Utilización de la espectrometría de masas en la detección de metabolitos de fármacos en aguas residuales

UNIVERSIDAD DE SEVILLA FACULTAD DE FARMACIA TRABAJO FIN DE GRADO BIBLIOGRÁFICO presentado por Luis Ramón Medina Padrón para optar al GRADO EN FARMACIA Curso Académico 2020-2021 Tutor: José Luis Espartero Sánchez Departamento de Química Orgánica y Farmacéutica Sevilla, julio 2021 Utilización de la espectrometría de masas en la detección de metabolitos de fármacos en aguas residuales Utilización de la espectrometría de masas en la detección de metabolitos de fármacos en aguas residuales Luis Ramón Medina Padrón Trabajo Fin de Grado bibliográfico Facultad de Farmacia Universidad de Sevilla Tutor: José Luis Espartero Sánchez Departamento de Química Orgánica y Farmacéutica Sevilla, julio de 2021 1 Resumen La metodología del Análisis de Aguas Residuales con Fines Epidemiológicos (WBE, del inglés Wastewater Based Epidemiology) permite obtener datos objetivos y casi en tiempo real sobre consumo de sustancias en una población determinada, aunque no se puedan obtener datos de prevalencia. La WBE se apoya en la cromatografía líquida acoplada a espectrometría de masas y en sus avances tecnológicos para lograr realizar la separación, análisis y detección de biomarcadores con una alta especificidad y selectividad. Estos biomarcadores deben ser específicos para el compuesto que se quiere cuantificar y por ello es necesario conocer sus rutas metabólicas, así como también el factor de excreción y el comportamiento del biomarcador desde que es excretado hasta su llegada a la Estación Depuradora de Aguas Residuales (EDAR). La concentración medida (MC) se calcula en base a la población servida por la EDAR y una vez hecho el cálculo retrospectivo y normalizados los datos, se pueden comparar poblaciones entre sí. Si la MC se corresponde con la concentración predicha basada en los datos de consumo (PC), estaremos en la situación donde todo lo vendido es consumido. Es la generalidad que siguen los medicamentos de prescripción como clindamicina, sulfametoxazol, claritromicina y metronidazol, que presentaron una relación MC=PC casi perfecta en un estudio en España. Si MC>PC, puede significar que existe otra fuente de nuestro biomarcador que no tomamos en cuenta, como el uso abusivo de medicamentos. Si MC<PC, es probable que el biomarcador escogido sufra algún tipo de degradación antes de llegar a la EDAR, por lo que sería conveniente escoger otro como, por ejemplo, la Odesmetil-venlafaxina, metabolito de venlafaxina que da mejores estimaciones. Palabras clave: sewage, wastewater-based epidemiology (WBE), mass spectrometry, pharmaceutical consumption, drug consumption. 2 Índice Glosario de abreviaturas ................................................................................................ 3 1. Introducción ................................................................................................................ 5 1.1. Metodología para un correcto análisis de aguas residuales ................................... 6 1.2. El análisis de aguas residuales en Europa y España .............................................. 8 1.3. Cromatografía líquida acoplada a espectrometría de masas .................................. 8 1.4. Principales ventajas y desventajas de la WBE ..................................................... 13 1.5. Otros usos de la WBE .......................................................................................... 14 2. Objetivo y metodología ............................................................................................ 15 3. Resultados y discusión .............................................................................................. 16 3.1. Métodos de recolección de información de consumo de medicamentos ............. 16 3.2. Determinación de los biomarcadores más importantes ....................................... 17 3.3. Importancia de la distinción entre enantiómeros ................................................. 19 3.4. Caso práctico en Cataluña, España ...................................................................... 21 3.5. Limitaciones y fuentes de incertidumbre que afectan a la WBE ......................... 23 3.6. Evaluación de riesgo medioambiental ................................................................. 