Ritmos circadianos en Drosophila

UNIVERSIDAD DE SEVILLA Grado en Física Trabajo de fin de grado: “RITMOS CIRCADIANOS EN DROSOPHILA” Andrés Martínez Fernández-Salguero Tutora: María del Carmen Lemos Fernández Departamento de Física de la Materia Condensada Septiembre 2018 1 2 ÍNDICE RESUMEN ........................................................................................................................... 4 I. INTRODUCCIÓN ........................................................................................................... 5 I.1. Drosophila Melanogaster ......................................................................................... 5 I.2. Ritmos Circadianos .................................................................................................. 6 I.3. Osciladores no-lineales acoplados........................................................................... 7 I.4. Biología .................................................................................................................... 11 I.4.1. Proteínas ........................................................................................................... 11 I.4.2. Los genes y el ADN ......................................................................................... 11 I.4.3. Dogma central de la biología ............................................................................ 12 a) Transcripción .................................................................................................. 12 b) Traducción ...................................................................................................... 15 I.4.4 Reacciones enzimáticas y fosforilación. Cinética de Michaelis-Menten .......... 15 I.5. Mecanismo molecular ............................................................................................ 16 II. OBJETIVOS Y METODOLOGÍA ............................................................................ 20 II.1. Objetivos ................................................................................................................ 20 II.2. Metodología y herramientas ................................................................................ 20 III. DESARROLLO DE LOS CONTENIDOS ............................................................... 20 III.1. Biología computacional ...................................................................................... 20 III.2. Naturaleza de las oscilaciones ............................................................................ 22 III.3. Herramientas del modelado ............................................................................... 23 III.4. Modelos ................................................................................................................ 26 III.4.1. Oscilador de Van der Pol ............................................................................... 26 III.4.2. Oscilador Goodwin ........................................................................................ 28 III.4.3. Modelo de Goldbeter 1995 ............................................................................ 30 III.4.4. Modelo de Leloup y Goldbeter 1998 ............................................................. 34 Experimentación con el modelo ......................................................................... 42 3 IV. CONCLUSIONES ...................................................................................................... 43 V. BIBLIOGRAFÍA .......................................................................................................... 45 4 RESUMEN En 2017 el Premio Nobel de Medicina y Fisiología fue otorgado a Jeffrey C. Hall, Michael Rosbash y Michael W. Young por “sus descubrimientos de mecanismos moleculares que controlan el ritmo circadiano” [1]. Los ritmos circadianos constituyen un reloj genético que ha permitido a la mayoría de los organismos adaptarse al entorno anticipándose a los cambios diarios que en él ocurren. La Drosophila Melanogaster (mosca de la fruta) es el organismo del que mejor conocemos los detalles de este tipo de reloj biológico, y en él se han centrado los estudios de los tres laureados con el Premio Nobel. Los datos sobre genes, proteínas y redes celulares que se han acumulado en las últimas décadas, han hecho cada vez más necesario el uso de la biología computacional para dar sentido y comprender los complejos mecanismos regulatorios que intervienen en la célula. En este trabajo, tras familiarizarnos con el concepto de ritmos circadianos y los procesos biológicos que intervienen en su funcionamiento, se explican las herramientas matemáticas que utilizan los modelos teóricos para simular los ritmos circadianos. Se exponen cuatro modelos matemáticos diferentes para los ritmos circadianos (dos de ellos genéricos y otros dos específicos de Drosophila), todos ellos basados en sistemas de ecuaciones diferenciales no lineales y en los que un ciclo de realimentación negativa constituye el corazón de las oscilaciones. 5 I. INTRODUCCIÓN I.1 Drosophila Melanogaster La Drosophila Melanogaster es el nombre científico con el que se conoce a la mosca de la fruta o del vinagre. Esta mosca es muy conocida en los hogares por aparecer en la fruta en descomposición durante los meses de primavera y verano. Esta especie se utiliza con frecuencia en experimentación genética por su reducido número de cromosomas (cuatro pares) y por su breve ciclo de vida (35-40 días) y facilidad de reproducción que permite estudiar muchas generaciones en poco tiempo. Ya se conoce el mapa completo de su genoma, y el 61% de los genes de enfermedades humanas que se conocen tienen una contrapartida identificable en el genoma de estos insectos. Se observa en la naturaleza que la actividad locomotora de la Drosophila aumenta al acercarse el amanecer para disminuir cuando comienza el día, y aumenta nuevamente al acercarse el atardecer disminuyendo al caer la noche [2]. De igual manera, la eclosión de moscas adultas de sus crisálidas ocurre siempre en una ventana de tiempo de unas 8-10 horas que se abre 1-2 horas antes de que comience el día. Las moscas que no están del todo listas para su eclosión deberán esperar 24 horas a que se abra nuevamente la ventana para eclosionar [3]. Figura 1: (izquierda) Histograma de la actividad motora de Drosophila Melanogaster. Imagen obtenida de [2]. Se aprecia cómo la mosca se anticipa al cambio de luz aumentando su actividad para alcanzar el máximo al amanecer y el anochecer. (Derecha) Etapa P15 (90-103 horas postfertilización) de Drosophila Melanogaster, inmediatamente antes de la eclosión. Imagen obtenida de [4]. La eclosión de las moscas adultas de sus pupas tiene lugar en una ventana de tiempo que se abre cada 24 horas. 