Efecto sobre la recombinación homóloga de la distribución de las histonas parentales y la localización de los obstáculos de replicación en las cadenas nacientes

Efecto sobre la Recombinación Homóloga de la distribución de las histonas parentales y la localización de los obstáculos de replicación en las cadenas nacientes Trabajo realizado por la Graduada Cristina González Garrido en el Departamento de Biología del Genoma de CABIMER y en el Departamento de Bioquímica Vegetal y Biología Molecular de la Universidad de Sevilla, para optar al título de Doctora por la Universidad de Sevilla Sevilla, 2024 El director de la tesis, El tutor de la tesis, Cristina González Garrido Félix Prado Velasco Antonio Jesús Díaz Quintana PRADO VELASCO JOSE FELIX - I ÍNDICE DE CONTENIDOS ABREVIATURAS ............................................................................................................................... IX 1. INTRODUCCIÓN ........................................................................................................................... 1 1.1. Replicación del ADN ............................................................................................................. 3 1.2. Ensamblaje de la cromatina acoplado a la replicación ........................................................ 6 1.2.1. Incorporación de histonas de nueva síntesis ................................................................ 7 1.2.2. Reciclaje de histonas parentales ................................................................................. 10 1.3. Tolerancia a daños replicativos .......................................................................................... 12 1.3.1. Regulación de la respuesta DDT mediante modificaciones postraduccionales de PCNA ...................................................................................................................................... 14 1.3.2. Tolerancia a daños en el ADN mediante TLS .............................................................. 16 1.3.3. Tolerancia a daños en el ADN mediante mecanismos de cambio de molde .............. 18 1.3.3.1. Relleno de ssDNA por HR dependiente de ubiquitinación de PCNA .......................... 18 1.3.3.2. Relleno de ssDNA por HR independiente de ubiquitinación de PCNA ....................... 20 1.3.3.3. Reversión de la horquilla ............................................................................................ 21 1.3.4. Balance entre los mecanismos de TLS y cambio de molde ......................................... 22 1.4. Cromatina y tolerancia al daño en el ADN ......................................................................... 23 2. OBJETIVOS ................................................................................................................................. 27 3. RESULTADOS .............................................................................................................................. 31 3.1. Papel del reciclaje de las histonas parentales en la DDT ................................................... 33 3.1.1. El reciclaje de las histonas histonas parentales contribuye a la resistencia a MMS mediante mecanismos de HR ............................................................................................... 33 3.1.2. El reciclaje de histonas parentales facilita la reparación de los fragmentos de ssDNA inducidos por MMS, en parte evitando una distribución sesgada de histonas parentales .. 38 3.1.3. La recombinación defectuosa de los mutantes de reciclaje de histonas redirige la reparación de los fragmentos de ssDNA hacia la ruta de TLS ............................................... 46 3.1.4. Un exceso de histonas parentales en la cadena adelantada del mutantes mcm2-3A desestabiliza las SCJs inducidas por MMS............................................................................. 47 3.1.5. La desestabilización de SCJs en el mutante mcm2-3A se suprime en ausencia de la helicasa Srs2 .......................................................................................................................... 51 3.1.6. La localización de un complejo dCas9*/R-loop en la cadena rezagada o adelantada determina la ruta de deposición de histonas parentales requerida para la HR ................... 52 3.2. Requerimientos genéticos de la HR en función de la localización de los complejos dCas9*/R-loops en las cadenas nacientes. ............................................................................... 59 3.2.1. Funciones que participan en la recombinación inducida por complejos dCas9*/R- loops en la cadena rezagada y adelantada ........................................................................... 62 II 3.2.2. Funciones que participan de manera específica en la recombinación inducida por complejos dCas9*/R-loops en la cadena rezagada ............................................................... 66 3.2.3. Funciones que participan de manera específica en la recombinación inducida por complejos dCas9*/R-loops en la cadena adelantada ........................................................... 69 3.2.4. Mutantes que aumentan la recombinación inducida por complejos dCas9*/R-loops en la cadena rezagada y adelantada ..................................................................................... 71 3.2.5. La ausencia de Elg1 y Exo1 aumenta de manera específica la recombinación inducida por complejos dCas9*/R-loops en la cadena adelantada y rezagada, respectivamente ..... 71 4. DISCUSIÓN ................................................................................................................................. 75 4.1. El reciclaje de histonas parentales controla la estabilidad de los intermediarios de HR durante la respuesta de DDT .................................................................................................... 77 4.2. La desestabilización de SCJs en el mutante mcm2-3A se suprime en ausencia de la helicasa Srs2 .............................................................................................................................. 79 4.3. Funciones adicionales del reciclaje de histonas en DDT .................................................... 79 4.4. Los defectos en HR de los mutantes de reciclaje de histonas canalizan la reparación de las lesiones en el ADN hacia TLS ............................................................................................... 80 4.5. La localización de complejos dCas9*/R-loops en la cadena rezagada o adelantada determina la ruta de deposición de histonas parentales requerida para la HR ....................... 80 4.6. Requerimientos genéticos para la HR inducida por complejos dCas9*/R-loops en la cadena rezagada ....................................................................................................................... 83 4.7. Requerimientos genéticos para la HR inducida por complejos dCas9*/R-loops en la cadena adelantada .................................................................................................................... 85 5. CONCLUSIONES .......................................................................................................................... 89 6. MATERIALES Y MÉTODOS ......................................................................................................... 93 6.1. Estirpes ............................................................................................................................... 95 6.2. Oligonucleótidos .............................................................................................................. 107 6.3. Plásmidos ......................................................................................................................... 109 6.4. Anticuerpos ...................................................................................................................... 111 6.5. Medios y condiciones de cultivo ...................................................................................... 111 6.6. Reactivos químicos ........................................................................................................... 112 6.6.1. Antibióticos ............................................................................................................... 112 6.6.2. Drogas e inhibidores ................................................................................................. 113 6.6.3. Otros compuestos ..................................................................................................... 113 6.7. Enzimas ............................................................................................................................ 115 6.8. Ensayos comerciales ........................................................................................................ 116 6.9. Tampones ......................................................................................................................... 116 6.10. Transformación de células ............................................................................................. 116 6.10.1 Transformación de bacterias ................................................................................... 116 6.10.2 Transformación de levadura .................................................................................... 117 6.11. Sincronización de cultivos de levaduras ........................................................................ 117 III 6.12. Análisis de viabilidad y sensibilidad a agentes genotóxicos .......................................... 117 6.13. Ensayos de recombinación homóloga y mutagénesis ................................................... 117 6.14. Citometría de flujo ......................................................................................................... 118 6.15. Manipulación y análisis de ADN ..................................................................................... 118 6.15.1. Extracción de ADN plasmídico de bacterias ............................................................ 118 6.15.2. Extracción ADN genómico de levaduras ................................................................. 118 6.15.2.1. Extracción estándar ................................................................................................ 118 6.15.2.2. Extracción G2/CTAB ................................................................................................ 119 6.15.3. PCR .......................................................................................................................... 119 6.15.4. Análisis de cortes de doble cadena mediante qPCR ............................................... 120 6.16. Análisis de reclutamiento de proteínas al ADN mediante Corte Endógeno de cromatina (ChEC) ...................................................................................................................................... 120 6.17. Análisis de intermediarios replicativos en geles bidimensionales ................................. 121 6.18. Análisis de fragmentos de ADN por Southern blot ........................................................ 121 6.19. Extracción estándar de proteínas .................................................................................. 122 6.20. Co-inmunoprecipitación................................................................................................. 123 6.21. Fraccionamiento celular ................................................................................................. 123 6.22. Detección y cuantificación de proteínas mediante western blot .................................. 124 6.22. Análisis de los focos de Rad52-YFP, Rad54-YFP y Rfa1-YFP ........................................... 125 7. APÉNDICE ............................................................................................................................ 127 8. BIBLIOGRAFÍA ..................................................................................................................... 141 9. PUBLICACIONES .................................................................................................................. 169 IV V ÍNDICE DE FIGURAS Figura I1. Iniciación de la replicación. .............................................................................................. 4 Figura I2. Componentes y dinámica de la horquilla de replicación. ................................................ 6 Figura I3. Ensamblaje de histonas de nueva síntesis acoplado a la replicación. ............................. 8 Figura I4. Reciclaje de histonas parentales durante la replicación ................................................ 10 Figura I5. Esquema de los mecanismos de DDT............................................................................. 13 Figura I6. Regulación de las rutas de DDT por ubiquitinación y sumoilación de PCNA. ................ 15 Figura I7. Funciones antirecombinogénicas de Srs2. Ver texto para más detalles. ...................... 16 Figura I8. Representación esquemática de la HR dependiente de poliubiquitinación de PCNA asociada a la formación de SCJ ...................................................................................................... 19 Figura I9. Modelo propuesto para la reversión de la horquilla de replicación. ............................ 22 Figura R1.1. Viabilidad, progresión del ciclo celular y presencia de daño en el ADN en los mutantes de reciclaje de histonas parentales en condiciones no perturbadas ............................ 34 Figura R1.2. Análisis de la respuesta a MMS en mutantes de reciclaje de histonas parentales ... 35 Figura R1.3. El reciclaje de histonas parentales contribuye a la resistencia a MMS a través de HR ........................................................................................................................................................ 37 Figura R1.4. El reciclaje de histonas parentales contribuye a la resistencia a MMS a través de HR ........................................................................................................................................................ 38 Figura R1.5. El reciclaje de histonas parentales facilita la reparación de fragmentos de ssDNA inducidos por MMS en los centros de reparación marcados con Rfa1-YFP .................................. 40 Figura R1.6. El reciclaje de histonas parentales facilita la reparación de los fragmentos de ssDNA inducidos por MMS en los centros de reparación marcados con Rfa1-YFP .................................. 41 Figura R1.7. El reciclaje de histonas parentales facilita la reparación de los fragmentos de ssDNA inducidos por MMS en los centros de reparación marcados con Rad52-YFP ............................... 43 Figura R1.8. El reciclaje de histonas parentales facilita la reparación de los fragmentos de ssDNA inducidos por MMS en los centros de reparación marcados con Rad54-YFP ............................... 45 Figura R1.9. Los defectos en HR de los mutantes de reciclaje de histonas redirigen la reparación de los fragmentos ssDNA a TLS ...................................................................................................... 46 VI Figura R1.10. El reciclaje de las histonas parentales no es necesario para la unión de Rad52 a los fragmentos de ssDNA inducido por MMS...................................................................................... 48 Figura R1.11. Un exceso de histonas parentales en la cadena adelantada en el mutante mcm2- 3A desestabiliza las SCJs inducidas por MMS ................................................................................ 49 Figura R1.12. Caracterización complementaria de mutantes de reciclaje de histonas parentales en ausencia y presencia de agentes genotóxicos .......................................................................... 51 Figura R1.13. La desestabilización de SCJs en mcm2-3A se suprime en ausencia de Srs2 ............ 52 Figura R1.14. Caracterización de un sistema de uSCE inducido por la unión específica a cadena de un complejo dCas9*/R-loop ...................................................................................................... 55 Figura R1.15. La localización de un complejo dCas9*/R-loop en la cadena rezagada o adelantada determina la vía de deposición de histonas parentales requerida para HR .................................. 56 Figura R2.1. Frecuencia de uSCE inducida por complejos dCas9*/R-loops en la cadena adelantada ..................................................................................................................................... 61 Figura D1. La distribución de las histonas parentales y la localización del obstáculo en las cadenas nacientes regulan la HR. .................................................................................................. 78 Figura D2. Modelo de HR inducido por un dCas9*/R-loop en la cadena rezagada y adelantada, respectivamente ............................................................................................................................ 84 VII ÍNDICE DE TABLAS Tabla R2.1. Factores analizados en este estudio ........................................................................... 60 Tabla R2.2. Funciones que participan en la recombinación inducida por complejos dCas9*/R- loops en la cadena rezagada y adelantada .................................................................................... 64 Tabla R2.3. Funciones no implicadas en la recombinación inducida por complejos dCas9*/R- loops ............................................................................................................................................... 65 Tabla R2.4. Funciones que participan de manera específica en la recombinación inducida por complejos dCas9*/R-loops en la cadena rezagada ........................................................................ 68 Tabla R2.5. Funciones que participan de manera específica en la recombinación inducida por complejos dCas9*/R-loops en la cadena adelantada .................................................................... 70 Tabla R2.6. Mutantes que aumentan la recombinación inducida por complejos dCas9*/R-loops en la cadena rezagada y adelantada. ............................................................................................. 73 Tabla R2.7. La ausencia de Elg1 aumenta de manera específica la recombinación inducida por complejos dCas9*/R-loops en la adelantada ................................................................................. 73 Tabla R2.8. La ausencia de Exo1 aumenta de manera específica la recombinación inducida por complejos dCas9*/R-loops en la cadena rezagada ........................................................................ 73 Tabla M1. Estirpes utilizadas en esta tesis ..................................................................................... 96 Table M2. Lista de oligonucleótidos utilizados en esta tesis. ...................................................... 107 Tabla M3. Plásmidos. ................................................................................................................... 109 Tabla M4. Anticuerpos. ................................................................................................................ 