Reconocimiento molecular en macromoléculas sintéticas

RECONOCIMIENTO MOLECULAR EN MACROMOLÉCULAS SINTÉTICAS INÉS ORELLANA RUIZ UNIVERSIDAD DE SEVILLA FACULTAD DE FARMACIA CURSO 2015-2016 2 UNIVERSIDAD DE SEVILLA FACULTAD DE FARMACIA TRABAJO DE FIN DE GRADO GRADO EN FARMACIA RECONOCIMIENTO MOLECULAR EN MACROMOLÉCULAS SINTÉTICAS Inés Orellana Ruiz Sevilla, 20 de septiembre de 2016 Departamento de Química Orgánica y Farmacéutica Tutores: Doña Inmaculada Molina Pinilla y Don Manuel Bueno Martínez Carácter bibliográfico 3 RESUMEN El reconocimiento molecular constituye actualmente una de las ramas de estudio más prometedora, fruto de la combinación de las ciencias químicas y biológicas. Este concepto está involucrado en numerosos procesos biológicos que se dan en la naturaleza y que, al contrario de lo que se cree, raramente ocurren al azar, sino que a menudo ocurren entre moléculas seleccionadas, sobretodo en sistemas altamente organizados, lo que implica asociaciones intermoleculares más o menos complejas que pueden ser vistas como el sistema de comunicación molecular del mundo químico. La creación de macromoléculas sintéticas capaces de realizar reconocimiento molecular ha aumentado espectacularmente en los últimos años. Estos compuestos tienen aplicación en el análisis clínico, medioambiental y agroalimentario. En el campo farmacéutico abre un amplio abanico de posibilidades a la hora de diseñar nuevas terapias. De los métodos de obtención de macromoléculas sintéticas capaces de reconocimiento molecular, en este trabajo de fin de grado, se ha elegido la impresión molecular por su bajo coste, resistencia, versatilidad, alta selectividad y sencillez de preparación. En esta revisión se pretende dar una visión general de cómo se efectúa el reconocimiento molecular y de las interacciones no covalentes que lo hacen posible, y, además, explicar uno de los métodos más importante de obtención de macromoléculas sintéticas, la impresión molecular. Se hace un repaso de las ventajas con respecto a los receptores biológicos y las limitaciones de los polímeros impresos molecularmente. Las cuatro formas de impresión molecular que revisamos pueden optimizarse en aspectos como los monómeros funcionales, agentes de entrecruzamiento, disolvente porógeno e iniciador. Dedicamos, por ello, un último apartado a los nuevos enfoques para la optimización. ABSTRACT Molecular recognition is currently one of the most promising study fields, resulting from the combination of the chemical and biological sciences. It is involved in many biological processes that occur in nature. Contrary to popular belief, these processes rarely occur randomly, especially in highly organized systems involving intermolecular associations. These associations, more or less complex, can be seen as the molecular communication system of the chemical world. The creation of synthetic macromolecules capable of molecular recognition has increased dramatically in recent years. These compounds have applications in the clinical, environmental and food analysis. In the pharmaceutical world, they open up a wide range of possibilities when designing new therapies. Of the methods existing to obtain 4 synthetic macromolecules capable of molecular recognition, Molecular Imprinting was chosen for its low cost, strength, versatility, high selectivity and ease of preparation. This review aims to give an overview on how the molecular recognition is made and of the non-covalent interactions that make it possible as well as explain one of the most important methods of obtaining synthetic macromolecules, molecular printing. A review of the advantages against biological receptors and the limitations of molecularly imprinted polymers is made. Four forms of molecular impression are reviewed, and these can be optimised in aspects such as functional monomers, crosslinking agents, pore-forming solvent and initiator. This is addressed in the last chapter of this work. PALABRAS CLAVE Molecular recognition, macromolecules, synthetic polymers, antibody, molecular imprinting. 5 ÍNDICE 1. Introducción ............................................................................................................................ 6 2. Objetivos ................................................................................................................................. 8 3. Metodología ............................................................................................................................ 8 4. Resultados y Discusión ............................................................................................................ 8 4.1. Reconocimiento Molecular: Química Supramolecular .................................................... 8 4.2. Interacciones No Covalentes .......................................................................................... 