6 Esto es sólo un ejemplo de cómo los organismos adaptan su comportamiento o incluso fisiología al momento del día. Ante estas evidencias se obtiene la impresión de que existe un reloj interno que permite al organismo saber cuándo van a llegar las horas de luz, y cuándo caerá la noche. Los ritmos circadianos son los que conforman este reloj interno, y debido a la facilidad de experimentación con Drosophila en los laboratorios de biología y genética, éste fue el primer organismo para el que se obtuvo información detallada sobre sus ritmos circadianos [5]. Descubrimientos de las últimas décadas han revelado sorprendentes similitudes entre los mecanismos moleculares de los relojes circadianos en la mosca de la fruta y otros organismos tan distintos como los ratones o el moho del pan [6]. En el caso de los mamíferos, por ejemplo, nuestro conocimiento del mecanismo molecular de sus ritmos circadianos resulta de una descripción detallada de componentes homólogos al mecanismo de Drosophila [7]. Por tanto, comprender la base molecular del sistema circadiano de Drosophila nos sirve para llegar a comprender el de otros organismos. Este fue el organismo modelo utilizado por Hall, Rosbash y Young en las investigaciones que les hicieron merecedores del Premio Nobel de Medicina y Fisiología en 2017. I.2 Ritmos Circadianos Los ritmos circadianos son ritmos biológicos que como su nombre indica presentan periodos de aproximadamente 24 horas (circa = alrededor de, dies = día). Lo más llamativo de estos ritmos es su capacidad de acoplarse al ciclo de luz-oscuridad natural del ambiente consecuencia de la rotación de la tierra. Así, dos moscas que se encuentren en dos zonas horarias diferentes tendrán sus relojes sincronizados a la luz local. Los ciclos circadianos constituyen por tanto un reloj biológico interno cuya función es anticipar los ciclos día-noche, permitiendo a los organismos adaptar su fisiología y comportamiento a los cambios de luz y temperatura que tienen lugar en el entorno como consecuencia de la rotación de la tierra. Esta adaptabilidad supone una ventaja evolutiva que 7 permite una mayor optimización energética. Es por eso que estos ritmos se encuentran en todos los organismos eucariotas 1 y algunas bacterias 2 [8]. Este reloj interno son oscilaciones en los niveles de concentración de ciertas proteínas en el interior de las células. Estas oscilaciones tienen un período de 24 horas sincronizado con el ciclo de luz-oscuridad externo [9]. Veremos que las proteínas pueden realizar funciones muy diversas y, por tanto, las proteínas circadianas pueden regular diferentes parámetros fisiológicos. En el caso de los humanos, las proteínas de nuestro reloj circadiano controlan los patrones de sueño, la temperatura corporal, la liberación de hormonas, la presión sanguínea y el metabolismo. Los descubrimientos de Hall, Rosbash y Young han revelado que la adaptación circadiana constituye un mecanismo fisiológico crucial con importantes implicaciones para la salud humana además de las ventajas adaptativas ya mencionadas [10]. Cuando hacemos un viaje largo y cambiamos de huso horario experimentamos el desajuste de nuestro ritmo circadiano con el ciclo externo de luz-oscuridad y nos lleva unos días la adaptación al nuevo horario. Este desajuste tiene efectos fisiológicos que conocemos comúnmente como jet lag. En el caso de Drosophila, además de la actividad locomotora y el tiempo de eclosión de la crisálida, las proteínas circadianas regulan la respuesta olfativa [7]. I.3 Osciladores no-lineales acoplados El mecanismo circadiano constituye entonces un oscilador. A la hora de buscar un modelo matemático para estas oscilaciones sería un error asemejarlo a un oscilador lineal como el péndulo simple o el oscilador armónico. En los osciladores lineales la amplitud de oscilación depende de las condiciones iniciales, y al aplicarles una perturbación, su energía se ve modificada y la amplitud pasa a ser otra diferente. Dado que estamos tratando con un sistema biológico, sus características deben ser preferiblemente independientes de las condiciones iniciales, pues en el entorno se producen inevitablemente perturbaciones que afectan al sistema y éste debe ser robusto para paliar los efectos de dichas perturbaciones, de manera que pueda volver al estado de funcionamiento que tenía antes de que éstas se produjeran. 1 Organismos cuyas células tienen un núcleo bien formado donde se encuentra almacenada la información genética. Se distinguen de los organismos procariotas los cuales no tienen núcleo definido en la célula. Parece que las células eucariotas evolucionaron a partir de las células procariotas. 2 Organismos unicelulares procariotas. 