Efecto de la aplicación de microorganismos (Bacillus subtilis Trichoderma asperellum T 34) y ácidos orgánicos, en un medio calcáreo en diferentes formas de Zn y dosis de P, sobre la bioacumulación de P y Zn en trigo

! ! ! !Universidad!de!Sevilla! Escuela! Técnica! Superior! de!Ingeniería!Agronómica! ! TRABAJO'FIN'DE'GRADO' Efecto!de!la!aplicación!de!microorganismos!(Bacillus(subtilis(y( Trichoderma(asperellum(T34)!y!ácidos!orgánicos,!! en!un!medio!calcáreo!con!diferentes!formas!de!Zn!y!dosis!de!P,!! sobre!la!bioacumulación!de!P!y!Zn!en!trigo! ! ! ! ! ! ! ! ! ! Titulación:!Grado!en!Ingeniería!Agrícola.!Especialidad!Explotaciones!Agropecuarias! ! ! ! Mireya!Galeote!Cobos! ! Sevilla,!Septiembre!2017! ! ! 2! ! ! ! ! ! ! Universidad'de'Sevilla' Escuela'Técnica'Superior'de'Ingeniería'Agronómica.' Departamento'de'Ciencias'Agroforestales' ! ! TRABAJO'FIN'DE'GRADO' ! EFECTO! DE! LA! APLICACIÓN! DE! MICROORGANISMOS! (BACILLUS( SUBTILIS( Y( TRICHODERMA( ASPERELLUM(T34)!Y!ÁCIDOS!ORGÁNICOS,!EN!UN!MEDIO!CALCÁREO!CON!DIFERENTES!FORMAS! DE!Zn!Y!DOSIS!DE!P,!SOBRE!LA!BIOACUMULACIÓN!DE!P!Y!Zn!EN!TRIGO! ! Titulación:!Grado!en!Ingeniería!Agrícola.!Especialidad!Explotaciones!Agropecuarias! ! Sevilla,!Septiembre!2017! ! ! Autora' Mireya!Galeote!!Cobos! ! Directores' Dr.!Antonio!Delgado!García!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!! Universidad!de!Sevilla' ! Aurora!Moreno!Lora! Universidad!de!Sevilla! ! ! 2! ! ! !! 3! ! Agradecimientos' En! primer! lugar! debo! agradecerle! a! Antonio! Delgado! la! oportunidad! que! me! ha! dado! para! poder!terminar!el!proyecto!de!fin!de!grado.!Gracias!a!esta!experiencia!he!podido!conocer!y! trabajar!!con!personas!estupendas.! Gracias!también!a!Aurora!Moreno,!la!jefa,!por!su!paciencia!infinita!y!sus!ánimos!constantes.! Gracias!a!Oli,!por!su!gran!ayuda!y!por!su!apoyo.!Siempre!dispuesta!a!ayudarnos!en!todo.! Gracias!a!Puri,!por!sus!explicaciones!y!sus!conversaciones.!Gracias!a!Ramiro!por!su!interés!y! por!sus!aportaciones.!! Gracias!a!mi!colega!Ángel,!compañero!de!fatigas!durante!este!año!(¡al!final!lo!conseguimos!).! Gracias!a!mis!amigos!Pedro!e!Inma,!porque!siempre!están!dispuestos!a!ayudar!en!cualquier! momento.! Y!gracias!a! mi!esposo!Ángel,!por! su! paciencia,!por! su! ayuda! y! por! su! dominio! de! todas!las! herramientas!informáticas.!¡Sin!tu!ayuda!esto!no!hubiera!sido!posible!!! ! ! ! 4! ! ! ! Mireya!Galeote!Cobos! 5! ! Tabla'de'contenido! 0.!ÍNDICE'DE'TABLAS,'FIGURAS'Y'FOTOS' 6! 1.!INTRODUCCIÓN' 7! 2.!OBJETIVOS'11! 2.1.!Objetivo(General(11! 2.2.!Objetivos(Específicos(11! 3.!MATERIALES'Y'MÉTODOS'11! 3.1.!Diseño(experimental(11! 3.2.!Medio(de(cultivo(12! 3.3.!Material(vegetal(y(sistema(de(cultivo(14! 3.4.!Tratamientos(15! 3.5.!Análisis(del(medio(y(material(vegetal(16! 3.5.1.!Análisis!del!medio!16! 3.5.2.!Análisis!del!material!vegetal!17! 3.6.!Análisis(estadístico(18! 4.!RESULTADOS'Y'DISCUSIÓN'18! 5.!CONCLUSIONES'28! 6.!BIBLIOGRAFÍA'30! ! ! ! Mireya!Galeote!Cobos! 6! ! ! 0. ÍNDICE!DE!TABLAS,!FIGURAS!Y!FOTOS! Tabla'1.!Factores!principales!para!el!desarrollo!del!experimento! Tabla'2.!Condiciones!de!las!cámaras!de!cultivo! Tabla'3.!Duración!del!ciclo!completo!(días)! Tabla'4.!Efecto!de!los!diferentes!factores!