Caracterización de las principales enzimas celulolíticas de myceliophthora thermophila implicadas en la degradación de biomasa lignocelulósica y mejora de la hidrólisis de hemicelulosa para la producción de bioetanol de segunda generación.

! 1 ! UNIVERSIDAD DE SEVILLA FACULTAD DE BIOLOGÍA Departamento de Bioquímica Vegetal y Biología Molecular TESIS DOCTORAL Caracterización de las principales enzimas celulolíticas de Myceliophthora thermophila implicadas en la degradación de biomasa lignocelulósica y mejora de la hidrólisis de hemicelulosa para la producción de bioetanol de segunda generación Laura Benítez Casanova Sevilla, 2017 ! 2 ! 3 ÍNDICE LISTADO DE ABREVIATURAS ..................................................................................... 7 1 INTRODUCCIÓN ...................................................................................................... 9 1.1 Bioetanol como carburante ........................................................................... 11 1.1.1 Consumo de bioetanol mundial ................................................................. 12 1.2 Lignocelulosa ................................................................................................. 13 1.3 Proceso de obtención de bioetanol de segunda generación .................... 15 1.4 Organismos degradadores de lignocelulosa .............................................. 19 1.4.1 Myceliohpthora thermophila ....................................................................... 20 1.5 Celulasas ......................................................................................................... 22 1.5.1 Endoglucanasas ........................................................................................ 24 1.5.2 Celobiohidrolasas I y II ............................................................................... 25 1.5.3 β-glucosidasas ........................................................................................... 26 1.5.4 Polisácarido monooxigenasa (PMO) ......................................................... 27 1.5.5 Sinergismo ................................................................................................. 28 1.6 Hemicelulasas ................................................................................................ 29 1.6.1 β-xilosidasa ................................................................................................ 30 1.7 Mejora enzimática para la degradación de la lignocelulosa ...................... 31 2 OBJETIVOS ........................................................................................................... 35 3 MATERIALES Y MÉTODOS .................................................................................. 39 3.1 Materiales ........................................................................................................ 41 3.1.1 Biomasa lignocelulósica .......................................................................... 41 3.1.2 Cepas ........................................................................................................ 41 3.1.3 Plásmidos ................................................................................................. 42 3.1.4 Medios de crecimiento del hongo ........................................................... 42 3.2 Métodos ........................................................................................................... 43 3.2.1 Actividades Enzimáticas .......................................................................... 43 3.2.2 Determinación de concentración de proteína ........................................ 49 3.2.3 Purificación de las principales celulasas de Myceliophthora thermophila C1 ..................................................................................................... 50 3.2.4 Electroforesis de proteínas ...................................................................... 53 3.2.5 Caracterización cinética de las enzimas purificadas ............................. 56 3.2.6 Termorresistencia, termoestabilidad y temperatura óptima .................. 58 3.2.7 pH óptimo .................................................................................................. 59 3.2.8 Hidrólisis enzimática de biomasa ............................................................ 59 3.2.9 Escrutinio de actividad β-xilosidasa en cepas de hongos celulolíticos 62 3.2.10 Amplificación, clonación y subclonación del gen bxl 20.17 ................ 62 3.2.11 Transformación del gen bxl 20.17 en M. thermophila C1 ................... 66 3.2.12 Fermentación a escala microplaca ....................................................... 66 3.2.13 Fermentación en matraz ........................................................................ 67 4 RESULTADOS ....................................................................................................... 69 4.1 Purificación y caracterización de la enzima β-glucosidasa 1 de Myceliophthora thermophila C1 ............................................................................. 71 4.1.1 Purificación de la enzima Bgl1 .................................................................. 71 ! 4 4.1.2 Caracterización cinética de la enzima Bgl1 ............................................... 73 4.1.3 Desnaturalización térmica de la enzima Bgl1 ............................................ 75 4.1.4 Termorresistencia de la enzima Bgl1 ......................................................... 75 4.1.5 Temperatura óptima de la enzima Bgl1 ..................................................... 75 4.1.6 pH óptimo de la enzima Bgl1 ..................................................................... 75 4.2 Purificación y caracterización de la enzima celobiohidrolasa 1 de Myceliophthora thermophila C1 ............................................................................. 76 4.2.1 Purificación de la enzima Cbh1 ................................................................. 76 4.2.2 Caracterización cinética de la enzima Cbh1 .............................................. 78 4.2.3 Desnaturalización térmica de la enzima Cbh1 ........................................... 80 4.2.4 Termorresistencia de la enzima Cbh1 ....................................................... 81 4.2.5 Temperatura óptima de la enzima Cbh1 .................................................... 81 4.2.6 pH óptimo de la enzima Cbh1 .................................................................... 81 4.3 Purificación y caracterización de la enzima Celobiohidrolasa 4 de Myceliophthora thermophila C1 ............................................................................. 82 4.3.1 Purificación de la enzima Cbh4 ................................................................. 82 4.3.2 Caracterización cinética de la enzima Cbh4 .............................................. 84 4.3.3 Desnaturalización térmica de la enzima Cbh4 ........................................... 86 4.3.4 Termorresistencia de la enzima Cbh4 ....................................................... 86 4.3.5 Temperatura óptima de la enzima Cbh4 .................................................... 86 4.3.6 pH óptimo Cbh4 ......................................................................................... 86 4.4 Purificación y caracterización de la enzima Endoglucanasa 2 de Myceliophthora thermophila C1 ............................................................................. 87 4.4.1 Purificación de la enzima Eg2 .................................................................... 87 4.4.2 Inhibición de la enzima Eg2 ....................................................................... 89 4.4.3 Desnaturalización térmica de la enzima Eg2 ............................................. 90 4.4.4 Termorresistecia de la enzima Eg2 ........................................................... 90 4.4.5 Temperatura óptima de la enzima Eg2 ...................................................... 90 4.4.6 pH óptimo de la enzima Eg2 ...................................................................... 91 4.5 Prueba funcional para la optimización del cóctel secretado por Myceliophthora thermophila C1 ............................................................................. 92 4.5.1 Diseño de un cóctel sintético con el mínimo número de componentes para la hidrólisis de biomasa lignocelulósica ................................................................. 92 4.5.2 Influencia individual de cada una de las celulasas en el cóctel mínimo (CM 6) 96 4.5.3 Optimización de las proporciones de las distintas celulasas en el cóctel mínimo (CM 6) ....................................................................................................... 97 4.6 Búsqueda y expresión de una enzima β-xilosidasa en Myceliophthora thermophila C1 ...................................................................................................... 103 4.6.1 Escrutinio de β-xilosidasas de hongos celulolíticos ................................. 104 4.6.2 Amplificación del gen bxl 20.17 ............................................................... 105 4.6.3 Expresión del gen bxl 20.17 en Myceliophthora thermophila C1 ............. 107 4.6.4 Hidrólisis de PCS con los sobrenadantes de los clones transformantes de Myceliophthora thermophila C1 ........................................................................... 110 DISCUSIÓN .......................................................................................................... 113 5 5.1 La enzima Bgl1 frente a otras β-glucosidasas .......................................... 115 5.1.1 Constantes cinéticas de las β-glucosidasas ............................................ 118 ! 5 5.1.2 Termoestabilidad de las β-glucosidasas .................................................. 120 5.1.3 Efecto de la temperatura y el pH en la actividad de las β-glucosidasas .. 121 5.2 Las enzimas Cbh1 y Cbh4 frente a otras celobiohidrolasas .................... 122 5.2.1 Caracterización de las enzimas Cbh1 y Cbh4 ......................................... 128 5.2.2 Efecto de la temperatura y el pH sobre la actividad de las celobiohidrolasas ................................................................................................. 131 5.3 La enzima Eg2 frente a otras endoglucanasas ......................................... 133 5.3.1 Caracterización de la enzima Eg2 ........................................................... 135 5.3.2 Efecto de la temperatura y el pH sobre la actividad de Eg2 .................... 136 5.4 Búsqueda de las enzimas para la composición del cóctel mínimo ........ 138 5.4.1 Influencia individual de cada una de las celulasas en el cóctel mínimo CM 6 141 5.4.2 Optimización de las proporciones de las distintas celulasas del cóctel mínimo (CM 6) para la hidrólisis de PCS ............................................................ 142 5.4.3 Efecto del dominio de unión a carbohidratos de la enzima Cbh1 en la hidrólisis de PCS ................................................................................................. 144 5.5 Mejora en la hidrólisis de hemicelulosa ..................................................... 145 5.5.1 Expresión heteróloga del gen bxl 20.17 en M. thermophila C1 ............... 146 5.5.2 Hidrólisis de PCS por los transformates de bxl 20.17 .............................. 148 6 CONCLUSIONES ................................................................................................. 149 7 BIBLIOGRAFÍA ...................................................................................................... 153 LISTADO DE ABREVIATURAS ! ! ATA ácido aurin-tricarboxílico Azo-CMC azo carboximetil celulosa BGL CBD ß-glucosidasa dominio de unión a carbohidratos CBH celobiohidrolasa CDH celobiosa deshidrogenasa CHAPS 3-(3-colamidopropil)dimetilamonio.-1- propano sulfonato CM 4 cóctel mínimo DMSO dimetilsulfóxidos DTT ditiotreitol EG GH endoglucanasa familia glicosil hidrolasa IEF isoelectroenfoque MUX metil umberiferilβ-D-xilopiranosido PASC celulosa amorfa tratada con ácido fosfórico PCS pretreated corn stover (rastrojo de maíz pretratado) PMO polisacárido monooxigenasa pNCB p-nitrofenil β-D-celobiosido pNGP p-nitrofenil β-D-glucopiranósido pNXP p-nitrofenil β-D-xilopiranósido pyr4 orotidina-5’-fosfato descarboxilasa ! 8 pyr5 orotato-fosforribosil transferasa SDS-PAGE electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato sódico Tm temperatura de fusión de proteínas U unidad de activdad enzimática ura/uri uracilo/uridina ! ! ! ! 9 1 INTRODUCCIÓN ! ! ! ! ! ! Introducción ! ! ! 16 I. Pretratamiento. El objetivo del pretratamiento es la eliminación parcial de la lignina y la hemicelulosa así como disminuir el grado de cristalinidad de la celulosa y aumentar la porosidad de la biomasa (Kristensen y col., 2008). Este proceso modifica la estructura nativa de las fibras para facilitar la accesibilidad de las enzimas degradadoras de lignocelulosa, necesarias en la posterior etapa de hidrólisis. El pretratamiento debe cumplir los siguientes requisitos: mejorar la liberación de azúcares durante el mismo o en la posterior hidrólisis enzimática; evitar la degradación o pérdida de hidratos de carbono; evitar la formación de subproductos inhibidores de las posteriores etapas de hidrólisis y fermentación; y finalmente, ajustarse a la rentabilidad (Sun y col., 2002). Existen distintos métodos para llevar a cabo el pretratamiento, que se pueden clasificar en químicos, aquellos en los que se emplean ácidos, bases o solventes para la modificación estructural de la lignocelulosa; físicos, donde se incluye la molienda, presión y temperatura para la disminución del tamaño de partícula y aumento del área accesible; físico-químicos donde se combinan cambios de temperatura y presión con el uso de ácidos o bases (la explosión de vapor es el más utilizado); o biológicos en los que se aprovechan las enzimas lignolíticas de algunos microorganismos, principalmente hongos basidiomicetos, para la eliminación de la lignina que resulta el componente más difícil de degradar, siendo este método el menos agresivo y de menor coste energético, pero también el menos controlable (Dong 2013). El tipo de material lignocelulósico así como las características del pretratamiento utilizado condicionan las propiedades del material, variando la accesibilidad de la celulosa, el grado de polimerización y su composición, lo que puede influir en la formulación del cóctel enzimático y la dosis del mismo para una óptima degradación de la biomasa. ! ! II. Hidrólisis enzimática. Tras el pretratamiento el siguiente paso es la conversión de la celulosa y hemicelulosa a monómeros de hexosas y pentosas mediante la acción combinada de celulasas, hemicelulasas y enzimas auxiliares. Teniendo en cuenta la complejidad y variabilidad de los materiales, para llevar a cabo la completa degradación de los polímeros ha de haber una combinación óptima de las distintas actividades enzimáticas en función del material y del pretratamiento utilizados. En la naturaleza esta función ha sido desarrollada por diferentes microorganismos que utilizan materia lignocelulósica como fuente de carbono. Desde bacterias anaeróbicas presentes en el rumen y tracto intestinal de los animales herbívoros e insectos como escarabajos y termitas, bacterias aerobias presentes en aguas residuales hasta hongos basidiomicetos de la podredumbre blanca u hongos filamentosos (Martínez y col., 2008), existe una gran variedad de organismos con capacidad de producir enzimas hidrolíticas que pueden ser utilizados en la industria para llevar a cabo la hidrólisis de los polímeros de celulosa y hemicelulosa. Para ello se han de fijar unas condiciones de proceso en las que las enzimas puedan actuar eficientemente, que suele ser en el rango de 45º-55ºC y pH 4.8-5.8. Estas condiciones de temperatura favorecen la solubilización de los componentes de la lignocelulosa ya que disminuyen la viscosidad de la biomasa y así facilitan la licuefacción. Para incrementar las concentraciones de etanol al final del proceso, la hidrólisis se suele llevar a cabo ! ! ! ! Introducción ! ! ! 17 a altas concentraciones de sólidos totales entre 15-22% durante 24-80h (Chen y col., 2016). La sacarificación o hidrólisis enzimática ha sido durante muchos años la principal limitación para la rentabilidad del proceso de obtención del bioetanol lignocelulósico, existiendo factores limitantes tanto a nivel de sustrato como de la enzima. Entre los factores limitantes dependientes del sustrato, podemos contar la cristalinidad de la celulosa, el grado de polimerización, la superficie disponible, el porcentaje de humedad y el contenido de lignina (Hendriks y col., 2009). Como factores limitantes dependientes de los mecanismos de acción de las enzimas se encuentran la desnaturalización o estabilidad de las propias enzimas, las uniones inespecíficas y la inhibición por producto o por otros compuestos presentes en la hidrólisis. Debido a que la cantidad de enzimas necesaria para la hidrólisis impacta muy significativamente en el coste final del etanol, se están realizando en la actualidad grandes esfuerzos enfocados en la mejora enzimática, teniendo como objetivo económico lograr una contribución de la enzima al coste del bioetanol lignocelulósico de 40 centavos de dólar por galón (Tao y col. 2014). III. Fermentación. Los monosacáridos obtenidos de la hidrólisis enzimática de la lignocelulosa se transforman en etanol por fermentación alcohólica mediada por cepas industriales de la levadura Saccharomyces cerevisiae. En el caso de las hexosas, la levadura incorpora la glucosa del medio y la convierte en piruvato a través de la glucolisis. Este piruvato es llevado a acetaldehído y este a su vez a etanol gracias a la acción catalítica secuencial de la enzima piruvato descarboxilasa y la enzima alcohol deshidrogenasa (Figura 1.4). Figura 1.4 Fermentación alcohólica de la glucosa. La utilización industrial de la levadura S. cerevisiae para la producción de bioetanol se ve beneficiada por los altos niveles de producción que alcanza así como su tolerancia al etanol y a los productos inhibitorios presentes en la biomasa, además de crecer bien a pH relativamente bajos lo que protege el proceso de la contaminación por bacterias. Sin embargo está limitado a la fermentación de glucosa, ya que S. cerevisiae no es capaz de metabolizar la xilosa, que representa en torno al 40% de los azúcares resultantes de la Glucosa Piruvato Acetaldehido Etanol Alcoholdeshidrogenasa Piruvato - descarboxilasa Glucolisis ! ! ! ! Introducción ! ! ! 18 hidrólisis de la lignocelulosa. Para aprovechar la xilosa liberada se están generando cepas modificadas genéticamente para conseguir fermentar este azúcar. En la naturaleza existen dos rutas metabólicas para la incorporación de la xilosa. La primera se da en algunas especies de levaduras, donde ésta pentosa se reduce a xilitol mediante la xilosa reductasa (XR), tras lo cual el xilitol es oxidado a 5-xilulosa por la xilitol deshidrogenasa (XDH). La xilulosa es fosforilada por la xilulokinasa (XK), y entra en la ruta de las pentosas fosfato y la glucolisis para finalmente ser fermentada a etanol. En la segunda ruta metabólica, presente en bacterias y algunos hongos, la asimilación de la xilosa es llevada a cabo por la xilosa isomerasa (XI) que cataliza la conversión de xilosa en xilulosa en un único paso. A continuación seguiría la misma ruta que en levaduras. En los últimos años se han construido distintas cepas de S. cerevisiae expresando genes para estas rutas con el fin de mantener el potencial fermentativo de la levadura tradicional. Una de las estrategias ha sido la expresión heteróloga de los genes que codifican para XR y XDH, para la cual los genes más utilizados han sido los de la levadura Scheffersomyces stipitis. Otra de la estrategias ha sido la introducción del gen que codifica para la XI de organismos como el hongo anaerobio Piromyces sp E2 o la bacteria Clostridium phytofermentans. De manera paralela se ha realizado la sobreexpresión de la XK endógena y de transportadores de azúcares (Moysés y col., 2016). Aunque existen levaduras naturales que pueden llevar a cabo la fermentación tanto de glucosa como de xilosa a etanol, estas levaduras poseen una serie de limitaciones para su utilización industrial en la conversión de los azúcares procedentes de biomasa lignocelulósica a etanol. Estas limitaciones son principalmente, la baja eficiencia fermentativa en presencia de inhibidores liberados durante el pretratamiento como los furfurales, la baja tolerancia al etanol y la represión por glucosa, que lleva a que la fermentación de las pentosas se retrase hasta que se hayan consumido la glucosa de forma que para cuando se inicia la conversión de la xilosa, los niveles de etanol son demasiado altos e inhiben el proceso. Actualmente se trabaja en la modificación genética de algunas de estas cepas de levaduras naturales que fermentan conjuntamente hexosas y pentosas, como Pachysolen tannophilus, Scheffersomyces (Candida) shehatae, Scheffersomyces (Pichia) stipitis, y Spathaspora Passalidarum, para mejorar la tolerancia a inhibidores, la producción de etanol así como la desrepresión por glucosa (Harner y col., 2015). De igual manera que con la xilosa, se está trabajando en la modificación genética de cepas industriales para la fermentación de otros azúcares como la arabinosa, presente en torno a un 5% tras la hidrólisis de la biomasa lignocelulósica (Zhang y col., 2015) IV. Destilación. Tras la fermentación se ha de recuperar el etanol del mosto ! ! ! ! Introducción ! ! ! 19 fermentado, para lo cual se precisa de columnas de destilación, en donde se separa una mezcla de alcohol/agua de una suspensión acuosa de sólidos que se retira por el fondo. A través de los métodos convencionales de destilación es posible obtener etanol con concentraciones cercanas a la composición azeotrópica (96% en peso); sin embargo, para que el etanol pueda ser mezclado con la gasolina es necesario que su contenido de agua sea muy bajo, con el fin de evitar la formación de dos fases líquidas en la mezcla. La primera alternativa puesta en consideración para superar el punto azeotrópico consiste en modificar las condiciones de operación de la destilación, las cuales abarcan desde la aplicación de alto vacío hasta la adición de solvente; dichas modificaciones varían los coeficientes de actividad de la mezcla. Posteriores a las técnicas de destilación, que involucran operaciones líquido-vapor, se han introducido otras que utilizan los principios de adsorción y permeación: entre ellas se destacan la utilización de zeolitas y membranas de pervaporación, y como propuestas alternas se encuentran los procesos híbridos que combinan diferentes técnicas y procesos. Estos procesos alcanzan una pureza de 99,5% de etanol (Frolkova y col. 2010) . ! 1.4 Organismos degradadores de lignocelulosa Las celulasas son enzimas sintetizadas por una gran diversidad de organismos entre los que se incluyen hongos y bacterias. La función de estas enzimas en la naturaleza ha sido el uso del material celulósico como fuente de carbono. Estas enzimas pueden ser inducibles por el crecimiento de microorganismos en materiales celulósicos. Entre los principales géneros estudiados para la producción de celulasas se encuentran Clostridium, Cellulomonas, Thermomonospora, Trichoderma y Aspergillus (Kuhad y col., 2011, H.M. Hassan y col., 2016). Sin embargo, de todos los organismos degradadores de celulosa, los hongos filamentosos son los responsables de la vasta mayoría de la degradación de biomasa en la naturaleza. Los hongos han colonizado distintos ambientes desde terrestres hasta marinos y son de vital importancia para el reciclaje del carbono en la Tierra, una capacidad con implicaciones ecológicas, bioquímicas, agrónomas y recientemente como aplicación industrial. El uso de estos microorganismos en la industria es debido a que pueden llegar a producir una batería de enzimas con altos niveles de producción y eficiencia catalítica que secretan al medio de cultivo, facilitando su recuperación para los distintos usos industriales. Cabe destacar las especie Trichoderma reesei, en concreto el mutante supersecretor RUT-C30 (ATCC 56765), como uno de los hongos filamentosos más utilizados para la producción de enzimas celulolíticas y proteínas recombinantes, así como para la investigación académica, que puede llegar a producir 40 g/L de proteína (Peterson y col., 2012). Existen en el mercado cócteles enzimáticos basados en la modificación genética de T. reesei como Cellic® CTec2 de la empresa Novozymes (http://www.novozymes.com). ! ! ! ! Introducción ! ! ! 20 Las especies Aspergillus fumigatus y Aspergillus niger, así como otros hongos del género Aspergillus, han sido utilizados ampliamente en la industria por el gran número de genes que codifican para celulasas, hemicelulasas y pectinasas, cobrando mayor importancia las dos últimas (Sherief y col., 2010, De Souza 2013, De Vries y col., 2001). Existen además preparados comerciales de β-glucosidasa de A. niger que se han convertido en el estándar de este tipo de enzimas. Por otro lado en los últimos años el género Penicillium se ha posicionado como uno de los géneros más adecuados para la producción de celulasas de manera industrial. Cepas como Penicillium brasilianum o Penicillium janthinellum cuentan con una alta expresión de β-glucosidasa y celobiohidrolasa tipo 1, llevando a cabo la hidrólisis de la celulosa a unos niveles comparables a los de T. reesei. Conjuntamente, sus enzimas cuentan con una baja afinidad por la lignina, lo que se traduce en una menor inhibición por uniones inespecíficas con este polímero (Marjamaa y col., 2013). 