10 4.2.2. Enlace de hidrógeno. ........................................................................................... 12 4.2.3. Interacciones  ................................................................................................. 13 4.2.4. Interacciones de Van der Waals y dispersión de London .................................... 15 4.2.5. Efecto hidrofóbico ................................................................................................ 17 4.3. Macromoléculas Sintéticas empleadas en el Reconocimiento Molecular ..................... 18 4.3.1. Polímeros de Impresión Molecular (MIPs) .......................................................... 19 4.3.2. Métodos de obtención de los MIPs .................................................................... 20 4.3.2.1. Método de impronta covalente ............................................................. 20 4.3.2.2. Método de impronta no covalente ........................................................ 22 4.3.2.3. Método semi-covalente ......................................................................... 23 4.3.2.4. Método de impronta mediante “espaciadores sacrificables” ............... 24 4.3.3. Optimización a nivel sintético de los MIPs en el Reconocimiento ..................... 26 4.3.3.1. Monómeros funcionales ........................................................................ 27 4.3.3.2. Agente de entrecruzamiento ................................................................. 29 4.3.3.3. Disolvente porógeno .............................................................................. 31 4.3.3.4. Iniciador .................................................................................................. 31 4.4. Nuevos Métodos ............................................................................................................ 32 5. Conclusiones.......................................................................................................................... 33 6. Bibliografía ............................................................................................................................ 34 6 1. INTRODUCCIÓN El Reconocimiento Molecular es el proceso por el que un receptor reconoce e identifica una especie química a través de un conjunto de interacciones moleculares estructuralmente muy bien definidas (Fernández-González y Guardia, 2007). Este proceso se da en la naturaleza de forma espontánea y es el punto de partida de numerosos procesos biológicos tales como los neurotransmisores, las hormonas, los sistemas enzima-sustrato y antígeno-anticuerpo, los mecanismos de acción de los fármacos, entre otros. La especificidad del reconocimiento molecular (host-guest) se basa en la complementariedad estructural y funcional de una parte de las moléculas que participan en el equilibrio de interacción. Son las interacciones no covalentes las que juegan un papel fundamental en este proceso de reconocimiento molecular, y generalmente, no es un único tipo de interacción intermolecular por sí misma la que impulsa la unión receptor-ligando, sino que es la acción cooperativa de múltiples de estas interacciones. La cooperatividad es un concepto fundamental, no solo en el reconocimiento molecular sino también en los auto-ensamblajes supramoleculares, es decir en la asociación espontánea de pequeñas entidades, para formar agregados estables y perfectamente estructurados, como son las proteínas globulares. La cooperatividad ha permitido explicar cómo el comportamiento de un sistema de interacciones en conjunto, es diferente de lo que se esperaría de cada una de las interacciones individuales aisladas (Carrillo y cols., 2011). Cuanto más complementarios sean los lugares receptorligando, mayor es su energía de unión, lo que lo convierte en un fenómeno fundamental en el desarrollo y la regulación de las propiedades colectivas en los complejos químicos y en los sistemas biológicos. Un conocimiento estructural a nivel atómico de esta complementariedad molecular en los procesos de reconocimiento molecular en disolución, permite aportar nuevas soluciones optimizadas en forma de modificaciones químicas, con el objetivo de incrementar o disminuir las afinidades entre las moléculas participantes, creando así el entorno adecuado para el diseño racional de nuevos ligandos. El objetivo o reto, es la posibilidad de desarrollar compuestos sintéticos capaces de presentar una funcionalidad equiparable a los de la naturaleza, siendo de gran interés para uso médico y farmacéutico. Es por ello que, en el campo de la investigación química actual, un objetivo de gran interés es el diseño, preparación y caracterización de receptores sintéticos capaces de imitar los procesos de reconocimiento molecular llevados a cabo por macromoléculas biológicas como