(ANOVA)!estudiados!en!las!variables!del!cultivo!y!del!medio! de!crecimiento! Tabla' 5.!Efecto! de! los! diferentes! factores! (ANOVA)! para! las! dos! fuentes! de! Zn! utilizadas! en! el! Zn! extraíble!por!DTPA! Tabla'6.!Efecto!de!los!factores!principales! Figura'1.!Efecto!de!la!interacción!de!la!forma!de!adición!de!Zn!en!el!medio!y!los!tratamientos!de!ácido! cítrico!e!inoculación!con!microorganismos!en!la!concentración!de!Zn!en!raíz! Figura'2.!Efecto!de!la!interacción!de!la!forma!de!adición!de!Zn!en!el!medio!!y!los!tratamientos!de!ácido! cítrico!e!inoculación!con!microorganismos!en!la!concentración!de!Zn!en!la!parte!aérea! Figura'3.!Efecto!de!la!interacción!entre!la!forma!de!adición!de!Zn!y!la!dosis!de!P!en!la!concentración!de! Zn!en!la!parte!aérea! Figura'4.!Efecto!de!la!interacción!entre!la!forma!de!adición!de!Zn!y!la!dosis!de!P!en!la!absorción!total! de!Zn!en!la!parte!aérea!(Zn!uptake!total)! Figura'5.!Efecto!de!la!interacción!entre!la!forma!de!adición!de!Zn!y!los!tratamientos!de!ácido!cítrico!e! inoculación!sobre!la!absorción!total!de!P!por!las!plantas!(P!uptake!total)! Figura'6.!Efecto!de!la!interacción!entre!la!forma!de!adición!de!Zn!y!la!dosis!de!P!en!la!acumulación!de! ácidos!orgánicos!(único!detectable!oxálico)!en!la!rizosfera! Figura'7.!Efecto!de!la!interacción!entre!la!forma!de!adición!de!Zn!y!los!tratamientos!de!ácido!cítrico!e! inoculación!en!la!actividad!en!la!rizosfera! Figura'8.!Efecto!de!la!interacción!entre!la!dosis!de!P!y!los!tratamientos!de!ácido!cítrico!!e!inoculación! con!microorganismos!en!el!Zn!extraíble!por!DTPA!en!el!suelo!después!del!cultivo!cuando!el!Zn!se!aplicó! adsorbido!a!carbonatos.! Foto'1.!(A)!Proceso!vernalización,!(B)!Semillero!de!perlita,!(C-D)!Plantas!en!semillero!de!perlita! Foto'2.!(A)!Baño!de!raíces!para!la!inoculación!de!Trichoderma(asperellum!.!B)!Macetas!preparadas!para! el!trasplante! ! ! ! Mireya!Galeote!Cobos! 7! ! 1. INTRODUCCIÓN! El!desarrollo! de! la! población! mundial! ha! hecho! que! la! agricultura! de! supervivencia! que! existía! antiguamente!de!paso!a!una!agricultura!más!intensiva!e!intensificada.!El!uso!de!fertilizantes!ha!sido! imprescindible! para! mantener! una! producción! de!calidad!que! sigue! en! aumento.! Sin! embargo,!el! fósforo!no!es!un!elemento!inagotable.!En!2008!se!da!la!llamada!“crisis!de!fósforo”,!que!nos!invita!a! pensar!que!a!partir!del!2030!la!producción!de!fósforo!irá!decreciendo!(Ulrich!&!Schnug,!2013).!Esto! hace! necesario! un! uso! sostenible! del! mismo.! Es! importante! saber! utilizar! este! recurso,! siempre! asegurando!la!producción!de!alimentos!y!respetando!el!medio!ambiente.!! El! !fósforo! (P)! es! un! macroelemento!! esencial!para! la! vida! de! las! plantas,! encontrándose!entre! los! dieciséis!nutrientes!esenciales!para!el!desarrollo!funcional!de!los!cultivos.!Forma!parte!de!estructuras! de!la!pared!celular!vegetal,!es!un!constituyente!de!los!ácidos!nucleicos!(ADN!y!ARN)!y!juega!un!papel! muy! importante! en! los! procesos! metabólicos! que! implican! reacciones! de! transferencia! de! energía,! como!por!ejemplo!la!fotosíntesis!(Yang!