1.4.1 Myceliohpthora thermophila Myceliophthora thermophila es un hongo termófilo descomponedor de restos vegetales, en cuyo genoma están identificados más de 200 genes que codifican para celulasas, hemicelulasas y enzimas accesorias para la degradación de la pared celular de las plantas, repartidos en 7 cromosomas (Tabla 1.2). Se diferencia de otras especies de hongos industriales como T. reesei o A. niger, por la presencia en el genoma de un elevado número de enzimas polisacáridos monooxigenasas (PMO), previamente conocidas como GH61 (Karnaouri y col., 2014). A partir de un aislado de este organismo, inicialmente clasificado como Chrysosporium lucknowense C1, la empresa americana Dyadic International Inc. construyó la plataforma de expresión Myceliophthora thermophila C1, para la producción de enzimas y otras proteínas de interés industrial. Esta plataforma fue desarrollada desde la década de 1990 por mutagénesis al azar inducida por UV y agentes mutagénicos como la nitrosoguanidina, generando una cepa supersecretora (Visser y col., 2011). Con las sucesivas mutagénesis la cepa C1 adquirió adicionalmente un beneficioso fenotipo: una viscosidad del cultivo líquido hasta 50 veces inferior a la cepa parental. Los desarrollos iniciales se enfocaron a la producción de celulasas de aplicación en industria textil aunque dada la capacidad de secreción del organismo, posteriormente se aplicó a otros productos o procesos como la producción de bioetanol. ! ! ! ! Introducción ! ! ! 21 Tabla 1.2. Número de genes que codifican para enzimas degradadoras de las paredes vegetales presentes en el genoma de M. thermophila C1. Las ventajas que ofrece M. thermophila C1 para su uso industrial como productor de enzimas celulolíticas son importantes. Se alcanzan altos niveles de producción superiores a 100 g/L de los que entre un 60-80% son celulasas. Posee una baja viscosidad que permite una mejor mezcla y transferencia de oxígeno y nutrientes, es fácilmente escalable para el manejo industrial. Las condiciones de fermentación de esta cepa son versátiles y económicas, pudiendo crecer en un rango de pH de 4,5 a 8,8 y a una temperatura de 25 a 44ºC y utilizar los nutrientes habituales en la fermentación a gran escala. Se dispone de numerosas herramientas genéticas para la modificación de este microorganismo, desde promotores constitutivos e inducibles a distintos marcadores de selección. En concreto la selección de los transformantes se basa en la complementación de la auxotrofía para la síntesis de uridina por la introducción de casetes de expresión que codifican para la orotato-fosforribosil transferasa (pyr5) o la orotidina-5’-fosfato descarboxilasa (pyr4) en las correspondientes cepas auxótrofas de M. thermophila C1. Tiene una alta eficiencia en transformación y la integración en el genoma es estable. El tipo de transformación más usada en este organismo es la transformación de los protoplastos mediada por polietilenglicol. Otra de las ventajas que existen para trabajar con M. thermophila C1 es que su genoma se encuentra secuenciado y anotado (Joint Genome Institute, University of California, http:// genome.jgi-psf.org; Berka y col. 2011). La secuencia de aminoácidos de las glicosil hidrolasas de este hongo demuestran una alta similitud (entre un 70- 85%) con las enzimas de Chaetomium spp., Humicola spp., Neurospora crassa, mientras que presentan menos similitud con las enzimas de los géneros Trichoderma, Aspergillus, Phanerochaete. Actividad Número de genes en Myceliophthora thermophila C1 β-glucosidasa 7 endoglucanasa + celobiohidrolasa 13 polisacarido monooxigenasa 26 Celobiosa deshidrogenasa 9 β-xilosidasa 5 xilanasa 13 arabinoxilano hidrolasas 7 esterasas 13 α-glucuronidasa 2 arabinasas + arabinofuranosidasas 7 ! ! ! ! Introducción ! ! ! 22 Figura 1.5 (A) Hifas de M. thermophila al microscopio. Tomada de Joint Genome Institute. (B) SDS-PAGE del caldo extracelular industrial de M. thermophila C1. Actualmente la cepa industrial de M. thermophila C1 ha sufrido una serie de modificaciones genéticas para la eficiente conversión de biomasa lignocelulósica. La sobreexpresión de una β-glucosidasa endógena, de distintas polisacáridos monooxigenasas o la delección de genes que codifican para actividades perjudiciales o enzimas improductivas son algunas de estas modificaciones. El caldo industrial secretado por M. thermophila C1 se compone principalmente de endoglucanasas, polisacárido monooxigenasas, celobiohidrolasas y β-glucosidasas en proporciones optimizadas. La acción conjunta y sinérgica de estas enzimas dan lugar a la hidrólisis eficiente de biomasa lignocelulósica alcanzando elevados niveles de conversión de glucano a etanol. 1.5 Celulasas La degradación de la celulosa hasta glucosa es llevada a cabo por la acción conjunta de las llamadas celulasas y la β-glucosidasa. En primer lugar las endoglucanasas (EG) hidrolizan los enlaces glucosídicos β(1,4) de zonas internas de la cadena de celulosa generando nuevos sitios de unión para la acción de las celobiohidrolasas o exoglucanasas (CBH). Éstas son enzimas procesivas que comienzan la degradación desde un extremo de la cadena liberando oligómeros de glucosa, mayoritariamente el disacárido celobiosa. Por último actúa la β-glucosidasa (BGL) que hidroliza los dímeros de celobiosa o pequeños oligómeros de glucosa, obteniendo como producto final el monómero de glucosa. Existen enzimas auxiliares que ayudan a la degradación de la celulosa, como es el caso de las polisacárido monooxigenasas (PMO) que producen cortes oxidativos en las cadenas de celulosa. Las celulasas pueden ser proteínas solubles secretadas de manera individual como en el caso de los hongos, o pueden formar un complejo multienzimático asociado a la célula, como en el caso de bacterias anaeróbicas. En este complejo, que recibe el nombre de celulosoma, una proteína no catalítica sirve de andamio o anclaje !! 116 96 66 45 31 21 A B FE-118&G11 FE-134&A10 FE-140&A12 kDa M54&h 81&h 98&h 119&h 143&h 143&h&clarif 119&h 119&h 141&h 116 97 66 45 31 21 34 56 68 82 92 96 65 63 85,5 Protein&(g/kg) FE-142&A13(1D9) FE-118&G11 FE-134&A10 FE-140&A12 kDa M54&h 81&h 98&h 119&h 143&h 143&h&clarif 119&h 119&h 141&h 116 97 66 45 31 21 34 56 68 82 92 96 65 63 85,5 Protein&(g/kg) FE-142&A13(1D9) BGL! CBH!I! EG! CBH!II! PMO! PMO! ! ! ! ! Introducción ! ! ! 23 a varias subunidades enzimáticas mediante interacciones proteína-proteína de tipo cohesina-dockerina (Lynd y col., 2002). Debido al mayor interés industrial que poseen las enzimas solubles secretadas, en los próximos apartados nos centraremos en este tipo de celulasas. Estructuralmente las celulasas se componen de un dominio catalítico y un dominio de unión a carbohidratos (CBD) conectados por un péptido de unión flexible o linker rico en serina, treonina y prolina. El CBD facilita la unión específica y adsorción de la enzima a los polímeros de celulosa, ya que tiene afinidad por ésta debido a que en su superficie se encuentran residuos aromáticos que le proporcionan carácter hidrofóbico (Martínez-Anaya y col., 2008). Esta cualidad permite que se incremente la concentración de enzimas en la superficie de los polímeros. Se ha descrito que la presencia del CBD mejora la acción catalítica de las celulasas en celulosa cristalina mientras que no afecta la actividad en celulosa amorfa o sustratos solubles (Le Costaouëc y col., 2013). Los CBDs pueden tener desde 30 a 200 aminoácidos y se clasifican según su secuencia. Los CBDs de celulasas fúngicas pertenecen a la familia 1. Sin embargo, existen celulasas que carecen de CBD. Existen dos mecanismos de acción para estas enzimas, dependiendo de la familia a la que pertenezcan: retención o inversión. La hidrólisis del enlace glucosídico mediante el mecanismo de retención ocurre en dos etapas en la que están implicados dos residuos del sitio activo de la enzima. En la primera etapa (glicosilación) se produce un intermediario entre el grupo carboxilo de un residuo de la enzima y el glucósido. En el segundo paso (desglicosilación) el grupo carboxilo del otro residuo se une a una molécula de agua que dirige el ataque nucleofílico para hidrolizar el complejo intermediario, dando el producto hidrolizado y restableciendo la enzima a su estado catalítico inicial (Withers 2001). Este mecanismo es utilizado para la hidrólisis del enlace glucosídico por endoglucanasas o celobiohidrolasas de la familia GH7. En el caso del mecanismo de inversión tiene lugar en una sola etapa, mediante un proceso catalítico ácido-base. Uno de los dos residuos catalíticos opera como base, facilitando el ataque de una molécula de agua al carbono anomérico y el otro, como ácido, asistiendo la separación del oxígeno. El mecanismo de inversión es utilizado por celobiohidrolasas de la familia GH6 entre otras. La celulasas son glicoproteínas de manera que las modificaciones postraduccionales más frecuentes en las celulasas es la glicosilación, restringiendo la N-glicosilación al sitio catalítico de la enzima y la O-glicosilación al péptido de unión, dejando el dominio de unión a carbohidratos libre de modificaciones postraduccionales. En la N-glicosilación un oligosacárido del tipo Glc3Man9GlcNAc2 se une a un residuos de asparragina suceptibles de ser glicosilados (Asn-X-Ser/Thr). En la O-glicosilación los azúcares se añaden al grupo hidroxilo –OH de residuos de serina y treonina. La glicosilación del péptido de unión, rico en serina, protege de la acción proteolítica de las serín proteasas evitando la separación del CBD del dominio catalítico. La glicosilación de las celulasas aporta multiplicidad, estabilidad y modifica la actividad de las enzimas (Juturu y col., 2014). Las enzimas son secretadas al medio completamente N-glicosiladas y O- glicosiladas sufriendo un proceso de triming o eliminación de azúcares en el caldo de ! ! ! ! Introducción ! ! ! 24 cultivo. La modificación postsecretorial de estas proteínas es debida a actividades extracelulares como α(1,2)-manosidasa, α(1,3)-glucosidasa y N- acetilglucosaminidasas en el caso de la N-glicosilación, encontrada en el sitio catalítico, mientras que para el linker O-glicosilado las fosfatasas y las manosidasas son las actividades principales responsables de la modificación (Stals y col., 2004). El patrón de glicosilación encontrado en las distintas proteínas es dependiente de las condiciones de cultivo, afectado por la fuente de carbono y/o nitrógeno o el pH. 1.5.1 Endoglucanasas La actividad catalítica de las enzimas endoglucanasas (EC 3.2.1.4) es la hidrólisis de los enlaces glucosídicos β(1,4) internos de los polímeros de celulosa, de manera aleatoria. Pueden pertenecer a diversas familias de las glicosil hidrolasas como GH 5, 6, 7, 9, 12 y 45. Dependiendo de la familia que pertenezcan tienen una mayor especificidad por unos sustratos u otros. Mientras las enzimas de la familia GH7 son capaces de hidrolizar sustratos de pequeño tamaño como el pNPC (paranitrofenil celobiósido), el resto de familias no muestra actividad sobre estos sustratos. En general tienen mayor afinidad por las regiones amorfas del polímero de celulosa, como se demuestra por una alta actividad frente a sustratos como carboximetil celulosa o PASC (celulosa amorfa tratada con ácido fosfórico), y prácticamente una actividad nula para sustratos como Avicel (celulosa cristalina) (Vlasenko y col., 2010). La hidrólisis del enlace glucosídico ocurre mediante un mecanismo de retención. Gran parte de las endoglucanasas fúngicas descritas pertenecen a la familia GH5, familia que incorpora además enzimas con actividad 1,6-galactanasa, 1,3-mananasa, 1,4- xilanasa y actividad xiloglucanasa. Generalmente no son enzimas procesivas, aunque algunas endoglucanasas bacterianas muestran una moderada acción procesiva, teniendo un mecanismo distinto a las celobiohidrolasas (Payne y col., 2015). Su inhibidor principal es la celobiosa aunque se ha descrito que algunas endoglucanasas se ven inhibidas por glucosa. Debido a la complejidad de la composición del hidrolizado del material lignocelulósico pretratado, con multitud de azúcares con diversos grados de polimerización así como derivados de lignina y acetato, diferentes compuestos pueden actuar como inhibidores de forma cooperativa de forma que el efecto del conjunto es mayor que la suma de los efectos individuales. La masa molecular de estas enzimas oscila entre 22-50 kDa. Estructuralmente suelen constar de un dominio catalítico, conectado por un péptido de unión a un dominio de unión a carbohidratos (CBD) de hasta 5 kDa, pudiendo ser separado por proteólisis con papaína (Uzcategui y col., 1991a). Existen también algunas endoglucanasas de menos tamaño que no poseen CBD (Henriksson y col., 1999). La glicosilación es la modificación postraduccional más representada en las endoglucanasas. Gusakov (2008) demostró que uno de cada tres residuos de asparragina susceptibles de ser N-glicosilados en la enzima Eg2 de M. thermophila, resultaba estar ocupado. Además demostró que esta enzima presentaba una ! ! ! ! Introducción ! ! ! 25 glicosilación variable, lo que significa que el mismo residuo puede tener diferentes longitudes del oligosacárido, dando lugar a distintos patrones de glicosilación. 1.5.2 Celobiohidrolasas I y II Las enzimas celobiohidrolasas son enzimas hidrolíticas que cortan los enlaces de β(1,4) del glucano de forma procesiva partiendo de extremos libres de las cadenas de celulosa. Su principal producto es la celobiosa, pudiendo liberar también pequeños oligómeros de glucosa. Mientras que las endoglucanasas actúan sobre las regiones amorfas de la celulosa, las celobiohidrolasas llevan a cabo la hidrólisis de las zonas más cristalinas de los polímeros de celulosa. Son enzimas procesivas, lo que significa que efectúan varios eventos hidrolíticos en los polímeros de celulosa antes de disociarse de ella. Este proceso incluye al menos las etapas de adsorción a la zona cristalina de la celulosa, descristalización y apertura de las cadenas de celulosa, hidrólisis, expulsión del producto y desorción (Payne et al. 2015). La etapa limitante de la acción de las enzimas CBH en ausencia de enzimas sinérgicas es la disociación del sustrato, ya sea causada por obstáculos o regiones amorfas de celulosa. En presencia de enzimas sinérgicas la etapa limitante es la velocidad procesiva (los pasos de hidrólisis, expulsión del producto y el movimiento procesivo). Principalmente pertenecen a dos familias de glicosil hidrolasas, GH6 y GH7. Las celobiohidrolasas tipo I (EC 3.2.1.176), pertenecientes a la familia GH7, actúan sobre los extremos reductores de las cadenas de celulosa, mientras que las celobiohidrolasas tipo II (EC 3.2.1.91), de la familia GH6, actúan sobre los extremos no reductores, siendo así complementarias para la degradación eficiente de la celulosa. Además de esta diferencia, las enzimas celobiohidrolasas de la familia GH7 actúan mediante un mecanismo de retención, al igual que las endoglucanasas previamente descritas. En el caso de las enzimas pertenecientes a la familia GH6 el mecanismo de acción es por inversión. Son enzimas monoméricas con una masa molecular entre 50 y 65 kDa. Típicamente de estructura modular, constan de un dominio catalítico y un dominio de unión a carbohidratos (CBD) conectados por un péptido de unión. Los dos módulos pueden ser separados por la acción catalítica de la papaína, que libera un CBD de entre 4 y 5 kDa (Uzcategui y col., 1991b). Al igual que las endoglucanasas, su inhibidor principal es la celobiosa, su producto de reacción, pudiendo ser también inhibidas por glucosa. Otros componentes presentes en la hidrólisis de la biomasa lignocelulósica como compuestos fenólicos o altas concentraciones de acetato pueden ejercer un efecto inhibitorio sobre este tipo de enzimas. Las celobiohidrolasas son las celulasas más abundantes en la naturaleza. En el ! ! ! ! Introducción ! ! ! 32 termoestabilidad es una de las propiedades más estudiadas y modificadas por ingeniería genética, no existen reglas establecidas para incrementarla. En general se da por cambios acumulativos de las interacciones hidrofóbicas, electroestáticas y puentes de hidrógeno en la proteína (Viikari y col., 2012). Voutilainen y col., (2014) demostraron que la fusión de distintos CBDs al módulo catalítico de una celobiohidrolasa GH7 dio lugar a una proteína quimérica con mayor termoestabilidad y temperaturas de desnaturalización más altas. Por otro lado Anbar y col., (2010) incrementaron la termoestabilidad de una endoglucanasa, CtCel8A, en 7ºC mediante la sustitución de un único residuo de serina por glicina, al igual que Akcapinar y col., (2015) que con métodos computacionales y mutagénesis dirigida aumentaron la termoestabilidad de la endoglucanasa I de Trichoderma reseei. La glucosa es el producto final de la hidrólisis de la celulosa. Éste monómero es el principal inhibidor de la β-glucosidasa, por lo que su presencia a altas concentraciones en la hidrólisis reduce la capacidad de la enzima de hidrolizar la celobiosa. A su vez, este dímero es inhibidor de las celobiohidrolasas y endoglucanasa, por lo que la sacarificación se ve considerablemente ralentizada. Además, también está descrito que los productos de la degradación de la hemicelulosa pueden inhibir a las celulasas (Bezerra y col., 2005). Para eliminar el producto final y evitar la inhibición una de las técnicas es la sacarificación y fermentación simultáneas (SSF), en la que la glucosa que va siendo liberada es fermentada a etanol. Modificando las constantes de inhibición de las celulasas mediante mutación de distintos residuos se pueden conseguir enzimas resistentes a los productos finales (Lavigne y col., 2011). La presencia de lignina en la biomasa lignocelulósica es uno de los mayores inconvenientes a los que se enfrentan las enzimas en la hidrólisis enzimática. Además de suponer un obstáculo para la acción de las enzimas, las celulasas y hemicelulasas se unen de manera inespecífica a la lignina por interacciones hidrofóbicas (Rahikainen y col., 2013). La adición de agentes surfactantes como el Tween 20 o polietilenglicol evitan las uniones inespecíficas mejorando la hidrólisis entre un 20-50% (Börjesson y col., 2007). Como alternativa, la búsqueda de enzimas que se vean menos afectadas por la interacción con la lignina puede mejorar el rendimiento de la hidrólisis así como la mutagénesis dirigida del CBD para aumentar la afinidad por la celulosa frente a la lignina (Strobel y col., 2015). ! Una manera de reducir la cantidad de enzima requerida es la formulación de cócteles enzimáticos más eficientes específicos para cada tipo de sustrato. La determinación de las enzimas principales y la variación de las proporciones de éstas pueden ayudar a formular cócteles más eficaces en la degradación de materiales lignocelulósicos (Gusakov y col., 2005, Viikari y col., 2012). De igual manera, la adición de enzimas accesorias, como xilanasas o xiloglucanasas, que actúan de manera sinérgica con las celulasas, mejora la hidrólisis del material lignocelulósico. Sin embargo, son altamente dependientes de la composición del sustrato (Hu y col., 2013). Otro tipo de enzimas accesorias son las expansinas, proteínas que inducen la relajación de las paredes celulares de las plantas mediante la ruptura de los puentes de hidrógeno que unen las fibras de celulosa y/o la celulosa con otros polisacáridos ! ! ! ! Introducción ! ! ! 33 mediante un proceso no hidrolítico. La adición de proteínas con este tipo de actividad puede reducir la dosis de las celulasas necesarias para la degradación de la celulosa (Kim y col., 2009). ! Utilizando otro enfoque, otros investigadores industriales sugieren el reciclado de enzimas para disminuir el consumo de la proteína. En condiciones de proceso industrial (alta temperatura y sólidos totales elevados) se puede llegar a recuperar hasta un 25% del total de la enzima empleada, pudiendo utilizarse para hidrolizar nueva biomasa lignocelulósica (Lindedem y col., 2013). ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! 34 ! ! ! ! ! 35 ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! 2 OBJETIVOS ! ! ! ! ! ! 36 ! ! ! ! Objetivos ! ! ! 37 El presente trabajo de tesis doctoral se encuentra estructurado dentro de dos proyectos de investigación. El primer bloque se encuentra enmarcado dentro del proyecto “Optimización del proceso de obtención de etanol a partir de biomasa” cuyo objetivo general es la mejora del proceso de hidrólisis enzimática mediada por el hongo filamentoso Myceliophthora thermophila C1. En el desarrollo de esta tesis se plantean dos objetivos particulares para la guía de la mejora del cóctel enzimático: 4 Purificación y caracterización de las principales enzimas celulolíticas del hongo filamentoso Myceliophthora thermophila implicadas en la degradación de la lignocelulosa. 5 Realización de pruebas funcionales en la que se enfrenten las principales enzimas purificadas en una hidrólisis de biomasa lignocelulósica, para evaluar la implicación de cada una de ellas en el proceso. El segundo bloque del trabajo de esta tesis se encuentra enmarcado en el proyecto de investigación “Enzyme discovery”, cuyo objetivo general es el descubrimiento de nuevas enzimas que mejoren la degradación de la lignocelulosa. Debido que caldo secretado de M. thermophila C1 es deficitario en actividad βxilosidasa, se plantea la mejora de la hidrólisis de la hemicelulosa mediante dos objetivos: 6 Escrutinio de enzimas β-xilosidasa de hongos celulolíticos y caracterización. 7 Expresión del gen codificante para una enzima con actividad β-xilosidasa de elección en la plataforma M. thermophila C1. ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! 38 ! ! ! ! ! ! 39 ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! 3 MATERIALES Y MÉTODOS ! ! ! ! 40 ! ! ! ! ! ! Materiales y Métodos ! ! ! 41 3.1 Materiales 3.1.1 Biomasa lignocelulósica La biomasa lignocelulósica utilizada para las hidrólisis enzimáticas fue rastrojo de maíz (Pretreated Corn Stover, PCS) facilitado por la planta piloto de ABN de York (Nebraska, USA) pretratado con 1% de H2SO4 y explosión de vapor. La composición de dicho material se refleja en la Tabla 3.1. Tabla 3.1 Composición de la biomasa lignocelulósica empleada en las hidrólisis enzimáticas 3.1.2 Cepas - NEB® 5-alpha Competent E. coli (High Efficiency). La cepa utilizada para la clonación de el gen bxl 20.17 fue E.coli DH5α cuyo genotipo es fhuA2 Δ(argF- lacZ)U169 phoA glnV44 Φ80 Δ(lacZ)M15 gyrA96 recA1 relA1 endA1 thi-1 hsdR1. - Myceliophthora thermophila C1. Es la cepa supersecretora de M. thermophila proveniente de la cepa UV 18-25. Esta capacidad se adquierió a través de mutagénesis al azar inducida por UV y agentes mutagénicos como la nitrosoguanidina (Punt y col., 2010). La cepa industrial utilizada en el presente trabajo ha sufrido la sobreexpresión de una β-glucosidasa endógena, de distintas polisacáridos monooxigenasas y la delección de genes que codifican para actividades perjudiciales o enzimas improductivas. Componente Rastrojo de maíz pretratado (%) Glucano 35,82 Xilano 5,33 Galactano 0,78 Arabinano 0,72 Manano 0,55 Lignina 21,05 Cenizas 5,90 Acetato 0,83 Sólidos Solubles 21,09 ! ! ! ! Materiales y Métodos ! ! ! 48 5,0. La reacción se incubó durante 10 minutos, y posteriormente se paró con 1000 µL de solución precipitante (80% etanol, 40 g/L de acetato sódico, 4 g/L de acetato de zinc). Tras la parada se dejó precipitar a temperatura ambiente durante 10 minutos y se centrifugó a 3000 x g durante 10 minutos. Se midió absorbancia del sobrenadante a 590nm en un espectrofotómetro marca “Termo Scientific” modelo “Genesys 6”. Para el blanco se procedió de la misma manera sustituyendo la muestra por tampón de ensayo. Todos los ensayos se realizaron por duplicado. El cálculo de actividad se realizó mediante una recta de regresión con celulasa de Aspergillus niger comercial a 50ºC y pH 5,0 (Sigma Aldrich- 22178). Actividad EG Azo-CMC (U/mL) = (-0,1242x2 + 0,2933x) * FD Donde: x = absorbancia medida a 590 nm restando la absorbancia del blanco. FD = factor de dilución de la enzima utilizado en el ensayo. Para expresar la actividad específica (U/g) se dividió por la concentración de proteína de la muestra. 3.2.1.6 Medida de la actividad β-xilosidasa La cuantificación de la actividad beta-xilosidasa (BXL) con sustrato análogo se determinó mediante la formación de p-nitrofenol a partir de p-nitrofenil β-D- xilopiranósido (pNXP, Calbiochem 487870), por medio de la modificación del protocolo establecido por Berghem y col. (1974). Para ello se diluyeron las muestras en el tampón de ensayo, acetato sódico 200 mM pH 5,0, 10 veces o hasta llegar a la zona lineal del ensayo (comprendida entre 0,1-1 UA). El ensayo se llevó a cabo en tubos de 1,5 mL. Se usó un volumen de 250 µL de enzima atemperándose a 50 ºC durante aproximadamente 5 min en un termobloque “Eppendorf” modelo “Thermomixer Comfort”. La muestra se mezcló con 250 µL de pNXP a 0,2 g/L de manera que la concentración de sustrato en el ensayo es 0,1 g/L. Se incubó la mezcla durante 10 min exactos a 50ºC tras lo cual se paró la reacción con 500 µL de carbonato sódico 1M, de manera que el p-nitrofenol liberado viró a amarillo por el cambio de pH permitiendo la cuantificación de la formación de este compuesto. Se midió la absorbancia a 410 nm en un espectrofotómetro marca “Termo Scientific” modelo “Genesys 6”. Para el blanco se procedió de la misma manera sustituyendo la muestra por tampón de ensayo. Todos los ensayos se realizaron por triplicado. ! ! ! ! Materiales y Métodos ! ! ! 