Nuevos tio- y selenoderivados de carbohidratos en enfermedades degenerativas: cáncer y Alzheimer

“Nuevos tio- y selenoderivados de carbohidratos en enfermedades degenerativas: cáncer y Alzheimer” Presenta M.C. Martha Velueta Viveros BENEMÉRITA UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE PUEBLA FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS Y CENTRO DE QUÍMICA-INSTITUTO DE CIENCIAS Doctorado en Ciencias Químicas UNIVERSIDAD DE SEVILLA DEPARTAMENTO DE QUÍMICA ORGÁNICA FACULTAD DE QUÍMICA Doctorado en Química Puebla, México Julio 2022 Directores de tesis Dra. Penélope Merino Montiel Dr. Óscar López López Memoria presentada por la M.C. Martha Velueta Viveros para optar al grado de Doctora en Química. Puebla, México. Julio de 2022 BENEMÉRITA UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE PUEBLA FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS Y CENTRO DE QUÍMICA-INSTITUTO DE CIENCIAS Doctorado en Ciencias Químicas UNIVERSIDAD DE SEVILLA DEPARTAMENTO DE QUÍMICA ORGÁNICA FACULTAD DE QUÍMICA Doctorado en Química Fdo. Dr. Óscar López López, Profesor Titular del Departamento de Química Orgánica de la Universidad de Sevilla Fdo. Dra. Penélope Merino Montiel, Profesora Titular del Departamento de Química Orgánica del Posgrado en Ciencias Químicas, BUAP Vº Bº de los Directores de la Tesis El presente trabajo de investigación se realizó en el Laboratorio de Síntesis y Modificación de Productos Naturales de la Benemérita Universidad Autónoma de Puebla y en el Laboratorio de Química Fina de Carbohidratos de la Universidad de Sevilla, España bajo la dirección de la Dra. Penélope Merino Montiel y el Dr. Óscar López López con el apoyo otorgado por CONACYT a través de la beca nacional con el número (CVU/Becario) 628962/ 481149 y de la beca mixta (291250) del 1 de Agosto de 2017 al 31 de Julio de 2021. Publicación derivada de esta Tesis: Carbohydrate-derived bicyclic selenazolines as new multipotent agents against Alzheimer’s disease. Martha Velueta-Viveros, Macarena Martínez-Bailén, Adrián Puerta, Laura Romero- Hernández, Penélope Merino-Montiel, Sara Montiel-Smith, Miguel X. Fernandes, Antonio J. Moreno-Vargas, José M. Padrón, Óscar López, José G. Fernández-Bolaños. Bioorganic Chemistry 2022, en prensa. Algunos de los resultados obtenidos en este trabajo de Tesis fueron presentados en los siguientes congresos y reuniones: Martha Velueta Viveros, Óscar López López, Penélope Merino Montiel. Síntesis de nuevos selenoheterociclos derivados de carbohidratos. XXII Simposio Interno del Posgrado en Ciencias Químicas, Puebla, Puebla. 6 al 10 de noviembre de 2017. Martha Velueta Viveros, Penélope Merino Montiel, Óscar López López, Sara Montiel Smith. Síntesis de selenadiazoles derivados de D- glucosa. 14a Reunión Internacional de investigación en Productos Naturales. Cuernavaca, Morelos. 23-26 de mayo de 2018. Martha Velueta Viveros, Penélope Merino Montiel, José G. Fernández Bolaños, Óscar López López, Sara Montiel Smith. Síntesis de nuevos selenoheterociclos derivados de carbohidratos. 15a Reunión Internacional de Investigación en Productos Naturales, A. C. San Luis Potosí, San Luis Potosí. 22-25 de mayo de 2019. Martha Velueta Viveros, José G. Fernández Bolaños, Óscar López López, Penélope Merino Montiel. Síntesis de 2-alcoxiselenazolinas derivados de carbohidratos. XXVIII Congreso Internacional de la Sociedad Italo-Latinoamericana de ETNOMEDICINA. La Habana, Cuba. 16-20 de septiembre de 2019. Martha Velueta Viveros, Óscar López López, Penélope Merino Montiel. Síntesis de 2- alcoxiselenazolinas derivados de carbohidratos. XXIV Simposio Interno del Posgrado en Ciencias Químicas, Puebla, Puebla. 11 al 15 de noviembre de 2019. Martha Velueta Viveros, Penélope Merino Montiel, José G. Fernández Bolaños, Óscar López López. Síntesis de nuevas 2-alquiltio-1,3-oxazolinas bicíclicas derivadas de carbohidratos. LatinXChem, Modalidad Virtual. 7 de septiembre de 2020. Martha Velueta Viveros. Sintesis de 2-alquiltio-1,3-oxazolinas bicíclicas derivadas de – glucosamina. 4° Congreso (Virtual) de estudiantes de Doctorado en Química. Escuela internacional de Doctorado. Facultad de Quimica, Universidad de Sevilla. Sevilla. 2 al 3 de diciembre de 2020. Martha Velueta Viveros, Penélope Merino Montiel, Sara Montiel Smith, José Luis Vega Báez, José G. Fernández Bolaños, Óscar López López. Síntesis de nuevas 2-alquiltio-1,3- oxazolinas bicíclicas derivados de carbohidratos. XVI Reunión de la Academia Mexicana de Química Orgánica. Modalidad Virtual. 19-13 de abril de 2021. Martha Velueta Viveros, Penélope Merino Montiel, Sara Montiel Smith, José Luis Vega Báez, José G. Fernández Bolaños, Óscar López López. Síntesis de Se-metil derivados como potentes agentes antiproliferativos. Congreso internacional de la Sociedad Química de México 2021, Modalidad Virtual. 30 de agosto al 3 de septiembre de 2021. AGRADECIMIENTOS A CONACYT: Por la beca otorgada de doctorado, numero de becario: 628962 Por la beca de Movilidad al Extranjero (291250). A la VIEP: Por el apoyo económico de movilidad recibido para realizar la estancia en el extranjero. Por el apoyo de Conclusión de Tesis. Universidad de Sevilla, España: Facultad de Química, Departamento de Química Orgánica Grupo de Química Fina de Carbohidratos (FQM-134) Por permitirme realizar una estancia de síntesis, caracterización de compuestos. A mis asesores de tesis Dra. Penélope Merino Montiel, Dr. Óscar López López A los miembros de la comisión revisora: Dra. Sara Montiel Smith, Dr. José María Fernández Bolaños Guzmán, Dra. Inés Maya Castilla, Dr. José Luis Vega Báez, Dra. Laura Leticia Romero Hernández. Al grupo del Dr. José M. Padrón (U. La Laguna, España) Por los ensayos antiproliferativos y de docking A los Drs. Antonio J. Moreno Vargas y Macarena Martínez Por la realización de los ensayos de inhibición en OGA y glicosidasas 16 2. RELACIÓN DE NUEVOS COMPUESTOS PREPARADOS 2-Alquiltio-1,3-oxazolinas bicíclicas Selenoureas derivadas de carbohidrato 2-Alquilamino-1,3-selenazolinas bicíclicas O-acetiladas 17 2-Alquilamino-1,3-selenazolinas bicíclicas O-desprotegidas N-alquil-Se-metil selenocarbamato Selenocarbamatos y carbamato derivados de carbohidrato 18 2-Alcoxi-1,3-selenazolinas-O-acetiladas 2-Alcoxi-1,3-selenazolinas O-desprotegidas 19 Se-alquil isoselenocarbamatos derivados de carbohidrato Glucofurano-imidazolina-2-selonas 1,3,4-Selenadiazol derivado de carbohidrato Glicotioureas derivadas de cumarinas 20 3. NUEVOS DERIVADOS ORGANOSELÉNICOS CON POTENCIAL ACTIVIDAD ANTI-ALZHEIMER Y ANTIPROLIFERATIVA 3.1. Introducción y antecedentes Enfermedad de Alzheimer (EA) De acuerdo con la Organización Mundial de la Salud (OMS), la demencia es un síndrome de carácter degenerativo que provoca el deterioro progresivo de la función cognitiva, en unos niveles que van más allá del simple envejecimiento. Tiene efectos irreversibles sobre la memoria, lenguaje, orientación, comprensión o aprendizaje. 1 , 2 La demencia, en sus múltiples variantes, afecta en la actualidad a más de 50 millones de personas en todo el mundo (el 60% en países de ingresos bajos o medios, y en el 60% de los casos, a mujeres), y se prevé un crecimiento exponencial y preocupante hasta alcanzar los 82 millones en el año 2030, y los 152 millones en el 2050.1, 3 Estos datos suponen la aparición de un nuevo caso de demencia cada 3.2 s. 4 El aumento de la esperanza de vida contribuye a aumentar los casos de demencia, que suelen manifestarse en la población mayor de 60 años. La demencia provoca una enorme carga emocional y económica, tanto a las familias del enfermo, como sobre los sistemas públicos de salud. 5 Se ha estimado que para el año 2030, el conjunto de dichos costes será de unos 2.8 trillones de US$.1 Por todos estos motivos, la OMS ha catalogado el conjunto de las demencias como una prioridad de salud pública. 6 Las demencias, que en numerosas ocasiones son difíciles de diagnosticar, debido a su carácter multifactorial, se han dividido en varios grupos, recogidos en la Tabla 3.1: 7 8 1 . Organización Mundial de la salud, https://www.who.int/es/news-room/fact-sheets/detail/dementia. Último acceso: 18 de abril de 2022. 2 . Arvanitakis, Z.; Shah, R. C.; Bennett, D. A. JAMA, 2019, 322, 1589‒1599. 3 . World Alzheimer Report 2019. https://www.alzint.org/u/WorldAlzheimerReport2019.pdf. Último acceso: 20 de Marzo 2022. 4 . Alzheimer´s Disease International. https://www.alzint.org/about/dementia-facts-figures/dementia-statistics/. Último acceso: 18 de abril de 2022. 5 . Xu, J.; Zhang, Y.; Qiu, C.; Cheng, F. Lancet, 2017, 390, S47. 6 . World Health Organization. https://www.who.int/publications/i/item/dementia-a-public-health-priority. Último acceso: 18 de abril de 2022. 7 . Raz, L.; Knoefel, J.; Bhaskar, H. J. Cereb. Blood Flow Metab. 2016, 36, 172‒186. 8 . Alzheimer´s association, Alzheimer´s Dement. 2021, 17, 327‒406. 21 Tabla 3.1. Causas comunes de demencia y características. Causa Características Enfermedad de Alzheimer Es la causa más común de demencia9 y representa aproximadamente del 60% al 80% de los casos.10,11Algunos de los signos tempranos que presenta son la dificultad para recordar conversaciones, nombres o eventos recientes, además de ser personas apáticas y con depresión. Demencia vascular (enfermedades cerebrovasculares) Proceso por el cual se dañan los vasos sanguíneos del cerebro y/o se lesiona el tejido cerebral por no recibir suficiente sangre, oxigeno o nutrientes. Algunos de los síntomas iniciales son: juicio deteriorado o la capacidad deteriorada para tomar decisiones, así como afectaciones en la memoria. Además de presentar dificultades con funciones motoras, especialmente el caminar lento y falta de equilibrio. Demencia con cuerpos de Lewy Son agregaciones anormales de la proteína alfa-sinucleína en las neuronas; si se desarrollan en la corteza pueden provocar demencia. Algunos de los síntomas iniciales son trastornos del sueño, alucinaciones visuales y deterioro visoespacial. Degeneración lobular frontotemporal (DLFT) Los primeros síntomas típicos incluyen cambios marcados en la personalidad y el comportamiento y/o dificultad para producir o comprender el lenguaje. A diferencia de la EA, la memoria se conserva en las primeras etapas de la enfermedad. Enfermedad de Parkinson (EP) Algunos de los síntomas más comunes de la EP son la lentitud, rigidez, temblores y cambios en la forma de caminar. Esclerosis del hipocampo Se produce el endurecimiento del tejido en el hipocampo del cerebro, lo que ocasiona la pérdida de memoria. Muchas veces puede ser confundida con la EA. Patologías mixtas La presencia de más de una alteración cerebral se denomina patología mixta. Cuando estas patologías presentan síntomas de demencias se denomina demencia mixta. 9 . Lane, C. A.; Hardy, J.; Schott, J. M. Eur. J. Neurol. 2018, 25, 59‒70. 10 . Holtzman, D. M.; Morris, J. C.; Goate, A. Sci. Transl. Med. 2011, 3. 11 . Gaugler, J.; James, B.; Johnson, T.; Reimer, J.; Weuve, J. Alzheimer Dement. 2021, 17, 327‒406. 22 De acuerdo con la OMS, el número de muertes provocados por el conjunto de todas las demencias en el año 2019, fueron de 1.62 millones de personas en todo el mundo. 12 Además, cabe resaltar que ese mismo año, el Alzheimer y el resto de demencias se situaron como la séptima causa de muerte, por detrás de enfermedades cardiovasculares (cardiopatía isquémica, accidente cerebrovascular), enfermedades respiratorias (enfermedad pulmonar obstructiva crónica, infecciones de las vías respiratorias inferiores), afecciones neonatales y cáncer de tráquea, bronquios y pulmón (Figura 3.1). Figura 3.1. Causas principales de defunción, Obtenida de la OMS. 13 12 . Alzheimer´s association, Alzheimer´s Dement. 2019, 7, e12200. 13 . Organización Mundial de la Salud. https://www.who.int/es/news-room/fact-sheets/detail/the-top-10- causes-of-death. Último acceso: 18 de abril de 2022. 23 En el S. XIX, los patólogos observaron un pequeño estrechamiento de los vasos sanguíneos del cerebro, y lo relacionaron con la hipoperfusión que podría conducir al daño cerebral observado en las demencias. A esto se le conoció con el nombre de demencia arteriosclerótica, es decir, producida por el endurecimiento de las arterias.7 Alois Alzheimer, neuropsiquiatra y neuropatólogo alemán, comenzó a cuestionarse que la demencia siempre fuera causada por arterosclerosis cerebral. En el año 1898 estudió a un paciente que presentó demencia a una edad muy temprana; al examinar su cerebro comprobó que había una gran pérdida de células neuronales, pero no había cambio significativo arteriosclerótico. 14 En 1901, Emil Sioli, director del Hospital Mental de Frankfurt (Städtische Anstalt für Irre und Epileptische), le presentó el caso de Auguste Deter, mujer de 50 años de edad, que presentaba delirios, alucinaciones, desorientación, alteraciones en la memoria, paranoia y confusión progresiva; con el paso del tiempo se volvió mucho más apática. Los días 26, 28, 29 y 30 de Noviembre de 1901, A. Alzheimer entrevista a la paciente con una serie de preguntas sencillas cuyas respuestas anota de forma manuscrita 15 en su informe (en la Figura 3.2 se muestra una transcripción parcial), observándose que una gran mayoría de las respuestas son totalmente incoherentes. También muestra trastorno amnésico de la escritura al intentar escribir su nombre y la ciudad en la que reside (Figura 3.2). Se sienta en la cama con una expresión de desamparo. ¿Cuál es su nombre? Auguste. ¿Apellido? Auguste. ¿Cuál es el nombre de su marido? Auguste, creo. ¿Su marido? Ah, mi marido. Mira como si no entendiera la pregunta. ¿Está casada? Con Auguste. ¿Es Ud. la Sra. Deter? Sí, con Auguste Deter. ¿Cuánto tiempo ha estado aquí? Parece estar tratando recordar. Tres semanas. ¿Qué es esto? Le muestro un lápiz. Un bolígrafo. ¿Qué año es? Mil ochocientos. ¿Está Ud. enferma? Segundo mes. Figura 3.2. Extracto de las notas de A. Alzheimer (Noviembre de 1901) 16 y transcripción de algunas respuestas de A. Deter.15 14 . Verhey, F. R. J. J. Neurol., 2009, 256, 502‒503. 15 . Maurer, K. Volk, S.; Gerbaldo, H. Lancet, 1997, 349, 1546‒1549. 16 . Investigación y ciencia. https://www.investigacionyciencia.es/blogs/psicologia-y-neurociencia/63/posts/lahistoria-clnica-de-auguste-d-13791. Último acceso: 18 de abril 2022. 