&!Finnegan,!2010).!Si!existe!una!deficiencia!de!este!elemento,! ya!sea!por!escasez!en!los!suelos!cultivados!o!porque,!aún!existiendo!una!cantidad!suficiente,!la!planta! es!incapaz!de!asimilarlo,!el!desarrollo!del!cultivo!se!verá!afectado.!Su!carencia!puede!limitar!incluso!el! desarrollo!de!la!planta!(Ryan!et!al.,!2012;!Yang!&!Finnegan,!2010).!! Gran!parte!del!P!aplicado!al!suelo!como!fertilizante!se!fija!al!mismo,!reduciéndose!de!manera!drástica! su!disponibilidad!para!el!cultivo!(Ulrich!&!Schnug,!2013).!Del!P!aplicado!como!fertilizante,!sólo!una! mínima!parte!(raramente!superior!al!25%)!es!aprovechado!!(Syers!et!al.,!2008)! El!P!es!muy!abundante!en!la!corteza!terrestre,!existiendo!un!reservorio!de!4X1015!toneladas,!aunque! soló!el!0,1%!está!disponible!para!la!planta!a!causa!de!su!pobre!solubilidad!y!su!fijación!en!el!suelo! (Sharma!et!al.,!2013).!La!principal!fuente!de!P!inorgánico!procede!de!la!descomposición!y!degradación! de! las! rocas! que! contienen! apatita! aunque! también! se! puede!encontrar! combinado! con! hierro! y! aluminio!(Recena! et! al.,! 2017).! Hay! estudios! que! confirman! que! en! más! del!30%! de! la! superficie! agrícola!del!mundo!existe!!una!carencia!de!P!en!el!suelo!(Runge-Metzger,!1995).!! Podemos!encontrar!el!P!en!el!suelo!de!varias!maneras:!disuelto!en!la!solución!del!suelo!(P!asimilable,! que!es!el!único!asimilable!por!la!planta!en!forma!de!ión!ortofosfato),!fijado!al!complejo!arcillo-húmico! (P!lábil!o!cambiable),!como!componente!de!la!materia!orgánica,!precipitado!o!adsorbido!a!complejos! de!hierro!o! aluminio,! precipitado! como! fosfato!cálcico! en! suelos!básicos!(P! poco! asimilable)!y,! por! último,!formando!parte!de!la!roca!madre!(P!no!asimilable).!El!comportamiento!del!P!en!el!suelo!es! complejo,!debido!a!que!la!el!proceso!de!solubilización!conlleva!una!serie!de!reacciones!simultáneas!e! Mireya!Galeote!Cobos! 14! ! 3.3. Material!vegetal!y!sistema!de!cultivo! Se!realiza!un!ensayo!experimental!bajo!condiciones!controladas!de!luz,!temperatura!y!humedad!en! una!cámara!de!cultivo!de!la!E.T.S.I.A.!con!trigo!blando!(Triticum(aestivum).!!! ! ! ! ! Foto'1.'(A)'Proceso'vernalización,'(B)'Semillero'de'perlita,'(C-D)'Plantas'en'semillero'de'perlita' Las! semillas! se! sometieron! a! un! proceso! de! vernalización.! Se! sumergieron! en! NaCl! 5%! durante! un! minuto!y!luego!se!enjuagaron!con!agua!desionizada.!Se!agruparon!las!semillas!de!seis!en!seis!en!placas! Petri!con!papel!de!filtro!humedecido!con!agua!millipore!y!se!pusieron!en!un!frigorífico!a!6ºC.!Tras!la! germinación!se!pasaron!a!un!semillero!con!perlita.!El!semillero!se!regaba!con!agua!desionizada!en!días! alternos.!Cuando!la!planta!alcanzó!la!fase!de!desarrollo!Z1.2!según!la!escala!decimal!Zadoks!(ZADOKS! et!al.,!1974)!se!trasplantaron!a!una!maceta.!Las!macetas!se!situaron!en!!la!cámara!de!cultivo,!según!las! condiciones!que!se!citaron!en!la!Tabla!2.! C! D! A! B! Mireya!Galeote!Cobos! 15! ! ! Germinación! placa!Petri! Semillero! Trasplante!en!maceta! Ciclo!completo! Días! 8! 18! 52! 78! Tabla'3.'Duración'del'ciclo'completo'(días)' Cada!una!de!las!macetas!recibieron!un!total!de!340!ml!solución!nutritiva!Hoagland!libre!de!P,!Zn!y!Fe!a! pH!8.5,!y!70!ml!de!agua!desionizada.!! ! ! Foto'2.''(A)'Baño'de'raíces'para'la'inoculación'de'Trichoderma!asperellum'.'