8 Para que se den estas características, la dinámica del sistema ha de ser no lineal. Esto implica generalmente que el sistema sea disipativo necesitando un aporte de energía continuo, a diferencia del oscilador armónico que en ausencia de rozamiento funcionaría eternamente sin consumir energía [9]. A lo largo del trabajo veremos que el mecanismo molecular del reloj circadiano está basado en una realimentación negativa de las proteínas sobre los genes que las codifican, lo que aportará la no linealidad suficiente para el comportamiento deseado. Es importante comprender que las oscilaciones circadianas no son una respuesta pasiva a los ciclos de luz-oscuridad externos, sino que son ritmos endógenos generados por el propio sistema y que tienen lugar en ausencia de cambios periódicos de luz o temperatura en el ambiente [11]. Desde que en 1729 el astrónomo francés Jean Jaques d’Ortous de Mairan estudiara las plantas de mimosa, observando que en condiciones de oscuridad continuada seguían abriendo y cerrando sus hojas rítmicamente como hacían bajo exposición a ciclos de luz-oscuridad [10], se ha demostrado para múltiples organismos que los ritmos circadianos continúan en condiciones de luz constantes [12]. En condiciones de oscuridad continuada el periodo de las oscilaciones endógenas no tiene exactamente 24 horas, sino que estas oscilaciones necesitan de la señal luminosa externa para que ambas estén en fase [9]. Así, un organismo inicialmente sincronizado con el ciclo luminoso del entorno de periodo igual a 24 horas, si lo sometemos a oscuridad continuada, el periodo de sus oscilaciones circadianas pasará a ser ligeramente diferente a 24 horas y se acabará desajustando del ciclo día-noche al que estaba sincronizado en el comienzo. La sincronización con el ambiente ocurre cuando el periodo del oscilador iguala el periodo de la señal periódica externa de luz. En este caso, el oscilador se dice que es de fase fija, porque su fase relativa a la fase de la señal externa es constante. Para que las oscilaciones endógenas se puedan sincronizar a la señal externa, el periodo de dichas oscilaciones debe ser suficientemente cercano al periodo de luz-oscuridad al que se quiere acoplar, pues cuando la amplitud de la señal externa no es lo suficientemente alta o cuando los periodos son demasiado diferentes, se pierde la sincronización y se observan comportamientos complejos con oscilaciones irregulares y sin fase fija [11]. 15 b) Traducción En el citoplasma, la molécula de ARN mensajero es leída por la maquinaria celular (unos orgánulos celulares llamados ribosomas) y traducida a un lenguaje químico diferente: las secuencias de aminoácidos que forman las proteínas. Para ello, cada grupo de tres nucleótidos (llamado triplete o codón) se relaciona con un aminoácido específico. Así, en el proceso de traducción, la cadena de ARNm recorre el ribosoma dando lugar a otra cadena: la proteína, compuesta por aminoácidos. Esta etapa del proceso de expresión génica puede ser también regulada por otros factores que determinarán la cantidad final de proteína funcional obtenida a partir de un gen concreto [14]. La tasa de traducción se modelará por lo general como lineal frente a la cantidad de ARNm: 𝑑[𝑃] 𝑑𝑡 =𝑘[𝐴𝑅𝑁𝑚] I.4.4 Reacciones enzimáticas y fosforilación. Cinética de Michaelis-Menten Las enzimas son proteínas que actúan de catalizadores de reacciones químicas en el interior de la célula. Sin ellas, las reacciones no ocurrirían a la velocidad necesaria para la vida. Estas proteínas acercan las moléculas reactantes, denominadas sustratos, y las orientan en una posición precisa, de manera que la interacción entre los átomos implicados en la reacción es más probable. Muchas proteínas son modificadas después de su síntesis por enzimas que añaden o quitan un grupo fosfato. La fosforilación (adición de un grupo fosfato) y la desfosforilación (eliminación de un grupo fosfato) pueden provocar grandes cambios en la reactividad de las proteínas, por lo general llevándolas de un estado activo a uno inactivo y viceversa [14]. En 1913 Michaelis y Menten propusieron el siguiente mecanismo para las reacciones enzimáticas: 𝑆+𝐸 ⇄𝑘−1 𝑘1𝐶 𝑘2 → 𝑃+ 𝐸 El sustrato (S) se une a la enzima (E) formando un complejo (C), y dando lugar posteriormente al producto y de nuevo la enzima. En el mecanismo tienen lugar dos tipos de reacción diferentes, una reversible y otra irreversible, donde 𝑘±1 es la tasa de la reacción 16 reversible en uno y otro sentido, y 𝑘2 es la tasa de la segunda reacción. Estas tasas son constantes de proporcionalidad que tienen diferentes unidades. Utilizando la Ley de Acción de Masas, aplicando la conservación de la cantidad de enzima total presente en el sistema (no se contempla la degradación o creación de nuevas enzimas) y considerando que la cantidad de sustrato es tan grande que es invariante, puede obtenerse la velocidad de una reacción enzimática: 𝑑[𝑃] 𝑑𝑡 =𝑘2𝑒0[𝑆] 𝐾𝑚+[𝑆] donde Km es la llamada constante de Michaelis-Menten, dada por 𝐾𝑚=𝑘−1+𝑘2 𝑘1, y 𝑒0 es la cantidad de enzima total. La tasa máxima de producción es 𝑣𝑚á𝑥 =𝑘2𝑒0 [17]. Se ha demostrado que la principal proteína causante de las oscilaciones circadianas en Drosophila (proteína PER) se degrada con mayor rapidez si está fosforilada. Además, los modelos contemplan la necesidad del estado fosforilado para que la proteína entre en el núcleo celular y para formar complejos con otra proteína muy importante, la proteína TIM [10]. I.5 Mecanismo molecular Ahora que nos hemos familiarizado con los conceptos y mecanismos biológicos asociados a los ritmos circadianos, estamos en disposición de comprender mejor los trabajos de los merecedores del Nobel de Fisiología y Medicina de 2017 Hall, Rosbash y Young. Veremos que los trabajos de estos científicos se basaron en grandes logros realizados en el campo de los ritmos circadianos por los ya fallecidos Seymour Benzer y Ronald Konopka. Desde hace mucho tiempo se ha documentado que los organismos adaptan su fisiología al momento del día, es decir, circadianamente (apertura y cierre de hojas en la planta mimosa, ciclo vigilia-sueño y temperatura corporal en mamíferos, cambio en la sensibilidad ocular de las arañas lanzadoras de tela, etc.). Sin embargo, hasta bien entrado el siglo XX, no se estableció la concepción de que estos cambios fisiológicos tuvieran su origen en un reloj circadiano interno [10]. En la década de 1960 Seymour Benzer y Ronald Konopka [18] se propusieron encontrar un origen genético de los ritmos circadianos. Se dedicaron a aislar mutaciones de Drosophila con comportamiento circadiano alterado y que tuvieran mutaciones en genes individuales. 