24 La paciente murió 4 años después de su ingreso a causa de una septicemia provocada por úlceras de decúbito, y al realizar la autopsia, Alois Alzheimer describió alteraciones histológicas en el cerebro, 17 que años más tarde serían conocidas como placas seniles o amiloides y ovillos neurofibrilares, además de atrofia cortical (disminución del córtex). Este descubrimiento fue hecho público en 1906 en el 37 Simposio de psiquiatras alemanes del Suroeste, celebrado en Tübingen, el 3 de Noviembre de 1906. En dicho congreso científico impartió la conferencia titulada “Sobre el peculiar proceso patológico de la corteza cerebral”, que no tuvo especial repercusión en ese momento, y que años más tarde sería publicada.17, 18 Gateano Perusini presentó a Alois Alzheimer el caso de Johann Feigl, paciente que mostró síntomas similares a los de Auguste Deter. Su cerebro mostraba las placas amiloides clásicas, pero con la excepción de que carecía de ovillos neurofibrilares. 19 Posteriormente se descubrió una predisposición familiar a desarrollar demencia presenil. 20 Fue Emil Kraepelin, compañero de Alzheimer, quien dio el nombre de “Enfermedad de Alzheimer”; en su libro publicado en 1909. En el capítulo sobre trastornos psiquiátricos seniles y preseniles, Kraepelin discute el significado clínico y nosológico de la enfermedad de Alzheimer. Cita que es una enfermedad que se caracteriza por una demencia grave cuyos síntomas comienzan a una edad de 50 años y no se encuentran signos de arteroesclerosis cerebral. 21 Los archivos originales de Alzheimer acerca de los dos pacientes evaluados no fueron encontrados hasta 1995 tras una ardua investigación, hallándose también las muestras histopatológicas en el Instituto de Munich de Neuropatología. 22 La EA es considerada como una de las enfermedades más complejas y devastadoras en la actualidad, 23 que en estados avanzados conlleva la pérdida total de la capacidad de 17 . Stelmann, R. A.; Schitzlein H. N.; Murtagh, R. Clin. Anat. 1995, 8, 429‒431. 18 . Alzheimer, A. Psychisch-Gerichtl Med. 1907, 64, 146‒148. 19 . Dahm, R. Curr. Biol. 2006, 16, R906‒R910. 20 . Klünemann, H. H.; Fronhöfer, W.; Wuster, H.; Fischer, W.; Ibach, B.; Klein, H. E. Ann Neurol. 2002, 52, 520‒523. 21 . Weber, M. M. J. Psychiat. Res. 1997, 6, 635‒643. 22 . Hippius, H.; Neundörfer, G. Dialogues Clin. Neurosci. 2003, 5, 101‒108. 23 . Talwar, P.; Sinha, J.; Grover, S.; Rawat, C.; Kushwaha, S.; Agarwal, R.; Taneja, V.; Kukreti, R. Mol. Neurobiol. 2016, 53, 4833‒4864. 25 realizar las tareas diarias, y la completa dependencia del paciente de sus cuidadores. 24 En este trastorno neurodegenerativo se pueden observar efectos severos e irreversibles, como el deterioro cognitivo, pérdida de memoria, cambios de comportamiento, depresión, psicosis o síntomas parkinsonianos, entre otros; 25 se cree que los cambios patológicos en el cerebro ocurren hasta 20 años antes del inicio de los síntomas, 26 lo que implica la importancia fundamental de desarrollar protocolos de detección temprana. 27 Tradicionalmente, los fármacos se han diseñado con el propósito de que los síntomas o el desarrollo de una enfermedad determinada se pueda abordar mediante la modulación adecuada de una sola diana biológica; sin embargo, se ha demostrado que los fármacos orientados a una sola diana resultan ser obsoletos para lograr un tratamiento terapéutico. 28 Se recomienda encarecidamente, también para la EA, el diseño de ligandos multidiana, 29 es decir, la combinación de varios farmacóforos para abordar simultáneamente las principales dianas terapéuticas de la enfermedad. 30 El estilo de vida (por ejemplo, fumar) y el estado de salud (por ejemplo, diabetes, obesidad, hipertensión) están estrechamente relacionados con el riesgo de desarrollar EA. 31 Estudios recientes incluso relacionan la EA con la diabetes tipo 2; debido a esta conexión, a la EA a veces se le denomina diabetes tipo 3 32 o diabetes cerebral. 33 La conexión entre ambas enfermedades se debe al hecho de que la insulina no solo regula los niveles de azúcar en la 24 . Coimbra, J. R. M.; Marques, D. F. F.; Baptista, S. J.; Pereira, C. M. F.; Moreira, P. I.; Dinis, T. C. P.; Santos, A. E.; Salvador J. A. R. Front. Chem. 2018, 6. 25 . Knopman, D. S.; Amieva, H.; Petersen, R. C.; Chételat, G.; Holtzman, D. M.; Hyman, D. T.; Nixon, R. A.; Jones, D. T. Nat. Rev. Dis. Primers. 2021, 7. 26 . Beason-Held, L. L.; Goh, J. O.; An, Y.; Kraut, M. A.; O’Brien, R. J.; Ferrucci, L.; Resnick, S. M. J. Neurosci. 2013, 33, 18008‒18014. 27 . Frisoni, G. B.; Boccardi, M.; Barkhof, F.; Blennow, K.; Cappa, S.; Chiotis, K.; Démonet, J.-F.; Garibotto, V.; Giannakopoulos, P.; Gietl, A.; Hansson, O.; Herholz, K.; Jack Jr., C. R.; Nobili, F.; Nordberg, A.; Snyder, H. M.; Kate, M. T.; Varrone, A.; Albanese, E.; Becker, S.; Bossuyt, P.; Carrillo, M. C.; Cerami, C.; Dubois, B.; Gallo, V.; Giacobini, E.; Gold, G.; Hurst, S.; Lönneborg, A.; Lovblad, K.-O.; Mattsson, N.; Molinuevo, J.-L.: Monsch, A. U.; Mosimann, U.; Padovani, A.; Picco, A.; Porteri, C.; Ratib, O.; Saint- Aubert, L.; Scerri, C.; Scheltens, P.; Schott, J. M.; Sonni, I.;Teipel, S.;Vineis, P.; Visser, P. J.; Yasui, Y.;Winblad, B. Lancet Neurol. 2017, 16, 661‒676. 28 . Bolognesi, M. L.; Cavalli, A. ChemMedChem 2016, 11, 1190‒1192. 29 . Sameem, B.; Saeedi, M.; Mahdavi, M.; Shafiee, A. Eur. J. Med. Chem. 2017, 128, 332‒345. 30 . Catania. M.; Giaccone, G.; Salmona, M.; Tagliavini, F.; Di Fede, G. Front. Aging Neurosci. 2019, 11, 317. 31 . Aisen, P. S.; Cummings, J.; Jack Jr., C. R.; Morris, J. C.; Sperling, R.; Frölich, L.; Jones, R. W.; Dowsett, S. A.; Matthews, B. R.; Raskin, J.; Scheltens, P.; Dubois, B. Alzheimer’s Res. Ther. 2017, 9. 32 . Kandimalla, R.; Thirumala, V.; Reddy, P. H. Biochim Biophys Acta Mol Basis Dis. 2017, 1863, 1078‒1089. 33 . Ferreira-Vierira, T.; Guimaraes, I. M.; Silva, F. R.; Ribeiro, F. M. Curr. Neuropharmacol. 2016, 14, 101‒ 115. 32 Figura 3.6. Fármacos anti-Alzheimer como inhibidores de colinesterasas y comparación con la tacrina. Otro fármaco que presenta un mecanismo de acción completamente diferente a los anteriores es la memantina (Figura 3.7), un antagonista del receptor del ácido N-metil-D- aspártico (NMDAR). 64 De esta forma, la memantina bloquea la excesiva actividad del receptor de NMDA (N-metil- D -aspartato) en el enfermo de Alzheimer sin interrumpir la actividad normal. La memantina también se prescribe para el tratamiento de otros trastornos del Sistema Nervioso Central (SNC), como la enfermedad de Parkinson, epilepsia, o el traumatismo del SCN. 65 La memantina está indicada para tratar la enfermedad de Alzheimer de moderada a grave. 66 64 . Liu1, J.; Chang, L.; Song, Y.; Li, H.; Wu, Y. Front. Neurosci. 2019, 13, 43. 65 Ivleva, E. A.; Klimochkin, Y. N. Org. Prep. Proced. Int. 2017, 49, 155‒162. 66 . Matsunaga, S.; Kishi, T.; Nomura, I.; Sakuma, K.; Okuya, M.; Ikuta, T.; Iwata, N. Expert Opin. Drug Saf. 2018, 17, 1053‒1061. 33 Figura 3.7. Estructura de la memantina Muy recientemente, la FDA aprobó 67 Adulhem, a través de la vía de aprobación acelerada, para reducir las placas amiloides; esta es la primera terapia lanzada desde 2003, y la primera dirigida hacia la que se piensa es uno de los orígenes de la enfermedad, como son las placas amiloides. El lanzamiento de este fármaco se llevó a cabo con cierta controversia, ya que parte de la comunidad científica duda acerca de los efectos beneficiosos reales en los pacientes. β-N-acetil-D-hexosaminidasas Las β-N-acetil-D-hexosaminidasas humanas son enzimas lisosomales que catalizan la hidrolisis de los enlaces glucosídicos en glucanos, glucoproteínas y glucolípidos. Estas se encuentran implicadas en diferentes bioprocesos importantes, como el metabolismo, comunicación celular, proliferación celular, inflamación, la modificación de las glicoproteínas, el metabolismo de los glicoconjugados, reconocimiento de gametos, y la degradación de la quitina en las paredes celulares tanto de hongos como de exoesqueletos de artrópodos. 68 Las β-N-acetil-D-hexosaminidasas humanas HexA, HexB y O-GlcNAcasa (OGA) son de particular interés debido a su potencial como dianas farmacológicas para el desarrollo de fármacos. El funcionamiento anómalo en ellas da como resultado la acumulación de 67 . Food and Drug Administration, https://www.fda.gov/drugs/news-events-human-drugs/fdas-decision- approve-new-treatment-alzheimers-disease. Último acceso: 23 de febrero de 2022. 68 . Liu, T.; Duan, Y.; Yang, Q., Biotech. Adv, 2018, 36, 1127‒1138. 34 gangliósidos GM2 dentro de los lisosomas, 69 lo cual conduce a trastornos neurodegenerativos hereditarios que incluyen enfermedades como el Tay-Sachs o Sandhoff (producidas por la inactivación genética de la Hex A y B). 70 Es por ello que se ha propuesto que los inhibidores de hexosaminidasas podrían constituir una nueva familia de fármacos para el tratamiento de estas enfermedades. La O-GlcNAcasa (OGA, OGA, EC 3.2.1.169; GH84), junto con la O-GlcNAc transferasa (OGT) son enzimas clave que controlan la modificación postraduccional 71 , 72 de una plétora de proteínas de señalización mitocondriales, citoplasmáticas y nucleares. Mientras que la OGT cataliza la transferencia de N-acetil-D-glucosamina del nucleótido UDP-GlcNAc a residuos de Ser/Thr, la OGA, una enzima de 103 kDa 73 perteneciente a la familia de hidrolasas de glicósidos 84 (GH84), 74 ejerce una acción hidrolítica en dicha posición. 75 Se ha demostrado que en la EA se produce una disminución en la O- GlcNAcilación de la proteína tau, junto con una hiperfosforilación en los residuos libres de Ser/Thr. 76 En consecuencia, la hiperfosforilación de las proteínas tau y la formación subsiguiente de NFTs patológicos pueden reducirse mediante la inhibición de OGA; 77 por lo tanto, esta es un área emergente para abordar las taupatías, incluida la EA. 78 La OGA exhibe un mecanismo de acción asistido por sustrato (38), en el cual el grupo acetamido de la posición C-2 actúa como nucleófilo dando lugar a un intermedio de tipo oxazolina (39), con un estado de transición con carácter de catión oxocarbenio (41);74 en este proceso, los residuos catalíticos clave son Asp174 y Asp175 (Esquema 3.1). 69 . 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X.; Maguire, M.; Mahadomrongkul, V.; McEachern, E. J.; Ouyang, X.; Rosahl, T. W.; Selnick, H.; Stanton, M.; Terracina, G.; Vocadlo, D. J.; Wang, G.; Duffy, J. L.; Parker, E. M.; Zhang, L. Mol. Neurodegener. 2017, 12, 39. 78 . Bartolomé-Nebreda, J. M.; Trabanco, A. A.; Velter, A. I.; Buijnsters, P. Exp. Opin. Ther. Pat. 2021, 31, 1117‒1154. 35 Esquema 3.1. Mecanismo catalítico de la hidrólisis mediada por OGA humana. Los inhibidores clásicos de OGA son miméticos de los intermedios de la hidrólisis o del estado de transición similar al catión oxocarbenio. 79 Entre ellos, algunos ejemplos de inhibidores potentes de OGA (Figura 3.8) son el PUGNAc (42, N-fenilcarbamato de glucopiranosilideno), 80 las tiazolinas fusionadas con carbohidratos NAG-tiazolina (inhibidor nanomolar, pero no selectivo, 44), 81 Thiamet-G 82 (45), y sus derivados,74, 83 , 84 GlcNAcstatinas (47, glucoimidazoles), 85 junto con moléculas pequeñas no basadas en carbohidratos. 86 79 . Elbatrawy, A. A.; Kim, E. J.; Nam, G. ChemMedChem 2020, 15, 1244‒1257. 80 . Horsch, M.; Hoesch, L.; Vasella, A.; Rast, D. M. Eur. J. Biochem. 1991, 197, 815‒818. 81 . Macauley, M. S.; Whitworth, G. E.; Debowski, A. W.; Chin, D; Vocadlo, D. J. J. Biol. Chem. 2005, 280, 25313‒25322. 82 . Yuzwa, S. A.; Macauley, M. S.; Heinonen, J. E.; Shan, X.; Dennis, R. J.; He, Y.; Whitworth, G. E.; Stubbs, K. A.; McEachern, E. J.; Davies, G. J.; Vocadlo, D. J. Nat. Chem. Biol. 2008, 4, 483‒490. 83 . Kiss, M.; Szabó, E.; Bocska, B.; Sinh, L. T.; Fernandes, C. P.; Timári, I.; Hayes, J. M.; Somsák, K.; Barna, T. Eur. J. Med. Chem. 2021, 223, 113649. 84 . Selnick, H. G.; Hess, J. F.; Tang, C.; Liu, K.; Schachter, J. B.; Ballard, J. E.; Marcus, J.; Klein, D. J.; Wang, X.; Pearson, M.; Savage, M. J.; Kaul, R.; Li, T.-S.; Vocadlo, D. J.; Zhou, Y.; Zhu, Y.; Mu, C.; Wang, Y.; Wei, Z.; Bai, C.; Duffy, J. L.; McEachern, E. J. J. Med. Chem. 2019, 62, 10062‒10097. 85 . Dorrmueller H. C.; Borodkin, V. S.; Schi,pl, M.; Aalte, D. M. F. Biochem. J. 2009, 420, 221‒227. 86 . Martínez-Viturro, C. M.; Trabanco, A. A.; Royes, J.; Fernández, E.; Tresadern, H.; Vega, J.A.; del Cerro, A.; Delgado, F.; Molina, A. G.; Tovar, F.; Shaffer, P.; Ebneth, A.; Bretteville, A.; Mertens, L.; Somers, M.; Alonso, J. M.; Bartolomé-Nebreda, J. M. J. Med. Chem. 2020, 63, 14017‒14044. 36 Figura 3.8. Inhibidores de a β-N-acetil-hexosaminidasa NGT Y PUGNAc PUGNAc (42) es un inhibidor no selectivo de O-GlcNAcasa (Ki= 46 nM) y de βhexosaminidasa (Ki= 36 nM). 87 Dado que las Hex A y Hex B pueden procesar tanto la configuración D-gluco como D-galacto, se ha investigado la actividad del epímero en C-4 de 42, Gal-PUGNAc (43, Figura 3.8), que resultó ser un potente inhibidor selectivo frente a ambas hexosaminidasas, con constantes de inhibición Ki= 18±1 nM para la HexB y Ki= 51±3 nM para la HexA. 88 Las GlcNAstatinas 47 son otra familia que han mostrado ser potentes inhibidores de hexosaminidasas. Esta familia tiene similitudes estructurales con PUGNAc y la nagstatina natural 46 (Figura 3.8). Las GlcNAstatinas 47a-d mostraron inhibición de la enzima humana 87 . Kong, H.; Chen, W.; Liu, T.; Lu, H.; Yang, Q.; Dong, Y.; Liang, X.; Jin, S.; Zhang, J. Carbohydr. Res. 2016, 419, 54‒61. 88 . Stubbs, K. A.; Macauley, M. S.; Vocadlo, D. J. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 2009, 48, 1300‒1303. 37 en el rango nanomolar y subnanmolar, siendo los derivados 47b y 47d los más potentes frente a la inhibición de hOGA con valores de Ki de 0.42 y 0.74 nM respectivamente (Tabla 3.3).85 Tabla 3.3. Valores de Ki (nM) de las GlcNAstatins 47 frente a Hex A/B y hOGA Compuesto Hex A/B Ki hOGA, Ki 47a 0.55 ± 0.05 4.3 ± 0.2 47b 0.17 ± 0.06 0.42 ± 0.06 47c 550 ± 10 4.4 ± 0.1 47d 2.7 ± 0.4 0.74 ± 0.09 No obstante, la inhibición simultánea de OGA y de HexA/B puede conducir a importantes efectos secundarios (ya se ha indicado previamente que la inactivación de Hex A y B conduce a enfermedades de almacenamiento lisosomal). Es por ello que, para el tratamiento de enfermedades neurodegenerativas, como la EA, es importante que se diseñen inhibidores selectivos frente a OGA, sin afectar a las otras hexosaminidasas. En este contexto, resultaron de gran interés las 1,3-tiazolinas derivadas de carbohidrato, 89 como el Thiamet-G (45, Figura 3.8); será este tipo de estructura el hilo conductor de una parte importante del presente capítulo de Tesis Doctoral. Knapp y Vocadlo35 describieron la síntesis de NAG-Tiazolina 44, utilizando el reactivo de Lawesson sobre la N-acetil-D-glucosamina 52; esto condujo a la formación de la correspondiente tioamida, que experimentó una reacción tipo SN2 intramolecular, promovida por calentamiento en tolueno, entre el átomo de azufre de la tioamida y el carbono anomérico, con la expulsión del acetato de dicha posición (Esquema 3.2). La desprotección final en condiciones de Zemplen (NaOMe metanólico) condujo a 44. 