49 Para el cálculo de la actividad se aplicó la siguiente formula:! 𝐴𝑐𝑡𝑖𝑣𝑖𝑑𝑎𝑑 𝛽−𝑥𝑖𝑙𝑜𝑠𝑖𝑑𝑎𝑠𝑎 (𝑈/𝑚𝐿)=(𝐴𝑏𝑠 −𝐵𝐶)×1000×𝑉𝑓×𝐹𝐷 ε×𝑉𝑒×𝑙×𝑡 Dónde: Abs-BC = absorbancia corregida para el blanco a 410 nm. Vf = Volumen final del ensayo (µL). Ve= Volumen de enzima utilizado en el ensayo (µL). FD = factor de dilución de la enzima previa al ensayo. ε = coeficiente de extinción molar del nitrofenol a 410 nm (15200 M-1 cm-1). l = paso de luz. En el ensayo en microtubo viene dado por la anchura de la cubeta (1 cm). t = tiempo de ensayo en (min). Para expresar la actividad específica (U/g) se dividió por la concentración de proteína de la muestra. 3.2.2 Determinación de concentración de proteína 3.2.2.1 Determinación de concentración de proteína en muestras purificadas La determinación de la concentración de proteína de las distintas muestras purificadas se llevó a cabo mediante Pierce™ BCA Protein Assay Kit (Thermo Scientific™). Para ello se diluyeron las muestras en agua destilada hasta un rango comprendido entre 0,2 y 0,8 g/L de contenido de proteína para operar en el rango lineal del ensayo. A 50 µL de la dilución se añadieron 950 µL de reactivo BCA (preparado según instrucciones del fabricante) y se incubó a 37ºC durante 30 min en un termobloque “Eppendorf” modelo “Thermomixer Comfort”. Transcurrido este tiempo se leyó la absorbancia a 562 nm en un espectrofotómetro marca “Termo Scientific” modelo “Genesys 6”. Para el blanco se procedió de la misma manera sustituyendo la muestra por agua. Todos los ensayos se realizaron por duplicado. Para el cálculo del valor de concentración de proteína se utilizó una regresión a partir de un patrón de Gamma Globulina liofilizada (Bio-Rad, Ref. 500-0005) siguiendo las instrucciones del proveedor. ! ! ! ! Materiales y Métodos ! ! ! 50 3.2.2.2 Determinación de concentración de proteína en cócteles enzimáticos Para la determinación de la concentración de proteína en cócteles enzimáticos en primer lugar se aplicó Compat-Able™ Protein Assay Preparation Reagent Kit (Thermo Scientific™) para eliminar sales, detergentes, agentes reductores o cualquier tipo de impureza de la muestra que pueda hacer interferencia con el ensayo. Se diluyeron las muestras en agua destilada hasta un rango comprendido entre 0,2 y 0,8 g/L de contenido de proteína para operar en el rango lineal del ensayo y se tomaron 50 µL de estas diluciones a las que se añadió 500 µL del reactivo 1. Tras 5 min de incubación a temperatura ambiente se añadió el reactivo 2 y se centrifugó a 12000 x g durante 5 min. Se eliminó el sobrenadante por aspiración usando una bomba de vacío y se resuspendió la pella en 50 µL de agua destilada. Una vez completado este protocolo se procedió a aplicar Pierce™ BCA Protein Assay Kit (Thermo Scientific™) como se describe en el apartado 3.2.1. ! 3.2.3 Purificación de las principales celulasas de Myceliophthora thermophila C1 3.2.3.1 Clarificación Para la purificación de las distintas enzimas del cóctel secretado por M. thermophila C1 se partió de un caldo de fermentación con una concentración de proteína de 92 g/L. En primer lugar se llevó a cabo una clarificación consistente en una centrifugación a 16000 rpm (27760 x g) durante 40 min a 4ºC (Compact High Speed Refrigerated Centrifugate 6500 con rotor AG-506R, Kubota), una filtración mediante filtros de nylon de 0,45 µm (VWR) y una dilución al 30% v/v con tampón Tris-HCl 50 mM, pH 7,0. 3.2.3.2 Primer paso de purificación de las principales celulasas Tras la clarificación, 200 mL de muestra clarificada fueron aplicados a una columna de intercambio aniónico, Q-Sepharose Fast Flow High Scale-HS (GE Heatlcare), equilibrada con 6 volúmenes de columna de tampón Tris-HCl 50 mM pH 7,0 a una velocidad de flujo de 6 mL/min. Las proteínas unidas según su carga neta fueron eluidas mediante gradiente 0-1 M NaCl con tampón Tris-HCl 50 mM pH 7,0 y un a una velocidad de flujo de 10 mL/min. ! ! ! ! Materiales y Métodos ! ! ! 51 3.2.3.3 Purificación β-glucosidasa 1 (Bgl1) Para la purificación de la enzima Bgl1 del caldo secretado por M. thermophila C1, las fracciones resultantes del primer paso de purificación de las principales celulasas se ensayaron para la actividad BGL con el sustrato pNGP y se analizó el perfil proteico mediante gel SDS-PAGE. Se escogieron las fracciones que concentraban la actividad BGL, se juntaron y acondicionaron con sulfato amónico 1 M para la posterior cromatografía de interacción hidrofóbica en una columna HiLoad 26/10 Phenyl-Sepharose High Performance (GE Healthcare), equilibrada con 6 volúmenes de tampón fosfato sódico 100 mM pH 7,0 con 1 M de sulfato amónico a una velocidad de flujo de 6 mL/min. La proteína unida se eluyó en un gradiente de 1-0 M de sulfato amónico con tampón fosfato sódico 100 mM pH 7,0 a una velocidad de 6 mL/min. Se obtuvieron fracciones con alta pureza eletroforética de la enzima Bgl1 que se juntaron y aplicaron a una columna de desalado HiPrep 26/10 Desalting (GE Healthcare), equilibrada con 5 volúmenes de tampón fosfato sódico 100 mM pH 7,0 a una velocidad de flujo de 8 mL/min. La muestra final se concentró con centricones de 50 kDa (Vivaspin 20, Sartorius) y posteriormente se determinó la concentración de proteínas y las actividades celulolíticas principales. Finalmente la muestra se identificó por huella péptida por el Servicio de Análisis de Proteínas del Instituto de Bioquímica Vegetal y Fotosíntesis (Sevilla). 3.2.3.4 Celobiohidrolasa 1 (CbhIa) La purificación de la enzima Cbh1 del cóctel enzimático secretado por M. thermophila C1 se inició a partir de las fracciones procedentes del primer paso cromatográfico de intercambio aniónico de la purificación de las principales celulasas. Las fracciones fueron ensayadas para actividad CBH sobre Avicel y se analizó el perfil proteico mediante gel SDS-PAGE. Las fracciones que se escogieron para el siguiente paso de purificación tenían altos niveles de actividad celobiohidrolasa y un perfil proteico donde se incluía la enzima Cbh1 de forma mayoritaria. Éstas se juntaron y acondicionaron con sulfato amónico 1 M para posteriormente aplicarlas en una columna de interacción hidrofóbica, HiLoad 26/10 Phenyl-Sepharose High Performance (GE Healthcare), equilibrada con 6 volúmenes de tampón fosfato sódico 100 mM pH 7,0 con 1 M de sulfato amónico a una velocidad de flujo de 6 mL/min. La proteína unida se eluyó en un gradiente de 1-0 M de sulfato amónico con tampón fosfato sódico 100 mM pH 7,0 y, a una velocidad de flujo de 6 mL/min generando una serie de fracciones separadas en base a su interacción con los grupos hidrofóbico de la resina de la columna. Las fracciones obtenidas de la segunda etapa de purificación tenían actividad y perfil proteico similares en el que se encuentra la enzima Cbh1 con un alto grado de ! ! ! ! Materiales y Métodos ! ! ! 52 pureza electroforética. Estas fracciones se unieron y aplicaron en una columna HiPrep 26/10 Desalting (GE Healthcare) equilibrada con 5 volúmenes de tampón fosfato sódico 100 mM pH 7,0 a un flujo de 8 mL/min, para eliminar las sales que contiene la muestra. La muestra final se concentró con centricones de 30 kDa (Vivaspin 20, Sartorius) y posteriormente se determinó la concentración de proteínas y las actividades celulolíticas principales. Finalmente la muestra se identificó por huella péptida por el Servicio de Análisis de Proteínas del Instituto de Bioquímica Vegetal y Fotosíntesis (Sevilla). 3.2.3.5 Celobiohidrolasa 4 (CbhIIb) La purificación de la enzima Cbh4 del caldo secretado por M. thermophila C1 partió de la cromatografía de intercambio aniónico del primer paso de purificación de las celulasas principales (Apartado 3.2.3.2). Descartando aquellas fracciones donde se conocía que se encontraba la enzima Cbh1, se analizaron las fracciones resultantes mediante ensayo de actividad CBH sobre Avicel y SDS-PAGE. La actividad mayoritaria se encontró en las fracciones no retenidas por la columna, compuesta por aquellas proteínas que se encuentran cargadas positivamente de manera que no son retenidas por la columna. Las fracciones escogidas se unieron, se acondicionaron con sulfato amónico 1 M y se aplicaron a una columna de interacción hidrofóbica, HiLoad 26/10 Phenyl-Sepharose High Performance (GE Healthcare), equilibrada con 6 volúmenes de tampón fosfato sódico 100 mM pH 7,0 con 1 M de sulfato amónico a una velocidad de flujo de 6 mL/min. La proteína unida se eluyó en un gradiente de 1-0 M de sulfato amónico con tampón fosfato sódico 100 mM pH 7,0 a una velocidad de flujo de 6 mL/min. Se monitorizó la purificación analizando las fracciones resultantes mediante ensayo de actividad CBH con Avicel como sustrato y gel SDS-PAGE. De esta segunda etapa de purificación se obtuvieron fracciones enriquecidas en la enzima Cbh4 que, se juntaron y aplicaron en tres rondas consecutivas a una columna de exclusión molecular HiLoad 16/600 Superdex 75 pg previamente equilibrada con 8 volúmenes de tampón fosfato sódico 100 mM pH 7,0. Las proteínas se eluyeron a una velocidad de flujo 0,4 mL/min con tampón de equilibrado. Tras analizar las muestra por ensayo de actividad CBH con Avicel como sustrato y gel SDS-PAGE las fracciones que contenían la enzima Cbh4 pura, se unieron y se concentraron con centricones de 30 kDa (Vivaspin 20, Sartorius) para posteriormente determinar la concentración de proteína y las actividades celulolíticas principales. Finalmente la muestra se identificó por huella péptida por el Servicio de Análisis de Proteínas del Instituto de Bioquímica Vegetal y Fotosíntesis (Sevilla). ! ! ! ! Materiales y Métodos ! ! ! 53 3.2.3.6 Endoglucanasa 2 Para comenzar la purificación de Eg2 del caldo enzimático secretado por M. thermophila se parte del fraccionamiento inicial mediante cromatografía de intercambio aniónico (Apartado 3.2.3.2). Las fracciones se ensayaron en busca de actividad EG con sustrato Azo-CMC y se observó el perfil proteico mediante SDS-PAGE. El pico de actividad EG se encontró en las primeras fracciones de la zona no retenida de la columna de intercambio iónico. El siguiente paso de purificación y fue llevado a cabo mediante una cromatografía de interacción hidrofóbica. Para ello se acondicionaron las muestras con sulfato amónico 1M y se aplicaron a una columna HiLoad 26/10 Phenyl-Sepharose High Performance (GE Healthcare), equilibrada con 6 volúmenes de tampón fosfato sódico 100 mM pH 7,0 con 1 M de sulfato amónico a una velocidad de flujo de 6 mL/min. La proteína unida se eluyó en un gradiente de 1-0 M de sulfato amónico con tampón fosfato sódico 100 mM pH 7,0 a una velocidad de flujo de 6 mL/min. El pico correspondiente a las fracciones que concentraron la actividad EG mostraron en el gel una proteína con el tamaño de Eg2 (45 kDa). Estas fracciones se unieron, se concentraron y se llevó a cabo una cromatografía de exclusión molecular en cinco rondas consecutivas mediante el uso de una columna HiLoad 16/600 Superdex 75 pg, previamente equilibrada con 8 volúmenes de tampón fosfato sódico 100 mM pH 7,0. Las proteínas se eluyeron a una velocidad de flujo 0,5 mL/min con tampón de equilibrado. La purificación se siguió mediante ensayo de actividad con sustrato Azo-CMC a la vez que se analizó el perfil proteico mediante SDS-PAGE. Las fracciones que contenían la enzima Eg2 electroforéticamente pura se concentraron con centricones de 10 kDa (Vivaspin 20, Sartorius) para posteriormente determinar la concentración de proteína y las actividades celulolíticas principales. Finalmente la muestra se identificó por huella péptida por el Servicio de Análisis de Proteínas del Instituto de Bioquímica Vegetal y Fotosíntesis (Sevilla). 3.2.4 Electroforesis de proteínas 3.2.4.1 Electroforesis en condiciones desnaturalizantes (SDS-PAGE) La electroforesis en condiciones desnaturalizantes se realizó en geles de poliacrilamida 7,5% o 12% MiniProtean (4561023 y 4561043 BioRad) en presencia de SDS (250 mM Tris-HCl, 930 mM glicina, SDS 1%). Un total de 20 µg de muestra se mezclaron con tampón de carga 4X (0,5 M Tris-HCl pH 6.8, β-mercaptoetanol 5%, SDS 2%, glicerol 20% v/v, azul de bromofenol 0,02%) y se hirvió durante 5 min para la ! ! ! ! Materiales y Métodos ! ! ! 54 completa desnaturalización de las proteínas. Se cargaron 5 µL de marcador Broad- Range SDS-PAGE Standards (1610317 Biorad) mezclados con 5 µL del tampón de carga. La electroforesis se llevó a cabo en el sistema Mini-PROTEAN Tetra Cell (1658004 Biorad) con un amperaje de 20 mA por gel durante aproximadamente 50 minutos a temperatura ambiente. Tras la migración, la tinción se realizó sumergiendo el gel en una disolución de Coomassie Brilliant Blue 1%, etanol 20% y ácido acético glacial 10% durante 30 minutos en agitación suave. Para desteñir se utilizó una solución de decoloración con etanol 20% y ácido acético glacial 10% durante aproximadamente 2 horas hasta la completa visualización de las bandas. 3.2.4.2 Electroforesis bidimensional de proteínas Se llevó a cabo una electroforesis bidimensional de proteínas (2D) de las proteínas purificadas. Para ellos se escogió como primera dimensión un isoelectroenfoque donde las proteínas de separaron según su punto isoeléctrico, para a continuación llevar a cabo una segunda dimensión mediante una electroforesis en gel de poliacrilamida para separar dichas proteínas según su peso molecular. - Primera dimensión: Isoelectroenfoque (IEF) Con el objetivo de limpiar de impurezas, así como reducir el contenido en sales que pudiera afectar al IEF, las muestras se dializaron con tampón fosfato sódico 10 mM pH 7,0 y se concentraron con centricones de 10 kDa (Vivaspin 20, Sartorius). En el caso de las proteínas puras se cargaron 5 µg de proteína a 125 µL de tampón de rehidratación (Urea 8M, DTT 7,7 g/L, CHAPS 40 g/L, anfolitos BioLyte 3/10 100x, azul de bromofenol 0,002%). La mezcla se aplicó en una de las calles del sistema PROTEAN I12 IEF donde se colocó a continuación una tira ReadyStrip de IPG de 7cm con pH 3-10 (1632000, Biorad). Para evitar la evaporación se añadieron 4 mL de aceite mineral. El tamaño de poro de la acrilamida en la tira de IPG es muy pequeño en las fases tempranas de la rehidratación, lo que disminuye la eficiencia de la absorción de las proteínas de mayor peso molecular. Debido a que las muestras que aplicamos tienen proteínas de un tamaño comprendido entre los 45 y 100 kDa se optó por llevar a cabo una rehidratación de la tira activa, pasando un voltaje suave de 50 V durante 12h a temperatura ambiente, lo que favorece la absorción de las proteínas de mayor peso molecular. A continuación se comenzó el IEF donde se escogió el protocolo 7 cm pH 3–10 G detallado en la Tabla 3.2 por ser el protocolo optimizado por el fabricante para la entrada de la muestra en la tira. ! ! ! ! Materiales y Métodos ! ! ! 55 Tabla 3.2 Protocolo de IEF para la electroforesis bidimensional de proteínas - Equilibrado de tiras Una vez transcurrido el IEF se procedió al equilibrado de las tiras de IPG para lo cual se colocó la tira en el soporte para tal fin de Biorad y se sumergió dicha tira en 2,5 mL de la solución de equilibrado I (Urea 6M, SDS 0,4%, Glicerol 20%, Tris HCl 250mM pH 8,8, DTT 20 g/L) durante 10 minutos, para reducir y alquilar todos los puentes de disulfuro que pudieran quedar oxidados. A continuación se descartó la solución de equilibrado I y se sumergió la tira en 2,5 mL de solución de equilibrado II (urea 6M, SDS 0,4%, glicerol 20% v/v, Tris HCl 250mM pH 8,8, iodoacetamida 25 g/L) durante 10 minutos para sustituir los detergentes no iónicos para preparar la segunda dimensión. Por último se realizó un lavado de la tira en tampón de corrida con SDS durante 10 minutos. - Segunda dimensión: Electroforesis en poliacrilamida según peso molecular en condiciones desnaturalizantes La segunda dimensión se llevó a cabo tras el equilibrado de las tiras utilizando geles de acrilamida Mini-PROTEAN® TGX™ Precast Gels for 2-D Electrophoresis (Biorad). Se cargaron 8 µL de marcador Broad-Range SDS-PAGE Standards aplicados en un papel de filtro Whatman e insertado en el pocillo. Para sellar el pocillo se utilizó una solución de agarosa al 0,8% con azul de bromofenol para visualizar el frente. Se aplicó un amperaje de 20 mA por gel durante aproximadamente 50 minutos a temperatura ambiente. La tinción se llevó a cabo según lo descrito en el apartado 3.2.4.1. 3.2.4.3 Zimogramas Para localizar la actividad β-xilosidasa de los sobrenadantes de M. thermophila C1 transformado con bxl 201.7 en geles de electroforesis se llevó a cabo un zimogama con metil umberiferilβ-D-xilopiranosido (MUX, M7008 Sigma Aldrich). Se mezclaron 15 µL de sobrenadante con 5 de µL tampón de carga 4X (0.5 M Tris-HCl pH 6.8, β-mercaptoetanol 5%, SDS 2%, glicerol 20% v/v, azul de bromofenol 0,02%). Se cargó la mezcla en un gel de poliacrilamida 12% MiniProtean (BioRad). La Paso Voltaje (V) Rampa Tiempo Unidades 1250 Rápida 0:20 H:min 24000 Gradual 1:00 H:min 34000 Rápida 15000 Vh 4500 ∞ ! ! ! ! Materiales y Métodos ! ! ! 56 electroforesis se llevó a cabo en el sistema Mini-PROTEAN Tetra Cell aplicando un amperaje constante de 20 mA durante aproximadamente 50 min a temperatura ambiente. Tras la migración, el gel se incubó con Triton X-100 al 2,5% v/v durante 30 min en agitación suave para renaturalizar las proteínas. A continuación se incubó en tampón de ensayo acetato sódico 100 mM pH 5,0 durante 5 min. Por ultimo el gel se incubó con MUX 100 µM diluido en acetato sódico 100 mM pH 5,0 durante 5 min. El gel se visualizó en el Gel Doc™ XR+ System. 3.2.5 Caracterización cinética de las enzimas purificadas 3.2.5.1 Cálculo de las constantes cinéticas Las constantes cinéticas para cada una de las enzimas purificadas, Bgl1, Cbh1 y Cbh4, se determinaron mediante el ensayo de actividad descrito para cada una de ellas. - Para la enzima Bgl1 con sustrato análogo se ensayó en un rango de concentración de sustrato pNGP de 0 a 2 mM, con intervalos de 0,33 mM. Cuando se utilizó celobiosa como sustrato se ensayó en un rango de concentraciones de 0 a 3 mM con intervalos de 0,3 mM y de 4,3 a 5,8 mM. - Para las enzimas Cbh1 y Cbh4 se ensayó en un rango de concentraciones de Avicel PH-101 de 0 a 10 g/L con intervalos de 2 g/L y de 20 a 100 g/L con intervalos de 20 g/L. Adicionalmente la enzima Cbh1 se ensayó con sustrato análogo pNCB en un rango de concentraciones de 0 a 2 mM en intervalos de 0,2 mM y una última concetración a 3,2 mM. El cálculo de la Km y Vmax se realizó mediante el diagrama de Hanes-Woolf (S/v vs. S) donde S es el sustrato y v la velocidad (Figura 3.2). En la ecuación obtenida con esta representación el valor de Vmax es la inversa de la pendiente. El punto de corte con el eje x daría el valor de la Km. [𝑆] 𝑣 = 1 𝑉𝑚𝑎𝑥 [𝑆]+ 𝐾𝑚 𝑉𝑚𝑎𝑥 ! ! ! ! Materiales y Métodos ! ! ! 57 Figura 3.2 Representación secundaria de Hanes-Woolf para el cálculo de las constantes cinéticas. 3.2.5.2 Cálculo de las constantes de inhibición Para la determinación de las constantes de inhibición de la enzima Bgl1 por glucosa se midió la actividad en presencia de concentraciones crecientes de glucosa. En la determinación con pNGP como sustrato se eligieron unas concentraciones de 0,66 mM (S1) y 2,66 mM (S2) y un rango de inhibidor de 0 a 33 mM. Cuando se utilizó celobiosa como sustrato se optó por unas concentraciones de 0,6 mM (S1) y 2,3 mM (S2) y un rango de inhibidor de 0 a 4,4 mM. Para la determinación de las constante de inhibición de las enzimas Cbh1 y Cbh4 para glucosa y celobiosa con Avicel PH-101 como sustrato se midió la actividad celobiohidrolasa en presencia de concentraciones crecientes de los dos inhibidores. En todos los casos las concentraciones de sustrato Avicel PH-101 fueron de 40 g/L (S1) y 80 g/L (S2). Para la inhibición por glucosa se llevó a cabo el ensayo en un rango de concentración de inhibidor de 0 a 55 mM. Para la inhibición por celobiosa el rango de concentración de inhibidor escogido fue de 0 a 5,5 mM. En el caso de utilizar el sustrato análogo pNCB se eligieron las concetraciones 0,85 mM como S1 y 1,7 mM como S2. Para la inhibición por celobiosa se utilizó un rango de 0 a 2,9 mM, mientras que para la inhibición por glucosa se alcazaron valores de 55 mM. El cálculo de las constantes inhibitorias se realizó mediante el diagrama de Dixon-Webb (1/v vs. I) donde v es la velocidad e I es la concentración del inhibidor a dos concentraciones distintas de sustrato, S1 y S2 (Figura 3.3). La constante de inhibición, Ki, se calculó del corte de ambas rectas donde Ki=-I. 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 -2 0 2 4 6 8 10 [S]/v [S] 1/Vmax -KM Vmax/KM ! ! ! ! Materiales y Métodos ! ! ! 64 Tabla 3.4 Protocolo de la PCR para la amplificación del gen bxl 20.17 3.2.10.3 Electroforesis de ADN en gel de agarosa. El análisis del producto de la PCR se realizó mediante electroforesis en gel de agarosa al 1% teñido con 0,005% de SYBR Safe DNA Gel Stain (ThermoFisher) en tampón TAE (Tris-acetato 40mM, EDTA 1mM, pH 8). Para ello se mezcló con tampón de carga 6x (NEB) y se cargó en el gel. Como marcador se incluyó el 1kb DNA Ladder (Promega). Se utilizó un voltaje constante de 100V durante 40 minutos tras lo cual se visualizó y fotografió en el transiluminador Gel Doc™ XR con el software ImageneLab (Bio-rad). 3.2.10.4 Purificación del fragmento amplificado La banda del fragmento amplificado se recortó del y el ADN se purificó mediante en kit QIAquick Gel Extraction (28706, Qiagen) según recomendaciones del fabricante. Un microlitro del fragmento purificado se corrió en gel de agarosa para comprobar la purificación. 3.2.10.5 Ligación en pMBL-T El producto de la PCR purificado contaba con dos adeninas en los extremos que sirven para la ligación en el vector de clonación comercial pMBL-T (C0030, Canvax), ya que este vector posee dos timinas en sus extremos. La ligación se llevó a cabo según las instrucciones del fabricante utilizando un ratio 5:1 inserto:vector. Tras el tiempo de incubación se transformó en células competentes E.coli DH5α High Etapa Temperatura (ºC) Tiempo (min:s) Ciclos Desnaturalización inicial 95 5:00 1 Desnaturalización 94 0:30 Alineamiento 57 1:00 Extensión 72 2:30 Elongamiento final 72 15:00 1 Mantenimiento 4∞1 x34 ! ! ! ! Materiales y Métodos ! ! ! 65 eficiency (NEB) según indicaciones de la casa comercial. Se sembraron en placas de medio LB con 100 µg/mL de ampicilina, 40 µg/mL de X-gal y 0,1 mM IPTG para la selección y se incubaron a 37ºC O/N. Tras la incubación gracias al método de selección LacZ se escogieron 4 colonias blancas que debían haber incorporado el gen bxl 20.17. Para la comprobración se llevó a cabo un PCR de colonias en las mismas condiciones que la PCR de amplificación del gen bxl 20.17. Además se iniciaron inóculos para miniprep en un volumen de 2,5 mL de LB con 100 µg/mL de ampicilina y se incubaron a 37ºC y 250 rpm O/N. 3.2.10.6 Análisis de restricción Tras llevar a cabo la extracción del plásmido de los cultivos incubados mediante lisis alcalina con el kit QIAprep Spin Miniprep (Qiagen) según las indicaciones del fabricante, se realizó un análisis de restricción para confirmar la inserción del fragmento en el vector. Para ello se utilizaron 2 µL de cada uno de los plásmidos y se llevó a cabo una digestión con 20 U de NdeI (NEB) y 20 U de BamHI (NEB) en tampón CutSmart en un volumen final de 20 µL durante 30 min a 37ºC. El producto de la digestión se cargo en un gel de agarosa en las mismas condiciones previamente descritas (3.2.10.3). El plásmido se utilizó para secuenciar el fragmento insertado por la unidad de genómica y síntesis de ADN del Instituto de Parasitología y Biomedicina "López – Neyra” (Granada). 3.2.10.7 Subclonación en vector de expresión de M. thermophila C1 Se escogió por un lado uno de los clones positivos de la construcción pMBL- T::bxl 20.17, confirmados tanto por PCR de colonias como por restricción, y por otro lado se usó el vector pBase5K-4 para llevar a cabo una doble digestión independiente. En el caso de la construcción pMBL-T::bxl 20.17 se usaron 25 µL y el caso del vector pBase5K-4 20µg, y en ambos casos se utilizaron 40 U de NdeI (NEB) y 40 U de BamHI-HF (NEB) en tampón CutSmart en un volumen final de 50 µL durante 2h a 37ºC. Tras comprobar el final de la digestión al analizar las reacciones por electroforesis en gel de agarosa, se procedió a recortar las bandas correspondientes al fragmento bxl 20.17 y del vector pBase5K-4 digerido y a su purificación mediante el kit QIAquick Gel Extraction (Qiagen) según las indicaciones del fabricante. Una vez purificados vector e inserto se realizó la ligación por duplicado con 1 U de ligasa T4 (Roche) con ratio 1:5 y 1:7 vector:inserto en 10 µL de volumen final a 4ºC ! ! ! ! Materiales y Métodos ! ! ! 66 O/N. Para llevar un control de religación se puso una ligación en las mismas condiciones sin inserto. La ligación se transformó en células competentes E. Coli DH5α High eficiency (NEB) según indicaciones de la casa comercial, se sembró en placas de medio LB con 50 µg/mL de kanamicina y se incubó a 37ºC durante la noche. Se escogieron 4 colonias al azar de la construcción pBase5-K4::bxl 20.17 para comprobar por PCR de colonias con las mismas condiciones que la amplificación del gen bxl 20.17. A su vez, estas colonias se crecieron en 2,5 mL de LB con 50 µg/mL de kanamicina a 37ºC a 250 rpm O/N para llevar a cabo la extracción del plásmido con el kit QIAquick Gel Extraction (Qiagen). Una vez purificado se llevó a cabo un análisis de restricción en las mismas condiciones que la comprobación por restricción de las construcción pMBL-T::bxl 20.17. El clon 1 se seleccionó para secuenciar y transformar en M. thermophila C1. 