111 Introducción 4 S. cerevisiae, los orígenes de replicación contienen elementos específicos llamados secuencias de replicación autónoma (ARS) (Palzkill & Newlon, 1988) que son reconocidos por el complejo de reconocimiento de orígenes (ORC, del inglés “Origin Recognition Complex”) (Bell & Stillman,1992; Diffley et al., 1994; Rowley et al., 1995). Al final de mitosis, la reducción de los niveles de quinasa dependiente de ciclina (CDK, del inglés “Cyclin Dependent Kinase”, Cdc28 en S. cerevisiae) permite que la proteína Cdc6 se una a ORC (Diffley, 2011; Liang et al., 1995; Speck et al., 2005). La hidrólisis de ATP por Cdc6 permite la carga de la helicasa replicativa de MCM (hexámero en forma de anillo formado por las subunidades Mcm2-7) junto con Cdt1 al ADN de doble cadena (dsDNA, del inglés “double strand DNA”) (Bochman & Schwacha, 2009; Labib et al., 2001; Randell et al., 2006; Tanaka & Diffley, 2002). Posteriormente, la hidrólisis de ATP por ORC desplaza a MCM del origen, permitiendo la carga de la siguiente molécula de MCM. El resultado de este proceso son dos complejos MCM inactivos cargados alrededor del dsDNA de los orígenes de replicación (pre-RC) (Figura I1A) (Remus et al., 2009). Figura I1. Iniciación de la replicación. (A) En G1, la baja actividad quinasa permite que ORC reclute a Cdc6 y MCM junto con Cdt1, formando el pre-RC donde la helicasa MCM en estado inactivo se encuentra unida al dsDNA. (B) A principios de la fase S, las actividades CDK y DDK inducen la formación del pre-IC, donde la helicasa MCM junto con Cdc45 y GINS (CMG) quedan unidos al ssDNA en estado activo. Ver texto para más detalles. La activación de los orígenes de replicación comienza durante la transición G1-S como consecuencia del incremento de las actividades quinasa de CDK y de DDK (del inglés “Dbf4 Dependent Kinase”; Cdc7 en S. cerevisiae), las cuales van a inducir el ensamblaje escalonado de múltiples proteínas adicionales necesarias para la formación del complejo de pre-iniciación (pre- IC) (Tanaka & Araki, 2013). Entre estas proteínas se encuentran los factores Cdc45 y GINS que se unen de manera estable a MCM para formar el complejo CMG (Gambus et al., 2006; Moyer et al., Introducción 5 2006; Pacek et al., 2006). Durante este proceso, las actividades CDK y DDK promueven la transición de los complejos CMG inactivos unidos al dsDNA a complejos activos unidos a ADN de cadena sencilla (ssDNA, del inglés “single strand DNA”) (Figura I1B) (Boos et al., 2012; Duzdevich et al., 2015; Ticau et al., 2015). Estos orígenes se activan durante la fase S siguiendo un programa temporal altamente regulado (Raghuraman et al.,2001; Wyrick et al., 1992). Una vez activada, la helicasa CMG desenrolla el ADN, lo cual va asociado a una acumulación transitoria de ssDNA que se estabiliza mediante la unión del complejo RPA (del inglés “Replication Protein A”) (formado por Rfa1, Rfa2 y Rfa3) (Wold,1997). La activación del pre-IC se completa con el reclutamiento del complejo polimerasa α primasa (Pol α) junto con el factor PCNA (que se carga sobre el ssDNA por el complejo RFC (del inglés “Replication Factor C”)) al que se unen las polimerasas Pol δ y Pol ε. El resultado son dos horquillas de replicación activas que se mueven en direcciones opuestas desde el origen activado. Dado que la doble hélice es antiparalela y todas las polimerasas catalizan la síntesis de ADN en dirección 5’ a 3’, la replicación en cada horquilla ocurre de manera asimétrica (Georgescu et al., 2014., 2015); una cadena se sintetiza de manera continua mediante la actividad de Pol ε en la dirección que progresa el replisoma (cadena adelantada) y la otra se sintetiza de manera discontinua en la dirección opuesta a través del cebado y extensión de fragmentos discretos de aproximadamente 150 pb (fragmentos de Okazaki) (cadena rezagada) (Figura I2) (Langston et al., 2014; Nick McElhinny et al .,2008; Pursell et al., 2007). La síntesis de cada fragmento de Okazaki es iniciada a partir de un cebador inicial de ARN sintetizado por Pol α y extendido por Pol δ, y requiere las proteínas Rad27, Exo1, Dna2 y Lig1 para su correcto procesamiento y maduración (Ayyagari et al., 2003; Garg et al., 2004; Jin et al., 2003). Durante este proceso, la enzima Rnasa H se encarga de eliminar los cebadores de ARN en la cadena rezagada (Qiu et al., 1999). El acoplamiento entre la helicasa CMG y las polimerasas esta mediado por los factores Mrc1 y Ctf4 que unen físicamente MCM con Pol ε y GINS con Pol α, respectivamente (Lou et al., 2008; Simon et al., 2014). Ctf4 y Mrc1, junto con la helicasa CMG, el complejo protector de la horquilla (Tof1/Csm3), el complejo remodelador de la cromatina FACT y la topoisomerasa I constituyen el complejo de progresión del replisoma (RPC, del inglés “Replisome Progression Complex”), el cual regula la velocidad y estabilidad de la horquilla de replicación (Figura I2) (Yeeles et al., 2017). La dinámica de la horquilla de replicación está adicionalmente regulada por factores que son reclutados específicamente a regiones concretas de ADN o en condiciones específicas (Alabert, 2014; Lopez-Contreras et al., 2013; Sirbu et al., 2011). Recientemente, se ha propuesto que Pol α sintetiza un cebador de ARN que es extendido por Pol δ tanto en la cadena rezagada como adelantada hasta que establece contacto con la helicasa replicativa y se intercambia con Pol ε en la cadena adelantada (Figura I2) (Yeeles et al., 2015; Zhou et al., 2019). Introducción 6 Figura I2. Componentes y dinámica de la horquilla de replicación. Ver texto para más detalles. La terminación de la replicación ocurre cuando dos horquillas que avanzan en sentido inverso convergen o cuando una horquilla alcanza el telómero de un cromosoma (Dewar & Walter, 2017). Este proceso se encuentra regulado por el desemsamblaje de la helicasa CMG, que depende de la poliubiquitinación de Mcm7 por la E3 ubiquitina ligasa SCFDia2 y la segregasa Cdc48 (Maculins et al., 2015; Maric et al., 2014; Morohashi et al., 2009). 1.2. Ensamblaje de la cromatina acoplado a la replicación La replicación del ADN en células eucariotas ocurre en el contexto de la cromatina. La unidad básica de la cromatina es el nucleosoma, que está constituido por un octámero de histonas formado por un tetrámero H3-H4 y dos dímeros H2A-H2B envuelto por aproximadamente 147 pares de bases de ADN (Khorasanizadeh, 2004; Kornberg & Lorch, 1999). La replicación del ADN requiere que los nucleosomas se desensamblen delante de la horquilla y se vuelvan a ensamblar Introducción 7 rápidamente tras el paso de la maquinaria de replicación en las cromátidas nacientes. La duplicación del material genético hace que los nucleosomas parentales sean insuficientes para reestablecer la cromatina en las dos cadenas hijas, por lo que se complementan con histonas sintetizadas de novo. Estos dos procesos han sido estudiados extensamente en S. cerevisiae, aunque los datos existentes en células de mamífero sugieren que están altamente conservados. En líneas generales, el ensamblaje se produce mediante un proceso escalonado, donde chaperonas y ensambladores de la cromatina depositan primero el tetrámero H3-H4 y posteriormente los dos dímeros H2A-H2B. Tras la deposición, actúan complejos remodeladores dependientes de ATP y complejos modificadores de histonas que establecen las características de la cromatina específicas de cada región (Ransom et al., 2010). 1.2.1. Incorporación de histonas de nueva síntesis El principal pico de síntesis de histonas durante el ciclo celular ocurre al final de G1 y principios de S, y está estrechamente conectado con la síntesis de ADN para asegurar un correcto suministro de histonas a la horquilla (Heintz, 1991). Las histonas recién sintetizadas están acompañadas por chaperonas llamadas carioferinas (p. ej. Kap123 para el heterodímero H3-H4) desde su síntesis en el citoplasma hasta su importación al núcleo, y se modifican postraduccionalmente para facilitar su transferencia a los factores de ensamblaje de la cromatina en la horquilla de replicación (Bernardes & Chook, 2020; Ejlassi et al., 2017; Greiner et al., 2004; Mosammaparast et al., 2001, 2002). En particular, la acetilación de la cola N-terminal de H3 y H4 juega un papel importante en el ensamblaje de la cromatina (Ling et al., 1996). El complejo acetiltransferasa HAT1 acetila la histona H4 en las lisinas 5 y 12 tanto en levadura como en humanos (Figura I3A-B) (Barman et al., 2008; Parthun & Widom, 1996). Esta marca de acetilación regula tanto el transporte de histonas recién sintetizadas al núcleo como su deposición en la cromatina, siendo las histonas H4 no acetiladas descartadas del núcleo por la acción de Kap123 y del factor de ensamblaje de la cromatina (CAF1) (Glowczewski et al., 2004). El patrón de acetilación de la histona H3 es más variable evolutivamente siendo acetilada en las lisinas 9 y 27 por las acetiltransferasas Gcn5 y Rtt109 en S. cerevisiae (Figura I3A) (Burgess & Zhang, 2013; Fillingham et al., 2008). La acetilación por Gcn5 de la cola N-terminal de H3 aumenta la afinidad del dímero por CAF1 promoviendo el ensamblaje asociado a la replicación (RCNA, del inglés “Replication Coupled Nucleosome Assembly”) (Burgess et al., 2010). Introducción 8 Figura I3. Ensamblaje de histonas de nueva síntesis acoplado a la replicación. Se muestran los componentes del replisoma, chaperonas de histonas, factores de ensamblaje de la cromatina y principales acetiltransferasas con los residuos que se modifican, implicados en el ensamblaje de la cromatina en levaduras (A) y humanos (B). Las líneas discontinuas indican interacciones físicas. Consulte el texto para obtener más detalles. (Adaptado de Prado & Maya, 2017). En levaduras, una marca muy importante durante el RCNA es la acetilación de la lisina 56 de la histona H3 (H3K56ac) por Rtt109 (Figura I3A) (Driscoll et al., 2007; Han et al., 2007); de hecho, el 99% de las histonas recién sintetizadas en levaduras presentan esta modificación. Por el contrario, en humanos la acetilación de la lisina 56 por el complejo CBP sólo representa el 1,5%, mientras que la monometilación de H3.1K9 por SETDB1 es la marca mayoritaria de las histonas recién sintetizadas (Figura I3B) (Jasencakova et al., 2010). En S. cerevisiae, el papel de la acetilación de H3K56 en la deposición de histonas recién sintetizadas ha sido ampliamente estudiado. La chaperona Asf1 desempeña un papel fundamental en este proceso mediante su unión a los dímeros H3-H4 recién sintetizados y su presentación a Rtt109 para su acetilación (Han et al., 2007; Recht et al., 2006). Vps75 trabaja junto con Rtt109, que ayuda a la importación nuclear, estabilización y actividad de Rtt109 (Berndsen et al., 2008). Esta modificación aumenta la afinidad del dímero H3-H4 a los ensambladores de la cromatina CAF1 y Rtt106 (Li et al., 2008). Este proceso es facilitado por el complejo Rtt101Mms1/Mms22 en levaduras y su ortólogo CUL4DDB1 en humanos, que ubiquitinan la histona H3K56ac debilitando la interacción entre Asf1 y H3-H4 y facilitando así la transferencia a los factores de ensamblaje de la cromatina CAF1 y Rtt106 (Figura I3A-B) (Han et al., 2013). Introducción 9 CAF1 es un complejo heterotrimérico (compuesto por las subunidades Cac1, Cac2 y Cac3 en levaduras y p150, p60 y p48 en células humanas) que reconoce y se une a dímeros H3K56ac- H4. Además, la subunidad Cac1 es responsable de la tetramerización de dos dímeros H3-H4 antes de su deposición en el ADN (Liu et al., 2012, 2016; Winkler et al., 2012). Por otro lado, Rtt106 se une con alta afinidad tanto a dímeros como a tetrámeros que contienen H3K56ac (Fazly et al., 2012; Su et al., 2012). A pesar de la importancia de CAF1 y Rtt106 en el ensamblaje de la cromatina, el doble mutante cac1Δ rtt106Δ es viable, lo que sugiere que otras chaperonas participan en el proceso y pueden complementar la ausencia de CAF1 y Rtt106 (Q. Li et al., 2008). En este sentido, el complejo FACT (formado por Spt16 y Pob3 en levaduras y Spt16 y SSRP1 en humanos) interacciona tanto con CAF1 como con Rtt106 y actúa como receptor de dímeros H3K56ac (Figura I3A) (Yang et al., 2016). Existe una estrecha colaboración entre los factores de ensamblaje de la cromatina y los componentes del replisoma para la incorporación de las histonas en la cromatina. Estas interacciones aseguran un correcto acoplamiento entre los procesos de síntesis de ADN y deposición de histonas. Por ejemplo, PCNA interactúa con CAF1 y lo recluta a la horquilla de replicación, marcando así el ADN replicado para el ensamblaje de nucleosomas (Figura I3A-B) (Ben-Shahar et al., 2009; Q. Li et al., 2008; W. Zhang et al., 2020). De manera similar, el nucleofilamento de ssDNA/RPA interacciona tanto con los ensambladores de la cromatina FACT, CAF1 y Rtt106 como con las histonas parentales y de nueva síntesis (Liu et al., 2017; VanDemark et al., 2006). Recientemente, se ha demostrado que el nucleofilamento ssDNA/RPA promueve el ensamblaje de las histonas H3-H4 en el dsDNA adyacente, por lo que se ha propuesto que RPA actúe como un puente entre los complejos H3-H4/chaperonas y el ADN (S. Liu et al., 2017). Las modificaciones de histonas son necesarias no solo para el ensamblaje del tetrámero H3-H4, sino también para los heterodímeros H2A-H2B. Así, la histona H2B recién sintetizada es monoubiquitinada en la cromatina por la ubiquitina ligasa Bre1 en la lisina 123, lo cual promueve su ensamblaje y/o estabilidad (Trujillo & Osley, 2012). Además, H2BK123Ub1 estabiliza Spt16, lo que sugiere que esta modificación coopera con FACT en la deposición de histonas (Trujillo & Osley, 2012). Introducción 10 1.2.2. Reciclaje de histonas parentales Los procesos de reciclaje de histonas parentales se conocen en menos detalle, a pesar de que son esenciales para el mantenimiento de la herencia epigenética asociada a las modificaciones postraduccionales de las histonas (Stewart-Morgan et al., 2020). Recientemente, se ha demostrado que componentes de la maquinaria de replicación del ADN presentan actividades de chaperona de histonas que facilitan la deposición de histonas parentales a las cadenas nacientes. Por un lado, las subunidades Dpb3 y Dpb4 en S. cerevisiae (POLE3 y POLE4 en humanos) de Pol ε promueven la transferencia de los tetrámeros H3-H4 parentales en la cadena adelantada (Figura I4) (Bellelli et al., 2018; Yu et al., 2018). En levadura, la ausencia de Dpb3 y Dpb4 conduce a una pérdida parcial de la herencia posicional, una perturbación moderada del silenciamiento en los loci de apareamiento y un sesgo de las histonas parentales hacia la cadena rezagada (Schlissel & Rine, 2019; Yu et al., 2018). Figura I4. Reciclaje de histonas parentales durante la replicación. La helicasa MCM junto con Ctf4 y Pol α participan en el reciclaje de histonas parentales a la cadena rezagada, mientras que las subunidades Dpb3 y Dpb4 de la Pol ε participan en la deposición de las histonas parentales en la cadena adelantada. La helicasa MCM podría cooperar junto con Asf1 o FACT en el reciclaje de histonas parentales. Por otro lado, la región N-terminal de la subunidad Mcm2 de la helicasa MCM contiene un dominio de unión a histonas (HBD, del inglés “Histone Binding Domain”) que se une a las histonas H3-H4 tanto en humanos como en levadura (Foltman et al., 2013; Groth et al., 2007). Esta unión puede darse tanto con el dímero como con el tetrámero (H. Huang et al., 2015; Richet et al., 2015). Además, Mcm2 puede unirse tanto a las histonas canónicas (H3.1 y H3.2) como variantes (H3.3 y CENP-A) (Clément & Almouzni, 2015; H. Huang et al., 2015), lo que sugiere que actúa en el reciclaje de las histonas parentales en todo el genoma. La mutación de los residuos del HBD de Mcm2 da lugar a una pérdida parcial de la herencia posicional y perturbación de la Introducción 11 heterocromatina subtelomérica en S. cerevisiae, y un sesgo de histonas parentales hacia la cadena adelantada tanto en células de mamíferos como en S. cerevisiae (Foltman et al., 2013; Gan et al., 2018; Petryk et al., 2018; Schlissel & Rine, 2019). La subunidad Pol1 del complejo Pol α tanto de levaduras como de células humanas contiene un dominio de unión a histonas H2A-H2B en su extremo N-terminal que interacciona tanto con éstas como con las histonas H3-H4 (Evrin et al., 2018). En levadura, Pol α interacciona con el complejo CMG mediante el adaptador homotrimérico Ctf4 (Simon et al., 2014). Recientemente, se ha demostrado que mutaciones tanto en Ctf4 como en Pol α que disrumpen esta interacción comparten fenotipos similares con la mutación de Mcm2 en el dominio HBD: pérdida de silenciamiento en las regiones teloméricas y en los loci de apareamiento y un sesgo de histonas parentales hacia la cadena rezagada (Gan et al., 2018). Del mismo modo, la mutación en el dominio HBD de Pol1 tiene un defecto similar al mutante Pol1 defectuoso en la unión a Ctf4 (Li et al., 2020). En conjunto, estos datos sugieren que Mcm2 actúa junto con Ctf4 y Pol α en un eje que facilita la deposición de las histonas parentales en la cadena rezagada (Figura I4) (Gan et al., 2018). La chaperona de histonas Asf1 también participa en el reciclaje de histonas parentales, como sugiere el hecho de que se acumulen en células humanas complejos Mcm2/ H3-H4/ Asf1 en los que H3-H4 presentan marcas parentales (H4K16ac y H3K9me) (Groth et al., 2007). En línea con estos datos, estudios estructurales han demostrado que Mcm2 se une tanto a un tetrámero (H3-H4)2 como a un dímero (H3-H4) conjuntamente con Asf1 (H. Huang et al., 2015; Richet et al., 2015). La unión in vitro de Asf1 al tetrámero (H3-H4)2 lo divide de manera que queda unido al dímero ocluyendo la interfaz de tetramerización (Richet et al., 2015). Esta interacción entre Mcm2 y Asf1 ocurre en los sitios de replicación de células de mamíferos (Figura I4) (H. Huang et al., 2015), aunque no está claro si contribuye al reciclaje normal de H3-H4 u opera principalmente para atrapar histonas desalojadas durante el estrés replicativo (H. Huang et al., 2015; Jasencakova et al., 2010). Al igual que Asf1, FACT también participa en el reciclaje de histonas parentales, como sugiere el hecho de que interactúe con el complejo MCM cuando se liberan histonas de la cromatina en extractos celulares (Foltman et al., 2013). Recientemente, se ha descubierto que el dominio N terminal de Spt16 interactúa con la helicasa MCM y promueve la formación de un complejo ternario FACT/ H3-H4/ Mcm2 necesario para el reciclaje de las histonas parentales (Figura I4). La falta de este dominio N-terminal de Spt16 no reduce la afinidad de FACT por las histonas, pero debilita la interacción FACT-MCM afectando negativamente al reciclaje de histonas parentales preferentemente en la cadena rezagada. La ausencia del dominio N-terminal también reduce la interacción con Pol α, otro factor clave en este proceso (X. Wang et al., 2023). Introducción 12 Esta poco claro si los dímeros de histonas H2A-H2B se reciclan eficientemente, debido a su naturaleza más dinámica. Datos recientes en células de mamíferos muestran que el dímero H2A-H2B se recicla simétricamente e independientemente de H3-H4 a través de POLA1 (Flury et al., 2023). 1.3. Tolerancia a daños replicativos Durante la duplicación del genoma, el avance de la horquilla de replicación se puede ver amenazado por lesiones y/o estructuras en el ADN que provocan un bloqueo transitorio. Si no se resuelven adecuadamente, estas paradas pueden provocar el colapso de la horquilla de replicación y en última instancia inestabilidad genómica. Para evitar este problema, las células disponen de diferentes mecanismos que por un lado facilitan el avance de las horquillas de replicación a través de los daños y por otro participan en el relleno de los fragmentos de ssDNA generados durante el baipás de la lesión (Boiteux & Jinks-Robertson, 2013; Chatterjee & Siede, 2013). Dado que la reparación/resolución del daño/obstáculo que provocó la parada se pospone, esta respuesta recibe el nombre de DDT. La respuesta de DDT comprende diferentes mecanismos que pueden actuar tanto en la horquilla como detrás de ésta. En principio, estos mecanismos pueden verse afectados por la posición del agente bloqueante en el molde de la cadena adelantada o rezagada. En general, una lesión en la cadena rezagada no impide el avance de la horquilla de replicación debido a la naturaleza semidiscontinua de la síntesis de ADN en esta cadena, donde el cebado del siguiente fragmento de Okazaki permitirá la replicación aguas debajo de la lesión (Marians, 2018; Taylor & Yeeles, 2018). Por el contrario, una lesión en la cadena adelantada inhibe la síntesis en el punto de bloqueo, lo que a menudo provoca el desacoplamiento de la helicasa y la Pol ε. Sin embargo, los daños en el ADN generan fragmentos de ssDNA detrás de la horquilla en ambas cadenas (Giannattasio et al., 2014; Lopes et al., 2006), lo que sugiere que existen mecanismos que permiten a la cadena adelantada baipasear el obstáculo. En células de mamíferos existe una ADN polimerasa con actividad primasa denominada Primpol que es capaz de cebar la síntesis de ADN aguas debajo de la lesión de bloqueo (Figura I5A; “repriming”) (García-Gómez et al., 2013; Mourón et al., 2013). En levaduras no existe un homólogo de PrimPol; sin embargo, datos genéticos sugieren que Pol α podría llevar a cabo esta función (Fumasoni et al., 2015). Los fragmentos de ssDNA generados detrás de la horquilla, ya sea en la cadena rezagada o adelantada, se pueden reparar por dos mecanismos: (I) La síntesis translesión (TLS, del inglés “Translesion Synthesis”) (Waters et al., 2009) se basa en el uso de ADN polimerasas especializadas capaces de introducir un nucleótido en el sitio opuesto a la base dañada. Dado que estas polimerasas son poco fiables, Introducción 13 TLS es un proceso propenso a errores y por tanto mutagénico (Figura I5A; TLS) (Sale, 2013); (II) la HR usa la cromátida hermana como molde para rellenar los fragmentos de ssDNA. Este proceso de cambio de molde se lleva a cabo mediante un intercambio de cadenas que genera una unión entre cromátidas hermanas (SCJ, del inglés “Sister Chromatid Junction”), y a diferencia de TLS es un proceso fundamentalmente libre de errores (Figura I5A; HR) (Branzei & Psakhye, 2016; Branzei & Szakal, 2016; Prado, 2014, 2018). Al igual que ocurre durante la reparación de cortes de doble cadena (DSB, del inglés “Double Strand Break”), el intercambio de cadenas durante la DDT es llevado a cabo por un nucleofilamento de ssDNA cubierto por Rad51. Figura I5. Esquema de los mecanismos de DDT. Un bloqueo en la cadena adelantada conduce a una acumulación transitoria de ssDNA como consecuencia del desacoplamiento de la helicasa de Pol ε. La horquilla de replicación puede baipasear estas lesiones mediante “repriming” aguas abajo de la lesión seguido de relleno de los fragmentos de ssDNA por TLS o HR postreplicativamente (A), o directamente en la horquilla de replicación mediante TLS (B), reversión de la horquilla (C) o HR (D). Un bloqueo en la cadena rezagada podría ser baipasado mediante la síntesis de un nuevo fragmento de Okazaki, dando lugar a fragmentos de ssDNA detrás de la horquilla que podrían ser reparados por TLS o HR (A). Introducción 20 cadenas puede extenderse hasta el extremo 5’ del fragmento de ssDNA dando lugar a una estructura similar a una doble unión de Holliday dHJ (del inglés, “double Holliday Junction”) (Figura I8) (Giannattasio et al., 2014). Estos intermediarios se pueden disolver por la acción del complejo STR en levaduras o BTR (BLM-TOP3α-RMI1/2) en humanos. Este mecanismo requiere la sumoilación de STR por el complejo Smc5/6-Mms21 SUMO ligasa que favorece la interacción entre las subunidades STR y su acumulación en los centros de reparación del ADN (Bermúdez- López et al., 2016; Bonner et al., 2016; Menolfi et al., 2015; Sollier et al., 2009). En caso de que no pueda actuar el complejo STR, estas estructuras pueden resolverse por la acción de las endonucleasas Mus81/Mms4 y Yen1 (Figura I8). La resolución de las HJ por estas nucleasas puede estar asociada a entrecruzamientos los cuales pueden dar lugar a reordenamientos genómicos si ocurren entre repeticiones desiguales entre cromátidas hermanas o secuencias situadas ectópicamente (Eissler et al., 2014). Por ello, la actividad de estas nucleasas está restringuida a G2/M mediante fosforilación de Mms4 (dependiente de Cdc5, Cdk1 y DDK) y desfosforilación de Yen1 (dependiente de Cdc14) (Gallo-Fernández et al., 2012; Matos et al., 2011; Princz et al., 2017; Szakal & Branzei, 2013). Además de la maquinaria de HR, tanto las cohesinas como componentes del replisoma (p.ej. Ctf4) facilitan la HR manteniendo las cromátidas hermanas en proximidad (Samora et al., 2016; Srinivasan et al., 2020). De igual modo, transiciones en la arquitectura del genoma que involucran eventos de flexión del ADN intracromosómico mediados por la proteína Hmo1 (HMGB) favorecen los eventos de SCJs (Gonzalez-Huici et al 2014). 