89 . Stubbs, K. A.; Balcewich, M.; Mark, B. L.; Vocadlo, C. J. J. Biol. Chem. 2007, 282, 21382‒21391. 38 Esquema 3.2 Síntesis de NAG-tiazolina (44). La NAG-tiazolina (44) resultó ser un potente inhibidor competitivo de N- acetilhexosaminidasa de guisantes de Jack, con una Ki =280 nM, uniéndose casi 20 000 veces más firmemente que el azúcar original, la N-aceti- β-D-glucosamina (Ki= 5 mM). 90 Aunque menos potente, su actividad puede ser comparada con algunos de los inhibidores más potentes de esta enzima, los iminoazúcares 2-acetamido-1,2-didesoxinojirimicina (Ki= 140‒ 230 nM) y 2-acetamido-2-desoxinojirimicina (Ki= 1.2 nM).90 Además, es un potente inhibidor de OGA (Ki= 70 nM) y de β-hexosaminidasa (Ki= 70 nM). Thiamet-G (45), que resulta de la sustitución del grupo 2-metilo en el sistema heterocíclico de 44 por un grupo etilamino resultó ser un inhibidor potente y selectivo de la enzima humana OGA, teniendo una inhibición competitiva con Ki= 21±3 nM;82 es importante destacar que frente a la β-hexosaminidasa lisosomal humana exhibió valores de Ki= 750 ± 60 nM. La actividad frente a OGA fue recientemente reestudiada74 y refinada, sustituyendo la representación de Lineweaver-Burk por el método de Morrison, que proporciona valores más precisos de constantes de inhibición para el tipo de inhibición mostrado por el compuesto; esto arrojó un valor de Ki 10 veces menor (2.1 nM), por lo que se puede hablar de una selectividad excepcional frente a OGA por parte de Thiamet-G (45). 90 . Knapp, S.; Vocadlo, D.; Gao, Z.; Kirk, B.; Lou, J.; Withers, S. G., J. Am. Chem. Soc. 1996, 118, 6804‒ 6805. 39 Además, es un producto estable en medios acuosos, y un potencial inhibidor permeable a la barrera hematoencefálica.82 Se ha descrito que Thiamet-G disminuye la fosforilación de la proteína tau in vitro e in vivo.82 Cuando 45 se administró por vía oral (disuelto en el agua ingerida por el animal) en un modelo de ratón tau/APP, donde coexisten las patologías β-amiloide y tau, imitando un estado avanzado de la EA, el Thiamet G incrementó los niveles de O-GlcNAc y evitó la disfunción cognitiva. 91 En este caso, esto fue atribuido, no a la modificación de los niveles de hiperfosforilación en la proteína tau, sino a la disminución, o incluso eliminación de péptidos β-amiloides. Posteriormente se demostró 92 que los inhibidores de la OGA actúan a través de un mecanismo de autofagia, que permite una disminución de los niveles de los péptidos neurotóxicos en el cerebro. El compuesto MK-8719, un derivado fluorado del Thiamet-G resultante de la sustitución del fragmento hidroximetilo exocíclico por un grupo difluorometilo, se diseñó para incrementar la lipofilia del Thiamet-G, y, por tanto, favorecer la penetración al SNC; actualmente se encuentra en fase clínica I.84 Amorelli y col 93 describieron la síntesis de GalNAc-tiazolinas y sus homólogos en C- 1 (ej. 52, 53), como análogos de GlcNAc-tiazolina (44). El paso de esta síntesis es el tratamiento de la lactona 49 con tert-butoxicarbonilmetilentrifenilfosforano, dando una mezcla del éster de la tiazolina 50 y el derivado insaturado 51 (Esquema 3.3). La posterior desprotección de la mezcla de productos obtenida, seguido de algunas etapas adicionales, condujo a 52 y 53. Los estudios de inhibición de 52 y 53 frente a SpHex (N- acetilhexosaminidasa de Streptomyces plicatus) reveló afinidades muy reducidas frente a dicha enzima, en relación con las tiazolinas originales (Ki= 20 µM para GlcNAc-tiazolina y Ki= 100 µM para GalNAc-tiazolina) 91 . Yuzwa, A.A:; Shan, X.; Jones, B.A.; Zhao, G.; Woodward, M.L.; Li, X.; Zhu, Y.; McEachern, E.J.; Silverman, M.A.; Watson, N.V:; Gong, C.-X.; Vocadlo, D.J. Mol. Neurodegener. 2014, 9, 42. 92 . Zhu, Y.; Shan, X.; Safarpour, F.; Go, N.R.; Li, N.; Shan, A.; Huang, M.C.; Deen, M.; Holicek, V.; Ashmus, R.; Madden, Z.; Gorski, S.; Silverman, M.A.; Vocadlo, D.J. ACS Chem. Neurosci. 2018, 9, 1366‒1379. 93 . Amorelli, B.; Yang, C.; Rempel, B.; Withers, S. G.; Knapp, S. Bioorg. Med. Lett. 2008, 18, 2944‒2947. 40 Esquema 3.3. Síntesis de GalNAc-tiazolinas 52 y 53. Kong y col 94 describieron la síntesis de una serie de derivados N-sustituidos de manotiazolinas; a tal efecto, la síntesis comenzó con el hidrocloruro de D-manosamina 54, que se protegió en forma de base de Schiff, seguido de acetilación de los hidroxilos del carbohidrato, y N-desprotección en condiciones ácidas suaves, para dar lugar a la manosamina O-acetilada 56 (Esquema 3.4). El tratamiento de 56 con tiofosgeno para dar el correspondiente isotiocianato, seguido de acoplamiento con aminas, condujo a las tioureas 57. Para efectuar la ciclación del átomo de azufre de la tiourea sobre el carbono anomérico, en lugar de llevar a cabo la sustitución en condiciones térmicas, 57 se transformó en el correspondiente bromuro de glicosilo (HBr/AcOH), y tras la sustitución nucleófila intramolecular, los acetatos se desprotegieron en medio básico (K2CO3), originando las tiazolinas bicíclicas desprotegidas 59 (Esquema 3.4). Se comprobó que los derivados que portaran sustituyentes R1/R2 con cadenas lineales y de máximo tres átomos de carbono (Me, Et, Pr, Me/Me, Me/Pr), fueron los inhibidores más potentes de la serie frente a hOGA (Ki= 94 . Kong, H.; Chen, W.; Liu, T.; Yang, Q.; Dong, Y.; Liang, X.; Jin, S.; Zhang, J. Carbohydr. Res. 2016, 429, 54‒61. 41 6.4-28.5 µM), y si bien eran inhibidores más modestos que los clásicos tipos NAG-tiazolina o Thiamet-G sí mantenían una buena selectividad frente a HexB (Ki > 100 µM). Esquema 3.4. Síntesis de 2-aminotiazolinas de configuración D-mano. Por otra parte, Kim y col. 95 describieron la síntesis de que es, hasta la fecha, la única GlcNAc selenazolina; para ello emplearon como materia prima la N-acetil-β-D-glucosamina pentaacetilada 48, que fue tratada con el reactivo de Woollins (WR) para transformarla en la correspondiente selenoamida, seguido de O-desacetilacion en medio básico, originando así la GlcNAc selenazolina 60 con un rendimiento del 78% (Esquema 3.5). Con una Ki= 0.7 µM frente a OGA, el derivado 60 fue significativamente menos activo que las tiazolinas isósteras; se argumentó que quizás, la mayor longitud del enlace C-Se, junto con la menor capacidad de aceptar enlaces de hidrógeno, son responsables de la disminución de dicha actividad.95 95 . Kim, E. J.; Love, D. C.; Darout, E.; Abdo, M.; Rempel, B.; Withers, S. G.; Rablen, P. R.; Hanover, J. A.; Knapp, S., Bioorg. Med. Chem. 2010, 18, 7058‒7064. 48 mimético del catión Li+. 129 Por otro lado, el etaselén (BBSKE) (2,2´-(1,2-etanodiil)bis(1,2- benzoselenazol-3(2H)-ona, 74) ha demostrado tener actividad antioxidante y antiinflamatoria, así como importantes efectos antitumorales en células de pulmón. 130 Figura 3.12. Estructuras del ebselén y etaselén Dentro de las numerosas familias de selenoheterociclos descritos hasta la fecha destacan las 2-selenazolinas, selenazoles, selenadiazoles, o 1,3-selenazinas (75‒78), entre otros (Figura 3.13). Figura 3.13. Ejemplos de selenoheterociclos. 129 . Singh, N.; Halliday, A.C.; Thomas, J.M.; Kuznetsova, O.; Baldwin, R.; Woon, E.C.Y.; Aley, P.K.; Antoniadou, I.; Sharp, T.; Vasudevan, S.R.; Churchill, G.C. Nat. Commun. 2013, 4, 1332. 130 . Ye, S. F.; Ji, S. M.; Zeng, H. H.; Lu, W. Acta Pharmacol. Sin.2017, 38, 223‒232. 49 En este apartado de la Tesis Doctoral se abarcará la síntesis de selenadiazoles derivados de D-glucosa y 2-selenazolinas derivadas de D-glucosamina. Por este motivo, a continuación, se describirán aspectos relevantes en la síntesis de estos selenoheterociclos descritos en la bibliografía. Li y et al. 131 describieron la síntesis de 2-amino-1,3,4-selenadiazoles en un proceso one-pot a partir de isoselenocianatos 79, hidracina monohidratada (80) y aldehídos aromáticos (82). Este procedimiento les permitió obtener de forma simple diversos 2- aminoselenadiazoles con rendimientos de buenos a moderados (57-82%). En primer lugar, se lleva a cabo la formación de las selenosemicarbazidas 81, que se obtienen de manera sencilla a partir de los correspondientes isoselenocianatos e hidracina (Esquema 3.6). Posteriormente se lleva a cabo el acoplamiento con diferentes aldehídos para dar como resultado las selenosemicarbazonas 83 y finalmente la ciclación intramolecular promovida por NBS, y su posterior aromatización dio como resultado los 2-amino-1,3,4- selenadiazoles 84 (Esquema 3.6). Esquema 3.6. Síntesis de 2-amino-1,3,4-selenadiazoles. 131 . Li, X.; Gan, B.; Xie, T.; Yang, P.; Xie, Y.; J. Chem. Res. 2016, 40, 178‒181. 50 Wojciech y col. 132 describieron (Esquema 3.7) la síntesis de 1,3,4-selenadiazoles 86 a partir de N,N’-diacilhidracinas utilizando el reactivo de Woollins (análogo del reactivo de Lawesson, excelente reactivo selenante) para la síntesis. Los productos se obtuvieron con rendimientos moderados (26-57%). El mecanismo de este tipo de reacciones es desconocido, pero es probable que se lleve a cabo la selenación de los grupos carbonilo para la ciclación con desprendimiento de selenuro de hidrógeno. Esquema 3.7. Síntesis de 1,3,4-selenadiazoles monosustituidos. Wei y col. 133 describieron la síntesis de 2-amino-1,3,4-selenadiazoles 88 con rendimientos moderados a partir de N-tosilhidrazona utilizando selenocianato de potasio, a temperatura ambiente. El efecto electrónico sobre el anillo aromático de las N-tosilhidrazonas tuvo poca influencia en la reacción (Esquema 3.8). Esquema 3.8. Síntesis de 2-amino-1,3,4-selenadiazoles. 132 . Ostrowski, W.; Gierczyk, B.; Frański, R. J. Heterocyl. Chem. 2012, 49, 1266‒1268. 133 . Wei, Z.; Zhang, Q.; Tang, M.; Zhang, S.; Zhang, Q. Org. Lett. 2021, 23, 4436‒4440. 51 Stepanova y col. 134 describieron la síntesis de un 1,2,3-selenadiazol derivado de carbohidrato a partir de 2-fluoro-4-hidroxiacetofenona 89 (Esquema 3.9). Para ello se hizo reaccionar la cetona 89 con el clorhidrato de la semicarbazida en presencia de acetato de sodio, dando la semicarbazona 90 como un solo isómero. Posteriormente se llevó a cabo la oxidación de la semicarbazona con SeO2, aislándose el compuesto 91 con un rendimiento moderado (22%); el acoplamiento de este con la acetobromogalactosa per-O-acetilada 92 condujo al selenoheterociclo 93 (25%). Esquema 3.9. Síntesis de 4-(2-Fluoro-4-hidroxifenil)-1,2,3-selenadiazol. Huang y col. 135 describieron la síntesis de las 1,3-selenazolinas espiránicas 96 (Esquema 3.10) utilizando 2-bromo-2-ciclo-propilidenacetato de etilo y diversas arilselenoamidas, con excelentes rendimientos (82-88%). 134 . Stepanova, O. V.; Pevzner, L. M.; Petrov, M. L.; Stepanova, N. P.; Sokolova, N. B.; Stepakov, A. V. Russ. J. Gen. Chem. 2020, 90, 1241‒1248. 135 . Huang, X.; Chen, W. L.; Zhou, H. W. Synlett. 2004, 2, 329‒331. 52 Esquema 3.10. Síntesis de las selenazolinas 96. Shibahara y col. 136 describieron la obtención selenazolinas quirales 100 a partir de N- aciloxazodilinonas (Esquema 3.11); la reacción se lleva a cabo mediante un re-ordenamiento selenativo del esqueleto cíclico quiral, en presencia de selenio elemental, un hidrocolorosilano y una amina; se accedió de esta forma a una amplia gama de productos, aunque de estabilidad reducida. Esquema 3.11. Reordenamiento selenativo para la obtención de selenazolinas quirales. 136 . Shibahara, F.; Fukunaga, T.; Kubota, S.; Yoshida, A.; Murai, T. Org. Lett. 2018, 20, 5826‒5830. 53 3.2. Objetivos El presente capítulo de la Tesis Doctoral describe la preparación de varias familias de derivados organoselénicos con potencial actividad anti-Alzheimer o antiproliferativa que, tal y como se ha indicado en la introducción, son dos de las enfermedades multifactoriales más complejas en la actualidad. 3.3. Discusión de resultados 2-Alquiltio-1,3-oxazolinas bicíclicas derivadas de carbohidrato En relación a los derivados con actividad anti-Alzheimer, se llevó a cabo la preparación de sistemas bicíclicos derivados de carbohidrato, análogos a las 1,3-tiazolinas desarrolladas por Knapp y Vocadlo (NAG-tiazolina, 44, y Thiamet-G, 45). En primer lugar, se abordó la preparación de 2-alquiltio-1,3-oxazolinas bicíclicas como potenciales inhibidores de la enzima OGA, siendo la estructura general la mostrada en la Figura 3.14. Así pues, el sistema bicíclico permitiría mimetizar, si es protonado en condiciones fisiológicas, el estado de transición en la hidrólisis del sustrato natural de la OGA, pudiendo encajar de esta manera en el sitio catalítico de la misma. Por otro lado, la incorporación sobre el átomo de azufre de residuos hidrofóbicos permitiría el establecimiento de interacciones no covalentes con bolsillos hidrofóbicos de la enzima, lo cual podría, a su vez, potenciar la actividad inhibitoria de estos compuestos. Figura 3.14. Estructura general de las 2-alquiltio-1,3-oxazolinas abordadas. 54 A tal efecto, la preparación de estos derivados comenzó a partir del hidrocloruro de D-glucosamina 101 como materia prima comercial asequible, que fue transformada en el tiocarbamato bicíclico 105, siguiendo la metodología indicada en el Esquema 3.12. Así pues, su tratamiento con tiofosgeno como agente tionante empleando un buffer de NaHCO3/CO2 condujo al isotiocianato 102 no aislado, que experimenta un ataque nucleofílico intramolecular espontáneo del grupo hidroxilo del anómero α sobre el heterocumuleno, dando lugar al tiocarbamato 103. 137 Posteriormente se acetiló de manera convencional dicho tiocarbamato con una mezcla 1:1 de Ac2O/Py, obteniéndose el derivado per-O- y N-acetilado 104. Finalmente, el compuesto 104 fue sometido a una desacetilación quimioselectiva del grupo N-acetilo utilizando p-toluidina en EtOH a 65°C.137 De esta manera se obtuvo el derivado 105, que fue utilizado como materia prima para la formación de las 2-alquitio-1,3- oxazolinas bicíclicas (Esquema 3.13). Esquema 3.12. Preparación del tiocarbamato bicíclico 105. Para la alquilación del átomo de azufre de 105 se llevó a cabo el tratamiento de dicho compuesto con diferentes bromuros de alquilo (bromuro de bencilo, bromobutano, bromohexano) en condiciones ligeramente básicas (Et3N) y en presencia de DMAP como 137 . López, Ó.; Zafra, E.; Maya, I.; Fuentes, J.; Diánez, M. J.; Estrada, M. D.; Pérez-Garrido, S.; Fernández- Bolaños, J. G. Tetrahedron, 2008, 64, 11789–11796. 