3.2.11 Transformación del gen bxl 20.17 en M. thermophila C1 La transformación del hongo M. thermophila se llevó a cabo mediante la fusión de protoplastos siguiendo el protocolo descrito en la patente de Dyadic (Emalfarb y col., 2006). Este procedimiento se basa en la generación de protoplastos mediante la incubación del micelio con una solución de enzimas líticas para la correcta degradación de la pared celular y la liberación de protoplastos para su posterior transformación con el ADN correspondiente. 3.2.12 Fermentación a escala microplaca La fermentación de los clones de M. thermophila C1 transformados con el gen bxl 20.17 se llevó a cabo según lo descrito en la patente Emalfarb y col., 2014. 3.2.12.1 Fase de crecimiento: En placas multipocillo de 96 pocillos, que contenían 220 µL de medio MP1, se inocularon los transformantes de M. thermophila C1 provenientes de la transformación con bxl 20.17 arrastrando parte de las colonias formadas en cada uno de los pocillos. Para el control sin transformar, auxótrofo para la síntesis de uridina, se utilizó medio MP1 ura/uri. La microplaca se envolvió en papel film introduciéndola a continuación en una bolsa de plástico cerrada para evitar la evaporación y se incubó a 35ºC y 800 rpm durante 72h en un incubador orbital Multitron Pro con adaptador para microplacas y un diámetro de 3 mm. ! ! ! ! Materiales y Métodos ! ! ! 67 3.2.12.2 Fase de producción: Transcurrido el tiempo de crecimiento, se inoculó con 5 µL de cada uno de los pocillos de la fase de crecimiento en placas multipocillo de 96 pocillos, que contenían 220 µL de medio MP2. Para el control sin transformar, auxótrofo para la síntesis de uridina, se utilizó medio MP2 ura/uri. Se incubó a 35 ºC y 800 rpm durante 96 horas en un incubador orbital Multitron Pro con adaptador para microplacas y un diámetro de 3 mm.. Se transfirieron también 5 µL de la placa de crecimiento a placas de medio sólido MS y se incubaron a 35ºC durante una semana para conservar una réplica de las colonias. Tras la incubación para el análisis de la fermentación en microplaca se centrifugaron las placas a 2900 x g en una centrifuga Eppendorf 5810 R durante 10 minutos para separar el sobrenandante del micelio. Este sobrenadante fue utilizado para la actividad enzimática y los zimogramas. ! 3.2.13 Fermentación en matraz La fermentación en matraz de los clones de M. thermophila C1 transformados con bxl 20.17 se llevó a cabo en dos etapas con modificaciones del protocolo establecido en la patente Emalfarb y col., 2006. 3.2.13.1 Preinóculo Se inocularon 2 matraces Erlenmeyer de 100 mL por clon desde las placas réplica de colonias transformadas de Myceliophtora thermophila C1, que contenían 20 mL de medio de crecimiento MM1. Para el control sin transformar auxotrofo para la síntesis de uridina, el medio se suplementó con uracilo y uridina. Se incubó durante 48 h a 35º C y 250 rpm con órbita de 25 mm de diámetro en un incubador orbital Multitron II. 3.2.13.2 Producción De cada uno de los clones se seleccionó el de mejor crecimiento en preinoculo y con él se inocularon 2 matraces Erlenmeyer de 250 mL por clon que contenían 20 mL de medio de producción MM2-Lac con 1 mL de los preinóculos (5 % de inóculo). Para el ! ! ! ! Materiales y Métodos ! ! ! 68 control sin transformar el medio utilizado fue MM2-Lac Ura/Uri. Se incubó a 35º C y 250 rpm con órbita de 25 mm de diámetro en un incubador orbital Multitron II, durante 5 días. 3.2.13.3 Análisis de fermentación en matraz Se centrifugaron las muestras 10 min a 3220 x g para eliminar el micelio y se tomó el sobrenadante para determinar concentración de proteína, SDS-PAGE y actividad BXL según protocolo. Se utilizó este sobrenadante también para determinar la capacidad de sacarificación de los cultivos sobre la biomasa. ! ! ! ! 69 4 RESULTADOS ! ! ! ! 70 ! ! ! ! Resultados ! ! ! 71 4.1 Purificación y caracterización de la enzima β-glucosidasa 1 de Myceliophthora thermophila C1 La enzima!β-glucosidasa 1! (Bgl1), perteneciente a la familia GH3, cataliza la hidrólisis del enlace β-1,4 de un residuo terminal β -D-glucósido no reductor, liberando una molécula de β-D-glucosa. Su actividad es, por tanto, la última participante en la degradación de la celulosa a monómeros de glucosa. La cepa industrial de M. thermophila C1 secreta al medio de cultivo un cóctel enzimático donde la enzima Bgl1 supone aproximadamente un 10% del conjunto total de las proteínas secretadas. 4.1.1 Purificación de la enzima Bgl1 Para la purificación de la enzima Bgl1 de M. thermophila C1 se partió de un caldo de fermentación en bioreactor de 30 L con una concentración de proteína de 92 g/L y una actividad β-glucosidasa (BGL) de 9 U/mg frente a p-nitrofenil glucopiranósido (pNGP). Para llevar a cabo la cromatografía de intercambio iónico la muestra se aplicó a una columna Q-sefarosa, tras la cual se analizaron las fracciones resultantes por perfil proteico y en búsqueda de actividad BGL. Se escogieron las fracciones activas y se resolvieron en una segunda etapa de purificación mediante cromatografía de interacción hidrofóbica (Fenil sefarosa). En esta segunda etapa se obtuvieron fracciones con un alto grado de pureza electroforética, por lo que se concentraron para su posterior caracterización (Figura 4.1). El la tabla 4.1 se resume el proceso de purificación de esta enzima. Se obtuvo una proteína con una actividad frente a pNGP de 82 U/mg, con un rendimiento del 24% y un factor de purificación de 8,8. Figura 4.1 Purificación de la enzima Bgl1. (A) Cóctel extracelular de M. thermophila C1 (B) Muestra enriquecida en Bgl1 tras la cromatografía de intercambio iónico. (C) Muestra purificada de Bgl1 tras la cromatografía de interacción hidrofóbica. Geles A y C SDS-PAGE 12%. Gel B SDS-PAGE 7,5%. En todos los casos el carril izquierdo muestra el marcador de peso molecular. ! ! ! ! Resultados ! ! ! 72 Tabla 4.1 Rendimiento y factor de purificación de Bgl1 a partir del caldo extracelular de M. thermophila C1 La actividad BGL se ensayó usando pNGP. Una vez aisladas las fracciones donde se encontraba la proteína Bgl1 se confirmó la identificación por huella peptídica mediante el uso de MALDI –TOF/TOF. Se realizó una electroforesis bidimensional de la enzima purificada Bgl1 (Figura 4.2). Se observaron diferentes puntos en el gel, correspondientes a las distintas isoformas de la proteína, sin embargo predomina un punto que corresponde a la isoforma más abundante de la enzima Bgl1. Dicha isoforma tiene un punto isoeléctrico en torno a 5,3, que difiere levemente del punto isoeléctrico teórico predicho en 5,1. El peso molecular determinado experimentalmente es de 110 kDa, frente al teórico de 95 kDa, siendo probablemente las modificaciones postraduccionales responsables del aumento de tamaño aparente. En la tabla 4.2 se incluyen los valores de peso molecular y punto isoeléctrico tanto teóricos como experimentales. Figura 4.2 Electroforesis bidimensional de la enzima Bgl1 purificada. Tabla 4.2 Valores de peso molecular y punto isoeléctrico teóricos y experimentales de la enzima Bgl1 Etapas Proteína (mg) Actividad total (U) Actividad específica (U/mg) Rendimiento (%) Factor de purificación Interacción hidrofóbica (Fenil sefarosa) 303 24846 82 24 8,8 Intercambio iónico (Q-sefarosa) 5493 63385 12 61 1,2 Caldo crudo 11040 103440 9 100 1 pI 3 4 5 6 7 8 9 10 250 150 100 75 50 37 25 20 15 10 Teórico Experimental Peso molecular 95 kDa 110 kDa Punto isoeléctrico 5,1 5,3 ! ! ! ! Resultados ! ! ! 73 4.1.2 Caracterización cinética de la enzima Bgl1 Para la caracterización cinética de la enzima Bgl1 se utilizaron dos tipos de sustratos: celobiosa como sustrato natural y un sustrato análogo colorimétrico derivado del nitrofenol, el p-nitrofenil β-D-glucopiranósido (pNGP). 4.1.2.1 Perfil de actividad de la enzima Bgl1 usando pNGP como sustrato El ensayo de actividad β-glucosidasa se llevó a cabo usando pNGP a distintas concentraciones en un rango de 0 a 2 mM. Se observa en la gráfica una caída de la actividad a concentraciones crecientes de sustrato (Figura 4.3). Esta inhibición a concentraciones altas de sustrato se ha observado previamente en otras enzimas βglucosidasas caracterizadas (Daroit y col., 2008, Krogh y col., 2010). Este perfil podría explicarse por el fenómeno de transglicosilación, en el que la enzima Bgl1 a altas concentraciones de sustrato actuaría de forma reversa formando oligosacáridos de glucosa (Park y col., 2005). Debido a que la cinética de la enzimas Bgl1 frente a pNGP como sustrato no seguía el modelo de Michaelis-Menten el cálculo de las constantes cinéticas no pudo ser realizado. Figura 4.3 Caracterización de la enzima Bgl1 frente a sustrato pNGP. Relación entre la actividad expresado en U/mg proteína y la concentración de sustrato. 4.1.2.2 Perfil de actividad e inhibición de la enzima Bgl1 usando celobiosa como sustrato Se llevó a cabo el ensayo de actividad con celobiosa como sustrato natural de la enzima, a distintas concentraciones. Se observó que en este caso el comportamiento de la enzima Bgl1 se ajustaba al modelo de Michaelis-Menten (Figura 4.4A). Para el cálculo de las constantes cinéticas sobre celobiosa se realizó la representación de Hanes-Woolf donde se enfrentan la relación entre sustrato y velocidad ([S]/v) frente a la concentración de sustrato (Figura 4.4B). De la gráfica se obtuvieron las constantes cinéticas de la Bgl1 para la celobiosa resumidas en la Tabla 4.3. 0 10 20 30 40 50 0,00 0,50 1,00 1,50 2,00 v (U/mg) pNGP (mM) ! ! ! ! Resultados ! ! ! 80 Figura 4.9 Caracterización cinética de la enzima Cbh1 de M. thermophila C1 con pNCB como sustrato. (A) Relación entre de velocidad y la concentración de sustrato. (B) Diagrama de Hanes-Woolf para el cálculo de las constantes cinéticas. Se representa la relación entre sustrato y velocidad ([S]/v) frente a la concentración de sustrato. (C) Diagrama de Dixon de la inhibición de Cbh1 por celobiosa con Avicel como sustrato. Se representa la inversa de la velocidad (1/v) frente a la concentración de inhibidor a dos concentraciones de sustrato. 4.2.3 Desnaturalización térmica de la enzima Cbh1 Con el objetivo de determinar la estabilidad frente a la desnaturalización térmica de la enzima Cbh1 se incubó la durante 10 minutos en tampón acetato de sodio 200 mM pH 5,0 en un rango de temperaturas de 25ºC a 80ºC en intervalos de 5ºC, tras lo cual se realizó el ensayo de actividad a 50ºC para determinar la actividad residual (Figura 4.10A). La enzima Cbh1 es estable hasta 50ºC presentando el 100% de su actividad. A partir de esta temperatura comienza la desnaturalización térmica. Se determinó que la temperatura de fusión (Tm) de la enzima Cbh1 es de 63 °C. 0 10 20 30 40 50 60 70 80 0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 v (U/g proteína) pNCB (mM) y = 0,011x + 0,0069 R² = 0,99701 -0,01 0 0,01 0,02 0,03 0,04 0,05 -1 0 1 2 3 4 [pNCB]/v pNCB (mM) y = 0,0104x + 0,0215 R² = 0,97471 y = 0,0049x + 0,0146 R² = 0,98508 0 0,01 0,02 0,03 0,04 0,05 0,06 -3 -2 -1 0 1 2 3 4 1/v [celobiosa] mM S1 S2 A C B ! ! ! ! Resultados ! ! ! 81 4.2.4 Termorresistencia de la enzima Cbh1 Para comprobar la termorresistencia de la enzima Cbh1 durante el proceso de hidrólisis se llevó a cabo una incubación en las condiciones de proceso de sacarificación de biomasa: pH 5,0 y 50ºC durante 72h. Se ensayó la actividad a tiempo cero y se tomaron muestras cada 24h para medir la actividad residual de la enzima (Figura 4.10B). La enzima Cbh1 resultó mantener la totalidad de su actividad en las condiciones de proceso de hidrólisis enzimática. 4.2.5 Temperatura óptima de la enzima Cbh1 La temperatura óptima de la enzima Cbh1 se determinó llevando a cabo el ensayo de actividad con Avicel en un rango de temperatura de 40ºC a 65ºC en intervalos de 5ºC (Figura 4.10C). La temperatura óptima de la enzima es 50ºC manteniendo al menos un 80% de actividad entre 45 y 55ºC. 4.2.6 pH óptimo de la enzima Cbh1 Para determinar el pH óptimo de la enzima Cbh1 se midió la actividad CBH utilizando Avicel como sustrato en un rango de pH de 4,0 a 9,0 (Figura 4.10D). La enzima Cbh1 presenta un máximo de actividad entre pH 4,5 y 5,0. Entre pH 5,5 y 6,0 mantiene un 80% de actividad mientras que a pH 7,5 su actividad se reduce a un 50%. ! ! ! ! Resultados ! ! ! 82 Figura 4.10 Caracterización de la enzima Cbh1 con Avicel como sustrato. (A) Desnaturalización térmica. Se representa la actividad residual de la enzima tras la incubación frente a las distintas temperaturas de incubación. (B) Termorresistencia en condiciones de proceso: 50ºC, pH 5,0 y 72h. (C) Temperatura óptima. (D) pH óptimo. 4.3 Purificación y caracterización de la enzima Celobiohidrolasa 4 de Myceliophthora thermophila C1 La enzima celobiohidrolasa 4 (Cbh4) es la segunda celobiohidrolasa mayoritaria del secretoma de M. thermophila C1 suponiendo un 15% del total de cóctel enzimático secretado. Perteneciente a la familia GH6, tiene un peso molecular de 72 kDa, comprendido por el dominio catalítico, un péptido de unión y un dominio de unión a carbohidratos. Es una enzima procesiva que cataliza la hidrólisis de los enlaces β-1,4 de los extremos no reductores de las cadenas de celulosa liberando oligómeros de glucosa. 4.3.1 Purificación de la enzima Cbh4 Para la purificación de la enzima Cbh4 del caldo extracelular de M. thermophila C1 se partió de un cóctel producido en condiciones industriales en bioreactor de 30L con una concentración de 92 g/L de proteína y una actividad CBH de 272 U/g. La purificación de esta enzima se inició aplicando el caldo extracelular pretratado a una columna de Q-sefarosa para llevar a cabo una cromatografía de intercambio aniónico. Localizadas las fracciones donde se encuentra la Cbh1 para descartarlas, se realizó un ensayo de actividad CBH con Avicel como sustrato y se observó el perfil proteico 0 20 40 60 80 100 120 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 Actividad CBH (%) Temperatura (°C) 0 20 40 60 80 100 120 Actividad CBH (%) Tiempo (h) 0 24 48 72 0 20 40 60 80 100 120 35 45 55 65 75 Actividad CBH (%) Temperatura (ºC) 0 20 40 60 80 100 120 4 5 6 7 8 9 Actividad CBH (%) pH A D C B ! ! ! ! Resultados ! ! ! 83 mediante gel SDS-PAGE de las fracciones restantes. El pico de actividad CBH se encontró en la fracción no retenida de la columna de intercambio iónico, por lo que se concluyó que era ahí donde se encontraba la enzima Cbh4. Las proteínas que componen estas fracciones se encuentran cargadas positivamente de manera que no son retenidas por la columna. Con las fracciones escogidas se llevó a cabo una cromatografía de interacción hidrofóbica aplicando la muestra a una columna fenilsefarosa. Aquellas fracciones que concentraron la actividad CBH a la vez que se observó en el gel una proteína mayoritaria con el tamaño de Cbh4 se concentraron y se sometieron a cromatografía de exclusión molecular por una columna Superdex 75 para separar las proteínas en base a su tamaño. De esta última etapa de purificación se obtuvo una muestra de enzima Cbh4 con un alto grado de pureza electroforética. En la Figura 4.11 se muestran los geles de proteína como resumen de las distintas etapas de la purificación de la enzima Cbh4. La muestra purificada se ensayó frente a las actividades celulolíticas principales obteniéndose resultados negativos para todas menos para la actividad CBH, para la que mostró una actividad específica de 268 U/g. En la Tabla 4.7 se resume el rendimiento de la purificación de esta enzima. La muestra se identificó por huella peptídica mediante el uso de MALDI–TOF/TOF como Celobiohidrolasa IIb de M. thermophila que corresponde a la enzima Cbh4. Figura 4.11 Purificación de la enzima Cbh4. (A) Cóctel extracelular de M. thermophila C1 (B) Fracción no retenida tras la cromatografía de intercambio iónico. (C) Muestra enriquecida en la enzima Cbh4 tras la cromatografía de interacción hidrofóbica. (D) Muestra purificada de la enzima Cbh4 tras la cromatografía de exclusión molecular. Geles A, C y D SDS-PAGE 12%. Gel B SDS-PAGE 7,5%. En todos los casos el carril izquierdo muestra el marcador de peso molecular. Tabla 4.7 Rendimiento y factor de purificación de la enzima Cbh4 a partir del caldo extracelular de M. thermophila C1 La actividad se ensayó usando Avicel como sustrato. Etapas Proteína (mg) Actividad total (U) Actividad específica (U/g) Rendimiento (%) Factor de purificación 1 Exclusión molecular (Superdex-75) 308 83 268 3 1 Interacción hidrofóbica (Fenil sefarosa) 934 340 264 11 100 1 Intercambio iónico (Q-sefarosa) 5493 1157 366 39 1,3 Caldo crudo 11040 2980 272 ! ! ! ! Resultados ! ! ! 84 La muestra purificada de la enzima Cbh4 se analizó mediante electroforesis bidimensional en un rango de pH de 3 a 10 (Figura 4.12). El patrón observado demuestra la existencia de distintas isoformas de la enzima debido a las diferentes modificaciones postraduccionales, probablemente glicosilaciones tal y como está descrito (Gusakov y col., 2008). Se observó un incremento en el tamaño experimental frente al teórico, debido probablemente a las modificaciones postraduccionales que sufre la enzima, así como una mayor dispersión en el punto isoeléctrico observado frente al predicho en base a la secuencia de aminoácidos (Tabla 4.8). Figura 4.12 Electroforesis bidimensional de la enzima Cbh4 purificada. Tabla 4.8 Peso molecular y punto isoeléctrico teóricos y experimentales de la enzima Cbh4. 4.3.2 Caracterización cinética de la enzima Cbh4 Para la determinación de las constantes cinéticas se midió la actividad CBH con Avicel como sustrato a distintas concentraciones de sustrato en un rango de 2 a 100 g/L. En la gráfica donde se representa la velocidad de reacción frente a la concentración de sustrato se observa que la cinética se ajusta al modelo de Michaelis- Menten (Figura 4.13A). Para el cálculo de las constantes cinéticas se representó el diagrama de Hanes-Woolf donde se enfrenta la relación entre la concentración de sustrato y la velocidad ([S]/v) frente la concentración de sustrato ([S]) (Figura 4.13B). De la ecuación de la gráfica se calcularon las constantes cinéticas para la enzima Cbh4 especificadas en la Tabla 4.9. pI 3 4 5 6 7 8 9 10 250 150 100 75 50 37 25 20 15 10 Teórico Experimental Peso molecular 51 kDa 70 kDa Punto isoeléctrico 5,2 5,2-5,7 ! ! ! ! Resultados ! ! ! 85 Para el estudio de la inhibición de la enzima Cbh4 por glucosa y celobiosa se llevó a cabo el ensayo de actividad con Avicel como sustrato en un rango de 0 a 6mM de inhibidor. Mientras la glucosa no demostró ser un inhibidor en las condiciones ensayadas, la celobiosa, siendo producto de reacción de la Cbh4, demostró ser inhibidor de esta enzima. Para el cálculo de las constantes inhibitorias se partió del diagrama de Dixon donde se representa la inversa de la velocidad (1/v) frente a concentraciones crecientes de inhibidor ([I]) a dos concentraciones distintas de sustrato (Figura 4.13C). Del punto de intersección de ambas ecuaciones de la gráfica se obtiene un valor de la Ki de de 1,3 mM para la celobiosa. Debido a que la intersección de las rectas del diagrama de Dixon tiene lugar en el segundo cuadrante de la gráfica, concluimos que la celobiosa es un inhibidor competitivo de la enzima Cbh4. Figura 4.13 Caracterización cinética de la enzima Cbh4 con Avicel como sustrato. (A) Relación entre de velocidad y la concentración de sustrato. (B) Diagrama de Hanes-Woolf para el cálculo de las constantes cinéticas. Se presenta la relación entre sustrato y velocidad ([S]/v) frente a la concentración de sustrato. (C) Diagrama de Dixon de la inhibición por celobiosa. Se representa la inversa de la velocidad frente a la concentración de inhibidor a dos concentraciones de sustrato. Tabla 4.9 Constantes cinéticas e inhibitorias de la enzima Cbh4 con Avicel como sustrato. y = 0,0012x + 0,0315 R² = 0,99192 -0,03 0 0,03 0,06 0,09 0,12 0,15 0,18 -40 -20 0 20 40 60 80 100 [Avicel]/v Avicel (g/L) AB 0 100 200 300 400 500 600 700 0 20 40 60 80 100 v (U/mg proteína) Avicel (g/L) y = 0,0004x + 0,0024 R² = 0,97148 y = 0,0001x + 0,002 R² = 0,92899 0 0,0015 0,003 0,0045 0,006 -2 -1 0 1 2 3 4 5 6 1/v Celobiosa (mM) S1 S2 C Ki celobiosa (mM) 1,3 Vmax (U/g proteína) 833 Km (g/L) 26,2 Ki glucosa No presenta inhibición ! ! ! ! Resultados ! ! ! 86 4.3.3 Desnaturalización térmica de la enzima Cbh4 Para llevar a cabo la desnaturalización térmica de la enzima Cbh4 se incubó en periodos de 10 minutos en tampón acetato de sodio 200 mM pH 5,0 a distintas temperaturas en un rango de temperatura ambiente a 80ºC en intervalos de 5ºC, tras lo cual se realizó el ensayo de actividad. La enzima es estable a la incubación hasta 60ºC donde su actividad cae radicalmente (Figura 4.14A). Se determinó la temperatura de fusión (Tm) de la enzima Cbh4 en 66ºC. 4.3.4 Termorresistencia de la enzima Cbh4 Con el objetivo de determinar si la enzima Cbh4 era resistente a las condiciones de proceso de hidrólisis de biomas se incubó la enzima a 50ºC y pH 5,0 durante 72 horas, tomando muestras cada 24h para monitorizar la actividad residual de la enzima. Al analizar la actividad CBH con Avicel se observó una caída de la actividad del 10% en las primeras 24 horas, del 20% a las 48 horas y hasta casi un 30% de disminución de la actividad al fin de la incubación (Figura 4.14B). 4.3.5 Temperatura óptima de la enzima Cbh4 Para determinar la temperatura óptima de la enzima se llevó a cabo el ensayo de actividad CBH con Avicel en un rango de temperaturas de 40ºC a 65ºC (Figura 4.14C). La enzima Cbh4 sufre un incremento de la actividad desde 40ºC a 60ºC donde alcanza su temperatura óptima. A 65ºC la actividad se ve disminuida en un 20%. En las condiciones estándar del ensayo (50ºC) la enzima Cbh4 tiene un 67% de su actividad máxima. 4.3.6 pH óptimo Cbh4 Para determinar el pH óptimo de la enzima Cbh4 se llevó a cabo el ensayo de actividad CBH usando Avicel como sustrato a distintos pH en un rango de 4,5 a 9,0 (Figura 4.14D). La enzima tiene un pH óptimo entre 5,0 y 6,0 disminuyendo su actividad drásticamente a pH básicos. ! ! ! ! Resultados ! ! ! 87 Figura 4.14 Caracterización de la enzima Cbh4 con Avicel como sustrato. (A) Desnaturalización térmica. Se representa el porcentaje de actividad residual tras la incubación a distintas temperaturas de la enzima. (B) Termorresistencia en condiciones de hidrólisis enzimática de biomasa: 50ºC y pH 5,0 durante 72h. Se representa la actividad en porcentaje asumiendo el 100% al inicio de la incubación. (C) Temperatura óptima. (D) pH óptimo. 4.4 Purificación y caracterización de la enzima Endoglucanasa 2 de Myceliophthora thermophila C1 La enzima endoglucanasa 2 (Eg2) de M. thermophila C1 pertenece a la familia GH5. Representa un 10% del total de las proteínas secretadas por este organismo. Son las primeras enzimas en actuar en la degradación de la celulosa hidrolizando los enlaces glucosídicos β(1,4) de zonas internas de la cadena de celulosa, generando nuevos sitios de unión para la acción de las celobiohidrolasas. La estructura de esta proteína está compuesta por un dominio catalítico, un péptido de unión flexible y un dominio de unión a carbohidratos. 4.4.1 Purificación de la enzima Eg2 Para la purificación de la enzima Eg2 se partió del caldo extracelular de M. thermophila C1 de producción en bioreactor de 30 L, con una concentración de 92 g/L y una actividad endoglucanasa (EG) de 11,4 U/mg. Se inició la purificación mediante una cromatografía de intercambio aniónico con la aplicación del caldo pretratado a una columna Q-sefarosa. Para monitorizar la purificación se ensayaron las fracciones resultantes en busca de actividad EG con sustrato azo-carboximetilcelulosa (Azo- 0 20 40 60 80 100 120 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 Actividad CBH (%) Temperatura (ºC) 0 20 40 60 80 100 120 1 2 3 4 Actividad CBH (%) Tiempo (h) 0 24 48 72 0 20 40 60 80 100 120 40 45 50 55 60 65 Actividad CBH (%) Temperatura (ºC) 0 20 40 60 80 100 120 4 5 6 7 8 9 Actividad CBH (%) pH A D C B ! ! ! ! Resultados ! ! ! 88 CMC) siguiendo el perfil proteico mediante gel SDS-PAGE. El pico de actividad EG se encontró en la fracción no retenida de la columna de intercambio aniónico. Las proteínas que componen estas fracciones se encuentran cargadas positivamente de manera que no son retenidas por la columna. Con estas fracciones se llevó a cabo una cromatografía de interacción hidrofóbica sometiendo dichas fracciones a una columna fenil-sefarosa, tras la cual, las fracciones con actividad EG se aplicaron a una columna Superdex 75 para llevar a cabo una cromatografía de exclusión molecular donde separar las proteínas en base a su tamaño. De esta tercera etapa de purificación se obtuvieron fracciones de Eg2 con un alto grado de pureza electroforética. La proteína resultante tenía una actividad específica de 74 U/mg con sustato Azo-CMC y 95 U/g con sustrato Avicel, ya que está descrita cierta actividad avicelasa minoritaria por parte de las endoglucanasas. En la Tabla 4.10 se resume el rendimiento de purificación de esta enzima. La proteína se identificó por huella peptídica mediante el uso de MALDI– TOF/TOF como endoglucanasa 2 de M. thermophila. Figura 4.15 Purificación de la enzima Eg2. (A) Cóctel extracelular de M. thermophila C1. (B) Fracción no retenida tras la cromatografía de intercambio iónico. (C) Muestra enriquecida en Eg2 tras la cromatografía de interacción hidrofóbica. (D) Muestra purificada de la enzima Eg2 tras la cromatografía de exclusión molecular. Geles A, C y D SDS-PAGE 12%. Gel B SDSPAGE 7,5%. En todos los casos el carril izquierdo muestra el marcador de peso molecular. Tabla 4.10 Rendimiento y factor de purificación de la enzima Eg2 a partir del caldo extracelular de M. thermophila C1 La actividad se ensayó usando Azo-CMC como sustrato. Etapas Proteína (mg) Actividad total (U) Actividad específica (U/mg) Rendimiento % Factor de purificación Exclusión molecular (Superdex-75) 156 11544 74,0 9 6,5 Interacción hidrofóbica (Fenil sefarosa) 1289 35285 27,4 28 2,4 Intercambio iónico (Q-sefarosa) 3158 80756 25,6 64 2,3 Caldo crudo 11040 125400 11,4 100 1 ! ! ! ! Resultados ! ! ! 