Microorganismos Extremófilos, vida microbiana más allá de sus condiciones óptimas

MICROORGANISMOS EXTREMÓFILOS. VIDA MICROBIANA MÁS ALLÁ DE SUS CONDICIONES ÓPTIMAS Memoria que presenta José Antonio Delgado Romero para optar al título de Doctor en Biología Integrada En Sevilla, a………de………..…...de 2021 I MICROORGANISMOS EXTREMÓFILOS. VIDA MICROBIANA MÁS ALLÁ DE SUS CONDICIONES ÓPTIMAS Visado en Sevilla, a ….. de …………… de 2021 EL DIRECTOR Dr. D. JUAN MIGUEL GONZÁLEZ GRAU Investigador científico del CSIC IRNAS-CSIC El TUTOR Dr D. FERNANDO PUBLIO MOLINA HEREDIA Profesor titular de la Universidad de Sevilla Facultad de Biología II III DOCTOR D. JOSÉ ENRIQUE FERNÁNDEZ LUQUE, DIRECTOR DEL INSTITUTO DE RECURSOS NATURALES Y AGROBIOLOGÍA DE SEVILLA DEL CONSEJO SUPERIOR DE INVESTIGACIONES CIENTÍFICAS. Certifica: Que la presente memoria de investigación titulada “MICROORGANISMOS EXTREMÓFILOS, VIDA MICROBIANA MÁS ALLÁ DE SUS CONDICIONES ÓPTIMAS”, presentada por D. JOSÉ ANTONIO DELGADO ROMERO para optar al grado de Doctor en BIOLOGÍA INTEGRADA, ha sido realizada en el Departamento de Biogeoquímica, Ecología Vegetal y Microbiana, bajo la dirección del Dr. D. JUAN MIGUEL GONZÁLEZ GRAU, reuniendo todas las condiciones exigidas a los trabajos de Tesis Doctorales. En Sevilla, a …….. de…………...de 2021. IV V El siguiente trabajo se ha realizado en el marco del proyecto CGL2014- 58762-P del Plan Nacional de I+D+i, Proyectos de Excelencia 2015-2017, dentro del Programa Nacional de Formación de Personal Investigador. VI ÍNDICE ÍNDICE. ................................................................................................................. VII ÍNDICE DE TABLAS Y FIGURAS. ........................................................................ XI RESUMEN. .......................................................................................................... XIV Capítulo 1: Introducción. ...................................................................................... 1 1.1. Extremófilos. ..................................................................................................... 7 1.2. Termófilos. ........................................................................................................ 8 1.3. Geobacillus y microorganismos afines. ......................................................... 13 1.4. Objetivos. ....................................................................................................... 18 1.5. Bibliografía. .................................................................................................... 21 1.6. Anexo. ............................................................................................................ 52 Capítulo 2: Respuesta fisiológica de Parageobacillus thermoglucosidasius 23.6 a tasas de crecimiento cercanas a cero. .................................................. 58 2.1. Resumen. ....................................................................................................... 59 2.2. Introducción. ................................................................................................... 60 2.3. Materiales y métodos. .................................................................................... 70 2.3.1.Quimiostato. ...................................................................................... 70 2.3.2. Retentostato. .................................................................................... 72 2.3.3. Medidas. ........................................................................................... 72 2.3.4. Cálculo de la tasa de crecimiento en un cultivo continuo. ............... 74 2.4. Resultados. .................................................................................................... 78 2.4.1. Crecimiento y viabilidad. .................................................................. 80 VII 2.4.2. Morfología celular. ............................................................................ 83 2.5. Discusión. ....................................................................................................... 86 2.5.1. Crecimiento en situaciones limitantes. ............................................. 86 2.5.2. Biovolumen celular en relación a la tasa de crecimiento. ................ 89 2.6. Conclusiones. ................................................................................................. 91 2.7. Bibliografía. .................................................................................................... 92 Capítulo 3. Análisis genómico de la cepa Parageobacillus thermoglucosidasius 23.6. ............................................................................... 100 3.1. Resumen. ..................................................................................................... 101 3.2. Introducción. ................................................................................................. 102 3.2.1. Genómica. ...................................................................................... 102 3.2.2. Transferencia horizontal de genes. ................................................ 105 3.2.3. Genómica en Geobacillus y Parageobacillus. ............................... 110 3.3. Materiales y métodos. .................................................................................. 114 3.3.1. Muestreo. ........................................................................................ 114 3.3.2. Identificación, secuenciación y anotación de la cepa. ................... 114 3.3.3. Pan-genoma. .................................................................................. 117 3.3.4. Clasificación funcional de genes ortólogos (COGs). ..................... 118 3.3.5. Análisis GhostKOALA del pangenoma.. ......................................... 119 3.3.4. Usos de codones. .......................................................................... 120 3.4. Resultados. .................................................................................................. 121 3.4.1. Características generales del genoma. ......................................... 121 3.4.1.1. Tmp1. ............................................................................... 123 3.4.1.2. Tmp2. ............................................................................... 127 3.4.1.3. Tmp3. ............................................................................... 129 3.4.1.4. Tmp4. ............................................................................... 133 VIII 3.4.2. Pan-genoma. .................................................................................. 138 3.5. Discusión. ......................................................................................................148 3.6. Conclusiones. ................................................................................................152 3.7. Bibliografía. ...................................................................................................154 3.8. Anexos. ..........................................................................................................166 Capítulo 4: Análisis transcripcional de la cepa Parageobacillus thermoglucosidasius 23.6 a tasas de crecimiento cercanas a cero. ...........170 4.1. Resumen. ......................................................................................................171 4.2. Introducción. ..................................................................................................172 4.3. Materiales y métodos. ...................................................................................180 4.3.1. Quimiostato y retentostato. .............................................................180 4.3.2. Análisis transcriptómico. ..................................................................182 4.4. Resultados. ...................................................................................................185 4.4.1. Análisis del transcriptoma. ..............................................................187 4.4.2. Regulación transcripcional de las rutas metabólicas generales. ....192 4.4.3. Regulación transcripcional de las rutas secundarias. ....................195 4.4.4. Análisis transcripcional de Tmp2, Tmp3 y Tmp4. ...........................197 4.5. Discusión. ......................................................................................................202 4.6. Conclusiones. ................................................................................................210 4.7. Bibliografía. ....................................................................................................211 4.8. Anexo. ...........................................................................................................219 IX Capítulo 1 La mayor diversidad y abundancia de organismos en nuestro planeta está constituida por los microorganismos. En tan solo 10g de suelo se pueden encontrar unas 1011 bacterias, una cifra similar al número de estrellas que hay en la Vía Láctea (Curtis et al., 2002; González et al., 2012). Además, los microorganismos regulan el buen funcionamiento de los ecosistemas a través de su papel esencial en los ciclos biogeoquímicos (Whitman et al., 1998; Uroz et al., 2009). El avance de la microbiología ha ido de la mano de nuevos métodos para detectar y comprender la presencia de los microorganismos en diversos ambientes y, en los últimos años, llegar a entender la enorme diversidad microbiana existente en nuestro planeta (Pedros-Alió, 2006). Desde la época de Aristóteles hasta la década de los 60, los investigadores se basaban en aspectos morfológicos, fisiológicos o ambos para clasificar taxonómicamente los microorganismos. Sin embargo, los microorganismos, en parte por su reducido tamaño (generalmente un micrómetro de diámetro), son difíciles de clasificar en base a estas características sobretodo por la enorme diversidad que presentan. A finales de los 60, Woese sugirió que la manera mas fiable de diferenciar y clasificar las formas de vida de nuestro planeta (desde las bacterias mas simples hasta los animales mas complejos) serían las variaciones existentes en genes universales (presentes en todos los organismos), como por ejemplo la subunidad pequeña del ARN ribosomal (SSU rRNA). En 1977, Woese y Fox indicaron que toda forma de vida se puede clasificar en uno de los tres grandes Dominios que propusieron: Eucariotas, Eubacterias y Arqueobacterias (Woese y Fox, 1977). Demostrando así por primera vez que las formas de vida pueden analizarse filogenéticamente y existe una relación evolutiva entre ellas. 2 Introducción Fue en 1990 cuando Woese y sus colaboradores propusieron los tres grupos filogenéticos principales, o Dominios, asignándoles su designación actual: Eucarya, Bacteria y Archaea (Figura 1.1) (Woese et al., 1990). Figura 1.1. Árbol filogenético simplificado de los organismos vivos basado en las secuencias de genes de las subunidades pequeñas del ARN ribosomal (modificado del modelo propuesto por Woese, 1990). Según se plantea en el árbol filogenético propuesto por Woese y sus colaboradores los genes se transmiten verticalmente de generación en generación. Sin embargo, hoy en día se sabe que la herencia vertical no es el único proceso evolutivo generado por la transferencia de material genético. La 3 Capítulo 1 transferencia horizontal de genes (transferencia de material genético entre distintas especies o grupos taxonómicos) afecta muy significativamente a la evolución de los microorganismos, transformándose el modelo de árbol filogenético inicial (Figura 1.1), en uno mucho más complejo en el que se proponen un gran número de interacciones entre las distintas líneas evolutivas tomando el aspecto de red (Figura 1.2) (Doolittle, 2000). Figura 1.2. Árbol filogenético simplificado que incluye interacciones evolutivas por transferencia horizontal de genes en los seres vivos (Doolittle, 2000). 4 Introducción A lo largo de la evolución, los microorganismos han sido capaces de colonizar prácticamente todo tipo de ambientes en nuestro planeta incluyendo un rango amplio de condiciones de temperatura, pH, salinidad, etc. Esta colonización ha sido posible, en parte gracias a la gran diversidad metabólica y fisiológica alcanzada por los microorganismos, un aspecto muy importante a la hora de comprender la diversidad del mundo microbiano que no se restringe únicamente a la diversidad específica, sino que va mas allá y se complementa con un amplio rango de posibilidades metabólicas y modos de vida. El camino seguido por la Microbiología hasta alcanzar los niveles de conocimiento actuales ha sido lento y difícil, generalmente ligado a nuevos desarrollos metodológicos. Hasta los años 70, los microorganismos se pensaban que eran escasamente diversos debido a que únicamente se detectaban al cultivarlos en el laboratorio. En la siguiente década comenzaron a teñirse los microorganismos con colorantes fluorescentes (naranja de acridina, DAPI, etc.) dirigidos a la tinción de las proteínas o ácidos nucleicos de las células (Hobbie et al., 1977; Porter y Feig, 1980). De este modo, se pudieron enumerar las bacterias presentes en distintos ambientes viéndose que eran enormemente abundantes. Por ejemplo, un mililitro de agua mineral potable contiene aproximadamente un millón de bacterias y un gramo de suelo puede contener alrededor de 1010 bacterias. Sin embargo, la diversidad existente en esas abundantes comunidades microbianas se creía que era reducida a unas pocas especies. Estas especies eran aquellas fácilmente cultivables en el laboratorio y clasificadas taxonómica y metabólicamente. Sin embargo, con el uso de técnicas de Biología Molecular se comenzó a descubrir una elevada diversidad de microorganismos de modo que se observó que no sólo eran muy abundantes si no también enormemente diversos. Con la introducción de las técnicas de secuenciación masiva o “new generation sequencing” (NGS) se ha podido observar que la diversidad microbiana es enorme y las últimas técnicas 5 Capítulo 1 disponibles a penas nos permiten evaluar la verdadera dimensión de esta gran diversidad. No obstante, aún hoy en día únicamente somos capaces de cultivar aproximadamente el 1% de los microorganismos presentes en muestras ambientales siguiendo métodos generales de cultivo, lo que sugiere que aún queda por estudiar una gran fracción de la enorme diversidad microbiana existente en nuestro planeta (Hugenholtz et al., 1998; González et al., 2003). Con el desarrollo de métodos de secuenciación de última generación (NGS) las técnicas genómicas han experimentado un enorme desarrollo que están permitiendo en la actualidad el estudio y análisis detallado de los genomas bacterianos, incluso ofreciendo la posibilidad de analizar bacterias no cultivadas. Una vez capaces de acceder al genoma de los microorganismos, podemos comenzar a analizar el origen de sus genes y la evolución de los distintos microorganismos. La técnicas genómicas abren las puertas al análisis de la expresión de los genes que contienen los genomas microbianos. Este es el campo de la transcriptómica que nos permite evaluar los niveles de expresión a nivel global de las células bajo condiciones específicas de crecimiento. Los avances de NGS también han servido para impulsar enormemente los estudios transcriptómicos de expresión génica. A pesar de los avances actuales y los nuevos conceptos de abundancia y diversidad en Microbiología, aún no somos capaces de determinar eficientemente el crecimiento de las bacterias en ambientes naturales. Debido al desconocimiento del crecimiento bacteriano en la naturaleza, el concepto actual se basa en la creencia de que los microorganismos alternan condiciones de abundancia de nutrientes o condiciones favorables con períodos de escasez nutricional o condiciones desfavorables (Zambrano et al., 1993; Morita, 1997). En relación a este concepto, la frecuencia y duración de las condiciones limitantes (adversas o bajo estrés) parecen dominar la vida microbiana en su entorno natural (Zambrano et al., 1993; Morita, 1997). Sin embargo, el mundo microbiano en 6 Introducción condiciones que limitan su crecimiento es uno de los aspectos peor comprendidos de la Microbiología actual. Los mecanismos o estrategias utilizadas por los microorganismos para mantener su persistencia en el medio ambiente es un hueco de conocimiento que requiere investigación. 1.1 Extremófilos La palabra extremofilo es un neologismo que fue acuñada en 1974 por el investigador MacElroy (MacElroy, 1974). Es un término híbrido en el que se unen la palabra del Latín Extremus (más externo, distante o alejado) y la palabra Griega filia (atracción, afecto por) resultando su significado en “amigo de condiciones extremas” Debido a la alta diversidad microbiana y a su versatilidad metabólica los microorganismos son capaces de vivir y desarrollarse en una gran variedad de hábitats y condiciones (Cases y De Lorenzo, 2002). El cuerpo humano (por su importancia médica) y los ecosistemas marinos y de agua dulce (por sus implicaciones ambientales) han sido estudiados en profundidad, sin embargo, otros ambientes como aquellos más extremos (en comparación con los parámetros fisiológicos del ser humano) han permanecido durante muchos años prácticamente desconocidos ya que inicialmente se consideraron como zonas exentas de vida. Los procariotas son los organismos extremófilos por excelencia aunque también se incluyen como extremos a algunas especies de protozoos, algas y hongos. Cuando las condiciones de los entornos extremos se vuelven mas exigentes los microorganismos dominantes son los procariotas (Horikoshi, 1998). 7 Capítulo 1 Desde un punto de vista antropocéntrico las condiciones extremófilas se definen generalmente como: temperaturas inferiores a 10º C (psicrófilos) y superiores a 40º C (termófilos); pH inferior a 5.0 (acidófilos) y superior a 8.0 (alcalófilos); presión superior a 1 atmósferas (piezófilos); concentración de sal superior a 30 g/ L (halófilos) y baja disponibilidad de agua (condiciones de sequedad): actividad de agua inferior a 0.9 (xerófilos), entre otras. Cualquier microorganismo que requiera algunas de esas condiciones para vivir y crecer se considera extremófilo (Vorgias y Antranikian, 2004). Cuando un microorganismo necesita mas de una condición extrema se denomina poliextremófilo (Canganella y Wiegel, 2010). Los microorganismos extremofilos tienen una gran importancia por su alto potencial biotecnológico ya que atraen gran interés por sus posibles aplicaciones. Por ejemplo, proporcionan una variedad de biomoléculas como enzimas y compuestos que son únicos en la naturaleza (Vorgias y Antranikian, 2004) y presentan elevada estabilidad y durabilidad, aspectos de gran trascendencia en la industria biotecnológica (Vieille and Zeikus, 2001). 