las enzimas, debido a su elevado potencial de desarrollo en aplicaciones como en el análisis de compuestos de importancia clínica y ambiental y preparación de sensores (Mahon y Fulton, 2014). La química 7 supramolecular estudia los sistemas que implican la unión de moléculas o iones mediante interacciones no covalentes: interacciones electrostáticas, enlaces de hidrógeno o interacciones por formación de dipolos (Steed y cols., 2007). Para ello emplea la Impresión Molecular, una estrategia que permite crear matrices poliméricas artificiales con sitios de unión selectivos que presentan propiedades de reconocimiento molecular específico con una distribución de grupos funcionales adecuada para enlazar al sustrato que se desea. Presentan una gran afinidad, así como una selectividad, similar a muchos receptores naturales, pudiéndose regenerar fácilmente. Son fáciles de fabricar y se pueden producir en grandes cantidades debido al bajo coste de los reactivos necesarios para su preparación (Figura 1). Figura 1.- Representación del proceso de obtención de polímeros de impresión molecular (MIPs); (a) Formación del complejo de prepolimerización entre la molécula molde y los monómeros funcionalizados. (b) Co-polimerización con el agente de entrecruzamiento. (c) Extracción de la plantilla de la cavidad. (d) Unión de la plantilla a la cavidad. El empleo de MIPs (“molecular imprinted polymers”) presenta una serie de ventajas frente a biomoléculas como son los anticuerpos, los ácidos nucleicos, las enzimas, etc., como es la posibilidad de trabajar en condiciones extremas de pH, o temperatura, así como en presencia de disolventes orgánicos, no viéndose afectado por ello ni su estructura ni su afinidad por el sustrato. Sin embargo, presentan problemas de contaminación al no poderse eliminar completamente las moléculas molde. Los MIPs se están empleando ampliamente en campos como la biología y en medioambiente. (Tamayo y cols., 2007; Pichon, 2007; Stevenson, 1999). 8 2. OBJETIVOS En esta revisión se han marcado los siguientes objetivos:  Proporcionar una visión general del concepto “reconocimiento molecular”.  Mostrar la relación existente entre el reconocimiento molecular y las macromoléculas sintéticas.  Exponer cómo se diseñan y sintetizan dichas macromoléculas mediante impresión molecular.  Indicar los avances más recientes en su preparación en el reconocimiento molecular, que podrían ser de interés. 3. METODOLOGÍA Este trabajo de fin de grado perteneciente al campo de la Química Orgánica y Farmacéutica, con pinceladas de otros como la Tecnología Farmacéutica y la Biotecnología, tiene un carácter bibliográfico. La metodología ha consistido en la recopilación de información, empleando recursos electrónicos como las bases de datos científicas PubMed (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed), Scopus (http://www.scopus.com/) y Science Direct (http://www.sciencedirect.com/), además de los Recursos-e de la Biblioteca de la Universidad de Sevilla (http://bib.us.es/busca_y_encuentra/recursos_e). Como palabras clave en la búsqueda se emplearon: molecular, recognition, macromolecules, synthetics, polymers, antibody, dendrimers, molecular imprinting. Para que esta búsqueda quedara dirigida al tema deseado, se combinaron “molecular” y “recognition” con las otras palabras clave en todas las búsquedas. De los artículos y revisiones encontrados se seleccionaron los más recientes, fundamentalmente de 2010 en adelante, y los de mejor índice de impacto. Al proceder a la consulta de estas fuentes, todas en inglés, se presenta el obstáculo del empleo de un lenguaje técnico que se resuelve conforme se avanza en el conocimiento de la materia. A la hora de elaborar el contenido se contó con la orientación y seguimiento de los profesores tutores a través de entrevistas personales y consultas vía email, acordando planes de trabajo marcados. En la confección del trabajo se siguieron las directrices del documento “Especificaciones formales memoria Trabajo Fin de Grado” de la Facultad de Farmacia. 9 4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 4.1.- Reconocimiento Molecular: Química Supramolecular Es la química de enlaces covalentes a la que se le ha prestado mayor atención durante décadas ya que los enlaces covalentes determinan la disposición de los átomos dentro de una molécula, sin embargo son las interacciones no covalentes, siendo muchos más débiles, las que controlan las propiedades de numerosos procesos biológicos y químicos como el reconocimiento, la catálisis, el transporte, la regulación,…, ya que son las responsables de la conformación de las moléculas o de las agregaciones moleculares. Es por ello que, en los últimos años, el diseño y la síntesis de nuevos receptores moleculares destinados al reconocimiento selectivo de moléculas de importancia biológica y/o