55 catalizador; esto proporcionó las correspondientes oxazolinas bicíclicas S-alquiladas 1-3, con rendimientos de moderados a buenos (Esquema 3.13). Se emplearon fragmentos hidrofóbicos tanto de tipo alquílico de distinta longitud, como bencílico, con objeto de observar su influencia sobre las propiedades inhibitorias. La preferencia de la S-alquilación sobre la N-alquilación podría explicarse atendiendo a la teoría ácido-base duro-blando (HSAB, Hard-Soft Acid-Base) de Pearson; 138 en este contexto, los haluros de alquilo se consideran como especies electrofílicas blandas, a diferencias de los haluros de ácido, que se consideran como especies duras. 139 Así pues, es el nucleófilo más blando (átomo de azufre del grupo tiona) 140 el que experimenta la reacción de alquilación con los haluros de alquilo, y no el nitrógeno. Esquema 3.13. Preparación de las 2-alquiltio-1,3-oxazolinas 1‒3. A modo de ejemplo se muestra el espectro de 1H-RMN del producto 2 (Figura 3.15), en el cual se pueden destacar como señales importantes el metileno unido directamente al átomo de azufre alrededor de 3.0 ppm, claramente apantallado con respecto a una función de tipo éter. Por otro lado, el protón anomérico se encuentra claramente desapantallado, resonando a aproximadamente 6.0 ppm; además, la constante de acoplamiento J1,2 es de 7.1 Hz, mostrando claramente una distorsión de la conformación 4C1 de la silla estándar del carbohidrato. 138 . Ho, T. L. Chem. Rev. 1975, 75, 1‒20. 139 . Ach, D.; Reboul, V.; Metzner, P. Eur. J. Org. Chem. 2002, 2573‒2586. 140 . Sambrook, M. R.; Beer, P. D.; Wisner, J. A.; Paul, R. L.; Cowley, A. R.; Szemes, F.; Drew, M. G. B. J. Am. Chem. Soc. 2005, 127, 2292‒2302. 56 Figura 3.15. Espectro de 1H-RMN (500 MHz, CDCl3) del compuesto 2. Por otra parte, en el espectro de 13C-RMN de 2 (Figura 3.16) se puede destacar la presencia de la señal C=N en aproximadamente 168 ppm. Figura 3.16. Espectro de 13C-RMN (125.7 MHz, CDCl3) del compuesto 2. A continuación, se muestra (Tabla 3.4) una selección de datos espectroscópicos de las 1,3-oxazolinas bicíclicas 1-3; en concreto, los desplazamientos químicos de H-1, C=N y C-1, así como la constante de acoplamiento J1,2 Los tres compuestos muestran el mismo comportamiento conformacional con respecto a la distorsión de la silla 4C1. 57 Tabla 3.4. Selección de datos de RMN de 1H y 13C de las oxazolinas bicíclicas 1-3. Compuesto H-1 (ppm) J1,2 (Hz) δC=N (ppm) δC-1 (ppm) 1 5.99 7.1 167.5 101.2 2 6.03 7.1 168.1 100.8 3 6.03 7.0 168.1 100.8 Posteriormente se abordó la desprotección de las 2-alquiltio-1,3-oxazolinas bicíclicas; no obstante, dicha desprotección resultó ser mucho más complicada de lo que podría anticiparse. En un primer ensayo se emplearon las condiciones clásicas de Zemplen (NaOMe en metanol), 141 seguido de neutralización con resina ácida Amberlita IR-120(H+) sobre el producto 1. No obstante, y de manera inesperada, no se obtuvo el producto bicíclico O-desacetilado, sino el derivado 106, resultante de la apertura del biciclo por el ataque nucleofílico del metóxido sobre el carbono anomérico (Esquema 3.14). El espectro de 1H- RMN (700 MHz, CD3OD) del crudo de reacción mostró un singulete que integra para 3 protones a 3.47 ppm, correspondiente al grupo metoxilo. Por otro lado, el protón anomérico (4.29 ppm) exhibió una J1,2 típica de un derivado de D-glucosa de configuración β (8.4 Hz), y, por tanto, no del sistema bicíclico esperable. De igual manera, el espectro de 13C-RMN (176.1 MHz, CD3OD) muestra la señal correspondiente al metoxilo en 57.2 ppm. Esquema 3.14. Intento de desprotección de 1 en condiciones de Zemplen. 141 . Zemplen, G.; Kuntz, A.; Ber., 1924, 57B, 1357. 64 total, el procesado de la reacción resultó ser más problemático de lo esperado. Por un lado, la neutralización con resina Amberlita IR-120(H+) conducía a descomposición, probablemente con apertura del anillo bajo las fuertes condiciones ácidas. Por otro lado, la neutralización con AcOH, si bien evitó la descomposición del sistema bicíclico, dificultó la eliminación del NaOAc generado. Por ello se optó por una desacetilación promovida por amoníaco metanólico. De esta manera, se obtuvieron las selenazolinas O-desprotegidas 10‒12 (Esquema 3.18), con rendimientos de moderados a excelentes (38‒91%) tras purificación cromatográfica. Esquema 3.18. Síntesis de las 2-aminoselenazolinas desprotegidas. A modo de ejemplo, en la Figura 3.18 se muestra el espectro de 1H-RMN de la selenourea 6 donde en el rango 6.3‒6.9 ppm se observan dos señales ensanchadas, correspondientes a los NH, lo cual hace evidente la formación del producto. También se observa la resonancia del protón H-1 en 5.8 ppm, y las señales correspondientes al cuerpo 65 del azúcar alrededor en la zona de 5.3‒3.8 ppm. El triplete próximo a 1.0 ppm, que integra para 3H, corresponde al CH3 del fragmento de propilo. Cabe destacar que gran parte de las señales del compuesto en el espectro de 1H-RMN, en especial aquéllas que forman parte de la estructura sacarídica, y muy especialmente las próximas al grupo selenoureido, se encuentran especialmente ensanchadas. Muy probablemente ello se debe a la existencia de confórmeros con respecto a la función selenoureido, donde existe un enlace C-N parcialmente doble; la interconversión rotamérica E-Z normalmente tiene lugar en la escala de tiempo del RMN, lo que conlleva el ensanchamiento de las señales. Esta situación ha sido ampliamente documentada para los correspondiente tio-isósteros (tioureas). 158 Figura 3.18. Espectro de 1H-RMN (300 MHz, CDCl3) del producto 6. Por otra parte, el espectro de 13C-RMN (Figura 3.19) muestra señales importantes de la formación de la selenourea de propilo, como las observada en 11.3 ppm, correspondiente al CH3 del fragmento de propilo; desafortunadamente el enlace C=Se no se puede apreciar (región 180-185 ppm), probablemente por el ensanchamiento de dicha señal, como 158 . García Fernández, J. M.; Mellet, C. O. Adv. Carbhydr. Chem. Biochem. 2000, 55, 35–135. 66 consecuencia del anteriormente mencionado equilibrio conformacional. Incluso dos de las señales de carbonilo de los acetatos experimentan dicho ensanchamiento (región de 170 ppm). Figura 3.19. Espectro de 13C-RMN (125.7 MHz, CDCl3) del producto 6. Ac continuación se abordó la preparación de los biciclos 7‒9 (Esquema 3.18); la conjugación entre los NH y el grupo selona (C=Se) hacen que exista una cierta densidad de carga negativa sobre dicho átomo, haciéndolo más nucleófilo. Haciendo uso de esta propiedad se promovió una reacción de sustitución nucleofílica biomolecular del átomo de selenio sobre el carbono anomérico del carbohidrato mediante calentamiento, dando como resultado el sistema bicíclico de los derivados 7‒9 (Esquema 3.19). La mayor reactividad del átomo de selenio con respecto al de azufre en las tioureas isósteras se pone de manifiesto en el hecho de que estas requieren del uso de un catalizador ácido, bien prótico, o bien de tipo ácido de Lewis (SnCl4) para experimentar la ciclación.74 67 Esquema 3.19. Mecanismo de formación de las 2-alquilaminoselenazolinas bicíclicas. A modo de ejemplo, se muestra el espectro de 1H-RMN para la selenazolina 9 (Figura 3.20) donde se observa un fuerte desapantallamiento de H-1, cuyo desplazamiento químico cambia de 5.81 ppm a 6.69 ppm comparando 6 y 9. Además, la constante de acoplamiento J1,2 es de 6.6 Hz para el compuesto 9, mostrando claramente una distorsión de la conformación 4C1 del residuo de carbohidrato. La pérdida de un grupo acetato, puesto que únicamente se observan tres señales de acetilo, vuelve a confirmar la formación de la selenazolina. Figura 3.20. Espectro de 1H-RMN (300 MHz, CDCl3) de 9. 68 En el espectro de 13C-RMN de 9 (Figura 3.21) destaca la resonancia del carbono N=C, a 158.3 ppm, evidenciando la transformación del sistema sacarídico hacia el biciclo, ya que el grupo selona de las tioureas de partida resuena en torno a 180 ppm. Se observan también las señales en 41.4, 22.8 y 11.3 ppm asignados al fragmento N-propilo. Adicionalmente se puede evidenciar la eliminación de un grupo acetato, puesto que únicamente se observan tres señales de tipo acetato, tanto en la región de carbonilo, como en la alifática. Figura 3.21. Espectro de 13C-RMN (125.7 MHz, CDCl3) del producto 9. A continuación, se muestra una tabla de datos espectroscópicos seleccionados para las 2-alquilaminoselenazolinas 7-9: desplazamientos químicos de H-1, C=N y C-1, así como constante de acoplamiento J1,2 (Tabla 3.5). 69 Tabla 3.5. Selección de datos de RMN de 1H de los selenazolinas 6-8. Compuesto H-1 (δ, ppm) J1,2 (Hz) C=N (δ, ppm) C-1 (δ, ppm) 7 6.75 6.1 157.9 92.9 8 6.70 6.1 158.1 91.9 9 6.59 6.1 160.0 91.2 Finalmente, las selenazolinas 7-9 se trataron con amoníaco metanólico burbujeando amoníaco sobre una disolución metanólica del compuesto acetilado; bajo estas condiciones se eliminaron por completo los grupos acetilo, conduciendo así a las 2-aminoselenazolinas desprotegidas 10-12 (Esquema 3.20). Afortunadamente en este caso, y a diferencia de las oxazolinas análogas 1‒3, sí fueron lo suficientemente estables a las condiciones de desprotección en medio básico. Esquema 3.20. Reacción de desprotección de las selenazolinas 7‒9. A modo de ejemplo se muestra el espectro de 1H-RMN para la senelazolina 12 (Figura 3.22) donde se puede comprobar la ausencia de las señales pertenecientes a los acetilos; por otro lado, se siguen observando las señales del grupo N-propilo en 3.25 ppm (NH-CH2), 1.62 ppm (CH2) y 0.98 ppm (CH3). La señal que proporciona mayor información es la de H-1, que se encuentra en 6.70 ppm con una constante de acoplamiento de 5.4 Hz, lo cual pone de manifiesto que las condiciones básicas no afectaron al biciclo formado, a diferencia de las 2-alquil-1,3-tiazolinas descritas al comienzo del capítulo. 70 Figura 3.22. Espectro de 1H-RMN (300 MHz, CD3OD) del producto 12. Por otra parte, en el espectro de 13C-RMN (Figura 3.23) se puede destacar de nuevo la ausencia de las señales de los acetilos, tanto en la región de los grupos carbonilo, como en la zona alifática. Figura 3.23. Espectro de 13C-RMN (125.7 MHz, CD3OD) del producto 12. 71 A modo de ejemplo, la Figura 3.24 muestra el espectro de masas de baja resolución del compuesto 12, donde se observa claramente la distribución isotópica del átomo de selenio, confirmando la presencia de este en su estructura. Figura 3.24. Espectrometría de masas de baja resolución (ESI) del producto 12. La Tabla 3.6 muestra una selección de los datos espectroscópicos de las selenazolinas 10-12: desplazamientos químicos de H-1, C-1 y C-2, así como constante de acoplamiento J1,2, observándose un comportamiento totalmente análogo a lo comentado anteriormente. Tabla 3.6. Selección de datos de RMN de 1H de los selenazolinas 9-11. Compuesto H-1 (δ, ppm) J1,2 (Hz) C-1 (δ, ppm) C-2 (δ , ppm) 10 (R = Me) 6.87 6.0 91.8 72.5 11 (R = Et) 6.81 5.9 91.8 73.5 12 (R = Pr) 6.79 5.4 92.5 75.2 C:\Users\jesus\Desktop\BG_190412_MVVE61 04/12/19 14:51:59 MVVE61 PM=310 C10H18N2O4Se BG_190412_MVVE61 #65-69 RT: 0.31-0.33 AV: 5NL: 2.08E8 T: FTMS + c ESI Full ms [60.00-900.00] 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 440 m/z 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 85 90 95 100 Relative Abundance 311.05 309.05 179.02 307.05 313.05 176.01 333.03 101.00 137.00 123.09 331.03 181.01 349.11 146.01 293.04 168.02 361.13 98.00 263.11 434.17 411.05398.24 116.01 79.02 219.00 67.49 250.18 206.44 385.29 72 También se abordó la síntesis de 2-alcoxi-1,3-selenazolinasa través de la ciclación intramolecular de un O-alquil selenocarbamato; la sustitución isostérica de un grupo NH por un átomo de oxígeno en la posición 2 de la selenazolina permitirá analizar la influencia, tanto de los efectos electrónicos, como estéricos en las propiedades biológicas de los compuestos finales. A tal efecto, se utilizó de nuevo como materia prima el isoselenocianato 115, que mediante calentamiento a reflujo en presencia de los correspondientes alcoholes (metanol, etanol, propanol, pentan-1-ol, dodecan-1-ol y octadecan-1-ol), permitió obtener los correspondientes selenocarbamatos 14-19. Para los selenocarbamatos 18 y 19, dado que los alcoholes correspondientes son sólidos, se utilizó como disolvente THF y 10.0 equivalentes del alcohol (Esquema 3.21). Esquema 3.21. Síntesis de los selenocarbamatos derivados de carbohidrato 12-19. 73 De todos los selenocarbamatos preparados (Esquema 3.21), y por los motivos anteriormente argumentados de selectividad, sólo los de cadena más corta (Me, Et, Pr) se emplearán para llevar a cabo la ciclación y las correspondientes selenazolinas, ser evaluadas como potenciales inhibidores de la OGA y colinesterasas, como selenoisósteros del Thiamet- G. Por otro lado, los selenocarbamatos en su totalidad serán evaluados como potenciales agentes antiproliferativos; estos compuestos conjugan dos unidades estructurales interesantes. Por un lado, la función organoselénica,y por otro lado, el residuo sacarídico. Los carbohidratos juegan un papel fundamental en el desarrollo de nuevos agentes quimioterapéuticos en el tratamiento del cáncer. 159 Los carbohidratos, sus análogos y miméticos pueden mejorar las propiedades farmacocinéticas del fármaco (ej. incremento de la solubilidad en medios acuosos y biodisponibilidad) mediante la formación de glicoconjugados; en este contexto, están adquiriendo especial importancia los nanotransportadores decorados en su superficie con residuos sacarídicos. 160 Adicionalmente, está ampliamente documentado que las células tumorales, en su mayoría emplean la glicolisis aeróbica para producir ATP, lo que es conocido como el efecto Warbug. 161 Esto implica que las células tumorales sobreexpresan receptores sacarídicos (ej. GLUT1, Glucose Transporter) para el suministro energético, lo cual puede ser empleado para el acceso selectivo del fármaco a las células tumorales. Durante la optimización de la síntesis de los selenocarbamatos mostrados en el Esquema 3.21, se observó una reacción totalmente inesperada en el intento inicial de formación del selenocarbamato de metilo 14. Así pues, el calentamiento a reflujo del isoselenocianato 115 en MeOH (VWR) mostró la formación de un isómero de 14; si bien el espectro de masas de alta resolución proporciona la masa exacta y, por consiguiente, la formula molecular esperada, los espectros de 1H y 13C-RMN mostraron una variación importante en la resonancia para algunas de las señales esperadas. Así pues, el grupo OMe (que resonaría a aproximadamente 3.70 ppm) mostró un apantallamiento muy significativo 159 . Franconetti, A.; López, Ó, Fernandez-Bolaños, J. G.; Curr. Med. Chem. 2020, 27, 1206–1242. 160 . Kang, B.; Opatz, T.; Landfester, K.; Wurm, F. R. Chem. Soc. Rev. 2015, 44, 8301–8325. 161 . Heiden, V.; Cantley, M. G.; Thompson, L. C. Science. 2009, 324, 1029–1033. 