Aislamiento de microorganismos degradadores de clorpirifós, fenantreno y pireno, para su uso en biorrecuperación de aguas y suelos contaminados.
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INSTITUTO DE RECURSOS NATURALES FACULTAD DE FARMACIA Y AGROBIOLÓGICAS DE SEVILLA. UNIVERSIDAD DE SEVILLA C.S.I.C. ÁNGELA DEL VALLE, LÓPEZ GARCÍA SEVILLA, JULIO 2018 Grado en Farmacia, Departamento Microbiología y Parasitología. Trabajo Fin de Grado Experimental.
UNIVERSIDAD DE SEVILLA FACULTAD DE FARMACIA Trabajo Fin de Grado, Grado en Farmacia AISLAMIENTO DE MICROORGANISMOS DEGRADADORES DE CLORPIRIFÓS, FENANTRENO Y PIRENO, PARA SU USO EN BIORRECUPERACIÓN DE AGUAS Y SUELOS CONTAMINADOS. Instituto de Recursos Naturales y Agrobiología de Sevilla Departamento Agroquímica, Microbiología Ambiental y Conservación de suelos. LOS TUTORES Dr. D. Jaime Villaverde Capellán Graduada. Dª. Alba Lara Moreno Científico Titular CSIC Predoctoral FPU (IRNAS-CSIC) (IRNAS -CSIC) TUTOR DE CENTRO TUTOR COLABORADOR PROFESOR TUTOR Dr. D. Francisco Merchán Ignacio Departamento de Microbiología y Parasitología Facultad de Farmacia Departamento de Microbiología y Parasitología Ángela del Valle, López García Trabajo Fin de Grado Experimental SEVILLA, JULIO 2018
1 ÍNDICE………………………………………………………………………………………………………………….................. ÍNDICE DE TABLAS………………………………………………………………………………………………………………… ÍNDICE DE FIGURAS……………………………………………………………………………………………………………… RESUMEN…………………………………………………………………………………………………………………………….. LISTA DE ABREVIATURAS……………………………………………………………………………………………………… 1. INTRODUCCIÓN…………………………………………………………………………………………………………… 1.1. Problemática medioambiental derivada de la peseia de otaiates ogáios…. .. Plaguiidas……………………………………………………………………………………………………………………. ... Ogaofosfoados. Clopiifós…………………………………………………………………………………. .. Hidoauos aoátios poliílios PAHs………………………………………………………………… 1.4. Biodegradación, mineralización, biodisponibilidad, bioaccesibilidad, y envejecimiento.. 1.4.1. Papel de los consorcios microbianos en la biodegradación.......................................... 1.5. Bioestiulaió ioaueto……………………………………………………………………………………… 2. OBJETIVOS…………………………………………………………………………………………………………………… . METODOLOGÍA……………………………………………………………………………………………………………. .. Mateiales……………………………………………………………………………………………………………………… ... Cepas ateiaas aisladas………………………………………………………………………………………. ... Cosoios ioiaos……..……………………………………………………………………………………. ... Plaguiidas………………………………………………………………………………………………………………. ... Hidoauos aoátios poliílios……………………………………………………………………… 3.1.5. Solución de nutrientes (SNs)……………………………………………………………………………......... 3.1.6. Medios de cultivos……………………………………………………………………………………………........ ... Suelo……………………………………………………………………………………………………………………….. 3.2. Métodos……………………………………………………………………………………………………………………..... 3.2.1. Eiueiieto de suelos………………………………………………………………………………………. 3.2.2. Preparación de inóculos de los consorcios microbianos y cepas bacterianas aisladas 3.2.3. Deteiaió de la deada iológia de oígeo………………………………………………… 3.2.4. Estudio de mineralización de clorpirifós, fenantreno y pireno en solución y en suelo……………………………………………………………………………………………………………………….. . RESULTADOS Y DISCUSIÓN………………………………………………………………………………………….. 4.1. Demanda biológica de oxígeno………………………………………………………………………………….. 4.2. Mineralización de clorpirifós, fenantreno y pireno en soluió…………………………… .. Miealizaió de feateo pieo e suelo………………………………………………………… . CONCLUSIONES…………………………………………………………………………………………………………… 6. BIBLIOGRAFÍA……………………………………………………………………………………………………………… 1 2 3 4 5 6 6 7 7 8 9 11 13 14 15 15 15 15 17 17 17 18 18 19 19 19 20 22 24 24 26 29 33 34