26 4. Conclusiones .............................................................................................................. 27 5. Bibliografía ................................................................................................................ 28 3 Glosario de abreviaturas APCI: Ionización Química a Presión Atmosférica APPI: Fotoionización a Presión Atmosférica CI: Ionización Química Código ATC: Sistema de Clasificación Anatómica, Terapéutica y Química EDAR: Estación Depuradora de Aguas Residuales EI: Ionización Electrónica EMA: Agencia Europea del Medicamento EMCDDA: Observatorio Europeo de la Drogas y las Toxicomanías ESAR-Net: Red Española de Análisis de Aguas Residuales con Fines Epidemiológicos ESI: Ionización por Electrospray EF: Fracción Enantiomérica GC: Cromatografía de Gases HE: Alta Energía HPLC: Cromatografía Líquida de Alta Resolución IT: Trampa de Iones LC: Cromatografía Líquida LC-MS: Cromatografía Líquida acoplada a Espectrometría de Masa LC-MS/MS: Cromatografía Líquida acoplada a Espectrometría de Masas en tándem LE: Baja Energía LLE: Extracción Líquido-Líquido LOD: Límite de Detección LOQ: Límite de Cuantificación 4 MDA: 3,4-metilendioxianfetamina MDMA: 3,4-metilendioximetanfetamina MC: Concentración Medida MRM: Monitoreo de reacciones múltiples MS: Espectrometría de Masas m/z: Relación masa/carga NPS: Nuevas Sustancias Psicoactivas OTC: Medicamento de Venta Libre PC: Concentración Predicha basada en los datos de consumo Q: Cuadrupolo QqQ: Triple cuadrupolo SPE: Extracción en Fase Sólida TOF: Tiempo de Vuelo UHPLC: Cromatografía Líquida de Super Alta Resolución WBE: Análisis de Aguas Residuales con Fines Epidemiológicos 5 1. Introducción La utilización de métodos tradicionales para conocer y estimar el consumo de sustancias en la sociedad, tanto de medicamentos como de drogas de abuso, mediante el uso de, por ejemplo, encuestas y cuestionarios a los pacientes, no resultan ser completamente fiables pues son dependientes de la memoria de las personas. Estos cuestionarios suelen ser limitados a una investigación específica y resultan poco prácticos para conocer un uso más amplio y general del consumo de varios medicamentos (Escolà Casas et al., 2021), ni resultan muy honestos al hablar de drogas ilegales por la falsedad en las respuestas o baja participación por el estigma social asociado a ellas (Hernández et al., 2018). Además, estos métodos presentan el inconveniente que no permiten estimar el consumo en tiempo real (Escolà Casas et al., 2021), pues se necesita de tiempo para recabar suficiente cantidad de datos que sean representativos de la población (Pocurull et al., 2020), limitación que es determinante para una rápida intervención por parte de las autoridades competentes para regular las nuevas sustancias psicoactivas (NPS) por el riesgo a la salud que conllevan (Rice et al., 2020). Como alternativa resolutiva a estos problemas anteriormente expuestos de tiempo y fiabilidad, surge una propuesta por parte de Daughton en el año 2001, donde sugiere utilizar las aguas residuales para realizar estimaciones en el consumo de drogas en la población con fines epidemiológicos (Daughton, 2001), pero no fue sino hasta el 2005 cuando su idea fue puesta en práctica primeramente por Zuccato et al. para analizar el consumo de cocaína de algunas ciudades al norte de Italia (Zuccato et al., 2005). A través de los años esta metodología se consolida y es utilizada por los investigadores para estimar y analizar el consumo de drogas ilegales en primer lugar (Bijlsma et al., 2009; Castiglioni et al., 2006; Zuccato et al., 2008), así como cambios en los patrones de consumo de las mismas (Mastroianni et al., 2017; Zuccato et al., 2011), hasta llegar a hoy día donde se utiliza para analizar el consumo de sustancias de abuso como alcohol y tabaco (Rodríguez-Álvarez et al., 2014; Trowsdale et al., 2021) y de fármacos (objetivo de esta revisión). Esta metodología lleva por nombre Análisis de Aguas Residuales con Fines Epidemiológicos (wastewater-based epidemiology, WBE, en inglés) y se fundamenta en que toda sustancia que es introducida al organismo humano es posteriormente excretada, 12 Figura 2. (a) Espectro de masas de baja energía (LE) y alta energía (HE); (b) Cromatograma de iones: LE, los dos inferiores y HE, los 4 superiores (Hernández et al., 2014) Inclusive, si no se dispone de los estándares