89 La muestra de la enzima Eg2 purificada se analizó mediante electroforesis bidimensional (Figura 4.16). El patrón observado muestra que existen distintas isoformas de la enzima probablemente diferenciadas por glicosilaciones variables en la longitud del oligosacárido, como previamente describió Gusakov (2008). El punto isoeléctrico predicho para la enzima es 5,1, sin embargo el experimental se encontró entre 4,7 y 5,1 debido a dichas isoformas. Igualmente se observó un incremento en el peso molecular entre el teórico y el experimental. Estos datos se recogen en la Tabla 4.11. Figura 4.16 Electroforesis bidimensional de la enzima Eg2 purificada del caldo enzimático secretado por M. thermophila C1. Tabla 4.11 Peso molecular y punto isoeléctrico teóricos y experimentales de la enzima Eg2. 4.4.2 Inhibición de la enzima Eg2 Con el fin de comprobar la posible inhibición de la enzima Eg2 por glucosa y celobiosa se realizó un ensayo de actividad EG sobre Azo-CMC en presencia de las mismas. La glucosa se añadió en un rango de 0 y 0,55 M y la celobiosa de 0 a 88 mM. Mientras que la glucosa no demostró ser inhibidor de esta enzima a las concentraciones ensayadas, la celobiosa provoca una inhibición de aproximadamente un 20% a 20 mM, llegando hasta un 60% de actividad a la máxima concentración de inhibidor utilizado (Figura 4.17). Teórico Experimental Punto isoeléctrico 5,1 4,7-5,1 Peso molecular 42 kDa 50 kDa pI 3 4 5 6 7 8 9 10 250 150 100 75 50 37 25 20 15 10 ! ! ! ! Resultados ! ! ! 96 4.5.2 Influencia individual de cada una de las celulasas en el cóctel mínimo (CM 6) Para determinar la contribución de cada una de las celulasas a la hidrólisis de PCS llevada a cabo por el coctel mínimo con enzimas PMO (CM 6), se eliminó cada una de las celulasas por separado, por un lado rebajando la dosis total de celulasas y por otro manteniendo la dosis total mediante el remplazo con las celulasas restantes. La dosificación de las distintas condiciones se muestra en la Tabla 4.13 mientras que el resultado de la hidrólisis se refleja en la Figura 4.22. Tabla 4.13. Dosificación en miligramos por gramo de glucano de las celulasas ! ! Figura 4.22 Rendimiento de glucosa relativo a 72 horas en hidrólisis de PCS con CM 6 eliminando cada una de las celulasas de manera individual. En azul se representa la eliminación de cada una de las celulasas del cóctel sintético. En verde se representa la eliminación de cada una de las celulasas remplazando la dosis por las celulasas restantes.* Suma de glucosa más celobiosa. Condición Eg2 Cbh1 Cbh4 Bgl1 PMO-04725 PMO-06230 Dosis total Control 2,27 3,99 1,30 1,08 1,00 1,00 10,64 Sin Eg2 0,00 3,99 1,30 1,08 1,00 1,00 8,37 Sin Cbh1 2,27 0,00 1,30 1,08 1,00 1,00 6,65 Sin Cbh4 2,27 3,99 0,00 1,08 1,00 1,00 9,34 Sin Bgl1 2,27 3,99 1,30 0,00 1,00 1,00 9,56 Sin PMO-04725 2,27 3,99 1,30 1,08 0,00 1,00 9,64 Sin PMO-06230 2,27 3,99 1,30 1,08 1,00 0,00 9,64 Sin Eg2 0,00 5,08 1,65 1,37 1,27 1,27 10,64 Sin Cbh1 3,65 0,00 2,07 1,72 1,60 1,60 10,64 Sin Cbh4 2,58 4,54 0,00 1,24 1,14 1,14 10,64 Sin Bgl1 2,54 4,44 1,44 0,00 1,11 1,11 10,64 Sin PMO-04725 2,50 4,40 1,45 1,19 0,00 1,10 10,64 Sin PMO-06230 2,50 4,40 1,45 1,19 1,10 0,00 10,64 Dosis disminuida Dosis compensada 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 Sin Eg2 Sin Cbh1 Sin Cbh4 Sin Bgl1 Sin PMO- 04725 Sin PMO- 06230 Sin Eg2 Sin Cbh1 Sin Cbh4 Sin Bgl1 Sin PMO- 04725 Sin PMO- 06230 CM 6 Dosis disminuida Dosis compensada Rendimiento de glucosa relativo (%) *" *" ! ! ! ! Resultados ! ! ! 97 Los resultados fueron los siguientes: § La eliminación de Eg2 en el cóctel mínimo supone la bajada de un 15% de rendimiento en liberación de glucosa. Cuando se remplaza la dosis de esta enzima por el resto de la celulasas se alcanza un 93% del rendimiento del control del cóctel mínimo. § La eliminación de Cbh1 en el cóctel mínimo supone la bajada de un 32% de rendimiento en liberación de glucosa. Cuando se remplaza la dosis de Cbh1 por el resto de la celulasas se alcanza un 85% del rendimiento del control del cóctel mínimo. § La eliminación de Cbh4 en el cóctel mínimo supone la bajada de un 10% de rendimiento en liberación de glucosa. Cuando se remplaza la dosis de esta celobiohidrolasa por el resto de la celulasas se alcanza un 95% del rendimiento del control del cóctel mínimo. § La eliminación de Bgl1 en el cóctel mínimo supone la bajada de un 23% de rendimiento, expresado como la suma de glucosa y celobiosa. Cuando se remplaza la dosis de Bgl1 por el resto de la celulasas se alcanza un 77% del rendimiento del control del cóctel mínimo ya que el resto de celulasas no compensa la falta de Bgl1. § La eliminación de PMO-04725 en el cóctel mínimo supone la bajada de un 13% de rendimiento en liberación de glucosa. Cuando se remplaza la dosis de esta PMO por el resto de la celulasas se alcanza un 91% del rendimiento del control del cóctel mínimo. § La eliminación de PMO-06230 en el cóctel mínimo supone la bajada de un 26% de rendimiento en liberación de glucosa. Cuando se remplaza la dosis de esta PMO por el resto de la celulasas se alcanza un 79% del rendimiento del control del cóctel mínimo. 4.5.3 Optimización de las proporciones de las distintas celulasas en el cóctel mínimo (CM 6) La eficiencia hidrolítica de un complejo multi-enzimático en el proceso de sacarificación de material lignocelulósico depende tanto de las propiedades individuales de cada uno de los componentes enzimáticos como de las proporciones de los mismos. M. thermophila se encuentra en la naturaleza en ambientes con materia orgánica lignocelulósica en descomposición bajo condiciones ambientales variables de temperatura, humedad y pH, de forma que la secreción de un cóctel de diversas celulasas con un amplio rango de actividad óptima representa una ventaja competitiva. Sin embargo para su aplicación industrial a la hidrólisis de biomasa lignocelulósica pretratada en que las condiciones son preestablecidas y uniformes para todas las enzimas del cóctel, puede que las proporciones de cada una de las enzimas principales presentes en el secretoma no sean las óptimas. Una vez definidos aquellos componentes necesarios en el cóctel mínimo para reproducir el rendimiento del cóctel ! ! ! ! Resultados ! ! ! 98 completo y conocidas sus proporciones en el secretoma de este organismo, se llevó a cabo un reajuste de las proporciones de los componentes para la optimización de la liberación de glucosa en hidrólisis de PCS. Utilizando el programa estadístico StatGraphics Plus, se realizó un diseñó experimental para optimización de mezclas. Partiendo de las proporciones estándar que reflejan la representación de cada una de las enzimas en el cóctel secretado por M. thermophila C1, se variaban las proporciones de las distintas celulasas incluidas en el cóctel mínimo (CM 6) dentro de unos límites establecidos, resultando un diseño experimental con 56 combinaciones de mezclas o proporciones del cóctel. En la Tabla 4.14 se muestran las dosificaciones de las celulasas de cada una de las condiciones. Como control se incluyeron las proporciones estándar y el cóctel completo a una dosis de 10,64 mg de proteína por gramo de glucano. Con las combinaciones diseñadas se llevó a cabo la hidrólisis de la biomasa lignocelulósica y se analizó la glucosa liberada a 72h. Determinadas combinaciones superaron el rendimiento en glucosa de las proporciones estándar como las condiciones 53 o 50 que liberan hasta 3 g/Kg más. Otras condiciones como la 37, 39, 44 y 46 muestran incrementos más moderados (Figura 4.23). Figura 4.23 Liberación de glucosa expresada en gramos por kilogramo de hidrolizado de cada una de las condiciones con distintas proporciones diseñadas por el programa estadístico StatGraphics. La línea roja representa la liberación de la condición estándar. Mt: cóctel completo secretado por M. thermophila C1 a una dosis de 10,64 mg/g glucano. Los valores representan la media de dos repeticiones. 0 10 20 30 40 50 60 70 80 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 Mt Glucosa (g/Kg) ! ! ! ! Resultados ! ! ! 99 Tabla 4.14. Dosificación de las distintas celulasas para la optimización de las proporciones del cóctel mínimo (CM 6) para la hidrólisis de PCS. La dosificación se expresa de miligramos de proteína por gramo de glucano. Condición Eg2 Cbh1 Cbh4 Bgl1 PMO-04725 PMO-06230 13,18 4,83 0,78 0,65 0,60 0,60 22,42 5,59 0,78 0,65 0,60 0,60 33,18 3,79 1,82 0,65 0,60 0,60 41,38 5,59 1,82 0,65 0,60 0,60 51,36 5,59 1,82 0,67 0,60 0,60 61,36 5,59 1,82 0,65 0,62 0,60 71,36 5,59 1,82 0,65 0,60 0,62 83,18 3,97 0,78 1,51 0,60 0,60 91,56 5,59 0,78 1,51 0,60 0,60 10 1,36 5,59 0,98 1,51 0,60 0,60 11 1,36 5,59 0,78 1,51 0,80 0,60 12 1,36 5,59 0,78 1,51 0,60 0,80 13 1,36 4,74 1,82 1,51 0,60 0,60 14 3,18 2,93 1,82 1,51 0,60 0,60 15 3,18 2,39 1,82 1,51 1,13 0,60 16 3,18 2,39 1,82 1,51 0,60 1,13 17 3,18 4,03 0,78 0,65 1,40 0,60 18 1,62 5,59 0,78 0,65 1,40 0,60 19 1,36 5,59 1,04 0,65 1,40 0,60 20 1,36 5,59 0,78 0,91 1,40 0,60 21 1,36 5,59 0,78 0,65 1,40 0,86 22 1,36 4,81 1,82 0,65 1,40 0,60 23 3,18 2,99 1,82 0,65 1,40 0,60 24 3,18 2,39 1,82 1,25 1,40 0,60 25 3,18 2,39 1,82 0,65 1,40 1,20 26 1,36 4,98 0,78 1,51 1,40 0,60 27 3,18 3,17 0,78 1,51 1,40 0,60 28 3,18 2,39 1,55 1,51 1,40 0,60 29 3,18 2,39 0,78 1,51 1,40 1,37 30 2,91 2,39 1,82 1,51 1,40 0,60 31 1,36 3,94 1,82 1,51 1,40 0,60 32 3,18 4,03 0,78 0,65 0,60 1,40 33 1,62 5,59 0,78 0,65 0,60 1,40 34 1,36 5,59 1,04 0,65 0,60 1,40 35 1,36 5,59 0,78 0,91 0,60 1,40 36 1,36 5,59 0,78 0,65 0,86 1,40 37 1,36 4,81 1,82 0,65 0,60 1,40 38 3,18 2,99 1,82 0,65 0,60 1,40 39 3,18 2,39 1,82 1,25 0,60 1,40 40 3,18 2,39 1,82 0,65 1,20 1,40 41 1,36 4,98 0,78 1,51 0,60 1,40 42 3,18 3,17 0,78 1,51 0,60 1,40 43 3,18 2,39 1,55 1,51 0,60 1,40 44 3,18 2,39 0,78 1,51 1,37 1,40 45 2,91 2,39 1,82 1,51 0,60 1,40 46 1,36 3,94 1,82 1,51 0,60 1,40 47 1,36 5,05 0,78 0,65 1,40 1,40 48 3,18 3,23 0,78 0,65 1,40 1,40 49 3,18 2,39 1,62 0,65 1,40 1,40 50 3,18 2,39 0,78 1,49 1,40 1,40 51 2,98 2,39 1,82 0,65 1,40 1,40 52 1,36 4,01 1,82 0,65 1,40 1,40 53 3,15 2,39 0,78 1,51 1,40 1,40 54 1,36 4,18 0,78 1,51 1,40 1,40 55 2,11 2,39 1,82 1,51 1,40 1,40 56 1,36 3,14 1,82 1,51 1,40 1,40 Estándar 2,27 3,99 1,30 1,08 1,00 1,00 ! ! ! ! Resultados ! ! ! 100 Tabla 4.15 Resultados de ANOVA R2:0,895; R2 ajustado por Gl: 0,615. Gl: grados de libertad Tabla 4.16 Dosificación óptima y límites establecidos de las distintas celulasas según el programa estadístico StatGraphics. La dosificación se expresa en miligramos de proteína por gramo de glucano. Los resultados de la hidrólisis se analizaron mediante el modelo cúbico. El valor- P para este modelo es menor que 0,05, lo que demuestra que existe una relación estadísticamente significativa entre glucosa y los componentes (enzimas), con un nivel de confianza del 95,0%. El análisis de la varianza (ANOVA) se encuentra resumido en la Tabla 4.15. El estadístico R2 indica que el modelo, así ajustado, explica 89,5% de la variabilidad en los valores de glucosa, dejando un 10,5% de la variabilidad no explicada por el modelo. El estadístico R2 ajustada, que es más adecuado para comparar modelos con diferente número de variables independientes, es 61,5%. La baja correlación presente en el modelo es debida a que el programa no tiene en cuenta el factor de sinergia entre enzimas. El programa determinó un valor óptimo de liberación de glucosa de 74 g/Kg. Siendo la liberación de glucosa de la condición control de proporciones estándar 66,8 g/Kg el reajuste de las proporciones del cóctel supone una mejora de 7,2 g/Kg en liberación de glucosa respecto a dicho control. La dosificación óptima de cada una de las enzimas se encuentra reflejada en la tabla 4.16. Comparando con las proporciones estándar del CM 6, que son aquellas que simulan las encontradas en el caldo extracelular de M. thermophila C1, se requiere para su mayor eficiencia menor cantidad de las enzimas Eg2, Bgl1 y PMO-04725. Las proporciones óptimas de las enzimas Eg2 y PMO-04725 coinciden con el valores mínimo probado por lo que puede existir mayor rango de mejora. Las enzimas Cbh1 y Cbh4 son deficitarias en el cóctel estándar según los valores óptimos, coincidiendo la proporción óptima de Cbh4 con el máximo probado. La enzima PMO-06230 mantiene su proporción. Fuente Suma de Cuadrados Gl Cuadrado Medio Razón-F Valor-P Modelo Cúbico Especial 335,31 40 8,38 3,2 0,009 Error total 39,29 15 2,62 Total (corr.) 374,60 55 Enzima Estándar Límite inferior Límite superior Óptimo Eg2 2,27 1,36 3,18 1,36 Cbh1 3,99 2,39 5,59 5,10 Cbh4 1,30 0,78 1,82 1,82 Bgl1 1,08 0,65 1,51 0,78 PMO-04725 1,00 0,60 1,40 0,60 PMO-06230 1,00 0,60 1,40 0,98 ! ! ! ! Resultados ! ! ! 101 4.5.4 Efecto del dominio de unión a carbohidratos de la enzima Cbh1 en la hidrólisis de PCS La estructura de un gran número de celulasas está compuesta por un dominio catalítico, un péptido de unión y un dominio de unión a carbohidratos (CBD). Este último juega un importante papel en la unión de la enzima a la celulosa y como consecuencia mejora la actividad de la enzima (Tomme y col.,1988). En varios estudios a distintas concentraciones de solidos totales se propone que, a bajas concentraciones de sólidos la ausencia del CBD de las celulasas supone una bajada en el rendimientos de hidrólisis respecto a aquellas celulasas que poseen CBD. Por el contrario, a alta concentración de sólidos las diferencias de rendimiento disminuyen, siendo comparables los valores de las condiciones con y sin CBD (Pakarinen y col., 2014; Le Costaouëc y col., 2013). En el caldo secretado por M. thermophila C1 existen dos isoformas de Cbh1: con CBD y sin CBD. La actividad de ambas isoformas es distinta y sus proporciones en el caldo extracelular dependen principalmente de las condiciones de cultivo que pueden favorecer la ruptura proteolítica del conector, dando como resultado una mayor proporción de la isoforma sin CBD. Debido a que las condiciones de proceso de hidrólisis en este proyecto son a alta concentración de sólidos totales (20%) y ante los precedentes citados, se decidió determinar la importancia del papel del CBD de la enzima Cbh1 en la hidrólisis de PCS. Para ello, y haciendo uso de la herramienta del cóctel sintético CM 6, se llevó a cabo una hidrólisis de la biomasa lignocelulósica con las enzimas puras, fijando las proporciones de Eg2, Cbh4, Bgl1, PMO-04725 y PMO-06230, y modificando las proporciones de la enzima Cbh1 con CBD por la isoforma sin CBD purificada del caldo de cultivo. En la Tabla 4.17 se muestra la dosificación empleada en cada condición. Tabla 4.17 Dosificación de las distintas celulasas presente en CM 6 en la hidrólisis de PCS para el estudio del efecto del CBD de la enzima Cbh1. ! La dosificación se expresa en miligramos de proteína por gramo de glucano. Cbh1-CBD+: Enzima Cbh1 con dominio de unión a carbohidratos CBD. Cbh1-CBD-: Enzima Cbh1 sin dominio de unión a carbohidratos. Condición Eg2 Cbh1- CBD+ Cbh1- CBD- Cbh4 Bgl1 PMO-04725 PMO-06230 100% Cbh1-CBD+ 2,27 3,99 0,00 1,30 1,08 1,00 1,00 75%Cbh1-CBD+ 25% Cbh1-CBD- 2,27 1,00 2,99 1,30 1,08 1,00 1,00 66%Cbh1-CBD+ 33% Cbh1-CBD- 2,27 2,00 2,00 1,30 1,08 1,00 1,00 50%Cbh1-CBD+ 50% Cbh1-CBD- 2,27 2,99 1,00 1,30 1,08 1,00 1,00 25%Cbh1-CBD+ 75% Cbh1-CBD- 2,27 2,63 1,32 1,30 1,08 1,00 1,00 100% Cbh1-CBD- 2,27 0,00 3,99 1,30 1,08 1,00 1,00 ! ! ! ! Resultados ! ! ! 102 Tras monitorizar la hidrólisis de la biomasa lignocelulósica tomando muestra cada 24h se obtuvo la cinética de liberación de glucosa (Figura 4.24A). Se observó que desde tiempos cortos existía una correlación entre la proporción presente de isoforma Cbh1 con CBD y la liberación de glucosa, de manera que cuanto mayor era la relación Cbh1 con CBD:Cbh1 sin CBD mayores era los niveles de glucosa producidos. A tiempo final 72h se evidencia aún más esta relación, alcanzando concentraciones de glucosa de 67 g/Kg de hidrolizado en la condición donde se emplea la totalidad de la isoforma con CBD, mientras que cuando la totalidad de la isoforma empleada es sin CBD la concentración de glucosa liberada es de 55 g/Kg (Figura 4.24B). Figura 4.24 Liberación de glucosa en la hidrólisis de PCS mediada por el cóctel sintético CM 6 con sustitución de la enzima Cbh1 con CBD por la isoforma sin CBD a distintas proporciones, para el estudio de la importancia del papel del CBD en el proceso. (A) Cinética de liberación. Se representa la concentración de glucosa en el eje de ordenadas frente al tiempo en el eje de abscisas. (B) Liberación de glucosa a tiempo final 72h. Los valores son la media de dos réplicas. Cbh1-CBD+: Enzima Cbh1 con dominio de unión a carbohidratos CBD. Cbh1-CBD-: Enzima Cbh1 sin dominio de unión a carbohidratos. 0 10 20 30 40 50 60 70 0 10 20 30 40 50 60 70 80 Glucosa (g/Kg) Tiempo (h) 100% Cbh1-CBD+ 75%Cbh1-CBD+ 25% Cbh1-CBD- 66%Cbh1-CBD+ 33% Cbh1-CBD- 50%Cbh1-CBD+ 50% Cbh1-CBD- 25%Cbh1-CBD+ 75% Cbh1-CBD- 100% Cbh1-CBD- A B 0 10 20 30 40 50 60 70 100% Cbh1-CBD+ 75%Cbh1-CBD+ 25% Cbh1-CBD- 66%Cbh1-CBD+ 33% Cbh1-CBD- 50%Cbh1-CBD+ 50% Cbh1-CBD- 25%Cbh1-CBD+ 75% Cbh1-CBD- 100% Cbh1-CBD- Glucosa (g/Kg) B ! ! ! ! Resultados ! ! ! 103 4.6 Búsqueda y expresión de una enzima β-xilosidasa en Myceliophthora thermophila C1 Como se describió previamente en la introducción (véase apartado 1.2), la hemicelulosa es el segundo polisacárido predominante en la lignocelulosa. Aproximadamente el 70% de la hemicelulosa está compuesta por polímeros de xilano, siendo por tanto la xilosa el monosacárido más abundante en la lignocelulosa tras la glucosa. En el proceso de obtención de bioetanol de segunda generación el aprovechamiento de la xilosa para la conversión a etanol es fundamental para el rendimiento global del proceso. Por este motivo, en la actualidad se trabaja tanto en la optimización de la hidrólisis de la hemicelulosa como en la modificación genética de distintas levaduras para que puedan aprovechar los dos principales monosacáridos generados en la hidrólisis (Matsushika y col., 2009, Harner y col., 2015). Para la degradación completa de la hemicelulosa se requiere una batería de enzimas hemicelulasas que hidrolicen las ramificaciones y las cadenas principales del polímero. La última enzima en actuar es la β-xilosidasa, que hidroliza los dímeros y oligómeros solubles de xilosa. El caldo secretado por M. thermophila C1 es deficitario en actividad β-xilosidasa debido a la baja expresión de sus enzimas endógenas, por lo que en la hidrólisis de PCS con este cóctel enzimático, gran parte de la xilobiosa no es degradada a xilosa. Aproximadamente se libera un 50% del máximo teórico de xilosa mientras que otro 50% queda sin hidrolizar. En el caso de la glucosa se alcanzan niveles cercanos al 80% y la celobiosa residual prácticamente es despreciable (Figura 4.25). Estos valores de xilobiosa suponen una gran pérdida ya que se deja de utilizar en torno al 15% de los azúcares totales. Figura 4.25 Liberación de distintos azúcares en hidrólisis de PCS a 72h con el cóctel secretado por M. thermophila C1. Se representa el porcentaje de liberación respecto a un máximo teórico de los distintos azúcares. Teniendo en cuenta la limitación del cóctel secretado por M. thermophila C1 en la degradación de la hemicelulosa, se planteó mejorar la calidad del mismo mediante la expresión de una β-xilosidasa que hidrolizase los dímeros y oligómeros de xilosa residuales de las hidrólisis. La estrategia seguida para la mejora de este cóctel 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 Celobiosa Glucosa Xilobiosa Xilosa Liberación de azúcares (%) ! ! ! ! Resultados ! ! ! 104 enzimático fue el escrutinio de distintas β-xilosidasa de otros hongos celulolíticos, la expresión heteróloga y la selección de un clon con alta expresión de una β-xilosidasa en M. thermophila C1. 4.6.1 Escrutinio de β-xilosidasas de hongos celulolíticos Para la búsqueda de una proteína β-xilosidasa (Bxl) candidata a ser expresada en M. thermophila C1 se cultivaron 200 cepas de hongos celulolíticos en medio líquido, con el objetivo de llevar a cabo un escrutinio en busca de actividad βxilosidasa (BXL) mediante ensayo de actividad con el sustrato análogo p-nitrofenil xilopiranósido (pNXP). De las cepas analizadas, 47 mostraron actividad β-xilosidasa significativa, por encima del control de M. thermophila C1 cuya actividad es 10 U/g de proteína. Para tener un valor comparable entre todas las cepas se calculó la actividad específica relativizada a la cantidad de proteína total secretada por cada una de ellas (Figura 4.26). Figura 4.26 Actividad específica BXL medida con pNXP del escrutinio de las mejores cepas de la colección de hongos celulolíticos. Se representa un corte en el eje Y para la correcta visualización de los valores. La selección de la enzima a expresar en M. thermophila C1 se realizó en base a distintos factores: • Alta actividad específica. • Expresión de la enzima β-xilosidasa respecto al conjunto de proteínas secretadas observado en el perfil proteico. • Termorresistencia en condiciones de proceso de hidrólisis enzimática: 50ºC, pH 5,0 y 72h. • pH óptimo comprendido entre el 4,5 y 5,5 por ser el pH de la hidrólisis. • Cobertura de la identificación por huella peptídica. // 0 500 1000 1500 2000 2500 11.1 11.3 11.11 11.19 11.20 12.19 13.3 13.4 13.6 13.7 13.13 13.14 14.6 14.11 14.12 14.14 14.15 14.16 14.18 14.19 15.4 15.5 15.7 15.18 15.19 16.1 16.14 16.15 16.21 17.4 17.7 17.15 17.20 18.6 18.17 18.18 19.5 19.7 19.8 19.9 19.17 19.20 20.4 20.9 20.13 20.14 20.17 3000 4500 6000 7500 9000 BXL (U/g) ! ! ! ! Resultados ! ! ! 105 Se escogió la enzima β-xilosidasa de la cepa 20.17 para continuar el estudio y comprobar si sería una buena candidata a expresar en M. thermophila C1 por sus propiedades. Siendo la actividad específica del cóctel superior a 3000 U/g y tras determinar que la actividad BXL de la cepa 20.17 era termorresistente a las condiciones de proceso, se procedió a realizar una curva de pH con el objetivo de determinar si la enzima era activa en el rango de pH en el que se produce la hidrólisis. Se observó que la actividad BXL de la cepa tiene un óptimo a pH 4,5 conservando un 90% de actividad a pH 5,0 y un 80% a pH 5,5 (Figura 4.27A). Figura 4.27 (A) pH óptimo de la actividad BXL de la cepa 20.17 a 50ºC usando pNXP como sustrato. (B) Gel SDS-PAGE (12%) del caldo extracelular la cepa 20.17. Se indica con una flecha la banda correspondiente a la enzima Bxl 20.17. Para analizar el perfil proteico se llevó a cabo un gel SDS-PAGE del caldo secretado por la cepa 20.17 (Figura 4.27B), donde se observó que existían 5 bandas predominantes, por lo que la alta actividad específica BXL no era debida a la presencia de una única proteína mayoritaria secretada. Se recortaron las distintas bandas y se identificó la enzima β-xilosidasa 20.17 mediante huella peptídica. En el gel SDS-PAGE se indica con una flecha la banda correspondiente a la enzima βxilosidasa presente en esta cepa. 4.6.2 Amplificación del gen bxl 20.17 A partir de las secuencias de los péptidos obtenidos se realizó una búsqueda en las bases de datos, en la que se identificó una proteína perteneciente a la familia GH3 del género Trichoderma. En base a dichas secuencias se diseñaron los cebadores correspondientes para intentar obtener el gen mediante amplificación por PCR. Para la expresión del gen bxl 20.17 se siguieron dos estrategias basadas en la mejora de la secreción de enzimas heterólogas por el uso de distintos péptidos señales (Zoglowek y col., 2015, Kanamasa y col., 2003). La primera estrategia fue el uso del péptido señal nativo de la proteína Bxl 20.17. Para la segunda estrategia el péptido señal nativo se sustituyó por el péptido señal de la glucoamilasa de Aspergillus AB Bxl 20.17 0 20 40 60 80 100 120 3 4 5 6 7 Actividad BXL(%) pH ! ! ! ! 112 ! ! ! ! ! 113 ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! DISCUSIÓN 5 ! ! ! ! 114 ! ! ! ! Discusión ! ! ! 