2 ÍNDICE DE TABLAS Tabla 1. Nomenclatura utilizada para las bacterias aisladas de suelo y solución de clorpirifós otaiada……………………………………………………………………………………………………. 15 Tabla 2. Nomenclatura utilizada para los consorcios microbianos empleados en este taajo……..…………………………………………………………………………………………………………............... 15 Tabla 3. Solución de nutrientes (SNs)……………………………………………………………………………….. 17 Tabla 4. Medios de cultivos empleados……………………………………………………………………………. 18 Tabla 5. Propiedades físicoquímicas del suelo empleado……………………………………………… 18 Tabla 6. Factor de conversión de valores obtenidos en el experimento de demanda iológia de oígeo…………………………………………………………………………………………………….…… 22 Tabla 7. Ensayos de mineralización de clorpirifós, fenantreno y pireno en solución, y en suelo……………………………………………………………………………………………………………………………...... 23 Tabla 8. Mg consumidos de oxígeno L-1 a los difeetes tiepos del esao e el oitop… 26
3 ÍNDICE DE FIGURAS Figura 1. Estructura química del insecticida, clorpirifós……………………………………………….. 7 Figura 2. Estructura química de fenantreno………………………………………………………………… 8 Figura 3. Estructura química de pireno………………………………………………………………………… 9 Figura 4. Concepto de biodisponibilidad y bioaccesibilidad de un contaminante en el suelo……………………………………………………………………………………………………………………………. 10 Figura 5. Consorcio microbianos y cepas bacterianas aisladas sembradas en cuadrante en placa petri con medio LB-agar (Luria Bertani)…………………………………………………………. 16 Figura 6. Preparación de los inóculos de las cepas bacterianas aisladas y los consorcios de microorganismos…………………………………………………………………………………… 19 Figura 7. Cabezal del oxitop y cabina termostática……………………………………………………. 21 Figura 8. Respirómetro empleado para los estudios de mineralización de contaminantes y trampa de álcali antes de ser incorporada al matraz erlenmeyer……… 22 Figura 9. Graficas de mg oxígeno consumido L-1 frente al tiempo de ensayo……………….. 25 Figura 10. Porcentaje mineralizado de los contaminantes clorpirifós, fenantreno y pireno en solución……………………………………………………………………………………………………….. 28-29 Figura 11. Porcentaje mineralizado en suelo de cada PAHs frente al tiempo de ensayo 30
4 RESUMEN Título: Aislamiento de microorganismos degradadores de clorpirifós, fenantreno y pireno para su uso en la biorrecuperación de aguas y suelos contaminados. En este Trabajo de Fin de Grado Experimental se ha desarrollado y evaluado una técnica de biorrecuperación de suelos contaminados por clorpirifós, fenantreno y pireno. Estos contaminantes están ampliamente distribuidos en el medioambiente, lo que supone un riesgo para la salud humana. Con esta técnica de biorrecuperación se pretende conseguir un incremento en la tasa de mineralización de estos contaminantes mediante la inoculación con cepas bacterianas aisladas y consorcios microbianos procedentes de un suelo agrícola, obtenidos a partir de cultivos de enriquecimiento. La demanda biólogica de óxigeno (DBO), es una prueba previa para determinar que el medio contaminado posee las condiciones adecuadas para el desarrollo de las cepas bacterianas aisladas y de los consorcios microbianos empleados en la biorrecuperación, los contaminantes constituyen la única fuente de energía y carbono. Se observó que los medios con clorpirifós y pireno eran propicios para el desarrollo de las cepas B1, B2, B3, B4 y los consorcios C1 y C2, midiendo para ello los mg de oxígeno consumidos L-1. Los estudios de mineralización se llevaron a cabo utilizando respirómetros con soluciones o suspensiones de suelo, en agitación continua. En el tiempo de ensayo se llegó a observar que en las soluciones contaminadas con fenantreno, e inoculadas con el consorcio microbiano C1, se alcanzó un porcentaje de mineralización del 30%. Cuando se utilizó el consorcio microbiano C1 en las muestras de suelo Andújar (contaminado con fenantreno y pireno), se cuantificó una mineralización del pireno inferior al 20% (inferior a lo alcanzado en solución) y ligeramente superior al 20% en el caso del fenantreno. Palabras claves: clorpirifós, fenantreno, pireno, biodegradación y microorganismos degradadores.
5 LISTA DE ABREVIATURAS CLP: clorpirifós. DBO: demanda biológica de oxígeno. LB: medio de cultivo DifcoTM LB Broth, Miller Luria-Bertani. MSM: mineral salts medium. PAHs: hidrocarburos aromáticos policíclicos. PHE: fenantreno. PYR: pireno. SNs: solución de micronutrientes.