(B)'Macetas'preparadas'para'el'trasplante' 3.4. Tratamientos! • Inóculo!de!Bacillus(subtilis!! En!el!momento!del!trasplante!en!maceta!se!aplicaron!2!104!CFU!g-1!suelo.!Se!aplicó!en!cada!maceta!20! ml!de!una!suspensión!de!Bacillus(subtilis!!(García-López!et!al.,!2016).! • Inóculo!de!Trichoderma(asperellum!cepa!T34! En!el!momento!del!trasplante!también!se!inoculó!con!Trichoderma,!se!sumergieron!las!raíces!de!las! plántulas!en!una!suspensión!de!103!conidias!mL-1!agua.!Posteriormente!se!aplicaron!104!conidias!g-1!a! partir!de!una!suspensión!con!1,5!105!conidias!mL-1!agua!en!diferentes!puntos!de!la!superficie!de!la! maceta!(García-López!et!al.,!2016).! ! ! A! B! Mireya!Galeote!Cobos! 16! ! • Ácidos!orgánicos! Justo! antes! del!trasplante,!se! aplicó! ácido! cítrico! en! el! medio.!Se! aplicaron!200! mg! C! kg! medio! de! cultivo-1!.! 3.5. Análisis!del!medio!y!material!vegetal! Tras! el! experimento! se! analizó! pH! y! CE! en! el! medio,! actividades! enzimáticas! (β-Glucosidasa! y! fosfatasa),!sideróforos,!ácidos!orgánicos,!plating!para!determinar!el!número!de!unidades!formadoras! de!colonia!(CFU)!en!el!medio,!Fe!y!Zn!extraíble!por!DTPA,!P!Olsen,!biomasa!seca!y!uptake!de!la!planta! (Zn!y!P).! 3.5.1. !Análisis!del!medio! El!medio!de!cultivo!se!guardó!en!tubos!falcon!para!su!posterior!análisis,!conservado!en!el!frigorífico.!Se! realizaron!los!siguientes!determinaciones:! • pH!y!CE:! Se!tomó!una!relación!1:5!(p/v)!de!suelo!y!agua.!Se!agitó!durante!30!minutos!y!se!centrifugó!10!minutos! a!2500!rpm.!Tras!extraer!una!alícuota!de!10!ml!se!procedió!a!leer!la!CE!y!el!pH!de!cada!muestra.! • Actividades!Enzimáticas! o Fosfatasa:!Se!siguió!el!procedimiento!de!Tabatabai!y!Bremmer!(1969)!descrito! por!Eivazi!y!Tabatai!(1988).!Se!pesaron!2!g!de!suelo!(control!y!dos!repeticiones! de!cada!muestra)!y!se!le!añadieron!4!ml!de!buffer!universal!(MUB)!y!1!ml!de!pnitrophenilfosfato!(PNP).!La!muestra!se!agitó!y!se!dejó!incubar!al!baño!maría! durante!1!hora!a!37ºC.!Transcurrido!ese!tiempo!se!paró!la!reacción!añadiendo! 1!ml!de!Ca!Cl2!0,5!M!y!4!ml!de!NaOH!0,5!M.!Posteriormente!se!midió!mediante! espectofotometría! visible!a! 410! nm.! Se! determinó! la! cantidad! de! pnitrophenilfosfato!(PNP).!! o ß-Glucosidasa:! Se! siguió! el! procedimiento! de! Eivazi! y! Tabatai! (1988).! Se! pesaron! 2! g! de! suelo! (testigo! y! dos! repeticiones! de! cada! muestra)! y! se! le! añadieron! 4! ml! de! buffer! universal! (MUB)! y! 1! ml! de! p-nitrophenyl-ß-D- glucoside!(PNG).!La!muestra!se!agitó!y!se!dejó!incubar!al!baño!maría!durante!1! hora!a!37ºC.!Transcurrido!ese!tiempo!se!paró!la!reacción!añadiendo!1!ml!de!Ca! Cl2!0,5! M! y! 4! ml! de! THAM!a! pH! 12.! Posteriormente! se! midió! mediante! Mireya!Galeote!Cobos! 17! ! espectofotometría! visible.! Se! determinó! la! cantidad! de! p-nitrophenyl-ß-D- glucoside!(PNG).! • Sideróforos! Se!realizó!una!extracción!con!NaOH!0,1!M,!en!una!relación!1:1!de!p/v!.!Se!centrifugó!10!minutos!a! 2500!rpm!y!se!filtró.!Se!utilizaron!2!ml!para!analizar!sideróforos!(Schwyn!&!Neilands,!1987).! • Ácidos!orgánicos! Se!realizó!una!extracción!con!NaOH!0,1!M,!en!una!relación!1:1!p/v.!Se!pesaron!5!g!de!medio!rizosférico! y!se!le!añadieron!5!ml!de!NaOH!0,1!M.!Se!agitó!a!160!rpm!durante!90!minutos,!se!centrifugó!durante! 