1.2 Termófilos Los organismos termófilos son aquellos que crecen en condiciones de alta temperatura. La primera bacteria térmófila descrita se atribuye a Miquel en 1878 y se trataba de un bacilo aislado del rio Sena (Miquel, 1888), aunque en 1866 Brewer describió Chlamydobacterias termófilas en geiseres de California (Brewer, 1866). Los eucariotas pluricelulares generalmente no sobreviven a temperaturas superiores de 60ºC (Tansey and Brock, 1972). La ameba Echinamaeba thermarun es de los pocos eucariotas que crecen de manera óptima en fuentes termales a 50º C (Baumgartner et al., 2003). A finales del siglo XIX y principios del siglo XX 8 Introducción se publicaron numerosos trabajos donde se describieron que las formas mas habituales de termófilos son los bacilos y tienen una naturaleza ubicua debido a la gran variedad de hábitats en los que han sido aislados (Morrison y Tanner, 1922). Se propuso el término termotolerante, para bacterias que crecían tanto a altas como a bajas temperaturas, reservando el término termófilos para bacterias que crecen exclusivamente a temperaturas altas (Schillinger, 1898). En la actualidad los microorganismos se suelen clasificar según su temperatura óptima de crecimiento en psicrófilos (temperatura óptima ≤ 20º C), mesófilos (temperatura óptima entre 20 y 45º C), termófilos (temperatura óptima entre 45 y 60º), termófilos extremos (temperatura óptima entre 60 y 80º C) e hipertermófilos (temperatura óptima ≥ 80º C) (Figura 1.3) Figura 1.3. Clasificación de los microorganismos según su rango de temperatura de crecimiento. (https://courses.lumenlearning.com/microbiology/chapter/temperature-and- microbial-growth/). 9 Capítulo 1 El descubrimiento en 1969 de la bacteria Thermus aquaticus en el Parque Nacional de Yellowstone (Brock y Freeze, 1969) generó un gran interés en el estudio de los microorganismos termófilos y especialmente en el campo de la biotecnología debido al interés que despertó como fuente de enzimas termoestables, producción de exopolisacaridos, bacteriocinas etc. La ADN polimerasa de Thermus aquaticus (taq) es un componente esencial en biología molecular e hizo posible el desarrollo de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) que tan de moda está hoy en día con el diagnostico de coronavirus. Debido al gran potencial de los microorganismos termófilos y sus enzimas en procesos industriales, en las ultimas décadas ha habido gran interés por la búsqueda de nuevos microorganismos termófilos. Existen diversos hábitats en el que los microorganismos termófilos pueden desarrollarse (Mehta y Satyanarayana, 2013), algunos son naturales como las zonas volcánicas con actividad geotérmica, tanto superficiales (fumarolas, solfataras, fuentes termales y geyseres) como subterráneas (reservas de petróleo, lagos y acuíferos, marinas y profundidades abisales) y suelos, sedimentos y cualquier superficie (hojas) calentada por la radiación solar. Otros ambientes se forman de forma natural aunque son aprovechados por el hombre como es el caso de las pilas de compost, y otros ambientes que son, o pueden ser, generados como consecuencia directa de la actividad humana y su industria. Es el caso de plantas de tratamiento de desechos en el rango termófilo, sistemas de calentamiento de agua, producción de productos químicos, procesos y efluentes térmicos de plantas de energía, procesos de limpieza y calentamiento en reactores y conductos de plantas de producción de alimentos y medicamentos entre otros entornos. 10 Introducción Los hábitats con temperaturas altas pueden presentar esas elevadas temperaturas de forma prolongada en el tiempo (fuentes termales, reservas de petróleo, etc) o variable, registrándose altas temperaturas en momentos puntuales de forma ocasional o periódica (superficies calentadas por la radiación solar, diversos procesos industriales que requieren calentamientos periódicos, etc.). El suelo es uno de los hábitats con mayor diversidad microbiana, probablemente, debido a la variabilidad ambiental y a la gran heterogeneidad en su estructura. El clima influye directamente en el suelo, principalmente en su superficie (primeros 10 cm), a través de los cambios estacionales y los ciclos diarios. Dependiendo de la zona geográfica (latitud y altitud) estos cambios pueden ser mas o menos extremos sobre la superficie del suelo (Santana y González, 2015). Mas del 55 % de las tierras emergidas de nuestro planeta se encuentran a latitudes menores de 40º N y 40º S. En esta zona se registran temperaturas elevadas de forma periódica y frecuente a lo largo del año (González et al., 2014) debido a que la incidencia de la radiación solar es mas intensa. En nuestro grupo de investigación hemos comprobado (Portillo et al., 2012) que a temperaturas ambientales de incluso menos de 30º C la superficie de suelos y sedimentos con escasa cobertura vegetal puede alcanzar temperaturas superiores de 45º C. Esta temperatura es adecuada para el desarrollo de microorganismos termófilos como es el caso de los representantes del género Geobacillus y otros géneros relacionados filogenéticamente (González et al., 2014). Un ejemplo es la Península Ibérica donde existen suelos (por ejemplo, Sevilla a 37º N) expuestos aproximadamente un tercio del año a temperaturas ambientales superiores a los 30º C. En otros suelos en latitudes superiores a 40º N (ejemplo, Galicia, provincia de Lugo 42º N) esa frecuencia de altas temperaturas es muy inferior y sólo representan el 1,5% de los días del año (Figura 1.4) 11 Capítulo 1 Comprender como sobreviven los microorganismos en condiciones muy diferentes de las condiciones consideradas óptimas (según cultivos de laboratorio) es un área de la Microbiología que requiere especial atención y experimentación. El modelo de estudio que se sugiere en este trabajo es una bacteria termófila comunmente encontrada en ambientes considerados templados. La presencia y desarrollo de microorganismos extremófilos en ambientes moderados es una pregunta similar a estudiar como sobreviven los microorganismos, llamémosles comunes (de ambientes moderados o mesófilos) a situaciones extremas como, por ejemplo, temperaturas elevadas durante el verano o muy frías durante el invierno, eventos extremos de desecación por escasez de agua, etc. El estudio propuesto contribuirá a analizar estrategias de respuesta de los microorganismos a condiciones diferentes de las condiciones consideradas óptimas para su desarrollo. 1.4. Objetivos El papel de los microorganismos más allá de lo que consideramos como condiciones óptimas para su crecimiento (determinadas por experimentos de laboratorio con cultivos) es tema de gran interés en microbiología ambiental y básico para comprender la dinámica de la comunidades microbianas y el papel y relevancia de los microorganismos en los ambientes naturales, tanto a nivel local (ecosistema) como global (cambio climático). La hipótesis de partida de esta tesis es que los microorganismos son capaces de desarrollar un metabolismo significativo e incluso crecer en condiciones muy diferentes de las que consideramos que son sus condiciones óptimas de crecimiento. 18 Introducción Para abordar esta idea se utilizará un microorganismo termófilo aislado de suelos del Parque Nacional de Doñana (Huelva, España), Parageobacillus thermoglucosidasius cepa 23.6 (CECT 9776). Con objeto de alcanzar ese objetivo general se han planteado los siguientes objetivos concretos: 1- Desarrollo de un sistema de cultivo apropiado para el análisis de tasas de crecimiento muy reducidas, cercanas a crecimiento cero. Hito necesario para los siguientes objetivos concretos. 2- Secuenciación y análisis del genoma de la cepa Parageobacillus thermoglucosidasius 23.6. Hito necesario para los análisis transcriptómicos de los siguientes objetivos concretos y para comprender la capacidad genómica de esta cepa. 3- Evaluar el comportamiento de la cepa estudiada bajo un amplio rango de tasas de crecimiento por análisis transcriptómico de su expresión génica. La limitación de nutrientes es el factor utilizado para limitar su crecimiento. Permitirá alcanzar el hito de comprender la estrategia de persistencia de esta cepa en condiciones adversas, por ejemplo, por limitación nutricional. 4- Evaluar el comportamiento de la cepa estudiada, en base a análisis transcriptómico de expresión génica, durante ciclos de temperatura al fluctuar de una temperatura elevada (óptima, 60º C) a una baja (20º C) simulando un ciclo de temperatura observado en las capas superiores de suelos (ejemplo, en Sevilla). Estos datos permitirán alcanzar el hito de comprender la estrategia de persistencia de la cepa estudiada frente a cambios de temperatura en condiciones observadas en suelos naturales a lo largo de ciclos diarios de la temperatura. 19 Capítulo 1 Cada uno de estos objetivos concretos ha quedado reflejado en un capítulo de este trabajo. 20 Introducción 1.5. Bibliografía Abd Rahman, R. N., Leow, T. C., Salleh, A. B., Basri, M. 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DUSELR13 Mina de Oro Homestake, Dakota del sur Bibra et al., 2018 Geobacillus thermodenitrificans ArzA-6 Sedimentos de un Manantial de agua termales, Armenia Panosyan et al., 2018 Geobacillus toebii ArzA-8 Geobacillus spp. Panosyan et al., 2020 Geobacillus spp. Geobacillus yumthangensis Aguas termales de Sikkim, India Najar et al., 2018 Najar et al., 2020 Geobacillus spp. Suelo de aguas termales de Tapovan, India Rawat y Joshi 2019 Geobacillus spp. K1C Aguas termales de Manikarna, India Sudan et al., 2018 Geobacillus galactosidasius BS61 Aguas termales de Rize/Ayder, Turquía Sari et al., 2018 Geobacillus spp. Aguas termales, Turquía Adiguzel et al., 2009 Geobacillus stearothermophilus ATCC 12980 Aguas termales de Savusavu, Fiji Narayan et al., 2008 Geobacillus icigianus Aguas termales de Surajkund, India Soy et al., 2019 Geobacillus spp. Aguas termales, Túnez Thebti et al., 2016 Geobacillus spp. Aguas termales de Buranga, Uganda Hawunba et al., 2002 Geobacillus thermoglucosidasius C56-YS93 Aguas termales de Yellowstone, Estados Unidos Brumm et al., 2015 52 Introducción Especie Hábitat Referencia Geobacillus spp. Aguas termales, Argelia Benammar et al., 2020 Geobacillus sp. T6 Aguas termales en Salta, Argentina Ortiz et al., 2015 Geobacillus spp. Aguas termales de Gönen and Hisaralan, Turquía Çağlayan y Bilgin, 2011 Geobacillus sp. ZGt-1 Aguas termales de Zara, Jordania Alkhalili et al., 2015 Geobacillus icigianus Strain G1w1 Lodos de aguas termales en Kamchatka, Rusia Bryanskaya et al., 2014 Geobacillus spp. Aguas termales Rekadwad y Khobragade, 2016 Geobacillus spp. Biomasa vegetal en Aguas termales de Sungai Klah, Malasia Lee et al., 2018 Geobacillus thermopakistaniensis MAS1. Aguas termales, Pakistán Siddiqui et al., 2014 Geobacillus kaustophilus Sedimentos de aguas termales, Arabia Saudi Yasir et al., 2019 Geobacillus spp. Aguas termales en Himalaya, India Sahay et al., 2017 Geobacillus spp. Aguas termales Siristova et al., 2009 Geobacillus spp. Aguas termales en Xiamen, China Zhao et al., 2017 Geobacillus spp. Chimeneas hidrotermales en Islas Eolias, Italia Maugeri et al., 2002 Geobacillus spp. Sedimentos de las Fosas Marianas Takami et al., 1997 Geobacillus spp. Chimeneas hidrotermales, Papua Nueva Guinea Kimura et al., 2003 Geobacillus spp. Chimeneas hidrotermales en el Océano Pacífico Wang y Zhang, 2010 Geobacillus spp. Sedimentos de Aguas termales de el Tatio y Liquiñe, Chile Jorquera et al., 2018 Geobacillus sp. 12AMOR1 Sedimentos de Chimeneas hidrotermales en Jan Mayen, Océano Ártico Wissuwa et al., 2016 Geobacillus stearothermophilus Lodos hidrotermales del volcán Campi Flegrei, Italia Puopolo et al., 2020 Geobacillus spp. Lodos y agua de chimeneas hidrotermales, Turquía Yavuz et al., 2004 Geobacillus sp. E263 Chimeneas hidrotermales en el Océano Pacífico. Xu et al., 2017 Geobacillus spp. Chimeneas hidrotermales del volcán Capelinhos, Islas Azores Pillot et al., 2020 Geobacillus toebii Aguas termales, Bulgaria Radchenkova et al., 2013 Geobacillus sp. MT-1 Chimeneas hidrotermales en el Océano Pacífico. Wu et al., 2006 Geobacillus sp. EPT3 Sedimentos de Chimeneas hidrotermales en el Océano Pacífico Zhu et al., 2014 Geobacillus sp. EPT9 Zhu et al., 2015 53 Especie Hábitat Referencia Geobacillus subterraneus KCTC 3922T Yacimiento petrolífero de Liaohe, China Lee et al., 2017 Geobacillus jurassicus Yacimiento petrolífero de Dagang, China Nazina et al., 2005 Geobacillus sp. SH-1, Yacimiento petrolífero Zhang et al., 2012 Geobacillus spp. Yacimiento petrolífero en Sfax, Tunez Chamkha et al., 2008 Geobacillus lituanicus Yacimiento petrolífero, Lituania Kuisiene et al., 2004 Geobacillus sp. FW23 Yacimiento petrolífero de Mehsana, India Pore et al., 2014 Geobacillus spp. Yacimiento petrolífero en la cuenca del rio Cauvery, India Elumalai et al., 2019 Geobacillus subterraneus Agua de yacimientos petrolíferos en Rusia, Kazajistan y China Nazina et al., 2001 Geobacillus uzenensis Geobacillus subterraneus K Yacimiento petrolífero en Kazajistan Poltaraus et al., 2016 Geobacillus thermoglucosidasius W-2 Yacimiento petrolífero en China Zhu et al., 2016 Geobacillus sp. 1017 Agua de yacimiento petrolífero de Dagang, China Kadnikov et al., 2016 Geobacillus spp. Yacimiento petrolífero Tourova et al., 2016 Geobacillus sp. ZY-10 Yacimiento petrolífero Sun et al., 2015 Geobacillus thermodenitrificans NG80-2 Yacimiento petrolífero de Dagang, China Wang et al., 2006 Geobacillus zalihae Efluentes de Industria de aceite de palma, Malasia Abd et al., 2007 Geobacillus thermodenitrificans OS27 Algas marinas Fujii et al., 2018 Geobacillus spp. Salas blancas La Duc et al., 2007 Geobacillus thermoleovorans SGAir0734 Aire de Singapur Gaultier et al., 2018 Geobacillus spp. Aire de los Alpes (3106 m), Austria Els et al., 2019 Geobacillus spp. Aerosol de industrias de compostaje Le Goff et al., 2010 Geobacillus spp. Troposfera DeLeon-Rodriguez et al., 2013 54 Introducción Especie Hábitat Referencia Geobacillus sp. strain WSUCF1 Mina Govil et al., 2019 Geobacillus galactosidasius Compost, Italia Poli et al., 2011 Geobacillus spp. Compost Sarkar et al., 2010 Geobacillus spp. Compost Rastogi et al., 2010 Geobacillus toebii Compost de Pomigliano, Italia Poli et al., 2006 Geobacillus thermodenitrificans T12 Compost, Holanda Daas et al., 2018 Geobacillus kaustophilus Compost Marks y Hamilton 2014 Geobacillus spp. Compost de estiercol Charbonneau et al., 2012 Geobacillus spp. Compost Daas et al., 2016 Geobacillus sp. WCH70 Compost de madera Brumm et al., 2016 Geobacillus sp. WSUCF1 Suelo de una instalación de Compostaje Wang et al., 2019 Geobacillus toebii Compost de heno, Korea Sung et al., 2002 Geobacillus sp. SG-01 Compost de estiércol de cerdo y madera Yang et al 2013 Geobacillus thermoglucosidasius Compost del zoo de Sao Paulo Lemos et al., 2017 Geobacillus thermodenitrificans Y7 Compost de estiércol de pollo Ma et al., 2020 Geobacillus thermoglucosidasius Compost de desechos urbanos Fong et al., 2006 Geobacillus spp. Compost Zhao et al., 2014 Geobacillus spp. Compost de desechos urbanos, Haití Piceno et al., 2017 Geobacillus sp. JS12 Compost en Namhae, Korea Jeon et al., 2016 Geobacillus stearothermophilus B5 Compost Wang et al., 2020 Geobacillus sp. 70PC53 Compost de estiércol de cerdo y arroz Ng et al., 2009 Geobacillus sp. S-07 Compost Pan et al., 2017 55 Especie Hábitat Referencia Geobacillus spp. Compost Wang et al., 2007 Geobacillus stearothermophilus Industria alimentaria, Alimentos enlatados. André et al., 2017 Geobacillus spp. Industria alimentaria, leche en polvo Sadiq et al., 2017 Geobacillus spp. Industria alimentaria, leche en polvo Cho y Rhee 2019 Geobacillus thermoglucosidans TNO-09.023 Industria alimentaria, fábrica de leche Caspers et al., 2016 Geobacillus stearothermophilus TNO-09.027 Geobacillus stearothermophilus DSM 458, Industria alimentaria, fábrica de remolacha Egan et al., 2017 Geobacillus thermodenitrificans DSM 101594 Suelo de compost, Lituania Petkauskaite et al., 2017 Geobacillus thermoglucosidasius PB94A Industria textil Valladares Juárez et al., 2009 Geobacillus spp. Suelo de agricultura, Taiwan Das et al., 2014 Geobacillus spp. Suelo Zeigler, 2005 Geobacillus thermoleovorans YN Suelo de desierto, Egipto Nadia et al., 2007 Geobacillus spp. Suelo con contaminantes orgánicos Muccee y Ejaz, 2020 Geobacillus stearothermophilus Suelo de desierto, Arabia Saudi Abu-Zinada et al., 1981 Geobacillus stearothermophilus Suelo Kim et al., 1989 Geobacillus spp. Suelo de desierto, Kuwaiti Al-Mailem et al., 2015 Geobacillus stearothermophilus Suelo de Islandia Fields y Chen Lee, 1974 Geobacillus sp. LEMMY01 Compost De Souza et al., 2017 Geobacillus stearothermophilus KIBGE-IB29. Industria procesamiento de acero Bibi et al., 2014 Geobacillus stearothermophilus Suelo Chakraborty et al., 2000 Geobacillus sp. Strain GHH01 Suelo de jardín botánico de Hamburgo, Alemania Wiegand et al., 2013 Geobacillus spp. Suelo de yacimientos petrolíferos Kaunietis et al., 2016 56 Introducción Especie Hábitat Referencia Geobacillus spp. Suelo de bosque de pino, España Portillo et al., 2012 Geobacillus spp. Suelo de campos de olivos, Portugal Santana et al., 2013 Geobacillus sp Sah69 Suelo de Sahara, Argelia Bezuidt et al., 2015 Geobacillus stearothermophilus Sedimentos marinos Bartholomew y Paik, 1966 Geobacillus stearothermophilus ET1 Suelo, Korea Hae-Jeon et al., 1998 Geobacillus sp. E55-1 Sedimentos de la mina Geyser, Estados Unidos Miyazaki et al., 2020 Geobacillus sp. LEMMJ02 Sedimento de la Isla Deception, Antartida Schultz et al., 2019 Geobacillus spp. Suelo de Yellowstone, Estados Unidos Ren et al., 2010 Geobacillus stearothermophilus Industria alimentaria, fabrica de productos lacteos Buergess et al., 2017 Geobacillus thermocatenulatus Suelo Tomita et al., 2003 Geobacillus thermodenitrificans NG80-2 Yacimiento petrolífero, China Feng et al., 2007 Geobacillus thermodenitrificans DSM465. Yacimiento petrolífero, China Yao et al., 2013 Geobacillus thermoleovorans ARTRW1, Aguas termales, Turquía Oztug et al., 2020 Geobacillus thermoleovorans CCB_US3_UF5 Aguas termales, Malasia Muhd et al., 2012 Geobacillus thermoleovorans N7 Aguas termales de Paniphala, India Bose et al., 2016 Geobacillus thermoleovorans RL Aguas termales de Manikaran, India Singh et al., 2019 Geobacillus thermoleovorans B23. Yacimiento petrolífero, Japón Boonmak et al., 2013 Geobacillus subterraneus Aguas termales, Turquía Poli et al., 2012 Geobacillus thermocatenulatus GS-1 Yacimiento petrolífero, China Zheng et al., 2014 Parageobacillus thermoglucosidasius Suelo Mohr et al., 2018 Geobacillus spp. Suelo, Irlanda Marchan et al., 2002 Geobacillus spp. Aire y agua de lluvia, Irlanda Marchan et al., 20 57 Capítulo 2 Respuesta fisiológica de Parageobacillus thermoglucosidasius 23.6 a tasas de crecimiento cercanas a cero 58 Capítulo 2 2.1 Resumen En la naturaleza, las tasas de crecimiento de los microorganismos son frecuentemente muy bajas debido a la escasez y competencia por los nutrientes. Para comprender la vida de los microorganismos, y específicamente de los termófilos, en ambientes naturales es importante estudiar su respuesta a tasas de crecimiento cercanas a cero. Para ello, se cultivó Parageobacillus thermoglucosidasius 23.6 en un quimiostato modificado (retentostato) con el fin de obtener tasas de crecimiento muy bajas. Durante el cultivo experimental se analizaron la acumulación de biomasa, número de células, viabilidad y biovolumen. Durante el cultivo con retentostato, la tasa de crecimiento específica disminuyó hasta 0,0002 h-1 correspondiéndose con un tiempo de duplicación de 141 días. Las células se mantenían activas en el sistema de cultivo. Medidas del biovolumen celular mostraron que el número de células pequeñas (< 3 µm3) aumentó al disminuir la tasa de crecimiento. Las células en división presentaban una morfología filamentosa. Ello sugiere que la citocinesis se ve afectada en condiciones de crecimiento mínimo. 