química ha sufrido un desarrollo espectacular. El concepto “Reconocimiento Molecular” (Gellman, 1997) comprende un conjunto de fenómenos basados en interacciones específicas y de naturaleza no covalente. Es un proceso que incluye no sólo el reconocimiento sino también la interacción selectiva entre entidades químicas dentro de un entorno químico complejo, con el objetivo de realizar una función específica (Lehn, 1995). Esta unión selectiva es el resultado de la combinación del ajuste estérico entre el ligando y la cavidad del receptor junto a una distribución espacial apropiada de los lugares de unión entre ambas moléculas, que potenciará las interacciones atractivas y disminuirá las repulsivas. Por lo tanto, en el reconocimiento molecular, la elevada selección por parte del receptor se fundamentará en una gran diferencia en la energía del sistema resultante en la formación del complejo con una molécula determinada frente a otras presentes (Figura 2) (Lehn, 1985). Figura 2.- Diagrama de energía de formación del complejo receptor-ligando: la energía libre de asociación (  Ga) determina la constante de asociación (Ka). Las energías libres de activación para la asociación compleja (ΔGon ‡) y de la disociación (ΔGoff ‡), establecen las constantes de velocidad correspondientes para estos pasos (kon y koff, respectivamente). 16 4.2.4.- Interacciones de Van der Waals y dispersión de London Estas interacciones surgen de la interacción de una nube electrónica que se encuentra polarizada debido a la acción de núcleos adyacentes, por lo que la fuerza de estas interacciones depende por un lado de la polarizabilidad de las moléculas que participan, siendo las más polarizables las que den lugar a interacciones más fuertes y por otro lado de la distancia, ya que realmente tienen importancia cuantitativa exclusivamente a distancias cortas o muy cortas. Las interacciones de Van der Waals, pueden ser tanto atractivas como repulsivas (Figura 11), ya que las moléculas se atraen entre sí cuando se encuentran a una distancia moderada, pero, cuando sus nubes electrónicas empiezan a solaparse, las moléculas se repelen con fuerza. Son relativamente débiles, no direccionales, y muy importantes en campos como la química supramolecular, biología estructural, ciencia de polímeros, nanotecnología, ciencia de superficies y física de la materia condensada. Figura 11.- Interacciones dipolo-dipolo atractivas y repulsivas. Las fuerzas de dispersión de London tienen lugar en enlaces no polares y se origina por la aparición de dipolos instantáneos transitorios que todas las moléculas presentan debido a una distribución asimétrica de la nube electrónica alrededor del núcleo. Este dipolo instantáneo, con magnitud y dirección muy cambiantes, polariza a otra molécula e induce en ella un momento dipolar también instantáneo. Los dos dipolos se atraen mutuamente siendo por tanto el resultado de esta inducción una fuerza atractiva denominada fuerza dipolo inducidodipolo inducido o fuerzas de London, y en consecuencia la energía potencial del par disminuye. Estas interacciones intermoleculares tienen un valor similar en agua y en disolventes orgánicos (Figura 12) (Van Benthem y cols., 2006). En la química supramolecular, más concretamente en sistemas ligando-receptor, estas interacciones juegan un papel muy importante. 17 Figura 12.- Representación esquemática de las fuerzas de dispersión de London en moléculas no polares: algunas forman un dipolo instantáneo y éstos inducen a la formación de un dipolo en las moléculas vecinas. 4.2.5.- Efecto hidrofóbico El efecto solvofóbico surge al desplazarse las moléculas de disolvente, que se encuentran en el interior de la cavidad de un receptor, al formarse el complejo receptor-ligando. Este efecto recibe el nombre de hidrofóbico cuando se produce en un medio acuoso. Durante años el origen del efecto hidrofóbico ha sido interpretado de diferentes maneras, siendo las más aceptadas aquellas que se basan en el aspecto termodinámico. En ellas los efectos hidrofóbicos poseen dos componentes energéticos principales: un efecto hidrofóbico entálpico, cuando un sustrato reemplaza a las moléculas de agua dentro de una cavidad y un efecto hidrofóbico entrópico debido a que la combinación de dos o más moléculas orgánicas en disolución acuosa para formar un complejo supramolecular provocan un aumento de la entropía, debido al desorden que se produce al salir las moléculas de la cavidad del receptor, lo que se traduce en una disminución de la energía libre global del sistema (Figura 13). Las interacciones hidrofóbicas entálpicas se dan fácilmente en sistemas donde las moléculas de agua interaccionan débilmente con la cavidad hidrofóbica del receptor y la energía en el sistema es alta. Al reemplazar estas moléculas de agua por un ligando, la energía del sistema disminuye como consecuencia de la interacción entre las moléculas de agua que se encontraban en el interior y las del exterior (Steed y cols., 2007). Se ha observado este tipo de interacción en diferentes sistemas como micelas, vesículas, proteínas, ácidos nucleicos, análisis de drogas, … 18 Figura 13.