6 1. INTRODUCCIÓN 1.1. PROBLEMÁTICA MEDIOAMBIENTAL DERIVADA DE LA PRESENCIA DE CONTAMINANTES ORGÁNICOS Debido al aumento demográfico a escala mundial, en los últimos años, se ha tendido hacia una agricultura intensiva, ya que las plantas constituyen la principal fuente de alimentos en el mundo. El aumento de la productividad se ha desarrollado con la difusión de nuevas variedades de cultivo de alto rendimiento, unido a nuevas prácticas agrícolas que utilizan grandes cantidades de fertilizantes, insecticidas y plaguicidas, así como tractores y otra maquinaria pesada. Los beneficios alcanzados por esta mejora agrícola son indiscutibles, pero han surgido diversos problemas entre los que destacan los daños medioambientales generados, incluyendo la erosión del suelo, la salinización, el anegamiento de suelos muy irrigados, el agotamiento de acuíferos, deforestación, etc., así como la contaminación del medioambiente por el uso excesivo de plaguicidas. En ocasiones los plaguicidas no alcanzan su objetivo y al llegar a la superficie del suelo pueden sufrir una serie de procesos tales como degradación química y/o biológica, fotodescomposición, etc. También pueden producirse pérdidas por escorrentías y lixiviación, pudiendo alcanzar y contaminar las aguas subterráneas, lo que supone un gran riesgo para la salud humana (Rubio-Bellido et al., 2016). No obstante, hay que reconocer que los plaguicidas, contribuyen significativamente al mantenimiento y protección de los cultivos, siendo indispensables en la agricultura moderna. Sin embargo a pesar de los beneficios, en la sociedad hay una urgente necesidad de optimizar sus usos, no sólo en respuesta a las normativas establecidas sobre contaminación medioambiental, sino también para asegurar el mantenimiento de estos como una herramienta efectiva y valiosa para los agricultores del futuro (Kudsk y Streibig, 2003). Por otro lado la contaminación de suelos, aguas subterráneas y superficiales por hidrocarburos aromáticos policíclicos (PAHs) es un tema de gran interés a nivel mundial. Muchos de estos compuestos constituyen una amenaza para la salud humana y el medio ambiente. El suelo es el principal sumidero para la mayoría de los PAHs. Su contaminación puede ser debida a accidentes industriales y a actividades antropogénicas, y constituyen un fuente de contaminación del medioambiente a largo plazo (Wong et al., 2009).
7 1.2. PLAGUICIDAS Los plaguicidas son compuestos sintéticos extensivamente usados en cultivos para protegerlos de plagas. El uso estimado de plaguicidas en el mundo es de 2 millones de toneladas por año, de los que 45% es usado en Europa, 25% en USA, y 25% en el resto del mundo. El 80 % de los plaguicidas son usados en forma de insecticidas, el 15% son herbicidas y el 2% son fungicidas (Agarwal et al., 2015). Se pueden encontrar residuos de plaguicidas en el aire, suelo, agua superficial y subterránea. Una familia de estos plaguicidas son los organoclorados (lindano, heptacloro, diclorodifeniltricloroetano (DDT), etc). Estos compuestos tienen una amplia persistencia, tendencia para bioacumularse y un elevado potencial tóxico en organismos no diana. Por ello, este grupo de plaguicidas ha sido reemplazado por los organofosforados (OP), relativamente menos persistentes y efectivos. Aunque los organofosforados se degradan más rápido que los organoclorados, esta clase de plaguicidas tiene una aguda neurotoxicidad debido a su habilidad para inactivar la acetilcolina esterasa (AChE). 1.2.1. ORGANOFOSFORADOS. CLORPIRIFÓS El clorpirifós (figura 1) (O,O-dietil O-3,5,6-trichloropyridin-2-ifosforotioato) es uno de los organofosforados más usados en el control de insectos en las cosechas. La vida media del clorpirifós es normalmente de 10 a 120 días en suelo, pero puede alcanzar hasta 1 año dependiendo del tipo de suelo, dosis de insecticida, clima y otros factores medioambientales. El clorpirifós sin embargo posee efectos secundarios en la actividad espermática, hepática y renal de humanos. La exposición prenatal a clorpirifós tiene una fuerte relación con el bajo peso en el nacimiento, la microcefalia y retraso en el desarrollo neuronal. Clorpirifós ha sido identificado como un factor ambiental relacionado con el cáncer de mama. Figura 1. Estructura química del insecticida, clorpirifós.