59 Parageobacillus thermoglucosidasius 23.6 a tasas de crecimiento cercanas a cero Figura 2.2. Relación de la concentración microbiana y el tiempo de generación a diferentes tasas de dilución en un quimiostato Para disminuir aún mas las tasas de crecimiento específicas, el quimiostato puede ser equipado en la salida de los efluentes con un sistema de filtrado (filtración tangencial) que retenga las células y elimine únicamente el sobrenadante. A este tipo de bioreactores se les conoce como retentostato (Herbert, 1961) (Figura 2.3). El retentostato es un sistema en continuo, abierto para los sustratos y cerrado para la biomasa (van Verseveld, et al., 1984). 66 Capítulo 2 Figura 2.3 Esquema de un quimiostato y un retentostato (las células son retenidas por un filtro tangencial eliminando solo el sobrenadante). La tasa de dilución en el retentostato es la misma que en el quimiostato, pero al ir aumentando la biomasa en el bioreactor debido a la retención celular, la cantidad de sustrato disponible para cada célula disminuye progresivamente. Como consecuencia la energía disponible para el crecimiento cada vez es mas limitante hasta el punto de obtener con el tiempo tasas de crecimiento muy reducidas, cercanas a cero (Figura 2.4) (Ercan et al., 2015; van Mastrigt, et al., 2018). Al final del proceso, el sustrato es mayoritariamente catabolizado siendo destinado principalmente a procesos de mantenimiento. 67 Quimiostato Retentostato Parageobacillus thermoglucosidasius 23.6 a tasas de crecimiento cercanas a cero Figura 2.4. Relación de biomasa y tasa de crecimiento a lo largo del tiempo en un quimiostato y en un retentostato. Distintas evidencias parecen sugerir la posibilidad de que diversos tipos bacterianos sean capaces de vivir en condiciones no óptimas (Keep et al., 2006; Marchant et al., 2008). Un ejemplo de estos microorganismos son las bacterias termófilas, principalmente del Phylum Firmicutes, que se han aislado de forma vegetativa en todos los suelos estudiados (Marchant et al., 2002, 2008; Portillo et al., 2012; Santana et al., 2013). Se ha sugerido que los representantes de estos termófilos de suelos, por ejemplo Geobacillus, sobreviven en el suelo presentando actividad muy reducida y un crecimiento muy bajo pero mantenido en el tiempo (Marchant et al., 2002, 2008). 68 Capítulo 2 Las características que presentan géneros como Geobacillus y Parageobacillus como: capacidad de formar esporas, motilidad celular (Nazina et al., 2001), una gran diversidad metabólica (Suzuki, 2018), actividad enzimática extracelular máxima a baja disponibilidad de agua (Gómez et al., 2021), elevada persistencia de enzimas extracelulares en suelos (Gómez et al., 2020) y elevada transferencia horizontal de genes (Esin et al., 2018), facilitan su supervivencia en una gran variedad de condiciones ambientales y son probablemente un reflejo de la variabilidad de sus hábitats y la flexibilidad de su capacidad adaptativa a esos ambientes. Los estudios en retentostato de microorganismos a tasas de crecimiento específica reducidas o cercanas a cero, representan un área escasamente explorada en el campo de la Microbiología. Especialmente, estos estudios no han sido llevados a cabo hasta la fecha con microorganismos termófilos y podría ser de gran interés ya que muchos de estos microorganismos se encuentran en una gran variedad de nichos (Suzuki, 2018) en los que el crecimiento cero es probablemente un estado común de persistencia y adaptación a esas condiciones ambientales. Aquí describimos el cultivo de la cepa Parageobacillus thermoglucosidasius 23.6, (aislada de suelos de Doñana, CECT9776) en un retentostato con el objetivo de investigar las respuestas fisiológicas a tasas de crecimiento específico cercanas a cero. 69 Parageobacillus thermoglucosidasius 23.6 a tasas de crecimiento cercanas a cero 2.3. Materiales y métodos. El bioreactor utilizado ha sido diseñado por el grupo de investigación para el desarrollo de la tesis. Consta de un reactor cilíndrico de vidrio (volumen máximo de 2l) con camisa termostática por la cual circula agua procedente de un baño con refrigeración AP07R-20 (VWR, Atlanta, Georgia, USA), un refrigerador Davis, una bomba de aire “Eheim 400” (Eheim, Deizisau, Alemania), un difusor de aire, cuatro bombas peristáticas “Welco WPM2” (Welco, Tokio, Japón), una bomba de gran caudal “Welco WP1200”, un medidor de pH autoclavable “BOQU pH5806/S8” (Boqu, Shangai, China) y un filtro tangencial autoclavable con un tamaño de poro de 0,2 μm “MiniKros Hollow fiber filter” (C02-P20U-05N PES/0.2 μm; Repligen Co., Rancho Domínguez, California, EE. UU). La mezcla del cultivo en el interior de la cubeta se realizaba mediante agitación magnética ajustable y la aireación del cultivo. Las bombas peristálticas y el medidor de pH son controlados por un programa diseñado a tal fin por el grupo de investigación, escrito en C y utilizando el sistema operativo linux Raspian instalado en un ordenador de placa simple Rapsberry Pi3. 2.3.1 Quimiostato Antes de comenzar con el cultivo en el bioreactor, se prepararon precultivos inoculando una única colonia de una placa de agar nutritivo NB (composición por litro: 3 g de extracto de levadura, 5 g de peptona y 15 g de agar) en 20 ml de medio de cultivo NB líquido (misma composición pero sin agar) y se incubó a 60º C durante toda la noche. A la mañana siguiente se traspasaron 0,5 ml del cultivo ya crecido a un matraz con 50 ml de NB y se incubó a 60º C hasta alcanzar la fase exponencial que se utilizó como inóculo de los biorreactores. Durante el 70 Capítulo 2 cultivo en los biorreactores el pH se mantuvo a 7.0 mediante la adición automática de ácido clorhídrico 0,1 M. Se realizaron cultivos de quimiostato con medio NB diluido 5 veces por duplicado a una tasa de dilución, D (definida como la relación entre la tasa de alimentación del medio, 0,045 l/h, y el volumen de cultivo, 1,7 l) de 0,025 h-1. Los bioreactores se hicieron funcionar a 60° C en condiciones aeróbicas con un caudal de aire de 3 l.min-1 y una velocidad de agitación de 500 r.p.m. La formación de espuma en el bioreactor debido a la mezcla vigorosa y el burbujeo con aire se evitó añadiendo 1 ml del agente antiespumante (Xiameter ACP-1500) cada 12 horas. La configuración experimental para el cultivo en retentostato de la cepa Parageobacillus thermoglucosidasius 23.6 requirió una modificación importante con respecto a otros estudios a tasas de crecimiento cercano a cero (Ercan et al., 2013; Overkamp et al., 2015). La alta temperatura (60º C) empleada para el crecimiento de la cepa 23.6 provocaba una acentuada evaporación del medio de cultivo a lo largo del tiempo, haciendo que disminuyese el volumen del bioreactor. Para evitar la pérdida de volumen y no alterar la tasa de dilución, se instaló en la cabeza del bioreactor un refrigerador Davis por el cual circulaba agua a 20º C haciendo que el vapor de agua generado se condensase y regresase al bioreactor. El estado estacionario en el quimiostato se definió como la condición en la que los parámetros de cultivo (densidad óptica a 600 nm) eran constantes durante al menos 2 cambios del volumen de trabajo. 71 Parageobacillus thermoglucosidasius 23.6 a tasas de crecimiento cercanas a cero 2.3.2 Retentostato Se iniciaron dos experimentos individuales de retentostato a partir de cultivos de quimiostato a la tasa de dilución de 0,025 h-1. Después de alcanzar la estabilidad en el quimiostato, los biorreactores se cambiaron al modo retentostato, haciendo pasar el cultivo a través del sistema de filtración tangencial para retener la biomasa y eliminar el sobrenadante. Para verificar el buen funcionamiento del filtro se sembraron periódicamente 100 μl del cultivo filtrado (sin bacterias) en placas de agar NB y se incubaron a 60º C durante toda la noche. Los cultivos en retentostato se hicieron funcionar en las mismas condiciones (temperatura, pH, caudal medio, oxigenación, velocidad de agitación, adición antiespumante) que en modo quimiostato. La pureza del cultivo puede ser un problema con cultivos a largo plazo. Una de las ventajas de trabajar con un microorganismo termófilo es que permite reducir posibles problemas de contaminación cruzada. Las altas temperaturas (60º C) y el flujo de aire ascendente caliente que se genera dificulta mucho la contaminación por otros microorganismos. 2.3.3. Medidas Durante el cultivo de quimiostato y retentostato, se extrajeron muestras del bioreactor para determinar diferentes parámetros: concentraciones de biomasa (peso seco de las células), densidad óptica a 600 nm, unidades formadoras de colonias (UFC), recuento al microscopio del número total de células, biovolumen celular y análisis al microscopio electrónico de transmisión. El volumen extraído en cada muestreo fue el mínimo (12 ml), con el fin de influir lo menos posible en el volumen del bioreactor. Se tomaron un total de 10 muestras 72 Capítulo 2 a lo largo del tiempo: T0 = quimiostato, T1= 2 días, T2= 4 días, T3 = 7 días, T4= 14 días, T5= 21 días, T6= 20 días, T7= 35 días, T8= 45 días y T9= 52 días. También se cogieron muestras (1ml) durante la fase exponencial (Exp) y el periodo de estabilización del quimiostato (T0.1; T0.2; T0.3). El peso seco de las células se determinó por duplicado filtrando 5 ml de cultivo a través de filtros de membrana de acetato de celulosa (0,22 μm diámetro de poro) previamente pesados. Los filtros con las células recogidas fueron secados a 105° C durante 24 h y tras alcanzar la temperatura ambiente pesados. Para estimar la fracción de células muertas en muestras de cultivo, se utilizó el compuesto fluorescente, bis-(1,3-dibutylbarbituric acid) trimethine oxonol (DiBAC4(3)) (máximo excitación 490 nm y máximo emisión 516 nm, verde), que solo penetra en células con membranas dañadas que son permeables (Beck y Huber, 1997). Se añadió 4 µl de DiBAC4(3) (25 µM disuelto en etanol) a 100 µl de cultivo (concentración final 1 µM) y se incubó durante 5 minutos a temperatura ambiente. La enumeración de las fracciones de células vivas se realizó restando las células marcadas con DiBAC4(3) al total del número de células en cada tiempo. Para estos recuentos se utilizó un microscopio de epifluorescencia Zeiss Axioskop 2 equipado con un casette de fluorescencia BP 450-490/FT150/LP515. Adicionalmente, las unidades formadoras de colonias (UFC) se estimaron mediante el método de siembra en microgotas. Se hicieron diluciones seriadas (1/10) de la muestra en medio de cultivo liquido NB (entre 4 y 7 diluciones) y se sembraron por triplicado 10 µl de las tres últimas diluciones en placas de agar NB. Se esperó a que la gota se secase y se incubó a 60º C durante toda la noche. 73 Parageobacillus thermoglucosidasius 23.6 a tasas de crecimiento cercanas a cero El recuento del número total de células se llevó a cabo en un microoscopio óptico de contraste de fase Olympus BX40F-3 (aumentos totales 400x) utilizando un hemocitómetro para bacterias (EKDS, 0.02 mm profundidad, 1/400&1/16 mm2). Las células se fijaron con formaldehido (concentración final 2%). Se hicieron fotos de todas las muestras a las bacterias comprendidas en las mismas 12 cuadrículas y siguiendo el mismo patrón de recuento. Debido a la forma de bacilo de la cepa 23.6, el biovolumen celular se calculó siguiendo la fórmula Vol=(π/4)·A2·(L - (1/3)·A) (Bratbak, 1985), donde A es la anchura de la célula y L es la longitud. Las medidas celulares se llevaron a cabo en el programa Image J (https://imageJ.nih.gov/ij/) utilizando como referencia un objetivo micrométrico de 0.01 mm (Nikon Co., Tokio, Japón). Para el análisis al microscopio electrónico de transmisión (TEM, Zeiss Libra 120) se fijaron las células con glutaraldehido pH 7.2 (concentracion final 2,5%) durante una hora a temperatura ambiente y a 4º C durante toda la noche. Posteriormente, se lavaron las células tres veces en tampón cacodilato 0.2 M pH 6.5 y se conservaron en frio (4º C). El resto del proceso de preparación de las muestras fue llevada a cabo por el Servicio de Microscopia de la Universidad de Sevilla (CITIUS) donde se realizó la observación y su fotografiado. 2.3.4. Cálculo de la tasa de crecimiento en un cultivo contínuo En un cultivo continuo (quimiostato) la tasa de crecimiento está limitada por el flujo de nutrientes en un volumen determinado, dicho con otras palabras, la tasa de dilución en el cultivo. La dilución en un cultivo continuo representa el aporte de nutrientes en el tiempo. La tasa de crecimiento se iguala a la tasa de dilución a lo largo del tiempo porque los nutrientes aportados son directamente proporcionales 74 Capítulo 2 al crecimiento que el cultivo puede experimentar en condiciones constantes (Herbert et al., 1956). La ecuación 1 muestra el cálculo de la tasa de dilución en un quimiostato. D = F / V (ecuación 1) donde D, es la tasa de dilución (h-1); F, es el flujo de medio de cultivo fresco (l/h); y V, el volumen de cultivo (l) en el bioreactor. Comparación y cálculo de la tasa de crecimiento y del tiempo de duplicación. μ = Ln(2) / tgtg = Ln(2) / μ μ, tasa de crecimiento (h-1) tg, tiempo de duplicación o tiempo de generación Ln(2) = 0.693, es el logaritmo natural de 2. La cinética de crecimiento de cultivos en continuo con retención de células (retentostato) se predice en base a una ecuación de balance de masa para biomasa (ecuación 2) (van Verseveld et al., 1986). Esta ecuación asume (i) una retención completa de las células en el retentostato y (ii) un volumen constante. En base al filtro utilizado (0.2 μm diámetro de poro) en el sistema de filtración tangencial para la retención de las células en el retentostato y la determinación experimental de que no se pierde un número significativo de células en el desecho, la primera asunción es correcta establecerla. El volumen se mantiene constante a lo largo del experimento, lo que supone también correcto el segundo punto. 75 Parageobacillus thermoglucosidasius 23.6 a tasas de crecimiento cercanas a cero celulares intacta evaluado por recuentos de microscopía con el colorante fluorescente vital, DiBAC4(3). En cualquier caso, en base a los cálculos efectuados, sólo se observarían diferencias significativas cuando la viabilidad del cultivo fuese inferior al 70% del total de células (Figura 2.6). Los cambios drásticos en la tasas de crecimiento se observarían cuando la viabilidad se reduzca bruscamente y la proporción de células dañadas aumente muy considerablemente (Figura 2.6) Figura 2.6. Estimación de la variación en la tasa específica de crecimiento con respecto a cambios de viabilidad en el cultivo. Nótese la respuesta asintótica para una mayoría de células activas/viables en el cultivo y sólo se observa un incremento exponencial en los cálculos de la tasa de crecimiento específico para aquellos casos en los que la fracción de células intactas activas se vea seriamente comprometida. 82 Capítulo 2 3.4.2. Morfología celular Se evaluó la morfología y el biovolumen celular de la cepa 23.6 durante los experimentos en retentostato, incluyendo la fase exponencial (Exp) de crecimiento y de quimiostato (T0.1-T0.3). Se muestran solo los resultados del retentostato 2 para simplificar y facilitar su comprensión ya que los resultados del retentostato 1 fueron muy similares y el experimento número 2 fue el de mayor duración. Durante la fase previa al retentostato los tamaños celulares en cada tiempo son similares y se van reduciendo conforme se alcanza la estabilización de la tasa de crecimiento en el quimiostato (Figura 2.7). En el retentostato la morfología celular pareció ser más heterogénea, dominando las células cortas. Al disminuir la tasa de crecimiento específica, comenzaron a aparecer células que eran más largas que la célula típica (tamaño estándar durante crecimiento constante), algunas alcanzando longitudes de más de 30 veces la de la célula única vegetativa habitual al comienzo del cultivo de retentostato (Figura 2.7, T9). Con el fin de entender mejor los cambios de morfología de la cepa 23.6 durante su cultivo en retentostato se establecieron grupos de tamaños según su biovolumen (µm³): < 3, 3-5, 5-8, 8-12 y > 12. Las células con un biovolumen inferior a 3 µm³ no se estarían dividiendo o han completado su división, el resto de tamaños si implicaría un estado de división o aumento progresivo de biomasa celular. 83 Parageobacillus thermoglucosidasius 23.6 a tasas de crecimiento cercanas a cero Figura 2.7. Cambios en la morfología celular de Parageobacillus thermoglucosidasius 23.6 durante el cultivo en retentostato. En la figura 2.8 se representa el porcentaje de cada grupo de tamaño desde el inicio del cultivo hasta el final del retentostato. En la fase exponencial, como era de esperar, no se observan células con un biovolumen inferior a 3 µm³ y mas del 95% de las células están comprendidas en las clases de tamaños superiores. Durante el proceso de estabilización del quimiostato el tamaño celular se va reduciendo de forma progresiva ya que el biovolumen celular se va concentrando en las tres clases de tamaño con un biovolumen inferior. Alcanzar una tasa de crecimiento constante se ve reflejado en una estabilización del tamaño celular en las clases de tamaños. 84 Capítulo 2 Figura 2.8. Porcentajes de las cinco clases de tamaño dados por el biovolumen de las células de Parageobacillus thermoglucosidasius durante su cultivo en fase exponencial (Exp), en quimiostato (T0.1 a T0.3) y en retentostato (T0 a T9). En el periodo de retentostato el biovolumen dominante general es inferior a 3 µm³ y los cambios en el biovolumen celular concuerdan con la disminución progresiva de las tasas de crecimiento específica. Se observa como en las primeras etapas del retentostato (Figura 2.8, T1-T5), cuando las velocidades de crecimiento no son tan bajas, el biovolumen inferior a 3 µm³ disminuye rápidamente del mismo modo que aumentan los biovolumenes superiores a 5 µm³. Por otro lado, en las etapas finales del retentostato (Figura 2.8, T6-T9) la disminución del biovolumen inferior a 3 µm³ es mucho más lenta debido a que las tasas de crecimiento son muy bajas. En este periodo los biovolumenes superiores a 8 µm³ dominan el estado de división celular, llegándose a registrar celulas con un biovolumen máximo de 101 85 Parageobacillus thermoglucosidasius 23.6 a tasas de crecimiento cercanas a cero µm³. El hecho de que se observe descenso en el número de células de menor tamaño también confirma, una vez más, la existencia de crecimiento celular que, como hemos visto, se reduce progresivamente a lo largo del tiempo de incubación en el retentostato como resultado de la limitación de recursos disponibles para las células del cultivo. 