Variaciones de la respuesta microglial según el contexto patológico en la Enfermedad de Alzheimer

DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA Y BIOLOGÍA MOLECULAR FACULTAD DE FARMACIA UNIVERSIDAD DE SEVILLA Variaciones de la respuesta Microglial según el contexto patológico en la Enfermedad de Alzheimer Memoria presentada por la Graduada Carmen Romero Molina, para optar al Grado de Doctora por la Universidad de Sevilla Sevilla, 5 de Febrero de 2021 UNIVERSIDAD DE SEVILLA Departamento de Bioquímica y Biología Molecular Facultad de Farmacia C / Profesor García González, 2. 41012 Sevilla (España) Teléfono: 954 55 67 70 Dr. Javier Vitorica Ferrández y Dra. Mª Luisa Vizuete Chacón, ambos Catedráticos de Universidad asociados al Departamento de Bioquímica y Biología Molecular de la Universidad de Sevilla, INFORMAN: Que Dña. Carmen Romero Molina ha realizado, bajo nuestra dirección, el trabajo experimental que ha llevado a la redacción de la presente memoria de Tesis Doctoral, titulada “Variaciones de la respuesta microglial según el contexto patológico en la Enfermedad de Alzheimer”. Considerando que constituye trabajo de tesis doctoral, autorizamos su presentación para optar al grado de Doctor. Para que así conste y surta los efectos oportunos, firmamos el presente informe en Sevilla, a 5 de Febrero de 2021. Fdo. Javier Vitorica Ferrández Fdo. María Luisa Vizuete Chacón UNIVERSIDAD DE SEVILLA Departamento de Bioquímica y Biología Molecular Facultad de Farmacia C / Profesor García González, 2. 41012 Sevilla (España) Teléfono: 954 55 67 70 Dr. José Luis Venero Recio, Catedrático de Universidad y Director del Departamento de Bioquímica y Biología Molecular de la Universidad de Sevilla, INFORMA: Que Dña. Carmen Romero Molina ha realizado el trabajo experimental que ha llevado a la redacción de la presente memoria de Tesis Doctoral bajo la dirección del Dr. Javier Vitorica Ferrández y la Dra. María Luisa Vizuete Chacón. Para que así conste y surta los efectos oportunos, firmo el presente informe en Sevilla, a 5 de Febrero de 2021. Fdo. Dr. José Luis Venero Recio Durante la realización de la presente Tesis Doctoral, Dña. Carmen Romero Molina ha disfrutado de un contrato – beca predoctoral de la Fundación Tatiana Pérez de Guzmán el Bueno y, posteriormente, de un contrato – beca predoctoral de Formación de Profesorado Universitario (FPU) del Ministerio de Educación y Formación Profesional de España. Además, ha realizado una estancia internacional predoctoral en el Imperial College of London, financiada por la Fundación Tatiana Pérez de Guzmán el Bueno, y una estancia internacional predoctoral en el Massachusetts General Hospital – Harvard University, financiada por una Beca de Excelencia IMFAHE – Universidad de Sevilla. Durante la realización de la presente Tesis Doctoral, se han publicado los siguientes artículos científicos en revistas internacionales, una revisión bibliográfica en una revista nacional y dos contribuciones divulgativas: 1. Romero-Molina, C., Navarro V., Sanchez-Varo, R., Jimenez, S., Fernandez-Valenzuela, J.J., Sanchez-Mico, M.V., Muñoz-Castro, C., Gutierrez, A.#, Vitoric,a, J.#, Vizuete M.# (2018). Distinct Microglial Responses in Two Transgenic Murine Models of TAU Pathology. Frontiers in cellular neuroscience, 12, 421. Doi: 10.3389/fncel.2018.00421. 2. March-Diaz, R.*, Lara-Ureña, N.*, Romero-Molina, C.*, Heras-Garvin, A.*, Ortega-de San Luis, C.*, Alvarez-Vergara, M.I., Sanchez-Garcia, M.A., Sanchez-Mejias, E., Davila, J.C., Rosales-Nieves, A.E., Forja, C., Navarro, V., Gomez-Arboledas, A., Sanchez-Mico, M.V., Viehweger, A., Gerpe, A., Hodson, E.J., Vizuete, M., Ratcliffe, P.J., Bishop, T., Serrano-Pozo, A., Lopez-Barneo, J., Berra, E., Gutierrez, A., Vitorica, J.#, Pascual A.#. Hypoxia compromises the mitochondrial metabolism of Alzheimer’s disease microglia via HIF1. Nature Aging (aceptado). 3. Sanchez-Mico, M., Jimenez, S., Gomez-Arboledas, A., Muñoz-Castro, C., Romero-Molina, C., Navarro, V., Sanchez-Mejias, E., Nuñez-Diaz, C., Sanchez-Varo, R., Galea, E., Davila, J., Vizuete, M., Gutierrez, A., Vitorica, J. Amyloid-β impairs the phagocytosis of dystrophic synapses by astrocytes in Alzheimer’s Disease. Glia, 69(4), 997-1011. Doi: 10.1002/glia.23943. Epub 2020 Dec 7. 4. Mirzaei, N., Mota, B. C., Birch, A. M., Davis, N., Romero-Molina, C., Katsouri, L., Palmer, E., Golbano, A., Riggall, L. J., Nagy, I., Tyacke, R., Nutt, D. J., Sastre, M. (2021). Imidazoline ligand BU224 reverses cognitive deficits, reduces microgliosis and enhances synaptic connectivity in a mouse model of Alzheimer's disease. British journal of pharmacology, 178(3), 654–671. Doi: 10.1111/bph.15312. 5. Ries, M., Yanez-Lopez, M., Watts, H., Chau, TW.., Iqbal, S.J., Baxan, N., Romero-Molina, C., Donat, C., Hernandez-Mir, G., d’Amati, A., Gentleman, S., Solito, E., Sastre, M. ANXA1 restores cerebrovascular integrity, increases amyloid degradation and improves memory loss at early stages of Alzheimer’s disease. Brain (aceptado). 6. Muñoz-Castro, C.*, Romero-Molina C.*, Vitorica J. Redirigiendo las estrategias terapéuticas en la Enfermedad de Alzheimer. Revista Española de Ciencias Farmacéuticas. 2020;1(1):18-33. 7. Wasalathanthri, N.D., Zaidi, S.S., Mahrt, E., Srivastava, S., Yu, K.H., Johansson, K., Li, F., Jimenez, M., Lo, C., Allareddy, V., Romero-Molina, C., Mosegaard, S., Heaton, S. M., Park, J. J., Bacon, C. D., Yu, S., Polat, E. O., Wasalathanthri, D., Wang, W., & Agarwal, D. (2019). Challenging transitions. Science (New York, N.Y.), 363(6422), 24–26. Doi: 10.1126/science.aaw2641. Todos los autores contribuyeron igualmente. 8. Segal, L., Agarwal, D., Isaacson, K. J., Oehmke, T. B., Kumar, B., Chen, J. S., Cusimano, J. M., Negi, S., Tiper, I., Bakermans, A. J., Jensen, M. M., Sanganyado, E., Zaidi, S. S., Romero-Molina, C., Martínez, S. E., Anderson, S. M., Santos, G. M., De Lella Ezcurra, A. L., Farragher, J., Sharma, V., … Kerman, B. E. (2018). NextGen Voices: Quality mentoring. Science (New York, N.Y.), 362(6410), 22– 24. Doi: 10.1126/science.aav5914. Todos los autores contribuyeron igualmente. VI F. CONCLUSIONES / CONCLUSIONS 203 G. SUMMARY 207 H. ANEXO: Tablas Suplementarias 217 I. ABREVIATURAS 227 J. BIBLIOGRAFÍA 233 Índice de Figuras y Tablas IX A. INTRODUCCIÓN 1 Figura A.1. Dinámica de los biomarcadores en la patología de Alzheimer .............................................. 2 Figura A.2. Factores de riesgo genéticos de la EA y sus funciones fisiológicas generales ................ 5 Figura A.3. Esquema comparativo de un hemicerebro humano sano y de un paciente de Alzheimer ............................................................................................................................................................................. 6 Figura A.4. Procesamiento de la Proteína Precursora Amiloide (APP) ........................................................ 8 Figura A.5. Agregación del péptido Abeta ........................................................................................................... 10 Figura A.6. Clasificación de las placas amiloides ................................................................................................ 12 Figura A.7. Gen MAPT e isoformas de Tau .......................................................................................................... 14 Figura A.8. Agregación y propagación de Tau .................................................................................................. 16 Figura A.9. Agregados intracelulares de Tau ...................................................................................................... 17 Figura A.10. Funciones fisiológicas microgliales ............................................................................................... 22 Figura A.11. Mecanismo secuencial de activación microglial DAM............................................................ 25 Figura A.12. Activación microglial en modelos de patología de Alzheimer .......................................... 26 Figura A.13. Activación astroglial ............................................................................................................................. 29 Figura A.14. Macrófagos asociados al SNC ........................................................................................................ 31 C. MATERIALES Y MÉTODOS 39 Figura C.1. Representación esquemática del funcionamiento del sistema Cre-LoxP.......................... 44 Figura C.2. Esquema del tratamiento de los animales CX3CSF1R con tamoxifeno agudo y crónico ............................................................................................................................................................................................... 45 Figura C.3. Esquema del funcionamiento de la separación celular FACS ................................................. 52 Figura C.4. Inmunoblot capilar en el dispositivo Jess (Bio-Techne) ............................................................ 61 Figura C.5. Esquema del funcionamiento de una sonda Taqman ............................................................... 64 Figura C.6. Anatomía de la formación hipocampal a distintos niveles rostro-caudales .................... 68 Figura C.7. Detección del agente intercalante de ADN EdU y comparación con el BrdU ................. 74 Figura C.8. Cuantificación ex vivo de microglía proliferativa ........................................................................ 75 Figura C.9. Esquema de los complejos de la cadena de transporte de electrones y los inhibidores aplicados en los ensayos de Seahorse ................................................................................................................... 75 Figura C.10. Parámetros clave de la respiración mitocondrial obtenidos a partir de la OCR .......... 76 Tabla C.1. Datos de las muestras humanas analizadas .................................................................................... 41 X Tabla C.2. Cebadores, cantidad de ADN y programa de PCR utilizados para genotipar las diferentes líneas de animales transgénicos ......................................................................................................... 43 Tabla C.3. Relación de anticuerpos utilizados en Western-Blot ................................................................... 60 Tabla C.4. Relación de los reactivos para la retrotranscripción .................................................................... 62 Tabla C.5. Secuencias de los cebadores para RT-PCR ..................................................................................... 65 Tabla C.6. Sondas Taqman para RT-PCR ............................................................................................................... 66 Tabla C.7. Relación de anticuerpos utilizados para histología .................................................................... 71 D. RESULTADOS 79 1. Dualidad fenotípica microglial: caracterización diferencial de la respuesta microglial en dos modelos murinos de tauopatía .................................................................................................................... 81 Figura D.1. Respuesta microglial en los modelos APP, TAU P301S y ThyTau22 ................................... 82 Figura D.2. Fenotipo microglial en el hipocampo de los ratones WT, ThyTau22 y TAU P301S ...... 83 Figura D.3. La expresión y fosforilación de Tau es mayor en el modelo TAU P301S que en el ThyTau22............................................................................................................................................................................ 85 Figura D.4. La fosforilación de Tau es superior en el modelo TAU P301S que en el ThyTau22 ...... 86 Figura D.5. Las fracciones solubles procedentes de ratones ThyTau22, a diferencia de las fracciones solubles de ratones P301S, son tóxicas en cultivos de células BV2 ..................................... 87 Figura D.6. Mecanismo de toxicidad de las fracciones S1 de ratones ThyTau22.................................. 88 Figura D.7. La agregación de Tau es mayor en el modelo TAU P301S que en el ThyTau22 ............ 90 2. Activación microglial: perfil transcriptómico de la microglía activa en respuesta a patología Abeta y Tau in vivo ............................................................................................................................... 92 Figura D.8. Aislamiento específico de la microglía activa de corteza cerebral e hipocampo de ratón .................................................................................................................................................................................... 93 Figura D.9. Caracterización transcriptómica de la microglía aislada del cerebro de ratones transgénicos modelos de la EA ................................................................................................................................. 94 Figura D.10. La microglía activa aislada de los modelos APP y TAU presenta un fenotipo DAM y una respuesta inflamatoria asociada a neurodegeneración ......................................................................... 96 Figura D.11. Ilustración de la microglía Trem2+ en el hipocampo de ratones APP y TAU ............... 97 Figura D.12. La microglía activa aislada de los modelos APP y TAU presenta un metabolismo oxidativo............................................................................................................................................................................. 99 Figura D.13. Diagrama de los genes incluidos en la ruta KEGG Enfermedad de Alzheimer .......... 100 XI Figura D.14. Las mitocondrias de la microglía asociada a placas de Abeta presentan morfología elongada ......................................................................................................................................................................... 101 Figura D.15. El tratamiento con oligómeros de Abeta aumenta la capacidad máxima respiratoria microglial in vitro ......................................................................................................................................................... 103 Figura D.16. Estudio de la expresión proteica de los complejos de la cadena de transporte de electrones ....................................................................................................................................................................... 104 Figura D.17. El metabolismo oxidativo de la microglía activa podría estar mediado vía mTOR . 106 Figura D.18. TREM2 es indispensable para la activación microglial y fagocitosis de Abeta oligomérico .................................................................................................................................................................... 108 Figura D.19. Diferente perfil génico en la microglía activa en respuesta a las patologías Abeta y Tau ..................................................................................................................................................................................... 110 3. Disfuncionalidad microglial por disminución de la disponibilidad de oxígeno ................. 112 Figura D.20. En el hipocampo de pacientes con EA aumenta la expresión de marcadores de respuesta a hipoxia ..................................................................................................................................................... 113 Figura D.21. Las regiones con baja disponibilidad de oxígeno en el cerebro de paciente con EA presentan placas amiloides desnudas de microglía, con un incremento de las neuritas distróficas ............................................................................................................................................................................................ 114 Figura D.22. La respuesta inflamatoria microglial a Abeta se ve comprometida en hipoxia ........ 115 Figura D.23. La hipoxia crónica disminuye el clustering de microglía asociada a placa ................. 117 Figura D.24. La hipoxia disminuye la activación microglial en el modelo TAU P301S ..................... 119 Figura D.25. La hipoxia disminuye la activación astroglial en el modelo TAU P301S ...................... 120 Figura D.26. Inmunohistoquímica de la activación astrocítica en animales TAU P301S en normoxia e hipoxia ............................................................................................................................................ 121 Figura D.27. La hipoxia disminuye la inflamación y activación del complemento en el modelo TAU P301S ...................................................................................................................................................................... 122 Figura D.28. La hipoxia disminuye la patología Tau en el modelo TAU P301S .................................. 123 Figura D.29. La hipoxia disminuye la patología Tau en el modelo TAU P301S .................................. 124 Figura D.30. La hipoxia per se no induce cambios en la fosforilación ni en los niveles totales de Tau en la línea neuronal SH-Tau ........................................................................................................................... 125 Figura D.31. Estudio de la patología sináptica en animales TAU P301S sometidos a hipoxia ..... 126 4. Disfuncionalidad microglial por ablación genética de CSF1R ...................................................... 127 Figura D.32. La depleción microglial producida tras 7 días de inyecciones con tamoxifeno en ratones CX3CSF1R de 2 meses está seguida de una rápida repoblación ............................................. 129 XII Figura D.33. El tratamiento agudo con tamoxifeno en ratones CX3CSF1R de 2 meses produce elevados niveles de depleción microglial .......................................................................................................... 130 Figura D.34. Depleción y repoblación microglial en animales CS3CSF1R de 2 meses. ................... 131 Figura D.35. Población microglial (Iba1+) en cortes secuenciales de un animal CX3CSF1R ......... 132 Figura D.36. El inicio de la repoblación se caracteriza por activación microglial en animales de 2 meses ............................................................................................................................................................................... 134 Figura D.37. Estudio de marcadores de infiltración de células inmunes tras el tratamiento agudo de depleción en animales de 2 meses ................................................................................................................ 136 Figura D.38. Estudio de la reactividad astrocítica tras el tratamiento de depleción aguda en animales de 2 meses .................................................................................................................................................. 137 Figura D.39. La depleción aguda microglial es menos eficaz en animales de 12 meses y es seguida por una rápida repoblación. .................................................................................................................. 140 Figura D.40. Estudio de la reactividad astrocítica tras el tratamiento de depleción aguda en animales de 12 meses................................................................................................................................................ 141 Figura D.41. Un 2º ciclo de depleción aguda no logra una depleción completa y conlleva una super-repoblación microglial 14 días post-tratamiento en animales de 2 meses ............................ 142 Figura D.42. Estudio de la depleción microglial en animales jóvenes tras tratamientos crónicos ............................................................................................................................................................................................ 143 Figura D.43. Imágenes ilustrativas del hipocampo de ratones WT y CX3CSF1R tratados durante 1 o 2 meses con tamoxifeno oral.............................................................................................................................. 145 Figura D.44. Estudio del fenotipo microglial e infiltración de células periféricas en animales jóvenes tras tratamientos crónicos con tamoxifeno oral ............................................................................ 147 Figura D.45. Estudio del fenotipo astroglial en animales jóvenes tras tratamientos crónicos con tamoxifeno oral ........................................................................................................................................................... 148 Figura D.46. Estudio de la depleción y fenotipo microglial en animales envejecidos tras 4 meses de tratamiento con tamoxifeno oral. ................................................................................................................... 149 Figura D.47. Estudio de la infiltración de células inmunes periféricas y de activación astroglial en animales envejecidos tras 4 meses de tratamiento ....................................................................................... 150 Figura D.48. La depleción microglial crónica no induce cambios neuronales ni sinápticos en animales envejecidos tras 4 meses de tratamiento con tamoxifeno oral ............................................. 150 Figura D.49. La alimentación con tamoxifeno desde los 4 a los 8 meses en animales APPCX3 produce disminución de la población microglial, incremento en su activación y no induce la infiltración de células periféricas inmunes Cd163+, Ccr2+, Cd3+, pero sí Ly6c+ ............................. 152 Figura D.50. La alimentación con tamoxifeno desde los 4 a los 8 meses en animales APPCX3 no modifica la reactividad astrocítica ........................................................................................................................ 153 Figura D.51. Estudio del efecto de la depleción parcial microglial en animales APPCX3 sobre el contenido amiloide ..................................................................................................................................................... 154 XIII Figura D.52. La alimentación con tamoxifeno desde los 4 a los 8 meses en animales APPCX3 no induce cambios significativos en la fosforilación de Tau ............................................................................ 155 Figura D.53. La alimentación con tamoxifeno desde los 4 a los 8 meses en animales APPCX3 no induce cambios neuronales ni sinápticos .......................................................................................................... 156 Figura D.54. La alimentación con tamoxifeno desde los 8 hasta los 12 meses en animales APPCX3 reduce los niveles de microglía y la activación microglial, y no conlleva infiltración de células inmunes periféricas ...................................................................................................................................... 158 Figura D.55. Imágenes ilustrativas de la microglía hipocampal en ratones APP, y APPCX3 alimentados de los 8 a los 12 meses con tamoxifeno oral ......................................................................... 159 Figura D.56. La alimentación con tamoxifeno desde los 8 hasta los 12 meses en animales APPCX3 reduce la reactividad astrocítica .......................................................................................................... 156 Figura D.57. La alimentación con tamoxifeno desde los 8 hasta los 12 meses en animales APPCX3 no altera los niveles de Abeta ni de fosfo-Tau .............................................................................. 156 E. DISCUSIÓN 163 Figura E.1. La activación microglial crónica requiere un metabolismo oxidativo .............................. 184 H. ANEXO: Tablas Suplementarias 217 Tabla Suplementaria 1. Los 20 GeneSet de la categoría “Biological Processes” que más incrementan su expresión en la microglía activa aislada de ratones APP de 12 meses versus WT de 12 meses ................................................................................................................................................................... 219 Tabla Suplementaria 2. Los 20 GeneSet de la categoría “Rutas Kegg” que más incrementan su expresión en la microglía activa aislada de ratones APP de 12 meses versus WT de 12 meses . 220 Tabla Suplementaria 3. Los 100 genes que más se expresan diferencialmente en la microglía activa aislada de ratones APP 12 meses versus WT de 12 meses ............................................................ 221 Tabla Suplementaria 4. Los 100 genes que más se sobre-expresan en la microglía activa aislada de ratones APP 12 meses versus TAU P301S de 9 meses ........................................................................... 222 Tabla suplementaria 5. Los 20 GeneSet de la categoría “Biological Processes” que más incrementan su expresión en la microglía activa aislada de ratones TAU P301S de 9 meses versus WT de 12 meses ........................................................................................................................................................... 223 Tabla suplementaria 6. Los 20 GeneSet de la categoría “Rutas Kegg” que más incrementan su expresión en la microglía activa aislada de ratones TAU P301S de 9 meses versus WT de 12 meses ............................................................................................................................................................................... 224 Tabla suplementaria 7. Los 100 genes que más se expresan diferencialmente en la microglía activa aislada de ratones TAU P301S de 9 meses versus WT de 12 meses .......................................... 225 Tabla suplementaria 8. Genes, con un p-valor ajustado <0.05, que se sobre-expresan en la microglía activa aislada de ratones TAU P301S de 9 meses versus APP de 12 meses ....................... 