10!minutos!a!2500!rpm!y!se!ultracentrifugó!a!12000!rpm!durante!15!minutos.!Tras!ese!proceso!se! obtuvo!una!alícuota!que!se!filtró!(filtro!de!0,25!mm)!y!se!midió!con!HPLC!(Gao!et!al.,!2012).! ! • Plating! Se!realizó!un!recuento!de!Trichoderma(asperellum(cepa!T34!y!Bacillus(subtilis!(en!placa!(García-López! et!al.,!2016).!Se!realizó!una!extracción!con!Na-pirofosfato!en!5!g!de!suelo!húmedo!rizosférico,!se!diluyó! con!agar!agua!hasta!la!concentración!de!suelo!óptima!y!se!sembró!mediante!arrastre!en!placa!Petri.!Se! utilizó!un!medio!selectivo!para!cada!uno!de!los!microorganismos!como!describe!Borrero!et!al.!(2012).! Las!unidades!formadoras!de!colonias!(CFU)!se!contaron!7!días!después!de!la!siembra!y!se!expresaron! como!CFU!por!gramo!de!medio!de!cultivo! • DTPA! Se!analizó!el!contenido!de!Fe!y!Zn!mediante!una!extracción!1:4!p/v!en!DTPA/TEA/CaCl2!con!un!pH! ajustado!a!7,3!(Lindsay!&!Norvell,!1978).!La!extracción!se!realiza!durante!2!horas!en!un!agitador!de! vaivén!a!120!rpm!y!posteriormente!se!centrifuga!a!2500!rpm.!De!ahí!se!obtiene!el!extracto!para!hacer! las!determinaciones!de!Fe!y!Zn!con!absorción!atómica.!! • P!Olsen! Mediante!una!extracción!con!2!g!de!suelo!y!40!ml!de!extractante,!NaHCO3!0,5!M!a!pH!8,5,!(Olsen!et!al.,! 1954)!determinándose!la!concentración!de!P!en!el!extracto!según!Murphy!et!al.!(1962).! 3.5.2. Análisis!del!material!vegetal! Mireya!Galeote!Cobos! 18! ! Se!levantó!el!ensayo!y!se!separó!la!parte!aérea!de!la!raíz.!La!raíz!se!lavó!con!agua!desionizada!y!se! introdujo!en!un!baño!de!ultrasonido!durante!1!minuto.!Tras!este!proceso,!se!volvió!a!lavar!con!agua! desionizada!y!se!puso!a!secar,!para!posteriormente!ser!pesada.!La!parte!aérea!se!guardó!en!sobres! debidamente!identificados!en!la!estufa!para!su!posterior!procesado.!Tras!el!secado,!se!pesó!y!se!picó!la! raíz!y!la!parte!aérea!de!cada!una!por!separado.!Se!calcinó!en!la!mufla!durante!8!horas!a!550!ºC.!Las! cenizas!se!llevaron!a!ebullición!con!10!ml!de!HCl!1!N!durante!15!minutos.!Tras!este!proceso!se!volvió!a! llevar!hasta!un!volumen!de!10!ml!con!agua!desionizada,!y!así!ajustar!la!concentración!en!1!N!de!HCl.!En! la!disolución!resultante!se!determinaron!Fe!y!Zn!mediante!absorción!atómica,!y!la!concentración!de! fósforo!molibdato!reactivo!(MRP)!a!través!de!colorimetría,!según!Murphy!et!al.!(1962).! 3.6. Análisis!estadístico! Para! el! análisis! estadístico! se! utilizó! el! programa! Statgraphics! Plus! 5.1.! Se! realizó! un! análisis! multifactorial!de!la!varianza!(ANOVA).!Previamente!se!comprobó!la!normalidad!de!los!datos!(test!de! Smirnoff-Kolmogorov)!y!de!homogeneidad!de!la!varianza!(test!de!Levene).!Si!no!se!cumplían!alguno!de! ellos,!los! datos!se!transformaron!para!cumplir!con! estas! premisas!(transformaciones!logarítmicas!o! potencial).!Se!realizó!un!análisis!con!los!tres!factores!definidos!en!el!diseño!experimental,!excepto!para! el!Zn!extraíble!por!DTPA!después!del!cultivo!ya!que!tenían!una!distribución!bimodal.!Las!medias!se! compararon!según!el!test!de!LSD!para!un!nivel!de!probabilidad!del!5%.!Cuando!la!interacción!entre! factores!era!significativa,!el!efecto!de!los!factores!principales!no!puede!ser!estudiado,!ya!que!el!efecto! de!un!factor!depende!del!nivel!del!otro.!En!estos!casos,!la!interacción!se!estudió!mediante!la!gráfica!de! interacción.!! 