115 5.1 La enzima Bgl1 frente a otras β-glucosidasas Tradicionalmente las β-glucosidasas han seguido dos criterios de clasificación basados en la especificidad de sustrato o en la identidad de la secuencia nucleotídica. Basándose en la especificidad de sustrato, estas enzimas se han clasificado como arilo β-glucosidasas, que actúan sobre arilo-glucósidos, verdaderas celobiasas, que hidrolizan celobiosa para liberar glucosa; y enzimas de amplia especificidad de sustrato, que actúan sobre un amplio espectro de sustratos. La mayoría de las βglucosidasas caracterizadas se encuentran en la última categoría (Singhania y col., 2013). Sin embargo, el método más aceptado de clasificación es por la identidad de las secuencia de aminoácidos, propuesto por Henrissat y Bairoch (1991), basado en las similitudes en la secuencia y en el plegamiento de estas enzimas. La mayoría de las β-glucosidasas fúngicas pertenecen a la familia GH3, así como un gran número de enzimas provenientes de levaduras y bacterias. Es el caso de la enzima Bgl1 de M. thermophila C1, cuya secuencia consta de 870 aminoácidos que conforman un dominio N terminal de la familia GH3 (residuos 42-362), un dominio C terminal de la familia GH3 (residuos 394-666) y un dominio tipo fibronectina tipo III (residuos 792- 860), dominios según InterProScan (Jones y col., 2014). Los primeros 19 aminoácidos corresponden a un péptido señal que dirige la proteína hacia la ruta de secreción, demostrando que es una proteína extracelular. Como se puede observar en la Figura 5.1, la enzima Bgl1 conserva los residuos del sitio activo Arg165, Lys198, His199, Glu213, Met254, Asp289, Trp290 y Trp456, marcados en amarillo. Estos residuos han sido determinados por homología con otras enzimas β-glucosidasas, como la enzima de Penicillium purpurogenum KJS506 (Jeya y col., 2010). Los residuos catalíticos Asp289 y Glu518 se encuentran conservados (resaltados en rosa en la Figura 5.1), correspondiendo el primero al residuo que actua como nucleofílico y el segundo, al que actúa de ácido/base. Estos residuos de la enzima Bgl1 han sido confirmados por Zhao y col. (2015) al ser mutados ambos de manera independiente por Ala y perder su actividad frente a pNGP. La enzima Bgl1 es una glicoproteína. Como tal, presenta 11 posibles sitios de N- glicosilación según NetNGlyc 1.0 Server (Blom y col., 2004), no pudiendo determinarse en las condiciones de cultivo de este trabajo, la cantidad de Asn que se encuentran glicosiladas. Estas modificaciones son con alta probabilidad las causantes de la diferencia de tamaño teórico y experimental observado en esta tesis (Tabla 4.2). Zhao (2015) determinó la existencia de 5 sitios de O-glicosilación mediante NetOGlyc 4.0 sever (http://www.cbs.dtu.dk/services/NetOGlyc/), cuando expresó esta proteína de manera heteróloga en Pichia pastoris. La secuencia de la enzima Bgl1 presenta una identidad del 82% con una GH3 de Thielavia terrestris, un 75% con la Bgl3A de Humicola insolens y un 66% con la Bgl de Fusarium oxysporum y una Bgl de la familia GH3 de T. reesei. ! ! ! ! Discusión ! ! ! 116 M_thermophila --mkaa--alsclfgstla--------vagaIESRKVHQKPLARSEPFYPSPWMNPNADG 48 H_insolens mralyaagwllistvsmttaNRHRQVIGRNHLNHHHRSQRELAYSPPSYPSPWMDPKAAE 60 T_terrestris mrlrsaaqwllvlparssgl--------aDKNSHQPLEKRTLATSEPFYPSPWMNPDADG 52 P_anserina mkfsvv----vaaalasgal--------aTPQYPPKLIKRDLAYSPPVYPSPWMNPEADG 48 F_oxysporum mklnwvaaalsigaagtdgTVALASEVPGTLAGVKVVTRDTLAHSPPHYPSPWMDPNAIG 60 T_reesei mk------tlsvfaaallaavaea--------NPYPPPHSNQAYSPPFYPSPWMDPSAPG 46 : * * * ******:*.* M_thermophila WAEAYAQAKSFVSQMTLLEKVNLTTGVGWGAEQCVGQVGAIPRLGLRSLCMHDSPLGIRG 108 H_insolens WQNAYAKAKAFVSKLTLLEKVNLTTGVGWASEQCVGNTGSVPRLGLRGLCLHDSPLGIRG 120 T_terrestris WTEAYARAKEFVSRMTLLEKVNLTTGVGWEAEQCVGQVGAIPRLGLRSLCMQDSPLGVRG 112 P_anserina WAEAYVKAREFVSQMTLLEKVNLTTGTGWASEQCVGQVGAIPRLGLRSLCMHDAPLGIRG 108 F_oxysporum WEEAYAKAKNFVSQLTLLEKVNLTTGVGWQGERCVGNVGSIPRLGMRGLCLQDGPLGIRL 120 T_reesei WEQAYAQAKEFVSGLTLLEKVNLTTGVGWMGEKCVGNVGTVPRLGMRSLCMQDGPLGLRF 106 * :**.:*: *** :***********.** .*:***:.*::****:*.**::*.***:* M_thermophila ADYNSAFPSGQTVAATWDRGLMYRRGYAMGQEAKGKGINVLLGPVAGPLGRMPEGGRNWE 168 H_insolens SDYNSAFPSGQTTAATFDRILMYRRGYAMGKEAKGKGINVLLGPVAGPLGRMPAAGRNWE 180 T_terrestris TDFNSGFPSGQTAAATFDRGLIYRRGYAMGQEARGKGVNVLLGPVAGPLGRAPTGGRNWE 172 P_anserina TDYNSAFPSGQTAAATWDRQLMYRRGYAIGKEAKGKGINVILGPVAGPLGRMPAAGRNWE 168 F_oxysporum SDYNSAFPAGTTAGASWSKSLWYERGLLMGTEFKGKGIDIALGPATGPLGRTAAGGRNWE 180 T_reesei NTYNSAFSVGLTAAASWSRHLWVDRGTALGSEAKGKGVDVLLGPVAGPLGRNPNGGRNVE 166 :**.* * *..*::.: * ** :* * :***::: ***.:***** .*** * M_thermophila GFAPDPVLTGIGMSETIKGIQDAGVIACAKHFIGNEQEHFRQVPEAQGYGYNISETLSSN 228 H_insolens GFSPDPVLTGVGMAETIKGIQDAGVVACAKHLIGNEQEHFRQAGE--DYGFNITEALSSN 238 T_terrestris GFSPDPVLTGVGMAESIKGIQDAGTIACAKHFIGNEQEHFRQVGEAQGYGFNISEALSSN 232 P_anserina GFSPDPVLTGVGMAETVKGHQDAGVIACAKHFIGNEQEHFRQVGEARGYGFNISETLSSN 228 F_oxysporum GFTVDPYMAGHAMAEAVKGIQDAGVIACAKHYIANEQEHFRQSGEVQSRKYNISESLSSN 240 T_reesei GFGSDPYLAGLALADTVTGIQNAGTIACAKHFLLNEQEHFRQVGEANGYGYPITEALSSN 226 ** ** ::* .:::::.* *:**.:***** : ******** * : *:*:**** M_thermophila IDDKTMHELYLWPFADAVRAGVGSVMCSYQQVNNSYACQNSKLLNDLLKNELGFQGFVMS 288 H_insolens IDDKTMHELYLWPFVDAVRAGVGSVMCAYTQVNNSYSCQNSYLLNYLLKNELGFQGFVMS 298 T_terrestris IDDKTLHELYLWPFADAVRAGVGSVMCSYQQLNNSYSCQNSKLLNGLLKGELGFQGFVMS 292 P_anserina IDDKTMHELYLWPFADAVRAGAGSFMCSYQQVNNSYGCQNSKLMNGLLKDELGFQGFVLS 288 F_oxysporum LDDKTLHELYAWPFADAVRAGVGSVMCSYNQINNSYGCQNSKLLNGILKDEMGFQGFVMS 300 T_reesei VDDKTIHEVYGWPFQDAVKAGVGSIMCSYNQVNNSYACQNSKLINGLLKEEYGFQGFVMS 286 :****:**:* *** ***:**.**.**:* *:****.**** *:* :** * ******:* M_thermophila DWQAQHTGAASAVAGLDMSMPGDTQFNTGVSFWGANLTLAVLNGTVPAYRLDDMAMRIMA 348 H_insolens DWQAQHAGVSAAVAGLDMSMPGDTTFNTGVSFWGANLTLAVLNGTVPRYRIDDMAMRIMA 358 T_terrestris DWQAQHTGAASAVAGLDMTMPGDTEFNTGRSYWGANLTLAVLNGTVPAYRIDDMAMRIMA 352 P_anserina DWQAQHTGAAAAAAGLDMSMPGDTEFNTGVSFWGTNLTVAVLNGTVPAYRIDDMAMRIMA 348 F_oxysporum DWAAQHTGAASAVAGLDMSMPGDTAFDSGYSFWGGNLTLAVINGTVPAWRVDDMALRIMS 360 T_reesei DWQAQHTGVASAVAGLDMTMPGDTAFNTGASYFGSNLTLAVLNGTVPEWRIDDMVMRIMA 346 ** ***:*.::*.*****:***** *::* *::* ***:**:***** :*:***.:***: M_thermophila ALFKVTKTTD-LEPINFSFWTDDTYGPIHWAAKQGYQEINSHVDVRADHGNLIREIAAKG 407 H_insolens AFFKVHPDIH-LDPVNFSFWTRQTYGPLHWRAGDGYQQVNFHVDVREDHHLLIREIAAKG 417 T_terrestris AFFKVNKDIK-LDPINFSFWTLDTYGPIHWAAQTGYQQINYHVDVRADHGSLIREIGAKG 411 P_anserina AFFKVEKSIE-LDPINFSFWSLDTYGPIHWAAGEGHQQINYHVDVRADHANLIREIAAKG 407 F_oxysporum AFFKVGKSVEDLPDINFSSWTRDTFGFVQTFAQENREQVNFGVNVQHDHKNHIRESAAKG 420 T_reesei PFFKVGKTVDSLIDTNFDSWTNGEYGYVQAAVNENWEKVNYGVDVRANHANHIREVGAKG 406 :*** . * **. *: :* :: . :::* *:*: :* *** .*** M_thermophila TVLLKNTGSLPLNKPKFVAVIGEDAGSSPNGPNGCSDRGCNEGTLAMGWGSGTANYPYLV 467 H_insolens TVLLKNTGGLPLKKPKFIAVIGDDAGPNPNGPNSCDDRGCNNGTLAMGWGSGTANFPYLI 477 T_terrestris TVLLKNTGSLPLKKPKFLAVIGEDAGPNTSGPNSCSDRGCDNGTLAMGWGSGTANFPYVV 471 P_anserina TVLLKNTGSLPLNKPKFVAVIGEDAGPNPNGPNSCADRGCNNGTLAMGWGSGTANFPYLI 467 F_oxysporum SVILKNTGSLPLNNPKFLAVIGEDAGPNPAGPNGCGDRGCDNGTLAMAWGSGTSQFPYLI 480 T_reesei TVIFKNNGILPLKKPKFLTVIGEDAGGNPAGPNGCGDRGCDDGTLAMEWGSGTTNFPYLV 466 :*::**.* ***::***::***:*** . ***.* ****::***** *****:::**:: M_thermophila SPDAALQARAIQDGTRYESVLSNYAEEKTKALVSQANATAIVFVNADSGEGYINVDGNEG 527 H_insolens TPDAALQARALRDGTRYESVLTNYALEKTETLVSQANATAIVFVNANSGEGYTRVDGNMG 537 T_terrestris TPDAALQAQALQDGSRYESILSNYATSQIKALVSQANVTAIVFVNADSGEGYINVDGNMG 531 P_anserina TPDAALQAQAIKDGSRYESILTNYAASQTRALVSQDNVTAIVFVNADSGEGYINFEGNMG 527 F_oxysporum TPDQGLQNRAAQDGTRYESILTNNEWAQTQALVSQPNVTAIVFANADSGEGYIEVDGNFG 540 T_reesei TPDAALQSQALQDGTRYESILSNYAISQTQALVSQPDAIAIVFANSDSGEGYINVDGNEG 526 :** .** :* :**:****:*:* : .:**** :. ****.*::***** ..:** * M_thermophila DRKNLTLWNNGDTLVKNVSSWCSNTIVVIHSVGPVLLTDWYDNPNITAILWAGLPGQESG 587 H_insolens DRKNLTLWGNGDDLIKNVSSWCSNTIVVIHSTGPVLLTDWYNSPNITAILWAGLPGQESG 597 T_terrestris DRKNLTLWKDGDALVKNVASWCSNTIVVIHSPGPVLLTEWYNSPNVTAILWAGLPGQESG 591 P_anserina DRNNLTLWRGGDDLVKNVSSWCSNTIVVIHSTGPVLISEWYDSPNITAILWAGLPGQESG 587 F_oxysporum DRKNLTLWQQGDELIKNVSSICPNTIVVLHTVGPVLLADYEKNPNITAIVWAGLPGQESG 600 T_reesei DRKNLTLWKNGDDLIKTVAAVNPKTIVVIHSTGPVILKDYANHPNISAILWAGAPGQESG 586 **:***** ** *:*.*:: :****:*: ***:: :: . **::**:*** ****** ! ! ! ! Discusión ! ! ! 117 Figura 5.1 Alineamiento de la secuencias de aminoácidos de la enzima Bgl1 de M. thermophila C1 con β-glucosidasas de la familia GH3 realizado con el programa Clustal Omega (Sievers y col., 2011). La secuencia en minúscula resaltada en gris son los péptidos señal de las proteínas predichos por el programa SignalP 4.1 (Petersen y col., 2011). Los residuos conservados que forman el sitio activo se encuentran resaltados en amarillo mientras que los residuos catalíticos conservados en la familia GH3 se encuentran resaltados en rosa. En verde se representa una secuencia del dominio catalítico encontrada en la mayoría de las βglucosidasas de la familia GH3. Los residuos de asparragina susceptibles de ser glicosilados, predichos por el programa NetNGlyc 1.0 Server (Blom y col., 2004), se encuentran marcados en negrita. Números de acceso: M. thermophila XP_003663420.1; H. insolens AMQ75895.1; T. terrestris XP_003655388.1; Podospora anserina XP_001907699.1; F. oxysporum EWZ43800.1; T. reesei XP_006965281.1. M_thermophila NSITDVLYGKVNPAARSPFTWGKTRESYGADVLYKPNNGNGAPQQDFTEGVFIDYRYFDK 647 H_insolens NSLVDVLYGDVNPAGRTPFTWGATRESYGVDVMYKPNNDDGAPQQDFDEGVFIDYRYFDR 657 T_terrestris NSIADVLYGRVNPAARSPFTWGPTRESYGTDVLYTPNNGNGAPQDDFTEGVFIDYRYFDK 651 P_anserina NSITDVLYGKVNPSGKSPFTWGATREGYGADVLYTPNNGEGAPQQDFSEGVFIDYRYFDK 647 F_oxysporum NAIADLLYGKVSP-GRSPFTWGRTRESYGTEVLYEANNGRGAPQDDFSEGVFIDYRHFDR 659 T_reesei NSLVDILYGKQSP-GRTPFTWGPSLESYGVSVMTTPNNGNGAPQDNFNEGAFIDYRYFDK 645 *::.*:*** .* .::***** : *.**..*: ** ****::* **.*****:**: M_thermophila V-----------DDDSVIYEFGHGLSYTTFEYSNIRVVKSNVSEYRPTTGTTAQAPTFGN 696 H_insolens E-----------D-TPVIYEFGHGLSYTTFNYSNLKIEKHNAEPYKPTTGKTTPAPTFGQ 705 T_terrestris T-----------N-SSVIYEFGHGLSYTTFEYSNIRVQKSNAGKYEPTTGKTSPAPTFGN 699 P_anserina A-----------N-TSVIYEFGHGLSYTTFEYSNIQVTKKNAGPYKPTTGQTAPAPTFGN 695 F_oxysporum RSPSTDGKSAPNNTAAPLYEFGHGLSWTTFEYSDLNIQKNVNSTYSPPAGQTIPAPTFGN 719 T_reesei VAPGKPR----SSDKAPTYEFGFGLSWSTFKFSNLHIQKNNVGPMSPPNGKTIAAPSLGS 701 . ****.***::**::*::.: * * * * **::*. M_thermophila FS----TDLEDYLFPKDEFPYIYQYIYPYLNTTDPRR-A-SADPHYGQTAEEFLPPHATD 750 H_insolens DDAYGYTGSEKYLFPPSPFRRITDYIYPYLNSTDPHE-A-SLDPHYGQTAEQFLPPGALR 763 T_terrestris FS----TNLKDYVFPSHEFPYVYEYIYPYLNTTDPKA-A-SGDANYGQTADKFLPPHATD 753 P_anserina FS----TDLSDYLFPDEEFPYVYQYIYPYLNTTDPRN-A-SGDPHFGQTAEEFMPPHAID 749 F_oxysporum FS----KNLNDYVFPKG-VRYIYKFIYPFLNTSSSASEASNDGGQFGKTAEEFLPPNALN 774 T_reesei FS----KNLKDYGFPKN-VRRIKEFIYPYLSTTTSGKEASG-DAHYGQTAKEFLPAGALD 755 . . ..* ** . : .:***:*.:: * .:*:**.:*:* * M_thermophila DDPQPLLRSSGGNSPGGNRQLYDIVYTITADITNTGSVVGEEVPQLYVSLGGPEDPKVQL 810 H_insolens ADEQPLLRASGQHQPGGNPGLWDVLYTITADITNMGSVTGDEVPQLYVSLGGPQDPKVVL 823 T_terrestris SSAQPLLRSSGKNSPGGNRQLYDVMYTITADIKNTGSIVGEEVPQLYVALGGPDDPKVQL 813 P_anserina DSPQPLLPSSGKNSPGGNRALYDILYEVTADITNTGEIVGDEVVQLYVSLGGPDDPKVVL 809 F_oxysporum GSAQPRLPSSG--APGGNPQLWDILYTVTATITNTGNATSDEIPQLYVSLGGENEPVRVL 832 T_reesei GSPQPRSAASG--EPGGNRQLYDILYTVTATITNTGSVMDDAVPQLYLSHGGPNEPPKVL 813 . ** :** **** *:*::* :** *.* *. : : ***:: ** ::* * M_thermophila RDFDRMR-IEPGETRQFTGRLTRRDLSNWDVTVQDWVISRYPKTAYVGRSSRKLDLKIEL 869 H_insolens RGFDRLREIGPGETRQFMARLTRRDLSNWDPVLQDWVVGGHKKTVFVGKSSRKLELSAEL 883 T_terrestris RDFDRIR-IDPGKTAQFRGTLTRRDLSNWDTTLQDWVISKYKKTAYVGRSSRKLDLSIEL 872 P_anserina RDFGKLR-IEPGQTAKFRGLLTRRDLSNWDVVSQDWVISEHTKTVFVGKSSRDLGLSAVL 868 F_oxysporum RGFDRIENIAPGQSAIFNAQLTRRDLSNWDVNAQNWVITDHPKTVWVGSSSRKLPLSAKL 892 T_reesei RGFDRIERIAPGQSVTFKADLTRRDLSNWDTKKQQWVITDYPKTVYVGSSSRDLPLSARL 873 * * ::. * **:: * . ********** *:**: : **.:** ***.* *. * M_thermophila P 870 H_insolens P 884 T_terrestris P 873 P_anserina E 869 F_oxysporum E 893 T_reesei P 874! ! ! ! ! Discusión ! ! ! 118 Las enzimas β-glucosidasas han sido ampliamente estudiadas en la literatura debido a su gran valor en la industria como elemento final en la ruta de degradación de la celulosa, pudiendo llegar a ser el cuello de botella del proceso debido a inhibición por producto de la propia degradación de la celulosa (Sørensen y col., 2013). Han sido extensamente caracterizadas β-glucosidasas de géneros como Aspergillus (Kitpreechavanich y col., 1986) o Trichoderma (Chauve y col., 2010) por su aplicación comercial. 5.1.1 Constantes cinéticas de las β-glucosidasas La enzima Bgl1 de M. thermophila sido previamente caracterizada por Zhao y col. (2015), nombrada como Bgl3b. Los datos presentados previamente no son comparables a los descritos en esta tesis ya que se utilizó para la caracterización cinética el sustrato análogo pNGP, en lugar del sustrato natural celobiosa. Además, la enzima fue expresada de manera heteróloga en la levadura P. pastoris, por lo que las modificaciones postraduccionales de la enzima son significativamente distintas, ya que esta levadura produce proteínas con la mayoría de sus sitios de N-glicosilación modificados con entre 8 y 14 residuos de manosa (Grinna y Tschopp 1989). El efecto de la glicosilación de las celulasas ha sido ampliamente estudiado, demostrando que esta modificación postraduccional aporta multiplicidad, estabilidad y modifica la actividad de las enzimas tanto frente a sustratos análogos como a sustratos naturales (Juturu y col., 2014, Dotsenko y col.,2016). Otras enzimas β-glucosidasas de M. thermophila han sido caracterizadas previamente. Karnaouri y col. (2013) expresaron la enzima MtBgl3a en P. pastoris cuya Km para la celobiosa fue de 2,64 mM, muy similar a la obtenida en este trabajo. Roy y col. (1991) purificaron una β-glucosidasa extracelular de M. thermophila cuya Km para la celobiosa fue de 8,0 mM, dentro del mismo orden de magnitud que la Bgl1. La Tabla 5.1 resume constantes cinéticas de β-glucosidasas producidas por otros hongos encontradas en la bibliografía. La afinidad que presentan estas enzimas por la celobiosa es muy variada, encontrado enzimas con gran afinidad como la Bgl de H. insolens u otras que muestra menos afinidad por este sustrato, como la BglA de Thermotoga neapolitana, cuya Km es dos ordenes de magnitud mayor que la de la primera. Se estudió la inhibición producida por la glucosa en la enzima Bgl1 utilizando celobiosa como sustrato. La inhibición resultó ser competitiva, fenómeno muy común en la inhibición de las β-glucosidasas por glucosa (Saha y col., 1996). La Ki para la glucosa fue de 0,71 mM, similar a la enzima β-glucosidasa de Penicillium brasilianum o la β-glucosidasa de A. niger del cóctel comercial Novozym-188 (Tabla 5.1). No existen más datos de constantes inhibitorias debido a que la mayoría de los autores utilizan el sustrato análogo pNGP para calcularlas. ! ! ! ! Discusión ! ! ! 119 Tabla 5.1 Comparativa de constantes cinéticas de distintas enzimas β-glucosidasas usando celobiosa como sustrato. (a) Enzima β-glucosidasa purificada del caldo de cultivo. (b) Enzima β-glucosidasa expresada de manera heteróloga en bacterias o levaduras. La hidrólisis del pNGP mediada por la enzima Bgl1 evidencia una desviación del modelo de Michaelis-Menten mediante un comportamiento bifásico en el que a altas concentraciones de sustrato se observa cierta inhibición (Figura 4.3). Este comportamiento ha sido previamente descrito por otros autores como Daroit y col. (2008) o Krogh y col. (2010). Además de la hidrólisis de los enlaces glucosídicos, algunas enzimas β-glucosidasa pueden catalizar simultáneamente la síntesis reversa o transglicosilación a altas concentraciones de sustrato. La hidrólisis del enlace glucosídico mediante mecanismo de retención, expuesto en la introducción (Apartado 1.5), forma inicialmente un complejo glicosil covalente con la enzima. Este intermediario se descompone en la segunda etapa de la reacción, lo que se puede producir mediante una molécula de agua (actividad hidrolítica) o mediante un azúcar aceptor (actividad de transglicosilación). En la reacción de transglicosilación más sencilla, el aceptor es el propio sustrato. Esta reacción inhibe la hidrólisis de manera proporcional con un incremento de la concentración de sustrato. Por lo tanto la transglicosilación puede emular la inhibición por sustrato en las reacciones de hidrólisis de enlace glucosídico por mecanismo de retención (Bohlim y col., 2013). Debido a la desviación del modelo de Michaelis-Menten que presenta esta enzima no se calcularon las constantes cinéticas. Sin embargo podemos afirmar que la enzima Bgl1 muestra una mayor actividad en la hidrólisis del pNGP que en la hidrólisis de la celobiosa. Como se adelantó en la introducción, muchas de las enzimas β-glucosidasas caracterizadas muestran este comportamiento debido a que la cinética de las β-glucosidasas depende de la configuración del sustrato y para la hidrólisis de la celobiosa se requiere un cambio conformacional que no es necesario para la hidrólisis del pNGP (Nam y col., 2010). Organismo Enzima Vmax (U/mg) Km (mM) Ki glucosa (mM) Referencia M. thermophila C1 Bgl1 1666 20,71 Presente trabajo a M. thermophila MtBgl3a - 2,64 - Karnaouri y col., 2013 b A. fumigatus Z5 nBgl3 52,37 1,75 - Liu y col., 2012 a A. orizae CBS 12559 HGT-BG 353 7 - Riou y col., 1998 a A. niger Novozym-188 - 0,35 1,6 Krogh y col., 2010 a T. thermosaccharolyticum BGL 120 7,9 - Pei y col., 2012 b T. neapolitana rBglA - 66,6 - Park y col., 2005 b P. brasilianum rBgl 28 1,58 1,1 Krogh y col., 2010 b M. purpureus NRRL1992 βG4,71 2,86 - Daroit y col., 2010 a T. reesei BglI 43,5 2,1 - Chen y col., 1992 a T. reesei BglII 9,8 11,11 - Chen y col., 1992 a H. insolens Bgl 86 0,51 - Souza y col., 2010 a F. palustris BGL - 4,81 - Yoon y col., 2007 a Phoma sp. KCTC11825BP BGL - 3,2 - Choi y col., 2011 a ! ! ! ! Discusión ! ! ! 120 5.1.2 Termoestabilidad de las β-glucosidasas Muchos autores afirman haber descubierto enzimas β-glucosidasas termoestables, sin embargo normalmente los ensayos a altas temperaturas están hechos exclusivamente durante cortos periodos de tiempo (Yeoman y col., 2010). La hidrólisis de biomasa lignocelulósica a nivel industrial requiere de 3 a 5 días y para el propósito de este proyecto el proceso se encuentra optimizado a 72h. Por lo tanto, resulta imprescindible que las enzimas utilizadas no pierdan actividad durante el transcurso del proceso. Más evidente aun si cabe, es el caso de la enzima βglucosidasa, ya que al ser la última enzima en actuar en la hidrólisis de la celulosa, la pérdida de actividad debida a las condiciones de pH y temperatura pueden suponer un cuello de botella en la sacarificación, no llegándose a obtener los niveles de glucosa objetivo. Tras los ensayos realizados en esta tesis se puede afirmar que la enzima Bgl1 es termoestable en las condiciones del proceso, haciéndola una candidata idónea para su uso (Figura 4.5B). Previamente Zhao y col., (2015) observaron cierto grado de termoestabilidad de esta enzima hasta 60ºC, sin embargo y tal y como se ha mencionado, los ensayos fueron realizados tan sólo a un máximo de 120 min, tiempo insuficiente para demostrar la termoestabilidad de la enzima en hidrólisis de biomasa lignocelulósica. Otra β-glucosidasa de M. thermophila, MtBgl3a, tan sólo resiste a 50ºC durante 60 min a pH 6,5, disminuyendo su actividad hasta un 50% tras 240 min de incubación (Karnaouri y col., 2013). Existen datos reportados de β-glucosidasa de otros hongos: la GH3 de P. brasilianum es termoestable durante 24 h a 60ºC en un rango de pH de 4 a 6 (Krogh y col., 2010); una β-glucosidasa extracelular del hongo basidiomiceto Fomitopsis palustris resultó ser termoestable entre 45 y 55ºC hasta 50 h de incubación (Yoon y col., 2008). La termoestabilidad de las enzimas puede ser medida también según su temperatura de fusión (Tm). Para ello, la enzima se incuba a distintas temperaturas durante cortos periodos de tiempo y se realiza un ensayo para determinar la actividad residual de la misma. Según este método, le enzima Bgl1 es estable hasta los 60ºC, obteniéndose una Tm de 69ºC (Figura 4.5A). La β-glucosidasa extracelular de A. niger es termoestable hasta los 55ºC, mientras que su Tm es de 59ºC (Yan y col., 1997). La Bgl3 de Aspergillus fumigatus Z5, tanto la producida por el hongo como la recombinante, mantiene la totalidad de su actividad tras la incubación hasta los 50ºC, siendo su Tm de 70 y 73ºC respectivamente (Liu y col., 2012). En este caso, parece ser que la glicosilación producida por el hospedador en la enzima Bgl3 recombinante aporta mayor termoestabilidad frente a la producida por el propio hongo. ! ! ! ! Discusión ! ! ! 121 5.1.3 Efecto de la temperatura y el pH en la actividad de las βglucosidasas En los resultados obtenidos en esta tesis se muestra que la enzima Bgl1 tiene su máximo de actividad entre 50ºC y 60ºC reduciendo dicha actividad a partir de los 65ºC(Figura 4.5C). Sin embargo, Zhao y col. (2015) establecen un óptimo de temperatura para esta enzima de 50 a 65ºC. Esta alteración probablemente sea debida a las modificaciones postraduccionales sufridas en la expresión heteróloga de la enzima en P. pastoris, en concreto a la glicosilación que este organismo produce. Ya se comentó anteriormente casos en los que se evidencian diferencias en el comportamiento de una enzima expresada de manera heteróloga frente a la expresada por su propio hospedador (Liu y col., 2012). Karnouri y col. (2013) expresaron de manera heteróloga en levadura la Bgl3a de M. thermophila, obteniendo una temperatura óptima de 70ºC. Parece lógico pensar que un mismo organismo cuente con distintas enzimas que realicen una misma función dentro de condiciones distintas, de manera que pueda adaptarse a distintos ambientes. No obstante, habría que confirmar estos resultados con la enzima expresada en M. thermophila. Dentro del rango de temperaturas óptimas de la enzima Bgl1 se encuentran la βglucosidasa del hongo Aspergillus oryzae (50ºC, Riou y col., 1998), la de A. fumigatus expresada en P. pastoris (60ºC, Liu y col., 2012), la β-glucosidasa intracelular de Talaromyces thermophilus CBS 236.58 (50ºC, Nakkharat y col., 2006) o de Candida peltata (50ºC, Saha y col., 1996). Por debajo de esta temperatura óptima se encuentran las β-glucosidasas de Aspergillus ochraceus (40ºC, Asha y col. 2016), del hongo filamentoso Termitomyces clypeatus (45ºC, Pal y col., 2010) o la de Debaryomyces vanrijiae (40ºC, Belancic y col., 2003). Sin embargo existen otro grupo de enzimas que proviene de organismos hipertermófilos cuya temperatura óptima está comprendida por encima de los 70ºC, como es el caso de la β-glucosidasa de bacteria marina T. neapolitana expresada en E. coli (95ºC, Park y col., 2005). Para el proceso industrial de hidrólisis de biomasa lignocelulósica es preferible la utilización de enzimas de organismos termófilos. La utilización de enzimas termotolerantes en el proceso de hidrólisis permite la aplicación de altas temperaturas de reacción. Estas altas temperaturas aportan numerosas ventajas dado que las enzimas derivadas de hongos termófilos tienen mejores capacidades hidrolíticas que las enzimas derivadas de hongos mesófilos, como mayor velocidad de reacción y tiempos de incubación reducidos (Berka y col., 2011; Singh y col., 2014). El uso de altas temperaturas también reduce el riesgo de contaminación, reduce la viscosidad de sustrato y mejora la transferencia de masa. También las enzimas termófilas pueden ser conservadas por periodos de tiempo prolongados a temperatura ambiente. Por último pierden menos actividad durante el proceso a alta temperatura frecuentemente usados en el pretratamiento de los materiales crudos. El amplio rango de temperatura óptima de la enzima Bgl1 permitiría incluso una posible subida de la temperatura de hidrólisis en beneficio de las mejoras mencionadas. ! ! ! ! Discusión ! ! ! 128 5.2.1 Caracterización de las enzimas Cbh1 y Cbh4 Aunque existe mucha información bioquímica acerca de las celobiohidrolasas de tipo I y II pertenecientes a las familias GH6 y GH7, la comparativa resulta dificultosa debido a la gran cantidad de ensayos y sustratos que se utilizan. Atendiendo a la afinidad de la enzima por el sustrato soluble pNCB, se observa que la enzima Cbh1 es similar en esta propiedad a las encontradas en la bibliografía, manteniéndose la Km en casi todos los casos en el mismo orden de magnitud. El valor de Km se encuentra dentro de mismo rango que el que determinaron previamente Gusakov y col. (2005). En cuanto a la inhibición, la Ki para la celobiosa se encuentra dentro del mismo rango que otras celobiohidrolasas, mostrando una inhibición competitiva. En este caso, el valor de Ki no coincide con el determinado por Gusakov y col. (2005), aumentando en dos órdenes de magnitud (Tabla 5.2). Teniendo en cuenta que las diferentes condiciones de cultivo varían las modificaciones postraduccionales de las enzimas y éstas a sus vez las propiedades de las mismas (Stals y col., 2004), se puede achacar la diferencia en la constante de inhibición a condiciones de cultivo distintas en el trabajo de Gusakov y esta tesis. ! Tabla 5.2 Constantes cinéticas usando pNCB como sustrato de distintas enzimas celobiohidrolasas fúngicas de la familia GH7 purificadas de caldo de cultivo *M. thermophila previamente clasificada como Chrysosporium lucknowense ! Aunque los datos con el sustrato soluble pNCB resultaron útiles para hacer la comparativa de las constantes cinéticas de las celobiohidrolasas tipo I (las de tipo II no son activas frente a este sustrato) se decidió hacer una caracterización con un sustrato polimérico (Avicel), más parecidos al sustrato real. El motivo que nos llevó a caracterizar estas enzimas con Avicel es que los pequeños oligómeros que se suelen usar como sustratos análogos no son fiables para una buena caracterización por no comportarse de la misma manera que los sustratos poliméricos, al no participar en su actividad fenómenos como la procesividad de la enzima. Diferentes autores ha Organismo Enzima Vmax (U/mg) Km (mM) Ki celobiosa (mM) Referencia M. thermophila C1 Cbh1 0,09 0,63 1,25 Este trabajo C. lucknowense* CBHI - 0,16 0,09 Gusakov y col., 2005 T. reesei CBHI - 0,06 0,05 Gusakov y col., 2005 P. canescens PcCel7A - 1,0 - Volkov y col., 2014 T. emersonii CBH IA 159,7 2,1 2,5 Tuhohy y col., 2002 T. emersonii CBH IB 28,4 0,8 0,18 Tuhohy y col., 2002 P. chrysosporium CBH I - 0,38 0,065 Igarashi y col., 1998 T. viride CBH I - 0,03 - Igarashi y col., 1998 P. purpurogenum CBH 11,9 1,1 - Lee y col., 2011 T. versicolor TvCel7a 1 0,58 0,49 Lahjouji y col., 2007 P. occitanis CBHI - 1 2 Liman y col., 1995 P. occitanis CBHII - 5 No inhibición Liman y col., 1995 ! ! ! ! Discusión ! ! ! 