestras empleando el kit BCA (Thermo Fisher Scientific) y siguiendo las recomendaciones del fabricante. Las muestras se diluyeron para obtener la cantidad total de proteínas a cargar en tampón de carga (Tris-HCl 180 mM pH 6.8, 2% SDS, 10% glicerol, 0.005% azul de bromofenol, 4% βmercaptoetanol). Las muestras se calentaron durante 5 minutos a 95 °C para favorecer la desnaturalización de las proteínas. Los geles de SDS-Bis-acrilamida empleados para la separación de las proteínas se prepararon empleando cristales un grosor de 1.5 mm (BioRad) y peines de 10 o 15 carriles (BioRad). Se utilizó una mezcla de acrilamida:bis-acrilamida 37.5:1 (BioRad). Los geles de separación constan de dos fases, una superior al 4% de acrilamida (solución apiladora) y una inferior al 8-13.5% de acrilamida en función del peso molecular de la proteína a analizar (solución separadora). La electroforesis se realizó empleando el sistema mini- Protean (BioRad) con tampón Tris-Glicina-SDS (tris 25 mM, glicina 192 mM, 0.1% SDS). Las muestras en tampón de carga y el marcador de peso molecular pre-teñido (bioBlu, gTPbio) se cargaron en los pocillos del gel y se separaron aplicando corriente constante de 100 V. Una vez separadas, las proteínas se transfirieron a una membrana de PVDF de 0.45 µm (Millipore) previamente activada sumergiéndola en metanol 100%. Esta transferencia se realizó en el sistema de transferencia húmeda mini-Trans-Blot (BioRad) en tampón de transferencia (Tris 25 mM, glicina 192 mM, 20% metanol) aplicando una corriente de 300 mA constantes durante 90 minutos. 41 III Materiales y métodos 4.5 Inmunodetección de proteínas Para bloquear las uniones inespecíficas, se incubó la membrana durante 1 hora a temperatura ambiente en 5% leche desnatada deshidratada disuelta en tampón Tris Salino-Tween (TBS-T) (NaCl 137 mM, Tris 20 mM, 1% Tween pH 7.4). A continuación, se incubó la membrana con el anticuerpo primario correspondiente diluido en 2.5% leche desnatada deshidratada disuelta en TBS-T (ver apartado 7 de Materiales y Métodos). La incubación se realizó durante 1 hora a temperatura ambiente o bien durante 16 horas a 4 °C en agitación continua. Tras la realización de 3 lavados en agitación de 10 minutos de duración con TBS-T, la membrana se incubó con el anticuerpo secundario conjugado con la enzima peroxidasa HRP (Jackson Immunoresearch) diluido 1:5000 en solución de bloqueo durante 1 hora a temperatura ambiente (ver apartado 7 de Materiales y Métodos para la información de los anticuerpos secundarios). A continuación, se realizaron 3 lavados en agitación de 10 minutos de duración con TBS-T. 4.6 Revelado, toma de imágenes y cuantificación. La membrana se incubó con los reactivos reveladores Clarity o Clarity Max (BioRad) durante 1-2 minutos y se detectó la quimioluminiscencia emitida empleando el transiluminador Chemidoc Touch (BioRad). Se tomaron imágenes digitales acumuladas cada 2-5 segundos hasta la saturación de la señal. Para la cuantificación de las imágenes se empleó el software Quantity-One (BioRad). Se seleccionaron 4 imágenes no saturadas con tiempos de exposición en incremento y se trazaron rectángulos sobre las bandas a cuantificar, además de un área igual trazada sobre una región de señal inespecífica. Se cuantificó la suma de la intensidad de los píxeles dentro de cada área restándole el fondo de señal inespecífica. Este proceso se repitió en las distintas imágenes seleccionadas, clonando las áreas a cuantificar. Para la cuantificación se tomó el valor promedio de cada banda en las imágenes seleccionadas. 42 III Materiales y métodos 5 Técnicas para el análisis histológico 5.1 Análisis de proteínas en tejido cerebral 5.1.1 Perfusión transcardíaca, fijación y corte del tejido Los animales se anestesiaron mediante una inyección intraperitoneal con Tiobarbital (Braun) a una dosis letal. Tras comprobar un profundo nivel de sedación por la ausencia de reflejos al dolor en patas y cola, se realizó una perfusión transcardíaca con PBS frío empleando una bomba de perfusión a velocidad constante durante 5 minutos. A continuación, se extrajo el cerebro y se post-fijó sumergiéndolo en una solución de parafolmaldehído (Sigma) al 4% en PBS, pH 7.4 durante 16 horas a 4°C. Una vez fijado, el cerebro se deshidrató mediante una inmersión en sacarosa al 30% en PBS durante 72 horas a 4°C. Se incluyó en OCT líquido (Tissue-Tek, VWR) y se congeló en nieve carbónica. Los bloques se preservaron a -80 °C hasta su procesamiento. Se realizaron cortes coronales de 20 µm de grosor empleando un criostato (Leica) y se preservaron en placas de 24 pocillos con 5-10 cortes por pocillo sumergidos en solución crioprotectora (30% etilenglicol, 30% glicerol en PBS) a -20 °C hasta su uso. 5.1.2 Inmunohistoquímica Las inmunohistoquímicas de esta tesis doctoral se realizaron siguiendo el método free-floating, empleando 5 cortes de cerebro por pocillo en placas de 12 o 24 pocillos. Tras tres lavados de 5 minutos de duración con PBS para eliminar los restos de solución crioprotectora, se realizó un desenmascaramiento de antígeno empleando una solución de citrato sódico 10 mM, pH 6 a punto de ebullición, tres tratamientos de 10 minutos de duración. Tras 3 lavados con PBS de 5 minutos de duración, se bloqueó la actividad de la peroxidasa endógena con una solución de 0.006% H2O2, en PBS durante 30 minutos a temperatura ambiente en agitación suave. Tras volver a realizar 3 lavados con PBS de 5 minutos de duración, se realizó la permeabilización y bloqueo del tejido en solución de bloqueo (0.3% tritón X-100, 5% suero de cabra en PBS) durante 1 hora a temperatura ambiente en agitación suave. Se prepararon los anticuerpos primarios (ver apartado 7 de Materiales y Métodos) en solución de bloqueo (0.1% Tritón X-100, 5% 43 III Materiales y métodos suero de cabra en PBS) y se incubaron los cortes a 4 °C durante 16 horas. A continuación, se realizaron 3 lavados de 10 minutos con PBS en agitación suave y los cortes se incubaron con el anticuerpo secundario biotinilado (ver apartado 7 de Materiales y Métodos) diluido en PBS 0.1% Tritón-X100 durante dos horas a temperatura ambiente en agitación suave. Tras 3 lavados de 10 minutos con PBS, los cortes se incubaron con avidina/biotina-HRP durante 1 hora a temperatura ambiente en agitación suave empleando el kit de tinción peroxidasa ABC (Vectastain). Tras 2 lavados de 10 minutos con PBS, se incubó con la solución reveladora conteniendo el sustrato diaminobenzidina (DAB) y potenciador de color de níquel (1% DAB, 0.05% sulfato amónico de níquel, 0.033% H2O2, en PBS). Se estableció un tiempo de revelado para cada anticuerpo en base a la relación fondo/señal específica empleando cortes que no fueron incubados con anticuerpo primario como control negativo. Los cortes una vez revelados se montaron en portaobjetos superfrost (Menzer-Glazer) y, una vez secos, se deshidrataron siguiendo una cadena de etanol de concentración creciente (50% - 100%) y xilol. Se montó un cubreobjetos empleando medio de montaje DPX (Merck). 5.1.3 Toma de imágenes y cuantificación La adquisición de imágenes de las inmunohistoquímicas de tejido cerebral se realizó empleando el microscopio Thunder (Leica). Utilizando la pletina automatizada del microscopio, se realizó un escaneo completo de 4 portaobjetos utilizando el objetivo 5x para localizar los cortes. Una vez localizados, se tomaron las imágenes de cada corte completo empleando el objetivo 20x y las condiciones de iluminación óptimas para maximizar el contraste entre fondo y señal específica para cada marcador. Se obtuvieron entre 15 y 20 imágenes por corte que se combinaron en una super-imagen compuesta utilizando el software de Leica. Las imágenes se enfocaron de manera automática estableciendo 4-6 puntos de foco por corte. La cuantificación de los diferentes marcadores se realizó en el programa libre ImageJ (NIH). Para el grosor de corteza se midió la distancia en micras (µm) entre la capa II/III y el cuerpo calloso. Se seleccionó una región con un grosor constante situado sobre el hipocampo. La cuantificación de densidad de células NeuN positivas se realizó mediante 44 III Materiales y métodos un conteo manual sobre un área determinada en la misma región donde se cuantificó el grosor de corteza. La cuantificación de los marcadores GFAP e Iba1 se realizó estableciendo un umbral para transformar las imágenes en binario. El umbral se estableció para que la región positiva coincidiera con la señal específica y se eliminara el fondo de cada imagen. Se dibujó un área determinada y se cuantificó el porcentaje de área ocupada por los marcadores. Para el marcador Iba1 también se realizó un conteo manual de las células Iba1+ dentro de la misma área. En la cuantificación de las imágenes colaboraron Luna López Coleto, estudiante de máster, y Samuel López Rodríguez, antiguo miembro del laboratorio. 5.2 Tinción de Golgi-Cox 5.2.1 Procesamiento de las muestras La tinción mediante el método Golgi-Cox se realizó como ha sido descrita previamente (Glaser et al., 1981; Marco et al., 2013). Todos los pasos de incubación se realizaron en condiciones de oscuridad y a temperatura ambiente. La solución Golgi-Cox (1% K2Cr2O7, 1% HgCl2, 0.8% K₂CrO₄) se preparó 5 días antes de su uso para descartar los precipitados iniciales. Los animales se anestesiaron mediante una inyección intraperitoneal de Tiobarbital (Braun) a dosis letal. Tras comprobar una profunda sedación, los animales se decapitaron y se extrajo el cerebro completo. El cerebro, separado en dos hemisferios, se sumergió en la solución Golgi-Cox durante 48 horas, tras las cuales la solución se renovó. Tras una incubación de 3 semanas, se realizaron 3 lavados de 2 minutos de duración con agua destilada y 1 incubación con 90% etanol durante 30 minutos. A continuación, los cerebros se sumergieron en 70% etanol y, empleando un vibratomo (Leica), se seccionaron obteniendo cortes coronales de 200 µm de grosor. Los cortes se lavaron con agua destilada y se incubaron con una solución de NH3 al 15% durante 1 hora para reducir la solución Golgi-Cox. Tras un lavado con agua destilada, los cortes se incubaron con 1% Na2S2O3 durante 7 minutos para la fijación de la tinción. Las secciones cerebrales se montaron sobre portaobjetos superfrost (Menzer-Glazer) y se deshidrataron siguiendo una cadena de etanol de concentración creciente (50% - 100%) y xilol. Se montó un cubreobjetos empleando medio de montaje DPX (Merck). 45 III Materiales y métodos 5.2.2 Toma de imágenes y cuantificación de la densidad de espinas dendríticas Para la toma de imágenes se empleó el microscopio de campo claro BX-61 (Olympus). Tras localizar la región CA1 del hipocampo empleando el objetivo 5x, se localizó una neurona relativamente aislada utilizando el objetivo 20x. Con el objetivo 100x se adquirieron imágenes en varios planos en el eje Z con una separación entre ellos de 0.5 µm (entre 20-30 imágenes por neurona). Se adquirió el árbol dendrítico completo teniendo en cuenta que las dendritas secundarias quedaran enfocadas. Para la cuantificación de la densidad de espinas dendríticas se empleó el programa libre ImageJ (NIH). Se midió la distancia en micras (µm) de los segmentos dendríticos secundarios con una longitud mínima de 10 µm como criterio de inclusión. A continuación, se realizó un contaje manual de las espinas dendríticas localizadas sobre este segmento dendrítico. A partir de estos datos se calculó la densidad de espinas dendríticas para cada segmento dendrítico y el promedio de la densidad de espinas dendríticas para cada neurona. 6 Experimentos de comportamiento en ratones 6.1 Condiciones generales para la realización de comportamiento en ratones Los animales se estabularon en la zona donde se les realizaría el comportamiento 5 días previos al comienzo de los experimentos para favorecer el aclimatamiento de los mismos a las salas. Para disminuir el estrés derivado del propio manejo de los animales, el experimentador que realizó los test manipuló los ratones en la sala donde se realizará el test de comportamiento durante 2 días en sesiones de 5 minutos por animal los días previos a la realización del test. Tanto durante la realización de los test como durante el manejo inicial de los animales, se evitó el uso de perfume y que se generaran ruidos que pudieran alterar el comportamiento de los animales y, por tanto, los resultados obtenidos. Los animales se trasladaron a la sala donde se realizó el test con un mínimo de 20 minutos antes del inicio de las pruebas de comportamiento. Estas pruebas se realizaron en la fase de luz y en la franja horaria entre las 09:00 y las 17:00. Entre los distintos animales evaluados en el mismo día, los distintos aparatos se limpiaron con un detergente inodoro diluido, Derquim (PanReac). Durante la realización del test y la 46 III Materiales y métodos extracción de los datos se desconocía el genotipo de los animales. A la realización de algunos de los experimentos colaboraron Ana Carmen Sánchez Hidalgo y Celia Martín Cuevas, antiguos miembros del grupo de investigación. 6.2 Análisis SHIRPA Para una evaluación inicial del estado general de los animales previa a la realización de los experimentos de comportamiento se realizó la batería de test primarios SHIRPA (SmithKline Beecham, Harwell, Imperial College and Royal London Hospital phenotype assessment) (Rogers et al., 1997) recogidos en la tabla 5. Reflejo analizado Realización Observación Posición corporal y actividades espontaneas Observación del animal en la batea Temblores, espasmos o saltos Reflejo de enderezamiento Colocación del animal en decúbito supino Capacidad para corregir la postura y apoyarse sobre las patas Reflejo postural Suspensión del animal sujeto por la cola y colocación sobre la esquina de la batea Capacidad de tratar de girarse sobre sí mismo Reflejos faciales Estimulación táctil suave sobre el pabellón auditivo, vibrisas y párpados Capacidad de retirada del pabellón auditivo y vibrisas o cierre del párpado Fuerza en extremidades Colocación en decúbito supino sobre una reja Capacidad de mantenerse agarrado durante un minuto Visión Suspendido de la cola se aproxima al animal a una superficie Extensión de las extremidades delanteras hacia la superficie Reflejo auditivo Se genera un ruido seco y fuerte Sobresalto producido como reacción al ruido Tabla 5. Pruebas empleadas para la evaluación de la batería SHIRPA. 6.3 Evaluación locomotora La prueba de campo abierto se realizó en una arena cuadrada de metacrilato gris de 45 x 45 cm con paredes opacas (Harvar Apparatus). Se permitió al ratón la libre exploración de la arena durante 15 minutos, tiempo durante el cual sus movimientos se grabaron desde un plano cenital con una cámara (PanLab). Empleando el programa Smart (PanLab) se detectó automáticamente el animal y sus movimientos, calculando así la distancia total recorrida y el número de entradas al centro de la arena delimitado como un área de 25 x 25 cm (Figura 11). 47 III Materiales y métodos Figura 11. Test de campo abierto. A la izquierda, una representación ilustrada de cómo se graba desde el plano cenital el test. A la derecha, los datos de trayectoria obtenidos con el programa Smart. En rojo, la trayectoria del animal; en azul, el límite de la periferia y en verde el límite del centro de la arena. Ilustración realizada con Biorrender.com. 6.4 Evaluación de estereotipias Se colocó al ratón en el centro de una batea limpia durante 10 minutos para su habituación. Durante los siguientes 10 minutos se grabó el comportamiento del animal desde una vista frontal (Figura 12). Se cuantificó manualmente el tiempo de acicalamiento realizado durante los 10 minutos. Un evento de acicalamiento se consideró como cualquier secuencia de movimientos realizada con las extremidades superiores, inferiores o boca para limpiar su propio cuerpo y pelaje. Figura 12. Test de acicalamiento. Representación ilustrada del test realizada con Biorender.com. 6.5 Evaluación de preferencia social La prueba para evaluar la preferencia social se realizó en una arena de metacrilato transparente de 60 x 42 cm de superficie con 3 estancias (una central y dos laterales de 20 x 42 cm cada una) conectadas entre sí mediante unas compuertas deslizantes (Harvard Apparatus) (Figura 13). La prueba se realizó como ha sido descrita previamente (Silverman et al., 2010) y consta de 3 etapas de 10 minutos de duración cada una: I) Pre-habituación. El animal se colocó en la estancia central con las compuertas que comunican con las estancias laterales cerradas. II) Habituación. Se abrieron las compuertas laterales y se dejó explorar las tres estancias libremente. En las estancias laterales se colocó una jaula cilíndrica vacía (8 cm de diámetro). IV. RESULTADOS 55 1 Interacción Neurexinas-Neuroliguinas Las Nlgns tienen una expresión postsináptica diferencial. Nlgn1 se localiza en terminales glutamatérgicos y Nlgn2 en terminales GABAérgicos, mientras que Nlgn3 puede localizar en ambos tipos de terminales (Ali et al., 2020; Budreck & Scheiffele, 2007; Poulopoulos et al., 2009; Song et al., 1999). Además, aproximaciones in vitro han mostrado que la interacción entre isoformas de Nrxns y Nlgns está regulada por splicing alternativo. La inserción del splicing B en Nlgn1 limita su interacción con isoformas de βNrxns que carecen del sito SP4 (Boucard et al., 2005; Miller et al., 2011). Por otra parte, Nlgn2 carece naturalmente del sitio B de splicing, por lo que podría interaccionar con α- y βNrxns (Chih et al., 2006; Koehnke et al., 2010). Estos datos han servido para apoyar la existencia de un código sináptico mediado por Nrxns y Nlgns en contactos glutamatérgicos y GABAérgicos (Chih et al., 2006). Sin embargo, estos resultados se han obtenido mediante ensayos de interacción realizados in vitro con los ectodominios solubles de Nrxns y/o Nlgns expresados por células no neuronales. Cabe destacar que la interacción trans-sináptica de Nrxns y Nlgns podría modificarse en un contexto neuronal por mecanismos post-traduccionales y la presencia de otras proteínas que regulen al alza o a la baja dichas interacciones (Dai et al., 2022; Pettem, Yokomaku, Takahashi, et al., 2013; Singh et al., 2016). Por todo ello, es fundamental estudiar la interacción transsináptica de Nrxns y Nlgns en un contexto neuronal. Existen dos limitaciones importantes que han impedido estudiar la interacción de isoformas de Nrxns y Nlgns en contactos sinápticos. Una, es la falta de anticuerpos específicos para las distintas isoformas de Nrxns. La segunda, es la ausencia de aproximaciones que permitan expresar pares concretos de Nrxns y de Nlgns presentadas en membranas opuestas. Para abordar estas limitaciones, decidimos desarrollar un abordaje que nos permitiera expresar e identificar en neuronas isoformas concretas de Nrxn1, para, posteriormente, poder analizar su reclutamiento a contactos sinápticos inducidos por isoformas de Nlgns expresadas en la membrana opuesta. 