22 A. Introducción 6 Introducción A 1.2. Rasgos neuropatológicos A nivel macroscópico, los enfermos de Alzheimer presentan una importante atrofia cortical, adelgazamiento de las circunvoluciones y ensanchamiento de los surcos, engrosamiento de las meninges, agrandamiento de las cavidades ventriculares, disminución del bulbo olfatorio y pérdida de peso y volumen cerebral (Figura A.3). Las técnicas de neuroimagen de alta resolución permiten visualizar la atrofia cerebral y sirven de ayuda para el diagnóstico y evolución de la enfermedad (Eskildsen et al., 2015). Figura A.3. Esquema comparativo de un hemicerebro humano sano (izq) y de un paciente de Alzheimer (dcha). El cerebro afectado por la EA presenta menor volumen y ventrículos más dilatados. Esta atrofia afecta principalmente a los lóbulos temporales, frontales, parietales y occipitales. Las regiones más afectadas son las implicadas en las funciones de memoria (hipocampo) y lenguaje (áreas de Broca y de Wernicke). Imagen tomada de “The Brain from the Top” (https://thebrain.mcgill.ca/index.php). Las principales alteraciones microscópicas características de la EA son los agregados proteicos extracelulares en forma de placas de péptido beta-amiloide, los ovillos neurofibrilares intraneuronales de la proteína Tau hiperfosforilada, la disminución de la densidad sináptica, la degeneración neuronal en las áreas cerebrales afectadas y un proceso neuroinflamatorio mediado por células gliales. 7 Introducción A 2. ABETA Y PATOLOGÍA AMILOIDE Las placas seniles son agregados proteicos localizados en el parénquima cerebral cuyo componente principal es el péptido Abeta, que contiene entre 39 y 43 aminoácidos y deriva del procesamiento proteolítico de la proteína precursora del péptido beta-amiloide (APP) (Figura A.4). En individuos sanos, este péptido circula a baja concentración en plasma y líquido cefalorraquídeo. De hecho, se han descrito depósitos de Abeta insoluble en el parénquima cerebral y en la pared de los vasos sanguíneos cerebrales de personas sanas con edad avanzada (Selkoe, 2004). Numerosas investigaciones intentan aclarar el papel fisiológico de Abeta. Algunos resultados sugieren que podría actuar regulando la liberación de vesículas desde terminales presinápticas excitatorias (Abramov et al., 2009), y como modulador postsináptico negativo (Palop y Mucke, 2010). En condiciones fisiológicas, más del 90% de las especies de Abeta están en forma de Abeta40 (soluble), con 40 aminoácidos y Val40 en su extremo C-terminal, y menos del 10% como Abeta42, con los aminoácidos adicionales Ile41 y Ala42, que le confieren mayor hidrofobicidad y capacidad de agregación (Zhang et al., 2011). El acúmulo de Abeta (especialmente de Abeta42) parece ser limitante en la formación de las placas, aunque su mecanismo de formación no está completamente caracterizado. 2.1. Síntesis de Abeta 2.1.1. Proteína Precursora Amiloide y su procesamiento APP es una glicoproteína integral de membrana de tipo I muy conservada evolutivamente. Está formada por un largo ectodominio globular (N-terminal) en el espacio extracelular, un único segmento transmembrana y un pequeño dominio citosólico (C-terminal). Su gen se localiza en el cromosoma 21 y está constituido por 18 exones que dan lugar a 10 isoformas, siendo las más frecuentes APP695, APP751 y APP770 (Nguyen, 2015). La isoforma APP695 se expresa predominantemente en neuronas (Haass et al., 1991) y, por tanto, es la mayoritaria en el SNC. Se han descrito 60 mutaciones en el gen APP relacionadas con las formas familiares de la EA (www.alzforum.org/mutations), que, en general, suponen una ganancia de función tóxica al aumentar los niveles de Abeta42, disminuir los de Abeta40, o incrementar la patogenicidad de Abeta y su capacidad de agregación (Castro et al., 2019). Sin embargo, la mutación A673T en APP reduce la producción de Abeta y su agregación, proporcionando protección contra el declive cognitivo asociado a la edad (Karran y De Strooper, 2016). La proteína APP sufre diversas escisiones proteolíticas tanto a través de las vías canónicas, explicadas a continuación (rutas amiloidogénica y no amiloidogénica; Figura A.4), como de las no canónicas (Andrew et al., 2016), en las que están implicadas diversas enzimas como las caspasas, meprina, δ-secretasa y η-secretasa. 8 Introducción A Ruta no amiloidogénica. Es la ruta principal en la mayoría de las células y no genera péptido Abeta. En primer lugar, actúa la α-secretasa, enzima perteneciente a la familia ADAM (del inglés, A desintegrin and metalloprotease ), que escinde la proteína APP dentro del fragmento de Abeta (aminoácidos 16-17) y libera un fragmento soluble denominado sAPPα, al que se le atribuyen propiedades neurotróficas y neuroprotectoras (De Strooper, 2010). Además, se genera un fragmento C-terminal (APP-CTF) de 83 aminoácidos (C83), que permanece anclado a la membrana. C83 es sustrato del complejo ϒ-secretasa, que lo escinde originando los péptidos P3, que se liberan al espacio extracelular o vesicular, y un dominio AICD citosólico (p7), al que se le han atribuido propiedades neurotóxicas, funciones en la homeostasis del calcio y en la regulación de la transcripción génica (De Strooper, 2010; Wilkins y Swerdlow, 2017). Figura A.4. Procesamiento de la Proteína Precursora Amiloide (APP) . Mediante la vía no amiloidogénica, el APP se procesa por la acción secuencial de la α- y γ-secretasa, generando sAPPα, p3 y AICD. Por otro lado, en el procesamiento mediante la vía amiloidogénica intervienen la β- y γ-secretasa, dando lugar a los fragmentos N-APP, AICD y Aβ40-42. Imagen modificada de O’Brien et al., 2011. Ruta amiloidogénica . Es minoritaria en la mayoría de las células, excepto en neuronas, y se activa de forma fisiológica durante el envejecimiento normal, aunque se potencia en la EA. En primer lugar, la proteína APP se escinde por acción de la β-secretasa, atribuida a la enzima BACE-1 (del inglés, beta-site APP cleaving enzime 1), y origina APP soluble (sAPPβ), que se libera al espacio extracelular; y un fragmento C-terminal (APP-CTF) de 99 aminoácidos (C99). C99 permanece anclado a la membrana y es procesado por el complejo ϒ-secretasa, generando el péptido Abeta (39-43 aminoácidos), que se libera al medio extracelular, y AICD (Selkoe, 2008; Wilkins y Swerdlow, 2017). El procesamiento proteolítico del sAPPβ origina N-APP, que parece estar implicado en procesos de degeneración axonal y neuronal (De Strooper, 2010; Jeong, 2017). Figura Intro.3. Esquema comparativo de un hemicerebro humano sano (izq) y de un paciente de Alzheimer (dcha). El cerebro afectado por la EA presenta menor volumen y ventrículos más dilatados. Esta atrofia afecta principalmente a los lóbulos temporales, frontales, parietales y occipitales. Las regiones más afectas se corresponden con donde residen las funciones de memoria (hipocampo) y lenguaje (áreas de Broca y de Wernicke). Modificado de https://gamebasedassessofdememtia. Regulación transcripcional N-APP Degeneración axonal y neuronal Mutaciones PS1 y PS2 Figura 1.4. Procesamiento de la Proteína Precursora Amiloide (APP).Mediante la vía no amiloidogénica, el APP se procesa por la acción secuencial de la α- y γ-secretasa, generando sAPPα, p3 y AICD. Por otro lado, en el procesamiento mediante la vía amiloidogénica intervienen la β- y γ-secretasa, dando lugar a los fragmentos N-APP, AICD y Aβ40-42. Imagen modificada de O’Brien y col, 2011. Vía no-amiloidogénica Vía amiloidogénica Neurotrófico 9 Introducción A Se ha propuesto que los oligómeros solubles de Abeta podrían ser los responsables iniciales de los procesos neurodegenerativos en la EA, potenciando la actividad neurotóxica de N-APP y AICD, y/o antagonizando las funciones protectoras de sAPPα, sAPPβ (Jeong, 2017). Aunque BACE-1 y ϒ-secretasa se han considerado posibles dianas terapéuticas en la EA, los ensayos clínicos realizados con inhibidores de estas enzimas no han llegado a término (De Strooper, 2010; Hunt y Turner, 2009; Mangialasche et al., 2010). Actualmente, se está usando un inhibidor de BACE-1 en fase 3 de estudio (“Elenbecestat”), y sus resultados parecen eficaces cuando se aplica en los estadios iniciales de la patología (Muñoz-Castro et al., 2020). 2.1.2. Complejo ϒ -secretasa La γ-secretasa es un complejo aspartil-proteasa constituido por un núcleo catalítico formado por PS1 o PS2 y tres proteínas accesorias: nicastrina, APH-1 ( pharynx-defective-1 ) y PEN2 ( presenilin enhancer 2), necesarias para la maduración, estabilidad y actividad de la enzima (Andreeva et al., 2017; De Strooper, 2003; De Strooper et al., 2012). Las presenilinas se expresan predominantemente en neuronas, aunque también pueden hacerlo en astrocitos reactivos (Elder et al., 2010). PS1 y PS2 comparten más de un 65% de homología, siendo PS1 la que se expresa mayoritariamente. Sus principales sustratos son Notch y APP y además participa en el control de la apoptosis, la homeostasis del calcio, el crecimiento neurítico, la plasticidad sináptica, las rutas autofagocíticas/lisosomales, el tráfico de proteínas y la señalización mediada por β‐catenina (Oikawa y Walter, 2019). A día de hoy, se han identificado 300 mutaciones en el gen de PS1 y 56 en el de PS2 que producen EOAD (www.alzforum.org/mutations). Todas implican una ganancia de función del complejo ϒ -secretasa, y producen un aumento de Abeta42 y una disminución de Abeta40. 2.2. Degradación/eliminación de Abeta La acumulación patológica de Abeta se origina por un desequilibrio entre su producción y su degradación. Aunque en los pacientes de Alzheimer Familiar existe un aumento en la producción de Abeta, en el Alzheimer esporádico, la acumulación de Abeta parece deberse a una disminución en su degradación y/o aclaramiento (Evin y Weidemann, 2002; Hane et al., 2017). Las enzimas más relevantes que participan en la eliminación de Abeta (Ries y Sastre, 2016) son: (i) metaloendopeptidasas, principalmente NEP (neprelisina) e IDE (enzima degradadora de insulina) implicadas en la degradación de Abeta monomérico. Durante el envejecimiento, se produce una disminución de los niveles de NEP (Farris et al., 2007), que podría ser responsable del aumento de Abeta con la edad. (ii) Metaloproteinasas de la matriz (MMPs), expresadas y secretadas principalmente por astrocitos, participan en la degradación de formas monoméricas y fibrilares de Abeta. (iii) Peptidasas lisosomales, como la catepsina B, que 10 Introducción A transforman agregados de Abeta en especies más pequeñas y con mayor afinidad por IDE y NEP (De Strooper, 2010; Mueller-Steiner et al., 2006). Por otro lado, las células gliales, principalmente los astrocitos, liberan chaperonas extracelulares que facilitan el aclaramiento de Abeta a través de la BHE, como ApoE, ApoJ o Clu, α1-antiquimiotripsina y α2- macroglobulina (α2-M)) (Ries y Sastre, 2016). Además, la glía participa de manera activa en la internalización de Abeta mediante mecanismos de pinocitosis, fagocitosis y/o endocitosis mediada por receptores, entre los que destacan los scavenger receptors (SR), toll-like receptors (TLR), RAGE, receptores Fc, Trem2, LGI3, y receptores de lipoproteínas (Cai et al., 2017; Lee y Landreth, 2010; Ries y Sastre, 2016). 2.3. Agregación del péptido Abeta: oligomerización y formación de placas El péptido Abeta es una proteína de 4 kDa, constituida por 39‐43 aminoácidos. La isoforma de 42 aminoácidos (Abeta42) presenta una mayor hidrofobicidad y, por tanto, mayor capacidad de agregación (Hiltunen et al., 2009; Zhang et al., 2011), siendo el componente mayoritario de las placas amiloides. Los mecanismos de agregación de Abeta y el proceso de formación de las placas extracelulares no están claramente definidos, aunque se han propuesto modelos que describen cómo los monómeros de Abeta tienden a agregarse generando formas intermedias oligoméricas solubles, de entre 8 KDa (dímeros) y 100 KDa, que posteriormente dan lugar a las fibras y las placas amiloides (Figura A.5) (Cline et al., 2018; Sakono y Zako, 2010; Takahashi et al., 2017). Figura A.5. Agregación del péptido Abeta. Los monómeros de Abeta pueden autoensamblarse formando dímeros y trímeros (agregados tempranos), protofibrillas y fibras (insolubles) que formarán, finalmente, las placas amiloides. Imagen tomada de Graham et al. 2017. Los oligómeros solubles intermediarios y las protofibras parecen ser las formas más tóxicas del péptido Abeta (Choi y Gandhi, 2018; Ricciarelli y Fedele, 2017; ViolayKlein, 2015). Los oligómeros presentan una estructura micelar y pueden ensamblarse para generar estructuras de mayor peso molecular (Iadanza et al., 2018): (i) ligandos difusibles derivados de Abeta, que correlacionan con los déficits cognitivos (Lambert et al., 1998); (ii) estructuras anulares, sólo distinguibles mediante microscopía electrónica de Figura 1.5. Agregación del péptido Abeta. Los monómeros de Abeta pueden autoensamblarse formando dímeros y trímeros (agregados tempranos), protofibrillas y fibras (insolubles) que formarán, finalmente, las placas amiloides. Imagen tomada de Graham y col. 2017. Monómeros Agregados tempranos Protofibrillas Fibras Placa Placa 10 aa Figura 1.6. Gen MAPT e isoformas de Tau.El gen MAPT presenta 16 exones. N1 y N2 están codificados por los exones E2 (verde) y E3 (morado), respectivamente. La repetición R2 está codificada por el exón E10 (rojo). Los exones E1, E4, E5, E7, E9, E11, E12 y E13 constituyen el componente básico de la proteína tau (azul). E0 y E14 son no codificantes (blanco). E4a (amarillo) se transcribe sólo en tejido periférico y E6 y E8 no se expresan en el cerebro humano (rosa). La isoforma de tau está compuesta por 4 regiones: región N-terminal, dominio rico en prolina, dominio de unión a microtúbulos y región C-terminal. Mediante procesamiento alternativo de los exones E2, E3 y E10,se generan 6 isoformas principales de Tau expresadas en el cerebro humano. Imagen tomada de Gao y col. 2018. 11 Introducción A alta resolución (Lambert et al., 1998); (iii) protofibrillas (Ono y Tsuji, 2020; Walsh et al., 1997) y (iv) paranúcleos, Abeta*56 (Lesné et al., 2006), amiloesferoides (Noguchi et al., 2009), globulómeros, oligómeros prefibrilares, oligómeros fibrilares, etc (Chang y Chen, 2014; Choi y Gandhi, 2018; Lesné et al., 2013). Entre los distintos mecanismos deletéreos que ejercen, los oligómeros parecen inhibir la LTP (del inglés, long-term potentiation ) en el hipocampo (Haass y Selkoe, 2007). Además, perturban la membrana celular, lo que altera las vías de señalización, la homeostasis del calcio, la formación de canales iónicos, aumenta la permeabilidad, e induce estrés oxidativo, cascadas inflamatorias, disfunciones mitocondriales y modificación de la estructura del ADN (Hane et al., 2017; Reiss et al., 2018; Ricciarelli y Fedele, 2017; Viola y Klein, 2015). Las placas amiloides o seniles son agregados proteicos insolubles que se depositan extracelularmente, tanto en el parénquima cerebral como en la pared de los vasos sanguíneos cerebrales (Greenberg et al., 2020; Thal et al., 2008). Su componente principal son los péptidos de Abeta insoluble (Glenner y Wong, 1984; Masters et al., 1985), aunque también pueden contener proteoglicanos, moléculas inflamatorias, proteasas, iones metálicos, ApoE, proteínas antioxidantes, colinesterasas y restos de neuronas y células gliales (Atwood et al., 2002). Las placas seniles se clasifican en dos grupos según su morfología, composición, y presencia o ausencia de distrofias neuríticas asociadas (Figura A.6) (D’ Andrea y Nagele, 2010; Serrano-Pozo et al., 2011; Thal et al., 2008): a) Placas neuríticas: son depósitos extracelulares de Abeta de aspecto filamentoso, que reciben su nombre por aparecer íntimamente asociadas a neuritas distróficas (inmunopositivas para Tau, APP, Ubiquitina o ChAT), y a células microgliales reactivas, mientras que la astroglía se localiza en la periferia (Bouvier et al., 2016; Dickson, 1997). Se subdividen en dos tipos, atendiendo a su morfología: (i) placas clásicas, normalmente asociadas a vasos y caracterizadas por un núcleo amiloide redondo y compacto, formado por Abeta fibrilar y células microgliales, rodeado por un halo difuso que contiene distintas especies solubles de Abeta; y (ii) placas primitivas, con forma esférica, sin núcleo compacto y que suelen aparecer en zonas cercanas a los axones y a las sinapsis. b) Placas difusas o “pre-amiloides”: son depósitos extracelulares no fibrilares de Abeta. Poseen una estructura amorfa, con límites poco definidos y sin núcleo compacto. Apenas poseen células microgliales, astrocitos o neuritas y su composición principal es Abeta42 (Perl, 2010). Pueden estar presentes en personas sanas sin síntomas de demencia. 12 Introducción A Figura A.6. Clasificación de las placas amiloides. Las placas neuríticas pueden ser de tipo fibrilar (placas primitivas) (A1 y A2), o clásicas (B1 y B2), con núcleo denso compuesto principalmente por Abeta42 y un halo. Las placas difusas (C) presentan una morfología indefinida. Inmunohistoquímica (A1, B1, C1) doble para Abeta (azul) y fosfo-Tau (marrón); (A2, B2, C2) simple para Abeta42. Imágenes cedidas por el grupo de la Dra. Antonia Gutiérrez. En contra de la hipótesis de la cascada amiloide (Hardy y Allsop, 1991; Hardy y Higgins, 1992), actualmente hay evidencias de que estas placas podrían no ser el principal agente causal de la neurodegeneración y la respuesta inflamatoria en la patología (Cline et al., 2018; Karran y De Strooper, 2016; Makin, 2018; Ricciarelli y Fedele, 2017). Sin embargo, la deposición de amiloide sí correlaciona con el riesgo de una progresión del deterioro cognitivo leve hacia la EA (Hane et al., 2017), lo que parece indicar que diferentes estructuras moleculares de Abeta presentes en el parénquima cerebral deben contribuir a la neuroinflamación y a la pérdida neuronal típicas de la enfermedad (Benilova et al., 2012; Viola y Klein, 2015). 2.4. Abeta intracelular El péptido Abeta también se acumula en el citosol y en diferentes compartimentos subcelulares (mitocondria, lisosomas y retículo endoplásmico) de la neurona (Gouras et al., 2015; Sun et al., 2015), pudiendo causar disfuncionalidad en los mismos (Kuruva y Reddy, 2017). El Abeta intraneuronal puede originarse por fallos en la liberación tras su síntesis (Takahashi et al., 2017), o en su reinternalización a través de receptores extracelulares específicos, como la subunidad α7 del receptor nicotínico (Ma y Qian, 2019; Wang et al., 2000), el receptor LDL (Zerbinatti et al., 2006) o los receptores NMDA (Bi et al., 2002). La acumulación de Abeta intracelular se atribuye a los primeros estadios de la EA (Bayer y Wirths, 2010), ya que se produce en las células piramidales del hipocampo y de la corteza entorrinal de pacientes con defectos cognitivos leves, y sus niveles descienden con la formación de las placas (LaFerla et al., 2007). Placas neuríticas Placas difusas 13 Introducción A El Abeta intraneuronal podría alterar la función mitocondrial y del proteasoma, provocar una disfunción sináptica, potenciar la hiperfosforilación de Tau (LaFerla et al., 2007), originar déficits en la LTP (Billings et al., 2005) e incluso la muerte neuronal (Bayer y Wirths, 2010). 3. PROTEÍNA TAU Y PATOLOGÍA NEUROFIBRILAR 3.1. Estructura y Función de Tau Tau es una proteína soluble perteneciente a la familia de las proteínas asociadas a microtúbulos (MAPs; del inglés, microtubule associated proteins ), que se expresa predominantemente en neuronas. Está codificada por el gen MAPT, que contiene 16 exones y está localizado en el cromosoma 17 (Neve et al., 1986). Mediante splicing alternativo, se pueden generar 6 isoformas con tamaños entre 352-441 aminoácidos (Kosik, 1990; Wang y Mandelkow, 2016) (Figura A.7). Cada isoforma se caracteriza por la presencia o ausencia de fragmentos (N) de 29 ó 58 aminoácidos en el extremo N-terminal, y de una secuencia de 31-32 aminoácidos que se repite 3 ó 4 veces en el extremo C-terminal (R) y que constituye el “dominio de unión a microtúbulos”. Por tanto, las isoformas de Tau pueden ser: 0N3R, 0N4R, 1N3R, 1N4R, 2N3R o 2N4R. En el cerebro humano sano hay cantidades similares de Tau 3R y 4R, pero no ocurre lo mismo en enfermedades neurodegenerativas (Gao et al., 2018). En el desarrollo fetal, Tau se distribuye por todo el citoplasma neuronal, pero a medida que maduran las neuronas, se elimina del soma y se sitúa exclusivamente en el axón. Tau estabiliza y regula la estructura y la dinámica de los microtúbulos neuronales y favorece su polimerización. Además, interviene en procesos de señalización y de organización del citoesqueleto, lo que depende de su estado de fosforilación (Avila et al., 2004). Recientemente, se ha implicado a Tau en el mantenimiento de la integridad del ADN frente a estrés oxidativo, en la regulación de la actividad neuronal, la neurogénesis, la exportación de hierro, la regulación de la insulina cerebral y la depresión a largo plazo (Gao et al., 2018; Mroczko et al., 2019). 14 Introducción A Figura A.7. Gen MAPT e isoformas de Tau. El gen MAPT presenta 16 exones. N1 y N2 están codificados por los exones E2 (verde) y E3 (morado), respectivamente. La repetición R2 está codificada por el exón E10 (rojo). Los exones E1, E4, E5, E7, E9, E11, E12 y E13 constituyen el componente básico de la proteína Tau (azul). E0 y E14 son no codificantes (blanco). E4a (amarillo) se transcribe sólo en tejido periférico y E6 y E8 no se expresan en el cerebro humano (rosa). La isoforma de Tau está compuesta por 4 regiones: región N-terminal, dominio rico en prolina, dominio de unión a microtúbulos y región C-terminal. Mediante procesamiento alternativo de los exones E2, E3 y E10, se generan 6 isoformas principales de Tau expresadas en el cerebro humano. Imagen tomada de Gao et al., 2018. 3.2. Fosforilación de Tau Tau presenta 80 residuos de serina o treonina y 5 de tirosina susceptibles de ser fosforilados, la mayoría localizados alrededor del dominio de unión a microtúbulos. En condiciones fisiológicas, existe un equilibrio entre fosforilaciones y desfosforilaciones necesario para sus funciones fisiológicas. Sin embargo, su hiperfosforilación anómala produce modificaciones estructurales que dificultan su unión a microtúbulos. Se ha demostrado que la fosforilación en Ser208 promueve la agregación de Tau y las fosforilaciones en Ser202 y Thr205 conllevan su deslocalización hacia el soma y las dendritas (Xia et al., 2020). Como consecuencia, se producen agregados intracelulares que interrumpen el transporte axonal y provocan disfunción neuronal (Guo et al., 2017). En el estado de fosforilación de Tau están implicadas más de 20 quinasas (Gao et al., 2018; Oliveira et al., 2017), entre las que destacan GSK-3β ( glycogen synthase kinase 3 ) y Cdk5 (c yclin dependent kinase 5 ), y varias fosfatasas, principalmente PP2A y PP1 (Liu y Götz, 2013; Ma et al., 2017). Además, niveles altos de Abeta y/o el estrés oxidativo, pueden provocar una desregulación en la actividad de las quinasas Figura 1.5. Agregación del péptido Abeta. Los monómeros de Abeta pueden autoensamblarse formando dímeros y trímeros (agregados tempranos), protofibrillas y fibras (insolubles) que formarán, finalmente, las placas amiloides. Imagen tomada de Graham y col. 2017. Monómeros Agregados tempranos Protofibrillas Fibras Placa Placa 10 aa Figura 1.6. Gen MAPT e isoformas de Tau.El gen MAPT presenta 16 exones. N1 y N2 están codificados por los exones E2 (verde) y E3 (morado), respectivamente. La repetición R2 está codificada por el exón E10 (rojo). Los exones E1, E4, E5, E7, E9, E11, E12 y E13 constituyen el componente básico de la proteína tau (azul). E0 y E14 son no codificantes (blanco). E4a (amarillo) se transcribe sólo en tejido periférico y E6 y E8 no se expresan en el cerebro humano (rosa). La isoforma de tau está compuesta por 4 regiones: región N-terminal, dominio rico en prolina, dominio de unión a microtúbulos y región C-terminal. Mediante procesamiento alternativo de los exones E2, E3 y E10,se generan 6 isoformas principales de Tau expresadas en el cerebro humano. Imagen tomada de Gao y col. 2018. 15 Introducción A de Tau (Moore et al., 2015). Tau puede sufrir además otras modificaciones postraduccionales que afectan a su estado de agregación, como glicosilación, acetilación o ubiquitinación. La quinasa GSK-3β está constitutivamente activa en el SNC, aunque su actividad está regulada a su vez por fosforilaciones y desfosforilaciones en diferentes sitios (Lauretti et al., 2020). Además, sus niveles de expresión aumentan con la edad (Lee et al., 2006). GSK-3β también está implicada en la formación y acumulación de Abeta ya que APP y PS1 pueden ser sus sustratos (Cai et al., 2012), y además puede regular la actividad catalítica de BACE-1 (Ly et al., 2013). Es más, algunos estudios proponen un mecanismo de retroalimentación entre GSK-3β y Abeta que aumentaría la hiperfosforilación de Tau (Lauretti et al., 2020). Por otro lado, la quinasa CDK5 está formada por dos subunidades: la unidad catalítica Cdk-5 y el polipéptido p25, que actúa como unidad reguladora. La sobreexpresión de p25 aumenta la fosforilación de Tau y la transcripción de BACE-1 mediada por CDK5, dando lugar a un procesamiento aberrante de Abeta (Cortés et al., 2019; Gupta y Singh, 2019). Aunque actualmente no existen fármacos en ensayos clínicos en fase III dirigidos hacia la patología Tau, 17 fármacos se encuentran en fase I, II o II/III. Dada la implicación de la GSK3β, se han desarrollado diferentes inhibidores contra esta diana, siendo el más estudiado el cloruro de litio (Hampel et al., 2019; Torres et al., 2012). Por otro lado, el inhibidor de GSK3β ANAVEX 2-73 ha mejorado la realización de tareas cotidianas en pacientes con deterioro cognitivo leve (Parmentier et al., 2019). Además, otras moléculas que disminuyen la agregación de Tau, como LUCIDITY o Nilotinib, están siendo evaluadas en ensayos en fase II (Medina, 2018). Por otra parte, al igual que en la terapia dirigida contra Abeta, existen proyectos de inmunización activa o pasiva contra Tau (Gauthier et al., 2020). 