1.3.3.2. Relleno de ssDNA por HR independiente de ubiquitinación de PCNA La ruta de salvamento es un mecanismo alternativo de DDT mediado por HR que no depende de ubiquitinación de PCNA. La ruta de salvamento también utiliza el intercambio de cadenas para rellenar los fragmentos de ssDNA que quedan detrás de la horquilla y genera SCJs. Por tanto, ambas rutas comparten las proteínas de recombinación Rad51, Rad54, Rad55 Rad57 y los complejos 9-1-1 y STR para la formación y disolución de SCJs (Karras et al., 2013; Vanoli et al., 2010). A diferencia de la ruta de HR dependiente de ubiquitinación de PCNA que actúa durante la fase S, la ruta de salvamento actúa normalmente en fase G2/M debido a la actividad de Srs2 durante la fase S. Esta ruta es propensa a la formación de entrecruzamiento debido a la ausencia de Srs2 que facilita la formación de dHJ y a la expresión de las nucleasas Mus81-Mms4 y Yen1 en G2/M (Burkovics et al., 2013; Szakal & Branzei, 2013). Introducción 21 1.3.3.3. Reversión de la horquilla Como he comentado, el cambio de molde también puede ocurrir en la propia horquilla generando la reversión de está. Las horquillas revertidas son estructuras raras en células de levaduras tratadas con MMS o UV, aunque se detectan a niveles similares a los de células humanas en células de levaduras tratadas con camptothecina (CPT) (Menin et al., 2018). También se han encontrado en mutantes de checkpoint y de componentes del replisoma, así como en mutantes que no son capaces de hacer un repriming correcto (Fumasoni et al., 2015; Sogo et al., 2002). A diferencia de levaduras, las horquillas revertidas son estructuras abundantes en células de mamíferos, tanto en ausencia como en presencia de todo tipo de daño replicativos (Zellweger et al., 2015), por lo que es donde se han estudiado en más detalle. Hay dos aspectos esenciales asociados a la dinámica de las horquillas revertidas: su formación y su protección. La reversión de la horquilla requiere translocasas y helicasas de ADN como ZRANB3 (Ciccia et al., 2012; Vujanovic et al., 2017), SMARCAL1 (Bétous et al., 2013; Kolinjivadi et al., 2017) y HLTF (Bai et al., 2020; Kile et al., 2015). RAD51, independientemente de BRCA2 (mediador de RAD51 en mamíferos), también es necesario para la reversión de la horquilla de replicación (Zellweger et al., 2015). Sin embargo, esta actividad de remodelación de la horquilla no se ha demostrado in vitro, lo que sugiere que podría estimular la reversión de la horquilla a través de las translocasas (Bugreev et al., 2011). Recientemente, se ha propuesto que la actividad de intercambio de cadenas de Rad51 es necesaria para generar un dúplex de ADN parental detrás de la horquilla que sería utilizado como sustrato por las translocasas de ADN (Figura I9) (W. Liu et al., 2023). Una vez formada, la horquilla revertida presenta un extremo que puede ser procesado por las nucleasas como Mre11, Exo1 y Dna2 (Lemaçon et al., 2017; Mijic et al., 2017; Thangavel et al., 2015). Aunque la actividad de estas nucleasas es necesaria para facilitar la reiniciación de la replicación por HR, su actividad debe estar estrictamente regulada para evitar una degradación excesiva que es perjudicial para la estabilidad del genoma. Entre las enzimas que se encargan de la protección de la horquilla revertida se encuentran BRCA1, BRAC2 y RAD51 (Qiu et al., 2021). Es importante resaltar que la protección de la horquilla revertida no requiere la actividad de intercambio de cadena de RAD51, a diferencia del reinicio de la horquilla de replicación mediante recombinación (Ait Saada et al., 2017; Mason et al., 2019; Somyajit et al., 2015). Introducción 22 Figura I9. Modelo propuesto para la reversión de la horquilla de replicación. (W. Liu et al., 2023). La dinámica de formación de la horquilla revertida es mucho menos conocida en levaduras. Rad5 es capaz de promover in vitro la reversión de la horquilla de replicación a través de su dominio HIRAN (Blastyák et al., 2007; J. A. Ling et al., 2023; Shin et al., 2018). Este proceso también podría estar facilitado por Mph1 en S. cerevisiae y Fml1 en Schizosaccharomyces pombe, los cuales son ortólogos de FANCM (Sun et al., 2008; Zheng et al., 2011). Sin embargo, no existen evidencias moleculares in vivo de estas actividades. 1.3.4. Balance entre los mecanismos de TLS y cambio de molde La elección entre las distintas estrategias de DDT puede determinar que el resultado del proceso sea libre de error o mutagénico, por lo que es una pregunta fundamental que está aún por resolver. La elección entre la HR y TLS está en parte determinada por el ciclo celular, ya que la disponibilidad de los factores de HR y TLS puede variar a lo largo de éste. En S. cerevisiae, los niveles de Rev1 están limitados durante la fase S y tienen un pico máximo en G2/M (Waters & Walker, 2006). Esta regulación de Rev1 limita la expresión de TLS y facilita la HR dependiente de ubiquitinación de PCNA durante la fase S (Waters & Walker, 2006). Por el contrario, los niveles de Pol η son constante durante el ciclo celular (Waters & Walker, 2006). Por tanto, esta regulación a Introducción 23 lo largo del ciclo de las polimerasas de TLS promueve la vía no mutagénica de esta ruta durante la fase S, conjuntamente con la HR dependiente de ubiquitinación de PCNA. El tipo de lesión y la cantidad de daño son otros factores fundamentales en la elección de la ruta de DDT. Las polimerasas de TLS presentan diferente afinidad y cinética dependiendo de la lesión en el ADN. Pol η puede baipasear eficientemente lesiones de dímeros de ciclobutanopirimidina (CPD) inducidas por luz UV, mientras que Rev1 junto con Pol ζ pueden baipasear lesiones de 6-4PPs inducidas por luz UV, 7meG inducida por MMS y N2G y C8G inducidas por 4NQO (Z. Wang & Xiao, 2020). Por tanto, las lesiones inducidas por MMS y 4NQO son toleradas durante la fase S fundamentalmente por HR debido a la contribución minoritaria de Pol η frente a estas lesiones y la restricción de la actividad de Rev1 a G2/M (Masłowska et al., 2019). Por otro lado, las lesiones inducidas por exposición a dosis agudas y altas de UV son toleradas principalmente por TLS, mientras que las lesiones asociadas a una exposición baja y crónica de UV son toleradas fundamentalmente por HR sin que la vía de TLS pueda compensar defectos en HR (Daigaku et al., 2010; Hishida et al., 2009). Estas diferencias sugieren que la cantidad relativa de lesiones (6-4PPs y CPD) y/o la disponibilidad de un molde no dañado necesario para reparar por HR son elementos decisivos en la elección entre las rutas de DDT y el equilibrio entre éstas. En S. cerevisiae, Rad5 interacciona con la polimerasa de TLS Rev1 y promueve su reclutamiento a los sitios de daño (Gallo et al., 2019; Kuang et al., 2013; Xu et al., 2016). Del mismo modo, en células de mamífero SHPRH y HLTF interactúan con Rad18 y promueven el reclutamiento de las polimerasas de TLS más adecuadas (Lin et al., 2011). También se ha observado que Rad52 y Rad51 participan en TLS, facilitando entre otros mecanismos el reclutamiento de Rad6/Rad18 y la monoubiquitinación de PCNA (Cano-Linares et al., 2021). Todos estos datos indican la existencia de conexiones conservadas entre las rutas de cambio de molde y TLS que resaltan la complejidad de la regulación de la respuesta de DDT. 1.4. Cromatina y tolerancia al daño en el ADN El estrés replicativo tiene lugar en el contexto de la cromatina. Por tanto, no es de extrañar que la dinámica de los nucleosomas y las modificaciones de las histonas jueguen un papel importante en la regulación de los mecanismos de DDT. Por ejemplo, el complejo remodelador de la cromatina INO80 en S. cerevisiae es necesario para el reclutamiento de Rad18 al ADN, la ubiquitinación de PCNA y la formación de SCJs en presencia de MMS (Falbo et al., 2009). Curiosamente, INO80 no participa en la ubiquitinación inducida por otros agentes genotóxicos como UV y HU, lo que sugiere que el acceso de Rad18 al ADN dañado puede estar limitado por la Introducción 24 cromatina dependiendo del tipo de lesión (Niimi et al., 2012). Otro complejo remodelador de la cromatina que participa en la ubiquitinación de PCNA inducida por UV, HU y MMS es RSC (Niimi et al., 2012). Por tanto, la reorganización de la estructura de la cromatina es un factor clave en el reclutamiento de los complejos de ubiquitinación de PCNA. Además de los complejos remodeladores de la cromatina, las modificaciones de las histonas juegan un papel relevante en DDT. El ejemplo más estudiado es H3K56ac, los mutantes asf1Δ y rtt109Δ defectivos en la acetilación de H3K56 son sensibles a agentes genotóxicos como MMS y HU, lo que sugiere un papel de esta modificación en los mecanismos de DDT (Duro et al.,2008; Tyler et al., 1999). De acuerdo con esto, durante el daño en el ADN la quinasa Mec1, tras activarse el checkpoint, promueve la degradación de las desacetilasas de histonas Hst3 y Hst4 evitando que H3K56ac se desacetile (Celic et al., 2006; Maas et al., 2006; Masumoto et al., 2005; Thaminy et al., 2007). Como hemos mencionado anteriormente, estas proteínas están implicadas en el ensamblaje de la cromatina de novo. Sin embargo, los mutantes cac1Δ y rtt1016Δ están igualmente afectados en el ensamblaje de la cromatina, pero son mucho menos sensible a estos agentes genotóxicos (Tyler et al., 1999), lo que sugiere que H3K56 actúa en DDT una vez que se ha depositado en la cromatina. Los datos genéticos sugieren que la acetilación de la Lys56 de H3 promueve el reclutamiento del complejo Rtt101Mms1/Mms22, el cual facilitaría la HR durante la respuesta de DDT promoviendo el desacoplamiento del complejo helicasa MCM de las polimerasas replicativas (Buser et al., 2016; Luciano et al., 2015). En células humanas, el complejo MMS22L-TONSL muestra similitudes funcionales con el complejo Rtt101Mms1/Mms22. En estas células la histona H3K56ac representa menos del 1,5%; sin embargo, incorporan histonas H4 no metiladas en la lisina 20 (H4K20me0) que se metilan a finales de G2/M. En presencia de CPT, MMS22L-TONSL se une a H4K20me0 en la cromatina naciente y facilita la respuesta recombinacional al estrés replicativo mediante el reclutamiento/estabilización de Rad51 (Saredi et al., 2016). Otro ejemplo de modificaciones de histonas implicadas en la DDT es la ubiquitinación de la lisina 123 de la histona H2B (H2BUb123) por la ubiquitina ligasa Bre1 en levadura. Esta modificación facilita el baipás de la horquilla de replicación mediante HR durante la fase S (Hung et al., 2017). El papel de los complejos remodeladores de la cromatina y de las modificaciones postraduccionales de las histonas en la respuesta de DDT puede ser interdependiente. Así, la acetilación de la lisina 16 de la histona H4 (H4K16ac) por la acetiltransferasa Nua4 promueve la recombinación dependiente de Rad5 con la cromátida hermana en repeticiones de trinucleótidos CAG/CTG propensas a formar expansiones mediante un proceso que requiere el remodelador de Introducción 25 la cromatina RSC (House et al., 2014). Otra diana de la acetiltransferasa Nua4 es la variante de H2A codificada por HTZ1 cuya modificación parece promover TLS (Renaud-Young et al., 2015). Como se ha mencionado, el papel de H3K56ac en DDT está relacionado con una función posterior a su papel en el ensamblaje de la cromatina. No obstante, existen datos que demuestran un papel directo de la deposición de nucleosomas en la regulación de la respuesta de DTT. En concreto, en S. pombe el factor de HR Rph52 (homólogo de Rad52) promueve el reclutamiento de CAF1 y posterior ensamblaje en cromatina de los intermediarios de recombinación. Este ensamblaje contrarresta la actividad antirrecombinogénica de Rqh1, homóloga de la helicasa Sgs1 de S. cerevisiae, lo que promueve el baipás de la lesión por HR (Hardy et al., 2019). Este ejemplo demuestra la estrecha conexión que puede existir entre los procesos de deposición de histonas y los mecanismos que regulan el avance y estabilidad de las horquillas de replicación. Poco más se ha avanzado sin embargo en este campo, y el único ejemplo, como hemos visto, está relacionado con la deposición de histonas de nueva síntesis no se sabe nada sobre el papel del reciclaje de histonas parentales en la respuesta a DDT a pesar del potencial regulador de las marcas epigenéticas asociado a la cromatina madura. 2. OBJETIVOS Objetivos 29 1. Estudiar el papel del reciclaje de histonas parentales tanto en la estabilidad de las horquillas de replicación como en los mecanismos de DDT. 2. Determinar los requerimientos genéticos de la respuesta de DDT dependiendo de la posición del obstáculo en las cadenas nacientes. Resultados 36 mcm2-3A incrementó la sensibilidad a MMS del triple mutante rev1Δ rev3Δ rad30Δ (Figura R1.3A), fundamentalmente como consecuencia de la ausencia de rev1Δ y rev3Δ (Figura R1.3B). Este resultado sugiere que la deposición de histonas parentales facilita la resistencia a MMS mediante un mecanismo de HR. De acuerdo con esta hipótesis, rad52Δ, mms2Δ, rad5Δ y mph1Δ fueron epistáticos sobre mcm2-3A en la sensibilidad a MMS (Figura R1.3C-F), lo que apunta a un papel del reciclaje de histonas en la HR dependiente de ubPCNA. Sin embargo, el alelo mcm2-3A también aumentó la sensibilidad a MMS del doble mutante rad18Δ srs2Δ (Figura R1.3G), en el que la HR independiente de UbPCNA es el único mecanismo operativo de DDT. Estos resultados sugieren que el reciclaje de histonas parentales favorece la HR tanto dependiente como independiente de UbPCNA. El efecto de mcm2-3A sobre la sensibilidad de MMS fue mucho más fuerte en las células que expresaban el alelo rad5-535 que en las que carecían de las polimerasas TLS, lo que sugiere que el efecto sinérgico de mcm2-3A con rad5-535 no está relacionado con el papel de Rad5 en TLS (Gangavarapu et al., 2006; Gallo et al., 2019). La función principal de Rad5 en la DDT está asociada con sus actividades ubiquitina ligasa y helicasa. Estas actividades se eliminan específicamente en los mutantes rad5-I916A (ubiquitina ligasa) y rad5-Q1106D (helicasa) (Choi et al., 2015). Con objeto de entender cuál es la actividad de Rad5 relevante en los mutantes afectados en el reciclaje de histonas, analizamos la sensibilidad a MMS de mcm2-3A con rad5Q- 1106D y rad5-I916A. El mutante mcm2-3A aumentó levemente la sensibilidad a MMS de rad5- Q1106D y rad5-I916A (Figura R1.3H), aunque esta sensibilidad fue menor que la conferida por el alelo rad5-535. Este resultado sugiere que es una función adicional de Rad5, o la combinación de diversas funciones, las que resultan necesarias en los mutantes afectados en el reciclaje de histonas parentales. Los mutantes afectados en HR pueden rescatar parcialmente la sensibilidad a MMS de un mutante smc6-56 afectado en la resolución de SCJs, ya que impide que estos intermediarios se acumulen (Choi et al., 2015). Del mismo modo, los mutantes defectuosos en HR pueden suprimir la sensibilidad al frío asociada con la pérdida de Pol32 (Karras & Jentsch, 2010), una subunidad tanto de la polimerasa de TLS Pol ζ como de la polimerasa asociada a la cadena rezagada Pol δ (Gerik et al., 1998; R. E. Johnson et al., 2012). Por tanto, nos planteamos si el mutante mcm2-3A también podría rescatar parcialmente la sensibilidad a MMS de estos mutantes. El mutante mcm2-3A no suprimió ninguno de estos fenotipos (Figura R1.3I, J). De hecho, exacerbó aún más la sensibilidad al frío y a MMS de la cepa pol32Δ (Figura R1.3A, J). Dado que el defecto de mcm2- 3A sobre la sensibilidad a MMS de los mutantes TLS fue más suave (Figura R1.3A, B), este efecto sinérgico de mcm2-3A con pol32Δ podría estar asociado con una pérdida de función de Pol δ Resultados 37 durante la HR inducida por MMS, específicamente en la síntesis de ADN durante la formación de SCJs. Alternativamente, aunque Pol32 no es esencial para la función replicativa de Pol δ (Gerik et al., 1998), su ausencia podría desestabilizar la síntesis de la cadena rezagada y exacerbar los defectos en la deposición de histonas parentales del mutante mcm2-3A. Figura R1.3. El reciclaje de histonas parentales contribuye a la resistencia a MMS a través de HR. Análisis de sensibilidad a MMS mediante diluciones seriadas de los mutantes indicados en los diferentes paneles. El mutante rad52Δ se incluyó como control negativo. Los análisis se repitieron al menos dos veces con resultados similares. Resultados 38 Finalmente, hemos probado si el mutante dpb3Δ compartía el efecto aditivo del mutante mcm2-3A con los mutantes de DDT. La ausencia de Dpb3 aumentó la sensibilidad a MMS de pol32Δ (Figura R1.4A) y rad5-I916A, pero no de rad5-Q1006D (Figura R1.4C) y rad18Δ srs2Δ (Figura R1.4B), lo que sugiere que el impacto del reciclaje de histonas parentales en la HR puede ser parcialmente diferente dependiendo de la cadena que está afectada y/o la gravedad del defecto de deposición de histonas. En conclusión, nuestros análisis genéticos sugieren una función del reciclaje de histonas parentales en la respuesta recombinacional a MMS. Figura R1.4. El reciclaje de histonas parentales contribuye a la resistencia a MMS a través de HR. Análisis de sensibilidad a MMS mediante diluciones seriadas de los mutantes indicados en los diferentes paneles. El mutante rad51Δ se incluyó como control negativo. Los análisis se repitieron al menos dos veces con resultados similares. 3.1.2. El reciclaje de histonas parentales facilita la reparación de los fragmentos de ssDNA inducidos por MMS, en parte evitando una distribución sesgada de histonas parentales Con objeto de entender el papel del reciclaje de histonas parentales en la vía recombinacional de la DTT, analizamos en primer lugar la reparación de los fragmentos de ssDNA inducidos por MMS mediante microscopia de fluorescencia. La reparación de estas lesiones ocurre en centros de reparación que podemos seguir marcando las proteínas de interés con proteínas fluorescentes. En primer lugar, seguimos la resolución de los focos de RPA, complejo que cubre el ssDNA independientemente del mecanismo de reparación. Para ello marcamos la proteína Rfa1 (subunidad mayor del complejo RPA) con YFP. El nivel de detección de la señal Rfa1-YFP es mayor que el observado por otras proteínas de reparación, lo que la convierte en un marcador muy sensible para detectar fragmentos de ssDNA no reparados. Para realizar este análisis, sincronizamos las células en G1 y liberamos en la fase S en presencia de MMS a 0,033% durante Resultados 39 1 h, inactivamos el MMS y lavamos y liberamos las células en medio fresco para permitir la reparación del ADN. Aproximadamente un 95% de las células silvestres y mutantes presentaron un pico máximo de células con focos de Rfa1-YFP 1 h después de la inactivación del MMS (Figura R1.5A, B). El porcentaje de células silvestres con focos cayó al 21% al final de la cinética (79% de resolución), mientras que los mutantes mcm2-3A y dpb3Δ cayeron al 61% y 37% (37% y 63% de resolución, respectivamente) (Figura R1.5B, C). Inesperadamente, el porcentaje de células con focos de RPA en el mutante mcm2-3A dpb3Δ cayó al 43%, lo que indica un porcentaje de resolución significativamente mayor que el del mutante simple mcm2-3A (Figura R1.5C, 53% y 37%). Resultados 40 Figura R1.5. El reciclaje de histonas parentales facilita la reparación de fragmentos de ssDNA inducidos por MMS en los centros de reparación marcados con Rfa1-YFP. (A) Porcentaje de células con focos de Rfa1-YFP a lo largo de la cinética de reparación y análisis de la progresión a lo largo del ciclo mediante citometría de flujo de las estirpes indicadas. Las células se sincronizaron en G1 y se liberaron en fase S en presencia de MMS 0,033% durante 1 h, se trataron con tiosulfato de sodio al 2,5% para inactivar el MMS, se lavaron y liberaron en medio fresco tomando muestras a diferentes tiempos. Las células liberadas en ausencia de MMS durante 1 h se incluyeron como control (60-). Las células con focos se contaron directamente en las muestras procesadas. (B- E) Porcentaje de células con focos (B), porcentaje de resolución de los focos (C) y señal de fluorescencia total por célula (D, E) a 1 (pico) y 7 h después del tratamiento con MMS, determinados mediante análisis con el software MetaMorph. (C) La resolución de los focos se calculó como (100 - porcentaje de células con focos a las 7 h x 100) / porcentaje máximo de células con focos durante la cinética). (E) Distribución de valores de los experimentos representados en D. (F) Imágenes representativas de células mutantes y silvestre con focos de RPA 1 y 7 h tras la liberación de MMS. Se muestra la media y la SEM de cuatro (wt y dpb3Δ), cinco (mcm2-3A) y tres (mcm2-3A dpb3Δ) experimentos independientes. Los asteriscos indican diferencias estadísticamente significativas según un test de Student no pareado (n=3): *, **, ***representan un p-valor de < 0,05, < 0,01 y p < 0,001 respectivamente. Con objeto de obtener un cálculo más preciso del número de fragmentos de ssDNA sin reparar, determinamos la señal de fluorescencia en los focos por célula, parámetro que integra tanto el