de referencia en un momento determinado, esta técnica permite identificar los compuestos con una alta probabilidad, dando una identificación tentativa gracias a los espectros de masas y softwares especializados, que posteriormente puede ser corroborada al conseguir el estándar de referencia correspondiente. A manera de ejemplo se muestra la identificación tentativa del levamisol, cuyo estándar no se disponía en ese momento en el laboratorio, mediante el espectro de masas a LE (figura 3a). Con la ayuda del software MassFragment se dedujeron las masas de los iones fragmentos y con la UHPLC se pudieron asignar perfectamente a los iones que coeluyeron, por los picos cromatográficos encontrados en el tiempo de retención de 3,86 minutos (figura 3b). Quedando entonces el ion precursor con m/z 205, y sus iones fragmentos con m/z 178 y m/z 123, y descartando m/z 104 y m/z 83. Posteriormente, consultando con la literatura, se corroboró que dos iones fragmentos a m/z 178 y m/z 123 habían sido previamente encontrados para el levamisol. Finalmente, con la adquisición del estándar se determinó sin lugar a dudas que la identificación tentativa era correcta (Hernández et al., 2014). 13 Figura 3. Detección e identificación de levamisol en aguas residuales. (a) Espectro de masas LE y HE de los compuestos eluyendo a los 3,86 minutos. (b) Cromatogramas de iones: LE, abajo y HE, los cinco primeros (Hernández et al., 2014) 1.4. Principales ventajas y desventajas de la WBE Desventajas • No se pueden obtener datos de prevalencia (número de dosis y frecuencia), pureza de la droga, número de usuarios de drogas (Rice et al., 2020). • No se pueden diferenciar ni el tipo de consumidor ni la vía de administración (Bijlsma et al., 2018; Pocurull et al., 2020). • Puede causar sesgo de segregación en una comunidad (Pocurull et al., 2020). Ventajas • Obtención de datos objetivos de consumo (Bijlsma et al., 2018) y prácticamente en tiempo real (Rice et al., 2020), respetando la privacidad. • Permite monitorizar cambios de consumo en el tiempo y/o entre poblaciones (Pocurull et al., 2020). • Puede detectar sustancias que tienen poca prevalencia de consumo o que están siendo recientemente introducidas en la población, es decir, cambios en los hábitos de consumo en el tiempo (Pocurull et al., 2020). • Permite monitorizar tendencias de consumo en poblaciones pequeñas (como centros penitenciarios o vecindarios específicos) o grandes (como ciudades o países) (Pocurull et al., 2020), así como en eventos específicos tales como festividades y conciertos (Andrés-Costa et al., 2016; Bijlsma et al., 2014). 14 • Pone en evidencia los co-consumos de sustancias a través del biomarcador específico para ello (Pocurull et al., 2020). 1.5. Otros usos de la WBE Adicionalmente al uso principal del análisis de drogas y medicamentos, cabe resaltar la posibilidad de medir los niveles de exposición a contaminantes como pesticidas y análisis de biomarcadores de estrés oxidativo o asociados a procesos carcinogénicos (Bijlsma et al., 2018), así como la identificación y control de NPS, que suelen presentar una prevalencia de consumo muy baja, con la dificultad de que a veces no se conoce el biomarcador por falta de estudios y se suelen encontrar en concentraciones extremadamente bajas en comparación a las drogas de abuso clásicas (Pocurull et al., 2020). Recientemente, grupos de investigación han determinado marcadores potenciales del SARS-CoV-2 para poder reconocer posibles brotes antes que las personas muestren síntomas y aplicar las medidas de restricción rápidamente, lo que junto con la vacunación, disminuiría el número de contagios (Anand et al., 2021). 15 2. Objetivo y metodología El presente trabajo tiene por objetivo realizar una investigación en la que se refleje la importancia del análisis de aguas residuales con fines epidemiológicos en la detección de fármacos y/o sus metabolitos en los últimos diez años utilizando para ello la espectrometría de masas. En cuanto a la metodología seguida para la recolección de información para esta revisión bibliográfica se utilizó el motor de búsqueda PubMed, que utiliza la base de datos MEDLINE. Se realizó una primera investigación general sobre el tema a estudiar que nos sirviese de guía sobre qué palabras clave acotar así como los autores más citados en el área, para luego utilizarlas en una segunda