56 Resultados IV 1.1 Marcaje de isoformas de α- y β-Nrxn1 mediante la inserción de un epítopo Flag Mediante el método de overlap extensión-PCR insertamos la secuencia del epítopo Flag en el domino citoplásmico de cuatro isoformas de splicing de Nrxn1: αNrxn1SP4, αNrxn1Δ4, βNrxn1SP4 y βNrxn1Δ4. La inserción de la etiqueta Flag se llevó a cabo en fase entre la Asparagina 420 y la Glicina 421 (número de aminoácidos correspondientes a la secuencia de βNrxn1), 28 aminoácidos después del dominio transmembrana. Estas isoformas de Nrxn1 estaban marcadas previamente en el extremo N-terminal con la etiqueta HA. Dado que el extremo N-terminal de las diferentes isoformas de Nrxns es altamente polimórfico y participa en las interacciones con ligandos postsinápticos, razonamos que el marcaje del dominio citoplásmico común de Nrxns permitiría analizar la distribución de distintas isoformas de Nrxn1 de una forma más directamente comparable Tras comprobar mediante secuenciación la correcta inserción en fase de la secuencia de ADN correspondiente a la etiqueta Flag, decidimos analizar si dicha inserción interfería de algún modo con la expresión de las proteínas marcadas. Para ello, se transfectaron células HEK 293T con vectores de expresión para HA-αNrxn1Δ4 y βNrxn1Δ4 marcados con y sin la etiqueta Flag y la expresión se analizó por Western-blot (Figura 17). El anticuerpo anti-HA detectó la expresión HA-αNrxn1Δ4 como un doblete de bandas sobre 180 KDa, correspondientes al peso molecular de la proteína sin glicosilar, y bandas de mayor peso molecular, correspondientes con la proteína αNrxn1Δ4 glicosilada. En los lisados de células transfectadas con HA-βNrxn1Δ4., el anticuerpo HA detectó una banda mayoritaria a la altura de 50 KDa correspondiente al peso del núcleo proteico sin glicosilar, junto con bandas de mayor tamaño generadas por glicosilación (Figura 17). El patrón de expresión reconocido por el anticuerpo HA no se afectó por la inserción del epítopo Flag en HA-αNrxn1Δ4 y en HA-βNrxn1Δ4 (Figura 17). La menor movilidad electroforética de las distintas bandas de HA-βNrxn1Δ4-Flag se debe a la inserción de la secuencia de 8 aminoácidos que codifican para Flag. Además, un anticuerpo contra Flag detectó de forma específica las proteínas HA-αNrxn1Δ4-Flag y HA-βNrxn1Δ4-Flag, pero no las mismas isoformas que carecían del epítopo (Figura 17). Estos datos indican que el 57 IV Resultados marcaje del dominio citoplásmico de Nrxn1 mediante la inserción de un epítopo Flag no afecta el patrón ni los niveles de expresión de las isoformas que lo contienen. Una vez validada la aproximación para el marcaje, generamos mediante abordajes de biología molecular vectores lentivirales para la expresión de las isoformas de HA- αNrxn1-Flag y HA-βNrxn1-Flag, sin y con el sitio de splicing alternativo 4 (Figura 18). A continuación, generamos los correspondientes lentivirus recombinantes para cada una de las 4 isoformas de HA-Nrxn1-Flag y se infectaron cultivos de neuronas. Una ventaja de nuestros sistemas lentivirales es que emplean al promotor neuronal de sinapsina, dirigiendo, por tanto, la expresión de la proteína exógena específicamente a las neuronas del cultivo (Gascón et al., 2008). La expresión de las isoformas de Nrxn1 se analizó mediante Western-blot con un anticuerpo anti Flag. En lisados infectados con αNrxn1Δ4 y αNrxn1SP4 el anticuerpo anti-Flag detecto bandas en torno a los 180 KDa, junto con una serie de bandas de menor movilidad electroforética correspondientes con proteínas glicosiladas (Figura 18). En los lisados infectados con βNrxn1Δ4 y βNrxn1SP4, se detectó una banda mayoritaria a la altura de 50 KDa, además de bandas adicionales de proteínas glicosiladas en el rango de 70 -100 KDa. Se pudo apreciar un ligero incremento en el peso molecular de las isoformas que contienen el SP4 debido a la inserción de 37 aminoácidos, más evidente en el caso de βNrxn1 por la resolución de los geles (Figura 18). Figura 17. Expresión de α y βNrxn1 en células HEK 293T marcadas con epítopos en los dominios extra e intracelular. Arriba, esquema representativo de las isoformas α- y βNrxn1. Se muestra la localización de las etiquetas HA y Flag. SP: péptido señal; LNS: dominio Laminina/ Neurexina/ Globulina de unión a hormona sexual; EGF: factor de crecimiento epidermal; O-glyc: sitios de O-glicosilación; TM: dominio transmembrana. Abajo, Western blot de células HEK 293T transfectadas con α- y βNrxn1 con y sin la etiqueta Flag (Flag- Tag) junto a células sin transfectar (Ø). A la izquierda, se empleó el anticuerpo anti-HA; a la derecha, se empleó el anticuerpo anti-Flag. 58 Resultados IV Cabe destacar la baja expresión relativa de αNrxn1 respecto a βNrxn1, presumiblemente debido al mayor tamaño de los vectores lentivirales de αNrxn1, que pudo reducir el título viral. En resumen, la generación de vectores lentivirales que codifican para α- y βNrxn1 marcadas con un epítopo, nos permiten dirigir la expresión en neuronas de isoformas de splicing concretas e identificar su distribución con anticuerpos específicos. 1.2 Interacción diferencial de isoformas de Neurexinas con isoformas de Neuroliguinas en experimentos de co-cultivo Mediante aproximaciones in vitro, el grupo de Thomas Südhof ha reportado que la presencia del sitio B de splicing en Nlgn1 le confiere una interacción preferente con isoformas de βNrxnsΔ4, mientras que isoformas de Nlgn1 que carecen del sitio B pueden interaccionar con isoformas de α- y βNrxn (Boucard et al., 2005; Chih et al., 2006). Para profundizar cómo la presencia o ausencia de SP4 en Nrxns modula la interacción transsináptica con Nlgns nos valimos de la capacidad de Nlgns de disparar el reclutamiento axonal de Nrxns y la inducción de terminales presinápticos en los axones que contactan a la célula transfectada (Dean et al., 2003; Scheiffele et al., 2000). En primer lugar, se infectaron cultivos de corteza con lentivirus recombinantes que codifican para αNrxn1SP4, αNrxn1Δ4, βNrxn1SP4 y βNrxn1Δ4, todas las isoformas marcadas con un Figura 18. Expresión de distintas isoformas de Nrxn en neuronas corticales de rata. Arriba, esquema representativo de las isoformas α y βNrxn. Se muestra la localización de las etiquetas HA y Flag además del sitio de splicing 4. SP: péptido señal; LNS: dominio Laminina/Neurexina/Globulina de unión a hormona sexual; EGF: factor de crecimiento epidermal; SP4: Sitio de splicing 4; O-glyc: sitios de O- glicosilación; TM: dominio transmembrana. Abajo, Western blot de neuronas corticales 13 días in vitro infectadas con lentivirus para la expresión de las diferentes isoformas de Nrxns. Detección de las proteínas empleando el anticuerpo anti-Flag. 59 IV Resultados epítopo Flag. El título viral de cada una de las construcciones se ajustó para producir la expresión de las distintas isoformas a niveles comparables. Tras 12-13 días de infección, cada uno de los cultivos se co-cultivaron con células HEK 293T previamente transfectadas con VSV-Nlgn1 (A,B) o con VSV-Nlgn2 (A). Como control negativo de reclutamiento se empleó células HEK 293T transfectadas con GFP. Los cultivos de neuronas se fijaron 24 horas después de establecer el co-cultivo. De esta manera, podemos estudiar el reclutamiento de las isoformas de Nrxn1 a los axones que contactan a células HEK 293T que expresan Nlgn1 o Nlgn2 en su membrana mediante anticuerpos anti Flag y anti VSVS, respectivamente. Las imágenes de inmunofluorescencia mostraron un bajo reclutamiento de αNrxn1Δ4 y αNrxn1SP4 a los contactos sinápticos inducidos por Nlgn1 en las células HEK 293T, como se puede observar al comparar los niveles de expresión con las zonas de no contacto en el mismo campo (Figura 19). Sin embargo, se observó un reclutamiento evidente de αNrxn1Δ4 y αNrxn1SP4 a los contactos sinápticos mediados por Nlgn2 (Figura 19). Los niveles de expresión de Nlgn1 y Nlgn2 fueron comparables entre los dos tipos de experimentos. El análisis cuantitativo mostró un reclutamiento preferente de αNrxn1 por Nlgn2. La inserción de SP4 redujo el reclutamiento de αNrxn1 inducido por Nlgn2. Figura 19. Reclutamiento preferente de isoformas de αNrxn1 por Nlgn2. Nlgn1 y Nlgn2 expresadas en las células HEK 293T inducen el reclutamiento de Nrxns. Se muestran proyecciones máximas de confocal. Cultivos neuronales infectados durante 13 días in vitro para expresar HA-αNrxn1Δ4-Flag (izquierda) y HA-αNrxn1SP4-Flag (derecha)(rojo). Células HEK 293T transfectadas con VSV-Nlgn1, VSV-Nlgn2 o GFP (verde). Se emplearon los anticuerpos anti-VSV y anti- Flag. GFP se detectó por la autofluorescencia. Se muestra la cuantificación de la intensidad media de αNrxn1 en la zona de contacto con las células HEK 293T normalizada con la expresión en zonas vecinas sin contacto. ANOVA de una vía con post-hoc Tukey. * p<0.05, *** p<0.001, **** p<0.0001. Las barras de error representan la SEM. 60 Resultados IV Al contrario de los resultados obtenidos con las isoformas de αNrxn1, Nlgn1 produjo un robusto reclutamiento de βNrxn1Δ4 en los terminales presinápticos (Figura 20). La inserción de SP4 redujo los niveles de βNrxn1 reclutada en los sitios de contacto con Nlgn1. De forma similar, encontramos que Nlgn2 reclutó a βNrxn1Δ4 a unos niveles igualmente altos que los obtenidos por Nlgn1. La inserción del SP4 redujo el reclutamiento de βNrxn1Δ4 a los contactos sinápticos mediados por Nlgn1 y Nlgn2. En conjunto, estos datos indican que las isoformas de βNrxn1 son receptores presinápticos tanto para Nlgn1 como para Nlgn2, mientras que las isoformas de αNrxn1 son receptores presinápticos para Nlgn2, pero no para Nlgn1. La inserción de SP4 modula a la baja el reclutamiento de α- y βNrxn1. 1.3 Interacción diferencial de isoformas de Neurexinas con isoformas de Neuroliguinas en un contexto neuronal. Los experimentos de co-cultivo anteriores indicaron que Nlgn1 en el terminal postsináptico glutamatérgico se une específicamente con βNrxn1, pero no con αNrxn1, en el terminal presináptico. Para obtener evidencias adicionales, desarrollamos un protocolo que nos permitió analizar la interacción de isoformas de Nrxns y Nlgns entre neuronas pre- y postsinápticas. Figura 20. Reclutamiento de isoformas de βNrxn1 por Nlgn1 y Nlgn2. Nlgn1 y Nlgn2 en las células HEK 293T inducen el reclutamiento de Nrxns. Se muestran proyecciones máximas de confocal. Cultivos neuronales infectados durante 13 días in vitro para expresar HA-βNrxn1Δ4-Flag (izquierda) y HA-βNrxn1SP4-Flag (derecha)(rojo). Células HEK 293T transfectadas con VSV-Nlgn1, VSV-Nlgn2 o GFP (verde). Se emplearon los anticuerpos anti-VSV y anti-Flag. GFP se detectó por la autofluorescencia. Se muestra la cuantificación de la intensidad media de βNrxn1 en la zona de contacto con células HEK 293T normalizada con la expresión en zonas vecinas sin contacto. ANOVA de una vía con post-hoc Tukey. * p<0.05, *** p<0.001, **** p<0.0001. Las barras de error representan la SEM. 61 IV Resultados En estos experimentos se infectaron cultivos de neuronas corticales con lentivirus de αNrxn1SP4, αNrxn1Δ4, βNrxn1SP4 y βNrxn1Δ4. Tras 13 días in vitro, los cultivos se transfectaron con VSV-Nlgn1. Debido a la baja eficiencia de transfección de los cultivos neuronales, se consiguió la expresión de VSV-Nlgn1 en neuronas individualizadas que, a su vez, se encontraban rodeadas de neuronas que expresan las isoformas de Nrxn1 por la alta eficiencia de la transducción lentiviral. La expresión de Nlgn1 y de las isoformas de Nrxn1 se analizaron en experimentos de inmunofluorescencia empleando los anticuerpos anti-VSV y anti-Flag, respectivamente. Además, los cultivos se tiñeron en paralelo con anticuerpos contra sinapsina para identificar los contactos presinápticos. Las imágenes de confocal mostraron que Nlgn1 expresada en dendritas no indujo el reclutamiento de αNrxn1SP4 ni de αNrxn1Δ4 a los contactos presinápticos (Figura 21). Sin embargo, Nlgn1 sí incrementó la densidad de contactos presinápticos, como era de esperar (Dean et al., 2003). Por el contrario, βNrxn1SP4 y βNrxn1Δ4 sí se reclutaron a los terminales presinápticos que contactaban a las dendritas transfectadas con Nlgn1 (Figura 21). La cuantificación de estos experimentos mostró un incremento en el reclutamiento de βNrxn1Δ4 de hasta cuatro veces sobre la expresión basal. El reclutamiento de βNrxn1SP4, siendo evidente, fue de una magnitud ligeramente menor, en consonancia con un efecto modulador negativo de SP4 (Figura 21). Además, la cuantificación demostró que la densidad los puncta de sinapsina inducidos por la transfección de Nlgn1 se vieron incrementados aún más con la expresión de βNrxn1Δ4. De igual forma, la longitud y densidad de las espinas dendríticas inducidas por Nlgn1 parecían haberse incrementado con la expresión de βNrxn1Δ4, aunque este efecto no se cuantificó. Estos datos indican que la interacción de βNrxn1Δ4 con Nlgn1 tiene un papel funcional promoviendo la diferenciación sináptica glutamatérgica. Estos resultados indican que Nlgn1 en el terminal postsináptico glutamatérgico recluta a βNrxn1 a los terminales presinápticos que contactan. La inserción de SP4 en βNrxn1 reduce, pero no bloquea, la interacción con Nlng1. Por el contrario, αNrxn1 se encuentra ausente en los terminales presinápticos glutamatérgicos que contactan con Nlgn1. Sin embargo, Nlgn2 en el terminal postsináptico GABAérgico puede reclutar tanto 62 Resultados IV a αNrxn1 como a βNrxn1. La interacción selectiva de Nlgn1 con βNrxn1 indica un papel preferente para estas isoformas de Nrxns en las sinapsis glutamatérgicas. Figura 21. Reclutamiento de Nrxns por Nlgn1 en sistemas neuronales. Nlgn1 en células neuronales induce el reclutamiento de Nrxns. Se muestran proyecciones máximas de confocal. Cultivos neuronales infectados durante 13 días in vitro para expresar HA- α- y βNrxn1-Flag con y sin el SP4 (rojo). Células neuronales transfectadas con VSV-Nlgn1 (verde). Detección del patrón de sinapsina endógeno (azul). Se emplearon los anticuerpos anti-VSV, anti-Flag y antisinapsina. Se muestra la cuantificación de la intensidad media de Nrxns en la zona de contacto con neuronas transfectadas con Nlgn1 normalizada con la expresión en zonas vecinas sin contacto. ANOVA de una vía con post-hoc Tukey. * p<0.05, ** p<0.01, *** p<0.001, **** p<0.0001. Las barras de error representan la SEM. 63 IV Resultados 2 Control temporal de la función de Presenilina, generación del modelo animal PScKOtemp El envejecimiento es el factor no genético más relevante en AD. Incluso en pacientes con mutaciones de pérdida de función causantes de AD en los genes PSEN1/2 los síntomas de la enfermedad aparecen tras décadas de vida (Kumar et al., 2022; Long & Holtzman, 2019). Sin embargo, se desconoce porqué los síntomas asociados a AD no aparecen hasta una edad relativamente avanzada. Existen dos posibilidades generales, la progresión de un mecanismo patogénico durante la primera etapa asintomática que antecede a la aparición de los síntomas; o la existencia de un momento del envejecimiento especialmente sensible a la falta de función de PS/γ-secretasa que explique la aparición de los síntomas. En la primera posibilidad, la aparición y progresión de síntomas y los mecanismos responsables ocurrirían de igual manera a cualquier edad que se produjera la pérdida de PS/γ-secretasa. En el segundo escenario, los mecanismos patogénicos responsables de la aparición y progresión de los síntomas asociados a AD dependerían de una determinada edad durante el envejecimiento. El abordaje experimental empleado previamente por otros grupos para el estudio de la pérdida de función de PS ha consistido en la generación un mutante condicional de pérdida de función de PS1 en neuronas glutamatérgicas del cerebro postnatal de ratones PS2 KO (Ratones PScKO: PS1f/f; PS2-/-; CAMKII-Cre) (Aoki et al., 2009; Beglopoulos et al., 2004; Saura et al., 2004; Watanabe et al., 2014; Wines-Samuelson et al., 2010). En los ratones PScKO, se han descrito defectos sinápticos y de memoria tempranos seguidos de una clara neurodegeneración, neuroinflamación e hiperfosforilación de Tau, recapitulando los principales defectos asociados a AD. Sin embargo, debido a que la pérdida de función de PS en los ratones PScKO ocurre en el primer mes postnatal (Saura et al., 2004), se desconoce el efecto que una pérdida de función de PS podría provocar en el cerebro envejecido. Hay datos que apuntan a que la pérdida de función de PS actúa de manera diferencial en función del momento del desarrollo en el que ocurra. Por ejemplo, la regulación de Notch y sus efectores difieren entre el cerebro embrionario y el adulto con respecto a su dependencia de la función de PS1 (Huakui Yu et al., 2001; W. Y. Kim & Shen, 2008). 