- El desplazamiento de las moléculas de agua ordenadas provoca un aumento de la entropía provocando que la formación del complejo enzima-sustrato sea termodinámicamente más favorable. 4.3.- Macromoléculas Sintéticas empleadas en el Reconocimiento Molecular Cuando se pretende diseñar y sintetizar moléculas receptoras artificiales que puedan mimetizar los procesos biológicos, la Naturaleza sirve de inspiración a la química supramolecular para poder entender cada una de las etapas que ocurren en determinados de estos procesos, como la transcripción del código genético, la entrada de virus en las células, la inducción de la señal por neurotransmisores, etc. (Hunter, 2004); (Szalewick y cols., 2005); (Nandi y cols., 2007); (Krushelnitsky y cols., 2006). Es de esta manera cómo surge el concepto Química “Host-Guest” o “Huésped-Anfitrión” (Cram, 1983) basado en una evolución del modelo “Llave-Cerradura” postulado por Fischer (Fischer, 1894) a finales del siglo XIX, para describir cómo un enzima actúa y se une a un sustrato. Para que se produzca un reconocimiento molecular es preciso que la interacción sea selectiva y discrimine a un sustrato frente a otros. Según las características que tenga el receptor las funciones que pueden provocar pueden ser variadas, desde las más básicas como la catálisis o el transporte hasta otras más complejas como el auto-ensamblaje dando lugar a capas, membranas, vesículas, cristales líquidos, …) (Figura 14). Figura 14.- Modelo “llave-cerradura”, subrayando la complementariedad topológica imprescindible en el reconocimiento molecular 19 D. Koshland, (Koshland, 1958) tras varios estudios realizados, publicó, posteriormente algunas modificaciones al postulado de Fischer, conocido como el modelo de “encaje inducido”. En él concluyó que las enzimas son estructuras flexibles que pueden sufrir cambios conformacionales en su centro activo al darse la interacción con el sustrato, dando como resultado el complejo enzima-sustrato. Tras el reconocimiento, el sustrato es transformado en uno o varios productos y termina liberándose del punto de anclaje, dejando libre a la enzima (Figura 15). Figura 15.- Modelo “de encaje inducido”: (1) Reconocimiento del sustrato. (2) El receptor sufre un cambio conformacional, provocando que el proceso de ajuste sea más preciso. (3) Catálisis enzimática. (4) Liberación de los productos. 4.3.1.- Polímeros de Impresión Molecular (MIPs) Los Polímeros de Impresión Molecular (MIPs) son definidos como “polímeros tridimensionales con huecos específicos inducidos por una molécula molde que sirven para el reconocimiento molecular y que dan lugar a un material donde el molde dirige la disposición y orientación de los componentes que lo forman mediante un mecanismo de autoensamblaje” (Henry y cols., 2005), es decir son materiales sintéticos que actúan como receptores biomiméticos artificiales ya que pueden de una manera específica y selectiva reconocer un determinado sustrato reproduciendo de forma básica, el mecanismo de acción de algunos sistemas biológicos como son los sistemas hormona-receptor, enzima-sustrato, o antígeno-anticuerpo (Sellergren, 2001). La obtención de estos materiales con “memoria selectiva” se basa en la síntesis de un polímero altamente entrecruzado, alrededor de una molécula que actúa como molde (plantilla o “template”) que se extrae tras la polimerización, generando una cavidad. El MIPs presentará, con respecto a la molécula molde, lugares de unión complementarios en cuanto a forma, tamaño y distribución de grupos funcionales, lo que permitirá posteriormente un reconocimiento molecular de forma selectiva, como una “cerradura” y una “llave” (Figura 16). 20 Figura 16.- Aplicación del modelo llave-cerradura al reconocimiento molecular de los MIPs (Suedee, 2013). Los MIPs suelen presentar ventajas importantes con respecto a los receptores biológicos en las aplicaciones indicadas anteriormente: a) Posibilidad de reconocimiento selectivo y específico en medio orgánico. b) Tiempo de vida media largo ya que presenta una alta estabilidad química, térmica y mecánica frente a diferentes condiciones de pH, temperatura y presencia de disolventes orgánicos. c) Reproducibilidad en el proceso de síntesis con un bajo coste a gran escala. d) Aplicación a muy diversos moldes, incluyendo biomoléculas, sustancias tóxicas o especies para las que aún no se ha localizado un elemento de reconocimiento biológico. Sin embargo, también presentan limitaciones, como un reconocimiento selectivo limitado en medio acuoso, constantes de afinidad moderadas, lo que implica una cinética de unión lenta, a veces el procedimiento de síntesis de los MIPs conlleva varias etapas o que se necesitan altas concentraciones de molécula molde. (Lanza y Sellergren, 2004). 