17 Es interesante destacar que por aquel entonces la comunidad científica rechazaba la idea de que cambios específicos en el comportamiento estuvieran influenciados por la acción de genes individuales. Encontraron tres mutaciones con alteraciones en su ritmo circadiano, y los ensayos genéticos de aquel tiempo sugirieron que todas ellas eran debidas a alteraciones en el mismo gen, el gen period. Los ritmos de estas mutaciones poseían las siguientes características en su periodo: arrítmico, periodo corto (19h) y periodo largo (28h) [10]. Estas tres alteraciones del gen per se designan respectivamente per0, perS y perL [6]. Siguiendo estos trabajos, los científicos Hall y Rosbash aislaron y caracterizaron el gen period (gen per), aunque su estructura y secuencia no sugería inmediatamente un mecanismo molecular para el reloj circadiano [10]. Gracias al desarrollo de anticuerpos de la proteína que codificaba el gen per (proteína PER) fue posible observar que la abundancia de esta proteína en el cerebro de la mosca oscilaba en ciclos de 24h con máximo durante la noche. También el ARNm de este gen oscilaba de manera circadiana precediendo los ciclos de PER por varias horas, lo que indicaba que las oscilaciones de PER son el resultado de las oscilaciones del ARNm que la codifica (per ARNm) [10]. Este comportamiento sugirió que la proteína PER es un factor de transcripción que actúa como represor del propio gen per, pues una vez alcanzado el máximo en la concentración de per ARNm, aumenta la concentración de PER conforme se va sintetizando en el ribosoma, y conforme ésta aumenta, disminuye el ARNm debido a la acción represora de PER hasta alcanzar un mínimo en el momento en que PER es máximo (máxima acción represora). La baja concentración de ARNm hace que disminuya PER, y la concentración de ARNm puede subir nuevamente. Se trata de un ciclo de realimentación negativa, donde la acumulación de PER inhibe su propia transcripción y resulta en oscilaciones de la proteína y de su ARNm desfasadas en el tiempo. 18 Figura 6: Ciclo de realimentación negativa del gen period. La proteína que codifica el gen period inhibe la transcripción del propio gen. La proteína PER se acumula durante la noche y se degrada durante el día. (1) Síntesis del ARNm en el núcleo (proceso de transcripción). (2) Síntesis de la proteína PER a partir de per ARNm (proceso de traducción). (3) Entrada de PER en el núcleo celular. (4) Represión del proceso de transcripción (disminución de la concentración de ARNm). (5) Disminución de la cantidad de PER en el citoplasma. (6) Disminución de la concentración de PER en el núcleo. Imagen tomada de [1]. Young identificó un segundo gen participante en el reloj circadiano, el gen timeless, cuyo ARNm (tim ARNm) se descubrió que también oscilaba en periodos de 24h. La proteína que codifica este gen, la proteína TIM, forma un complejo con la proteína PER (complejo PERTIM), y mediante la formación de dicho complejo, se bloquea la degradación de PER y permite su entrada en el núcleo celular, donde debe estar para actuar como represor de la transcripción del gen per. Se observó que el ciclo de la expresión de period se suprimía en las moscas con mutación en timeless, y que los ciclos en la expresión de timeless se suprimían en las mutaciones de period. Lo que indica una necesaria interrelación de ambas proteínas para que tengan lugar las oscilaciones [10]. 19 Figura 7: Ciclo de realimentación del gen period incluyendo la acción de la proteína TIM. La formación del complejo PER-TIM evita la degradación de PER y permite la entrada al núcleo de la misma, donde ejerce su acción represora de la transcripción. Imagen tomada de [10]. Un nuevo descubrimiento por Joseph Takahashi [19] ayudaría a clarificar el mecanismo que regula la transcripción genética de period y timeless, las proteínas CLOCK (CLK) y CYCLE (CYC). Estas proteínas son activadores de la transcripción de period y timeless, y el complejo PER-TIM actúa regulando negativamente la actividad de CLK. Las reacciones de transcripción y traducción son relativamente rápidas. Sin embargo, para que se observen oscilaciones de 24 horas, se deben imponer retrasos sustanciales en el modelo. Dichos retrasos se consiguen introduciendo reacciones de fosforilación, degradación, formación de complejos proteicos y transporte al núcleo entre otras modificaciones postraduccionales [10]. Este retraso se introdujo en el mecanismo molecular gracias a un nuevo descubrimiento realizado por Young. Un nuevo gen llamado doubletime que sintetiza la enzima DBT (dibenzotiofeno) que actúa fosforilando PER e induciendo su degradación. Los modelos moleculares actuales son más complejos e incluyen muchos otros componentes adicionales que colectivamente contribuyen a la robustez de sus oscilaciones y a la periodicidad circadiana. Además se incluyen proteínas que involucran comportamientos relacionados con el ambiente y ayudan al acoplamiento del reloj. Por ejemplo, la luz actúa activando una proteína llamada CRY (codificada por el gen cryptochrome) promoviendo su unión a TIM y favoreciendo su degradación. Bajo exposición a la luz, TIM se degrada por acción de CRY, quedando PER vulnerable a la fosforilación por DBT y su consecuente degradación [10]. 20 II. OBJETIVOS Y METODOLOGÍA II.1 Objetivos Comprender cómo se construyen modelos matemáticos basados en ecuaciones diferenciales no-lineales para simular ritmos circadianos en Drosophila, así como presentar distintos modelos matemáticos ya existentes de diferente complejidad, validez y utilidad, que pondremos de manifiesto. II.2 Metodología y herramientas El presente trabajo se ha construido principalmente a partir de bibliografía referente a los ritmos circadianos en Drosophila y al modelado de ritmos biológicos. Ha sido una labor de búsqueda de artículos científicos pertinentes al tema y consulta de libros de distintas disciplinas, pues en este campo la física y las matemáticas van de la mano de la biología. Otra parte del trabajo se ha basado en la simulación mediante código Matlab de los dos modelos más representativos de las oscilaciones circadianas en Drosophila. Los códigos utilizados para la simulación se encuentran anexos a este trabajo. III. DESARROLLO DE LOS CONTENIDOS III.1 Biología computacional En las últimas décadas hemos vivido una rápida acumulación de datos sobre genes, proteínas y redes celulares. La necesidad del uso de biología computacional para dar sentido a las interacciones que intervienen en la regulación celular se ha visto cada vez más