3.3. Tau soluble hiperfosforilado Aunque la cuantificación e interpretación del perfil de fosforilación de Tau es complicada (Kimura et al., 2018), diversos estudios asocian su patrón de fosforilación con la progresión de la patología de Alzheimer (Barthélemy et al., 2020; He et al., 2018; Zempel et al., 2010). En el LCR de pacientes con LOAD, se acumula Tau fosforilado en Thr217 aproximadamente 21 años antes del inicio de la sintomatología y, posteriormente, se detecta Tau fosforilado en Thr181, seguido de Thr205 (13 años antes del inicio de la patología) (Barthélemy et al., 2020). Estos indicios apuntan a que la trayectoria de fosforilación de Tau podría usarse como biomarcador precoz de la enfermedad (Barthélemy et al., 2020; Quiroz et al., 2018). Tau hiperfosforilado se disocia de los microtúbulos, lo que altera el transporte de organelas, principalmente de mitocondrias hacia la sinapsis, desregula la homeostasis del calcio (Calvo-Rodriguez et al., 2020) y produce la activación de caspasas. Como consecuencia, se produce una pérdida de espinas 22 Introducción A a la vez que, de manera paracrina y autocrina, retroalimentan la activación microglial (Cherry et al., 2014; Gomez-Nicola y Perry, 2015). Además, se produce el ensamblaje de los inflamasomas, que activa a la caspasa 1 y el procesamiento de ILs (Rathinam y Fitzgerald, 2016). Concretamente, en la microglía juega un papel fundamental el inflamasoma NLRP3, activado por proteínas mal plegadas, agregados de Abeta, proteínas priónicas y componentes del sistema del complemento (Heneka et al., 2018). Figura A.10. Funciones fisiológicas microgliales. La microglía lleva a cabo diferentes funciones para mantener la homeostasis del SNC: presenta capacidad fagocítica, mejora la plasticidad sináptica y participa en el mantenimiento de los progenitores de oligodendrocitos y en la mielinogénesis, en la vigilancia inmune del entorno, en la poda sináptica, y en la neoformación de vasos. Imagen tomada de Han et al., 2019. Clásicamente, la microglía activa se ha clasificado en dos fenotipos funcionales extremos, atendiendo a la señal de activación y a la respuesta desencadenada: fenotipo clásico (M1), que generan una respuesta pro-inflamatoria y citotóxica, y fenotipo alternativo (M2), responsable de una respuesta prosupervivencia, regeneradora y antiinflamatoria. Esta clasificación de la microglía está siendo actualmente cuestionada (Masgrau et al., 2017; Ransohoff, 2016), ya que las células microgliales raramente muestran una polarización completa hacia un fenotipo y coexisten varios tipos en la patología (Colonna y Butovsky, 2017; Leyns y Holtzman, 2017). Los estudios de célula única suponen una poderosa herramienta para descifrar la heterogeneidad de los estadios microgliales, que no sólo dependen del tipo de estímulo, sino también de la localización en el SNC, de la edad del individuo y del microambiente. 23 Introducción A 6.1.2. Metabolismo microglial El metabolismo microglial se basa en los conceptos generales del metabolismo de macrófagos, que ante una activación pro-inflamatoria (respuesta a LPS, INF-ϒ) aumentan la glucólisis y alteran la fosforilación oxidativa (OXPHOS) (Bossche et al., 2017; Pearce y Pearce, 2013; Rodriguez-Gomez et al., 2020). Este metabolismo anaerobio permite una rápida producción de ATP, balanceada con síntesis de macromoléculas, para responder al daño. En estas condiciones, el ciclo de ácidos tricarboxílicos se interrumpe y sus intermediarios se destinan a la producción de citoquinas y especies reactivas de oxígeno (ROS) (Jha et al., 2015; Tannahill et al., 2013). Estos cambios afectan a la morfología mitocondrial, que sufre fusiones y fisiones para adaptar su capacidad bioenergética (Rambold y Pearce, 2018). En contraposición, en presencia de estímulos anti-inflamatorios (por ejemplo IL-4), aumenta el metabolismo oxidativo y se produce una activación alternativa orientada a la reparación tisular y mediada por el eje AKT-mTORC1 (Covarrubias et al., 2016; Jung et al., 2019). A día de hoy, el metabolismo microglial no está completamente caracterizado (Borst et al., 2019; Bernier et al., 2020), aunque estudios in vitro corroboran el patrón descrito para macrófagos: la activación microglial M1 incrementa la glucólisis anaerobia y disminuye la función mitocondrial, vía inducción de óxido nítrico (Chénais et al., 2002; Ghosh et al., 2018; Gimeno-Bayón et al., 2014; Moss y Bates, 2001; Palmieri et al., 2020). Sin embargo, en la polarización a M2, la microglía en cultivo no modifica su metabolismo respecto al estado quiescente (Orihuela et al., 2016). Por otro lado, las aproximaciones transcriptómicas en modelos animales reflejan un aumento de genes implicados tanto en glucólisis como en OXPHOS (Zhang et al., 2014). Por tanto, se requieren nuevos estudios que utilicen tecnologías emergentes (Bernier et al., 2020) para definir con exactitud cómo los cambios metabólicos influencian la progresión de patologías, con especial interés en la EA. 6.1.3. Papel de la microglía en la patología de la EA Aunque actualmente está claro que la microglía tiene una implicación esencial en la patología de Alzheimer, su papel parece ser dual y complejo, pudiendo desempeñar una función perjudicial o insuficientemente protectora en estadios avanzados de la enfermedad (Gutierrez y Vitorica, 2018; Navarro et al., 2018). Como se ha mencionado anteriormente, los estudios de GWAS han identificado numerosos polimorfismos en genes asociados con la función microglial considerados factores de riesgo para la EA. Destacan mutaciones en Trem2 (Guerreiro et al., 2013; Jonsson et al., 2013; Korvatska et al., 2015) y en el receptor de superficie CD33 (Bradshaw et al., 2013; Griciuc et al., 2013; Zhao, 2019), ambos implicados en la activación y/o internalización microglial del péptido Abeta (Bradshaw et al., 2013; Guerreiro et al., 2013; Yeh et al., 2017). Además, durante el envejecimiento, principal factor de riesgo del LOAD, la microglía sufre cambios morfológicos y moleculares hacia la hiperreactividad, y una posterior 24 Introducción A pérdida progresiva de sus funciones (Colonna y Butovsky, 2017; Flanary et al., 2007; Mosher y Wyss- Coray, 2014; Watanabe et al., 2017). 6.1.3.1. Perfil genético en la activación microglial En los últimos años, se han identificado a nivel transcripcional los perfiles microgliales específicos en diversos modelos de enfermedades neurodegenerativas. De esta forma, se ha caracterizado el fenotipo microglial en modelos amiloidogénicos (Keren-Shaul et al., 2017; Krasemann et al., 2017; Mrdjen et al., 2018; Ofengeim et al., 2017), de tauopatías (Friedman et al., 2018; Leyns y Holtzman, 2017; Wang et al., 2018), y de otras enfermedades neurodegenerativas, como la esclerosis lateral amiotrófica (Spiller et al., 2018) y la esclerosis múltiple (Krasemann et al., 2017), así como en el envejecimiento (Mrdjen et al., 2018; Olah et al., 2018). Estas investigaciones concluyen que en la activación microglial disminuye de la expresión de genes “homeostáticos” (Cx3cr1, P2ry12, P2ry13, Tmem119, y Cd33) (Butovsky et al., 2014) y se induce un programa genético denominado DAM (del inglés, disease-associated microglia ) (Keren- Shaul et al., 2017), caracterizado por un incremento en la expresión de diversos genes como: (i) Csf1, Clec7a e Igf-1; (ii) Trem2, ApoE y Tyropb, asociados con un mayor riesgo de padecer Alzheimer (Lambert et al., 2013), y (iii) genes implicados en fagocitosis/degradación lisosomal, respuesta inmune y endocitosis (Hashemiaghdam y Mroczek, 2020). Dentro de este clúster microglial, se ha descrito un subgrupo denominado MGnD (del inglés, microglia neurodegenerative phenotype ) con una firma molecular caracterizada por el aumento de 28 genes inflamatorios (Spp1, Tfgax, Axl, Lilrb4, ApoE, Clec7a, etc.) y que correlaciona con placas neuríticas de Abeta y con las distrofias neuríticas (Krasemann et al., 2017). Aunque no se conocen con detalle los mecanismos que regulan el cambio de fenotipo microglial, se han identificado factores transcripcionales dependientes de señales inflamatorias (NFkB, Proteína activadora 1, Factores Reguladores de INF, p53 o STATs), en contraposición con otros que median un estado homeostático y de inspección del entorno (Pu.1, Sall1, Mafb) (Holtman et al., 2017). La transición a fenotipo DAM parece, además, ser un proceso secuencial, mediado por la señalización Trem2-ApoE (Figura A.11) (Hickman y Khoury, 2014; Keren-Shaul et al., 2017; Krasemann et al., 2017; Ulland et al., 2017). Es más, Trem2 soluble aumenta en el LCR de pacientes con deterioro cognitivo leve (Suárez- Calvet et al., 2016), e induce cambios morfológicos y la producción de citoquinas en la microglía (Zhong et al., 2017). 25 Introducción A Figura A.11. Mecanismo secuencial de activación microglial DAM. La transición de microglía homeostática a microglía DAM pasa por una primera fase, independiente de Trem2 y que cursa con una disminución de la expresión de genes homeostáticos (“Stage 1 DAM”). A continuación, le sigue una segunda fase, dependiente de Trem2, que supone la activación de genes esenciales para la fagocitosis y el metabolismo lipídico (“Stage 2 DAM”). Se muestran los genes clave implicados en cada estado; las flechas indican el incremento (rojo) o disminución (verde) de su expresión. Imagen tomada de Keren-Shaul et al., 2017. En procesos neurodegenerativos, incluida la EA, se han descrito múltiples estados de activación microglial que podrían corresponder a distintos papeles de estas células en la progresión de la patología (Hansen et al., 2018; Stratoulias et al., 2019). Además, la activación microglial puede estar influenciada por el sexo, la edad y los polimorfismos genéticos interindividuales (Sala Frigerio et al., 2019). Sin embargo, en los estadios finales de la enfermedad, la desregulación genética parece originar en la microglía un patrón de expresión de respuesta global a estrés común con otros tipos celulares (Mathys et al., 2019). Recientemente, gracias a novedosos avances metodológicos, se ha caracterizado el perfil genético de la microglía humana en la EA, HAM (del inglés, human Alzheimer ’s microglia ) (Srinivasan et al., 2019). La firma genética HAM comparte la mitad de su perfil de expresión con la microglía de individuos controles, es decir, manifiesta cambios asociados a un envejecimiento fisiológico. En contraste, apenas comparte perfil de expresión con la firma DAM, siendo ApoE el único gen que aumenta significativamente en ambos clústeres (Srinivasan et al., 2019). Sin embargo, Thrupp et al. (2020) han reportado que estas diferencias podrían deberse a limitaciones de la técnica experimental, por lo que deben refinarse las nuevas aproximaciones metodológicas antes de establecer conclusiones sólidas. 26 Introducción A 6.1.3.2. Actividad microglial en respuesta a las patologías Abeta y Tau Los depósitos de Abeta atraen a una población de células mieloides conocida como microglía asociada a placa, (PAM, del inglés plaque-associated microglia ) (Figura A.12 B) (Malm et al., 2005; Yin et al., 2017), que se caracteriza por un aumento de genes pro-inflamatorios y genes implicados en la respuesta fagocítica (Boza-Serrano et al., 2019; Shukla et al., 2019; Yin et al., 2017). Este clúster microglial suele relacionarse a su vez con el concepto de microglía “oscura”, que hace referencia a células microgliales con elevados niveles de estrés oxidativo, remodelación de la cromatina nuclear y un citoplasma denso y oscuro (Bisht et al., 2016; St-Pierre et al., 2020). Esta microglía podría constituir una barrera protectora frente a la toxicidad de la placa, promoviendo su compactación y aislamiento (Yuan et al., 2016). Además, la fagocitosis activa de Abeta oligomérico por la microglía (Mandrekar et al., 2009), junto con la actividad proteolítica de las enzimas que secreta (Nixon y Yang, 2011), impiden el crecimiento de la placa (Bolmont et al., 2008). Este proceso se asocia a la neuroinflamación descrita en modelos animales amiloideos de EA, en los que la activación microglial se inicia alrededor de las placas y se expande con el avance de la patología por todo el parénquima cerebral (Jimenez et al., 2008, 2011). Figura A.12. Activación microglial en modelos de patología de Alzheimer. La microglía homeostática (A) presenta una morfología ramificada, mientras que la microglía activa (B, C) presenta un engrosamiento del cuerpo celular y las prolongaciones. Inmunohistoquímica de fluorescencia para microglía (tinción Iba1) en el hipocampo de ratones WT (A), ratones con patología amiloide (APP; la microglía se dispone alrededor de las placas) (B) y ratones con patología Tau (TAU P301S) (C). Barra de escala: 20 µm. A BC 27 Introducción A Paralelamente, la microglía parece responder a la patología de Tau a través de distintos mecanismos que incluyen su activación (Figura A.12 C) y la secreción de citoquinas (Bhaskar et al., 2010) (Maphis et al., 2015), la propagación de depósitos de Tau (Asai et al., 2015; Hopp et al., 2018) o la capacidad de fagocitar y degradar depósitos de Tau (Bolós et al., 2015; Luo et al., 2015; Majerova et al., 2014). En contraposición, otros autores sugieren que la respuesta microglial es independiente de la progresión de la patología Tau (Streit et al., 2014; Zhu et al., 2020), o incluso que la microglía podría ser incapaz de responder a la elevada toxicidad de Tau soluble (Sanchez-Mejias et al., 2016; Streit et al., 2009). En este sentido, en cerebros envejecidos, se ha descrito una microglía senescente caracterizada por una morfología distrófica e incapaz de realizar eficazmente sus funciones (Flanary et al., 2007; Mosher y Wyss-Coray, 2014; Savage et al., 2019). Esta disfuncionalidad microglial parece estar agravada en la EA (Lopes et al., 2008; Mosher y Wyss-Coray, 2014; Tischer et al., 2016) debido a la presencia tanto de depósitos amiloides (Flanary et al., 2007; Gyoneva et al., 2016; Krabbe et al., 2013) como de patología Tau (Sanchez-Mejias et al., 2016; Streit et al., 2009). Nuestro grupo de investigación ha caracterizado un proceso de degeneración microglial en el hipocampo de pacientes de Alzheimer, mediado por formas tóxicas solubles de Tau fosforilado (Sanchez-Mejias et al., 2016). Esta respuesta microglial difiere llamativamente del fenotipo hiperreactivo citotóxico observado en la mayoría de modelos murinos (Gutierrez y Vitorica, 2018; Navarro et al., 2018; Prokop et al., 2019; Romero-Molina et al., 2018). Por consiguiente, es imprescindible dilucidar el papel de la microglía en la progresión de la patología de Alzheimer, que probablemente dependa de la coyuntura contextual. 6.2. Astrocitos Los astrocitos son las células gliales más abundantes del SNC (~35%) y también participan en la respuesta neuroinflamatoria. Aunque morfológicamente son muy heterogéneos, presentan una estructura estrellada con múltiples prolongaciones que conectan con vasos sanguíneos, neuronas, oligodendrocitos, microglía y otros astrocitos. La proteína Gfap (del inglés, Glial fibrilary acidic protein ), es el componente principal de la red de filamentos intermedios del citoesqueleto de los astrocitos, y por tanto, el marcador más usado para identificarlos. Otras proteínas abundantemente expresadas en los astrocitos son vimentina (Vim), aldehído deshidrogenasa (Aldh) y glutamina sintetasa (Gs) (Phillips et al., 2014; Sofroniew y Vinters, 2010; Verkhratsky et al., 2014). 6.2.1. Funciones fisiológicas Los astrocitos desarrollan múltiples funciones fundamentales para la homeostasis general del SNC (Pestana et al., 2020). Por un lado, contribuyen a la captación de glucosa sanguínea para dar soporte energético a las neuronas (Verkhratsky et al., 2019), a las que además suministran compuestos 28 Introducción A antioxidantes, factores tróficos (VEGF, GDNF, bFGF) y otros elementos esenciales para su soporte metabólico. Además, eliminan toxinas del LCR, liberan factores quimiotáxicos, mantienen el equilibrio hidro-salino del parénquima cerebral y contribuyen a la reparación y cicatrización del SNC (Phillips et al., 2014). Los pies astrocitarios forman parte de la BHE, participando en su mantenimiento, proporcionando soporte bioquímico a las células endoteliales y regulando el paso selectivo de sustancias (Ota et al., 2013). Paralelamente, controlan el flujo de agua a través de las acuaporinas (Aqp1 y Aqp4) (Perez-Nievas y Serrano-Pozo, 2018) y el “drenaje glinfático”, por el que se produce el aclaramiento paravascular de solutos tóxicos (Ries y Sastre, 2016). Por otro lado, los astrocitos regulan funciones neuronales y sinápticas, y a su vez la actividad neuronal también regula el transcriptoma de los astrocitos (Covelo y Araque, 2018; Hasel et al., 2017). Un insulto agudo o crónico en el SNC origina una activación y un cambio morfológico de los astrocitos, conocida como astrogliosis (Sofroniew y Vinters, 2010), que se caracteriza por la inducción de las proteínas Gfap y Vimentina, implicadas en el engrosamiento de las prolongaciones y el aumento del tamaño del soma (Perez-Nievas y Serrano-Pozo, 2018; Zamanian et al., 2012). La activación astrocítica puede ejercer un efecto tanto beneficioso como perjudicial para las células de su entorno (Leyns y Holtzman, 2017; Liddelow y Barres, 2017; Liu et al., 2014; Sofroniew y Vinters, 2010). Además, la deficiencia de cualquiera de sus funciones podría desencadenar o empeorar la disfunción neuronal en distintos procesos neurodegenerativos (Cragnolini et al., 2019). 6.2.2. Papel de los astrocitos en la patología de la EA En cerebros post mortem de enfermos de Alzheimer, así como en ratones transgénicos modelos de la enfermedad, se produce una reactividad astrocitaria generalizada (Figura A.13) (Cai et al., 2017; Verkhratsky et al., 2019), que se inicia en los primeros estadios de la enfermedad y progresa significativamente a medida que evolucionan la patología amiloidea y de Tau (Garwood et al., 2017; Heneka et al., 2015b). Los astrocitos reactivos se localizan alrededor de las placas amiloides, lo que sugiere que los depósitos y los oligómeros de Abeta desencadenan la activación astroglial (Medeiros y LaFerla, 2013; Walsh y Selkoe, 2020). Paralelamente, los factores pro-inflamatorios liberados tras su activación podrían inducir la producción de Abeta en los astrocitos (Perez-Nievas y Serrano-Pozo, 2018). En contraposición, los astrocitos reactivos también podrían tener un papel protector, ya que forman una barrera física alrededor de las placas e intervienen en procesos de captación, aclaramiento y degradación de Abeta (Ries y Sastre, 2016; Verkhratsky et al., 2019). Por otro lado, el cambio morfológico asociado a la activación astroglial afecta a los pies astrocíticos, produciéndose alteraciones en la integridad de la BHE y contribuyendo así a las alteraciones cerebrovasculares típicas de la EA (Acosta et al., 2017). Como 29 Introducción A consecuencia, se acentúa la deposición de Abeta (Cai et al., 2017, 2018; Ries y Sastre, 2016), y se origina un bucle de retroalimentación positiva que agrava el proceso. Evidencias recientes parecen indicar que los astrocitos poseen un papel neuroprotector en los inicios de la patología, que podría disminuir con la progresión de la enfermedad, probablemente debido a una pérdida de sus funciones fisiológicas y/o a una ganancia de función tóxica (Perez-Nievas y Serrano- Pozo, 2018). En este sentido, se ha relacionado la progresión de la EA con deficiencias metabólicas en el SNC, donde los astrocitos tienen un papel fundamental (Le Douce et al., 2020; Muñoz-Castro, 2021; Sanchez-Mico, 2019; Verkhratsky et al., 2019; Zhou et al., 2020). Diversos estudios transcriptómicos han identificado dos fenotipos de reactividad astroglial, según el estímulo que lo genere: A1 y A2. La neuroinflamación parece inducir un fenotipo A1, caracterizado por un perfil inflamatorio que aumenta la expresión de genes que provocan destrucción sináptica (por ejemplo, genes de la cascada del complemento) (Liddelow et al., 2017). La adquisición del fenotipo A1 depende, en cierta medida, de la interacción con la microglía y se modula por la presencia del alelo Ɛ4 del ApoE, al menos en modelos animales (Liddelow y Barres, 2017; Shi et al., 2017). Por otro lado, los daños por isquemia producen un fenotipo A2 (Liddelow et al., 2017; Zamanian et al., 2012), caracterizado por un incremento en la expresión de factores neurotróficos, que promueven la supervivencia y crecimiento neuronal, y trombospondinas, que favorecen la reparación de sinapsis. Sin embargo, probablemente esta división en dos fenotipos contrapuestos no representa la realidad (Chai et al., 2017; John Lin et al., 2017; Sosunov et al., 2014), y los astrocitos presenten fenotipos dispares en función de la región en la que se encuentran y/o del estímulo que reciban. Figura A.13. Activación astroglial. Inmunohistoquímica fluorescente para el marcador astroglial Gfap. A la izquierda, astrocitos quiescentes del cerebro de un ratón WT. A la derecha, astrocitos activos en el cerebro de un ratón modelo de EA (TAU P301S). La activación astroglial se caracterizan por un aumento de la expresión de Gfap, del tamaño del cuerpo celular y un engrosamiento de las prolongaciones. Barra de escala: 20 µm. 30 Introducción A 6.3. Interacción microglía-astrocitos en la respuesta inmune innata Recientemente, se ha postulado que la activación microglial supone la liberación de citoquinas implicadas en la activación astrocítica (Vainchtein y Molofsky, 2020). La señalización a través de receptores purinérgicos induce una polarización astrocitaria hacia un fenotipo mayoritariamente A2 (Yeh et al., 2017), mientras que la liberación de IL1a, TNFα o C1q conlleva una polarización hacia una respuesta A1 (Liddelow et al., 2017). A su vez, la liberación de moléculas pro-inflamatorias por parte de los astrocitos amplifica la respuesta inflamatoria microglial. Concretamente, la liberación de lipocalina-2, de MCP-1 (del inglés, chemoattractan protein 1 ) o del factor C3 del complemento potencian la microgliosis (Lian et al., 2016; Yang et al., 2020). En contraste, los astrocitos también pueden secretar TFGβ, GDNF u orosomucoide-2 que inhiben la activación microglial (Jha et al., 2018), conteniendo parcialmente la neuroinflamación. 6.4. Mediadores de la respuesta inflamatoria Se han descrito diversas citoquinas mediadoras de la respuesta inflamatoria en la EA, de naturaleza proinflamatoria (TNFα, FASL, CH3L1, IFNg, IL1β, IL6 e IL12a) y anti-inflamatoria (IL13, IGF1, TGFβ, IL10, IL4) (Heneka et al., 2015b; Leyns y Holtzman, 2017). Algunos ejemplos de quimioquinas y sus receptores con implicaciones importantes en la EA son CCL2/CCR2, CXCL10/CXCR3, CX3CL1/CX3CR1, CXCL12/CXCR4, CXCL3/CXCR1, RANTES y CCL5 / CCR1, CCR2 y CCR5 (Colonna y Butovsky, 2017; Liu et al., 2014). La producción de quimioquinas por astrocitos y microglía en respuesta a citoquinas pro-inflamatorias del SNC podría mediar la migración de células del sistema inmune periférico desde el espacio perivascular hacia el parénquima cerebral (Fani Maleki y Rivest, 2019; Kierdorf et al., 2019). También cabe destacar la participación del sistema del complemento, que facilita la fagocitosis de los antígenos opsonizados o de células dañadas, e induce la liberación de citoquinas pro-inflamatorias (Morgan, 2018; Rajendran y Paolicelli, 2018). Todos los mediadores inflamatorios y sus receptores podrían ser potenciales dianas farmacológicas en enfermedades que cursan con neuroinflamación, como la EA. 6.5. Células inmunes asociadas al SNC En condiciones fisiológicas, el SNC presenta una extensa red vascular que alberga una población heterogénea de células inmunes residentes que incluye a los macrófagos asociados al SNC, a monocitos, células derivadas de monocitos (CDM), células dendríticas (CD), neutrófilos, mastocitos y linfocitos. Durante la EA, las alteraciones vasculares ya mencionadas deterioran la BHE, posibilitando la entrada de células del sistema inmune periférico. Si la infiltración favorece o no la progresión de la patología es una cuestión pendiente de resolver. Sin embargo, podría compensar las funciones que la microglía endógena disfuncional ya no es capaz de cumplir (Prinz et al., 2011; Muñoz-Castro, 2021). De hecho, la entrada de 31 Introducción A células externas podría estar inducida por citoquinas secretadas por la microglía vía señalización Ccr2 (Van Hove et al., 2019). Actualmente, no está definido si realmente existe infiltración de células inmunes periféricas en el cerebro de pacientes de Alzheimer, y qué tipo de células llegarían al parénquima, en caso de existir. A continuación se describen los principales candidatos. 