4.3.2.- Métodos de obtención de los MIPs Se puede distinguir cuatro procedimientos en la preparación de los MIPs (Mayes y Whitcombe, 2005), en base al modo en el que se determina la posición concreta de los grupos funcionales del polímero para que el reconocimiento sea óptimo: - Método de impronta covalente - Método de impronta no covalente - Método semi-covalente - Método de impronta mediante “espaciadores sacrificables” 21 4.3.2.1.-Método de impronta covalente Es en 1972 cuando Wulff y Klotz (Wulff y Sarhan, 1972); (Takagishi y Klotz, 1972) presentaron, de forma independiente, los primeros ejemplos de impronta molecular covalente con polímeros orgánicos sintéticos, los cuales presentaban una selectividad predeterminada hacia determinadas moléculas. En el modelo de impresión covalente (Figura 17) primero se produce la obtención de un complejo a partir de la molécula molde y los monómeros funcionalizados unidos entre sí mediante enlaces covalentes “reversibles”. Una vez obtenido este complejo de prepolimerización, se adiciona un agente de entrecruzamiento, el iniciador y el disolvente en el que se lleva a cabo la polimerización (porogen), lo que permitirá la formación de una red tridimensional a través de la polimerización propiamente dicha. Esta polimerización generalmente sigue un mecanismo de propagación radicálico y puede estar inducida tanto térmica como fotoquímicamente. Finalmente, mediante medios químicos como una hidrólisis ácida/básica, se extrae el molde de la resina polimérica obteniéndose una estructura tridimensional que contiene cavidades de reconocimiento que son complementarias en forma, tamaño y con los grupos funcionales dispuestos en la posición adecuada a la molécula molde. Estas cavidades permiten, teóricamente, que el polímero impreso sea capaz de reconocer de forma selectiva tanto a la plantilla como a otros compuestos estructuralmente análogos. Figura 17.- Esquema de la preparación de MIPs de impresión covalente: a) formación del complejo de pre-polimerización entre la molécula molde y los monómeros funcionalizados; b) adición del agente de entrecruzamiento y polimerización; c) extracción del molde. El tipo de enlace covalente “reversible” que se han empleado en la preparación del complejo de pre-polimerización ha sido principalmente:  Éster borónico para la impresión de galactosa y fructosa (Wulff y cols., 1977); (Takeba y cols., 1998) (Figura 18), nucleótidos (Sallacan y cols., 2002), etc. a) b) c) 22  Base de Schiff en la síntesis de MIPs enantioselectivos para aminoácidos (Verdon y Couëdor, 1999).  Enlace acetal para la formación de polímeros de plantillas basadas en mono- y diacetona (Heller y cols., 2006). Figura 18.-. MIPs del 4-nitrofenil-α-D-manopiranosido-2,3:4,6-di-O-(4- vinilfenilboronato) (A). (1) Formación del complejo de pre-polimerización entre el ácido 4-vinilbenzenoborónico y el 4- nitrofenil-α- D-manopiranosido; (2) adición del agente de entrecruzamiento, divinilbenzeno o etilenglicol dimetacrilato y polimerización; (3) extracción del molde a través de la hidrólisis de los grupos éster del boronato y la adición de 4 equivalentes de agua. La unión de la molécula molde al polímero es reversible (Wulff y cols., 1977). Las principales ventajas en este tipo de polimerización se basan en que al realizarse la síntesis en condiciones estequiométricas, por un lado, se minimiza considerablemente la presencia de interacciones inespecíficas, ya que no hay monómeros fuera de las cavidades, de ahí su elevada selectividad; mientras que por otro lado se obtienen polímeros que presentan centros activos con una elevada homogeneidad y bien definidos, es decir muy similares entre sí. Sin embargo, este método de síntesis presenta limitaciones importantes como es que el número de monómeros capaces de formar enlaces covalentes reversibles con la plantilla es limitado, o la ruptura química del molde de la matriz polimérica, así como una cinética de unión más lenta, ya que el reenlace de la molécula impresora con análogos al molde, son también covalentes. A pesar de haber sido el primer método en desarrollarse, debido a las limitaciones que presenta su aplicación ha sido considerablemente escasa. 23 4.3.2.2.