80 Figura 3.29. Fragmento seleccionado del espectro de 1H-RMN (300 MHz, (CD3)2SO) del producto 15 a distintas temperaturas. Por otro lado, en el espectro de 13C-RMN del producto 15 (Figura 3.30), se pueden destacar señales importantes; así pues, en 197.0 y 194.0 ppm existen dos señales, correspondientes al grupo NCSe, lo que confirma de nuevo la presencia de dos confórmeros; de igual manera, la presencia de dos carbonos anoméricos en 92.4 y 91.7 ppm; sugiere la misma situación. Adicionalmente, en la región comprendida entre de 55-70 ppm puede observarse que cada una de las señales del cuerpo del azúcar se encuentra doble. Figura 3.30. Espectro de 13C-RMN (125 MHz, CDCl3) del producto 15. 81 En la Figura 3.31 se muestra el espectro de masas de baja resolución (ESI) que refleja de nuevo la distribución isotópica característica del átomo de selenio. Figura 3.31. Espectrometría de masas de baja resolución (ESI) del producto 15. En la Tabla 3.7 se muestra una selección de datos de 1H-RMN de los selenocarbamatos 15‒19. Todos los datos mostrados son consistentes con la existencia de una relación antiperiplana entre el H-2 del carbohidrato y el NH del grupo selenocarbamato. Tabla 3.7. Selección de datos de RMN de 1H de los selenocarbamatos 15-19. Compuesto δNH (ppm) JNH,2 (Hz) δH-1 (ppm) J1,2 (Hz) 15 (R= Et) 7.5 6.8 9.8 9.9 5.8 5.7 8.2 8.7 16 (R = Pr) 7.9 7.2 9.8 9.8 5.8 5.7 8.3 8.6 17 (R = Pent) 7.8 7.0 9.9 9.8 5.7 5.8 8.1 8.7 18 (R= (CH2)11CH3) 9.2 8.5 9.6 9.8 5.8 5.7 8.6 8.7 19 (R= (CH2)17CH3) 7.7 6.9 9.8 9.5 5.8 5.7 7.9 8.7 C:\Users\...\Desktop\BG_190321_MVVE352M2 03/21/19 13:32:45 MVVE 35-2-M2 PM=483 C17H25NO10Se BG_190321_MVVE352M2 #30-35 RT: 0.12-0.15 AV: 6SB: 59 0.69-0.92 NL: 7.18E7 T: FTMS + c ESI Full ms [60.00-900.00] 100 150 200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 m/z 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 85 90 95 100 Relative Abundance 506.05 424.05 437.19 381.30 353.27 446.03 619.53 579.53 647.56 364.03 341.30 591.49 313.27 551.50 522.03 453.17 415.21 331.28 484.07 693.56 206.14 257.97 304.01168.07 665.53 226.07 149.10 529.41 80.05 561.40 108.04 82 A continuación, se llevó a cabo la ciclación de los selenocarbamatos 14-16 mediante catálisis acida (AcOH), dando lugar a la formación de las 2-alcoxiselenazolinas 23-23 (Esquema 3.25). Dada la menor conjugación existente en la función selenocarbamato con respecto a las selenoureas, por la existencia de un solo grupo NH, se hizo necesario el uso de 10 equivalentes de AcOH como catalizador para promover la sustitución nucleófila, mediante protonación del grupo acetoxi saliente; estos resultados contrastan con la formación de los 2- alquilamino isósteros 7‒9, que no requirieron catálisis ácida, sino solamente una ciclación térmica. Esquema 3.25. Formación de las 2-alcoxiselenazolinas bicíclicas 21-23. A modo de ejemplo, en la Figura 3.32 se muestra el espectro de 1H-RMN para la 2- alcoxiselenazolina 23; al igual que en las 2-aminoselenazolinas, en la región de 2.0 ppm se observa la eliminación de un grupo acetato, puesto que solo hay tres señales de metilo. Se observó un claro despantallamiento del protón anomérico (6.71 vs 5.79 y 5.72 ppm de ambos confórmeros del selenocarbamato 16). Por otro lado, el cambio de una constante de acoplamiento anomérico claramente β (8.3 y 8.6 Hz de ambos confórmeros) a J1,2= 6.3 Hz sugiere la existencia de una conformación de silla distorsionada, típica de ese sistema bicíclico. 83 Figura 3.32. Espectro de 1H-RMN (300 MHz, CDCl3) del producto 23. En el espectro de RMN de 13C del producto 23 (Figura 3.33), se puede destacar en 163.5 ppm al carbono N=C, lo cual confirma la formación de la 2-alcoxiselenazolina. Figura 3.33. Espectro de 13C-RMN (125.7 MHz, CDCl3) del producto 23. A continuación, se muestra una tabla de datos espectroscópicos seleccionados para las 2-alcoxiselenazolinas 21-23 desplazamientos químicos de H-1, C=N y C-1, así como constante de acoplamiento J1,2 (Tabla 3.8). 84 Tabla 3.8. Selección de datos de RMN de 1H y 13C de las selenazolinas 21-23. Compuesto δH-1 (ppm) J1,2 (Hz) δC=N (ppm) δC-1 (ppm) 21 (R= Me) 6.73 6.4 164.1 92.8 22 (R = Et) 6.74 ---* 163.5 92.5 23 (R = Pr) 6.71 6.4 163.5 92.3 *La señal se observa como multiplete. Finalmente, las 2-alcoxiselenazolinas 21-23 se desprotegieron en las mismas condiciones que las 2-aminoselenazolinas, en amoníaco metanólico; esto permitió el acceso a las 2-alcoxiselenazolinas desprotegidas 24-26 (Esquema 3.26). Esquema 3.26. Reacción de desprotección de las 2-alcoxiselenazolinas 21‒23. A modo de ejemplo se muestra el espectro de 1H-RMN para la 2-O-etoxiselenazolina 25 (Figura 3.34) donde se puede comprobar la ausencia de las señales pertenecientes a los acetilos; por otro lado, se observan las señales correspondientes al fragmento O-etilo en 4.3 y 1.3 ppm. La señal que más información proporciona es la de H-1 en 6.9 ppm con una J1,2= 6.2 Hz, lo cual indica que las condiciones básicas no afectaron a la 2-alcoxiselenazolina, no experimentando de esta manera una reacción indeseada de apertura del ciclo. 85 Figura 3.34. Espectro de 1H-RMN (500 MHz, CD3OD) del producto 25. Por otra parte, el espectro de RMN de 13C (Figura 3.35), se puede destacar como señal importante C=N en 165.3 ppm. Figura 3.35. Espectro de 13C-RMN (125 MHz, CD3OD) del producto 25. 86 A continuación, se muestra una tabla de datos espectroscópicos seleccionados para las 2-alcoxiselenazolinas 24-26: desplazamientos químicos de H-1, C=N y C-1, así como constante de acoplamiento J1,2 (Tabla 3.9). Tabla 3.9. Selección de datos de RMN de 1H de las 2-alcoxiselenazolinas 24-26. Compuesto δH-1 (ppm) J1,2 (Hz) δC=N (ppm) δC-1 (ppm) 24 (R= Me) 6.90 6.1 166.0 95.5 25 (R = Et) 6.89 6.2 165.3 95.2 26 (R = Pr) 6.89 6.0 165.6 95.2 Finalmente, y con objeto de tener una visión global de la conformación preferente en disolución de los selenoheterociclos preparados, en la Tabla 3.10 se muestran los principales valores de constantes de acoplamiento para los biciclos 7‒12 y 21‒26. De acuerdo con los valores J1,2 (5.4‒6.4 Hz, Tabla 3.10), las selenazolinas bicíclicas deben exhibir una conformación de silla distorsionada. Además, se observa un cambio de conformación en solución cuando se comparan los derivados O-protegidos y sus contrapartes desprotegidas. Los valores de las constantes de acoplamiento J2,3, J3,4 (aproximadamente 5.0 Hz) para los derivados acetilados sugieren la preferencia por una conformación 0,3B en solución (Figura 3.36), situación previamente observada para algunos tiocarbamatos bicíclicos cisfusionados.137 Curiosamente, cuando se eliminan los grupos acetilo, los valores de J2,3, J3,4 se desplazan a 7.3‒8.0 Hz, lo que sugiere la preferencia por una conformación 4C1 distorsionada. 87 Tabla 3.10. Constantes de acoplamiento seleccionadas para los compuestos 7‒12 y 21‒26. Compuesto Constantes de acoplamiento (Hz) J1,2 J2,3 J3,4 J4,5 X = NH R2 = Ac 7 6.1 5.3 5.3 9.8 8 6.1 5.2 5.2 9.8 9 6.1 5.0 5.0 9.8 R2 = H 10 6.0 8.0 8.0 8.3 11 6.1 7.6 ---a --- 12 5.4 --- 7.5 7.5 X = O R2 = Ac 21 6.2 5.0 5.0 9.6 22 --- --- 4.2 9.5 23 6.4 5.0 5.0 9.7 R2 = H 24 6.1 7.6 7.5 9.2 25 6.2 7.4 7.3 9.2 26 6.0 7.4 7.4 --- a Señales anchas o múltiples. Figura 3.36. Conformación 0,3B preferente en disolución de los compuestos 7-9 y 21-23. 88 Está documentado que la sales del derivado triacetilado de la NAG-tiazolina exhiben una conformación de tipo bote torcido (0S2), tanto en disolución, como en estado sólido. 176 El análisis de la constantes de acoplamiento vecinas y experimentos NOE llevados a cabo sobre la NAG-tiazolina sugieren 177 que este compuesto puede existir como una mezcla de confórmeros en disolución: 0S2 como el mayoritario; 4C1, 1S3, como minoritarios, y 1C4, despreciable. Se argumentó que, quizás, las repulsiones estéricas 1,3-diaxiales eran responsables de que la conformación de silla fuera minoritaria en disolución. Estudios teóricos también sugirieron que no existe mucha penalización en la interconversión de las distintas conformaciones (1-2 kcal/mmol); esto quiere decir que la NAG-tiazolina puede adoptar fácilmente la conformación 4C1 requerida al interaccionar con el sitio activo de la OGA.177 Por otro lado, cálculos ab initio realizados sobre la 2-metil-1,3-selenazolina, el selenoisóstero de la NAG-tiazolina predijeron la conformación 4C1 como la más favorable, quizás con una participación menor de las conformaciones 0S2 y 1S3.95 Selenocarbamatos Se-metilados en posición C-2 de D-glucosamina Las excelentes propiedades antiproliferativas (ver sección de actividades biológicas) exhibidas por el Se-metil selenocarbamato 13 (Esquema 3.21) nos animó a llevar a cabo la preparación de derivados análogos; para ello se procedió a metilar algunos de los selenocarbamatos obtenidos con MeI. Los selenocarbamatos correspondientes 14 (OMe), 15 (OEt) y 17 (OPent) se hicieron reaccionar con yoduro de metilo como agente alquilante en presencia de DMAP y trietilamina, obteniéndose los productos 27-29 con rendimientos de buenos a excelentes tras purificación cromatográfica (Esquema 3.27). En estos compuestos se ha dibujado uno de los posibles isómeros geométricos del doble enlace C=N, pero no se ha determinado la estereoquímica real del mismo. 176 . Knapp, S.; Abdo, M.; Ajayi, K.; Huhn, R.A.: Emge, T.J.; Kim, E.J.; Hanover, J.A. Org. Lett. 2007, 9, 23212‒2324. 177 . Knapp, S.; Fash, D.; Abdo, M.; Emge, T.J.; Rablen, P.R. Bioorg. Med. Chem. 2009, 17, 1831–1836. 89 Esquema 3.27. Síntesis de Se-metil selenocarbamatos derivados de carbohidrato. En la Figura 3.37 se muestra, a modo de ejemplo, el espectro de 1H-RMN del producto 27, donde alrededor de 2.30 ppm se encuentra la señal de metilo correspondiente al fragmento Se-Me, de manera análoga a lo observado anteriormente para el Se-metil selenocarbamato 13. Adicionalmente se observa la señal correspondiente al fragmento OMe alrededor de 3.70 ppm. Figura 3.37. Espectro de 1H-RMN (500 MHz, CDCl3) del producto 27. Por otra parte, el espectro de 13C-RMN (Figura 3.38), se pueden destacar dos señales importantes en la formación de este producto; por un lado, la señal que se encuentra alrededor 96 Figura 3.39. Espectro de 1H-RMN (500 MHz, CDCl3) del producto 31. Por otra parte, se puede observar el espectro de 13C-RMN (Figura 3.40) la señal correspondiente al enlace C=Se (≈180 ppm), en la región entre 140-120 ppm, las señales correspondientes al fragmento del arilo y en 96.9 ppm, el carbono anomérico. Una característica interesante del espectro de 13C-RMN del derivado 31 es que, debido a la presencia del átomo de F (activo en RMN, 19F, I = 1/2), se observan acoplamientos del átomo de flúor con todos los átomos de carbono del anillo aromático, que aparecen como dobletes, tal y como puede apreciarse en la ampliación de la Figura 3.40. De esta manera, se tienen las siguientes constantes de acoplamiento: C-1’ (δ = 136.4 ppm, 4JC,F= 2.8 Hz), C-2’ (δ = 131.5 ppm, 3JC,F= 8.8 Hz), C-3’ (δ = 116.4 ppm, 2JC,F= 23.0 Hz), C-4’ (δ = 163.3 ppm, 1JC,F= 245.8 Hz). 97 Figura 3.40. Espectro de 13C-RMN (125 MHz, CDCl3) del producto 29. A continuación, en la Tabla 3.12 se muestra una selección de datos espectroscópicos para todas las glucofuranoso-imidazolina-2-selonas obtenidas. Se puede observar que la modificación del sustituyente del anillo aromático no causa ningún efecto sobre las señales de los compuestos, y que en todos ellos se mantiene la conformación anteriormente mencionada, con J1,2 en torno a 6.3-6.5 Hz, y J2,3≈ 0 Hz. 98 Tabla 3.12. Selección de datos de RMN de 1H y 13C de los productos 30-32. 134a,ca Compuesto H-1 J1,2 C=Se C-1 134a (R=H) 5.96 6.4 178.2 95.0 30 (R=Me) 5.90 6.3 178.3 95.0 134c (R=OMe) 5.94 6.4 181.1 97.1 31 (R = F) 6.01 6.5 180.9 96.9 32 (R = Cl) 5.97 6.3 178.2 94.9 aLos datos espectroscópicos de 134a,c están de acuerdo con los descritos en la bibliografía.178 Síntesis de 2-amino-1,3,4-selenadiazoles Debido al interés que suscita el empleo de derivados de carbohidrato en el desarrollo de productos con actividad antitumoral, así como las interesantes propiedades biológicas de los selenoheterociclos, decidimos llevar a cabo la conjugación de 1,3,4-selenadiazoles a un fragmento sacarídico, con objeto de explorar nuevos derivados con potencial actividad antiproliferativa. Para la síntesis de 2-amino-1,3,4-selenadiazoles, se utilizó la metodología desarrollada por Li et al.;131 para ello, la materia prima clave fue el β-D- glucopiranosilisoselenocianato per-O-acetilado 127 (Esquema 28). El acoplamiento de 127 con hidrazina condujo a la formación de la selenosemicarbazida 136 no aislada; posteriormente la adición de benzaldehído en el mismo medio de reacción, dio como resultado la selenosemicarbazona 137, que tras el tratamiento con NaOAc y NBS experimentó una ciclación intramolecular para dar lugar al selenadiazol 33 con un 38% de rendimiento global para las tres etapas en una metodología one-pot (Esquema 3.32). 99 Esquema 3.32. Síntesis del 2-amino-1,3,4-selenadiazol derivado de carbohidrato 33. En el espectro de 1H-RMN del compuesto 33 (Figura 3.41) se pueden observar las señales características de la estructura: señales aromáticas entre 7.70-7.40 ppm, protón anomérico en 5.17 ppm, con una J1,2= 9.25 Hz, así como 4 singuletes (2.04-2.08 ppm), correspondientes a los 4 grupos acetilo. La desaparición de las señales por encima de 9 ppm en el espectro de 1H-RMN (protón imínico de la selenosemicarbazona) justifica la formación de 33. 100 Figura 3.41. Espectro de 1H-RMN (500 MHz, CDCl3) del producto 33. El espectro de 13C RMN (Figura 3.42) nos proporciona información valiosa; por ejemplo, se observan dos señales nuevas pertenecientes al nuevo ciclo del selenadiazol en aproximadamente 165 (C-2) y 169 ppm (C-5). 101 Figura 3.42. Espectro de 13C RMN (125.7 MHz, CDCl3) del producto 33. Desafortunadamente, la mejora del rendimiento y el acoplamiento con diferentes aldehídos con objeto de extender la serie no se pudo realizar debido a la pandemia provocada por el COVID-19, que obligo a la interrupción de la actividad investigadora en la BUAP en el periodo comprendido entre Marzo de 2020 y de Junio 2021, y a la incorporación escalonada a partir de Julio-Diciembre de 2021. 102 3.4. Evaluación biológica Como se ha comentado en la sección anterior, las 2-aminoalquil y 2-alcoxi-1,3- selenazolinas bicíclicas 10-12 y 24-26, respectivamente, han sido evaluadas como potenciales inhibidores de colinesterasas (ChE) y OGA, debido a su analogía estructural con inhibidores clásicos como el Thiamet-G. Por otro lado, las otras familias de selenoderivados de carbohidrato sintetizados en este capítulo de la Tesis Doctoral, esto es, las selenoureas 4- 6, el Se-metil selenocarbamato 13, los O-alquilselenocarbamatos 14-19, los Sealquilisoselenocarbamatos 27-29 y el selenadiazol 33 han sido evaluados como agentes antiproliferativos. Se espera poder evaluar en breve en este sentido a las imidazolidina-2- selonas 30-32, 134a,c. Los resultados obtenidos hasta la fecha se expondrán a continuación. 