clara, pues para comprender los complejos mecanismos regulatorios, así como los mecanismos de coordinación celular a nivel de población, la intuición y los argumentos verbales por lo general son insuficientes. Los resultados aportados por la biología computacional con frecuencia resultan antintuitivos. Aunque el sistema circadiano consiste en poblaciones de células acopladas y sincronizadas para generar oscilaciones estables, en este trabajo nos centraremos en modelos para oscilaciones que ocurren en células individuales. Los modelos deben proporcionar un marco teórico capaz de explicar las observaciones experimentales y hacer predicciones que puedan ser comprobadas [5]. La traducción de los 21 modelos moleculares a modelos computacionales que permitan hacer simulaciones posibilita la comprobación de la validez del modelo, así como llevar a cabo predicciones que pueden encaminar la experimentación celular. Además, las simulaciones permiten determinar los efectos cualitativos y cuantitativos de cada parámetro y así reconocer los parámetros que más afectan a la dinámica del sistema. A la hora de diseñar un modelo matemático hay ciertas cuestiones que necesariamente aparecen. Es el caso de determinar cuáles son los parámetros clave, el número y el tipo de ecuaciones a considerar y cómo elegir el valor de los parámetros de nuestro modelo. Las opciones dependen del modelo biológico que se esté siguiendo, pero por lo general quedan márgenes que hay que salvar mediante la experiencia y el gusto personal [11]. El resultado del modelado por lo general es un sistema de ecuaciones diferenciales en el que se expresa la variación con el tiempo de las distintas sustancias que intervienen en las reacciones químicas relacionadas con la producción de ritmos circadianos en el interior celular y en función de las constantes cinéticas de las distintas reacciones. La mayoría de los modelos propuestos son de naturaleza determinista, de manera que una vez fijados parámetros y condiciones iniciales, la evolución del sistema es única y perfectamente predecible. Esto no va de acuerdo con la realidad, pues en las células reales existen varias fuentes de ruido que producen fluctuaciones en los parámetros. Las ecuaciones deterministas no son suficientes para abarcar el proceso en toda su complejidad y es necesario entrar en el campo de la física estadística. Se pueden utilizar aproximaciones estocásticas basadas en modelos probabilísticos para simular el ruido y tratar de asegurar la robustez de las oscilaciones en presencia de dichas fluctuaciones [11], aunque esto queda fuera del propósito de este trabajo. Ninguno de los modelos que se presentarán a continuación tiene en cuenta el espacio y la difusión de los diferentes componentes de la célula. Únicamente se distingue entre dos compartimentos: citoplasma y núcleo. Las variables representan la concentración media de las proteínas o el ARNm en el interior de estos compartimentos. En cualquier caso, los modelos computacionales y las simulaciones son una herramienta fundamental para explorar los fenómenos dinámicos en la célula y a nivel de población celular. Y en concreto los ritmos circadianos son un buen terreno para aplicar la biología computacional al estudio de oscilaciones asociadas a la regulación genética [5]. 22 III.2 Naturaleza de las oscilaciones Antes de hacer un modelo matemático para simular las oscilaciones circadianas es conveniente reunir las características de estos ritmos para tratar de reproducir su naturaleza. Dichas características son: a) Existencia de un ritmo endógeno, de periodo cercano a 24 horas. En el estudio de los ritmos circadianos, se suele hacer la suposición implícita de que las manifestaciones fisiológicas circadianas de los organismos (que actúan en períodos de 24 horas) tienen la misma fase y periodo que el componente molecular del reloj circadiano [11]. b) Acoplamiento y sincronización con el ciclo diario de luz. c) Persistencia de las oscilaciones en ausencia del ritmo de luz-oscuridad. Las oscilaciones autosostenidas persisten con periodo cercano a 24 horas en condiciones de iluminación constantes. d) Oscilaciones robustas, autosostenidas e independientes de las condiciones iniciales, para que el reloj soporte las pequeñas perturbaciones que se puedan producir con frecuencia en el entorno y siga funcionando. Un buen modelo debería ser capaz además de contemplar la existencia de periodos similares a los encontrados en las moscas con mutaciones. Otra herramienta que permite contrastar la validez del modelo son los diagramas de respuesta de fase. Las curvas de respuesta de fase muestran el signo y la amplitud del desplazamiento de fase que se produce al aplicar un pulso de luz al reloj circadiano (u otro tipo de estimulación química) en función del tiempo [11]. Estas curvas se han determinado experimentalmente para los ritmos circadianos de numerosos organismos, incluyendo Drosophila [20]. Los modelos permiten crear curvas de respuesta de fase teóricas que deben coincidir con las experimentales. Las curvas de respuesta de fase se obtienen simulando un oscilador perturbado por un pulso de luz y comparando la fase de las curvas del oscilador perturbado con la de un oscilador idéntico sin perturbar [11]. 23 Figura 8: (izquierda) Desplazamiento de fase inducido por un pulso de luz. La línea discontinua corresponde al oscilador sin perturbar y la línea continua el oscilador perturbado por el pulso de luz. (Derecha) Curva de respuesta de fase. En esta gráfica se representa el desplazamiento de fase ∆𝜙 frente al tiempo. Imagen tomada de [11]. Siguiendo los trabajos de Hall, Rosbash y Young, podemos incluir en la naturaleza de los ritmos circadianos el origen a partir de la realimentación negativa según un ciclo de transcripción-traducción. III.3 Herramientas del modelado Para proporcionar un modelo con las características mencionadas en el apartado anterior, podríamos utilizar oscilaciones de tipo Lotka-Volterra, ya que éstas tienen la capacidad de acoplarse a una señal externa y de producir curvas de respuesta de fase comparables a los datos experimentales. Sin embargo, se trata de un oscilador lineal, estructuralmente inestable y cualquier perturbación pequeña modificaría su amplitud, no siendo un modelo válido para nuestro propósito [11]. Para lograr oscilaciones robustas y autosostenidas, que soporten pequeñas perturbaciones (estas son perturbaciones que modifiquen el valor de los parámetros dentro de órdenes de magnitud fisiológicos) necesitamos un modelo matemático que defina un sistema estructuralmente estable. La estabilidad estructural se define de la siguiente manera: “Diremos que un sistema es estructuralmente estable para un determinado valor de los parámetros de control si pequeñas variaciones alrededor de ese valor no modifican cualitativamente el comportamiento del sistema, o lo que es lo mismo, el “retrato” que del sistema podemos hacer en el plano fásico se mantiene inalterado” [21]. 