búsqueda más específica que nos permitiese encontrar las publicaciones más acorde para satisfacer los objetivos de la revisión, con el criterio de selección de que fuesen publicaciones y/o artículos de revisión, con una antigüedad de publicación inferior a diez años, con excepción de algunos de mayor antigüedad debido a su relevancia para el desarrollo de la WBE. Además, se consultaron las web de la Red Española de Análisis de Aguas Residuales con Fines Epidemiológicos (ESAR-Net) y la del Observatorio Europeo de las Drogas y las Toxicomanías (EMCDDA). De todos los artículos encontrados, se seleccionaron aquellos cuyos resúmenes, metodologías y conclusiones se ajustaban al objetivo de esta revisión. Las palabras claves usadas (en inglés) fueron sewage, wastewater-based epidemiology (WBE), mass spectrometry, pharmaceutical consumption y drug consumption. 16 3. Resultados y discusión 3.1. Métodos de recolección de información de consumo de medicamentos La recolección de datos a gran escala referente al consumo de medicamentos no es tarea sencilla ni tampoco es de fácil acceso; sin embargo, es fundamental para comprender cómo se ve afectada una comunidad en “términos médicos, sociales y económicos” (Escolà Casas et al., 2021). La principal limitación es la disponibilidad de estos datos, ya que pueden provenir del sistema de salud público y/o privado, así como de clínicas y hospitales, además de aportar información de una o varias vías de administración. Según los datos con los que se trabajen, se hacen unas presunciones que pueden contribuir a errores en lo cálculos y, por tanto, a interpretaciones erróneas, como por ejemplo el uso de consumo per cápita anual, que asume que no hay diferencias significativas entre los hábitos de consumo local y nacional ni a través de todo el año (Escolà Casas et al., 2021; Saunders et al., 2016) y que “la gente consume y excreta la mayoría de los medicamentos comprados en una farmacia cercana a donde la prescripción fue realizada” (Saunders et al., 2016). Además, diferencias demográficas pueden ser determinantes en los medicamentos que son más específicos para un grupo de edad o género (Saunders et al., 2016). A partir de estos datos, se puede calcular la concentración predicha basada en los datos de consumo (PC) que permite hacer una comparación directa con la concentración medioambiental medida (MC) en las muestras y saber si las concentraciones se encuentran dentro de los rangos esperados (Escolà Casas et al., 2021), como se demuestra en la figura 4, donde tanto ibuprofeno como diclofenaco mostraron que la regresión es estadísticamente significativa (p < 0,001), pero la relación es débil (R2 = 0,56 y 0,28, respectivamente) lo que evidencia que hay otros factores que afectan la MC y no solo la información obtenida por los datos de consumo (Saunders et al., 2016). En la tabla 2 se muestran dos métodos para obtener estos datos junto con sus ventajas y limitaciones. Ambos tienen en común que no todos los medicamentos (prescritos o comprados) serán consumidos, bien dentro del tiempo estipulado en la prescripción, o porque son medicamentos de consumo ocasional. La principal ventaja de los datos de ventas es que toma en cuenta los medicamentos de venta libre (OTC) además de las prescripciones, disminuyendo los errores por fuentes externas que pudiesen aumentar la 17 MC. En contra tiene que si los datos de venta disponibles son de laboratorios a farmacias, el stock comprado en un mismo mes puede ser vendido a través de varios meses, dificultando el análisis temporal, por lo que es mejor trabajar con los datos de ventas de las farmacias a los pacientes siempre que se pueda (Escolà Casas et al., 2021; Rice et al., 2020). Figura 4. Comparación de los valores de logaritmo de PC en aguas efluentes (PEC) vs logaritmo de MC en aguas efluentes (MEC) en Gran Victoria, Canadá. IBU: ibuprofeno; DCF: diclofenaco (Saunders et al., 2016) Tabla 2. Ventajas e inconvenientes de los métodos de recolección de información de consumo de medicamentos (Escolà Casas et al., 2021) Método de obtención Ventajas Limitaciones Agrupación de datos de prescripción médica Fuente más confiable para datos de medicamentos de prescripción cuando se necesita analizar períodos de tiempo. Permite obtener información para analizar grandes períodos de tiempo No tiene en cuenta los OTC. Requiere reunir las