3.4.1. Actividad anti-Alzheimer La potencial actividad anti-Alzheimer de las 1,3-selenazolinas bicíclicas derivadas de carbohidrato 10-12 y 24-26, se ha evaluado mediante la inhibición de las enzimas clave colinesterasas (AChE, BuChE), así como la OGA, esta última en colaboración con el Dr. Antonio J. Moreno, del Departamento de Química Orgánica de la Universidad de Sevilla. Inhibición de colinesterasas La acetilcolinesterasa (EC 3.1.1.7) cataliza la hidrolisis del neurotransmisor acetilcolina (ACh), finalizando la transmisión sináptica en el sistema nervioso central (Esquema 3.33); dicha enzima posee una elevada actividad catalítica, siendo capaz de procesar alrededor de 25.000 moléculas de ACh/s. 181 La hidrólisis genera acetato y colina (Ch). Esquema 3.33. Esquema general de la hidrólisis del neurotransmisor ACh mediada por AChE. 181 . Čolović, M. B.; Krstić, D. Z.; Lazarević-Pašti, T. D.; Bondžić, A. M.; Vasić, V. M. Curr. Neuropharmacol. 2013, 11, 315–335. 103 La AChE exhibe dos regiones cruciales para el diseño de potenciales inhibidores: el sitio activo catalítico (CAS, Catalytic Active Site) y la región aniónica periférica (PAS, Peripheral Active Site), conectados por una cavidad o garganta estrecha (con una longitud de aproximadamente 20 Å); el PAS, que contiene los residuos Tyr72, Asp74, Tyr124, Trp286, Tyr341, sirve como un punto de unión de baja afinidad para concentrar la ACh en la entrada de la garganta. A su vez, CAS, la región donde tiene lugar la reacción de hidrólisis de la ACh se puede dividir en cuatro regiones adicionales (Figura 3.43): el subsitio esterático (que contiene la triada catalítica, Ser203, His447, Glu334), el subsitio aniónico (que contiene los aminoácidos Trp86, Tyr133, Tyr337 y Phe338, y que estabiliza al grupo amonio de la AChE a través de interacciones catión-π), el subsitio del oxianión (que contiene los aminoácidos Gly121, Gly122, Ala204, que estabilizan la carga negativa del intermedio cargado de la hidrólisis de la AChE), y el subsitio de acilo (que a través de los residuos Phe295 y Phe 297 controla la especificidad hacia el sustrato). 182 Figura 3.43. Estructura parcial de la AChE humana, mostrando las regiones esenciales. Tomado de referencia 182. 182 . Eckroat, T. J.; Manross, D. L.; Cowan, S. C. Int. J. Mol. Sci. 2020, 21, 5965. 104 El mecanismo de la AChE implica una reacción tipo SNAc mediada por el residuo de Ser203, y favorecida por reacciones ácido-base en la que participan el carboxilato del aminoácido Glu334 y el fragmento de imidazol de His447.181 Con respecto a los derivados 10-12 y 24-26, y tal y como se mencionó anteriormente, el resto de selenazolina incorporado en los compuestos objetivo resultan ser interesantes, debido a su carácter protonable; el correspondiente resto cargado positivamente, que se asemeja al ion de amonio cuaternario de acetilcolina, podría estabilizarse en el sitio aniónico, mediante interacciones catión-π. Para la evaluación in vitro de la inhibición de colinesterasas se utilizaron AChE de electrophorus electricus y BuChE de suero equino, que actualmente se consideran buenas enzimas modelo debido a su semejanza estructural con las de mamíferos, 183 El análisis de la actividad se realizó mediante el ensayo colorimétrico de Ellman, 184 un método indirecto en el que los sustratos modelo (yoduros de acetil y butiril tiocolina) se someten a hidrólisis realizada por la enzima (pH 8.0), seguida de una reacción in situ del producto hidrolizado con DTNB (5,5'-ditiobis(ácido 2-nitrobenzoico), reactivo de Ellman), para proporcionar 2- nitro-5-tiobenzoato, que absorbe fuertemente a 405 nm (Esquema 3.34). 185 183 . Bon, S.; Vigny, M.; Massoulie, J.; Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1979, 76, 2546–2550. 184 . Ellman, G. L.; Courtney, K. D.; Andres, V. Biochem. Pharmacol. 1961, 7, 88–95. 185 . Worek, F.; Eyer, P.; Thiermann, H. Drug Test. Analysys. 2012, 4, 282–291. 105 Esquema 3.34. Reacciones implicadas en el ensayo de Ellmann. En las Figuras 1.44-1.55 y Tabla 3.13 se presentan los valores de IC50 para la inhibición de AChE y BuChE obtenidos para las selenazolinas 10-12 y 24-26, es decir, la concentración de los mismos necesaria para reducir la actividad de la enzima al 50% a una concentración fija de sustrato ([S] = 121 µM para AChE, [S] = 112 µM para BuChE). Dichos valores se obtuvieron mediante representación del %I frente al log[Inhibidor], y ajustando a una ecuación de segundo grado. Los experimentos se realizaron por duplicado, y el resultado se expresa como la media ± desviación estándar. Es importante recordar que un menor valor de IC50 se corresponde con una mayor actividad del compuesto en cuestión. En la comparativa se incluyó también el fármaco galantamina, usado actualmente en el tratamiento del Alzheimer, como control positivo. 112 Tabla 3.13. Inhibición de las colinesterasas por los compuestos 10-12, 24-26 (IC50, µM) Compuesto AChE (Electrophorus electricus) BuChE (Suero equino) X = NH 10 (R = Me) 3.6 ± 0.3 4.5 ± 0.6 11 (R = Et) 3.0 ± 0.1 2.4 ± 0.1 12 (R = Pr) 2.2 ± 0.1 0.46 ± 0.01 Inhibición mixta Kia = 0.24 ± 0.03 µM Kib = 1.5 ± 0.2 µM X = O 24 (R = Me) 28 ± 1 4.1 ± 0.9 25 (R = Et) 24 ± 1 16 ± 2 26 (R = Pr) 20 ± 1 7.2 ± 0.1 --- Galantamina 1.4 ± 0.1 3.9 ± 0.3 113 Los datos indican claramente que las selenazolinas que portan un grupo 2-alquilamino (10-12) se comportaron como inhibidores más potentes que sus derivados 2-alcoxi isostéricos (24-26, 8-9 veces). Este resultado está de acuerdo con lo indicado al comienzo de la sección de discusión y resultados, acerca de la mayor capacidad de protonación para un resto de tipo 2-alquilamino. Además dicho fragmento puede favorecer las interacciones de enlace hidrogeno con regiones clave de la enzima. Este comportamiento es más pronunciado en la AChE, conduciendo así para los derivados 10-12 a actividades dentro del rango micromolar bajo, prácticamente igual que el fármaco de referencia utilizado en la presente Tesis (galantamina). Además, se logró una aumentar ligeramente la actividad al aumentar el tamaño de la cadena hidrocarbonada. Con respecto a la BuChE, el derivado 12 resultó ser un fuerte inhibidor de esta enzima, con actividad dentro del rango submicromolar (IC50 = 0.46 µM) y con un aumento en la actividad de aproximadamente 8.5 veces en comparación con la galantamina (Tabla 3.13). Para este compuesto, se encontró una cierta selectividad sobre AChE (IC50 = 2.2 y 0.46 µM, respectivamente). Es importante resaltar que, mientras que la AChE predomina en cerebros sanos, su actividad disminuye fuertemente con la progresión de la enfermedad, conduciendo a que la BuChE sea la colinesterasa más prominente en las etapas más avanzadas de la EA. 186 Además, considerando que la cavidad del sitio activo es significativamente mayor (aproximadamente 200 Å3) en BuChE, 187 se puede deducir que los inhibidores más voluminosos se pueden acomodar mejor en comparación con la AChE, y esta podría ser la razón de la selectividad observada. El modo de inhibición de 12 frente a BuChE se determinó mediante el método de Cornish- Bowden, 188 que consiste en realizar dos gráficas: 1/V vs. [I] y [S]/V vs. [I] (Figura 3.56) y se encontró que es un inhibidor mixto (en ambas gráficas, las distintas líneas de cada una de las concentraciones se intersectan en uno de los dos cuadrantes). Por lo tanto, el compuesto puede interactuar con la enzima libre y con el complejo E‒S. El cálculo de los parámetros cinéticos (KM, KM,app, Vmax, Vmax,app) se llevó a cabo utilizando una regresión no lineal, y a 186 . Greig, N. H.; Lahiri, D. K.; Sambamurti, K. Int. Psychogeriatr. 2002, 14, 77–91. 187 . Saxena, A.; Redman, A. M. G.; Jiang, X.; Lockridge, O.; Doctor, B. P. Biochemistry, 1997, 36, 14642– 145651. 188 . Cornish-Bowden, A. Biochem. J. 1974, 137, 143–144. 114 partir de dichos parámetros se calcularon las constantes de inhibición (Kia para la componente competitiva, es decir, de la interacción con el sitio activo de la enzima libre, y Kib, referente a la interacción con el complejo E-S). Se obtuvieron los siguientes valores para el compuesto 12: Kia = 0.24 µM; Kib = 1.5 µM. El menor valor de Kia sugiere una interacción más eficaz a través del mecanismo competitivo que la interacción con la región alostérica (definida por Kib). Figura 3.56. Gráficas de Cornish-Bowden de 12 frente a BuChE Inhibición de hexosaminidasas La inhibición de la O-GlcNAc hidrolasa nucleocitoplásmica (OGA) mostrada por las selenazolinas 10-12, 24-26 también se evaluó espectrofotométricamente, utilizando pnitrofenil-2-acetamido-2-desoxi-β-N-D-glucopiranósido omo sustrato modelo; los valores de IC50 se muestran en las Figuras 1.57-1.61 y en la Tabla 3.14. -150 -50 50 150 250 350 450 550 -1,5 -1 -0,5 0 0,5 1 [S]/V (mM x Abs-1 x s) [I] (µM) [S]/V vs. [I] [S]= 0,028 mM [S]= 0,056 mM [S]= 0,112 mM [S]= 0,224 mM [S]= 0,448 mM -150 -50 50 150 250 350 450 550 -1,5 -1 -0,5 0 0,5 1 [S]/V (mM x Abs-1 x s) [I] (µM) [S]/V vs. [I] [S]= 0,028 mM [S]= 0,056 mM [S]= 0,112 mM [S]= 0,224 mM [S]= 0,448 mM 115 Figura 3.57. Grafica de IC50 para la inhibición de OGA humana del compuesto 10 (IC50 = 52.2 ± 2.1 nM) Figura 3.58. Grafica de IC50 para la inhibición de OGA humana del compuesto 11 (IC50 = 96.5 ± 2.1 nM). 116 Figura 3.59. Grafica de IC50 para la inhibición de OGA humana del compuesto 12 (IC50 = 53.0 ± 7.1 nM). Figura 3.60. Grafica de IC50 para la inhibición de OGA humana del compuesto 24 (IC50 = 2721 ± 221 nM). 117 Figura 3.61. Grafica de IC50 para la inhibición de HexB humana del compuesto 10 (IC50 = 62.4 ± 2.8 µM). Tabla 3.14. Inhibición de hexosamidasas ejercida por los compuestos 10-12, 24-26 (IC50, en µM, Ki en nM) Compuesto hOGA hHexB X= NH 10 0.052 ± 0.002 Inhibición mixta Kia = 8.6 ± 0.6 nM Kib = 12.3 ± 0.4 nM 62 ± 3 11 0.097 ± 0.002 >100 12 0.053 ± 0.007 >100 X= O 24 2721 ± 221 >100 25 >100 >100 26 >100 >100 118 Mientras que las 2-alquilamino selenazolinas 10-12 mostraron actividades sobresalientes frente a la OGA, en el intervalo nanomolar (IC50 = 52‒97 nM), sus isósteros de tipo 2-alcoxi derivados 24-26 se comportaron como inhibidores bastante débiles o prácticamente inactivos (Tabla 3.14). Los compuestos 10 y 12 (derivados que contienen metilo y propilo, respectivamente) están dotados prácticamente de la misma actividad. Estos datos sugieren claramente la importancia crucial del fragmento 2-amino funcionalizado en el fragmento de 1,3-selenazolina para la interacción con el sitio activo de OGA. Aunque el uso del resto alcoxi condujo a un claro deterioro de la inhibición de la colinesterasa, el efecto no fue tan pronunciado como para la enzima OGA. La única selenazolina descrita hasta la fecha como inhibidor de OGA es GlcNAcselenazolina 60,95 con una Ki = 0.7 µM (inhibición competitiva), aproximadamente 80 veces menos activa que el compuesto 10 aquí mostrado. La inhibición considerablemente menor de la selenazolina descrita en la bibliografía en comparación con sus análogos de azufre (por ejemplo, GlcNAc-tiazolina 44) se atribuyó a la mayor longitud del enlace C‒Se y a la menor capacidad de aceptar enlaces de hidrogeno.95 A pesar de ello, la NAG-tiazolina 44 y su selenoisóstero 60 tuvieron efectos similares en la Glc-NAc-ilación, lo que se atribuyó a la internalización mejorada de 60 en las células, debido a su mayor lipofilia.95 Sin embargo, en nuestro caso, la combinación del átomo de selenio y el fragmento de 2-alquilamino proporcionó un excelente perfil inhibitorio en términos de potencia y selectividad. Una enzima estrechamente relacionada con OGA es HexB (beta-hexosaminidasa, subunidad beta: EC 3.2.1.52; GH20), una hexosaminidasa lisosomal que desempeña un papel fundamental en el desarrollo de la enfermedad de Sandhoff, 189 un trastorno de almacenamiento lisosomal. Aunque ambas hexosaminidasas, OGA y HexB, pertenecen a distintas familias CAZy, ambas son enzimas que catalizan la hidrólisis de GlcNac, por lo que en numerosas ocasaiones, inhibidores de HexB lo son también de OGA. Por lo tanto, con el objetivo de evitar efectos secundarios, también se evaluó la posible inhibición de HexB por parte de los compuestos 10-12, 24-26, con objeto de analizar la 189 . Brekk, O. R.; Korecka, J. A.; Crapart, C. C.; Huebecker, M.; MacBain, Z. K.; Rosenthal, S. A.; Sena- Esteves, M.; Priestman, D. A.; Platt, F. M.; Isacson, O.; Hallett, P. J. Acta Neuropathol. Commun. 2020, 8, 127. 119 selectividad frente a la OGA. Como se puede observar en la Tabla 3.14, los compuestos son prácticamente inactivos (IC50 > 100 µM) o son inhibidores bastante débiles (10, IC50 = 62 µM) frente a la enzima HexB. Esto proporcionó una selectividad excepcional para el compuesto cabeza de serie, 12 (S.I. > 1887) hacia OGA. Como compuesto modelo, se determinó el modo de inhibición para 10 y se encontró que era un inhibidor de tipo mixto (Figura 3.62, gráficas de Cornish-Bowden); se calcularon las constantes de inhibición para los mecanismos competitivos y no competitivos (Kia, Kib, respectivamente) y se encontró que estaban en el rango nanomolar bajo (8.6 y 12.3 nM, respectivamente, Tabla 3.14). Se demostró de esta manera que el compuesto 12 es aproximadamente 8 veces más activo que NAG-tiazolina. Figura 3.62. Graficas de Cornish-Bowden del compuesto 10 frente a hOGA. También realizamos un ensayo de cribado para determinar la selectividad frente a un panel de 10 glicosidasas relevantes, con objeto de predecir posibles efectos secundarios: α- L-glucosidasa (homo sapiens), α-galactosidasa (granos de café verde), β-galactosidasa (E. coli , A. orizae), α-glucosidasa (levadura, arroz), amiloglucosidasa (A. niger), β-glucosidasa (almendras), α-manosidasa (judías verdes), β-manosidasa (caracoles), así como una β-N- acetilglucosaminidasa humana (judías verdes). Esta evaluación se realizó en colaboración con el Dr. Antonio J. Moreno, del Departamento de Química Orgánica de la Universidad de Sevilla. -2,0 0,0 2,0 4,0 6,0 8,0 10,0 12,0 -20 0 20 40 60 1/v [I] (nM) [S] = 0.208 mM [S] = 0.416 mM [S] = 0.833 mM -1,0 0,0 1,0 2,0 3,0 4,0 5,0 -40 -20 0 20 40 60 [S]/v [I] (nM) [S] = 0.208 mM [S] = 0.416 mM [S] = 0.833 mM 120 En todos estos casos, se observó una falta de actividad relevante a la concentración ensayada (IC50> 100 µM), lo que indica una destacada selectividad de las 1,3-selenazolinas hacia las enzimas implicadas en el desarrollo de la enfermedad de Alzheimer (colinesterasas, OGA). Por lo tanto, no se esperan interferencias no deseadas con otros procesos mediados por glicosidasas, lo que reduce las posibilidades de efectos secundarios. Estudios de docking Con objeto de obtener una visión más profunda del mecanismo de inhibición ejercido por las selenazolinas biciclicas, el compuesto cabeza de serie (12) se sometió a estudios de docking con AChE, BuChE y OGA humanas. Estos estudios se realizaron en colaboración con el Dr. José M. Padrón, de la Universidad de La Laguna (Tenerife, España). En primer lugar, se llevó a cabo la minimización de la energía para los complejos 12-enzima; los datos se muestran en la Tabla 3.15. La energía de unión estimada es considerablemente más baja para OGA en comparación con las colinesterasas; esta observación es compatible con la fuerte potencia encontrada en el ensayo in vitro frente a dicha enzima. Tabla 3.15. Energía de interacción del compuesto 12-enzima Enzima AChE BuChE OGA Energía (kcal/mol) -6.6 -6.5 -9.9 Las predicciones del docking en la interacción del compuesto 12 con AChE mostraron interacciones de enlace de hidrógeno con residuos de Asp74, Glu202 y Ser203. Además, establece interacciones de van der Waals con los residuos Gln71, Tyr72, Val73, Trp86, Asn87, Gly120, Gly121, Tyr124, Ser125, Tyr133, Tyr337, Phe338, His447, Gly448 e Ile451. En la Tabla 3.16 se muestran las regiones de la enzima implicadas en dichas interacciones. 