2.5. Discusión. 2.5.1. Crecimiento en situaciones limitantes Se implementó una configuración para cultivar el microorganismos termófilo Parageobacillus thermogucosidasius 23.6 a tasas de crecimiento extremadamente bajas y se estudió su adaptación a condiciones de crecimiento cercanas a cero mediante el análisis de la acumulación de biomasa, la viabilidad del cultivo y su morfología. Utilizar una bacteria termófila tiene la ventaja de que reduce mucho el riesgo de contaminación con otros microorganismos y no requiere introducir modificaciones genéticas que favorezcan su identificación, pero también tiene inconvenientes que hemos tenido que solventar con varias adaptaciones en el bioreactor como: (i) la instalación de un gotero para evitar que las células de P. thermoglucosidaisus 23.6 crezcan por la línea de alimentación de medio y genere obstrucciones, (ii) la instalación de un refrigerador Davis que impida la perdida de volumen del bioreactor por evaporación y no se altere la tasa de dilución. Debido a la prolongada duración experimental y el elevado número de elementos que intervienen en el cultivo en un retentostato, existen riesgos que pueden desestabilizar el cultivo. Este tipo de cultivos son muy laboriosos y hemos dedicado mucho tiempo y esfuerzo en la configuración del retentostato. 86 Capítulo 2 En diferentes estudios de cultivos en retentostato (Boender et al., 2009; Ercan et al., 2013; Overkamp et al., 2015) las tasas de crecimiento específicas se han calculado ajustando el aumento de la biomasa en el tiempo a una ecuación exponencial Cx= A · eB·t + C (Figura 2.9). El modelo exponencial de crecimiento indicaría un aumento exponencial de la biomasa en el tiempo y es típico en las etapas iniciales de un cultivo en “batch” (Figura 2.1) donde hay un exceso de nutrientes y los microorganismos alcanzan su máxima tasa de crecimiento. Por el contrario en un cultivo de retentostato, donde los nutrientes por célula bacteriana disminuyen con el tiempo, observamos que el aumento de la biomasa no es exponencial si no que tiende a alcanzar su asíntota con el tiempo al experimentar una reducción progresiva de la tasa de crecimiento, ajustándose mas a un modelo logarítmico (Figura 2.9). Figura 2.9. Comparación de la evolución de la biomasa en el tiempo en un modelo de crecimiento exponencial y logarítmico. Esta confusión también ha podido ser debido a un error en la explicación matemática del proceso aunque los cálculos pudieran haberse efectuado 87 Parageobacillus thermoglucosidasius 23.6 a tasas de crecimiento cercanas a cero correctamente. Este hecho queda por confirmar pero lo que es un hecho es que el modelo logaritmo se ajusta al modelo de trabajo que lo justifica y cuadra con los resultados experimentales (nuestros datos y los de otros autores) (Boender et al., 2009; Ercan et al., 2013; Overkamp et al., 2015) y la conceptualización del proceso encaminado a la limitación del crecimiento celular a lo largo del tiempo. En general los termófilos cultivados en “batch” presentan tasas de crecimiento muy altas (Manchant y Banat, 2010), por ejemplo, la cepa 23.6 durante la fase exponencial tiene un tiempo de duplicación de 18 minutos. Altas tasas de crecimiento conllevan a un rápido consumo de los nutrientes. Pavlostathis y colaboradores describen que en Geobacillus thermoleovorans el agotamiento de los nutrientes induce un colapso de la población acompañado de una lisis celular extensa que no se puede revertir mediante la adición de más nutrientes (Pavlostathis et al., 2006). En nuestro experimento hemos demostrado que Parageobacillus thermoglucosidasius 23.6 alcanza tasas de crecimiento específico extremadamente bajas (0,0002 h-1 al final del cultivo) y que mantiene una viabilidad alta durante todo el cultivo. Nuestros datos confirman que Parageobacillus thermoglucosidasius 23.6 es capaz de persistir a tasas de crecimiento muy reducidas. Por lo tanto, reduciendo la tasa de crecimiento en función de la disponibilidad de nutrientes y las condiciones ambientales, representaría una estrategia de adaptación a ambientes cambiantes encaminada a mantener la persistencia de estas células en esos ecosistemas. Un ejemplo, de estos ecosistemas naturales serían los suelos, donde estas células termófilas habitan manteniendo su viabilidad. Estos resultados están de acuerdo con las perspectivas planteadas por Marchant et al. (2002, 2008) pero descartan los planteamientos de Zeigler (2014) que atribuyen la presencia de termófilos en 88 Capítulo 2 suelos meramente al azar y a la dispersión de células desde ambientes geotérmicos o cálidos (i.e., zonas geotermales o desiertos). Este hito es importante porque refuerza la idea de que los microorganismos termofilos pueden vivir en condiciones que no son óptimas para su crecimiento. Hoy en día, es un hecho que los suelos albergan una comunidad compleja y omnipresente de microorganismos termófilos, representados principalmente por los géneros Geobacillus y Parageobacillus, que desempeñan funciones de importancia en el ecosistema suelo (Portillo et al. 2002; Santana et al. 2003; Santana y González, 2015; Gómez et al., 2021) y que han desarrollado mecanismos adaptativos y una estrategia propia de persistencia en estos ambientes. 2.5.2. Biovolumen celular en relación a la tasa de crecimiento La presencia de células largas en cultivos de cepas del género Geobacillus ha sido descrita previamente (Marchant et al., 2002). En este caso la proporción de células largas aumenta durante la fase exponencial (tasas de crecimiento altas) y posteriormente se produce la división celular de dichas células. La división celular es un proceso cíclico y nuestros resultados muestran que la duplicación del ADN y otros componentes celulares son más rápidos que la citocinesis, favoreciendo el desarrollo de células largas. Sin embargo, la reducida tasa de crecimiento en retentostato implica la generación de un gran número de células reducidas y un bajo número de células alargadas. En la figura 2.10 se muestra varias moléculas de ADN en una misma célula de la cepa 23.6 durante la fase exponencial de crecimiento. 89 Parageobacillus thermoglucosidasius 23.6 a tasas de crecimiento cercanas a cero Figura 2.10. Fotografía al microscopio electrónico de transmisión de una célula de la cepa Parageobacillus thermoglucosidasius 23.6 durante la fase exponencial de crecimiento. Al disminuir la velocidad de crecimiento parece que la formación del septo se ralentiza aun mas dando lugar a células muy largas. Sin embargo el número de células alargadas en exceso es reducido debido a las reducidas tasas de crecimiento durante el cultivo en retentostato. Un cultivo de Bacillus subtilis (género taxonómicamente cercano a Parageobacillus) en retentostato (Overkamp et al., 2015) describe el mismo fenómeno que nosotros, a medida que disminuye la tasa de crecimiento aumenta la presencia de células largas. Anteriormente también se había observado está morfología en Bacillus subtilis (Ohnishi et al., 1999; Gregory et al.,2008; Cozy y Kearns, 2010) y se propuso que las causas estaban relacionadas con la división celular, separación y composición de la membrana. La regulación de la división celular es un proceso complejo (Jensen et al., 2005; Adams y Errington., 2009; Treuner-Lange y Søgaard-Andersen., 2014;) y posiblemente una amplia variedad de causas puede generar este tipo de 90 ADN 1 µm Ribosomas Septo Capítulo 2 morfología. No obstante, los diferentes biovolumenes celulares observados en este estudio parecen corroborar la existencia de una tasa de crecimiento muy baja y confirma esta estrategia para la persistencia de esas células en condiciones drásticamente limitantes de su crecimiento. 2.6. Conclusiones Como consecuencia de que las células experimentaron una drástica limitación nutricional en el cultivo en retentostato, las células han sido capaces de persistir en un estado metabólicamente activo pero a tasas de crecimiento extremadamente reducidas. Este trabajo muestra que el cultivo en retentostato es un sistema de cultivo controlado y estable, adecuado para el estudio de microorganismos termófilos como Parageobacillus thermoglucosidasius y de su capacidad para persistir en ambientes adversos o a través de períodos de escasa disponibilidad de nutrientes o condiciones adversas. Los estudios próximos se centrarán en analizar la adaptación de Parageobacillus thermoglucosidasius 23.6 a tasas de crecimiento cercanas a cero en cultivos de retentostato mediante análisis transcriptómico, lo que complementará los resultados obtenidos a través de este sistema de cultivo imprescindible para el análisis de las células a tasas muy reducidas de crecimiento de forma que podremos comprender mejor algunas de las estrategias adaptativas de estas células. 91 Parageobacillus thermoglucosidasius 23.6 a tasas de crecimiento cercanas a cero Santana, M., Portillo, M. C., Gonzalez, J. M., Clara, I. E. (2013) Characterization of new soil thermophilic bacteria potentially involved in soil fertilization. Journal of Plant Nutrition and Soil Science, 176:47-56. Suzuki H. (2018) Peculiarities and biotechnological potential of environmental adaptation by Geobacillus species. Applied microbiology and biotechnology, 102(24): 10425-10437. Treuner-Lange, A., Søgaard-Andersen, L. (2014) Regulation of cell polarity in bacteria. The Journal of cell biology, 206(1): 7-17. van Bodegom P. (2007) Microbial maintenance: a critical review on its quantification. Microbial ecology, 53(4): 513-523. van Mastrigt, O., Abee, T., Lillevang, S. K., Smid, E. J. (2018) Quantitative physiology and aroma formation of a dairy Lactococcus lactis at near-zero growth rates. Food microbiology, 73: 216-226. van Verseveld, H. K., Arbige, M. Chesbro, W. R. (1984) Continuous culture of bacteria with biomass retention. Trends in Biotechnology, 2(1): 8-12. van Verseveld, H. W., de Hollander, J. A., Frankena, J., Braster, M., Leeuwerik, F. J., Stouthamer, A. H. (1986) Modeling of microbial substrate conversion, growth and product formation in a recycling fermentor. Antonie van Leeuwenhoek, 52(4) 325-342. 98 Capítulo 2 Veening, J. W., Igoshin, O. A., Eijlander, R. T., Nijland, R., Hamoen, L. W., Kuipers, O. P. (2008) Transient heterogeneity in extracellular protease production by Bacillus subtilis. Molecular systems biology, 4: 184. Zambrano, M. M., Siegele, D. A., Almirón, M., Tormo, A., Kolter, R. (1993) Microbial competition: Escherichia coli mutants that take over stationary phase cultures. Science (New York, N.Y.), 259(5102): 1757-1760. Zeigler, D. R. (2014) The Geobacillus paradox: why is a thermophilic bacterial genus so prevalent on a mesophilic planet?. Microbiology (Reading, England), 160:1-11. 99 Capítulo 3 Análisis genómico de la cepa Parageobacillus thermoglucosidasius 23.6 100 Capítulo 3 3.1. Resumen. La genómica es una ciencia que nos permite comprender la relación entre la información genética codificada en el ADN y la fisiología del microorganismo, así como aspectos bioquímicos y evolutivos. Se secuenció y ensambló el genoma de Parageobacillus thermoglucosidasius 23.6, una cepa termófila aislada del suelo en el Parque Nacional de Doñana (Huelva) (CECT9776). La secuenciación identificó 4 moléculas de ADN circular: El genoma principal o Tmp1 (3.870.682 pb), Tmp2 (102283 bp), un megaplásmido,, Tmp3 (50843 pb), un plásmido, y un bacteriófago, Tmp4 (55505 pb). El pangenoma de la cepas de P. thermoglucosidaius es abierto y ha identificado en Tmp1 y Tmp2 puntos calientes de transferencia horizontal de genes constituido por genes únicos y elementos genéticos móviles (transposasas). El sesgo del uso de codones establece una relación entre los genes únicos y Tmp3, que contiene en su secuencia un elemento integrativo y conjugativo. El bacteriófago identificado pertenece a la familia Syphoviridae y no está integrado en el genoma principal. El gran número de regiones CRISPR presentes en Tmp1 y la homología de 11 espaciadores con Tmp4 podría explicar porque el fago no se integra en el genoma principal. La información genómica de Parageobacillus thermoglucosidaius 23.6 sugiere que podría tener la plasticidad de incorporar ADN a su genoma a través de diferentes estrategias de transferencia horizontal de genes (transformación, conjugación y traducción), lo que facilitaría su capacidad de adaptación a nuevos medios y a cambios producidos en el ambiente. 101 Análisis genómico de la cepa Parageobacillus thermoglucosidasius 23.6 3.2 Introducción 3.2.1 Genómica En 1986 Thomas H. Roderick propuso una nueva disciplina basada en el mapeo, secuenciación y análisis del ADN (Yadav, 2007) a la que denomino genómica. Es una ciencia que se centra en estudiar la secuencia de ADN de un organismo. Inicialmente los métodos tradicionales de secuenciación eran lentos y costosos, ralentizando el desarrollo de esta disciplina. Por ejemplo, el proyecto del genoma humano supuso aproximadamente una inversión de 2.500 millones de euros y fue llevado a cabo durante 13 años. Sin embargo, gracias al avance de las nuevas técnicas de secuenciación masiva o NGS (Nex Generation Sequencing) y el desarrollo de técnicas informáticas para su análisis (Hall, 2007), en la actualidad secuenciar el genoma de un ser humano cuesta menos de 1.000 Euros y se puede hacer en un día. 26 años después de la primera publicación del genoma completo de la bacteria Haemophilus influenzae (Fleischmann et al., 1995) hay aproximadamente medio millón de genomas publicados en la base de datos del NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/browse#!/) siendo la mayoría de procariotas. Este desarrollo tecnológico ha llevado a un avance significativo en las investigaciones actuales, refiriéndose al siglo XXI como “el siglo de los genomas” La determinación de la secuencia completa de un microorganismos resulta muy útil para comprender la relación entre la información que alberga el ADN y la fisiología del microorganismo, así como conocer aspectos bioquímicos y evolutivos y acceder a genes con interés biotecnológico. 102 Capítulo 3 El principal reto al que se enfrenta la comunidad cuando comienza a analizar un genoma es interpretar esa gran cantidad de información de la que disponemos (Pedros-Alió, 2006). Gracias al gran número de genomas secuenciados y disponibles en las bases de datos se pueden hacer estudios comparativos, como, por ejemplo, filogenias de genes o grupos de genes determinados o análisis del Pangenoma. El término Pangenoma fue acuñado en 2005 por Tettelin et al. (2005) y describe la unión de entidades de secuencia (generalmente genes o marcos de lectura abiertos, ORF) compartidos por genomas de interés. La resolución filogenética del grupo taxonómico de interés es ilimitada y depende del objetivo del estudio, existen proyectos enfocados a nivel de especie, nivel de género e incluso a nivel de clase, filo o reino (Vernikos et al., 2015). En la literatura científica existe variabilidad a la hora de nombrar las combinaciones del conjunto de secuencias. Nosotros vamos a seguir la nomenclatura descrita por Tettelin et al. (2005) (Figura 3.1): - Pangenoma: engloba todo el repertorio de genes accesibles al taxón estudiado - Genoma central: contiene genes compartidos por todas las cepas dentro del taxón. Incluye genes responsables de los aspectos básicos de la biología de las células estudiadas y sus principales rasgos fenotípicos. - Genoma prescindible: contiene genes compartidos por un subconjunto de cepas. Contribuye a la diversidad de especies, podría codificar vías y funciones bioquímicas complementarias que no son esenciales para el crecimiento pero que confieren ventajas selectivas, como la adaptación a diferentes nichos, resistencia a antibióticos, etc. - Genes específicos o únicos: aquellos genes detectados en un solo organismo del grupo analizado. Permiten identificar fenómenos de intercambio de 103 Análisis genómico de la cepa Parageobacillus thermoglucosidasius 23.6 material genético entre distintos microorganismos y aspectos interesantes de su historia evolutiva. Figura 3.1. Esquema y nomenclatura de la combinación de genes entre tres organismos. Los análisis de pangenoma proporcionan un marco para determinar la diversidad genómica en un grupo taxonómico a analizar. Podemos diferenciar entre pangenoma cerrado (representa prácticamente la variabilidad de genes existentes) y pangenoma abierto (el conjunto de datos es limitado y no alcanza a representar la variabilidad real existente en el taxón) (Figura 3.2). Las limitaciones en el número de representantes en los pangenomas abiertos suelen deberse a 104 Capítulo 3 que aún nos queda una gran diversidad microbiana por descubrir en nuestro planeta (González et al. 2020). Figura 3.2. Representación teórica de un pangenoma abierto y cerrado. 2.2.2 Trasferencia Horizontal de Genes En 1928 Griffith observó que el carácter virulento de Streptococcus pneumonae se podía transmitir entre cepas de la misma especie. Estos hallazgos sirvieron para establecer la necesidad de estudiar los mecanismos y consecuencias de la transferencia de ADN. Décadas mas tarde se observó que las transferencias de genes se producían incluso entre organismos de especies diferentes (Syvanen, 1985) y, en la actualidad, esta aceptada la elevada promiscuidad existente en el intercambio de ADN entre microorganismos (Frost et al., 2005). 105 Análisis genómico de la cepa Parageobacillus thermoglucosidasius 23.6 Bajo este contexto, a principios de los años 90 nace el concepto de transferencia horizontal de genes (HGT, Horizontal Gene Transfer), refiriéndose a la transferencia de fragmentos de ADN entre distintas especies. Estas observaciones hicieron cambiar la idea tradicional de herencia vertical, proponiéndose una nueva visión de los árboles filogenéticos que incluyen ramas entrecruzadas adquiriendo apariencia de red (Figura 1.2) (Doolittle, 2000). Los mecanismos mas importantes por los que se produce la transferencia horizontal de genes entre microorganismos son (Furuya y Lowy, 2006) (Figura 3.3): - Transformación: Ciertos microorganismos tienen la capacidad de captar, integrar y expresar fragmentos de ADN extracelular liberados, por ejemplo, durante la lisis bacteriana. - Conjugación: Transferencia de ADN que requiere el contacto entre dos células a través de pilis o adhesinas de la superficie celular. La maquinaría conjugativa suele estar codificada por genes que están presentes en plásmidos. - Traducción: Secuencias de ADN que se transfieren de unos microorganismos a otros mediante la infección por bacteriófagos que transportan esa información génica. Estos fagos pueden o no integrarse en la célula receptora dando lugar a procesos de lisis o lisogénesis en la interacción célula huésped y virus. - Agentes de transferencia de genes (Gene transfer agents, GTAs): son partículas producidas por la célula huésped que se asemejan a los bacteriófagos, capaces de transferir contenido genético (Lang et al., 2017). A diferencia de los fagos, no tienen la capacidad de autopropagarse y se liberan a través de la lisis celular. 