70 Resultados IV área GFAP+ ± SEM) (Figura 26). Las cuantificaciones revelaron un incremento en la astrogliosis en animales PScKOyoung que se estabiliza a los 13 meses de edad. Por otro lado, en el hipocampo encontramos cierta dificultad a la hora de analizar la astrogliosis en los animales PScKOyoung debido a la propia abundancia relativa de astrocitos en esta área del cerebro en animales controles. Encontramos un incremento no significativo en el área teñida por GFAP en el hipocampo de los animales PScKOyoung de 7 meses de edad. Este incremento se vuelve significativo a la edad de 13 meses, siendo el área GFAP+ en los animales PScKOyoung el doble de la presente en los animales controles. A los 18 meses, los animales controles presentan un incremento del área teñida y no se observaron diferencias respecto a los PScKOyoung (7 meses, control: 16.23 ± 2.44, PScKOyoung: 20.67 ± 2.86; 13 meses, control: 12.76 ± 0.93, PScKOyoung: 20.86 ± 1.81; 18 meses, control: 20.11 ± 4.63, PScKOyoung: 24.83 ± 2.24. Unidades: porcentaje de área GFAP+ ± SEM) (Figura 27). Figura 26. Astrogliosis cortical en animales PScKOyoung. A la izquierda, imágenes representativas de secciones de corteza de animales PScKOyoung de 7, 13 y 18 meses teñidas con anti-GFAP. La barra de escala representa 200 µm, la línea discontinua delimita el cuerpo calloso. A la derecha, cuantificación del porcentaje de área teñida. N a 7 meses= 3 controles, 3 PScKOyoung; a 13 meses 5 controles, 5 PScKOyoung; a 18 meses 3 controles, 3 PScKOyoung; 4-5 cortes por animal. Análisis estadístico t-test. * p<0.05, *** p<0.001, **** p<0.0001. Las barras de error representan la SEM. 71 IV Resultados En otros estudios donde se analizó la población de células GFAP+ en animales PScKO, los autores encontraron un incremento progresivo del área teñida por GFAP en la corteza pasando de un 20% observado a los 4 meses a duplicarse a los 16 meses. Curiosamente, en Watanabe et al., 2004 también tuvieron dificultades a la hora de analizar el área teñida por GFAP en el hipocampo, debido a los altos niveles de GFAP en esta región cerebral en animales controles y a su elevada variabilidad. En animales PScKO observaron un incremento del área teñida por GFAP en el hipocampo del 14% a la edad de 4 meses que pasaba a un 38% a los 16 meses (Saura et al., 2004; Watanabe et al., 2014; Wines-Samuelson et al., 2010). 2.1.3.3 Microgliosis en animales PScKOyoung La proliferación y activación de la microglía en el cerebro es otra de las características principales en AD. Para estudiar la microglía empleamos cortes de cerebro Figura 27. Astrogliosis hipocampal en animales PScKOyoung. A la izquierda, imágenes representativas de secciones de hipocampo de animales PScKOyoung de 7, 13 y 18 meses teñidas con anti-GFAP. Se muestra un detalle de la región CA1 el hipocampo. La línea discontinua indica la capa piramidal. La barra de escala representa 200 µm. A la derecha, cuantificación del porcentaje de área teñida. N a 7 meses= 3 controles, 3 PScKOyoung; a 13 meses 5 controles, 5 PScKOyoung; a 18 meses 3 controles, 3 PScKOyoung. 4-5 cortes por animal. Análisis estadístico t-test. ** p<0.01. Las barras de error representan la SEM. 72 Resultados IV de animales PScKOyoung de 7, 13 y 18 meses de edad. Se realizó una tinción empleando el anticuerpo anti-Iba1, marcador de microglía. Analizamos tanto el número de células Iba1+ como el porcentaje de área teñida. En la corteza de los animales PScKOyoung de 7 meses encontramos un incremento en el número de células Iba1+ tres veces superior al encontrado en la corteza de animales controles. Este incremento en densidad se mantuvo a los 13 y 18 meses (7 meses, control: 157.2 ± 14.90, PScKOyoung: 471.4 ± 29.11; 13 meses, control: 193.4 ± 11.47, PScKOyoung: 589.7 ± 46.83; 18 meses, control: 183.6 ± 7.57, PScKOyoung: 500.6 ± 28.34. Unidades: células Iba1+/mm2 ± SEM) (Figura 28). Por otro lado, en cuanto al porcentaje de área teñida por Iba1 encontramos un incremento de un 30% en los animales PScKOyoung de 7 meses, que aumentó al 50% a los 13 meses y progresó hasta observarse un área teñida por Iba1 2.3 veces superior en los animales PScKOyoung de 18 meses respecto a animales controles (7 meses, control: 13.39 ± 0.49, PScKOyoung: 19.87 ± 1.94; 13 meses, control: 13.20 ± 0.51, PScKOyoung: 20.51 ± 1.39; 18 meses, control: 11.24 ± 0.39, PScKOyoung: 24.96 ± 0.94. Unidades: porcentaje de área Iba1 ± SEM+) (Figura 28). Figura 28. Presencia de microglía cortical en animales PScKOyoung. A la izquierda, imágenes representativas de secciones de corteza de animales PScKOyoung de 7, 13 y 18 meses teñidas con anti- Iba1. La barra de escala representa 200 µm, la línea discontinua delimita el cuerpo calloso. A la derecha, cuantificación de la densidad microglial y el porcentaje de área teñida por anti-Iba1. N a 7 meses= 3 controles, 3 PScKOyoung; a 13 meses 5 controles, 5 PScKOyoung; a 18 meses 3 controles, 3 PScKOyoung; 4-5 cortes por animal. Análisis estadístico t-test. * p<0.05, ** p<0.01, *** p<0.001, **** p<0.0001. Las barras de error representan la SEM. 73 IV Resultados Cabe destacar que el incremento progresivo del porcentaje de área teñida por Iba1 vino acompañado de un notable cambio en la morfología de la microglía en los ratones PScKOyoung respecto a la de animales controles, observándose unos somas más gruesos y ramificaciones más cortas y gruesas, indicando una mayor activación de esta (Figura 28). A continuación, estudiamos la presencia de microglía en el hipocampo de animales PScKOyoung de 7, 13 y 18 meses, en concreto, se llevó a cabo una cuantificación en la región CA3 del hipocampo. En el análisis del número de células Iba1+ por mm2 encontramos un incremento de tres veces en los animales PScKOyoung respecto a animales controles. Este incremento en el número de células Iba1+ se mantuvo a los 13 y 18 meses. (7 meses, control: 139.5 ± 13.99, PScKOtemp: 449.2 ± 6.95; 13 meses, control: 200.6 ± 22.44, PScKOyoung: 567.0 ± 33.54; 18 meses, control: 142.5 ± 22.17, PScKOyoung: 488.6 ± 13.34. Unidades: células Iba1+/mm2 ± SEM) (Figura 29). Este incremento en la densidad de células Iba1+ vino acompañado del mismo cambio en la morfología que el observado en la región cortical (Figura 29). Figura 29. Presencia de microglía hipocampal en animales PScKOyoung. A la izquierda, imágenes representativas de secciones de hipocampo de animales PScKOyoung de 7, 13 y 18 meses teñidas con anti-Iba1. Se muestra la región CA3. La barra de escala representa 200 µm, la línea discontinua indica la capa piramidal. A la derecha, cuantificación de la densidad microglial. N a 7 meses= 3 controles, 3 PScKOyoung; a 13 meses 5 controles, 5 PScKOyoung; a 18 meses 3 controles, 3 PScKOyoung; 4-5 cortes por animal. Análisis estadístico t-test. * p<0.05, ** p<0.01, *** p<0.001, **** p<0.0001. Las barras de error representan la SEM. 74 Resultados IV Estos resultados del análisis de la microglía en la corteza e hipocampo de animales PScKOyoung son comparables a los obtenidos en estudios previos realizados en animales PScKO (Watanabe et al., 2014), donde los autores observaron un incremento en la densidad de células Iba1+ en animales PScKO de 4 y 3 veces en corteza e hipocampo, respectivamente, a la edad de 16 meses. En conjunto, la caracterización histológica realizada en los animales PScKOyoung indica que la inducción de la escisión de Psen1 en el primer mes de vida de los animales PScKOyoung reproduce los defectos observados en neurodegeneración, astrogliosis y microgliosis en animales PScKO por otros grupos (Saura et al., 2004; Watanabe et al., 2014; Wines-Samuelson et al., 2010) (Tabla 8). De esta manera, los resultados obtenidos Neurodegeneración cortical Edad (meses) PScKO PScKOyoung 6-7 35% de pérdida de volumen cortical 16% de reducción en el grosor de corteza 9-13 35% de pérdida de volumen cortical 38% de reducción en el grosor de corteza 16-18 50% de pérdida de volumen cortical 34% de reducción en el grosor de corteza Astrogliosis cortical (área GFAP+) Edad (meses) PScKO PScKOyoung 6-7 No datos cuantitativos Incremento de 1.7 veces 9-13 No datos cuantitativos Incremento de 2.8 veces 16-18 Incremento de 7 veces Incremento de 4.7 veces Microgliosis cortical (densidad de Iba1+) Edad (meses) PScKO PScKOyoung 6-7 No datos cuantitativos Incremento de 3 veces 9-13 No datos cuantitativos Incremento de 3 veces 16-18 Incremento de 5 veces Incremento de 2.7 veces Tabla 8. Comparación de los datos histológicos entre animales PScKO y PScKOyoung. Se describen los datos cuantitativos recopilados por otros grupos sobre la neurodegeneración, astrogliosis y microgliosis cortical en los animales PScKO en distintos rangos de edad. Se comparan con los datos obtenidos en los animales PScKOyoung. Datos de los PScKO obtenidos de Saura et al., 2004; Watanabe et al., 2014; Wines-Samuelson et al., 2010 75 IV Resultados durante el abordaje experimental empleado indica que podemos considerar validado funcionalmente el modelo animal PScKOtemp. 2.2 Análisis del fenotipo asociado con neurodegeneración causado por la pérdida de función de PS en el cerebro envejecido La caracterización del modelo PScKOyoung nos llevó a las siguientes observaciones: i) la escisión de Psen1 se puede regular con tamoxifeno, II) los fragmentos CTFs de diferentes sustratos de PS se acumulan ante la pérdida de función γ-secretasa y III) se produce una neurodegeneración, astrogliosis y microgliosis similares a las encontradas en los animales PScKO. Una vez validado el modelo experimental, decidimos provocar la pérdida de función de PS/γ-secretasa a distintas edades del envejecimiento: 7 meses (ratones PScKOadult) y 13 meses (ratones PScKOold). Para cada caso, el efecto de la pérdida de función de PS/γ-secretasa se planteó estudiar en segmentos de 6 meses tras la escisión, permitiendo así la comparación entre modelos. De esta forma, buscamos analizar si los efectos provocados por la pérdida de función de PS se ven alterados por la edad del cerebro donde ocurren. En la figura 30 se representa el esquema general de la aproximación empleada. Figura 30 Representación del esquema de tratamiento con tamoxifeno (Tmx). Se muestra el tratamiento con tamoxifeno a 1 mes en los animales PScKOtemp y las distintas edades a las que se ha realizado el estudio de neurodegeneración y marcadores asociados, detallado en los puntos anteriores de esta tesis doctoral. Abajo en verde, el esquema de tratamiento para conseguir la escisión de Psen1 en la edad adulta del animal con los dos puntos propuestos para su realización. 76 Resultados IV En un primer conjunto de experimentos planteamos estudiar los efectos en neurodegeneración, astrogliosis y microgliosis en animales con pérdida de función de PS en el cerebro envejecido. Las exigencias temporales de los modelos desarrollados, junto con las limitaciones de tiempo de la Tesis Doctoral, han hecho que en el momento de escritura de esta memoria solo se encontraran completados datos de ratones PScKOadult de 13 meses. Estos datos se presentarán a continuación y se compararán con los datos obtenidos en los ratones PscKOyoung de 7 meses, presentados en apartados previos. 2.2.1 Neurodegeneración en animales PScKOadult De forma similar al estudio realizado en animales PScKOyoung, analizamos la neurodegeneración en los animales PScKOadult mediante tinciones de cortes cerebrales empleando el anticuerpo anti-NeuN. Se realizaron mediciones de grosor de corteza desde la capa II a la capa VI y la cuantificación de la densidad de células NeuN+. Los ratones PScKOadult de 13 meses presentaron una reducción del grosor de la corteza del 20% respecto a animales controles (Control: 659.2 ± 29.46, PScKOadult: 531.1 ± 22.76. Unidades: µm ± SEM) (Figura 31). La reducción del grosor de corteza observada previamente en los animales PScKOyoung en el periodo de 1 a 7 meses fue del 16%. Sin embargo, la reducción del grosor de corteza en los animales PScKOyoung a los 13 meses fue del 38%, es decir, una reducción de 22% en el segmento de 7 a 13 meses. Por tanto, la reducción del grosor de corteza en los ratones PScKOadult fue ligeramente superior a la observada en los animales PScKOyoung tras el mismo tiempo de escisión de 6 meses Figura 31. Neurodegeneración en animales PScKOadult. Imágenes representativas de secciones de corteza de animales PScKOadult de 13 meses teñidas con NeuN. La barra de escala representa 200 µm, la línea discontinua delimita el final de la capa I y el inicio del cuerpo calloso. A la derecha, cuantificación del grosor de corteza y densidad de células NeuN+. N= 5 controles, 5 PScKOtemp-7m de 13 meses, 5 cortes por animal. 77 IV Resultados (PScKOyoung 16% vs PScKOadult 20%), pero más cercana a la reducción correspondiente al mismo tramo de edad (PScKOyoung 7-13 meses, 22% vs PScKOadult 7-13 meses, 20%). Si bien estos resultados son muy iniciales, podrían sugerir la existencia de edades durante el envejecimiento de mayor susceptibilidad a la pérdida de PS/γ-secretasa. Por otro lado, no se observaron diferencias en la densidad de células NeuN+ entre animales controles y PScKOadult (Control: 3037 ± 385.9, PScKOadult: 3187 ± 417.2. Unidades: Células Neun+/mm2) (Figura 31). 2.2.2 Astrogliosis en los animales PScKOadult Realizamos inmunotinciones empleando el anticuerpo anti-GFAP para analizar la presencia de astrocitos en los cerebros de los animales PScKOadult. En el análisis de la tinción de GFAP encontramos un incremento del área teñida en los animales PScKOadult de dos veces la encontrada en los controles (Control: 9.60 ± 2.02, PScKOadult: 20.29 ± 2.76. Unidades: porcentaje de área GFAP+ ± SEM) (Figura 32). El incremento observado es ligeramente mayor que el analizado previamente en los animales PScKOyoung de 7 meses de edad, con el mismo periodo de escisión de Psen1 (1.7 veces). 2.2.3 Microgliosis en animales PScKOadult Para analizar la microglía en la corteza de los animales PScKOadult empleamos cortes coronales de corteza y realizamos experimentos de inmunohistoquímica con el Figura 32. Astrogliosis en animales PScKOadult. Imágenes representativas de secciones de corteza de animales PScKOadult de 13 meses teñidas con anti-GFAP. La barra de escala representa 200 µm, la línea discontinua delimita el cuerpo calloso. A la derecha, cuantificación del porcentaje de área teñida por anti-GFAP. N= 5 controles, 5 PScKOadult, 5 cortes por animal. 78 Resultados IV anticuerpo Iba1. La densidad de células Iba1+ de los animales PScKOadult fue de 2 veces la observada en los animales controles (Control: 207.8 ± 31.71, PScKOtemp-7m: 451.0 ± 45.30. Unidades: células Iba1+/mm2 ± SEM) (Figura 33). En cuanto al área teñida encontramos un incremento de 1.5 veces en los animales PScKOadult respecto a animales controles (Control: 14.23 ± 1.06, PScKOadult: 22.28 ± 0.56. Unidades: porcentaje de área Iba1+ ± SEM) (Figura 33). Este incremento en la densidad de las células Iba1+ vino acompañado de un cambio en la morfología, con unos somas más grandes y unas prolongaciones más cortas y gruesas (Figura 33). Los datos de densidad y superficie ocupada por Iba1 en los animales PScKOadult fueron ligeramente menores y mayores, respectivamente, a los encontrados en los ratones PScKOyoung a la edad de 7 meses. Neurodegeneración cortical (grosor de corteza) Tiempo de escisión PScKOyoung PScKOadult 6 meses 16% de reducción 20% de reducción Astrogliosis cortical (área GFAP+) Tiempo de escisión PScKOyoung PScKOadult 6 meses Incremento de 1.7 veces Incremento de 2.11 veces Microgliosis cortical (densidad de Iba1+) Tiempo de escisión PScKOyoung PScKOadult 6 meses Incremento de 3 veces Incremento de 2.17 veces Tabla 9. Comparación de los datos histológicos obtenidos en animales PScKOyoung y PScKOadult tras 6 meses de escisión de Psen1. Se muestran los datos de neurodegeneración, astrogliosis y microgliosis corticales obtenidos comparando los animales PScKOyoung de 7 meses con los animales PScKOadult de 13 meses. Figura 33 Microgliosis en animales PScKOadult. Imágenes representativas de secciones de corteza de animales PScKOadult de 13 meses teñidas con anti-Iba1. La barra de escala representa 200 µm, la línea discontinua delimita el cuerpo calloso. A la derecha, cuantificación del porcentaje de área teñida y de la densidad microglial. N= 5 controles, 5 PScKOadult, 5 cortes por animal. 