14 2. OBJETIVOS La selección de los contaminantes sobre los que hemos centrado nuestro trabajo se ha realizado en base a su especial persistencia y toxicidad en suelos y aguas. Los contaminantes elegidos son: clorpirifós, fenantreno y pireno. Los objetivos específicos que se persiguen en el presente trabajo son los siguientes: 1). Aislar microorganismos potencialmente degradadores de clorpirifós, fenantreno y pireno, mediante el empleo de técnicas de cultivos de enriquecimiento a partir de suelos contaminados. 2). Estudios preliminares relacionados con la DBO a partir de un sistema acuoso contaminado artificialmente e inoculado con las cepas baterianas aisladas y consorcios microbianos, que potencialmente son biodegradadores de dichos contaminantes, con el fin de obtener una primera aproximación de posibles bacterias capaces de llevar a cabo la mineralización de estos. 3). Monitorizar en el laboratorio los procesos de mineralización de clorpirifós, fenantreno y pireno en solución, y en suelo de pireno y fenantreno, empleando para ello los sistemas bacterianos aislados y consorcios microbianos.
15 3. METODOLOGÍA 3.1. MATERIALES 3.1.1. CEPAS BACTERIANAS AISLADAS Las bacterias aisladas fueron obtenidas de suelos agrícolas a través de cultivos de enriquecimiento y de una solución de clorpirifós contaminada en el laboratorio (Tabla 1). Tabla 1. Nomenclatura utilizada para las bacterias aisladas de suelo y solución de clorpirifós contaminada. Procedencia Nomenclatura para cepas Bacteria aislada en solución de clorpirifós contaminada 1mg L-1 B1 Bacteria aislada en solución de clorpirifós contaminada 1mg L-1 B2 Bacteria aislada en solución de clorpirifós contaminada 1mg L-1 B3 Bacteria aislada de SUELO ALAJAR B4 3.1.2. CONSORCIOS MICROBIANOS Los consorcios microbianos se aislaron de suelos agrícolas a través de cultivos de enriquecimiento o por la unión en el laboratorio de cepas bacterianas aisladas previamente. Dichos consorcios microbianos, serán nombrados en este trabajo tal como se indican en la tabla 2. Tabla 2. Nomenclatura utilizada para los consorcios microbianos empleados en este trabajo. Procedencia Nomenclatura para consorcio microbianos SUELO ANDUJAR C 1 SUELO FUENTEHERIDOS C2 Artificial: combinación C2 + B4 Artificial: combinación cepas B1 + B2 + B3 C3 C4 En la figura 5 se muestran los consorcios y cepas aisladas, sembrados en cuadrantes en placas Petri cuyo medio elegido fue LB-agar.
16 Figura 5. Consorcio microbianos y cepas bacterianas aisladas sembradas en cuadrante en placa petri con medio LB-agar (Luria Bertani).
17 3.1.3. PLAGUICIDAS Se ha utilizado clorpirifós en polvo (pureza >98%), suministrado por Sigma Aldrich (Madrid, España). El clorpirifós marcado radiactivamente en el anillo aromático se adquirió del instituto de Isótopos Co, Ltd., (Budapest, Hungría), actividad específica, 36 mCi mmol -1; pureza química, 99,9%; pureza radioquímica, 100%. 3.1.4. HIDROCARBUROS AROMÁTICOS POLICÍCLICOS Se han utilizado los siguientes (PAHS) adquiridos a Sigma Aldrich (Madrid, España): Pireno (PYR C14H10) en polvo (pureza > 98%) y fenantreno (PHE C14H10) en polvo (pureza >98%). El pireno y el fenantreno marcados radiactivamente en el anillo aromático se adquirien el Instituto de Isótopos Co., Ltd., (Budapest, Hungría). 3.1.5. SOLUCIÓN DE NUTRIENTES (SNs) Para estimular a las cepas bacterianas se empleó una solución de nutrientes, cuya composición se muestra en la Tabla 3. Tabla 3. Solución de nutrientes (SNs). Nutrientes μg mL¯¹ Mn Cl2 . 4 H2O Fe SO4 . 7 H2O Sn Cl2 . 2 H2O Zn SO4 . 7 H2O Al2 (SO4)3 . 18 H2O CO Cl2 . 6 H2O Ca SO4 . 2 H2O K Br K Cl Li Cl 75,0 37,5 25,0 12,5 12,5 12,5 10,0 3,75 3,75 2,50
18 3.1.6. MEDIOS DE CULTIVOS Los medios de cultivos empleados en la obtención de las cepas bacterianas aisladas y los consorcios microbianos, y en la realización de los estudios de mineralización y pruebas para la determinación de la demanda biológica de oxígeno, se muestran a continuación en la tabla 4. Tabla 4. Medios de cultivos empleados. (1)MSM: Mineral salts medium. Resultado de la mezcla de las siguientes disoluciones: Disolución I: 2,0 g de KH2PO4 más 4,0 g de Na2HPO4 en 500 mL de agua destilada. Disolución II: 1,6 g de MgSO4 x 7 H2O más 0,8 g de (NH4)2SO4 en 500 mL de agua destilada. (2) LB: Luria- Bertani médium. Medio 381 de la lista de medios para microorganismos (Leibniz Institute DSMZ- German Collection of Microorganisms and Cell Cultures). 