106 Capítulo 3 Figura 3.3. Representación de cuatro mecanismos diferentes por los que se producen transferencia horizontal de genes. (Modificación de la figura descrita en Furuya y Lowy, 2006). En la transferencia de fragmentos de ADN entre células desempeña un papel importante la existencia de elementos genéticos móviles (MGE; “Mobile genetic elements”) que directamente podrían influir en fenómenos de HGT. Los MGE son 107 Transformación GTAs Célula donadora con GTAs Conjugación Traducción Célula receptora Célula receptora Célula receptora Célula receptoraCélula donadora Célula donadora infectada por fagos Célula donadora Célula donadora Transposón ADN bacteria ADN vírico Análisis genómico de la cepa Parageobacillus thermoglucosidasius 23.6 3.3 Materiales y métodos 3.3.1 Muestreo Las muestras para el aislamiento de microorganismos termófilos se recolectaron de la superficie (0-5 cm) de suelos situados en el Parque Nacional de Doñana, concretamente en la zona circundante de la Laguna de Santa Olalla (Almonte, Huelva; 36º58′N, 6º28′O). El suelo tiene las características típicas de un sistema dunar, es de tipo arenoso con escasa vegetación de matorral y pastizal. La superficie del suelo es la zona de mayor fluctuación térmica y el sur-oeste de España representa una de las zonas más cálidas de la Península Ibérica (Santana y González, 2015) . 3.3.2 Identificación, secuenciación y anotación de la cepa Un gramo de muestras de suelo resuspendido en 10 ml de solución salina (NaCl al 0,9%) fue agitado en un vórtex durante 5 minutos previo a la inoculación en medio de cultivo para aislar cepas de bacterias termófilas en suelos. 100 μl de la mezcla se sembraron por extensión en placas con agar nutritivo (NB, composición por litro: 3 g de extracto de levadura, 5 g de peptona y 15 g de agar) y se incubaron durante 3 días a 60° C. Las unidades formadoras de colonias (UFC) obtenidas de termófilos heterótrofos aeróbicos, se sembraron hasta extinción en nuevas placas de NB incubándose a 60° C durante 24 horas. Este proceso se repitió tres veces con la finalidad de obtener colonias puras. El ADN genómico de los aislados puros se obtuvo con el kit de extracción ZymoBIOMICS DNA/RNA Minipred (Zymo research, Irvine, CA, USA) siguiendo las instrucciones del fabricante. Antes de emplear el kit se incubaron previamente 114 Capítulo 3 las células obtenidas por centrifugación con una solución de lisozima (1 μg/ml) durante 15 minutos a temperatura ambiente. Este paso previo facilita la lisis celular y aumenta la cantidad de ADN extraído. Para obtener la identificación taxonómica de los aislados, se realizó la amplificación mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) de genes de ARNr 16S utilizando los cebadores 616F (5′-TTTTATAAAAGGTTGATTGT) y 907R (5′-CCCCGTCAATTCATTTGAGTTT). Las reacciones se realizaron en un volumen total de 50 µl, que contenían 5 µl de tampón de PCR 1X, 1 µl de dNTP (500 µM), 1 µl de cada cebador (2,5 µM), 1,5 µl de MgCl2 (0,16 µM), 1 µl de ADN genómico (40 ng), 39,2 µl de agua desionizada y 0,3 µl de Biotaq DNA Polymerase (5 u/µl). El ciclo de PCR se realizó en un termociclador Bio-Rad T-100 (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). Las reacciones de ciclo de PCR incluyeron un paso de desnaturalización inicial a 95° C durante 1 min, seguido de 40 ciclos a 95° C durante 15 s, hibridación a 55° C durante 15 s, extensión a 72° C durante 1 minuto. El último ciclo fue seguido de 10 minutos a 72° C. Los fragmentos obtenidos durante la amplificación por PCR anterior, se purificaron con el kit Clean Easy PCR purification (Canvax, Córdoba, España) siguiendo las instrucciones del fabricante y se secuenciaron (método Sanger) en ambas cadenas utilizando los cebadores directos 616F y el cebador inverso 907R, en los servicios de secuenciación de Stab Vida (Caparica, Portugal). Las secuencias se identificaron utilizando la herramienta Blastn del Centro Nacional de Información Biotecnológica (NCBI). La cepa Parageobacillus thermoglucosidasius 23.6 se cultivó aeróbicamente en medio líquido NB (composición por litro: 3 g de extracto de levadura, 5 g de peptona) a 60º C (temperatura óptima de crecimiento) hasta alcanzar la fase exponencial. El ADN total se obtuvo con el kit de extracción ZymoBIOMICS DNA/ 115 Análisis genómico de la cepa Parageobacillus thermoglucosidasius 23.6 RNA Minipred siguiendo las instrucciones del fabricante. La secuenciación del genoma de la cepa 23.6 se realizó utilizando la plataforma Illumina Hiseq en BGI Genomics (Hong Kong, China). La secuenciación fue en los dos sentidos, con secuencias por pares y se generaron un total de 9.240.570 lecturas con un tamaño de 350 pares de bases (pb) cada una. El filtrado de calidad y un primer ensamblaje del genoma lo realizó la empresa BGI Genomics, utilizando el genoma de Parageobacillus thermoglucosidasius C56-YS93 como referencia, generando 48 scafolds de un tamaño máximo de 711.050 pb y mínimo de 512 pb. La circularización del genoma a partir de estos últimos 48 fragmentos se llevó a cabo manualmente utilizando scripts desarrollados en nuestro laboratorio y el editor de secuencias Bioedit (Hall, 1999). Estos scripts buscan y alinean, mediante Clustal W, todas las lecturas que tengan un oligonucleótido diana concreto correspondiente al fragmento más extremo de un scafold ensamblado. De esta forma se seleccionaban aquellos oligonucleótidos localizados en los extremos de los scafolds lo que permitía obtener la secuencia contigua correspondiente progresando en la ampliación de dicho scafold. Los extremos de los scafolds se van ampliando hasta encontrar solapamiento con el extremo de otro scafold, lo que permite unir los dos fragmentos. Como referencia para el ensamblado y progresión en el acabado del genoma se han utilizado las secuencias genómicas completas de Parageobacillus thermoglucosidasius disponibles en el NCBI. La anotación se realizó siguiendo las indicaciones del canal de anotación de genomas de procariotas del NCBI (https://github.com/ncbi/pgap/) Las herramientas bioinformáticas utilizadas en este trabajo son: ISfinder (Siguier et al., 2006) para la búsqueda de secuencias de inserción; ICEfinder (Liu et al., 2019); CRISPR-Casfinder (Couvin et al., 2018) y Phaster (Arndt et al., 2016) para 116 Capítulo 3 la búsqueda de bacteriófagos integrados en los genomas de Geobacillus y Parageobacillus. 3.3.3 Pan-genoma Los 13 genomas de Parageobacillus thermoglucosidasius utilizados para los análisis pangenómicos se descargaron de la base de datos del NCBI (Tabla 3.3) Tabla 3.3. Genomas anotados en el NCBI de Cepas de Parageobacillus thermoglucosidasius. Cepa Nº Acceso Nº Bases % G+C Plásmidos NCIMB 11955 NZ_CP016622.1 4,00492 43,8 pNCI001; pNCI002 DSM 2542 NZ_CP012712.1 3,87312 43,9 - C56-YS93 NC_015660.1 3,99379 43,9 pGEOTH01; pGEOTH02 TM242 NZ_CP016916.1 4,00434 43,8 pNCI001; pNCI002 TNO-09.020 NZ_CM001483.1 3,74024 43,9 - NBRC 107763 BAWP00000000.1 3,87116 43,7 - DSM 2543 QQOJ00000000.1 3,96168 43,8 pGeo2DSM2543; pGeo7DSM2543 DSM 6285 QQOK00000000.1 3,96773 43,6 pGeo7DSM6285 TG4 NZ_AP019364.1 3,94852 43,9 pPTG4S DSM 21625 QQOL00000000.1 4,00604 43,8 pGeo8DSM21625 GT23 LUCT00000000.1 3,69646 43,8 - ZCTH02-B4 LZRS00000000.1 4,38293 43,4 - W-2 LXMA00000000.1 3,89456 43,2 - Para analizar el pangenoma de un taxón bacteriano hay que llevar a cabo agrupaciones de genes ortólogos para lo que en nuestro caso se utilizó el programa GET_HOMOLOGUES (Contreras-Moreira y Vinuesa, 2013). Las búsquedas de similitud y agrupamiento de las secuencias codificantes (CDS) de los 14 genomas se realizaron usando BLASTp por pares (Altschul et al. al., 1990) y algoritmos OrthoMCL (Li et al., 2003). Los parámetros establecidos para la identificación y agrupación de genes fueron: valor de E <10-05 y una cobertura de alineación mínima superior al 70%. El valor E es el número de aciertos que uno puede "esperar" por azar cuando se busca en una base de datos de un tamaño 117 Análisis genómico de la cepa Parageobacillus thermoglucosidasius 23.6 particular. Cuanto menor sea el valor de E, o más cerca esté de 0, más significativa es la coincidencia (Altschul et al., 1990). Los grupos determinados a partir de los análisis se definieron como: Genoma central: genes presentes en todos los genomas; Genoma prescindible: genes presentes en más de 1 genoma y menos de 12 y Genes únicos: genes presentes en menos de 2 genomas. 3.3.4 Clasificación funcional de genes ortólogos (COGs) Los ortólogos son genes que se encuentran en diferentes especies y provienen de un gen ancestral común, generalmente presentan la misma función o familias funcionales. Cada COG se define como el grupo de tres o más proteínas que son ortólogas y se generan mediante la comparación, todos contra todos, de secuencias de proteínas codificadas en genomas completos secuenciados (Tatusov et al., 2000). En la actualidad se han clasificado 25 grupos COG (Tabla 3.4) Para asignar categorías COG a los genes de los 14 genomas se utilizó el script Bac-genomics (Leimbach, 2016). El script utiliza RPS-BLAST+ (BLAST específico de posición inversa) con un valor de E <10-02 contra la base de datos de dominios conservados (CDD) del NCBI. 118 Capítulo 3 Tabla 3.4. Clasificación de los grupos COGs. Símbolo Definicón A Procesamiento y modificación de ARN B Estructura y dinámica de la cromatina C Producción y conversión de energía D Control del ciclo celular, división celular y partición cromosómica E Transporte y metabolismo de aminoácidos F Transporte y metabolismo de nucleótidos G Transporte y metabolismo de carbohidratos H Transporte y metabolismo de coenzimas I Transporte y metabolismo de lípidos J Traducción, estructura ribosómica y biogénesis K Transcripción L Replicación, recombinación y reparación M Biogénesis de la membrana y pared celular N Movilidad celular O Modificación postraduccional P Metabolismo y transporte de iones inorgánicos Q Biosíntesis, transporte y catabolismo de metabolitos secundarios R Predicción de función general S Función desconocida T Mecanismos generales de transducción de señales U Tráfico intracelular, secreción y transporte vesicular V Mecanismos de defensa W Estructuras estracelulares Y Estructura nuclear Z Citoesqueleto 3.3.5. Análisis GhostKOALA del pangenoma. El pangenoma de la cepa P. thermoglucosidasius 23.6 se anotó por separo (core, shell y cloud) utilizando GhostKOALA (KEGG Orthology And Links Annotation), una herramienta interna de KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes) que asigna números KO (KEGG Orthology) a cada una de los CDS mediante búsqueda GhostX contra la bases de datos "genus_prokaryotes + family_eukaryotes + viruses" con los algoritmos de reconstrucción Brite, Pathway y Module (Kanehisa et al., 2016). La búsqueda y reconstrucción de la rutas metabólicas se realizó utilizando el conjuntos de números KO contra el módulo de 119 Análisis genómico de la cepa Parageobacillus thermoglucosidasius 23.6 referencia de KEGG. Se contaron para el core, shell y cloud el número de genes identificados para cada ruta KEGG. 3.3.6 Uso de codones Un codón está formado por tres nucleótidos que codifica para un aminoácido específico. Existe un total de 64 codones distintos (61 codifican para aminoácidos y 3 son codones de parada), pero solo hay 20 aminoácidos por lo que un aminoácido puede ser codificado por varios codones. Existe una redundancia de codones y por eso se dice que el código genético es degenerado. Los codones que se traducen al mismo aminoácido se denominan sinónimos. En los códigos genéticos de diferentes especies de microorganismos existe una preferencia por ciertos codones sobre otros, generando una diferencia de frecuencia en los codones sinónimos. A este fenómeno se le conoce como sesgo en el uso de codones. Conocer la frecuencia de aparición de codones dentro de un genoma es esencial en técnicas biológicas comunes y en varios campos de estudio. Además, los patrones de uso de codones sinónimos pueden ser una herramienta que nos permita deducir posibles relaciones evolutivas entre especies, así como coevolución huésped-patógeno o bacteria-fago específicos (Athey et al., 2017). Para calcular el sesgo del uso de codones de cada gen se ha utilizado el Script de R, coRdon (Elek et al., 2020). El estadístico utilizado en el script es la medida independiente de longitud y composición (MILC, Measure Independent of Length and Composition) (Supek y Vlahovicek, 2005) y normaliza los resultados de acuerdo a la longitud de cada secuencia. Aunque el estadístico MILC es independiente de la longitud hemos eliminado aquellas secuencias menores a 240 120 Capítulo 3 nucleótidos ya que las secuencias cortas no tienen buena representación de algunos aminoácidos. 3.4. Resultados 3.4.1. Características generales del genoma La cepa Parageobacillus thermoglucosidasius 23.6 aislada de suelos de Doñana está depositada en la Colección Española de Cultivos Tipo (CECT) con el número de registro CECT9776. Los datos de secuenciación muestran que Parageobacillus thermoglucosidasius 23.6 alberga en su interior 4 moléculas de ADN de doble cadena circular, a las que se les ha denominado Tmp1, Tmp2, Tmp3 y Tmp4 (Figura 3.4) Durante el ensamblaje del genoma se calculó el número de lecturas de secuenciación para diferentes genes de Tmp1, Tmp2, Tmp3 y Tmp4, con la intención de saber si las cuatro moléculas de ADN estaban presentes en la misma proporción. Se utilizaron como controles los genes de ARN ribosomal 23s y 16s, ya que se conocía el número exacto de copias existentes en el genoma (10 copias de cada uno), y genes que solo estuviesen representados una vez en cada una de las cuatro moléculas de ADN (figura 3.5). 121 Análisis genómico de la cepa Parageobacillus thermoglucosidasius 23.6 Figura 3.4. Esquema y características de las moléculas de ADN presentes en la cepa Parageobacillus thermoglucosidasius 23.6. En la figura 3.5 se muestra que Tmp2 presenta un valor medio ligeramente superior de lecturas que Tmp1 y Tmp3, pero las diferencias no son significativas y sus intervalos de confianza se solapan. Los valores de Tmp1 y Tmp3 son muy parecidos entres si y a los genes control (16s y 23s). Por el contrario Tmp4 tiene el valor mas bajo de lecturas y su intervalo de confianza no solapa con las del resto de moléculas de ADN y los genes control. Este resultado nos indica que Tmp4 está en menor proporción que el resto de moléculas. 122 Capítulo 3 Figura 3.5. Número de lecturas de secuenciación por gen de las cuatro moléculas de ADN presentes en Parageobacillus thermoglucosidasius 23.6 y de los genes de ARN ribosómicos 16s y 23s. 3.4.1.1. Tmp1 Tmp1 representa el elemento genómico principal y es la molécula de ADN de mayor tamaño, 3.870.682 pares de bases (pb) (número de acceso en GenBank: CP063414). Contiene 3914 genes de los cuales 3782 son secuencias que codifican proteínas (CDS), entre estas hay 149 clasificadas como pseudogenes por distintas razones como estar incompletas, tener un codón stop interno, etc. El resto, esta constituido por 132 genes que no codifican proteínas: 10 ARN ribosómicos (ARNr) 23s, 10 ARNr 16s, 7 ARNr 5s, 100 ARN transferente (ARNt) y 5 ARN no codificante (ARNnc). El contenido de guanina mas citosina (G+C) es de un 43,8 % un valor muy similar al resto de cepas de Parageobacillus thermoglucosidasius (Tabla 3.3). 123 Análisis genómico de la cepa Parageobacillus thermoglucosidasius 23.6 tercios de los 62 genes que tiene Tmp3 no están dentro de ningún grupo COG y la gran mayoría de estos genes están anotados como proteínas hipotéticas. Los grupos COGs dominantes en Tmp3 son replicación, recombinación y reparación (L) y tráfico intracelular, secreción y transporte vesicular (U) con 5 genes cada uno. Para esta molécula de ADN, el uso de codones en sus genes es muy diferente al de los genes de Tmp1 (figura 3.9). Los valores se alejan del eje 1:1 indicando que Tmp3 ha sido incorporado en la historia evolutiva reciente de la especie y probablemente tenga un origen lejano al “core” de la cepa Parageobacillus thermoglucosidasius 23.6. Figura 3.9. Representación del sesgo del uso de codones entre los elementos genómicos Tmp1 y Tmp3. 130 Capítulo 3 El resultado del ICEfinder ha detectado en Tmp3 un elemento integrativo y conjugativo de 29906 pb de tamaño, localizado entre las posiciones 15520-45425. El elemento integrativo consta de 35 proteínas (Tabla 3.6). La gran mayoría son de función desconocida y están relacionadas con especies del género Geobacillus y otras especies del Phyllum Firmicutes. ORF 6, ORF 16, ORF 25, ORF 34 y ORF 35 son proteínas que están involucradas en sistemas de secreción tipo II y tipo IV y tienen homología con especies mesófilas como Bacillus cereus y Clostridium argentinense. El elemento integrativo descrito junto con la diferencia significativa en el uso de codones con respecto al genoma principal nos indica que Tmp3 es un plásmido constituido por ADN de microorganismos relativamente alejados al genero Parageobacillus pero del mismo phylum Firmicutes y que han podido ser adquiridos mediante conjugación durante la historia evolutiva relativamente reciente de la cepa. 131 Análisis genómico de la cepa Parageobacillus thermoglucosidasius 23.6 Tabla 3.6. ORF del elemento integrativo de Tmp3. Función, posición, tamaño y homología. ORF Referencia GenBank Nombre Posición pb Tamaño pb Especie homóloga 1 p.004040 Tirosina recombinasa 15520-16461 942 Geobacillus stearothermophilus 2 p.004041 Proteína hipotética 16498-16960 462 - 3 p.004042 fic 16961-17804 843 Geobacillus subterraneus 4 p.004043 antitoxin VbhA 17596-17804 208 Lihuaxuella thermophila 5 p.004044 Proteína hipotética 17805-18248 443 - 6 - traK 18280-18444 165 - 7 p.004045 Proteína hipotética 18461-18838 377 Anoxybacillus caldiproteolyticus 8 p.004046 Proteína hipotética 19019-19240 221 Geobacillus subterraneus 9 p.004047 Proteína hipotética 19307-19486 179 - 10 p.004048 ASCH 19820-20056 236 Parageobacillus genomosp. 