6.5.1. Macrófagos asociados al SNC Las poblaciones de macrófagos asociados al SNC más estudiadas son los macrófagos perivasculares, los macrófagos leptomeníngeos y los macrófagos del plexo coroideo (Figura A.14). Entre otras funciones, controlan la BHE y el intercambio de antígenos y metabolitos con el SNC, teniendo un papel fundamental la glucoproteína MRC1 (del inglés, mannose receptor C-type 1 ) y el receptor Cd163 (Kierdorf et al., 2019). En la EA, los macrófagos asociados al SNC podrían modular la entrada de células inmunes y su fenotipo durante la neuroinflamación (Jordão et al., 2019). Además, se ha propuesto su implicación en la regulación de la angiopatía amiloide cerebral puesto que un aclaramiento deficiente en los espacios perivasculares podría contribuir al cúmulo de depósitos de Abeta vasculares (Thériault et al., 2015). Figura A.14. Macrófagos asociados al SNC. Los macrófagos asociados al SNC engloban a los macrófagos perivasculares, los macrófagos del plexo coroideo, los leptomeníngeos, los residentes en la duramadre y los ascoiados al epiplexus en el ventrículo (células de Kolmer). Imagen tomada de Kierdof et al., 2019. C. Materiales y Métodos 41 Materiales y Métodos C 1. MUESTRAS HUMANAS POSTMORTEM Las muestras de tejido proceden de necropsias de individuos control y pacientes con Enfermedad de Alzheimer. La clasificación de los pacientes se ha realizado según los estadios de Braak en función de la patología Tau presente en el tejido cerebral (Braak y Braak, 1991). Las muestras controles proceden de individuos sin ninguna enfermedad psiquiátrica/neurológica conocida y sin lesiones típicas de EA. Las muestras han sido cedidas por i) el Dr. Alberto Rábano Gutiérrez Arroyo, director del Banco de Tejido para Investigación Neurológica (BTIN) de Madrid, perteneciente a la Fundación CIEN del Instituto de Salud Carlos III; ii) el Dr. Isidro Ferrer, del Instituto de Neuropatología y coordinador del Banco de Tejidos Neurológicos del Servicio de Anatomía Patológica, perteneciente al IDIBELL-Hospital Universitario de Bellvitge, de Barcelona; iii) el Banco de Tejidos Neurológicos BioBanc del Hospital clínico-IDIBAPS, en Barcelona; siguiendo en todos los casos las normas generales de la legislación española y del comité ético local. Este proyecto ha sido aprobado por el Portal de Ética de la Investigación Biomédica de Andalucía (PEIBA) de la Consejería de Salud, así como por los propios Comités Éticos de los respectivos Bancos de Tejidos y por el Comité Ético de Investigación de los Hospitales Universitarios Virgen Macarena-Virgen del Rocío. En la Tabla C.1, se detallan las medias de edad y el sexo de los grupos estudiados (basados en el estadio de Braak), así como el intervalo de tiempo transcurrido desde la muerte del individuo hasta la toma de la muestra. El tejido, una vez extraído, se mantiene a -80ºC hasta su uso, para evitar la degradación de proteínas y ARN. Las muestras de la necropsia se dividen, aún congeladas, en secciones de 70-90 mg para la extracción de proteínas y ARN (Apartado 9). Estadio Braak Género Edad (años) Tiempo post mortem (h) Masculino (%) Femenino (%) Braak 0 (n=6) 66,67 33,33 49 ± 6 6,7 ± 3,4 Braak II (n=17) 52,94 47,06 78 ± 8,5 7 ± 4,6 Braak III-IV (n=12) 63,64 36,36 82,5 ± 8,1 6,1 ± 5,3 Braak V-VI (n=22) 57,14 42,86 75,3 ± 14,6 8,0 ± 3,2 Tabla C.1. Datos de las muestras humanas analizadas. Los individuos se clasifican según el estadio Braak y se especifican los porcentajes de individuos de cada sexo y los datos medios ± desviación estándar de la edad y el tiempo transcurrido desde la muerte del individuo hasta la toma de muestra. 42 Materiales y Métodos C 2. ANIMALES DE EXPERIMENTACIÓN 2.1. Líneas transgénicas utilizadas Hemos empleado ratones de entre 2 y 14 meses de edad de las líneas transgénicas que se citan a continuación. Como controles, hemos utilizado los correspondientes ratones no transgénicos (wildtype, WT) con el mismo fondo genético (C57BL/6) y edad. - APP/PS1 (PS1Δexón9xAPPs) (Jackson Laboratory, Bar Harbor, Maine): ratones doble transgénicos PS1dE9/APPS, que sobreexpresan el gen APP en su isoforma 695 con la mutación Swedish (K594M/M596L) descrita en casos de Alzheimer Familiar, y el gen PS1, que presenta una deleción del exón 9 (PS1dE9), bajo el control del promotor PrP. - APP (Sanofi-Aventis, París, Francia): simple transgénico APPSL, que sobreexpresa el gen APP751 humano con las mutaciones Swedish (KM670/671NL) y London (V717I) descritas en casos de Alzheimer Familiar, bajo el control del promotor Thy-1. - ThyTAU22 (Sanofi-Aventis, París, Francia): expresan la forma humana de Tau de 4 repeticiones, con las mutaciones G272V y P301S, bajo el control del promotor Thy1.2 (Schindowski et al., 2006). Para este Trabajo, no hemos tenido acceso a la colonia, sino a muestras congeladas de estos ratones de distintas edades, lo que ha limitado nuestro abordaje experimental con este modelo. - TAU P301S (Línea PS19) (Jackson Laboratory, Bar Harbor, Maine): expresan la forma humana de Tau 4R/1N, con la mutación P301S, bajo el control del promotor de la proteína priónica (PrP) (Yoshiyama et al., 2007). - CX3CSF1R: ratones procedentes del cruce de ratones Cx3Cr1CreER y CSF1rflox/flox (ambos de Jackson Laboratory, Bar Harbor, Maine). Utilizamos ratones homocigotos para CSF1rflox/flox y homo o heterocigotos para Cx3Cr1CreER. La expresión de CreER está controlada por el promotor CX3CR1, exclusivo de microglía, y es dependiente de tamoxifeno. La ablación específica de la correcta expresión del gen CSF1r nos permite disponer de un modelo de depleción microglial selectivo condicional (Kim et al., 2018) (ver Apartado 2.3.1). - APPCX3CSF1R: ratones Cx3Cr1CreER/CSF1rflox/flox cruzados con ratones APPS, ambos descritos anteriormente. 43 Materiales y Métodos C Los animales se crían en el animalario del Centro de Producción y Experimentación Animal de la Universidad de Sevilla, a una temperatura media de 21ºC, un 21% de oxígeno y un fotoperiodo de 14 horas de luz y 10 de oscuridad. Disponen de libre acceso al agua y a una dieta estándar. Todos los experimentos se han realizado en concordancia con las directrices del Parlamento Europeo y del Consejo (Directiva 2010/63/UE), siguiendo la normativa española para la protección de animales utilizados en experimentación (Real Decreto 53/2013). Todos los ensayos han sido aprobados por el Comité Ético de Uso de Animales para la Investigación de la Universidad de Sevilla. El número de animales empleados, así como el estrés y sufrimiento de éstos se ha reducido al máximo, de acuerdo con la regla de las 3R (reemplazar, reducir y refinar). 2.2. Genotipado de los animales El genotipado de los ratones transgénicos se ha realizado a partir de muestras de falanges de cada animal. Para ello, extraemos el ADN usando el kit Takara (Takara Bio INC, Japón): añadimos 150 µl de la solución Takara e incubamos 15 minutos a 95ºC en agitación. El ADN extraído se utiliza para realizar una PCR convencional, utilizando el kit comercial MyTaqTM Red DNA Polymerase (Bioline, Londres, UK) y los cebadores correspondientes al gen de interés (ver Tabla C.2). Para cada gen utilizamos una cantidad concreta de ADN y un programa específico de amplificación (ver Tabla C.2). Las muestras obtenidas se someten a electroforesis en gel de agarosa al 2%, al que se le añade el intercalante de ADN RedSafeTM Nucleic Acid Staining Solution (iNtRON Biotechnology, Seongnam, Corea Sur) al 5%, para separar las bandas de ADN según su tamaño. La electroforesis se realiza en tampón Tris-ácido Bórico-EDTA (TBE), a un voltaje constante de 200V durante 10 min. Finalmente, el gel se visualiza bajo luz UV, identificando la banda de interés por referencia al marcador de peso molecular. Gen Cebadores Cantidad de ADN Programa de PCR APPSL 5’-GGCTGAGGAACCCTACGAAGA-3’ 5’-CAAAGTACCAGCGGGAGATCA-3’ 1 µl MyTAQ hTAU-P301S 5’-GGC ATC TCA GCA ATG TCT CC-3’ 5’-GGT ATT AGC CTA TGG GGG ACA C-3’ 1 µl MyTAQ Cx3Cr1CreER CX3.Mt: 5’ -CGG TTA TTC AAC TTG CAC CA-3’ CX3.Cm: 5’-AAG ACT CAC GTG GAC CTG CT-3’ CX3.Wt: 5’-AGG ATG TTG ACT TCC GAG TTG-3’ 1 µl Cx3.Mt: CreFlox Cx3.Wt: Bio58 CSF1rflox/flox 5’-GGA CTA GCC ACC ATG TCT CC-3’ 5’-CAT GGC TGT GGC CTA GAG A-3’ 0.8 µl CreFlox Tabla C.2. Cebadores, cantidad de ADN y programa de PCR utilizados para genotipar las diferentes líneas de animales transgénicos. Mt=mutante; Cm=común; Wt=silvestre. Programas: MyTAQ= 95ºC 1min; 36 ciclos (95ºC 1min, 95ºC 15seg, 55ºC 15seg, 72ºC 10seg). Cre/Flox= 95ºC 2min, 10 ciclos, bajando 0.5ºC/ciclo (94ºC 20seg, 65ºC 15seg, 68ºC 10seg), 28 ciclos (94ºC 15seg, 60ºC 15seg, 72ºC 10seg), 72ºC 2min. Bio58= 95ºC 1min, 35 ciclos (95ºC 15seg, 58ºC 15seg, 72ºC 10seg). 44 Materiales y Métodos C 2.3. Tratamientos de los animales de experimentación 2.3.1. Administración de Tamoxifeno para la activación del sistema Cre-LoxP Para estudiar la depleción microglial in vivo , tratamos los ratones Cx3Cr1CreER/CSF1rflox/flox y APP- Cx3Cr1CreER/CSF1rflox/flox con tamoxifeno, que activa la recombinasa Cre. En este modelo, la enzima Cre está precedida por un promotor específico de células microgliales (Cx3Cr1), por lo que sólo se expresa en dichas células. Como se muestra en la Figura C.1, una vez activa, la enzima Cre reconoce los sitios LoxP que flanquean el gen de interés, en este caso, una región concreta codificante del gen CSF1r, y produce su deleción específica. Dado que CSF1r es esencial para la supervivencia microglial (Han et al., 2017), su expresión anómala conlleva la muerte de las células microgliales. Figura C.1. Representación esquemática del funcionamiento del sistema Cre-LoxP. El tratamiento con tamoxifeno induce la activación de la recombinasa Cre en las células donde se expresa (en este caso, en células microgliales dado que el promotor es el gen Cx3Cr1). La enzima Cre activa actúa sobre una región codificante del gen floxeado, CsF1r, produciendo su expresión anómala. Imagen modificada de Kim et al., 2018. Para la administración intraperitoneal de tamoxifeno, diluimos el tamoxifeno en polvo (T5648, Sigma) (1.6 mg / 100 µl) en etanol-aceite de maíz (C8267, Sigma) (1:5 v/v). Para la correcta disolución, añadimos primero el etanol y calentamos a 60ºC durante 5 min. Una vez disuelto, se añade el aceite de maíz y se vuelve a calentar a 60ºC durante 10 min hasta que las fases sean homogéneas. El preparado de tamoxifeno puede guardarse a 4ºC durante 3 días hasta su uso, y siempre lo calentamos y comprobamos la homogeneidad de la solución antes de cada administración. Los animales se inyectan, utilizando agujas de 25G, durante 5 días consecutivos, 2 días de descanso y 2 días consecutivos (total de 7 días de tratamiento), a una dosis de 75 mg/kg de peso. Una vez finalizado el tratamiento, dejamos un tiempo de 0, 7, 14 o 21 días antes de sacrificar los animales. El segundo ciclo de tratamiento inyectado de tamoxifeno, se inicia 14 días tras el final del primer tratamiento, y consiste en un nuevo ciclo de 7 días de tratamiento, tras los que sacrificamos los animales a los 0, 7 y 14 días. 45 Materiales y Métodos C Para los ensayos de administración oral de tamoxifeno, se proporciona una dieta de pienso con tamoxifeno (250 mg/kg de pienso, Envigo) ad libitum durante 1, 2 o 4 meses, estimando que los ratones ingieren una dosis media diaria de tamoxifeno de 40 mg/kg. En este caso los animales se sacrificaron inmediatamente tras finalizar el tratamiento. Figura C.2. Esquema del tratamiento de los animales CX3CSF1R con tamoxifeno agudo y crónico. El tratamiento agudo con tamoxifeno se realiza mediante inyecciones intraperitoneales diarias de 75 mg/kg de peso durante 7 días. Los ratones se sacrificaron 0, 7, 14 o 21 días tras la finalización del tratamiento. Para el tratamiento crónico, se administra una dieta ad libitum con pienso con tamoxifeno durante 1, 2 o 4 meses, estimando que los ratones ingieren una dosis media diaria de tamoxifeno de 40 mg/kg, y los animales se sacrifican inmediatamente al finalizar el tratamiento. 2.3.2. Cámara de hipoxia para animales Los ratones TAU P301S de 8-9 meses y los ratones APP/PS1 de 14 meses se estabulan en una cámara con control de la concentración de oxígeno (Coy Laboratory Products, Inc., Grass Lake, MI), donde se someten a hipoxia (9% de oxígeno) durante 21 días. La alimentación, temperatura y ciclos de luz son comunes al resto de animales estabulados (ver Apartado 2.1). Además, la humedad y el CO2 se controlan mediante la filtración del aire a través de Sodasorb (Grace) y silica gel absorbente (Panreac), respectivamente, usando una bomba conectada a los controladores de humedad y CO2. El acceso a la cámara para la alimentación y limpieza es posible gracias a una esclusa, que permite mantener las condiciones de la cámara. Una vez terminado el tratamiento, y antes del sacrificio y procesamiento del ratón (ver Apartado 2.4), se mide su hematocrito individual. Para ello, se extrae una muestra de sangre de la aurícula cardíaca derecha mediante un capilar y, por centrifugación diferencial a 5000 rpm durante 5 min (P Selecta Centrolit II), se diferencia el componente granular de la sangre, del plasma. El hematocrito se calcula como el porcentaje de parte granular (longitudes medidas), respecto al total de sangre del capilar. El hematocrito de los ratones hipóxicos es de un 72,19 ± 3,08 %, mientras que los valores normales están en torno al 40-50 %, lo que nos confirma que los ratones han sido sometidos a un ambiente hipóxico. Figura 2.2. Esquema de funcionamiento de FACS. Modificado de BioRad. 0714 21 Tratamiento 7 días Recuperación (días) 1 mes 2 meses 4 meses Placas de deflexión Fluoróforo Tamaño celular Complejidad celular/ fluorescencia Muestra Funda de líquido Carga Gota cargada Células sorteadas Células sorteadas 46 Materiales y Métodos C 2.3.3. Inyección de EdU El reactivo EdU (5-etinil-2’-deoxiuridina) es un análogo de la tiamina que se incorpora en la hebra de ADN durante su síntesis y que, por tanto, permite evaluar la proliferación celular (ver Apartado 19). Para estos experimentos, los ratones WT, TAU P301S y APP se somenten a tres inyecciones intraperitoneales (aguja 25G) en días alternos con EdU (A10044, ThermoFisher) disuelto en PBS (1.5 mg/ 100 µl/día). Para la correcta disolución del EdU, la solución se incuba a 50º en agitación (700 rpm) durante 10 min. Los animales CX3CSF1R se tratan con EdU en paralelo al resto de los animales; en este caso, el tratamiento se inicia 5 días después de terminar un ciclo de inyecciones agudas de tamoxifeno (ver Apartado 2.3.1). Los animales se procesan dos días después de finalizar el tratamiento. 2.4. Obtención de muestras Para la obtención de las muestras, los animales se anestesian con pentobarbital sódico (Tiobarbital (Braun), 90-120 mg/Kg) y se perfunden transcardialmente con tampón fosfato salino PBS [NaH2PO4 0.1M (Merck) + NaHPO4 0.1M (Merck) + NaCl 0.132M (Panreac), pH 7.4], durante 4 min a un flujo continuo de 10 ml/min, utilizando una bomba de perfusión (DINKO Mod. D-25V). A continuación, se decapitan y se extrae el cerebro. Los hemicerebros destinados a estudios inmunohistoquímicos se fijan y crioprotegen: 24 h en solución fijadora PLP (paraformaldehido 4% (Merk), L-Lisina 75 mM (Merk) y metaperyodato sódico 10 mM (Merk) en tampón PBS) y 24-48 h en sacarosa (Applichem) al 30% diluida en PBS. Finalmente, se congelan de manera gradual y se mantienen a -80ºC hasta su procesamiento. Para estudios bioquímicos de extracción de proteínas totales y/o ARN (ver Apartado 9), se separan las regiones cerebrales corteza e hipocampo y se congelan a -80ºC hasta su uso. En cada diseño experimental, las muestras de diferentes genotipos y edades se procesan de forma simultánea. 3. CULTIVOS CELULARES Los cultivos celulares se incuban a 37ºC, en una atmósfera humidificada con un 5% de CO2. Su manipulación se lleva a cabo bajo condiciones de esterilidad. 3.1. Líneas celulares Se subcultivan 2-3 veces en semana, manteniendo una confluencia adecuada. Para ello, mediante un rascador (scraper) o mediante el uso de Trypsin 0,25%-EDTA 1 mM (Biowest) se recogen del frasco de cultivo y se resuspenden en el medio correspondiente, haciendo diluciones 1:5 ó 1:10 antes de sembrar de nuevo. El número de células y soporte utilizado en cada ensayo dependen de cada condición experimental. 47 Materiales y Métodos C 3.1.1. Línea microglial BV2 Esta línea deriva de la microglía neonatal murina raf/myc-inmortalizada, siendo una de la más utilizada en estudios de neurodegeneración (Stansley et al., 2012). Estas células se mantienen de forma rutinaria en medio DMEM-F12 w/o L-glutamine (Biowest), suplementado con glutamina 2 mM (Biowest), suero fetal bovino (SFB) 10% (Biowest), 100 U/ml de penicilina (Biowest) y 100 µg/ml de estreptomicina (Biowest). 3.1.2. Línea neuronal SH-Tau La línea SH-SY5Y-Tau (SH-Tau) es una línea celular humana de neuroblastoma que expresa constitutivamente la isoforma 3R de la proteína Tau humana (Hamdane et al., 2003). Se cultiva en medio DMEM-F12 (Biowest) suplementado con glutamina 2 mM, suero fetal bovino (10%), 100 U/mL de penicilina (Biowest), 100 µg/mL de estreptomicina (Biowest) y 1% de aminoácidos no esenciales (Biowest). Además, se añade el antibiótico G418 (0.2 µg/mL) para la selección clonal. 3.2. Cultivo mixto de microglía y astrocitos primarios Estos cultivos primarios se realizan según se describe en Jiménez et al. (2008). Previamente, las placas de cultivo utilizadas se tratan con poli-D-lisina (Sigma) a 100 µg/ml, durante 2 horas a 37ºC, y posteriormente se lavan. Las células se extraen de la corteza e hipocampo de ratones CD1 neonatales (P1-P2). Tras la decapitación de las crías, se extrae el cerebro y se separan cortezas e hipocampos del resto del cerebro, trabajando en PBS (Biowest) frío con antibióticos (100 U/ml de penicilina y 100 µg/ml de estreptomicina). El tejido se homogeniza con tijeras de cirugía en Tripsina-EDTA 1x en PBS (Biowest) (250 µl/cerebro), se incuba a 37ºC durante 5 min y se repite el proceso hasta que quede completamente homogeneizado. Posteriormente, se le añade medio completo con SFB, para inhibir la tripsina, y la suspensión de células obtenida se filtra por un filtro de nylon con un diámetro de poro de 40 µm (Fisher Scientific). Las células se siembran en placas de 24 pocillos, a una densidad de 500.000 células por pocillo (área por pocillo: 1.77 cm2; Nunc). Se mantienen en medio completo para cultivo mixto: DMEM-F12 suplementado con 10% SFB, 1X aminoácidos no esenciales (Biowest), 10 µg/ml de gentamicina (Biowest), 2 mM de L-Glutamina, 100 U/ml de penicilina y 100 µg/ml de estreptomicina. A los 2 días, se retira la mitad del medio y se repone con medio nuevo. Cada 4 días, se renueva todo el medio. 3.2.1. Aislamiento de microglía La obtención de cultivos enriquecidos en microglía se realiza entre los 20 y 25 días del cultivo mixto. Se recoge el medio del cultivo, que se encuentra condicionado por los factores liberados por las células 54 Materiales y Métodos C se centrifuga a 100.000 x g a 4ºC durante 30 min. El pellet resultante, que constituye la fracción resistente a sarkosyl, se lava dos veces en PBS, se resuspende en PBS y se almacena a -80ºC hasta su uso. 6. PREPARACIÓN DE ABETA MONOMÉRICO Y OLIGOMÉRICO Para la preparación de monómeros y oligómeros de Abeta, seguimos el procedimiento usado por Ojha et al. (2011). Partimos de un vial con 0.5 mg del péptido Abeta42 (AnaSpec), que se disuelve en 100 µl de HFIP (1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol; Sigma) y se incuba a 4ºC durante 1 h con agitación suave. A continuación, se separan 5 alícuotas de 20 µl y se evapora el HFIP en un concentrador de vacío (Jouan RC10.22; Thermo Fisher Scientific) durante 20 min. El pellet de cada alícuota se disuelve en 4.43 µl de DMSO y se incuba 15 min a temperatura ambiente. Posteriormente, añadimos 223.5 µl de PBS para conseguir una concentración final de 100 µM de Abeta. Si lo incubamos a 4ºC en agitación suave durante 24 h, obtendremos Abeta oligomérico. 7. ENSAYO DE TOXICIDAD EN CULTIVOS CELULARES, MEDIANTE CITOMETRÍA DE FLUJO Para este ensayo, los tratamientos se realizan utilizando el medio correspondiente de cada tipo celular (Apartado 3), en placas de 24 pocillos y en ausencia de SFB, para no interferir en la supervivencia celular. Utilizamos una concentración de 0.1 µg/µl en el caso de los tratamientos con las fracciones solubles (S1) y estaurosporina (Sigma) a 1.2 µg/ml, como control positivo de apoptosis celular. En los ensayos de inhibición de caspasas, se añade el inhibidor z-VAD-FMK (Sigma) durante 30 min antes del tratamiento con S1. Tras 3-12 horas de tratamiento, se recogen todas las células (en suspensión y adheridas a la superficie de la placa) y se determina la viabilidad mediante el kit Annexin V‐FITC Apoptosis Detection Kit (Immunostep) y el citómetro de flujo BD Canto II, analizando los resultados con el software FACS DivaTM (BD Bioscience). Este kit se basa en un doble marcaje con Anexina V, conjugada con FITC (fluoresceína-5 isotiocianato) y que tiene gran afinidad por la fosfatidilserina que queda expuesta hacia el exterior de las células durante el proceso de apoptosis; y con ioduro de propidio (IP), que permite conocer la integridad de la membrana plasmática. En necrosis y apoptosis tardía, se pierde la integridad de membrana y el IP puede acceder al núcleo celular y unirse al ADN. Por lo tanto, el marcaje simultáneo con PI y Anexina V permite discriminar y cuantificar las células viables (AnexinaV-/IP-), las células en apoptosis temprana (AnexinaV+/IP-), las células en apoptosis tardía (AnexinaV+/PIP+) y las células necróticas (AnexinaV-/PI+). 8. ENSAYO DE ESTIMULACIÓN DE CULTIVOS CELULARES Para evaluar la estimulación microglial in vitro , los cultivos de microglía primaria, procedentes de animales WT o de animales Trem2KO, se tratan con LPS (1 mg/ml), monómeros u oligómeros de Abeta 55 Materiales y Métodos C (10 µM) (ver Apartado 6) durante 3 o 24 horas en medio de cultivos mixtos sin SFB. Seguidamente, se retira el medio y se recogen las células añadiéndoles el reactivo TRIsureTM (Bioline). Posteriormente, se extraen el ARN y las proteínas siguiendo el protocolo descrito en el Apartado 9. Una vez obtenido el ADNc (Apartado 13), medimos mediante qPCR (Apartado 14) marcadores de estimulación de interés, como interluquina-1-beta (IL1β), interluquina-6 (IL6) o TNFα. 9. AISLAMIENTO DE ARN Y PROTEÍNAS El método empleado para la extracción de ARN y proteínas se basa en la diferente solubilidad de las distintas biomoléculas (ARN, ADN, proteínas y lípidos) en disolventes orgánicos. Se utilizan los reactivos Tripure® (Roche) o TRIsureTM (Bioline), indistintamente. Ambos contienen tiocianato de guanidina, un agente caotrópico que rompe las membranas y desnaturaliza las proteínas, incluyendo proteasas, ADNasas y ARNasas. Para garantizar una extracción de ARN óptima, es necesario minimizar la actividad ribonucleasa por lo que rutinariamente tratamos el agua con dietilpirocarbonato (DEPC; Sigma) a una concentración del 0.1% (p/v) (Fedorcsak y Ehrenberg, 1966), durante 12 horas. Seguidamente, se elimina el DEPC en exceso por tratamiento térmico, ya que éste puede alterar el ARN por carboximetilación. Todos los reactivos y material fungible utilizados se adquieren libres de ARNasas. Cuando trabajamos con tejidos, es necesaria una homogenización de la muestra con un dispersador (Polytron; Heidoph), durante 15 segundos a máxima potencia. El proceso comienza añadiendo 1 ml del reactivo Tripure® ó TRIsureTM por cada 50-100 mg de tejido, o 0.5 ml de Tripure® ó TRIsureTM por cada 106 células de cultivo o aisladas de tejido, aproximadamente. A continuación, el homogenizado se incuba 10 min a temperatura ambiente para permitir una disociación completa de los complejos núcleoproteicos. Posteriormente, se añade cloroformo (Sigma) (0.2 ml por ml inicial de Tripure® añadido), se agita fuertemente y se deja incubar a temperatura ambiente durante 5 min. A continuación, se centrifuga a 12000 x g a 4ºC durante 15 min, obteniéndose una solución trifásica: la fase superior acuosa corresponde al ARN y las proteínas, lípidos y ADN se encuentran en la interfase y fase inferior orgánica. Por tanto, podemos aislar tanto el ARN como las proteínas, las cuales se encuentran desnaturalizadas, por lo que solamente pueden utilizarse para estudios en Western-blot (WB) (Apartado 11). 9.1. Aislamiento de ARN Se extrae la fase superior acuosa cuidadosamente y se le añade una mezcla de isopropanol (Sigma) y glicógeno (Thermo Scientific) (0.6 µl glicógeno en 750 µl de isopropanol, si hemos partido de 1 ml de Tripure®), que ayudará a la precipitación del ARN, incubándolo a -20ºC durante toda la noche. Al día siguiente, se incuba a temperatura ambiente durante 10 min, y se centrifuga a 12000 x g a 4ºC 15 min. El pellet de ARN obtenido se lava con etanol (Scharlau) preparado al 75% (v/v) en agua tratada con 56 Materiales y Métodos C DEPC. Seguidamente, se vuelve a centrifugar a 12000 x g a 4ºC 15 min y, por último, el pellet obtenido se deja secar y se resuspende en agua tratada con DEPC. Por otra parte, en cuanto a las muestras humanas, éstas no han sido obtenidas en las condiciones idóneas para obtener ARN de alta integridad. Las necropsias no son inmediatas, como puede ocurrir con las muestras de células o de modelos, y el tejido humano es almacenado en los Bancos de Tejidos durante varios años. En consecuencia, hemos empleado el protocolo comercial del RNeasy Mini Kit (Quiagen), que garantiza mejores resultados en cuanto a purificación e integridad del ARN. De forma breve, una vez extraída la fase acuosa, añadimos 0.7 ml de etanol (Scharlau) al 75% en agua tratada con DEPC, incubándolo a -20ºC durante 6-12 horas. Seguidamente, transferimos la muestra a una columna, donde quedará retenido el ARN. Realizamos diferentes lavados para eliminar cualquier tipo de contaminación y, finalmente, el ARN se eluye en 50 μl de agua tratada con DEPC. En ambos casos, el ARN purificado se cuantifica en un espectrofotómetro (NanoDrop; Thermo Scientific), aprovechando la capacidad de las bases nitrogenadas de absorber a una longitud de onda de 260 nm. Además, es conveniente determinar la razón de absorbancia 260 nm/ 280 nm (longitud de onda a la que absorben los aminoácidos aromáticos); una razón de 2.1 indica que la muestra de ARN no presenta prácticamente contaminación por proteínas. Para comprobar la integridad del ARN purificado, utilizamos Agilent RNA 6000 Nano Kit (Agilent Technologies) como soporte electroforético y Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies) como instrumento de detección y análisis. Este sistema permite llevar a cabo una electroforesis en gel mediante el uso de un chip, sobre el cual se carga la matriz del gel, el fluoróforo para la visualización del ARN y la muestra correspondiente. Tras la electroforesis, el sistema de análisis recoge la fluorescencia emitida por la muestra, que ha sido estimulada con láser, creando un electroferograma (fluorescencia/tiempo). El electroferograma proporciona el RIN (del inglés, RNA Integrity Number ), que establece una clasificación numérica de la calidad del ARN que comprende valores del 1 al 10, de degradado a perfectamente conservado. Una vez se ha purificado, cuantificado y comprobado su integridad, el ARN es almacenado a –80ºC. 9.2. Aislamiento de proteínas totales Partiendo de la solución trifásica anterior, utilizamos las fase intermedia y orgánica inferior para extraer proteínas. En primer lugar, se precipita el ADN genómico añadiendo etanol al 100%, (0.3 ml por cada ml inicial de Tripure). Se mezcla por inversión repetida y se incuba 2-3 min a temperatura ambiente. Se centrifuga a 2000 x g a 4°C 5 min y se recupera el sobrenadante (donde están las proteínas) en un tubo 57 Materiales y Métodos C nuevo. A continuación, las proteínas se precipitan con isopropanol (1.5 ml de isopropanol por cada ml de reactivo Tripure inicial), se agita invirtiendo el tubo varias veces, se incuba 10-15 min a temperatura ambiente y se centrifuga a 12000 x g a 4ºC 10 min. El precipitado se lava con guanidina (Sigma) 0.3 M en 95% (v/v) de etanol (2 ml por cada ml de Tripure), se agita fuertemente y se incuba 20 min a temperatura ambiente, para después centrifugar a 7500 x g a 4ºC 5 min. Este proceso se repite dos veces más y luego se realiza un último lavado con etanol absoluto para eliminar los restos de guanidina. Finalmente, se deja secar el precipitado hasta que se evapore todo el alcohol. Para solubilizar las proteínas, el precipitado se resuspende en SDS 4% (Applichem) - urea 8M (Applichem) y se deja incubando toda la noche en agitación a temperatura ambiente. Las proteínas solubilizadas se congelan en diferentes alícuotas a -20ºC hasta su uso. 10. CUANTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS: MÉTODO DE LOWRY La determinación de la concentración de proteínas se realiza mediante el método de Lowry (Lowry et al., 1951). La curva patrón se construye usando BSA (Sigma) con un rango de sensibilidad de 10-100 µg, y la absorbancia se determina a 750 nm. Para cuantificar proteínas solubilizadas en SDS 4%-urea 8M, se añade a la curva patrón el mismo porcentaje de urea y SDS que presentan las diluciones de las proteínas (normalmente 1:10). Por otra parte, para cuantificar muestras con bajo contenido en proteínas, se utiliza una variante denominada micro-lowry (modificación de Fryer et al., 1986) y la curva patrón se hace en un rango de 1 a 10 µg. En cualquier caso, a cada reacción se le añade la mezcla cobre-tartrato, en una razón 1:1:100 de CuSO4 al 5% (Panreac), NaKTartrato al 10% (Sigma) y Na2CO3 al 10% (Panreac) en NaOH 0.5 N y se incuba a temperatura ambiente durante 10 min. A continuación, añadimos el reactivo de Folin&Ciocalteu (Sigma) diluido en agua (1:1), e incubamos a temperatura ambiente 20 min. Finalmente, se lee la absorbancia de cada muestra a una longitud de onda de 595 nm y se construye la curva patrón para el cálculo de la concentración de proteínas en cada muestra. 