3.1.7. SUELO El suelo empleado para el experimento de mineralización en suelo de la presente memoria, fué un suelo denominado ANDUJAR, obtenido de la localidad de Andujar (Sur-Este de España °’’’N, °’’’W). La muestra se cogió de la capa más superficial (0-20cm), se secó al aire y se trituró haciéndose pasar por un tamiz de malla de 2mm. En la tabla 5 se representa las propiedades físicoquímicas de este suelo. Tabla 5. Propiedades físicoquímicas del suelo empleado. Suelo pH MO (%) Arena (%) Limo (%) Arcilla (%) CO3-2 (%) Clasificación Textural ANDUJAR 8,14 8,11 74,8 14,8 10,4 23,2 Arenosa Componentes MSM (1) LB(2) LBagar (NH4)2SO4 KH2PO4 Na2HPO4 MgSO4 x 7 H2O NaCl Triptona Extracto de levadura Bacto Agar 0,8 g 2,0 g 4,0 g 1,6 g 10 g 10 g 10 g 10 g 5 g 5 g 20g
19 3.2. MÉTODOS 3.2.1. ENRIQUECIMIENTO DE SUELOS En el caso de la cepa bacteriana B4 y consorcios microbianos C1 y C2 (tabla 1 y 2), se aislaron de suelos que habían sido sometidos a una aplicación continuada de contaminantes: clorpirifós, fenantreno y pireno. La cepa bacteriana y consorcios microbianos aislados se obtuvieron a partir de la técnica de cultivos de enriquecimiento de cada suelo. En primer lugar se preparó una suspensión en recipientes estériles de 250 mL con 10 g de cada suelo en 50 mL de medio MSM suplementado con clorpirifós, fenantreno y pireno (40 mg kg-1) y con una solución de nutrientes (SNs). Cada 15 días se recogían 10 mL de la suspensión y se añadían en 40 mL de medio MSM enriquecido con los contaminantes (40 mg mL-1) y SNs. Este proceso se repitió 4 veces. A los días, ua alíuota de μL de este ultio se iouló e placas Petri con medio LB–agar y posteriormente se incubaron a 30 OC durante 1 semana para finalmente, con asa de siembra estéril, introducir la biomasa a conservar en crioviales. 3.2.2. PREPARACIÓN DE INÓCULOS DE LOS CONSORCIOS MICROBIANOS Y CEPAS BACTERIANAS AISLADAS Se preparan inóculos a partir de los consorcios microbianos y cepas bacterianas aisladas, que fueron previamente seleccionadas mediante cultivos de enriquecimiento para ser posteriormente conservadas en crioviales a -80oC en congelador, (Revco Elite Plus, Clarkson Laboratory & Supply Inc. USA). El proceso de preparación de inóculos se muestra en la figura 6. Figura 6. Preparación de los inóculos de las cepas bacterianas aisladas y los consorcios de microorganismos.
20 De los crioviales se usó una esfera porosa que sirve de soporte para las bacterias y que a su vez se encuentran sumergidas en un líquido crioprotector, para sembrar en placas de Petri con medio LB- agar cada uno de los microorganismos conservados. Las placas se incubaron 24 horas a 30oC, excepcionalmente 48 horas en el caso del C2 y la B3. Se cogieron colonias aisladas de las placas en el caso de las cepas bacterianas aisladas, y biomasa representativa de todas las colonias presentes, en el caso de los consorcios microbianos, y se volvieron a sembrar de nuevo en placas Petri en cuadrante, y se incubaron de nuevo en estufa a 30º C durante 24 y 48 horas. Con biomasa suficiente de cada una de las placas Petri se inocularon botellas con 100 mL de medio LB y 100 mg L¯¹ (10 mg) de cada contaminante. Estas botellas se incubaron a 30ºC en agitación (130 rpm) durante 20 horas, tiempo suficiente para que las bacterias alcancen la fase estacionaria de crecimiento. Una vez pasado este tiempo, se recuperaron las células bacterianas crecidas en los medios por centrifugación durante 10 minutos a 7000 rpm. Al pellet de células se le añadieron 50 mL del medio MSM, en vistas a lavar las células de posibles metabolitos que pudiesen haber en el cultivo debido a los productos que se van formando con el metabolismo bacteriano, recuperando de nuevo las células tras centrifugación. Esta fase se repite una segunda vez. Finalmente, se desechó de nuevo con cuidado el sobrenadante y se conservó solo el pellet. Se resuspendió el pellet en medio MSM, hasta alcanzar una concentración equivalente a 108 UFC mL-1 por comparación con la escala de Mac Farland. La suspensión bacteriana se conservó en tubos a 4ºC hasta el momento de utilizarlos para inocular nuevos medios. 3.2.3. DETERMINACIÓN DE LA DEMANDA BIOLÓGICA DE OXÍGENO El ensayo de la demanda biológica de oxígeno (DBO), concierne la determinación de la degradación de sustancias orgánicas por microorganismos. La determinación de la DBO será posible al medir indirectamente dióxido de carbono y el cambio indirecto de presión. El dióxido de carbono obtenido va a reaccionar con hidróxido de sodio, formando carbonato de sodio. De esta manera el dióxido de carbono que se encuentra en fase gaseosa, al ser convertido en carbonato de sodio provoca un descenso de esta fase y por lo tanto un descenso de presión que será medido por el cabezal oxitop. 2 NaOH + CO2 ↓ Na2CO3 ↑ + H2O