1 11 p.004049 Proteína hipotética 20224-20454 230 Bacillales 12 p.004050 Proteína hipotética 21150-21932 782 - 13 p.004051 Regulador transcripcional 21952-22431 479 Bacillus thuringiensis 14 p.004052 Proteína hipotética 22500-23006 506 Bacillales 15 p.004053 Lisozima 23026-24609 1583 Bacillales 16 p.004054 Familia proteínas AAA 24734-27079 2346 Bacillales 17 p.004055 Proteína hipotética 27063-27476 413 Clostridium sp. 18 p.004056 Proteína hipotética 27488-28378 890 Bacillales 19 p.004057 Proteína hipotética 28389-28637 248 Bacillales 20 p.004058 Proteína hipotética 29010-29390 380 Bacillales 21 p.004059 Proteína hipotética 29733-30254 521 Bacillus thuringiensis 22 p.004060 Dominio DUF4320 30271-30666 395 Bacillus thuringiensis 23 p.004061 Proteína hipotética 30742-30987 245 Bacillus cereus 24 p.004062 Proteína hipotética 31019-31873 854 Bacillus sp. AFS098217 25 p.004063 T2SSE 31878-34215 2337 Bacillus cereus 26 p.004064 cpaF 32812-34215 1403 Bacillus sp. dmp10 27 p.004065 parA 34231-35058 827 Geobacillus kaustophilus 28 p.004066 cpaB 35071-36419 1348 Geobacillus kaustophilus 29 p.004067 Proteína hipotética 35913-36419 506 Geobacillus kaustophilus 30 p.004068 Proteína conjugativa 36457-38892 2435 Bacillus cereus 31 p.004069 S-Layer homology 38898-40043 1145 Bacillus cihuensis 32 p.004070 Proteína hipotética 40289-41491 1202 Geobacillus kaustophilus 33 p.004071 Proteína hipotética 41492-41864 372 Geobacillus kaustophilus 34 p.004072 T4SS transferencia ADN 41865-43778 1914 Clostridium argentinense 35 p.004073 mobA/mobL 43797-45425 1629 Aeribacillus pallidus 132 Capítulo 3 2.4.1.4. Tmp4 Tmp4 es una molécula de ADN circular que tiene un tamaño de 55505 pb, un contenido en G+C parecido a Tmp1 y Tmp2, 41.9% y consta de 72 genes (número de acceso en GenBank: CP063417). El sesgo en el uso de codones entre Tmp4 y Tmp1 muestra algunas diferencias (Figura 3.10) pero no tantas como con Tmp3. Los genes de Tmp4 se localizan próximos al eje 1:1 pero hay cierta dispersión de los valores de Tmp1. Figura 3.10. Representación del sesgo del uso de codones entre los elementos genómicos Tmp1 y Tmp4. El programa PHASTER identificó en Tmp4 un fago en posición 11748-55491, con un tamaño de 43,7 Kb y un contenido en G+C del 42,34 %. Imágenes por microscopía electrónica de transmisión (TEM) de la cepa Parageobacillus thermoglucosidasisus 23.6 demostró la presencia de un fago en 133 Análisis genómico de la cepa Parageobacillus thermoglucosidasius 23.6 el interior celular (Figura 3.11). Tiene una morfología típica del orden Caudovirales (fagos con cola), en concreto de la familia Syphoviridae (Ackermann, 2007), cola no contráctil de 185 nm de longitud y cabeza hexagonal de 110 nm de diámetro. Figura 3.11. En la imagen se muestra una célula en plasmólisis (pérdida de turgencia celular) junto con un fago localizado entre la pared celular y la membrana citoplasmática contraída (periplasma). El análisis Blastn de los 72 genes de Tmp4 muestra homología con genomas bacterianos y víricos (Tabla 3.7). 21 genes tienen homología con una secuencia que está anotada en el NCBI como un plásmido de Anoxybacillus sp. B7M1. Al introducir esta secuencia en el programa PHASTER identificamos la presencia de un fago. Al realizar el mismo procedimiento con el resto de genomas bacterianos también descubrimos la presencia de fagos integrados. 134 Cola Pared celular Membrana citoplasmática Cabeza 500 nm Capítulo 3 El sesgo en el uso de codones de Tmp4 y el plásmido de Anoxybacillus sp. B7M1 muestra gran similitud (Figura 3.12), todos los genes se localizan junto al eje 1:1. Por lo tanto Tmp4 está estrechamente relacionado con un posible fago, aún no descrito, presente en la cepa de Anoxybacillus sp. B7M1. Figura 3.12. Representación del sesgo del uso de codones del elemento genómico Tmp4 y un plásmido de Anoxybacillus sp. B7M1. Basándonos en la búsqueda de homología mediante psi-Blastp, podríamos asignar una función hipotética a 34 ORF (Tabla 3.7), que a su vez se pueden englobar en cinco grupos funcionales. Dos de esos grupos han sido detectados por las categorías COG: replicación, recombinación y reparación (L) con 8 genes: ORF1, ORF44, ORF48, ORF61, ORF64, ORF70, ORF71 y ORF72 y transcripción (K) con 6 genes: ORF5, ORF6, ORF8, ORF9, ORF50 y ORF63. Los otros tres grupos son: proteínas estructurales y empaquetamiento del fago, con 13 genes: ORF25, ORF26, ORF27, ORF28, ORF31, ORF32, ORF37, ORF38, ORF40, 135 Análisis genómico de la cepa Parageobacillus thermoglucosidasius 23.6 ORF41, ORF42, ORF43, ORF45; proteínas de lisis: ORF19 y ORF20 y proteínas metabólicas ORF21, ORF34 y ORF56 Tabla 3.7. ORFs de Tmp4. Posición, homología y función. ORF Referencia Gen Bank Posición pb Homología Blast Función 1 p.004080 1-948 Phage Altai3 Recombinasa YqaJ 2 p.004081 945-1142 Geobacillus phage GBSV1 Proteína hipotética 3 p.004082 1241-1381 Geobacillus phage GBSV1 Proteína hipotética 4 p.004083 1378-1563 Geobacillus phage GBSV1 Proteína hipotética 5 p.004084 1563-1796 Geobacillus phage GBSV1 Proteína represora 6 p.004085 2066-2458 Phage Altai3 Regulador transcripcional xre 7 p.004086 2455-2727 -Proteína hipotética 8 p.004087 3308-4243 Phage Altai3 Helix-turn-helix proteína 9 p.004088 4231-5022 Phage Altai3 Proteína ParA 10 p.004089 5006-5338 Phage Altai3 Proteína hipotética 11 p.004090 5862-5999 -Proteína hipotética 12 p.004091 7203-7340 -Proteína hipotética 13 p.004092 7640-9019 G. subterraneus E55-1 plasmid Proteína hipotética 14 p.004093 9079-9642 Clostridium phage phiMMP01 Proteína hipotética 15 p.004094 9758-10123 Thermoanaerosceptrum fracticalcis Proteína hipotética 16 p.004095 10233-10700 P. thermoglucosidasius C56-YS93 Proteína hipotética 17 p.004096 10775-11347 -Proteína hipotética 18 p.004097 11364-11723 Streptococcus phage 5093 Proteína hipotética 19 p.004098 11938-12729 Bacillus licheniformis strain H2 Glucosido hidrolasa 20 p.004099 12729-13145 Geobacillus phage GBSV1 Proteína de lisis 21 p.004100 13200-14684 Clostridium botulinum F str. 230613 Pectato liasa 22 p.004101 14725-15288 Clostridium phage phiCTC2A Proteína hipotética 23 p.004102 15301-16353 Brevibacillus phage Jenst Proteína de adhesión 24 p.004103 16365-18452 -Proteína hipotética 25 p.004104 18537-20294 Brevibacillus phage Jenst Proteína estructural vírica 26 p.004105 20269-21651 Brevibacillus phage Jenst Proteína estructural vírica 27 p.004106 21662-22048 Anoxybacillus sp. B7M1 plasmid Proteína estructural vírica 28 p.004107 22048-22470 Anoxybacillus sp. B7M1 plasmid Proteína estructural vírica 29 p.004108 22482-24080 Anoxybacillus sp. B7M1 plasmid Proteína hipotética 30 p.004109 24077-24769 Anoxybacillus sp. B7M1 plasmid Proteína hipotética 31 p.004110 24783-29120 Anoxybacillus sp. B7M1 plasmid Proteína de cola vírica 32 p.004111 29113-29472 Anoxybacillus sp. B7M1 plasmid Proteína unión cola vírica 33 p.004112 29514-29924 Anoxybacillus sp. B7M1 plasmid Proteína hipotética 136 Capítulo 3 34 p.004113 29996-30829 Anoxybacillus sp. B7M1 plasmid chitobiase/betahexosaminidase 35 p.004114 30843-31238 Anoxybacillus sp. B7M1 plasmid Proteína hipotética 36 p.004115 31238-31750 Anoxybacillus sp. B7M1 plasmid Proteína hipotética 37 p.004116 31755-32165 Anoxybacillus sp. B7M1 plasmid Proteína unión cabeza-cola 38 p.004117 32162-32719 Anoxybacillus sp. B7M1 plasmid Conector cabeza gp6 39 p.004118 32767-33006 Anoxybacillus sp. B7M1 plasmid Proteína hipotética 40 p.004119 33023-34264 Anoxybacillus sp. B7M1 plasmid Proteína principal cápsida HK97 41 p.004120 34370-35110 Anoxybacillus sp. B7M1 plasmid Proteasa cabeza HK97 42 p.004121 35184-37196 Anoxybacillus sp. B7M1 plasmid Proteína portal 43 p.004122 37218-38633 Anoxybacillus sp. B7M1 plasmid Subunidad grande terminasa 44 p.004123 38827-39651 Recombinasa XerD 45 p.004124 39659-40588 Anoxybacillus sp. B7M1 plasmid Subunidad pequeña terminasa 46 p.004125 40714-40902 -Proteína hipotética 47 p.004126 41049-41324 Anoxybacillus sp. B7M1 plasmid Proteína hipotética 48 p.004127 41480-42712 Anoxybacillus sp. B7M1 plasmid Metilasa de ADN 49 p.004128 43265-43552 -Proteína hipotética 50 p.004129 43631-44110 Phage Altai3 ARN polimerasa 51 p.004130 44372-44566 Geobacillus phage GBSV1 Proteína hipotética 52 p.004131 44805-45008 Bacillus phage Wes44 Proteína hipotética 53 p.004132 45022-45522 Geobacillus phage GBSV1 Proteína recombinación U 54 p.004133 45617-45778 -Proteína hipotética 55 p.004134 45768-46022 -Proteína hipotética 56 p.004135 46362-46931 Anoxybacillus phage A403 DUTPasa 57 p.004136 47036-47386 Deep-sea thermophilic phage D6E Proteína hipotética 58 p.004137 47419-47763 P. thermoglucosidasius C56-YS93 Proteína hipotética 59 p.004138 47760-47993 Deep-sea thermophilic phage D6E Proteína hipotética 60 p.004139 47990-48178 Geobacillus sp. Y4.1MC1 Proteína hipotética 61 p.004140 48202-49014 Anoxybacillus sp. B7M1 plasmid Adenina metilasa N6 62 p.004141 49029-49547 P.thermoglucosidasius C56-YS93 Proteína hipotética 63 p.004142 49563-49745 Geobacillus phage GBSV1 Proteína hipotética 64 p.004143 49807-50793 Streptoccocus thermophilus phage Citosina metiltransferasa 65 p.004144 50943-51509 P. thermoglucosidasius C56-YS93 Proteína hipotética 66 p.004145 51509-51703 A. caldiproteolyticus strain U458 Proteína hipotética 67 p.004146 51706-52233 A. flavithermus WK1 Proteína hipotética 68 p.004147 52289-52465 A. caldiproteolyticus strain U458 Proteína DUF5320 69 p.004148 52467-52784 --- Proteína hipotética 70 p.004149 52800-53753 A. caldiproteolyticus strain U458 Proteína replicación 71 p.004150 53638-54387 Geobacillus phage GBSV1 Proteína replicación 72 p.004152 54589-55491 Phage Altai3 Recombinasa RecT Se encontraron 14 regiones con una identidad de secuencia de nucleótidos del 100% con espaciadores CRISPR, dos en Parageobacillus thermoglucosidasius C56-YS93 (ORF15 y ORF 65), uno en Geobacillus sp. Y4.1MC1 (ORF60) y once en Tmp1 (ORF 5, ORF 6, ORF 13, ORF 14, ORF 50, ORF 51, ORF 52, ORF 54, 137 Análisis genómico de la cepa Parageobacillus thermoglucosidasius 23.6 ORF 57 y ORF 58). Hay que destacar que ORF 5 y ORF 6 son reguladores transcripcionales XRE que codifican proteínas involucradas en la regulación de entrada en ciclo lítico o lisogénico. Es posible que estos espaciadores cuando son transcritos a ARN lleven a cabo una regulación post-trascripcional de los genes represores degradando sus ARN y por lo tanto impidiendo que el fago entre en ciclo lisogénico. El alto número de espaciadores de Tmp1 que tienen homología con genes de Tmp4 y la diferencia significativa en el número de lecturas de secuenciación (Figura 3.5) indica que el fago presente en Tmp4 no se integra en el genoma principal de Parageobacillus thermoglucosidasius 23.6. La homología de genes de Tmp4 con espaciadores CRISPR de otras cepas sugiere que Tmp4 o un fago muy similar también infectó a estas cepas en el pasado. Tmp4 es un fago termófilo que interactúa con 23.6, como nos indican los espaciadores CRISPR en Tmp1 y se parece mucho a un posible fago presente en Anoxybacillus sp. B7M1 como indica la homología de secuencias (Tabla 3.7) y el sesgo en el uso de codones (Figura 3.12). 3.4.2 Pangenoma Para obtener una vista general del contenido genómico, se calcularon y visualizaron tanto el genoma central como los pangenomas de las 13 cepas de Parageobacillus thermoglucosidasius registradas en el NCBI (Tabla 3.3) mas la cepa 23.6 en estudio. El número de genes del genoma central disminuyó rápidamente con la adición de genomas y se estabilizó lentamente después de añadir el décimo genoma, 138 Capítulo 3 indicando que los genomas disponibles definen el genoma central de esta especie y podemos considerarlo aproximadamente como cerrado (Figura 3.13.A). El pangenoma mostró un total de 5050 genes, aumentando a una media de 103 genes por genoma añadido. El valor de crecimiento exponencial cuando se agregó el último genoma es de 0.325; por tanto, el pangenoma podría considerarse abierto (Figura 3.13.B). La comparación genómica de Parageobacillus thermoglucosidasius 23.6 con el resto de cepas se puede dividir en tres grupos (Figura 3.14): - Genes que 23.6 comparte con 13 o 12 cepas (Core o genoma central), constituido por 3111 genes localizados principalmente en Tmp1 (85.7 %), solo 7 genes se encuentran en Tmp2 (7 %). - Genes prescindibles, son aquellos que 23.6 tiene en común con un rango de 2 a 11 cepas (Shell), formado por 349 genes de los cuales 294 se localizan en Tmp1 (8.1 %), 51 en Tmp2 (55.4 %) y 4 en Tmp3 (6.45 %). - Genes únicos (Cloud), solo están presentes en 23.6 o una cepa mas, constituido por 318 genes distribuidos entre Tmp1 (226, 6.2 %), Tmp2 (34, 37 %) y Tmp3 (58, 93.5 %). Tmp4, al identificarse como un fago, no se ha incluido en esta agrupación pero sus 72 genes se clasifican como únicos porque no se han encontrado en otras cepas de la especie. 139 Respuesta fisiológica y transcripcional de Parageobacillus thermoglucosidasius 23.6 a cambios de temperatura (60 – 20º C) El estado de crecimiento se indica por el porcentaje de células en división. En el primer ciclo de temperatura de ambos experimentos el porcentaje de células en división (>3 µm³) a 20º C es del 40% y se mantiene constante. En el segundo ciclo, cuando la temperatura desciende a 20º C el porcentaje de células en división es superior, 80% en el experimento A y 60% en el B. En el experimento A el porcentaje de células en división disminuye durante el periodo de incubación a 20º C y esto podría explicar porque el número de células totales y el número de células teóricas no coinciden. Las células que estaban en un estado avanzado de la citocinesis continuaron con la separación durante el periodo de incubación a 20º C, completando el proceso de división. Al subir la temperatura y alcanzar los 60º C el número de células totales disminuye inicialmente para posteriormente recuperarse. En el experimento A la disminución es mas acentuada y la recuperación mas lenta, iniciándose poco antes de volver a disminuir la temperatura (Figura 5.4 (A)). Sin embargo, el porcentaje de células que tienen un biovolumen mayor a 3 µm³ aumenta desde el momento que se alcanzan los 60º C llegando a valores del 70 y el 80 % al final del periodo de incubación a 60º C confirmando un crecimiento activo en ese periodo de exposición a 60ºC. La viabilidad celular durante los experimentos de ciclo de temperatura no se ve comprometida aunque en el experimento A, la unidad formadora de colonias (UFC) disminuye drásticamente (tres órdenes de magnitud menos) después de 8 horas a 60ºC (Figura 5.5) pero posteriormente se recupera durante el tiempo de bajada de temperatura. Por el contrario, en el experimento B no hay cambios significativos en la UFC a lo largo de los ciclos de temperatura. 242 Capítulo 5 Figura 5.5. Evolución del número de UFC a lo largo del ciclo de temperaturas entre 60º C y 20º C. Mientras que en el experimento A el número de UFC disminuye al final de los períodos de 60º C, en el experimento B se mantiene aproximadamente constante el número de UFC a lo largo del tiempo. El descenso de tres ordenes de magnitud de la UFC a 60º C (Figura 5.5) en el experimento A no se corresponde con la disminución de células totales (Figura 5.4). Posiblemente, esta diferencia se deba a que las células del experimento A son de mayor longitud que las del experimento 2, hecho que se ve mas acentuado al final del periodo de incubación a 60º C (Figura 5.6). En concreto, durante esta fase del ciclo mas de un 12 % de células tienen un volumen superior a 8 µm³ y se han medido volúmenes máximos de 40,7 µm³. La aparición de células largas se correlaciona con el recuento de UFC, cuando las células largas se colocan en una 243 Respuesta fisiológica y transcripcional de Parageobacillus thermoglucosidasius 23.6 a cambios de temperatura (60 – 20º C) placa de NB forman una sola colonia pero en realidad representan múltiples células. Figura 5.6. Cambio morfológico de Parageobacillus thermoglucosidasius 23.6 durante el cultivo en quimiostato con ciclos de temperatura. En el experimento A las células presentan una morfología mas alargada. Las imágenes seleccionadas se corresponden con los puntos representados con un asterisco en la figura 5.5. La abundancia de células es el resultado del equilibrio entre su tasa de crecimiento y su mortalidad. No se descarta que la incubación a 60º C después de un periodo de bajas temperaturas afecte a la viabilidad celular ya que se registra un descenso en el número de células totales superior al factor de dilución. En el experimento A el descenso se prolonga mas que en el experimento B. Esta diferencia posiblemente se deba a la configuración de los ciclos de temperatura. Al romper la estabilidad del cultivo en quimiostato la tasa de crecimiento se ve afectada. Las células del experimento B disponen de mas nutrientes (mejores condiciones, tras 10 h de dilución a 20º C) al inicio del periodo de incubación a 60º 244 Capítulo 5 C y entran rápidamente en fase de crecimiento exponencial. Las células se dividen con una tasa de duplicación de 2,3 horas en el primer crecimiento del ciclo y de 1,6 horas en el segundo (Figura 5.4 (B)). Sin embargo las células del experimento A, al tener un período más corto (8 h) a 20ºC, disponen de menos nutrientes y tiene una tasa de duplicación de 3,4 horas en la primera fase de crecimiento (Figura 5.4 (A)). Posiblemente esta diferencia en la tasa de crecimiento explica la diferencia de tamaño celular entre ambos experimentos (Figura 5.6). En el capítulo 2 se ha descrito la correlación negativa entre la tasa de crecimiento y el tamaño celular que ha sido utilizada para comprender la evolución de estos cultivos en los experimentos A y B. Durante el ciclo de temperatura generado (60-20º C), la división celular empieza cuando la temperatura aumenta a valores superiores de 40º C. Sin embargo, la separación de las células en dos células hijas es mas lenta en el experimento A (alargamiento celular) y no se detiene cuando la temperatura desciende a 20° C. Este fenómeno genera un aumento del número de células que viene derivado de un aumento previo en biomasa durante su exposición a 60º C. Durante todo el experimento de ciclos de temperatura no se detectó la producción de esporas, la viabilidad se mantuvo constante y no se observó daño celular que conduzca a rotura celular. Las diferencias en la UFC se corresponden al aumento del tamaño celular que dio una visión sesgada de la situación de crecimiento en el bioreactor en las condiciones de temperatura estudiadas. 245 Respuesta fisiológica y transcripcional de Parageobacillus thermoglucosidasius 23.6 a cambios de temperatura (60 – 20º C) 5.4.1. Análisis del transcriptoma Para el análisis del transcriptoma seleccionamos 3 tiempos del ciclo de temperatura (representados con un circulo en la figura 5.3): T0 (60º C), proviene de un estado de crecimiento lento; T1, primera muestra a 20º C y T3, después de 10 horas de incubación a 20º C. Si tomamos como referencia T0 comparamos la respuesta transcripcional ocasionada por el descenso de la temperatura, mientras que si tomamos como referencia T1 comparamos la regulación transcripcional durante el periodo de incubación a 20º C. Al disminuir la temperatura encontramos que aproximadamente el 66 % de los genes de la cepa 23.6 se expresa diferencialmente (un listado de estos genes expresados diferencialmente entre estas condiciones se muestran en la Tabla 5.1), siendo la represión la respuesta transcripcional mayoritaria con un total de 1742 genes en el primer punto a 20º C y 1884 genes al final del periodo de incubación a 20º C. Los genes sobreexpresados representan aproximadamente un tercio del total de genes regulados significativamente y se mantiene prácticamente constante durante el tiempo de incubación a 20ºC. Destacar que el número de genes que mantienen constante su nivel de expresión es elevado y solo se reduce en unos 100 genes en T2. Si tomamos como referencia T1 (20º C), el 85 % de los genes mantienen su nivel de expresión, mientras que el 15 % se expresa significativamente siendo la represión la regulación principal (470 genes). Resaltar que 167 genes se sobreexpresan tras el periodo de incubación a 20ºC. 246 Capítulo 5 Tabla 5.1. Descripción general comparativa del número de genes en los que se observan diferencias en sus niveles de expresión durante un ciclo de temperaturas Tiempo Temperatura ºC Número de genes con diferencias de expresión significativas Nivel constante de expresión Total Reprimidos Sobreexpresados T0 60 N/A Condición de referencia T1 20 2670 1742 928 1521 T2 20 2781 1884 897 1410 T1 20 N/A Condición de referencia T2 20 637 470 167 3554 La cepa en estudio era una cepa termófila por lo que esperaríamos que la gran mayoría de genes se reprimiesen al descender la temperatura por debajo del mínimo del rango de temperatura de crecimiento (40-70º C). Sin embargo, lo mas relevante es que la gran mayoría de los genes mantienen la misma expresión de ARN en sus células, después de un periodo de incubación a 20º C, incluso la cantidad de ARN por célula se mantiene constante (Figura 5.7). Figura 5.7. Cuantificación del ARN por célula a lo largo de un ciclo de temperatura. 