11. WESTERN BLOT (WB) 11.1. Fundamento Esta técnica permite la detección y cuantificación de proteínas específicas presentes en las proteínas totales extraídas en función de su movilidad electroforética, lo que depende de su tamaño. Se utilizan geles de poliacrilamida (PAGE) en condiciones desnaturalizantes siguiendo el método de Laemmli (Laemmli, 1970). Esta electroforesis tiene lugar en presencia del detergente aniónico dodecisulfato sódico (SDS; Panreac), que dispersa agregados proteicos y desnaturaliza las proteínas. Por otra parte, su presencia, tanto en los geles como en los tampones de electroforesis y transferencia, garantiza que las proteínas se encuentren desnaturalizadas y cargadas negativamente, lo que nos permite diferenciarlas 58 Materiales y Métodos C exclusivamente en función de su tamaño. La poliacrilamida se forma a partir de la copolimerización entre los reactivos acrilamida (Serva) y bis-acrilamida (N,N'-metilén-bis-acrilamida; Sigma), en presencia de PSA (persulfato de amonio; Sigma), que actúa como catalizador de la polimerización, y TEMED (Tetrametiletilendiamina; Sigma), que inicia la reacción. En estos geles, podemos variar el diámetro de poro, cambiando las concentraciones de acrilamida y bis-acrilamida, para resolver proteínas de diferentes tamaños. En este Trabajo, los geles preparados han variado entre 10, 12 o 14% de acrilamida. 11.2. Procedimiento Para llevar a cabo la electroforesis, las proteínas deben estar preparadas en un tampón de carga: SDS 2.3%, beta-mercaptoetanol (Sigma) 10%, glicerol (Sigma) 20% y azul de bromofenol (Sigma) 0.005%, en tampón 10 mM Tris-HCl a pH 6.8. Para la preparación del gel, usamos el sistema Mini Protean 3 (Bio- Rad) que permite preparar geles a la concentración deseada, combinando los reactivos descritos anteriormente, y con el número de pocillos necesarios según las condiciones de cada experimento (normalmente 15 pocillos). La electroforesis se lleva a cabo en tampón 25 mM Tris-HCl a pH 8.4 con Glicina 0.19 M (Applichem) y SDS 0.1% (p/v), sometiéndola a un voltaje constante de 90-120 V. En el caso de proteínas de muy bajo peso molecular, como por ejemplo el péptido Abeta (4.5 kDa), hemos optado por utilizar geles de poliacrilamida al 16% junto con un tampón de electroforesis que contiene 100 mM tricina (Applichem), pH 8.45. A continuación, transferimos las proteínas retenidas en el gel de poliacrilamida a una membrana, que puede ser de nitrocelulosa (Hybond-C extra, Amersham) o de PVDF (Inmobilon-P, Millipore), ambas con 0.45 µm de diámetro de poro. Utilizamos un soporte que nos permite realizar la transferencia sumergida en el tampón de transferencia [glicina 190 mM, metanol 20% (v/v) (Scharlau), SDS 0.005%, en 25 mM Tris-HCl, pH 8.4]; a 310 mA constantes durante 60-120 min. Al terminar, teñimos la membrana con solución de Rojo Ponceau´s (Sigma), preparado al 0.1% con ácido acético 5% (Panreac) en agua, para comprobar que las proteínas se han transferido correctamente. Después, lavamos con TPBS [Tween-20 (Sigma) 0.1% (v/v) en PBS] y realizamos el bloqueo con leche desnatada (BioRad) al 5% en TPBS, durante 30-60 min a temperatura ambiente. En caso de usar una membrana de PVDF, es necesario activarla sumergiéndola en metanol antes de usarla para la transferencia, y hervirla en PBS durante 5 min antes de bloquearla. Tras el bloqueo, la membrana se incuba con el anticuerpo primario (Tabla C.3) correspondiente en TPBS, durante toda la noche a 4ºC. Al día siguiente, retiramos el exceso de anticuerpo con tres lavados de 5 min de TPBS. Seguidamente, incubamos 1 hora a temperatura ambiente con el anticuerpo secundario correspondiente (Cell Signalling), que está unido a la peroxidasa de rábano (HRP). Volvemos a lavar con TPBS y, para visualizar las proteínas marcadas, usamos el reactivo Pierce ECL 2 Western Blotting 59 Materiales y Métodos C Substrate (Termo Scientific) que contiene el sustrato de la peroxidasa. Finalmente, mediante el sistema de captación Chemidoc Touch (Imaging System), recogemos la señal quimioluminiscente producida, que será proporcional a la cantidad de proteína específica de la muestra. La intensidad de las bandas se cuantifica utilizando el software Image Lab (BioRad). ANTICUERPO PROTEÍNA / ANTÍGENO DIANA ESPECIE HUÉSPED DILUCIÓN TAMAÑO BANDA PROVEEDOR Anticuerpos primarios 82E1 Abeta Ratón 1/6000 4,5 KDa IBL 6E10 Abeta Ratón 1/6000 4,5 kDa Palex AT8 Fosfo-tau (Ser199/202- Thr205) Ratón 1/1000 50-80 kDa Thermo Scientific AT100 Fosfo-tau (Thr212- Ser214) Ratón 1/1000 50-80 kDa Innogenetics AT180 Fosfo-tau (Thr231) Ratón 1/1000 50-80 kDa Thermo Scientific ATP sintasa beta Subunidad beta de la ATP sinatasa Ratón 1/1000 50 kDa BD Bioscences Caspasa 3 Caspasa 3 escindida (activa) Conejo 1/1000 17 kDa Cell Signalling Caspasa 8 Caspasa 8 escindida (activa) Conejo 1/1000 17 kDa Cell Signalling Caspasa 9 Caspasa 9 escindida (activa) Conejo 1/1000 38 kDa Cell Signalling HIF1α Subunidad alfa del factor 1 inducible por hipoxia Conejo 1/100 110-120 kDa Cayman NDUFS2 Subunidad del complejo NADH deshidrogenasa Conejo 1/1000 52 kDa Abcam PSD95 Proteína de densidad Postsináptica Conejo 1/1000 95 kDa Cell Signalling OC Abeta (Formas fibrilares) Conejo 1/5000 86 kDa Merck-Millipore 60 Materiales y Métodos C RPL26 L26 proteína ribosomal 60S Conejo 1/1000 20 kDa Sigma SDHA Complejo succinato deshidrogenasa, subunidad A Ratón 1/1000 70 kDa Abcam Sinaptofisina Proteína de densidad Presináptica Conejo 1/1000 38 kDa Synaptic Systems TAU12 Tau (total) Ratón 1/1000 50-80 kDa Merck-Millipore TAU46 Tau (total) Ratón 1/1000 50-80 kDa Cell Signalling VGAT Transportador GABA vesicular Conejo 1/5000 50-60 kDa Synaptic Systems VGLUT Transportador glutamato vesicular Conejo 1/2000 50 kDa Synaptic Systems beta-Actina Housekeeping protein Ratón 1/10000 42 kDa Sigma-Aldrich Gapdh Housekeeping protein Conejo 1/1000 37 kDa Cell Signalling Anticuerpos secundarios Anti-IgG conejo Secundario (HRP) Caballo 1/10000 - Cell Signalling Anti-IgG ratón Secundario (HRP) Cabra 1/10000 - Cell Signalling Tabla C.3. Relación de anticuerpos utilizados en Western-Blot. Se detalla el antígeno diana, la especie huésped, la dilución utilizada y el peso molecular esperable. 12. ELECTROFORESIS E INMUNOENSAYO EN CAPILAR La electroforesis en capilar se realiza utilizando el aparato Jess (Bio-Techne), que cuenta con numerosas ventajas: alta eficiencia de separación, sensibilidad, y menor consumo de muestra respecto al WB convencional (3 µl de muestra frente a 7.5-15 µl). Tras la separación en la matriz, las proteínas son inmovilizadas para el inmunoensayo y la detección. Para realizar la técnica, se utilizan los reactivos del Kit Jess-Protein Simple (Bio-Techne) y se siguen las indicaciones facilitadas. Brevemente, se preparan: (i) las muestras (se diluyen a la concentración adecuada y se les añade la Master Mix), (ii) los anticuerpos primarios y secundarios, diluidos a la concentración adecuada en el buffer “Antibody diluyent”; (iii) el reactivo de detección en los casos de quimiolumiscencia (luminol-peroxidasa); y (iv) el marcador de peso molecular biotinilado. Los diferentes compuestos y la solución de lavado se cargan en la placa proporcionada, que posteriormente se centrifuga a 1000 x g 5 min y se introduce en el aparato Jess. Por otro lado, también se introduce el cartucho de capilares, en nuestro caso, un cartucho de 25 capilares 61 Materiales y Métodos C con una matriz de 12-230 kDa (Bio-Techne) (Figura C.3). Para la configuración y análisis del ensayo se utiliza el software Compass for Simple Western (Protein Simple). Para la puesta a punto de cada ensayo, es necesario determinar la concentración de la muestra y de los anticuerpos primarios y secundarios, el tiempo de carga de la muestra en la matriz y los tiempos de incubación con cada uno de los anticuerpos. Una vez optimizado, esta tecnología permite la medida simultánea de varios anticuerpos, incluso con el mismo peso molecular, gracias a su triple sistema de detección (quimioluminiscencia y dos canales de fluorescencia). Figura C.4. Inmunoblot capilar en el dispositivo Jess (Bio-Techne). (A) Diagrama de flujo del ensayo de inmunoblot. (B) Introducción de la placa, que contiene las muestras y los reactivos, y del cartucho de capilares en el dispositivo. 13. RETROTRANSCRIPCIÓN La retrotranscripción permite obtener ADN complementario (ADNc) a partir de ARN mensajero (ARNm). El ADNc es una biomolécula más estable que permite un manejo más seguro de la muestra. Se forma a partir de un molde de ARN en presencia de un cebador mediante la actividad de la enzima transcriptasa inversa, que sintetiza una hebra de ADN complementaria y genera un híbrido ARN-ADN, el cual, por degradación del ARN, quedará como ADN monocatenario. Para la reacción de retrotranscripción, partimos del RNA resuspendido en agua con DEPC (ver Apartado 9.1) y utilizamos el “High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit” (Applied Biosystem), que contiene: mezcla de cebadores aleatorios, mezcla de desoxirribonucleótidos (dNTP), enzima transcriptasa inversa y tampón de retrotranscripción, que asegura unas condiciones óptimas para el funcionamiento de la enzima. La combinación de estos reactivos, siguiendo las especificaciones indicadas en la Tabla C.4, da Placa con muestra y reactivos Cartucho con capilares A B 62 Materiales y Métodos C lugar a una mezcla de reacción que se mezcla con nuestro ARNm en una proporción 1:1. Para que tenga lugar la reacción, la muestra se incuba en un termociclador (MasterCycler Gradient, Eppendorf), durante 10 min a 25ºC, para permitir la hibridación de los cebadores con su secuencia complementaria, seguido de 2 h a 37ºC, para que tenga lugar la retrotranscripción. El ADNc obtenido se conserva a -20ºC hasta su utilización. Reactivos Volumen de la mezcla de reacción Concentración final Cebadores aleatorios (10X) 20% 2X Tampón de Retrotranscripción (10X) 20% 2X Mezcla de Desoxirribonucleótidos (dNTP) (25X) 8% 2X Enzima Transcriptasa Inversa (50 U/μl) 10% 5 U/μl H2O tratada con DEPC 42% - Tabla C.4. Relación de los reactivos para la retrotranscripción (Applied Biosystems). Se indica el porcentaje del volumen total que supone cada uno de ellos en la mezcla de reacción y la concentración final de los mismos. 14. qPCR EN TIEMPO REAL 14.1. Fundamento La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es una técnica con numerosas aplicaciones y alta sensibilidad. Se denomina RT-PCR cuando se parte de ADNc, obtenido a partir de ARNm mediante retrotranscripción (Apartado 13). En la PCR cuantitativa (qPCR) a tiempo real, el análisis de las muestras amplificadas tiene lugar durante la reacción, monitorizando una señal fluorescente asociada al producto de cada ciclo. Durante el transcurso de este Trabajo hemos empleado dos métodos para la cuantificación del ARNm. Por un lado, hemos utilizado cebadores específicos junto con el fluoróforo de unión al ADN bicatenario SYBR-green I. Este fluoróforo emite poca fluorescencia mientras está en solución o cuando el ADN se encuentra desnaturalizado (monocatenario). Sin embargo, durante la etapa de elongación, cantidades crecientes del mismo se intercalan en la doble cadena de ADN que se está sintetizando, provocando un aumento en su fluorescencia de hasta 100 veces. El incremento de ADN en cada ciclo se refleja en un aumento proporcional de la fluorescencia emitida por SYBR-green I. El complejo resultante ADN-SYBR green I absorbe a una longitud de onda (λ) de 497 nm y emite a 520 nm. El principal inconveniente de este tipo de fluoróforos es su baja especificidad, debido a que se unen de manera indiscriminada a cualquier fragmento de ADN bicatenario, como productos generados inespecíficamente o dímeros de 63 Materiales y Métodos C cebadores. Con la finalidad de minimizar la inespecificidad, se deben emplear condiciones de reacción óptimas y cebadores diseñados para ser lo más específicos posible para la diana, a la vez que no sean complementarios entre sí. Por otra parte, también es recomendable iniciar la reacción de síntesis de ADN a temperaturas elevadas (hot-start PCR), lo cual disminuye el riesgo de amplificaciones inespecíficas. Para el diseño de cebadores, en primer lugar, obtenemos la secuencia del gen de estudio de PubMed.gov (U.S. National Library of Medicine and National Institutes of Health; www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez). La secuencia obtenida se introduce en el programa informático Primer Express v2.0 (Applied Biosystems) que nos permite escoger entre las mejores opciones de pares de cebadores posibles, optimizados para PCR a tiempo real. Para comprobar la especificidad del cebador, determinamos la temperatura de hibridación (Tm) de los fragmentos amplificados durante la PCR en un proceso denominado curva de disociación. Cada fragmento amplificado tiene una Tm característica, que depende principalmente de su longitud y del porcentaje en G+C. Los productos de PCR de diferente longitud y porcentaje en G+C tienen temperaturas de hibridación distintas y, por lo tanto, se observa más de una caída drástica de la fluorescencia emitida en función de la temperatura. Cuando se representa la derivada de la fluorescencia con respecto a la temperatura (-dF/dT), podemos observar un pico si el producto de PCR contenía un único producto de amplificación, o más de uno si durante la PCR se han amplificado también regiones inespecíficas. De esta forma, comprobamos la especificidad del cebador, previamente a su uso. Por otro lado, el segundo método utilizado para cuantificar la expresión de ARNm en este Trabajo consiste en el uso de sondas de hidrólisis o sondas Taqman, que permiten la detección exclusiva de secuencias específicas. Se trata de oligonucleótidos de 20-24 bases de longitud, que se unen complementariamente a una secuencia interna dentro del fragmento de ADN a amplificar. Estas sondas están marcadas en el extremo 5’ con un fluoróforo donador (reporter), como FAM, y en el extremo 3’ con un aceptor o sustancia absorbente (quencher), normalmente TAMRA, que absorbe la fluorescencia liberada por el donador. De esta forma, el espectro de emisión del primero ha de solapar con el espectro de absorción del segundo. Mientras que la sonda está intacta, no se detecta fluorescencia ya que la energía se transfiere vía FRET (Fluorescent Resonance Energy Transfer) del fluoróforo de baja longitud de onda (reporter) al fluoróforo de alta longitud en el otro extremo (quencher), apantallando la fluorescencia. Durante la fase de elongación, la sonda que ha hibridado con su secuencia complementaria está unida a una cadena simple de ADN, y flanqueada por cebadores específicos. Cuando la Taq-polimerasa alcanza la sonda, su actividad exonucleasa 5’-3’ libera al fluoróforo donador, que comienza a emitir fluorescencia al estar separado del quencher. Esta fluorescencia es captada por el detector, siendo su intensidad proporcional a la presencia de secuencias diana en la muestra. 70 Materiales y Métodos C a temperatura ambiente de nuevo, se realizan tres lavados con PBS-0.1% Tritón y se incuba con el anticuerpo secundario (ver Tabla C.7) diluido en 0.1% Tritón 1% BSA, durante 1 hora. Seguidamente, se realizan tres lavados en PBS-0.1% Tritón, un lavado con H2Od y se procede al montaje de las secciones en portaobjetos (Labbox), utilizando glicerol al 50% en H2Od como medio de montaje. 16.3. Anticuerpos utilizados En la Tabla C.7 se detallan las características de los anticuerpos utilizados para los diferentes estudios inmunohistoquímicos. ANTICUERPO (nomenclatura) PROTEÍNA / ANTÍGENO DIANA ESPECIE HUÉSPED DILUCIÓN PROVEEDOR Anticuerpos primarios AT8 Fosfo-tau (Ser199/202-Thr205) Ratón 1/1000 Thermo Scientific CD45 Receptor de membrana. Marcador de microglía activa Ratón 1/1000 Bio-Rad CD68 Glucoproteína de membrana situada en lisosomas, endosomas y superficie celular, que interviene en la fagocitosis. Marcador de microglía activa. Conejo 1/1000 Abcam Gfap Proteína ácida fibrilar glial. Marcador de astrocito activo. Conejo 1/10000 Dako Iba1 Ionized calcium binding adapter molecule . Marcador de microglía homeostática. Conejo 1/1000 SYSY Iba1 Ionized calcium binding adapter molecule . Marcador de microglía homeostática. Conejo 1/1000 Wako (estudios en muestras humanas) 71 Materiales y Métodos C Trem2 Triggering receptor expressed on myeloid cells 2. Marcador de microglía activa Oveja 1/100 R&D Systems Bio-Techne Abeta14-24 (clon 4G8) Abeta Ratón 1/2000 BioLegend TioS Tiofalvina-S - 0.005% Sigma Anticuerpos secundarios Anti-IgG Conejo Secundario biotinilado Cabra 1/500 Vector Lab Anti-IgG Ratón Secundario biotinilado Cabra 1/500 Vector Lab Anti-IgG Conejo Fluoróforos AF488 y AF564 Burro 1/500 Molecular Probes Anti-IgG Ratón Fluoróforos AF488 y AF564 Burro 1/500 Molecular Probes Anti-IgG Oveja Fluoróforo AF488 Burro 1/500 Abcam Tabla C.7. Relación de anticuerpos utilizados para histología. Se detalla el antígeno diana, la especie huésped, la dilución utilizada y el proveedor. 16.4. Cuantificaciones inmunohistoquímicas El estudio del número de células microgliales por placa en los ratones APP/PS1 en condiciones de normoxia e hipoxia se ha realizado en colaboración con el grupo de investigación del Dr. Alberto Pascual. Las placas de Abeta de corteza e hipocampo, teñidas con TioS, se seleccionan de forma aleatoria, sin conocer el tratamiento recibido por el animal en cada muestra (n=4/grupo). Las cuantificaciones se realizan en superimágenes generadas mediante el sistema NewCast (Visiopharm) asociado al microscopio BX61 (Olympus) del Servicio de Microscopía del Instituto de Biomedicina de Sevilla. El número de células microgliales se obtiene mediante el marcaje Iba1+. La cuantificación de la superficie de placas amiloides cubiertas por células microgliales en muestras humanas post mortem se ha realizado en colaboración con el grupo de investigación de la Dra. Antonia Gutiérrez. Consideramos la cobertura microglial de la placa como el porcentaje de área teñida por Iba1 en relación al área periplaca (círculo a 30 µm de los bordes de la placa). Las imágenes Iba1/4G8 se adquieren mediante el microscopio automático Olympus VS120, conectado al microscopio óptico Olympus BX61VS acoplado a una cámara digital a color de alta resolución (VC50 Olympus). Para la adquisición de las imágenes se utiliza el software Olyvia 2.6 (Olympus, Dinamarca), obteniéndose imágenes de 1654 pixel x 877 pixel; donde el tamaño de pixel es 28.34 pixel/cm. Las imágenes digitales 72 Materiales y Métodos C (n=3 individuos Braak V-VI) se procesan mediante el sistema de análisis de imagen Visilog 6.3 (Noesis, Francia). La señal Iba1+ se convierte en escala de grises (8 bits) y se identifica estableciendo un nivel umbral (120-130) mantenido en todas las secciones. Finalmente, se mide el área periplaca Iba1+ y se considera el índice de protección como el ratio entre Iba1/Abeta. Para la cuantificación de neuritas distróficas (fosfo-Tau, AT8+), se seleccionan aleatoriamente placas de Abeta TioS+ y el área TioS+ y fosfo-Tau+ se estima mediante el software Fiji (Image J) en placas individuales. Los resultados se presentan como el porcentaje del área fosfo-Tau+ respecto al área de placa. 17. MICROSCOPIA ELECTRÓNICA DE TRANSMISIÓN Los estudios de microscopía electrónico de transmisión (MET) se han realizado en colaboración con el laboratorio de la Dra. Antonia Gutierrez. Los ratones se perfunden transcardialmente, además de con PBS para drenar la sangre, con 180 ml de solución fijadora, compuesta por paraformaldehído al 4%, L- lisina 75 mM y meta-peryodato sódico 10 mM en tampón fosfato (PB) 0.1 M y pH 7,4 durante 30 min. A continuación, se extraen los cerebros, se postfijan por inmersión en la misma solución fijadora durante una noche a 4ºC y se cortan en secciones coronales de 100-150 µm en un vibratomo. Seguidamente, las secciones se fijan con la solución de tetróxido de osmio 1% (Electron Microscopic Sciences) en tampón fosfato PB [NaH2PO4 0.1M + NaHPO4 0.1M, pH 7.4], a 4°C durante 20 min y en oscuridad, se lavan con PBS 0,1M, se deshidratan en etanol y se incluyen en plano en resina Araldite (EMS, USA) (Gomez- Arboleda, 2017). Las áreas seleccionadas se cortan en secciones ultrafinas mediante un ultramicrotomo, se tiñen con acetato de uranilo y citrato de plomo y se examinan al microscopio electrónico JEOL JEM 1400 de los Servicios Centrales de Apoyo a la Investigación de la Universidad de Málaga. La cuantificación de la morfología mitocondrial se realiza mediante el software Fiji midiendo el área, perímetro y los ejes mayor y menor. Se utiliza la función “Fit Ellipse” para calcular los ejes. Se calculan los siguientes parámetros: (i) circularidad (4π*area/perimeter^2), donde un valor de 1.0 equivale a un círculo perfecto y a medida que nos aproximamos a valores de 0.0 se infiere una forma elongada; y (ii) ratio de aspecto: ejes mayores/ejes menores. 18. ENSAYO DE MEDIDA DE LOS NIVELES DE ATP La medida de los niveles de ATP se realiza utilizando el kit “ATP Molecular Probes” (ThermoFisher) que permite su determinación cuantitativa mediante bioluminiscencia, en presencia de luciferasa de luciérnaga recombinante y su sustrato D-luciferina, siguiendo la siguiente reacción: Luciferina + ATP + O2  Oxiluciferina+ AMP+ Pi+ CO2 + luz (emisión máxima a 560 nm). Hemos realizado este ensayo en células BV2 control y tratadas con S1 procedente de ratones ThyTAU22 de 12 meses (0.1 µg/µl) durante 3 o 6 horas en el medio de cultivo correspondiente, sin SFB. Una vez 73 Materiales y Métodos C finalizado el tratamiento, hemos utilizado un raspador para recoger las células en 350 µl de PBS, destinando 50 µl para el contaje del número de células, que será necesario para la normalización del ensayo. El resto del volumen se sonica a máxima potencia durante 10 seg 3 veces, dejando 1 min entre una sonicación y la siguiente y manteniendo las muestras en hielo. A continuación, se centrifuga a 14000 x g durante 10 min y se procede al ensayo, siguiendo las indicaciones del kit. Brevemente, se preparan los estándares de ATP y la mezcla de reacción, que se añade tanto a los estándares como a las muestras de interés (140 µl de mezcla de reacción y 10 µl de muestra). Se incuba durante 15 min a temperatura ambiente en oscuridad. La lectura de la luminiscencia se realiza en placas de 96 pocillos blancas con fondo plano (ThermoFisher) en el aparato Synergy HT (Biotek). La concentración de ATP de las muestras se extrapola a partir de la curva estándar construida. 19. ENSAYO DE PROLIFERACIÓN EDU 19.1. Fundamento El método más óptimo para medir proliferación celular es la medida directa de la síntesis de ADN. Para ello, anteriormente se utilizaban nucleósidos radioactivos, como la 3H-timidina. Posteriormente, esta aproximación fue reemplazada por el uso del nucleósido bromo-deoxiuridina (BrdU). El EdU (5-etinil-2’- deoxiuridina) es un análogo de la tiamina que se incorpora al ADN durante su síntesis activa y constituye una alternativa más reciente al BrdU. La detección del EdU se basa en una reacción tipo click , catalizada por cobre (I), entre el residuo alcano de la molécula EdU y la azida presente en el reactivo de detección, de manera que se forma un anillo estable de triazol (Figura C.5 A). Esta reacción es muy eficiente, sensible, con bajo background y fácilmente detectable mediante citometría de flujo, fluorimetría o microscopía de fluorescencia. El pequeño tamaño de la azida requerida para la detección permite la lectura del EdU en condiciones suaves, en contraste con la severa desnaturalización del ADN requerida para los ensayos con BrdU (Figura C.5 B). Para la detección del BrdU se requiere HCl, DNasa o elevadas temperaturas para permitir el acceso del anticuerpo de detección al complejo BrdU-ADN. Por tanto, la eliminación del proceso de desnaturalización en el ensayo con EdU permite obtener resultados más reproducibles. 