número como la intensidad de los focos (Figura R1.5D, E). Estos análisis confirmaron que el mutante de deposición de histonas de la cadena rezagada (mcm2-3A) está más afectado en la reparación de fragmentos de ssDNA inducidos por MMS que el mutante de la cadena adelantada (dpb3Δ), y que este mayor defecto se suprime (hasta los niveles del mutante dpb3Δ) al alterar la deposición de histonas en la cadena adelantada (mcm2-3A dpb3Δ). Con objeto de determinar hasta qué punto las diferencias entre mcm2-3A y dpb3Δ se debían exclusivamente a los defectos específicos de cadena o venían también determinadas por la severidad en el defecto de deposición, analizamos la reparación de los fragmentos de ssDNA en centros de Rfa1 en los siguientes mutantes afectados en la deposición de histonas parentales en la cadena rezagada: pol1-2A2, pol1-4A (mutado en el motivo de interacción con Ctf4) y Ctf4-E (mutado en el “péptido de interacción con Ctf4” o “caja CIP”, del inglés “Ctf4 Interacting- Peptide”). Aunque no es posible una comparación directa de los defectos de estos mutantes en la deposición de histonas parentales por falta de controles internos, la cantidad de señal eSPAN (del inglés “Enrichment and Sequencing of Protein-Associated Nascent DNA”) en las cadenas adelantada y rezagada en relación al wt sugiere que los cambios más fuertes en la distribución de las histonas parentales entre las cadenas nacientes ocurre en los mutantes mcm2-3A y ctf4-4E y los cambios menos severos en los mutantes pol1-4A, pol1-2A2 y dpb3Δ (Gan et al., 2018; Z. Li et al., 2020; Yu et al., 2018). Los mutantes pol1 exhibieron defectos en términos de resolución de focos de Rfa1 y señal total de fluorescencia por célula similares entre ellos y al mutante dpb3Δ (Figura R1.6A-F). Resultados 41 Además, los dobles mutantes pol1 dpb3Δ presentaron niveles similares al mutante dpb3Δ tanto en la resolución de focos de Rfa1 como en la señal total (Figura R1.6A-F)., como se mostró anteriormente para el mutante mcm2-3A dpb3Δ. Figura R1.6. El reciclaje de histonas parentales facilita la reparación de los fragmentos de ssDNA inducidos por MMS en los centros de reparación marcados con Rfa1-YFP. (A) Porcentaje de células con focos de Rfa1-YFP a lo largo de la cinética de reparación en las estirpes indicadas. (B-E) Porcentaje de células con focos (B), porcentaje de resolución de los focos (C) y señal de fluorescencia total por célula (D, E) a 1 (pico) y 7 h después del tratamiento con MMS, determinados mediante análisis con el software MetaMorph. (F) Imágenes Resultados 42 representativas de células mutantes con focos de RPA 1 y 7 h tras la liberación de MMS. (G) Análisis de sensibilidad a MMS de las estirpes indicadas. Se muestra la media y SEM de tres experimentos independientes. Ver leyenda de la Figura R1.5 para más detalles. A diferencia de los mutantes anteriores, el mutante ctf4-4E mostró una alta sensibilidad a MMS (Figura R1.6G) y un defecto grave en la reparación de los fragmentos de ssDNA inducidos por MMS que no fue suprimido por dpb3Δ (tanto en la resolución de focos de Rfa1 como en la señal total) (Figura R1.6A-F). La interpretación de estos resultados es compleja, porque la caja CIP une físicamente a Ctf4 no solo con MCM y Pol α sino también con otros factores como Dna2, Sld5 y Chl1. Estos factores están involucrados en el procesamiento de las horquillas y la cohesión entre cromátidas hermanas (Villa et al., 2016; Samora et al.,2016), procesos a su vez necesarios para la formación de SCJs inducida por MMS (Fumasoni et al., 2015). En la misma línea, el dominio N- terminal de Ctf4 es necesario para la función recombinacional de H3K56ac a través de interacciones físicas con el complejo ubiquitina ligasa E3 Rtt101Mms1/Mms22 (Luciano et al.,2015). De hecho, y en contraste con el resto de mutantes de reciclaje de histona parentales, el mutante ctf4-4E acumuló altos niveles de focos de RPA en ausencia de daño (Figura R1.6A, 60-). El complejo RPA cubre el ssDNA independientemente del mecanismo de reparación que actúe posteriormente. Con objeto de comprender el papel del reciclaje de histonas parentales en la vía recombinacional de DTT seguimos la acumulación de la proteína de recombinación Rad52 en los centros de reparación de ADN inducidos por MMS en células mcm2-3A, dpb3Δ y mcm2-3A dpb3Δ. Para ello, repetimos la cinética en las mismas condiciones experimentales que con Rfa1- YFP (Figura R2.7). Aproximadamente un 70% de las células silvestres y mutantes presentaron un pico máximo de células con focos de Rad52 1 h después de la inactivación de MMS (Figura R2.7A, B). El porcentaje de resolución de focos de Rad52 del wt fue de un 79% frente a un 52% y un 59% en los mutantes simples mcm2-3A y dpb3Δ, respectivamente, y de un 62% en el doble mutante mcm2-3A dpb3Δ (Figura R1.7C). La señal total de fluorescencia de focos de Rad52 por célula en estos mutantes presentó un defecto similar a la resolución de los focos (Figura R2.7D, E). Por tanto, el mutante dpb3Δ presentó un defecto ligeramente menor en la reparación por Rad52 de los fragmentos de ssDNA que el mutante mcm2-3A, y este defecto de dpb3Δ fue epistático sobre mcm2-3A. Resultados 43 Figura R1.7. El reciclaje de histonas parentales facilita la reparación de los fragmentos de ssDNA inducidos por MMS en los centros de reparación marcados con Rad52-YFP. (A) Porcentaje de células con focos de Rad52-YFP a lo largo de la cinética de reparación en las estirpes indicadas. (B-E) Porcentaje de células con focos (B), porcentaje de resolución de focos (C) y señal de fluorescencia total por célula (D, E) a 1 (pico) y 7 h después del tratamiento con MMS, determinados mediante análisis con el software MetaMorph. (F) Imágenes representativas de células mutantes y silvestre con focos de Rad52 1 y 7 h tras la liberación de MMS. Se muestra Resultados 44 la media y SEM de 7 (wt) y 3 (resto) experimentos independientes. Ver leyenda de la Figura R1.5 para más detalles. Además de su papel esencial en recombinación, Rad52 facilita TLS (Cano-Linares et al., 2021). Por eso, repetimos la cinética de reparación de los fragmentos de ssDNA inducidos por MMS en células que expresan Rad54-YFP, ya que Rad54 es una proteína específica de la reparación por HR (Cano-Linares et al., 2021). Aproximadamente entre un 50-60% de las células silvestres y mutantes presentaron un pico máximo de células con focos de Rad54 1 h después de la inactivación del MMS (Figura R1.8A, B). El porcentaje de resolución de focos de Rad54 en el wt fue un 80% frente a un 52% y un 72% en los mutantes simples mcm2-3A y dpb3Δ, respectivamente, mientras que el porcentaje de resolución del doble mutante mcm2-3A dpb3Δ fue de un 73%, similar al del mutante dpb3Δ (Figura R1.8C). La señal total de fluorescencia de focos de Rad54 por célula presentó defectos similares a la resolución de los focos (Figura R1.8D, E). Por tanto, el defecto en la reparación por HR de los fragmentos de ssDNA fue más pronunciado en mcm2-3A que en dpb3Δ, y nuevamente los defectos de deposición de histonas parentales en la cadena adelantada suprimieron parcialmente los defectos de HR asociados con los defectos de deposición de histonas parentales en la cadena rezagada. Como hemos indicado anteriormente, el alelo rad5-535 agrava severamente la sensibilidad a MMS y la recuperación del checkpoint de los mutantes de reciclaje de histonas parentales. Esto puede deberse a una mayor incapacidad para reparar los daños o a problemas en la desactivación del checkpoint. Para discernir entre estas posibilidades analizamos la acumulación de la proteína Rad52-YFP en los centros de reparación de ADN inducidos por MMS en células mutantes mcm2-3A y dpb3Δ en combinación con el alelo rad5-535. Los dobles mutantes mostraron un defecto sinérgico tanto en la resolución de los focos de Rad52 como en la señal total de fluorescencia por célula inducidos por MMS en comparación con los mutantes simples. Además, esta sinergia fue más fuerte con mcm2-3A que con dpb3Δ, en consonancia con los defectos de resolución de focos más graves del primero (Figura R1.7). Por tanto, la sensibilidad a MMS y los defectos de recuperación del checkpoint de los mutantes mcm2-3A y dpb3Δ en combinación con rad5-535 están asociados a defectos en la reparación de los fragmentos de ssDNA inducidos por MMS. Resultados 45 Figura R1.8. El reciclaje de histonas parentales facilita la reparación de los fragmentos de ssDNA inducidos por MMS en los centros de reparación marcados con Rad54-YFP. (A) Porcentaje de células con focos de Rad54-YFP a lo largo de la cinética de reparación en las estirpes indicadas. (B-E) Porcentaje de células con focos (B), porcentaje de resolución de los focos (C), y señal de fluorescencia total por célula (D, E) a 1 (pico) y 7 h después del tratamiento con MMS, determinados mediante análisis con el software MetaMorph. (F) Imágenes representativas de células mutantes y silvestre con focos de Rad54 1 y 7 h tras la liberación de MMS. Ver leyenda de la Figura R1.5 para más detalles. Resultados 52 Figura R1.13. La desestabilización de SCJs en mcm2-3A se suprime en ausencia de Srs2. (A) Análisis de los niveles de Srs2-Myc-AID en células srs2dg tratadas con NAA 0,5 mM mediante western-blot. Se utilizo el componente del degrón TIR-Myc como control de carga. (B) Análisis del ciclo celular mediante citometría de flujo de células sgs1Δ srs2dg sincronizadas en G1, mantenidas durante 2 h en G1 en presencia de NAA 0,5 mM y liberadas en fase S durante 2 h en presencia de NAA 0,5 mM y MMS 0,033%. (C) Análisis de estructuras en forma de X mediante geles bidimensionales de las estirpes indicadas sincronizadas en G1 y liberadas en medio fresco en presencia de MMS a 0,033%. Las células se trataron con 0,5 mM NAA 30 minutos después de la liberación de G1 para degradar Srs2. La progresión del ciclo celular se siguió mediante citometría de flujo. Se muestra el número de moléculas en forma de X en relación con el número total de moléculas, tomando el valor de sgs1Δsrs2dg a 1 h como 100. Se muestran las medias ± SEM de tres (sgs1Δ srs2dg y sgs1Δ mcm2-3A) y cuatro (sgs1Δ mcm2-3A srs2dg) experimentos independientes. El asterisco muestra una diferencia estadísticamente significativa entre sgs1Δ mcm2-3A y sgs1Δ mcm2-3A srs2dg según un test Student no pareado (*p < 0,05). 3.1.6. La localización de un complejo dCas9*/R-loop en la cadena rezagada o adelantada determina la ruta de deposición de histonas parentales requerida para la HR Un obstáculo en la cadena adelantada desacopla la helicasa MCM de Pol ε y por tanto interrumpe la deposición de histonas parentales en esa cadena con la consiguiente acumulación de histonas parentales en la cadena rezagada. Por el contrario, un obstáculo en la cadena rezagada se espera que tenga un menor impacto en la vía de deposición de histona parentales de esa cadena porque Resultados 53 la polimerasa se detendría detrás del eje MCM/Ctf4/Pol α. Por tanto, el efecto de los mutantes de reciclaje de histonas sobre la HR podría depender de la posición del obstáculo, ya sea en la cadena adelantada o rezagada. Para abordar esta posibilidad, diseñamos un sistema genético basado en el uso de un complejo formado por una subunidad catalítica inactiva de Cas9 (dCas9) unida a una guía de ARN (ARNg) específica de las repeticiones his3 del sistema de HR por uSCE descrito anteriormente (Figura R1.14A). En esta aproximación dCas9 y la ARNg se expresan desde un plásmido centrómerico; dCas9 de forma constitutiva y la guía de ARN bajo control de un promotor tet regulado por un represor que también se expresa desde el plásmido. En presencia de doxiciclina (dox) el ARNg se induce y el complejo dCas9/ARNg se une a las repeticiones de his3 formando un dCas9/R-loop (dCas9 unido a una estructura de triple hélice formada por un híbrido ADN-ARN y la cadena de ssDNA desplazada). Con objeto de bloquear específicamente la cadena rezagada o adelantada usamos ARNg específicos de cadena para formar híbridos de ADN-ARN en la cadena Watson o Crick de las repeticiones del sistema de uSCE. La región genómica que contiene este sistema se replica a partir del ARS416 (ARS1), un origen de replicación temprano y muy eficiente ubicado a aproximadamente 10kb de la primera repetición. Además, el sistema de HR está limitada al otro lado por el centrómero, que actúa como una eficiente barrera de replicación para replisomas provenientes del origen ARS415, menos eficiente y ubicado a 27 kb (Figura R1.14A). Por tanto, los complejos dCas9/ARNg dirigidos a las cadenas Watson y Crick forman dCas9/R-loop que pueden potencialmente obstaculizar la síntesis de las cadenas rezagada y adelantada, respectivamente, que replican el sistema de uSCE (Figura R1.14B). Como control negativo, utilizamos estirpes que expresaban dCas9, pero no el ARNg. Debido a que dCas9 está fusionado a un represor de la transcripción (MXI1) en esta construcción (dCas9*), primero descartamos un posible efecto de este represor en la transcripción de las repeticiones del ADN. Para ello, seleccionamos recombinantes His+ y los crecimos en medio sin histidina en las condiciones en las que se une el represor (+dox). La expresión de este no afecto al crecimiento de los recombinantes (Figura R1.14C). Posteriormente, analizamos la eficiencia de unión de los complejos dCas9*/ARNg a sus secuencias dianas. Para ello, delecionamos dCas9* del plásmido y contransformamos las células con un segundo plásmido que expresa una copia funcional de Cas9. La unión de Cas9/ARNg se dedujo de la cinética de acumulación de DSBs en la repetición his3Δ5´ del sistema de uSCE. Como se observa en la Figura R1.14D, el porcentaje de corte fue similar en ambas guías, lo que sugiere que los complejos dCas9*/R-loops se forman con una eficiencia similar en ambas cadenas. Finalmente, decidimos analizar a nivel molecular como afecta la unión de los complejos dCas9*/R-loops al avance de la horquilla de replicación. Para ello, estudiamos los intermediarios de replicación que se acumulan a lo largo del sistema de HR mediante geles bidimensionales. Si la horquilla de replicación se Resultados 54 detiene cuando encuentra el complejo dCas9*/R-loop, se producirá un incremento del intermediario que se detectará como un punto específico a lo largo del arco de las estructuras Y simples (población de intermediarios replicativos generados por el avance de una horquilla de replicación a lo largo del fragmento analizado). Al haber dos repeticiones, esperaríamos 2 puntos cuya posición se indica con flechas (Figura R1.14E, esquema). Como se observa en la Figura R1.14E, la expresión de los complejos dCas9*/R-loop en ninguno de los casos dió lugar a una parada detectable de la horquilla de replicación. Resultados 55 Figura R1.14. Caracterización de un sistema de uSCE inducido por la unión específica a cadena de un complejo dCas9*/R-loop. (A) Representación esquemática del sistema de uSCE replicado a partir del ARS416. Las flechas indican la localización de las estructuras dCas9*/R-loop formados al unirse los complejos dCas9*/ARNg a las repeticiones his3Δ. (B) Representación esquemática de un bloqueo transitorio de la síntesis de ADN en la cadena rezagada o adelantada mediante la formación de híbridos ADN-ARN unidos a dCas9*. Por simplicidad, solo se muestra la unión a la repetición his3Δ5´. (C) Crecimiento celular de recombinantes His+ en medio mínimo sin histidina y sin uracilo y 5 μg/ml de dox. (D) Acumulación de DSB inducidos por Cas9/ARNg en la repetición his3Δ5´ del sistema de uSCE en cultivos asincrónicos transformado con plásmidos que expresan tanto Cas9 (pmL107) como ARNg específicos de la cadena rezagada (p416dC9ΔlaggR), adelantada (p416dC9ΔleadR) o sin ARNg (p416dC9Δ) como control negativo. La cantidad de ADN sin cortar en la repetición his3Δ5´ antes y después del tratamiento con 5 μg/ml de dox durante 3 y 5 h se determinó por qPCR. Los valores se normalizaron a la cantidad de ADN en una secuencia control sin cortar en el gen ACT1 y representaron en relación con el enriquecimiento en el tiempo 0, tomado como 100. (E) Análisis de intermediarios de replicación en el sistema de uSCE mediante geles bidimensionales en células sincronizadas en G1 y liberadas en fase S. Se añadieron 5 μg/ml de dox al medio durante la sincronización en G1 y la fase S. Los análisis se realizaron en una estirpe silvestre con el sistema de uSCE transformada con plásmidos que expresan dCas9 y la guía de ARN rezagada (p416dC9laggR), adelantada (p416dC9leadR) o sin ARN guía (pRS416gT-Mxi1). En el panel de la izquierda se muestra un esquema del fragmento de restricción AscI-EcorI y la posición teórica de las pausas de la horquilla de replicación inducida por los complejos dCas9*/ARNg. Nota: La señal acumulada en el punto de inflexión de los arcos Y es consecuencia de la superposición de los arcos izquierdo y derecho. Con objeto de completar la caracterización del sistema, analizamos la frecuencia de recombinación inducida por los complejos dCas9*/R-loops unidos a las cadenas rezagada o adelantada. La expresión de dCas9 en ausencia de ARNg no alteró la frecuencia de recombinantes His+ (compare wt Figura R1.9A con wt Figura R1.15A). La presencia de complejos dCas9*/R-loops en el molde de la cadena rezagada aumentó la frecuencia de recombinación 13 veces respecto al control negativo, mientras que la presencia de este complejo dCas9*/R-loop en el molde de la cadena adelantada aumentó la frecuencia de recombinación solo 3,5 veces respecto al control negativo (Figura R1.15A). Por tanto, el sistema de uSCE se induce específicamente con la unión de dCas9*/R-loops, siendo el efecto mayor cuando el híbrido ADN/ARN se encuentra en la cadena rezagada. Dado que dCas9/ARNg se une a ambas cadenas con una eficiencia similar, este dato indica que el híbrido dCas9/ADN-ARN es más recombinogénico en la cadena rezagada que en la cadena adelantada. A continuación, analizamos la relevancia de las vías de deposición de histonas parentales en la recombinación inducida por complejos dCas9*/R-loops. La deposición defectuosa de histonas parentales en la cadena rezagada (mcm2-3A) causó una reducción de 3,2 veces en la frecuencia de recombinantes His+ inducida por complejos dCas9*/R-loops en la cadena rezagada, mientras que apenas afectó la frecuencia de HR inducida por complejos dCas9*/R-loops en la cadena adelantada. Por el contrario, la deposición defectuosa de histonas en la cadena adelantada (dpb3Δ), redujo casi todos los eventos de recombinación inducidos por complejos dCas9*/R-loops en la cadena adelantada, mientras que solo redujo 1,6 veces la frecuencia de HR Resultados 56 inducida por complejos dCas9*/R-loops en la cadena rezagada. Es importante destacar que el hecho de que la recombinación inducida por complejos dCas9*/R-loops fuera suprimida por mutaciones que afectan a los componentes del replisoma demuestra que estos eventos recombinógenicos dependen de la replicación del ADN. Además, estos resultados demuestran que los dCas9*/R-loops promueven la recombinación mediante un mecanismo que es particularmente sensible a problemas en la deposición de histonas parentales en la cadena que contiene el complejo dCas9*/ADN-ARN. De acuerdo con los datos obtenidos con MMS, la ausencia de Srs2 suprimió el defecto en recombinación de mcm2-3A (Figura R1.15A). Sin embargo, este defecto no se suprimió por la ausencia de Dpb3 (Figura R1.15A, comparar mcm2-3A dpb3Δ con mcm2-3A). Esta falta de supresión no fue debido a diferencias en la unión del ARNg en estos fondos mutantes, como podemos inferir del análisis de la eficiencia de corte del complejo Cas9*/gRNA en la repetición his3Δ5 del sistema uSCE mediante qPCR (Figura R1.15B). Por tanto, la restauración del equilibrio de histonas parentales en el doble mutante mcm2-3A dpb3Δ no es suficiente para suprimir los defectos de HR cuando el obstáculo es un complejo dCas9*/R-loop. Figura R1.15. La localización de un complejo dCas9*/R-loop en la cadena rezagada o adelantada determina la vía de deposición de histonas parentales requerida para HR. (A) Efecto de los complejos dCas9/R-loops sobre la frecuencia de uSCE en la cadena rezagada o adelantada en las estirpes indicadas. Las células se transformaron con plásmidos que expresaban tanto dCas9* como un ARNg específico de la cadena rezagada (p416dC9laggR), adelantada (p416dC9leadR) o sin ARNg (pRS416gT-Mxi1) como control negativo. La frecuencia de HR se determinó a partir de colonias crecidas en presencia de 5µg/ml de dox. Se muestra la media ± SEM de 9–14 (wt), 11–12 (mcm2-3A), 7 (dpb3Δ), 7–9 (mcm2-3A dpb3Δ), 4 (srs2Δ y mcm2-3A srs2Δ) y 3 (rad52Δ) tests de fluctuación independientes. (B) Acumulación de DSB inducidos por Cas9/ARNg en la repetición his3Δ5´ del sistema uSCE en Resultados 57 cultivos asincrónicos de células wt y mutantes transformadas con plásmidos que expresan tanto Cas9 (pmL107) como un ARNg específico de la cadena rezagada (p416dC9ΔlaggR), adelantada (p416dC9ΔleadR) o sin ARNg (p416dC9Δ) como control negativo. La cantidad de ADN sin cortar en la repetición his3Δ5´ antes y después del tratamiento con 5 μg/ml de dox durante 5 h se determinó por qPCR y normalizó a la cantidad de ADN en una secuencia control sin cortar en el gen ACT1. Todos los valores se representaron en relación con el enriquecimiento en el tiempo 0, tomado como 100. 