129 observado diferencias de comportamiento cuando se usa un sustrato soluble frente a un sustrato polimérico, como Voutilainen y col. (2007) que manifestó que el mutante termoestable de la enzima Cel7B de Melanocarpus albomyces más activo frente a sustratos solubles era el menos activo en la hidrólisis de Avicel. Además se ha demostrado que dichos sustratos poliméricos estabilizan la enzima, no así los sustratos solubles. Por ejemplo, previamente Voutilainen y col. (2008) observaron que la enzima Cel7A de Chaetomium thermophilum tenía una Km relativamente alta con sustratos solubles, pero no se estabilizaba muy bien con sustratos poliméricos respecto a otras enzimas, lo que indica que el comportamientos puede variar notablemente de un tipo de sustrato a otro.! ! Para la enzima Cbh1 de M. thermophila se determinó una Vmax de 286 U/g utilizando Avicel como sustrato, frente a las 91 U/g cuando se usó pNCB. Esto demuestra que la enzima es más activa sobre sustratos poliméricos (Tabla 5.3). Los valores de actividad específica obtenidos por Gusakov y col. (2007) son similares, aun llevando a cabo condiciones de ensayo distintas en cuento a concentración de sustrato y temperatura. Prestando atención a la enzima Cbh4 de M. thermophila C1 observamos que no es activa frente a sustratos solubles como el pNCB, por lo que no se pudo caracterizar con este sustrato, dificultando su estudio comparativo con otras enzimas celobiohidrolasas de la familia GH6 presentes en la bibliografía. Atendiendo exclusivamente a la comparativa con la enzima Cbh1, se concluye que la Cbh4 tiene una Vmax con Avicel como sustrato claramente superior de 833 U/g frente a 286 U/g de la Cbh1. Sin embargo, siendo más activa la enzima Cbh4, también es menos afín por este sustrato como demuestra su mayor Km (26 g/L de la Cbh4 frente a 10 g/L de la Cbh1). Contradiciendo las afirmaciones de Voutilainen y col. (2007) que indica que las celobiohidrolasas en general no suelen tener un comportamiento que se ajuste al modelo de Michaelis-Menten con sustratos poliméricos, las enzimas Cbh1 y Cbh4 se ajustaron perfectamente a dicho modelo en su caracterización con Avicel como sustrato. Al igual que con la enzima Cbh1, el valor de actividad específica para la Cbh4 obtenidos por Gusakov y col. (2007) es semejante a pesar de las distintas condiciones de ensayo. Atendiendo a este parámetro, la Cbh4 se posiciona como una de las celobiohidrolasas de la familia GH6 más activas, tan sólo por detrás de la enzima CBHII de T. emersonii cuya actividad es excepcionalmente alta, y la enzima Cel6A de Neocallimastix patriciarum. Ninguna de las dos celobiohidrolasas caracterizadas ha mostrado ser inhibida por glucosa, fenómeno frecuente en otras celobiohidrolasas, aunque con excepciones como la enzima TrCel6A de T. reesei donde la glucosa resulta ser un inhibidor no competitivo (Teleman y col., 1995). Analizando la inhibición producida por la celobiosa se determinó que sus Ki son similares para ambas enzimas (0,8 mM para Cbh1 y 1,3 mM para Cbh4). Ambas enzimas mostraron una inhibición competitiva, comportamiento bastante habitual en la inhibición por celobiosa de las celobiohidrolasas, como la enzima TrCel6A de T. reesei (Teleman y col., 1995). La inhibición por celobiosa sufrida por las enzimas Cbh1 y Cbh4 es contrarrestada en la hidrólisis de biomasa lignocelulósica por la acción de la β-glucosidasa que degrada la ! ! ! ! Discusión ! ! ! 130 celobiosa presente a glucosa. Es importante que ambas celobiohidrolasas no sean inhibidas por glucosa ya que en el caso de darse ese comportamiento podría ralentizar la hidrólisis, no llegando a los rendimientos esperados. El mecanismo de inhibición de las celobiohidrolasas de M. thermophila es desconocido pero existen datos de enzimas homólogas de la familia GH7. Jalak y col. (2012) en un estudio de inhibición con la enzima TrCel7A propusieron que la celobiosa competía con las cadenas de celulosa por la unión al sitio activo de la enzima, reduciendo de esta manera el número de puntos de inicio. Además, la celobiosa podría unirse al sitio del producto, lo que restringe la posibilidad del movimiento procesivo, contribuyendo a un mecanismo de inhibición no competitiva. Mientras que la inhibición de las celobiohidrolasas de la familia GH7 ha sido ampliamente estudiada, no existen muchos datos sobre la inhibición de las celobiohidrolasas de la familia GH6, y generalmente la información que hay es usando cócteles más que con enzimas purificadas (Payne y col., 2015). ! Tabla 5.3Propiedades de distintas celobiohidrolasas: actividad específica con Avicel como sustrato, temperatura y pH óptimo (1) Chrysosporium lucknowense está actualmente clasificado como Myceliophthora thermophila. (2) El ensayo de actividad se realizó con 10 g/L de Avicel como sustrato. (3) El ensayo de actividad se realizó con una concentración de sustrato de 5 g/L de Avicel. M. thermophila C1 Cbh1 GH7 157 50 4,5 - 5,0 Este trabajo M. thermophila C1 Cbh4 GH6 268 60 5,0 - 6,0 Este trabajo C. lucknowense (1) CBHI GH7 210 (3) - 5,0 - 5,5 Gusakov y col., 2005 C. lucknowense (1) CBHIIb GH6 220 (3) -5,0 Gusakov y col., 2007 A. nidulans FGSC A4 CBHII GH6 -57 5,5 Bauer y col., 2006 F. pinicola CBH GH7 7890 50 5 Shin y col., 2010 H. insolens CBH I GH7 - - 5,0 Schülein y col., 1997 H. insolens CBH II GH6 - - 9,0 Schülein y col., 1997 N. patriciarum J11 CelA GH6 1100 50 6,0 Wang y col., 2013 P. anserina PaCel6A GH6 7,6 55 7,0 Poidevin y col., 2013 P. anserina PaCel6C GH6 1,9 35 5,0 Poidevin y col., 2013 P. canescens PcCel7A GH7 100 (2) - 4,0 - 4,5 Volkov y col., 2014 P. occitanis CBHI GH7 420 60 4,0 - 5,0 Liman y col., 1995 P. occitanis CBHII GH6 130 65 4,0 - 5,0 Liman y col., 1995 P. purpurogenum CBH GH7 6500 60 5 Lee y col., 2011 T. aurantiacus CBHI GH7 30 65 6 Hong y col., 2003 T. emersonii CBH IA GH7 24800 78 3,6 Tuhohy y col., 2002 T. emersonii CBH IB GH7 5600 66 - 69 4,1 Tuhohy y col., 2002 T. emersonii CBHII GH6 16500 68 3,8 Tuhohy y col., 2002 T. harzianum IOC 3844 ThCBHI GH7 1250 50 5,0 Colussi y col., 2011 T. reesei CBHI GH7 14 - - Tomme y col., 1988 T. reesei TrCel6A GH6 16,4 65 5,0 Poidevin y col., 2013 T. versicolor TvCel7a GH7 138 40 5 Lahjouji y col., 2007 Referencia Organismo Enzima Actividad específica (U/g) (2) Tª óptima (ºC) pH óptimo Familia ! ! ! ! Discusión ! ! ! 131 5.2.2 Efecto de la temperatura y el pH sobre la actividad de las celobiohidrolasas Cuando se estudiaron las temperaturas óptimas de las enzimas Cbh1 y Cbh4 de M. thermophila C1 se determinó que dichas temperaturas era 50º y 60ºC respectivamente, ambas con un rango de 5ºC por encima y por debajo donde conservan una actividad del 80% (Figura 4.10C y 4.14C). Sabiendo que este organismo es termófilo, concuerda que sus celulasas principales tengan temperaturas óptimas elevadas. En la Tabla 5.3 se muestra la temperatura óptima de algunas de las celobiohidrolasas recogidas en la literatura, y se puede concluir que el óptimo de las celobiohidrolasas aquí caracterizadas se encuentra en el mismo rango que la mayoría de estas, no existiendo diferencias entre familias. Al analizar la desnaturalización térmica de las enzimas Cbh1 y Cbh4 de M. thermophila C1 la temperatura de fusión obtenida fue de 63ºC y 66ºC respectivamente (Figura 4.10A y 4.14A), similar a los 65ºC de la enzima Cel7A de T. ressei (Voutilainen y col., 2008), superior a los 60ºC encontrados en las CBHI y CBHII de P. occitanis (Limam y col., 1995) o los 62ºC de la enzima CelA de N. patriciarum (Wang y col., 2013) e inferior a la temperatura de fusión de Cel7A de T. emersonii, de 75ºC (Voutilainen y col., 2014). Otra característica relevante estudiada fue la termoestabilidad de las enzimas celobiohidrolasas. La importancia del uso de enzimas termoestables recae en que pueden ser usadas directamente tras el pretratamiento, cuando la biomasa aún está a una temperatura elevada. De esta manera se disminuye el tiempo de proceso, con el consiguiente ahorro de energía. Muchas de las celobiohidrolasas descritas en la literatura dicen ser termoestables por resistir temperaturas mayores de 50ºC durante escasas horas. En un proceso de hidrólisis enzimática de biomasa lignocelulósica las enzimas han de ser activas a 50ºC al menos durante las 72 horas que dura el proceso de sacarificación. Previamente, la enzima Cbh1 de M. thermophila mostró ser estable hasta 5 y 24 horas de incubación a 50ºC (Bukhtojarov y col., 2004, Gusakov y col., 2005), pero en este trabajo se ha demostrado su termoestabilidad durante el proceso completo, haciéndola en este aspecto una candidata ideal para su uso en producción de bioetanol (Figura 4.10B). Otras celobiohidrolasas que muestran ser termoestables durante un tiempo suficiente son la enzima CBHI de T. aurantiacus que resiste hasta una semana o la enzima CBH de Fomitopsis pinicola que tolera 144h a 50ºC (Hong y col., 2003, Shin y col., 2010). Anteriormente se había evaluado la termoestabilidad de la enzima Cbh4 a pH 5,0 y 50ºC durante 24h (Gusakov y col., 2007). Sin embargo, en los experimentos realizados en esta tesis se ha demostrado que no es termoestable en esas condiciones, ya que en las primeras 24h de incubación se pierde un 10% de actividad, reduciendo su actividad hasta en un 25% tras las 72h del proceso completo de incubación (Figura 4.14B). Otras celobiohidrolasas de la familia GH6 tampoco resultan termoestables, como es el caso de las enzimas PaCel6A y PaCel6C de P. anserina que tan sólo resisten una incubación de 24h a 45º y 35ºC respectivamente ! ! ! ! Discusión ! ! ! 132 (Poidevin y col., 2013) o de la enzima CelA de N. patriciarum J11 que tras una hora de incubación tan sólo retiene el 70% de su actividad (Wang y col., 2013). Aunque la termoestabilidad es una de las características más estudiadas de las enzimas industriales, no existen reglas establecidas que correlacionen la secuencia de aminoácidos de una proteína y esta propiedad. Las variaciones en la estructura secundaria de una proteína termófila frente a una proteína mesófila no son más de las que se encuentran entre dos proteínas homólogas. Esta característica es el resultado de muchos cambios acumulativos en las interacciones hidrofóbicas en el núcleo de la estructura de una proteína, en las interacciones electroestáticas y en los puentes de hidrógeno (Voet 2006). Una explicación a la termoestabilidad es que puede deberse a una superabundancia de puentes salinos en la superficie de la proteína (Voet 2006). También se ha intentado aumentar la termoestabilidad de distintas celulasas de la familia GH6 mediante la introducción de puentes disulfuro adicionales, como es el caso de Thermobifida fusca donde semutaron dos residuos de la proteína a cisteína para la formación del puente disulfuro, obteniendo un ligero aumento de la termoestablidad a la vez que un descenso en la producción de proteína (Ai y Wilson., 2002). Por otro lado, en un estudio con varias celobiohidrolasas de la familia GH6 tanto nativas como modificadas genéticamente, se demostró que mientras los puentes disulfuro son esenciales para mantener la actividad de la enzimas tras una incubación a altas temperaturas, los residuos de cisteína libres contribuyen a la inactivación térmica irreversibles de las proteínas (Wu et al., 2013). Ante estas evidencias y conociendo la pérdida de actividad que sufre la Cbh4 de M. thermophila C1 tras la incubación a 50ºC durante 72h, podría ser interesante para futuros trabajos mejorar la termoestabilidad de la enzima haciendo especial énfasis en los puentes disulfuro y la presencia de cisteínas libres en su estructura. Atendiendo al perfil de actividad de las enzimas frente a pH se determinó que el óptimo de la enzima Cbh1 de M. thermophila C1 era 4,5-5,0 (Figura 4.10D). Estos datos no concuerdan con los publicados por Gusakov y col. (2005) que afirmaban que el pH óptimo de la enzima se encontraba en el rango de 5,0-5,5. En concreto, a pH 5,5 en este trabajo se observa una caída de la actividad de un 20%. Gusakov y col. (2007) establecieron que el pH óptimo de la Cbh4 (nombrada como CBHIIb) era de 5,0, sin embargo se ha demostrado que la enzima tiene un rango óptimo ampliado, manteniendo el 100% de su actividad entre pH 5,0 y 6,0 (Figura 4.14D). El rango de pH óptimo de ambas celobiohidrolasas es adecuado para la hidrólisis de biomasa lignocelulósica en las condiciones del proyecto para la producción de bioetanol de segunda generación. La mayoría de las celobiohidrolasas fúngicas caracterizadas tienen un pH óptimo desplazado a zonas ácidas como se observa en la Tabla 5.3, sin observarse diferencias entre las familias GH6 y GH7 más allá de las propias entre diferentes enzimas de una misma familia. ! ! ! ! Discusión ! ! ! 133 5.3 La enzima Eg2 frente a otras endoglucanasas La actividad catalítica de las enzimas endoglucanasas (EC 3.2.1.4) es la hidrólisis de los enlaces glucosídicos β(1,4) internos de los polímeros de celulosa, de manera aleatoria. Pueden pertenecer a diversas familias de glicosil hidrolasas, como GH 5, 6, 7, 9, 12 y 45. Dependiendo de la familia a la que pertenecen cantienen una mayor especificidad por unos sustratos u otros (Vlasenko y col., 2010). La enzima Eg2 de M. thermophila C1 pertenece a la familia GH5. La secuencia consta de 389 aminoácidos subdivididos en un péptido señal (residuos 1-16), un dominio de unión a carbohidratos tipo I (residuos17-52), un conector rico en serina y treonina (residuos 53-86) y un dominio catalítico de la familia GH5 (residuos 87-389), dominios según InterProScan (Jones y col., 2014). Los residuos catalíticos han sido identificados por homología con otras endoglucanasas de la familia GH5, en concreto con la enzima Cel5A de T. aurantiacus (Leggio y col., 2002). Glu216 es el residuo ácido/base mientras que Glu323 es el nucleofílico, mostrados en la Figura 5.4 resaltados en rosa. Además esta enzima conserva otros residuos del sitio activo propios de esta familia: Arg132, His176, Asn215, His281, Tyr283 y Trp356. El sitio activo está formado por un surco surcado por aminoácidos aromáticos típica de las glicosil hidrolasas: Trp356, Trp361, Trp362, Trp253, Trp257 y Tyr200. Estos aminoácidos se encuentran conservados a excepción de Trp278, Trp279 y Trp174 en la endoglucanasa de T. reesei. La conformación cis del enlace peptídico que une los residuos Trp356 y Ala357 está conservada en la familia 5 y se cree que es importante para el posicionamiento de la cadena lateral del triptófano, lo cual es importante para la unión al sustrato. Al igual que el residuo Trp356, se ha descrito que el residuo conservado His176 participa en la unión al sustrato (Leggio y col., 2002). La enzima Eg2 cuenta con 3 posibles sitios de N-glicosilación, Asn93, Asn156 y Asn260. Gusakov y col. (2008) demostraron que tan sólo el residuo Asn156 estaba ocupado. Sin embargo, se encuentra ampliamente descrita la dependencia del tipo y las condiciones de cultivo del hongo (Stals y col., 2004), por lo que en las condiciones de fermentación utilizadas en este trabajo no se puede afirmar que no haya más sitios ocupados con diferentes cadenas de azúcares, explicando de esa manera al aumento de peso experimental respecto al teórico de 8 kDa (Tabla 4.11). También cuenta con dos sitios de O-glicosilación en el dominio catalítico, Thr261 y Ser297, predichos por el programa NetOGlyc 4.0 Server (Julenius y col., 2005), además de múltiples sitios en el péptido de unión. Presenta una identidad del 74% con la endoglucanasa 3 de N. crassa, un 61% con la Eg3 de F.oxysporum y un 66% con la endoglucanasa de A. fumigatus (números de acceso en pie Figura 5.4). ! ! ! ! Discusión ! ! ! 134 Figura 5.4 Alineamiento de la secuencia de aminoácidos de la enzima Eg2 de M. thermophila C1 con endoglucanasas de la familia GH5 realizado con el programa ClustalOmega (Sievers y col., 2011). Las secuencias en minúsculas resaltadas en gris son los péptidos señal de las proteínas predichos por el programa SignalP 4.1 (Petersen y col., 2011). Resaltado en azul se representa en dominio de unión a carbohidratos tipo I. Las secuencias de aminoácidos en verde representan el conector. Los residuos conservados en la familia GH5 se marcan en amarillo, mientras que los residuos catalíticos están resaltados en rosa y aquellos que forman el sitio activo en verde. En la secuencia de Eg2 de M. thermophila los residuos de asparragina suceptibles de N-glicosilación se encuentran marcados en negrita al igual que los de serina y treonina suceptibles de O-glicosilación. En rojo se marca un residuo con posible implicación en el perfil de pH (Wang y col., 2005). Números de acceso: N. crassa XP_964159.1; F. oxysporum EMT69524.1; A. fumigatus Z5 KMK63077.1; T. reesei P07982.1; T. aurantiacus AAL88714.2. M_thermophila -----mkssilasvfatgavaQSGPWQQCGGIGWQGSTDCVSGYHCVYQNDWYSQCVPGA 55 F_oxysporum -----mkslfalslfaglsvaQNAAWAQCGGNGWTGSKNCVSGYKCTVVNEWYSQCIPGT 55 N_crassa -----mkatilastfaagalaQSGAWGQCGGNGWSGATSCISGYACNYVNDWYSQCQPGT 55 T_ressei mnksvaplllaasilyggavaQQTVWGQCGGIGWSGPTNCAPGSACSTLNPYYAQCIPGA 60 A_fumigatus ------------------------------------------------------------ T_aurantiacus ------------------------------------------------------------ M_thermophila ASTTLQTSTTSRPTATSTAPPS-STTSPSKGKLKWLGSNESGAEFGEGNYPGLWGKHFIF 114 F_oxysporum AEEPTTTL------KTTTGGGSTPTGTPGNGKFLWVGTNEAGGEFGEGSLPGTWGKHFIF 109 N_crassa AAPTTTAAATTLVTSTKTAPPASTTTATASGKFKWFGVNEAGGEFGDGIFPGRWGTEFTF 115 T_ressei TTITTSTRPPSGPTTTTRATSTSSSTPPTSSGVRFAGVNIAGFDFGCTTDGT-CVTSKVY 119 A_fumigatus ----mk--fgsivliaaaagfavaAPAKRASVFQWFGSNESGAEFGENTIPGSYGKEFIF 54 T_aurantiacus -----------------------------AKVFQWFGSNESGAEFGSQNLPGVEGKDYIW 31 . : * * :* :** . : M_thermophila ------------PST--SAIQTLINDGYNIFRIDFSMERLVPNQLTSSFDEGYLRNLTEV 160 F_oxysporum ------------PDP--AAVDTLISQGYNAFRVQLRMERTNPSSMTGPFDTAYLKNLTTI 155 N_crassa ------------PDT--NTIQTLRSQGYNIFRVGFAMERLVPNTLTSSFDNGYLTNLTQV 161 T_ressei PPLKNFTGSNNYPDGIGQMQHFVNEDGMTIFRLPVGWQYLVNNNLGGNLDSTSISKYDQL 179 A_fumigatus ------------PDP--STISTLIGKGMNIFRIQFLMERLVPSSMTGSYNEEYLANLTSV 100 T_aurantiacus ------------PDP--NTIDTLISKGMNIFRVPFMMERLVPNSMTGSPDPNYLADLIAT 77 *. : .* . **: . : . : . : : . M_thermophila VNFVTNAGKYAVLDPHNYGRYYGNVITD----TNAFRTFWTNLAKQFASNSLVIFDTNNE 216 F_oxysporum VDHITGKGANVILDPHNYGRYFDKIITS----TSDFQTWWKNFATQFKSNSKVIFDTNNE 211 N_crassa VNSVTNSGAYIVLDPHNYGRYYGKIITD----TDAFKTFWQNVAAKFASNSKVIFDTNNE 217 T_ressei VQGCLSLGAYCIVDIHNYARWNGGIIGQGGPTNAQFTSLWSQLASKYASQSRVWFGIMNE 239 A_fumigatus VDAVTKAGSYAILDPHNFGRYNGQIISS----TDDFKTFWQNLAGKFKSNNLVIFDTNNE 156 T_aurantiacus VNAITQKGAYAVVDPHNYGRYYNSIISS----PSDFQTFWKTVASQFASNPLVIFDTNNE 133 *: * ::* **:.*: :* . * : * .* :: *: * * ** M_thermophila YNTMDQTLVLNLNQAAIDGIRAAGATSQYIFVEGNAWSGAWSWNTT--NTNMAALTDP-- 272 F_oxysporum YNTMDQTLVLNLNQAAINGIRAAGAT-QTIFVEGNQWSGAWSWPDV--NDNMKALTDP-- 266 N_crassa YNTMDQTLVLNLNQAAIDGIRAAGATSQYIFVEGNQWTGAWSWNVT--NTNLAALTDP-- 273 T_ressei PHDVNINTWAATVQEVVTAIRNAGATSQFISLPGNDWQSAGAFISDGSAAALSQVTNPDG 299 A_fumigatus YHDMDQTLVLNLNQAAINGIRAAGATSQYIFVEGNSWTGAWTWADV--NDNLKALTDP-- 212 T_aurantiacus YHDMDQTLVLNLNQAAIDGIRSAGATSQYIFVEGNSWTGAWTWTNV--NDNMKSLTDP-- 189 . :: . * .: .** **** * * : ** * .* :: : :*:* M_thermophila -QNKIVYEMHQYLDSDSSGTHAECVSSNIGAQRVVGATQWLRANGKLGVLGEFAGGANAV 331 F_oxysporum -LDKIVYEMHQYLDSDSSGTSPNCVSTTIGVERVKAATEWLRKNKKIGMIGELAGGPNDT 325 N_crassa -ENKIVYEMHQYLDSDSSGTSTACVSSEIGVQRIVGATAWLRANGKKGVLGEFAGGANSV 332 T_ressei STTNLIFDVHKYLDSDNSGTHAECTTNNIDGA-FSPLATWLRQNNRQAILTETGGGNVQS 358 A_fumigatus -QDKIVYEMHQYLDSDGSGTAESCVSTTIGKERVSAATKWLKDNGKVGIIGEFAGGVNDQ 271 T_aurantiacus -SDKIIYEMHQYLDSDGSGTSATCVSSTIGQERITSATQWLRANGKKGIIGEFAGGANDV 248 ::::::*:***** *** *.:. * . : **: * : .:: * .** M_thermophila CQQAVTGLLDHLQDNSEVWLGALWWAAGPWWGDYMYSFEPPSGTGYVNYNSILKKYLP-- 389 F_oxysporum CKTAVKNMLDYLKENSDVWKGVTWWAAGPWWADYMFSFEPPSGTGYQYYNSLLKTYI--- 382 N_crassa CKAAVTGLLEHLKANTDVWEGALWWAAGPWWGDYMYSFEPPSGTGYTYYNSLLKTYTP-- 390 T_ressei CIQDMCQQIQYLNQNSDVYLGYVGWGAGSFDSTYVLTETPTSSGNSWTDTSLVSSCLARK 418 A_fumigatus CRTAISGMLEYLAQNTDVWKGALWWAAGPWWGNYMFNMEPPSGAAYVGMLDILEPYLG-- 329 T_aurantiacus CETAITGMLDYMAQNTDVWTGAIWWAAGPWWGDYIFSMEPDNGIAYQQILPILTPYL--- 305 * : :::: *::*: * *.** : . *: . * .. :: ! ! ! ! ! Discusión ! ! ! 135 5.3.1 Caracterización de la enzima Eg2 En el proceso de obtención de bioetanol de segunda generación, la hidrólisis de biomasa lignocelulósica se lleva a cabo a un elevado porcentaje de sólidos totales (20%) por lo que la viscosidad del hidrolizado dificulta la mezcla del mismo y por tanto la accesibilidad de las enzimas a su sustrato. En las primeras horas de hidrólisis se observa una drástica reducción de la viscosidad, probablemente debido a la disminución gradual de la longitud de los polímeros de la celulosa, llevada a cabo por la acción de las endoglucanasas, las cuales son las primeras en actuar realizando cortes hidrolíticos en las zonas internas de la celulosa. Debido a este motivo cobran una especial importancia para la industria, encontrándose un gran número de endoglucanasas caracterizadas en la literatura. Sin embargo, no existen buenos sustratos modelo para realizar una caracterización cinética. Cuando se trató de llevar a cabo la caracterización cinética de la enzima Eg2 la curva de dilución (actividad frente a concentración de enzima) no fue lineal. Algunos autores reflejan constantes cinéticas con CMC, pero objetando este mismo problema (Macarrón y col., 1993). Vlasenko y col., 2010 caracterizaron previamente una endoglucanasa de M. thermophila de la familia GH5, Cel5A, en un estudio comparativo entre la actividad específica de distintas familias de endoglucanasas frente a distintos sustratos poliméricos. Los resultados de este estudio no son comparables debido a las diferencias en las condiciones de ensayo. De las endoglucanasas caracterizadas de la familia GH5 (Tabla 5.4), la enzima Eg2 es de la más activas a excepción de la EG de P. purpurogenum KJS506 y la EG de F. pinicola que es casi un orden de magnitud más activa que ésta. Casi todas las endoglucanasas aquí revisadas son menos activas frente a CMC. Como se explicó previamente en la introducción, las endoglucanasas carecen de actividad o son poco activas frente celulosa cristalina, llevando a cabo su actividad en las zonas amorfas de los polímeros. Como se observa en la Tabla 5.4, las endoglucanasas caracterizadas presentan una actividad específica muy baja o en algunos caso no detectable frente a sustratos de celulosa cristalina como el Avicel. Como se detalló en los resultados (apartado 4.4.2), la enzima Eg2 no se inhibe por glucosa, habiendo alcanzado concentraciones en ensayo de hasta 0,5 M. En el caso de la celobiosa, la enzima sufre una inhibición del 30% a una concentración de celobiosa de 80 mM. Se conoce de manera experimental que durante el proceso de hidrólisis de rastrojo de maíz pretratado utilizado en este proyecto, las máximas concentraciones de celobiosa alcanzadas durante el proceso serán de 6 g/L (16 mM) en las primera 24h, debido a la acción simultánea de la enzima Bgl1, que hidroliza la celobiosa a glucosa. A dichas concentraciones de inhibidor, según los resultados obtenido en el ensayo de inhibición, la enzima mantiene una actividad del 80% en el ensayo con sustrato análogo. Afirmar que este comportamiento se pueda extrapolar durante la hidrólisis de biomasa no podría considerarse correcto, pues ni la concentración, ni el tipo de sustrato son similares. Como se ha descrito previamente, la inhibición de las enzimas depende en gran medida de la naturaleza del sustrato, ! ! ! ! Discusión ! ! ! 136 variando las constante de inhibición hasta en dos órdenes de magnitud cuando se utilizan sustratos celulósicos o sustratos análogos oliméricos (Gruno y col., 2004). Sin embargo, con los datos obtenidos se podría asumir que la inhibición de la enzima Eg2 por celobiosa durante el proceso de hidrólisis de PCS será prácticamente despreciable. Tabla 5.4 Propiedades de distintas endoglucanasas ND: Actividad no detectada. 5.3.2 Efecto de la temperatura y el pH sobre la actividad de Eg2 La actividad celulasa de un cóctel no industrial de M. thermophila medida con papel de filtro muestra su máximo a 65ºC, lo que supone 2,3 veces más actividad que a 50ºC (Matsakas y col., 2015). Aunque este ensayo muestra la capacidad celulolítica del cóctel enzimático y no puede ser individualizado para cada una de las enzimas, demuestra que algunas de las enzimas presentes en ese cóctel responsables de la degradación de la celulosa tienen un máximo de actividad en torno a los 65ºC. Se podría concluir que no se conoce qué enzimas se encuentran expresadas en dicha cepa, sin embargo podría ser que una de las enzimas contribuyente a este fenómeno sea la enzima Eg2, cuya temperatura óptima se encuentra definida en un rango de 50 a 65ºC (Figura 4.18C). El ensayo no fue llevado a cabo a temperaturas superiores debido a que, en este proyecto, el proceso de hidrólisis industrial de biomasa no se encuentra optimizado por encima de los 65ºC, por lo que no se consideró aumentar esta temperatura en los ensayos enzimáticos. Teniendo en cuenta que M. thermophila es un organismo termófilo estos datos resultan razonables. En el caso de los hongos termófilos como T. aurantiacus observamos que la temperatura óptima de la endoglucanasa GH5 se encuentra entre los 70 y los 80ºC, mientras que el óptimo de las enzimas Cel5A de la bacteria aerobia Paenibacillus xylanilyticus KJ-03 o la endoglucanasa del hongo Aspergillus aculeatus aparece a los 40ºC. En la Tabla 5.3 se CMC Avicel M. thermophila C1 Eg2 GH5 74,0 0,10 50 - 65 5,5 Este trabajo M. thermophila MtEg7 GH7 106,0 0,24 60 5,0 Karnaouri y col., 2014 P. verruculosum PvEGIII GH12 24,0 - - 4,0 Tishkov y col., 2013 Melanocarpus sp. MTCC 3922 EGI GH5 25,0 3,00 50 6,0 Kaur y col., 2007 Melanocarpus sp. MTCC 3922 EGII GH5 35,0 ND 70 5,0 Kaur y col., 2007 N. crassa GH5-1 GH5 25,0 - - - Sun y col., 2011 A. fumigatus Z5 Egl2 GH5 1,8 <0,01 50 5,0 Liu y col., 2011 A. fumigatus Z5 Egl3 GH5 2,4 0,15 60 4,0 Liu y col., 2011 A. aculeatus EG - 14,0 <0,01 40 5,0 Naika y col., 2007 T. aurantiacus EG GH5 18,0 - 70 - 80 4,0 - 4,4 Parry y col., 2002 P. purpurogenum KJS506 EG GH5 110,0 70,00 70 5,0 Lee y col., 2010 F. oxysporum EG - 22,5 ND 50 6,0 Christakopoulos y col.,1990 P. xylanilyticus KJ-03 Cel5A GH5 0,2 0,13 40 6,0 Park y col., 2012 P. occitanis Pol 6 EG A GH12 4,7 0,02 60 3,5 Chaabouni y col., 2005 P. occitanis Pol 6 EG B GH12 3,3 0,03 50 3,5 Chaabouni y col., 2005 F. pinicola EG GH5 944,0 226,00 60 5,0 Yoon y col., 2008 Referencia ActIividad específica (U/mg) Organismo Enzima Familia Tª óptima (ºC) pH óptimo ! ! ! ! Discusión ! ! ! 