74 Materiales y Métodos C Figura C.7. Detección del agente intercalante de ADN EdU y comparación con el BrdU. (A) Diagrama de la detección del EdU incorporado al ADN. Se produce una reacción tipo click entre el residuo alcano de la molécula EdU y la azida del compuesto de detección. (B) Comparación de la accesibilidad de la molécula de detección al agente intercalado en el ADN EdU o BrdU. 19.2. Procedimiento Para estudiar la proliferación microglial en los diferentes animales transgénicos respecto a WT, los animales son sometidos a 3 inyecciones de 1.5 mg de EdU, tal y como se describe en el Apartado 2.3.3. Al finalizar el tratamiento, se procede al sacrificio de los animales (Apartado 2.4) y se realiza el protocolo de homogenización y gradiente de Percoll, descrito en el Apartado 4.1, para el aislamiento de células microgliales. A continuación, se procede a la fijación y permeabilización de las células obtenidas utilizando el Kit comercial EdU Click-it (BCK-FC647-100, Base Click). Brevemente, se lavan las células en 1% BSA en PBS, se centrifugan (1000 x g, 4ºC durane 5 min) y el pellet se resuspende e incuba durante 15 min, protegido de la luz, en el compuesto de fijación (compuesto D). A continuación, se repite un lavado con 1% BSA en PBS y, posteriormente, las células se incuban durante 15 min con el compuesto de permeabilización, basado en saponina. Para la detección del agente intercalante EdU, se realiza una conjugación con el fluoróforo Eternon-Red 645 Azida, en una reacción tipo “click-it”, siguiendo las indicaciones del Kit. Finalmente, la suspensión celular se tiñe también con los anticuerpos específicos para la detección de microglía Anti-CD45-PE (clon HI30; Immunostep) y Anti-CD11b-CF-Blue (clon M1/70; Immunostep), ambos a una dilución 1:33, y se analiza por citometría de flujo (ver Apartado 4.4). Para la cuantificación de células microgliales proliferativas se realiza el procedimiento de selección inicial de células individuales descrito en el Apartado 4.4, y posteriormente se cuantifica el porcentaje de células CD45+/CD11b+/EdU+ (Figura C.4). CD45 CD11b Linfocitos EdU CD11b BA 75 Materiales y Métodos C Figura C.8. Cuantificación ex vivo de microglía proliferativa. Tras la selección de células individualizadas, se selecciona la población microglial (CD45+CD11b+). Dentro de la población microglial, seleccionamos las células EdU+ que se corresponden con la microglía proliferativa. 20. ENSAYO DE METABOLISMO SEAHORSE 20.1. Fundamento El fenotipo energético de la microglía primaria ha sido determinado mediante el analizador de flujo extracelular Seahorse XFp (Agilent), que permite medir la velocidad de consumo de oxígeno (OCR, del inglés oxygen consumption rate ) y la velocidad de acidificación extracelular (ECAR, del inglés extracellular acidification rate ) de células vivas en tiempo real. De esta forma, permite estudiar la respiración mitocondrial, ligada al consumo de oxígeno , así como la glucólisis, puesto que la acidificación del medio puede relacionarse con la producción de lactato por esta vía. Ambos parámetros son calculados en condiciones basales y tras la inyección de diferentes compuestos que modulan el metabolismo. En este Trabajo, se han empleado cuatro inhibidores mitocondriales de forma secuencial: oligomicina, carbonilcianuro-p-trifluorometoxifenilhidrazona (FCCP, del inglés carbonyl cyanide-4- (trifluoromethoxy) phenylhydrazone ), rotenona y antimicina A (Figura C.9). Figura C.9. Esquema de los complejos de la cadena de transporte de electrones y los inhibidores aplicados en los ensayos de Seahorse. La oligomicina inhibe a la ATP sintasa o complejo V, el FCCP desacopla el consumo de oxígeno de la producción de ATP, y la rotenona y antimicina A inhiben a los complejos I y III, respectivamente. 76 Materiales y Métodos C Tras la medida de las condiciones basales, la adición de oligomicina inhibe la ATP sintasa o complejo V mitocondrial bloqueando la conductancia de protones. Esto inhibe la fosforilación oxidativa y permite calcular la producción de ATP y la entrada pasiva de H+ a través de la membrana mitocondrial interna ( proton leak ). Posteriormente, se añade FCCP, un desacoplante mitocondrial que disipa el gradiente de protones, disminuyendo el potencial de membrana de la membrana interna de las mitocondrias. Por lo tanto, desacopla la cadena de transporte de electrones de la síntesis de ATP y conlleva la aceleración de la cadena respiratoria, incrementando el consumo de oxígeno del complejo IV a su máximo nivel. La diferencia entre el valor de OCR para FCCP y basal es una buena medida de la capacidad de la célula para responder a un aumento de demanda energética, denominada como spare respiratory capacity . Por último, se adiciona una mezcla de rotenona y antimicina A. La rotenona es un inhibidor mitocondrial que previene la transferencia de electrones desde el complejo I mitocondrial a la ubiquinona mediante el bloqueo del sitio de unión de la ubiquinona y la antimicina A interrumpe el flujo de electrones mediante la inhibición del complejo III mitocondrial. La combinación de ambos inhibe la respiración mitocondrial y permite el cálculo del consumo de oxígeno asociado a la respiración no mitocondrial y de la capacidad respiratoria máxima (Figuras C.5 y C.6). Figura C.10. Parámetros clave de la respiración mitocondrial obtenidos a partir de la OCR en condiciones basales y tras la adición de drogas que modulan el metabolismo. Se obtiene los parámetros: respiración basal, producción de ATP, proton leak, capacidad máxima respiratoria, capacidad celular y respiración no-mitocondrial. 20.2. Procedimiento En primer lugar, se aísla la microglía primaria tal y como se indica en el Apartado 3.2.1. Se cultivan 35.000 células/pocillo en una placa de cultivo específica (Seahorse XFp Cell Culture Miniplates, Agilent), previamente tratada con poli-D lisina. Las placas constan de 8 pocillos con un radio de 3.81 mm: se 77 Materiales y Métodos C cultivan células en seis de ellos, y se dejan dos pocillos sólo con medio (serán utilizados como “blancos” para el análisis posterior). La placa se mantiene 1 hora a temperatura ambiente para garantizar que las células se adhieran de forma homogénea por todo el pocillo y se incuba durante 24 horas a 37ºC en una atmósfera humidificada con un 5% de CO2. Al día siguiente, se realiza el tratamiento con oligómeros de Abeta a 10 µM (Apartado 6) en medio de cultivos mixtos sin SFB, suplementado con B27 (20 µl/mL) durante 12 o 24 horas. Tras el tratamiento, se sigue el protocolo comercial proporcionado por Agilent, utilizando los medios, reactivos y material incluidos en el Kit. De forma breve, el medio de tratamiento se sustituye, tras dos lavados, por medio Seahorse [medio Seahorse XF DMEM, suplementado con Glucosa 17,5 mM, Piruvato 0,5 mM, L-Glutamina 4,5 mM y HEPES 5 mM, pH 7,4]. Este medio está formulado en base al medio de cultivos común DMEM, pero se caracteriza por la ausencia de bicarbonato y rojo fenol. La microglía se incuba a 37ºC en una estufa (sin controlador de CO2) durante 1 h. En este tiempo, se cargan los reactivos en el cartucho de Seahorse, previamente hidratado e incubado a 37ºC con la solución calibradora. En este Trabajo, la microglía se trata con 2 µM de oligomicina, 2 µM de FCCP y 0,5 µM de rotenona y antimicina A (preparadas a partir del Seahorse XFp Cell Mito Stress Test Kit). El cartucho con las drogas se introduce en el analizador Seahorse XFp para su calibración y seguidamente se introduce la placa con la microglía. El OCR se mide cada 6 min durante 72 min y los correspondientes compuestos se inyectan de manera secuencial a intervalos de 18 min. El OCR se calcula de manera automática mediante el uso del software Seahorse XFp (Agilent). Una vez finalizadas las medidas, las células se recogen en SDS al 4% en PBS, para realizar una cuantificación de proteínas mediante WB (Apartado 11). Una vez comprobado que no existen diferencias en la cantidad de proteína entre las muestras, los resultados de OCR se han normalizado respecto a las medidas finales (medidas tras la adición de rotenona/antimicina A) para comparar los ensayos independientes. 21. ANÁLISIS ESTADÍSTICO Todos los experimentos de este Trabajo se han repetidos un mínimo de 3 veces. El método de análisis estadístico varía según las muestras empleadas y se ha desarrollado con el programa GraphPad Prism 6 (GraphPad Inc.). Para las comparaciones entre dos grupos, se ha utilizado el t-test de Student nopareado de dos colas. Para las comparaciones de más de dos grupos, se ha utilizado el test ANOVA seguido del test de comparaciones múltiples Tukey, en los casos que se ha estudiado el efecto de grupo, o seguido del test de comparaciones individuales Fisher’s LSD en caso contrario. En el estudio de las muestras humanas, los datos no siguen una distribución normal, por tanto, empleamos pruebas no paramétricas. Para comparaciones múltiples, usamos la prueba de Kruskal Wallis, seguida de un test de Dunn; y en comparaciones entre dos grupos, la prueba U de Mann Whitney. Por 78 Materiales y Métodos C otro lado, los análisis estadísticos de correlaciones entre variables se han realizado mediante el coeficiente de correlación de Spearman, seguidos por un análisis de regresión lineal. Los datos se expresan como la media ± la desviación estándar; p<0.05 se considera como significativo. Mostramos el nivel de significación de la siguiente manera: p<0,05 (*), p<0,01 (**), p<0,001 (***) o p<0,0001 (****). D. Resultados 86 Resultados D Figura D.4. La fosforilación de Tau es superior en el modelo TAU P301S que en el ThyTAU22. Inmunotinción representativa de Tau fosforilado (AT8) en secciones hipocampales de ratones de 9 meses ThyTAU22 (1–4) y TAU P301S (5–8). so, stratum oriens; sp, stratum piramidal; sr, stratum radiatum. Barras de escala: (1, 2, 5, 6) 500 µm, (3, 7) 100 µm, (4, 8) 20 µm. Romero-Molina et al., 2018. 1.3. Evaluación de la toxicidad de las especies solubles fosforiladas de Tau sobre la microglía Como ya se ha comentado, nuestro grupo de investigación ha demostrado que las formas solubles de Tau procedentes del hipocampo de enfermos de EA son tóxicas sobre cultivos microgliales (Sanchez- Mejias et al., 2016). Por ello, consideramos de interés evaluar el efecto de las fracciones solubles de ratones TAU P301S y ThyTAU22 de 9-12 meses sobre cultivos de células BV2, esperando que una mayor acumulación de fosfo-Tau soluble produzca un efecto más deletéreo sobre la microglía. En primer lugar, determinamos mediante citometría de flujo (kit Anexina/Ioduro de Propidio (IP), ver Material y Métodos, Apartado 7), la viabilidad de las células BV2 tras distintos periodos de incubación (3, 6 y 12 horas) con fracciones solubles S1 (concentración de 0.1 µg proteína/µl) procedentes de la corteza de ratones ThyTAU22 de 12 meses. Como se ilustra en la Figura D.5 A y B, la viabilidad microglial disminuye progresiva y significativamente desde las 3 horas de incubación con las fracciones solubles y queda en un 13.7 ± 10.4% a las 12 horas. El análisis detallado de los resultados de citometría de flujo tras los distintos tiempos de incubación con las fracciones S1 refleja un primer paso de las células viables (IP-/Anexina-) a apoptosis temprana (IP-/Anexina+) y finalmente a apoptosis tardía (IP+/Anexina+) (datos no mostrados). Para confirmar que el mecanismo subyacente a la muerte de las células BV2 es la apoptosis, evaluamos el procesamiento de las caspasas 3, 8 y 9 en las células recogidas tras los distintos periodos de incubación con las fracciones S1. Como se muestra en la Figura D.6 A, observamos un aumento del procesamiento, y consiguiente activación, de las caspasas 3 (fragmento escindido a 17 kDa), 8 (43 kDa) y 9 (38 kDa) tras 3 y 6 horas de tratamiento. Además, realizamos en paralelo un 2 3 4 7 86 CA1 CA1 so sp sr so sp sr sp 1 5 CA1 CA1 ThyTau22 P301S sp AT8 87 Resultados D tratamiento de 6 horas con las fracciones S1 de los ratones ThyTAU22 de 12 meses en presencia del inhibidor de caspasas z-VAD-FMK, y comprobamos que la viabilidad microglial asciende de un 16 ± 8.8% a un 83 ± 17.1% y que no se produce activación de caspasa 3 (Figura D.6 B). Por consiguiente, confirmamos que la apoptosis es el mecanismo subyacente a la muerte de las células BV2. También analizamos si la inducción de la apoptosis es debida a una depleción de las reservas de ATP en respuesta a una exacerbada activación microglial. Al medir los niveles de ATP en células BV2 tratadas con S1 de ratones ThyTAU22 durante 3 y 6 horas, no observamos cambios respecto al control (Figura D.6. C), lo que refleja que la apoptosis microglial descrita no está mediada por un desabastecimiento energético. Figura D.5. Las fracciones solubles procedentes de ratones ThyTAU22, a diferencia de las fracciones solubles de ratones TAU P301S, son tóxicas en cultivos de células BV2. Citometría de flujo representativa (A) de la viabilidad microglial in vitro (kit Ioduro de Propidio (IP)/AnexinaV) y cuantificación (B) tras 3, 6 y 12 horas de tratamiento con fracciones solubles (S1) procedentes de corteza, a menos que se indique lo contrario, de ratones ThyTAU22 y TAU P301S de 2-4 y 9-12 meses de edad (n=3-5). (C) Cuantificación del porcentaje de células BV2 viables, analizadas mediante citometría de flujo, tras 12 horas de tratamiento con diferentes concentraciones de S1 procedente de animales ThyTAU22 y TAU P301S de 2-4 y 9-12 meses de edad (n=3). Hp: hipocampo. La significancia estadística se ha analizado mediante t test. *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001,****p<0.0001. Romero-Molina et al., 2018. 2 meses 12 meses ThyTau22 P301S Ioduro de propidio Anexina V 9-12m P301S 2-4m P301S 2-4m ThyTau22 9-12m ThyTau22 Hp 9-12m P301S ug/100ul m edio % cel viables 10 20 40 0 20 40 60 80 100 Tto 12 horas V iab ilidad B V2 **** Tiem po (h) % cel viab les 1 3 6 12 0 20 40 60 80 100 V iabilidad B V 2 (0.1ug/ul) **** ** **** **** A C B 88 Resultados D Figura D.6. Mecanismo de toxicidad de las fracciones S1 de ratones ThyTAU22. (A) Activación de caspasas 3, 8 y 9 tras el tratamiento con S1 (0.1 µg/µl) de ratones ThyTAU22 de 12 meses (n=3), normalizado por el control positivo (estaurosporina 1 mM). (B) Viabilidad de células BV2 (citometría de flujo, kit IP/AnexinaV) y activación de caspasa 3 (WB representativo) tras 6 horas de tratamiento con fracciones S1 (0.1 µg/µl) de ratones ThyTAU22 de 12 meses, en presencia de distintas concentraciones (0, 20, 40 µM) del inhibidor de caspasas zVAD. (C) Niveles de ATP tras el tratamiento de células BV2 durante 3 y 6 horas con S1 (0.1 µg/µl) de ratones ThyTAU22 de 12 meses (n=3). La significancia estadística se ha analizado mediante el test de ANOVA, seguido del Test Tukey. *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, ****p<0.0001. Romero-Molina et al., 2018. Caspasa 3 c trl - c trl + S 1 3 h S 1 6 h 0.0 0.5 1.0 1.5 R elativo al con trol + ***** **** Caspasa 9 c trl - c trl + S 1 3 h S 1 6 h 0.0 0.5 1.0 1.5 R elativo al control + * Caspasa 8 c trl - c trl + S 1 3h S 1 6 h 0.0 0.5 1.0 1.5 R elativo al contro l + *** ** Ctrl - Ctrl+ 3h 6h 43 kDa 38 kDa 17 kDa Caspasa 3 Caspasa 8 Caspasa 9 B-actina 42 kDa A T P C trl - S 1 3h S 1 6h 0.000 0.002 0.004 0.006 A TP (pm o les)/cel A C S1 ThyTau 12m 6 h ctrl –ctrl + 17 kDa 20µM 40µM Caspasa 3 zVAD % cel viab les 0 M 20 M 40 M 0 20 40 60 80 100 V iabilida d B V 2 zV A D S 1 ThyTau22 12m , 6 horas ** *** B 0µM 89 Resultados D Por otro lado, evaluamos la toxicidad de fracciones solubles procedentes de ratones TAU P301S de 12 meses sobre cultivos de células BV2 (Figura D.5). Al tratarse de un modelo con mayor acumulación y fosforilación de Tau, en principio esperábamos una mayor toxicidad de sus fracciones S1 sobre la microglía. Sin embargo, la viabilidad microglial no se altera tras 12 horas de tratamiento con 0.1 µg/µl de fracciones S1 de corteza de ratones TAU P301S, ni siquiera aumentando la dosis de tratamiento (0.2 y 0.4 µg/µl) (Figura D.5 C). Como en este modelo la patología Tau es más pronunciada en hipocampo que en corteza cerebral, repetimos el tratamiento utilizando fracciones S1 procedentes de hipocampo de ratones TAU P301S de 12 meses de edad (Figura D.5 B). En este caso, sí se afecta la viabilidad microglial tras 12 horas de tratamiento, aunque en bastante menor medida que tras el tratamiento con fracciones S1 procedentes de la corteza de ratones ThyTAU22 de 12 meses. 1.4. Caracterización de las formas agregadas de Tau en los modelos murinos de tauopatía y su toxicidad sobre la microglía En el modelo TAU P301S, los niveles elevados de Tau total y fosforilado correlacionan con una importante activación microglial, pero no explican la falta de toxicidad de sus fracciones solubles sobre los cultivos microgliales, más aún si se comparan con la toxicidad de las fracciones S1 del modelo ThyTAU22, con niveles considerablemente menores de las formas de Tau analizadas en el extracto total. Ante esta discrepancia, nos planteamos la posibilidad de que ambos modelos tuvieran un patrón distinto de agregación de Tau, y que el Tau acumulado y fosforilado en el modelo TAU P301S no esté en formas solubles, que son las utilizadas para los ensayos de toxicidad in vitro . Para analizar nuestra hipótesis, cuantificamos con el anticuerpo AT8 las formas fosforiladas de Tau en las fracciones solubles de los ratones TAU P301S y ThyTAU22. Como se ilustra en la Figura D.7 A, las fracciones S1 de los ratones ThyTAU22 de 9-12 meses poseen mayores niveles de fosforilación de Tau que las de los ratones TAU P301S, aunque en estas últimas los niveles de Tau total analizados con T46 sean más abundantes. Sin embargo, y como hemos descrito anteriormente, en fracciones totales del modelo TAU P301S hay mayor fosforilación de Tau que en el ThyTAU22, por lo que nos planteamos que la mayoría de formas fosfo-Tau del modelo TAU P301S pudieran estar agregadas. Para esclarecer esta posibilidad, evaluamos los niveles de Tau en las fracciones S1 y S3, correspondiente a proteínas disgregables por SDS (ver Materiales y Métodos, Apartado 5). Nuestros resultados muestran, como esperábamos, que la mayoría de las formas de Tau reconocidas por el anticuerpo T46 están concentradas en la fracción S3 en el modelo TAU P301S, mientras que se localizan en la fracción S1 en el modelo ThyTAU22 (Figura D.7 B). Por tanto, la elevada agregación de Tau en el cerebro de ratones TAU P301S de 9-12 meses podría explicar la baja concentración de formas fosfo-Tau detectadas en la fracción S1 y su falta de toxicidad sobre cultivos microgliales. 90 Resultados D Figura D.7. La agregación de Tau es mayor en el modelo TAU P301S que en el ThyTAU22. (A) Los niveles de fosfo-Tau (AT8) respecto a Tau total (T46) son superiores en la fracción S1 de ratones ThyTAU22 de 9-12 meses que en la correspondiente del modelo TAU P301S (n=3-6). La significancia estadística entre animales jóvenes y viejos de cada modelo y entre animales de ambos modelos de la misma edad se ha analizado mediante el test de Student. (B) WB representativo de la acumulación de Tau total (T46) en las fracciones soluble (S1) y agregadas (S3) de ratones WT, ThyTAU22 y TAU P301S. (C) WB representativo de fosfo-Tau (AT8 y AT100) en las fracciones S1 y S1 sonicada (S1s) procedente de animales TAU P301S. (D) Viabilidad de células BV2 analizada por citometría de flujo (kit IP/AnnexinaV) tras 12 horas de tratamiento con las fracciones sarkosyl-insoluble y S1s de ratones TAU P301S (control positivo = estaurosporina, 1 mM) (n=3). La significancia estadística se ha analizado mediante el test ANOVA. *p<0.05, **p<0.01, ****p<0.0001. Romero-Molina et al., 2018. 2-4m 9-12m AT8 ThyTau22 P301S S1 2-4m S1 S1 T46 S1 S3 WT 2-4m 9-12m 9-12m S1 S3 S3 S3 S3 P301S ThyTau22 9-12m 50kD 80kD A B 2-4m S1 S1s S1 S1s 9-12m S1 S1s S1 S1s S1 S1s AT8 AT100 C P301S 50kD 80kD 50kD 80kD 2-4m 9-12m T46 U nidades relativas 2-4m 9-12m 0 5 10 15 **** ** A T8 (S1) * Viabilidad BV2 % cel viables C- C+ Sarkosyl-insol 9-12m S1s 2-4m S1s 9-12m 0 50 100 Tto 12 horas **** D P301S ThyTau22 91 Resultados D Para evaluar si las formas agregadas de Tau son tóxicas para la microglía, tratamos cultivos de BV2 con fracciones resistentes a Sarkosyl (ver Materiales y Métodos, Apartado 5) de animales TAU P301S de 12 meses, comprobando que la viabilidad microglial prácticamente no se afecta (es de 96.8 ± 0.43%, Figura D.7 D). Estos resultados concuerdan con los obtenidos al tratar cultivos de microglía con fracciones insolubles de pacientes Braak V-VI (Sanchez-Mejias et al., 2016), y demuestran que las formas agregadas de Tau no son tóxicas para la microglía. Finalmente, evaluamos si el tratamiento de células microgliales con formas disgregadas de fosfo-Tau procedentes del modelo TAU P301S reduce su viabilidad. Para ello, tras sonicar y ultracentrifugar el pellet resultante del aislamiento de la fracción S1 (P1), obtenemos un sobrenadante que constituye la fracción solubilizable por sonicación (S1s) del P1. Aunque la fracción S1s procedente de ratones TAU P301S de edades avanzadas contiene, como esperábamos, formas de Tau positivas para AT8 y AT100 (Figura D.7 C), no reduce la viabilidad de cultivos BV2 tras 12 horas de tratamiento (Figura D.7 D). La falta de toxicidad de esta fracción S1s de ratones TAU P301S es probablemente debida a que las formas de fosfo-Tau solubles resultantes del protocolo de disgregación que hemos aplicado no mantengan las estructuras asociadas a la toxicidad generada por las fracciones S1 de ratones ThyTAU22 y de pacientes de Alzheimer. En definitiva, podemos concluir que existen diferentes patrones de acumulación, fosforilación y agregación de Tau en los ratones TAU P301S y ThyTAU22, que son responsables de las diferentes respuestas microgliales descritas en ambos modelos. 92 Resultados D 2. ACTIVACIÓN MICROGLIAL: PERFIL TRANSCRIPTÓMICO DE LA MICROGLÍA ACTIVA EN RESPUESTA A PATOLOGÍA ABETA Y TAU IN VIVO Como previamente hemos comentado, no se conoce con exactitud el papel de la microglía en la progresión de la patología de Alzheimer. Numerosos estudios muestran una clara activación microglial en modelos de EA, e incluso en los estadios iniciales de la enfermedad en pacientes. Con el fin de esclarecer el papel de la microglía activa en el contexto de la patología de Alzheimer, en este Trabajo hemos caracterizado su perfil transcriptómico y hemos comparado las similitudes y diferencias de la activación microglial en respuesta a las patologías Abeta y Tau. Para ello, hemos puesto a punto un método específico para aislar microglía activa (ver Materiales y Métodos, Apartado 4 y Figura D.8) y, posteriormente, hemos analizado su perfil transcriptómico mediante arrays de hibridación (ver Materiales y Métodos, Apartado 15). Hemos seleccionado como células microgliales las positivas para CD11b/CD45 y como microglía activa a las células CD11b+/CD45+/Clec7ahigh. Hemos utilizado ratones WT, APP y TAU P301S (al que en este Apartado nos referiremos como TAU) jóvenes (3 meses) y envejecidos (9-12 meses). En ratones jóvenes y también en WT envejecidos, hemos usado la población completa microglial ya que la microglía Clec7ahigh es prácticamente inexistente, mientras que en los animales APP y TAU envejecidos aislamos de forma específica la microglía Clec7ahigh (Figura D.8 D) para su posterior caracterización a través del array de hibridación. 2.1. Perfil de expresión génica durante la activación microglial En primer lugar, caracterizamos en la microglía aislada de los ratones jóvenes (3 meses) WT, APP y TAU los genes diferencialmente expresados (DEGs, por sus siglas en inglés), y comprobamos mediante herramientas bioinformáticas que no existen diferencias estadísticamente significativas entre ellos (Figura D.9 A), por lo que decidimos utilizarlos conjuntamente como condición control “jóvenes”. A continuación, obtuvimos el heatmap que representa los DEGs en microglía de ratones envejecidos WT (12 meses), APP (12 meses) y TAU (9 meses), tanto activa como no activa, con respecto a los ratones de 3 meses (Figura D.9 B). Como era de esperar, y como ilustra también el análisis de componentes principales (Figura D.9 C), la microglía activa (Clec7ahigh) de ratones TAU y APP envejecidos tiene un perfil transcriptómico similar entre sí, y diferente del WT de 12 meses. Por otro lado, la microglía no activa CD45+CD11b+Clec7alow aislada de ratones APP y TAU de 9-12 meses posee un perfil transcripcional intermedio entre el fenotipo WT y el fenotipo de microglía activa CD45+CD11b+Clec7ahigh de los mismos modelos, aunque guarda más similitud con el fenotipo reactivo (Figura D.9 B). 93 Resultados D Figura D.8. Aislamiento específico de la microglía activa de corteza cerebral e hipocampo de ratón . (A-D) Imágenes representativas del proceso de selección de la población de interés mediante citometría de flujo con separación celular (FACS). (A) Representación de la complejidad frente a tamaño celular (SSC/FSC), para la eliminación de debris, restos celulares y mielina. (B) Representación de FSC-H/FSC-A, para seleccionar células individuales. (C) Selección de la población CD45+/CD11b+, que corresponden a las células microgliales. (D) A partir de las células microgliales, aislamos aquellas activas (Clec7ahigh). (E) Cuantificación de la proporción de células microgliales activas en animales WT, APP y TAU de 9-12 meses de edad. La significancia se ha analizado mediante el test ANOVA, seguido del test Tuckey, *p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001. APP (12m) TAU (9m) WT (12m) A B C D E M icroglia activ a % cel C D45+C D 11b+C lec7ah ig h W T AP P T au 0 10 20 30 40 50 * *** Figura 3.5. Aislamiento específico de los microglía activa de la corteza cerebral e hipocampo de ratón.