4. RESULTADOS!Y!DISCUSIÓN! El!efecto!de!los!factores!estudiados!(ANOVA)!sobre!las!variables!medidas!en!planta!y!en!medio!de! cultivo!se!presentan!de!manera!global!en!la!Tabla!4.!Hubo!un!efecto!significativo!de!la!forma!de!Zn! aplicada! en! el! medio! y! del! tratamiento! con! microorganismos/ácidos! orgánicos! en! la! materia! seca! acumulada!en!la!parte!aérea!y!en!la!materia!seca!total.!El!tratamiento!microorganismo/ácidos!orgánico! afectó!significativamente!la!absorción!total!de!Zn!y!la!actividad!β-glucosidasa.!La!dosis!de!P!tuvo!un! efecto!significativo!en!las!actividades!enzimáticas!estudiadas!y!en!el!pH!en!la!rizosfera!tras!el!cultivo! (Tabla!4).!! Cuando!se!analizó!el!Zn!extraíble!por!DTPA!por!separado!para!ambas!formas!de!aplicación!de!este! nutriente,! hubo! una! interacción! significativa! entre! tratamiento! y! dosis! de! P! (Tabla! 5).! Hubo! interacciones!significativas!entre!la!forma!de!Zn!en!el!medio!y!el!tratamiento!en!las!concentraciones!de! Mireya!Galeote!Cobos! 19! ! Zn!en!raíz!y!tallo,!en!la!absorción!total!de!P!y!en!la!actividad!fosfatasa!en!el!medio!(Tabla!4).!Por!otra! parte,!también!fue!significativa!la!interacción!entre!la!forma!de!Zn!y!la!dosis!de!P!en!la!concentración! de!Zn!en!tallos,!en!la!absorción!total!de!Zn!y!en!los!ácidos!orgánicos!en!la!rizosfera.!!! La!mayor!producción!de!materia!seca!(aérea!y!total)!se!produjo!cuando!el!Zn!está!asociado!a!los!óxidos! (Tabla! 6).! También! podemos! observar! que! la! cantidad! de! biomasa! y! la! absorción! total! de! Zn! es! significativamente! menor! con! la! aplicación! de! ácidos! orgánicos! que! con! la! inoculación! con! microorganismos.!Por!el!contrario,!la!mayor!actividad!β-glucosidasa!se!observó!cuando!se!aplicaron! ácidos!orgánicos.!Esto!pone!de!manifiesto!que!la!adición!de!esta!fuente!de!C!incrementó!la!actividad! microbiana.! Este! incremento! de! la! actividad! microbiana! no! parece! traducirse! en! una! mejora! en! la! nutrición! de! la! planta,! quizás! poniendo! de! manifiesto! cierto! efecto! de! competencia.! Las! dosis! crecientes!de!P!incrementaron!la!absorción!de!P!por!la!planta!y!las!actividades!enzimáticas!(Tabla!6).! Esto!último!puede!deberse!a!un!mayor!desarrollo!radicular!que!puede!provocar!una!mayor!exudación! de! compuestos! orgánicos! en! la! rizosfera! y! una! mayor! actividad! microbiana.! Parte! de! la! actividad! fosfatasa!puede!deberse!a!la!propia!raíz!(García-López!et!al.!2015).! El!efecto!de!los!tratamientos!en!la!concentración!de!Zn!en!la!planta,!tanto!en!raíz!(Figura!1),!!como!en! la!parte!aérea!(Figura!2),!varió!dependiendo!de!las!formas!en!las!que!el!Zn!está!presente!en!el!medio,! como! pone! de! manifiesto! la! interacción! significativa! observada! (Tabla! 4).! En! general,! todos! los! tratamientos! con! microorganismos! o! ácidos! orgánicos! dieron! peores! resultados! que! el! testigo,! a! excepción!de!los!ácidos!orgánicos!en! la!concentración!de!Zn!en!parte!aérea!cuando!este!nutriente! estaba! asociado! a! carbonatos.! Cuando! el! Zn! estaba! presenta! asociado! a! óxidos,! el! efecto! de! la! aplicación! de! ácidos! orgánicos! fue! muy! negativo! en! comparación! al! testigo,! reduciendo! su! concentración!en!la!parte!aérea!en!un!40!