137 encuentra detalladas algunas de las temperaturas óptimas de endoglucanasas descritas en la literatura. En un estudio con distintas endoglucanasas de la familia GH5 se demostró que tanto la temperatura óptima de las enzimas como la termoestabilidad de las mismas no estaban relacionadas con ningún aminoácido en concreto pero sí con la flexibilidad de la estructura de la proteína (Badieyan y col., 2012). Del mismo modo Liang y col., (2011) confirmaron que realizando mutagénesis dirigida en la endoglucanasa de la familia de GH5 de la bacteria Thermoanaerobacter tengcongensis MB4 se obtenían mutantes con distintos perfiles de temperatura, aumentando los niveles de actividad a temperaturas por debajo de los 75ºC, óptimo de esta proteína. Dichos mutantes presentaban menos puentes de hidrógeno en su estructura haciéndola mas flexible. Cuando se estudió la desnaturalización térmica de la enzima Eg2 se obtuvo una Tm de 54ºC. Este valor se encuentra por debajo de otras Tm de endoglucanasas descritas en la literatura como los 57ºC de la endoglucanasa de A. aculeatus (Naika y col., 2007), los 69ºC de Hj_Cel5A de Hypocrea jecorina, la forma sexual de T. Reesei (Lee y col., 2011), o los 81ºC del la endoglucanasa del hongo termófilo T. aurantiacus (Parry y col., 2002). A pesar de la baja Tm que presenta la enzima Eg2 de M. thermophila C1, esta enzima es termoestable a las condiciones de proceso de hidrólisis a pH 5 y 50ºC durante 72 horas (Figura 4.18B), mientras que otras enzimas endoglucanasas de M. thermophila no resisten la incubación a 50ºC, como es el caso de MtEg7 de la familia GH7 que tras 24h de incubación tan sólo conserva un 60% de la actividad inicial (Karnaouri y col., 2014a). El comportamiento de la enzima Eg2 respecto a la temperatura la hace una proteína idónea para el propósito de su uso en la obtención de bioetanol de segunda generación, por ser estable a las condiciones de proceso y tener un amplio rango de temperatura óptima. Con estas características resulta una proteína versátil que, ante un posible aumento de la temperatura de hidrólisis, podría ser igualmente utilizada. En tal caso se habría de determinar la termoestabilidad a la temperatura deseada. La enzima Eg2 tiene un pH óptimo de 5,5 manteniendo la actividad por encima del 80% entre pH 4,5 y 6,0 (Figura 4.18D). Como se observa en la Tabla 5.4 el pH óptimo de esta enzima se encuentra dentro de los valores usualmente encontrados en la bibliografía para endoglucanasas fúngicas. Dependiendo de la aplicación que se vaya a dar a las enzimas endoglucanasas será conveniente que el pH óptimo de la enzima se encuentre desplazado hacia zonas básicas o ácidas. En el caso de la hidrólisis de lignocelulosa, el uso de enzimas cuyo pH óptimo sea ácido favorece el uso de menores cantidades de bases para corregir el pH ácido del pretratamiento y supone una ventaja en el proceso global, pues se podrían combinar las etapas de pretratamiento e hidrólisis enzimática. Wang y col., (2005) demostraron la importancia del residuo Asn321 de la enzima EgIII de T. ressei, homóloga a la enzima Eg2 de M. thermophila, para el perfil de pH de ésta. Mutando este aminoácido por distintos residuos observaron cambios en el pH ! ! ! ! Discusión ! ! ! 144 5.4.3 Efecto del dominio de unión a carbohidratos de la enzima Cbh1 en la hidrólisis de PCS La estructura de una gran número de celulasas está comprendida por un dominio catalítico y un dominio de unión a carbohidratos (CBD) conectados por un péptido de unión. Tradicionalmente se ha sostenido que la presencia del CBD de las celulasas en la hidrólisis de la celulosa favorece la unión a la misma, lo que supone una mejora en el rendimiento de la sacarificación. El propósito principal del CBD es aumentar la concentración de enzima sobre los polímeros de celulosa de manera que dirigen el módulo catalítico hacia el sustrato y de esta manera se mejora la actividad de la enzima (Tomme y col., 1988). Recientemente se han publicado varios estudios que defienden que la presencia del CBD de las celulasas no supone un claro beneficio cuando se trabaja a elevadas concentraciones de sólidos totales, como en el caso de la hidrólisis de biomasa lignocelulósica industrial. Le Costaouëc y col. (2013) llevaron a cabo hidrólisis de Avicel y distintos materiales lignocelulósicos a concentraciones crecientes de sólidos totales con celulasas con y sin CBD deT. reesei y T. aurantiacus. Concluyeron que las celulasas que no poseían CBD obtenían peores rendimientos a baja concentración de sólidos totales en comparación con las celulasas que poseían CBD, sin embargo, a altas concentraciones de sólidos totales (20-25%) las diferencias se amortiguaban, encontrando en algunos casos valores idénticos de rendimiento. La hipótesis planteada para este fenómeno fue que la menor disponibilidad de agua en el hidrolizado mejora la probabilidad de las enzimas de encontrar el sustrato de manera que se compensa la menor afinidad del módulo catalítico al sustrato. Además, en el caso de la hidrólisis de los materiales lignocelulósicos la unión inespecífica e improductiva se daba claramente en menor medida en las celulasas que no poseían CBD. La presencia de lignina en la hidrólisis de biomasa lignocelulósica supone uno de los mayores obstáculos para la actuación de las enzimas ya que ésta sufren adsorción a la lignina durante la hidrólisis y tras la finalización de ésta (Rahikainen y col., 2013). En experimentos posteriores, donde se llevó a cabo la hidrólisis de paja de trigo pretratada con celulasas con y sin CBD al 20% de sólidos totales, se obtuvo una disminución del 10% de rendimiento cuando se utilizaban celulasas sin CBD (Pakarinen y col., 2014). Adicionalmente la hidrólisis parecía verse ralentizada cuando se utilizaban celulasas sin CBD. A pesar de la disminución del rendimiento, los autores defienden el uso de celulasas sin CBD debido a su facilidad para el reciclado, pudiendo recuperar hasta un 80% de las celulasas sin CBD frente a un 35% de las celulasas con CBD. Ante estos precedentes y debido a que en el cóctel secretado por M. thermophila C1 existen dos isoformas de la Cbh1, con y sin CBD, se decidió estudiar la importancia del papel del CBD en la hidrólisis de PCS. Para ello se llevó a cabo la hidrólisis al 20% de sólidos totales con el cóctel sintético CM 6, sustituyendo parcialmente la enzima Cbh1 con CBD por la isoforma sin CBD. Los resultados obtenidos en este experimento demuestran una brecha mucho mayor entre el ! ! ! ! Discusión ! ! ! 145 rendimiento de las celulasas con y sin CBD de la que hasta ahora se había publicado. En el caso de la Cbh1 con CBD de M. thermophila C1, la sustitución completa por la isoforma sin CBD supone una disminución del rendimiento de casi un 20% (Figura 4.24). Se puede observar una correlación directa entre el rendimiento en glucosa de la hidrólisis y la proporción de Cbh1 con CBD presente en el cóctel. Este resultado se mantiene durante todo el proceso de hidrólisis, viéndose ralentizada la liberación de glucosa en las condiciones donde estaba presente la isoforma Cbh1 sin CBD. Debido a estos resultados se concluye la extremada importancia del CBD de la enzima Cbh1 en el cóctel de M. thermophila C1, contradiciendo los resultados anteriores en los que las diferencias de rendimiento entre las enzimas con y sin CBD se veían atenuadas a altas concentraciones de sólidos totales. Respecto al reciclado de las enzimas, en esta tesis no se llevó a cabo ninguna experimentación. Sin embargo, según el modelo de la planta industrial para la cual se realiza el proyecto de mejora del cóctel enzimático de M. thermophila C1, no parece viable la recuperación de las celulasas, por lo que por ahora no parece una ventaja a tener en cuenta. Como trabajos futuros se propone la optimización de las condiciones de cultivo para aumentar la proporción Cbh1 con CBD frente a la Cbh1 sin CBD. Se conoce experimentalmente que la proporción de las isoformas de la enzima Cbh1 con y sin CBD depende de las condiciones de cultivo que pueden provocar la ruptura proteolítica del péptido de unión, dando como resultado el dominio catalítico libre de la enzima Cbh1. Por tanto, la optimización de dichas condiciones de cultivo parece una solución prometedora para evitar la pérdida de rendimiento en hidrólisis que provoca la aparición de enzima Cbh1 sin CBD. 5.5 Mejora en la hidrólisis de hemicelulosa La hemicelulosa disponible en un material lignocelulósico pretratado va a depender tanto de su composición como del tipo de pretratamiento utilizado. Cuanto más severo es el pretratamiento del material más degradada se encontrará la hemicelulosa (Hendriks y col., 2009). En el caso del de PCS utilizado en este trabajo, la hemicelulosa disponible es aproximadamente un 6,5% del total de polisacáridos presentes en la muestra. La hidrólisis de este material realizada por el cóctel producido por M. thermophila C1 en biorreactor de 30 L, no alcanza a completar la degradación de la hemicelulosa, dejando alrededor de un 50% de xilobiosa no hidrolizada según se demostró en los resultados dentro del apartado 4.7 (Figura 4.25). Este cuello de botella en la hidrólisis del material lignocelulósico se debe a que el cóctel es deficitario en actividad β-xilosidasa debido a la baja representación de sus enzimas endógenas. Para abordar el problema del déficit de actividad β-xilosidasa del cóctel producido por M. thermophila C1, se decidió llevar a cabo un escrutinio de enzimas β-xilosidasas de otros hongos celulolíticos, dando prioridad a aquellos hongos con alta actividad específica β-xilosidasa, y que debido a su objetivo final dentro del ! ! ! ! Discusión ! ! ! 146 proceso de hidrólisis industrial fuesen termorresistentes a las condiciones de proceso así como un pH óptimo en el rango dentro del cual se produce la hidrólisis (pH 5,2 – 4,5). La importancia de estas características de la enzima es fundamental para un buen rendimiento de la hidrólisis de la hemicelulosa global en las condiciones definidas en este proyecto. Otros autores han expresado en plataformas fúngicas diversas enzimas β-xilosidasas (Mustafa y col., 2016), sin embargo, las características de estas enzimas o no son las óptimas para nuestro proceso, ya que tienen un pH óptimo alejado del rango del pH de hidrólisis o no existen datos de termorresistencia que respalden su uso en procesos industriales. Como criterio final a la hora de seleccionar una enzima para su posterior clonación y expresión en M. thermophila C1, se atendió a la cobertura de la identificación por huella peptídica, de manera que aquellas enzimas cuya cobertura no permitió hacer una búsqueda en bases de datos para obtener la secuencia y así generar los cebadores correspondientes, se descartaron. La candidata final fue la Bxl 20.17 cuya secuencia corresponde a la familia GH3. Esta secuencia mostró una alta homología con β-xilosidasas del género Trichoderma y comparte los residuos conservados propios de esta familia. 5.5.1 Expresión heteróloga del gen bxl 20.17 en M. thermophila C1 A pesar de que los sistemas de expresión en hongos filamentosos son muy utilizados en la industria, a menudo la expresión heteróloga presenta dificultades, no alcanzando los mismos niveles de producción que se consiguen mediante expresión homóloga (Gouka y col., 1997, Zoglowek y col., 2015). Debido a esto se han desarrollado una serie de estrategias para la mejora de la expresión heteróloga en hongos filamentosos. Algunas de ellas son: aumento del número de copias del gen, optimización del uso de codones y del porcentaje G+C, fusión del gen al extremo 3’ de un gen de alta expresión, uso de promotores de alta expresión, uso de péptidos señal de genes con alta secreción, el uso de cepas deficientes en proteasas o cepas superproductorasde chaperonas (Koushki y col., 2011,). De las herramientas aquí planteadas, en el presente trabajo se optó por el uso de promotores de alta expresión y el uso de distintos péptidos señal. En general, los promotores homólogos fuertes parecen tener mayor expresión que los promotores heterólogos (Nevalainen y col., 2005). La proteína extracelular más representada de M. thermophila C1 es Cbh1, suponiendo hasta un 30% del total de proteína secretada. Una evaluación de la expresión de distintos genes demostró que los niveles de expresión de Cbh1 eran claramente los más altos frente a otros dos genes que codificaban para una de las hidrolasas secretadas más representadas (chi1) y un gen constitutivo (his2A). Por lo tanto, se diseñaron vectores de expresión basados en el promotor de cbh1 que actualmente son comúnmente utilizado para la expresión de genes recombinantes en M. thermophila (Visser y col., 2011). Por este motivo se utilizó este promotor para la expresión heteróloga de Bxl 20.17. Por otro lado se escogieron distintas estrategias respecto al uso del péptido señal. Éste es responsable de la entrada en la vía de secreción de las proteínas ! ! ! ! Discusión ! ! ! 147 además de facilitar el correcto plegamiento de la proteína. Existe múltiple bibliografía acerca del uso de distintos péptidos señal para expresión heteróloga en hongos. Algunos autores defienden el uso del péptido señal nativo de la proteína, como Chou y col. (2004), que consiguieron mayores niveles de expresión con el péptido señal de Cel7A de P. funiculosum en A. niger var. awamori que con el péptido señal de la glucoamilasa de A. niger. Por otro lado, otros autores respaldan la teoría del uso de un péptido señal de una proteína con altos niveles de expresión como la glucoamilasa de A. niger (Gouka y col.,1997). Previamente en nuestro grupo se habían expresado satisfactoriamente de manera heteróloga algunas hemicelulasas, entre ellas una βxilosidasa de F. oxysporum (Díez y col., 2014) o una α-xilosidasa de Aspergillus terreus (Díez y col., 2015). Ambas proteínas se expresaron sustituyendo y fusionando el péptido señal de la glucoamilasa de A. niger, por lo que en el presente trabajo se decidió probar tanto esta estrategia como el uso del péptido señal nativo, para la obtención del máximo nivel de expresión de la Bxl 20.17. La mayoría de los clones de la construcción con el péptido señal nativo mostraron actividad β-xilosidasa superior a la del control (Figura 4.33A). Por el contrario, ninguno de los clones de la construcción con el péptido señal de la glucoamilasa de A. niger se expresaron, no viendo actividad en el sobrenadante tanto con ensayos colorimétricos como por zimografía. Podría ser debido a que el nuevo péptido señal provoque cambios en la estructura secundaria de la proteína que la hacen inactiva, como proponen Zoglowek y col. (2015) tras revisar una serie de celulasas que se expresan exclusivamente con el péptido señal nativo. Estas evidencias indican que la eficiencia de secreción probablemente dependa de la correlación exacta entre el péptido señal, la proteína recombinante y el sistema de reconocimiento de péptidos del huésped. En los ensayos de selección en microplaca se encontró que la mayoría de los clones con el péptido señal nativo sufrían un leve aumento en su actividad a pH 5,0 frente a 4,5 (pH óptimo de la enzima Bxl 20.17). De experimentos anteriores se conoce que el pH óptimo de la actividad Bxl del cóctel de M. thermophila C1 está desplazado hacia 6,0-6,5, sin embargo, este hecho no explica el aumento de actividad de los clones a pH 5,0. En el zimograma de los clones seleccionados se pudo corroborar la presencia de una proteína con actividad Bxl de alto peso molecular, de mayor tamaño que la β-xilosidasa endógena (Figura 4.33B). Estos datos confirman el tamaño teórico de la β-xilosidasa endógena de 78 kDa y el de Bxl 20.17 de 88 kDa. La producción de proteína de las fermentaciones en matraz, tanto de los transformantes como del control sin transformar, fue ligeramente inferior a los valores que suelen alcanzarse con M. thermophila C1 y el medio utilizado. Sin embargo, los valores de actividad normalizada a la cantidad de proteína sí correspondían a los observados anteriormente. Tomando esos datos de referencia, el clon 2D11, aquel que obtuvo mayores niveles de actividad, aumentó 60 veces la actividad del control. En todos los clones seleccionados la actividad a pH 4,5 fue superior que a pH 5,0, superando hasta en 100 U/g en el caso del clon 2D11. Este comportamiento concuerda con el visto anteriormente en la curva de pH realizada, donde el óptimo se encontraba a pH 4,5. ! ! ! ! Discusión ! ! ! 148 5.5.2 Hidrólisis de PCS por los transformates de bxl 20.17 Aunque la actividad de la β-xilosidasa de Trichoderma transformada en M. thermophila C1 del clon 2D11 ha conseguido degradar prácticamente la totalidad de la xilobiosa presente en el hidrolizado, no se alcanzan los valores de conversión a xilosa esperados. Mientras que dicho clon aumenta su capacidad hidrolítica de xilobiosa en 10 veces, la capacidad de producir xilosa es tan sólo de 1,5 veces superior (Figura 4.35). Comparativamente con otras β-xilosidasas expresadas por este grupo en M. thermophila C1, esta capacidad sería similar a la de la cepa que expresa una βxilosidasa de H. insolens e inferior a la que expresa la β-xilosidasa de F. oxysporum (Díez y col., 2014). Sin embargo, estas proteínas fueron expresadas en una cepa distinta a la usada en esta tesis. La posible explicación para que la hidrólisis de xilobiosa no se traduzca en mayor liberación de xilosa puede ser debida a que pueden existir oligómeros de xilosa de mayor tamaño a los que la β-xilosidasa no puede acceder. Para alcanzar dichos valores de conversión se necesitaría contar con enzimas aguas arriba que sean capaces de degradar el xilano presente en el PCS. Desde esta tesis se platea la hipótesis de que la cepa base usada para la transformación de la β-xilosidasa no tenga los niveles de expresión suficientes de PMO, en concreto de la PMO-06230. Como ya se avanzó en la introducción, las enzimas PMO, además de la ampliamente conocida función de realizar cortes oxidativos en las cadenas de celulosa, pueden igualmente actuar sobre la hemicelulosa, en concreto en los polímeros de xilano y xiloglucano (Agger y col., 2014, Frommhagen y col., 2015). Mayores niveles de actividad de esta enzima darían lugar a concentraciones más elevadas de xilobiosa en el hidrolizado y por consiguiente, tras la actuación de la enzima Bxl 20.17, mayores niveles de xilosa. La suposición de la falta de PMO en los transformantes se respalda con los datos de liberación de glucosa. Como se vio previamente en los experimentos de cóctel mínimo, la falta de la enzima PMO-06230 en la hidrólisis del material lignocelulósico disminuía el rendimiento de glucosa un 23% frente al control con las 6 enzimas principales (Figura 4.22), demostrando la importancia de la actuación de esta enzima. En la hidrólisis del PCS con los transformantes de Bxl 20.17, ninguno de estos alcanza los valores de glucosa del control, manifestando la falta de actividades celulolíticas en el cóctel enzimático secretado por los transformantes frente al control sin transformar. Sin embargo, esta hipótesis ha de ser demostrada en futuros trabajos, así como demostrar que una vez se cuente con una cepa base óptima tanto para la degradación de xilano como de glucano, los niveles de expresión de Bxl 20.17 sean suficientes. ! ! ! ! ! ! 149 ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! 6 CONCLUSIONES ! ! ! 150 ! ! ! ! ! Conclusiones ! ! ! 151 1. Se purificó una enzima β-glucosidasa de la familia GH3 del caldo de cultivo del biorreactor de Myceliophthora thermophila C1. Esta enzima, denominada como Bgl1, tuvo un comportamiento bifásico en la caracterización cinética con pNGP, comportamiento observado en otras β-glucosidasas, mientras que con celobiosa como sustrato, la cinética se ajustó al modelo de Michaelis-Mentel, La inhibición por glucosa mostró ser competitiva con una Ki similar a las publicadas en la bibliografía. Esta enzima demostró tener un pH y temperatura óptima dentro del rango de las condiciones de proceso industrial, siendo termorresistente a dichas condiciones y haciéndola una candidata idónea para su uso en la hidrólisis de PCS. 2. Se purificó una enzima celobiohidrolasa de la familia GH7 del caldo de cultivo del biorreactor de M. thermophila C1. Esta enzima, denominada como Cbh1, se caracterizó con el sustrato soluble pNCB, cuyas constantes se encontraron dentro de rango de las publicadas en la bibliografía, y con el sustrato celulósico Avicel, para el cual demostró ser más activa. La inhibición por celobiosa en ambos caso fue competitiva sin presentar inhibición por glucosa. Esta enzima demostró tener un pH y temperatura óptima dentro del rango de las condiciones de proceso industrial, siendo termorresistente a dichas condiciones y haciéndola una candidata idónea para su uso en la hidrólisis de PCS. Los datos publicados anteriormente de esta enzima no concuerdan en ciertos casos con los presentados en esta tesis, probablemente por las distintas modificaciones postraduccionales dependientes de las condiciones de cultivo. 3. Se purificó una enzima celobiohidrolasa de la familia GH6 del caldo de cultivo del biorreactor de M. thermophila C1. Esta enzima, denominada como Cbh4, no mostró actividad frente al sustrato soluble pNCB, siendo caracterizada usando el sustrato celulósico Avicel. La enzima Cbh4 demostró ser más activa frente a Avicel que la enzima Cbh1, pero menos afin. La inhibición por celobiosa fue competitiva, sin presentar inhibición por glucosa. La temperatura óptima de la enzima demostró ser superior a la de las condiciones de proceso industrial, mientras que el pH óptimo se encontró dentro de rango. La enzima no resultó ser termoestable a las condiciones de dicho proceso. 4. Se purificó una enzima endoglucanasa de la familia GH5 del caldo de cultivo del biorreactor de M. thermophila C1 con alta actividad específica frente al sustrato azo-CMC y baja frente a Avicel. No se pudo llevar a cabo la caracterización cinética de esta enzima, denominada como Eg2, por no existir sustratos modelos adecuados para ello. La enzima Eg2 no mostró ser inhibida por glucosa y presentó inhibición por celobiosa. Esta enzima demostró tener un pH y temperatura óptima dentro del rango de las condiciones de proceso industrial, siendo termorresistente a dichas condiciones y haciéndola una candidata idónea para su uso en la hidrólisis de PCS. ! ! ! ! Conclusiones ! ! ! 152 5. Se ha confirmado que la suplementación de distintas enzimas con actividad PMO, procedentes del caldo de cultivo de M. thermophila C1, sobre un coctel sintético compuesto por las principales celulasas de este organismo, supone una gran mejora del rendimiento en liberación de glucosa de en la hidrólisis del PCS. Asimismo se ha demostrado el sinergismo en la actividad de distintas enzimas PMO. 6. Se ha demostrado que existe una combinación de cuatro enzimas celulasas y dos enzimas PMO con la cual se alcanza el 100% del rendimiento del cóctel industrial en la hidrólisis del PCS. Asimismo se han encontrado unas proporciones de dichas enzimas con las que el rendimiento supera al del cóctel industrial en un 10%. 7. Se ha establecido la contribución de cada una de las enzimas presentes en el cóctel mínimo en la hidrólisis del PCS, siendo las de mayor importancia las enzimas Cbh1, PMO-06230 y Bgl1. 8. En contra de las hipótesis en las que se afirma que, en condiciones de hidrólisis enzimática a altos sólidos totales las diferencias de rendimiento entre las enzimas con y sin CBD se veían atenuadas, se ha demostrado una correlación directa entre el rendimiento en glucosa de la hidrólisis de PCS y la proporción de Cbh1 con CBD presente en el cóctel frente a la isoforma sin CBD. 9. Del escrutinio de enzimas con actividad β-xilosidasa en hongos celulolíticos se seleccionó una enzima de la familia GH3 del género Trichoderma con alta actividad y cuyas características la hacían apropiada para su uso en el proceso de hidrólisis de PCS. 10. Se expresó heterólogamente una proteína β-xilosidasa, denominada Bxl 20.17, en la plataforma de expresión M. thermophila C1, mediante la estrategia de uso del péptido señal nativo de esta proteína. El caldo de cultivo de los transformantes presentaba alta actividad β-xilosidasa. 11. Los clones transformados de M. thermophila C1 con el gen bxl 20.17 consiguieron aumentar 10 veces la capacidad hidrolítica de la xilobiosa durante la hidrólisis del PCS. La liberación de xilosa estuvo por debajo de los valores esperados, probablemente debido a la falta de expresión en la cepa transformada de enzimas que degraden los oligómeros de xilosa de mayor tamaño. ! ! ! ! 153 ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! 7 BIBLIOGRAFÍA