79 IV Resultados El conjunto de estos datos indicó que la escisión de Psen1 en la edad adulta del animal (7 meses) produce neurodegeneración, astrogliosis y microgliosis. Además, los datos de pérdida de grosor de corteza y de astrogliosis apuntan a una mayor sensibilidad del cerebro adulto a la pérdida de función de PS (Tabla 9), datos que necesitan confirmación experimental en futuros experimentos. 3 Efecto del incremento específico de los niveles de NrxnCTF en el contexto de pérdida de función de Presenilina La falta de función de PS conlleva el acúmulo de los diversos CTFs de sus sustratos. Dado el elevado número de sustratos, unos 150 identificados hasta día de hoy, se desconoce si alguno de ellos tiene especial relevancia en el desarrollo sintomático de AD. Resultados previos del grupo identificaron a Nrxns como sustrato de PS (Saura et al., 2011), además, demostraron que el acúmulo de NrxnCTF en cultivos neuronales inhibe la probabilidad de liberación, mimetizando los efectos provocados por una pérdida de función de PS (Servián-Morilla et al., 2018). Más recientemente, hemos demostrado que el acúmulo selectivo de NrxnCTF en el cerebro del ratón adulto produce defectos de memoria asociativa y de plasticidad presináptica en la amígdala (Sánchez-Hidalgo et al., 2022). Estos datos demuestran que la acumulación sináptica de NrxnCTF puede provocar, por sí misma, defectos de plasticidad sináptica y de memoria típicos de una falta de función de PS en AD. Si bien el desarrollo de estos modelos nos ha permitido demostrar un papel específico de la falta de procesamiento de NrxnCTF en la pérdida de función de PS, las mutaciones de pérdida de función de PSEN1 provocan la acumulación de sus numerosos sustratos, no solo de NrxnCTF. Es decir, los efectos deletéreos provocados por la acumulación de NrxnCTF se podrían ver alterados al alza o modificados provocando nuevos defectos cuando la acumulación de NrxnCTF se acompaña de la acumulación del resto de sustratos de PS. Esta es una pregunta fundamental que requiere para su respuesta alterar los niveles de la acumulación de NrxnCTF en un contexto de pérdida de función de PS. Para ello, en el grupo hemos generado un nuevo modelo animal, los ratones PScKO;NrxnCTF (PS1f/f; PS2-/-; CaMKII-CreERT2; CaMKII-HA-NrxnCTF) (Figura 34). 86 Resultados IV En conjunto, estos datos sugieren que el incremento en el acúmulo de NrxnCTF en un contexto de pérdida de función de PS no afecta de forma general al acúmulo de otros sustratos de PS/γ-secretasa. En cuanto a la contribución a los defectos ya observados en los animales PScKOyoung, hemos obtenido alguna evidencia de un ligero impacto sobre la densidad neuronal, siendo el grosor de corteza, la astrogliosis y la microgliosis de magnitudes muy similares a las encontradas en los animales PScKOyoung. La generación de este modelo animal nos permitirá, en un futuro, analizar los efectos sobre la neurodegeneración del incremento de NrxnCTF a edades más jóvenes y en otros aspectos funcionales donde el efecto de NrxnCTF ya ha sido documentado, como memoria y función sináptica (Sánchez-Hidalgo et al., 2022; Servián-Morilla et al., 2018). 4 Caracterización bioquímica y conductual del modelo animal knockin Nlgn1 Thr271fs El modelo animal KI Nlgn1 Thr271fs se generó en nuestro laboratorio empleando tecnología TALENS para introducir una inserción de TT encontrada en una paciente con AD en el gen Nlgn1 del ratón (Tristán-Clavijo et al., 2015). Con el objetivo de analizar los efectos de esta mutación en el animal y su posible relación con AD, se ha realizado una caracterización bioquímica y comportamental del animal KI Nlgn1 Thr271fs. 4.1 Generación del modelo animal knockin Nlgn1 Thr271fs y caracterización de la expresión de Neuroliguina 1 La región afectada por la mutación Nlgn1 Thr271fs está conservada en el genoma del humano y ratón (Figura 38). El ADN donador contenía las dos TT a insertar además de una mutación silente para generar una diana de restricción HpaI con la finalidad de facilitar la detección del alelo mutante. Mediante PCR de ADN genómico seguido de una restricción con HpaI se identificaron 3 potenciales fundadores entre 20 ratones nacidos. Se confirmó la presencia del alelo mutante Nlgn1 Thr271fs en heterocigosis en dos de los tres candidatos empleando secuenciación Sanger. El tercer candidato se descartó tras comprobar que contenía una deleción adicional en el segundo alelo de Nlgn1. 87 IV Resultados El cruce de los dos fundadores con animales C57BL/6J silvestres mostró una descendencia con una herencia del alelo Nlgn1 Thr271fs en una frecuencia esperada del 50%. Se descartaron inserciones off-target del ADN donador empleando qPCR genómica en la descendencia de las dos líneas de animales KI Nlgn1 Thr271fs. Seleccionamos una de las dos líneas idénticas del ratón KI Nlgn1 Thr271fs con la que se realizaron el resto de los experimentos. Para analizar la expresión del alelo Nlgn1 Thr271fs se realizaron experimentos de RT-PCR seguidos de una digestión con HpaI empleando material de diferentes regiones del cerebro. En animales silvestres se observó una única banda resistente a la restricción de HpaI, tal como se espera de la expresión del alelo sin editar silvestre de Nlgn1 (Figura 39). En animales Nlgn1 Thr271fs heterocigotos (HTZ) se observó una banda control resistente a la restricción de HpaI junto con dos bandas de los pesos esperados resultantes de la restricción con HpaI. La suma de las bandas provenientes del alelo mutante mostró una menor intensidad que la banda correspondiente a la expresión del alelo silvestre (Figura 39). Esto parece indicar que el ARN mensajero transcrito por el alelo Nlgn1 Thr271fs es inestable y mayoritariamente degradado, presumiblemente, por un mecanismo de nonsese-mediated mRNA decay. Para analizar en más detalle la expresión del alelo Nlgn1 Thr271fs decidimos realizar experimentos de Western blot. Se analizaron lisados provenientes de dos regiones cerebrales distintas, corteza e hipocampo, en animales de 6 meses de edad. Nlgn1 se detectó empleando un anticuerpo que reconoce a la proteína en su extremo N- Figura 38. Generación del modelo animal Nlgn1 Thr271fs. A.- Secuencia conservada del gen NLGN1 humano y de ratón. B.- Esquema representativo de la estrategia knockin. Se indican la inserción de TT y de la diana HpaI en el ADN donador C.- Comparación de la secuencia de nucleótidos de la mutación Nlgn1 Thr271fs junto con el alelo wild type. 88 Resultados IV terminal. Esta región se esperaba presente en la proteína truncada resultante del alelo mutante Nlgn1 Thr271fs, ya que la mutación Thr271fs genera un codón de parada prematuro en la posición 284 y 293 para las isoformas Nlgn1 (-B) y Nlgn1 (+B) respectivamente (Tristán-Clavijo et al., 2015). Se detectó una reducción al 50% de la proteína Nlgn1 madura en animales heterocigotos Nlgn1 Thr271fs (HTZ) mientras que en animales homocigotos Nlgn1 Thr271fs (HMZ) se observó una ausencia de la banda correspondiente a la proteína madura Nlgn1 (Figura 39). Sin embargo, el fragmento truncado de Nlgn1 de alrededor de 30 KDa solo se pudo detectar en el caso de blots sobre expuestos de animales HTZ y HMZ Thr271fs. La cuantificación de esta banda indicó una expresión menor al 1% respecto a la proteína silvestre presente en los mismos animales HTZ Thr271fs. Esta estimación está presumiblemente sobreestimando los niveles del fragmento debido a la sobreexposición de los blots. Estos resultados indican que la mutación Nlgn1 Thr271fs asociada con AD genera un alelo nulo junto con una cantidad marginal del fragmento correspondiente a la proteína Nlgn1 truncada. Figura 39. Expresión del alelo mutante Nlgn1 Thr271fs . A.- Experimento de RT-PCR de diferentes regiones cerebrales de animales wild type y HTZ Nlgn1 Thr271fs. La incubación con la encima de resticción HpaI genera una banda resistesten en el alelo wild type y dos bandas digeridas en el alelo Nlgn1 Thr271fs (indicadas con dos flechas). B.- Western blot de lisados provenientes de corteza e hipocampo de animales wild type, HTZ y HMZ Thr271fs. Se observa la ausencia de Nlgn1 madura en animales HMZ y una reducción al 50% en animales HTZ. Se puede observar una cantidad marginal del fragmento N-terminal de Nlgn1 en el caso de blots sobreexpuestos. Se empleó un anticuerpo de Nlgn1 que reconoce un epítopo N-terminal. Análisis estadístico: ANOVA de una vía con post-hoc Tukey. *** p<0.001, **** p<0.0001 Las barras de error representan la SEM. 89 IV Resultados 4.2 Caracterización conductual de los animales knockin Nlgn1 Thr271fs 4.2.1 Evaluación general del estado del animal Se realizó una primera evaluación del estado general del animal. No se detectaron diferencias observables en el aspecto general en los animales Nlgn1 Thr271fs respecto a sus hermanos de camada wild type. Además, no se observaron cambios en la frecuencia mendeliana esperada de nacimientos ni en animales HTZ ni HMZ Nlgn1 Thr271fs. Tampoco se observaron diferencias en peso o en esperanza de vida respecto a hermanos de camada (datos no mostrados). Por otro lado, para evaluar las funciones sensoriales autónomas y musculares de los animales Nlgn1 Thr271fs se realizó el conjunto de pruebas primarias SHIRPA (Rogers et al.,1997) detallados en el apartado 6.2 de Materiales y Métodos (Tabla 5). Tras analizar la posición corporal, los reflejos de enderezamiento, postural y faciales, la fuerza en las extremidades y la visión y audición de los animales, no se detectó ningún defecto funcional en animales Nlgn1 Thr271fs o en animales wild type. Las pruebas de análisis primarias SHIRPA se repitieron previamente a cada conjunto de pruebas conductuales para asegurar la ausencia de problemas que pudieran causar alguna dificultad a la hora de su realización y verificar el estado general de cada población. 4.2.2 Análisis fenotípico de una población adulta de animales knockin Nlgn1 Thr271fs Parte central del diagnóstico en AD se basa en la evaluación clínica de parámetros relacionados con un deterioro progresivo de la memoria y un deterioro cognitivo generalizado. Para tratar de descubrir fenotipos clínicos relevantes en los animales Nlgn1 Thr271fs se realizó una batería de pruebas de conducta. Para analizar alteraciones específicas generadas por un efecto de dosis de proteína, se analizaron en paralelo animales HTZ y HMZ Nlgn1 Thr271fs. Se han identificado mutaciones en NLGN3 y NLGN4X en enfermedades del neurodesarrollo, especialmente en pacientes con trastornos del espectro autista (TEA) (Chanda et al., 2016; Etherton et al., 2011; Jamain et al., 2003; Laumonnier et al., 2004; C. Zhang et al., 2009). En pacientes, el diagnóstico del TEA se basa en características de comportamiento definidas por patrones repetitivos de conducta y defectos persistentes 90 Resultados IV en la interacción y comunicación sociales. Para analizar si la pérdida de Nlgn1 genera un fenotipo asociado a trastornos del neurodesarrollo, se realizaron una serie de pruebas de comportamiento diseñadas para evaluar en roedores los comportamientos análogos a las alteraciones encontradas en pacientes, como la prueba de campo abierto, para evaluar hiperactividad y ansiedad, la prueba de acicalamiento, para evaluar patrones repetitivos y la prueba de las 3 habitaciones, para evaluar la interacción social (Crawley, 2012; Pasciuto et al., 2015; Silverman et al., 2010). Los siguientes experimentos se realizaron en una cohorte de animales de entre 4 y 8 meses de edad compuesta por una N de 9-18 animales wild type, 9-23 animales HTZ Nlgn1 Thr271fs y 9-18 animales HMZ Nlgn1 Thr271fs. La N empleada en cada prueba queda especificada en la descripción de estas. 4.2.2.1 Análisis de locomoción exploratoria: Test de campo abierto Uno de los principales síntomas asociados a enfermedades del neurodesarrollo es el comportamiento ansioso e hiperactivo. Para evaluar la presencia de dichos síntomas se analizó la locomoción general de los animales en la prueba de campo abierto. En esta, prueba se colocó al animal en una arena vacía de 45 x 45 cm con paredes opacas y se le dejó explorar libremente durante 15 minutos. Esta prueba nos permitió analizar el estado general de locomoción del animal midiendo la distancia total recorrida durante la exploración. Además, el espacio abierto del centro de la arena provoca una inseguridad innata en los animales (Choleris et al., 2001), por lo que el número de entradas al centro es una medida del nivel de ansiedad de estos. Figura 40. Test de campo abierto. A.- De izquierda a derecha, representación gráfica del test, trazados representativos de las trayectorias recorridas por ratones wild type, HTZ Nlgn1 Thr271fs y HMZ Nlgn1 Thr271fs. Trazados obtenidos mediante el software Smart. B.- Distancia total recorrida. C.- Número de entradas a la zona central. N= 18 wild type, 23 HTZ Nlgn1 Thr271fs, 18 HMZNlgn1 Thr271fs. Análisis estadístico: ANOVA de una vía con post-hoc Tukey. * p<0.05. Las barras de error representan la SEM. Representación gráfica del test generada con Biorrender.com 91 IV Resultados Observamos que, mientras que los animales HTZ Nlgn1 Thr271fs recorrían una distancia total similar a los animales wild type, los animales HMZ Nlgn1 Thr271fs recorrieron una distancia un 20% mayor respecto a sus hermanos de camada, alcanzando diferencias significativas respecto a animales HTZ (wild type 5206 ± 303.5; HTZ Nlgn1 Thr271fs 4902 ± 244.6; HMZ Nlgn1 Thr271fs 6116 ± 476.7, distancia en cm ± SEM) (Figura 40). Este incremento en la distancia total recorrida en los animales HMZ Nlgn1 Thr271fs vino acompañado de un incremento significativo del 30% respecto a animales HTZ en las entradas a la zona central de la arena (wild type 40.56 ± 2.644; HTZ Nlgn1 Thr271fs 36.26 ± 3.078; HMZ Nlgn1 Thr271fs 49.00 ± 5.167, número de entradas ± SEM) (Figura 40). Estos datos sugieren que la ausencia total de Nlgn1 produce un fenotipo de ligera hiperactividad que se preserva con una dosis parcial de Nlgn1. El mayor número de entradas al centro observado en los animales HMZ Nlgn1 Thr271fs podría deberse a la propia hiperactividad, ya que recorren una distancia mayor por toda la arena. 4.2.2.2 Análisis de patrones repetitivos: Test de acicalamiento Otro de los síntomas asociados a problemas del neurodesarrollo en pacientes son los comportamientos repetitivos (American Psychiatric Association [APA], 2022). En modelos animales de TEA se analiza el tiempo que emplean los animales en acicalarse para evaluar dicha conducta. Estos modelos, como los deficientes en la proteína SHANK o con disfunción en Nrxn1, muestran un claro incremento en el tiempo de acicalamiento (Jaramillo et al., 2017; Y. Jiang & Ehlers, 2013; Peça et al., 2011; Rabaneda et al., 2014). Para evaluar si la pérdida total o parcial de Nlgn1 se relaciona con la aparición de estereotipias, se analizó el tiempo que invertían los animales Nlgn1 Thr271fs en acicalarse. Se colocaron a los animales en una batea transparente y se grabó el comportamiento de estos durante 10 minutos desde una vista frontal. Se cuantificó manualmente el tiempo que pasaban realizando el patrón de movimientos de acicalamiento. Los animales HMZ Nlgn1 Thr271fs realizaron un tiempo de acicalamiento de casi el doble del empleado por sus hermanos de camada wild type, alcanzando significancia estadística (Figura 41). Sin embargo, los animales HTZ Nlgn1 Thr271fs mostraron tiempos similares a los controles, aunque se observó una tendencia al incremento (Wild type 55.53 ± 7.81; HTZ Nlgn1 Thr271fs 79.19 ± 12.26; HMZ Nlgn1 Thr271fs 105.80 ± 17.13. 92 Resultados IV p<0.05. Tiempo en segundos ± SEM.) (Figura 41). Este aumento en el tiempo de acicalamiento en los animales HMZ Nlgn1 Thr271fs parece indicar que la ausencia de Nlgn1 genera un incremento en comportamientos repetitivos a pesar de la ligera hiperactividad observada en la prueba del campo abierto. 