247 Respuesta fisiológica y transcripcional de Parageobacillus thermoglucosidasius 23.6 a cambios de temperatura (60 – 20º C) Con el fin de buscar una respuesta transcripcional mas específica durante el ciclo de temperatura se ha hecho un análisis de los datos en base a categorías funcionales COG. Al comparar la expresión diferencial de las categorías COG tomando como referencia T0 (60º C) (Figura 5.8) observamos que mayoritariamente entre un 40- 60 % de los genes de cada COG se reprimen al disminuir la temperatura a 20º C. Las barras en rojo muestran las categorías COGs que presentan mayor número de genes sobreexpresandos (aproximadamente un 40%), llegando incluso a superar a los genes reprimidos. Estas categorías son: transporte y metabolismo de nucleótidos (F); traducción, estructura ribosómica y biogénesis (J); transporte de iones inorgánicos (P); tráfico intracelular, secreción y transporte vesicular (U); mecanismos de defensa (V). Solo se representa el análisis transcripcional de una muestra (T2) a baja temperatura porque con la otra muestra los resultados obtenidos son muy similares. Aunque la represión génica es la respuesta mayoritaria de los genes cuando la cepa 23.6 pasa de una temperatura óptima de crecimiento (60º C) a una temperatura que está fuera de su rango de crecimiento, vemos que alrededor del 20 % de los genes de cada grupo COG están sobreexpresados (Figura 5.8). Esto sugiere que la célula activa un mecanismo de respuesta general ante el descenso de temperatura. 248 Capítulo 5 Figura 5.8. Porcentajes de genes reprimidos y sobreexpresados en cada categoría COG tomando como referencia la expresión transcripcional a 60º C (T0). En rojo aquellas categorías COG que muestran un nivel elevado de genes sobreexpresados. Por otro lado, si comparamos la expresión diferencial de las categorías COG tomando como referencia la primera muestra a baja temperatura (20º C) (Figura 5.9) vemos que la respuesta comparativa de los niveles de transcripción que presentan valores significativos es muy baja, dominando en todos los grupos COG la represión. Hay algunos grupos COG que presentan genes sobreexpresados y forman una parte importante de genes sobreexpresados en estas condiciones tras un largo período a 20ºC (barras en rojo, figura 5.9). Estos grupos COG están relacionados con la obtención de energía: producción y conversión de energía (C); transporte y 249 T2 (20º C) Respuesta fisiológica y transcripcional de Parageobacillus thermoglucosidasius 23.6 a cambios de temperatura (60 – 20º C) metabolismo de aminoácidos (E); transporte y metabolismo de carbohidratos (G) y biosítesis, transporte y catabolismo de metabolitos secundarios (Q). También hay genes sobreexpresados en el grupo COG de modificación postraduccional (O). Figura 5.9. Porcentajes de genes reprimidos y sobreexpresados en cada categoría COG tomando como referencia la expresión transcripcional a 20º C (T1). Para obtener mas información sobre respuesta transcripcional de Parageobacillus thermoglucosidasius 23.6 a la bajada de temperatura, analizamos los principales reguladores transcripcionales sobreexpresados: Factor sigma de la ARN polimerasa (inicio de la transcripción), marR (reguladores de resistencia a antibióticos y estrés oxidativo), lysR (regulador general involucrado en la virulencia, metabolismo, motilidad etc), tetR (represor transcripcional), gntR (regulador general del metabolimso), merR (activador de la transcripción), nusA (parte del complejo procesivo de transcripción y antiterminación del ARNr), mntR 250 Capítulo 5 (regulador de la homeostasis de manganeso y cadmio), proteínas de choque frio (cold shock protein, csp) etc. El aumento en la expresión de los reguladores transcripcionales a 20º C concuerda con la sobreexpresión de genes implicados en la síntesis de proteínas ribosomales 30s y 50s; factores de iniciación de la traducción if-1, if-2 e if-3; genes involucrados en la glucólisis (gap, pfkA, pyk); transportadores de azúcares ABC ; transportadores de iones inorgánicos (fosfato, manganeso, hierro, zinc, etc) sistemas de fosfotransferasa (ptsP), genes involucrados en la quimiostaxis y movimineto flagelar (motB, fliL, pilM), proteínas de secreción (secY), etc. Como describimos en el capítulo 2, el genoma principal (Tmp1) consta de 100 ARN transferentes (ARNt) y 5 ARN no codificantes (ARNnc). Los datos de transcriptómica muestran que 81 ARNt y 3 ARNnc (endoribonucleasa P, 6S y 4.5 S) aumentan significativamente cuando la temperatura baja a 20º C (Figura 5.10). Estos ARNnc estan involucrados en la biosíntesis de ARNt (rnpB), son reguladores transcripcionales (6S) y mantienen la viabilidad celular (4.5S). Además, genes relacionados con la modificación de los ARNt (truA, truB) también están sobreexpresados. Todo esto indicaría que la cepa termófila 23.6 mantiene un metabolismo activo durante el periodo de incubación a 20º C. 251 Respuesta fisiológica y transcripcional de Parageobacillus thermoglucosidasius 23.6 a cambios de temperatura (60 – 20º C) Después del periodo de incubación a 20º C cuando se alcanza la temperatura óptima de crecimiento (60º C) se observa un descenso en el número de células totales (mas pronunciado en el experimento A), indicando posibles eventos de mortalidad celular. Las altas temperaturas tienen efectos importantes sobre las propiedades estructurales y fisiológicas de las bacterias, afectando las membranas, ADN, ARN, ribosomas, etc. (Russell, 2003). Los microorganismos termófilos no están exentos de esos efectos aunque hasta cierto modo les favorece ya que pueden aproximarse a su temperatura óptima de crecimiento. Aunque la viabilidad celular se vea comprometida al subir la temperatura, el descenso pronunciado de células totales y UFC en el experimento A se podría explicar mediante el cambio en la morfología celular (Figura 5.6). Overkamp et al., (2015) observó que el aumento del tamaño celular de Bacillus subtilis durante el crecimiento en retentostato generaba un descenso en la UFC ya que las células largas están constituidas por varias células pero solo darían lugar a una colonia. Con respecto al número total de células, en el experimento A la disponibilidad de nutrientes por célula es menor que en el B cuando se alcanzan las condiciones óptimas de crecimiento (a 60º C tras un período a 20º C) y esto se ve reflejado en una tasa de crecimiento menor ya que durante el experimento el crecimiento en quimiostato es limitado por el aporte de nutrientes. En estas condiciones las células se alargan (Capítulo 3; Overkamp et al., 2015) y tardan mas tiempo en separarse por lo que no observaríamos un aumento en el número de células. Si el mantenimiento de la abundancia celular es un equilibrio entre la tasa de crecimiento y la tasa de mortalidad (Marchant et al., 2008; Pedrós-Alió, 2012), al aumentar la temperatura en el experimento A inicialmente no detectaríamos un crecimiento y la mortalidad existente (Russell, 2003) daría lugar a un descenso en el número de células totales hasta que completasen la división. Por el contrario en el experimento B al disponer de mas nutrientes las células tienen una tasa de 258 Capítulo 5 crecimiento mayor y fueron capaces de terminar su ciclo de división antes, no se acumularon células largas en el bioreactor y, por lo tanto, el descenso en el número de células totales es mucho menor y solo se observa al inicio de la fase de incubación a 60º C. Una de las respuestas mas importantes que presentan las especies del género Geobacillus y Parageobacillus ante situaciones adversas es la formación de esporas como estructuras de resistencia (Nazina et al., 2001). El estrés térmico (por baja temperatura) originado por los ciclos de temperatura junto con el estrés nutricional (capítulo 3) no induce la formación de esporas en la cepa 23.6. De hecho, según nuestro conocimiento, no existen citas de inducción de esporas por reducción de la temperatura en Bacillales, aunque la formación de esporas es una respuesta típica a aumentos de temperatura extremos para numerosas bacterias Gram-positivas. Esas condiciones de variaciones de temperatura son típicas de los suelos y la periodicidad de las condiciones ambientales, como las climáticas y ciclos diarios, lo que confirma que la cepa 23.6 al igual que otras cepas de Geobacillus/Parageobacillus (Marchant et al., 2002; Portillo et al., 2012) se encuentran en los suelos en forma vegetativa y participan activamente en el ecosistema suelo y mantenimiento de su salud. Para comprender mejor cómo las bacterias termófilas a nivel molecular se adaptan a las bajas temperaturas, se realizó un estudio transcriptómico para identificar genes que se expresan diferencialmente a 20° C. Un gran número de reguladores de la transcripción, marR, lysR, tetR, gntR, merR, nusA y mntR se regularon significativamente al inicio del periodo de incubación a 20º C. La sobreexpresión de estos reguladores transcripcionales indica que las células 259 Respuesta fisiológica y transcripcional de Parageobacillus thermoglucosidasius 23.6 a cambios de temperatura (60 – 20º C) detectan el descenso de temperatura y ponen en marcha un programa global de expresión génica. Algunos génes específicos de choque térmico al frio descritos en Bacillus subtilis como cps, inosina fosforilasa (purine nucleoside phosphorylase, pnp), factor de elongación, if-1, if-1 e if-3 (Phadtare e Inouye, 2008) también se sobreexpresan en Parageobacillus thermoglucosidasius 23.6. La inducción de los factores de traducción es necesaria para reiniciar la síntesis de proteínas durante el estrés por frío (Wounters et al., 2001; Phadtare e Inouye, 2008). También se observó un aumento en la expresión del factor sigma 54, que está involucrado en la expresión de genes relacionados con la utilización de fuentes de carbono, metabolismo energético, modificación del ARN, quimiotaxis etc. (Buck et al., 2000; Jagannathan et al., 2001). Esta respuesta transcripcional concuerda con el aumento de expresión a temperaturas bajas (20º C) de los genes de la glucólisis (gap, pfkA, pyk), transportadores ABC de azúcares e iones inorgánicos, sistemas de fosfotransferasa (ptsP), genes involucrados en la quimiostaxis y movimineto flagelar (motB, fliL, pilM) y proteínas de secreción (secY). La expresión de esos genes podría ayudar al microorganismo a obtener suficientes nutrientes esenciales y mantener un nivel mínimo de metabolismo anabólico y catabólico. En este sentido, una explicación para este aumento de expresión génica encaminado a aumentar la funcionalidad de las células puede ser resultado del concepto citado por distintos autores (Wiebe et al. 1992) según el cual la eficiencia metabólica a bajas temperaturas disminuye y, por tanto, para mantener cierto metabolismo las células requieren mayor abundancia de proteínas funcionales (i.e., enzimas). 260 Capítulo 5 Al final del periodo de incubación a 20º C la gran mayoría de los genes mantiene su expresión (incluso algunos aumentan su nivel de expresión) y la cantidad de ARN por célula permanece constante. Esto puede sugerir que la degradación del ARN ha sido inhibida a lo largo del tiempo de exposición a 20º C o que la síntesis y degradación del ARN presentaban un equilibrio. También hemos de tener en cuenta que al descender la temperatura, la degradación del ARN debe reducirse por el efecto de la bajada de temperatura sobre la actividad (reducida) de los enzimas destinados a su descomposición. La vida media de los ARNm en las bacterias puede variar de segundos a mas de una hora y generalmente son mas cortos que el tiempo de duplicación del organismo (Laalami et al., 2014). De este modo, mientras el ARN es relativamente estable a temperaturas moderadas, la degradación del ARN se acelera significativamente al aumentar la temperatura en mesófilos llegando a una vida media de menos de 3 min (Portillo y González, 2008). Por otra parte, en los últimos años, diferentes estudios han manifestado una estabilización del ARNm como respuesta a condiciones de estrés, generalmente factores que alteran la tasa de crecimiento (Vargas-Blanco y Shell, 2020). Una de las respuestas al estrés es la reducción de ribonucleasas (enzimas que degradan el ARN). A temperaturas de 20º C la cepa 23.6 inhibe la transcripción de las principales ribonucleasas (rnr, rny, ribonucleasa J) que constituyen el degradosoma (complejo multiproteíco especializado en la degradación del ARN). Otra de las respuestas que se observa es un aumento en la expresión de las proteínas ribosomales, ARNt, rnpB y genes encargados de la modificación epigenética del ARN (truA, truB, queA). Se ha descrito que un aumento en la expresión y función de estos genes aumenta la estabilidad del ARN (Vargas-Blanco y Shell, 2020). 261 Respuesta fisiológica y transcripcional de Parageobacillus thermoglucosidasius 23.6 a cambios de temperatura (60 – 20º C) En condiciones de estrés (temperatura de 20º C y limitación de nutrientes) los microorganismos termófilos estabilizan la degradación y mantienen sus niveles de ARN. Esta característica confiere una ventaja adaptativa ya que al mantener los niveles de expresión de los genes les evita la necesidad de sintetizar nuevo ARN y la presencia de un nivel elevado de ARN les permitirá responder rápidamente cuando las condiciones vuelvan a ser óptimas y facilitan la viabilidad celular ya que ambos factores de estrés para P. thermoglucosidasius 23.6 representan un descenso en la eficiencia nutricional de estas células. Como se observa en nuestros resultados las respuesta de P. thermoglucosidasius 23.6 al aumento de temperatura es muy rápida y es proporcional a las condiciones del medio, es decir, si las células disponen de mas nutrientes cuando las temperaturas son altas (60º C) la tasa de crecimiento específico aumenta y viceversa. Por lo tanto, esta condición coincide con el estado de “alerta fisiológico” que mantiene a las células potencialmente activas (Blagodatskaya y Kuzyakov, 2013) permitiendo responder rápidamente ante cambios ambientales y nutricionales. La plasticidad genómica mediada por la transferencia horizontal de genes es una característica típica en los géneros Geobacillus y Parageobacillus (Stuknyte et al., 2008; De Maayer et al., 2014; Burgess et al., 2017). Al disminuir las temperaturas muchos de los genes involucrados en estos procesos, como las secuencias de inserción o transposasas y la infección vírica (tmp4), se reprimen. Sin embargo la conjugación, representada principalmente por el plásmido tmp3, es el único elemento genómico de esta cepa que presenta mas genes sobreexpresados que reprimidos cuando la temperatura baja a 20º C. Teniendo en cuenta que Tmp3 tiene unas características muy diferentes al genoma principal (capítulo 2), un origen reciente en la cepa 23.6 y una gran homología con representantes mesófilos del género Bacillus y Clostridium, cabría indicar que el descenso de 262 Capítulo 5 temperatura favorece la incorporación de ADN exógeno, contribuyendo a una mayor diversidad genómica y una mejor adaptación del medio. Los fagos son muy abundantes en la tierra y en términos globales la abundancia de fagos representa aproximadamente un orden de magnitud superior al de células bacterianas. Los fagos juegan un papel importante en la regulación y desarrollo de las comunidades bacterianas (Breitbart y Rohwer, 2005; Hambly y Suttle, 2005). La infección del fago (Tmp4) depende de la tasa de crecimiento de la cepa 23.6 (mayor tasa de crecimiento mayor expresión del fago) (capítulo 4) y durante los ciclos de temperatura la escasez de nutrientes mantiene tasas de crecimiento bajas, que junto con el descenso de la temperatura provoca que Tmp4 no se exprese, lo que favorece el mantenimiento de la viabilidad y el crecimiento de la cepa 23.6 en el suelo. La respuesta transcripcional de Parageobacillus thermoglucosidasius 23.6 al descenso de la temperatura es muy similar a la descrita por Tripathy et al., (2014) en Brevibacillus borstelensis. El género Brevibacillus incluye representantes termófilos y presenta características similares a Parageobacillus: bacterias grampositivas, taxonómicamente cercanas (O. Bacillales, Firmicutes) y se encuentran habitualmente en suelos. Los cambios de temperatura en la superficie del suelo es uno de los factores de estrés más frecuentes y todo parece indicar que estos microorganismos termófilos están muy bien adaptados a las bajas temperaturas, manteniendo un metabolismo activo y posiblemente llevando a cabo un crecimiento lento que les permite persistir en el ecosistema y responder con rapidez a cambios favorables en este hábitat. 263 Respuesta fisiológica y transcripcional de Parageobacillus thermoglucosidasius 23.6 a cambios de temperatura (60 – 20º C) 5.6. Conclusiones. La simulación de ciclos de temperaturas del suelo en un cultivo de quimiostato nos ha permitido confirmar que microorganismos termófilos como Parageobacillus thermoglucosidaisus están adaptados a este tipo de estrés ambiental, manteniendo su viabilidad como células vegetativas y respondiendo rápidamente cuando las condiciones vuelven a ser óptimas para el crecimiento. Incluso algunos procesos celulares, como la citocinesis, no se detienen a temperaturas de 20º C. El perfil transcripcional a 20º C indicó una sobreexpresión de numerosos reguladores transcripcionales, incluidos genes de choque frío, que indujeron una respuesta transcripcional general regulando diferencialmente el 66 % de los genes anotados y sobreexpresando genes relacionados con la traducción, sistemas de secreción, conjugación, obtención de energía etc. En general, estos hallazgos sugieren que Parageobacillus thermoglucosidasius 23.6 regula un gran número de genes que le permiten adaptarse a un ambiente de baja temperatura incluso responder rápidamente cuando las condiciones vuelven a ser óptimas para el crecimiento ya que a temperatura de 20º C los niveles de expresión de los genes se mantienen constantes. 264 Capítulo 5 5.7. Bibliografía Blagodatskaya, E., Kuzyakov, Y. (2013) Active microorganisms in soil: critical review of estimation criteria and approaches. 