%!(Figura!2).!Esto!puede!poner!de!manifiesto,!que!si!en!bien! en! los! medios! calcáreos! puede! haber! cierto! efecto! beneficioso! por! promover! la! disolución! de! Zn! asociado!a!carbonatos,!cuando!se!aplica!el!Zn!como!óxidos!no!hay!beneficio!alguno.!En!este!último! caso,!quizás!el!efecto!que!prima!es!un!incremento!de!actividad!microbiana!y!probable!competencia! por! el! Zn! con! el! cultivo.! La! mayor! concentración! de! Zn! en! la! raíz! cuando! este! está! asociado! a! carbonatos!puede!ser!la!consecuencia!del!menor!desarrollo!que!tienen!las!plantas!en!los!medios!en!los! que!el!Zn!se!aporta!asociado!a!carbonatos.!El!menor!desarrollo!puede!dar!lugar!a! concentraciones! mayores!por!una!menor!dilución!del!nutriente!adsorbido.!Sin!embargo,!en!cuanto!a!la!acumulación!de! Zn!en!la!parte!área!ocurre!a!la!inversa!que!en!la!raíz.!La!concentración!de!Zn!en!la!parte!aérea!es!mayor! cuando!el!Zn!está!asociado!a!los!óxidos!en!vez!de!a!carbonatos!(Figura!2.).!!Por!tanto,!el!efecto!no! puede! explicarse! como! una! dilución.! La! forma! en! la! que! se! aplica! el! Zn! está! condicionando! Mireya!Galeote!Cobos! 20! ! probablemente!de!diferente!manera!las!acumulaciones!en!raíz!y!en!parte!aérea.!Cuando!se!aplica!en! asociado!a!óxidos,!se!favorecen!mayores!concentraciones!en!parte!aérea!y!menores!concentraciones! en!raíz.! El!efecto!de!la!dosis!de!P!en!la!concentración!de!Zn!en!la!parte!aérea!dependió!de!la!forma!en!la!que!el! Zn!estaba!presente!en!el!medio!(Figuras!3!y!4)!como!revela!la!interacción!significativa!observada!(Tabla! 1).! La! concentración! de! Zn! en! tallos! disminuye! con! las! dosis! crecientes! de! P! cuando! el! Zn! estaba! asociado! a! carbonatos,! mientras! que! el! efecto! contrario! se! observa! cuando! el! Zn! está! asociado! a! óxidos!(Figura!3).!En!el!Zn!total!en!planta,!el!efecto!negativo!a!bajas!dosis!no!es!tan!evidente!como!el! descrito!antes,!pero!las!dos!dosis!más!altas!de!P!dan!lugar!a!mayores!extracciones!de!Zn!que!la!más! baja!(Figura!4).!Esto!pone!de!manifiesto!que!el!posible!antagonismo!es!más!evidente!cuando!el!Zn!está! asociado!a!carbonatos,!mientras!que!el!P!puede!beneficiar!la!acumulación!de!Zn!si!este!está!asociado!a! óxidos.!Este!efecto!beneficioso!puede!deberse!a!que!el!P!puede!competir!por!lugares!de!adsorción,! promoviendo!la!liberación!de!Zn!adsorbido!en!los!óxidos.!! Mireya'Galeote'Cobos' 21' ' ' Biomasa1' DM'parte' aérea1' Concentración' Zn'Raíz2' Concentración' Zn'tallos' Absorción' total'de'Zn2' Absorción' total'de'P2' Ácidos' orgánicos' ß- Glucosidasa1' Fosfatasa1' pH3' Zn' DTPA3' Fuente'de'variación' –––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––'Valor'de'P–––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––''' Forma'Zn' 0.0000' 0.0000' 0.0000' 0.0039' 0.0000' 0.4570' 0.9778' 0.6944' 0.0000' 0.0003' 0.0000' Tratamiento' 0.0019' 0.0049' 0.0125' 0.3026' 0.0018' 0.0007' 0.8083' 0.0003' 0.0000' 0.7963' 0.9798' Dosis'P' 0.3637' 0.3617' 0.1170' 0.1412' 0.1857' 0.0234' 0.0000' 0.0006' 0.0455' 0.0146' 0.9204' Forma'Zn*Tratamiento' 0.0522' 0.1059' 0.0374' 0.0447' 0.1034' 0.0122' 0.0630' 0.8193' 0.0234' ' ' Forma'Zn*Dosis'P' 0.4772' 0.6541' 0.0795' 0.0050' 