4.2.2.3 Análisis de interacción social: Test de las tres habitaciones Una de las conductas afectadas en las enfermedades del neurodesarrollo es la interacción social. Para evaluar si la pérdida de Nlgn1 afecta a la interacción social, realizamos la prueba de las tres habitaciones. Se colocó al animal en la habitación central de una caja dividida en tres estancias conectadas (una habitación central y dos habitaciones laterales). En las salas laterales el animal puede encontrar un cilindro con un estímulo no social (objeto inanimado) o un estímulo social (animal de la misma edad y sexo). Para evaluar la preferencia innata de los roedores por la interacción social se analizó el tiempo de interacción de los animales con los dos estímulos. Los animales wild type y HTZ Nlgn1 Thr271fs mostraron una clara preferencia por interaccionar con el estímulo social en lugar de con el objeto inanimado (Figura 42). Los animales HMZ Nlgn1 Thr271fs mostraron una ligera reducción no significativa en el tiempo de interacción con el estímulo social (Tiempo de interacción con el objeto: Wild type 25.04 ± 5.027; HTZ Nlgn1 Thr271fs 21.66 ± 4.025; HMZ Nlgn1 Thr271fs 28.80 ± 4.12; tiempo de interacción con el ratón: Wild type 138.0 ± 13.50; HTZ Nlgn1 Thr271fs 122.0 ± 20.44; HMZ Nlgn1 Thr271fs 88.11 ± 15.04. Tiempo en segundos ± SEM) (Figura 42). Este descenso en la preferencia social observada en los animales HMZ Nlgn1 Thr271fs también se vio reflejado en un ligero descenso en el índice social, calculado como la diferencia porcentual de la interacción con el ratón respecto del tiempo total de interacción (Wild Figura 41. Test de acicalamiento. A la izquierda, epresentación gráfica de la prueba. A la derecha, Cuantificación del tiempo de acicalamiento durante los 10 minutos de prueba. N= 16 wild type, 23 HTZ Nlgn1 Thr271fs, 18 HMZ Nlgn1 Thr271fs. Análisis estadístico: ANOVA de una vía con post-hoc Tukey. * p<0.05. Las barras de error representan la SEM. Representación gráfica de la prueba generada con Biorrender.com 93 IV Resultados type 33.08 ± 3.98; HTZ Nlgn1 Thr271fs 30.44 ± 4.58; HMZ Nlgn1 Thr271fs 22.92 ± 4.67 índice ± SEM) (Figura 42). Estos datos sugieren que la ausencia total de Nlgn1 produce ligeros defectos en la interacción social, mientras que la pérdida parcial asociada con AD no genera ningún defecto observable relacionado con enfermedades del neurodesarrollo. En conjunto, el aumento observado en la locomoción, el incremento en el tiempo de acicalamiento y el ligero descenso en la interacción social presentes en los animales HMZ Nlgn1 Thr271fs con ausencia total de Nlgn1 concuerdan con los fenotipos previamente observados en el ratón KO Nlgn1 (Blundell et al., 2010). En el análisis fenotípico de los animales KO Nlgn1 se encontró un incremento en el tiempo de acicalamiento espontáneo superior a dos veces el realizado por los animales wild type, un leve descenso en la interacción social y, a diferencia de los datos obtenidos en los animales HMZ Nlgn1 Thr271fs, se reportó una actividad locomotora normal (Blundell et al., 2010). 4.2.2.4 Evaluación de la memoria La pérdida progresiva de la memoria es uno de los marcadores distintivos en el deterioro cognitivo producido en AD. Para esclarecer el impacto que pudiera tener la pérdida de Nlgn1 en la memoria de los animales, realizamos una batería de pruebas a los Figura 42. Test de las tres habitaciones. A.- Representación gráfica de la prueba. B.- Tiempo de interacción con el ratón o el objeto durante la fase de test. C.- Índice social calculado como [(t interacción Ratón/t inter total) *100-50]. N= 10 wild type, 11 HTZ Nlgn1 Thr271fs, 8 HMZ Nlgn1 Thr271fs. Análisis estadístico: t-test para cada genotipo en B, ANOVA con post-hoc Tukey en C. * p<0.05, ** p<0.01, *** p<0.001. Representación gráfica del test generada con Biorrender.com 94 Resultados IV animales Nlgn1 Thr271fs para evaluar diferentes tipos de memoria, la memoria contextual, asociativa y memoria de trabajo. 4.2.2.4.1 Memoria asociativa: Test de condicionamiento al miedo Para evaluar la memoria asociativa y emocional empleamos la prueba de condicionamiento al miedo. En la primera fase, se colocó al animal en un compartimento cerrado durante 2 minutos. Pasado este tiempo, recibió un estímulo sonoro de 30 s de duración (estímulo neutro) acompañado en sus últimos 5 s de un choque eléctrico (estímulo aversivo). Esta presentación de estímulos se repitió tres veces consecutivas, durante las cuales el ratón asocia el estímulo neutro y el contexto con la respuesta de miedo provocada por el estímulo aversivo. Pasadas 24 h, se colocó al animal en el mismo compartimento durante 5 minutos, pero en ausencia de estímulo sonoro (memoria contextual). A continuación, se cambió el contexto del compartimento, se introdujo al animal y se le presentó las tres repeticiones del estímulo sonoro (memoria del tono). El miedo en los roedores se evalúa por un comportamiento conocido como freezing o congelación, característico por la ausencia de movimientos salvo los respiratorios. Figura 43. Test de condicionamiento al miedo. A.- Fase de condicionamiento. Tiempo de congelación realizado durante cada uno de los tonos presentados. B.- Evaluación de memoria contextual, tiempo de congelación realizado durante los 5 minutos del test. C.- Evaluación de memoria del tono. N= 9 wild type, 10 HTZ Nlgn1 Thr271fs, 9 HMZ Nlgn1 Thr271fs. Análisis estadístico: ANOVA de una vía con post-hoc Tukey. * p<0.05, ** p<0.01. Las barras de error representan la SEM. Representación gráfica del test generada con Biorrender.com. 95 IV Resultados En la fase de condicionamiento, los animales HTZ y HMZ Nlgn1 Thr271fs presentaron tiempos similares de congelación a los tres tonos respecto a los animales wild type (Tono 1: Wild type 0.60 ± 0.283; HTZ Nlgn1 Thr271fs 2.662 ± 1.51; HMZ Nlgn1 Thr271fs 0.62 ± 0.368. Tono 2: Wild type 8.40 ± 2.94; HTZ Nlgn1 Thr271fs 8.036 ± 2.945; HMZ Nlgn1 Thr271fs 8.55 ± 1.55. Tono 3: Wild type 14.30 ± 2.57; HTZ Nlgn1 Thr271fs 16.51 ± 1.89; HMZ Nlgn1 Thr271fs 13.73 ± 2.02. Tiempo en segundos ± SEM) (Figura 43). Los tres genotipos mostraron un tiempo de congelación que fue incrementando con la presentación consecutiva de estímulos aversivos. Durante la exposición al contexto a las 24 horas, los animales HTZ Nlgn1 Thr271fs realizaron un tiempo de congelación similar a los animales wild type, mientras que en los animales HMZ Nlgn1 Thr271fs se observó una tendencia no significativa a una reducción (35% menos) del tiempo de congelación respecto a animales wild type (Wild type 142.1 ± 31.02; HTZ Nlgn1 Thr271fs 137.5 ± 28.17; HMZ Nlgn1 Thr271fs 91.85 ± 20.05. Tiempo en segundos ± SEM) (Figura 43). Durante la fase dependiente del estímulo sonoro, de nuevo, los animales HTZ Nlgn1 Thr271fs no mostraron diferencias significativas en el tiempo de congelación realizado respecto a animales wild type, sin embargo, los animales HMZ Nlgn1 Thr271fs mostraron una reducción significativa (61% menos) respecto a animales wild type (Wild type 52.32 ± 8.75; HTZ Nlgn1 Thr271fs: 54.61 ± 8.07; HMZ Nlgn1 Thr271fs 20.40 ± 5.39. Tiempo en segundos ± SEM) (Figura 43). Hay disparidad entre la bibliografía respecto al efecto de Nlgn1 en el condicionamiento al miedo. Por un lado, se ha descrito una memoria condicionada normal en los animales KO Nlgn1 (Blundell et al., 2010), mientras que otros autores han descrito defectos en la memoria en animales con un descenso agudo de Nlgn1 en la amígdala mediante siRNA (Kim et al., 2008). Nuestros datos indican que la pérdida total de Nlgn1 genera una deficiencia en la memoria asociativa mientras que, en animales con una reducción parcial de Nlgn1, este tipo de memoria se encuentra conservada. 4.2.2.4.2 Memoria espacial: Test del laberinto de Barnes Para analizar si la memoria espacial se encontraba afectada en los animales Nlgn1 Thr271fs empleamos la prueba del laberinto de Barnes. La prueba se realizó como se ha descrito anteriormente (Andrade-Talavera et al., 2015). El animal se colocó en el centro de una plataforma redonda que contiene 20 agujeros en la periferia. Solo uno de los 20 102 Resultados IV fase de retención. Estos efectos se vieron claramente reflejados en el índice de discriminación (Memoria a 30 minutos: wild type 0.45 ± 0.03; HTZ Nlgn1 Thr271fs, 0.01 ± 0.07. Memoria a 60 minutos: Wild type, 0.25 ± 0.03; HTZ Nlgn1 Thr271fs, 0.01 ± 0.03) (Figura 48). Las cuantificaciones mostraron que, a pesar de que los animales HTZ Nlgn1 Thr271fs fueron capaces de discriminar entre objeto nuevo y familiar cuando se evaluó la memora 5 y 15 minutos tras la fase de retención, reflejaron un descenso no significativo en el índice de discriminación respecto a animales wild type. Este descenso en el índice de discriminación de la población de animales HTZ Nlgn1 Thr271fs envejecidos fue más acusado respecto a la población adulta (Figuras 46 y 48), sugiriendo una ligera progresión del déficit en la consolidación de la memoria con la edad. Figura 48. Test de reconocimiento de objeto en animales envejecidos. A, B, C y D.- De izquierda a derecha, tiempo de interacción total con los dos objetos durante la fase de retención; tiempo de interacción porcentual con cada objeto respecto al tiempo total de interacción después de la retención; índice de preferencia por el objeto nuevo. A.- Test 5 minutos después de la retención. N= 11 wild type, 13 HTZ Nlgn1 Thr271fs. B.- Test 15 minutos después de la retención. N= 10 wild type, 12 HTZ Nlgn1 Thr271fs. C.- Test 30 minutos después de la retención. N= 11 wild type, 10 HTZ Nlgn1 Thr271fs. D.- Test 60 min después de la retención. N= 12 wild type, 14 HTZ Nlgn1 Thr271fs. E.- Índice de preferencia a distintos tiempos tras la retención. Análisis estadístico: t-test. * p<0.05, ** p<0.01, *** p<0.001, **** p<0.0001. Las barras de error representan la SEM. 103 IV Resultados En conjunto, estos datos muestran que los defectos específicos en la consolidación de la memoria de los animales HTZ Nlgn1 Thr271fs se mantienen en animales envejecidos y que, por otra parte, no aparecen de defectos en la condicionada al miedo asociada a una pérdida total de Nlgn1. Estos resultados indican que la pérdida parcial de Nlgn1 asociada a AD afecta a la memoria de una forma específica, de tal manera que no se puede acelerar mediante una pérdida total de Nlgn1. 4.2.4 Análisis de los defectos de memoria en los animales HTZ Nlgn1 Thr271fs Para profundizar en los defectos de memoria de reconocimiento observados en los animales HTZ Nlgn1 Thr271fs y en las posibles estructuras cerebrales implicadas, realizamos la prueba de reconocimiento de objeto en dos paradigmas distintos. Se ha documentado que permitir una exploración de más o menos tiempo de los objetos durante la fase de retención genera una memoria del objeto fuerte o débil, respectivamente (Cinalli et al., 2020). Según Cinalli et al., 2020, la inactivación de las sinapsis en la región CA1 del hipocampo tiene un impacto en la memoria de reconocimiento fuerte, pero no en la débil. Por el contrario, la inactivación de la actividad neuronal en la corteza perirrinal, tiene un efecto sobre la memoria débil y no sobre la memoria fuerte. Con el objetivo de poder identificar regiones cerebrales implicadas en los defectos en memoria de reconocimiento observados en los animales HTZ Nlgn1 Thr271fs analizamos la memoria fuerte y débil. Para el análisis de la memoria débil y memoria fuerte, a los animales se les permitió interactuar con los objetos un máximo de 11 s y 30s, respectivamente, durante la fase de retención, contabilizando el tiempo acumulado de interacción con los dos objetos idénticos. En ambos casos, la memoria se analizó una hora después de la fase de retención. Esta prueba se realizó en una nueva población de animales wild type y HTZ Nlgn1 Thr271fs de 10 meses de edad. Encontramos que los animales HTZ Nlgn1 Thr271fs realizaron una interacción muy similar entre objeto familiar y objeto nuevo en ambas pruebas (Figura 49). Los animales wild type mostraron una clara discriminación entre objeto familiar y nuevo en ambos paradigmas (Memoria fuerte: wild type, objeto familiar 32.51 ± 3.91, objeto nuevo 67.49 ± 3.91; HTZ Nlgn1 Thr271fs, objeto familiar 51.29 ± 1.69, objeto nuevo 48.71 ± 1.69. Memoria débil: wild type, objeto familiar 36.36 ± 3.05, objeto nuevo 63.64 ± 3.053; HTZ Nlgn1 Thr271fs, objeto familiar 48.51 ± 1.305, objeto nuevo 51.49 ± 1.30. Tiempo en 104 Resultados IV porcentaje respecto al tiempo de interacción total ± SEM) (Figura 49). Observamos un ligero descenso en el índice de preferencia de los animales wild type en la prueba de memoria débil respecto a la prueba de memoria fuerte, como cabría esperar, debido al menor tiempo de interacción con los objetos familiares. En animales HTZ Nlgn1 Thr271fs, el índice de interacción fue cercano a 0 tanto en la prueba de memoria débil como fuerte (Memoria fuerte: wild type 0.35 ± 0.07; HTZ Nlgn1 Thr271fs, -0.02 ± 0.03. Memoria débil: wild type, 0.27 ± 0.06; HTZ Nlgn1 Thr271fs, 0.03 ± 0.02 ± SEM) (Figura 49). Estos datos parecen indicar que los animales HTZ Nlgn1 Thr271fs podrían tener afectados los mecanismos de memoria de reconocimiento dependientes de corteza perirrinal y de hipocampo, ya que encontramos defectos en el reconocimiento de objeto tanto en el paradigma de memoria fuerte como en el de memoria débil. El papel del hipocampo en la memoria de reconocimiento es controversial. Encontramos varios estudios donde se describen defectos en la memoria de reconocimiento de objeto nuevo inducidos por lesiones en el hipocampo (Ainge et al., 2006; Broadbent et al., 2010; Clark et al., 2000). Sin embargo, la mayoría de los autores observaron este tipo de memoria conservada tras lesionar esta región cerebral (Albasser et al., 2012; Forwood et al., 2005; Gaskin et al., 2003; Mumby et al., 2005; Winters et al., Figura 49. Memoria de reconocimiento de objeto en dos paradigmas distintos. A y B.- A la izquierda, tiempo de interacción porcentual con cada objeto respecto al tiempo total de interacción después de la retención; a la derecha, índice de preferencia por el objeto nuevo. A.- Memoria de reconocimiento de objeto tras establecer un tiempo máximo de interacción con los objetos familiares de 30 s durante la retención. N= 7 wild type, 9 HTZ Nlgn1 Thr271fs. B.- Memoria de reconocimiento de objeto tras establecer un tiempo máximo de interacción con los objetos familiares de 11 s durante la retención. N= 6 wild type, 9 HTZ Nlgn1 Thr271fs. Análisis estadístico: ttest. ** p<0.01, *** p<0.001. Las barras de error representan la SEM. 105 IV Resultados 2004). Estos autores postulan que la memoria de reconocimiento es esencialmente dependiente de la corteza perirrinal. Nuestros experimentos no permiten distinguir directamente entre estas posibilidades, pero estos datos podrían indicar que los animales HTZ Nlgn1 Thr271fs pudieran tener una disfunción en la corteza perirrinal, sin descartar defectos en el hipocampo. Por otro lado, para analizar posibles defectos en la memoria espacial, tras la evaluación de la memoria de reconocimiento fuerte y débil, sometimos a los animales HTZ Nlgn1 Thr271fs a la prueba de reconocimiento de objeto desplazado. Al igual que la prueba de reconocimiento de objeto nuevo, esta prueba se basa en el impulso innato de los roedores por explorar la novedad, en este caso, una nueva localización del objeto. Durante la prueba de objeto desplazado, se les presentó a los animales dos objetos idénticos durante la fase de retención, y una hora después, se evaluó la memoria espacial desplazando uno de los dos objetos (Figura 50). Encontramos que los animales HTZ Nlgn1 Thr271fs fueron capaces de discriminar el objeto desplazado respecto del que se mantenía en la posición original, presentando unos tiempos de interacción con el objeto en posición familiar y nueva muy similares a los animales wild type (wild type, posición familiar 37.68 ± 3.27, posición nueva 62.32 ± 3.27; HTZ Nlgn1 Thr271fs, posición familiar 36.48 ± 2.29, posición nueva 63.52 ± 2.29. Tiempo en porcentaje respecto al tiempo de interacción total ± SEM) (Figura 50). Tampoco observamos diferencias en el índice de Figura 50. Test de reconocimiento de objeto desplazado. De izquierda a derecha, tiempo de interacción total con los dos objetos durante la fase de retención; tiempo de interacción porcentual con cada objeto respecto al tiempo total de interacción después de la retención; índice de preferencia por el objeto desplazado. N= 6 wild type, 9 HTZ Nlgn1 Thr271fs. Análisis estadístico: t-test. ** p<0.01, *** p<0.001. Las barras de error representan la SEM. 106 Resultados IV preferencia entre animales wild type y animales HTZ Nlgn1 Thr271fs (wild type, 0.246 ± 0.06; HTZ Nlgn1 Thr271fs, 0.270 ± 0.04) (Figura 50). Estos datos indican que los defectos en la memoria de reconocimiento de los ratones HTZ NL1 Thr271fs no se ven afectados por un mayor o menor tiempo de exploración de los objetos. Además, el hecho de que los ratones HTZ NL1 Thr271fs fueran capaces de reconocer un objeto desplazado en el mismo entorno, indica un defecto específico de la memoria de reconocimiento en los ratones HTZ NL1 Thr271fs asociados con AD. 4.3 Caracterización sináptica de los animales HTZ Nlgn1 Thr271fs La pérdida y deterioro de las sinapsis es una de las características principales en AD (DeKosky & Scheff, 1990; Terry et al., 1991). Nlgn1 es uno de los componentes principales de las sinapsis glutamatérgicas, donde puede reclutar receptores AMPA (AMPAR) y NMDA (NMDAR) a través de interacciones mediadas por los dominios intra- y extracelulares (Budreck et al., 2013; Heine et al., 2008; Song et al., 1999). Para analizar la densidad sináptica, realizamos un análisis cuantitativo de las sinapsis empleando la tinción de Golgi-Cox, que tiñe un porcentaje de neuronas (soma y dendritas) haciendo posible la visualización y cuantificación de las espinas dendríticas. Mediante este método, encontramos un número similar de espinas dendríticas en animales HTZ Nlgn1 Thr271fs y wild type en neuronas de la región CA1 del hipocampo, tanto en animales jóvenes como animales envejecidos (Animales de 5 meses: wild type, 10.16 ± 1.03; HTZ Nlgn1 Thr271fs, 10.29 ± 0.77. Animales de 25 meses: wild type, 8.41 ± 0.62; HTZ Nlgn1 Thr271fs, 7.84 ± 0.65. Densidad de espinas dendríticas por cada 10 µm ± SEM) (Figura 51). Estos datos apuntan a que la pérdida parcial de Nlgn1 actúa a través de un mecanismo distinto a la pérdida del número de sinapsis. Por otro lado, para comprobar si la composición de las sinapsis se veía alterada por los niveles de Nlgn1 decidimos estudiar mediante experimentos de Western blot diferentes componentes sinápticos que pudieran verse afectados. No encontramos cambios en los niveles de las subunidades AMPAR GluR1 y GluR2 en el hipocampo de animales HTZ Nlgn1 Thr271fs envejecidos (Figura 51). Se ha descrito con anterioridad un incremento compensatorio en los niveles de Nlgn3 en animales KO Nlgn1 (Blundell et al., 107 IV Resultados 2010; Dang et al., 2018). Dado que alteraciones en Nlgn3 producen déficits en las corrientes NMDAR/AMPAR (Chanda et al., 2016; Etherton et al., 2011; Polepalli et al., 2017), analizamos los niveles de Nlgn3 en animales Nlgn1 Thr271fs. Encontramos un incremento específico en los niveles de Nlgn3 en el hipocampo de animales HMZ Nlgn1 Thr271fs en ratones jóvenes y envejecidos (Figura 51). Sin embargo, el incremento en Nlgn3 no se observó en animales HTZ Nlgn1 Thr271fs (Figura 51). Estos resultados indican la aparición de un posible mecanismo compensatorio disparado ante la ausencia total de Nlgn1 que no se induce ante la pérdida parcial de la misma. En conjunto, la mutación Nlgn1 Thr271fs asociada a AD genera un alelo nulo que impide la expresión de Nlgn1. La falta de Nlgn1 tiene un impacto diferente en función de si la pérdida es total o parcial. Los animales HTZ Nlgn1 Thr271fs muestran defectos en la Figura 51. Análisis de número de espinas dendríticas y componentes sinápticos en animales KI Nlgn1. A.