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Anotación de los genes representados en la figura 5.10 Referencia Gen Nombre pgaptmp_000002 rpmH 50S ribosomal protein L34 pgaptmp_000018 - 30S ribosomal protein S6 pgaptmp_000020 rpsR 30S ribosomal protein S18 pgaptmp_000071 - PTS sucrose transporter subunit IIBC pgaptmp_000125 -sigma-54-dependent Fis family transcriptional regulator pgaptmp_000233 - ABC transporter permease pgaptmp_000254 - tRNA-Asn pgaptmp_000255 - tRNA-Ser pgaptmp_000256 - tRNA-Glu pgaptmp_000258 - tRNA-Glu pgaptmp_000259 - tRNA-Lys pgaptmp_000261 - tRNA-Leu pgaptmp_000268 - tRNA-Met pgaptmp_000269 - tRNA-Asp pgaptmp_000340 - ABC transporter permease pgaptmp_000456 - TetR family transcriptional regulator pgaptmp_000481 - GntR family transcriptional regulator pgaptmp_000482 - ABC transporter ATP-binding protein pgaptmp_000556 - ABC transporter ATP-binding protein pgaptmp_000579 - tRNA-Val pgaptmp_000581 - tRNA-Lys pgaptmp_000582 - tRNA-Leu pgaptmp_000583 - tRNA-Gly pgaptmp_000585 - tRNA-Arg pgaptmp_000586 - tRNA-Pro pgaptmp_000587 - tRNA-Ala pgaptmp_000588 - tRNA-Met pgaptmp_000589 - tRNA-Ile pgaptmp_000590 - tRNA-Ser pgaptmp_000591 - tRNA-Met pgaptmp_000592 - tRNA-Asp pgaptmp_000593 - tRNA-Phe pgaptmp_000594 - tRNA-Thr pgaptmp_000595 - tRNA-His pgaptmp_000596 - tRNA-Gly pgaptmp_000597 - tRNA-Ile pgaptmp_000598 - tRNA-Asn pgaptmp_000599 - tRNA-Glu pgaptmp_000600 - tRNA-Glu pgaptmp_000601 - tRNA-Gly pgaptmp_000625 - multidrug efflux SMR transporter 274 Respuesta fisiológica y transcripcional de Parageobacillus thermoglucosidasius 23.6 a cambios de temperatura (60 – 20º C) Referencia Gen Nombre pgaptmp_000626 - multidrug efflux SMR transporter pgaptmp_000627 - TetR/AcrR family transcriptional regulator pgaptmp_000667 arsB ACR3 family arsenite efflux transporter pgaptmp_000673 - MarR family transcriptional regulator pgaptmp_000768 - ABC transporter ATP-binding protein pgaptmp_001008 - ABC transporter permease pgaptmp_001025 - ABC transporter ATP-binding protein pgaptmp_001027 - TetR/AcrR family transcriptional regulator pgaptmp_001049 - PTS transporter subunit EIIC pgaptmp_001051 ptsP phosphoenolpyruvate--protein phosphotransferase pgaptmp_001134 rpmF 50S ribosomal protein L32 pgaptmp_001231 codY GTP-sensing pleiotropic transcriptional regulator CodY pgaptmp_001276 nusA transcription termination/antitermination protein NusA pgaptmp_001279 infB translation initiation factor IF-2 pgaptmp_001281 rbfA 30S ribosome-binding factor RbfA pgaptmp_001282 truB tRNA pseudouridine(55) synthase TruB pgaptmp_001298 - GntR family transcriptional regulator pgaptmp_001349 - MFS transporter pgaptmp_001384 - MFS transporter pgaptmp_001418 - cold-shock protein pgaptmp_001448 - iron chelate uptake ABC transporter family permease subunit pgaptmp_001449 - iron ABC transporter permease pgaptmp_001450 - iron-siderophore ABC transporter substrate-binding protein pgaptmp_001553 - ABC transporter ATP-binding protein pgaptmp_001554 - sugar ABC transporter permease pgaptmp_001556 - ABC transporter substrate-binding protein pgaptmp_001620 - ABC transporter permease pgaptmp_001621 - ABC transporter substrate-binding protein pgaptmp_001622 - ABC transporter ATP-binding protein pgaptmp_001623 - ABC transporter substrate-binding protein pgaptmp_001624 - ABC transporter permease pgaptmp_001626 - ABC transporter ATP-binding protein pgaptmp_001627 - ABC transporter ATP-binding protein pgaptmp_001637 - ABC transporter ATP-binding protein pgaptmp_001639 - TetR/AcrR family transcriptional regulator pgaptmp_001768 - sigma-54-dependent Fis family transcriptional regulator pgaptmp_001774 - MerR family transcriptional regulator pgaptmp_001777 celB PTS cellobiose transporter subunit IIC pgaptmp_001791 - DeoR/GlpR transcriptional regulator pgaptmp_001998 - sigma-70 family RNA polymerase sigma factor pgaptmp_002099 - ABC transporter ATP-binding protein pgaptmp_002100 - carbohydrate ABC transporter permease pgaptmp_002101 - sugar ABC transporter permease pgaptmp_002165 - tRNA-Ser pgaptmp_002166 - tRNA-Ala pgaptmp_002167 - tRNA-Pro 275 Capítulo 5 Referencia Gen Nombre pgaptmp_002169 - ABC transporter ATP-binding protein pgaptmp_002178 - ABC transporter ATP-binding protein pgaptmp_002179 - ABC transporter ATP-binding protein pgaptmp_002187 cadA cadmium-translocating P-type ATPase pgaptmp_002190 - ABC transporter ATP-binding protein pgaptmp_002191 - GntR family transcriptional regulator pgaptmp_002273 rnpB RNase P RNA component class B pgaptmp_002332 - methionine ABC transporter ATP-binding protein pgaptmp_002373 - iron-siderophore ABC transporter substrate-binding protein pgaptmp_002377 - ammonium transporter pgaptmp_002470 - tRNA-Gly pgaptmp_002471 - tRNA-Cys pgaptmp_002472 - tRNA-Gly pgaptmp_002773 - phosphate ABC transporter ATP-binding protein pgaptmp_002779 pstA phosphate ABC transporter permease PstA pgaptmp_002780 pstC phosphate ABC transporter permease subunit PstC pgaptmp_002781 pstS phosphate ABC transporter substrate-binding protein PstS family protein pgaptmp_002788 - metal ABC transporter permease pgaptmp_002789 - ABC transporter ATP-binding protein pgaptmp_002821 prmA 50S ribosomal protein L11 methyltransferase pgaptmp_002890 ssrS 6S RNA pgaptmp_002903 tgt tRNA guanosine(34) transglycosylase Tgt pgaptmp_002904 queAtRNA preQ1(34) S-adenosylmethionine ribosyltransferase-isomerase QueA pgaptmp_002925 rplU 50S ribosomal protein L21 pgaptmp_003002 - ABC transporter permease pgaptmp_003004 - ABC transporter ATP-binding protein pgaptmp_003023 - ABC transporter ATP-binding protein pgaptmp_003024 - ABC transporter ATP-binding protein pgaptmp_003037 rplT 50S ribosomal protein L20 pgaptmp_003038 rpmI 50S ribosomal protein L35 pgaptmp_003039 infC translation initiation factor IF-3 pgaptmp_003119 - cation transporter pgaptmp_003140 - zinc ABC transporter substrate-binding protein pgaptmp_003150 - ABC transporter substrate-binding protein pgaptmp_003173 - MFS transporter pgaptmp_003200 rpsD 30S ribosomal protein S4 pgaptmp_003254 - tRNA-Gln pgaptmp_003255 - tRNA-His pgaptmp_003256 - tRNA-Trp pgaptmp_003257 - tRNA-Tyr pgaptmp_003258 - tRNA-Thr pgaptmp_003259 - tRNA-Phe pgaptmp_003260 - tRNA-Asp pgaptmp_003261 - tRNA-Met pgaptmp_003262 - tRNA-Val 276 Respuesta fisiológica y transcripcional de Parageobacillus thermoglucosidasius 23.6 a cambios de temperatura (60 – 20º C) Referencia Gen Nombre pgaptmp_003263 - tRNA-Glu pgaptmp_003322 - inorganic phosphate transporter pgaptmp_003369 - MetQ/NlpA family ABC transporter substrate-binding protein pgaptmp_003370 - ABC transporter permease pgaptmp_003371 - methionine ABC transporter ATP-binding protein pgaptmp_003390 - ABC transporter ATP-binding protein pgaptmp_003391 - iron chelate uptake ABC transporter family permease subunit pgaptmp_003392 - ABC transporter permease pgaptmp_003399 - GntR family transcriptional regulator pgaptmp_003624 - MFS transporter pgaptmp_003625 - TetR/AcrR family transcriptional regulator pgaptmp_003630 - LysR family transcriptional regulator pgaptmp_003680 erm 23S ribosomal RNA methyltransferase Erm pgaptmp_003683 - ABC transporter ATP-binding protein pgaptmp_003684 - iron-hydroxamate ABC transporter substrate-binding protein pgaptmp_003685 - iron ABC transporter permease pgaptmp_003690 - iron ABC transporter permease pgaptmp_003692 - iron-hydroxamate ABC transporter substrate-binding protein pgaptmp_003717 - tRNA-Ala pgaptmp_003718 - tRNA-Gly pgaptmp_003719 - tRNA-Lys pgaptmp_003720 - tRNA-Gln pgaptmp_003721 - tRNA-Tyr pgaptmp_003722 - tRNA-Thr pgaptmp_003723 - tRNA-Val pgaptmp_003724 - tRNA-Glu pgaptmp_003725 - tRNA-Thr pgaptmp_003726 - tRNA-Asn pgaptmp_003730 - tRNA-Ile pgaptmp_003732 - tRNA-Ala pgaptmp_003733 - tRNA-Pro pgaptmp_003734 - tRNA-Arg pgaptmp_003735 - tRNA-Leu pgaptmp_003736 - tRNA-Gly pgaptmp_003737 - tRNA-Leu pgaptmp_003738 - tRNA-Lys pgaptmp_003739 - tRNA-Val pgaptmp_003751 truA tRNA pseudouridine(38-40) synthase TruA pgaptmp_003752 - energy-coupling factor transporter transmembrane protein EcfT pgaptmp_003753 - energy-coupling factor ABC transporter ATP-binding protein pgaptmp_003754 - energy-coupling factor ABC transporter ATP-binding protein pgaptmp_003755 rplQ 50S ribosomal protein L17 pgaptmp_003757 rpsK 30S ribosomal protein S11 pgaptmp_003758 rpsM 30S ribosomal protein S13 pgaptmp_003759 rpmJ 50S ribosomal protein L36 pgaptmp_003760 infA translation initiation factor IF-1 277 Capítulo 5 Referencia Gen Nombre pgaptmp_003765 rpmD 50S ribosomal protein L30 pgaptmp_003766 rpsE 30S ribosomal protein S5 pgaptmp_003767 rplR 50S ribosomal protein L18 pgaptmp_003768 rplF 50S ribosomal protein L6 pgaptmp_003769 rpsH 30S ribosomal protein S8 pgaptmp_003771 rplE 50S ribosomal protein L5 pgaptmp_003772 rplX 50S ribosomal protein L24 pgaptmp_003773 rplN 50S ribosomal protein L14 pgaptmp_003774 rpsQ 30S ribosomal protein S17 pgaptmp_003775 rpmC 50S ribosomal protein L29 pgaptmp_003777 rpsC 30S ribosomal protein S3 pgaptmp_003778 rplV 50S ribosomal protein L22 pgaptmp_003779 rpsS 30S ribosomal protein S19 pgaptmp_003780 rplB 50S ribosomal protein L2 pgaptmp_003781 rplW 50S ribosomal protein L23 pgaptmp_003783 rplC 50S ribosomal protein L3 pgaptmp_003784 rpsJ 30S ribosomal protein S10 pgaptmp_003787 rpsG 30S ribosomal protein S7 pgaptmp_003788 rpsL 30S ribosomal protein S12 pgaptmp_003789 - 50S ribosomal protein L7ae-like protein pgaptmp_003790 rpoC DNA-directed RNA polymerase subunit beta pgaptmp_003793 rplL 50S ribosomal protein L7/L12 pgaptmp_003794 - 50S ribosomal protein L10 pgaptmp_003796 rplK 50S ribosomal protein L11 pgaptmp_003800 sigH RNA polymerase sporulation sigma factor SigH pgaptmp_003818 - tRNA-Ala pgaptmp_003819 - tRNA-Pro pgaptmp_003820 - tRNA-Arg pgaptmp_003821 - tRNA-Leu pgaptmp_003822 - tRNA-Gly pgaptmp_003823 - tRNA-Leu pgaptmp_003824 - tRNA-Lys pgaptmp_003825 - tRNA-Val pgaptmp_003847 - tRNA-Glu pgaptmp_003848 - tRNA-Met pgaptmp_003886 - tRNA-Ala pgaptmp_003887 - tRNA-Ile pgaptmp_003894 ffs signal recognition particle sRNA large type pgaptmp_003908 - tRNA-Ala pgaptmp_003909 - tRNA-Ile 278 Capítulo 6 Discusión y conclusiones generales 279 Capítulo 6 6.1. Discusión general La distribución de los microorganismos y los factores que afectan a la composición de las comunidades microbianas están sujetos a un intenso debate por parte de la comunidad científica (Horner-Devine et al., 2004; Whitfield, 2005; Martiny et al., 2006; Pedrós-Alió, 2012; Zeigler, 2014). Esto se debe a la variabilidad existente en los ambientes naturales y al gran número de factores (abióticos y bióticos) que influyen en dichos ecosistemas (Ward, 2006). En la naturaleza, podemos encontrar ambientes que mantienen unas características mas o menos constantes a lo largo del tiempo, como por ejemplo las fuentes termales, donde los microorganismos se distribuyen principalmente dentro del rango de temperaturas a los que se encuentran mejor adaptados (Cuecas et al., 2014) o en otras palabras dentro de sus condiciones óptimas de crecimiento. También podemos encontrar muchos microorganismos que no se distribuyen siguiendo los límites aparentemente establecidos por las condiciones ambientales, como es el ejemplo de los microorganismos termófilos del género Geobacillus y Parageobacillus que han sido aislados de ambientes muy dispares (Suzuki, 2018), incluido algunos con características muy alejadas a sus condiciones óptimas de crecimiento (Marchant et al., 2002; Santana y González, 2015; Wong et al., 2015). La presencia de estos microorganismos termófilos en ambientes fríos y su repercusión ecológica en estos nichos no ha tenido una explicación consensuada, alguno autores lo atribuyen a la dispersión de células desde ambientes geotérmicos o cálidos y a su capacidad de formar esporas (Zeigler, 2014), mientras que otros autores sugieren que pueden participar activamente en las reacciones biogeoquímicas del suelo y desempeñar un papel ecológico importante (González y Portillo, 2010 a, b,c; Santana et al., 2013 González et al., 2015; Santana et al. 2021). 280 Discusión y conclusiones generales El presente trabajo busca profundizar en el estudio de las características fisiológicas y moleculares de un microorganismo termófilo típico del suelo cuando se encuentra en condiciones muy diferentes de sus condiciones óptimas de crecimiento, por ejemplo, en suelos. De este modo podremos comprender si estas bacterias termófilas son capaces de persistir en el medio ambiente y que estrategias utilizan durante estos períodos con condiciones adversas en relación a sus requerimientos de crecimiento. Para ello, una parte importante de esta tesis se ha centrado en: (i) el desarrollo de un sistema versátil de bioreactores que permite un amplio rango de condiciones de cultivo de microorganismos con especial interés en la posibilidad de explorar si estos microorganismos pueden persistir a tasas de crecimiento cercanas a cero, típicas de condiciones limitantes por recursos nutritivos en la naturaleza, y (ii) la simulación de ciclos diarios de temperatura típicos en la superficie de suelos. Ese tipo de bioreactores, junto con las nuevas técnicas de secuenciación masiva y el uso de herramientas bioinformáticas nos han permitido contribuir a una mejor comprensión del modo de vida de los microorganismos termófilos mas allá de sus condiciones óptimas de crecimiento. El microorganismo utilizado en este estudio es Parageobacillus thermoglucosidasius 23.6 (CECT9776), una cepa termófila aislada del suelo del Parque Nacional de Doñana (Huelva). Inicialmente, la secuenciación de su genoma estaba pensada como paso previo a los análisis transcriptómicos, sin embargo, una vez ensamblado, este genoma proporciona una enorme cantidad de información, como por ejemplo, la presencia de secuencias en cuatro elementos genómicos (Tmp1, Tmp2, Tmp3 y Tmp4) que presentan datos muy valiosos relacionados con la adaptación e interacción de estos microorganismos con su ambiente y su modo de vida. 281 Capítulo 6 Una de las características mas importantes de la cepa 23.6 es que dispone de numerosas herramientas en su genoma para llevar a cabo transferencia horizontal de genes (Furuya y Lowy, 2006). Transformación, promovida por el elevado número de secuencias de inserción presentes en Tmp1 y Tmp2 y su proximidad a genes únicos en esta cepa; Conjugación, representada por Tmp3, y Traducción, por la presencia de un fago (Tmp4) y el elevado número de regiones CRISPR con homología a fagos. La detección y evaluación de fenómenos de HGT resulta una tarea aún complicada (Ravenhall et al., 2015) aunque algunos estudios han sugerido que la transferencia de material genético se ve favorecida bajo las condiciones de estrés a la que están sometidos los microorganismos, específicamente los termófilos, en el ambiente (van Wolferen et al., 2013; Urbieta et al., 2015; Cuecas et al., 2017). En nuestro trabajo observamos que la respuesta trancripcional de los elementos genómicos que llevan a cabo la HGT varía en función del estrés aplicado. A tasas de crecimiento cercanas a cero y temperaturas de 60º C (condición muy frecuente en la superficie de los suelos durante el periodo estival) la transformación mediada por transposasas sería el principal motor evolutivo (capítulo 4). Por el contrario, a temperaturas bajas (20º C) y tasas de crecimiento reducidas se ve favorecido el intercambio de ADN con otros microorganismos o la captación de ADN exógeno (capítulo 5). Tmp4 no se activaría bajo condiciones de estrés ya que solo se expresa a tasas de crecimiento elevadas (60ºC y abundancia de nutrientes) (capítulo 4). Esto podría deberse, en parte, a la sobreexpresión a tasas de crecimiento cercanas a cero del "sistema inmunológico adaptativo" específico de secuencia (Marraffini y Sontheimer, 2010), llevado a cabo por los espaciadores con homología a Tmp4 y las proteínas CAS. Cuando las temperaturas son bajas (20º C) la expresión de Tmp4 permanece inhibida (capítulo 5). El hecho de que los mecanismos de HGT se regulen diferencialmente bajo estas condiciones de estrés no excluye que estos mecanismos puedan activarse con la 282 Discusión y conclusiones generales influencia de otros estímulos diferentes. La heterogeneidad del suelo es tan alta que los microorganismos están sometidos constantemente a multitud de interacciones (abióticas y bióticas) y en este trabajo hemos destacado alguna de las más comunes. Como han postulado algunos autores (Bezuidt et al., 2016; Esin et al., 2018 y Wang et al., 2020), la transferencia horizontal de genes es la principal fuerza evolutiva del género Geobacillus y Parageobacillus. La heterogeneidad en las condiciones a las que están sometidos estos microorganismos en la naturaleza implicarían un aumento de la presión ambiental promoviendo el intercambio genético. Como consecuencia, las especies de estos géneros presentan una distribución mundial y muestran la adquisición de características relacionadas con los hábitats donde han sido aislados (Das et al., 2014; Burgess et al., 2017; Fujii et al., 2018; Gómez et al., 2020; Gómez et al., 2021). Para que los microorganismos termófilos puedan vivir en condiciones que no son óptimas para su crecimiento no basta con integrar nuevos fragmentos de ADN, si no que también han de iniciar una respuesta transcripcional general y adecuadamente regulada que le confiera ventajas adaptativas para aprovechar al máximo los recursos que ofrece el medio y mantener su viabilidad. De este modo, el cultivo de los microorganismos termófilos en el retentostato es una muy buena aproximación al estudio de tasas de crecimiento cercanas a cero (típica de los termófilos en ambientes naturales) y experimentalmente ha sido sobradamente probada (Arbige y Chesbro, 1982; van Verseveld et al., 1984,1986; Tappe et al., 1996,1999; Boender et al., 2009; Ercan et al., 2013; Overkamp et al., 2015; van Mastrigt et al., 2017). Por lo tanto, en esta tesis se describe el primer cultivo en retentostato de una bacteria termófila, en nuestro caso aislada de una muestra de suelo, Parageobacillus thermoglucosidasius 23.6. 283 Capítulo 6 genes encargados de obtener energía de fuentes alternativas (lípidos) y de su metabolismo secundario. 5. En condiciones adversas (escasez de nutrientes) la cepa 23.6 activa un gran número de elementos móviles genéticos favoreciendo la diversificación del genoma e impidiendo la infección por el fago (Tmp4) que coexiste con esta cepa, lo que favorece su viabilidad y persistencia en los ambientes que coloniza cuando las condiciones son restrictivas para su crecimiento. 6. La simulación de cambios de temperatura, o ciclos diurnos de temperatura del suelo, en un cultivo continuo en quimiostato confirma que Parageobacillus thermoglucosidaisus 23.6 mantiene su viabilidad como células vegetativas, permitiéndole una rápida respuesta tan pronto vuelvan las condiciones óptimas para su crecimiento. 7. El perfil transcripcional a 20º C indicó una sobreexpresión de numerosos reguladores transcripcionales que influyen directamente en la traducción, sistemas de secreción, conjugación, obtención de energía etc, que les permite adaptarse a un ambiente de baja temperatura. Una característica importante durante su persistencia a bajas temperaturas es el mantenimiento de sus moléculas de ARN lo que lee permite una pronta respuesta a cambios ambientales y un ahorro en la síntesis de nuevas macromoléculas. 290 Discusión y conclusiones generales 6.3. Bibliografía Arbige, M., Chesbro, W. R. 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