0.0223' 0.2869' 0.0020' 0.0969' 0.1055' ' ' Tratamiento*Dosis'P' 0.4839' 0.4934' 0.3649' 0.5645' 0.2438' 0.3018' 0.0912' 0.4351' 0.9599' ' ' Forma' Zn*Tratamiento*Dosis'P' 0.3400' 0.2463' 0.1973' 0.0476' 0.3947' 0.1630' 0.0145' 0.6944' 0.8217' ' ' Ácidos'orgánicos,'pH,''en'rizosfera' 1'Transformación'logarítmica'(base'10)'para'cumplir'requisitos'de'normalidad'(Shapiro-Wilk)'y'homodedasticidad'(Levene)' 2'Transformación'X–0.8'para'la'concentración'de'Zn'en'raíz;''X0.14'para'absorción'total'de'Zn,'X0.19'para'absorción'total'de'P' 3'Test'de'Kruskal-Wallis'para'factores'principales'ya'que'no'se'ajusta'a'normalidad;'no'se'pueden'estudiar'interacciones' Tabla%4.%Efecto%de%los%diferentes%factores%(ANOVA)%estudiados%en%las%variables%del%cultivo%y%del%medio%de%crecimiento% ' Zn'en' carbonatos' Zn'en'óxidos' Fuente'de'variación' ' ' Tratamiento' 0.0173' 0.0650' Dosis'P' 0.0643' 0.3323' Tratamiento*Dosis'P' 0.0183' 0.0926' Tabla%5.%Efecto%de%los%diferentes%factores%(ANOVA)%para%las%dos%fuentes%de%Zn%utilizadas%en%el%Zn%extraíble%por%DTPA% Mireya'Galeote'Cobos' 22' ' ' ' ' Biomasa'total' (g)' Biomasa'aérea' (g)' Absorción'total'Zn' (mg'Zn/kg'suelo)' Absorción'total'P' (mg'P/kg'suelo)' ß-Glucosidasa' (µg'PNG/g'suelo)' Fosfatasa' (µg'PNP/g'suelo)' pH1' Forma'Zn' Carbonato' 0.10B' 0.07B' ' ' ' ' ' Óxido' 0.17A' 0.12A' ' ' ' ' ' Tratamiento' Ácidos'Orgánicos' 0.12b' 0.08b' 5.8b' ' 1.43a' ' ' Testigo' 0.14a' 0.10ab' 7.9a' ' 0.60b' ' ' Trichoderma' 0.14a' 0.10a' 8.5a' ' 0.51b' ' ' Bacillus' 0,15a' 0.11a' 8.7a' ' 0.87ab' ' ' Dosis'P' P1' ' ' ' 174β' 0.35'β' 26'β' 8.05'α' P2' ' ' ' 210'α'β' 0.52'β' 34'β' 7.99'β' P3' ' ' ' 246'α' 1.70'α' 54'α' 8.00'β' 4.1.1. El'efecto'de'los'factores'principales'no'se'puede'discutir'si'están'implicados'en'interacciones'significativas' 4.1.2. Letras' mayúsculas' diferentes' indican' medias' significativamente' distintas' para' formas' de' Zn;' letras' minúsculas' distintas' indican' medias' significativamente' distintas'para'Tratamiento;'letras'griegas'diferentes'indican'medias'significativamente'distintas'para'las'dosis'de'P.'Test'LSD'P'<'0.05' 1'Medianas'significativamente'distintas' Tabla%6.%Efecto%de%los%factores%principales% Mireya'Galeote'Cobos' 23' ' Figura'1.'Efecto'de'la'interacción'de'la'forma'de'adición'de'Zn'en'el'medio'y'los'tratamientos'de'ácido'cítrico'e' inoculación'con'microorganismos'en'la'concentración'de'Zn'en'raíz' ' Figura'2.'Efecto'de'la'interacción'de'la'forma'de'adición'de'Zn'en'el'medio''y'los'tratamientos'de'ácido'cítrico'e' inoculación'con'microorganismos'en'la'concentración'de'Zn'en'la'parte'aérea' ' Gráfica de Interacciones Medio 14 18 22 26 30 34 38 Raíz Zn (mg/kg ms) Carbonatos Zn Oxidos Zn Tratamiento Bacillus Testigo Trichoderma Ácidos Orgánicos Tratamientos Bacillus Testigo Trichoderma Ácidos Orgánicos Formas'de'Zn'en'el'medio' ' Asociado(a(Carbonatos( ( Asociado(a(Óxidos( ( Medio 13 15 17 19 21 Paérea Zn (mg/kg ms) Carbonatos Zn Oxidos Zn Tratamiento Bacillus Testigo Trichoderma Ácidos Orgánicos Tratamientos Bacillus Testigo Trichoderma Ácidos Orgánicos Formas'de'Zn'en'el'medio' ' Asociado(a(Carbonatos( ( Asociado(a(Óxidos( ( Mireya'Galeote'Cobos' 30' ' 6. 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