- A la izquierda, imagen representativa de la cuantificación de espinas dendríticas en dendritas secundarias de la región CA1 del hipocampo de animales jóvenes y envejecidos. La barra de escala representa 10 µm. A la derecha, cuantificación de la densidad de espinas dendríticas de 4-5 animales independientes por genotipo y 8-20 segmentos dendríticos por animal. Análisis estadístico: t-test para cada grupo de edad. B y C.- Expresión de componentes sinápticos en el hipocampo de animales envejecidos (B) y jóvenes (C). Abajo, se muestran las cuantificaciones normalizadas por actina y relativas al promedio de los animales wild tipe. Análisis estadístico: ANOVA de una vía con post-hoc Tukey para cada marcador analizado. * p<0.05, **p<0.01, *** p<0.001, **** p<0.0001 Las barras de error representan la SEM. 108 Resultados IV memoria de reconocimiento. Por el contrario, los animales HMZ Nlgn1 Thr271fs tienen defectos en la memoria condicionada al miedo y ciertos fenotipos asociados a trastornos del neurodesarrollo. La pérdida total, pero no parcial, de Nlgn1 dispara un mecanismo compensatorio que puede alterar la presentación fenotípica. Estos datos sugieren que la pérdida parcial de Nlgn1 asociada a AD puede contribuir a los defectos de memoria en AD por un mecanismo no compartido por modelos animales que reproducen una pérdida total de Nlgn1. 5 Interacción de Neuroliguina1 y APP De entre los sustratos de PS/γ-secretasa, APP ha obtenido más relevancia por su relación con las placas amiloides que aparecen en casos de AD. Datos recientes sugieren la existencia de una interacción funcional entre APP y/o sus metabolitos con el complejo Nrxns-Nlgn1. Se ha demostrado la interacción del péptido Aβ con Nlgn1 y Nrxns mediante ensayos de interacción (Brito-Moreira et al., 2017; Dinamarca et al., 2011; Naito et al., 2017). Además, se ha sugerido que el péptido Aβ podría generar una disfunción en la transmisión sináptica glutamatérgica en el hipocampo y defectos en la memoria espacial mediante la reducción de los niveles de Nlgn1 por mecanismos epigenéticos (Bie et al., 2014a). Estos datos apuntan a una posible interacción de APP y de sus metabolitos con el complejo Nrxns-Nlgn1 a dos niveles, upstream o downstream. Por un lado, si los defectos causados por el péptido Aβ actuasen mediante una reducción en los niveles de Nlgn1, sería esperable que dichos defectos se encontrasen incrementados en modelos animales con niveles reducidos de Nlgn1. Por el contrario, si Nlgn1 actuase como nucleador sináptico de Aβ, unos niveles reducidos de Nlgn1 implicarían una mejora en los efectos deletéreos generados por el acúmulo de Aβ. También existe la posibilidad de que Nlgn1 actuase a dos niveles. En este escenario, Nlgn1 podría posicionar a Aβ en las sinapsis y que su efecto resultase en un descenso en los niveles de Nlgn1. Por último, los estudios publicados hasta el momento se han limitado al empleo de exposiciones agudas del péptido Aβ, de manera que se desconoce la relación del sistema Nrxns-Nlgn1 con los 109 IV Resultados efectos de la expresión crónica de APP y sus metabolitos, un escenario más cercano a la enfermedad. Para esclarecer los efectos que pudieran tener la interacción de Aβ con Nlgn1, durante esta tesis doctoral hemos generado nuevos modelos animales que expresan el transgén hAPP751 con la doble mutación Swedish-London (KM670/671NL y V7171I) en un contexto de expresión total, parcial o nula de Nlgn1, como se detalla a continuación. 5.1 Generación modelo animal APP751SL; Nlgn1 Thr271fs y caracterización general Para la generación del modelo animal se cruzaron animales C57/Bl6 APP751SL cedidos por el Dr. Javier Vitorica (Universidad de Sevilla/IBiS), con animales HTZ Nlgn1 Thr271fs, de esta forma obtuvimos animales con la expresión del transgén hAPP751-SL y portadores de la mutación inactivante en Nlgn1. Posteriormente, cruzamos animales APP751SL; HTZ Nlgn1 Thr271fs con animales HTZ Nlgn1 Thr271fs. De estos cruces se obtuvieron los siguientes genotipos: ratones wild type, ratones APP751SL, animales APP751SL; Nlgn1partial (expresión de hAPP751-SL en un contexto de expresión parcial de Nlgn1) y animales APP751SL; Nlgn1null (expresión de hAPP751-SL en un contexto de expresión nula de Nlgn1). Además, en estos cruces se obtuvieron ratones HTZ Nlgn1 Thr271fs y HMZ Nlgn1 Thr271fs Observamos la frecuencia esperada de los distintos genotipos al nacimiento (datos no mostrados). Como caracterización fenotípica inicial, llevamos a cabo curvas de crecimiento y de supervivencia de los distintos animales. No observamos diferencias en el peso desde los 18 a los 90 días entre ninguno de los 6 genotipos estudiados en machos ni en hembras (Figura 52). El estudio de supervivencia se realizó durante los primeros 120 días de vida. Los animales wild type mostraron una supervivencia superior al 80% tanto en machos como en hembras durante este periodo de tiempo. Sin embargo, los animales APP751SL machos mostraron una supervivencia del 60% (Figura 52). Otros autores han encontrado un incremento de la mortalidad causado por muerte súbita en las primeras semanas de vida en animales transgénicos portadores de la mutación Swedish en APP y una mutación patogénica en el gen PSEN1 humano (Y. Huang & Lemke, 2022; Minkeviciene et al., 2009; Tzeng et al., 2018). La supervivencia en animales APP751SL; Nlgn1partial fue del 65% en machos y del 57% en hembras. Los animales APP751SL; Nlgn1null mostraron una 110 Resultados IV supervivencia aún menor en este rango de tiempo, alcanzando un 40% en machos y un 47% en hembras antes de los 120 días de vida, dándose un inicio más temprano y acelerado de la mortalidad (Figura 52). No se observaron cambios en la mortalidad respecto a animales wild type en animales que únicamente expresaban el alelo Nlgn1 Thr271fs (Figura 52). Estos datos indican un efecto negativo de la dosis de Nlgn1 en el índice de supervivencia asociado a la expresión del alelo hAPP751-SL. Es interesante destacar que el incremento de mortalidad en los animales APP751SL; Nlgn1partial y APP751SL; Nlgn1null ocurre a una edad temprana en la que no se espera encontrar acúmulo del péptido Aβ, ya que está descrito que dicho acúmulo sucede principalmente a una edad posterior a los 4 meses en este modelo animal (V. Blanchard et al., 2003). Por tanto, la correlación entre unos menores niveles de Nlgn1 y mayor mortalidad asociada a la expresión de hAPP751-SL podría deberse a un mecanismo independiente del péptido Aβ. Figura 52. Curvas de peso y supervivencia en animales APP751SL. Arriba, curva de peso de machos (izquierda) y hembras (derecha) desde los 18 días postnatales hasta los 90. N machos = wild type 11-29, APP751SL: 8-20, HTZ Nlgn1: 15-35, APP751SL; Nlgn1partial: 16-42, HMZ Nlgn1: 5-13, APP751SL; Nlgn1null: 3-14. N hembras= wild type 11-15, APP751SL: 13-23, HTZ Nlgn1: 19-28, APP751SL; Nlgn1partial: 19-38, HMZ Nlgn1: 4-14, APP751SL; Nlgn1null: 5-18. Abajo, curva de supervivencia en animales APP751SL con distintos niveles de Nlgn1 machos (izquierda) y hembras (derecha). La línea discontinua marca el 50% de supervivencia. N machos = wild type 28, APP751SL: 21, HTZ Nlgn1: 34, APP751SL; Nlgn1partial: 38, HMZ Nlgn1: 16, APP751SL; Nlgn1null: 15. N hembras= wild type 16, APP751SL: 20, HTZ Nlgn1: 28, APP751SL; Nlgn1partial: 41, HMZ Nlgn1: 14, APP751SL; Nlgn1null: 21. 111 IV Resultados 5.2 Análisis de la expresión de Aβ en el modelo animal APP751SL; Nlgn1 Thr271fs Para analizar si los niveles de Nlgn1 podrían afectar de alguna manera a los niveles de los metabolitos de APP in vivo, crecimos animales hasta la edad de 13 meses, edad a la que los niveles del péptido Aβ son fácilmente detectables en el cerebro de ratones APP751SL (J. Blanchard et al., 2009). En experimentos de Western blot analizamos los niveles de Aβ producidos en animales APP751SL, en animales con un 50% de expresión de Nlgn1 (APP751SL; Nlgn1partial) y en ratones con ausencia total de expresión de Nlgn1 (APP751SL; Nlgn1null). Empleamos animales wild type como control negativo. Como cabría esperar, no encontramos detección de formas de Aβ en animales wild type mientras que en los animales APP751SL de 13 meses de edad se observó una detección clara de Aβ aparentemente en forma de monómeros (peso molecular por debajo de los 11 KDa no indicado en la imagen) (Figura 53). La reducción de Nlgn1 al 50 % no parece tener ningún efecto en los niveles de Aβ, al menos a esta edad. Sorprendentemente, en los animales con ausencia total de expresión de Nlgn1 pudimos observar una reducción del 80% en la expresión de Aβ comparada con los animales APP751SL (Figura 53). No encontramos diferencias en los niveles totales de APP en ninguno de los genotipos estudiados respecto a animales APP751SL (datos no mostrados). Estos datos sugieren que Nlgn1 es importante para la formación o mantenimiento del péptido Aβ en el cerebro. 5.3 Caracterización de la patología Aβ en el modelo animal APP751SL; Nlgn1 Thr271fs Algunos de los principales marcadores asociados con la patología Aβ son los depósitos de Aβ extracelulares, la fosforilación de la proteína Tau y un aumento en la astrogliosis y astrocitosis (V. Blanchard et al., 2003; Boutajangout et al., 2004; Jimenez et Figura 53. Expresión de Aβ en animales con diferentes niveles de expresión de Nlgn1. Izquierda, detección de Aβ en lisados provenientes de hipocampo de animales wild type, APP751SL, APP751SL; Nlgn1partial (50% de Nlgn1) o. APP751SL; Nlgn1null (Ausencia total de expresión de Nlgn1.) Se detectó Aβ empleando el anticuerpo anti- Aβ (82E1) que detecta las formas solubles y fibrilares de Aβ. Derecha, se muestra la cuantificación de los niveles relativos de Aβ respecto a animales APP751SL normalizado por los niveles de NeuN. Análisis estadístico: ANOVA de una vía con post-hoc Tukey. *** p<0.001, **** p<0.0001. 118 V Discusión Estos datos indicaron que las isoformas de βNrxn1 son receptores presinápticos de para Nlgn1 y para Nlgn2, mientras que αNrxn1 se recluta preferentemente por Nlgn2. La presencia de SP4 tuvo un factor modulador negativo. Para analizar la interacción de isoformas de Nrxn1 con Nlgn1 en un contexto totalmente neuronal, modificamos nuestro sistema experimental. Para ello, transfectamos con VSV-Nlgn1 cultivos de corteza que expresaban las diferentes isoformas de Nrxn1 mediante infección lentiviral. Debido a la baja eficiencia de transfección, se consigue la expresión de Nlgn1 en neuronas individuales que se encuentran rodeadas de axones que expresan la isoforma de Nrxn1 correspondiente mediante infección viral. El reclutamiento axonal de las isoformas de Nrxn1 a las dendritas que expresan Nlgn1 se analizó por inmunofluorescencia con anticuerpos anti- Flag y anti-VSV, respectivamente. En estos experimentos confirmamos el reclutamiento selectivo de las isoformas de βNrxn1 por Nlgn1, mientras que las isoformas de αNrxn1 no se concentraban en dichos terminales. La inserción de SP4 moduló a la baja el reclutamiento de βNrxn1 por Nlgn1. Además, la expresión de βNrxn1Δ4 incrementó la capacidad sinaptogénica y la formación de espinas dendríticas inducida por Nlgn1, indicando que dicha interacción tiene efectos funcionales. Estos datos pueden tener consecuencias importantes. Nlgn1 y Nlgn2 tienen una localización y función específicas en sinapsis glutamatérgicas y GABAérgicas, respectivamente (Graf et al., 2004; Irie et al., 1997; Poulopoulos et al., 2009; Song et al., 1999; Varoqueaux et al., 2004). La interacción selectiva de Nlgn1 con βNrxns indica un papel relevante de isoformas de βNrxn en sinapsis glutamatérgicas. Por otra parte, la interacción de αNrxns con Nlgn2 sugiere una función de αNrxns en sinapsis GABAérgicas (Figura 55). La función de αNrxns en sinapsis inhibitorias se ve apoyada por los datos obtenidos por otros grupos en el ratón triple KO de los tres genes codificantes de αNrxns, pero que mantienen la expresión de βNrxns conservada. Estos animales mostraron una reducción al 50% de las sinapsis GABAérgicas respecto a animales controles, sin embargo, el número de sinapsis glutamatérgicas se mantuvo inalterado (Missler et al., 2003). En el contexto de enfermedad mental, se han descrito mutaciones y deleciones en el gen NRXN1 en pacientes de autismo y esquizofrenia. Estas mutaciones afectan a secuencias específicas de las isoformas αNrxn1 y βNrxn1 o a secuencias comunes de las dos isoformas (Camacho-Garcia et al., 2012, 2013; Ching et al., 2010; Dabell et al., 2013; 119 V Discusión Gauthier et al., 2011; Tromp et al., 2021; Winiowiecka-Kowalnik et al., 2010). La identificación de estas mutaciones podría sugerir que la disfunción de Nrxn1 en enfermedades del neurodesarrollo actúe a través de un mecanismo común que afecte a la función de α- y βNrxn. Sin embargo, otros datos del grupo han mostrado la formación de un complejo de βNrxn con Nlgn1, pero no con Nlgn2, en ensayos de inmunoprecipitación en un modelo animal de autismo que expresa un mutante de βNrxn (Rabaneda et al., 2014). Por tanto, nuestros datos apuntan a una posibilidad alternativa en la que mutaciones que afectaran la secuencia de αNrxn1 actuaran principalmente a través de ligandos comunes, como Nlgn2 en sinapsis GABAérgicas; mientras que mutaciones en secuencias de βNrxn1 podrían afectar la función de Nlgn1 en sinapsis glutamatérgicas. Además, el desarrollo de este sistema celular permitirá analizar en un contexto neuronal el reclutamiento de isoformas de Nrxn1 por otros miembros de Nlgns, como Nlgn3 y Nlgn4, cuyos genes se han encontrado mutados en pacientes de autismo (Jamain et al., 2003; Laumonnier et al., 2004; Yan et al., 2005). Figura 55. Interacción Nrxn-Nlgn en distintos tipos de sinapsis. Esquema representativo de la interacción de αNrxn y βNrxn con Nlgn1 y Nlgn2 en sinapsis glutamérgicas y GABAérgicas. Figura realizada con biorender.com 120 V Discusión 2 Análisis de la pérdida de función de Presenilina durante el envejecimiento del cerebro Mutaciones en los genes de PSEN1/2 son las causas mayoritarias de la FAD (Kumar et al., 2022; Long & Holtzman, 2019; Scheltens et al., 2021). El patrón de herencia autosómica dominante en las mutaciones en PSEN1/2 asociadas con FAD, la localización de dichas mutaciones a lo largo de toda la secuencia de la proteína y la caracterización in vitro e in vivo de numerosas de las mutaciones indican que la pérdida de función en PS y, por tanto, del complejo γ-secretasa, actúa como mecanismo iniciador en la FAD (Beglopoulos et al., 2004; Kabir et al., 2020; Saura et al., 2004; Sun et al., 2017). Sin embargo, encontramos una serie de aspectos de relevancia clínica aún sin respuesta. Una primera pregunta es la identificación funcional del sustrato, o sustratos, de PS que median los defectos sinápticos y de memoria causados por mutaciones de pérdida de función de PS. Una segunda cuestión es la clarificación del papel del envejecimiento en este proceso. Las respuestas a estas preguntas pueden tener una relevancia clínica importante, ya que permitirían identificar, por una parte, sustratos con interés farmacológico y, por otra, etapas del envejecimiento con una susceptibilidad diferencial a la pérdida de función de PS. Durante esta Tesis Doctoral se ha llevado a cabo la caracterización inicial de dos nuevos modelos animales generados en el grupo que tratan de responder a estas preguntas: ratones que presentan un incremento en los niveles de un sustrato relevante de PS, NrxnCTF, en un contexto general de pérdida de