24 El ciclo límite es una trayectoria periódica que cumple las condiciones de estabilidad estructural. En la representación en el espacio de fase (espacio definido por el conjunto de variables dependientes {xi}) la trayectoria periódica tendrá una forma de órbita cerrada. Por otro lado, una trayectoria correspondiente a un estado estacionario (recta paralela al tiempo) se vería en el espacio fase como un punto [21]. La estabilidad estructural del ciclo límite asegura que, tras pequeñas perturbaciones, el sistema vuelve a la trayectoria original [9]. La mayoría de modelos de relojes circadianos se basan en oscilaciones de tipo ciclo límite. Se caracterizan porque su amplitud y período son independientes de las condiciones iniciales y son constantes para un valor de los parámetros determinado [11]. La aparición de ciclos límite se basa en la no-linealidad del sistema, representando un sistema disipativo con necesidad de aporte continuo de energía [11]. La mayoría de los modelos utilizan una realimentación negativa que introduce la no-linealidad (proteína que reprime la expresión del gen que la codifica). Cuando simulamos el proceso de transcripción mediante una función de Hill y cuando aplicamos la cinética de Michaelis-Menten introducimos una no-linealidad suficiente para que ocurran ciclos límite. El tipo de ecuaciones que resultan de introducir la función de Hill y la función de Michaelis-Menten no son resolubles analíticamente, pero los algoritmos de integración numérica han demostrado funcionar muy bien en este tipo de sistemas y proporcionar soluciones precisas. Es necesario, sin embargo, conocer el valor de los parámetros del sistema para llevar a cabo la integración [11]. Los parámetros que se utilizan en el modelado representan por lo general parámetros de la cinética química en la célula. Sin embargo, las velocidades de reacción y constantes de equilibrio químico son rara vez determinables experimentalmente [11] y suele ser de interés explorar el comportamiento del sistema para diferentes valores de los parámetros, pues la dinámica del sistema puede cambiar si cambia el valor de los parámetros en juego. No obstante, la arquitectura de las ecuaciones favorece la aparición de ciclos límite y no es posible obtener cualquier comportamiento arbitrario modificando únicamente el valor de los parámetros. Para conocer la dinámica del sistema en función de un parámetro de control se utilizan diagramas de bifurcación. Estos diagramas muestran la amplitud o el período de las oscilaciones en función del valor del parámetro de control. Se construyen numéricamente resolviendo las ecuaciones para los diferentes valores del parámetro de control y reteniendo 31 Figura 11: Esquema del modelo para oscilaciones circadianas de PER y per ARNm. El per ARNm se sintetiza en el núcleo y es trasladado al citoplasma, donde se acumula con una velocidad máxima 𝑣𝑠. En el citoplasma se degrada mediante una reacción enzimática de velocidad máxima 𝑣𝑚 y constante de Michaelis 𝐾𝑚. El proceso de traducción transcurre sintetizando PER con una tasa proporcional a [ARNm] regulada por la constante 𝑘𝑠; Las sucesivas fosforilaciones y desfosforilaciones de la proteína ocurren a las velocidades máximas 𝑉𝑖 por reacciones enzimáticas con constantes de Michaelis 𝐾𝑖 (𝑖 =1,…,4). El estado doblemente fosforilado (P2) se degrada siguiendo la velocidad máxima 𝑣𝑑 y la constante de Michaelis 𝐾𝑑. La entrada en el núcleo de la proteína doblemente fosforilada transcurre a una velocidad regulada por una constante de proporcionalidad 𝑘1 y la velocidad de salida de PN al citoplasma viene regulada por la constante 𝑘2. En el núcleo la proteína reprime la transcripción que viene descrita por una función de Hill con coeficiente de Hill n y 𝐾𝐼 como constante de represión. Imagen tomada de [29]. El esquema de la figura se traduce en las siguientes ecuaciones [29]: 𝑑[𝐴𝑅𝑁𝑚] 𝑑𝑡 =𝑣𝑠𝐾𝐼𝑛 𝐾𝐼𝑛+[𝑃𝑁]𝑛−𝑣𝑚[𝐴𝑅𝑁𝑚] 𝐾𝑚+[𝐴𝑅𝑁𝑚] 𝑑[𝑃0] 𝑑𝑡 =𝑘𝑠[𝐴𝑅𝑁𝑚]−𝑉1[𝑃0] 𝐾1+[𝑃0]+𝑉2[𝑃1] 𝐾2+[𝑃1] 𝑑[𝑃1] 𝑑𝑡 =𝑉1[𝑃0] 𝐾1+[𝑃0]−𝑉2[𝑃1] 𝐾2+[𝑃1]−𝑉3[𝑃1] 𝐾3+[𝑃1]+𝑉4[𝑃2] 𝐾4+[𝑃2] 𝑑[𝑃2] 𝑑𝑡 =𝑉3[𝑃1] 𝐾3+[𝑃1]−𝑉4[𝑃2] 𝐾4+[𝑃2]−𝑘1[𝑃2]+𝑘2[𝑃𝑁]−𝑣𝑑[𝑃2] 𝐾𝑑+[𝑃2] 𝑑[𝑃𝑁] 𝑑𝑡 =𝑘1[𝑃2]−𝑘2[𝑃𝑁] La cantidad total de proteína PER viene dada por: [𝑃𝑡]=[𝑃0]+[𝑃!]+[𝑃2]+[𝑃𝑁] 32 Resolviendo el sistema de ecuaciones anterior por análisis numérico (el código utilizado se puede ver en el anexo I) obtenemos lo siguiente: Figura 12: Solución a las ecuaciones del modelo de Goldbeter de 1995. En la evolución temporal de las concentraciones se muestran las oscilaciones autosostenidas que se generan en el modelo. En esta representación se observa que la oscilación de la proteína PER y ARNm tienen periodos de 24 horas. Además se observa que las fosforilaciones introducen un retraso temporal. Los valores de los parámetros del modelo están tomados de [29] y son: 𝑣𝑠=0,76 𝜇𝑀ℎ−1, 𝑣𝑚=0,65 𝜇𝑀ℎ−1, 𝐾𝑚= 0,5 𝜇𝑀, 𝑘𝑠=0,38ℎ−1, 𝑣𝑑= 0,95 𝜇𝑀ℎ−1, 𝑘1=1,9 ℎ−1, 𝑘2=1,3 ℎ−1, 𝐾𝐼=1 𝜇𝑀, 𝐾𝑑= 0,2 𝜇𝑀, 𝑛 =4, 𝐾1=𝐾2=𝐾3=𝐾4= 2 𝜇𝑀, 𝑉1= 3,2 𝜇𝑀ℎ−1, 𝑉2=1,58 𝜇𝑀ℎ−1, 𝑉3=5 𝜇𝑀ℎ−1, 𝑉4=2,5 𝜇𝑀ℎ−1. La unidad de concentración es tomada por A. Goldbeter en 𝜇𝑀 de manera arbitraria. Imagen de elaboración propia. 