21 Se emplearon botellas de vidrio, previamente esterilizadas, especiales para el experimento. Para cada experimento se dispuso de un ensayo control y el inoculado por duplicado. Se añadió 147,6 mL de agua miliQ previamente esterilizada en autoclave, 16,4 mL de MSM, 164 µL de SNs, 1 mL del inoculo bacteriano, más una cantidad de contaminante, que en el caso de clorpirifós alcanzó una concentración de 1 mg L-1, y de pireno 0,2 mg L-1. En el caso del pireno se parte de una solución pireno:metanol 20 mg L-1, se toma 3 mL, y se añaden a la solución final. Por otro lado para las pruebas con clorpirifós, se partió de una solución clorpirifós: metanol de 1000 mg L-1, puesto que cogemos 0,164 mL, para alcanzar la concentración final de 1mg L-1. Siempre se tiene en cuenta que la concentración en metanol esté por debajo del 1% en la solución final puesto que sobrepasando este porcentaje puede ocasionar la muerte de los microorganismo. Se depositó la mezcla en la botella, en la cual se introdujo un imán para mantener la solución en agitación continúa. Se cerraron las botellas con el cabezal oxitop (figura 7), donde se introdujo la sosa. En dichos cabezales quedaron registrados automáticamente los valores de mg de oxígeno consumido L- 1. Las botellas se mantuvieron durante 7 días en unas cabinas termostáticas (figura 7), con una temperatura constante de 20o. Figura 7. Cabezal del oxitop y cabina termostática. Los valores obtenidos en el cabezal oxitop, deben ser multiplicados por un factor de conversión para obtener los valores reales de DBO, estos factores están sujetos al volumen del ensayo, tabla 6.
22 Tabla 6. Factor de conversión de valores obtenidos en el experimento de demanda biológica de oxígeno. Cantidad de muestra usada [mL] Factor(*) 432 1 365 2 250 5 164 10 97 20 43,5 50 22,7 100 *La cantidad de muestra usada es de 164 ml por tanto el factor a usar es 10. 3.2.4. ESTUDIOS DE MINERALIZACIÓN DE CLORPIRIFÓS, FENANTRENO Y PIRENO EN SOLUCIÓN Y EN SUELO Para llevar a cabo los ensayos de mineralización se utilizaron respirómetros, que consisten en un cuerpo principal, formado por un matraz de vidrio de 250 mL de capacidad, en cuyo interior se añadieron el contaminante a estudiar, clorpirifós, fenantreno y pireno, no marcado y marcado 14C en el anillo aromático junto con 50 mL de medio MSM, más el tratamiento a evaluar en cada experimento (solución de micronutrientes (1 mL SNs) y 1 mL del inóculo microbiano a estudiar). En la parte superior del matraz se colocó un tapón envuelto en cinta de teflón con una trampa de álcali suspendida (1 mL de NaOH 0,5N) (Figura 8), la cual será la encargada de atrapar la producción de 14CO2 (Reid et al., 2001). Figura 8. Respirómetro empleado para los estudios de mineralización de contaminantes y trampa de álcali antes de ser incorporada al matraz erlenmeyer. En primer lugar, se añadieron a los respirómetros aproximadamente 450 Bq (25000 dpm) del contaminante marcado 14C en el anillo aromático, así como contaminante no marcado en
23 cantidad necesaria, tanto al experimento de mineralización en solución como en suelo. La concentración del contaminante no marcado fue de 50 mg kg-1 en mineralización en suelo y 10mg L-1 en solución. El substrato marcado y el no marcado se añadieron disueltos en metanol, dejándolos evaporar antes de añadir el resto de componentes del tratamiento (SNs y/o consorcios microbianos y/o cepas aisladas) para que no interfiriera en la mineralización. En el caso de la mineralización en suelo se añadieron el marcado y no marcado a 25% del suelo para no destruir la flora endógena, el resto de suelo hasta alcanzar los 10g se agregó una vez evaporado el metanol. Finalmente, se homogeneizó bien el medio y los substratos, mediante agitación manual suave. Todos los experimentos se realizaron a una temperatura de 25°C. Periódicamente, la solución de la trampa de sosa se retiró y se reemplazó