(A-D) Imágenes representativas del proceso de selección de la población de interés mediante citometría de flujo con separación celular. (A) Representación de la complejidad frente a tamaño celular (SSC/FSC), para la eliminación de debris, restos celulares y mielina. (B) Representación de FSC-H/FSC-A, para seleccionar células individuales. (C) Selección de la población CD45+/CD11b+, que corresponden a las células microgliales. (D) A partir de las células microgliales, aislamos aquellas activas (Clec7a+). (E) Cuantificación de la proporción de células microgliales activas. La significancia se analizó mediante el test ANOVA, seguido del test Tuckey, *p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001. CLEC7ahigh CLEC7ahigh CLEC7ahigh CLEC7alow CLEC7alow CLEC7alow 94 Resultados D Figura D.9. Caracterización transcriptómica de la microglía aislada del cerebro de ratones transgénicos modelos de la EA. (A) Representación, mediante un diagrama de Venn, del número de genes diferencialmente expresados en la microglía de ratones de 3 meses WT, APP y TAU, donde se observa que no existen diferencias. (B) Análisis y representación, mediante heatmap , de los genes diferencialmente expresados, con un FDR<0,05, en la microglía (activa y no activa) aislada de ratones adultos WT (12 meses), APP (12 meses) y TAU P301S (TAU, 9 meses), con respecto al pool de animales de 3 meses (n=3-4). El código de colores muestra el valor logFC. (C) Representación de los componentes principales de la microglía WT frente a la microglía activa de los modelos APP y TAU. La microglía activa procedente de ambos modelos se agrupa parcialmente, y se distancia claramente de la microglía del modelo WT. TAU3m/WT3m APP3m/WT3m APP3m/TAU3m AB C TAU9m APP12m PC2 PC3 PC1 WT12m TAU9m PC2 PC3 PC1 WT12m APP12m PC2 PC3 PC1 TAU APP TAU APP WT ACTIVA NO ACTIVA -1.5 0 4 log FC Figura 3.6. Caracterización transcriptómica de la microglía aislada del cerebro de ratones transgénicos modelos de la EA. (A) Representación, mediante un diagrama de Venn, del número de genes diferencialmente expresados de la microglía de ratones de 3 meses, donde se observa que no existen diferencias. (B) Análisis y representación, mediante heatmap, de los genes diferencialmente expresados en la microglía (activa y no activa) aislada de ratones adultos WT (12 meses), APP (12 meses) y TAU P301S (TAU, 9 meses), con respecto a los de 3 meses, con un FDR<0,05 (n=3-4). El código de colores muestra el valor logFC. (C) Representación de los componentes principales de la microglía WT frente a la microglía activa de los modelos APP y TAU.La microglía activa procedente de ambos modelos se agrupa parcialmente y se distancia claramente de la microglía del modelo WT. Mef2a Tgfbr1 Clec7a, Axl, Cst7, Spp1 95 Resultados D Posteriormente, nos centramos en caracterizar la microglía activa Clec7ahigh aislada de los ratones envejecidos con patologías Abeta y Tau mediante análisis de enriquecimiento (GSEA). Nuestros resultados muestran que, en respuesta a ambas patologías, el perfil transcriptómico de la microglía activa es diferente del de la microglía de animales WT de 12 meses, y se corresponde significativamente (FDR q-valor=0) con un fenotipo DAM y neurodegenerativo (MGnD, firma genética extraída de Krasemann et al., 2017), caracterizado por un aumento de los genes Axl, Spp1, Clec7a, Itgax, entre otros (Figura D.10 A). La expresión génica de Trem2, que aunque no está incluido en la firma MGnD, es esencial para la activación y funcionalidad microglial (Ulland et al., 2017), también aumenta significativamente en la microglía activa de los ratones APP y TAU envejecidos respecto a animales WT de 12 meses (Figura D.10 B). A este respecto, las imágenes de inmunohistoquímica muestran que, mientras que en el modelo APP la microglía Trem2+ se localiza exclusivamente alrededor de las placas de Abeta, en el modelo TAU se distribuye homogéneamente por todo el hipocampo (Figura D.11). Por otro lado, en concordancia con lo descrito en la literatura (Keren-Shaul et al., 2017), en la microglía activa aislada de los modelos APP y TAU disminuye la expresión, respecto a WT, del set de genes homeostáticos microgliales, que incluye genes como Csf1r, P2ry12 o Tmem119; si bien la disminución es sólo significativa para APP (FDR<0.05) (Figura D.10 C). Además, y como se observa en la Figura D.10 D, las rutas Kegg ( Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes ) de EA, Enfermedad de Parkinson y Enfermedad de Huntington están significativamente enriquecidas en la microglía activa de los modelos APP y TAU respecto a WT, lo que confirma que, en ambos modelos, la microglía presenta un fenotipo común a enfermedades neurodegenerativas. De hecho, el módulo génico “asociado a neurodegeneración” descrito por Friedman et al. (2018) también aumenta significativamente en la microglía activa de APP y TAU. De los 134 genes incluidos en este módulo, un 75% se asocian a procesos biológicos ( GO terms ) relacionados con la membrana plasmática y el espacio extracelular, e incluye factores de transcripción como Bhlhe40, Rxrg, Hif1a y Mitf. Además, otros 10 genes (como las catepsinas Ctsb, Ctsl y Ctsz) se incluyen en el término ontológico “lisosoma”. También pertenecen al módulo de neurodegeneración los genes ApoE e Igf1, considerados como un posible factor neuroprotector secretado por la microglía activa (Bianchi et al., 2017). En concordancia, nuestros resultados de qPCR reflejan un aumento en la expresión de Igf1 en tejido hipocampal completo de animales APP y TAU (Figura D.1 A). Como se ilustra en la Figura D.10 D, partiendo de diferentes firmas genéticas ( Gene sets derived from GO Biological Process Ontology ; Friedman et al., (2018); Keren-Shaul et al., (2017)), comprobamos mediante análisis de GSEA que la microglía activa aislada de los modelos APP y TAU tiene enriquecida la expresión de módulos génicos de respuesta a interferón (módulo “asociado a interferón, INF” (Friedman et al., 2018)) y a INF tipo I ( GO Biological Process Ontology ), que incluyen miembros de las 102 Resultados D 2.2.2. El tratamiento in vitro con oligómeros de Abeta aumenta la capacidad respiratoria máxima microglial Tras observar, mediante estudios transcriptómicos, que en la microglía aislada de modelos murinos de EA se produce un incremento significativo del metabolismo oxidativo, nos planteamos reproducir in vitro este fenotipo energético. Para ello, tratamos cultivos de microglía primaria con oligómeros de Abeta (10 µM) durante 12 o 24 horas. Hemos elegido la dosis de Abeta oligomérico capaz de inducir una producción microglial de citoquinas pro-inflamatorias tras 3 horas de tratamiento (Figura D. 17). El metabolismo microglial se determina usando el analizador de flujo extracelular Seahorse XFp (Ver Materiales y métodos, Apartado 20). Este equipo permite medir la velocidad de consumo de oxígeno (OCR, del inglés oxygen consumption rate ) tanto en condiciones basales, como tras la administración de diferentes compuestos moduladores del metabolismo (oligomicina, FCCP, rotenona y antimicina A). Como se muestra en la Figura D.15, tras 12 horas de tratamiento con formas oligoméricas de Abeta, no existen diferencias en la respiración basal, pero se registra una tendencia al aumento de la respiración máxima de las células microgliales. Tras 24 horas de tratamiento, este incremento en la capacidad respiratoria máxima es estadísticamente significativo, siendo el único parámetro que varía significativamente. Por tanto, se requiere una exposición prolongada a formas oligoméricas de Abeta para inducir un incremento de la capacidad respiratoria máxima. Estos resultados apoyan nuevamente que la activación crónica de la microglía por la patología amiloide produce un incremento de su capacidad respiratoria mitocondrial. Además, mediante western-blot, hemos evaluado la expresión proteica de subunidades que componen los complejos mitocondriales de la cadena transportadora de electrones tras la exposición a oligómeros de Abeta in vitro . La SDHA (subunidad A del complejo succinato deshidrogenasa) es la subunidad catalítica principal del complejo II; la NDUFS2 (NADH deshidrogenasa ubiquinona hierro-sulfuro proteína 2) es una subunidad esencial del complejo I y la ATP sintasa beta es la subunidad catalítica del complejo V (Figura D.15 A). Dado que hemos observado que el tratamiento prolongado (24 horas) con Abeta oligomérico induce la síntesis de beta-actina (datos no mostrados), hemos utilizado la proteína houskeeping L26 ribosomal 60S (RPL26) para normalizar los resultados. Como se ilustra en la Figura D.15 B, el tratamiento de la microglía primaria con oligómeros de Abeta (10 µM) durante 24 horas induce un aumento significativo de SDHA, una tendencia al incremento en NDUSF2 y no modifica la expresión proteica de ATP sintasa beta. Por consiguiente, estos resultados reflejan un aumento moderado de la biosíntesis de los complejos mitocondriales implicados en la fosforilación oxidativa, y concuerda con el incremento de la capacidad respiratoria máxima observado en los ensayos de Seahorse (Figura D.15 B). 103 Resultados D Figura D.15. El tratamiento con oligómeros de Abeta aumenta la capacidad máxima respiratoria microglial in vitro . Medida del consumo de oxígeno mediante ensayos de Seahorse en cultivos microgliales tratados con oligómeros de Abeta (10 µM) durante 12 (A) ó 24 (B) horas. Las líneas discontinuas señalan en qué momento se inyectaron los reactivos indicados (Oligomicina, FCCP y rotenona/antimicina). La respiración máxima ha sido calculada teniendo en cuenta el consumo de oxígeno tras el desacople mitocondrial (adición de FCCP) y tras la inhibición de los complejos I y III (adición de rotenona/antimicina). La significancia estadística ha sido analizada mediante test de Student. *** p < 0.001. 0 20 40 60 80 0 20 40 60 80 Tiem po (m in) O C R (pm oles/m in) C ontrol O ligom eros Abeta 12h B C ontrol O ligo me ros 12h 0 2 4 6 8 10 R espiració n m áxim a U nidades relativas R espiración m áxim a U nidades relativas C ontrol O ligome ros 24h 0 2 4 6 8 *** A Oligomicina FCCP Rotenona/ antimicina C ontrol O ligome ros 12h 0 2 4 6 R espiració n basal U nidades relativas R espiración basal U nidades relativas C ontrol O lig ome ros 24h 0 1 2 3 4 5 0 20 40 60 80 0 20 40 60 Tiem po (m in) O C R (pm oles/m in) C ontrol O ligom eros Abeta 24h Oligomicina FCCP Rotenona/ antimicina 104 Resultados D Figura D.16. Estudio de la expresión proteica de los complejos de la cadena de transporte de electrones. (A) Diagrama de los complejos proteicos implicados en la cadena respiratoria mitocondrial. (B) Western-blots representativos y cuantificación de la expresión proteica de las subunidades SDHA (complejo II, succinato deshidrogenasa), NDUFS2 (complejo I, NADH deshidrogenasa) y ATP sintasa beta (complejo V, ATP sintasa), normalizada por RPL26, en microglía primaria control o tratada con oligómeros de Abeta (10 µM) durante 24 horas. La significancia estadística se ha analizado mediante test de Student. * p<0.05. 2.2.3. El incremento del metabolismo oxidativo en la microglía activa parece estar mediado por activación de la vía Trem2-mTOR Basándonos en los resultados anteriores, pensamos que el aumento del metabolismo oxidativo en la microglía activa de los modelos murinos de EA probablemente estuviese acompañado de un significativo incremento del flujo glucolítico. Sin embargo, en la microglía aislada de ratones APP de 12 meses, mientras que el proceso biológico OXPHOS presenta un NES = 2.63 (FDR q-val=0), la glucólisis presenta un NES = 1.56 (FDR q-val = 0.073). Además no existe aumento del proceso glucolítico en la microglía activa aislada de ratones TAU de 9 meses (NES = 1.05, FDR q-val=0.521) (Figura D.17 B). Por consiguiente, nos planteamos que el llamativo incremento de la OXPHOS podría estar impulsado por otras vías de señalización implicadas en reprogramaciones metabólicas (Figura D.16 A), como la ruta A B Control Oligómeros Abeta SDHA NDUFS2 ATPsintβ RPL26 N D U F S2 U nidades relativas C ontro l O lig ome ros Abe ta 0 1 2 3p = 0 .0 8 6 SDH A U nidades relativas C ontro l O ligo me ro s Abe ta 0 1 2 3 * ATP sint  Unidades relativas Control Oligomeros Abeta 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 105 Resultados D Trem2-mTOR, esencial para el metabolismo del fenotipo DAM (Ulland et al., 2017). Nuestro análisis transcriptómico muestra que en la microglía Clec7ahigh de ratones envejecidos APP y TAU se produce un enriquecimiento de la ruta mTOR (firma génica descrita por Ulland et al., 2017) en comparación con WT (Figura D.17 C). Este enriquecimiento, aunque sólo es estadísticamente significativo en presencia de patología amiloide, es superior al enriquecimiento de la ruta glucolítica. Además, como se observa en la Figura D.14, las imágenes ultraestructurales de las mitocondrias de microglía asociada a placas amiloides sugieren una capacidad biosintética dependiente de mTOR (Morita et al., 2015). Por todo ello, la activación del eje Trem2-mTOR-OXPHOS podría explicar el incremento del metabolismo oxidativo en la microglía activa en ratones envejecidos APP y Tau. Trem2 es esencial para la supervivencia y proliferación microglial (Poliani et al., 2015; Ulland et al., 2017; Yeh et al., 2017) y su interacción con ApoE resulta indispensable para la expresión génica del fenotipo microglial DAM (Krasemann et al., 2017). De hecho, la microglía activa DAM de los modelos APP y TAU de 9-12 meses aumenta su expresión de Trem2 respecto a la microglía homeostática de animales WT (Figura D.10 B). Además, numerosas publicaciones describen cómo la participación de Trem2 es fundamental para la fagocitosis de Abeta (Yeh et al., 2016; Zhao et al., 2018). Por consiguiente, en el modelo APP, el metabolismo oxidativo de la microglía activa podría estar mediado por el eje Abeta- Trem2-mTOR-OXPHOS. Sin embargo, es necesario aclarar qué formas de Abeta median la activación de Trem2 y cómo dicho proceso interviene en la activación microglial. 106 Resultados D Figura D.17. El metabolismo oxidativo de la microglía activa podría estar mediado vía mTOR. (A) Diagrama de las vías implicadas en el metabolismo oxidativo; imagen tomada de Bantug et al. (2018). (B, C). Comparativa de la microglía activa de ratones APP (12 meses) y TAU (9 meses) versus WT (12 meses). NES: factor de enriquecimiento normalizado; FDR q-value: p-valor ajustado, más restrictivo. El rango de colores del heatmap muestra el rango de valores de expresión génica, donde el rojo se corresponde con la expresión máxima y el azul con la expresión mínima. (B) Representación gráfica de enriquecimiento y heatmap de los genes incluidos en la ruta glucólisis/gluconeogénesis (KEGG pathway database). (C) Heatmap de los genes incluidos en la firma génica mTOR (Ulland et al., 2017). NES 1.56 FDR q-val 0.073 NES 1.05 FDR q-val 0.521 APP vs WT Figura 3.8. La microglía activa aislada de los modelos APP y TAU presenta un metabolismo oxidativo mediado vía mTOR. NES: factor de enriquecimiento normalizado; FDR q-value: p-valor ajustado, más restrictivo. Comparativa de la microglía activa de ratones APP (12meses) y TAU (9 meses) versus WT (12 meses) (A) Representación gráfica de enriquecimiento y heatmap de los genes incluidos en el proceso biológico fosforilación oxidativa (GO Biological Process Ontology). (B) Enriquecimientos de procesos biológicos relacionados con la fase III del metabolismo. (C) Heatmap de los genes incluidos en la firma génica mTOR (Ulland y col, 2017). (D) Representación gráfica de enriquecimiento y heatmap de los genes incluidos en la ruta glicólisis/gluconeogénesis (KEGG pathway database). B TAU vs WT APP vs WT Glucólisis mTOR C NES 1.66 FDR q-val 0.028 TAU vs WT NES 1.53 FDR q-val 0.134 RHOC HIF1A VEGFA PLD3 PDGFC AKT3 RPS19 RPS27L RPS13 RPS18 MRAS PRKCZ GAB1 PRKCA RHOC HIF1A VEGFA PLD3 RPS19 AKT3 MRAS RPS13 RPS27L RPS18 PRKCZ PDGFC GAB1 PRKCA TPI1 ALDH2 PGAM1 PGM2 PGK1 ALDOA LDHA PFKL ALDH3B1 GAPDH PDHA2 AKR1A1 ALDH1A3 GALM HK1 ALDOB PCK1 PFKP DLD ENO2 BPGM HK2 ALDH3A2 PGM1 PDHB PGK2 ADH4 PCK2 ALDH1B1 PDHA1 ALDH9A1 PGAM2 FBP1 ACSS2 DLAT ALDH3A1 ACSS1 LDHB ENO3 LDHAL6B TPI1 ALDH2 PGAM1 ALDOA AKR1A1 PFKL ALDH3B1 PGK1 PGM2 PCK2 PDHA1 ENO2 GAPDH BPGM PDHA2 ADH4 PGM1 LDHA ALDOB PFKP DLD ALDH9A1 LDHC GCK ALDH1B1 ALDH1A3 PCK1 G6PC HK2 LDHB DLAT G6PC2 PGK2 PDHB ALDH3A2 ADH5 ENO3 ACSS1 ADH7 ACSS2 A 107 Resultados D Para evaluar si Trem2 es indispensable para la activación microglial, utilizamos cultivos primarios de microglía tratados con LPS (control positivo de activación, 1 mg/ml), y con distintas formas de Abeta (10 µM). Como se muestra en la Figura D.18, el tratamiento durante 3 horas con Abeta oligomérico, pero no con Abeta monomérico, induce la expresión de IL1β y TNF en un cultivo de microglía primaria de ratones WT. Es decir, las formas oligoméricas amiloides inducen una estimulación microglial in vitro similar, aunque ligeramente inferior, a la inducida por LPS. Paralelamente, usamos cultivos de microglía primaria de ratones Trem2-KO, y cultivos procedentes de ratones WT a los que añadimos un RNA-interferente ( small-hairping RNA ) para Trem2 (Trem2 knockdown, Trem2-KD). La técnica de silenciamiento reduce la expresión de Trem2, cuantificada mediante qPCR, en un 80% (p<0.05, n=8), (resultados no mostrados). Además, para comprobar que el silenciamiento de Trem2 se produce de forma específica cuantificamos, mediante qPCR, la expresión de Trem1. Como esperábamos, la expresión de Trem1 no varía tras el tratamiento con RNA-interferente para Trem2 (datos no mostrados). Tanto en el cultivo Trem2-KO, como en los cultivos Trem2-KD, la estimulación con LPS mantiene la inducción de las citoquinas pro-inflamatorias, lo que indica que el LPS interacciona con receptores microgliales diferentes a Trem2, como TLR2 y TLR4. En el caso del tratamiento con Abeta monomérico, la expresión de IL1β y TNFα no se modifica, como era de esperar tras los resultados en el cultivo de microglía WT. En contraposición, el tratamiento con Abeta oligomérico no estimula la respuesta inflamatoria microglial en ausencia de Trem2, indicando que la interacción entre Abeta y Trem2 es indispensable para la activación microglial. De hecho, en cultivos de microglía primaria tratados con Abeta oligomérico aumenta la expresión de los marcadores de activación microglial Cd45 y Clec7a, pero no en los cultivos Trem2-KD (Figura D.18 B). Estos resultados apoyan la idea de que el cambio fenotípico de microglía homeostática a DAM es dependiente de la señalización mediada por Trem2. En segundo lugar, evaluamos el papel de Trem2 en la fagocitosis de Abeta. Para ello, tratamos cultivos de microglía primaria WT y Trem2-KD con monómeros y oligómeros de Abeta (10 µM) durante 3 horas, tiempo óptimo para la fagocitosis, pero no degradación intracelular, de Abeta. Mediante WB, estudiamos la acumulación de Abeta en el interior microglial, observando que, mientras que la fagocitosis de monómeros de Abeta es independiente de Trem2, la de oligómeros de Abeta disminuye en los cultivos microgliales con expresión deficiente de Trem2 (Figura D.18 C). En resumen, nuestros datos demuestran que Trem2 es un receptor crucial para la inducción del fenotipo DAM a través del eje Trem2-mTOR-OXPHOS, y es indispensable para la internalización de formas oligoméricas amiloides. 108 Resultados D Figura D.18. Trem2 es indispensable para la activación microglial y fagocitosis de Abeta oligomérico. Tratamiento de cultivos de microglía primaria de ratones WT, WT con Trem2 silenciado (KD-Trem2) y KO-Trem2 tras tratamientos de 3 horas con LPS (1 mg/ml), Abeta monomérico o Abeta oligomérico (10 µM). Expresión de (A) citoquinas pro-inflamatorias (n=4-6), de (B) genes de activación microglial (n=4). (C, D) Niveles de Abeta en la microglía tras la fagocitosis de (C) monómeros y (D) oligómeros, por microglía primaria control y KD-Trem2 (n=4). La significancia se ha analizado mediante t-test respecto su condición control correspondiente. **p<0.01, ***p<0.001, ****p<0.0001. W T K D -T R E M 2 KO -T R E M 2 W T K D -T R E M 2 K O -T R E M 2 W T K D -T R E M 2 K O -T R E M 2 WT KD -T R E M 2 KO -T R E M 2 0 20 40 60 80 E x p r e s io n r e la tiv a A R N m IL -1  C o n t ro l (-) L P S O lig o m e r o s M o n o m e r o s **** **** **** *** A W T KD -TR E M 2 K O -TR EM 2 WT K D -TR E M 2 K O -TR EM 2 W T K D -TR E M 2 KO -TR E M 2 WT K D -T R E M 2 KO -TR EM 2 0 50 100 150 TN F- C o ntrol (-) LPS Oligom eros Monomeros **** ******** **** Expresion relativa A R Nm C Fagocitosis m ó n om ero s A beta C on trol K D -T R EM 2 0.0 0.5 1.0 1.5 U nidades relativas B 7.5 kDa Control KD-TREM2 β-actina Monómeros Control KD-TREM2 Abeta (6e10 +82e1) 42 kDa 7.5 kDa 42 kDa Oligómeros D Fagocitosis oligómeros Abeta Control KD-TREM2 0.0 0.5 1.0 1.5 Unidades relativas *** C le c 7 a Expresion relativa A R Nm W T W T + o lig o K D -T R E M 2 K D -T R E M 2 + O lig o 0 1 2 3** C d 4 5 Expresion relativa A R N m W T W T + o lig o K D -TR E M 2 K D -TR EM 2 + O lig o 0 1 2 3 ** Abeta (6e10 +82e1) β-actina 109 Resultados D 2.3. Diferencias transcripcionales específicas en respuesta a las patologías Abeta y Tau Finalmente, comparamos directamente los perfiles de expresión génica de la microglía activada por las patologías Abeta y Tau. En la Figura D.19 A, se muestran los genes expresados diferencialmente (DEGs) en la microglía activa aislada de ratones envejecidos APP y TAU, respecto a la microglía de WT de 12 meses, con un [logFoldChange]>0.5 y p-valor<0.05. Aunque muchos de estos genes son comunes en los ratones APP y TAU de 9-12 meses, aproximadamente la mitad de los DEGs son específicos de cada patología, lo que parece indicar que existe una diferente respuesta microglial dependiente del estímulo. La comparación directa de los DEGs aumentados en la microglía activa aislada de APP respecto a TAU (Figura D.19 B y ver Anexo, Tabla Suplementaria 7), muestra un aumento en la expresión del factor de crecimiento insulínico (Igf1), de la glicoproteína NMb (Gpnmb) asociada a amiloidosis, o del factor 3 inducible por hipoxia (Egln3), entre otros. Además, analizamos mediante GSEA las rutas enriquecidas en la microglía activa de animales APP de 12 meses respecto a ratones TAU de 9 meses, y observamos un enriquecimiento estadísticamente significativo de la firma hipóxica (firma génica elaborada por el grupo de investigación del Dr. Alberto Pascual) que se manifiesta por un aumento significativo en la expresión de genes como Ero1, Hif1, Bhlhe40 o Prelid2. Estos resultados indican que la microglía activa en el modelo APP, situada alrededor de las placas, está sometida a una menor disponibilidad de oxígeno. Por otro lado, en la microglía asociada a placa, en comparación con la microglía activa del modelo TAU, también observamos un enriquecimiento de procesos biosintéticos de alcoholes y esteroles, que podría reflejar la relación entre Abeta y colesterol (Barbero-Camps et al., 2018; de Dios et al., 2019; Mandrekar et al., 2009; Nugent et al., 2020). En contraposición, al evaluar los procesos biológicos enriquecidos en la microglía activa del modelo TAU de 9 meses respecto a APP 12 meses, no encontramos ningún enriquecimiento estadísticamente significativo. Sin embargo, si utilizamos el parámetro estadístico p-valor normalizado (que es menos restrictivo), observamos en el modelo TAU respecto a APP un enriquecimiento en rutas de inflamación en respuesta a antígenos y señalización mediada por quimioquinas (Figura D.19 C), que concuerda con el aumento significativo de la expresión de genes implicados en la presentación de antígenos (H2-Aa, CD74, H2-Ab1, H2-Eb1) (Figura D.19 B y ver Anexo, Tabla Suplementaria 8). Otra ruta enriquecida en la microglía activa del modelo APP respecto a TAU es la regulación de proliferación de fibroblastos, resultado que podría reflejar una mayor proliferación general, incluida la microglial, en respuesta a la patología Abeta. Esto concuerda con el aumento de expresión de Igf-1 en la microglía activa de APP respecto a TAU (Figura D.19 B). En esta línea, la firma genética asociada a proliferación (Friedman et al., 2018) está enriquecida en la microglía del modelo APP respecto a TAU, aunque no de forma estadísticamente significativa (Figura D.19 E). Para comprobar si existe una mayor proliferación de las células microgliales en el modelo APP, hemos realizado un ensayo específico de 110 Resultados D proliferación microglial con el agente intercalante del ADN EdU (ver Materiales y Métodos, Apartado 19), analizando la microglía proliferativa (Cd45+EdU+) en los modelos WT, APP y TAU. Como control positivo de la técnica usamos el modelo de depleción microglial CX3CSF1R, en el que se produce una clara proliferación microglial con el fin de repoblar el parénquima depletado de microglía. Nuestros resultados indican que la proliferación microglial en los modelos APP y TAU es ligeramente superior a la del WT, aunque no existen diferencias significativas entre los 3 grupos (Figura D.19 F). En definitiva, concluimos que la microglía activa de los modelos APP y TAU presenta un perfil genético propio de procesos neurodegenerativos, con función inflamatoria y fagocítica, y un metabolismo oxidativo. Además, existen diferencias entre la microglía activa asociada a Abeta y a Tau, aunque se requiere una caracterización más exhaustiva para entender la diferente respuesta microglial en ambos modelos. Figura D.19. Diferente perfil génico en la microglía activa en respuesta a las patologías Abeta y Tau. NES: factor de enriquecimiento normalizado; FDR q-value: p-valor ajustado, más restrictivo; FC=fold-change. Comparativa de la microglía activa en animales APP (12 meses) y TAU (9 meses). El rango de colores del heatmap muestra el rango de valores de expresión génica, donde el rojo se corresponde con la expresión máxima y el azul con la expresión mínima. (A) Diagrama de Venn representando los genes diferencialmente expresados (DEGs) en APP y TAU versus WT (12 meses) con un [logFC]>0,5 y p-valor<0,05. (B) Comparativa de los genes que aumentan su expresión en APP versus TAU y viceversa. Adj.p.value: p-valor ajustado. (C) Procesos biológicos ( GO Biological Process Ontogeny ) enriquecidos en APP versus TAU y viceversa. NOM p-val: p-valor normalizado (D) Representación gráfica de enriquecimiento (valores NES y FDR q-valor) y heatmap de los genes incluidos en la firma hipóxica (elaborada por el laboratorio del Dr. Alberto Pascual) comparando la microglía activa de los ratones APP versus TAU. (E) Representación gráfica de enriquecimiento (valores NES y FDR q-valor) y heatmap de los genes incluidos en la firma asociada a proliferación (Friedman et al., 2018). (F) Proliferación microglial en animales WT, APP, TAU y CX3CSF1R (control positivo, 5 días de repoblación tras un tratamiento agudo de depleción), analizado mediante citometría de flujo con el kit EdU (n=2-3). La significancia estadística ha sido analizada mediante el test ANOVA, seguido del test Tukey. 