- Método de impronta no covalente Fue a principios de los años 80, cuando el grupo de Mosbach sintetizó geles de poliacrilamida selectivos a varios indicadores y alcaloides (Andersson y cols., 1984) introduciendo un avance importante en el campo de la impresión molecular al desarrollar un modelo no-covalente. La diferencia con el método de impronta covalente radica en que, en este proceso, el complejo de pre-polimerización no se prepara a través de enlaces covalentes, sino que se emplean interacciones moleculares de carácter débil, del tipo de enlaces de hidrógeno, interacciones ππ, dipolo-dipolo, electroestáticas y/o hidrofóbicas, que originan un preordenamiento molecular maximizando la interacción entre las dos especies. Estas interacciones pueden darse en uno o más puntos de las moléculas. En este método el molde se extrae de la matriz entrecruzada utilizando un disolvente capaz de anular las interacciones no covalentes específicas con el monómero funcional. (Figura 19). Figura 19.- Esquema de la preparación de MIPs de impronta no covalente; a) formación del complejo de pre-polimerización entre la molécula molde y los monómeros funcionalizados; b) adición del agente de entrecruzamiento y polimerización; c) extracción del molde. Este método es más flexible ya que hay una mayor variedad de monómeros y de moléculas impresoras, pero presenta el inconveniente de que las cavidades de unión que se obtienen son más heterogéneas debido al movimientos relativos entre la molécula molde y el polímero, por lo que son menos selectivas. Con este método, al emplearse interacciones débiles, el reenlace de la molécula presenta una cinética de unión muy favorable. 4.3.2.3.- Método semi-covalente El modelo semi-covalente combina las ventajas de los dos métodos de impresión anteriores. En este caso, la síntesis de la matriz se realiza del mismo modo que en el modelo covalente, la molécula se imprime como un complejo estable mediante interacciones covalentes, sin embargo, las interacciones implicadas en el reconocimiento posterior de los moldes análogos, es de naturaleza no covalente (Figura 20). 24 Este modelo fue formulado por primera vez por Sellergren y Andersson en 1990 al sintetizar un MIPs a partir del acetato de p-aminofenilalanina. Tras la hidrólisis del enlace amida formado entre el monómero y la plantilla, los restos de ácido carboxílico presentes en la matriz polimérica eran capaces de interaccionar con el aminoácido mediante la formación de enlaces por puente de hidrógeno (Sellergren y cols., 1990). Figura 20. Esquema de la preparación de MIPs de impresión semi-covalente. (a) Síntesis del MIP mediante impresión covalente, (b) Reenlace de la molécula molde mediante interacciones no covalentes. Con respecto a las ventajas que presenta esta técnica destaca el hecho de que, al eliminar la necesidad de formar un enlace covalente reversible durante la utilización del polímero, se pueden emplear diferentes tipos de monómeros y/o plantillas que permitan la formación de enlaces covalentes más fuerte y estables durante la síntesis del MIP. Por ejemplo, se ha empleado con éxito la formación de enlaces de tipo éster en métodos semi-covalentes porque en los casos en los que la hidrólisis ácida o básica del enlace éster no sea posible, se puede emplear LiAlH4 para poder reducirlo (Byström y cols., 1993). Así se han preparado MIPs capaces de reconocer, testosterona (Sneschkoff y cols., 2002), bisfenol A (Joshi y cols., 1999), 4- nitrofenol (Caro y cols., 2002) o esteroides (Byström y cols., 1993). Al igual que el método covalente la matriz tridimensional presentará una extraordinaria selectividad y una mayor homogeneidad en la distribución de puntos de unión. Su principal desventaja deriva de las diferencias estéricas que existe entre los enlaces covalente y no covalente, ya que el enlace no covalente necesita una mayor distancia para su formación que uno covalente. Además, este método conlleva una importante carga sintética necesaria para la fabricación de los monómeros funcionales. 25 4.3.2.4.-Método de impronta mediante “espaciadores sacrificables” Este método surge cuando Whitcombe (Whitcombe y cols., 1995) pretende solucionar la limitación de la distancia de enlace que presentaba el modelo semi-covalente introduciendo un espaciador, en concreto un grupo carbonilo, entre el monómero funcionalizado y el molde. Dicho grupo espaciador se eliminó posteriormente en forma de CO2 durante la hidrólisis del enlace formado en el complejo de pre-polimerización (Figura 21). Figura 21. Preparación de MIPs selectivos al colesterol empleando al grupo carbonilo como espaciadores sacrificables (B). (1) El complejo de pre-polimerización colesteril (4-vinil) fenilcarbonato (A) polimeriza con EDMA; (2) la molécula A permanece unida covalentemente al polímero resultante; (3) hidrólisis alcalina que elimina al molde a la vez que se produce la pérdida del espaciador (CO2) obteniéndose un MIP con un grupo fenol en la zona de reconocimiento; (4) reconocimiento del colesterol mediante enlace de hidrógeno con el fenol. La mayoría de los MIPs preparados utilizan plantilla altamente funcionalizadas, con grupos amino, amido, carboxilo y carbonílicos. La obtención de MIPs mediante “espaciadores sacrificables” permite ampliar la impronta molecular a MIPs con otras características químicas, ya que esta técnica otorga la capacidad de formar enlaces de hidrógeno débiles o desarrollar interacciones que involucren electrones π de sistemas aromáticos, que no se formarían con monómeros funcionales convencionales. Otro ejemplo nos lo proporciona J. Chen (Qi y cols., 2010) que empleó el método semicovalente con un grupo carbonilo como espaciador sacrificable para sintetizar una MIP para el 4-clorofenol. El MIP preparado a partir de 4-clorofenil (4-vinil) fenil carbonato resultó ser el mejor monómero funcionalizado (Figura 22). 