33 Figura 13: Representación en el plano de fases. Se observa la evolución hacia un ciclo límite y la naturaleza determinista del modelo. Las condiciones iniciales tomadas son: 𝐴𝑅𝑁𝑚 =0,1 𝜇𝑀, 𝑃0= 𝑃1= 𝑃2=𝑃𝑁= 0,25 𝜇𝑀, 𝑃𝑡=1 𝜇𝑀. Imagen de elaboración propia. La resolución del sistema de ecuaciones nos devuelve oscilaciones correspondientes a la evolución hacia un ciclo límite. Se observa también que los máximos de per ARNm tienen lugar varias horas antes que los máximos en la proteína PER total, como era de esperar de acuerdo a los experimentos. Esto apoya la idea de que el retardo en el tiempo que introducen las fosforilaciones múltiples fortalece la capacidad de producir oscilaciones mediante la realimentación negativa [29]. La robustez del modelo se ha probado introduciendo variaciones en los parámetros de ±5%, y su variación en el periodo es como máximo de ±2,7% [29]. El modelo predice que las oscilaciones autosostenidas ocurren en un rango acotado por dos valores críticos de la tasa de degradación 𝑣𝑑, siendo éste un parámetro clave del modelo. Se ha hecho un diagrama de bifurcación en período tomando 𝑣𝑑 como parámetro de control, y en él se muestra cómo variaciones en este parámetro podrían explicar las diferentes mutaciones con período alterado (perT, perS, per+, perL). Es posible que estas mutaciones afecten a la estructura de la proteína PER haciéndola más vulnerable (aumenta la tasa de degradación) o resistente (disminuyendo la tasa de degradación) a la degradación por enzimas, lo que se resultaría en períodos más largos (en el caso de 𝑣𝑑 alta) o cortos (en el caso de 𝑣𝑑 baja). 34 Figura 14: Diagrama de bifurcación en periodo del parámetro 𝑣𝑑. Variaciones en 𝑣𝑑 explicarían las mutaciones perT (llamada mutación de periodo ultracorto, con periodo cercano a 16 horas), perS (periodo en torno a 19 horas), per+ (Drosophila de tipo salvaje (Wild type), periodo de 24 horas) y perL (periodo de 28 horas). Imagen tomada de [29]. Además de cambios en 𝑣𝑑 (o en lugar de ellos), variaciones en otros parámetros bioquímicos podrían provocar los cambios observados por las mutaciones. Por ejemplo, la constante de velocidad 𝑘1, al controlar el transporte al núcleo, es otro parámetro clave del modelo, y existe, al igual que en 𝑣𝑑, un rango de valores en el que se producen oscilaciones autosostenidas. El período de las oscilaciones decrece conforme 𝑘1 aumenta [29]. Este modelo presenta notables mejoras respecto al modelo de Goodwin. Al introducir retrasos temporales mediante las fosforilaciones y la entrada controlada de proteína al núcleo, el dominio de parámetros en el que ocurren oscilaciones autosostenidas se alarga y permiten obtener valores circadianos del periodo. Estas características se ven favorecidas de igual manera aumentando el coeficiente de Hill de la realimentación negativa y también aumentando el número de fosforilaciones en la cadena [29]. III.4.4 Modelo de Leloup y Goldbeter 1998 Este modelo supone una extensión del anterior. En él se introduce el gen descubierto por Young, timeless, que actúa regulando la resistencia de PER a ser degradada. La proteína sintetizada por el gen tim (la proteína TIM) se degrada a mayor velocidad bajo efecto de la luz [20], lo que permite explicar el acoplamiento de los ritmos circadianos a los ciclos de luz-oscuridad externos. 35 En este modelo, la proteína TIM así como la proteína PER, se transcriben, traducen y fosforilan de forma análoga al modelo anterior. En este modelo, las formas bifosforiladas de PER y TIM (P2, T2) se unen formando un complejo C. Sólo cuando el complejo está formado puede entrar en el núcleo, donde pasa a llamarse CN. Es este complejo el que actúa de represor de la transcripción de los genes per y tim. Todas las formas de las proteínas, complejos y ARNm incluyen en el modelo un término de degradación lineal. A su vez, las formas bifosforiladas de PER y TIM incluyen además un término de degradación por enzimas siguiendo la cinética de Michaelis-Menten. Dado que las evidencias experimentales indican una degradación más rápida de TIM bajo efecto de la luz, la variación del valor de la velocidad máxima de degradación de T2 por enzimas (𝑣𝑑𝑇) solidariamente con la luz, permite introducir el acoplamiento a la señal luminosa externa. Los autores del modelo asignan un valor a 𝑣𝑑𝑇 que bajo efecto de la luz es el doble que en oscuridad. 36 Figura 15: Esquema del modelo de Leloup y Goldbeter 1998 para oscilaciones circadianas en Drosophila con realimentación negativa ejercida por PER y TIM. per ARNm y tim ARNm se sintetizan en el núcleo y se transportan al citoplasma, donde se acumulan a velocidades máximas 𝑣𝑠𝑃 y 𝑣𝑠𝑇. En el citoplasma se degradan por acción de enzimas a velocidades máximas 𝑣𝑚𝑃 y 𝑣𝑚𝑇 con constantes de Michaelis 𝐾𝑚𝑃 y 𝐾𝑚𝑇. Las velocidades de síntesis de PER y TIM son proporcionales a [per ARNm] (Mp) y [tim ARNm] (MT) por las constantes de velocidad 𝑘𝑠𝑃 y 𝑘𝑠𝑇. Las fosforilaciones reversibles de P0 (T0) a P1 (T1) y P1 (T1) a P2 (T2) vienen descritas por las ecuaciones de Michaelis con velocidades máximas 𝑉𝑖𝑃 (𝑉𝑖𝑇) y constantes de Michaelis 𝐾𝑖𝑃 (𝐾𝑖𝑇) (𝑖 =1,…,4). Las formas doblemente fosforiladas de las proteínas (P2 y T2) se degradan por reacciones enzimáticas a velocidades máximas 𝑣𝑑𝑃 y 𝑣𝑑𝑇 con constantes de Michaelis 𝐾𝑑𝑃 y 𝐾𝑑𝑇. Estas proteínas en estado bifosforilado forman un complejo C de manera reversible, siendo las constantes de asociación y disociación 𝑘3 y 𝑘4. El complejo migra al núcleo de manera regulada por la constante 𝑘1. La salida del complejo nuclear (CN) al citoplasma está regulada por la constante 𝑘2. La realimentación negativa que ejerce el complejo nuclear PER-TIM (CN) en el proceso de transcripción de los genes per y tim se expresa con una función de Hill decreciente con coeficiente de Hill n y constantes de represión 𝐾𝐼𝑃 y 𝐾𝐼𝑇. Imagen tomada de [20]. El modelo consta de diez variables y diez ecuaciones [20]: 𝑑[𝑀𝑝] 𝑑𝑡 =𝑣𝑠𝑃 𝐾𝐼𝑃 𝑛 𝐾𝐼𝑃 𝑛+[𝐶𝑁]𝑛−𝑣𝑚𝑃 [𝑀𝑃] 𝐾𝑚𝑃 +[𝑀𝑃]−𝑘𝑑[𝑀𝑝] 𝑑[𝑃0] 𝑑𝑡 =𝑘𝑠𝑃[𝑀𝑃]−𝑉1𝑃 [𝑃0] 𝐾1𝑃 +[𝑃0]+𝑉2𝑃 [𝑃1] 𝐾2𝑃 +[𝑃1]−𝑘𝑑[𝑃0] 37 𝑑[𝑃1] 𝑑𝑡 =𝑉1𝑃 [𝑃0] 𝐾1𝑃 +[𝑃0]−𝑉2𝑃 [𝑃1] 𝐾2𝑃 +[𝑃1]−𝑉3𝑃 [𝑃1] 𝐾3𝑃 +[𝑃1]+𝑉4𝑃 [𝑃2] 𝐾4𝑃 +[𝑃2]−𝑘𝑑[𝑃1] 𝑑[𝑃2] 𝑑𝑡 =𝑉3𝑃 [𝑃1] 𝐾3𝑃 +[𝑃1]−𝑉4𝑃 [𝑃2] 𝐾4𝑃 +[𝑃2]−𝑘3[𝑃2][𝑇2]+𝑘4[𝐶]−𝑣𝑑𝑃 [𝑃2] 𝐾𝑑𝑃 +[𝑃2] −𝑘𝑑[𝑃2] 𝑑[𝑀𝑇] 𝑑𝑡 =𝑣𝑠𝑇 𝐾𝐼𝑇 𝑛 𝐾𝐼𝑇 𝑛+[𝐶𝑁]𝑛−𝑣𝑚𝑇 [𝑀𝑇] 𝐾𝑚𝑇 +[𝑀𝑇]−𝑘𝑑[𝑀𝑇] 𝑑[𝑇0] 𝑑𝑡 =𝑘𝑠𝑇[𝑀𝑇]−𝑉1𝑇 [𝑇0] 𝐾1𝑇 +[𝑇0]+𝑉2𝑇 [𝑇1] 𝐾2𝑇 +[𝑇1]−𝑘𝑑[𝑇0] 𝑑[𝑇1] 𝑑𝑡 =𝑉1𝑇 [𝑇0] 𝐾1𝑇 +[𝑇0]−𝑉2𝑇 [𝑇1] 𝐾2𝑇 +[𝑇1]−𝑉3𝑇 [𝑇1] 𝐾3𝑇 +[𝑇1]+𝑉4𝑇 [𝑇2] 𝐾4𝑇 +[𝑇2]−𝑘𝑑[𝑇1] 