función de PS y ratones con un control temporal de la escisión de Psen1 en el cerebro durante el envejecimiento. Incluso los portadores de mutaciones en PSEN1 causantes de FAD desarrollan los síntomas tras las primeras décadas de vida. Hay dos posibilidades que pueden explicar esta dependencia temporal de la aparición de síntomas. Por un lado, la existencia de un mecanismo de progresión relativamente lento durante una fase asintomática que, una vez superado un determinado umbral patogénico, culmina con la aparición de los síntomas. Por otro lado, la existencia de una mayor sensibilidad a la falta de función de PS durante el envejecimiento que coincida con la aparición de síntomas. Los modelos actualmente generados carecen de la capacidad de controlar temporalmente la pérdida de función de PS. El modelo de pérdida de función de PS más 121 V Discusión ampliamente estudiado son los animales PScKO. Para evitar la muerte perinatal que se produce en los animales Psen1 KO convencionales (Shen et al., 1997), en los animales PScKO la escisión de Psen1, sobre un fondo PS2-/-, ocurre en neuronas glutamatérgicas del prosencéfalo a un mes de vida inducida por la actividad Cre dirigida por el promotor CaMKII (Saura et al., 2004). Para poder tener control temporal de la escisión de Psen1, en el grupo hemos empleado el sistema inducible por tamoxifeno que utiliza la proteína CreERT2 bajo la expresión del promotor CaMKII sobre un fondo PS2-/-, resultando en la generación de los animales PScKOtemp. De esta manera, se produce la escisión de Psen1 tras la administración en la dieta de tamoxifeno en las mismas neuronas del prosencéfalo que en los animales PScKO. Sin embargo, la administración de tamoxifeno ofrece un control temporal de la escisión de Psen1 en cualquier momento del envejecimiento. Como primera validación del modelo, observamos que los niveles de PS1 descendían drásticamente en la corteza y en el hipocampo de animales tratados con tamoxifeno en el primer mes de vida y a los 7 meses, ratones PScKOyoung y en ratones PScKOadult respectivamente. Actualmente hay más de 150 sustratos distintos de PS/γ-secretasa descritos. En modelos de pérdida de función de PS, ya sea por escisión génica, como en los animales PScKO (Saura et al., 2004), o por la presencia de mutaciones de pérdida de función en el gen PSEN1 (Xia et al., 2015), se produce un acúmulo de los fragmentos CTFs de los sustratos de PS. Para validar funcionalmente los modelos animales PScKOyoung y PScKOadult analizamos la acumulación de sustratos relevantes de PS/γ-secretasa. Seleccionamos sustratos ampliamente estudiados en el contexto de pérdida de función neuronal de PS, como APP y N-Cadherina (V. Blanchard et al., 2003; de Strooper et al., 1998; Marambaud et al., 2003; Philippe Marambaud et al., 2002) junto a sustratos de PS neuronales cuyo procesamiento ha sido descrito más recientemente y son de especial relevancia para el grupo, Nrxns y Nlgn1 (Peixoto et al., 2012; Saura et al., 2011; Suzuki et al., 2012). En lisados de hipocampo y corteza de animales PScKOyoung y PScKOadult observamos un incremento en los fragmentos CTFs seleccionados, sin que se afectaran los niveles de las correspondientes proteínas maduras. Es interesante destacar que, a pesar de la diferencia de edad en los animales, 7 meses en los ratones PScKOyoung y 13 meses en los ratones PScKOadult , en el momento del análisis llevaban el mismo tiempo tras la escisión de Psen1, y el acúmulo observado de los diferentes CTFs fue similar en ambas estructuras cerebrales. 122 V Discusión Para la caracterización funcional del modelo animal, se determinaron marcadores de neurodegeneración en animales PScKOyoung a los 7, 13 y 18 meses. Estas edades se seleccionaron ya que permitían la comparación con los datos descritos por otros grupos para los animales PScKO, en los que la escisión de Psen1 ocurre en el primer mes de vida (Saura et al., 2004; Watanabe et al., 2014; Wines-Samuelson et al., 2010). La tinción de cortes coronales de cerebro con NeuN reveló una disminución progresiva del grosor de corteza respecto a animales controles desde un 16% a la edad de 7 meses, hasta un 38% a la edad de 13 meses donde parece estabilizarse. Esta reducción del grosor cortical no se vio acompañada de cambios en la densidad neuronal. Por otro lado, observamos una astrogliosis abundante en la corteza de los animales PScKOyoung revelada por un incremento del área ocupada por células GFAP+. Este incremento de la astrogliosis parece progresivo con la edad, pasando de 1.7 veces la presencia de astrocitos en corteza respecto a animales controles a los 7 meses, hasta 4.7 veces a la edad de 18 meses. Los datos de astrogliosis en hipocampo no alcanzaron significancia estadística a la edad de 18 meses, presumiblemente, por la abundancia de los niveles basales de GFAP en el hipocampo de animales controles (Watanabe et al., 2014). Por último, el análisis de la presencia de microglía mediante un análisis de densidad de células Iba1 positivas reveló un incremento en los animales PScKOyoung de 3 veces respecto de animales controles, incremento que se mantuvo en las edades más tardías analizadas. Sin embargo, el análisis de porcentaje de área teñida por Iba1 sí reveló un incremento progresivo con la edad, pasando del 30% a la edad de 7 meses hasta un incremento de 2.3 veces a la edad de 18 meses. Este incremento en el área teñida parece estar asociado con el cambio en morfología que sufren las células microgliales en los animales PScKOyoung, pasando a tener unos somas más gruesos y unas ramificaciones más cortas y gruesas. En el hipocampo, la densidad de células iba1+ parece mantenerse estable con la edad a partir de los 7 meses, manteniendo un incremento de 3 veces respecto a los animales controles. La comparación de estos datos con los datos publicados en los animales PScKO mostró que la pérdida en el grosor de corteza observada en los ratones PScKOyoung a los 13 meses de edad del 38% fue de magnitud muy similar a la pérdida del 35% de volumen cortical descrita en los animales PScKO a los 9 meses. Además, el incremento observado en la astrogliosis y microgliosis en los animales PScKOyoung de 18 meses de edad de 4.7 y 2.7 veces, respectivamente, es de magnitud comparable, aunque algo más reducida, que 123 V Discusión las observadas en los ratones PScKO de 16 meses de edad. Estos datos muestran que la pérdida de función de PS inducida por la administración de tamoxifeno en los animales PScKOyoung genera una reducción en el grosor de corteza, astrogliosis y microgliosis de magnitud similar a los descritos en los animales PScKO. En conjunto, el descenso en los niveles de PS1 observado, el acúmulo de los fragmentos CTFs sustratos de PS junto con la aparición de marcadores de neurodegeneración en animales PScKOyoung a niveles similares a los descritos previamente en los ratones PScKO, nos han llevado a concluir que podemos reproducir la pérdida de función de PS en el ratón PScKOtemp con control temporal inducido por tamoxifeno. Una vez validado el modelo animal PScKOtemp decidimos emplear el sistema de inducción por tamoxifeno para estudiar los efectos de una pérdida de función de PS en edades más avanzadas. Para ello, animales PScKOtemp recibieron tamoxifeno a los 7 meses (animales PScKOadult) y se crecieron hasta los 13 meses. En cortes coronales del cerebro de estos animales, realizamos el mismo abordaje de tinción y cuantificación de experimentos de inmunohistoquímica empleado previamente en los animales PScKOyoung. De esta manera, hemos podido comparar los efectos producidos por una falta de función de PS de la misma duración de 6 meses, pero con dos edades de inicio distintas, a un 1 mes y a 7 meses. En los ratones PScKOadult observamos un descenso en el grosor de corteza ligeramente más acentuado que en los animales PScKOyoung, pasando de un 16% a un 20%, respectivamente. El área ocupada por células GFAP+ fue ligeramente superior en los animales PScKOadult, pasando de un incremento de 1.7 veces en los animales PScKOyoung a un incremento de 2.17 en los ratones PScKOadult. Sin embargo, el análisis de la microgliosis cortical no pareció revelar un incremento derivado de la pérdida de función de PS en la edad adulta del animal, sufriendo los animales PScKOadult un incremento de 2.17 veces respecto a los controles y los animales PScKOyoung un incremento de 3 veces respecto a animales controles. En conjunto, estos datos indican que la pérdida de función de PS en la edad adulta del animal produce una pérdida en el grosor de corteza y astrogliosis incrementados cuando se comparan con animales en los que la pérdida de función de PS ocurrió a una edad temprana. Esta observación inicial parece indicar que existen eventos concretos causados por la pérdida de función de PS que se puedan ver afectados por el momento 124 V Discusión del envejecimiento en el que ocurre. Una observación interesante derivada de estos experimentos es que la pérdida del grosor de corteza en animales PScKOyoung en el intervalo de 1 a 7 meses fue del 16% que incrementó a un 38% a la edad de 13 meses. Estos datos suponen una reducción en la corteza de los ratones PScKOyoung del 16% en el intervalo de 1 a 7 meses y del 22% en el intervalo de los 7 a los 13 meses. El porcentaje de reducción de corteza en el intervalo de edad desde los 7 a los 13 meses observado en los animales PScKOadult fue del 20%. Estos datos parecen indicar que la mayor neurodegeneración cortical observada en el periodo de 7 a 13 meses en los animales PScKOtemp no es consecuencia directa de un periodo previo de ausencia de función de PS, sino de un punto concreto del envejecimiento que parece ser más sensible a esta falta de función. Los ensayos en los animales PScKOadult forman parte de un abordaje experimental más extenso (Figura 30). En el grupo estamos completando la obtención y caracterización de animales PScKOold. De esta manera, se podrá comparar las consecuencias de una pérdida de función de PS de la misma duración, pero iniciada a tres edades distintas, joven (1 mes), adulto (7 meses) y viejo (12 meses). De igual manera, sería interesante en experimentos futuros la inclusión de otros marcadores cuantificables asociados con la pérdida de función de PS, por ejemplo, el estudio de la hiperfosforilación de la proteína Tau. Se ha mostrado una intensa hiperfosforilación de Tau en experimentos de Western blot empleando lisados provenientes de animales PScKO a los 9 meses de edad (Saura et al., 2004). Otro factor de estudio relevante es el análisis de densidad de espinas dendríticas. Mediante la tinción de Golgi-Cox, se ha descrito una pérdida de la arborización dendrítica y de la densidad de espinas dendríticas en neuronas de la región CA1 del hipocampo de animales PScKO de 9 meses (Saura et al., 2004). Un último factor sería el estudio de la apoptosis y muerte neuronal. Otros grupos han realizado análisis de la presencia de células positivas para caspasa-3 y -9 activadas y ensayos de terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated biotinylated UTP nick end labeling (TUNEL) en animales PScKO. Estos grupos encontraron un incremento significativo de las células positivas para caspasa-3 y -9 activadas en la corteza de animales PScKO de 2 y 4 meses de alrededor de 2 veces las presentes en animales controles. Por otro lado, reportaron un incremento significativo de entre 7 y 15 veces de células TUNEL+ en la corteza de animales PScKO del mismo rango de edad 125 V Discusión (Watanabe et al., 2014; Wines-Samuelson et al., 2010). En conjunto, la validación funcional del modelo PScKO regulable por tamoxifeno, la escisión de Psen1 en tres puntos distintos durante el envejecimiento, junto con el estudio de un número de marcadores cuantificables asociados con neurodegeneración, astrogliosis, microgliosis y muerte celular, nos permitirá determinar cómo afecta el envejecimiento en la pérdida de función de PS. Sin embargo, podría ocurrir que en estos estudios no se observaran diferencias significativas en ninguno de los marcadores analizados. Aunque un resultado negativo, estos datos indicarían que el fenotipo neurodegenerativo ocurre en la misma magnitud con independencia de la edad de inicio de la pérdida de función de PS, un resultado en sí mismo relevante. El análisis posterior de las rutas y sustratos alterados en las muestras de estos animales nos permitirá concluir la existencia, o no, de mecanismos responsables coincidentes. 3 Impacto del acúmulo específico de NrxnCTF. Como se ha indicado anteriormente, un factor relevante en el estudio de la falta de función de PS es la identificación de sustratos de PS/γ-secretasa concretos que produzcan los defectos sinápticos, de memoria y neurodegenerativos asociados con AD. Estudios previos del grupo han sugerido que las Nrxns pueden ser uno de los sustratos relevantes que medien los defectos sinápticos y de memoria ocasionados por una falta de función de PS. La pérdida de función de PS por mutaciones asociadas a FAD o mediante abordajes farmacológicos o genéticos impide el correcto procesamiento de Nrxns, llevando a la acumulación del sustrato de PS, NrxnCTF, en el terminal presináptico in vitro e in vivo (Sánchez-Hidalgo et al., 2022; Saura et al., 2011; Servián-Morilla et al., 2018). La acumulación del NrxnCTF en los terminales presinápticos de neuronas glutamatérgicas en los animales PScKO es un evento que ocurre a una edad temprana que coincide con defectos en plasticidad sináptica y de memoria (Saura et al., 2011). Además, el acúmulo específico de NrxnCTF, sin afectar al resto de sustratos de PS, produce defectos en la liberación de neurotransmisor, en plasticidad presináptica y en memoria asociativa (Sánchez-Hidalgo et al., 2022; Servián-Morilla et al., 2018). Estos datos nos han llevado a sugerir que NrxnCTF es un buen candidato para mediar los defectos asociados a la pérdida de función de PS en FAD. La acumulación de NrxnCTF en el terminal presináptico 126 V Discusión podría competir con ligandos sinápticos que se unan al dominio citoplásmico de Nrxns en el mismo terminal, desestabilizando así el correcto entramado proteico necesario para la liberación de neurotransmisor. En este sentido, hemos demostrado que NrxnCTF interacciona con CASK, una proteína que forma un complejo con Nrxns que interviene en la liberación de neurotransmisor (Servián-Morilla et al., 2018; Butz et al., 1998). También existe la posibilidad hipotética de que la acumulación de NrxnCTF actúe de manera transsináptica, alterando la interacción de Nrxns con ligandos postsinápticos, como Nlgns. Por tanto, los trabajos del grupo han demostrado un papel perjudicial de la acumulación de NrxnCTF en AD. La identificación de sustratos específicos de PS es un paso esencial para la identificación de dianas terapéuticas, pero es necesario tener en cuenta que la pérdida de función de PS en FAD desencadena el procesamiento incorrecto de sus numerosos sustratos, no de un único sustrato. Esto podría tener importantes consecuencias en la patología. Por un lado, el efecto deletéreo de un CTF determinado podría verse modulado al alza por la acumulación de los fragmentos CTFs de otros sustratos generados en paralelo. Por otro lado, podría ocurrir que, aunque el acúmulo selectivo de un fragmento CTF concreto no tuviera por sí mismo un efecto determinado, la combinación con otros sustratos resultara en la aparición de dicho efecto. Para poder analizar la posible interacción de NrxnCTF con otros sustratos de PS/γsecretasa, hemos incrementado los niveles de NrxnCTF en un contexto de pérdida general de función de PS. Los animales PScKO;NrxnCTF (PS1f/f; PS2-/-; CaMKII-CreERT2; CaMKII-HA-NrxnCTF) se diseñaron para inducir la expresión transgénica de NrxnCTF en las mismas neuronas glutamatérgicas del prosencéfalo adulto carentes de actividad de PS en los animales PScKO. Realizamos una caracterización bioquímica de la expresión del transgén HA-NrxnCTF y del estado del procesamiento de otros sustratos relevantes de PS en animales PScKO;NrxnCTF. Observamos que la expresión del transgén HA-NrxnCTF era indetectable en los animales simples transgénicos CaMKII-HA-NrxnCTF. Sin embargo, el transgén NrxnCTF se detectó en los animales PScKO;NrxnCTF. La explicación más plausible de estos resultados es que la presencia de actividad de PS impide la acumulación de NrxnCTF en los ratones CaMKII-HA-NrxnCTF, mientras que la pérdida de función de PS resulta en el acúmulo de NrxnCTF en los animales PScKO;NrxnCTF. Estos datos suponen, además, una confirmación adicional de que NrxnCTF es un sustrato in vivo de PS. Mediante el empleo del anticuerpo Pan-Nrxn observamos un incremento total de 127 V Discusión NrxnCTF en los animales PScKO;NrxnCTF que proviene de la suma de la acumulación de NrxnCTF endógeno y de HA-NrxnCTF transgénico. Se han identificado dos sitios de procesamiento del ectodominio en Nrxn1 y Nrxn3, sugiriendo la existencia de dos sitios de corte, uno mayoritario cercano al segmento transmembrana, y otro minoritario situado al N-terminal de éste (Borcel et al., 2016; Servián-Morilla et al., 2018). La detección de una única banda producida por el transgén HA-NrxnCTF podría indicar que la