111 Resultados D 798 (45,4%) 519 (29,5%) 441 (25,1%) DEGs respecto a WT APP TAU A C B APP vs TAU Proceso biológico enriquecido NES NOM p-val FDR q - val Regulación de la respuesta inflamatoria a estímulos antigénicos 1.94 0.004 0.4955 Regulación de macrófagos derivados de la diferenciación de células espumosas 1.90 0.004 0.4023 Vías de señalización mediadas por quimiocinas 1.87 0 0.3711 Activación del complemento 1.87 0.002 0.2955 TAU vs APP APP vs TAU D Gen FC adj.P.Val Igf1 18.06 0.0006 Egln3 12.61 4.16E-05 Gpnmb 11.98 0.0299 Mamdc2 9.84 4.16E-05 Etl4 9.26 5.70E-05 Adarb1 7.42 0.0016 Gm1673 6.83 0.05 Lgi2 6.29 0.0016 Fabp3 6.17 0.0026 Gcnt2 6.13 0.0064 Gen FC adj.P.Val Klrb1a 4.98 0.0021 Siglecf 5.26 0.0016 Klk8 5.35 0.0007 H2 - Aa 6.03 0.0021 Postn 7.89 0.0006 Cd74 8.12 2.48E-05 Cfb 9.07 0.0076 H2 - Ab1 9.1 2.48E-05 Olr1 19.48 0.0076 H2 - Eb1 21.09 2.48E-05 APP vs TAU TAU vs APP D Proceso biológico enriquecido NES FDR q - val HMM 2.48 0 Proceso biosintético de alcoholes 2.34 0 Proceso biosintético de esteroles 2.25 0.0011 Regulación positiva de la proliferación de fibroblastos 2.10 0.0169 NES 2.49 FDR q-val 0.000 E % m icroglia EdU + W T AP P T AU C X 3C S F 1R 0 1 2 3 4 5 20 25 30 35 *** P ro life ració n m icro glial F APP vs TAU NES 1.83 FDR q-val 0.173 Hipoxia Proliferación HPSE NUSAP1 RACGAP1 MKI67 GM1966 CDCA3 TIMELESS CBX5 KIF23 POLE2 SLC43A3 CCNB2 MIS18BP1 UBE2C DHFR TCF19 CDCA8 RRM2 SMC4 DUT CCNA2 MELK UBE2T CDT1 118 Resultados D T re m 2 Expresion relativa AR Nm WT T AU H ipoxia T AU 0 5 10 15 ** C lec7a Expresio n relativa A RN m WT T AU H ipoxia T AU 0 100 200 300 * A C Figura 3.16.La hipoxia disminuye la activación microglial en el modelo TAU P301S. (A) Expresión relativa de ARNm del marcador homeostático microglial Tmem119 yde marcadores de activación microglial (Clec7a, Trem2, Cd45 y Lgals3), medida por qPCR y normalizada por GAPDH, en ratones WT, TAU y TAU sometidos a hipoxia, de 9-12 meses. La significancia estadística se ha analizado mediante test ANOVA, seguido del post-test Tukey *p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001. Imágenes representativas del marcaje Iba1 (células microgliales) (B) e Iba1/AT8 (C) en el hipocampo de ratones TAU P301Sde 9-12 meses en normoxia e hipoxia. Barra de escala: (B)200 µm; L g a ls 3 Expresion relativa A RN m WT T AU H ipoxia T AU 0 20 40 * T m em 1 19 Expresion relativa A RN m WT T AU H ip oxia T AU 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 Iba1 C d 4 5 Expresio n relativa AR Nm WT T AU H ipoxia T AU 0 5 10 15 20 *** AT8 Iba1 BTAU TAU hipoxia 119 Resultados D Figura D.24. La hipoxia disminuye la activación microglial en el modelo TAU P301S. (A) Expresión de ARNm del marcador homeostático microglial Tmem119 y de marcadores de activación microglial (Clec7a, Trem2, Cd45 y Lgals3), medida por qPCR y normalizada por Gapdh, en ratones WT, TAU y TAU sometidos a hipoxia, de 9-12 meses. La significancia estadística se ha analizado mediante test ANOVA, seguido del post-test Tukey *p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001. Imágenes representativas del marcaje Iba1 (células microgliales) (B) e Iba1/AT8 (C) en el hipocampo de ratones TAU de 9 meses en normoxia e hipoxia. Barra de escala: (B) 200 µm; (C) 50 µm. Dado que existe una clara interacción entre microglía y astrocitos (Vainchtein y Molofsky, 2020), evaluamos la respuesta astroglial en ratones TAU de 9-12 meses en condiciones de normoxia e hipoxia. Como se observa en la Figura D.25, los ratones TAU de 9-12 meses de edad presentan activación astrocitaria, que se manifiesta por un aumento significativo en la expresión de los marcadores de reactividad astroglial general (Gfap, Aldh1l1) así como de marcadores de las respuestas A1 (Gbp2, H2- D1, Psmb8) y A2 (Cd14, Emp1) respecto a los valores correspondientes de animales WT de la misma edad. La respuesta A1 se caracteriza por un perfil inflamatorio neurotóxico mientras que el fenotipo A2 está asociado a un incremento en la expresión de factores neurotróficos y de la reparación de sinapsis (ver Introducción, Apartado 6.2). Por tanto, en los ratones TAU con patología establecida, los astrocitos adoptan ambos fenotipos reactivos. Sin embargo, tras la hipoxia, nuestros resultados muestran una disminución significativa en la astrogliosis general (Figura D.25 A), que afecta tanto a la respuesta A1 (Figura D.25 B) como A2 (Figura D.25 C). De hecho, para la mayoría de los marcadores, la respuesta astroglial en los animales TAU sometidos a hipoxia no es significativamente diferente a la respuesta astrocítica de los ratones WT de la misma edad. Además, hemos corroborado estos resultados mediante inmunohistoquímica, con el marcador de astrocitos Gfap. Como se ilustra en la Figura D.26, se observa una reducción de la reactividad astrocítica en el hipocampo de los animales TAU P301S sometidos a una baja disponibilidad de oxígeno. La menor activación astroglial en ratones TAU hipóxicos podría deberse a un efecto directo de la hipoxia sobre los astrocitos y/o a la menor activación microglial. 120 Resultados D Figura D.25. La hipoxia disminuye la activación astroglial en el modelo TAU P301S. Expresión relativa de ARNm, medida por qPCR y normalizada por Gapdh, en ratones WT, TAU y TAU sometidos a hipoxia, de 9-12 meses, de marcadores de activación general astroglial (A), de respuesta A1 (B) y respuesta A2 (C). La significancia estadística se ha analizado mediante test de ANOVA, seguido del test Tukey *p<0,05, **p<0,01. G fap Expresion relativa A RN m WT T AU H ipoxia T AU 0 5 10 15 20 25 ** H 2-D 1 Expresion relativa A RN m WT T AU H ip oxia T AU 0 10 20 30 40 50 *** G b p 2 Expresion relativa A R Nm WT T AU H ipoxia T AU 0 20 40 60 * P s m b 8 Expresion relativa A RN m WT T AU H ipoxia T AU 0 10 20 30 40 ** C d 1 4 Expresio n relativa A RN m WT T AU H ipoxia T AU 0 10 20 30 40 ** E m p 1 Expresion relativa A RN m WT T AU H ipoxia T AU 0 10 20 30 40 50 * A B C Figura 3.17.La hipoxia disminuye la activación astroglial en el modelo TAU P301S. Expresión relativa de ARNm, medida por qPCR y normalizada por GAPDH, en ratones WT, TAU y TAU sometidos a hipoxia, de 9-12 meses, de marcadores de activación general astroglial (A),de respuesta A1 (B) y respuesta A2 (C).La significancia estadística se ha analizado mediante test de ANOVA, seguido del test Tukey *p<0,05, **p<0,01. A ldh1l1 Exp resion relativa A RNm WT T AU H ipoxia T AU 0 1 2 3 4 5 * ** 121 Resultados D Figura D.26. Inmunohistoquímica de la activación astrocítica en animales TAU P301S en normoxia e hipoxia. Imágenes representativas del marcaje Gfap (células astrogliales) en el hipocampo de ratones TAU P301S de 9 meses en normoxia e hipoxia. Barra de escala: (A) 200 µm; (B) 50 µm. Además, para confirmar la disminución general de la neuroinflamación en los animales TAU sometidos a hipoxia, evaluamos la expresión de las citoquinas pro-inflamatorias IL1β y TNFα así como de los componentes del sistema del complemento C4a y C4b. Como se muestra en la Figura D.27, existe un aumento significativo de la expresión de las citoquinas pro-inflamatorias y una activación del sistema del complemento en los ratones TAU de 9-12 meses de edad respecto a WT. Sin embargo, bajo una disminución de la disponibilidad de oxígeno, la expresión de IL1β, TNFα, C4a y C4b se reduce, aproximándose a valores más similares al WT. 200um TAU TAU hipoxia GFAP 122 Resultados D Figura D.27. La hipoxia disminuye la inflamación y activación del complemento en el modelo TAU P301S. Expresión relativa de ARNm, medida por qPCR y normalizada por Gapdh, en ratones WT, TAU y TAU sometidos a hipoxia, de 9-12 meses, de (A) citoquinas inflamatorias, y (B) de componentes del sistema del complemento. La significancia estadística se ha analizado mediante test de ANOVA, seguido del test Tukey *p<0,05, **p<0,01. Aunque en el modelo APP la disfunción microglial por baja disponibilidad de oxígeno supone una menor compactación de las placas (este Trabajo) y un empeoramiento de la patología (March-Diaz et al., aceptado en Nature Aging), aún no está descrito el efecto de la disfunción microglial sobre la progresión de la patología Tau. Por consiguiente, evaluamos los niveles de fosfo-Tau en los transgénicos TAU P301S de 9-12 meses en condiciones de normoxia e hipoxia. Como se observa en la Figura D.28 y como se ha descrito previamente en este Trabajo, los ratones TAU de 9-12 meses poseen niveles elevados de Tau fosforilado (epítopos AT8, AT100, AT180). Sin embargo, tras la hipoxia, los niveles de fosfo-Tau para estos mismos marcadores disminuyen significativamente (Figura D.28), lo que indica que en condiciones de hipoxia se revierte la patología neurofibrilar. IL 1 b Exp resion relativa A R Nm WT T AU H ipoxia T AU 0 20 40 60 80 * T N F a Exp resio n relativa ARN m WT T AU H ipoxia T AU 0 5 10 15 20 25 * C 4a Exp resio n relativa ARN m WT T AU H ipoxia T AU 0 1 2 3 4* C 4b Exp resio n relativa ARN m WT T AU H ipoxia T AU 0 10 20 30 ** * Figura 3.17.La hipoxia disminuye la ínflamación y activación del complemento en el modelo TAU P301S. Expresión relativa de ARNm, medida por qPCR y normalizada por GAPDH, en ratones WT, TAU y TAU sometidos a hipoxia, de 9-12 meses, de citocinas inflamatorias (A), yde respuesta A1 (B).La significancia estadística se ha analizado mediante test de ANOVA, seguido del test Tukey *p<0,05, **p<0,01. A B 123 Resultados D Figura D.28. La hipoxia disminuye la patología Tau en el modelo TAU P301S. Western-blots representativos y cuantificaciones de fosfo-Tau (AT8, AT100 y AT180) referido a Tau total (T46) en ratones TAU P301S de 4 meses y de 9-12 meses en normoxia o hipoxia. La significancia estadística se ha analizado mediante t-test de Student. *p<0,05, **p<0,01. Además, las imágenes de inmunohistoquímica con el anticuerpo AT8 (Figura D.29) ilustran la reducción de la fosforilación de Tau, especialmente en hipocampo y corteza entorrinal, regiones donde se acumula preferentemente fosfo-Tau en este modelo. Como se ilustra en la Figura D.29 C, las imágenes a mayor aumento muestran que, mientras que en los ratones TAU en normoxia la tinción de AT8 es homogénea en todo el parénquima hipocampal, en los ratones TAU sometidos a hipoxia, el marcaje de fosfo-Tau está más focalizado en el stratum radiatum de CA2 y CA3 y en determinadas neuronas de la capa polimórfica del giro dentado. Actualmente, estamos completando estos estudios para obtener imágenes más detalladas y concluyentes. Con el objetivo de evaluar si la hipoxia per se , y no una reducción de la neuroinflamación, es la responsable de la disminución de la fosforilación de Tau, hemos sometido a hipoxia (1% O2) a cultivos celulares de la línea SH-Tau. Esta línea celular derivada de neuroblastoma humano y sobreexpresa la isoforma 3R de la proteína Tau humana, presentando elevados niveles de fosfo-Tau. Como se ilustra en la Figura D.30, tras 24 horas en condiciones de hipoxia, no observamos cambios en los niveles de fosfo- Tau (anticuerpo AT8) ni en los niveles de Tau total (anticuerpo T46) en la línea celular. Aunque podrían ensayarse nuevas condiciones, estos resultados parecen indicar que la hipoxia per se no induce cambios en la tauopatía. A T 1 0 0 A T 10 0/T au 46 T AU H ipoxia T AU 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 *** A T 8 A T 8/T au 46 T AU H ipo xia T AU 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 ** 4 m 9-12 m 9-12 m hipoxia T46 AT100 AT180 A T 1 8 0 A T 18 0/T au 46 T AU H ip oxia T AU 0 2 4 6 * AT8 TAU Figura 3.18.La hipoxia disminuye la patología Tau en el modelo TAU P301S. Western-blots representativos y cuantificaciones de fosfo-Tau (AT8, AT100 yAT180) referido a Tau total (T46)en ratones TAU P301Sde 4 meses y de 9-12 meses en normoxia o hipoxia. La significancia estadística se ha analizado mediante t-test de Student. *p<0,05, **p<0,01. 124 Resultados D Figura D.29. La hipoxia disminuye la patología Tau en el modelo TAU P301S. Marcaje inmuno-histoquímico para AT8 en secciones de ratones TAU de 9-12 meses de edad en normoxia e hipoxia. Barras de escala: (A) 500 µm; (B) 100 µm. (C) 50 µm. ATAU TAU hipoxia AT8 Figura 3.19.La hipoxia disminuye la patología Tau en el modelo TAU-P301S. Marcaje inmunohistoquímico para AT8en secciones de ratones TAU de 9-12 meses de edad en normoxia e hipoxia. Barras de escala: (A) 500 µm; (B) 100 µm.DETALLARIA MAS LOS RESULTADOS, Y PONDRIA UNA IMAGEN DE MAS AUMENTO B AT8 AT8 C 125 Resultados D Figura D.30. La hipoxia per se no induce cambios en la fosforilación ni en los niveles totales de Tau en la línea neuronal SH-Tau. Western-blot representativos y cuantificaciones de la expresión proteica de fosfo-Tau (AT8) y Tau total (T46), normalizados por Gapdh, en la línea celular SH-Tau en condiciones de normoxia (21% O2) e hipoxia (1% O2). La significancia estadística se ha analizado mediante t-test de Student. Con estos resultados, nos planteamos si este tratamiento de hipoxia, que implica menor activación microglial y mejora la tauopatía, afectaría a la patología sináptica en los ratones TAU P301S. Como se muestra en la Figura D.31, en los ratones TAU de 9-12 meses se produce un leve descenso de la expresión de los marcadores sinápticos PSD95, Vglut y Sinaptofisina respecto a los valores de los ratones WT de la misma edad, lo que refleja una afectación parcial de las sinapsis en dicho modelo. Sin embargo, aunque los cambios no son estadísticamente significativos, en condiciones hipóxicas se produce cierta recuperación de estos marcadores sinápticos. T46 AT8 Gapdh 21% O21% O2 SH-Tau U nidades relativas N ormoxia H ipoxia 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 SH T au A T 8 U nidades relativas N ormoxia H ipoxia 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 SH T au T 4 6 126 Resultados D Figura D.31. Estudio de la patología sináptica en animales TAU P301S sometidos a hipoxia. Western-blots representativos (A) y cuantificaciones (B) de los marcadores sinápticos PSD95, Vglut y Sinaptofisina en ratones WT, y TAU de 9-12 meses en normoxia o hipoxia. La significancia estadística se ha analizado mediante el test ANOVA, seguido del Test Tukey, *p<0,05. En resumen, una menor activación microglial en condiciones de hipoxia, mediada por la alteración de su metabolismo oxidativo, podría tener efectos contrarios frente a las patologías Abeta y Tau. En el modelo amiloide, donde la microglía reactiva está focalizada alrededor de las placas, una disminución de la microgliosis conlleva un menor empaquetamiento de los depósitos de Abeta y un empeoramiento de la patología. En contraste, en el modelo TAU, dado que la reactividad microglial es exacerbada y generalizada por todo el parénquima, la disminución de la activación microglial parece mejorar la tauopatía, al menos disminuyendo la fosforilación de TAU, y probablemente disminuyendo los daños sinápticos. P S D 95 P SD 95/b -actin a WT T AU H ipo xia T AU 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 Sinaptofisina Sinaptofisina/b-actina WT TAU Hipoxia TAU 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 V g lu t Vg lu t/b-actina WT T AU H ipoxia T AU 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 * WT 9-12 m 9-12 m hipoxia TAU PSD95 Sinaptofisina Vglut B-actina A B Figura 3.20. Estudio de la sinaptopatía en animales TAU P301S sometidos a hipoxia. Western-blots representativos (A) y cuantificaciones (B) de los marcadores sinápticos PSD95, Vglut y Sinaptofisina en ratones WT y P301Sde 9-12 meses en normoxia o hipoxia. La significancia estadística se ha analizado mediante el test ANOVA, seguido del Test Tukey, *p<0,05. 127 Resultados D 4. DISFUNCIONALIDAD MICROGLIAL POR ABLACIÓN GENÉTICA DE CSF1R Como hemos comentado anteriormente, en el hipocampo de pacientes con EA la reactividad microglial es muy limitada y se produce un proceso de degeneración microglial (Gutierrez y Vitorica, 2018; Navarro et al., 2018, Sanchez-Mejias et al., 2016). Además, en Apartados anteriores hemos demostrado que la respuesta microglial en los distintos modelos murinos asociados a EA es diferente. Por un lado, en el modelo ThyTAU22, con niveles moderados de Tau fosforilado y/o agregado, no se produce una clara activación microglial y las formas solubles de Tau aisladas de dicho modelo inducen la degeneración microglial in vitro . Por otro lado, en situaciones de baja disponibilidad de oxígeno, disminuye la activación microglial en el modelo amiloidogénico APP/PS1 y en el modelo TAU P301S. Aparte, hemos descrito cómo alteraciones de Trem2 impiden la activación microglial in vitro . Por tanto, existen numerosos condicionantes que pueden mermar el proceso de activación microglial. De igual forma, en pacientes con EA, las especies fosfo-Tau solubles, la patología vascular y/o las mutaciones/alteraciones de Trem2 parecen contribuir a la disfuncionalidad microglial observada (Karanfilian et al., 2020; Sanchez- Mejias et al., 2016; Sweeney et al., 2019). Para profundizar sobre los mecanismos moleculares asociados a la patología de Alzheimer en un contexto de disfunción microglial, hemos desarrollado un modelo de depleción genética microglial. Dado que las herramientas para la ablación microglial han sido desarrolladas recientemente, la caracterización de estos modelos de depleción microglial está en estadios iniciales. Nuestro objetivo principal ha sido la generación y caracterización de un modelo doble transgénico CX3CR1/CSF1R, que permite la ablación temporal de CSF1R, esencial para la supervivencia microglial, en un sistema controlado y reversible dependiente de tamoxifeno (ver Materiales y Métodos, Apartado 2.3.1). En este modelo, la enzima Cre se expresa específicamente en células CX3CR1+, que corresponden principalmente a células microgliales. Dado que el gen CSF1R está floxeado, la activación de la enzima Cre por tamoxifeno da lugar a una secuencia génica disfuncional de CSF1R, lo que impide la correcta expresión proteica de CSF1R y conlleva la muerte microglial. En primer lugar, evaluaremos en el modelo las consecuencias de la depleción microglial en cerebros sin patología. Posteriormente cruzaremos los ratones CX3CSF1R con ratones APP y TAU P301S con el fin de evaluar la influencia de la microglía en la progresión de las patologías Abeta y Tau. 4.1. Modelos de depleción microglial aguda y capacidad de repoblación Dado que los ratones CX3CSF1R se obtienen del cruce de ratones transgénicos Cx3Cr1CreER y CSF1r- flox/flox, en primer lugar, comprobamos si el sistema Cre funciona de manera correcta y específica. Para poner a punto el sistema de depleción microglial aguda, hemos testado distintas dosis y tiempos de 230 Abreviaturas I FAD: Alzheimer Familiar ( Familiar Alzheimer ’ s Disease ) FAO: oxidación de ácidos grasos ( fatty acid oxidation ) FCCP: carbonyl cyanide-4-(trifluoromethoxy) phenylhydrazone FDR: false discovery rate FC: fold change FTD: frontotemporal dementia FITC: fluoresceína-5-isotiocianato GABA: ácido g-aminobutírico Gfap: Glial fibrilary acidic protein GDNF: glial cell line-derived neurotrophic factor GSEA: Gene Set Enrichment Analysis Gfap: Glial fibrilary acidic protein GFP: green fluorescent protein GLUT1: transportador de glucosa 1 ( Slc2a1 ) GO: gene ontology GS: glutamina sintetasa GSK-3b : glycogen synthase kinase 3 GWAS: Genome wide association studies G418: geneticina HAM: human Alzheimer's microglia HBSS: Hanks' Balanced Salt solution HCl: ácido clorhídrico HDL: lipoproteínas de alta densidad ( High Density Lipoprotein ) HEPES: 4-(2-hydroxyethyl)-1- piperazineethanesulfonic acid HFIP: 1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol HPGs: heparan sulfate proteoglycans HRP: peroxidasa de rábano H2O2: peróxido de hidrógeno IBiS: Instituto de Biomedicina de Sevilla IDE: enzima de degradación de insulina ( Insulin degrading enzyme ) IDIBAPS: Institut d'investigacions Biomèdiques August Pi i Sunyer IDIBELL: Instituto de Investigación Biomédica de Bellvitge IGF1: Insulin Growth Factor-1 IL: interleuquinas IP: ioduro de propidio IFN: Interferón iNOS: enzima inducible óxido nítrico sintasa KCl: cloruro potásico KH2PO4: fosfato de potasio monobásico LCR: líquido cefalorraquídeo LDL: lipoproteínas de baja densidad ( Low Density Lipoprotein ) LOAD: Late-onset Alzheimer's Disease LPS: lipopolisacárido LTP: potenciación a largo plazo ( long term potentiation ) LRP: receptores de lipoproteínas ( low density lipoprotein receptor-related protein ) MAPs: proteínas asociadas a microtubulos ( Microtubule associated proteins ) DCL: deterioro cognitivo leve MCP-1: chemoattractan protein 1 MGnD: microglia neurodegenerative phenotype MMSE: Mini-Mental Status Examination MMPs: metaloproteinasas de la matriz MoCA: Montreal Cognitive Assessment MRC1: mannose receptor C-type 1 MRI: imagen de resonancia magnética MTs: microtúbulos NaCl: cloruro sódico NaHCO3: bicarbonato sódico 231 Abreviaturas I NaOH: hidróxido sódico Na2B4O7: borato sódico Na2CO3: carbonato sódico NCT: nicastrina NEP: neprilisina NES: factor de enriquecimiento normalizado NFTs: ovillos neurofibrilares intracelulares ( Neurofibrillary Tangles ) NMDA: N-methyl-D-aspartate receptor NS: neurosinaptosomas ( neurosynaptosomes ) NTs: filamentos de neuropilo ( neuropil threads ) OCR: oxygen consumption rate OMS: Organización Mundial de la Salud OXPHOS: Oxidative phosphorylation P1: proteínas insolubles aisladas bioquímicamente PAGE: electroforesis en gel de poliacrilamida PAM: plaque-associated microglia PAMPs: pathogen associated molecular patterns PB: tampón fosfato PBS: tampón fosfato salino PBT: tampón salino con 0.1% Tritón X-100 (v/v) PCR: reacción en cadena de la polimerasa ( polymerase chain reaction ) PE: R-phycoerythrin PEIBA: Portal de Ética de la Investigación Biomédica de Andalucía PEN2: potenciador de presenilina ( presenilin enhancer 2 ) PET: tomografía de emisión positrónica ( Positron Emission Tomography ) PFA: paraformaldehído PFs: Protofibrillas PHF: pares de filamentos helicoidales pHRodo: pHrodoTM Red succinimidyl (NHS) ester PLA2: fosfolipasa A2 ( Lipoprotein-Associated Phospholipase A2 ) PLD3: fosfolipasa D3 ( Lipoprotein-Associated Phospholipase D3 ) PLP: solución fijadora PSP: parálisis supranuclear progresiva PI: yoduro de propidio ( propidium iodide ) PIPES: piperazine-N,N ′ -bis(2-ethanesulfonic acid) PP2A: fosfatasa 2A ( protein phosphatase 2A ) PP1: fosfatasa 1 ( protein phosphatase 1 ) PRRs: pattern recognition receptors PSA: persulfato de amonio PSD95: Proteína de Densidad Postsináptica PS1: Presenilina 1 ( presenilin 1 ) PS2: Presenilina 2 ( presenilin 2 ) RAGE: receptor for advanced glycation end products RIN: Número de Integridad del ARN ( RNA Integrity Number ) RMA: Robust Multi-Array RNA: ribonucleic acid roGFP: biosensor de estrés oxidativo ( oxidative stress biosensor ) ROS: especies reactivas de oxígeno ( reactive oxygen species ) sAPPa: fragmento APP soluble alfa sAPPb: fragmento APP soluble beta SDS: detergente aniónico dodecisulfato sódico SFB: suero fetal bovino SNC: sistema nervioso central SR: scavenger receptors 232 Abreviaturas I S1: fracción soluble de proteínas aisladas bioquímicamente ( soluble fraction ) TAC: Transcriptome Analysis Console (Affymetrix) TAMRA: 5(6)-Carboxyfluorescein diacetate N- succinimidyl ester TEM: transmission electronic microscopy TEMED: Tetrametiletiléndiamina TGFb: Transforming Growth Factor-beta ThioS: Tioflavina S TLR: toll-like receptors TNF: factor de necrosis tumoral ( tumor necrosis factor ) TPBS: tampón salino con 0.1% Tween-20 (v/v) Trem2: triggering receptor expressed on myeloid cells 2 VEGF: Vascular endotelial growth factor Vim: Vimentina WB: Western Blot WT: ratón silvestre ( wild type ) J. Bibliografía 235 Bibliografía J Absinta, M., Ha, S.-K., Nair, G., Sati, P., Luciano, N.J., Palisoc, M., Louveau A., et al. (2017). Human and nonhuman primate meninges harbor lymphatic vessels that can be visualized noninvasively by MRI. ELife 6:e29738. Acharya, M., Green, K., Allen, B., Najafi, A., Syage, A., Minasyan, H., et al. Elimination of microglia improves cognitive function following cranial irradiation. Sci Rep 6, 31545 (2016). Acosta, C., Anderson, H.D., Anderson, C.M. (2017). Astrocyte dysfunction in Alzheimer disease. J. Neurosci. Res. 95, 2430–2447. Aletrino, M.A., Vogels, O.J., Van Domburg, P.H., Ten Donkelaar, H.J. (1992). Cell loss in the nucleus raphes dorsalis in Alzheimer’s disease. Neurobiol. Aging 13, 461–468. Alzheimer A, Stelzmann RA, Schnitzlein HN, Murtagh FR. An English translation of Alzheimer's 1907 paper, "Uber eine eigenartige Erkankung der Hirnrinde". (1995) Clin Anat. 8(6):429-31. Andersen P. (2007). The hippocampus book. Oxford University Press. 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