𝑑[𝑇2] 𝑑𝑡 =𝑉3𝑇 [𝑇1] 𝐾3𝑇 +[𝑇1]−𝑉4𝑇 [𝑇2] 𝐾4𝑇 +[𝑇2]−𝑘3[𝑃2][𝑇2]+𝑘4[𝐶]−𝑣𝑑𝑇 [𝑇2] 𝐾𝑑𝑇 +[𝑇2] −𝑘𝑑[𝑇2] 𝑑[𝐶] 𝑑𝑡 =𝑘3[𝑃2][𝑇2]−𝑘4[𝐶]−𝑘1[𝐶]+𝑘2[𝐶𝑁]−𝑘𝑑𝐶[𝐶] 𝑑[𝐶𝑁] 𝑑𝑡 =𝑘1[𝐶]−𝑘2[𝐶𝑁]−𝑘𝑑𝑁[𝐶𝑁] Las cantidades totales de proteína PER y TIM vienen dadas por: [𝑃𝑡]=[𝑃0]+[𝑃1]+[𝑃2]+[𝐶]+[𝐶𝑁] [𝑇𝑡]=[𝑇0]+[𝑇1]+[𝑇2]+[𝐶]+[𝐶𝑁] En primer lugar estudiaremos el comportamiento dinámico del modelo en condiciones de iluminación constante. Esto es, cuando el valor de 𝑣𝑑𝑇 es constante e igual a 2 𝑛𝑀 ℎ−1. Los demás parámetros los consideramos iguales para PER y TIM (por ejemplo 𝑉1𝑇 =𝑉1𝑃; 𝑉2𝑇 = 𝑉2𝑃;…). Podemos decir que los procesos que involucran a ambas proteínas por separado son simétricos. Resolvemos el sistema de ecuaciones diferenciales utilizando el código que se presenta en el anexo III. 38 Figura 16: Oscilaciones en la concentración de la proteína total PER y TIM (Pt y Tt, cuyas curvas coinciden por la simetría de los parámetros del modelo), per ARNm y tim ARNm (que también coinciden), y la cantidad de complejo PER-TIM total existente en el núcleo. La línea discontinua representa el valor de 𝑣𝑑𝑇 que es continuo e igual a 𝑣𝑑𝑇 =2 𝑛𝑀ℎ−1 en el caso de oscuridad permanente. Los resultados son similares al modelo de Goldbeter 1995, con oscilaciones en periodos de 24 horas. El valor de los parámetros utilizados son los del modelo de Leloup y Goldbeter 1998: 𝑣𝑠𝑃 =𝑣𝑠𝑇 =1 𝑛𝑀ℎ−1, 𝑣𝑚𝑃 =𝑣𝑚𝑇 =0,7 𝑛𝑀ℎ−1, 𝐾𝑚𝑃 = 𝐾𝑚𝑇 = 0,,2 𝑛𝑀, 𝑘𝑠𝑃 =𝑘𝑠𝑇 =0,9 ℎ−1, 𝑣𝑑𝑃 =𝑣𝑑𝑇 =2 𝑛𝑀ℎ−1, 𝑘1=0,6 ℎ−1, 𝑘2=0,2 ℎ−1, 𝑘3= 1,2 (𝑛𝑀ℎ)−1, 𝑘4=0,6 ℎ−1, 𝐾𝐼𝑃 =𝐾𝐼𝑇 = 1 𝑛𝑀, 𝐾𝑑𝑃 = 𝐾𝑑𝑇 =0,2 𝑛𝑀,𝑛 =4,𝑘𝑑𝑁 =𝑘𝑑𝐶 = 𝑘𝑑= 0,01 ℎ−1, 𝑉1𝑃 = 𝑉1𝑇 =8 𝑛𝑀ℎ−1, 𝑉2𝑃 =𝑉2𝑇 =1 𝑛𝑀ℎ−1, 𝑉3𝑃 =𝑉3𝑇 =8 𝑛𝑀ℎ−1, 𝑉4𝑃 =𝑉4𝑇 = 1 𝑛𝑀ℎ−1. Imagen de elaboración propia. 39 Figura 17: Representación en el espacio de fase de la concentración de per y tim ARNm frente a la proteína total de PER y TIM (Pt y Tt). Se aprecia la evolución hacia un ciclo límite. Los valores iniciales utilizados para la integración son: 𝑃0= 𝑃1=𝑃2= 𝑇0=𝑇1= 𝑇2=𝐶 =𝐶𝑁=0,25 𝑛𝑀, 𝑀𝑃=𝑀𝑇=0,15 𝑛𝑀. Imagen de elaboración propia. El modelo muestra que la formación del complejo PER-TIM favorece el comportamiento oscilatorio, pues el dominio de parámetros en los que tienen lugar oscilaciones autosostenidas es mucho más grande en el modelo de Leloup y Goldbeter 1998 [20] que en el anterior (modelo de Goldbeter 1995 [29]). Con este modelo (Leloup y Goldbeter 1998) es posible además demostrar que las oscilaciones autosostenidas ocurrirían aún sin incluir la fosforilación de las proteínas. Si se formara un complejo con P0 y T0, seguirían teniendo lugar las oscilaciones de ciclo límite de igual manera. Sin embargo, el dominio de los parámetros en el que ocurren las oscilaciones aumenta con el grado de fosforilación de las proteínas [20]. El pico de per y tim ARNm precede al pico de CN por unas 5 horas, mientras que el desplazamiento entre el máximo de los ARN mensajeros y el máximo de la cantidad total de PER y TIM (Pt y Tt) es del orden de 3 horas. Observaciones experimentales sin embargo indican que el máximo de PER se encuentra a una distancia de 4 horas del máximo en per ARNm [20]. En condiciones de total oscuridad se pueden obtener diagramas de bifurcación en período para los parámetros clave del modelo. Para estos, ocurren oscilaciones autosostenidas en un rango de valores acotado entre dos valores críticos. Estos parámetros son: 𝑘𝑑𝑁 (tasa de degradación del complejo en el núcleo), 𝑘𝑠𝑃 =𝑘𝑠𝑇 (tasa de síntesis de las proteínas), 𝑘3,𝑘4 (tasa de formación o disociación del complejo PER-TIM) y 𝑣𝑚𝑃 (tasa de degradación del per ARNm). 40 Figura 18: Diagramas de bifurcación que muestran la dependencia del periodo de las oscilaciones frente a diferentes parámetros de control: (A) tasa de degradación del complejo nuclear PER-TIM, (B) tasa de síntesis de las proteínas PER y TIM, (C) constante de formación o disociación del complejo PER-TIM, (D) velocidad de degradación de per ARNm. Las curvas se han hecho en condiciones constantes y de oscuridad continua, con el mismo valor de los parámetros que en la figura 16. En la gráfica A, la curva b se ha hecho variando el valor de algunos parámetros: 𝑉2𝑃 =𝑉2𝑇 =5 𝑛𝑀ℎ−1, 𝑉4𝑃 = 𝑉4𝑇 =5 𝑛𝑀ℎ−1. En la gráfica D, se observa la existencia de biritmicidad (coexistencia de dos regímenes periódicos) para el rango de valores de 𝑣𝑚𝑃 =0,989 a 0,998 𝑛𝑀ℎ−1. Imagen tomada de [20]. Como podemos observar en las gráficas, mutaciones que afecten a estos parámetros permitirían conseguir los periodos característicos de las distintas mutaciones (perT, perS, per+, perL). A continuación introducimos 𝑣𝑑𝑇 simulando un ciclo de luz-oscuridad de 12 horas de luz y 12 horas de oscuridad. Durante las horas de luz el valor de 𝑣𝑑𝑇 es el doble que en oscuridad. 47 [20] Leloup, J.C. and Goldbeter, A. A model for circadian rhythms in Drosophila incorporating the formation of a complex between the PER and TIM proteins. Journal of biological rhythms 13, No. 1, pp 70-87 (1998) [21] Montero, F., y Morán, F. Procesos de autoorganización en Biología, Ed. Eudema, Madrid (1992) [22] Larraza Hernández, S., y Palencia Gómez, V.J. El oscilador de Van der Pol. Multidisciplina 5, pp 93-102 (2010) [23] Kronauer R.E., Czeisler C.A., Pilato S.F., MooreEde M.C., and Weitzman E.D. Mathematical model of the human circadian system with two interacting oscillators. Am J Physiol 242, pp R3-R17 (1982) [24] Kunz, H., and Achermann, P. Simulation of circadian rhythm generation in the suprachiasmatic nucleus with locally coupled self-sustained oscillators. Journal of Theoretical Biology 224, pp 63–78 (2003) [25] Goodwin B.C. Oscillatory behavior in enzymatic control processes, Adv Enzyme Regul 3, pp 425-438 (1965) [26] Griffith J.S. Mathematical of celular control processes. I. Negative feedback to one gene. J Theor Biol 20, pp 202-208 (1968) [27] Nicolis, G. and Prigogine, I. Self-Organisation in Nonequilibrium Systems. 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Basic Life Sciences 16, pp 409-416, Springer, Boston, MA (1980) Anexo I Código Matlab para la resolución del modelo de Goldbeter 1995 A1 Anexo II Función GoldbeterPER A2 Anexo III Código Matlab para la resolución del modelo de Leloup y Goldbeter 1998 A3 A4 Anexo IV Función GoldbeterPERTIM A5 A6