121 Tabla 3.16. Composición de las regiones clave de la AChE y predicción de las interacción de 12a Región enzimática Aminoácidos Sitio esterático Ser203 His447 Glu334 Sitio aniónico Trp86 Tyr133 Tyr337 Phe338 Sitio de unión del oxianión Gly121 Gly122 Ala204 Sitio de unión del grupo acilo Phe295 Phe297 Sitio aniónico periférico (PAS) Tyr72 Asp74 Tyr124 Trp286 a En negrita, aminoácidos implicados en la interacción con 12 Como se muestra en la Tabla 3.16, la selenazolina 12 establece interacciones clave con cuatro regiones de la AChE: el sitio esterático, que soporta la tríada catalítica que normalmente se encuentra en las hidrolasas, el sitio aniónico, que estabiliza el catión amonio del sustrato, el subsitio del oxianión, que estabiliza el intermedio cargado, y el PAS, que concentra el sustrato en la entrada del canal.182 Es importante destacar que el bloqueo de la región PAS de la AChE con un inhibidor se ha correlacionado con una disminución de la autoagregación de las placas β-amiloide. 190 Con respecto a BuChE, los cálculos de docking del compuesto 12 revelaron que establece interacciones de enlace de hidrógeno con los residuos Gly117 e His438. Además, establece interacciones de van der Waals con los residuos Gly78, Ser79, Trp82, Gly115, Gly116, Thr120, Gly121, Tyr128, Glu197, Ser198, Ala328 y Trp430. Análogamente, los datos que se muestran en la Tabla 11.17 sugieren una interacción del compuesto con el sitio esterático, el sitio aniónico y el subsitio del oxianión de BuChE. 191 190 . Carvajal, F. J.; Inestrosa, N. C. Front. Mol. Neurosci. 2011, 4, 19. 191 . Bajda, M.; Więckowska, A.; Hebda, M.; Guzior, N.; Sotriffer, C. A.; Malawska, B. Int. J. Mol. Sci. 2013, 14, 5608-5632. 128 El selenadiazol 33 (no incluido en la Tabla 3.19) resultó inactivo para las 6 líneas tumorales evaluadas (GI50 > 100 µM); estos resultados ponen de manifiesto que previsiblemente no resultaría interesante extender esta serie con nuevos derivados. Tabla 3.19. Valores de GI50 (µM) para la actividad antiproliferativa de los glicoconjugados derivados de selenoureas, selenocarbamatos e isoselenocarbamatosa Producto A549 (Pulmón) HBL-100 Mama) HeLa (Cérvix) SW1573 (Pulmón) T-47D (Mama) A549 (Pulmón) 4 (R= Me) >100 5 (R= Et) 6 (R= Pr) 14 (R= Me) 5.6 ± 1.4 1.2 ± 0.2 6.4 ± 2.2 4.4 ± 0.3 8.6 ± 1.9 6.2 ± 1.5 15 (R= Et) 1.3 ± 1 4.2 ± 0.5 6.4 ± 1.5 4.1 ± 0.1 5.0 ± 0.8 8.1 ± 1.4 16 (R= Pr) 25 ± 11 24 ± 11 13 ± 3 22 ± 8 31 ± 13 26 ± 11 17 (R= Pent) 9.8 ± 0.5 13 ± 3 13 ± 6 6.7 ± 2.0 9.6 ± 1.5 14 ± 0 18 (R= (CH2)11CH3 20 ± 2 25 ± 5 16 ± 7 19 ± 7 19 ± 4 17 ± 3 19 (R= (CH2)17CH3 59 ± 15 66 ± 16 39 ± 7 91 ± 16 79 ± 4 86 ± 13 20 >100 13 1.2 ± 0.2 1.7 ± 0.3 0.80 ± 0.32 0.56 ± 0.15 0.55 ± 0.13 0.48 ± 0.17 129 27 (R = Me) 79 ± 27 44 0.89 ± 0.38 0.90 ± 0.16 1.2 0.44 28 (R = Et) 1.7 ± 0.5 1.1 ± 0.4 0.14 ± 0.05 0.34 ± 0.02 0.73 ± 0.34 0.016 29 (R = Pent) 0.001 ± 0.000 6.4 0.003 ± 0.000 0.062 0.57 0.014 ± 0.004 137 137a (R = Me) >100 >100 >100 28 ± 7 >100 >100 137b (R = Et) >100 >100 >100 17 ± 3 >100 >100 137c (R = Pr) 8.7 7.9 2.7 3.0 1.6 1.5 ± 0.8 137d (R = Bu) 74 ± 6 96 ± 6 >100 69 ± 11 >100 >100 5-FU 2.2 ± 0.3 4.4 ± 0.7 16 ± 5 3.3 ± 1.2 43 ± 16 49 ±7 Cisplatino 4.9 ± 0.2 1.9 ± 0.2 1.8 ± 0.5 2.7 ± 0.4 17 ± 3 25 ± 4 aLos valores sin SD están pendientes de la finalización del triplicado de la medida 130 3.5. Conclusiones del capítulo 3 PRIMERA La preparación de las 2-alquiltio-1,3-oxazolinas bicíclicas 1‒3 se efectuó mediante una síntesis lineal, teniendo como intermediario clave el tiocarbamato per-O-acetilado bicíclico 105, que mediante tratamiento con diferentes bromuros de alquilo permitió la formación de las 1,3-oxazolinas bicíclicas S-sustituidas. Los intentos de desprotección de las mismas resultaron infructuosos. SEGUNDA La preparación de 2-amino y 2-alcoxi-1,3-selenazolinas bicíclicas puede llevarse a cabo de una manera eficaz mediante una síntesis lineal, en tres etapas desde el isoselenocianato de D–glucosamina per-O-acetilado 115: formación de la correspondiente selenourea o selenocarbamato por tratamiento con aminas o alcoholes alifáticos, ciclación intramolecular en condiciones térmicas (con catálisis acida en el caso de los selenocarbamatos) y desprotección. TERCERA La modificación de algunos de los elementos estructurales clave en las selenazolinas bicíclicas (grupo alquilamino o alcoxi en la posición C-2 del heterociclo, longitud del fragmento hidrocarbonado) provocó cambios importantes en la inhibición de las enzimas evaluadas. Los derivados de tipo 2-alquilamino 10‒12 resultaron ser los más potentes frente a colinesterasas y OGA, lo que demuestra el papel crucial de la función NH. CUARTA El compuesto cabeza de serie como agente anti-Alzheimer (12), exhibió una actividad submicromolar frente a BuChE, con una actividad aproximadamente 8.5 veces mayor en comparación con la galantamina. 131 QUINTA Las 1,3-selenazolinas con un grupo de tipo 2-alquilamino 10‒12 resultaron ser inhibidores muy potentes y selectivos de la OGA humana (actividad nanomolar), con solo actividad residual o despreciable frente a HexB y otras 10 glucosidasas. Se mejoró la actividad en comparación con NAG-tiazolina. SEXTA los estudios de docking permitieron predecir las interacciones del compuesto 12 con las regiones clave de las tres enzimas consideradas (AChE, BuChE y OGA), y comparar el modo de unión con inhibidores estructuralmente relacionados. SÉPTIMA Las selenazolinas bicíclicas no mostraron actividad antiproliferativa destacable hasta una concentración de 100 µM, por lo que no se deben esperar efectos perjudiciales en células a las concentraciones terapéuticas. OCTAVA La presencia de impurezas desconocidas en una partida de MeOH comercial en el intento de preparación del selenocarbamato de metilo derivado de carbohidrato 14 condujo, de manera inesperada, a una transposición novedosa de tipo Newman-Kwart y a la formación del derivado Se-metilado 13. NOVENA Referente a la actividad antiproliferativa, si bien las selenoureas en C-2 resultaron inactivas, los correspondientes selenocarbamatos isósteros mostraron un amplio rango de actividades dependiendo de la posición del grupo selenocarbamato (C-1, C-2), así como de la longitud de la cadena hidrocarbonada, alcanzándose en algunos casos el rango submicromolar. 132 DÉCIMA En los selenocarbamatos en posición C-1, la actividad antiproliferativa crece con la longitud de la cadena hidrocarbonada hasta el sustituyente de tipo propilo, mientras que para los selenocarbamatos en la posición C-2 del carbohidrato, la actividad es máxima para los fragmentos más cortos (Me, Et). UNDÉCIMA La Se-metilación de los selenocarbamatos en posición C-2 condujo a agentes antiproliferativos muy potentes, alcanzándose actividades en el rango nM, y una mejora muy sustancial de la actividad de los fármacos empleados como referencia (5-FU y cisplatino), de hasta 5300 veces. DUODÉCIMA Se llevó a cabo la preparación exitosa en tres etapas del primer 2-amino-1,3,4-selenadiazol derivado de carbohidrato empleando el correspondiente β-D-glucopiranosilisoselenocianato per-O-acetilado 115 como materia prima clave: formación de la selenocarbazida por tratamiento con hidracina, transformación en selenosemicarbazona mediante condensación con un aldehído aromático y ciclación promovida por NBS. Desafortunadamente resultó inactivo como agente antiproliferativo. 133 4. NUEVOS GLICOCONJUGADOS DE CUMARINAS COMO POTENCIALES INHIBIDORES DE ANHIDRASAS CARBÓNICAS 4.1. Introducción y antecedentes En el presente capítulo de la Tesis Doctoral se abordará la preparación de una serie de potenciales agentes antiproliferativos derivados de cumarinas (2H-cromen-2-onas, Figura 4.1), una extensa familia de compuestos muy abundantes en la naturaleza, tanto como fitoquímicos en el reino vegetal, como en hongos y bacterias. 197 La palabra cumarina procede del termino francés coumarou, el nombre vernacular para las haBas de tonka (Dipteryx odorata Wild), de donde fue aislada por primera vez en 1820. 198 Cabe destacar que, hasta la fecha, se han aislado más de 1300 cumarinas en la naturaleza. 199 Figura 4.1. Estructura general de una cumarina con el sistema de numeración. Aunque las cumarinas pueden preparase a partir de una amplia variedad de reacciones, 200 como la reacción de Perkin, condensación de Knoevenagel, reacciones de Wittig, Baylis-Hilman, Vilsmeier-Haack, transposición de Claisen o acoplamiento cruzado de SuzukI, sin duda alguna, la metodología sintética más clásica y más ampliamente utilizada es la llamada condensación de Pechmann. 201 Dicho proceso consiste en la reacción entre 197 . Annunziata, F.; Pinna, C.; Dallavalle, S.; Tamborini, L.; Pinto, A. Int. J. Mol. Sci. 2020, 21, 4618. 198 . Vogel, A. Ann. Phys. 1820, 64, 161–166. 199 . Stefanachi, A.; Leonetti, F.; Pisani, L.; Catto, M.; Carotti, A. Molecules. 2018, 23, 250. 200 . Lončarić, M.; Gašo-Sokač, D.; Jokić, S.; Molnar, M. Biomolecules. 2020, 10, 151. 201 . Zambare, A. S.; Khan, A. K. F.; Zambare, S. P.; Shinde, S. D.; Sangshetti, J. N. Curr. Org. Chem. 2016, 20, 798–828. 134 fenoles y β-cetoésteres, materias primas de fácil acceso, empleando catálisis ácida, tanto en forma de ácido de Brönsted (ej. H2SO4, TsOH), como un ácido de Lewis (ej. AlCl3). Esto ha permitido el acceso a un elevado número de cumarinas sustituidas en las posiciones C-3 y/o C-4. El ácido cataliza tanto la reacción de transesterificación inicial entre el hidroxilo fenólico y el éster, como la tautomerización ceto-enólica del producto transesterificado (Esquema 4.1). A continuación, tiene lugar una adición de Michael, que genera el esqueleto de la cumarina, seguido de re-aromatización y perdida de una molécula de agua catalizada por ácido. Aunque este es quizás el mecanismo más aceptado en la actualidad, todavía existe una cierta controversia acerca del orden real de las tres etapas principales del proceso: transesterificación, adición de Michael (sustitución aromática electrófila) y deshidratación. Un estudio reciente 202 mediante RMN de 19F en la reacción entre fenoles activados y 4,4,4- trifluoroacetoacetato de etilo parece sugerir que la primera etapa seria la adición de Michael; no obstante, no está claro aún si esto es extensivo a todas las cumarinas sintetizadas mediante este procedimiento. Esquema 4.1. Mecanismo más aceptado para la formación de cumarinas mediante condensación de Pechmann. 202 . Tyndall, S.; Wong, K. F.; VanAlstine-Parris, M. A. J. Org. Chem. 2015, 80, 8951–8953. 135 En la bibliografía existen numerosas variantes de las condiciones originales de la condensación de Pechmann, por ejemplo, modificando la naturaleza del catalizador ácido. Así pues, a modo de ejemplo, Jafari et al. 203 describieron la preparación de cumarinas mediante un catalizador al que denominaron SO3H@PIL, consistente en H2SO4 inmovilizado en liquido poliiónico (SPIL); dicho catalizador pudo ser reutilizado en al menos tres ciclos sin pérdida significativa de actividad y eficiencia catalítica. En las condiciones óptimas (7% mol de catalizador, 130 °C, ausencia de disolvente y 1 h de reacción), se obtuvo la cumarina mostrada en el Esquema 4.2, con un 94% de rendimiento. Esquema 4.2. Preparación de cumarinas usando SO3H@PIL Por otro lado, Nasseri y Sadehzadeh 204 describieron el uso de un catalizador basado en nanopartículas magnéticas (Fe3O4-DABCO), que pueden ser preparadas de manera eficaz a partir de materias primas de fácil acceso. Su recuperación resultó sencilla mediante el empleo simplemente de un imán externo. Las mejores condiciones experimentales resultaron ser en ausencia de disolvente, y los rendimientos fueron excelentes (86-97%) para sustituyentes de tipo OH y NH2 en varias posiciones del esqueleto de la cumarina. Esquema 4.3. Preparación de cumarinas mediante catálisis con nanopartículas magnéticas. 203 . Jafari, E.; Farajzadeh, P.; Akbari, N.; Karbakhshzadeh, A. Chem. Rev. Lett. 2019, 2, 123–129. 204 . Nasseri, M. A.; Sadeghzadeh, S. M. J. Iran Chem. Soc. 2014, 11, 23–33. 136 Bouasla et al. 205 describieron la síntesis de cumarinas utilizando resorcinol y acetoacetato de etilo como reactivos modelo en la reacción de condensación de Pechmann en microondas sobre catalizadores ácidos sólidos heterogéneos (Amberlita-15, zeolita β y sílice funcionalizada con un ácido sulfónico) y en ausencia de disolvente. Los mejores rendimientos (97%) se obtuvieron para la Amberlita-15. Con respecto al uso de la condensación de Knoevenagel para la preparación de cumarinas, Dinparast y col. 206 describieron del uso de líquidos iónicos como medio de reacción eficaz en presencia de piperidina y AcOH; en concreto utilizaron el bromuro de 1- hexil-3-metilimodazolio ([HMIM]Br). Las reacciones transcurrieron rápidamente a t.a., con excelentes rendimientos (>90%) inmediatamente después de la adición de salicilaldehído (Esquema X). Esquema 4.4. Preparación de cumarinas en un medio de líquidos iónicos 205 . Bouasla, S.; Amaro-Gahene, J.; Esquivel, D.; López, M. I.; Jiménez-Sanchidrián, C.; Teguiche, M.; Romero-Salguero, F. J. Molecules 2017, 22, 2072. 206 . Dinparast, L.; Hemmati, S.; Zengin, G.; Alizadeh, A. A.; Bahadori, M. B.; Kafil, H. S.; Dastmalchi, S. ChemistrySelect, 2019, 4, 9211–9215. 