58 Resultados 59 3.2. Requerimientos genéticos de la HR en función de la localización de los complejos dCas9*/R-loops en las cadenas nacientes. Los estudios desarrollados hasta ahora en el campo de DDT no han tenido en cuenta la posición del obstáculo en la cadena naciente. Esto puede ser importante teniendo en cuenta que los mecanismos de síntesis de ADN son diferentes en cada cadena y pueden por tanto generar intermediarios diferentes en respuesta al bloqueo. De hecho, hemos visto anteriormente que los complejos dCas9*/R-loops en la cadena rezagada inducen la HR 10 veces, mientras que solo lo hacen 3 veces cuando el bloqueo es en la cadena adelantada (Figura R1.15A). Estas diferencias podrían deberse a que el obstáculo en la cadena adelantada sea menos estable que en la cadena rezagada (por ejemplo, porque las helicasas MCM que viajan por la cadena adelantada eliminen más fácilmente los complejos dCas9*/R-loops). Alternativamente, la diferencia podría deberse a que actúan diferentes mecanismos. A favor de esta posibilidad, hemos visto que los requerimientos genéticos en términos de ensamblaje de la cromatina son diferentes dependiendo de la posición del dCas9*/R-loop en la cadena rezagada o adelantada (Figura R1.15A). Con objeto de determinar si los mecanismos de HR son específicos de la posición del bloqueo decidimos analizar los requerimientos genéticos de la HR inducida por bloqueos específicos de cadena adelantada o rezagada utilizando el sistema de recombinación previamente descrito. Para ello, seleccionamos una batería de mutantes afectados en diferentes funciones relacionadas con la respuesta de DDT (Tabla R2.1). Proteína Función en DDT Rad18 Ubiquitina ligasa que forma con Rad6 (ubiquitina conjugasa) un complejo que monoubiquitina PCNA en la Lys164 Rad5 Ubiquitina ligasa que forma con Mms2-Ubc13 (ubiquitina conjugasa) un complejo que poliubiquitina PCNA en la Lys164 Mms2 Ubiquitina conjugasa junto con Ubc13 que forma con Rad5 un complejo que poliubiquitina PCNA en la Lys164 Pol32 Subunidad de pol δ implicada en la síntesis de ADN durante la extensión de la SCJs; subunidad de Pol ζ implicada en TLS Pol3 Subunidad catalítica del complejo pol δ Pol1 Subunidad catalítica del complejo Pol α Rad51 Recombinasa implicada en la búsqueda de homología e invasión de cadena durante los procesos de recombinación homóloga Rad52 Proteína mediadora de la recombinación que ayuda a cargar a Rad51 en el ssDNA; proteína con actividad de alineamiento de cadena sencilla Rad54 Proteína de HR implicada tanto en la formación del nucleofilamento Rad51/ssDNA como en su posterior desensamblaje tras la invasión de la cadena molde Rad55 Parálogo de Rad51 que forma un complejo con Rad57 que estabiliza el nucleofilamento de Rad51/ssDNA y contrarresta la actividad de Srs2 Resultados 60 Rad57 Parálogo de Rad51 que forma un complejo con Rad55 que estabiliza el nucleofilamento de Rad51/ssDNA y contrarresta la actividad de Srs2 Shu1 Subunidad del complejo Shu implicado en la formación del complejo Rad51/ssDNA contrarrestando la actividad de Srs2 Srs2 3’-5’ helicasa y translocasa que disrumpe el nucleofilamento de Rad51/ssDNA e inhibe la extensión del heterodúplex Sgs1 Helicasa que forma junto con Top3/Rmi1 un complejo implicado en la disolución de los SCJs durante DDT Top3 Topoisomerasa que forma junto con Sgs1/Rmi1 un complejo implicado en la disolución de los SCJs durante DDT Exo1 5’-3’ exonucleasa requerida para la formación de SCJs durante DDT Rad17 Proteína de unión al dsDNA que forma junto con Mec3/Ddc1 (9-1-1) un complejo requerido para la formación de SCJs durante DDT Elg1 Subunidad alternativa del complejo RFC que facilita el reciclaje y descarga de PCNA de la cromatina Hmo1 HMGB homólogo, requerido para la formación de SCJs en fase S Rad27 5-3’ flap exo/endonucleasa necesaria para el procesamiento y maduración de los fragmentos de Okazaki Rtt109 Acetiltransferasa específica de la lisina 56 de la histona H3 Rtt101 Ubiquitina ligasa implicada en varios procesos durante la formación de SCJs Mms22 Ubiquitina ligasa implicada en varios procesos durante la formación de SCJs Ctf4 Adaptador de CMG-Pol α facilita la formación de SCJs durante DDT Ctf18 Subunidad alternativa del complejo RFC implicado en la carga de PCNA durante el estrés replicativo Chl1 ADN helicasa implicado en la cohesión de las cromátidas durante la formación de SCJs Mre11 Nucleasa implicada en TLS y TS durante DDT Mgs1 ADN helicasa que interacciona con PCNA ubiquitinado y desestabiliza la interacción entre PCNA y Pol δ Esc2 Facilita la HR por desregulación local de Srs2; promueve la disolución de SCJs durante DDT Ubp10 Proteasa específica de ubiquitina implicada en la deubiquitinación de PCNA Ubp12 Proteasa específica de ubiquitina implicada en la deubiquitinación de PCNA Rtt105 Chaperona del complejo RPA implicada en la importación nuclear y en la unión al ssDNA Rad9 Mediador del checkpoint de daños Mus81 Endonucleasa que forma un complejo con Mms4 implicada en la resolución de los intermediarios durante DDT Mph1 3’-5’ ADN helicasa y ADN/ARN helicasa implicada en la reversión de la horquilla Top1 Topoisomerasa I Cdc7 Quinasa S/T que constituye la subunidad catalítica de la quinasa dependiente de Dbf4; con diferentes funciones en los procesos de DDT Tabla R2.1. Factores analizados en este estudio. Se indica la actividad de la proteína y las funciones descritas en el proceso de DDT Resultados 61 Los primeros resultados mostraron que el incremento en HR de 3 veces inducido con la guía 1 de la cadena adelantada no permitía determinar con fiabilidad estadística caídas parciales. Como observamos anteriormente que la diferencia en recombinación no es debido a una diferencia en la afinidad de las guías a los moldes de las cadenas adelantada y rezagada (Figura R1.14D), decidimos intentar aumentar la HR en la cadena adelantada introduciendo una segunda guía. Esta segunda guía se clonó en un vector similar al de la guía 1, al que previamente habíamos sustituido el marcador URA3 por TRP1. La expresión de esta segunda guía sola o en combinación con la guía 1 no incremento más de 3 veces la recombinación respecto al control sin guía (Figura R2.1, comparar lead2* o lead2*lead1 con -gRNA). En paralelo habíamos clonado la segunda guía en un plásmido centromérico que no contiene dCas9. La coexpresión de la segunda guía desde el plásmido centromérico junto con dCas9 desde un plásmido que no expresa guía incrementó 12 veces la recombinación respecto al control que solo expresa dCas9 (Figura R2.1, comparar lead2 con -gRNA2). Esta diferencia probablemente se debe a una mayor expresión de la guía en estas condiciones. La expresión adicional de la guía 1 no aumentó significativamente esta ventana (Figura R2.1, comparar lead2 con lead1 lead2). Por tanto, decidimos completar los análisis con la guía 2 desde el plásmido centromérico, ya que ofrecía un incremento similar al que obteníamos con la guía de la cadena rezagada. Es importante indicar que el estudio no se ha completado aun por cuestión de tiempo. Figura R2.1. Frecuencia de uSCE inducida por complejos dCas9*/R-loops en la cadena adelantada. Frecuencia de HR (x10-5) de células con el sistema uSCE transformadas con los plásmidos p314dC9lead2 (lead2*), p416dC9leadR y p314dC9lead2R (lead1 lead2*), p314dC9 y pRS416gT-Mxi1 (-gRNA), p314lead2 y pRS416gT- Mxi1 (lead2), p416dC9leadR y p314lead2 (lead 1 lead2), p314-sgRNA y pRS416gT-Mxi1 (-gRNA2). Resultados 68 Tabla R2.4. Funciones que participan de manera específica en la recombinación inducida por complejos dCas9*/R-loops en la cadena rezagada. Ver más detalles en Tabla R2.2. Genotipo dCas9*/lagg dCas9*/lead 1 -gRNA1 dCas9*/lead 2 -gRNA2 FR (x10-5) ± SEM (pvalue) FR nor. (n) FR (x10-5) ± SEM (pvalue) FR nor. (n) FR (x10-5) ± SEM (pvalue) FR nor. (n) FR (x10-5) ± SEM (pvalue) FR nor. (n) FR (x10-5) ± SEM (pvalue) FR nor. (n) wt 10,6 ± 0,70 1 (17) 3,4 ± 0,42 1 (11) 0,8 ± 0,8 1 (4) 12,6 ± 0,84 1 (7) 1 ± 0,13 1 (2) rad51Δ 7,4 ± 0,76 (0,02) 0,70 (6) 3,5 ± 0,43 (0,90) 1,03 (5) 2,9 ± 0,43 (<0,0001) 3,49 (5) 11,8 ± 0,70 (0,46) 0,93 (4) 1,4 (0,33) 1,39 (1) rad54Δ 5,1 ± 0,91 (0,01) 0,49 (3) 1,7 ± 0,33 (0,08) 0,52 (3) 0,9 ± 0,09 (0,69) 1,08 (3) 10,6 ± 0,25 (0,11) 0,84 (4) 0,7 ± 0,07 (0,22) 0,75 (2) rad59Δ 5,2 ± 1,02 (0,003) 0,50 (4) 2,5 ± 1,18 (0,44) 0,74 (2) 1,6 ± 0,76 (0,05) 1,91 (2) rad55Δ 4,9 ± 1,02 (0,002) 0,46 (4) 1,7 ± 0,40 (0,04) 0,50 (4) 1,0 ± 0,21 (0,48) 1,18 (3) 13,2 ± 1,51 (0,73) 1,04 (3) 0,3 ± 0,11 (0,06) 0,33 (2) rad51Δ rad59Δ 5,1 ± 0,54 (0,002) 0,48 (4) 0,7 ± 0,10 (0,31) 0,80 (3) 14,3 ± 1,18 (0,37) 1,13 (2) 0,5 ± 0,22 (0,18) 0,49 (2) shu1Δ 6,2 ± 0,88 (0,01) 0,59 (4) 1,8 ± 0,40 (0,05) 0,52 (4) 0,6 ± 0,04 (0,07) 0,68 (4) 14,6 ± 3,81 (0,46) 1,16 (3) 0,9 ± 0,28 (0,78) 0,88 (3) rad17Δ 6,0 ± 1,12 (0,01) 0,56 (4) 1,8 ± 0,48 (0,10) 0,54 (3) 0,9 ± 0,12 (0,64) 1,09 (3) 11,7 ± 2,48 (0,67) 0,93 (4) 0,7 ± 0,08 (0,26) 0,76 (2) rad18Δ 5,8 ± 1,03 (0,007) 0,55 (4) 1,6 ± 0,50 (0,04) 0,47 (4) 1,2 ± 0,29 (0,10) 1,46 (3) 11,4 ± 2,43 (0,59) 0,90 (5) 1,1 ± 0,77 (0,91) 1,10 (2) ubp12Δ 7,2 ± 1,24 (0,03) 0,68 (5) 2,0 ± 0,10 (0,13) 0,6 (3) 0,5 ± 0,13 (0,10) 0,64 (3) 10,1 ± 2,33 (0,10) 0,67 (4) 1,4 ± 0,95 (0,68) 1,47 (2) top1Δ 2,9 ± 0,16 (<0,0001) 0,27 (5) 1,9 ± 0,18 (0,11) 0,56 (3) 1,7 ± 0,10 (0,0003) 2,01 (3) 10,2 ± 1,41 (0,15) 0,8 (4) 1,4 ± 0,23 (0,23) 1,46 (2) Resultados 69 3.2.3. Funciones que participan de manera específica en la recombinación inducida por complejos dCas9*/R-loops en la cadena adelantada Como ya se ha mencionado, mucho de los factores que se habían implicado en la recombinación inducida por MMS o UV durante la DDT afectan solo a la recombinación inducida por un dCas9*/R- loop en la cadena rezagada y no en la cadena adelantada (Tabla R2.4). Una excepción son los mutantes mms2Δ y rad5Δ, los cuales no tienen efecto cuando el bloqueo es en la cadena rezagada, pero reducen ligeramente la recombinación inducida por complejos dCas9*/R-loops en la cadena adelantada (Tabla R2.5). Este resultado es aparentemente contradictorio con la ausencia de efecto del mutante rad18Δ, ya que el complejo Rad6/Rad18 es necesario para generar el sustrato (PCNA monoubiquitinado) para el complejo Rad5/Mms2-Ubc13 (Hoege et al., 2002). El papel de Rad5 podría estar asociado tanto a su actividad ligasa de ubiquitina como helicasa. Para distinguir entre estas posibilidades analizamos los mutantes rad5-Q1106D y rad5- I916A, pero no observamos una caída significativa en ninguno de ellos (Tabla R2.3). Finalmente, hemos observado que la ausencia de las proteínas Rad9 y Rtt105 tienen un ligero pero significativo efecto sobre la HR inducida por un bloqueo en la cadena adelantada (Tabla R2.5). Rad9 es la proteína mediadora del checkpoint de daños (Emili, 1998; Vialard, 1998), y Rtt105 es una chaperona del complejo RPA que participa en su importación al núcleo y unión al ssDNA (S. Li et al., 2018). Es improbable que el defecto del mutante rtt105Δ sea debido a un defecto en recombinación por limitación de RPA, ya que ni Rad51 ni sus mediadores son necesarios para la recombinación inducida por complejos dCas9*/R-loops en esta cadena (Tabla R2.4). Otra posibilidad es que esté relacionado con un defecto en checkpoint, ya que el primer paso en la activación del checkpoint es la unión del complejo Mec1/Ddc2 al nucleofilamento de ssDNA/RPA (Zou & Elledge, 2003). Resultados 70 Tabla R2.5. Funciones que participan de manera específica en la recombinación inducida por complejos dCas9*/R-loops en la cadena adelantada. Ver más detalles en Tabla R2.2. Genotipo dCas9*/lagg dCas9*/lead 1 -gRNA1 dCas9*/lead 2 -gRNA2 FR (x10-5) ± SEM (pvalue) FR nor. (n). FR (x10-5) ± SEM (pvalue) FR nor. (n) FR (x10-5) ± SEM (pvalue) FR nor. (n) FR (x10-5) ± SEM (pvalue) FR nor. (n) FR (x10-5) ± SEM (pvalue) FR nor. (n) wt 10,6 ± 0,70 1 (17) 3,4 ± 0,42 1 (11) 0,8 ± 0,8 1 (4) 12,6 ± 0,84 1 (7) 1 ± 0,13 1 (2) mms2Δ 13,6 ± 3,73 (0,18) 1,28 (3) 1,6 ± 0,48 (0,06) 0,48 (3) 1,0 ± 0,26 (0,42) 1,21 (2) 7,2 ± 0,76 (0,001) 0,57 (5) 0,6 ± 0,38 (0,48) 0,65 (2) rad5Δ 10,3 ± 1,99 (0,88) 0,97 (4) 1,5 ± 0,12 (0,02) 0,45 (4) 1,5 ± 0 0,05 (0,01) 1,79 (4) 8,9 ± 0,64 (0,05) 0,71 (2) 0,7 0,70 (1) rad9Δ 9,6 ± 1,43 (0,54) 0,91 (4) 1,5 ± 0,61 (0,05) 0,44 (3) 0,9 ± 0,11 (0,85) 1,04 (3) 8,2 ± 1,2 (0,02) 0,65 (5) 0,9 ± 0,16 (0,67) 0,90 (2) rtt105Δ 13,5 ± 1,08 (0,10) 1,28 (3) 8,6 ± 0,94 (0,02) 0,68 (2) 1,5 ± 0,04 1,51 (2) Resultados 71 3.2.4. Mutantes que aumentan la recombinación inducida por complejos dCas9*/R- loops en la cadena rezagada y adelantada El complejo STR es necesario para la disolución de estructuras de tipo dHJs (Liberi et al., 2005). En su ausencia, estos intermediarios se resuelven mediante resolvasas que aumentan la probabilidad de entrecruzamiento (Gallo-Fernández et al., 2012). La ausencia de Sgs1 y Top3 aumentó la tasa de HR inducida por complejos dCas9*/R-loops tanto en la cadena rezagada como adelantada (Tabla R2.6). Este resultado sugiere que ambos tipos de eventos de HR están asociados a la formación de dHJs. Rad27 es una endonucleasa implicada en la maduración de los fragmentos de Okazaki (Ayyagari et al., 2003). La ausencia de Rad27 aumentó la HR espontánea e inducida por complejos dCas9*/R-loops en ambas cadenas, siendo el efecto mayor cuando el bloqueo se produjo en la cadena adelantada (Tabla R2.6). Este dato implicaría a Rad27 en la supresión de un exceso de eventos de recombinación tanto en la cadena rezagada como sobre todo en la cadena adelantada. No obstante, los defectos del mutante rad27Δ podrían estar asociado a un procesamiento alternativo de los fragmentos de Okazaki, que se ha visto que genera largas colas de ssDNA que activan la ubiquitinación de PCNA (Becker et al., 2015). En consonancia con su papel antirecombinogénico la ausencia de Srs2 generó un ligero pero significativo incremento en los niveles de recombinación inducido por complejos dCas9*/R- loops tanto en la cadena rezagada (Tabla R2.6) como en la cadena adelantada (Macarena Alcalá, datos nos publicados). Como hemos comentado anteriormente, Srs2 tiene dos funciones antirrecombinogénica: participa en el desmantelamiento del nucleofilamento de Rad51/ssDNA (Papouli et al., 2005; Pfander et al., 2005) e inhibe la extensión del heterodúplex (Burkovics et al., 2013). Esta segunda posibilidad es más probable que participe durante la HR inducida por complejos dCas9*/R-loops en la cadena adelantada, ya que ni Rad51 ni sus mediadores son necesarios en esta cadena (Tabla R2.2). 3.2.5. La ausencia de Elg1 y Exo1 aumenta de manera específica la recombinación inducida por complejos dCas9*/R-loops en la cadena adelantada y rezagada, respectivamente Elg1 constituye una subunidad alternativa del complejo RFC implicado en el reciclaje de PCNA en la cadena rezagada durante la síntesis de los fragmentos de Okazaki (Kang et al., 2019; Kubota et al., 2013). En presencia de estrés replicativo como HU o MMS, Elg1 descarga PCNA de la cadena rezagada (Yu et al., 2014). De acuerdo con datos anteriores, la ausencia de Elg1 aumentó 3 veces Resultados 72 la recombinación espontánea (Tabla R2.7) (C. Johnson et al., 2016). Además, aumento 2,5 veces la HR inducida por complejos dCas9*/R-loops específicamente en la cadena adelantada. Esto sugiere que la acumulación de PCNA en la cadena rezagada promueve los eventos de HR asociados a bloqueos en esta cadena. La ausencia de Rad17 (subunidad del complejo 9-1-1) redujo la HR inducida por un bloqueo en la cadena rezagada. Este fenotipo podría deberse a su papel en el reclutamiento de Exo1 para la resección y extensión del fragmento de ssDNA como paso previo a la HR (Karras et al., 2013). Sin embargo, la ausencia de Exo1 aumentó ligeramente la HR inducida por complejos dCas9*/R-loops específicamente en la cadena rezagada (Tabla R2.8). La Tabla R2.3 muestra los mutantes que no alteraron la tasa de recombinación independientemente de la cadena a la que se dirigieron los complejos dCas9*/R-loops. En cualquier caso, es importante mencionar que los requerimientos genéticos descritos en este estudio son específicos de este tipo de obstáculo, por lo que no podemos descartar que otros tipos de bloqueos generados por alquilación de bases o radiación UV tengan unos requerimientos parcialmente diferentes. En conjunto, los resultados presentados sugieren que los mecanismos de recombinación que actúan en respuesta a un bloqueo replicativo varian dependiendo de que éste se de en la cadena adelantada o rezagada. Resultados 73 Tabla R2.6. Mutantes que aumentan la recombinación inducida por complejos dCas9*/R-loops en la cadena rezagada y adelantada. Ver más detalles en Tabla R2.2. Tabla R2.7. La ausencia de Elg1 aumenta de manera específica la recombinación inducida por complejos dCas9*/R-loops en la adelantada. Ver más detalles en Tabla R2.2. Genotipo dCas9*/lagg dCas9*/lead 1 -gRNA1 dCas9*/lead 2 -gRNA2 FR (x10-5) ± SEM (pvalue) FR nor. (n). FR (x10-5) ± SEM (pvalue) FR nor. (n) FR (x10-5) ± SEM (pvalue) FR nor. (n) FR (x10-5) ± SEM (pvalue) FR nor. (n) FR (x10-5) ± SEM (pvalue) FR nor. (n) wt 10,6 ± 0,70 1 (17) 3,4 ± 0,42 1 (11) 0,8 ± 0,8 1 (4) 12,6 ± 0,84 1 (7) 1 ± 0,13 1 (2) sgs1Δ 36,2 ± 3,70 (<0,0001) 3,4 (3) 20,9 ± 1,42 (<0,0001) 6,2 (3) 10,7 ± 0,9(<0,0001)12,98 (4) top3Δ 33,9 ± 7,69 (<0,0001) 3,2 (3) 8,12 ± 3,9 (0,0007) 9,87 (2) 36,3 ±0,58 (<0,0001) 2,9 (3) 11 (0,01) 11,31 (1) rad27Δ 16,8 ± 1,35 (0,0024) 1,6 (3) 9,7 ± 1,43 (<0,0001) 2,9 (4) 3,9 ± 1,68 (0,006) 4,72 (3) srs2Δ 16 ± 3,23 (0,02) 1,52 (4) 3,9 ± 0,97 (0,57) 1,16 (4) 1,71 ± 0,24 (0,001) 2,08 (3) Genotipo dCas9*/lagg dCas9*/lead 1 -gRNA1 FR (x10-5) ± SEM (pvalue) FR nor. (n) FR (x10-5) ± SEM (pvalue) FR nor. (n) FR (x10-5) ± SEM (pvalue) FR nor. (n). wt 10,6 ± 0,70 1 (17) 3,4 ± 0,42 1 (11) 0,8 ± 0,8 1 (4) elg1Δ 12,3 ± 1,94 (0,30) 1,17 (5) 8,4 ± 0,56 (<0,0001) 2,5 (6) 2,7 ± 0,53 (0,0005) 3,31 (5) Genotipo dCas9*/lagg dCas9*/lead 1 -gRNA1 dCas9*/lead 2 FR (x10-5) ± SEM (pvalue) FR nor. (n) FR (x10-5) ± SEM (pvalue) FR nor. (n). FR (x10-5) ± SEM (pvalue) FR nor. (n) FR (x10-5) ± SEM (pvalue) FR nor. (n) wt 10,6 ± 0,70 1 (17) 3,4 ± 0,42 1 (11) 0,8 ± 0,8 1 (4) 12,6 ± 0,84 1 (7) exo1Δ 14,7 ± 1,80 (0,02) 1,39 (5) 3,4 ± 0,46 (0,94) 1,02 (5) 2,11 ± 0,53 (0,004) 2,56 (4) 15,2 ± 0,74 (0,10) 1,2 (3) Tabla R2.8. La ausencia de Exo1 aumenta de manera específica la recombinación inducida por complejos dCas9*/R- loops en la cadena rezagada. Ver más detalles en Tabla R2.2. 4. DISCUSIÓN Discusión 77 Los mecanismos de DDT son desencadenados por condiciones que impiden el avance de la horquilla de replicación. Debido a la estrecha conexión genética y física entre la síntesis de ADN y el ensamblaje de nucleosomas en la horquilla de replicación, decidimos estudiar la relevancia de la deposición de las histonas parentales en los mecanismos de DDT. En este trabajo mostramos que mutantes en la deposición de histonas parentales están afectados en la reparación recombinacional de los fragmentos de ssDNA. A nivel molecular, demostramos que estos defectos de recombinación no se deben a un déficit global de deposición de histonas parentales, sino a un a desequilibrio en la distribución de histonas parentales y de novo entre las cadenas nacientes. Específicamente, hemos observado que un exceso de nucleosomas parentales en la cadena invadida durante la recombinación desestabiliza los intermediarios recombinogénicos mediante un mecanismo dependiente de la helicasa Srs2. Como consecuencia de estos defectos, la viabilidad de estos mutantes depende de la ruta mutagénica de TLS. Además, mediante un ensayo genético de HR basado en CRISPR/dCas9 que permite analizar las consecuencias de un bloqueo en la replicación dependiendo de que el obstáculo este en la cadena rezagada o adelantada hemos demostramos que la HR es más sensible a problemas en la deposición de histonas en la cadena donde se encuentra el obstáculo replicativo. 