por una nueva. La solución de NaOH retirada (1mL) se mezcló con 3 mL de líquido de centelleo (ÚLTIMA GOLD ™, PekiEle, I., USA dicha mezcla se mantuvo en oscuridad durante al menos 24 horas para la disipación de la quimioluminiscencia. La radiactividad se midió con un contador de centelleo líquido modelo lll Beckman LS5000TD. En la tabla 7 se representan los ensayos de mineralización. Tabla 7. Ensayos de mineralización de clorpirifós, fenantreno y pireno en solución, y en suelo. EXP SNs 1mL MSM 50mL C1 C2 B1 B2 B3 B4 CLP* PHEN* PYR* S* 1 SI SI SI 2 SI SI SI SI 3 SI SI SI 4 SI SI SI SI 5 SI SI SI 6 SI SI SI SI 7 SI SI SI SI 8 SI SI SI SI 9 SI SI SI 10 SI SI SI SI 11 SI SI SI SI 12 SI SI SI SI SI 13 SI SI SI 14 SI SI SI SI SI SI 15 SI SI SI 16 SI SI SI SI 17 SI SI SI SI SI 18 SI SI SI SI SI CLP*, clorpirifós. PHEN*, fenantreno. PYR*, pireno. S*, suelo.
30 suelo Andujar, previamente esterilizado, con el objetivo de evaluar su capacidad de mineralizar ambos contaminantes en él, dónde la biodisponibilidad del contaminante podría verse reducida por los fenómenos de adsorción sobre las partículas del mismo. Figura 11.Porcentaje mineralizado en suelo de cada PAHs frente al tiempo de ensayo. En la figura 11 se muestran los porcentajes de mineralización del fenantreno y pireno frente al tiempo, llevados a cabo por el C1. Las curvas de mineralización obtenidas, en el caso del pireno, presenta tres fases, que como anteriormente explicamos en el apartado 4.2.Mineralizacion de clorpirifós, fenantreno y pireno en solución, sería una primera fase lag, de adaptación de los microorganismos la cual en este caso tendría una duracion de aproximadamente 7 días, seguida de una fase exponencial y ya por último una fase plateau, alcanzandose un porcentaje de mineralización cercano al 20%. En el caso del fenantreno hay que puntualizar que no se observaría fase lag, y en este caso la mineralización alcanzada sería superior al 20%. Este consorcio microbiano se aplica a un suelo, que no esta en condiciones reales (ya que está previamente esterilizado). En el caso de mineralización del fenantreno en solución se ha alcanzado un porcentaje cercano al 30%, las propiedades fisico-químicas de los suelos influyen en la adsorción, y por lo tanto, en su fracción biodisponible potencialmente biodegradable. La degradación microbiana es el principal mecanismo de disipación de muchos compuestos orgánicos presentes en el suelo (Grant et al.,2002). La extension y la velocidad de degradación microbiana estan controladas por la biodisponibilidad de los contaminantes, que se define como la fracción libre que está disponible para atravesar la membrana celular de los organismos presentes en el medio en un momento determinado (Semple et al.,2004). Ello puede limitar la capacidad de los microorganismo presentes, en nuestro caso al consorcio 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 010 20 30 40 50 60 70 80 % mineralizado de PAHs Tiempo (días) C1+ Pireno C1 + Fenantreno
31 microbiano, para degradar los contaminantes retenidos en los mismos, dando lugar a un aumento en su persistencia, así como tambien al riesgo derivado de su prolongado efecto en el medio ambiente. Es por esto que la mineralización es inferior que en el caso de la solución. En el caso del pireno en suelo si se observa la aparición de una fase lag, la cual no puede ser explicada por la propia adaptacion del consorcio como lo confirmo el experimento en solución, y por lo tanto, la explicación se encontraría en la cantidad de pireno absorbido sobre las particulas del suelo que provocarían una reduccion en la fracción biodisponible del contaminante, es decir un menor número de moleculas de pireno estarían disponibles para ser atacadas por las enzimas excretadas por las cepas degradadoras específicas, lo que daría una disminución en la velocidad de degradación del contaminante (Mathews et al.,2002) ya que esta velocidad viene determinada por la concentración de sustrato disponible. Partiendo de esta conclusión, se puede explicar como estas fases lag son debidas pricipalmente a la solubilidad del contaminantes, es decir a la menor cantidad del contaminante solubilizado. Por otro lado Barles et al., (1979) comprobaron como tras la inoculación de un suelo contaminado con Paratión, con un cultivo degradador específico de este, constituido por una cepa de Pseudomonas stutzeri y