137 Mogharabi-Manzari et al. 207 describieron un catalizador híbrido entre una enzima (Lacasa) y TEMPO soportados en sílice mesoporosa para la síntesis de cumarinas a través de la condensación de Knoevenagel. La reacción transcurrió en medio acuoso, utilizando diferentes salicilatos (Esquema 4.5). Esquema 4.5. Preparación de cumarinas mediante reacción de Knoevenagel y catalizador híbrido enzima-TEMPO. Con respecto a las numerosas propiedades biológicas exhibidas por las cumarinas, se deben a su estructura especia. Tal y como se ha indicado al comienzo de la introducción, poseen un fragmento de α-pirona fusionado con un anillo de benceno, resultando un sistema π altamente conjugado; esta estructura, totalmente plana, le permite establecer interacciones no covalentes intensas, tanto a través de la lactona (enlaces de hidrogeno, interacciones dipolo-dipolo), como a través del sistema aromático (interacciones π-π y catión-π). Como consecuencia, las cumarinas pueden establecer interacciones con un elevado número de receptores biológicos, en la mayor parte de los casos, mediante la inhibición de enzimas clave. 208 , 209 Es por ello que las cumarinas presentan, un sinfín de propiedades biológicas, 210 y por este motivo, han sido catalogadas como estructuras privilegiadas en la Química Medicinal. 211 Se han descrito numerosos ejemplos de derivados de cumarinas con 207 . Mogharabi-Manzari, M.; Amini, M.; Abdollahi, M.; Khoobi, M.; Bagherzadeh, G.; Faramarzi, M. A. ChemCatChem, 2018, 10, 1542–1546. 208 . Abdizadeh, T.; Kalani, M. R.; Abnous, K.; Tayarani-Najaran, Z.; Khashyarmanesh B. Z.; Abdizadeh, R.; Ghodsi, R.; Hadizadeh, F. Eur. J. Med. Chem. 2017, 132, 42–62. 209 . Hng, Y.; Lin, M. H.; Lin, T. S.; Liu, I. C.; Lin, I. C.; Lu, Y.L.; Chang, C.N.; Chiu, P. F.; Tsai, K. C.; Chen, M. J.; Liang, P. H. Bioorg. Chem. 2020, 96, 103618. 210 . Medina, F. G.; Marrero, J. G.; Macías-Alonso, M.; González, M. C.; Córdova-Guerrero, I.; Teissier, G. A. G.; Osegueda-Robles, S. Nat. Prod. Rep. 2015, 32, 1472–1507. 211 . Stefanachi, A.; Leonetti, F.; Pisani, L.; Catto, M.; Carotti, A. Molecules. 2018, 23, 250. 144 constituye una diana interesante. 241 El estudio de estos mecanismos representa una nueva estrategia en el descubrimiento de fármacos eficaces contra el cáncer. 242 Se ha observado que una característica común en las células cancerosas es una desregularización en el pH, ya que a comparación las células sanas, tienen un pH intracelular aumentado (pHi) y un pH extracelular reducido (pHe). Esta desregularización influye sobre todo en la proliferación, metástasis, adaptación metabólica y la tumorogénesis. 243 El bloqueo del aumento del pHi puede atenuar el comportamiento de las células cancerígenas.236, 244 Hasta la fecha se han descrito 5 tipos distintos de inhibición de CAs: 245  Complejación del catión Zn(II) por parte de agentes quelatantes. A este grupo pertenecen las sulfonamidas (el grupo más ampliamente estudiado, y del que existen unos 20 fármacos en el mercado), y sus isósteros sulfamatos, así como ditiocarbamatos, carboxilatos e hidroxamatos.  Inhibidores que se anclan a la molécula de agua/ion hidroxilo que se encuentra en la esfera de coordinación del Zn(II). Son ejemplos de este tipo los fenoles, carboxilatos, poliaminas, sulfocumarinas y 2-tioxocumarinas.  Inhibidores que experimentan una transformación química mediada por la CA que conduce a la obtención de un derivado que ocluye la entrada al sitio activo. Son ejemplos las cumarinas, que serán comentadas a continuación, al ser el objetivo del presente capítulo de la Tesis Doctoral.  Inhibidores que interaccionan con la región externa al sitio activo (se describió un derivado de ácido carboxílico con este mecanismo).  Mecanismo desconocido. Son ejemplos las sulfonamidas secundarias y terciarias, así como los fármacos imatinib y nilotinib. 241 . Lee, S. H.; Griffiths, J. R. Cancers 2020, 12, 1616. 242 . Neri, D.; Supuran, C. T. Nat Rev Drug Discov. 2011, 10, 767–777. 243 . Sarnella, A.; Ferrara, Y.; Auletta, L.; Albanese, S.; Cerchia, L.; Alterio, V.; De Simone, G.; Supuran, C.T.; Zannetti, A. J. Exp. Clin. Cancer Res. 2022, 41, 122. 244 . White, K. A.; Grillo-Hill, B. K.; Barber, D. L. J. Cell Sci. 2017, 130, 663–669. 245 . Supuran, C. T. J. Enzyme Inhib. Med. Chem. 2016, 31, 345–360. 145 En este contexto, se descubrió que las cumarinas constituyen una nueva clase de inhibidores de CAs, 246 con un mecanismo totalmente distinto al exhibido por los inhibidores más clásicos, las sulfonamidas (que actúan quelatando al Zn(II), evitando la entrada del sustrato), tal y como se ha expresado anteriormente. De hecho, a las cumarinas, en relación con la inhibición de las CAs, muestran una inhibición lenta en comparación con las sulfonamidas, 247 lo cual sugirió que podrían realmente comportarse como inhibidores suicidas, y actuar como profármacos, 248 lo que fue demostrado mediante estudios cinéticos, cristalográficos y computacionales. 249 Ello es debido a que las CAs, además de catalizar la hidratación del CO2, poseen actividad esterasa, permitiendo de esta manera hidrolizar la lactona característica de las cumarinas, originando un derivado del ácido 2-hidroxicinámico (presumiblemente de configuración E, más estable), que ocluye la entrada al sitio activo (Esquema 4.7). Esquema 4.7. Mecanismo de inhibición de las CAs por parte de las cumarinas Por lo anteriormente expuesto, en la actualidad existe un interés creciente en la obtención de nuevos derivados de cumarinas como inhibidores de CAs, tanto naturales246 como sintéticos. Así pues, numerosos fragmentos aromáticos/heteroaromáticos y espaciadores han sido incluidos en diversas posiciones del esqueleto de las cumarinas 246 . Supuran, C. T. J. Enzyme Inhib. Med. Chem. 2020, 35,1462–1470. 247 . Maresca, A.; Temperini, C.; Vu, H.; Pham, N. B.; Poulsen, S. A.; Scozzafava, A.; Quinn, R. J.; Supuran, C. T. J. Am. Chem. Soc. 2009, 131, 3057–3062. 248 . Supuran, C.T. J. Enzyme Inhib. Med. Chem. 2020, 35, 1462‒1470. 249 . Maresca, A.; Temperini, C.; Pochet, L.; Masereel, B.; Scozzafava, A.; Supuran, C. T. J. Med. Chem. 2010, 53, 335‒344. 146 (Figura 4.3): C-3 (híbridos sulfonamidas-cumarinas A y B, 250 tiazolidinona-pirazoles C), 251 C-6 (triazoles D, 252 tioureas E 253 ), C-7 (2-aminobenzoxazoles F) 254 y C-8 (piperazinas G). 255 Además, tanto el oxígeno endocíclico, como el grupo carbonilo característicos de las cumarinas, han sido sustituidos por fragmentos isósteros, como NHR, S, Se o Te (compuesto H). 256 En la Figura 4.3 se muestran además las constantes de inhibición de las CAs I, II humanas (consideradas como off-targets), así como de las CAs relacionadas con procesos tumorales (IX, XII). En muchos de estos ejemplos se lograron actividades en el rango nanomolar bajo, así como excelentes selectividades, con un perfil mejorado con respecto la acetozolamida (AAZ), el fármaco usado como referencia (CA I: 250 nM; CA II: 12.1 nM; CA IX: 25.8 nM; CA XII: 5.7 nM) 250 . Abdelrahman, M. A.; Ibrahim, H. S.; Nocentini, A.; Eldehna, W. M. ; Bonardi, A.; Abdel-Aziz, H. A.; Gratteri, P.; Abou-Seri, S. M.; Supuran, C. T. Eur. J. Med. Chem. 2021, 209, 112897. 251 . Thacker, P. S.; Goud, N. S.; Argulwar, O. S.; Soman, T.; Angeli, A.; Alvala, M.; Arifuddin, M.; Supuran, C. T. Bioorg. Chem. 2020, 104, 104272. 252 . Thacker, P. S.; Tiwari, P. L.; Angeli, A.; Srikanth, D.;Swain, B.; Arifuddin, M.; Supuran, C. T. Metabolites, 2021, 11, 225. 253 . Bouasla, S.; Amaro-Gahene, J.; Esquivel, D.; López, M. I.; Jiménez-Sanchidrián, C.; Teguiche, M.; Romero-Salguero, F. J. Molecules,2017, 22, 2072. 254 . Fuentes-Aguilar, A.; Merino-Montiel, P.; Montiel-Smith, S.; Meza-Reyes, S.; Vega-Báez, J. L.; Puerta, A.; Fernandes, M. X.; Padrón, J. M.; Petreni, A.; Nocentini, A.; Supuran, C. T.; López, Ó.; Fernández- Bolaños, J. G. J. Enzyme Inhib. Med. Chem. 2021, 37, 168–177. 255 . Buran, H.; Bua, S.; Poli, G.; Bayram, F. E. Ö.; Tuccinardi, T.; Supuran, C. T. Int. J. Mol. Sci. 2019, 20, 1208. 256 . Angeli, A.; Trallori, E.; Carta, F.; Mannelli, L. D.; Ghelardini, C.; Supuran, C. T. ACS Med. Chem. Lett. 2018, 9, 947–951. 147 Figura 4.3. Algunos ejemplos de cumarinas sustituidas como inhibidores de CAs. 148 Con el objeto de incrementar la selectividad de los inhibidores de CAs frente a las CA IX y XII en un posible uso clínico, algunos inhibidores, tanto de tipo sulfonamida, como cumarina, se han conectado a un residuo sacarídico. Dado que las isoformas CAs IX y XII son enzimas transmembrana que poseen su sitio activo dirigido hacia el medio extracelular, y que los carbohidratos son moléculas con una alta polaridad, que no podrían atravesar dicha membrana, la conexión de estos a un farmacóforo orientado a la inhibición de CAs puede mejorar la selectividad del inhibidor. 257 A modo de ejemplo, en la Figura 4.4 se muestra la estructura de tioureas derivadas de arilsulfonamidas 141, 258 y de glicósidos derivados de cumarinas 142 259 diseñados con este fin. Se ha modificado la configuración del carbohidrato (D-glucosa, D-manosa, D-galactosa, D-xilosa, L-arabinosa, L-ramnosa), empleándose incluso disacáridos (maltosa), así como la distintos sustituyentes en los grupos hidroxilo (R= H, Ac). Figura 4.4. Estructura general de glicoconjugados y glicósidos derivados de arilsulfonamidas y cumarinas 141 y 142- El líder mundial indiscutible en la investigación de las CAs, sus inhibidores e implicaciones farmacológicas, es el Profesor Claudiu T. Supuran (Universidad de Florencia, Italia), con casi 1900 publicaciones en este contexto, y en cuyo laboratorio están siendo evaluados los productos preparados en este capítulo de la Tesis Doctoral. 257 . Cuffaro, D.; Nuti, E.; Rossello, A. J. Enzyme Inhib. Med. Chem. 2020, 35, 1906–1922. 258 . Mogharabi-Manzari, M.; Amini, M.; Abdollahi, M.; Khoobi, M.; Bagherzadeh, G.; Faramarzi, M. A. ChemCatChem 2018, 10, 1542–1546. 259 . Touisni, N.; Maresca, A.; McDonald, P. C.; Lou, Y.; Scozzafava, A.; Dedhar, S.; Winum, J. Y.; Supuran, C. T. J. Med. Chem. 2011, 54, 8271–8277. 149 4.2. Objetivos En este capítulo hemos abordado la preparación de nuevos derivados de cumarina con residuos de carbohidrato, con objeto de obtener compuestos que pudieran exhibir selectividades mejoradas frente a las CAs IX y XII en un posible uso clínico. 4.3. Discusión de resultados A tal efecto, se han funcionalizado diversas cumarinas en la posición C-7, con objeto de incorporar un espaciador hidrocarbonado de distintas longitudes y conectar el carbohidrato a través de una función tioureido. Adicionalmente también se han modificado las posiciones C-3 y C-4 del esqueleto de cumarina. La estructura general de los derivados preparados en este capítulo se muestra en la Figura 4.5. Figura 4.5. Estructura general de las glicocumarinas abordadas en este capítulo La síntesis para la obtención de las glico-cumarinas, se llevó a cabo usando los aminoderivados de cumarina 147a-d como intermediarios claves. Estos compuestos se obtuvieron fácilmente mediante la condensación de Pechmann entre el resorcinol y βcetoesteres sustituidos, empleando las condiciones clásicas con catálisis de H2SO4. Esto permitió obtener las cumarinas 144a-d sustituidas en las posiciones C-3 y/o C-4. 150 Posteriormente el grupo hidroxilo de la posición C-7 se alquiló mediante una síntesis de Williamson, para lo cual se hizo reaccionar con un exceso de α,ω-dibromoalcanos (1,3- dibromopropano y 1,6-dibromohexano) en medio básico (K2CO3), originando los productos monosustituidos 145a-d; dichos compuestos a su vez fueron sometidos a una reacción de tipo SN2 con NaN3 seguido de hidrogenación catalítica, para originar los amino-derivados 147a-d (Esquema 4.8). Estos compuestos fueron los intermediarios clave para reaccionar con isotiocianatos derivados de carbohidrato. Esquema 4.8. Preparación de los amino-precursores derivados de cumarina 147a-d. Para llevar a cabo la síntesis de las glico-cumarinas se planteó como compuesto intermedio clave el β-D-glucopiranosilisotiocianato per-O-acetilado 148; dicho compuesto se preparó mediante el tratamiento de la β-D-glucopiranosilamina per-O-acetilada 125 con tiofosgeno como agente tionante, en un medio trifásico (H2O, CH2Cl2, CaCO3) (Esquema 4.9). Camarasa et al.. 260 han descrito que este tipo de compuestos también puede prepararse mediante tratamiento de un haluro de glicosilo per-O-acetilado con KSCN en presencia de un catalizador de transferencia de fase. 260 . Camarasa, M. J.; Fernández-Resa, P.; García-López, M. T.; De las heras, F. G.; Méndez-Castrillón, P. P.; Sam Felix, A. Synthesis, 1984, 6, 509–510. 151 Esquema 4.9. Preparación del β-D-glucopiranosilisotiocianato per-O-acetilado 148. Finalmente, el acoplamiento entre la amina de las cumarinas 147a-d y el isotiocinato 148 se efectuó mediante calentamiento en una mezcla acetonitrilo/isopropanol, en medio básico (Et3N), dando como resultado los productos 34‒37 (Esquema 4.10). Esquema 4.10. Preparación de las glicocumarinas 34-37. 152 A continuación, se muestra el espectro de RMN de 1H del producto 35 (Figura 4.6), donde se observa la presencia de las señales pertenecientes a los acetilos correspondientes al azúcar alrededor de 2.0 ppm. Puede comprobarse además que todas las señales del compuesto se encuentran muy ensanchadas; ello es debido, al igual que se mostró en el capítulo anterior para los selenocarbamatos, a la presencia de diversos isómeros conformacionales E/Z (con distinta estabilidad) para cada enlace C-N del fragmento de pseudo-tioamida. Se ha descrito158 que en los espectros de glicosiltioureas en CDCl3 en el enlace Azúcar-NH-CS, el protón anomérico y el protón del grupo NH adoptan una orientación antiperiplana, que estaría de acuerdo con el triplete en torno a 5.8 ppm asignado a H-1 (J1,2= J1,NH=9.3 Hz). Figura 4.6. Espectro 1H-RMN (300 MHz, CDCl3) del producto 35. 153 Por otra parte, en el espectro de RMN de 13C (Figura 4.7), se puede destacar como señal importante de la formación de este producto la señal del grupo tioureido aproximadamente en 184 ppm; la señal correspondiente al carbono anomérico se observa como una señal ancha y muy pequeña en 82 ppm. Figura 4.7. Espectro de 13C-RMN (7.5 MHz, CDCl3) del producto 35. Estaba prevista la realización de una serie más amplia de derivados, con otras cadenas espaciadoras, el uso de otros carbohidratos (e.j. galactosa, e incluso disacáridos, como la maltosa), así como la comparación de las bioactividades entre los productos O-acetilados y sus correspondientes derivados desprotegidos. No obstante, el largo confinamiento en la BUAP, a raíz de la pandemia provocada por el COVID-19, impidió la culminación de dicha serie de derivados.