32 Debido al elevado número de variables que pueden influir en las características del polímero final obtenido, la optimización del proceso de síntesis resulta considerablemente complejo, haciendo que estos métodos sean generalmente tediosos y consuman mucho tiempo de tal manera que obtener un MIP con las propiedades de unión óptimas puede llevar días e incluso semanas, sobre todo si las proporciones de los reactivos a emplear, son seleccionadas a partir de ensayos de prueba y error. Para evitar estos inconvenientes, actualmente se han desarrollado tres tipos de aproximaciones para facilitar la optimización de los procesos de síntesis:  Empleo de los denominados mini- MIPs. Esta técnica se fundamenta en el empleo de un dispensador automático de disoluciones, capaz de mezclar un pequeño volumen de cada uno de los reactivos que intervienen en la polimerización en diferentes viales, con una variación sistemática de las mezclas empleadas en la síntesis de los polímeros. Después de la extracción de la plantilla mediante repetidos lavados de los polímeros, se aplica un método de “screening”, ya sea secuencial o en paralelo, con el objeto de evaluar el funcionamiento de los diferentes polímeros obtenidos. Posteriormente se sintetizarán mayores cantidades de aquellos polímeros para los que se haya obtenido un mayor grado de reconocimiento para una evaluación más detallada.  Métodos quimiométricos: permite optimizar un elevado número de variables de forma simultánea, ya que se genera una matriz multidimensional que incluye todas las posibles variables de todos los parámetros que pueden influir en el funcionamiento de la matriz. Posteriormente se seleccionan los pocos experimentos representativos siendo éstos los que se preparan y caracterizan (Mayes y Whitcombe, 2005).  Modelización Molecular: El estudio de la dinámica molecular de la interacción de la plantilla con diferentes polímeros previamente modelizados. Mediante estos métodos se han desarrollado polímeros de alta calidad para moléculas como creatinina (Subrahmanyam y cols., 2001), efedrina (Piletsky y cols., 2001) o microcistina LR (Chianella y cols., 2003) (Figura 23). 33 Figura 23. (A) Creatinina; (B) Efedrina; (C) Microcistina-LR. Moléculas sobre las cuales se ha utilizado métodos de modelización molecular para la selección de las condiciones óptimas de impronta. 5. CONCLUSIONES  Las interacciones no covalentes son las relevantes en el reconocimiento molecular. Aunque los enlaces de hidrogeno son de las interacciones más importantes para la química supramolecular, todas las interacciones no covalentes son importantes porque en una molécula no se suele dar solo un tipo de interacción.  El reconocimiento molecular precisa que la interacción sea selectiva y discrimine un sustrato de otro, para poder realizar una función especifica  Para diseñar nuevos receptores moleculares más selectivos hay que tener en cuenta la complementariedad estérica y química, ya que es imprescindible que exista complementariedad espacial y química entre el receptor y el sustrato.  Debido a la importancia de los factores que intervienen en las propiedades de reconocimiento de los MIPs, su optimización es compleja pero indispensable. Fundamentalmente se optimizan los monómeros funcionales, que se seleccionan en base a las características ácido/base de la plantilla; el agente de entrecruzamiento, que debe ser empleado en cantidad necesaria para un grado de entrecruzamiento mayor del 80%; el disolvente porógeno, que se elige en función de la capacidad para estabilizar el complejo pre-polimerización; y el iniciador, cuya elección es en función a las características del resto de componentes del sistema.  Actualmente las investigaciones están siendo encaminadas a facilitar la optimización de los métodos ya existentes. De forma que se pueda obtener un gran número de polímeros con alto rendimiento y posteriormente ensayar su utilidad. 34 6. BIBLIOGRAFÍA Amabilino D, Stoddart J. Self-assembly and macromolecular design. Pure and Applied Chemistry. 1993; 65 (11): 2351-2359. Amit AG, Mariuzz RA, Phillips SEV, Poliak RJ. Three-dimensional structure of an antigenantibody complex at 2.8 A resolution. 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