otra de Pseudomonas aeruginosa, la biodegradación de este compuesto aumento hasta el 25% de la cantidad del insecticida añadida, mientras que la flora endógena del mismo suelo no había degradado más del 10% del insecticida. (White et al., 1999), observaron que si suelos en los que la mineralización de PHE por la flora endógena del mismo era pequeña cuando eran inoculado con un degradador específico de este contaminante (Pseudomonas cepa R), la cantidad de substrato envejecido degradado aumentaba. Justificaron este resultado afirmando que la actividad de la población microbiana de un suelo, incluso sin que exista en el medio competencia con otros microoganismos por los nutrientes, puede reducirse considerablemente aunque el substrato esté disponible y permanezca en el medio. En el caso del pireno se observó un efecto contrario, ya que el pireno biodegradado fue superior en presencia del suelo respecto al ensayo en solución, donde todo el pireno estaba biodisponible. Este hecho se debe al efecto cometabólico que pudiese haber provocado la presencia de materia orgánica disuelta, haciendo que la actuación sobre la misma como fuente de carbono estimulase la actuación de una ruta biodegradadora del pireno (Rubio- Bellido et al., 2016). Existen diferentes conclusiones acerca del uso de inóculos microbianos degradadores específicos en la recuperación de suelos contaminados con hidrocarburos, ya que en algunos estudios se ha observado un incremento en la degradación del contaminante, mientras que en
32 otros se ha observado un efecto negativo en su degradación (Jobsen et al., 1974; Goldstein et al., 1985; Capelli et al.,2001; Bento et al.,2005); por ejemplo (Towell et al. (2011b)), estudiaron, en un suelo agrícola no contaminado, el efecto de la adición de tres inoculos bacterianos degradadores en la mineralización de 14C- fenildodecano. Cada uno de los inoculos se adicionó al suelo a tres concentraciones distintas. Salvo cuando los inóculos se adcionaron a la concentración mas baja de las tres empleadas, obtuvieron que la duración de la fase lag en las curvas de mineralización fue mayor cuando no se adicionó ningún inóculo. En todos los caso la tasa máxima de mineralización de 14C aumentó tras la adición de los inóculos. (Bento et al., 2005), estudiaron el efecto de la bioaumentación en la degradación de gasoleo en dos muestras de suelo observando en uno de los suelos una degradación optima tras la adición de un consorcio microbiano degradador específico, mientras que este tratamiento no tuvo un efecto significativo en el otro suelo en la degradación del gasoleo en el suelo procedente de Hong Kong.
33 5. CONCLUSIONES Las conclusiones que derivan de estos estudios son las siguientes: 1. Los consorcios microbioanos C1, C2 y cepa bacteriana B4, se consiguieron aislar de los suelos ANDUJAR, FUENTEHERIDOS Y ALAJAR respectivamente, mediante la técnica de cultivos de enriquecimento de cada suelo. Por otro lado las cepas B1, B2 y B3, fueron obtenidas de una solución contaminada de clorpirifós en el laboratorio. 2. En el experimento de la demanda biológica de óxigeno (DBO), se comprobó que los consorcios microbianos C1,C2 y cepas bacterianas B1, B2, B3 y B4, eran capaces de sobrevivir, empleando los contaminantes (clorpirifós y pireno) como única fuente de carbono y de aporte de energía. Las cepas bacterianas aisladas potencialmente degradadoras de clorpirifós, mostraron capacidad de biodegradación de los carbonos presentes en la cadena lateral del insecticida pero no del anillo aromático. 3. El consorcio C1 consiguió mineralizar fenantreno en solución, confirmándose que los consorcios microbianos poseen mayor capacidad para degradar, que las cepas bacterianas aisladas. 4. Una vez demostrado la capacidad de C1 para mineralizar fenantreno en solución, se ha estudio la mineralización en suelo del fenantreno, detectándose un porcentaje de mineralización mucho menor que en solución, debido posiblemente a que los contaminantes podrían quedar absorbidos sobre las partículas del suelo viéndose su biodisponibilidad fuertemente reducida. Por el contrario en el caso del pireno la biodegradación se vió favorecida en el suelo respecto a la observada en solución, probablemente debido a un efecto cometabólico por parte de la materia orgánica disponible en el propio suelo.
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