secuencia codificada por este transgén comienza a partir del residuo producido por el sitio de corte mayoritario y que carece del segundo sitio de procesamiento. Por otro lado, el análisis de otros sustratos de PS, como APP y N-Cadherina, determinó que el acúmulo de sus correspondientes CTFs se produce en los animales PScKO;NrxnCTF a niveles comparables a los detectados en los animales PScKOyoug. De esta manera, demostramos que en los ratones PScKO;NrxnCTF se produce un incremento específico de NrxnCTF en un contexto de pérdida de función de PS, sin afectar de forma general la acumulación de otros sustratos. A continuación, estudiamos la localización celular del transgén HA-NrxnCTF mediante experimentos de inmunohistoquímica en cortes coronales de cerebro. Detectamos expresión de HA-NrxnCTF en regiones de corteza e hipocampo, entre las que destacó una intensa tinción positiva en una región del hipocampo preferentemente presináptica, el stratum lucidum, donde HA-NrxnCTF se concentró en los axones que provienen del giro dentado hacía la región CA3. Esta localización aparentemente presináptica concuerda con la localización observada in vivo para NrxnCTF en nuestros trabajos previos mediante experimentos de Western blot (Sánchez-Hidalgo et al., 2022; Saura et al., 2011). El patrón de expresión del transgén NrxnCTF en este contexto de pérdida de función de PS puede reflejar regiones concretas del cerebro donde el procesamiento de Nrxns por PS sea más relevante. A continuación, pasamos a estudiar si el incremento en NrxnCTF modula los efectos causados por la pérdida de función de PS. Analizamos cortes de cerebro de animales PScKO;NrxnCTF de 13 meses de edad para estudiar marcadores de neurodegeneración, astrogliosis y astrocitosis ya observados en los animales PScKOyoug. Los datos obtenidos indican que el incremento en los niveles de NrxnCTF parece tener un leve efecto negativo en la densidad neuronal en corteza, donde detectamos una reducción de la densidad de células NeuN+ del 12% respecto a animales PScKOyoung. El resto de los marcadores 134 V Discusión la expresión de un mecanismo compensatorio que puede ser una limitación para la identificación de defectos cuando se emplea un modelo animal no relacionado con enfermedad. El periodo relativamente largo que va desde el descenso en Nlgn1 hasta la aparición completa de los efectos sinápticos en el ratón HTZ Nlgn1 Thr271fs ofrece una ventana experimental para descubrir dianas moleculares con la finalidad de atenuar la disfunción sináptica y de memoria en AD. Por último, estos experimentos ponen de manifiesto la necesidad en biomedicina de la generación de modelos animales que reproduzcan con fidelidad la perturbación identificada en pacientes. En una mayoría de casos, las mutaciones en genes autosómicos se encuentran en heterocigosis, afectando a un único alelo del gen. Sin embargo, una aproximación empleada con cierta asiduidad es la generación de modelos animales modificados genéticamente en los dos alelos del gen de estudio, esperando alcanzar el mismo fenotipo, pero en mayor magnitud o en un plazo de tiempo más corto. Si bien, la existencia de mecanismos compensatorios o alteraciones dependientes de dosis, como las descritas en esta Tesis, pueden alterar el fenotipo, especialmente en un órgano con una diversidad amplia de mecanismos homeostáticos como es el cerebro. Figura 57. Representación de las alteraciones en la sinapsis Nrxn-Nlgn1 en el modelo animal Nlgn1 Thr271fs. En la sinapsis wild type Nlgn1 recluta receptores AMPA y NMDA. En la reducción al 50% de Nlgn1 puede ocurrir una disminución en los receptores AMPA no rescatada por Nlgn3, la expresión parcial de Nlgn1 es suficiente para mantener los niveles sinápticos de NMDAR. En la sinapsis con ausencia total de Nlng1 se produce una reducción en los receptores NMDA mientras que los receptores AMPA son recatados por el incremento en los niveles de Nlgn3. Esquema realizado con Biorrender.com 135 V Discusión 5 Estudio de la interacción de Neuroliguina1 con APP in vivo Datos recientes in vitro apuntan a la existencia de una relación de Nlgn1 con APP en AD. Nlgn1 podría actuar como un nucleador sináptico de Aβ que indujera su agregación, como se ha propuesto mediante experimentos de surface plasmon-resonance (Brito- Moreira et al., 2017; Dinamarca et al., 2011, 2015). Por otra parte, la inhibición de Nlgn1 podría mediar los efectos sinápticos y de memoria en AD mediante interacción directa con el péptido Aβ o por un mecanismo epigenético inducido por el mismo (Bie et al., 2014). Para poder abordar el papel que juega la interacción de APP con Nlgn1 in vivo, durante esta Tesis Doctoral se ha generado un nuevo modelo animal que expresa la mutación hAPPSL asociada con AD en fondos genéticos con niveles reducidos de Nlgn1. Como modelo animal de pérdida de expresión de Nlgn1 empleamos los ratones Nlgn1 Thr271fs que expresan un alelo inactivante de Nlgn1. Los animales APP751SL; Nlgn1 de los diferentes genotipos nacieron con la proporción mendeliana esperada y no presentaron diferencias en el peso. Sin embargo, pudimos detectar un gran efecto en la supervivencia temprana de los mismos. La supervivencia antes de los 120 días se redujo al 65% en los ratones APP751SL; Nlgn1partial y al 40% en los ratones APP751SL; Nlgn1null, mientras que en los ratones APP751SL la supervivencia fue superior al 60%. Encontramos datos previos en la bibliografía donde se reporta un incremento en la mortalidad en las primeras semanas de vida en ratones transgénicos portadores de la mutación Swedish en APP y una mutación patogénica en el gen de PSEN1 humano (Y. Huang & Lemke, 2022; Minkeviciene et al., 2009; Tzeng et al., 2018). Es interesante resaltar que este efecto en la mortalidad ocurre antes de los 4 meses de vida, edad a partir de la cual se ha descrito que comienza a detectarse el acúmulo de Aβ en los animales APP751SL (V. Blanchard et al., 2003). Nuestros datos también revelaron una ausencia de expresión detectable de Aβ en los ratones APP751SL; Nlgn1partial y en los ratones APP751SL; Nlgn1null antes de los 4 meses (datos no mostrados). Por tanto, el incremento en la mortalidad temprana provocado por una ausencia de Nlgn1 podría ser independiente de la expresión de Aβ y depender de otro tipo de interacciones entre APP y Nlgn1. Existen numerosos datos que apoyan un papel de APP como una proteína de adhesión sináptica, similar a Nlgn1. Se ha mostrado una co-localización parcial de APP con NR1 y PSD-95 en cultivos de neuronas de hipocampo, además de observarse un incremento en la densidad de espinas dendríticas cuando se 136 V Discusión sobreexpresa APP en cultivo (Hoey et al., 2009; K. J. Lee et al., 2010). En experimentos de co-cultivo, se ha demostrado que la expresión de APP en células no neuronales promueve la formación de sinapsis en los axones que contactan (Wang et al., 2012). Más recientemente, se ha demostrado que Nrxns son sustratos presinápticos de APP durante la formación de sinapsis (Cvetkovska et al., 2022). Por otro lado, se ha descrito la interacción de APP con Nrxn1 y 2 en el cerebro de ratones (Norstrom et al., 2010). Por tanto, la ausencia de Nlgn1 junto con la expresión de un mutante de APP podría estar interfiriendo en el correcto funcionamiento de las sinapsis glutamatérgicas de manera independiente a la formación de Aβ. A continuación, analizamos los niveles de Aβ en el cerebro de animales APP751SL; Nlgn1. Seleccionamos una edad avanzada, 13 meses, en la que los efectos causados por Aβ en el ratón APP751SL son muy evidentes (J. Blanchard et al., 2008, 2011; V. Blanchard et al., 2003). Los resultados de los Western blots realizados revelaron que los animales con la mitad de dosis de Nlgn1 mantenían unos niveles de Aβ comparables a los ratones simples transgénicos APP751SL, mientras que los animales carentes de expresión de Nlgn1 mostraron un notable descenso en los niveles de Aβ. No encontramos cambios en los niveles totales de APP en ninguno de los genotipos (datos no mostrados). La reducción en los niveles de Aβ podría explicarse de varias maneras. Por un lado, Nlgn1 podría estar actuando como anclaje y estabilizador de los oligómeros de Aβ, por lo que la ausencia de Nlgn1 reduciría la nucleación de Aβ facilitando su eliminación. Por otro lado, la falta de Nlgn1 podría estar actuando sobre el propio procesamiento de APP, reduciendo de alguna manera el procesamiento amiloidogénico, con la consecuente reducción en los niveles de Aβ. Tras la sorprendente reducción de los niveles de Aβ detectada en lisados de los animales APP751SL; Nlgn1null, decidimos profundizar en el análisis de los defectos asociados al acúmulo de Aβ en el cerebro. Entre las patologías asociadas con el acúmulo de Aβ encontramos el depósito de formas de Aβ en forma de placas cerebrales (J. Blanchard et al., 2009), la hiperfosforilación de la proteína Tau asociada a estos depósitos (Boutajangout et al., 2004), una activación de la microglía (Jimenez et al., 2008) y una agregación de astrocitos alrededor de las placas (Brasnjevic et al., 2013). Realizamos un análisis por inmunohistoquímica en rodajas de cerebro en animales de 13 meses de edad donde comparamos la patología Aβ en animales APP751SL con animales APP751SL; Nlgn1null. 137 V Discusión Los animales APP751SL mostraron una patología avanzada con una abundante formación de depósitos fibrilares de Aβ distribuidos por toda la corteza. Además, encontramos numerosos agregados de astrocitos, un aumento en la densidad de pTau y una alta presencia de microglía. Sorprendentemente, en los animales con ausencia total de Nlgn1 observamos una drástica reducción en la densidad de depósitos fibrilares acompañada de una disminución importante de los agregados de astrocitos alrededor de los mismos y de una reducción, prácticamente a niveles de los animales wild-tipe, de los niveles de Tau fosforilada. La densidad microglial no pareció verse afectada respecto a animales APP751SL. Hay que destacar que el número experimental de animales APP751SL; Nlgn1 disponible para el análisis histológico y bioquímico se vio reducido debido a la elevada mortalidad sufrida por este genotipo. A pesar de ello, cabe destacar que la reducción causada por la ausencia de Nlgn1 en el efecto patológico asociado con Aβ fue muy evidente, incluso a pesar de la alta expresión esperada para Aβ en la edad avanzada de los animales de estudio. Actualmente, en el grupo se están creciendo nuevas colonias de animales en el grupo para la confirmación de estos resultados y la continuación del estudio. En conjunto, estos datos sugieren un papel potencial de Nlgn1 upstream del péptido Aβ, durante su generación o mantenimiento, que explicara la reducción en los niveles del péptido Aβ y la mejora generalizada de la patología ante la ausencia de Nlgn1. Por otra Figura 58. Esquema representativo de una sinapsis glutamatérgica wild type y en AD. En la sinapsis en AD observamos a el péptido Aβ en el espacio sináptico interaccionando con Nlgn1 llevando a una reducción en los niveles de la misma 138 V Discusión parte, los datos presentados en esta Tesis Doctoral con el ratón Nlgn1 Thr271fs que reproduce una mutación inactivante en NLGN1 asociada con AD, han mostrado que una reducción parcial de Nlgn1 puede desarrollar síntomas sinápticos y de memoria asociados con la enfermedad. Una posibilidad para conciliar estos distintos escenarios es que Nlgn1 actuara a dos niveles en AD: upstream, facilitando la generación, nucleación o mantenimiento del péptido Aβ y downstream, mediando los defectos sinápticos y de memoria causados por la propia reducción de Nlgn1 en AD (Figura 58). El esclarecimiento del papel desempeñado por Nlgn1 en el metabolismo o la función de APP in vivo puede tener importantes consecuencias clínicas, como la identificación de aproximaciones terapéuticas enfocadas a preservar la función normal de Nlgn1 y/o a bloquear la interacción con metabolitos de APP, que pudieran paliar la progresión o aparición de los síntomas de AD. VI. CONCLUSIONES 140 VI Conclusiones Los resultados mostrados en esta Tesis Doctoral permiten extraer las siguientes conclusiones: 1. El desarrollo de un modelo experimental que combina la expresión neuronal de Neurexinas con la expresión de Neuroliguinas en la membrana opuesta permite analizar el reclutamiento de isoformas concretas de Neurexinas a los contactos sinápticos. 2. Neuroliguina 1 recluta preferentemente a βNeurexina 1 a los terminales presinápticos glutamatérgicos, mientras que Neuroliguina 2 recluta a α- y βNeurexina 1 a los terminales GABAérgicos. La inserción del sitio de splicing 4 en Neurexina 1 tiene un efecto modulador negativo en ambas isoformas. 3. El desarrollo de los ratones condicionales PScKOtemp permite la deleción temporal de Psen1 en las neuronas del prosencéfalo durante el envejecimiento. 4. Los ratones PScKOyoung presentan una neurodegeneración cortical progresiva hasta los 13 meses de edad, acompañada de astrogliosis y microgliosis. 5. La pérdida de función de Presenilinas en edad adulta genera una reducción en el grosor de la corteza y un aumento en la astrogliosis de magnitud ligeramente superior a la producida por la pérdida de función de Presenilinas de la misma duración en edad juvenil. 6. Los ratones PScKO;NrxnCTF expresan el transgén NrxnCTF en hipocampo y corteza en ausencia de Presenilinas, sin afectar la acumulación general de sustratos de Presenilinas. El patrón de expresión del transgén en el hipocampo concuerda con una localización preferentemente presináptica. 7. El incremento selectivo de la acumulación de NrxnCTF en los ratones PScKO;NrxnCTF permite analizar los efectos de dosis provocados por la falta de 141 Conclusiones VI procesamiento de Neurexinas en un contexto de pérdida de función de Presenilinas. 8. La mutación Nlgn1 Thr271fs asociada a la enfermedad de Alzheimer genera un alelo nulo con la consecuente reducción en los niveles de Neuroliguina 1 al 50% en heterocigosis y la ausencia total de expresión en homocigosis. 9. Los ratones heterocigotos Nlgn1 Thr271fs no presentan defectos relacionados con enfermedades del neurodesarrollo, mientras que los ratones homocigotos Nlgn1 Thr271fs muestran hiperactividad, un incremento en comportamientos repetitivos y un déficit sutil en la interacción social. 10. Los ratones heterocigotos Nlgn1 Thr271fs presentan una menor duración de la memoria de reconocimiento. Este defecto no ocurre en los ratones homocigotos Nlgn1 Thr271fs. Por el contrario, los ratones homocigotos Nlgn1 Thr271fs presentan una menor expresión de la memoria asociativa de miedo, que no aparece en los ratones heterocigotos Nlgn1 Thr271fs. 11. Los ratones heterocigotos Nlgn1 Thr271fs presentan una densidad normal de espinas dendríticas en las neuronas CA1 del hipocampo, acompañada de niveles normales de los componentes de sinapsis excitatorias estudiados. Los ratones homocigotos Nlgn1 Thr271fs presentan un incremento específico en los niveles de Neuroliguina 3, sugiriendo la existencia de un mecanismo compensatorio asociado a una pérdida total de Neuroliguina 1. 12. La expresión del transgén hAPP751SL en un contexto de niveles decrecientes de Neuroliguina 1 no tiene impacto sobre el peso de los animales. Sin embargo, se incrementa la mortalidad temprana de forma inversa a los niveles de Neuroliguina 1. 13. La ausencia de Neuroliguina 1 reduce drásticamente los niveles de Aβ y la patología asociada en el limitado número de ratones estudiados. 142 VII. ANEXOS 143 VII Anexos 1 Análisis electrofisiológico de los animales Nlgn1 Thr271fs Los experimentos que se detallan a continuación se realizaron en el grupo de investigación del Dr Antonio Rodríguez Moreno (Universidad Pablo de Olavide). La caracterización fenotípica de los animales Nlgn1 Thr271fs ha mostrado defectos diferentes en los animales HTZ y HMZ Nlgn1 Thr271fs, sugiriendo que pudieran estar afectados distintos mecanismos sinápticos. La implicación del hipocampo en la memoria espacial y no espacial, así como las sinapsis CA3-CA1 están ampliamente estudiadas en la literatura. Se ha descrito previamente como una ausencia total de Nlgn1 en los animales KO Nlgn1 tienen un descenso en la LTP en las sinapsis CA3-CA1 (Blundell et al., 2010). Se realizaron registros electrofisiológicos de campo en rodajas de hipocampo de animales HTZ y HMZ Nlgn1 Thr271fs de 4-6 meses de edad. Las curvas de input-output fueron similares a los animales Nlgn1 Thr271fs tanto en animales HTZ como HMZ Nlgn1 Thr271fs. Tampoco se encontró afectada la facilitación paired-pulse (PFF) (Figura 59). Figura 59. Registros electrofisiológicos en el área CA1 del hipocampo de animales Nlgn1 Thr271fs jóvenes. A y B.- Curvas input-output. N= 6 wild type, 6 HTZ Nlgn1 Thr271fs, 6 HMZ Nlgn1 Thr271fs. C.- Paired-pulse ratio en rodajas hipocampales. N= 12 wild type, 19 HTZ Nlgn1 Thr271fs, 7 HMZ Nlgn1 Thr271fs. D.- Pendiente del fEPSP a lo largo del tiempo antes y después de la inducción de LTP en la región CA1 del hipocampo. E y F.- Cuantificación de la LTP temprana (e-LTP) o tardía (L-LTP). N= 15 wild type, 22 HTZ Nlgn1 Thr271fs, 8 HMZ Nlgn1 Thr271fs. ANOVA de una vía con posthoc Tukey. * p<0.05. Las barras de error representan la SEM.