prescripciones en una sola base de datos, tanto público como privado Datos de venta a farmacias Grandes compañías multinacionales podrían dar información respecto a muchos años en varios países. Tiene el potencial de reunir datos de manera más específica a una base de datos centralizada Información con valor comercial y, por tanto, cuesta dinero. Cuando las farmacias de distintas zonas geográficas hacen sus compras a un distribuidor centralizado, se afecta la resolución espacial 3.2. Determinación de los biomarcadores más importantes Aunque lo ideal sería poder analizar todos los fármacos en una sola muestra de agua residual, en el mercado existe un número demasiado elevado, lo que hace prácticamente 18 imposible monitorizar cada uno de ellos, debido a los largos tiempos de análisis requeridos y los elevados costos que conllevaría. Por ello se hace necesario idear una clasificación para acotar aquellos de mayor relevancia, como los que puedan causar un daño al medioambiente y, por consiguiente, al ser humano, es decir, una evaluación de riesgo (Gómez-Canela et al., 2019; He et al., 2020), o a través de la información obtenida de los datos de consumo de medicamentos de la región o país a analizar, buscar aquellos biomarcadores cuyos fármacos sean más consumidos o vendidos (Escolà Casas et al., 2021). La figura 5 indica que los medicamentos pertenecientes al grupo N (sistema nervioso), A (sistema digestivo y metabolismo), J (antiinfecciosos de uso sistémico), H (preparados hormonales sistémicos, excluidas las hormonas sexuales e insulinas) y G (aparato genitourinario y hormonas sexuales), como son paracetamol, metformina, amoxicilina, prednisona y finasterida, respectivamente, han incrementado su consumo entre los años 2013 y 2016 en Cataluña, mientras que los pertenecientes a los grupos M (sistema musculoesquelético), S (órganos de los sentidos), R (sistema respiratorio) y L (agentes antineoplásicos e inmunomoduladores), como son ibuprofeno, norfloxacino, teofilina y megestrol, respectivamente, lo han disminuido, por lo que los primeros pueden ser candidatos para ser monitorizados y, por tanto, necesitan determinarse sus biomarcadores. Figura 5. Consumo de medicamentos (toneladas por año) en Cataluña, ordenados según el código ATC (Gómez-Canela et al., 2019) Otra manera propuesta es hacer una evaluación de riesgo medioambiental, que será discutida más adelante. 19 Una última manera es tomando en cuenta la toxicidad del compuesto. Si la PC en las aguas de salida de la EDAR indicase que teóricamente encontraremos la sustancias en las aguas, se puede monitorizar pues inclusive en bajas concentraciones, estas podrían ser nocivas para el ecosistema acuático (Gómez-Canela et al., 2019). 3.3. Importancia de la distinción entre enantiómeros Lograr hacer una distinción entre el uso de fármacos de manera legal y la ingesta ilegal de sustancias, cuando el compuesto original puede ser usado de ambas manera; diferenciar cuando un biomarcador encontrado se debe al consumo directo del compuesto o al descarte directo de la droga sin ser usada; o identificar el origen de la droga, son retos que la WBE ha podido resolver cuando se realiza un análisis quiral, es decir, un estudio selectivo de enantiómeros en las muestras de agua (Evans and Kasprzyk-Hordern, 2014; Hernández et al., 2018; Pocurull et al., 2020). Un ejemplo de ello es la anfetamina, de la cual existen un enantiómero dextrógiro y otro levógiro, con propiedades farmacológicas diferentes. La forma dextrorrotatoria es encontrada en su uso ilegal, mientras que la forma levorrotatoria es un metabolito del principio activo selegilina, fármaco utilizado en la enfermedad de Parkinson, cuyo uso está autorizado en España (Mastroianni et al., 2017; Srinivas, 2004). El parámetro que suministra información sobre la proporción de enantiómeros en una muestra se denomina fracción enantiomérica (EF), y puede ser definido por la siguiente fórmula (Dogan et al., 2020): EF = R/(S+R) donde [S] y [R] representan las fracciones de los enantiómeros S y R, respectivamente. En el caso de racematos, el valor EF es 0,5, mientras que en el caso de enantiómeros puros el valor EF es 0 (enantiómero S) o 1,0 (enantiómero R). Otro ejemplo son MDMA y MDA, que también poseen un centro estereogénico, cuyo uso es completamente recreacional y se sintetizan y consumen en forma racémica. Al metabolizarse en el cuerpo, lo hacen de manera estereoselectiva, que lleva a un enriquecimiento en la forma enantiomérica R(‒), debido a que el ser humano metaboliza preferentemente el enantiómero S(+). 