4.1. El reciclaje de histonas parentales controla la estabilidad de los intermediarios de HR durante la respuesta de DDT En este trabajo mostramos que mutantes en la deposición de histonas parentales en la cadena rezagada o adelantada están afectados en la reparación recombinacional de los fragmentos de ssDNA inducidos por MMS. Además, hemos demostrado mediante análisis moleculares que el mutante mcm2-3A afectado en el reciclaje de las histonas parentales en la cadena rezagada es defectivo en la estabilidad de las SCJs inducidas por MMS, en línea con un trabajo paralelo de Dolce et al (2022). Nuestro trabajo demuestra que este defecto en SCJs no es debido a una pérdida global de nucleosomas parentales sino a un desequilibrio en la distribución de las histonas parentales y de novo entre las cadenas nacientes. Específicamente, los defectos en el relleno de los fragmentos de ssDNA y en la acumulación de SCJs asociados con defectos en la deposición de histonas parentales en la cadena rezagada en el mutante mcm2-3A se suprimen parcialmente al afectar también la deposición de histonas parentales en la cadena adelantada en el doble mutante mcm2-3A dpb3Δ. Esto indica que los defectos en HR en el mutante mcm2-3A no están asociados a un déficit de histonas parentales en la cadena rezagada sino a un exceso de histonas parentales en la cadena adelantada. A diferencia de los resultados publicados en Dolce et al (2022), los mutantes simples dpb3Δ, pol1-2A2 y pol1-4A no mostraron defectos significativos en la acumulación de SCJs bajo nuestras condiciones experimentales, lo cual podría deberse a Discusión 84 fragmentos de Okazaki, sugiere que la HR inducida por dCas9*/R-loop en la cadena rezagada ocurre en los fragmentos de ssDNA que quedan detrás de la horquilla mediante SCJs (Figura D2.1). Es también particularmente relevante que la HR inducida por un obstáculo en la cadena rezagada es completamente dependiente de Top1, lo que podría sugerir que la HR en esta situación tiene unas condiciones topológicas muy específicas. Sin embargo, Top1 no es necesario para la respuesta inducida por MMS (Niimi et al., 2012). Por tanto, no podemos descartar que este defecto este asociado a una menor eficiencia de unión de dCas9 junto con gRNA en la cadena rezagada por cuestiones topológicas. Figura D2. Modelo de HR inducido por un dCas9*/R-loop en la cadena rezagada y adelantada, respectivamente. Ver texto para más detalles. Discusión 85 4.7. Requerimientos genéticos para la HR inducida por complejos dCas9*/R- loops en la cadena adelantada Aunque Rad52 es completamente necesario para la HR inducida por complejos dCas9*/R-loops en la cadena adelantada, los factores de HR Rad51, Rad54, Rad55 y Shu1 fueron prescindibles. Este resultado es inesperado y sugiere que ni la formación de un nucleofilamento de Rad51/ssDNA ni el intercambio de cadena son necesarios para la HR inducida por estos obstáculos en la cadena adelantada. Además, este resultado implica que la función de Rad52 no esta asociado a su papel como mediador en la carga de Rad51 sino con su actividad de alineamiento de moléculas de ssDNA. Entonces, ¿cómo cataliza Rad52 el cambio de molde en la HR inducida por complejos dCas9*/R-loops independientemente de Rad51? Rad52 participa en dos mecanismos de recombinación independientes de Rad51: SSA (del inglés “Single Strand Annealing”) y BIR (del inglés “Break Induced Replication”). Sin embargo, ambas vías están asociadas a la formación de DSBs (Ivanov et al., 1996; Malkova et al., 1996; Signon et al., 2001). Recientemente, se ha observado que Rad52 puede reiniciar de manera independiente de Rad51 la replicación de una horquilla bloqueada por una barrera de replicación (RFB, del inglés “Replication Fork Barrier”) que no induce DSB (Kishkevich et al., 2022; Mizuno et al., 2009; Nguyen et al.,2015). Este papel de Rad52 depende de su dominio N-terminal (Kishkevich et al., 2022), el cual puede promover in vitro el alineamiento entre moléculas de ssDNA y generar D-loop entre una molécula de ssDNA y un ADN plasmídico superenrollado (Kagawa et al., 2008). Por tanto, nuestros datos sugieren que la HR mediada por complejos dCas9*/R-loops en la cadena adelantada procede mediante un mecanismo de alineamiento de moléculas de ssDNA dependiente de Rad52. En este contexto, el papel antirecombinogénico observado por Srs2 podría asociarse con su actividad disruptora del D-loop (Burkovics et al., 2013). Alternativamente, el papel de Srs2 podría estar relacionado con datos recientes in vitro que demuestran que Srs2 es capaz de eliminar tanto RPA como Rad52 de la molécula de ssDNA (De Tullio et al., 2017). ¿Cómo se podrían estar generando los sustratos de ssDNA que promueven el rescate de la horquilla bloqueada? En células mamíferos, la reversión de la horquilla parece ser un mecanismo mayoritario para baipasear los daños y obstáculos en el ADN (Zellweger et al., 2015). Recientemente, se ha propuesto que la reversión de la horquilla requiere la actividad de intercambio de cadena de Rad51 para generar un dúplex de ADN parental detrás de la helicasa replicativa que es usado como sustrato por las translocasas para revertir la horquilla (W. Liu et al., Discusión 86 2023). Este proceso generaría los fragmentos de ssDNA necesarios para el reinicio de la replicación (en el extremo procesado de la horquilla revertida y en la molécula de ADN abierta por la helicasa MCM) (Figura I9). Este modelo tiene dos limitaciones. Primero, es dependiente de Rad51, no obstante, Rad52 podría llevar acabo esta función independientemente de Rad51, dado que tras el bloqueo de la cadena adelantada y como consecuencia de la acumulación de ssDNA en la cadena rezagada se exponen dos moléculas de ssDNA (Figura D2B). Segundo, el modelo sugiere la formación de una horquilla revertida proceso que en levaduras parece ser poco abundante, aunque este paso podría ser llevado a cabo por Rad5 como se ha visto in vitro (Figura D2B) (Blastyák et al., 2007; Ling et al., 2023; Shin et al., 2018). De acuerdo con esta posibilidad, hemos observado que el mutante rad5Δ reduce la HR en esta cadena. La poca caída observada sugiere la existencia de helicasas/translocasas adicionales durante el mecanismo de reversión de la horquilla de replicación. De acuerdo con esta idea se ha demostrado que la ausencia simultanea de Mph1 y Rad5 afecta a la HR inducida por una RFB (Marie & Symington, 2022). Por tanto, sería interesante combinar el mutante rad5Δ con mutaciones en otras proteínas que han sido implicadas en la reversión de la horquilla como Mph1 y Rad54 (Bugreev et al., 2011; Zheng et al., 2011). Alternativamente, la contribución minoritaria de Rad5 en la HR en la cadena adelantada podría explicarse si los defectos en la reversión de la horquilla en el mutante rad5Δ se canalizan a la vía de HR asociada a la formación de SCJs. Para descartar esta posibilidad será necesario analizar mutante dobles que afecten a ambas rutas (p. ej. rad5Δ rad51Δ). La nucleasa Mre11 es necesaria para la HR inducida por complejos dCas9*/R-loops en la cadena adelantada. Mre11 esta implicada en la resección del ADN durante el procesamiento tanto de DSBs como de fragmentos de ssDNA previos a la formación de SCJs (Ball et al., 2014). Dado que la HR inducida por complejos dCas9*/R-loops en la cadena adelantada no parece estar asociada a la formación de SCJs, el requerimiento de Mre11 podría estar asociado a su papel durante el procesamiento de las horquillas revertidas (Figura I9, Figura D2B) (Lemaçon et al., 2017). En células de mamífero, CDC7 regula la actividad de Mre11 durante este proceso (Rainey et al., 2020). De acuerdo con esto, el mutante cdc7-4 redujo severamente la HR inducida por complejos dCas9*/R-loops en esta cadena, aunque también en la cadena rezagada. Sin embargo, no podemos descartar que el papel de Cdc7 en la HR inducida por complejos dCas9*/R-loops dependa de la posición del obstáculo en las cadenas nacientes. En este contexto, el papel de Cdc7 en la HR en la cadena rezagada podría estar relacionado con la formación de SCJs (Joseph et al., 2022). Discusión 87 Es importante mencionar que tanto Rad9 como Rtt105 son necesarios específicamente para la HR en la cadena adelantada, lo que sugiere que en este tipo de eventos se está acumulando ssDNA que activa el checkpoint y que es necesario para que se promuevan estos eventos de HR (Figura D2B). Dado que la ausencia de Rtt105 (chaperona de RPA) también afecta a la HR en esta cadena, es posible que la activación del checkpoint sea necesaria para la estabilización de estos intermediarios. ¿Cuál es la función de PCNA en la HR inducida por complejos dCas9*/R-loops? El mutante elg1Δ que acumula PCNA en la cadena rezagada (Yu et al., 2014), aumentó específicamente la HR en la cadena adelantada. Este fenotipo, podría deberse a efectos indirectos del mutante elg1Δ en cohesión (Choudhary et al., 2022; Moldovan et al., 2006; Parnas et al., 2009). Alternativamente, el aumento en HR podría estar asociado a defectos en ensamblaje de la cromatina (V. K. Gali et al., 2018). Como hemos mencionado, el mutante rad5Δ afectó a los eventos de HR inducidos por un obstáculo en la cadena adelantada, aunque esto parece no estar asociado a su papel en ubiquitinación de PCNA ya que el mutante rad18Δ, el cual elimina completamente la ubiquitinación de PCNA no afectó a los eventos de HR en esta cadena. Sin embargo, no podemos descartar que los defectos de los mutante rad5Δ y msm2Δ estén asociados a una acumulación de PCNA monoubiquitinado que podría reclutar a polimerasas de TLS y dificultar el baipás del obstáculo por HR. Los eventos de HR asociados a un obstáculo en la cadena rezagada si requieren Rad18, mientras que Rad5 y Mms2 son prescindibles, a pesar de ser la poliubiquitinación lo que es necesario para la HR durante la DDT. Una posibilidad, y en contraposición con la HR inducida durante la respuesta de DDT, es que la HR inducida por dCas9*/R-loops en la cadena rezagada necesite la monoubiquitinación de PCNA. Estudios adicionales serán necesarios para dilucidar el papel de PCNA y más específicamente de sus modificaciones en la HR inducida por complejos dCas9*/R-loops. 5. CONCLUSIONES Conclusiones 91 1. El reciclaje de histonas parentales promueve la respuesta de DDT mediante mecanismos de HR. 2. La correcta distribución de histonas parentales y recién sintetizadas entre las cadenas nacientes es necesaria para la estabilidad de los intermediarios de HR entre las cromátidas hermanas durante la DDT. 3. La correcta distribución de histonas parentales entre las cadenas nacientes facilita la HR durante la DDT evitando una unión/actividad patogénica de la helicasa Srs2. 4. Los defectos en HR de los mutantes de reciclaje de histonas parentales se compensan mediante la reparación de las lesiones en el ADN por la ruta de TLS. Por tanto, la correcta distribución de histonas parentales entre las cadenas nacientes es necesario para prevenir un exceso de mutaciones en el ADN. 5. Los complejos dCas9*/R-loops son más recombinogénicos en la cadena rezagada que en la adelantada, indicando que la posición del obstáculo en la cadena rezagada o adelantada puede tener un impacto diferente sobre la integridad genómica. 6. La localización de los complejos dCas9*/R-loop en la cadena rezagada o adelantada determina la ruta de deposición de histonas parentales requerida para la HR. 7. Los requerimientos genéticos de la HR son diferentes dependiendo de la posición del obstáculo (complejos dCas9*/R-loops) en las cadenas nacientes. 6. MATERIALES Y MÉTODOS Materiales y Métodos 100 WRAD54YFPd3- 11B MATa RAD54YFP::URA3 dpb3∆::KANMX4 RAD5 Esta tesis R1.8A-F WRAD54YFPm2d3- 4B MATa RAD54YFP::URA3 dpb3∆::KANMX4 mcm2-3A (hphNT) RAD5 Esta tesis R1.8A-F WSCE-1A MATa 100 trp1::SCE::URA3 RAD5 Esta tesis R1.9A WSCEm2-7C MATa trp1::SCE::URA3 mcm2-3A (hphNT) RAD5 Esta tesis R1.9A WSCEd3-4D MATa trp1::SCE::URA3 dpb3∆::KANMX4 RAD5 Esta tesis R1.9A WSCEm2d3-2D MATa trp1::SCE::URA3 mcm2-3A (hphNT) dpb3∆::KANMX4 RAD5 Esta tesis R1.9A W303CAN MATa CAN RAD5 (Cano- Linares et al., 2021) R1.9B WCAN-4D MATa CAN RAD5 Esta tesis R1.9B WCANm2-8B MATa CAN mcm2-3A (hphNT) RAD5 Esta tesis R1.9B WCANm2-10A MATa CAN mcm2-3A (hphNT) RAD5 Esta tesis R1.9B WCANd3-4A MATa CAN dpb3∆::KANMX4 RAD5 Esta tesis R1.9B WCANd3-7C MATa CAN dpb3∆::KANMX4 RAD5 Esta tesis R1.9B WCANm2d3-8B MATa CAN mcm2-3A (hphNT) dpb3∆::KANMX4 RAD5 Esta tesis R1.9B WCANm2d3-5B MATa CAN mcm2-3A (hphNT) dpb3∆::KANMX4 RAD5 Esta tesis R1.9B WRad52MN-14B MATa barΔ::HisG Rad52MN::HISMX6 RAD5 Esta tesis R1.10B WRad52MNm2-1A MATa barΔ::HisG Rad52MN::HISMX6 mcm2-3A (hphNT) RAD5 Esta tesis R1.10B W303sgs1 MATa sgs1∆::KANMX4 RAD5 (González -Prieto et al., 2013) R1.11B-E, R1.12A-C Wsgs1m2-2C MATa pep4Δ::ADE2 sgs1∆::KANMX4 mcm2-3A (hphNT) RAD5 Esta tesis R1.11B-E, R1.13C Materiales y Métodos 101 Wsgs1d3-3C MATa pep4Δ::ADE2 sgs1∆::KANMX4 dpb3∆::KANMX4 RAD5 Esta tesis R1.11B, D-E Wsgs1m2d3-12A MATa pep4Δ::ADE2 sgs1∆::KANMX4 mcm2-3A (hphNT) dpb3∆::KANMX4 RAD5 Esta tesis R1.11B, D-E Wsgs1r5-4A MATa sgs1∆::KANMX4 rad5-535 Esta tesis R1.11C-F Wsgs1m2r5-7A MATa sgs1∆::KANMX4 mcm2-3A (hphNT) rad5-535 Esta tesis R1.11C-F Wp1-4Asgs1-4D MATa pol1-4A::URA3 sgs1∆::KANMX4 RAD5 Esta tesis R1.12A-C Wp1-4Ad3sgs1-2D MATa pol1-4A::URA3 dpb3∆::KANMX4 sgs1∆::KANMX4 RAD5 Esta tesis R1.12A-C Wp1-2A2sgs1-4A MATa pol1-2A2 (hphNT) sgs1∆::KANMX4 RAD5 Esta tesis R1.12A-C Wp1- 2A2d3sgs1d3-6D MATa pol1-2A2 (hphNT) dpb3∆::KANMX4 sgs1∆::KANMX4 RAD5 Esta tesis R1.12A-C Wp1-4Ad3-3D MATa pol1-4A::URA3 dpb3∆::KANMX4 RAD5 Esta tesis R1.12D Wp1-2A2d3-4A MATa pol1-2A2 (hphNT) dpb3∆::KANMX4 RAD5 Esta tesis R1.12D WSrs2Dg-5 MATα ura3-1::ADH1-OsTIR1-9Myc (URA3) Srs2:: Srs2-aid (HygMX) Esta tesis R1.13A-B WSrs2Dgsgs1-9B MATa ura3-1::ADH1-OsTIR1-9Myc(URA3) Srs2:: Srs2-aid (HygMX) sgs1∆::KANMX4 RAD5 Esta tesis R1.13C WSrs2Dgsgs1 m2- 16D MATa ura3-1::ADH1-OsTIR1-9Myc(URA3) Srs2:: Srs2-aid (HygMX) sgs1∆::KANMX4 mcm2-3A (hphNT) RAD5 Esta tesis R1.13C WSCE-9,11 MATa bar1Δ::LEU2 trp1::SCE::KANMX4 RAD5 Esta tesis R1.14C, E, R1.15A, R2.1-8 WSCE-9B MATa trp1::SCE::KANMX4 RAD5 Esta tesis R1.14D, R1.15B, R2.2 WSCEm2-3C MATa bar1Δ::LEU2 trp1::SCE:: KANMX4 mcm2-3A (hphNT) RAD5 Esta tesis R1.15A WSCEm2-2B MATa trp1::SCE:: KANMX4 mcm2-3A (hphNT) RAD5 Esta tesis R1.15B WSCEd3-5C MATa bar1Δ::LEU2 trp1::SCE::KANMX4 dpb3∆::KANMX4 RAD5 Esta tesis R1.15A WSCEd3-9D MATa trp1::SCE:: KANMX4 dpb3∆::KANMX4 RAD5 Esta tesis R1.15B Materiales y Métodos 102 WSCEm2d3-10D MATa bar1Δ::LEU2 trp1::SCE::KANMX4 mcm2-3A (hphNT) dpb3∆::KANMX4 RAD5 Esta tesis R1.15A WSCEm2d3-5A MATa trp1::SCE:: KANMX4 mcm2-3A (hphNT) dpb3∆::KANMX4 RAD5 Esta tesis R1.15B WSCEsrs2-9D MATa bar1Δ::LEU2 pep4Δ::ADE2 trp1::SCE::KANMX4 srs2∆::KANMX4 RAD5 Esta tesis R1.15A, R2.6 WSCEsrs2m2-2A MATa bar1Δ::LEU2 pep4Δ::ADE2 trp1::SCE:: KANMX4 srs2∆::KANMX4 mcm2-3A (hphNT) RAD5 Esta tesis R1.15A WSCEr52-8C MATa bar1Δ::LEU2 trp1::SCE::KANMX4 rad52∆::KANMX4 RAD5 Esta tesis R1.15A, R2.2 WSCEr52-12A MATa trp1::SCE::KANMX4 rad52∆::KANMX4 RAD5 Esta tesis R1.15A, R2.2 WSCEhmo1-1A MATα trp1::SCE::KANMX4 hmo1∆::KANMX4 RAD5 Esta tesis R2.2 WSCEhmo1-1C MATa trp1::SCE::KANMX4 hmo1∆::KANMX4 RAD5 Esta tesis R2.2 WSCEpol1-1-3C MATα trp1::SCE::KANMX4 pol1-1 RAD5 Esta tesis R2.2 WSCErtt109-3B MATα bar1Δ::LEU2 trp1::SCE::KANMX4 rtt109∆::KANMX4 RAD5 Esta tesis R2.2 WSCErtt109-5B MATa trp1::SCE::KANMX4 rtt109∆::KANMX4 RAD5 Esta tesis R2.2 WSCErtt101-1,2 MATa bar1Δ::LEU2 trp1::SCE::KANMX4 rtt101∆::NATMX4 RAD5 Esta tesis R2.2 WSCEmms22- 5B,6B MATa trp1::SCE::KANMX4 mms22∆::NATMX4 RAD5 Esta tesis R2.2 WSCEctf4-4A MATa bar1Δ::LEU2 trp1::SCE::KANMX4 ctf4∆::KANMX4 RAD5 Esta tesis R2.2 WSCEctf4-10B MATa trp1::SCE::KANMX4 ctf4∆::KANMX4 RAD5 Esta tesis R2.2 WSCEctf18-3,4 MATa bar1Δ::LEU2 trp1::SCE::KANMX4 ctf18∆::NATMX4 RAD5 Esta tesis R2.2 WSCEchl1-8A,10C MATa trp1::SCE::KANMX4 chl1∆::KANMX4 RAD5 Esta tesis R2.2 WSCEpol3ct-11A MATa trp1::SCE::KANMX4 pol3-ct RAD5 Esta tesis R2.2 WSCEpol32-4D, 9C MATa trp1::SCE::KANMX4 pol32∆::HYGMX4 RAD5 Esta tesis R2.2 Materiales y Métodos 103 WSCEpol32-13B MATa bar1Δ::LEU2 trp1::SCE::KANMX4 pol32∆::HYGMX4 RAD5 Esta tesis R2.2 WSCEmre11-4C MATa bar1Δ::LEU2 trp1::SCE::KANMX4 mre11∆:: HYGMX4 RAD5 Esta tesis R2.2 WSCEmre11-5C MATa trp1::SCE::KANMX4 mre11∆:: HYGMX4 RAD5 Esta tesis R2.2 WSCEPcdc7-4-5C MATa bar1Δ::LEU2 trp1::SCE::KANMX4 cdc7-4 RAD5 Esta tesis R2.2 WSCEmus81-1,5 MATa 100 bar1Δ::LEU2 trp1::SCE::KANMX4 mus81∆::NATMX4 RAD5 Esta tesis R2.3 WSCEmph1-1A,1B MATa trp1::SCE::KANMX4 mph1∆::KANMX4 RAD5 Esta tesis R2.3 WSCEesc2-1B,2C MATa trp1::SCE::KANMX4 esc2∆::NATMX4 RAD5 Esta tesis R2.3 WSCEmgs1- 23B,20C MATa trp1::SCE::KANMX4 mgs1∆::HYGMX4 RAD5 Esta tesis R2.3 WSCEubp10-5C,6A MATa trp1::SCE::KANMX4 ubp10∆::HYGMX4 RAD5 Esta tesis R2.3 WSCEr5-I916A-6B MATα bar1Δ::LEU2 trp1::SCE::KANMX4 rad5I916A::KANMX4 RAD5 Esta tesis R2.3 WSCEr5-I916A-8A MATa trp1::SCE::KANMX4 rad5I916A::KANMX4 RAD5 Esta tesis R2.3 WSCEr5Q1106D- 1C,2D MATa bar1Δ::LEU2 trp1::SCE::KANMX4 rad5Q1106D∆::KANMX4 RAD5 Esta tesis R2.3 WSCEsmc3-42- 1A,10C MATa trp1::SCE::KANMX4 smc3-42 RAD5 Esta tesis R2.3 WSCEr51-8A,10A MATa trp1::SCE::KANMX4 rad51∆::KANMX4 RAD5 Esta tesis R2.4 WSCErad54- 4A,14A MATa bar1Δ::LEU trp1::SCE::KANMX4 rad54∆::NATMX4 RAD5 Esta tesis R2.4 WSCErad55-2D,8D MATa trp1::SCE::KANMX4 rad55∆::NATMX4 RAD5 Esta tesis R2.4 WSCEr59-3A MATa trp1::SCE::KANMX4 rad59∆::NATMX4 RAD5 Esta tesis R2.4 WSCEr51r59-4C,5B MATa 100 trp1::SCE::KANMX4 rad51∆::KANMX4 rad59∆:: NATMX4 RAD5 Esta tesis R2.4 WSCEshu1-5A,10B MATa trp1::SCE::KANMX4 shu1∆::NATMX4 RAD5 Esta tesis R2.4 Materiales y Métodos 104 WSCEr17-1C,2A MATa bar1Δ::LEU2 trp1::SCE::KANMX4 rad17∆::NATMX4 RAD5 Esta tesis R2.4 WSCErad18- 3A,13B MATa trp1::SCE::KANMX4 rad18∆::KANMX4 RAD5 Esta tesis R2.4 WSCEubp12-9A MATα bar1Δ::LEU2 trp1::SCE::KANMX4 ubp12∆::KANMX4 RAD5 Esta tesis R2.4 WSCEubp12-10D MATa bar1Δ::LEU2 trp1::SCE::KANMX4 ubp12∆::KANMX4 RAD5 Esta tesis R2.4 WSCEtop1-2B,3D MATa trp1::SCE::KANMX4 top1∆::NATMX4 RAD5 Esta tesis R2.4 WSCEmms2-2 MATa bar1Δ::LEU2 trp1::SCE::KANMX4 mms2∆::NATMX4 RAD5 Esta tesis R2.5 WSCEr5-9D,10C MATa trp1::SCE::KANMX4 rad5∆::TRP1 RAD5 Esta tesis R2.5 WSCEr5-9D,10C MATa trp1::SCE::KANMX4 rad5∆::NATMX4 RAD5 Esta tesis R2.5 WSCErad9-3A,8A MATa bar1Δ::LEU2 trp1::SCE::KANMX4 rad9∆::HYGMX4 RAD5 Esta tesis R2.5 WSCErtt105-5,6 MATa bar1Δ::LEU2 trp1::SCE::KANMX4 rtt105∆::NATMX4 RAD5 Esta tesis R2.5 WSCEsgs1-5C MATa bar1Δ::LEU2 trp1::SCE::KANMX4 sgs1∆::KANMX4 RAD5 Esta tesis R2.6 WSCEtop3-4C MATα trp1::SCE::KANMX4 top3∆::NATMX4 RAD5 Esta tesis R2.6 WSCEtop3-8B MATa trp1::SCE::KANMX4 top3∆::NATMX4 RAD5 Esta tesis R2.6 WSCEr27-2A MATa bar1Δ::LEU2 trp1::SCE::KANMX4 rad27∆::NATMX4 RAD5 Esta tesis R2.6 WSCEsiz1-1A,2D MATa trp1::SCE::KANMX4 siz1∆::HYGMX4 RAD5 Esta tesis R2.6 WSCEelg1-1,2 MATa bar1Δ::LEU2 trp1::SCE::KANMX4 elg1∆::NATMX4 RAD5 Esta tesis R2.7 WSCEexo1-5A MATa bar1Δ::LEU2 trp1::SCE::KANMX4 exo1∆::HYGMX4 RAD5 Esta tesis R2.8 Wcdc7asM4GFP-4 MATa bar1Δ::HisG cdc7as3MYC MCM4GFP::URA3 RAD5 (Cabello Lobato et al., 2021) A.1A, A.4 Wb1cdc7M4GFP- 1b MATa bar1Δ::HisG cdc7Δ::HIS3 mcm5/bob1 MCM4GFP::URA3 RAD5 (Cabello Lobato et al., 2021) A.1A Materiales y Métodos 105 55Sc34.08 MATa bar1Δ::LEU2 RAD5 (Gallego Sánchez et al., 2012) A.1A-B, A.5A LSY0983 MATa rad51-K191A RAD5 (Morgan et al., 2002) A.2A WM4GFPrad51K19 1A-2C,4D MATa MCM4GFP::URA3 rad51-K191A RAD5 (Cabello Lobato et al; 2021) / Esta tesis A.2B WM4GFP-2B,3A MATa MCM4GFP::URA3 RAD5 (Cabello Lobato et al; 2021) / Esta tesis A.2B WMCM4GFPpep4- 5C,7A MATa pep4Δ::ADE2 MCM4GFP::URA3 RAD5 (Cabello Lobato et al., 2021) A.3A-B, A.5A-B Wrad51- 54.7MCM4- 8B MATa pep4Δ::ADE2 MCM4GFP::URA3 rad51m RAD5 (Cabello Lobato et al., 2021) A.3A-B Wcdc7asM4G51.5 4-5A-4 MATa cdc7as3MYC MCM4GFP::URA3 rad51m RAD5 (Cabello Lobato et al., 2021) A.4 WRAD51GBP-1 MATa RAD51-GBP::KANMX4 RAD5 (Cabello Lobato et al., 2021) / Esta tesis A.5A WM4GFPR51GBP- 8D MATa pep4Δ::ADE2 MCM4GFP::URA3 RAD51-GBP::KANMX4 RAD5 (Cabello Lobato et al., 2021) / Esta tesis A.5A Wrad51.54GBP-2 MATa rad51m-GBP::KANMX4 RAD5 (Cabello Lobato et al., 2021) / Esta tesis A.5A-B WM4GFPr51.54GB P1D MATa pep4Δ::ADE2 MCM4GFP::URA3 rad51m-GBP::KANMX4 RAD5 (Cabello Lobato et al., 2021) / Esta tesis A.5A-B W303.51.54-7 MATa rad51m RAD5 (Cabello Lobato et al., 2021) A.6A-D WRfa1YFP-1B MATa bar1Δ::LEU2 RFA1-8ala-YFP RAD5 (Cano- Linares et al., 2021) A.7A-G, A.8A-D WRfa1YRad51.54- 9B MATa RFA1-8ala-YFP rad51m RAD5 (Cabello Lobato et al., 2021) / Esta tesis A.7A-G, A.8A-D Wcdc7asM4GFPr5 1- 2D MATa cdc7as3MYC MCM4GFP::URA3 rad51Δ::KANMX4 bar1Δ::HisG RAD5 (Cabello Lobato et al., 2021) A.9B-D Materiales y Métodos 106 Para los mutantes generados mediante sustitución génica o el etiquetado de proteínas se siguió el protocolo descrito por (Longtine et al., 1998; Sheff & Thorn, 2004). Los fragmentos de ADN se amplificaron por PCR utilizando oligonucleótidos con homología a la región a amplificar (epítopo y/o marcador de selección) y al gen a reemplazar o etiquetar. La estirpe original se transformó con el ADN lineal resultante y se seleccionó el fenotipo deseado. Los candidatos se comprobaron por PCR usando oligonucleótidos externos a la zona etiquetada o reemplazada (oligonucleótidos en Tabla M2). Las estirpes Spt16Dg y Srs2Dg, se construyeron según Nishimura et al (2009). En resumen, se amplifico fragmentos de ADN que contenía (AID, epítopo y un marcador de resistencia a drogas) desde el plásmido pHyg-AID-9myc (Morawska & Ulrich, 2013). Los oligonucleótidos utilizados para la amplificación contenían homología al extremo C-terminal de Spt16 y Srs2 justo antes y después del codón de STOP. El ADN lineal resultante se transformó en una estirpe que expresa OsTIR1, que en presencia de auxina lleva acabo la proteólisis de la proteína fusionada a AID. Los candidatos se comprobaron por PCR y western-blot. Algunas construcciones se trasladaron de fondo genético BY4741 a W303. Para ello, el gen reemplazado en la estirpe BY4741 se amplifico por PCR con oligonucleótidos externos. A continuación, la estirpe W303 se transformó con el ADN lineal resultante y se seleccionó el fenotipo deseado Materiales y Métodos 107 6.2. Oligonucleótidos Los oligonucleótidos utilizados en esta tesis se describen en la Tabla M2. Table M2. Lista de oligonucleótidos utilizados en esta tesis. Nombre Secuencia (5’ a 3’) Up Rad51-GBP CTATGAAGATGGTGTTGGTGACCCCAGAGAAGAAGACGAGTCCGTACGCTGCAGGTC GAC Lo Rad51-GBP GTAAACCTGTGTAAATAAATAGAGACAAGAGACCAAATACAATCGATGAATTCGAGCT CG Up T475C AGAACCCGTTGTCAAACGAATCAGCTCCGATCTTC Lo T475C GAAGATCGGAGCTGATTCGTTTGACAACGGGTTCT Up dpb3* TGGCCTTAACAACTGCCTGC Lo dpb3* ATTATCCCTAAGCTTTTTCG Up Spt16dg AATTAGAGAAAAAGGCTGCTAGGGCTGATAGGGGTGCAAACTTTAGAGATCGTACGC TGCAGGTCGAC Lo Spt16 dg TTCTGTCAGATCAAGGTCTTGCTGGTGAAACCCAGTAAGTGTTATAAAGTCATCGATG AATTCGAGCTCG Up Srs2 dg AAAGTCAAAATTAAACAACGGTGAAATCATAGTCATCGATCGTACGCTGCAGGTCGAC Lo Srs2 dg CCGCCTCCAATAGTTGACGTAGTCAGGCATGAAAGTGCTACATCGATGAATTCGAGCT CG Up Srs2 disrupt GATCTACGAGATGCGGCTAT Lo Srs2 disrupt TTATAAAGTTGCCGAATGCT Up mph1 * CTTCTTCTCCATCGACCTTC Lo mph1 * TTGTATAGACGCCGACGTAT Up elg1 disrupt ACCATAGCATTAAACTTTTTGAATCAGAGAAGGTTTTCCACAGCTGAAGCTTCGTACG Lo elg1 disrupt TACGTGTTCCTGTAACGATGCACGCAATTTCATATCAGTGCTAGTGGATCTGATATCAT C Up elg1 compr TCGTATGGTACCATAGCATT Lo elg1 compr TACGTGTTCCTGTAACGATG Up ctf18 disrupt ACACTATTTGACCCAAAAGGTGGATGTAAGGTCAGGGATCCAGCTGAAGCTTCGTACG Lo ctf18 disrupt TATGCTTCTTAAGAGAGACTGCGTATATATCTTACGTCATCTAGTGGATCTGATATCAT C Up ctf18 compr TGACCCAAAAGGTGGATGTA Lo ctf18 compr GCTGCTGGTCCATATACAAG Up ctf4 compr TCACCTGGAGAATGGGTGTT Lo ctf4 compr GCATTTTGAACGATGATTTG Up top1 disrupt TAAAAAAAATCTAAAGGGAGGGCAGAGCTCGAAACTTGAAACGCGTAAAACAGCTGA AGCTTCGTACG Lo top1 disrupt ACTTGATGCGTGAATGTATTTGCTTCTCCCCTATGCTGCGTTTCTTTGCGCTAGTGGATC TGATATCATC Up top1 compr AAAAAAATCTAAAGGGAGGG Lo top1 compr CGAACTTGATGCGTGAATGT Up top3 disrupt GCGCTCGCTTCAGCTACGTAAAGGTGTATTATAGACAATACAGCTGAAGCTTCGTACG CT Lo top3 disrupt GCGGAGAGCTTTTTTGAAGACAAAGGGCGGCAAAAACGCCCCGCATAGGCCACTAGT GGA Up top3 compr TGTCAATAAAGAGGGCATCG Lo top3 compr GGCTGGTACTGAAAATGCAC Up mus81 disrupt AAACAAAGTTTCAAAGGATTGATACGAACACACATTCCTAGCATGAAAGCCAGCTGAA GCTTCGTACG Materiales y Métodos 108 Lo mus81 disrupt ATCACTTTTTTCTTTATAAAACCTTGCAGGGATGACTATATTTCAAATTGCTAGTGGATC TGATATCATC Up mms2 disrupt CTGTATATGCAACGTAGAAGAAAGCAGCGTTTACACAAAACAGCTGAAGCTTCGTACG Lo mms2 disrupt CTTGGAATGCTGCAAATACTGTTTAGGAAAAAGTAGATAACTAGTGGATCTGATATCA TC Up rtt101 disrupt TTTTTACTGGTATAAATTCTCGTACGGGTTCACAGGAACACAGCTGAAGCTTCGTACG Lo rtt101 disrupt CTATCTCAGTAGTTAGGTAATATATAAGATGGCACCAGTCCTAGTGGATCTGATATCAT C Up rtt101comp TGGTATAAATTCTCGTACGG Lo rtt101 comp GGCTGGTACGGATTATAAAC Up rrm3 * TTTTCATTTTCCCTATAACG Lo rrm3 * CCCTCACTTTTTTTTTCGAT Up rtt109 * CGCGTTGTAAGCTATAATGG Lo rtt109 * TGGCGATCAAGGTACTAACA Up rad17 disrupt CAGAACGGTGTGGAAACAAAGTAGTTGAAGGATTTCAACTCAGCTGAAGCTTCGTAC GCT Lo rad17 disrupt TGAATGAAGTTCTGCGTTTTCTGCGATGCTGGATATTGACCCGCATAGGCCACTAGTG GA Up rad59 disrupt TAGAGGAGAAGAGCATATTTCAGGATAAACAGACAAAATACAGCTGAAGCTTCGTAC GCT Lo rad59 disrupt ATAAATTTGCTACTTGTGCCCTTTTTCTTTCTTTTTTTTTCTAGTGGATCTGATATCATC Up rad59 Compr GGCAAGGGCAGATATGATA Lo rad59 compr AGTTTGGGTACGCATGGTTA Up mms22 compr TTTGAAGTTTAGTGGTAGCG Lo mms22 compr GCAGAAGCAACTAAATCAAG Up check lagg/lead TCCCTATCAGTGATAGAGA Up sgRNA GGTTCCTGGCCTTTTGCTGG Lo sgRNA-SacI CCTTAAGAGCTCATTGCACGTCCCTTAGCCTT gRNA-lagg AAACTCTGGGAGCTGCGATTGGCAGACTCAACGATTAGCGACCA GCGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTT gRNA-lead AAACTCTGGGAGCTGCGATTGGCAGGTCGCTAATCGTTGAGTGC ATGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTT gRNA-lead 2 AAACTCTGGGAGCTGCGATTGGCAGGGACCATATGATACATGCTCGTTTTAGAGCTAG AAATAGCAAGTT ForSCE∆5 CCAAGTTCGACAACTGCGTA RevSCE∆5 CTGATAGTGACCTGTTCGTTGC ACT1-F TCGTTCCAATTTACGCTGGTT ACT1-R CGGCCAAATCGATTCTCAA Up SCE-2D CTGTGATGCCATGGTGTCCG Lo SCE-2D GGGTTGGTTTGCGCATTCAC A305ARS AAGAAAGAAAAGCATTCCAGAGACA A305ARS TGCTAACTGATGTGCCAAAGTCA Up ori1 ATAGGCTCGGCCCCCCTGAC Lo F1 ori ATGAGCTGATTTAACAAA Azul: región de homología al plásmido donde se encuentra el marcador de resistencia a drogas. Verde: región de homología adyacente aguas arriba y abajo al sitio de clonación NotI. Rojo: secuencia para la expresión del gRNA. Naranja: secuencia de enzimas de restricción para el clonaje de productos de PCR. Los oligonucleótidos “disrupt” son para la sustitución de genes con marcadores de resistencia a drogas, los “compr” para la comprobación de dichas estirpes. Los oligonucleótidos Materiales y Métodos 109 “GBP” para el etiquetado en el extremo C-terminal de dichas proteínas con GBP. Los oligonucleótidos “dg” son para la construcción de degrones. Las parejas nombradas como For/Rev se usaron para la amplificación por PCR cuantitativa. Los oligonucleótidos 305ARS y SCE son para la construcción de las sondas para el análisis de los intermediarios replicativos. Los oligonucleotidos “*” son para la sustitución de genes con marcadores de resistencia a drogas (desde BY4741 a W303) y la comprobación de dichas estirpes. 