20 Figura 6. N-desmetilación metabólica de MDMA, con producción de MDA (elaboración propia) Sabiendo que MDA es un metabolito de MDMA (figura 6), si en un análisis se encuentra mayoritariamente el enantiómero S(+)-MDA, este resultado nos indicaría que este proviene del consumo de MDMA, y no del consumo directo de MDA, ya que en ese caso, encontraríamos un enriquecimiento de la forma R(‒)-MDA (Hernández et al., 2018; Kasprzyk-Hordern and Baker, 2012). La figura 7 ejemplifica la distinción entre consumo directo de MDMA en el año 2010, indicado en la línea verde, con una fracción enantiomérica (EF) media de 0,65 y la eliminación directa en el sistema de alcantarillado en el año 2011, reflejada en la línea roja, con una EF media de 0,54 (valor más concordante con una mezcla racémica), probablemente debido a una redada policial realizada dos días antes del comienzo del estudio, donde se estimó que 30 kg de MDMA fueron desechados al drenaje, puesto que la policía encontró mayoritariamente reactivos y múltiples bolsas vacías donde pudo estar la droga ya preparada (Emke et al., 2014). Figura 7. Cantidad de MDMA encontrada durante una semana de muestreo en dos años consecutivos en la EDAR de Utrecht, Países Bajos, y sus correspondientes fracciones enantioméricas (Hernández et al., 2018) 21 3.4. Caso práctico en Cataluña, España Esta investigación analiza las aguas residuales de las ciudades de Girona y Barcelona durante el mes de octubre de 2019 para los siguientes principios activos: azitromicina (AZI), cefalexina (CEF), ciprofloxacino (CIP), claritromicina (CLA), clindamicina (CLI), eritromicina (ERY), metronidazol (MEZ), sulfametoxazol (SMX), trimetoprim (TRI), paracetamol (ACE), ibuprofeno (IBU), naproxeno (NAP), diltiazem (DIL), irbesartán (IRB), losartán (LOS), valsartán (VAL), furosemida (FUR), hidroclorotiazida (HYD), atenolol (ATE), metoprolol (MET), propanolol (PRO), sotalol (SOT), carbamazepina (CAR), citalopram (CIT), fluoxetina (FLU), venlafaxina (VEN), codeína (COD), lorazepam (LOR), ranitidina (RAN), bezafibrato (BEZ), gemfibrozilo (GEM) y pravastatina (PRA), utilizando como información de consumo de medicamento la agrupación de datos de prescripción médica pública para el cálculo de PC. A pesar de la diferencia en el número de habitantes (1.619.602 en Barcelona y 151.076 en Girona), los resultados obtenidos podrán ser comparados gracias a la normalización de los datos. Las determinaciones se llevaron a cabo utilizando LC-MS/MS, con un analizador QqQ y a las concentraciones obtenidas en las aguas residuales se les aplicaron los factores de corrección explicados en la figura 1 (población que sirve la EDAR, caudal, factor de excreción, dosis) y un factor de corrección estadístico, para obtener la MC (figura 8). En la figura 8 se observa que los antibióticos clindamicina, sulfametoxazol, claritromicina y metronidazol presentaron una relación casi perfecta MC/PC en ambas ciudades, además de ciprofloxacino en Girona, lo que era de esperarse ya que son medicamentos de venta con prescripción y se ajustan mejor que los medicamentos de venta libre como se aprecia por ejemplo con el naproxeno. Las coformulaciones serían una explicación a ciertos principios activos que son de venta con prescripción, pero que son encontrados en concentraciones superiores a las esperadas, como la codeína, en tratamientos para el resfriado y la eritromicina en el tratamiento del acné. Además, otra fuente que incrementaría la MC y no se refleja en la PC son las prescripciones de médicos privados, como con los antidepresivos fluoxetina y venlafaxina. La ranitidina se detectó 5 veces más de lo que fue prescrita. Esto puede deberse a la retirada del mismo por la alerta sanitaria de presencia de impureza tóxica por parte de la AEMPS el 1 de octubre de 2019, pero personas ajenas a esta noticia continuaron consumiendo el medicamento, mientras que los médicos dejaron de recetarlo (Escolà Casas et al., 2021). 28 5. Bibliografía Akash MSH, Rehman K. Mass Spectrometry. En: Essentials of Pharmaceutical Analysis. 1ª ed. Singapore: Springer Singapore; 2020. p.121–36. 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