6.3. Plásmidos Para el clonaje y propagación de plásmidos se utilizó la estirpe de E. coli DH5α: supE44 ΔlacU169 (ɸ80lacZΔM15) hsdR17 recA1 endA1 gyrA96 thi-1 relA1 (Hanahan & Meselson, 1980). Los plásmidos utilizados en esta tesis se muestran en la Tabla M3. Tabla M3. Plásmidos. Nombre Descripción Referencia pRS313 pBluescript, HIS3, CEN6, ARSH4 (Sikorski & Hieter, 1989) pRS314 pBluescript, TRP1, CEN6, ARSH4 (Sikorski & Hieter, 1989) pRS315 pBluescript, LEU2, CEN6, ARSH4 (Sikorski & Hieter, 1989) pRS316 pBluescript, URA3, CEN6, ARSH4 (Sikorski & Hieter, 1989) pRS304 pBluescript, TRP1 (Sikorski & Hieter, 1989) pFA6KanMX4 pFA6-KanMX4 (Wach et al., 1994) pAG32 pFA6-hpHMX4 (Goldstein & McCusker, 1999) pAG25 pFA6-NatMX4 (Goldstein & McCusker, 1999) pWJ1213 pRS413-RAD52YFP (Alvaro et al., 2006) pWJ1344 pRS415-RAD52YFP (Alvaro et al.,2006) pFA6a-GBP- KanMX4 (pHA29) pFA6a-GBP-KanMX4 (Rothbauer et al., 2006) pHyg-AID-9myc pFA6a-AID-9myc-HphNT1 (Morawska & Ulrich, 2013) pRS313-r51.54 pRS313-rad51m (Cabello Lobato et al.,2021) pRS51s pRS313-RAD51 Laboratorio Andrés Aguilera pS313r51-C159R pRS313-rad51C159R Esta tesis pRS416gT-Mxi1 pRS416-dCas9/Mxi1-tetR-tetO (sgRNA) (Smith et al., 2 016) p416dC9laggR pRS416-dCas9/Mxi1-tetR-tetO (gRNA HIS3) Esta tesis p416dC9leadR pRS416-dCas9/Mxi1-tetR-tetO (gRNA HIS3) Esta tesis Materiales y Métodos 116 6.8. Ensayos comerciales  GFP trap magne�c bead (Chromotek, gtma 100)  QuickChange XL Site-directed Mutagenesis Kit (Agilent, 200517)  NEB Builder Hifi DNA Assembly Master Mix (NEB, E2621S) 6.9. Tampones Los tampones generales usados en esta tesis son:  TE 1X: Tris-HCl 10 mM pH 7.5 y EDTA 50 mM pH 8.0.  TAE 1X: Tris base 40 mM, EDTA1 mM pH 8.0 y ácido acético glacial 20 mM.  TBE 1X: Tris base 90 mM, ácido bórico 90 mM y EDTA 2 mM pH 8.0.  Tampón de carga 10X: EDTA 1mM pH 8.0, azul de bromofenol 0,05%, glicerol 50% y SDS 1%.  Laemmli 4X: Tris-HCl 250mM pH 6.8, glicerol 20%, SDS 8%, azul de bromofenol 0,02% y βmercaptoetanol 10%.  PBS 1X: NaCl 137mM, KCl 2,7 mM, Na2HPO4 10mM y KH2PO4 1,8mM.  TBS 1X: NaCl 137mM, KCl 2,7 mM y Tris base 25mM.  Tampones fosfato potásico 0,1 M: - pH 6.4: 27,8 mM K2HPO4, 72,2 mM KH2PO4 - pH 6.6: 38,1 mM K2HPO4, 61,9 mM KH2PO4 - pH 7.4: 80,2 mM K2HPO4, 19,8 mM KH2PO4  SSC 20X: 3 M NaCl, 345 mM citrato sódico (pH 7.0 ajustado con HCl 1 M).  SSPE 20X: 3 M NaCl, 0,2 M NaH2PO4*H2O, 25 mM EDTA pH 8 (pH 7.4 ajustado con NaOH 10 N). 6.10. Transformación de células 6.10.1 Transformación de bacterias Se mezclaron 100 μl de células competentes de E. coli DH5α preparadas según Inoue et al., 1990 con 50-100 ng de ADN y se incubaron en hielo durante 20 min. A continuación, las células se sometieron a un choque térmico de 42 °C durante 1 min seguido de 2 min en hielo, se resuspendieron en 1ml de LB y se incubaron durante 45 min a 37 °C en agitación suave. Finalmente, las células se recogieron por centrifugación y se sembraron en medio selectivo (LB + Amp). Materiales y Métodos 117 6.10.2 Transformación de levadura Las estirpes de levadura se transformaron siguiendo el método descrito en Amberg et al., 2006 a partir de 5 ml de cultivo a D.O 660 ≈ 0,5. Las células se lavaron con AcLi 100 mM, se recogieron por centrifugación y se mezclaron con PEG4000 al 50%, AcLi 100 mM, ADN desnaturalizado de esperma de salmón a 2 mg/ml y 0,1-10 μg de ADN. Tras incubarlas a 30 °C durante 30 min, las células se sometieron a un choque térmico a 42 °C durante 20 min. Posteriormente, se lavaron y sembraron en el medio selectivo pertinente, a excepción de cuando se transformaron con marcadores de resistencia a drogas, en cuyo caso se incubaron en YPAD durante 2 h antes de ser lavadas y sembradas en el medio selectivo. 6.11. Sincronización de cultivos de levaduras Las células se sincronizaron en G1 con factor α a partir de cultivos de SMM en fase exponencial (D.O 660 ≈ 0,3) a los que se añadió factor α dos veces en intervalos de 60 min a 1 μg/ml en el caso de estirpes BAR1 y 0,25 μg/ml en el caso de estirpes bar1Δ. Para liberar las células del bloqueo de G1, éstas se lavaron 3 veces y se resuspendieron en medio fresco con pronasa a 50 μg/ml en presencia o ausencia de agentes genotóxicos. 6.12. Análisis de viabilidad y sensibilidad a agentes genotóxicos La viabilidad y sensibilidad a agentes genotóxicos de las estirpes de levadura se determinó mediante ensayos de gotas con diluciones seriadas (factor de dilución de 10) a partir del mismo número de células de cultivos en fase exponencial. El número de células se determinó mediante recuento con una cámara Bürker. A continuación, se sembraron 4 μl de cada concentración en placas de SMM con y sin los correspondientes agentes genotóxicos, a las concentraciones indicadas. 6.13. Ensayos de recombinación homóloga y mutagénesis Para estudiar la frecuencia de recombinación homóloga entre cromátidas hermanas se utilizó un sistema genético de intercambio desigual entre cromátidas hermanas (uSCE) (del inglés “unequal Sister Chromatid Exchange”), el cual consiste en repeticiones directas de dos alelos truncados del gen HIS3 que comparten un fragmento interno de 300 pb de homología (Fasullo & Davis, 1987). La recombinación entre estas secuencias homólogas genera una copia silvestre del gen HIS3, la cual puede seleccionarse en medio SMM-His. Por otra parte, la mutagénesis espontánea e inducida por MMS se determinó analizando las células capaces de formar colonias en presencia Materiales y Métodos 118 de canavanina, el cual es un análogo tóxico de la arginina que entra en la célula a través de la arginina permeasa codificada por el gen CAN1. Por tanto, este ensayo mide la frecuencia de mutagénesis directa del locus CAN1 mediante la aparición de mutantes can1. Las frecuencias de recombinación y mutagénesis se determinaron mediante test de fluctuación en los cuales las células de 6 colonias independientes de tamaño similar y aisladas en medio con - +MMS o 5 µg/ml de dox se sembraron con las diluciones apropiadas en SMM sin histidina, SMM sin arginina con 60 mg/ml canavanina y SMM, para calcular recombinantes, mutantes y células totales, respectivamente. La frecuencia de recombinación y mutagénesis se calcularon utilizando la mediana de recombinantes/mutantes y el número medio de células totales. 6.14. Citometría de flujo El análisis del contenido de ADN se determinó mediante citometría de flujo (Corliss & White, 1981). Las células recogidas en las condiciones experimentales correspondientes, se fijaron con etanol 70%, se lavaron con PBS1X, se resuspendieron en 100 μl de PBS con RNasa A a 100 μg/ml y se incubaron toda la noche a 37 °C. Posteriormente, las muestras se lavaron con PBS 1X y se resuspendieron en una mezcla de PBS 1X con yoduro de propidio a 5 μg/ml y se incubaron en oscuridad a temperatura ambiente al menos durante 1 h. Las muestras se sonicaron con una amplitud del 10% durante 3 segundos y se analizaron en un FACScalibur (Becton Dickinson). 6.15. Manipulación y análisis de ADN 6.15.1. Extracción de ADN plasmídico de bacterias La extracción de ADN plasmídico de E. coli se realizó siguiendo el método descrito por (Birnboim & Doly, 1979) a partir de cultivos crecidos en LB + Amp. 6.15.2. Extracción ADN genómico de levaduras 6.15.2.1. Extracción estándar El ADN se extrajo según el protocolo de Miniprep de ADN de levadura descrito en Amberg et al., 2006, con las siguientes modificaciones. Las células se recogieron por centrifugación y se resuspendieron en 320 μl de sorbitol 0,9 M, EDTA 0,1 M pH 8, β-mercaptoetanol 0,1% y se incubaron 1 h a 37 °C con 10 μl de zimoliasa 20T a 15 mg/ml. Los esferoplastos se recogieron y se resuspendieron en 350 μl de Tris-HCl 50 mM, EDTA 20 mM pH 8 y se incubaron con 16 μl de SDS 10% 30 min a 65 °C. Luego, se precipitaron las membranas añadiendo 85 μl de acetato sódico 5 M y se incubaron las muestras en hielo durante 1 h. Posteriormente, se centrifugó y el sobrenadante Materiales y Métodos 119 se precipito con 2,5 volúmenes de etanol 96%. El precipitado se resuspendió en 300 μl de TE 1X y se incubó 30 min a 37 °C con 3 μl de RNasa A a 10 mg/ml. Posteriormente, se mezcló con 1 volumen fenol: cloroformo: isoamílico (25:24:1), se centrifugó y se pasó la fase superior a un nuevo tubo. El ADN se volvió a precipitar con etanol 96%, se lavó con etanol 70% y el ADN se resuspendió en 20 μl para PCR y 100 μl para ChEC de TE1X. 6.15.2.2. Extracción G2/CTAB Para los experimentos de análisis de intermediarios replicativos el ADN se extrajó mediante el protocolo G2/CTAB (Clemente-Ruiz & Prado, 2009). Se partió de cultivos de 100 ml parados con azida sódica al 0,1% y enfriados en hielo. Tras centrifugar y lavar con agua, las células se resuspendieron en 2,4 ml de tampón de esferoplastos con 20 U de zimoliasa/ml y se incubaron primero durante 20 min a 30 °C y posteriormente durante 25 min a 37 °C. Los esferoplastos se recogieron por centrifugación y el precipitado se resuspendio cuidadosamente en 2 ml de solución G2. Posteriormente, se añadió RNAsa A a 10 mg/ml y proteinasa K a 20 mg/ml y se incubó 1 h a 50 °C. Las muestras se centrifugaron a 8500 r.p.m. 10 min, el sobrenandante se transfirió a un tubo nuevo al que se le añadió 1 volumen de cloroformo: isoamílico (24:1) a temperatura ambiente y la mezcla se homogeneizó con cuidado. Tras centrifugar, la fase superior se pasó a un tubo nuevo y se mezcló con 5 ml de solución II y se centrifugó a a 8500 r.p.m. 10 min. El precipitado se resuspendió en 0,8ml de solución III y 0,2 ml de NaCl 2,5 M y se volvió a precipitar con un volumen de isopropanol. Tras centrifugar 10 min a 13000 r.p.m., el ADN precipitado se lavó con etanol 70% y se resuspendió en Tris-HCl 250 mM pH 8. Tampón de esferoplastos: 1 M sorbitol, 100 mM EDTA, 2 mM Tris-HCl pH 8, 0,1% v/v β-mercaptoetanol Solución G2: 800 mM guanidina HCl, 30 mM Tris-HCl pH 8,0, 30 mM EDTA pH 8,0, 5% Tween-20, 0,5% Triton X- 100 Solución II: 1% p/v CTAB (cetil-trimetil-amonio-bromuro), 50 mM Tris-HCl pH 7,6, 10 mM EDTA pH 8 Solución III: 1,4 M NaCl, 10 mM Tris-HCl pH 7,6,1 mM EDTA pH 8 6.15.3. PCR La amplificación de ADN se llevo acabo con diferentes polimerasas termoestables (descritas en Materiales y Métodos 6.7) según las indicaciones del fabricante. La temperatura de hibridación fue específica para cada pareja de oligonucleó�dos y el �empo de extensión viene determinado por la longitud del fragmento a amplificar. Se u�lizó un termociclador T100TM-BioRad. Los productos de PCR se separaron según su tamaño en geles de agarosa al 0,8% en tampón TAE 1X o TBE 1X mediante electroforesis en un campo eléctrico constante a 5 V/cm de Materiales y Métodos 120 longitud de gel. Las muestras se mezclaron con tampón de carga 1X. Para determinar el tamaño de los fragmentos de ADN se usó un marcador de tamaño (1Kb plus DNA Ladder). Los oligonucleó�dos empleados en esta tesis se describen en la Tabla M2 del apartado “Materiales”. Los fragmentos de ADN u�lizados para integración genómica/sonda/secuenciación se purificaron u�lizando el Kit de purificación de ADN (Bioline; BIO-52059), a par�r de una banda de agarosa obtenida tras separar el fragmento mediante electroforesis. 6.15.4. Análisis de cortes de doble cadena mediante qPCR La eficiencia de corte del ADN por las nucleasas Cas9 se determinó por PCR cuantitativa (qPCR). Se partió de cultivos asincrónicos (10 ml por punto) y se extrajo el ADN según 6.15.2.1. Los análisis cuantitativos se realizaron mediante PCR a tiempo real con iTaqTM Universal SYBR Green Supermix en ViiATM7 Real-Time PCR System (Applied Biosystems), utilizando el programa ViiATM7 System software. Las reacciones se prepararon con 4 μl del ADN diluido 1/50 con 5 μl de SYBR Green y 0,5 μl de los correspondientes oligonucleótidos (Ver Tabla M2) en un volumen de 10μl. Las condiciones de amplificación se realizaron siguiendo el siguiente programa: 40 ciclos (15 s 95 °C,1 min 60 °C) con una etapa final de disociación (15 s 95 °C,1 min 60 °C, 15 s 95 °C). Se calculó una curva de calibración para cada pareja de oligonucleótidos con cinco diluciones seriadas (factor de dilución 10) de la muestra más concentrada sin guía para la cuantificación absoluta. La eficiencia de corte por la nucleasa Cas9 se determino calculando la ratio entre el ADN amplificado por oligonucleótidos flanqueando el corte y el ADN amplificado de una secuencia control sin cortar en el gen ACT1 (ver Tabla M2 para oligonucleótidos). Los valores se normalizaron respecto al control sin cortar, y se representaron en relación con el enriquecimiento en tiempo 0, tomado como 100. 6.16. Análisis de reclutamiento de proteínas al ADN mediante Corte Endógeno de cromatina (ChEC) El ensayo de CheC se realizó según Schmid et al., 2004 con las modificaciones descritas en Gonzalez-Prieto et al., 2013. Se partió de cultivos de 50 ml a D.O 660 ≈ 0,4, los cuales se pararon con azida sódica al 0,1%. Tras centrifugar, se lavaron 1 vez con agua y 3 veces con tampón A-PBPi y se resuspendieron en 600 μl de tampón Ag-PBPi-Digitonina 0,1%. Tras preincubar 5 minutos a 30 °C, se añadió CaCl2 a una concentración final de 2 mM para activar la MNasa. Las reacciones se pararon a diferentes tiempos con 600 μl de tampón STOP 2X. Posteriormente se extrajo el ADN genómico mediante el protocolo estándar (ver apartado 6.15.2.1) y se analizó mediante electroforesis en geles de agarosa al 0,8% en TAE 1X y bromuro de etidio a 0,4 mg/ml durante 80 Materiales y Métodos 121 min a 90 V. Los geles se escanearon en una maquina FujiFilm FLA 5100 y los perfiles de digestión del ADN se cuantificaron mediante el software Image Gauge de Fuji. tampón A-PBPi: Tris-HCl 15 mM pH 7.4, KCl 80 mM, EDTA 2 mM, espermina 0,2 mM, espermidina 0,5 mM, PMSF 1 mM, benzamidina 1 mM, quimiostastina 10 μg/ml, pepstatina A 10 μg/ml, hemisulfato de leupeptina 10 μg/ml tampón Ag- PBPi-Digitonina 0,1%: Tris-HCl 15 mM pH 7.4, KCl 80 mM, EGTA 0,01mM, espermina 0,2 mM, espermidina 0,5 mM, PMSF 1 mM, benzamidina 1 mM, quimiostastina 10 μg/ml, pepstatina A 10 μg/ml, hemisulfato de leupeptina 10 μg/ml, digitonina 0,1% tampón STOP 2X: NaCl 400 mM, EDTA 20 mM, EGTA 4 mM, glicógeno 0,2 mg/ml 6.17. Análisis de intermediarios replicativos en geles bidimensionales Los intermediarios replicativos se analizaron en muestras de ADN extraídas con el protocolo G2/CTAB (6.15.2.2). El ADN fue digerido durante 6 h en un volumen de 500 µl con las enzimas de restricción EcoRV- HindIII (para Figura R1.11B, R1.12A, R1.13C) y AscI-EcorI (para Figura R.1.14E) Transcurrido este tiempo, el ADN se precipitó con 600 µl de isopropanol, se lavó con etanol al 70% y se resuspendió en 20 µl de TE 1X con tampón de carga. Los intermediarios replicativos se resolvieron mediante electroforesis en geles bidimensionales neutro/neutro (Brewer & Fangman, 1987). La primera dimensión se llevó a cabo en geles de agarosa al 0,4% en TBE 1X, a temperatura ambiente y 40 V durante 22 h. Posteriormente, el gel se tiñó con 0,34 µg/ml de bromuro de etidio en Tris-HCl 0,01 M pH 7.5 durante 30 min y se recortó la banda (aproximadamente de 7 cm) que comprendía los fragmentos de ADN entre 3-13 Kb. Estos fragmentos de ADN se resolvieron en la segunda dimensión en geles de agarosa al 1,1% en TBE 1X con 0,34 µg/ml de bromuro de etidio a 4 °C durante 14 h a 140 V y con recircularización del tampón. Finalmente, los geles se transfirieron a membranas Hybond XL mediante southern-blot y los intermediarios replicativos (IRs) se detectaron mediante hibridación con sondas específicas generadas mediante PCR con los oligonucleótidos ForA305ARSy RevA305ARS (sonda A) y UpSCE2D y LoSCE2D (sonda sistema uSCE) (oligonucleótidos en Tabla M2). 6.18. Análisis de fragmentos de ADN por Southern blot Tras separar mediante electroforesis el ADN digerido con enzimas de restricción, los geles de agarosa se incubaron en una solución de HCl 0,25 M durante 10 min, se lavaron con agua y se trataron con solución de desnaturalización durante 30 min. El ADN se transfirió por capilaridad en solución de desnaturalización a una membrana de nylon Hybond XL. Posteriormente, el ADN Materiales y Métodos 122 se fijó covalentemente a la membrana irradiándola por ambos lados con luz ultravioleta (70000 μJ/cm2), y la membrana se lavó con SCC 2X. Solución de desnaturalización: NaCl 1,5 M, NaOH 0,5 M Las membranas se hibridaron con sondas de ADN radiactivas. Para el marcaje de las sondas con α-P32-dCTP, se mezclaron 100 ng de ADN desnaturalizado con 1mM de hexanucleótidos de secuencias generadas al azar, una mezcla de dATP, dGTP, dTTP 0,5 mM, 25 μCi de P32-dCTP y 2,5U de ADN polimerasa Klenow. La mezcla se incubó 1 h a 37 °C y los nucleótidos no incorporados en la reacción se eliminaron usando columnas de Sephadex-G50. Las membranas se prehibridaron 30 min a 65 °C en solución de hibridación con agitación constante. La hibridación se realizó incubando la membrana en la solución anterior con la sonda radiactiva previamente desnaturalizada durante 12-16 h a 65 °C. Tras la hibridación, la membrana se lavó dos veces con solución de lavado a temperatura ambiente durante 5 min, y una vez durante 1 h a 65 °C. En caso necesario, las membranas se deshibridaron lavándolas 3 veces con solución de deshibridación a 90-100 °C. Solución de hibridación: Na2HPO4 0,25 M, SDS 7%, EDTA 1 mM, pH 7.2 Solución de lavado: SSPE 0,1X, EDTA 5 mM, SDS 0,5% Solución de deshibridación: SDS 0,1% y SSPE 0,1% La señal radiactiva se detectó exponiendo las membranas a pantallas PhosphorImager (Fuji) que se escanearon en un analizador de radiación FujiFilm FLA 5100. La cuantificación de la señal se realizó con el software Image Gauge de Fuji. 6.19. Extracción estándar de proteínas La extracción de proteínas se realizó según Foiani et al (1994) con las siguientes modificaciones. Se partió de 10 ml de cultivo en fase exponencial. Tras centrifugar y lavar con 1 ml de ácido tricloroacético (TCA) frío al 20%, las células se resuspendieron en 200 μl de TCA 20% y se congelaron a -20 °C hasta su posterior procesamiento. Para ello, las muestras se mezclaron con aproximadamente con 100 μl de perlas de vidrio y se agitaron durante 10 min a 4 °C con un multivortex (IKA-VIBRAX-VXR). El sobrenadante se pasó a un nuevo tubo y las perlas se volvieron a lavar con 600 μl de TCA 5% frio, mezclándose el sobrenadante de este lavado con el anterior. Esta muestra se centrifugó 5 min a 13000 r.p.m. y el precipitado se resuspendió en 100 μl de tampón Laemmli 2X, añadiéndose 50 μl de Tris-HCl 1 M pH 8.8 para neutralizar el pH. Finalmente, las Materiales y Métodos 123 muestras se hirvieron durante 5 min, se centrifugaron y el sobrenandante se pasó a un tubo nuevo el cual guardo a -20 °C hasta su posterior análisis. 6.20. Co-inmunoprecipitación Para estudiar la interacción entre proteínas por coinmunoprecipitación se partió de cultivos de 100 ml de células a D.O 660 ≈ 0,45. Tras centrifugar a 4100 r.p.m. a 4 °C y lavar con agua fría, las células se resuspendieron en 500 μl de tampón de lisis frio con inhibidores de proteasas (1mM PMSF, 2mM de DTT e inhibidores de proteasas 1X (COMPLETE EDTA free, Roche) y un volumen de bolas de vidrio. Las células se lisaron a 4 °C en un Multi Beads Shocker (Yasui Kikai) durante 40 minutos con pulsos de 60 s a 2500 r.p.m. y 60 s de parada. Se recogió el sobrenadante y se pasó a un tubo nuevo y las bolas se lavaron con 200 μl de tampón de lisis frio con inhibidores de proteasas (1mM PMSF e inhibidores de proteasas 1X), mezclándose el sobrenadante de este lavado con el anterior. Esta solución se centrifugó 5 min a 1000g a 4 °C, pasándose el sobrenadante a un tubo siliconizado Ultra Clear (Axygen, MCT-175-L-C), al cual se le añadió tampón MN 10X y 2,5 U de MNasa Micrococal o tampón BZ 10X y 2,5 U de benzonasa hasta una concentración final 1X. La muestra se incubó a 37 °C durante 20 minutos, tras los cuales se centrifugó a 13000 r.p.m. durante 15 min a 4 °C. El sobrenadante se pasó a un nuevo tubo siliconizado y la concentración de proteínas se determinó mediante Bradford. Para el input, aproximadamente 100-200 μg de proteínas se tamponaron con Laemmli 1X e hirvieron durante 5 min. Para el inmunoprecipitado se incubaron la misma cantidad de proteínas de cada muestra (entre 12000-16000 μg) con 100 μl de bolas magnéticas GFP-trap al 20% en solución de lisis O/N a 4 °C. Las bolas magnéticas GFP-trap se lavaron 5 veces con 1 ml de tampón de lisis, se secaron, se mezclaron con 40 μl de tampón de carga Laemmli 1X y se hirvieron durante 5 min. Para la detección de las proteínas mediante western-blot, se cargaron 20 μl de inmunoprecipitado y 25 μg de proteína total. Tampón de lisis: Tris-HCl 50 mM pH 7.5, NaCl 150 mM, NP40 1% Tampón MN 10X: Tris-HCl 150 mM pH 8.0, NaCl 500 mM, CaCl2 14 mM, EDTA 2 mM pH 8.0, EGTA 2 mM pH 8.0 Tampón BZ 10X: Tris-HCl 500 mM pH 8.0, MgCl2 10 Mm 6.21. Fraccionamiento celular El fraccionamiento celular se realizó según Feser et al., 2010 con algunas modificaciones. Se partió de 30 ml de cultivos a D.O 660 ≈ 0.5. Tras centrifugar y lavar con solución I fría, las células se resuspendieron en 1ml de la solución anterior y se incubó 15 min en hielo. A continuación, las células se centrifugaron a 4000 r.p.m., se lavaron con 1 ml de tampón de esferoplasto, y se Materiales y Métodos 124 volvieron a centrifugar y el precipitado se resuspendió en 1 ml del mismo tampón con 210 μg de zimoliasa 20T e incubó 1 h a 30 °C. Los esferoplastos se recogieron por centrifugación 1 min a 1000 r.p.m. y se lavaron suavemente dos veces con tampón de lavado frio. Tras los lavados, los esferoplastos se resuspendieron en 1 ml de tampón de lisis e incubaron en hielo 5-10 min. Una vez lisadas las células, se apartaron 80 μl (fracción total) y el resto de la muestra se centrifugó a 13000 r.p.m. a 4 °C durante 15 min. Se retiraron 160 μl de sobrenadante (fracción soluble) y el precipitado se lavó con 500 μl de tampón de lisis, se recogió por centrifugación y resuspendió en 160 μl de agua (fracción enriquecida en cromatina). Las fracciones totales, solubles y enriquecida en cromatina se mezclaron con tampón Laemmli 1X en el momento e hirvieron durante 5 min y se guardaron a -20 °C hasta su posterior análisis. Los equivalentes celulares de las fracciones enriquecida en cromatina, soluble y total se cargaron en geles de SDS-PAGE y se analizaron por western blot. Solución I fría: Tris-HCl 0,1 mM pH 9.4, DTT 10 mM Tampón de esferoplastos: HEPES 20 mM pH 7.4, sorbitol 1,2 M e inhibidores de proteasas 1X de Roche “mini complete EDTA free”. Tampón de lavado: Tris-HCl 20 mM pH 7.4, KCl 20 mM, sorbitol 1 M, espermina 0,1 μM, espermidina 0,25 μM e inhibidores de proteasas 1X. Tampón de lisis: Tris-HCl 20 mM pH 7.4, KCl 20 mM, sorbitol 0,4 M, espermina 0,1 μM, espermidina 0,25 μM, Triton X-100 1% e inhibidores de proteasas 1X. 6.22. Detección y cuantificación de proteínas mediante western blot Las proteínas se separaron mediante electroforesis en geles de SDS-poliacrilamida (acrilamidabisacrilamida 29:1) según Laemmli, 1970. La zona de compactación del gel (stacking) se preparó al 5% y la zona de separación (separating) se preparó según el tamaño de las proteínas a analizar: 8% (Mcm4-GFP, Rad51 y Rad53) o 15% (H4, Pgk1). La electroforesis se llevó acabo a voltaje constante de 120 V durante 1-2 h en tampón Tris-glicina en una cubeta Mini-PROTEAN (Bio-Rad). Como marcador de peso molecular de las proteínas se utilizó gTPbio. Stacking (5%): Tris-HCl 125 mM pH 6.8, SDS 0,1%, APS 0,1%, TEMED 0,1% Separating (8%): Tris-HCl 375 mM, SDS 0,1%, APS 0,1%, TEMED 0,04% Tampón Tris-glicina: Tris base 25 mM, glicina 192 mM pH 8.3 y SDS 0,025% A continuación, las proteínas se transfirieron a membranas de nitrocelulosa (AmershamTM ProtranTM Premium 0,45 μm NC, GE Healthcare) mediante transferencia húmeda con el sistema Mini Trans-Blot (BioRad) durante 1 h (1 h 30 min para Rad53) a 80 V en tampón de transferencia. Para comprobar la eficiencia de la transferencia se tiñeron las membranas con Materiales y Métodos 125 solución Ponceau S durante 5 min. Para la inmunodetección de las proteínas, las membranas se trataron con solución de bloqueo durante 1-2 h a temperatura ambiente en agitación suave. Tras bloquear, las membranas se incubaron con el anticuerpo primario correspondiente (ver Tabla M4) diluido en solución de bloqueo a 4 °C durante toda la noche en cámara húmeda. Tras la incubación, las membranas se lavaron con TBS 1X-Tween 0,1% a temperatura ambiente 3 veces durante 15 min. Posteriormente, las membranas se incubaron 2 h con el anticuerpo secundario correspondiente (ver Tabla M4) diluido en solución de bloqueo y se lavaron 3 veces con TBS 1X- Tween 0,1%. Las bandas inmunoreactivas se detectaron mediante quimioluminiscencia WesternBrightTM ECL o ClarityTM Western ECL Substrate en ChemiDocTM MP Imaging System (Bio- Rad). Para la cuantificación de las bandas se utilizó el programa Image Lab 5.1. Tampón de transferencia: Tris base 25 mM, glicina 192 mM pH 8.3 y metanol 20% Pounceau S: 0,1% p/v en ácido acético 5% Solución de bloqueo: leche en polvo al 5% en TBS 1X-Tween 0,1% 6.22. Análisis de los focos de Rad52-YFP, Rad54-YFP y Rfa1-YFP Para determinar los porcentajes de células con focos de reparación, células expresando las quimeras Rfa1-YFP, Rad54-YFP o Rad52-YFP se crecieron en cultivos líquidos bajo las condiciones indicadas y se fijaron según Monje-Casas et al., 2007. En resumen, se centrifugo 1 ml de cultivo a 6000 r.p.m. 1 min y el precipitado se resuspendió en 1 ml de formaldehido al 2,5% en tampón fosfato 0,1 M pH 6.4 durante 10-15 min, se lavó 2 veces con tampón fosfato pH 6.6 y se resuspendió en tampón fosfato pH 7.4. Las muestras se guardaron a 4 °C hasta el momento de su análisis al microscopio (máximo 2 semanas). Luego, las células se permeabilizaron con etanol 80% durante 10 min, se centrifugaron y resuspendieron en H2O para Rfa1-YFP o DAPI 1 μg/ml para Rad52-YFP y Rad54-YFP. Las muestras se analizaron usando un microscopio de fluorescencia Leica DM6000 equipado con objetivos de inmersión 100x/1.40, filtros A4 (DAPI), L5 (YFP) y una cámara digital DF350 CDD (Leica). Los focos se contaron directamente en las muestras procesado bajo el microscopio, adicionalmente se tomaron imágenes usando el programa las AF (Leica). Las imágenes tomadas fueron procesadas y analizadas en el software MetaMorph. Apéndice 132 B). Estos resultados demuestran que la interacción MCM/Rad51 no es necesaria para el reclutamiento de estas proteínas a la fracción insoluble y sugieren que Cdc7 mantiene la interacción MCM/Rad51 evitando que Rad51 se disocie de esta fracción. Figura A3. El mantenimiento de Rad51 en la fracción insoluble es independiente de su interacción con MCM. (A, B) Acumulación de Mcm4-GFP y Rad51 en la fracción insoluble mediante ensayos de fraccionamiento celular y western blot de células wt o rad51m sincronizadas en G1 y liberadas en medio fresco en ausencia de daño (A), o presencia de MMS a 0,025% (B). Como controles del fraccionamiento celular se analizaron las proteínas Pgk1 y H4 en las fracciones solubles e insolubles. La histona H4 se utilizó para normalizar la cantidad de cada proteína. Se muestra la media de 2 (A) y 6 (B) experimentos diferentes con su rango y SEM, respectivamente. Los valores se normalizaron a G1, tomado como 100. La progresión a lo largo del ciclo se siguió mediante citometría de flujo. Apéndice 133 Para confirmar esto, analizamos la acumulación de Rad51 en la fracción insoluble en ausencia de Cdc7 en el mutante rad51m. Cdc7 es esencial para la iniciación de la replicación (Donaldson et al., 1998). Por tanto, para eliminar la actividad quinasa de Cdc7 de forma selectiva usamos un alelo de CDC7 (cdc7-as3) que es sensible al inhibidor 1NMPP1, un análogo no hidrolizable del ATP (Wan et al., 2006). Las células se sincronizaron en G1 y se liberaron hasta G2/M en presencia de MMS a 0,025%, añadiéndose el inhibidor o el vehículo (DMSO) 35 min tras la salida de G1. Como se había descrito, la unión de Rad51 a la fracción insoluble se pierde en ausencia de la actividad Cdc7 (Cabello Lobato et al., 2021) (Figura A4). La proteína mutante Rad51m se comportó como la silvestre (Figura A4), lo que sugiere que Cdc7 regula el mantenimiento de Rad51 a la fracción insoluble independientemente de su interacción con MCM. Figura A4. El mantenimiento de Rad51 en la fracción insoluble es dependiente de Cdc7. (A) Localización de Mcm4-GFP y Rad51 a la fracción insoluble mediante ensayos de fraccionamiento celular y western-blot de células cdc7as y cdc7asrad51m sincronizadas en G1 y liberadas en medio fresco con MMS al 0,025%. Las células se trataron con 15 µM 1NMPP1 o DMSO 30 min después de la liberación de G1. Como controles del fraccionamiento celular se analizaron las proteínas Pgk1 y H4 en las fracciones solubles e insolubles. La histona H4 se utilizó para normalizar la cantidad de cada proteína. Se muestra la media y SEM de 7 experimentos independientes. Los valores se normalizan a la ausencia de inhibidor, tomada como 100. Los asteriscos representan una diferencia significativa respecto a la ausencia de inhibidor; ***p < 0,001; prueba one sample ttest. La progresión a lo largo del ciclo se siguió mediante citometría de flujo. Apéndice 134 7.5. La interacción entre MCM y Rad51 facilita la replicación del ADN en presencia de MMS Estudios previos en el laboratorio demostraron mediante citometría de flujo y CHEF un defecto replicativo del mutante rad51m en fase S en presencia del agente genotóxico MMS (datos Dra. Maria Isabel Cano Linares). Estos resultados sugieren que la interacción entre MCM y Rad51 es necesaria para una correcta replicación del ADN en presencia de aductos. Sin embargo, cabría la posibilidad de que estos defectos se debieran a la pérdida de una función adicional de Rad51 en el mutante rad51m. Para demostrar que los defectos de replicación del mutante rad51m están asociados a su incapacidad de interactuar con MCM, forzamos la interacción MCM/Rad51 en el mutante rad51m coexpresando Mcm4 y Rad51m etiquetados con GFP y GBP (proteína de unión a GFP), respectivamente. Al igual que ocurre con la quimera Rad51-GFP (Waterman et al., 2019), la quimera Rad51-GBP mostró una fuerte sensibilidad a MMS (Figura A5A), lo que sugiere una pérdida de funcionalidad en la reparación recombinacional. En primer lugar, analizamos la progresión de las células en presencia de MMS a lo largo de la fase S mediante citometría de flujo. Para ello, sincronizamos las células en G1 y las liberamos en presencia de MMS al 0,025% tomando muestras cada 20 min. La químera Mcm4-GFP es totalmente funcional y se comporta como la estirpe silvestre. La expresión de Mcm4-GFP restauró parcialmente los defectos de replicación del ADN durante la fase S en presencia de daño del mutante Rad51mGBP (Figura A5B, izquierda). Del mismo modo, analizamos la recuperación de la replicación tras la exposición a un daño agudo con MMS. Por ello, sincronizamos las células en G1 y las liberamos en presencia de MMS al 0,025% durante 1 h, inactivamos el MMS y liberamos en medio fresco. Se observó que las células que coexpresan Rad51m-GBP y Mcm4-GFP alcanzaron G2/M tras la exposición a MMS antes que las células que expresaban solamente Rad51m-GBP (Figura A5B, derecha). Estos resultados demuestran que la interacción entre MCM y Rad51 facilita la replicación de ADN en presencia de lesiones bloqueantes. Apéndice 135 Figura A5. La interacción entre MCM y Rad51 facilita la replicación del ADN en presencia de MMS. (A) Sensibilidad a MMS de las estirpes indicadas. (B) Análisis de progresión del ciclo celular mediante citometría de flujo de células MCM4GFP, rad51m-GBP y MCM4-GFPrad51m-GBP sincronizadas en G1, liberadas en presencia de MMS al 0,025% y mantenidas en presencia del daño (izquierda) o rescatadas con medio fresco tras 1 h con MMS (derecha). Los experimentos se repitieron dos veces con resultados similares. 7.6. El mutante rad51m es parcialmente defectivo en la reparación de fragmentos de ssDNA inducidos por MMS Para determinar si la interacción MCM/Rad51 es relevante para la reparación del daño en el ADN inducido por MMS, analizamos mediante microscopia de fluorescencia la reparación de los fragmentos de ssDNA inducidos por MMS. La reparación de estas lesiones ocurre en centros de reparación que se pueden seguir marcando las proteínas de recombinación con proteínas fluorescentes. En primer lugar, seguimos la resolución de los focos de Rad52. Para ello, sincronizamos las células en G1 y las liberamos en fase S en presencia de MMS a 0,033% durante 1 h, inactivamos el MMS y liberamos en medio fresco para permitir la reparación del daño en el ADN. Aproximadamente el 50% de las células silvestres y rad51m acumularon focos de Rad52 1- 2 h después de inactivar el MMS (Figura A6A, B). La eficiencia de reparación de los fragmentos de ssDNA fue inferida tanto de la resolución de los focos como de la señal total de fluorescencia de los focos por célula. El porcentaje de células con focos se redujo al 5% en células silvestres 5h después de liberar en medio fresco (85% de resolución), mientras que rad51m solo cayó al 25% (45% de resolución) (Figura A6C). Un defecto similar se observó cuando calculamos la señal total de fluorescencia de los focos por célula (Figura A6D). En conjunto, estos datos sugieren un defecto parcial en la reparación de las lesiones de ssDNA en el mutante rad51m. Apéndice 136 Figura A6. El mutante rad51m es parcialmente defectivo en la reparación de fragmentos de ssDNA en los centros de Rad52 inducidos por MMS. (A) Porcentaje de células con focos de Rad52-YFP a lo largo de la cinética de reparación y análisis de la progresión del ciclo celular mediante citometría de flujo en wt y rad51m. Las células se sincronizaron en G1 y se liberaron en fase S en presencia de MMS a 0,033% durante 1 h, se trataron con tiosulfato de sodio al 2,5% para inactivar el MMS, se lavaron y liberaron en medio fresco tomando muestras a diferentes tiempos. Las células liberadas en ausencia de MMS durante 1 h se incluyeron como control (60-). Las células con focos se contaron directamente en las muestras procesadas. (B, C y D) El porcentaje de células con focos (B), el porcentaje de resolución de focos (C) y la señal de fluorescencia total por célula (D) a 1-2 (pico) y 7 h después del tratamiento con MMS se determinaron con el software MetaMorph. La resolución de los focos se calculó mediante el siguiente algoritmo: (100 - porcentaje de células con focos a las 7 h x 100) / porcentaje máximo de células con focos durante la cinética). Se muestra la media y la SEM de tres experimentos independientes. Los asteriscos indican diferencias estadísticamente significativas según un test de Student no pareado (n=3): *, **, ***representan un p-valor de < 0,05, < 0,01 y p < 0,001 respectivamente. Para corroborar este defecto de reparación de fragmentos de ssDNA, seguimos la cinética de formación y resolución de focos del complejo RPA. Aproximadamente un 90% de las células silvestres y rad51m acumularon focos de RPA 1- 2 h después de inactivar el MMS (Figura A7A, B). La eficiencia de reparación de los fragmentos de ssDNA inferida tanto de la resolución de los focos de RPA como de la señal total de fluorescencia en los focos por célula se vio severamente comprometida en el mutante rad51m (Figura A7C, D). De hecho, la eficiencia de reparación se vio afectada incluso a dosis bajas de MMS (0,01%) (Figura A7E, F, G). Apéndice 137 Figura A7. El mutante rad51m es parcialmente defectivo en la reparación de fragmentos de ssDNA en los centros de Rfa1 inducidos por MMS. (A, E) Porcentaje de células con focos de Rfa1-YFP a lo largo de la cinética de reparación en wt y rad51m. El porcentaje de células con focos (B, F), la resolución de los focos (C, G) y la señal de fluorescencia total por célula (D) a 1 (pico) y 7 h después del tratamiento con MMS se determinaron con el software MetaMorph para las células liberadas en presencia de MMS a 0,033% o se contaron directamente en las muestras procesadas para las células liberadas en presencia de MMS a 0,01%. Ver leyenda de la Figura A.6 para más detalles. Para determinar si el defecto en reparación en el mutante rad51m era específico de MMS, seguimos la formación y resolución de los focos de RPA en células irradiadas en G1 con 35 GY y liberadas en fase S tomando muestras a diferentes tiempos. Como se muestra en la Figura A8A, aunque la cinética de reparación fue algo más lenta en el mutante rad51m que en el wt, la eficiencia de reparación fue similar en ambas cepas tanto en el porcentaje de células con focos como en la señal de fluorescencia total al final de la cinética (Figura A8C, D). Por tanto, el mutante rad51m es defectuoso en la reparación de fragmentos de ssDNA inducidos por MMS, pero no en la reparación de los DSBs inducidos por IR Apéndice 138 Figura A8. El mutante rad51m es proficiente en la reparación de DSBs inducidos por IR. (A) Porcentaje de células con focos de Rfa1-YFP a lo largo de la cinética de reparación y análisis de la progresión del ciclo celular mediante citometría en wt y rad51m. Las células se sincronizaron en G1, se irradiaron con 35 GY y se liberaron en fase S tomando muestras a diferentes tiempos. Porcentaje de células con focos (B), resolución de focos (C) y señal de fluorescencia total por célula (D) a 2 (pico) y 9 h después de la irradiación. Ver leyenda de la Figura A.6 para más detalles. Datos adicionales han demostrado que el mutante rad51m no está afectado ni en su interacción con Rad52 (Datos Cristina González Garrido), ni en la unión de Rad51 al ADN de cadena sencilla, ni en la formación de SCJs, ni en la recombinación genética entre cromátidas hermanas desiguales (uSCE) (Datos Dras M.J Cabello Lobato y M.I Cano Linares). Estos sugieren que los defectos en la reparación de los fragmentos de ADN de cadena sencilla ocurren mediante un proceso no recombinogénico. 7.7 La cisteína 159 de Rad51 es necesaria para la interacción con MCM y la reparación de los fragmentos de ssDNA inducidos por MMS No podemos utilizar el sistema Mcm4-GFP/Rad51m-GBP para demostrar que el defecto de rad51m en la reparación de los fragmentos de ssDNA inducidos por MMS está asociado con la interrupción de la interacción MCM/Rad51 porque la quimera Rad51m-GBP es defectuosa en reparación (Figura A5A). Por tanto, decidimos determinar cuál es la mutación de Rad51m responsable de interrumpir la interacción MCM/Rad51. El alelo rad51m contiene cinco sustituciones de aminoácidos (M93L, E101G, S102R, A113S, C159R) (Figura R1.11A). Se clonaron las mutaciones individuales en plásmidos centroméricos y se analizó mediante coIP su efecto sobre la interacción con MCM. Este análisis reveló que el alelo rad51-C159R perdía la interacción con MCM de forma similar a rad51m (Figura A9B). De acuerdo con los resultados anteriores, el mutante rad51-C159R fue sensible a MMS, aunque algo menos que el mutante rad51m (Figura A9C). Además, los mutantes rad51m y rad51-C159R mostraron defectos similares en la cinética de reparación de fragmentos de ssDNA inducidos por MMS mediante el análisis de focos de Rad52 Apéndice 139 (Figura A9D). Por lo tanto, la alteración de la interacción MCM/Rad51 está genéticamente ligada a una mutación puntual que causa defectos no recombinógenicos en la reparación del ADN dañado por MMS. Figura A9. La cisteína 159 de Rad51 es necesaria para la interacción con MCM y la reparación de fragmentos de ssDNA inducidos por MMS. (A) Mutaciones del alelo rad51m. ND, dominio N-terminal; AD, dominio ATPase; HhH hélix-hairpin-helix; WA y WB, dominios Walker A y B. (B) Coinmunoprecipitación de Mcm4-GFP con Rad51 en extractos celulares de cultivos asincrónicos de células que expresan Rad51, Rad51m y Rad51-C159R tratados con MMS 0,025% durante 2 h. Los extractos se trataron con benzonasa para descartar que las interacciones pudieran estar mediadas por ADN. (C) Análisis de sensibilidad a MMS del wt y los mutantes rad51C-159R, rad51m y rad51Δ. (D) Eficiencia de reparación de fragmentos de ssDNA inducidos por MMS en células wt, rad51- C159R y rad51m determinada mediante el análisis de focos de Rad52-YFP. Las células se sincronizaron en G1 y se liberaron en fase S en presencia de MMS a 0,033% durante 1 h, se trataron con tiosulfato de sodio al 2,5% para inactivar el MMS, se lavaron y se liberaron en medio fresco. Las células liberadas en ausencia de MMS durante 1 hora se incluyeron como control (60-). Las células con focos se contaron directamente en las muestras procesadas. (B-D) Los análisis se realizaron en una cepa rad51Δ transformada con los plásmidos pRS313-r51.54 (rad51m), p313r51-C159R (rad51-C159R), pRS51s (RAD51) o pRS313 (rad51Δ). Los experimentos se repitieron 2 veces con 2 transformantes independientes con resultados similares. Se muestra la media y rango. Apéndice 140 8. BIBLIOGRAFÍA